EA045516B1 - MONOCLONAL ANTIBODIES TO C-MET - Google Patents
MONOCLONAL ANTIBODIES TO C-MET Download PDFInfo
- Publication number
- EA045516B1 EA045516B1 EA201201273 EA045516B1 EA 045516 B1 EA045516 B1 EA 045516B1 EA 201201273 EA201201273 EA 201201273 EA 045516 B1 EA045516 B1 EA 045516B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- region
- seq
- met
- cancer
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 162
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 151
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 69
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 69
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 69
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 39
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 25
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 19
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 17
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 15
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000009203 Sema domains Human genes 0.000 claims description 12
- 108050000099 Sema domains Proteins 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 12
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 claims description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 9
- 206010073140 Clear cell sarcoma of soft tissue Diseases 0.000 claims description 8
- 201000000292 clear cell sarcoma Diseases 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 5
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037540 Alveolar soft tissue sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 3
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000006644 Malignant Fibrous Histiocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015778 Undifferentiated pleomorphic sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims 1
- YINZYTTZHLPWBO-UHFFFAOYSA-N Kifunensine Natural products COC1C(O)C(O)C(O)C2NC(=O)C(=O)N12 YINZYTTZHLPWBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OIURYJWYVIAOCW-VFUOTHLCSA-N kifunensine Chemical compound OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2NC(=O)C(=O)N12 OIURYJWYVIAOCW-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 claims 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 claims 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 110
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 98
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 63
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 62
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 27
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 24
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- -1 carboplatin ) Chemical class 0.000 description 16
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 16
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 16
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 13
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 13
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 13
- 101001138128 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-12 Proteins 0.000 description 12
- 102100020773 Immunoglobulin kappa variable 1-12 Human genes 0.000 description 12
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 11
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 9
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 9
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 9
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 6
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 6
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 5
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 5
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 5
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012450 HuMAb Mouse Methods 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 4
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 4
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 3
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700012941 GNRH1 Proteins 0.000 description 3
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 3
- 101001138127 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-13 Proteins 0.000 description 3
- 101001008333 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-16 Proteins 0.000 description 3
- 101000654674 Homo sapiens Semaphorin-6A Proteins 0.000 description 3
- 102100020772 Immunoglobulin kappa variable 1-13 Human genes 0.000 description 3
- 102100027462 Immunoglobulin kappa variable 1D-16 Human genes 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 3
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 3
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 3
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 3
- 102100032795 Semaphorin-6A Human genes 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 3
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 3
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 description 3
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 3
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 3
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 3
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 3
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 3
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 3
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 description 3
- BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N lapatinib Chemical compound O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 3
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229960003552 other antineoplastic agent in atc Drugs 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 3
- BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N seliciclib Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)CC)=NC=1NCC1=CC=CC=C1 BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 3
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 3
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 2
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VPFUWHKTPYPNGT-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(5-hydroxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)propan-1-one Chemical compound OC1=C2C=CC(C)(C)OC2=CC=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VPFUWHKTPYPNGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBCZSGKMGDDXIJ-HQCWYSJUSA-N 7-hydroxystaurosporine Chemical compound N([C@H](O)C1=C2C3=CC=CC=C3N3C2=C24)C(=O)C1=C2C1=CC=CC=C1N4[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]3(C)O1 PBCZSGKMGDDXIJ-HQCWYSJUSA-N 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100021266 Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 2
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N Ethinyl estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical class OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000819490 Homo sapiens Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000998139 Homo sapiens Interleukin-32 Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 102100033501 Interleukin-32 Human genes 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 2
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 2
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 2
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 2
- VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N Mitobronitol Chemical compound BrC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CBr VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- YJDYDFNKCBANTM-QCWCSKBGSA-N SDZ PSC 833 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)C(=O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O YJDYDFNKCBANTM-QCWCSKBGSA-N 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 2
- 101710097160 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical class OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 2
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 2
- WNRZHQBJSXRYJK-UHFFFAOYSA-N carboxyamidotriazole Chemical compound NC1=C(C(=O)N)N=NN1CC(C=C1Cl)=CC(Cl)=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 WNRZHQBJSXRYJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 2
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 2
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 2
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001842 estramustine Drugs 0.000 description 2
- FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N estramustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 2
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 2
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002710 external beam radiation therapy Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 2
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 2
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 2
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 2
- RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N megestrol acetate Chemical compound C1=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N 0.000 description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 2
- 229960005485 mitobronitol Drugs 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 2
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 2
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 2
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 2
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 2
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229950010938 valspodar Drugs 0.000 description 2
- 108010082372 valspodar Proteins 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NGGMYCMLYOUNGM-UHFFFAOYSA-N (-)-fumagillin Natural products O1C(CC=C(C)C)C1(C)C1C(OC)C(OC(=O)C=CC=CC=CC=CC(O)=O)CCC21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXTKHLHCVFUPPT-YYFJYKOTSA-N (2s)-2-[[4-[(2-amino-5-formyl-4-oxo-1,6,7,8-tetrahydropteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid;(1r,2r)-1,2-dimethanidylcyclohexane;5-fluoro-1h-pyrimidine-2,4-dione;oxalic acid;platinum(2+) Chemical compound [Pt+2].OC(=O)C(O)=O.[CH2-][C@@H]1CCCC[C@H]1[CH2-].FC1=CNC(=O)NC1=O.C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 YXTKHLHCVFUPPT-YYFJYKOTSA-N 0.000 description 1
- GTXSRFUZSLTDFX-HRCADAONSA-N (2s)-n-[(2s)-3,3-dimethyl-1-(methylamino)-1-oxobutan-2-yl]-4-methyl-2-[[(2s)-2-sulfanyl-4-(3,4,4-trimethyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)butanoyl]amino]pentanamide Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](S)CCN1C(=O)N(C)C(C)(C)C1=O GTXSRFUZSLTDFX-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- ARBXEMIAJIJEQI-WDCZJNDASA-N (3s,4r,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)piperidin-2-one Chemical compound OC[C@H]1CNC(=O)[C@@H](O)[C@@H]1O ARBXEMIAJIJEQI-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N (R)-alpha-Tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
- JRMXMUCILWKNNW-UHFFFAOYSA-N 1-butoxy-2-methylbenzene Chemical compound CCCCOC1=CC=CC=C1C JRMXMUCILWKNNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFPYWIDHMRZLRN-UHFFFAOYSA-N 17alpha-ethynyl estradiol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)(O)C#C)C4C3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBUTXZSKZCQABC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-1-methyl-7h-purine-6-thione Chemical compound S=C1N(C)C(N)=NC2=C1NC=N2 FBUTXZSKZCQABC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purine-6-thione Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=S)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQOQDQWUFQDJMK-SSTWWWIQSA-N 2-methoxy-17beta-estradiol Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H](O)CC[C@H]3[C@@H]1CCC1=C2C=C(OC)C(O)=C1 CQOQDQWUFQDJMK-SSTWWWIQSA-N 0.000 description 1
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRWCBEOAFGHNNU-UHFFFAOYSA-N 6-[difluoro-[6-(1-methyl-4-pyrazolyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl]methyl]quinoline Chemical compound C1=NN(C)C=C1C1=NN2C(C(F)(F)C=3C=C4C=CC=NC4=CC=3)=NN=C2C=C1 JRWCBEOAFGHNNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMKPVDQDJQWBPD-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-7-[2-(4-morpholinyl)ethylamino]quinoline-5,8-dione Chemical compound O=C1C2=NC=CC=C2C(=O)C(Cl)=C1NCCN1CCOCC1 BMKPVDQDJQWBPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBCZSGKMGDDXIJ-UHFFFAOYSA-N 7beta-hydroxystaurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3C(O)NC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 PBCZSGKMGDDXIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000644 Angiozyme Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N Aromasine Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N 0.000 description 1
- 229940122815 Aromatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000669426 Aspergillus restrictus Ribonuclease mitogillin Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- PGFQXGLPJUCTOI-WYMLVPIESA-N BIBR-1532 Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=CC=1C(/C)=C/C(=O)NC1=CC=CC=C1C(O)=O PGFQXGLPJUCTOI-WYMLVPIESA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010037003 Buserelin Proteins 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 description 1
- 101710085500 C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100447914 Caenorhabditis elegans gab-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102400000730 Canstatin Human genes 0.000 description 1
- 101800000626 Canstatin Proteins 0.000 description 1
- 101710158575 Cap-specific mRNA (nucleoside-2'-O-)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256135 Chironomus thummi Species 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 108700032819 Croton tiglium crotin II Proteins 0.000 description 1
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- ZQZFYGIXNQKOAV-OCEACIFDSA-N Droloxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=C(O)C=CC=1)\C1=CC=C(OCCN(C)C)C=C1 ZQZFYGIXNQKOAV-OCEACIFDSA-N 0.000 description 1
- 101100015729 Drosophila melanogaster drk gene Proteins 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 101710147220 Ent-copalyl diphosphate synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150009958 FLT4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100027844 Fibroblast growth factor receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 1
- VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N Fulvestrant Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3[C@H](CCCCCCCCCS(=O)CCCC(F)(F)C(F)(F)F)CC2=C1 VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010069236 Goserelin Proteins 0.000 description 1
- BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N Goserelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](COC(C)(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NNC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010091938 HLA-B7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100035108 High affinity nerve growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000917134 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000596894 Homo sapiens High affinity nerve growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001047617 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-11 Proteins 0.000 description 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 1
- 101000606465 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001106413 Homo sapiens Macrophage-stimulating protein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057156 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C2 Proteins 0.000 description 1
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 description 1
- 101001024605 Homo sapiens Next to BRCA1 gene 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001062222 Homo sapiens Receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells Proteins 0.000 description 1
- 101000821981 Homo sapiens Sarcoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000648075 Homo sapiens Trafficking protein particle complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- DOMWKUIIPQCAJU-LJHIYBGHSA-N Hydroxyprogesterone caproate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)CCCCC)[C@@]1(C)CC2 DOMWKUIIPQCAJU-LJHIYBGHSA-N 0.000 description 1
- 102000016878 Hypoxia-Inducible Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010028501 Hypoxia-Inducible Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJKOTMDDZAJTGQ-DQSJHHFOSA-N Idoxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN2CCCC2)=CC=1)/C1=CC=C(I)C=C1 JJKOTMDDZAJTGQ-DQSJHHFOSA-N 0.000 description 1
- 101150106555 Il24 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100022955 Immunoglobulin kappa variable 3-11 Human genes 0.000 description 1
- 102100022964 Immunoglobulin kappa variable 3-20 Human genes 0.000 description 1
- 102100039813 Inactive tyrosine-protein kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010040765 Integrin alphaV Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100036671 Interleukin-24 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- UCEQXRCJXIVODC-PMACEKPBSA-N LSM-1131 Chemical compound C1CCC2=CC=CC3=C2N1C=C3[C@@H]1C(=O)NC(=O)[C@H]1C1=CNC2=CC=CC=C12 UCEQXRCJXIVODC-PMACEKPBSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 108010048043 Macrophage Migration-Inhibitory Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100037791 Macrophage migration inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 102100021435 Macrophage-stimulating protein receptor Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 102100027252 Melanoma-associated antigen C2 Human genes 0.000 description 1
- 244000302512 Momordica charantia Species 0.000 description 1
- 235000009811 Momordica charantia Nutrition 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000534 N(2)-L-lysino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 102100029166 NT-3 growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 101150117329 NTRK3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101150038994 PDGFRA gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 229940049937 Pgp inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 235000009074 Phytolacca americana Nutrition 0.000 description 1
- 240000007643 Phytolacca americana Species 0.000 description 1
- 101100413173 Phytolacca americana PAP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100029165 Receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100021466 Sarcoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000014105 Semaphorin Human genes 0.000 description 1
- 108050003978 Semaphorin Proteins 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010091769 Shiga Toxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010090763 Shiga Toxin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIRKNQLZZXALBI-MSVGPLKSSA-N Squalamine Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](NCCCNCCCCN)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](C(C)C)OS(O)(=O)=O)[C@@]2(C)CC1 UIRKNQLZZXALBI-MSVGPLKSSA-N 0.000 description 1
- UIRKNQLZZXALBI-UHFFFAOYSA-N Squalamine Natural products OC1CC2CC(NCCCNCCCCN)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(C(C)C)OS(O)(=O)=O)C1(C)CC2 UIRKNQLZZXALBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 1
- JXAGDPXECXQWBC-LJQANCHMSA-N Tanomastat Chemical compound C([C@H](C(=O)O)CC(=O)C=1C=CC(=CC=1)C=1C=CC(Cl)=CC=1)SC1=CC=CC=C1 JXAGDPXECXQWBC-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102100025256 Trafficking protein particle complex subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102400000731 Tumstatin Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 240000001866 Vernicia fordii Species 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001818 alpha-sarcin Proteins 0.000 description 1
- 238000003016 alphascreen Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000008524 alveolar soft part sarcoma Diseases 0.000 description 1
- LXQXZNRPTYVCNG-YPZZEJLDSA-N americium-241 Chemical compound [241Am] LXQXZNRPTYVCNG-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960003437 aminoglutethimide Drugs 0.000 description 1
- ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N aminoglutethimide Chemical compound C=1C=C(N)C=CC=1C1(CC)CCC(=O)NC1=O ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- 229960002616 ancestim Drugs 0.000 description 1
- 108700024685 ancestim Proteins 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003388 anti-hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 230000034720 apoptotic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940078010 arimidex Drugs 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- MOTJMGVDPWRKOC-QPVYNBJUSA-N atrasentan Chemical compound C1([C@H]2[C@@H]([C@H](CN2CC(=O)N(CCCC)CCCC)C=2C=C3OCOC3=CC=2)C(O)=O)=CC=C(OC)C=C1 MOTJMGVDPWRKOC-QPVYNBJUSA-N 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N buserelin Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](COC(C)(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N 0.000 description 1
- 229960002719 buserelin Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXUFYVBQPIQQH-UHFFFAOYSA-N butoxymethoxybenzene Chemical compound CCCCOCOC1=CC=CC=C1 PLXUFYVBQPIQQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046731 calcineurin inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 1
- FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N captopril Chemical compound SC[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 1
- 229960000830 captopril Drugs 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100001012 cardiac lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-RNFDNDRNSA-N cesium-137 Chemical compound [137Cs] TVFDJXOCXUVLDH-RNFDNDRNSA-N 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-YPZZEJLDSA-N cobalt-57 Chemical compound [57Co] GUTLYIVDDKVIGB-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000004814 combretastatins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-AKLPVKDBSA-N copper-67 Chemical compound [67Cu] RYGMFSIKBFXOCR-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960004969 dalteparin Drugs 0.000 description 1
- 229960002204 daratumumab Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 229960000452 diethylstilbestrol Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229950004203 droloxifene Drugs 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 108010028531 enomycin Proteins 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960002568 ethinylestradiol Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960000255 exemestane Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960000556 fingolimod Drugs 0.000 description 1
- KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N fingolimod Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CCC(N)(CO)CO)C=C1 KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229960002258 fulvestrant Drugs 0.000 description 1
- 229960000936 fumagillin Drugs 0.000 description 1
- NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N fumagillin Chemical compound C([C@H]([C@H]([C@@H]1[C@]2(C)[C@H](O2)CC=C(C)C)OC)OC(=O)\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O)C[C@@]21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940080856 gleevec Drugs 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 239000002748 glycoprotein P inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical group 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-OUBTZVSYSA-N gold-198 Chemical compound [198Au] PCHJSUWPFVWCPO-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229960002913 goserelin Drugs 0.000 description 1
- 101150098203 grb2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 239000003481 heat shock protein 90 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000002628 heparin derivative Substances 0.000 description 1
- 108010083213 heparitinsulfate lyase Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229950000801 hydroxyprogesterone caproate Drugs 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 229950002248 idoxifene Drugs 0.000 description 1
- YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N imatinib methanesulfonate Chemical compound CS(O)(=O)=O.C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 102000003898 interleukin-24 Human genes 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-AHCXROLUSA-M iodine-123(1-) Chemical compound [123I-] XMBWDFGMSWQBCA-AHCXROLUSA-M 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-IGMARMGPSA-N iridium-192 Chemical compound [192Ir] GKOZUEZYRPOHIO-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 229960005280 isotretinoin Drugs 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-XFYACQKRSA-N isotretinoin Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-XFYACQKRSA-N 0.000 description 1
- 229960002014 ixabepilone Drugs 0.000 description 1
- FABUFPQFXZVHFB-CFWQTKTJSA-N ixabepilone Chemical compound C/C([C@@H]1C[C@@H]2O[C@]2(C)CCC[C@@H]([C@@H]([C@H](C)C(=O)C(C)(C)[C@H](O)CC(=O)N1)O)C)=C\C1=CSC(C)=N1 FABUFPQFXZVHFB-CFWQTKTJSA-N 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- DHMTURDWPRKSOA-RUZDIDTESA-N lonafarnib Chemical compound C1CN(C(=O)N)CCC1CC(=O)N1CCC([C@@H]2C3=C(Br)C=C(Cl)C=C3CCC3=CC(Br)=CN=C32)CC1 DHMTURDWPRKSOA-RUZDIDTESA-N 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229950008959 marimastat Drugs 0.000 description 1
- OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N marimastat Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](O)C(=O)NO OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004616 medroxyprogesterone Drugs 0.000 description 1
- 229940090004 megace Drugs 0.000 description 1
- 229960001786 megestrol Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 1
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 1
- CKNAQFVBEHDJQV-UHFFFAOYSA-N oltipraz Chemical compound S1SC(=S)C(C)=C1C1=CN=CC=N1 CKNAQFVBEHDJQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008687 oltipraz Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940043138 pentosan polysulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000001608 potassium adipate Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 229940063222 provera Drugs 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 229960004622 raloxifene Drugs 0.000 description 1
- GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N raloxifene Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(C(=O)C=2C=CC(OCCN3CCCCC3)=CC=2)C2=CC=C(O)C=C2S1 GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 229950003238 rilotumumab Drugs 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940072272 sandostatin Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- LVLLALCJVJNGQQ-ZCPUWASBSA-N seocalcitol Chemical compound C1(/[C@H]2CC[C@@H]([C@@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/C=C/C(O)(CC)CC)=C/C=C1/C[C@H](O)C[C@@H](O)C1=C LVLLALCJVJNGQQ-ZCPUWASBSA-N 0.000 description 1
- 229950009921 seocalcitol Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229940115586 simulect Drugs 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100996 sodium bisulfate Drugs 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940001482 sodium sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical class C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 235000003687 soy isoflavones Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950001248 squalamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000007755 survival signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXVCSRUYMINUSF-UHFFFAOYSA-N tetrathiomolybdate(2-) Chemical compound [S-][Mo]([S-])(=S)=S CXVCSRUYMINUSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001196 time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229950005976 tivantinib Drugs 0.000 description 1
- AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N tocofersolan Chemical compound OCCOC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- XFCLJVABOIYOMF-QPLCGJKRSA-N toremifene Chemical compound C1=CC(OCCN(C)C)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(\CCCl)C1=CC=CC=C1 XFCLJVABOIYOMF-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- 229960005026 toremifene Drugs 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 108010012374 type IV collagen alpha3 chain Proteins 0.000 description 1
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013594 undilute cell lysate Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 229960000241 vandetanib Drugs 0.000 description 1
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 1
- LLDWLPRYLVPDTG-UHFFFAOYSA-N vatalanib succinate Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O.C1=CC(Cl)=CC=C1NC(C1=CC=CC=C11)=NN=C1CC1=CC=NC=C1 LLDWLPRYLVPDTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940099073 xolair Drugs 0.000 description 1
- 229950009002 zanolimumab Drugs 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам против человеческого c-Met, рецептора фактора роста гепатоцитов, и к применениям таких антител, конкретно к их применению в лечении злокачественных новообразований.The present invention relates to monoclonal antibodies against human c-Met, a hepatocyte growth factor receptor, and to uses of such antibodies, particularly to their use in the treatment of cancer.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Белок c-Met является мембраноассоциированным рецептором-тирозинкиназой. Преимущественно одноцепочечный предшественник посттрансляционно расщепляется с получением зрелой формы гетеродимера c-Met, который состоит из внеклеточной α-цепи (50 кДа) и более длинной трансмембранной βцепи (145 кДа), которые связаны дисульфидной связью (Birchmeier et al. 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915). Внеклеточная часть c-Met состоит из трех типов доменов. N-концевой домен SEMA образуется из цельной α-субъединицы и части β-субъединицы и имеет гомологию с белками семафоринов. За доменом SEMA следует цистеин-богатый домен, а далее 4 иммуноглобулино-(Ig)-подобных домена. Цитоплазматическая часть содержит околомембранный киназный домен и С-концевой хвост, который существенен для передачи сигнала в клетку. Единственный известный высоко-аффинный лиганд для c-Met, фактор роста гепатоцитов (HGF), экспрессируется, главным образом, фибробластами в нормальных условиях (Li and Tseng 1995. J Cell Physiol 163:61) и опухолевыми клетками (Ferracini et al. 1995. Oncogene 10:739). HGF (также называемый рассеивающим фактором: SF) синтезируется в виде предшественника, который протеолитически превращается в активный а/р гетеродимер. На основании кристаллической структуры фрагмента, связывающего рецептор, считается, что HGF связывается с c-Met в виде димера (Chirgadze et al. 1999. Nat Struct Biol 6:72). α-Цепь HGF связывается в c-Met с высокой аффинностью с Ig-подобным доменом, тогда как β-цепь HGF связывается в c-Met с низкой аффинностью с доменом SEMA (Basilico et al. 2008. J Biol Chem 283:21267). Последнее взаимодействие ответственно за димеризацию c-Met и активацию рецепторной тирозинкиназы при связывании с активным гетеродимером HGF. Автофосфорилирование рецептора приводит в результате к получению уникального стыковочного сайта для привлечения эффекторов, из которых связывание Gab1 (1-й связующий агент, ассоциированный с 2-м белком, связанным с рецептором фактора роста [Grb2]) существенно для последующих этапов основных сигнальных путей c-Met (Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504):The c-Met protein is a membrane-associated receptor tyrosine kinase. The predominantly single-chain precursor is posttranslationally cleaved to yield the mature form of the c-Met heterodimer, which consists of an extracellular α chain (50 kDa) and a longer transmembrane β chain (145 kDa) that are linked by a disulfide bond (Birchmeier et al. 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915). The extracellular portion of c-Met consists of three types of domains. The N-terminal domain of SEMA is formed from the entire α-subunit and part of the β-subunit and has homology with semaphorin proteins. The SEMA domain is followed by a cysteine-rich domain, and then 4 immunoglobulin (Ig)-like domains. The cytoplasmic part contains a juxtamembrane kinase domain and a C-terminal tail, which is essential for signal transduction into the cell. The only known high-affinity ligand for c-Met, hepatocyte growth factor (HGF), is expressed primarily by fibroblasts under normal conditions (Li and Tseng 1995. J Cell Physiol 163:61) and tumor cells (Ferracini et al. 1995. Oncogene 10:739). HGF (also called scattering factor: SF) is synthesized as a precursor that is proteolytically converted into the active a/p heterodimer. Based on the crystal structure of the receptor binding fragment, it is believed that HGF binds to c-Met as a dimer (Chirgadze et al. 1999. Nat Struct Biol 6:72). The HGF α-chain binds in c-Met with high affinity to the Ig-like domain, while the HGF β-chain binds in c-Met with low affinity to the SEMA domain (Basilico et al. 2008. J Biol Chem 283:21267). The latter interaction is responsible for dimerization of c-Met and activation of the receptor tyrosine kinase upon binding to the active HGF heterodimer. Autophosphorylation of the receptor results in a unique docking site for the recruitment of effectors, of which the binding of Gab1 (growth factor receptor-associated protein 2 [Grb2]-associated protein 1) binding is essential for subsequent steps of the major c-signaling pathways. Met (Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504):
Путь Ras-ERK1/2: пролиферация;Ras-ERK1/2 pathway: proliferation;
Путь Ras-Rac: инвазия, подвижность, эпителиально-мезенхимальный переход;Ras-Rac pathway: invasion, motility, epithelial-mesenchymal transition;
Путь PI3K-Akt: жизнеспособность.PI3K-Akt pathway: viability.
c-Met экспрессируется на поверхности эпителиальных и эндотелиальных клеток многих органов в процессе эмбриогенеза и во взрослом состоянии, включая печень, поджелудочную железу, предстательную железу, почки, мышцы и костный мозг. Активация c-Met играет существенную роль в так называемой программе инвазивного роста, которая состоит из ряда процессов, включающих пролиферацию, подвижность, ангиогенез и защиту от апоптоза (Boccaccio and Comoglio 2006. Nat Rev Cancer 6:637). Эти регулируемые c-Met процессы идут при нормальных физиологических условиях в процессе эмбрионального развития, при репарации поражений печени и сердца, и в патологических случаях в ходе онкогенеза (Eder et al. 2009. Clin Cancer Res 15:2207).c-Met is expressed on the surface of epithelial and endothelial cells in many organs during embryogenesis and in adulthood, including the liver, pancreas, prostate, kidney, muscle, and bone marrow. Activation of c-Met plays an essential role in the so-called invasive growth program, which consists of a number of processes including proliferation, motility, angiogenesis and protection against apoptosis (Boccaccio and Comoglio 2006. Nat Rev Cancer 6:637). These c-Met-regulated processes occur under normal physiological conditions during embryonic development, during repair of liver and cardiac lesions, and in pathological cases during tumorigenesis (Eder et al. 2009. Clin Cancer Res 15:2207).
Неуместная передача сигналов от c-Met происходит фактически во всех типах твердых опухолей, таких как рак мочевого пузыря, рак груди, рак шейки матки, колоректальный рак, рак желудка, рак головы и шеи, рак печени, рак легкого, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак почек и рак щитовидной железы, а также в различных саркомах, гемопоэтических злокачественных новообразованиях и в меланомах (Birchmeier et al. 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915; Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drag Discov 7:504; Peruzzi and Bottaro 2006. Clin Cancer Res 12:3657). Основополагающие механизмы онкогенности cMet, как правило, осуществляются тремя различными путями:Inappropriate c-Met signaling occurs in virtually all types of solid tumors, such as bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colorectal cancer, stomach cancer, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer glands, kidney cancer and thyroid cancer, as well as in various sarcomas, hematopoietic malignancies and melanomas (Birchmeier et al. 2003. Nat Rev Mol Cell Biol 4:915; Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drag Discov 7:504 ; Peruzzi and Bottaro 2006. Clin Cancer Res 12:3657). The underlying mechanisms of cMet oncogenicity typically occur through three different pathways:
аутокринные петли HGF/c-Met, сверхэкспрессия c-Met или HGF, мутации в кодирующей последовательности рецептора c-Met, активирующие киназы.autocrine HGF/c-Met loops, overexpression of c-Met or HGF, mutations in the c-Met receptor coding sequence, activating kinases.
Наиболее значимо то, что активирующие c-Met мутации были идентифицированы у пациентов с наследственным папиллярным раком почек (Schmidt et al. 1997. Nat Genet 16:68). Конститутивная активация c-Met способствует одному из или комбинации пролиферативного, инвазивного, жизнеобеспечивающего или ангиогенного фенотипов злокачественных новообразований. Было показано, что сайленсинг эндогенно экспрессирующегося гена c-Met в опухолевых клетках в результате приводит к прекращению пролиферации и опухолевого роста и к регрессии начавшегося метастазирования, а также к уменьшению образования новых метастаз (Corso et al. 2008. Oncogene 27:684).Most significantly, c-Met activating mutations have been identified in patients with hereditary papillary renal cancer (Schmidt et al. 1997. Nat Genet 16:68). Constitutive activation of c-Met contributes to one or a combination of proliferative, invasive, life-sustaining, or angiogenic phenotypes of malignancies. Silencing of the endogenously expressed c-Met gene in tumor cells has been shown to result in cessation of proliferation and tumor growth and regression of established metastasis, as well as a reduction in the formation of new metastases (Corso et al. 2008. Oncogene 27:684).
Так как c-Met способствует многим состояниям развития злокачественного новообразования, от исходного до прогрессии к метастазированию, c-Met и его лиганд HGF стали лидирующими кандидатами для направленной противоопухолевой терапии (Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Knudsen and Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18:87). Для достижения данной цели изучаются несколько стратегий:Because c-Met contributes to many stages of malignancy development, from initial development to progression to metastasis, c-Met and its ligand HGF have emerged as leading candidates for targeted anticancer therapy (Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504; Knudsen and Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18:87). Several strategies are being explored to achieve this goal:
Ложные рецепторы: субобласти HGF или c-Met или молекулярные аналоги могут действовать антаFalse receptors: HGF or c-Met subregions or molecular analogues may act ant
- 1 045516 гонистически в качестве стехиометрических конкурентов путем блокирования связывания лиганда или димеризации рецептора. Одним примером такой антагонистической субобласти HGF является NK4 (Kringle Pharma).- 1 045516 gonistically as stoichiometric competitors by blocking ligand binding or receptor dimerization. One example of such an antagonistic HGF subregion is NK4 (Kringle Pharma).
Низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ (TKI): Тремя c-Met-специфичными TKI в различных стадиях клинической оценки являются ARQ197 (ArQule), JNJ 38877605 (Johnson & Johnson) и PF04217903 (Pfizer).Small molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs): Three c-Met-specific TKIs in various stages of clinical evaluation are ARQ197 (ArQule), JNJ 38877605 (Johnson & Johnson), and PF04217903 (Pfizer).
Моноклональные антитела, связывающие HGF, такие как AMG102, рилотумумаб (англ. rilotumumab) (Amgen), HuL2G7 (Takeda), и AV-299 (Schering).Monoclonal antibodies that bind HGF, such as AMG102, rilotumumab (Amgen), HuL2G7 (Takeda), and AV-299 (Schering).
Моноклональные антитела, связывающие c-Met, описаны в WO 2005016382, WO 2006015371, WO 2007090807, WO 2007126799 WO 2009007427, WO 2009142738 и в работе van der Horst et al. (van der Horst et al. 2009. Neoplasoa 11:355). MetMAb (Genentech) представляют собой гуманизированные моновалентные (одно-плечевые) OA-5D5 антитела, которое связывают внеклеточный домен c-Met, предотвращая таким образом связывание HGF и последующую активацию рецептора (Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360). В мышиных моделях ксенотрансплантатов было обнаружено, что обработка MetMAb ингибирует опухолевый рост HGF-управляемой ортотопической глиобластомы и подкожных панкреатических опухолей (Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360; Martens et al. 2006. Clin Cancer Res 12:6144). Антитело h224G11 (Pierre Fabre) (Corvaia and Boute 2009. Abstract 835 AACR 100th Annual Meeting) представляет собой гуманизированное двухвалентное IgG1-антитело против c-Met. Противоопухолевый эффект данного антитела наблюдали у мышей (Goetsch et al. 2009. Abstract 2792 AACR 100th Annual Meeting). Антитело СЕ-355621 (Pfizer) представляет собой человеческий IgG2, который блокирует связывание лиганда путем связывания с внеклеточным доменом c-Met и ингибирует HGF-зависимый рост в моделях опухолевых ксенотрансплантатов (Tseng et al. 2008. J Nucl Med 49:129).Monoclonal antibodies that bind c-Met are described in WO 2005016382, WO 2006015371, WO 2007090807, WO 2007126799 WO 2009007427, WO 2009142738 and van der Horst et al. (van der Horst et al. 2009. Neoplasoa 11:355). MetMAb (Genentech) is a humanized monovalent (single-arm) OA-5D5 antibody that binds the extracellular domain of c-Met, thereby preventing HGF binding and subsequent receptor activation (Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360). In murine xenograft models, MetMAb treatment was found to inhibit tumor growth of HGF-driven orthotopic glioblastoma and subcutaneous pancreatic tumors (Jin et al. 2008. Cancer Res 68:4360; Martens et al. 2006. Clin Cancer Res 12:6144). Antibody h224G11 (Pierre Fabre) (Corvaia and Boute 2009. Abstract 835 AACR 100th Annual Meeting) is a humanized divalent IgG1 antibody against c-Met. The antitumor effect of this antibody was observed in mice (Goetsch et al. 2009. Abstract 2792 AACR 100th Annual Meeting). Antibody CE-355621 (Pfizer) is a human IgG2 that blocks ligand binding by binding to the extracellular domain of c-Met and inhibits HGF-dependent growth in tumor xenograft models (Tseng et al. 2008. J Nucl Med 49:129).
В заключении следует отметить, что некоторые продукты против c-Met уже изучались, но до сих пор не существует ни одного продукта против c-Met, одобренного для терапевтического применения. Существует потребность в получении эффективных и безопасных продуктов для лечения тяжелых, ассоциированных с c-Met заболеваний, таких как злокачественные новообразования.In conclusion, several anti-c-Met products have already been studied, but there is still no anti-c-Met product approved for therapeutic use. There is a need to provide effective and safe products for the treatment of severe c-Met-associated diseases such as cancer.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Целью настоящего изобретения является предложение новых высокоспецифичных и эффективных моноклональных антител против c-Met для медицинского применения. Антитела по изобретению демонстрируют характеристики связывания с c-Met, которые отличаются от характеристик антител, описанных в данной области. В предпочтительных воплощениях, антитела по изобретению обладают высокой аффинностью по отношению к человеческому c-Met, являются антагонистическими и обладают предпочтительным профилем фармакокинетики для применения у пациентов-людей.The purpose of the present invention is to provide new highly specific and effective monoclonal antibodies against c-Met for medical use. Antibodies of the invention exhibit c-Met binding characteristics that differ from those of antibodies described in the art. In preferred embodiments, the antibodies of the invention have high affinity for human c-Met, are antagonistic, and have a favorable pharmacokinetic profile for use in human patients.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фиг. 1. Сравнение последовательностей вариабельных участков тяжелых цепей антител HuMab. На основании этих последовательностей могут быть определены консенсусные последовательности CDR. Эти консенсусные последовательности представлены в таблице 4.Fig. 1. Comparison of the sequences of the variable regions of the heavy chains of HuMab antibodies. Based on these sequences, consensus CDR sequences can be determined. These consensus sequences are presented in Table 4.
Фиг. 2. Сравнение последовательностей вариабельных участков легких цепей антител HuMab. На основании этих последовательностей могут быть определены консенсусные последовательности CDR. Эти консенсусные последовательности представлены в табл. 4.Fig. 2. Comparison of the sequences of the variable regions of the light chains of HuMab antibodies. Based on these sequences, consensus CDR sequences can be determined. These consensus sequences are presented in Table. 4.
Фиг. 3. Кривые связывания одновалентных и двухвалентных форм антител против c-Met с клетками А431, которые экспрессируют c-Met. Представленные данные это MFI одного репрезентативного эксперимента. Так как IgG1-024 и Uni-068 не демонстрируют насыщенного связывания с клетками А431, то не представляется возможным рассчитать точное значение EC50.Fig. 3. Binding curves of monovalent and divalent forms of antibodies against c-Met to A431 cells that express c-Met. Data presented are the MFI of one representative experiment. Since IgG1-024 and Uni-068 do not show strong binding to A431 cells, it is not possible to calculate an accurate EC 50 value.
Фиг. 4. Связывание антител с c-Met, который экспрессируется на эпителиальных клетках макакирезус. Представленные данные - это MFI одного эксперимента.Fig. 4. Antibody binding to c-Met, which is expressed on rhesus epithelial cells. Data presented are the MFI of a single experiment.
Фиг. 5. Ингибирование связывания HGF с внеклеточным доменом рецептора с-Met, индуцированное антителом против c-Met. Представленные данные - это один репрезентативный эксперимент.Fig. 5. Inhibition of HGF binding to the extracellular domain of the c-Met receptor induced by anti-c-Met antibody. The data shown is one representative experiment.
Фиг. 6. Кривые ингибирования различными антителами против c-Met связывания HGF с cMetSEMA_567His8, полученные с помощью TR-FRET. Представленные данные - это среднее MFI ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.Fig. 6. Inhibition curves of various anti-c-Met antibodies on HGF binding to cMetSEMA_567His8 obtained using TR-FRET. Data shown are the mean MFI ± standard deviation of three independent experiments.
Фиг. 7. Процентное ингибирование жизнеспособных клеток KP4 после обработки антителом против c-Met по сравнению с необработанными клетками (0%). Представленные данные - это процентное ингибирование жизнеспособных клеток двух независимых экспериментов ± стандартное отклонение. IgG11016-022 является единственным положительным результатом в одном эксперименте.Fig. 7. Percent inhibition of viable KP4 cells after treatment with anti-c-Met antibody compared to untreated cells (0%). Data shown are percentage inhibition of viable cells from two independent experiments ± standard deviation. IgG11016-022 is the only positive result in one experiment.
Фиг. 8. Эффективность антител против c-Met при ингибирования опухолевого роста в модели ксенотрансплантата KP4 в мышах SCID. Мышей обрабатывали с помощью 400 цд антитела на 9 день после недельного поддержания дозы 200 цд. Представлены средние размеры опухоли на группу обработки.Fig. 8. Efficacy of anti-c-Met antibodies in inhibiting tumor growth in the KP4 xenograft model in SCID mice. Mice were treated with 400 cd antibody on day 9 after a weekly maintenance dose of 200 cd. Average tumor sizes per treatment group are presented.
Фиг. 9. Эффективность антител, связывающих c-Met, для ингибирования опухолевого роста в модели ксенотрансплантата KP4 в мышах SCID. Мышей обрабатывали 400 мкг антитела на 9 день, с последующей поддерживающей дозой 200 мкг раз в неделю. Эффект обработки, оказываемый на частоту опуFig. 9. Efficacy of c-Met binding antibodies to inhibit tumor growth in the KP4 xenograft SCID mouse model. Mice were treated with 400 μg of antibody on day 9, followed by a maintenance dose of 200 μg once weekly. Processing effect on frequency
- 2 045516 холей, от времени. Представлен процент мышей без опухоли (размеры опухолей <500 мм3). Образование опухолей замедлялось у мышей, обработанных антагонистическими антителами, по сравнению с мышами, обработанными контрольными антителами.- 2 045516 holey, from time to time. The percentage of tumor-free mice (tumor size <500 mm 3 ) is presented. Tumor formation was slowed in mice treated with antagonistic antibodies compared to mice treated with control antibodies.
Фиг. 10. Эффективность антител против c-Met при ингибировании опухолевого роста в модели ксенотрансплантата MKN45 в мышах SCID. Мышей обрабатывали 40 мг/кг антитела на 7 день и 20 мг/кг антитела в дни 14, 21 и 28. Представлены средние размеры опухолей до достижения 50% мышей предельного значения, составляющего 700 мм3 на группу обработки.Fig. 10. Efficacy of anti-c-Met antibodies in inhibiting tumor growth in the MKN45 xenograft model in SCID mice. Mice were treated with 40 mg/kg antibody on day 7 and 20 mg/kg antibody on days 14, 21 and 28. Average tumor sizes until 50% of mice reached the cutoff of 700 mm 3 per treatment group are shown.
Фиг. 11. Эффективность антител против c-Met, при ингибировании опухолевого роста в модели ксенотрансплантата MKN45 в мышах SCID. Мышей обрабатывали 40 мг/кг антитела на 7 день и 20 мг/кг антитела в дни 14, 21 и 28. Процент мышей с размером опухоли менее чем 700 мм3 представлен на диаграмме Каплана-Мейера. Образование опухолей замедлялось у мышей, обработанных анти c-Met антителами, по сравнению с мышами, обработанными изотипическим контрольным антителом.Fig. 11. Efficacy of anti-c-Met antibodies in inhibiting tumor growth in the MKN45 xenograft model in SCID mice. Mice were treated with 40 mg/kg antibody on day 7 and 20 mg/kg antibody on days 14, 21 and 28. The percentage of mice with tumor size less than 700 mm 3 is presented on the Kaplan-Meier plot. Tumor formation was slowed in mice treated with anti-c-Met antibodies compared with mice treated with an isotype control antibody.
Фиг. 12. Анализ жизнеспособности KP4 для определения влияния гибкости антитела (antibody flexibility) на его агонистическую активность. Формат IgA2m(l) не индуцирует пролиферацию в отличие от форматов IgA1 и IgG1 того же антитела. В данном эксперименте использовали варианты антитела против c-Met 5D5 (см. US6468529 и пример 2).Fig. 12. KP4 viability assay to determine the effect of antibody flexibility on its agonistic activity. The IgA2m(l) format does not induce proliferation, unlike the IgA1 and IgG1 formats of the same antibody. Variants of the anti-c-Met antibody 5D5 were used in this experiment (see US6468529 and Example 2).
Фиг. 13. Анализ гибких мутантов в невосстанавливающем ДСН-ПААГ (069). Не наблюдали аберрантных мультимеров или продуктов деградации, тогда как спаривание легкой цепи было видно как полосу 50 кДа ((LC)2) в C220S, АС220 в мутантах IgG1-шарнир IgG3.Fig. 13. Analysis of flexible mutants in non-reducing SDS-PAGE (069). No aberrant multimers or degradation products were observed, whereas light chain pairing was visible as a 50 kDa band ((LC) 2 ) in C220S, AC220 in IgG1-IgG3 hinge mutants.
Фиг. 14. Антигенсвязывающий тИФА для измерения связывания с c-Met антител против c-Met с мутациями в шарнире. С помощью тИФА было показано, что все мутанты связывают c-Met со сравнимой аффинностью.Fig. 14. Antigen-binding ELISA to measure c-Met binding of anti-c-Met antibodies with hinge mutations. Using ELISA, all mutants were shown to bind c-Met with comparable affinities.
Фиг. 15. Фосфорилирование c-Met как регистрируемая величина агонистической активности антител против c-Met. На фиг. 15 представлены результаты вестерн-блоттинга лизатов клеток А549; мембраны окрашены антителами против фосфорилированного c-met, общего c-Met или β-актина.Fig. 15. Phosphorylation of c-Met as a recorded value of the agonistic activity of antibodies against c-Met. In fig. Figure 15 shows the results of Western blotting of A549 cell lysates; membranes are stained with antibodies against phosphorylated c-met, total c-Met, or β-actin.
Фиг. 16. Анализ пролиферации с использованием клеток NCI-H441. Клеточную массу определяли через 7 дней инкубации в присутствии антитела или контролей, и выражали в виде процента относительно необработанных образцов (для которых устанавливали 100%).Fig. 16. Proliferation assay using NCI-H441 cells. Cell mass was determined after 7 days of incubation in the presence of antibody or controls and was expressed as a percentage relative to untreated samples (which was set to 100%).
Фиг. 17. Анализ жизнеспособности KP4. Тестировали эффект, оказываемый антителами против cMet, на общую жизнеспособность клеток KP4. Способность IgG1-1016-069 снижать жизнеспособность KP4 сохранялась и/или улучшалась путем введения мутаций, которые снижали гибкость антител.Fig. 17. KP4 viability assay. The effect of anti-cMet antibodies on overall KP4 cell viability was tested. The ability of IgG1-1016-069 to reduce KP4 viability was maintained and/or improved by introducing mutations that reduced antibody flexibility.
Фиг. 18. Отрицательная модуляция, измеренная с помощью тИФА в виде уровня суммарного c-Met в лизатах А549. Все варианты антитела (069) сохраняли способность отрицательной модуляции.Fig. 18. Negative modulation measured by ELISA as total c-Met level in A549 lysates. All variants of antibody (069) retained the ability of negative modulation.
Фиг. 19. Анализ ADCC для сравнения антител IgG1-1016-069 с высоким и с низким содержанием фукозы.Fig. 19. ADCC assay to compare high and low fucose IgG1-1016-069 antibodies.
Фиг. 20. Отсутствие связывания антител c-Met с клетками в цельной крови в анализе связывания FACS. Результаты представлены для В-клеток, моноцитов и гранулоцитов.Fig. 20. Lack of c-Met antibody binding to cells in whole blood in FACS binding assay. Results are presented for B cells, monocytes and granulocytes.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
ОпределенияDefinitions
Термин c-Met, при использовании в данном документе, обозначает рецептор фактора роста гепатоцитов (регистрационный номер Genbank NM 000245) и включает любые варианты, изоформы и межвидовые гомологи человеческого c-Met, которые естественным образом экспрессируются клетками или экспрессируются на клетках, трансфецированных геном c-Met.The term c-Met, as used herein, refers to hepatocyte growth factor receptor (Genbank accession number NM 000245) and includes any variants, isoforms, and interspecies homologues of human c-Met that are naturally expressed by cells or expressed on cells transfected with the c gene -Met.
Термин иммуноглобулин обозначает класс структурно родственных гликопротеинов, состоящих из двух пар полипептидных цепей, одной пары легких (L) низкомолекулярных цепей и одной пары тяжелых (Н) цепей, все четыре связаны между собой дисульфидными связями. Структура иммуноглобулинов хорошо охарактеризована. См., например, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Вкратце, каждая тяжелая цепь, как правило, содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначенную в данном документе как VH ИЛИ VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит, как правило, три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит, как правило, вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначенную в данном документе как VL ИЛИ VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит, как правило, один домен, CL. Области VH И VL, которые могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности (или гипервариабельные участки, которые могут быть гипервариабельными по последовательности и/или форме структурно определяемых петель), также их называют областями, отвечающими за комплементарность связывания (CDR), перемежаются участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH И VL, как правило, содержит три CDR и четыре FR, расположенные от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (см., также Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в данной области осуществляется с помощью метода, описанного у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NaThe term immunoglobulin refers to a class of structurally related glycoproteins consisting of two pairs of polypeptide chains, one pair of light (L) chains and one pair of heavy (H) chains, all four linked by disulfide bonds. The structure of immunoglobulins is well characterized. See, for example, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, NY (1989)). Briefly, each heavy chain typically contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH OR VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region typically contains three domains, CH1 , CH2 and CH3. Each light chain typically contains a light chain variable region (abbreviated herein as VL OR VL) and a light chain constant region. The light chain constant region typically contains one domain, CL. The VH and VL regions, which can be further subdivided into hypervariable regions (or hypervariable regions that may be hypervariable in sequence and/or shape of structurally defined loops), also called complementarity-determining regions (CDRs), are interspersed with regions that are more conserved, called framework regions (FR). Each VH and VL typically contains three CDRs and four FRs, arranged from N-terminus to C-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (see also Chothia and Lesk J Mol Biol 196, 901-917 (1987). Typically, numbering of amino acid residues in a given region is done using the method described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Na
- 3 045516 tional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (фразы, такие как нумерация остатка вариабельного домена как у Kabat или согласно Kabat обозначают в данном документе систему нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи). С использованием данной системы нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, что соответствует укорачиванию или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать единичную аминокислотную вставку (остаток 52а согласно Kabat) после остатка 52 VH CDR2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b, и 82с, и т.д. согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может определяться для данного антитела с помощью сравнения областей гомологии последовательности антитела с последовательностью со стандартной нумерацией по Kabat.- 3 045516 National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (phrases such as Kabat or Kabat variable domain residue numbering refer to the numbering system for heavy chain variable domains or light chain variable domains herein). Using this numbering system, the actual linear amino acid sequence of the peptide may contain fewer amino acids or additional amino acids, corresponding to shortening or insertion into the FR or CDR of the variable domain. For example, a heavy chain variable domain may include a single amino acid insertion (residue 52a according to Kabat) after residue 52 of VH CDR2 and inserted residues (e.g., residues 82a, 82b, and 82c, etc. according to Kabat) after residue 82 of FR heavy chains. Kabat residue numbering can be determined for a given antibody by comparing regions of homology between the antibody sequence and a standard Kabat numbering sequence.
В контексте настоящего изобретения термин антитело (AT) обозначает молекулу иммуноглобулина, фрагмент молекулы иммуноглобулина или их производное, которые обладают способностью специфично связываться с антигеном при обычных физиологических условиях, с периодом полужизни, составляющим существенные периоды времени, например, по меньшей мере около 30 мин, по меньшей мере около 45 мин, по меньшей мере около 1 ч, по меньшей мере около 2 ч, по меньшей мере около 4 ч, по меньшей мере около 8 ч, по меньшей мере около 12 ч, около 24 ч или более, около 48 ч или более, около 3, 4, 5, 6, 7 дней или более и т.д., или любой другой соразмерный функционально определенный период (такой как период времени, достаточный для индукции, стимулирования, усиления и/или модуляции физиологического ответа, ассоциированного с антителом, связывающимся с антигеном, и/или период времени, достаточный для антитела для вызова эффекторной активности). Вариабельные области тяжелой и легкой цепей молекулы иммуноглобулина содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител (AT) могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (такие как, эффекторные клетки) и компоненты системы комплемента, такие как C1q, первый компонент классического пути активации системы комплемента. Антитело, связывающее c-Met, также может быть биспецифичным антителом, диателом или подобной им молекулой (описание диател см., например, в PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)). Действительно, биспецифичные антитела, диатела и им подобные, представленные настоящим изобретением, могут связываться с подходящей мишенью дополнительно к участку c-Met. Как указано выше, термин антитело в данном документе, если не указано иное или пока нет очевидного противоречия по контексту, включает фрагменты антитела, которое сохраняет способность специфично связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена с помощью фрагментов полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином антитело, включают (i) фрагмент Fab' или фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL И CH1, ИЛИ моновалентное антитело, описанное в WO2007059782 (Genmab); (ii) фрагменты F(ab')2, двухвалентные фрагменты, включающие два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, по существу состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, по существу состоящий из доменов VL И VH ОДИНОЧНОГО плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который по существу состоит из домена VH И называется также доменным антителом (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90); (vi) верблюжьи антитела или нанотела (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) и (vii) выделенный гипервариабельный участок (CDR). Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL И VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены, с помощью рекомбинантных методов, посредством синтетического линкера, который позволяет им создать отдельную белковую цепь, в которой области VL и VH сливаются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), см. например, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) и Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела охвачены термином антитело, если не упомянуто иное или очевидно не указано в контексте. Хотя такие фрагменты, как правило, включены в обозначение антитела, они все вместе или по отдельности представляют собой уникальные признаки настоящего изобретения, демонстрирующие различные биологические свойства и применимость. Эти и другие применяемые антительные фрагменты в контексте настоящего изобретения обсуждаются далее в данном документе. Также следует понимать, что термин антитело, если не указано иное, также включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (мАТ), антитело-подобные полипептиды, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела, и антительные фрагменты, сохраняющие способность специфического связывания с антигеном (антигенсвязывающие фрагменты), полученные с помощью известных методов, таких как ферментативное расщепление, пептидный синтез и рекомбинантные методы. При продуцировании антитело может обладать любым изотипом.In the context of the present invention, the term antibody (AT) means an immunoglobulin molecule, a fragment of an immunoglobulin molecule or a derivative thereof, which has the ability to specifically bind to an antigen under normal physiological conditions, with a half-life of significant periods of time, for example, at least about 30 minutes, at least about 45 minutes, at least about 1 hour, at least about 2 hours, at least about 4 hours, at least about 8 hours, at least about 12 hours, about 24 hours or more, about 48 h or more, about 3, 4, 5, 6, 7 days or more, etc., or any other proportionate functionally defined period (such as a period of time sufficient to induce, stimulate, enhance and/or modulate a physiological response, associated with the antibody binding to the antigen, and/or a period of time sufficient for the antibody to induce effector activity). The variable regions of the heavy and light chains of the immunoglobulin molecule contain a binding domain that interacts with the antigen. Antibody constant regions (ATs) can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (such as effector cells) and components of the complement system, such as C1q, the first component of the classical complement pathway. The c-Met binding antibody may also be a bispecific antibody, diabody, or the like (for a description of diabodies, see, for example, PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)). Indeed, bispecific antibodies, diabodies and the like provided by the present invention can bind to a suitable target in addition to the c-Met site. As stated above, the term antibody as used herein, unless otherwise indicated or otherwise obvious by context, includes fragments of an antibody that retains the ability to specifically bind an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be achieved using fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed by the term antibody include (i) a Fab' fragment or a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of V L , V H , C L AND CH 1 domains, OR a monovalent antibody described in WO2007059782 (Genmab); (ii) F(ab') 2 fragments, divalent fragments comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment essentially consisting of VH and C H 1 domains; (iv) an Fv fragment consisting essentially of the V L AND VH domains of a SINGLE arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) which essentially consists of a VH AND domain is called also a domain antibody (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90); (vi) camel antibodies or nanobodies (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) and (vii) a dedicated hypervariable region (CDR). Moreover, although the two domains of the Fv fragment, V L and VH, are encoded by separate genes, they can be combined, using recombinant methods, through a synthetic linker that allows them to create a separate protein chain in which the VL and VH regions are fused to form monovalent molecules (known as single chain antibodies or single chain fragment Fv (scFv), see for example Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) and Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)) . Such single chain antibodies are encompassed by the term antibody unless otherwise noted or clearly indicated in the context. Although such fragments are typically included in the antibody designation, they, collectively or individually, constitute unique features of the present invention, demonstrating distinct biological properties and utility. These and other useful antibody fragments in the context of the present invention are discussed later in this document. It should also be understood that the term antibody, unless otherwise noted, also includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs), antibody-like polypeptides such as chimeric antibodies and humanized antibodies, and antibody fragments that retain the ability to specifically bind an antigen (antigen-binding fragments ), obtained using known methods such as enzymatic digestion, peptide synthesis and recombinant methods. When produced, an antibody can be of any isotype.
При использовании в данном документе термин изотип относится к любому классу иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, или IgM), которые кодируются генами константных областей тяжелых цепей.As used herein, the term isotype refers to any class of immunoglobulins (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, or IgM) that are encoded by heavy chain constant region genes.
В контексте настоящего изобретения, термин моновалентное антитело обозначает, что молекула антитела способна к связыванию с одной молекулой антигена, и, таким образом, не способна к перекреIn the context of the present invention, the term monovalent antibody means that the antibody molecule is capable of binding to a single antigen molecule, and thus is not capable of crosstalk.
- 4 045516 стному связыванию с антигенами.- 4 045516 natural binding to antigens.
Антитело, дефицитное по эффекторной функции или антитело с дефицитом эффекторной функции обозначает антитело, которое обладает значительно меньшей или не обладает способностью активировать один или несколько эффекторных механизмов, таких как активация комплемента или связывание с Fc-рецептором. Таким образом, антитела, дефицитные по эффекторной функции, обладают значительно меньшей или не обладают способностью опосредовать антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Примером такого антитела является IgG4.An antibody deficient in effector function or an antibody deficient in effector function refers to an antibody that has significantly less or no ability to activate one or more effector mechanisms, such as complement activation or Fc receptor binding. Thus, antibodies deficient in effector function have significantly less or no ability to mediate antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and/or complement-dependent cytotoxicity (CDC). An example of such an antibody is IgG4.
Антитело, связывающее c-Met представляет собой антитело, описанное выше, которое специфично связывается с антигеном c-Met.A c-Met binding antibody is an antibody described above that specifically binds to a c-Met antigen.
При использовании в данном документе, подразумевается, что термин человеческое антитело включает антитела, содержащие вариабельные и константные области, выделенные из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулинов. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими зародышевыми последовательностями иммуноглобулинов (например, мутации, введенные неспецифическим или сайтспецифическим мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo). Однако, при использовании в данном документе, подразумевается, что термин человеческое антитело не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мыши, были пересажены в человеческие каркасные последовательности.As used herein, the term human antibody is intended to include antibodies containing variable and constant regions derived from human immunoglobulin germline sequences. Human antibodies of the invention may include amino acid residues not encoded by human immunoglobulin germline sequences (eg, mutations introduced by nonspecific or site-specific mutagenesis in vitro or somatic mutations in vivo). However, as used herein, the term human antibody is not intended to include antibodies in which CDR sequences derived from the germ line of other mammalian species, such as mice, have been transplanted into human framework sequences.
При использовании в данном документе, человеческое антитело выделено из зародышевой последовательности, если антитело получено из системы с использованием человеческих иммуноглобулиновых последовательностей, например, путем иммунизации трансгенной мыши, несущей человеческие иммуноглобулиновые гены, или путем скрининга библиотеки человеческих иммуноглобулиновых генов, и где выбранное человеческое антитело идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой зародышевым иммуноглобулиновым геном, по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 96%, например по меньшей мере на 97%, например по меньшей мере на 98%, или например по меньшей мере на 99%. Как правило, помимо CDR3 тяжелой цепи, человеческое антитело, полученное из конкретной человеческой зародышевой последовательности, будет демонстрировать не более чем 20 аминокислотных отличий, например, не более чем 10 аминокислотных отличий, как например, не более чем 9, 8, 7, 6 или 5, например, не более чем 4, 3, 2, или 1 аминокислотное отличие от аминокислотной последовательности, кодируемой зародышевым иммуноглобулиновым геном.As used herein, a human antibody is isolated from a germline sequence if the antibody is derived from a system using human immunoglobulin sequences, for example, by immunizing a transgenic mouse carrying human immunoglobulin genes or by screening a library of human immunoglobulin genes, and where the selected human antibody is identical in amino acid sequence with the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene by at least 90%, for example at least 95%, for example at least 96%, for example at least 97%, for example at least 98% , or for example at least 99%. Typically, in addition to the heavy chain CDR3, a human antibody derived from a particular human germline sequence will exhibit no more than 20 amino acid differences, such as no more than 10 amino acid differences, such as no more than 9, 8, 7, 6, or 5, for example, no more than 4, 3, 2, or 1 amino acid difference from the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene.
В предпочтительном воплощении антитело по изобретению является выделенным. При использовании в данном документе, подразумевается, что выделенное антитело обозначает антитело, которое по существу свободно от других антител, обладающих отличными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с c-Met, по существу свободно от антител, которые специфично связываются с антигенами, отличными от c-Met). Выделенное антитело, которое специфично связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого c-Met, может, однако, обладать перекрестной реактивностью с другими родственными антигенами, например из других видов (например, с межвидовыми гомологами c-Met). Кроме того, выделенное антитело может быть фактически свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном воплощении настоящего изобретения два или несколько выделенных моноклональных антител, обладающих отличающимися антигенсвязывающими специфичностями, объединяются в хорошо охарактеризованной композиции.In a preferred embodiment, the antibody of the invention is isolated. As used herein, isolated antibody is meant to mean an antibody that is substantially free from other antibodies having different antigen specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds to c-Met is substantially free from antibodies that specifically bind to antigens other than c-Met). An isolated antibody that specifically binds to an epitope, isoform, or variant of human c-Met may, however, be cross-reactive with other related antigens, such as those from other species (eg, interspecies c-Met homologues). In addition, the isolated antibody may be substantially free of other cellular material and/or chemicals. In one embodiment of the present invention, two or more isolated monoclonal antibodies having different antigen binding specificities are combined in a well characterized composition.
При использовании в данном документе в контексте двух или нескольких антител, термин конкурирует с или перекрестно конкурирует с обозначает, что два или несколько антител конкурируют за связывание с c-Met, например, конкурируют за связывание с c-Met в анализе, описанном в примерах данного документа. Для некоторых пар антител конкуренция при анализе в примерах наблюдается только тогда, когда антитело нанесено в виде покрытия на чашку, а другое антитело используется для конкуренции, а не наоборот. Также при использовании в данном документе подразумевается, что термин конкурирует с охватывает такие комбинации антител.When used herein in the context of two or more antibodies, the term competes with or cross-competes with means that two or more antibodies compete for binding to c-Met, for example, compete for binding to c-Met in the assay described in the examples herein document. For some antibody pairs, competition in the example assays is observed only when the antibody is coated on a plate and the other antibody is used to compete, rather than vice versa. Also when used herein, the term is intended to compete with such combinations of antibodies.
Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы, как правило, содержат поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем что связывание с первым, но не последним, нарушается в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп может включать аминокислотные остатки, непосредственно вовлеченные в связывание (также называемые иммунодоминантные компоненты эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые вовлечены в связывание, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим антигенсвязывающим пептидом (другими словами, аминокислотный остаток находится внутри футпринта специфического антигенсвязывающего пептида).The term epitope means a protein determinant capable of specifically binding to an antibody. Epitopes typically contain surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and typically have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Conformational and non-conformational epitopes differ in that binding to the former, but not the latter, is impaired in the presence of denaturing solvents. An epitope may include amino acid residues directly involved in binding (also called immunodominant components of the epitope) and other amino acid residues that are involved in binding, such as amino acid residues that are effectively blocked by the specific antigen binding peptide (in other words, the amino acid residue is within the footprint of the specific antigen binding peptide). peptide).
При использовании в данном документе термин моноклональное антитело относится к препаратуWhen used herein, the term monoclonal antibody refers to the drug
- 5 045516 молекул антитела одной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела демонстрирует уникальную специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Соответственно, термин человеческое моноклональное антитело обозначает антитела, демонстрирующие уникальную специфичность связывания, и которые содержат вариабельные и константные области, выделенные из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулинов. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены с помощью гибридомы, которая является слитой с иммортализованной клеткой В-клеткой, полученной из трансгенного или трансхромосомного животного, отличного от человека, такого как трансгенная мышь, имеющего геном, включающий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека.- 5,045,516 antibody molecules of one molecular composition. The monoclonal antibody composition exhibits unique binding specificity and affinity for a particular epitope. Accordingly, the term human monoclonal antibody refers to antibodies that exhibit unique binding specificity and that contain variable and constant regions derived from human immunoglobulin germline sequences. Human monoclonal antibodies can be produced by a hybridoma that is a fused immortalized B cell derived from a transgenic or transchromosomal non-human animal, such as a transgenic mouse, having a genome comprising a human heavy chain transgene and a human light chain transgene.
При использовании в данном документе, термин связывание в контексте связывания антитела с конкретным антигеном с аффинностью связывания, соответствующей KD около 10-7 М или менее, как например, около 10-8 М или менее, как например, около 10-9 М или менее, около 10-10 М или менее, или около 10-11 М или еще менее, согласно определению, с помощью, например технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в приборе BIAcore 3000 с использованием антигена в качестве лиганда и антитела в качестве аналита, которое связывается с конкретным антигеном с аффинностью, соответствующей KD, которая по меньшей мере в десять раз ниже, например, в 100 раз ниже, например, по меньшей мере, в 1000 раз ниже, например, по меньшей мере, в 10000 раз ниже, например по меньшей мере в 100000 раз ниже, чем аффинность связывания с неспецифичным антигеном (например, БСА, казеин), отличным от конкретного антигена или близкородственного антигена. Значение, на которое снижается аффинность, зависит от KD антитела, так что когда KD антитела очень низкая (то есть, антитело высокоспецифично), то значение, на которое аффинность к антигену ниже, чем аффинность для неспецифичного антигена, может быть, по меньшей мере, десятикратным.As used herein, the term binding in the context of binding an antibody to a specific antigen with a binding affinity corresponding to a K D of about 10 -7 M or less, such as about 10 -8 M or less, such as about 10 -9 M or less, about 10 -10 M or less, or about 10 -11 M or less, as determined by, for example, surface plasmon resonance (SPR) technology in a BIAcore 3000 instrument using an antigen as a ligand and an antibody as an analyte, which binds to a specific antigen with an affinity corresponding to a K D that is at least ten times lower, for example 100 times lower, for example at least 1000 times lower, for example at least 10,000 times lower, for example, at least 100,000 times lower than the binding affinity for a nonspecific antigen (eg, BSA, casein) other than a specific antigen or closely related antigen. The amount by which affinity is reduced depends on the KD of the antibody, so when the KD of an antibody is very low (that is, the antibody is highly specific), the amount by which the affinity for the antigen is lower than the affinity for a nonspecific antigen may be less than at least tenfold.
Термин kd (с-1), при использовании в данном документе, обозначает константу степени диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. Указанное значение также обозначается в виде kf.The term k d (c -1 ), as used herein, denotes the degree of dissociation constant for a particular antigen-antibody interaction. The specified value is also denoted as kf.
Термин ka (M-1 х с-1), при использовании в данном документе, обозначает константу степени ассоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело.The term k a (M -1 x c -1 ), as used herein, denotes the degree of association constant for a particular antigen-antibody interaction.
Термин KD (М), при использовании в данном документе, обозначает константу равновесной диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело.The term K D (M), as used herein, denotes the equilibrium dissociation constant of a particular antigen-antibody interaction.
Термин KA (М-1), при использовании в данном документе, обозначает константу равновесной ассоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело, которую получают путем деления ka на kd.The term K A (M -1 ), as used herein, refers to the equilibrium association constant of a particular antigen-antibody interaction, which is obtained by dividing k a by kd.
При использовании в данном документе, подразумевается, что термин ингибирует рост (например, в отношении клеток, таких как опухолевые клетки) включает любое измеряемое уменьшение клеточного роста при контакте с антителом, связывающим c-Met, по сравнению с ростом тех же клеток, не контактировавших с антителом, связывающим с-Met, например, ингибирование роста клеточной культуры, по меньшей мере, на величину около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, или 100%. Такое уменьшение клеточного роста может происходить с помощью различных механизмов, например, с помощью фагоцитоза эффекторных клеток, ADCC, CDC, и/или апоптоза.As used herein, the term growth inhibitory (eg, in relation to cells such as tumor cells) is intended to include any measurable reduction in cell growth upon contact with a c-Met binding antibody compared to the growth of the same cells not exposed with a c-Met binding antibody, for example, inhibition of cell culture growth by at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99 %, or 100%. This reduction in cell growth can occur through various mechanisms, such as effector cell phagocytosis, ADCC, CDC, and/or apoptosis.
В настоящем изобретении также предлагаются антитела, включающие функциональные варианты области VL, области VH, или одного или нескольких CDR антител из примеров. Функциональный вариант VL, VH, или CDR, используемых в контексте антитела против c-Met, дает возможность антителу сохранить, по меньшей мере, существенную часть (по меньшей мере около 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) аффинности/авидности и/или специфичности/селективности родительского антитела и в некоторых случаях такое антитело против c-Met может быть ассоциировано с большей аффинностью, селективностью и/или специфичностью, чем родительское антитело.The present invention also provides antibodies comprising functional variants of the V L region, V H region, or one or more of the CDR antibodies of the examples. The functional variant V L , V H , or CDR used in the context of an anti-c-Met antibody allows the antibody to retain at least a substantial portion (at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or greater) of the affinity/avidity and/or specificity/selectivity of the parent antibody and in some cases such anti-c-Met antibody may be associated with greater affinity, selectivity and/or specificity than the parent antibody.
Такие функциональные варианты, как правило, сохраняют существенную идентичность последовательности с родительским антителом. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций в последовательностях (т.е. % гомологии = числу идентичных позиций/общее число позиций х 100), принимая во внимание число пробелов и длину каждого пробела, которые должны вноситься для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, может быть определен, например, с помощью алгоритма Е. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988), который включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы масс остатков РАМ120, с штрафом за удлинение пробела, равным 12, и штрафом за внесение пробела, равным 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с помощью алгоритма Нидлмана и Вунша, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).Such functional variants typically retain substantial sequence identity to the parent antibody. The percentage identity between two sequences is a function of the number of identical positions in the sequences (i.e. % homology = number of identical positions/total number of positions x 100), taking into account the number of gaps and the length of each gap that must be introduced for optimal alignment of the two sequences. The percentage of identity between two nucleotide or amino acid sequences can be determined, for example, using an algorithm by E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988), which is included in the ALIGN program (version 2.0) using the PAM120 residue mass table, with a gap extension penalty of 12 and a gap penalty of 4. Additionally, the percent identity between two amino acid sequences can be determined using the algorithm of Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
Последовательность вариантов CDR может отличаться от последовательности CDR последовательностей родительских антител консервативными заменами; например, по меньшей мере 10, например по меньшей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 из замен в варианте являются консервативными заменами аминокислотных остатков.The sequence of the CDR variants may differ from the CDR sequence of the parent antibody sequences by conservative substitutions; for example, at least 10, such as at least 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 of the substitutions in the variant are conservative substitutions of amino acid residues.
В контексте настоящего изобретения консервативные замены могут определяться с помощью замен внутри классов аминокислот, отраженных в следующей таблице:In the context of the present invention, conservative substitutions can be defined by substitutions within classes of amino acids reflected in the following table:
- 6 045516- 6 045516
Классы аминокислотных остатков для консервативных заменAmino acid residue classes for conservative substitutions
При использовании в данном документе, подразумевается, что термин рекомбинантная клеткахозяин (или просто клетка-хозяин) обозначает клетку, в которую вводится экспрессирующий вектор, например, экспрессирующий вектор, кодирующий антитело по изобретению. Рекомбинантные клеткихозяева включают, например, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки HEK293, клетки NS/0 и лимфоцитарные клетки.As used herein, the term recombinant host cell (or simply host cell) is meant to mean a cell into which an expression vector, such as an expression vector encoding an antibody of the invention, is introduced. Recombinant host cells include, for example, transfectomes such as CHO cells, HEK293 cells, NS/0 cells and lymphocyte cells.
Термин трансгенное животное, отличное от человека обозначает животное, отличное от человека, имеющее геном, включающий один или несколько трансгенов тяжелой и/или легкой цепи человека или включающий трансхромосомы (как интегрированные, так и не интегрированные в естественную геномную ДНК животного), и который способен экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген человеческой легкой цепи и либо трансген человеческой тяжелой цепи, либо трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так что мышь продуцирует человеческие антитела против c-Met, при иммунизации антигеном с-Met и/или клетками, экспрессирующими cMet. Трансген человеческой тяжелой цепи может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных мышей, например, мышей HuMAb, как например, мышей НСо7 или мышей НСо12, или трансген человеческой тяжелой цепи может поддерживаться внехромосомно, как в случае трансхромосомных мышей KM, как описано в WO 02/43478. Похожие мыши, имеющие большой набор человеческих генов AT, включают НСо7 и НСо20 (см., например, WO 2009097006). Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (вместе обозначенные в данном документе как трансгенные мыши) способны продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к данному антигену (таких как IgG, IgA, IgM, IgD и/или IgE), при рекомбинации V-D-J и переключении изотипов. Трансгенное животное, отличное от человека, также может использоваться для продуцирования антител против специфического антигена путем введения генов, кодирующих специфическое антитело, например, путем функционального связывания генов с геном, который экспрессируется в молоке животного.The term transgenic non-human animal means a non-human animal having a genome that includes one or more human heavy and/or light chain transgenes or that includes transchromosomes (whether integrated or not integrated into the natural genomic DNA of the animal), and which is capable of express fully human antibodies. For example, a transgenic mouse may have a human light chain transgene and either a human heavy chain transgene or a human heavy chain transchromosome such that the mouse produces human anti-c-Met antibodies when immunized with c-Met antigen and/or cells expressing cMet. The human heavy chain transgene can be integrated into the mouse chromosomal DNA, as in the case of transgenic mice, such as HuMAb mice, such as HCo7 mice or HCo12 mice, or the human heavy chain transgene can be maintained extrachromosomal, as in the case of transchromosomal KM mice, as described in WO 02/43478. Similar mice having a large repertoire of human AT genes include HCo7 and HCo20 (see, for example, WO 2009097006). Such transgenic and transchromosomal mice (collectively referred to herein as transgenic mice) are capable of producing multiple isotypes of human monoclonal antibodies to a given antigen (such as IgG, IgA, IgM, IgD and/or IgE) through V-D-J recombination and isotype switching. A non-human transgenic animal can also be used to produce antibodies against a specific antigen by introducing genes encoding the specific antibody, for example by operably linking genes to a gene that is expressed in the animal's milk.
Лечение обозначает введение эффективного количества терапевтически активного соединения по настоящему изобретению с целью облегчения, улучшения, купирования или устранения (излечения) симптомов болезненных состояний.Treatment means the administration of an effective amount of a therapeutically active compound of the present invention for the purpose of alleviating, ameliorating, reversing, or eliminating (cure) symptoms of disease states.
Эффективное количество обозначает количество, эффективное в такой дозировке и в течение таких периодов времени, которые необходимы для достижения целевого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела против с-Met, может варьировать согласно таким факторам, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, а также способность антитела против c-Met, вызывать целевой ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое количество, в котором терапевтически полезные эффекты превышают любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела.An effective amount means an amount effective at such dosage and for such periods of time as necessary to achieve the intended therapeutic result. The therapeutically effective amount of the anti-c-Met antibody may vary according to factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual, as well as the ability of the anti-c-Met antibody to elicit a target response in the individual. A therapeutically effective amount is also an amount in which the therapeutically beneficial effects exceed any toxic or harmful effects of the antibody or antibody portion.
Идиотипическое антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела.An idiotypic antibody is an antibody that recognizes unique determinants typically associated with the antigen binding site of the antibody.
Дополнительные аспекты и воплощения изобретенияAdditional Aspects and Embodiments of the Invention
Как описано выше в первом аспекте, изобретение относится к моноклинальному человеческому антителу, которое связывает человеческий c-Met.As described above in the first aspect, the invention relates to a monoclonal human antibody that binds human c-Met.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), или могут быть получены с использование методов рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговой библиотеки антител с помощью методов, описанных например, в Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) и в Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Моноклональные антитела могут быть получены из любого подходящего источника. Таким образом, моноклональные антитела могут быть получены из гибридом, приготовленных из мышиных В-клеток селезенки, полученных из мышей, иммунизированных с использованием антигена, представляющего интерес, например, в форме клеток, экспрессирующих на своей поверхности антиген, или в форме нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, представляющий интерес. Моноклональные антитела также могут быть получены из гибридом, выделенных из экспрессирующих антитело клеток иммунизированных людей или млекопитающих, отличных от человека, таких как крысы, собаки, приматы и т.д.The monoclonal antibodies of the present invention can be produced by the hybridoma method first described by Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), or can be produced using recombinant DNA techniques. Monoclonal antibodies can also be isolated from a phage antibody library using methods described, for example, in Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) and in Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Monoclonal antibodies can be obtained from any suitable source. Thus, monoclonal antibodies can be obtained from hybridomas prepared from murine splenic B cells obtained from mice immunized with the antigen of interest, for example, in the form of cells expressing the antigen on their surface, or in the form of a nucleic acid encoding antigen of interest. Monoclonal antibodies can also be obtained from hybridomas isolated from antibody-expressing cells of immunized humans or non-human mammals such as rats, dogs, primates, etc.
В одном воплощении антитело по изобретению является человеческим антителом. Человеческие моноклональные антитела, направленные против c-Met, могут быть получены с использованием трансIn one embodiment, the antibody of the invention is a human antibody. Human monoclonal antibodies directed against c-Met can be produced using trans
- 7 045516 генных или трансхромосомных мышей, несущих в большей степени части человеческой иммунной системы, а не мышиной. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в данном документе как мыши HuMAb и мыши KM, соответственно, и вместе обозначаются в данном документе как трансгенные мыши.- 7 045516 gene or transchromosomal mice, carrying more parts of the human immune system rather than the murine one. Such transgenic and transchromosomal mice include mice referred to herein as HuMAb mice and KM mice, respectively, and are collectively referred to herein as transgenic mice.
Мышь HuMAb содержит минилокус человеческих иммуноглобулиновых генов, который кодирует последовательности тяжелой цепи (μ и γ) и легкой цепи к иммуноглобулинов, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы цепей μ и к (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856859 (1994)). Соответственно, мыши демонстрируют пониженную экспрессию мышиного IgM или к и, в ответ на иммунизацию, введенные человеческие трансгены тяжелой и легкой цепи подвергаются переключению класса и соматическим мутациям с образованием высокоаффинных человеческих моноклональных антител IgG,K (Lonberg, N. et al. (1994), выше; обзор в Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) и Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). Получение мышей HuMAb подробно описано в Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). См., также US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5789650, US 5877397, US 5661016, US 5814318, US 5874299, US 5770429, US 5545807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 и WO 01/09187.The HuMAb mouse contains the human immunoglobulin gene minilocus, which encodes the immunoglobulin heavy chain (μ and γ) and light chain sequences, together with targeted mutations that inactivate the endogenous μ and κ chain loci (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856859 (1994)). Accordingly, mice exhibit reduced expression of murine IgM or K and, in response to immunization, the introduced human heavy and light chain transgenes undergo class switching and somatic mutations to produce high-affinity human IgG,K monoclonal antibodies (Lonberg, N. et al. (1994) , above; reviewed in Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). The production of HuMAb mice is described in detail in Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). See also US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5789650, US 5877397, US 5661016, US 5814318, US 5874299, US 5770429, US 5545807, WO 98/24 884, WO 94/25585, WO 93/ 1227, WO 92/22645, WO 92/03918 and WO 01/09187.
Мыши НСо7 содержат нарушение JKD в своих эндогенных генах легкой цепи (каппа) (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), и нарушение CMD в своих эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере 1 WO 01/14424), трансген KCo5 человеческой легкой цепи каппа (как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), и трансген НСо7 человеческой тяжелой цепи (как описано в US 5770429).HCo7 mice contain a JKD disruption in their endogenous light chain (kappa) genes (as described in Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), and a CMD disruption in their endogenous heavy chain genes (as described in Example 1 WO 01/14424), the human kappa light chain KCo5 transgene (as described in Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), and the human heavy chain HCo7 transgene (as described in US 5,770,429).
Мыши НСо12 содержат нарушение JKD в своих эндогенных генах легкой цепи (каппа) (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), и нарушение CMD в своих эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере 1 WO 01/14424), трансген KCo5 человеческой легкой цепи каппа (как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), и трансген НСо12 человеческой тяжелой цепи (как описано в примере 2 WO 01/14424).HCo12 mice contain a JKD disruption in their endogenous light chain (kappa) genes (as described in Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), and a CMD disruption in their endogenous heavy chain genes (as described in Example 1 WO 01/14424), the human kappa light chain KCo5 transgene (as described in Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), and the human heavy chain HCo12 transgene (as described in Example 2 of WO 01/14424 ).
В линии мышей KM гомозиготно нарушен эндогенный мышиный ген легкой цепи каппа, как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993), а также гомозиготно нарушен эндогенный мышиный ген тяжелой цепи, как описано в примере 1 WO 01/09187. Данная линия мышей несет трансген человеческой легкой цепи каппа, KCo5, как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Данная линия мышей также несет трансхромосому человеческой тяжелой цепи, состоящую из фрагмента hCF (SC20) хромосомы 14, как описано в WO 02/43478.In the KM mouse strain, the endogenous mouse kappa light chain gene is homozygously disrupted, as described in Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993), and the endogenous mouse heavy chain gene is homozygously disrupted, as described in Example 1 of WO 01 /09187. This mouse strain carries the human kappa light chain transgene, KCo5, as described in Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). This mouse strain also carries a human heavy chain transchromosome consisting of the hCF fragment (SC20) of chromosome 14, as described in WO 02/43478.
Спленоциты из этих трансгенных мышей можно использовать для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела, согласно известным методам.Splenocytes from these transgenic mice can be used to produce hybridomas that secrete human monoclonal antibodies according to known methods.
Кроме того, человеческие антитела по настоящему изобретению или антитела по настоящему изобретению из других видов могут быть идентифицированы посредством методов дисплейного типа, включающих в частности фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомный дисплей и другие методы, хорошо известный в данной области, и полученные в результате молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, такому как созревание аффинности в качестве такого метода, хорошо известного в данной области (см., например, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (фаговый дисплей), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (фаговый дисплей), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (рибосомный дисплей), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (фаговый дисплей), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), CH1swell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), и US 5733743). Если для получения антител, которые не являются человеческими, применяются технологии дисплея, то такие антитела могут быть гуманизированы.In addition, human antibodies of the present invention or antibodies of the present invention from other species can be identified by display methods, including, but not limited to, phage display, retroviral display, ribosomal display, and other methods well known in the art, and the resulting molecules may be subjected to additional maturation, such as affinity maturation, as such a method is well known in the art (see, for example, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (phage display), Vaughan et al. al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (phage display), Hanes and Pluckthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (ribosome display), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (phage display), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russell et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol Reviews 130, 43-68 (1992), CH1swell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), and US 5733743). If display technologies are used to produce antibodies that are not human, then such antibodies can be humanized.
В одном воплощении антитело по изобретению относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, или IgM.In one embodiment, the antibody of the invention is of the IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, or IgM isotype.
В первом основном воплощении антитела по изобретению, антитело конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с иммобилизованным антителом, которое содержит область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:33, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO:37 (024), предпочтительно, где антитело конкурирует более чем за 50%, как, например, более чем за 75% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определению, данному в примере 17.In the first basic embodiment of the antibody of the invention, the antibody competes for binding to soluble cMetECDHis with an immobilized antibody that contains a VH region comprising the sequence SEQ ID NO:33 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO:37 (024), preferably where the antibody competes for more than 50%, such as more than 75% with the specified immobilized antibody, as defined in Example 17.
В следующем воплощении, антитело не конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с антителом, выбранным из группы, состоящей из:In a further embodiment, the antibody does not compete for binding to soluble cMetECDHis with an antibody selected from the group consisting of:
a) иммобилизованного антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 1, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 5 (005);a) an immobilized antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 1 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 5 (005);
b) иммобилизованного антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQb) an immobilized antibody containing a VH region including the sequence SEQ
- 8 045516- 8 045516
ID NO: 17, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 21 (008);ID NO: 17, and containing the VL region including the sequence SEQ ID NO: 21 (008);
c) иммобилизованного антитела, содержащего область VH и область VL антитела 5D5, Иc) an immobilized antibody containing the VH region and the VL region of the 5D5 antibody, AND
d) иммобилизованного антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 49, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 53 (045), предпочтительно, где антитело конкурирует менее чем на 25%, как например, менее чем на 20% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определениям, данным в примере 17.d) an immobilized antibody containing a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 49, and containing a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 53 (045), preferably where the antibody competes by less than 25%, such as by less than 20% with the indicated immobilized antibody, according to the definitions given in Example 17.
В следующем воплощении антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из:In a further embodiment, the antibody binds to the same epitope as the antibody selected from the group consisting of:
a) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 33, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 37 (024);a) an antibody containing a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 33 and containing a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 37 (024);
b) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 65, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 69 (061);b) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 65 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 69 (061);
c) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 73, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 77 (062);c) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 73 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 77 (062);
d) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 81, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 85 (064);d) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 81 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 85 (064);
e) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 89, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 93 (068);e) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 89 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 93 (068);
f) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 97, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 101 (069);f) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 97 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 101 (069);
g) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 113, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 117 (098);g) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 113 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 117 (098);
h) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 121, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 125 (101), иh) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 121 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 125 (101), and
i) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 129, и содержащего область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 133 (181).i) an antibody comprising a VH region comprising the sequence of SEQ ID NO: 129 and a VL region comprising the sequence of SEQ ID NO: 133 (181).
В следующем воплощении антитело содержит область CDR3 из VH, имеющую последовательность, представленную в:In a further embodiment, the antibody comprises the CDR3 region of VH having the sequence shown in:
a) SEQ ID NO: 36 (024);a) SEQ ID NO: 36 (024);
b) SEQ ID NO: 193, как например, область CDR3 из VH, представленную в SEQ ID NO: 68, 76, 84 или 92 (061, 062, 064, 068);b) SEQ ID NO: 193, such as the CDR3 region of VH represented in SEQ ID NO: 68, 76, 84 or 92 (061, 062, 064, 068);
c) SEQ ID NO: 196, как например, область CDR3 из VH, представленную в SEQ ID NO: 100 или 132 (069, 181)c) SEQ ID NO: 196, such as the CDR3 region of VH represented in SEQ ID NO: 100 or 132 (069, 181)
d) SEQ ID NO: 116 (098) илиd) SEQ ID NO: 116 (098) or
e) SEQ ID NO: 201, как например, область CDR3 из VH, представленную в SEQ ID NO: 124 (101).e) SEQ ID NO: 201, such as the CDR3 region of VH shown in SEQ ID NO: 124 (101).
B следующем воплощении антитело содержит:In a further embodiment, the antibody contains:
a) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 34, 185 и 36, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 38, 39 и 206, как например, антитело, которое содержит область VH, включающую последовательности SEQ ID NO: 34, 35 и 36, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 38, 39 и 40, (024);a) a VH region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 34, 185 and 36, and a VL region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 38, 39 and 206, such as an antibody, which contains a VH region comprising the sequences SEQ ID NOs: 34, 35 and 36, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 38, 39 and 40, (024);
b) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 191, 192 и 193, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 78, 79 и 208, как например, антитело, включающее:b) a VH region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 191, 192 and 193, and a VL region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 78, 79 and 208, such as an antibody, including:
a) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 66, 67 и 68, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 70, 71 и 72, (061);a) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 66, 67 and 68, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 70, 71 and 72, (061);
b) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 74, 75 и 76, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO:78, 79 и 80, (062);b) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 74, 75 and 76, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 78, 79 and 80, (062);
c) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 82, 83 и 84, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 86, 87 и 88, (064);c) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 82, 83 and 84, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 86, 87 and 88, (064);
d. область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 90, 91 и 92, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 94, 95 и 96, (068);d. the VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 90, 91 and 92, and the VL region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 94, 95 and 96, (068);
c) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 194, 195 и 196, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 209, 210 и 104, как например, антитело, включающее:c) a VH region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 194, 195 and 196, and a VL region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 209, 210 and 104, such as an antibody, including:
a) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 98, 99 и 100, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 102, 103 и 104, (069), илиa) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 98, 99 and 100, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 102, 103 and 104, (069), or
b) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 130, 131 и 132, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 134, 135 и 136, (181),b) the VH region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 130, 131 and 132, and the VL region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 134, 135 and 136, (181),
d) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 197, 198 и 116, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 118, 119 и 211, как например, антитело, которое содержит область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 114, 115 и 116, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 117, 118 и 120,d) a VH region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 197, 198 and 116, and a VL region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 118, 119 and 211, such as an antibody, which contains the VH region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 114, 115 and 116, and the VL region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 117, 118 and 120,
- 9 045516 (098) или- 9 045516 (098) or
е) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 199, 200 и 201 и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 126, 212 и 128, как например, антитело, которое содержит область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 122, 123 и 124 и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 126, 127 и 128 (101).e) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3 of SEQ ID NOs: 199, 200 and 201 and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3 of SEQ ID NOs: 126, 212 and 128, such as an antibody that contains the region VH, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 122, 123 and 124 and the VL region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 126, 127 and 128 (101).
В следующем воплощении антитело содержит:In a further embodiment, the antibody comprises:
a) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 33, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 37 (024);a) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 33, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 37 (024);
b) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 61, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 69 (061);b) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 61, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 69 (061);
c) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 73, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 77 (062);c) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 73, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 77 (062);
d) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 81, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 85 (064);d) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 81, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 85 (064);
e) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 89, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 93 (068);e) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 89, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 93 (068);
f) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 97, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 101 (069);f) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 97, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 101 (069);
g) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 113, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 117 (098);g) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 113, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 117 (098);
h) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 121, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 125 (101);h) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 121, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 125 (101);
i) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:129, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 133 (181);i) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 129, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 133 (181);
j) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 159 и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 160 (078);j) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 159 and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 160 (078);
k) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 161, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 162 (084);k) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 161, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 162 (084);
i) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 163, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 164 (063);i) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 163, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 164 (063);
m) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 165, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 166 (087);m) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 165, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 166 (087);
n) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 137, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 138 (066);n) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 137, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 138 (066);
о) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 139, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 140 (065);o) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 139, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 140 (065);
р) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 141, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 142 (082);p) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 141, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 142 (082);
q) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 143, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 144 (089), илиq) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 143, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 144 (089), or
r) вариант любого из указанных антител, где указанный вариант предпочтительно содержит по большей мере 1, 2 или 3 аминокислотных модификации, более предпочтительно аминокислотные замены, например консервативные аминокислотные замены в указанных последовательностях.r) a variant of any of said antibodies, wherein said variant preferably contains at least 1, 2 or 3 amino acid modifications, more preferably amino acid substitutions, for example conservative amino acid substitutions in said sequences.
В одном воплощении антитело содержит область VH, включающую CDR3-последовательность SEQ ID NO: 100, и область VL, включающую CDR3-последовательность SEQ ID NO: 104 (069).In one embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the CDR3 sequence of SEQ ID NO: 100 and a VL region comprising the CDR3 sequence of SEQ ID NO: 104 (069).
В одном воплощении антитело содержит область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 98, 99 и 100, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 102, 103 и 104, (069).In one embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 98, 99 and 100, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 102, 103 and 104, (069 ).
В одном воплощении антитело содержит область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:97, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO:101 (069).In one embodiment, the antibody contains a VH region comprising the sequence SEQ ID NO:97 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO:101 (069).
В другом основном воплощении антитело по изобретению:In another basic embodiment, the antibody of the invention:
конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с иммобилизованным антителом, где указанное иммобилизованное антитело содержит область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 9, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 13 (006), предпочтительно, где антитело конкурирует более чем на 50%, как, например, более чем на 75% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определению, данному в примере 17, и не конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с иммобилизованным антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:49, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 53 (045), предпочтительно, где антитело конкурирует менее чем на 50%, например, менее чем на 25%, например, менее чем на 20% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определению, данному в примере 17, и связывает домен SEMA из -Met, предпочтительно, где антитело способно ингибировать связываниеcompetes for binding to soluble cMetECDHis with an immobilized antibody, wherein said immobilized antibody comprises a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 9 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 13 (006), preferably where the antibody competes by more than 50 %, such as, for example, more than 75% with the specified immobilized antibody, as defined in example 17, and does not compete for binding with soluble cMetECDHis with the immobilized antibody containing the VH region comprising the sequence SEQ ID NO:49, and the region VL comprising the sequence SEQ ID NO: 53 (045), preferably where the antibody competes less than 50%, for example less than 25%, for example less than 20% with the specified immobilized antibody, as defined in the example 17, and binds the SEMA domain of -Met, preferably where the antibody is capable of inhibiting binding
- 10 045516- 10 045516
HGF с доменом SEMA с IC50, составляющей менее чем 10 мкг/мл, например менее чем 2 мкг/мл, как описано в примере 9.SEMA domain HGF with an IC50 of less than 10 μg/ml, for example less than 2 μg/ml, as described in Example 9.
В следующем воплощении антитело не конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с иммобилизованным антителом, содержащим область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 33, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 37 (024), предпочтительно, где антитело конкурирует менее чем на 25%, например, менее чем на 20% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определению, данному в примере 17.In a further embodiment, the antibody does not compete for binding to soluble cMetECDHis with an immobilized antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 33 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 37 (024), preferably where the antibody competes by less than 25%, for example, less than 20% with the specified immobilized antibody, as defined in Example 17.
В следующем воплощении антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из:In a further embodiment, the antibody binds the same epitope as the antibody selected from the group consisting of:
a) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 1, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 5 (005);a) an antibody containing a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 1, and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 5 (005);
b) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 9, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 13 (006);b) an antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 9 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 13 (006);
c) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 25, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 29 (022), иc) an antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 25 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 29 (022), and
d) антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 57, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 61 (058).d) an antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 57 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 61 (058).
В следующем воплощении антитело содержит область CDR3 из VH, имеющую последовательность, представленную в:In a further embodiment, the antibody comprises the CDR3 region of VH having the sequence shown in:
a) SEQ ID NO: 181, как например, область CDR3 из VH, представленную в SEQ ID NO: 4 или 12 (005, 006);a) SEQ ID NO: 181, such as the CDR3 region of VH represented in SEQ ID NO: 4 or 12 (005, 006);
b) SEQ ID NO: 28 (022) илиb) SEQ ID NO: 28 (022) or
c) SEQ ID NO: 60 (058).c) SEQ ID NO: 60 (058).
В следующем воплощении антитело содержит:In a further embodiment, the antibody comprises:
a) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 179, 180 и 181, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 6, 7 и 202, как например, антитело, содержащее:a) a VH region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 179, 180 and 181, and a VL region including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 6, 7 and 202, such as an antibody, containing:
a) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 3, 4 и 3, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 6, 7 и 8, (005), илиa) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 3, 4 and 3, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 6, 7 and 8, (005), or
b) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 10, 11 и 12, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 14, 15 и 16, (006) b') область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 26, 184 и 28, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 30, 31 и 205, как например, антитело, содержащее область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 26, 27 и 28, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 30, 31 и 32 (62), илиb) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 10, 11 and 12, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 14, 15 and 16, (006) b' ) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 26, 184 and 28, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 30, 31 and 205, such as an antibody containing the VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 26, 27 and 28, and the VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 30, 31 and 32 (62), or
с) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 189, 190 и 60, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 62, 63 и 207, например, антитело, содержащее область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 58, 59 и 60, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 62, 63 и 64 (058).c) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 189, 190 and 60, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 62, 63 and 207, for example, an antibody containing the VH region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 58, 59 and 60, and the VL region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 62, 63 and 64 (058).
В следующем воплощении, антитело содержит:In a further embodiment, the antibody comprises:
a) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 1, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 5 (005);a) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 1, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 5 (005);
b) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 9, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 13 (006);b) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 9, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 13 (006);
c) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 25, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 29 (022);c) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 25, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 29 (022);
d) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 57, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 61 (058);d) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 57, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 61 (058);
e) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 145, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 146 (031);e) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 145, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 146 (031);
f) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 147, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 148 (007);f) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 147, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 148 (007);
g) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 149, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 150 (011);g) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 149, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 150 (011);
h) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 151, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 152 (017);h) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 151, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 152 (017);
i) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 153, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 154 (025), илиi) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 153, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 154 (025), or
j) вариант любого из указанных антител, где указанный вариант содержит по большей мере 1, 2 или 3 аминокислотных модификации, более предпочтительно аминокислотные замены, например консервативные аминокислотные замены в указанных последовательностях.j) a variant of any of said antibodies, wherein said variant contains at least 1, 2 or 3 amino acid modifications, more preferably amino acid substitutions, for example conservative amino acid substitutions in said sequences.
В другом основном воплощении антитело по изобретениюIn another basic embodiment, the antibody of the invention
- 11 045516 конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с иммобилизованным антителом, где указанное иммобилизованное антитело содержит область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 49, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 53 (045), предпочтительно, где антитело конкурирует более чем на 50%, например, более чем на 75% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определению, данному в примере 17, и антитело не конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с иммобилизованным антителом, где указанное иммобилизованное антитело содержит область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:9, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 13 (006), предпочтительно, где антитело конкурирует менее чем на 25%, как например, менее чем на 20% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определению, данному в примере 17.- 11 045516 competes for binding to soluble cMetECDHis with an immobilized antibody, wherein said immobilized antibody comprises a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 49 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 53 (045), preferably where the antibody competes more less than 50%, such as greater than 75%, with said captive antibody as defined in Example 17, and the antibody does not compete for binding to soluble cMetECDHis with the captive antibody, wherein said captive antibody comprises a VH region comprising the sequence SEQ ID NO:9, and the VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 13 (006), preferably where the antibody competes less than 25%, such as less than 20% with the specified immobilized antibody, as defined in example 17 .
В следующем воплощении антитело не конкурирует за связывание с растворимым cMetECDHis с антителом, выбранным из группы, состоящей из:In a further embodiment, the antibody does not compete for binding to soluble cMetECDHis with an antibody selected from the group consisting of:
a) иммобилизованного антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 17, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 21(008), иa) an immobilized antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 17 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 21(008), and
b) иммобилизованного антитела, содержащего область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 33, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 37 (024), предпочтительно, где антитело конкурирует менее чем на 25%, например, менее чем на 20% с указанным иммобилизованным антителом, согласно определениям, данным в примере 17.b) an immobilized antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 33 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 37 (024), preferably where the antibody competes by less than 25%, for example, by less than 20% with said immobilized antibody as defined in Example 17.
В следующем воплощении антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 49, и включающее область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 53 (045).In a further embodiment, the antibody binds to the same epitope as an antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 49 and comprising a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 53 (045).
В следующем воплощении антитело содержит область CDR3 из VH, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188, например, область CDR3 из VH, представленную в SEQ ID NO: 52 (045).In another embodiment, the antibody comprises a VH CDR3 region having the sequence set forth in SEQ ID NO: 188, for example, the VH CDR3 region set forth in SEQ ID NO: 52 (045).
В следующем воплощении антитело содержит область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 186, 187 и 188, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 54, 55 и 56, например антитело, содержащее область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 50, 51 и 52, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 54, 55 и 56, (045).In a further embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 186, 187 and 188, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3 SEQ ID NO: 54, 55 and 56, for example an antibody, containing a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3 of SEQ ID NOs: 50, 51 and 52, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3 of SEQ ID NOs: 54, 55 and 56, (045).
В следующем воплощении антитело содержит:In a further embodiment, the antibody comprises:
a) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 49, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 53 (045);a) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 49, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 53 (045);
b) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:155, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO:156 (040);b) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO:155, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO:156 (040);
c) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 157, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 158 (039), илиc) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 157, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 158 (039), or
d) вариант любого из указанных антител, где указанный вариант предпочтительно содержит по большей мере 1, 2 или 3 аминокислотных модификации, более предпочтительно аминокислотных замены, таких как консервативные аминокислотные замены в указанных последовательностях.d) a variant of any of said antibodies, wherein said variant preferably contains at least 1, 2 or 3 amino acid modifications, more preferably amino acid substitutions, such as conservative amino acid substitutions in said sequences.
В следующем воплощении антитело связывается с доменом SEMA из c-Met, предпочтительно, если антитело способно ингибировать связывание HGF с доменом SEMA с IC50, составляющей менее чем 10 мкг/мл, например, менее чем 2 мкг/мл, как описано в примере 9.In a further embodiment, the antibody binds to the SEMA domain of c-Met, preferably the antibody is capable of inhibiting the binding of HGF to the SEMA domain with an IC50 of less than 10 μg/ml, for example, less than 2 μg/ml, as described in Example 9.
В другом основном воплощении антитела по изобретению, антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело, содержащее область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:17, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 21 (008), или связывает тот же эпитоп, что и антитело, содержащее область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 41, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 45 (035), или связывает тот же эпитоп, что и антитело, содержащее область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 105, и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 109 (096).In another basic embodiment of an antibody of the invention, the antibody binds the same epitope as an antibody comprising a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 17 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 21 (008), or binds the same epitope the same as an antibody containing a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 41 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 45 (035), or binds the same epitope as an antibody containing a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 105, and the VL region including the sequence SEQ ID NO: 109 (096).
В следующем воплощении антитело содержит область CDR3 из VH, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 183, например, область CDR3 из VH, представленную в SEQ ID NO: 20, 44 или 108 (008, 035, 096).In another embodiment, the antibody comprises a VH CDR3 region having the sequence set forth in SEQ ID NO: 183, for example, a VH CDR3 region set forth in SEQ ID NO: 20, 44, or 108 (008, 035, 096).
В следующем воплощении антитело содержит область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 18, 182 и 183, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 22, 203 и 204, например антитело, содержащее:In a further embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 18, 182 and 183, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 22, 203 and 204, e.g. containing:
a) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 18, 19 и 20, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 22, 23 и 24, (008),a) the VH region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 18, 19 and 20, and the VL region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 22, 23 and 24, (008),
b) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 42,43 и 44, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 46, 47 и 48, (035),b) the VH region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 42,43 and 44, and the VL region, including the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NO: 46, 47 and 48, (035),
с) область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 106, 107 и 108, и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3, SEQ ID NO: 110, 111 и 112,(096).c) a VH region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 106, 107 and 108, and a VL region comprising the sequences CDR1, 2 and 3, SEQ ID NOs: 110, 111 and 112, (096).
В другом воплощении антитело содержит:In another embodiment, the antibody contains:
- 12 045516- 12 045516
а) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 17, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 21 (008);a) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 17, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 21 (008);
b) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 41, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 45 (035);b) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 41, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 45 (035);
c) область VH, включающую последовательность SEQ ID NO: 105, и предпочтительно область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 109 (096); илиc) a VH region comprising the sequence SEQ ID NO: 105, and preferably a VL region comprising the sequence SEQ ID NO: 109 (096); or
d) вариант любого из указанных антител, где указанный вариант предпочтительно содержит по большей мере 1, 2 или 3 аминокислотных модификации, более предпочтительно аминокислотных замены, таких как консервативные аминокислотные замены в указанных последовательностях.d) a variant of any of said antibodies, wherein said variant preferably contains at least 1, 2 or 3 amino acid modifications, more preferably amino acid substitutions, such as conservative amino acid substitutions in said sequences.
В следующем воплощении антитело связывается с клетками А431 с ЕС50, составляющей 10 нМ или менее, как например, с ЕС50 равной 2 нМ или менее, предпочтительно, как определено согласно примеру 13. In a further embodiment, the antibody binds to A431 cells with an EC50 of 10 nM or less, such as an EC50 of 2 nM or less, preferably as determined according to Example 13.
В следующем воплощении, антитело связывается с c-Met с константой аффинности (KD), составляющей 20 нМ или менее, например, 5 нМ или менее, предпочтительно, как определено согласно примеру 14.In a further embodiment, the antibody binds to c-Met with an affinity constant (KD) of 20 nM or less, e.g., 5 nM or less, preferably as determined according to Example 14.
В следующем воплощении антитело связывается с c-Met макаки-резус, предпочтительно, если сигнал связывания антитела с c-Met макаки-резус по меньшей мере в 5 раз превышает сигнал для антитела отрицательного контроля, как определено согласно примеру 15.In a further embodiment, the antibody binds to rhesus c-Met, preferably if the antibody binding signal to rhesus c-Met is at least 5 times greater than the signal for the negative control antibody as determined according to Example 15.
В следующем воплощении, антитело ингибирует связывание HGF с внеклеточным доменом c-Met, предпочтительно, если антитело ингибирует связывание более чем на 40%, как например, более чем на 50%, например, более чем на 60%, например, более чем на 70%, например, более чем на 80%, например, более чем на 90%, как определено согласно примеру 16.In a further embodiment, the antibody inhibits the binding of HGF to the extracellular domain of c-Met, preferably the antibody inhibits binding by more than 40%, such as by more than 50%, for example by more than 60%, for example by more than 70 %, for example more than 80%, for example more than 90%, as determined according to example 16.
Еще в одном воплощении, антитело способно ингибировать жизнеспособность клеток KP4, предпочтительно, если антитело способно ингибировать жизнеспособность более чем на 10%, например, более чем на 25%, например, более чем на 40%, предпочтительно, как описано в примере 19.In yet another embodiment, the antibody is capable of inhibiting the viability of KP4 cells, preferably the antibody is capable of inhibiting viability by more than 10%, e.g., more than 25%, e.g., more than 40%, preferably as described in Example 19.
Форматы антителAntibody formats
В настоящем изобретении предлагаются антагонистические и неантагонистические антитела, связывающие c-Met. Поскольку некоторые антитела действуют антагонистически на клетки-мишени независимо от того, моновалентны они или бивалентны, для других антител при этом функциональный эффект зависит от валентности. Как представлено в примере 19 в данном документе, антитела 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181 (которые все находятся в одной и той же группе перекрестной блокировки, см. пример 17), например, демонстрируют антагонистические свойства в анализе жизнеспособности клеток KP4 независимо от их формата. Антитела 022 и 058, с другой стороны, ведут себя антагонистично в данном анализе в моновалентном формате, но агонистично (или, по меньшей мере, не антагонистично) в бивалентном формате. Таким образом, в зависимости от искомых функциональных свойств для конкретного использования, конкретные антитела могут быть выбраны из набора антител, предлагаемых в настоящем изобретении и/или их формат может быть адаптирован путем изменения валентности.The present invention provides antagonistic and non-antagonistic c-Met binding antibodies. While some antibodies act antagonistically on target cells regardless of whether they are monovalent or bivalent, for other antibodies the functional effect depends on valency. As presented in Example 19 herein, antibodies 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181 (which are all in the same cross-blocking group, see Example 17), for example, exhibit antagonistic properties in analysis of the viability of KP4 cells, regardless of their format. Antibodies 022 and 058, on the other hand, behave antagonistically in this assay in a monovalent format, but are agonistic (or at least not antagonistic) in a bivalent format. Thus, depending on the desired functional properties for a particular use, specific antibodies can be selected from the set of antibodies proposed in the present invention and/or their format can be adapted by changing the valency.
Более того, антитело изобретения может быть антителом любого изотипа. При выборе изотипа, как правило, будут руководствоваться искомыми эффекторными функциями, такими как индукция ADCC. Примерами изотипов являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Может быть использована одна из двух константных областей человеческой легкой цепи, каппа или лямда. При необходимости класс антитела против c-Met настоящего изобретения может быть изменен известными способами. Например, антитело настоящего изобретения, которое изначально было IgM, может быть изменено на класс антитела IgG настоящего изобретения. Кроме того, методы изменения класса могут быть использованы для конвертации одного подкласса IgG в другой, например, с IgG1 на IgG2. Таким образом, эффекторные функции антител настоящего изобретения могут быть изменены при смене изотипа, например, на антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различных терапевтических применений. В одном воплощении антитело настоящего изобретения является антителом IgG1, например, IgG1,K.Moreover, the antibody of the invention can be of any isotype. Isotype selection will typically be guided by the effector functions sought, such as ADCC induction. Examples of isotypes are IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. One of two human light chain constant regions, kappa or lambda, may be used. If necessary, the class of the anti-c-Met antibody of the present invention can be changed by known methods. For example, the antibody of the present invention, which was originally IgM, can be changed to the IgG antibody class of the present invention. Additionally, class change techniques can be used to convert one IgG subclass to another, for example from IgG1 to IgG2. Thus, the effector functions of the antibodies of the present invention can be changed by changing the isotype, for example, to an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE or IgM antibody for various therapeutic applications. In one embodiment, the antibody of the present invention is an IgG1 antibody, for example, IgG1,K.
Отрицательная модуляция, индуцированная антагонистичными антителами, представляет собой механизм действия терапевтических антител против c-Met. Соответственно, в одном аспекте изобретения искомыми являются антитела с пониженными агонистическими свойствами, но с сохранившейся способностью индуцировать отрицательную модуляцию c-Met.Negative modulation induced by antagonistic antibodies is the mechanism of action of therapeutic antibodies against c-Met. Accordingly, in one aspect of the invention, antibodies are sought that have reduced agonistic properties but retain the ability to induce negative modulation of c-Met.
Было обнаружено, что при пониженной конформационной гибкости антител потенциальная остаточная агонистическая активность бивалентных IgG1 антител минимизирована.It was found that with reduced antibody conformational flexibility, the potential residual agonist activity of bivalent IgG1 antibodies was minimized.
Соответственно, в одном воплощении, антитело изобретения было модифицировано так, чтобы сделать его менее гибким, например, посредством мутаций в шарнирной области.Accordingly, in one embodiment, the antibody of the invention has been modified to make it less flexible, for example, through mutations in the hinge region.
Наибольшие конформационные изменения являются результатом гибкости шарнира, благодаря которой доступен широкий диапазон углов Fab-Fc (Ollmann Saphire, Е., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton and LA. Wilson. 2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility. J. Mol. Biol. 319: 9-18). Один из путей уменьшения гибкости Fab-плеча в иммуноглобулинах заключается в предотвращении образования дисульфидных связей между легкой и тяжелой цепью посредством генетической модификации. В естественном антителе IgG1 легкая цепь соThe greatest conformational changes result from the flexibility of the hinge, which allows a wide range of Fab-Fc angles to be accessible (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton and L.A. Wilson. 2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility. J. Mol. Biol. 319: 9-18). One way to reduce the flexibility of the Fab arm in immunoglobulins is to prevent the formation of disulfide bonds between the light and heavy chains through genetic modification. In the natural IgG1 antibody, the light chain is
- 13 045516 единена с тяжелой цепью ковалентно через дисульфидную связь, соединяющую С-концевой цистеин легкой цепи с цистеином в позиции 220 (С220 EU нумерации) в шарнире Fc тяжелой цепи. Либо путем мутации аминокислоты С220 в серин либо любую другую естественную аминокислоту, либо удалением С220, либо путем полного удаления шарнира, либо путем замены шарнира IgG1 на шарнир IgG3, образуется молекула, в которой легкие цепи соединены через их С-концевые цистеины, аналогично ситуации, обнаруженной в человеческом изотипе IgA2m(1). Это приводит к снижению гибкости Fab относительно Fc и, следовательно, уменьшает способность к перекрестному связыванию, как показано в примерах.- 13 045516 is united to the heavy chain covalently through a disulfide bond connecting the C-terminal cysteine of the light chain to the cysteine at position 220 (C220 EU numbering) in the Fc hinge of the heavy chain. Either by mutating the amino acid C220 to serine or any other naturally occurring amino acid, or by removing C220, or by removing the hinge entirely, or by replacing the IgG1 hinge with an IgG3 hinge, a molecule is formed in which the light chains are connected through their C-terminal cysteines, similar to the situation found in the human isotype IgA2m(1). This results in a decrease in the flexibility of the Fab relative to the Fc and therefore reduces the ability to cross-link, as shown in the examples.
Другая стратегия уменьшения гибкости молекулы IgG1 заключается в замене шарнира IgG1 на шарнир IgG2 или IgG2-подобный шарнир (Dangl et al. EMBO J. 1988;7:1989-94). Данная шарнирная область имеет два свойства, отличные от свойств шарнира IgG1, которые, как считается, делают молекулу менее гибкой. Во-первых, по сравнению с шарниром IgG1 шарнир IgG2 на 3 аминокислоты короче. Вовторых, шарнир IgG2 содержит дополнительный цистеин, таким образом, образуется три, вместо двух, дисульфидных мостика внутри тяжелой цепи. В ином случае, может быть введен вариант шарнира IgG1, который имеет сходство с шарниром IgG2. Этот мутант (ТН7А6-9) (WO2010063746) содержит мутацию Т223С и две делеции (K222 и Т225) для образования более короткого шарнира с дополнительным цистеином.Another strategy to reduce the flexibility of the IgG1 molecule is to replace the IgG1 hinge with an IgG2 hinge or an IgG2-like hinge (Dangl et al. EMBO J. 1988;7:1989-94). This hinge region has two properties that are different from those of the IgG1 hinge, which are thought to make the molecule less flexible. First, compared to the IgG1 hinge, the IgG2 hinge is 3 amino acids shorter. Second, the IgG2 hinge contains an additional cysteine, thus forming three, instead of two, disulfide bridges within the heavy chain. Alternatively, a variant IgG1 hinge may be introduced that is similar to the IgG2 hinge. This mutant (TH7A6-9) (WO2010063746) contains the T223C mutation and two deletions (K222 and T225) to produce a shorter hinge with an additional cysteine.
В следующем воплощении антитело изобретения является подтипом IgG1, в котором область шарнира была модифицирована путем:In a further embodiment, the antibody of the invention is an IgG1 subtype in which the hinge region has been modified by:
(i) удаления шарнирной области с последовательностью EPKSCDKTHTCPPCP и ее замены на шарнирную область IgG2 с последовательностью: ERKCCVECPPCP (IgG1 Шарнир-IgG2);(i) removing the hinge region with the sequence EPKSCDKTHTCPPCP and replacing it with an IgG2 hinge region with the sequence: ERKCCVECPPCP (IgG1 Hinge-IgG2);
(ii) удаления в положении 220, так чтобы модифицированная шарнирная область содержала последовательность EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220);(ii) deletion at position 220 such that the modified hinge region contains the sequence EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220);
(iii) замены цистеина в положении 220 на любую другую естественную аминокислоту (X) так, чтобы модифицированная шарнирная область содержала последовательность EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);(iii) replacing the cysteine at position 220 with any other naturally occurring amino acid (X) such that the modified hinge region contains the sequence EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);
(iv) удаления шарнирной области с последовательностью EPKSCDKTHTCPPCP (UniBody IgG1);(iv) deleting the hinge region with the sequence EPKSCDKTHTCPPCP (UniBody IgG1);
(v) удаления шарнирной области с последовательностью EPKSCDKTHTCPPCP и ее замены на шарнирную область IgG3 с последовательностью ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPP CPRCP (IgG1 Шарнир-IgG3); или (vi) замены треонина в положении 223 на цистеин и удаления лизина в положении 222 и треонина в положении 225, так чтобы модифицированная шарнирная область содержала последовательность EPKSCDCHCPPCP (IgG1 TH7A6-9).(v) removing the hinge region with the sequence EPKSCDKTHTCPPCP and replacing it with an IgG3 hinge region with the sequence ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPP CPRCP (IgG1 Hinge-IgG3); or (vi) replacing the threonine at position 223 with a cysteine and removing the lysine at position 222 and the threonine at position 225 such that the modified hinge region contains the sequence EPKSCDCHCPPCP (IgG1 TH7A6-9).
В одном воплощении изобретения антитело изобретения имеет подтип IgG1, в котором область шарнира была модифицирована удалением в позиции 220 таким образом, чтобы модифицированная область шарнира имела последовательность EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220) или заменой цистеина в позиции 220 на любую другую естественную аминокислоту (X), так чтобы модифицированная область шарнира имела последовательность EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);In one embodiment of the invention, the antibody of the invention has an IgG1 subtype in which the hinge region has been modified by deletion at position 220 such that the modified hinge region has the sequence EPKSDKTHTCPPCP (IgG1 AC220) or by replacing the cysteine at position 220 with any other naturally occurring amino acid (X), such that that the modified hinge region has the sequence EPKSXDKTHTCPPCP (IgG1 C220X);
В следующем воплощении антитело изобретения имеет подтип IgG1, в котором область шарнира была модифицирована заменой цистеина в позиции 220 на серин, так чтобы модифицированная область шарнира имела последовательность EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).In a further embodiment, the antibody of the invention is of the IgG1 subtype in which the hinge region has been modified by replacing the cysteine at position 220 with a serine such that the modified hinge region has the sequence EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
В следующем воплощении антитело изобретения имеет подтип IgG2.In a further embodiment, the antibody of the invention is of the IgG2 subtype.
В следующем воплощении в антителе изобретения модифицированы сахара для уменьшения количества фукозы и, таким образом, для усиления ADCC, например, путем добавления соединений в культуральную среду в ходе выработки антител, как описано в US 2009317869 или как описано в van Berkel et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350 или с помощью нокаутных по FUT8 клеток, например, как описано в Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614. В ином случае ADCC может быть оптимизировано с помощью способа, описанного Umana et al. (1999) Nature Biotech 17:176.In a further embodiment, the antibody of the invention has sugars modified to reduce the amount of fucose and thus enhance ADCC, for example by adding compounds to the culture medium during antibody production, as described in US 2009317869 or as described in van Berkel et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350 or using FUT8 knockout cells, for example, as described in Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng 87:614. Alternatively, ADCC can be optimized using the method described by Umana et al. (1999) Nature Biotech 17:176.
В одном воплощении антитело содержит область VH, включающую CDR3-последовательность, SEQ ID NO: 100, и область VL, включающую CDR3-последовательность, SEQ ID NO: 104 (069), подтипа IgG1, в котором область шарнира была модифицирована заменой цистеина в позиции 220 на серин, так чтобы модифицированная шарнирная область имела последовательность EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).In one embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the CDR3 sequence, SEQ ID NO: 100, and a VL region comprising the CDR3 sequence, SEQ ID NO: 104 (069), of the IgG1 subtype in which the hinge region has been modified by replacing a cysteine at the position 220 to serine, so that the modified hinge region has the sequence EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
В одном воплощении антитело содержит область VH, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 98, 99 и 100 и область VL, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 102, 103 и 104 (069) подтипа IgG1, в котором область шарнира была модифицирована заменой цистеина в позиции 220 на серин, так чтобы модифицированная шарнирная область имела последовательность EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).In one embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the CDR1, 2 and 3 sequences of SEQ ID NOs: 98, 99 and 100 and a VL region comprising the CDR1, 2 and 3 sequences of SEQ ID NOs: 102, 103 and 104 (069) of the IgG1 subtype, in which the hinge region was modified by replacing the cysteine at position 220 with a serine, such that the modified hinge region had the sequence EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
В одном воплощении антитело содержит область VH, включающую последовательность SEQ ID NO:97 и область VL, включающую последовательность SEQ ID NO: 101 (069) подтипа IgG1, в котором область шарнира была модифицирована заменой цистеина в позиции 220 на серин, так чтобы модифицированная шарнирная область имела последовательность EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).In one embodiment, the antibody comprises a VH region comprising the sequence SEQ ID NO:97 and a VL region comprising the sequence SEQ ID NO:101 (069) of the IgG1 subtype, in which the hinge region has been modified by replacing the cysteine at position 220 with a serine such that the modified hinge the region had the sequence EPKSSDKTHTCPPCP (IgG1 C220S).
- 14 045516- 14 045516
В различных публикациях продемонстрирована корреляция между сниженным фукозилированием кора и повышенной активностью ADCC in vitro (Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278(5):3466-3473, Umana P. Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17(2): 176-80).Various publications have demonstrated a correlation between reduced core fucosylation and increased ADCC activity in vitro (Shields RL. 2002 JBC; 277:26733-26740, Shinkawa T. 2003 JBC; 278(5):3466-3473, Umana P. Nat Biotechnol. 1999 Feb;17(2):176-80).
В следующем воплощении антитело изобретения было модифицировано для уменьшения фукозилирования кора ниже 10%, например, ниже 5%, что определяется с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии вместе с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD). Данная проверка может быть осуществлена хорошо известными в предшествующем уровне техники способами, например, обработкой кифунензином или получением клеток, отрицательных по FUT8.In a further embodiment, the antibody of the invention has been modified to reduce core fucosylation below 10%, eg below 5%, as determined by high performance anion exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). This test can be carried out by methods well known in the prior art, for example, treatment with kifunensin or obtaining cells negative for FUT8.
В другом воплощении антитело изобретения было сконструировано для усиления активации комплемента, например, как описано в Natsume et al. (2009) Cancer Sci. 100:2411.In another embodiment, the antibody of the invention was designed to enhance complement activation, for example, as described in Natsume et al. (2009) Cancer Sci. 100:2411.
В одном воплощении антитело изобретения является полноразмерным, предпочтительно антителом IgG1, в частности, антителом IgG1, к. В другом воплощении антитело изобретения является фрагментом антитела или одноцепочечным антителом.In one embodiment, the antibody of the invention is a full length, preferably an IgG1 antibody, in particular an IgG1 antibody, k. In another embodiment, the antibody of the invention is an antibody fragment or a single chain antibody.
Фрагменты антител могут быть получены, например, фрагментацией обычными методами, и фрагменты подвергаются скринингу таким же образом, как описано в данном документе для целых антител. Например, фрагменты F(ab')2 могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Полученный фрагмент F(ab')2 может быть обработан для уменьшения дисульфидных мостиков для получения фрагментов Fab'. Фрагменты Fab могут быть получены путем обработки антитела IgG папаином; Фрагменты Fab' могут быть получены расщеплением пепсином антитела IgG. Фрагмент F(ab') также может быть получен связыванием Fab', описанным ниже через тиоэфирную связь или дисульфидную связь. Фрагмент Fab' является фрагментом антитела, полученным расщеплением дисульфидной связи области шарнира F(ab')2. Фрагмент Fab' может быть получен обработкой фрагмента F(ab')2 восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол. Фрагмент антитела также может быть получен экспрессией нуклеиновых кислот, кодирующих такие фрагменты в рекомбинантных клетках (см., например, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Например, химерный ген, кодирующий часть фрагмента F(ab')2, может включать последовательности ДНК, кодирующие домен CH1 и область шарнира Н-цепи, после которых следует кодон остановки трансляции с получением таким образом молекулы фрагмента укороченного антитела.Antibody fragments can be prepared, for example, by fragmentation using conventional methods, and the fragments are screened in the same manner as described herein for whole antibodies. For example, F(ab') 2 fragments can be obtained by treating the antibody with pepsin. The resulting F(ab') 2 fragment can be processed to reduce disulfide bridges to produce Fab' fragments. Fab fragments can be produced by treating an IgG antibody with papain; Fab' fragments can be obtained by pepsin digestion of an IgG antibody. The F(ab') fragment can also be obtained by linking Fab', described below via a thioether bond or a disulfide bond. A Fab' fragment is an antibody fragment produced by cleavage of the disulfide bond of the F(ab')2 hinge region. The Fab' fragment can be prepared by treating the F(ab')2 fragment with a reducing agent such as dithiothreitol. An antibody fragment can also be produced by expressing nucleic acids encoding such fragments in recombinant cells (see, for example, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). For example, a chimeric gene encoding part of an F(ab') 2 fragment may include DNA sequences encoding a CH1 domain and an H-chain hinge region followed by a translation stop codon, thereby producing a truncated antibody fragment molecule.
Как указано выше, в одном воплощении антитело изобретения против c-Met является бивалентным антителом.As stated above, in one embodiment, the anti-c-Met antibody of the invention is a bivalent antibody.
В одном воплощении антитело изобретения против c-Met является моновалентным антителом.In one embodiment, the anti-c-Met antibody of the invention is a monovalent antibody.
В одном воплощении антитело изобретения является фрагментом Fab или одноплечевым антителом таким, как описанное в US 20080063641 (Genentech) или другим моновалентным антителом, например, таким, как описано в WO 2007048037 (Amgen).In one embodiment, the antibody of the invention is a Fab fragment or single-arm antibody such as described in US 20080063641 (Genentech) or another monovalent antibody, for example, such as described in WO 2007048037 (Amgen).
В предпочтительном воплощении, моновалентное антитело имеет структуру, описанную в WO 2007059782 (Genmab) (который включен в данный документ ссылкой), имеющую делецию в области шарнира. Соответственно, в одном воплощении антитело является моновалентным антителом, где указанное антитело против c-Met сконструировано способом, включающим:In a preferred embodiment, the monovalent antibody has the structure described in WO 2007059782 (Genmab) (which is incorporated herein by reference) having a deletion in the hinge region. Accordingly, in one embodiment, the antibody is a monovalent antibody, wherein said anti-c-Met antibody is constructed by a method comprising:
i) обеспечение нуклеотидного конструкта, кодирующего легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанный конструкт содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL выбранного антигенспецифического антитела против c-Met, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (CL) Ig, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VL выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область CL Ig, функционально связаны друг с другом, и где в случае подтипа IgG1, нуклеотидная последовательность кодирующая область CL, была модифицирована так, чтобы область CL не содержала аминокислот, способных образовывать дисульфидные связи или ковалентные связи с другими пептидами, содержащими идентичную области CL аминокислотную последовательность в присутствии поликлонального человеческого IgG или при введении животному или человеку;i) providing a nucleotide construct encoding a light chain of said monovalent antibody, said construct comprising a nucleotide sequence encoding the VL region of a selected antigen-specific anti-c-Met antibody, and a nucleotide sequence encoding a constant region (CL) of an Ig, wherein said nucleotide sequence encoding the region The VL of the selected antigen-specific antibody and said nucleotide sequence encoding the CL region of the Ig are operably linked to each other, and wherein in the case of the IgG1 subtype, the nucleotide sequence encoding the CL region has been modified so that the CL region does not contain amino acids capable of forming disulfide bonds or covalent bonds with other peptides containing an identical amino acid sequence to the CL region in the presence of polyclonal human IgG or when administered to an animal or human;
ii) обеспечение нуклеотидного конструкта, кодирующего тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанный конструкт содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область CH человеческого Ig, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH модифицирована таким образом, чтобы область, соответствующая шарнирной области и, как требует подтип Ig, другие области СН, такие как область СН3, не содержала каких-либо аминокислотных остатков, которые принимают участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных или устойчивых нековалентных межцепных связей тяжелой цепи с другими пептидами, содержащими аминокислотную последовательность идентичную константной области CH человеческого Ig, в присутствии поликлонального человеческого IgG или при введении человеческому существу, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VH выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH указанного IIIg, функционально связаны друг с другом;ii) providing a nucleotide construct encoding the heavy chain of said monovalent antibody, said construct comprising a nucleotide sequence encoding the VH region of the selected antigen-specific antibody and a nucleotide sequence encoding the CH constant region of a human Ig, wherein the nucleotide sequence encoding the CH region is modified such that the region corresponding to the hinge region and, as required by the Ig subtype, other CH regions, such as the CH3 region, did not contain any amino acid residues that are involved in the formation of disulfide bonds or covalent or stable non-covalent heavy chain interchain bonds with other peptides containing an amino acid sequence identical to the CH constant region of a human Ig, in the presence of a polyclonal human IgG or when administered to a human being, wherein said nucleotide sequence encoding the VH region of the selected antigen-specific antibody and said nucleotide sequence encoding the CH region of the specified IIIg are operably linked to each other;
iii) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентногоiii) providing a cellular expression system to produce said monovalent
- 15 045516 антитела;- 15 045516 antibodies;
iv) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (i) и (ii) в клетках клеточной экспрессирующей системы (iii).iv) obtaining said monovalent antibody by co-expression of nucleotide constructs (i) and (ii) in cells of the cellular expression system (iii).
Подобным образом, в одном воплощении антитело против c-Met является моновалентным антителом, которое содержит (i) вариабельную область антитела изобретения, как описано в данном документе или антигенсвязывающую часть указанной области, и (ii) область CH иммуноглобулина или ее фрагмент, включающий участки CH2 и CH3, где область CH или ее фрагмент модифицированы так, чтобы область, соответствующая шарнирному участку, и, если иммуноглобулин не относится к изотипу IgG4, другие участки CH, такие как CH3, не несли никаких аминокислотных остатков, которые были бы не способны образовывать дисульфидные связи с идентичным участком CH или не способны образовывать другие ковалентные или стабильные нековалентные связи между тяжелыми цепями с идентичным участком CH в присутствии поликлонального человеческого IgG.Similarly, in one embodiment, an anti-c-Met antibody is a monovalent antibody that contains (i) a variable region of an antibody of the invention as described herein or an antigen binding portion of said region, and (ii) an immunoglobulin CH region or fragment thereof including CH2 regions and CH3, wherein the CH region or fragment thereof is modified so that the region corresponding to the hinge region, and, if the immunoglobulin is not of the IgG4 isotype, other CH regions, such as CH3, do not carry any amino acid residues that would not be capable of forming disulfide bonds to an identical C H region or are unable to form other covalent or stable non-covalent heavy chain bonds to an identical C H region in the presence of polyclonal human IgG.
В следующем воплощении тяжелая цепь моновалентного антитела против c-Met была модифицирована таким образом, чтобы цельный шарнир был удален.In a further embodiment, the monovalent anti-c-Met antibody heavy chain was modified such that the entire hinge was removed.
В другом дополнительном воплощении, указанное моновалентное антитело является подтипом IgG4, но область СН3 была модифицирована так, чтобы одна или несколько следующих аминокислотных замен были внесены:In another further embodiment, said monovalent antibody is an IgG4 subtype, but the CH3 region has been modified so that one or more of the following amino acid substitutions are made:
Нумерация мутаций СНЗNumbering of SNZ mutations
*KABAT указывает на нумерацию аминокислот согласно Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). EU индекс указывает на нумерацию аминокислот согласно EU индексу как изложено в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).*KABAT indicates amino acid numbering according to Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). EU index indicates amino acid numbering according to the EU index as outlined in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
В следующем воплощении последовательность указанного моновалентного антитела была модифицирована таким образом, чтобы оно не содержало каких-либо акцепторных сайтов для N-связанного гликозилирования.In a further embodiment, the sequence of said monovalent antibody has been modified so that it does not contain any acceptor sites for N-linked glycosylation.
Антитела изобретения против c-Met также включают одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела являются пептидами, в которых области Fv тяжелой и легкой цепей соединены. В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается одноцепочечная Fv (scFv) в которой тяжелая и легкая цепи в Fv антитела против c-Met настоящего изобретения объединены с гибким пептидным линкером (как правило около 10, 12, 15 или большего количества аминокислотных остатков) в одноцепочечном пептиде. Способы получения таких антител описаны, например, в US 4946778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 5879, 5883-1988 (85) and McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если используют один тип VH и VL, бивалентным если два типа VH и VL используют, или поливалентным, если используют больше двух типов VH и VL.The anti-c-Met antibodies of the invention also include single chain antibodies. Single chain antibodies are peptides in which the Fv regions of the heavy and light chains are joined. In one embodiment, the present invention provides a single chain Fv (scFv) in which the heavy and light chains in the Fv of the anti-c-Met antibody of the present invention are combined with a flexible peptide linker (typically about 10, 12, 15 or more amino acid residues) in a single chain peptide . Methods for producing such antibodies are described, for example, in US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 5879, 5883-1988 (85) and McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990) . A single chain antibody may be monovalent if one type of VH and VL is used, bivalent if two types of VH and VL are used, or multivalent if more than two types of VH and VL are used.
В одном воплощении антитело изобретения против c-Met является антителом с дефицитом эффекторной функции. В одном воплощении антитело против c-Met с дефицитом эффекторной функции является стабилизированным антителом IgG4, которое было модифицировано для предотвращения замены Fab-плеча (van der Neut Kolfschoten et al. (2007) Science 317(5844): 1554-7). Примерами подходящих стабилизированных антител IgG4 являются антитела, в которых аргинин в положении 409 в константной области тяжелой цепи человеческого IgG4, который указан по индексу EU как и в Kabat et al., заменен на лизин, треонин, метионин или лейцин, предпочтительно лизин (описанный в WO2006033386 (Kirin)) и/или где область шарнира была модифицирована так, чтобы она содержала последовательность Cys-ProPro-Cys.In one embodiment, the anti-c-Met antibody of the invention is an effector function-deficient antibody. In one embodiment, the effector function-deficient anti-c-Met antibody is a stabilized IgG4 antibody that has been modified to prevent Fab arm replacement (van der Neut Kolfschoten et al. (2007) Science 317(5844): 1554-7). Examples of suitable stabilized IgG4 antibodies are those in which the arginine at position 409 in the heavy chain constant region of human IgG4, which is indicated by the EU index as in Kabat et al., is replaced by lysine, threonine, methionine or leucine, preferably lysine (described in WO2006033386 (Kirin)) and/or where the hinge region has been modified to contain the sequence Cys-ProPro-Cys.
В другом воплощении стабилизированное IgG4 антитело против c-Met является антителом, содержащим тяжелую и легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит константную область человеческого IgG4, имеющую остаток, выбранный из группы, состоящей из Lys, Ala, Thr, Met и Leu в позиции, со- 16 045516 ответствующей 409 и/или остаток выбирают из группы, состоящей из: Ala, Val, Gly, Ile и Leu в позиции, соответствующей 405, и где указанное антитело необязательно включает одну или несколько дополнительных замен, делеций и/или вставок, и где указанное антитело содержит последовательность Cys-ProPro-Cys в области шарнира. Предпочтительно, если указанное антитело содержит остаток Lys или Ala в позиции, соответствующей 409 или область СН3 антитела заменена на область СН3 человеческого IgG1, или человеческого IgG2 или человеческого IgG3. См. также WO 2008145142 (Genmab).In another embodiment, the stabilized anti-c-Met IgG4 antibody is an antibody comprising a heavy and a light chain, wherein said heavy chain comprises a human IgG4 constant region having a residue selected from the group consisting of Lys, Ala, Thr, Met and Leu at the position corresponding to 409 and/or the residue is selected from the group consisting of: Ala, Val, Gly, Ile and Leu at the position corresponding to 405, and wherein said antibody optionally includes one or more additional substitutions, deletions and/or insertions, and wherein said antibody comprises a Cys-ProPro-Cys sequence in the hinge region. Preferably, the antibody contains a Lys or Ala residue at the position corresponding to 409 or the CH3 region of the antibody is replaced by the CH3 region of human IgG1, or human IgG2, or human IgG3. See also WO 2008145142 (Genmab).
В еще одном воплощении стабилизированное IgG4 антитело против c-Met является антителом, содержащим тяжелую и легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит константную область человеческого IgG4, имеющую остаток, выбранный из группы, состоящей из Lys, Ala, Thr, Met и Leu в позиции, соответствующей 409 и/или остаток выбирают из группы, состоящей из Ala, Val, Gly, Ile и Leu в позиции, соответствующей 405, и где указанное антитело необязательно включает одну или несколько дополнительных замен, делеций и/или вставок и где указанное антитело содержит последовательность CysPro-Pro-Cys в области шарнира. Предпочтительно, если указанное антитело содержит остаток Lys или Ala в позиции, соответствующей 409 или область СН3 антитела заменена на область СН3 человеческого IgG1, или человеческого IgG2 или человеческого IgG3.In yet another embodiment, the stabilized anti-c-Met IgG4 antibody is an antibody comprising a heavy and a light chain, wherein said heavy chain comprises a human IgG4 constant region having a residue selected from the group consisting of Lys, Ala, Thr, Met and Leu at position corresponding to 409 and/or the residue is selected from the group consisting of Ala, Val, Gly, Ile and Leu at the position corresponding to 405, and wherein said antibody optionally includes one or more additional substitutions, deletions and/or insertions and wherein said antibody contains sequence CysPro-Pro-Cys in the hinge region. Preferably, the antibody contains a Lys or Ala residue at the position corresponding to 409 or the CH3 region of the antibody is replaced by the CH3 region of human IgG1, or human IgG2, or human IgG3.
В следующем воплощении антитело против c-Met с дефицитом эффекторной функции является антителом не IgG4 типа, например, IgG1, IgG2 или IgG3, которые были мутированы таким образом, чтобы способность опосредовать эффекторые функции, такие как ADCC, была снижена или даже устранена. Такие мутации описаны, например, у Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(21:1129-1138 (2006) and Hezareh M, J Virol.; 75(24): 12161-12168(2001).In a further embodiment, the effector function-deficient anti-c-Met antibody is a non-IgG4 antibody, such as IgG1, IgG2, or IgG3, that has been mutated such that the ability to mediate effector functions such as ADCC is reduced or even eliminated. Such mutations are described, for example, in Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(21:1129-1138 (2006) and Hezareh M, J Virol.; 75(24): 12161-12168(2001).
КонъюгатыConjugates
В следующем воплощении в настоящем изобретении предлагается антитело против c-Met, конъюгированное с терапевтической составляющей, такой как цитотоксин, химиотерапевтическое лекарственное средство, иммуносупрессант или радиоизотоп. Такие конъюгаты называются в данном документе иммуноконъюгатами. Иммуноконъюгаты, которые включают один или большее количество цитотоксинов называются иммунотоксинами.In a further embodiment, the present invention provides an anti-c-Met antibody conjugated to a therapeutic moiety, such as a cytotoxin, a chemotherapeutic drug, an immunosuppressant, or a radioisotope. Such conjugates are referred to herein as immunoconjugates. Immunoconjugates that include one or more cytotoxins are called immunotoxins.
Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который отрицательно сказывается на клетках (например, убивает их). Подходящие терапевтические агенты для формирования иммуноконъюгатов настоящего изобретения, включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин-дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, декарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин, кладрибин), алкилирующие агенты (такие, как мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, дакарбазин (DTIC), прокарбазин, митомицин С, цисплатин и другие производные платины, такие как карбоплатин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, даунорубицин (ранее дауномицин), доксорубицин, идарубицин, митрамицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин, антрамицин (АМС)), токсин дифтерии и связанные с ними молекулы (такие как цепь дифтерии А и их активные фрагменты и гибридные молекулы), токсин рицин (например, рицин или дегликозилированная цепь А рицина), холерный токсин, шигатоксин-подобный токсин (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT токсин, С3 токсин, шигатоксин, коклюшный токсин, столбнячный токсин, соевый ингибитор протеазы Баумана-Бирка, экзотоксин Pseudomonas, алорин, сапорин, модеццин, геланин, цепь абрина А, цепь моддецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolacca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор Momordica Charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин и эномицин. Другие подходящие конъюгированные молекулы включают рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, стафилококковый энтеротоксин-А, антивирусный белок лаконоса, дифтерийный токсин и эндотоксин псевдомонас. См., например, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) and Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Терапевтические агенты, которые могут быть введены в комбинации с антителом настоящего изобретения против c-Met, как описано где либо еще в данном документе, также могут быть кандидатами для терапевтических составляющих, применимых при конъюгации антитела настоящего изобретения.A cytotoxin or cytotoxic agent includes any agent that has an adverse effect on cells (eg, kills them). Suitable therapeutic agents for forming the immunoconjugates of the present invention include taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracine-dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol and puromycin, antimetabolites (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, fludarabine, 5-fluorouracil, decarbazine, hydroxyurea, asparaginase, gemcitabine, clad ribin), alkylating agents (such as mechlorethamine, thiotepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU), lomustine (CCNU), cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, dacarbazine (DTIC), procarbazine, mitomycin C, cisplatin and other platinum derivatives such as carboplatin ), antibiotics (eg, dactinomycin (formerly actinomycin), bleomycin, daunorubicin (formerly daunomycin), doxorubicin, idarubicin, mithramycin, mitomycin, mitoxantrone, plicamycin, anthramycin (AMC)), diphtheria toxin and related molecules (such as diphtheria chain A and their active fragments and hybrid molecules), ricin toxin (for example, ricin or deglycosylated ricin A chain), cholera toxin, Shiga toxin-like toxin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toxin, C3 toxin, Shiga toxin, pertussis toxin, tetanus toxin, soybean Baumann-Birk protease inhibitor, Pseudomonas exotoxin, alorin, saporin, modescine, gelanin, abrin A chain, moddecin chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, diantine proteins, Phytolacca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S), Momordica Charantia inhibitor, curcin, crotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomycin and enomycin. Other suitable conjugated molecules include ribonuclease (RNase), DNase I, staphylococcal enterotoxin-A, sweet potato antiviral protein, diphtheria toxin and pseudomonas endotoxin. See, for example, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) and Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Therapeutic agents that can be administered in combination with the anti-c-Met antibody of the present invention, as described elsewhere herein, may also be candidates for therapeutic moieties useful in conjugating the antibody of the present invention.
В другом воплощении антитело против c-Met изобретения включает конъюгированную нуклеиновую кислоту или молекулу, ассоциированную с нуклеиновой кислотой. В одном из таких аспектов настоящего изобретения конъюгированной нуклеиновой кислотой является цитотоксическая рибонуклеаза, антисмысловая нуклеиновая кислота, ингибирующая молекула РНК (например, молекула миРНК) или иммуностимулирующая нуклеиновая кислота (например, молекула ДНК, содержащая иммуностимулирующий CpG-мотив). В другом воплощении антитело против c-Met изобретения конъюгировано с аптамером или рибозимом.In another embodiment, the anti-c-Met antibody of the invention includes a conjugated nucleic acid or a molecule associated with a nucleic acid. In one such aspect of the present invention, the conjugated nucleic acid is a cytotoxic ribonuclease, an antisense nucleic acid, an inhibitory RNA molecule (eg, an siRNA molecule), or an immunostimulatory nucleic acid (eg, a DNA molecule containing an immunostimulatory CpG motif). In another embodiment, the anti-c-Met antibody of the invention is conjugated to an aptamer or ribozyme.
В одном воплощении предлагаются антитела против c-Met, содержащие одну или несколько радиоактивно меченных аминокислот. Радиоактивно меченное антитело против c-Met может быть использовано как в диагностических так и терапевтических целях (конъюгация с радиоактивно меченными молекуIn one embodiment, anti-c-Met antibodies are provided containing one or more radiolabeled amino acids. Radiolabeled anti-c-Met antibody can be used for both diagnostic and therapeutic purposes (conjugation with radiolabeled molecules
- 17 045516 лами является другой возможной особенностью). Неограничивающие примеры меток для полипептидов включают 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс и 1251, 1311 и 186Re.- 17 045516 lami is another possible feature). Non-limiting examples of tags for polypeptides include 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc and 1251, 1311 and 186Re.
Антитела против c-Met также могут быть химически модифицированы ковалентной конъюгацией с полимером, например, для увеличения их периода полужизни в кровотоке. Примерные полимеры и способы прикрепления их к полипептидам, иллюстрированы например, в US 4766106, US 4179337, US 4495285 и US 4609546. Дополнительные полимеры включают полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (ПЭГ) (например, ПЭГ с молекулярной массой от около 1000 до около 40 000, например, от около 2000 до около 20 000).Antibodies against c-Met can also be chemically modified by covalent conjugation to a polymer, for example, to increase their half-life in the bloodstream. Exemplary polymers and methods for attaching them to polypeptides are illustrated, for example, in US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 and US 4,609,546. Additional polymers include polyoxyethylated polyols and polyethylene glycol (PEG) (for example, PEG with a molecular weight of about 1000 to about 40,000, for example, from about 2000 to about 20,000).
Для конъюгирования антитела против c-Met с конъюгируемой молекулой(ами), такой как те, что описаны выше, может быть использован любой способ, известный в данной области, включая способы, описанные Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Такие антитела могут быть получены химическим конъюгированием другой составляющей с N-концевой стороной или Сконцевой стороной антитела против c-Met или его фрагмента (например, Н- или L-цепи антитела против c-Met) (см., например, Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Такие производные конъюгированного антитела могут быть получены конъюгацией внутренних остатков или Сахаров, где это необходимо. Агенты могут быть спарены либо напрямую, либо не напрямую с антителом против c-Met настоящего изобретения. Одним примером непрямого спаривания со вторым агентом является спаривание посредством спейсера. В одном воплощении, антитело против C-Met настоящего изобретения прикрепляется к хелатору-линкеру, например, тиукситану, который позволяет антителу быть конъюгированным с радиоизотопом.To conjugate an anti-c-Met antibody to conjugated molecule(s), such as those described above, any method known in the art can be used, including those described by Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Such antibodies can be prepared by chemically conjugating another moiety to the N-terminal side or C-terminal side of an anti-c-Met antibody or fragment thereof (e.g., the H or L chain of an anti-c-Met antibody) (see, e.g., Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Such conjugated antibody derivatives can be prepared by conjugation of internal moieties or sugars, where necessary. The agents can be paired either directly or indirectly with the anti-c-Met antibody of the present invention. One example of indirect pairing with a second agent is pairing via a spacer. In one embodiment, the anti-C-Met antibody of the present invention is attached to a chelator linker, such as thiuxitan, which allows the antibody to be conjugated to a radioisotope.
Биспецифические антителаBispecific antibodies
В дополнительном аспекте, изобретение относится к биспецифической молекуле, содержащей первый антигенсвязывающий участок из антитела изобретения против c-Met, как описано в данном документе выше, и второй антигенсвязывающий участок, с различной связывающей специфичностью, такой как связывающая специфичность к человеческой эффекторной клетке, человеческому Fc-рецептору, Тклеточному рецептору, В-клеточному рецептору или связывающей специфичностью к неперекрывающемуся эпитопу c-Met, т.е. биспецифическому антителу в котором первый и второй антигенсвязывающие участки не конкурируют за связывание с c-Met, например, биспецифическое антитело, в котором первый и второй антигенсвязывающие участки не конкурируют за связывание с c-Met, например, при тестировании, описанном в примере 17.In a further aspect, the invention provides a bispecific molecule comprising a first antigen binding region from an anti-c-Met antibody of the invention as described hereinabove, and a second antigen binding region, with different binding specificities, such as binding specificity to a human effector cell, human Fc -receptor, T-cell receptor, B-cell receptor, or binding specificity to a non-overlapping c-Met epitope, i.e. a bispecific antibody in which the first and second antigen-binding regions do not compete for binding to c-Met, for example, a bispecific antibody in which the first and second antigen-binding regions do not compete for binding to c-Met, for example, in the test described in Example 17.
Примерные молекулы биспецифических антител изобретения включают (i) два антитела, одно со специфичностью к c-Met, а второе со специфичностью ко второй мишени, которые конъюгированы вместе, (ii) одиночное антитело, которое имеет одну цепь или плечо, специфичное к c-Met, и вторую цепь или плечо, специфичное ко второй молекуле, и (iii) одноцепочечное антитело, которое имеет специфичность к c-Met и ко второй молекуле. В одном воплощении вторая молекула является антигеном злокачественного новообразования /опухолевым антигеном, таким как онкоэмбриональный антиген (СЕА), простатоспецифический антиген (PSA), RAGE (почечный антиген), а-фетопротеин, CAMEL (CTLраспознаваемый антиген меланомы), СТ антигены (такие как MAGE-B5, -В6, -С2, -С3 и D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE and SAGE), муциновые антигена (например, MUC1, муцин-СА125 и т.п.), ганглиозидные антигены, тирозиназы, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, Ep-CAM или интегрин, ассоциированный с злокачественным новообразованием, такой как α5β3 интегрин. В другом воплощении, вторая молекула является ангиогенным фактором или другим ассоциированным со злокачественными новообразованиями фактором роста, таким как фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, ангиогенин или рецептор любого из них, особенно рецепторы, ассоциированные с прогрессией злокачественных новообразований (например, один из рецепторов HER1-HER4). В одном воплощении биспецифическое антитело настоящего изобретения является диателом.Exemplary bispecific antibody molecules of the invention include (i) two antibodies, one with specificity for c-Met and one with specificity for a second target, that are conjugated together, (ii) a single antibody that has a single chain or arm specific for c-Met , and a second chain or arm specific for the second molecule, and (iii) a single chain antibody that has specificity for c-Met and the second molecule. In one embodiment, the second molecule is a cancer antigen/tumor antigen, such as oncoembryonic antigen (CEA), prostate specific antigen (PSA), RAGE (renal antigen), α-fetoprotein, CAMEL (CTL melanoma antigen), CT antigens (such as MAGE -B5, -B6, -C2, -C3 and D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE and SAGE), mucin antigens (for example, MUC1, mucin-CA125 and etc.), ganglioside antigens, tyrosinases, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, Ep-CAM or cancer associated integrin such as α5β3 integrin. In another embodiment, the second molecule is an angiogenic factor or other cancer-associated growth factor, such as vascular endothelial growth factor, fibroblast growth factor, epidermal growth factor, angiogenin, or a receptor of any of these, especially receptors associated with cancer progression (eg , one of the HER1-HER4 receptors). In one embodiment, the bispecific antibody of the present invention is a diabody.
Нуклеотидные последовательности, вектора и клетки-хозяеваNucleotide sequences, vectors and host cells
В дополнительном аспекте изобретение относится к нуклеотидных последовательностям, таким как последовательности ДНК, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела изобретения.In a further aspect, the invention relates to nucleotide sequences, such as DNA sequences, encoding the heavy and light chains of an antibody of the invention.
В одном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,172, 173, 174, 175, 176, 177 и 178.In one embodiment, the nucleic acid sequence encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 1 67, 168, 169, 170, 171,172, 173, 174, 175, 176, 177 and 178.
В другом конкретном воплощении, последовательность нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VH, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 и 177.In another specific embodiment, the nucleic acid sequence encodes a VH amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 and 177.
В другом конкретном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53,In another specific embodiment, the nucleic acid sequence encodes a VL amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53,
- 18 045516- 18 045516
61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 и 178.61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 and 178.
В следующем аспекте изобретение относится к экспрессирующему вектору, или набору экспрессирующих векторов, кодирующих антитело по изобретению. Тяжелая или легкая цепь антитела может быть закодирована тем же самым вектором или другим вектором.In a further aspect, the invention relates to an expression vector, or set of expression vectors, encoding an antibody of the invention. The antibody heavy or light chain may be encoded by the same vector or by a different vector.
Такие экспрессирующие вектора могут быть использованы для рекомбинантного продуцирования антител изобретения.Such expression vectors can be used to recombinantly produce antibodies of the invention.
В одном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 и 178.In one embodiment, the expression vector of the invention contains a nucleotide sequence encoding one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45 , 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139 , 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 , 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 and 178.
В другом конкретном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей VH, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175 и 177.In another specific embodiment, the expression vector of the invention contains a nucleotide sequence encoding one or more VH amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 , 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 1 73 , 175 and 177.
В другом конкретном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей VL, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 и 178.In another specific embodiment, the expression vector of the invention contains a nucleotide sequence encoding one or more VL amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 , 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 , 176 and 178.
В следующем воплощении экспрессирующий вектор дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область легкой цепи, тяжелой цепи или и легкой, и тяжелой цепей антитела, например, человеческого антитела.In another embodiment, the expression vector further includes a nucleotide sequence encoding a constant region of a light chain, a heavy chain, or both a light and heavy chain of an antibody, such as a human antibody.
Экспрессирующий вектор в контексте настоящего изобретения может быть любым подходящим вектором, включая хромосомный, нехромосомный и синтетический нуклеотидный векторы (нуклеотидная последовательность, содержащая набор элементов контроля экспрессии). Примеры таких векторов включают производные SV40, бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирусы, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговой ДНК, и векторы на основе вирусных нуклеиновых кислот (РНК или ДНК), В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против c-Met, содержит голый ДНК или РНК вектор, включая, например, линейный экспрессирующий элемент (как описано, например, у Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), упакованный нуклеотидный вектор (как описано, например, в US 6077835 и/или WO 00/70087), плазмидный вектор, такой как pBR322, pUC 19/18, или pUC 118/119, нуклеотидный вектор минимального размера midge (как описано, например, в Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), или преципитированный нуклеотидный вектор-конструкт, например, конструкт, преципитированный СаРО4 (как описано, например, в WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), и Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Такие нуклеотидные векторы и их применения хорошо известны в данной области (см. например, US 5589466 и US 5973972).An expression vector in the context of the present invention can be any suitable vector, including chromosomal, non-chromosomal and synthetic nucleotide vectors (a nucleotide sequence containing a set of expression control elements). Examples of such vectors include SV40 derivatives, bacterial plasmids, phage DNA, baculoviruses, yeast plasmids, vectors derived from combinations of plasmids and phage DNA, and viral nucleic acid (RNA or DNA) vectors. In one embodiment, a nucleic acid encoding an antibody against c-Met, contains a naked DNA or RNA vector, including, for example, a linear expression element (as described, for example, by Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), a packaged nucleotide vector (as described, for example, in US 6077835 and/or WO 00/70087), a plasmid vector such as pBR322, pUC 19/18, or pUC 118/119, a midge nucleotide vector (as described, for example, in Schakowski et al., Mol Ther 3 , 793-800 (2001)), or a precipitated nucleotide vector construct, for example a CaPO4-precipitated construct (as described, for example, in WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), and Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Such nucleotide vectors and their uses are well known in the art (see, for example, US 5,589,466 and US 5,973,972).
В одном воплощении, вектор подходит для экспрессии антитела против с-Мус в бактериальной клетке. Примеры таких векторов включают экспрессирующие векторы, такие как BlueScript (Stratagene), векторы pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), векторы рЕТ (Novagen, Мэдисон, Висконсин) и т.п.).In one embodiment, the vector is suitable for expressing an anti-c-Myc antibody in a bacterial cell. Examples of such vectors include expression vectors such as BlueScript (Stratagene), pIN vectors (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET vectors (Novagen, Madison, Wis.), etc.).
Экспрессирующий вектор также может или в ином случае является вектором, подходящим для экспрессии в дрожжевой системе. Может быть использован любой вектор, подходящий для экспрессии в дрожжевой системе. Подходящие вектора включают, без ограничения перечисленным, векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как альфа-фактор, алкоголь оксидаза и PGH (рассмотренные в: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), и Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544(1987)).The expression vector may also be, or otherwise is, a vector suitable for expression in a yeast system. Any vector suitable for expression in a yeast system can be used. Suitable vectors include, but are not limited to, vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase and PGH (reviewed in: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), and Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
Экспрессирующий вектор также может быть или в ином случае является вектором, подходящих для экспрессии в клетках млекопитающих, например, вектор, содержащий глутаминсинтетазу в качестве селективного маркера, такой, как векторы описанные в (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175).The expression vector may also be or otherwise be a vector suitable for expression in mammalian cells, for example a vector containing glutamine synthetase as a selectable marker, such as the vectors described in (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175 ).
Нуклеиновая кислота и/или вектор также может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность секреции/локализации, которая может направлять полипептид, такой как растущая полипептидная цепь, в периплазматическое пространство или в клеточную культуральную среду. Такие последовательности известны в данной области и включают секреционный лидер или сигнальные пептиды.The nucleic acid and/or vector may also contain a nucleotide sequence encoding a secretion/localization sequence that can target a polypeptide, such as a growing polypeptide chain, into the periplasmic space or cell culture medium. Such sequences are known in the art and include secretion leader or signal peptides.
В экспрессирующем векторе изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело против cMet, могут содержать или могут быть ассоциированы с любым подходящим промотором, энхансером и другими элементами облегчающими экспрессию. Примеры таких элементов включают промоторы для сильной экспрессии (например, человеческий CMV IE промотор/энхансер а также промоторы RSV,In the expression vector of the invention, the nucleic acids encoding the anti-cMet antibody may contain or be associated with any suitable promoter, enhancer and other expression facilitating elements. Examples of such elements include promoters for strong expression (e.g., human CMV IE promoter/enhancer and RSV promoters,
- 19 045516- 19 045516
SV40, SL3-3, MMTV и HIV LTR), эффективные последовательности терминации с полиА, и точки начала репликации для плазмидного продукта в Е. coli, ген устойчивости к антибиотику в качестве селективного маркера, и/или обычный участок для клонирования (например, полилинкер). Нуклеиновые кислоты также могут содержать индуцируемый промотор, в отличие от конститутивного промотора, такого как CMV IE.SV40, SL3-3, MMTV and HIV LTR), effective polyA termination sequences, and origins of replication for the plasmid product in E. coli, an antibiotic resistance gene as a selectable marker, and/or a common site for cloning (e.g., polylinker ). The nucleic acids may also contain an inducible promoter, as opposed to a constitutive promoter such as CMV IE.
В одном воплощении экспрессирующий вектор, кодирующий антитело против с-Met, может быть расположен в и/или доставлен в клетку-хозяин или в животное-хозяин посредством вирусного вектора.In one embodiment, an expression vector encoding an anti-c-Met antibody may be located in and/or delivered to a host cell or host animal via a viral vector.
В дополнительном аспекте изобретение относится к рекомбинантной эукариотической или прокариотической клетке-хозяину, такой как трансфектома, которая продуцирует антитело изобретения, определенное в данном документе. Примеры клеток-хозяев включают дрожжевые, бактериальные клетки и клетки млекопитающих, такие как клетки СНО или HEK. Например в одном воплощении в настоящем изобретении предлагается клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, стабильно интегрированную в клеточный геном, который содержит кодирующую последовательность, экспрессирующую антитело против c-Met по настоящему изобретению. В другом воплощении в настоящем изобретении предлагается клетка, содержащая неинтегрированную нуклеиновую кислоту, такую как плазмида, космида, фагемида или линейный экспрессирующий элемент, который содержит кодирующую последовательность, экспрессирующую антитело изобретения против c-Met.In a further aspect, the invention relates to a recombinant eukaryotic or prokaryotic host cell, such as a transfectome, that produces an antibody of the invention as defined herein. Examples of host cells include yeast, bacterial and mammalian cells such as CHO or HEK cells. For example, in one embodiment, the present invention provides a cell containing a nucleic acid stably integrated into the cell genome that contains a coding sequence expressing an anti-c-Met antibody of the present invention. In another embodiment, the present invention provides a cell containing a non-integrated nucleic acid, such as a plasmid, cosmid, phagemid or linear expression element, which contains a coding sequence that expresses an anti-c-Met antibody of the invention.
В дополнительном аспекте изобретение относится к гибридоме, которая продуцирует антитело изобретения, определенное в данном документе. В еще одном дополнительном аспекте, изобретение относится к трансгенному животному, не являющемуся человеком, или растению, содержащему нуклеиновые кислоты, кодирующие человеческую тяжелую и легкую цепь, где животное или растение продуцируют антитело изобретения.In a further aspect, the invention relates to a hybridoma that produces an antibody of the invention as defined herein. In yet another additional aspect, the invention relates to a transgenic non-human animal or plant containing nucleic acids encoding a human heavy and light chain, wherein the animal or plant produces an antibody of the invention.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения антитела изобретения против c-Met, который включает стадии:In a further aspect, the invention relates to a method for producing an anti-c-Met antibody of the invention, which includes the steps of:
a) культивирования гибридомы или клетки-хозяина по изобретению, как описано в данном документе выше, иa) culturing the hybridoma or host cell of the invention as described above herein, and
b) очистки антитела изобретения из культуральной среды.b) purifying the antibody of the invention from the culture medium.
КомпозицииCompositions
В дополнительном главном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело против c-Met, определенное в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.In a further main aspect, the invention provides a pharmaceutical composition comprising an anti-c-Met antibody as defined herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать одно антитело настоящего изобретения или комбинацию различных антител настоящего изобретения.The pharmaceutical composition of the present invention may contain one antibody of the present invention or a combination of different antibodies of the present invention.
Фармацевтические композиции могут быть созданы в соответствии с обычными методами, такими как те, что описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может, например, включать разбавители, наполнители, соли, буферы, детергенты (например, неионный детергент, такой как Tween-20 или Tween-80), стабилизаторы (например, сахара или безбелковые аминокислоты), консерванты, фиксаторы тканей, солюбилизаторы, и/или другие материалы, подходящие для включения в фармацевтическую композицию.Pharmaceutical compositions can be formulated in accordance with conventional methods, such as those described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Pharmaceutical composition of the present invention may, for example, include diluents, excipients, salts, buffers, detergents (eg, nonionic detergent such as Tween-20 or Tween-80), stabilizers (eg, sugars or protein-free amino acids), preservatives, tissue fixatives, solubilizers, and/ or other materials suitable for inclusion in a pharmaceutical composition.
Фармацевтически приемлемые носители включают любой и все подходящие растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонические агенты, антиоксиданты и замедляющие абсорбцию агенты, и т.п., которые физиологически совместимы с соединением настоящего изобретения. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, солевой раствор, фосфатно-буферный солевой раствор, этанол, декстрозу, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси, растительные масла, коллоидальные растворы карбоксиметилцеллюлозы, трагакантовую камедь, и инъекционные органические эфиры, такие как этилолеат, и/или различные буферы. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий для немедленного приема. Правильная текучесть может поддерживаться, например, при применении покрывающих материалов, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий, и с помощью использования ПАВ.Pharmaceutically acceptable carriers include any and all suitable solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, antioxidants and absorption retarding agents, and the like, which are physiologically compatible with the compound of the present invention. Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers that can be used in the pharmaceutical compositions of the invention include water, saline, phosphate-buffered saline, ethanol, dextrose, polyols (such as glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof, vegetable oils, colloidal solutions of carboxymethylcellulose, gum tragacanth, and injectable organic esters such as ethyl oleate, and/or various buffers. Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions or dispersions for immediate administration. Correct flow can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать фармацевтически приемлемые антиоксиданты, например, (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилоксианизол, бутилокситолуол, лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) хелатирующие металлы агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.The pharmaceutical compositions of the present invention may also contain pharmaceutically acceptable antioxidants, for example, (1) water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite and the like; (2) oil-soluble antioxidants such as ascorbyl palmitate, butyloxyanisole, butyloxytoluene, lecithin, propyl gallate, alpha-tocopherol and the like; and (3) metal chelating agents such as citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid, and the like.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать изотонические агенты, такие как сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, глицерин или хлорид натрия в композиThe pharmaceutical compositions of the present invention may also contain isotonic agents such as sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, glycerin or sodium chloride in the composition
- 20 045516 циях.- 20 045516 tions.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать один или несколько адъювантов, подходящих для выбранного пути введения, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты, диспергирующие агенты, консерванты или буферы, которые могут усилить срок хранения или эффективность фармацевтической композиции. Соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут предохранять соединение от быстрого высвобождения, такие как состав с контролируемым высвобождением, включая импланты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Такие носители могут включать желатин, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту отдельно или с воском, или другими материалами, хорошо известными в данной области. Способы приготовления таких составов запатентованы или хорошо известны специалистам в данной области.The pharmaceutical compositions of the present invention may also contain one or more adjuvants suitable for the chosen route of administration, such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, preservatives or buffers, which can enhance the shelf life or effectiveness of the pharmaceutical composition. The compounds may be formulated with carriers that will prevent the compound from being rapidly released, such as controlled release formulations, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Such carriers may include gelatin, glyceryl monostearate, glyceryl distearate, biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid alone or with waxes, or other materials well known in the art. Methods for preparing such compositions are patented or well known to those skilled in the art.
Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены путем включения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. В общем, дисперсии готовят путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсную среду и другие требуемые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, примерами способов приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный требуемый ингредиент из его предварительно стерильно фильтрованного раствора.Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the active compound in the required amount into an appropriate diluent with one or a combination of the ingredients listed above, as required, followed by microfiltration sterilization. In general, dispersions are prepared by introducing the active compound into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and other required ingredients from those listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, examples of preparation methods are vacuum drying and freeze drying (lyophilization), which yield a powder of the active ingredient plus any additional required ingredient from a pre-sterile filtered solution thereof.
Фактические уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях могут варьировать для того чтобы количество активного ингредиента являлось эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретных пациента, композиции и режима введения, без оказания токсичного воздействия на пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от целого ряда фармакокинетических факторов, включая активность определенных композиций, используемых настоящим изобретением, или их амида, путь введения, время введения, скорость выведения определенного используемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, массу, состояние, общий уровень здоровья и предыдущую история болезни подвергаемого лечению пациента и т.п. факторы, хорошо известные в медицине.Actual dosage levels of active ingredients in pharmaceutical compositions may vary so that the amount of active ingredient is effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition, and mode of administration, without causing toxic effects to the patient. The dosage level selected will depend on a number of pharmacokinetic factors, including the potency of the particular compositions used in the present invention or their amide, route of administration, time of administration, elimination rate of the particular compound used, duration of treatment, other drugs, compounds and/or materials used in combination with the particular compositions used, the age, sex, weight, condition, general health level and previous medical history of the patient being treated, and the like. factors well known in medicine.
Фармацевтическая композиция может быть введена любым подходящим путем или способом. В одном воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения вводится парентерально. Словосочетание вводить парентерально используемое в данном документе, означает режимы введения отличные от энтерального или местного введения, обычно инъекцией, и включает, без ограничения перечисленным, эпидермальную, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутритрахеальную, внутрикапсулярную, внутриорбитальную, внутрикардиальную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, внутриспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию или инфузию.The pharmaceutical composition may be administered by any suitable route or method. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention is administered parenterally. The phrase parenterally administered as used herein means modes of administration other than enteral or local administration, usually by injection, and includes, but is not limited to, epidermal, intravenous, intramuscular, intraarterial, intratracheal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural and epigastric injection or infusion.
В одном воплощении фармацевтическую композицию вводят внутривенной или подкожной инъекцией или инфузией.In one embodiment, the pharmaceutical composition is administered by intravenous or subcutaneous injection or infusion.
ПримененияApplications
В дополнительном главном аспекте изобретение относится к антителу изобретения против c-Met для применения в качестве лекарственного средства.In a further main aspect, the invention relates to an anti-c-Met antibody of the invention for use as a drug.
Антитела изобретения против c-Met могут быть использованы в нескольких целях. Конкретно, антитела по изобретению могут быть использованы для лечения различных форм злокачественных новообразований, включая метастатические злокачественные новообразования и невосприимчивые к лечению злокачественные новообразования. Такие злокачественные опухоли могут быть HGF-зависимыми или HGF-независимыми.The anti-c-Met antibodies of the invention can be used for several purposes. Specifically, the antibodies of the invention can be used to treat various forms of cancer, including metastatic cancers and treatment-resistant cancers. Such malignancies may be HGF-dependent or HGF-independent.
В одном воплощении антитела изобретения против c-Met используют при лечении формы злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака груди, рака шейки матки, холангиокарциномы, колоректального рака, рака эндометрия, рака пищевода, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, рака легкого (такого как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)), рака носоглотки, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака желчного пузыря, рака предстательной железы, рака щитовидной железы.In one embodiment, the anti-c-Met antibodies of the invention are used in the treatment of a form of cancer selected from the group consisting of bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, cholangiocarcinoma, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, gastric cancer, head cancer and neck, kidney cancer, liver cancer, lung cancer (such as non-small cell lung cancer (NSCLC)), nasopharyngeal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, prostate cancer, thyroid cancer.
В другом воплощении антитела изобретения против c-Met используют при лечении формы злокачественного новообразования, выбранной из группы, состоящей из остеосаркомы, рабдомиосаркомы и синовиальной саркомы.In another embodiment, the anti-c-Met antibodies of the invention are used in the treatment of a form of malignancy selected from the group consisting of osteosarcoma, rhabdomyosarcoma and synovial sarcoma.
В другом воплощении антитела изобретения против c-Met используют при лечении формы злокачественного новообразования, выбранной из группы, состоящей из саркомы Капоши, лейомиосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы и фибросаркомы.In another embodiment, the anti-c-Met antibodies of the invention are used in the treatment of a form of malignancy selected from the group consisting of Kaposi's sarcoma, leiomyosarcoma, malignant fibrous histiocytoma and fibrosarcoma.
В другом воплощении антитела изобретения против c-Met используют при лечении гематопоэтичеIn another embodiment, the anti-c-Met antibodies of the invention are used in the treatment of hematopoietic
- 21 045516 ских злокачественных опухолей, например злокачественных опухолей, выбранных из группы, состоящей из острого миелогенного лейкоза, Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического миелоидного лейкоза, лимфомы и множественной миеломы.- 21 045516 Chinese malignant tumors, for example malignant tumors selected from the group consisting of acute myelogenous leukemia, adult T-cell leukemia, chronic myeloid leukemia, lymphoma and multiple myeloma.
В дополнительном воплощении антитела изобретения против c-Met используют при лечении неоплазий, выбранных из группы, состоящей из глиобластомы, астроцитомы, меланомы, мезотелиомы и опухоли Вилмса.In a further embodiment, the anti-c-Met antibodies of the invention are used in the treatment of neoplasias selected from the group consisting of glioblastoma, astrocytoma, melanoma, mesothelioma and Wilms tumor.
В дополнительном воплощении антитела изобретения против c-Met используют при лечении MiTопухолей, включающих светлоклеточную саркому (CCS), альвеолярную саркому мягких тканей (ASPS) и ассоциированную с транслокацией почечноклеточную карциному.In a further embodiment, the anti-c-Met antibodies of the invention are used in the treatment of MiT tumors including clear cell sarcoma (CCS), alveolar soft tissue sarcoma (ASPS) and translocation-associated renal cell carcinoma.
В другом воплощении агонистические антитела изобретения против c-Met используют для регуляции выработки цитокинов и индукции мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, например у пациентов с ишемической болезнью сердца (Yang et al. (2009) Clin Exp Pharmacol Physiol. 36:790).In another embodiment, the anti-c-Met agonistic antibodies of the invention are used to regulate cytokine production and induce endothelial progenitor cell mobilization, for example in patients with coronary artery disease (Yang et al. (2009) Clin Exp Pharmacol Physiol. 36:790).
В другом воплощении агонистические антитела изобретения против c-Met используют для ингибирования или улучшения состояния при хронической почечной недостаточности (Mizuno et al. (2008) Front Biosci. 13:7072).In another embodiment, the anti-c-Met agonistic antibodies of the invention are used to inhibit or improve chronic renal failure (Mizuno et al. (2008) Front Biosci. 13:7072).
Аналогично, изобретение относится к способу ингибирования роста и/или пролиферации опухолевой клетки, экспрессирующей c-Met, причем способ включает введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества антитела по изобретению.Likewise, the invention relates to a method of inhibiting the growth and/or proliferation of a tumor cell expressing c-Met, the method comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of an antibody of the invention.
В одно воплощение указанная опухолевая клетка вовлечена в виде злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака груди, рака шейки матки, холангиокарциномы, колоректального рака, рака эндометрия, рака пищевода, рака желудка, рака головы и шеи, рака почки, рака печени, рака легкого, рака носоглотки, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака желчного пузыря, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, синовиальной саркомы, саркомы Капоши, лейомиосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитоксантомы, фибросаркомы, острого миелогенного лейкоза, Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического миелоидного лейкоза, лимфомы, множественной миеломы, глиобластомы, астроцитомы, меланомы, мезотелиомы, опухоли Вилмса.In one embodiment, said tumor cell is involved as a malignancy selected from the group consisting of bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, cholangiocarcinoma, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, gastric cancer, head and neck cancer, kidney cancer , liver cancer, lung cancer, nasopharyngeal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, prostate cancer, thyroid cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, synovial sarcoma, Kaposi's sarcoma, leiomyosarcoma, malignant fibrous histiocytoxanthoma, fibrosarcoma, acute myelogenous leukemia , T-cell leukemia of adults, chronic myeloid leukemia, lymphoma, multiple myeloma, glioblastoma, astrocytoma, melanoma, mesothelioma, Wilms tumor.
Также изобретение относится к применению моноклонального антитела, которое связывает человеческий c-Met, для приготовления лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования, такого как одно из конкретных проявлений злокачественных новообразований, упомянутых выше.The invention also relates to the use of a monoclonal antibody that binds human c-Met for the preparation of a medicament for the treatment of cancer, such as one of the specific manifestations of cancer mentioned above.
В одном воплощении отбор пациентов для лечения с использованием антитела против c-Met, основан на уровне (сверх)экспрессии c-Met и/или HGF на соответствующих опухолевых клетках указанных пациентов.In one embodiment, the selection of patients for treatment using an anti-c-Met antibody is based on the level of (over)expression of c-Met and/or HGF on the respective tumor cells of said patients.
В следующем воплощении способов лечения по настоящему изобретению, эффективность лечения отслеживается в процессе терапии, например в определенные моменты времени путем определения уровня экспрессии c-Met на соответствующих опухолевых клетках.In a further embodiment of the treatment methods of the present invention, the effectiveness of treatment is monitored during therapy, for example at certain time points by determining the level of c-Met expression on the corresponding tumor cells.
Режимы дозировки в вышеуказанных способах лечении и применениях корректируются для обеспечения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может быть введен одиночный болюс, могут быть введены несколько доз в течение периода времени или дозы могут быть пропорционально уменьшены или увеличены в зависимости от потребностей терапевтической ситуации. Парентеральные композиции могут быть составлены в виде единичной лекарственной формы для легкого введения и единообразия доз.Dosage regimens in the above treatments and applications are adjusted to provide the optimal desired response (eg, therapeutic response). For example, a single bolus may be administered, multiple doses may be administered over a period of time, or doses may be proportionally decreased or increased depending on the needs of the therapeutic situation. Parenteral compositions can be formulated in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosage.
Эффективные дозировки и режимы дозировки для антител против c-Met зависят от заболевания или состояния подвергаемого лечению, или могут определяться специалистом в данной области. Типичный неограничивающий интервал для терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению составляет около 0,1-100 мг/кг, например около 0,1-50 мг/кг, например около 0,1-20 мг/кг, как например, около 0,1-10 мг/кг, например около 0,5, около 0,3, около 1, около 3, около 5, или около 8 мг/кг.Effective dosages and dosage regimens for anti-c-Met antibodies depend on the disease or condition being treated, or can be determined by one skilled in the art. A typical non-limiting range for a therapeutically effective amount of a compound of the present invention is about 0.1-100 mg/kg, such as about 0.1-50 mg/kg, such as about 0.1-20 mg/kg, such as about 0. 1-10 mg/kg, for example about 0.5, about 0.3, about 1, about 3, about 5, or about 8 mg/kg.
Врач или ветеринар, являющийся специалистом в данной области, может легко определить и прописать требуемое эффективное количество терапевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с дозировки антитела против c-Met в фармацевтической композиции на уровне ниже, чем требуется для достижения требуемого терапевтического эффекта, с постепенным увеличением дозировки до достижения целевого эффекта. Вообще, подходящая суточная доза композиции по настоящему изобретению будет представлять собой такое количество соединения, которое составляет самую низкую дозу, эффективную для получения терапевтического эффекта. Введение может быть парентеральным, таким как внутривенное, внутримышечное или подкожное введение. В одном воплощении антитела против c-Met могут вводиться путем инфузии с еженедельной дозировкой от 10 до 500 мг/м2, как например, от 200 до 400 мг/м2. Такое введение может повторяться, например, 1-8 раз, например, 3-5 раз. Введение может осуществляться путем непрерывной инфузии в течение периода от 2 до 24 ч, например от 2 до 12 ч. В одном воплощении антитела против c-Met могут быть введены медленной непрерывной инфузией в течение длительного периода, например, более чем за 24 ч, с целью уменьшения токсических побочных эффектов.A physician or veterinarian skilled in the art can readily determine and prescribe the required effective amount of the therapeutic composition. For example, a physician or veterinarian may begin with a dosage of the anti-c-Met antibody in the pharmaceutical composition at a level lower than required to achieve the desired therapeutic effect, and gradually increase the dosage until the target effect is achieved. In general, a suitable daily dosage of a composition of the present invention will be that amount of compound that is the lowest dose effective to produce a therapeutic effect. Administration may be parenteral, such as intravenous, intramuscular or subcutaneous. In one embodiment, anti-c-Met antibodies can be administered by infusion at a weekly dosage of 10 to 500 mg/m 2 , such as 200 to 400 mg/m 2 . Such administration may be repeated, for example, 1-8 times, for example, 3-5 times. Administration may be by continuous infusion over a period of 2 to 24 hours, such as 2 to 12 hours. In one embodiment, anti-c-Met antibodies may be administered by slow continuous infusion over a long period, such as over 24 hours, with to reduce toxic side effects.
- 22 045516- 22 045516
В одном воплощении, антитела против c-Met, могут быть введены с еженедельной дозировкой от 250 до 2000 мг, как например, 500 мг, 700 мг, 1000 мг, 1500 мг, 2000 мг или 300 мг, в течение до 8 раз, например от 4 до 6 раз. Такой режим может повторяться один или более раз по необходимости, например, через 6 или 12 месяцев. Дозировка может быть определена или урегулирована путем измерения количества соединения по настоящему изобретению в крови при введении путем, например, забора биологического образца и использования антиидиотипических антител, мишенью которых является антигенсвязывающая область антител изобретения против c-Met.In one embodiment, anti-c-Met antibodies may be administered at a weekly dosage of 250 to 2000 mg, such as 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg, 2000 mg, or 300 mg, for up to 8 times, e.g. from 4 to 6 times. This regimen can be repeated one or more times as necessary, for example after 6 or 12 months. The dosage can be determined or adjusted by measuring the amount of a compound of the present invention in the blood upon administration by, for example, collecting a biological sample and using anti-idiotypic antibodies that target the antigen binding region of the anti-c-Met antibodies of the invention.
В одном воплощении антитела против c-Met могут быть введены поддерживающей терапией, например, один раз в неделю в течение 6 месяцев или больше.In one embodiment, anti-c-Met antibodies can be administered maintenance therapy, for example, once a week for 6 months or more.
Антитела против c-Met также могут быть введены профилактически для уменьшения риска развития злокачественного новообразования, задержки наступления события в прогрессии злокачественного новообразования, и/или уменьшения риска рецидива при ремиссии злокачественного новообразования.Antibodies against c-Met may also be administered prophylactically to reduce the risk of developing a cancer, delay the onset of an event in the progression of a cancer, and/or reduce the risk of relapse when the cancer is in remission.
Антитела против c-Met также могут быть введены в комбинаторной терапии, т.е. комбинации с другими терапевтическими агентами, релевантными заболеванию или состоянию, подвергаемому лечению. Соответственно, в одном воплощении антитело-содержащее лекарственное средство находится в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, например, цитотоксическим, химиотерапевтическим или антиангиогенным агентом.Antibodies against c-Met can also be administered in combinatorial therapy, i.e. combinations with other therapeutic agents relevant to the disease or condition being treated. Accordingly, in one embodiment, the antibody-containing drug is in combination with one or more additional therapeutic agents, for example, a cytotoxic, chemotherapeutic or antiangiogenic agent.
Такое объединенное введение может быть одновременным, раздельным или последовательным. Для одновременного введения агенты могут быть введены в виде одной композиции или в виде раздельных композиций, по необходимости. В настоящем изобретении, таким образом, предлагаются способы лечения заболевания, в которое вовлечены клетки, экспрессирующие c-Met, как описано выше, где способы включают введение антитела против c-Met по настоящему изобретению, объединенного с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, как описано ниже.Such combined administration may be simultaneous, separate or sequential. For simultaneous administration, the agents may be administered as a single composition or as separate compositions, as appropriate. The present invention therefore provides methods for treating a disease involving c-Met expressing cells as described above, wherein the methods comprise administering an anti-c-Met antibody of the present invention combined with one or more additional therapeutic agents as described below.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается способ лечения расстройства, в которое вовлечены клетки, экспрессирующие c-Met, в объекте, где способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против c-Met по настоящему изобретению, и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента нуждающемуся в этом объекту.In one embodiment, the present invention provides a method of treating a disorder that involves c-Met expressing cells in a subject matter, wherein the method includes administering a therapeutically effective amount of an anti-c-Met antibody of the present invention, and at least one additional therapeutic agent to a patient in need of this object.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, где способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против c-Met по настоящему изобретению, и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента нуждающемуся в этом объекту.In one embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing cancer, wherein the method comprises administering a therapeutically effective amount of an anti-c-Met antibody of the present invention, and at least one additional therapeutic agent, to a subject in need thereof.
В одном воплощении такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из антиметаболита, такого как метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, декарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин или кладрибин.In one embodiment, such additional therapeutic agent may be selected from an antimetabolite such as methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, fludarabine, 5-fluorouracil, decarbazine, hydroxyurea, asparaginase, gemcitabine, or cladribine.
В другом воплощении, такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из алкилирующего агента, такого как мехлореамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусулфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, декарбазин (DTIC), прокарбазин, митомицин С, цисплатин и других платиновых производных, таких как карбоплатин.In another embodiment, such additional therapeutic agent may be selected from an alkylating agent such as mechloroamine, thiotepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU), lomustine (CCNU), cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, decarbazine (DTIC), procarbazine, mitomycin C, cisplatin and other platinum derivatives such as carboplatin.
В другом воплощении такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из антимитотического агента, такого как таксаны, например доксетацель и паклитаксель, и алколоиды барвинка, например, виндезин, викристин, винбластин и винорелбин.In another embodiment, such additional therapeutic agent may be selected from an antimitotic agent such as taxanes, eg doxetacel and paclitaxel, and vinca alkaloids, eg vindesine, vicristine, vinblastine and vinorelbine.
В другом воплощении такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из ингибиторов топоизомераз, такого как топотекан или иринотекан, или цитостатического лекарственного средства, такого как этопозид и тенипозид.In another embodiment, such additional therapeutic agent may be selected from a topoisomerase inhibitor such as topotecan or irinotecan, or a cytostatic drug such as etoposide and teniposide.
В другом воплощении такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из ингибиторов фактора роста, такого как ингибитор ErbB1 (EGFR) (такой как антитело против EGFR, например, залутумумаб, цетуксимаб, панитумумаб или нимотузумаб или другие ингибиторы EGFR, такие как гефитиниб или ерлотиниб), ингибитор ErbB2 (Her2/neu) (такой как антитело против HER2, например, трастузумаб, трастузумаб DMI или пертузумаб) или ингибитор как EGFR, так и HER2, такой как лапатиниб).In another embodiment, such additional therapeutic agent may be selected from a growth factor inhibitor, such as an ErbB1 (EGFR) inhibitor (such as an anti-EGFR antibody, e.g. zalutumumab, cetuximab, panitumumab or nimotuzumab or other EGFR inhibitors such as gefitinib or erlotinib), an ErbB2 (Her2/neu) inhibitor (such as an anti-HER2 antibody such as trastuzumab, trastuzumab DMI or pertuzumab) or an inhibitor of both EGFR and HER2 such as lapatinib).
В другом воплощении такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из ингибитора тирозинкиназы, такого как иматиниб (Glivec, Gleevec STI571) или лапатиниб, PTK787/ZK222584.In another embodiment, such additional therapeutic agent may be selected from a tyrosine kinase inhibitor such as imatinib (Glivec, Gleevec STI571) or lapatinib, PTK787/ZK222584.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается способ лечения расстройства, в которое вовлечены клетки, экспрессирующие c-Met, в объекте, где способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против c-Met по настоящему изобретению, и, по меньшей мере, одного ингибитора ангиогенеза, неоваскуляризаии и/или другой васкуляризации, нуждающемуся в этом объекту.In one embodiment, the present invention provides a method of treating a disorder involving c-Met expressing cells, wherein the method comprises administering a therapeutically effective amount of an anti-c-Met antibody of the present invention, and at least one angiogenesis inhibitor, neovascularization and/or other vascularization in need of this object.
Примерами таких ингибиторов ангиогенеза являются ингибиторы урокиназы, ингибиторы матриксных металлопротеаз (такие как маримастат, Неовастат, BAY 12-9566, А. Г. 3340, BMS-275291 и т.п.), ингибиторы миграции и пролиферации эндотелиальных клеток (такие, как TNP-470, скваламин, 2метоксиэстрадиол, комбретастатины, эндостатин, ангиостатин, пеницилламин, SCH66336 (ScheringPlough Corp, Меэдисон, Нью-Джерси), R115777 (Янссен Фармацевтика, Inc, Титусвилль, Нью-Джерси) иExamples of such angiogenesis inhibitors are urokinase inhibitors, matrix metalloprotease inhibitors (such as marimastat, Neovastat, BAY 12-9566, A.G. 3340, BMS-275291, etc.), inhibitors of endothelial cell migration and proliferation (such as TNP -470, squalamine, 2methoxyestradiol, combretastatins, endostatin, angiostatin, penicillamine, SCH66336 (ScheringPlough Corp, Meedison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceuticals, Inc, Titusville, NJ) and
- 23 045516 подобные агенты), антагонисты ангиогенных факторов роста (например, такие как ZD6474, SU6668, антитела против ангиогенных агентов и/или их рецепторов (такие как VEGF (например, бевацизумаб), bFGF, и ангиопоэтин-1), талидомид, аналоги талидомида (например, СС-5013), 5416 Sugen, SU5402, антиангиогенный рибозим (например, ангиозим), интерферон (например, интерферон а2а), сурамин и т.п.), ингибиторы киназы VEGF-R и других антиангиогенных тирозинкиназ (например, SU 011248), ингибиторы специфичного для эндотелия интегрина/сигнальных путей выживания (такие как витаксин и подобные агенты), антагонисты/хелаторы меди (например, тетратиомолибдат, каптоприл и т.п.), карбоксиамидотриазол (CAI), ABT-627, CM101, интерлейкин-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, а также нуклеотидные молекулы, ингибирующие ангиогенез (например, антисмысловая-VEGF-кДНК, кДНК, кодирующая ангиостатин, кДНК, кодирующая р53 и кДНК, кодирующая дефектный рецептор VEGF -2).- 23 045516 similar agents), antagonists of angiogenic growth factors (for example, such as ZD6474, SU6668, antibodies against angiogenic agents and/or their receptors (such as VEGF (for example, bevacizumab), bFGF, and angiopoietin-1), thalidomide, analogues thalidomide (e.g. CC-5013), 5416 Sugen, SU5402, antiangiogenic ribozyme (e.g. angiozyme), interferon (e.g. interferon a2a), suramin, etc.), inhibitors of VEGF-R kinase and other antiangiogenic tyrosine kinases (e.g. SU 011248), endothelium-specific integrin/survival signaling pathway inhibitors (such as Vitaxin and similar agents), copper antagonists/chelators (such as tetrathiomolybdate, captopril, etc.), carboxyamidotriazole (CAI), ABT-627, CM101, interleukin-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, and nucleotide molecules that inhibit angiogenesis (eg, antisense-VEGF cDNA, angiostatin cDNA, p53 cDNA, and defective VEGF receptor-2 cDNA).
Другими примерами таких ингибиторов ангиогенеза, неоваскуляризации, и/или другой васкуляризации являются производные антиангиогенного гепарина (например, гепариназа III), темозоломид, NK4, фактор ингибирования миграции макрофагов, ингибиторы циклооксигеназы-2, ингибиторы индуцируемого гипоксией фактора 1, антиангиогенные изофлавоны сои, олтипраз, фумагиллин и его аналоги, аналоги соматостатина, пентозанполисульфат, текогалан натрия, дальтепарин, тумстатин, тромбоспондин, NM-3, комбрестатин, канстатин, авастатин, антитела против других целей, таких антитела против альфаV/бета-3 интегрина и антитела против кинитостатина.Other examples of such inhibitors of angiogenesis, neovascularization, and/or other vascularization include antiangiogenic heparin derivatives (eg, heparinase III), temozolomide, NK4, macrophage migration inhibitory factor, cyclooxygenase-2 inhibitors, hypoxia-inducible factor 1 inhibitors, antiangiogenic soy isoflavones, oltipraz, fumagillin and its analogs, somatostatin analogs, pentosan polysulfate, sodium tecohalane, dalteparin, tumstatin, thrombospondin, NM-3, combrestatin, canstatin, avastatin, antibodies against other targets such as anti-alphaV/beta-3 integrin antibodies and anti-kinitostatin antibodies.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с антителом против cMet при лечении расстройств, описанных выше, может быть иммуногеном против злокачественного новообразования, таким как антиген злокачественного новообразования/опухоль-ассоциированный антиген (например, молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM/TACSTDl), муцин 1 (MUC1), онкоэмбриональный антиген (ОЭА), ассоциированный с опухолями гликопротеин 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, вакцины против вирусов, ассоциированных со злокачественными новообразованиями (например, вакцины против вируса папилломы человека) или опухолевые белки теплового шока.In one embodiment, the therapeutic agent for use in combination with an anti-cMet antibody in the treatment of the disorders described above may be an anti-cancer immunogen, such as a cancer antigen/tumor-associated antigen (e.g., epithelial cell adhesion molecule (EpCAM/TACSTDl), mucin 1 (MUC1), oncoembryonic antigen (OAA), tumor associated glycoprotein 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vaccines against viruses associated with malignancies (e.g. human papillomavirus vaccines) or heat shock tumor proteins.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с антителом против cMet при лечении расстройств, описанных выше, может быть противоопухолевым цитокином, хемокином, или их комбинацией. Примеры, подходящих цитокинов и факторов роста включают IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (например, INFa2b), IFNe, GM-CSF, CD40L, лиганд Flt3, фактор стволовых клеток, анцестим и TNFa. Подходящие хемокины могут включать Glu-Leu-Arg (ELR)-отрицательные хемокины, такие как IP-10, МСР-3, MIG и SDF-1a из семейств человеческих хемокинов СХС и С-С. Подходящие цитокины включают производные цитокинов, варианты цитокинов, фрагменты цитокинов и химерные белки на основе цитокинов.In one embodiment, the therapeutic agent for use in combination with an anti-cMet antibody in the treatment of the disorders described above may be an antitumor cytokine, a chemokine, or a combination thereof. Examples of suitable cytokines and growth factors include IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (eg, INFa2b), IFNe, GM-CSF, CD40L, Flt3 ligand, stem cell factor, ancestim and TNFa. Suitable chemokines may include Glu-Leu-Arg (ELR)-negative chemokines such as IP-10, MCP-3, MIG and SDF-1a from the CXC and C-C families of human chemokines. Suitable cytokines include cytokine derivatives, cytokine variants, cytokine fragments, and cytokine-based chimeric proteins.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с антителом против cMet при лечении расстройств, описанных выше, может быть регулятором контроля клеточного цикла/апоптоза (или регулирующим агентом). Регулятор контроля клеточного цикла/апоптоза может включать молекулы, которые направляют и модулируют регуляторы контроля клеточного цикла/апоптоза такие как (i) cdc-25 (например, NSC 663284), (ii) циклинзависимые киназы, которые сверхстимулируют клеточный цикл (например, флавопиридол (L868275, HMR1275), 7-гидрокистауроспорин (UCN-01, KW-2401) и росковитин (R-росковитин, CYC202)) и (iii) модуляторы теломеразы (например, BIBR1532, SOT-095, GRN163 и композиции описанные, например, в US 6440735 и US 6713055). Неограничивающие примеры молекул, которые интерферируют с апоптотическими сигнальными путями, включают апоптоз-индуцирующий лиганд, родственный TNF (TRAIL)/лиганд 2 апоптоза (Apo-2L), антитела, которые активируют рецепторы TRAIL, IFN, и антисмысловую Bcl-2.In one embodiment, the therapeutic agent for use in combination with an anti-cMet antibody in the treatment of the disorders described above may be a cell cycle control/apoptosis regulator (or regulatory agent). The cell cycle control/apoptosis regulator may include molecules that target and modulate cell cycle control/apoptosis regulators such as (i) cdc-25 (e.g., NSC 663284), (ii) cyclin-dependent kinases that overstimulate the cell cycle (e.g., flavopiridol ( L868275, HMR1275), 7-hydroxycytosporine (UCN-01, KW-2401) and roscovitine (R-roscovitine, CYC202)) and (iii) telomerase modulators (e.g. BIBR1532, SOT-095, GRN163 and compositions described in e.g. US 6440735 and US 6713055). Non-limiting examples of molecules that interfere with apoptotic signaling pathways include TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/apoptosis ligand 2 (Apo-2L), antibodies that activate TRAIL receptors, IFN, and antisense Bcl-2.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с антителом против cMet при лечении расстройств, описанных выше, может быть гормональным регулирующим агентом, таким как агенты, применимые в антиандрогенной и антиэстрогенной терапии. Примерами таких гормональных регулирующих агентов являются тамоксифен, идоксифен, фулвестрант, дролоксифен, торемифен, ралоксифен, диэтилстильбестрол, этинилэстрадиол/эстинил, антиандроген (такой, как флутаминд/эулексин), прогестин (например, таких как гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерон/провера, мегестрол ацепат/мегэйс), адренокортикостероид (например, гидрокортизон, преднизолон), рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (и его аналоги и других агонисты ЛГРГ, таких как бусерелин и гозерелин), ингибитор ароматазы (например, анастразола/аримидекс, аминоглютетимид/цитраден, экземестан) или гормональный ингибитор (например, октреотид/сандостатин).In one embodiment, the therapeutic agent for use in combination with an anti-cMet antibody in the treatment of the disorders described above may be a hormonal regulatory agent, such as agents useful in anti-androgen and anti-estrogen therapy. Examples of such hormonal regulatory agents are tamoxifen, idoxifene, fulvestrant, droloxifene, toremifene, raloxifene, diethylstilbestrol, ethinyl estradiol/estinyl, antiandrogen (such as flutamind/eulexin), progestin (eg, such as hydroxyprogesterone caproate, medroxyprogesterone/provera, megestrol acepate/ Megace), adrenocorticosteroid (eg, hydrocortisone, prednisolone), luteinizing hormone releasing factor (and its analogs and other LHRH agonists such as buserelin and goserelin), aromatase inhibitor (eg, anastrazole/arimidex, aminoglutethimide/citraden, exemestane) or hormonal inhibitor (eg octreotide/sandostatin).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с антителом против cMet при лечения расстройств, описанных выше, может быть любым антианергическим агентом, например, соединениями, которые являются молекулами, блокирующими активность CTLA-4, например, может быть ипилимумабом.In one embodiment, the therapeutic agent for use in combination with an anti-cMet antibody in the treatment of the disorders described above may be any anti-anergic agent, for example, compounds that are molecules that block the activity of CTLA-4, for example, may be ipilimumab.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с антителом против cMet при лечении расстройств, описанных выше, может быть противоопухолевой нуклеиновой кислотойIn one embodiment, the therapeutic agent for use in combination with an anti-cMet antibody in the treatment of the disorders described above may be an antitumor nucleic acid
- 24 045516 или противоопухолевой ингибирующей молекулой РНК.- 24 045516 or antitumor inhibitory RNA molecule.
Примерами других противоопухолевых агентов, которые могут быть применимы в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с антителом против с-Met при лечении расстройств, описанных выше, являются агенты, индуцирующие дифференцировку, аналоги ретиноевой кислоты (такие как все из числа транс-ретиноевой кислоты, 13-цис-ретиноевой кислоты и похожих агентов), аналоги витамина D (такие как сеокальцитол и похожие агенты), ингибиторы ErbB3, ErbB4, IGF-IR, рецепторов инсулина, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk/2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, RON (например, антитело против RON), Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 и похожие агенты.Examples of other antineoplastic agents that may be useful as therapeutic agents for use in combination with an anti-c-Met antibody in the treatment of the disorders described above include differentiation-inducing agents, retinoic acid analogues (such as all of trans-retinoic acid, 13-cis-retinoic acid and similar agents), vitamin D analogues (such as seocalcitol and similar agents), ErbB3, ErbB4, IGF-IR, insulin receptor, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk/2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3 inhibitors , FGFR4, TRKA, TRKC, RON (eg anti-RON antibody), Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 and similar agents.
Примерами других противоопухолевых агентов, которые можно применять в качестве терапевтических агентов в комбинации с антителом против c-Met при лечении расстройств, описанных выше, являются эстрамустин и эпирубицин.Examples of other antineoplastic agents that can be used as therapeutic agents in combination with an anti-c-Met antibody in the treatment of the disorders described above are estramustine and epirubicin.
Примерами других противоопухолевых агентов, которые можно применять в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с антителом против с-Met при лечении расстройств, описанных выше, являются ингибитор HSP90, такой как 17-аллиламиногельдамицин, антитела против опухолевого антигена, такого как PSA, CA125, KSA, интегрин, например интегрин бета1, или ингибиторы VCAM.Examples of other antitumor agents that can be used as therapeutic agents for use in combination with an anti-c-Met antibody in the treatment of the disorders described above include an HSP90 inhibitor such as 17-allylaminogeldamycin, antibodies against a tumor antigen such as PSA, CA125, KSA, integrin such as beta1 integrin, or VCAM inhibitors.
Примерами других противоопухолевых агентов, которые можно применять в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с антителом против с-Met при лечении расстройств, описанных выше, являются ингибиторы кальциневрина (такие как валсподар, PSC 833 и другие ингибиторы MDR-1 или р-гликопротеина), ингибиторы TOR (такие как сиролимус, еверлимус и рапамицин), и ингибиторы механизма хоминга лимфоцитов (такие как FTY720), и агенты, оказывающие воздействие на клеточные сигнальные пути, такие как ингибиторы молекул адгезии (например, анти-LFA).Examples of other antineoplastic agents that may be used as therapeutic agents for use in combination with an anti-c-Met antibody in the treatment of the disorders described above include calcineurin inhibitors (such as valspodar, PSC 833 and other MDR-1 or p-glycoprotein inhibitors) , TOR inhibitors (such as sirolimus, everlimus and rapamycin), and lymphocyte homing mechanism inhibitors (such as FTY720), and agents that affect cell signaling pathways, such as adhesion molecule inhibitors (for example, anti-LFA).
В одном воплощении антитело изобретения против c-Met предназначено для применения в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими антителами, такими как офатумумаб, занолимумаб, даратумумаб, ранибизумаб, зенапакс, Симулект, Ремикад, Химура, Тусабри, Ксолаир, Раптива и/или ритуксимаб.In one embodiment, the anti-c-Met antibody of the invention is for use in combination with one or more other therapeutic antibodies, such as ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab, Zenapax, Simulect, Remicade, Himura, Tusabri, Xolair, Raptiva and/or rituximab.
Другими терапевтическими антителами, которые могут быть использованы в комбинации с антителом настоящего изобретения, являются антитела против c-Met, которые связывают другие области c-Met, такие как антитела описанные в WO 2005016382, WO 2006015371, WO 2007090807, WO 2007126799 или WO 2009007427 (все включены в данный документ ссылкой).Other therapeutic antibodies that can be used in combination with an antibody of the present invention are anti-c-Met antibodies that bind other c-Met regions, such as those described in WO 2005016382, WO 2006015371, WO 2007090807, WO 2007126799 or WO 2009007427 ( all are incorporated herein by reference).
В другом воплощении при лечении заболевания используют комбинацию двух или нескольких различных антител изобретения, описанных в данном документе. Особенно интересные комбинации включают два или большее количество неконкурирующих антител. Такая комбинационная терапия может приводить к связыванию повышенного количества молекул антител на клетку, что может увеличить эффективность через активацию комплемент-опосредованного лизиса.In another embodiment, a combination of two or more different antibodies of the invention described herein is used in the treatment of a disease. Particularly interesting combinations include two or more non-competing antibodies. Such combination therapy may result in the binding of increased numbers of antibody molecules per cell, which may increase efficacy through activation of complement-mediated lysis.
В дополнение к вышеуказанному, другие воплощения комбинационных терапий изобретения включают следующее:In addition to the above, other embodiments of the combination therapies of the invention include the following:
При лечении немелкоклеточного рака легкого применяют антитело против с-Met в комбинации с ингибиторами EGFR, такими как антитело против EGFR, например, залутумумаб, цетуксимаб, панитумумаб или нимотузумаб, или другими ингибиторами EGFR, такими как гефитиниб или ерлотиниб) или в комбинации с ингибитором ErbB2 (Her2/neu) (таким как антитело против HER2, например, трастузумаб, трастузумаб-DMI или пертузмумаб) или в комбинации с ингибитором как EGFR так и HER2, таким как лапатиниб, или в комбинации с ингибитором HER3.In the treatment of non-small cell lung cancer, an anti-c-Met antibody is used in combination with EGFR inhibitors, such as an anti-EGFR antibody such as zalutumumab, cetuximab, panitumumab or nimotuzumab, or other EGFR inhibitors such as gefitinib or erlotinib) or in combination with an ErbB2 inhibitor (Her2/neu) (such as an anti-HER2 antibody such as trastuzumab, trastuzumab-DMI or pertuzmumab) or in combination with an inhibitor of both EGFR and HER2, such as lapatinib, or in combination with a HER3 inhibitor.
При лечении глиомы применяют антитело против c-Met в комбинации с темозоломидом или ингибитором ангиогенеза, таким как бевацизумаб.Glioma is treated with an anti-c-Met antibody in combination with temozolomide or an angiogenesis inhibitor such as bevacizumab.
При лечении колоректального рака применяют антитело против c-Met в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из: гемцитабина, бевацизумаба, фолфокса, фолфири, кселокса, IFL, оксалиплатина, иринотекана, 5-FU/LV, капецитабина, UFT, нацеливающих на EGFR агентов, таких как цетуксимаб, панитумумаб, залутумумаб; ингибиторов VEGF или ингибиторов тирозинкиназ, таких как сунитиниб.In the treatment of colorectal cancer, an anti-c-Met antibody is used in combination with one or more compounds selected from: gemcitabine, bevacizumab, Folfox, Folfiri, Xelox, IFL, oxaliplatin, irinotecan, 5-FU/LV, capecitabine, UFT, targeting EGFR agents such as cetuximab, panitumumab, zalutumumab; VEGF inhibitors or tyrosine kinase inhibitors such as sunitinib.
При лечении рака предстательной железы применяют антитело против c-Met в комбинации с одним или несколькими соединениями, выбранными из: гормональной/антигормональной терапии; например, антиандрогенов, агонистов рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH), и химиотерапевтических веществ, таких как таксаны, митоксантрон, эстрамустин, 5FU, винбластин, иксабепилон.In the treatment of prostate cancer, an anti-c-Met antibody is used in combination with one or more compounds selected from: hormonal/antihormonal therapy; for example, antiandrogens, luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) agonists, and chemotherapeutic agents such as taxanes, mitoxantrone, estramustine, 5FU, vinblastine, ixabepilone.
Лучевая терапия - хирургияRadiation therapy - surgery
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается способ лечения расстройства, в которое вовлечены клетки, экспрессирующие c-Met, в объекте, где способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против c-Met по настоящему изобретению и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, нуждающемуся в этом объекту.In one embodiment, the present invention provides a method of treating a disorder involving c-Met expressing cells in a subject matter, wherein the method comprises administering a therapeutically effective amount of an anti-c-Met antibody of the present invention and at least one additional therapeutic agent to a subject in need of this object.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается способ лечения или предотвращения злокачественного новообразования, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против c-Met по настоящему изобретению, и применение лучевой терапии у нужIn one embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of an anti-c-Met antibody of the present invention, and administering radiation therapy to the desired
- 25 045516 дающегося в этом объекта.- 25 045516 given in this object.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается применение антитела против c-Met по настоящему изобретению для приготовления фармацевтической композиции для лечения злокачественного новообразования путем введения антитела в комбинации с лучевой терапией.In one embodiment, the present invention provides the use of an anti-c-Met antibody of the present invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer by administering the antibody in combination with radiation therapy.
Лучевая терапия может включать облучение или ассоциированное введение пациенту радиофармацевтических веществ. Источник излучения может быть как внешним, так и внутренним по отношению к пациенту, подвергаемому обработке (лучевая обработка может, например, быть в форме внешней направленной лучевой терапии (EBRT) или в форме брахотерапии (ВТ)). Радиоактивные элементы, которые могут использоваться при практическом осуществлении таких методов, включают, например, цезий137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, иодид-123, иодид-131, и индий-111.Radiation therapy may involve irradiation or associated administration of radiopharmaceuticals to the patient. The radiation source may be either external or internal to the patient being treated (radiation treatment may, for example, be in the form of external beam radiation therapy (EBRT) or in the form of brachotherapy (BT)). Radioactive elements that may be used in the practical implementation of such methods include, for example, cesium-137, iridium-192, americium-241, gold-198, cobalt-57, copper-67, technetium-99, iodide-123, iodide-131, and indium-111.
В следующем воплощении в настоящем изобретении предлагается способ лечения или предотвращения злокачественного новообразования, причем способ включает введение нуждающемуся в этом объекту терапевтически эффективного количества антитела против c-Met, такого как антитело против cMet по настоящему изобретению в комбинации с хирургической операцией.In a further embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing cancer, the method comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of an anti-c-Met antibody, such as the anti-cMet antibody of the present invention, in combination with surgery.
Диагностические примененияDiagnostic applications
Антитела изобретения против c-Met также могут быть использованы для диагностических целей. Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к диагностической композиции, включающей антитело против c-Met, определенное выше.Antibodies of the invention against c-Met can also be used for diagnostic purposes. Thus, in a further aspect, the invention relates to a diagnostic composition comprising an anti-c-Met antibody as defined above.
В одном воплощении, антитела против c-Met по настоящему изобретению могут использоваться in vivo или in vitro для диагностики заболеваний, в которых активированные клетки, экспрессирующие cMet, играют активную роль в патогенезе, путем определения уровня c-Met, или уровня клеток, которые содержат c-Met на своей мембранной поверхности. Этого можно достичь, например, путем контакта тестируемого образца необязательно вместе с контрольным образцом, с антителом против c-Met в условиях, которые дают возможность образования комплекса между антителом и c-Met.In one embodiment, the anti-c-Met antibodies of the present invention can be used in vivo or in vitro to diagnose diseases in which activated cMet-expressing cells play an active role in pathogenesis, by determining the level of c-Met, or the level of cells that contain c-Met on its membrane surface. This can be achieved, for example, by contacting the test sample, optionally together with a control sample, with an anti-c-Met antibody under conditions that allow the formation of a complex between the antibody and c-Met.
Таким образом, в следующем аспекте, изобретение относится к способу обнаружения наличия антигена c-Met или клетки, экспрессирующей c-Met, в образце, включающему контакт образца с антителом в условиях, которые дают возможность образования комплекса между антителом и c-Met; и анализ образования комплекса.Thus, in a further aspect, the invention relates to a method for detecting the presence of c-Met antigen or a cell expressing c-Met in a sample, comprising contacting the sample with an antibody under conditions that allow formation of a complex between the antibody and c-Met; and analysis of complex formation.
В одном воплощении, способ осуществляют in vitro.In one embodiment, the method is carried out in vitro.
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагаются способы идентификации и диагностики инвазивных клеток и тканей и других клеток, на которые направлены антитела против c-Met по настоящему изобретению, и способы мониторинга прогресса терапевтического лечения, состояния после лечения, риска развития злокачественного новообразования, прогрессии злокачественного новообразования и т.п.More specifically, the present invention provides methods for identifying and diagnosing invasive cells and tissues and other cells targeted by the anti-c-Met antibodies of the present invention, and methods for monitoring the progress of therapeutic treatment, post-treatment status, risk of cancer, progression of cancer and so on.
Подходящие метки для антитела против c-Met, и/или для вторичных антител, используемые в таких методах, хорошо известны в данной области.Suitable labels for the anti-c-Met antibody and/or secondary antibodies used in such methods are well known in the art.
В дополнительном аспекте изобретение относится к набору реактивов для обнаружения наличия антигена c-Met или клетки, экспрессирующей c-Met, в образце, который содержит антитело изобретения против c-Met или биспецифичную молекулу по изобретению и инструкции по применению набора реактивов.In a further aspect, the invention relates to a reagent kit for detecting the presence of c-Met antigen or a cell expressing c-Met in a sample that contains an anti-c-Met antibody of the invention or a bispecific molecule of the invention and instructions for use of the reagent kit.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается набор для диагностики злокачественного новообразования, содержащий контейнер, в котором находится антитело против c-Met, и один или несколько реактивов для обнаружения связывания антитела против c-Met с c-Met. Реактивы включают, например, флуоресцентные метки, ферментные метки или другие детектируемые метки. Реактивы также могут включать вторичные или третичные антитела или реактивы для ферментативных реакций, где ферментативные реакции дают продукт, который может быть визуализирован.In one embodiment, the present invention provides a kit for the diagnosis of cancer comprising a container containing an anti-c-Met antibody and one or more reagents for detecting binding of the anti-c-Met antibody to c-Met. Reagents include, for example, fluorescent tags, enzyme tags, or other detectable tags. Reagents may also include secondary or tertiary antibodies or reagents for enzymatic reactions, where the enzymatic reactions produce a product that can be visualized.
Антиидиотипические антителаAnti-idiotypic antibodies
В дополнительном аспекте изобретение относится к антииидиотипическому антителу, которое связывает антитело изобретения против c-Met, описанное в данном документе.In a further aspect, the invention provides an anti-idiotypic antibody that binds the anti-c-Met antibody of the invention described herein.
Антиидиотипическое (Id) антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. В качестве источника мАТ против c-Met с мАТ Id-антитело может быть получено иммунизацией животного того же самого вида и генетического типа, для которого получено антитело против Id. Иммунизированное животное, как правило, распознает и отвечает на идиотипические детерминанты иммунизированного антитела выработкой антитела к этим идиотипическим детерминантам (антитело против Id).An anti-idiotypic (Id) antibody is an antibody that recognizes unique determinants typically associated with the antigen-binding site of the antibody. As a source of the anti-c-Met mAb with the Id mAb, the Id antibody can be produced by immunizing an animal of the same species and genetic type for which the anti-Id antibody is produced. The immunized animal typically recognizes and responds to the idiotypic determinants of the immunized antibody by producing an antibody to the idiotypic determinants (anti-Id antibody).
Антитела против Id также могут быть использованы в качестве иммуногена для индукции иммунного ответа в другом животном, продуцируя так называемое антитело против антитела против Id. Антитело против антитела против Id может быть эпитопно идентичным исходному мАТ, которое индуцирует антитело против Id. Таким образом, при использовании антител к идиотипическим детерминантам мАТ, можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.Anti-Id antibodies can also be used as an immunogen to induce an immune response in another animal, producing a so-called anti-Id antibody. The anti-Id antibody may be epitopically identical to the parent mAb that induces the anti-Id antibody. Thus, by using antibodies to idiotypic mAb determinants, other clones expressing antibodies of identical specificity can be identified.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые неThe present invention is further illustrated by the following examples, which are not
- 26 045516 должны толковаться как ограничивающие.- 26 045516 should be construed as limiting.
ПримерыExamples
Пример 1. Конструкты, экспрессирующие c-MetExample 1: c-Met Expression Constructs
Получали оптимизированные по кодонам конструкты для экспрессии c-Met, внеклеточного домена (ECD) (ак 1-932 и С-концевая метка His6 или домен SEMA из c-Met (ак 1-567 и С-концевая метка His9) в клетках HEK и СНО. Белки, кодируемые этими конструктами идентичны учетной записи Genbank NM 000245 для c-Met. Конструкты, содержат подходящие сайты рестрикции для клонирования и оптимальную последовательность Козак (Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208). Конструкты клонировали в вектор для экспрессии в млекопитающих рЕЕ13.4 (Lonza Biologies) (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175), с получением pEE13.4cMet, pEE13.4cMetECDHis и pEE13.4cMetSEMA-567His8.Codon-optimized constructs were obtained for the expression of c-Met, the extracellular domain (ECD) (aa 1-932 and the C-terminal His6 tag or the SEMA domain of c-Met (aa 1-567 and the C-terminal His9 tag) in HEK cells and CHO The proteins encoded by these constructs are identical to Genbank account NM 000245 for c-Met. The constructs contain suitable restriction sites for cloning and the optimal Kozak sequence (Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208). The constructs are cloned into a vector for mammalian expression of pEE13.4 (Lonza Biologies) (Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175), yielding pEE13.4cMet, pEE13.4cMetECDHis and pEE13.4cMetSEMA-567His8.
Пример 2. Экспрессирующие конструкты для 5D5v1, 5D5 и G11-HZExample 2: Expression constructs for 5D5v1, 5D5 and G11-HZ
Получали оптимизированные по кодонам конструкты для экспрессии тяжелой (НС) и легкой цепей (LC) антител IgG1 5D5vl, 5D5 и G11-HZ в клетках HEK. Белки, кодируемые этими конструктами, идентичны тем, что описаны в Пат. США 6468529 (последовательности 3 и 4) для тяжелой и легкой цепей 5D5vl, WO 2006/015371 А2 (фиг. 13) для тяжелой и легкой цепей 5D5, и WO 2009/007427 А2 (последовательность была выделена из множества фигур) для тяжелой и легкой цепей 224G11. 224G11 также называется в данном документе G11-HZ.Codon-optimized constructs were obtained for the expression of heavy (HC) and light chains (LC) of IgG1 antibodies 5D5vl, 5D5 and G11-HZ in HEK cells. The proteins encoded by these constructs are identical to those described in Pat. US 6468529 (sequences 3 and 4) for the heavy and light chains 5D5vl, WO 2006/015371 A2 (Fig. 13) for the heavy and light chains 5D5, and WO 2009/007427 A2 (sequence was isolated from multiple figures) for the heavy and light chains 224G11. 224G11 is also referred to in this document as G11-HZ.
Пример 3. Временная экспрессия в клетках HEK-293FExample 3 Transient Expression in HEK-293F Cells
Клетки Freestyle™ 293-F (субклон НЕК-293 адаптирован для суспензионного роста и химически заданной среды Freestyle (HEK-293F)) были получены из Invitrogen и трансфецированы соответствующей плазмидной ДНК, с помощью 293fectin (Invitrogen), согласно инструкциям производителя. Экспрессию c-Met проверяли с помощью анализа FACS, как описано ниже. В случае экспрессии антитела, соответствующие экспрессирующие векторы для тяжелой и легкой цепей коэкспрессировали.Freestyle™ 293-F cells (a subclone of HEK-293 adapted for suspension growth and chemically specified Freestyle media (HEK-293F)) were obtained from Invitrogen and transfected with the appropriate plasmid DNA using 293fectin (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. c-Met expression was checked by FACS analysis as described below. In the case of antibody expression, the corresponding expression vectors for the heavy and light chains were co-expressed.
Пример 4. Временная экспрессия в клетках СНО pEE13.4cMet временно трансфецировали в клеточную линию Freestyle™ CHO-S (Invitrogen) с помощью реактива для трансфекции Freestyle MAX transfection reagent (Invitrogen). Экспрессию c-Met проверяли анализом FACS, как описано ниже.Example 4 Transient Expression in CHO Cells pEE13.4cMet was transiently transfected into the Freestyle™ CHO-S cell line (Invitrogen) using Freestyle MAX transfection reagent (Invitrogen). c-Met expression was checked by FACS analysis as described below.
Пример 5. Клонирование и экспрессия моновалентных антител (молекул UniBody®)Example 5: Cloning and expression of monovalent antibodies (UniBody® molecules)
Для экспрессии моновалентных антител в клетках млекопитающих константную область НС из IgG4, утратившую область шарнира (Ch) (аминокислоты Е99-Р110) и содержащую 2 мутации F405T и Y407E в области СН3, синтезировали в виде оптимизированного по кодонам конструкта в экспрессирующем в млекопитающих векторе pcDNA3.3 (Invitrogen) и назвали pUniTE. Путем вставки оптимизированной по кодонам константной области в область человеческой легкой цепи каппа в pcDNA3.3 сконструировали отдельный вектор.To express monovalent antibodies in mammalian cells, the HC constant region from IgG4, which had lost the hinge (Ch) region (amino acids E99-P110) and contained two mutations F405T and Y407E in the CH3 region, was synthesized as a codon-optimized construct in the mammalian-expressing vector pcDNA3. 3 (Invitrogen) and named pUniTE. By inserting a codon optimized constant region into the human kappa light chain region in pcDNA3.3, a separate vector was constructed.
Релевантные области VH и VL вставили соответственно в pUniTE и pKappа с получением векторов для экспрессии тяжелой и легкой цепей специфических антител. Котрансфекция векторов с тяжелой и легкой цепями специфического антитела в клетках HEK-293F (Invitrogen), приводила к временной выработке моновалентных антител с искомыми специфичностями. Очистку антител осуществляли с помощью аффинной колоночной хроматографии с протеином А (как описано в примере 11).The relevant VH and VL regions were inserted into pUniTE and pKappa, respectively, to obtain vectors for the expression of the heavy and light chains of specific antibodies. Cotransfection of vectors with heavy and light chains of specific antibodies in HEK-293F cells (Invitrogen) led to the transient production of monovalent antibodies with the desired specificities. Antibody purification was carried out using Protein A affinity column chromatography (as described in Example 11).
Пример 6. Очистка His-меченного c-Met cMetECDHis и cMetSEMAHis экспрессировали в клетках HEK-293F. Метка His в cMetECDHis и cMetSEMAHis позволяет очищать их с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом. В этом способе, хелатор, зафиксированный в хроматографической смоле, наполнен Со2+. Надосадочные жидкости, содержащие cMetECDHis и cMetSEMAHis, инкубировали со смолой в периодическом режиме (т.е. в растворе). Меченный His белок сильно связывается с гранулами смолы, тогда как другие белки, присутствующие в культуруральной надосадочной жидкости, связываются не сильно. После инкубации гранулы извлекали из надосадочной жидкости и помещали в колонку. Колонку промывали для удаления слабо связанных белков. Затем элюировали сильно связанные белки cMetECDHis и cMetSEMAHis буфером, содержащим имидазол, который конкурирует с His за связывание с Со2+. Элюэнт удаляли из белка заменой буфера на обессоливающей колонке.Example 6 Purification of His-tagged c-Met cMetECDHis and cMetSEMAHis were expressed in HEK-293F cells. The His tag in cMetECDHis and cMetSEMAHis allows them to be purified by immobilized metal affinity chromatography. In this method, the chelator fixed in the chromatography resin is loaded with Co 2+ . Supernatants containing cMetECDHis and cMetSEMAHis were incubated with the resin in batch mode (i.e., in solution). The His-tagged protein binds strongly to the resin beads, whereas other proteins present in the culture supernatant do not bind strongly. After incubation, the beads were removed from the supernatant and placed on a column. The column was washed to remove loosely bound proteins. The highly bound proteins cMetECDHis and cMetSEMAHis were then eluted with a buffer containing imidazole, which competes with His for binding to Co 2+ . The eluent was removed from the protein by exchanging the buffer on the desalting column.
Пример 7. Процедура иммунизации трансгенных мышейExample 7. Procedure for immunization of transgenic mice
Антитела 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 031, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101 и 104 выделяли из следующих иммунизаций: одну мышь НСо20 (1 самка, штамм GG2713), одну мышь НСо17 (самка, штамм GG2714) и две мыши HCol2-Balb/C (2 самки, штамм GG2811) (Medarex, Сан-Хосе, Калифорния, США; для ссылки см. выше параграф о мышах HuMab, WO2009097006 и US2005191293) иммунизировали каждые две недели по очереди 5x106 опухолевых клеток NCI-H441 внутрибрюшинно (в.б.) и подкожно (п.к.) 20 мкг белка cMetECDHis, связанного с гаптеном гемоцианина лимфы улитки (KLH).Antibodies 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 031, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101 and 104 were allocated from the following immunizations: one one HCo20 mouse (1 female, strain GG2713), one HCo17 mouse (female, strain GG2714) and two HCol2-Balb/C mice (2 females, strain GG2811) (Medarex, San Jose, CA, USA; for reference see above paragraph on HuMab mice, WO2009097006 and US2005191293) were immunized every two weeks in turn with 5x106 NCI-H441 tumor cells intraperitoneally (i.p.) and subcutaneously (s.c.) with 20 μg of cMetECDHis protein coupled to the keyhole limpet hemocyanin hapten (KLH) .
Антитела 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 087, 089, 098 и 181 выделяли из следующих иммунизаций: две мыши НСо20 (1 самец и 1 самка, штамм GG2713), одну мышь HCol2Balb/C (1 самец, штамм GG2811) (Medarex, Сан-Хосе, Калифорния, США; для ссылки см. выше абзац оAntibodies 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 087, 089, 098 and 181 were isolated from the following immunizations: two HCo20 mice (1 male and 1 female, strain GG2713) , one HCol2Balb/C mouse (1 male, strain GG2811) (Medarex, San Jose, CA, USA; for reference, see above paragraph on
- 27 045516 мышах HuMab) иммунизировали каждые две недели по очереди 5х106 клеток CHO-K1SV, временно трансфецированных cMetECD, внутрибрюшинно (в.б.) и подкожно (п.к.) 20 мкг белка cMetECDHis, связанного с гаптеном гемоцианина лимфы улитки (KLH).- 27 045516 HuMab mice) were immunized every two weeks in turn with 5x10 6 CHO-K1SV cells transiently transfected with cMetECD, intraperitoneally (i.p.) and subcutaneously (s.c.) with 20 μg of cMetECDHis protein associated with the hemocyanin hapten of the snail lymph ( KLH).
Осуществляли максимум восемь иммунизаций на мышь, четыре в.б. и четыре п.к. иммунизации в крестец. Первую иммунизацию проводили с помощью клеток в полном адъюванте Фрейнда (CFA; Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США). Для всех остальных иммунизаций, клетки инъецировали в.б. в PBS, a cMetECD, соединенный с KLH, инъецировали п.к. с использованием неполного адъюванта Фрейнда (IFA; Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США). Объединяли мышей, по меньшей мере, с двумя последовательными титрами c-Met-специфичного антитела, равными 200 (разведение сыворотки 200/1) или выше, определенных в анализе антиген-специфичного скрининга FMAT, как описано в примере 8.A maximum of eight immunizations per mouse were performed, four i.p. and four p.c. immunization in the sacrum. The first immunization was performed with cells in complete Freund's adjuvant (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). For all other immunizations, cells were injected i.p. in PBS, and cMetECD coupled to KLH was injected s.c. using incomplete Freund's adjuvant (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Mice with at least two consecutive c-Met-specific antibody titers of 200 (200/1 serum dilution) or greater, as determined by the FMAT antigen-specific screening assay, as described in Example 8, were pooled.
Пример 8. Анализ гомогенным антигенспецифичным скринингомExample 8 Homogeneous antigen-specific screening assay
Наличие антител против c-Met в сыворотке иммунизированных мышей или в гибридомах HuMab (человеческие моноклональные антитела) или в надосадочной жидкости культуры трансфектом, определяли в анализе гомогенным антигенспецифичным скринингом (четвертый квадрант) с помощью технологии Fluorometric Micro volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosystems, Фостер-Сити,The presence of anti-c-Met antibodies in the sera of immunized mice or in HuMab hybridomas (human monoclonal antibodies) or in transfectome culture supernatants was determined in a homogeneous antigen-specific screening assay (fourth quadrant) using Fluorometric Micro volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosystems, Foster City,
Калифорния, США). Для этого использовали комбинацию 3 анализов на основе клеток и одного анализа на основе гранул. В анализах на основе клеток, определяли связывание с TH1016-cMet (клетки HEK-293F временно экспрессирующие внеклеточный домен рецептора c-Met; полученные как описано выше) и с НТ29 (которые экспрессируют c-Met на клеточной поверхности), а также с клетками HEK293 дикого типа (отрицательный контроль который не экспрессирует c-Met). Для анализа на основе гранул, определяли связывание с SB1016-cMet (cMetECDHis, полученный при временной экспрессии в клетках HEK-293F, как описано выше, биотинилированный и спаренный с покрытыми стрептавидином гранулами). Образцы добавляли к клеткам/гранулам для связывания с с-Met. Затем связывание HuMab детектировали с помощью флуоресцентного конъюгата (козьи антитела против человеческих IgG-Cy5; Jackson ImmunoResearch). Химерное антитело специфичное к c-Met 5D5vl (полученное в клетках HEK-293F) использовали в качестве положительного контроля, а смешанную сыворотку HuMab и HuMab-KLH использовали в качестве отрицательных контролей. Образцы сканировали с помощью системы детекции Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (8200 CDS) и значения 'импульсы х флюоресценция' использовали в качестве выводимых данных. Образцы установили как положительные, когда импульсы были выше чем 50, а 'импульсы х флюоресценция' были по меньшей мере в три раза выше, чем в случае отрицательного контроля HuMab-KLH.California, USA). For this purpose, a combination of 3 cell-based assays and one bead-based assay was used. In cell-based assays, binding to TH1016-cMet (HEK-293F cells transiently expressing the extracellular domain of the c-Met receptor; prepared as described above) and HT29 (which express c-Met on the cell surface), as well as HEK293 cells, was determined. wild type (negative control which does not express c-Met). For the bead-based assay, binding to SB1016-cMet (cMetECDHis produced by transient expression in HEK-293F cells as described above, biotinylated and coupled to streptavidin-coated beads) was determined. Samples were added to cells/beads to bind to c-Met. HuMab binding was then detected using a fluorescent conjugate (goat anti-human IgG-Cy5; Jackson ImmunoResearch). The c-Met-specific chimeric antibody 5D5vl (produced in HEK-293F cells) was used as a positive control, and HuMab and HuMab-KLH mixed sera were used as negative controls. Samples were scanned using an Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (8200 CDS) and the counts x fluorescence values were used as output data. Samples were determined to be positive when counts were greater than 50 and the 'counts x fluorescence' was at least three times higher than the HuMab-KLH negative control.
Пример 9. Получение гибридомы HuMabExample 9. Preparation of HuMab hybridoma
Мышей HuMab с достаточным развитием антиген-специфичного титра (определенного выше) умерщвляли и собирали селезенку и лимфоузлы, фланкирующие абдоминальную аорту и полую вену. Слияние спленоцитов и клеток лимфоузлов с клеточной линией мышиной миеломы осуществляли элекрослиянием с помощью системы CEEF 50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Глен-Бурни, Мериленд, США), преимущественно согласно инструкциям изготовителя. Планшеты для слияния скринировали с помощью антиген-специфичных анализов связывания, как описано выше, а клетки, положительные по этому анализу, тестировали в анализе ERK-фосфорилирования Alphascreen® SureFire®, и в анализе оценки аффинности Octet, как описано ниже. Антитела 031, 035, 087 и 089 наращивали и культивировали по стандартным протоколам (например, как описано в Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).HuMab mice with sufficient development of an antigen-specific titer (defined above) were sacrificed and the spleen and lymph nodes flanking the abdominal aorta and vena cava were collected. Fusion of splenocytes and lymph node cells with a murine myeloma cell line was performed by electrofusion using the CEEF 50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), essentially according to the manufacturer's instructions. Fusion plates were screened using antigen-specific binding assays as described above, and cells positive for this assay were tested in the Alphascreen® SureFire® ERK phosphorylation assay and the Octet affinity assay as described below. Antibodies 031, 035, 087, and 089 were raised and cultured using standard protocols (e.g., as described in Coligan, J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
Параллельно клонировали антитела 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 и 181 с использованием системы ClonePix (Genetix, Гэмпшир, Великобритания). Специфические первичные луночные гибридомы высевали на полужидкую среду, приготовленную из 40% CloneMedia (Genetix, Гэмпшир, Великобритания) и 60% полной среды HyQ 2x (Hyclone, Уолтем, США), и выкалывали приблизительно 100 субклонов каждой первичной лунки. Субклоны тестировали в антигенспецифичном анализе связывания, как описано ранее, а уровень IgG измеряли с использованием Octet с целью отбора наиболее специфичного и продуктивного клона из первичной лунки для последующего наращивания. Следующее наращивание и культивирование полученных в результате гибридом HuMab проводили по стандартным протоколам (например, как описано в Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).In parallel, antibodies 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 061, 062, 063, 064, 065, 06 were cloned 6,068 , 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 and 181 using the ClonePix system (Genetix, Hampshire, UK). Specific primary well hybridomas were plated on semisolid medium prepared with 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) and 60% HyQ 2x complete medium (Hyclone, Waltham, USA), and approximately 100 subclones of each primary well were punctured. Subclones were tested in an antigen-specific binding assay as previously described, and IgG levels were measured using Octet to select the most specific and productive clone from the primary well for subsequent expansion. Subsequent expansion and cultivation of the resulting HuMab hybridomas was carried out using standard protocols (e.g., as described in Coligan, J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons , Inc., 2006).
Пример 10. Масс-спектрометрия очищенных антителExample 10: Mass spectrometry of purified antibodies
Малую аликвоту 0,8 мл антитела, содержащего надосадочную жидкость гибридом из 6-луночной стадии или стадии Hyperflask очищали с помощью колонок PhyTip, содержащих смолу с протеином G (PhyNexus Inc., Сан-Хосе, США ) на рабочей станции Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Хопкинтон, США) Колонки PhyTip использовали согласно инструкциям производителя, но буферы заменили на: Буфер для Связывания PBS (В. Braun, Medical B.V., Occ, Нидерланды) и Буфер для элюции 0.1М Глицин-HCl рН 2,7 (Fluka Riedel-de Haen, Букс, Германия), после очистки образцы нейтрализовалиA small 0.8 ml aliquot of antibody containing hybridoma supernatant from the 6-well or Hyperflask stage was purified using PhyTip columns containing protein G resin (PhyNexus Inc., San Jose, USA) on a Sciclone ALH 3000 workstation (Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA) PhyTip columns were used according to the manufacturer's instructions, but the buffers were replaced with: PBS Binding Buffer (B. Braun, Medical B.V., Occ, The Netherlands) and Elution Buffer 0.1 M Glycine-HCl pH 2.7 (Fluka Riedel -de Haen, Buchs, Germany), after cleaning the samples were neutralized
- 28 045516- 28 045516
М 2М Tris-HCl рН 9,0 (Sigma-Aldrich, Зейндрехт, Нидерланды). В ином случае в некоторых случаях большие объемы культуральной надосадочной жидкости очищали с помощью аффинной колоночной хроматографии с протеином А.M 2M Tris-HCl pH 9.0 (Sigma-Aldrich, Zeindrecht, The Netherlands). Alternatively, in some cases large volumes of culture supernatant were purified by protein A affinity column chromatography.
После очистки образцы поместили в 384-луночный планшет (Waters, планшет с 100 мкл квадратными лунками, part* 186002631). Образцы дегликозилировали в течение ночи при 37°С с помощью Nгликозидазы F. Добавляли DTT (15 мг/мл) (1 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Образцы (5 или 6 мкл) обессоливали на Acquity UPLC™ (Waters, Милфорд, США) с помощью колонки а ВЕН300 С18, 1.7цт, 2.1x50 мм при 60°С. Воду MQ и ацетонитрил категории LC-MS (Biosolve, cat no 01204101, Валкенсваард, Нидерланды), оба с 0,1% муравьиной кислотой (Fluka, cat no 56302, Букс, Германия), использовали в качестве Элюентов А и В соответственно. Масс-спектры с времяпролетной ионизацией электрораспылением записывали в режиме реального времени на масс-спектрометре micrOTOF™ (Bruker, Бремен, Германия), функционирующем в режиме положительных ионов. До анализа шкалу 900-3000 m/z калибровали с помощью смеси для Настройки ES (Agilent Technologies, Санта-Клара, США). Масс-спектры подвергали деконволюции с помощью программного обеспечения DataAnalysis™ software v. 3.4 (Bruker) при использовании алгоритма максимальной энтропии для поиска молекулярных масс между 5 и 80 кДа.After purification, samples were placed in a 384-well plate (Waters, 100 µl square well plate, part* 186002631). Samples were deglycosylated overnight at 37°C with Nglycosidase F. DTT (15 mg/ml) was added (1 μl/well) and incubated for 1 hour at 37°C. Samples (5 or 6 μl) were desalted on an Acquity UPLC™ (Waters, Milford, USA) using a BEN300 C18, 1.7 ct, 2.1 x 50 mm column at 60°C. MQ water and LC-MS grade acetonitrile (Biosolve, cat no 01204101, Valkenswaard, The Netherlands), both with 0.1% formic acid (Fluka, cat no 56302, Buchs, Germany), were used as Eluents A and B, respectively. Electrospray ionization time-of-flight mass spectra were recorded in real time on a micrOTOF™ mass spectrometer (Bruker, Bremen, Germany) operating in positive ion mode. Prior to analysis, the 900–3000 m/z scale was calibrated using ES Setup Mix (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Mass spectra were deconvoluted using DataAnalysis™ software v. 3.4 (Bruker) using the maximum entropy algorithm to find molecular masses between 5 and 80 kDa.
После деконволюции полученные массы тяжелой и легкой цепей для всех образцов сравнивали для обнаружения дублирующих антител. В сравнении тяжелых цепей было принято во внимание возможное присутствие вариантов с С-концевым лизином. Был получен список уникальных антител, в котором уникальные определены как уникальная комбинация тяжелой и легкой цепей. В случае если дублированные антитела были найдены, результаты из других тестов использовали для решения, какое из антител является лучшим материалом для продолжения экспериментов.After deconvolution, the resulting heavy and light chain masses for all samples were compared to detect duplicate antibodies. In heavy chain comparisons, the possible presence of C-terminal lysine variants was taken into account. A list of unique antibodies was obtained, in which unique is defined as a unique combination of heavy and light chains. In the event that duplicate antibodies were found, results from other tests were used to decide which antibody was the best material to proceed with the experiments.
Пример 11. Анализ и клонирование в экспрессирующие векторы последовательностей вариабельных доменов антитела против c-MetExample 11. Analysis and cloning of anti-c-Met antibody variable domain sequences into expression vectors
Общую РНК HuMab против c-Met получали из 5x106 клеток гибридомы, а 5'-RACEкомплементарную ДНК (кДНК) получали из 100 нг общей РНК, с помощью набора SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech), согласно инструкциям производителя. Кодирующие области VH (вариабельная область тяжелой цепи) и VL (вариабельная область легкой цепи) аплифицировали ПЦР и в рамке считывания клонировали в векторы с константной областью pGlf (содержащий оптимизированную по кодонам, полностью синтетическую, константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 (аллотип f) в экспрессирующем в млекопитающих векторе рЕЕ6.4 (Lonza Biologies, Слау, Великобритания (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) и pKappa (содержащий оптимизированную по кодонам, полностью синтетическую, константную область человеческой легкой цепи каппа (аллотип Km3) в экспрессирующем в млекопитающих векторе рЕЕ12.4 (Lonza Biologies, Слоу, Великобритания (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) с помощью независимой от лигирования стратегии клонирования (Aslanidis et al. Nucleic Acids Res. 18:6069-6074). Для каждого HuMab 12 клонов VL и 8 клонов VH секвенировали и их теоретические массы рассчитывали и сравнивали с доступными массспектрометрическими данными по антителам. Последовательности даны в перечне последовательностей и в табл. 1 в данном документе ниже. Последовательности CDR определяли согласно Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). В табл. 2 и 3 дан обзор информации о последовательностях антител и большинстве гомологичных зародышевых последовательностей.HuMab anti-c-Met total RNA was prepared from 5x106 hybridoma cells, and 5'-RACE complementary DNA (cDNA) was prepared from 100 ng of total RNA using the SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech), according to the manufacturer's instructions. The VH (heavy chain variable region) and VL (light chain variable region) coding regions were amplified by PCR and cloned in frame into constant region vectors pGlf (containing a codon optimized, fully synthetic, heavy chain constant region of human IgG1 (allotype f) in the mammalian expression vector pEE6.4 (Lonza Biologies, Slough, UK (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) and pKappa (containing a codon optimized, fully synthetic, human kappa light chain constant region (allotype Km3 ) in the mammalian expression vector pEE12.4 (Lonza Biologies, Slough, UK (Bebbington et al. (1992) Biotechnology 10:169-175)) using a ligation-independent cloning strategy (Aslanidis et al. Nucleic Acids Res. 18: 6069-6074) For each HuMab, 12 VL clones and 8 VH clones were sequenced and their theoretical masses were calculated and compared with available antibody mass spectrometry data. The sequences are given in the sequence list and in table. 1 below in this document. CDR sequences were determined according to Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). In table 2 and 3 provide an overview of antibody sequence information and most homologous germline sequences.
- 29 045516- 29 045516
Таблица 1. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH), вариабельной области легкой цепи (VL) и последовательности CDR из HuMabTable 1. Variable heavy chain (VH), variable light chain (VL) and CDR sequences from HuMab
- 30 045516- 30 045516
- 31 045516- 31 045516
- 32 045516- 32 045516
- 33 045516- 33 045516
- 34 045516- 34 045516
- 35 045516- 35 045516
- 36 045516- 36 045516
- 37 045516- 37 045516
Таблица .2. Гомологии мышиного первоисточника и последовательностей тяжелых цепейTable 2. Homologies of mouse origin and heavy chain sequences
Таблица 3. Гомологии мышиного первоисточника и последовательностей легких цепейTable 3. Homologies of mouse origin and light chain sequences
На фиг. 1 и 2 представлено выравнивание последовательностей HuMabs. На основании этих последовательностей может быть определена консенсусная последовательность для последовательностей CDR. Эти консенсусные последовательности представлены в табл. 4.In fig. Figures 1 and 2 show the sequence alignment of HuMabs. Based on these sequences, a consensus sequence for the CDR sequences can be determined. These consensus sequences are presented in Table. 4.
- 38 045516- 38 045516
Таблица 4. Консенсусные последовательностиTable 4. Consensus sequences
- 39 045516- 39 045516
Пример 12. Очистка антителExample 12 Antibody Purification
Культуральную надосадочную жидкость фильтровали через 0,2 мкм тупиковый фильтр и наносили на 5 мл колонки MabSelect SuRe (GE Health Care) и элюировали 0,1 M цитратом натрия - NaOH, рН 3. Элюат немедленно нейтрализовали 2 М Tris-HCl, pH 9 и диализовали в течение ночи против 12,6 мМ NaH2PO4, 140 мМ NaCl, pH 7,4 (B.Braun). В ином случае, после очистки элюат наносили на колонку HiPrep Desalting column и заменяли в антителах буфер на 12,6 мМ NaH2PO4, 140 мМ NaCl, pH 7,4 (B.Braun). После диализа или замены буфера образцы стерильно фильтровали через 0,2 мкм тупиковые фильтры. Чистоту определяли посредством ДСН-ПААГ, а концентрацию измеряли нефелометрией и по поглощению при 280 нм. Очищенные антитела хранили при 4°С. Масс-спектрометрию осуществляли для идентификации молекулярной массы тяжелой и легкой цепей антител, экспрессируемых гибридомами, как описано в примере 10.The culture supernatant was filtered through a 0.2 μm dead-end filter and applied to 5 ml MabSelect SuRe columns (GE Health Care) and eluted with 0.1 M sodium citrate-NaOH, pH 3. The eluate was immediately neutralized with 2 M Tris-HCl, pH 9 and dialyzed overnight against 12.6 mM NaH 2 PO 4 , 140 mM NaCl, pH 7.4 (B. Braun). Otherwise, after purification, the eluate was applied to a HiPrep Desalting column and the antibody buffer was replaced with 12.6 mM NaH 2 PO 4 , 140 mM NaCl, pH 7.4 (B. Braun). After dialysis or buffer exchange, samples were sterile filtered through 0.2 μm dead-end filters. Purity was determined by SDS-PAGE, and concentration was measured by nephelometry and absorbance at 280 nm. Purified antibodies were stored at 4°C. Mass spectrometry was performed to identify the molecular weight of the heavy and light chains of the antibodies expressed by the hybridomas as described in Example 10.
Пример 13. Связывание клонов анти-c-Met с опухолевыми клетками, которые экспрессируют мембраносвязанный c-Met, измеренное посредством анализа FACSExample 13 Binding of anti-c-Met clones to tumor cells that express membrane-bound c-Met measured by FACS analysis
Связывание антител c-Met и их моновалентных форм (также называемых в данном документе молекулами UniBody см. пример 5) с клетками А431, экспрессирующими мембраносвязанный c-Met (приобретенными у АТСС, CRL-1555), проверяли с помощью проточной цитометрии (FACS Canto II, BD Biosciences). Анализ Qifi (Dako, Глоструп, Дания) выявил, что клетки А431 экспрессируют в среднем 30The binding of c-Met antibodies and their monovalent forms (also referred to herein as UniBody molecules, see Example 5) to A431 cells expressing membrane-bound c-Met (purchased from ATCC, CRL-1555) was tested by flow cytometry (FACS Canto II BD Biosciences). The Qifi assay (Dako, Glostrup, Denmark) revealed that A431 cells express an average of 30
- 40 045516- 40 045516
000 копий белка c-Met на клетку. Связывание антител против c-Met и молекул UniBody определяли с помощью конъюгированных с фикоэритрином козьих антител, связывающих человеческие IgG (Jackson). IgG1-5D5 использовали в качестве положительного контрольного антитела, а HuMab-KLH использовали в качестве антитела изотипного контроля. Значения ЕС50 определяли посредством нелинейной регрессии (сигмоидальная кривая доза-эффект с вариабельным наклоном) с помощью программного обеспечения GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).000 copies of c-Met protein per cell. Binding of anti-c-Met antibodies and UniBody molecules was determined using phycoerythrin-conjugated goat human IgG binding antibodies (Jackson). IgG1-5D5 was used as a positive control antibody, and HuMab-KLH was used as an isotype control antibody. EC 50 values were determined by nonlinear regression (sigmoidal dose response curve with variable slope) using GraphPad Prism V4.03 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
На фиг. 3 показано, что все протестированные антитела и молекулы UniBody против c-Met связывают c-Met, экспрессируемый на клетках А431 дозозависимым способом. Значения EC50 для связывания варьируют в диапазоне 0,28-1,92 нМ для IgG и 0,52-13,89 нМ для молекул UniBody. Интересно, что антитело IgG1-024 продемонстрировало высокие уровни ненасыщенного связывания с клетками А431, которое не наблюдалось при тестировании связывания с клетками НТ-29 (приобретенных у АТСС, НТВ38™) (данные не представлены). Для антител 022, 024, 062, 064, 069, 098, 101 и 181, снижения ЕС50 не наблюдалось или наблюдалось менее чем 2 кратное снижение между IgG1 и молекулами UniBody идентичных клонов. Также уровни максимального связывания не менялись у IgG1 и молекул UniBody. Для антител 005, 006, 008, 035, 045 и 058, с другой стороны, при сравнении IgG1 с эквивалентным UniBody наблюдали больше чем 2 кратное уменьшение значения EC50, а также уменьшение уровня максимального связывания. Это, по всей вероятности, произошло из-за более низких скоростей диссоциации (Kd) этих антител (см. пример 14).In fig. Figure 3 shows that all anti-c-Met antibodies and UniBody molecules tested bind c-Met expressed on A431 cells in a dose-dependent manner. EC 50 values for binding range from 0.28-1.92 nM for IgG and 0.52-13.89 nM for UniBody molecules. Interestingly, the IgG1-024 antibody showed high levels of unsaturated binding to A431 cells, which was not observed when testing binding to HT-29 cells (purchased from ATCC, NTB38™) (data not shown). For antibodies 022, 024, 062, 064, 069, 098, 101 and 181, no reduction in EC 50 was observed or less than a 2-fold reduction was observed between IgG1 and UniBody molecules of identical clones. Also, the levels of maximum binding did not change for IgG1 and UniBody molecules. For antibodies 005, 006, 008, 035, 045 and 058, on the other hand, when comparing IgG1 with the equivalent UniBody, a greater than 2-fold decrease in EC 50 value was observed, as well as a decrease in the level of maximum binding. This was most likely due to the lower dissociation rates ( Kd ) of these antibodies (see example 14).
Пример 14. Анализ Octet для ранжирования аффинностиExample 14: Octet Analysis for Affinity Ranking
Связывание антитела с cMetECDHis анализировали посредством технологии Bio-Layer Interferometry (BLI) на системе Octet (Fortebio, Менло-Парк, США). Биосенсоры, покрытые антителами к человеческим IgG (Fc-специфичными) использовали для захвата антител против c-Met согласно процедуре, рекомендованной изготовителем. cMetECDHis, полученный из клеток HEK293, наносили сверху на иммобилизованные антитела против c-Met путем помещения загруженного биосенсора в лунку, содержащую 10 мкл/мл cMetECDHis разведенного в 10 раз в буфере для измерения кинетики (Fortebio). Различие в отражении света (Δλ, нм) поверхности биосенсора из-за связывания с cMetECDHis измеряли в реальном времени в течение примерно 10 минут, а для расчета константы ассоциации (ka[1/Мχс]) использовали программное обеспечение Octet (V4.0, Fortebio). Затем загруженный биосенсор помещали в лунку, содержащую только буфер для измерения кинетики (разведенный в 10 раз в PBS) для определения константы диссоциации (kd [1/с]). Анализ кинетики осуществляли для определения аффинности (KD [М]) при использовании модели 1:1 (ленгмюр). В качестве положительного контроля использовали 0,2 мкг/мл IgG15D5, продуцируемого клетками HEK293.Antibody binding to cMetECDHis was analyzed by Bio-Layer Interferometry (BLI) technology on an Octet system (Fortebio, Menlo Park, USA). Biosensors coated with anti-human IgG antibodies (Fc-specific) were used to capture anti-c-Met antibodies according to the procedure recommended by the manufacturer. HEK293 cell-derived cMetECDHis was coated on top of immobilized anti-c-Met antibodies by placing the loaded biosensor in a well containing 10 μL/mL cMetECDHis diluted 10-fold in kinetics measurement buffer (Fortebio). The difference in light reflectance (Δλ, nm) of the biosensor surface due to binding to cMetECDHis was measured in real time over approximately 10 minutes, and Octet software (V4.0, Fortebio). The loaded biosensor was then placed in a well containing only the kinetics buffer (diluted 10-fold in PBS) to determine the dissociation constant (kd [1/s]). Kinetics analysis was performed to determine affinity (K D [M]) using a 1:1 (Langmuir) model. 0.2 μg/ml IgG15D5 produced by HEK293 cells was used as a positive control.
В табл. 5 показано, что все антитела против c-Met связывают cMetECDHis с наномолярными аффинностями в диапазоне 0,6-13,9 нМ.In table Figure 5 shows that all anti-c-Met antibodies bind cMetECDHis with nanomolar affinities in the range of 0.6-13.9 nM.
Таблица 5. Кинетические константы (ka, kd и KD) антител при связывании с cMetECDHisTable 5. Kinetic constants ( ka , kd and KD ) of antibodies upon binding to cMetECDHis
Пример 15. Связывание антител против c-Met с мембрано-связанным c-Met на эпителиальных клетках макак-резусов, измеренное анализом FACSExample 15 Binding of anti-c-Met antibodies to membrane-bound c-Met on rhesus macaque epithelial cells measured by FACS analysis
Для определения кросс-реактивности с c-Met макак-резусов, связывание антител против c-Met с cMet-положительными эпителиальными клетками макак-резусов (4MBr-5, приобретенными у АТСС) тестировали с помощью проточной цитометрии (FACS Canto II, BD Biosciences). Конъюгированное с фикоэритрином козье антитело против человеческих IgG (Jackson) использовали в качестве вторичного конъюгата. HuMab-KLH использовали в качестве изотипного контрольного антитела.To determine cross-reactivity with rhesus monkey c-Met, binding of anti-c-Met antibodies to cMet-positive rhesus monkey epithelial cells (4MBr-5, purchased from ATCC) was tested by flow cytometry (FACS Canto II, BD Biosciences) . Phycoerythrin-conjugated goat anti-human IgG antibody (Jackson) was used as a secondary conjugate. HuMab-KLH was used as an isotype control antibody.
На фиг. 4 продемонстрировано, что все протестированные антитела против с-Met являются кроссреактивными с c-Met макаки-резуса. В обеих протестированных концентрациях (0,5 и 10 мкг/мл) антитеIn fig. 4 demonstrates that all anti-c-Met antibodies tested are cross-reactive with rhesus monkey c-Met. At both tested concentrations (0.5 and 10 µg/ml)
- 41 045516 ла против c-Met были способны специфически связывать c-Met макаки-резуса. Для всех антител, сигнал был, по меньшей мере, в 5 раз выше, чем для изотипного контрольного антитела HuMab-KLH. Интересно, что Р1016-035 продемонстрировал намного более высокие верхние уровни флуоресценции (MFI ~200 000) по сравнению с другими специфичными к c-Met антителами. Это различие не наблюдалось на клеточных линиях, экспрессирующих человеческий рецептор c-Met.- 41 045516 anti-c-Met la were able to specifically bind rhesus monkey c-Met. For all antibodies, the signal was at least 5-fold higher than that for the isotype control antibody HuMab-KLH. Interestingly, P1016-035 exhibited much higher upper fluorescence levels (MFI ~200,000) compared to other c-Met-specific antibodies. This difference was not observed in cell lines expressing the human c-Met receptor.
Пример 16. Блокирование связывания HGF с внеклеточным доменом c-Met, определенное с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА)Example 16: Blocking HGF Binding to the Extracellular Domain of c-Met Determined by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Для анализа возможности антител против c-Met блокировать связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с рецептором c-Met осуществляли тИФА. Для этого прикрепленный внеклеточный домен c-Met инкубировали с немеченым антителом против c-Met и флуоресцентно меченным HGF. Неблокирующие антитела не конкурируют с меченным HGF за связывание с c-Met, что дает максимальный сигнал флуоресценции.To analyze the ability of anti-c-Met antibodies to block the binding of hepatocyte growth factor (HGF) to the c-Met receptor, ELISA was performed. To do this, the attached extracellular domain of c-Met was incubated with unlabeled anti-c-Met antibody and fluorescently labeled HGF. Non-blocking antibodies do not compete with labeled HGF for binding to c-Met, resulting in maximum fluorescence signal.
Блокирующие антитела конкурируют с меченным HGF за связывание с c-Met, что приводит к снижению флуоресцентного сигнала.Blocking antibodies compete with labeled HGF for binding to c-Met, resulting in a decrease in fluorescent signal.
HGF (ProSpec Tarry, Реховот, Израиль) флуоресцентно метили путем конъюгации с Европием3+ (PerkinElmer, Турку, Финляндия). Лунки для тИФА покрывали в течение ночи при 4°С 0,5 мкг/мл рекомбинантным человеческим внеклеточным доменом c-Met (R&D systems, Миннеаполис, США), разведенным в PBS. Затем лунки для тИФА отмывали PBST (PBS, дополненный 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Звейндрехт, Нидерланды]) и блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) PBST, дополненным 2% (об./об.) куриной сывороткой (Gibco, Пейсли, Шотландия). После отмывки PBST, лунки для тИФА инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте со смесью 50 мкл серийно разведенного антитела против c-Met (0,128-10000 нг/мл в 5-кратных разведениях) и HGF, конъюгированным с 50 мкл 0,44 мкг/мл Европия3+ в PBST. Затем несвязанный HGF, конъюгированный с Европием3+, отмывали PBST, a связанный HGF, конъюгированный с Европием3+, инкубировали в течение 30 мин при КТ в темноте с раствором Delfia Enhancement Solution (PerkinElmer) для усиления флуоресцентного сигнала. Среднюю интенсивность флуоресценции при 615 нм измеряли с помощью ридера EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer) со следующими устанавливаемыми параметрами: парное зеркало Lance/Delfia, фильтр эмиссии 615, фильтр возбуждения 340 нм, время задержки 400 мкс, окно 400 мкс, 100 вспышек, 2000 мкс на цикл и двунаправленное построчное считывание. Для определения значений IC50, кривые связывание анализировали с помощью нелинейной регрессии (сигмоидальная кривая доза-эффект с вариабельным наклоном, высшие значения ограничены общим значением для всех наборов данных) с помощью программного обеспечения GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).HGF (ProSpec Tarry, Rehovot, Israel) was fluorescently labeled by conjugation with Europium 3+ (PerkinElmer, Turku, Finland). ELISA wells were coated overnight at 4°C with 0.5 μg/ml recombinant human c-Met extracellular domain (R&D systems, Minneapolis, USA) diluted in PBS. ELISA wells were then washed with PBST (PBS supplemented with 0.05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands]) and blocked for 1 h at room temperature (RT) with PBST supplemented with 2% (v/v). ) chicken whey (Gibco, Paisley, Scotland). After washing with PBST, ELISA wells were incubated for 1 h at room temperature in the dark with a mixture of 50 μl of serially diluted anti-c-Met antibody (0.128-10000 ng/ml in 5-fold dilutions) and HGF conjugated to 50 μl of 0. 44 µg/ml Europium 3+ in PBST. Unbound Europium 3+ -conjugated HGF was then washed with PBST, and bound Europium 3+ -conjugated HGF was incubated for 30 min at RT in the dark with Delfia Enhancement Solution (PerkinElmer) to enhance the fluorescent signal. The average fluorescence intensity at 615 nm was measured using an EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer) with the following settings: Lance/Delfia pair mirror, 615 emission filter, 340 nm excitation filter, 400 μs delay time, 400 μs window, 100 flashes, 2000 μs per cycle and bidirectional line-by-line readout. To determine IC50 values, binding curves were analyzed using nonlinear regression (sigmoidal dose-response curve with variable slope, highest values constrained to be common across all data sets) using GraphPad Prism V4.03 software (GraphPad Software, San Diego, California, USA).
На фиг. 5 представлены характерные примеры кривых ингибирования связывания HGF антителами против c-Met, связывающими внеклеточный домен рекомбинантного человеческого c-Met. 5D5 использовали в качестве положительного контрольного антитела. Все антитела против c-Met в эксперименте продемонстрировали свою способность конкурировать с HGF, конъюгированным с Европием3+, за связывание с рекомбинантным c-Met. Значения IC50 варьируют в диапазоне 0,0011-0,0794 мкг/мл. Без добавления HGF, конъюгированного с Европием3+, детектировали приблизительно 600 относительных флуоресцентных единиц (англ. relative fluorescent units, RFU), что указывает на уровень сигнала при достижении максимального ингибирования. Когда связывание HGF, конъюгированного с Европием3+, не ингибировалось, детектировали примерно ~66,000 RFU. Антитела 005, 006, 058, 101 и антитело положительного контроля 5D5 были способны ингибировать на 84,5-92,1% связывание HGF с рецептором c-Met. Все другие антитела были способны ингибировать связывание HGF с c-Met по меньшей мере на 55%. Поскольку HGF может связывать рецептор c-Met по обоим доменам SEMA и в Ig-области, некоторые антитела могут ингибировать только одно из этих взаимодействий. Для определения, какое из взаимодействий ингибировано, осуществляли анализ ингибирования на основе cMetSEMAHis резонансным переносом энергии флуоресценции с временным разрешением (англ. time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET).In fig. 5 shows representative examples of inhibition curves of HGF binding by anti-c-Met antibodies binding the extracellular domain of recombinant human c-Met. 5D5 was used as a positive control antibody. All anti-c-Met antibodies in the experiment demonstrated their ability to compete with Europium 3+ -conjugated HGF for binding to recombinant c-Met. IC 50 values vary in the range of 0.0011-0.0794 μg/ml. Without the addition of HGF conjugated to Europium 3+ , approximately 600 relative fluorescent units (RFU) were detected, indicating the signal level when maximum inhibition was achieved. When Europium 3+ -conjugated HGF binding was not inhibited, approximately ∼66,000 RFU were detected. Antibodies 005, 006, 058, 101 and the positive control antibody 5D5 were able to inhibit HGF binding to the c-Met receptor by 84.5-92.1%. All other antibodies were able to inhibit the binding of HGF to c-Met by at least 55%. Because HGF can bind the c-Met receptor at both the SEMA and Ig domains, some antibodies may inhibit only one of these interactions. To determine which interaction was inhibited, a cMetSEMAHis-based time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) inhibition assay was performed.
Пример 17. Конкуренция антител против c-Met за связывание с растворимым cMetECDHis, измеренная с помощью сэндвич-тИФА.Example 17: Competition of anti-c-Met antibodies for binding to soluble cMetECDHis measured by sandwich ELISA.
Во-первых, определяли концентрации оптимального покрытия тестируемых антител против c-Met и оптимальную концентрацию cMetECDHis. Далее лунки для тИФА покрывали в течение ночи при 4°С HuMab против c-Met, серийно разведенными в PBS (8 мкг/мл в 2-кратных разведениях). Затем лунки для тИФА отмывали PBST (PBS, дополненный 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Звейндрехт, Нидерланды]) и блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) PBSTC (PBST, дополненный 2% (об./об.) куриной сывороткой [Gibco, Пейсли, Шотландия]). После этого, лунки для тИФА отмывали PBST и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с биотинилированными cMetECDHis серийно разведенными в PBSTC (1 мкл/мл в 2-кратных разведениях). Несвязанный биотинилированный cMetECDHis отмывали с PBST, и связанный биотинилированный cMetECDHis инкубировали в течение 1 ч при КТ с 0,1 мкг/мл Стрептавидин-поли-HRP (Sanquin, Амстердам, Нидерланды) разведенным в PBST.First, the optimal coverage concentrations of the tested anti-c-Met antibodies and the optimal cMetECDHis concentration were determined. Next, ELISA wells were coated overnight at 4°C with HuMab against c-Met, serially diluted in PBS (8 μg/ml in 2-fold dilutions). ELISA wells were then washed with PBST (PBS supplemented with 0.05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands]) and blocked for 1 h at room temperature (RT) with PBSTC (PBST supplemented with 2% (v/v) vol.) chicken whey [Gibco, Paisley, Scotland]). Thereafter, ELISA wells were washed with PBST and incubated for one hour at room temperature with biotinylated cMetECDHis serially diluted in PBSTC (1 μl/ml in 2-fold dilutions). Unbound biotinylated cMetECDHis was washed with PBST, and bound biotinylated cMetECDHis was incubated for 1 h at RT with 0.1 μg/ml Streptavidin-poly-HRP (Sanquin, Amsterdam, the Netherlands) diluted in PBST.
- 42 045516- 42 045516
После отмывки, реакцию визуализировали после 15-минутной инкубации с 2,2'-азино-бис (3этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислотой (ABTS: развести одну таблетку ABTS в 50 мл буфера ABTS [Roche Diagnostics, Алмер, Нидерланды]) при КТ с защитой от света. Окрашивание останавливали путем добавления равного объема щавелевой кислоты (Sigma-Aldrich, Звейндрехт, Нидерланды). Флуоресценцию при 405 нм измеряли с помощью ридера микротитрационных планшетов (Biotek Instruments, Винуски, США). Условия, которые приводили к субоптимальному (прим. 80%) связыванию каждого антитела, были определены и использованы для последующих экспериментов перекрестного блокирования.After washing, the reaction was visualized after a 15-minute incubation with 2,2'-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS: dilute one ABTS tablet in 50 ml ABTS buffer [Roche Diagnostics, Almere, the Netherlands]) at RT with protection from light. Staining was stopped by adding an equal volume of oxalic acid (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands). Fluorescence at 405 nm was measured using a microtiter plate reader (Biotek Instruments, Winooski, USA). Conditions that resulted in suboptimal (approx. 80%) binding of each antibody were determined and used for subsequent cross-blocking experiments.
Лунки для тИФА покрывали антителом против c-Met в субоптимальной дозе, как описано выше. После блокировки лунки для тИФА инкубировали с заданной концентрацией биотинилированного cMetECDHis в присутствии избытка антитела против c-Met. Реакция развивалась, как описано выше. Остаточное связывание было выражено как процент относительно связывания, наблюдаемого в отсутствии антитела-конкурента.ELISA wells were coated with anti-c-Met antibody at a suboptimal dose as described above. After blocking, ELISA wells were incubated with a given concentration of biotinylated cMetECDHis in the presence of excess anti-c-Met antibody. The reaction proceeded as described above. Residual binding was expressed as a percentage relative to the binding observed in the absence of the competitor antibody.
Таблица 6. При добавлении в качестве конкурента, все антитела против c-Met были способны конкурировать за связывание с их иммобилизованными эквивалентами. 022, 058 и 5D5, при добавлении в качестве антител-конкурентов, конкурировали с антителами 005 и 006. Однако в обратной реакции выявили только частичную конкуренцию антител 005 и 006. Эти отличия могут быть объяснены более низкими аффинностями антител 005 и 006 к биотинилированному cMetECDHis. Антитело 5D5, при добавлении в качестве антитела-конкурента, также демонстрировало частичную конкуренцию с антителами 008 и 045, тогда как в обратной реакции не наблюдали или наблюдали минимальную конкуренцию. Кроме того, антитела 024, 062, 064, 068 и 181 при добавлении в качестве антител-конкурентов демонстрируют частичную конкуренцию с антителом 101, тогда как обратная реакция продемонстрировала полное ингибирование связывания cMetECDHis. Значения выше чем 100% могут быть объяснены эффектами авидности и образованием комплексов антитело-cMetECDHis, содержащим два неконкурирующих антитела.Table 6. When added as a competitor, all anti-c-Met antibodies were able to compete for binding with their immobilized equivalents. 022, 058 and 5D5, when added as competitor antibodies, competed with antibodies 005 and 006. However, the reverse reaction revealed only partial competition between antibodies 005 and 006. These differences may be explained by the lower affinities of antibodies 005 and 006 for biotinylated cMetECDHis. Antibody 5D5, when added as a competitor antibody, also showed partial competition with antibodies 008 and 045, while no or minimal competition was observed in the reverse reaction. Additionally, antibodies 024, 062, 064, 068 and 181, when added as competitor antibodies, showed partial competition with antibody 101, whereas the reverse reaction showed complete inhibition of cMetECDHis binding. Values higher than 100% can be explained by avidity effects and the formation of antibody-cMetECDHis complexes containing two non-competing antibodies.
Антитела 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 и 181 конкурируют друг с другом за связывание с cMetECDHis. Антитела 005, 006, 022 и 058 рассматривались как принадлежащие к одной перекрестноблокирующей группе, которая отличается полной конкуренцией с 005, 006, 022, 058 и 5D5. Однако антитело 5D5 было единственным антителом, которое также было способно конкурировать за связывание с антителом 045. Другая группа антител, которые конкурируют за связывание с cMetECDHis, образована из 008, 035 И G11-HZ.Antibodies 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 and 181 compete with each other for binding to cMetECDHis. Antibodies 005, 006, 022 and 058 were considered to belong to the same cross-blocking group, which is characterized by complete competition with 005, 006, 022, 058 and 5D5. However, antibody 5D5 was the only antibody that was also able to compete for binding with antibody 045. Another group of antibodies that compete for binding with cMetECDHis is formed from 008, 035, and G11-HZ.
Таблица 6. Конкуренция антител против c-Met за связывание с биотинилированным cMetECDHisTable 6. Competition of anti-c-Met antibodies for binding to biotinylated cMetECDHis
Конкуренция 75 -> 100%Competition 75 -> 100%
Конкуренция 25-74% конкуренция 0-24%Competition 25-74% competition 0-24%
- 43 045516- 43 045516
Представленные данные являются процентом ингибирования связывания ± ст. откл. 3 независимых экспериментов. Для антител 035, 5D5 и G11-HZ перекрестно-блокирующий тИФА осуществляли только дважды. Кроме того, несколько конкурентных реакций (*) давших значения Оптимальной плотности выше, чем 5,0, которые выше предела детекции ридера для тИФА. Эти результаты были исключены из анализа в результате повторных измерений.Data shown are percent binding inhibition ± st. off 3 independent experiments. For antibodies 035, 5D5 and G11-HZ, cross-blocking ELISA was performed only twice. In addition, several competitive reactions (*) gave Optimal Density values higher than 5.0, which are above the detection limit of the ELISA reader. These results were excluded from the analysis due to repeated measures.
Пример 18. Блокирование связывания HGF с cMetSEMA-567His8, определенное анализом резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (TR-FRET)Example 18 Blocking HGF Binding to cMetSEMA-567His8 Determined by Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer (TR-FRET) Assay
HGF может связывать рецептор c-Met как в домене SEMA, так и в IgG-области. Однако только связывание HGF с доменом SEMA оказалось критическим для активации рецептора. По этой причине, с помощью технологии TR-FRET было исследовано взаимодействие антител против c-Met с доменом SEMA рецептора c-Met. Для осуществления данного анализа на основе однородного сближения, фактор роста гепатоцитов (HGF, ProSpec Tarry, Реховот, Израиль) конъюгировали с флуоресцентным красителемакцептором AlexaFluor-647 (Invitrogen, Бреда, Нидерланды). cMetSEMA-567His8 метили флуоресцентной донорной молекулой, направленной против гистидиновой метки (Anti-6xhis Europium, PerkinElmer, Турку, Финляндия). Связывание HGF, конъюгированного с AlexaFluor-647, с меченным Европием3+ cMetSEMA-567His8 делает возможным перенос энергии с донорной молекулы (возбуждение 340 нм) на акцепторную молекулу (эмиссия 665 нм). Среднюю интенсивность флуоресценции при 665 нм измеряли на ридере EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer). Конкуренцию немеченых антител против c-Met с HGF, конъюгированным с AlexaFluor-647, измеряли по уменьшению сигнала TR-FRET при 665 нм, изза того, что в несвязанном состоянии дистанция между донорным и акцепторным флуорофорами слишком большая для осуществления переноса энергии.HGF can bind the c-Met receptor in both the SEMA and IgG domains. However, only the binding of HGF to the SEMA domain appears to be critical for receptor activation. For this reason, the interaction of anti-c-Met antibodies with the SEMA domain of the c-Met receptor was investigated using TR-FRET technology. To perform this homogeneous proximity assay, hepatocyte growth factor (HGF, ProSpec Tarry, Rehovot, Israel) was conjugated to the fluorescent dye acceptor AlexaFluor-647 (Invitrogen, Breda, the Netherlands). cMetSEMA-567His8 was labeled with a fluorescent donor molecule directed against the histidine tag (Anti-6xhis Europium, PerkinElmer, Turku, Finland). Binding of AlexaFluor-647-conjugated HGF to Europium 3+ -labeled cMetSEMA-567His8 allows energy transfer from the donor molecule (excitation 340 nm) to the acceptor molecule (emission 665 nm). The average fluorescence intensity at 665 nm was measured using an EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer). Competition of unlabeled anti-c-Met antibodies with HGF conjugated to AlexaFluor-647 was measured by the decrease in TR-FRET signal at 665 nm, due to the fact that in the unbound state the distance between the donor and acceptor fluorophores is too great for energy transfer to occur.
Все разведения были сделаны в 0,5х буфере для детекции LANCE Detection Buffer (PerkinElmer), дополненном 2,67% стабилизирующим раствором (PerkinElmer) и 0,03% (об./об.) Tween-20 (Riedel de Haen, Зельце, Германия). 25 мкл cMetSEMA-567His8 добавляли к 25 мкл HGF, конъюгированного с AlexaFluor-647, 35 мкл Anti-6xhis Europium3+ и 25 мкл немеченого антитела против c-Met в 96-луночном планшете opti-white (PerkinElmer). Была получена конечная концентрация 2,93 мкл/мл cMetSEMA567His8, 0,96 мкл/мл HGF, конъюгированного с AlexaFluor-647 и 0,4 мкл/мл Anti-6xhis Europium3+. Тестировали 4-кратное серийное разведение немеченого антитела против с-Met в диапазоне 0,49-8000 нг/мл. После инкубирования при 4°С в темноте в течение ночи. Среднюю интенсивность флюоресценции при 665 нм измеряли с помощью ридера EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer) со следующими устанавливаемыми параметрами: парное зеркало Lance/Delfia, фильтр эмиссии 615-665 нм, фильтр возAll dilutions were made in 0.5x LANCE Detection Buffer (PerkinElmer) supplemented with 2.67% Stabilizing Solution (PerkinElmer) and 0.03% (v/v) Tween-20 (Riedel de Haen, Selze, Germany). 25 μl of cMetSEMA-567His8 was added to 25 μl of AlexaFluor-647-conjugated HGF, 35 μl of Anti-6xhis Europium 3+ , and 25 μl of unlabeled anti-c-Met antibody in an opti-white 96-well plate (PerkinElmer). A final concentration of 2.93 μl/ml cMetSEMA567His8, 0.96 μl/ml HGF conjugated to AlexaFluor-647 and 0.4 μl/ml Anti-6xhis Europium 3+ was obtained. A 4-fold serial dilution of unlabeled anti-c-Met antibody was tested in the range of 0.49-8000 ng/ml. After incubation at 4°C in the dark overnight. The average fluorescence intensity at 665 nm was measured using an EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer) with the following set parameters: Lance/Delfia pair mirror, 615-665 nm emission filter, WHO filter
- 44 045516 буждения 320 нм, время задержки 60 мкс, окно 100 мкс, 100 вспышек, 2000 мкс на цикл и двунаправленное построчное считывание. Для определения значений IC50 кривые связывания анализировали с помощью нелинейной регрессии (сигмоидальная кривая доза-эффект с вариабельным наклоном) с помощью программного обеспечения GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).- 44 045516 320 nm wake-up, 60 µs latency, 100 µs window, 100 flashes, 2000 µs per cycle and bidirectional line readout. To determine IC50 values, binding curves were analyzed using nonlinear regression (sigmoidal dose response curve with variable slope) using GraphPad Prism V4.03 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
На фиг. 6 представлены кривые ингибирования связывания различных антител, связывающих Met, при связывании с cMetSEMA_567His8, протестированные с помощью TR-FRET. За исключением антител 008, 035 и 096, все антитела были способны конкурировать с HGF, конъюгированным с AlexaFluor647, за связывание с cMetSEMA-567His8. Антитело 022 было способно ингибировать ~80% связывания HGF, тогда как антитела 005, 006, 024, 045, 058, 061, 062, 064, 068, 069, 101, 181 и антитело положительного контроля 5D5 были способны ингибировать >90% связывание HGF с cMetSEMA-567His8. Определили значения IC50, которые находятся в диапазоне 0,082-0,624 мкг/мл.In fig. 6 shows the binding inhibition curves of various Met-binding antibodies upon binding to cMetSEMA_567His8 tested by TR-FRET. With the exception of antibodies 008, 035, and 096, all antibodies were able to compete with AlexaFluor647-conjugated HGF for binding to cMetSEMA-567His8. Antibody 022 was able to inhibit ~80% of HGF binding, while antibodies 005, 006, 024, 045, 058, 061, 062, 064, 068, 069, 101, 181 and the positive control antibody 5D5 were able to inhibit >90% of HGF binding with cMetSEMA-567His8. IC 50 values were determined to be in the range of 0.082-0.624 μg/ml.
Таблица 7. Значения IC50 (мг/мл) и процент ингибирования антителами против с-Met связывания лиганда с cMetSEMA-567His8, определенные с помощью TR-FRETTable 7. IC50 values (mg/ml) and percent inhibition of cMetSEMA-567His8 ligand binding by anti-c-Met antibodies determined by TR-FRET
Представленные данные являются средним MFI трех независимых экспериментов.Data shown are the average MFI of three independent experiments.
Пример 19. Анализ жизнеспособности KP4Example 19 KP4 Viability Assay
Антитела против c-Met тестировали по их способности ингибировать жизнеспособность клеток KP4 (Riken BioResource Center Cell Bank, RCB1005). Клетки KP4, которые аутокринным образом экспрессируют высокие уровни как c-Met, так и HGF, рассевали в 96-луночном культуральном планшете (Greiner bio-one, Фриккенхаузен, Германия) (10000 клеток/лунка) в бессывороточной среде (1 часть HAM's F12K [Cambrex, Ист-Резерфорд, Нью-Джерси] и 1 часть DMEM [Cambrex]). Получали 66,7 нМ разведение антитела c-Met в бессывороточной среде и добавляли к клеткам. Через 3 дня инкубации, количество жизнеспособных клеток подсчитывали с помощью Alamarblue (BioSource International, Сан-Франциско, США) согласно инструкции производителя. Флуоресценцию отслеживали с помощью ридера EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Турку, Финляндия) со стандартными параметрами для Alamarblue. Сигнал Alamarblue обработанных антителом клеток наносили на диаграмму в виде процента сигнала по сравнению с необработанными клетками.Antibodies against c-Met were tested for their ability to inhibit KP4 cell viability (Riken BioResource Center Cell Bank, RCB1005). KP4 cells, which express high levels of both c-Met and HGF in an autocrine manner, were seeded in a 96-well culture plate (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) (10,000 cells/well) in serum-free medium (1 part HAM's F12K [ Cambrex, East Rutherford, NJ] and 1 part DMEM [Cambrex]). A 66.7 nM dilution of c-Met antibody was prepared in serum-free medium and added to the cells. After 3 days of incubation, the number of viable cells was counted using Alamarblue (BioSource International, San Francisco, USA) according to the manufacturer's instructions. Fluorescence was monitored using an EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Finland) with standard parameters for Alamarblue. The Alamarblue signal of antibody-treated cells is plotted as a percentage of signal compared to untreated cells.
На фиг. 7 изображено процентное ингибирование жизнеспособных клеток KP4 после обработки антителом, связывающим c-Met, по сравнению с необработанными клетками (0%). Окаймленные рамкой клоны являются антителами, которые перекрестно конкурируют друг с другом как описано в примере 17. Интересно, что антитела 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 и 181, которые принадлежат к одной перекрестно-блокирующей группе, все были способны ингибировать жизнеспособность KP4 (18-46%), как виде IgG1, так и в виде молекул UniBody. Также молекулы IgG1 антител 008, 061 и 096 были способны ингибировать жизнеспособность KP4. Напротив, антитело 045 не ингибирует жизнеспособность KP4 ни в виде IgG1, ни в виде молекулы UniBody. Для Uni-1016-045-ТЕ это возможно происходит из-за его низкой кажущейся аффинности к мембраносвязанному c-Met, что измерено с помощью анализа FACS (пример 13). Антитела IgG1 клонов 005, 006, 022 и 058 не ингибируют значимым образом жизнеспособность KP4, тогда как Uni-1016-022-TE, Uni-1016-058-TE и IgG1-1016-058-wtFab ингибировали жизнеспособность KP4 на 57, 38 и 44% соответственно. Uni-1016-005 и Uni-1016-006 также перекрестно конкурируют с клонами 022 и 058, но не ингибируют значимым образом жизнеспособность KP4. Это возможно происходит из-за их низких кажущихся аффинностей, измеренных анализом FACS (пример 13). Интересно, что IgG4-1016-058 также продемонстрировал некоторое ингибирование жизнеспособности KP4. Этого не наблюдалось с IgG4-5D5).In fig. 7 depicts the percentage inhibition of viable KP4 cells after treatment with c-Met binding antibody compared to untreated cells (0%). Boxed clones are antibodies that cross-competite with each other as described in Example 17. Interestingly, antibodies 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 and 181, which belong to the same cross-blocking group, were all able inhibit the viability of KP4 (18-46%), both as IgG1 and UniBody molecules. Also, IgG1 antibody molecules 008, 061 and 096 were able to inhibit KP4 viability. In contrast, antibody 045 does not inhibit the viability of KP4 either as IgG1 or as the UniBody molecule. For Uni-1016-045-TE, this is possibly due to its low apparent affinity for membrane-bound c-Met as measured by FACS analysis (Example 13). IgG1 antibodies clones 005, 006, 022 and 058 did not significantly inhibit KP4 viability, whereas Uni-1016-022-TE, Uni-1016-058-TE and IgG1-1016-058-wtFab inhibited KP4 viability at 57, 38 and 44% respectively. Uni-1016-005 and Uni-1016-006 also cross-competed with clones 022 and 058 but did not significantly inhibit KP4 viability. This is possibly due to their low apparent affinities as measured by FACS analysis (Example 13). Interestingly, IgG4-1016-058 also showed some inhibition of KP4 viability. This was not observed with IgG4-5D5).
В целом данные указывают на то, что в некоторых перекрестно-блокирующих группах, для ингибирования жизнеспособности KP4 требуется моновалентное связывание, тогда как в других перекрестноOverall, the data indicate that in some cross-blocking groups, monovalent binding is required to inhibit KP4 viability, whereas in others cross-linking
- 45 045516 блокирующих группах жизнеспособность KP4 могут ингибировать как моновалентно, так и бивалентно связывающие антитела.- 45 045516 blocking groups KP4 viability can be inhibited by both monovalently and bivalently binding antibodies.
Пример 20. Опухолевая модель на основе ксенотрансплантата KP4 в SCID-мышахExample 20 KP4 Xenograft Tumor Model in SCID Mice
Опухолевую модель на основе ксенотрансплантата в SCID-мышах использовали для определения эффективности HuMab против c-Met при ингибировании опухолевого роста in vivo. Семи-одиннадцати недельные самки SCID-мышей, линии C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL, приобрели у Charles River Laboratories Nederland (Маастрихт, Нидерланды) и содержали в стерильных условиях в клетках с верхним фильтром с кормом и водой, которые предлагались ad libitum. Для идентификации мышей использовали микрочипы (PLEXX BV, Элст, Нидерланды). Все эксперименты были одобрены комитетом по этике отношения к животным университета Утрехта.A xenograft tumor model in SCID mice was used to determine the effectiveness of HuMab against c-Met in inhibiting tumor growth in vivo. Seven to eleven week old female SCID mice, strain C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL, were purchased from Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, The Netherlands) and maintained under sterile conditions in overhead filter cages with food and water offered ad libitum . Microchips (PLEXX BV, Elst, The Netherlands) were used to identify mice. All experiments were approved by the animal ethics committee of the University of Utrecht.
В день 0, 10x106 клеток KP4 инокулировали подкожно в 200 мкл PBS в правый бок. Мышей проверяли, по меньшей мере, дважды в неделю по клиническим признакам заболевания. Размер опухоли определяли, по меньшей мере, раз в неделю. Объемы (мм3) рассчитывали после измерений штангенциркулем (PLEXX) как 0,52 x (длина) x (ширина)2, начиная с 16 дня. На 9 день измеряли средние размеры опухолей и мышей разделяли на 8 групп по 7 мышей в каждой. Антитела против c-Met (008, 058, 069 и 098) инъецировали внутрибрюшинно. Антитело G11-HZ использовали в качестве антитела положительного контроля, тогда как антитела 5D5 и изотипного контроля использовали в качестве антител отрицательного контроля. Мыши получали насыщающую дозу 400 мкг/мышь с последующей еженедельной поддерживающей дозой 200 мкг/мышь, в течение 7 недель.On day 0, 10x106 KP4 cells were inoculated subcutaneously in 200 μl PBS in the right flank. Mice were monitored at least twice a week for clinical signs of disease. Tumor size was determined at least once a week. Volumes (mm3) were calculated after measurements with a caliper (PLEXX) as 0.52 x (length) x (width)2 from day 16 onwards. On day 9, the average tumor sizes were measured and the mice were divided into 8 groups of 7 mice each. Antibodies against c-Met (008, 058, 069, and 098) were injected i.p. Antibody G11-HZ was used as a positive control antibody, while 5D5 and isotype control antibodies were used as negative control antibodies. Mice received a loading dose of 400 μg/mouse followed by a weekly maintenance dose of 200 μg/mouse for 7 weeks.
Дополнительно образцы плазмы, собирали до введения 1, 3 и 5 поддерживающей дозы, а затем мышей умерщвляли, и определяли наличие человеческих IgG с помощью латексных гранул на нефелометре BNII (Dade Behring, Аттербури, Великобритания).Additionally, plasma samples were collected before maintenance doses 1, 3 and 5, and then mice were sacrificed and the presence of human IgG was determined using latex beads on a BNII nephelometer (Dade Behring, Atterbury, UK).
На фиг. 8 и 9 показано, что опухолевый рост клеток KP4 ингибировали HuMab 008, 069, 098 и положительный контроль G11-HZ. Ингибирование сравнивали с обработкой антителом изотипического контроля. Опухолевых рост клеток KP4 был замедлен, но не был полностью ингибирован контрольным антителом G11-HZ. Клоны 069 и 098 продемонстрировали более мощное ингибирование по сравнению с клонами 008 и G11-HZ. Антитела 5D5 и 058 не ингибировали опухолевый рост. Это согласовалось с данными in vitro, описанными в примере 19. В совокупности, эти данные указывают на то, что в некоторых перекрестно-блокирующих группах бивалентно связывающие антитела могут ингибировать рост опухоли КР4.In fig. 8 and 9 show that tumor growth of KP4 cells was inhibited by HuMab 008, 069, 098 and the positive control G11-HZ. Inhibition was compared with isotype control antibody treatment. Tumor growth of KP4 cells was slowed but not completely inhibited by the control antibody G11-HZ. Clones 069 and 098 showed more potent inhibition compared to clones 008 and G11-HZ. Antibodies 5D5 and 058 did not inhibit tumor growth. This was consistent with the in vitro data described in Example 19. Taken together, these data indicate that in certain cross-blocking groups, bivalent binding antibodies can inhibit KP4 tumor growth.
Пример 21. Опухолевая модель на основе ксенотрансплантата MKN45Example 21 Tumor model based on MKN45 xenograft
Опухолевую модель ксенотрансплантата человеческой аденокарциномы желудка MKN45 в голых мышах использовали для определения эффективности HuMab против с-Met при ингибировании опухолевого роста in vivo.The MKN45 human gastric adenocarcinoma xenograft tumor model in nude mice was used to determine the effectiveness of HuMab against c-Met in inhibiting tumor growth in vivo.
Клетки человеческой аденокарциномы желудка MKN45 культивировали при 37°С и 5% СО2 в среде RPMI-1640, содержащей 100 единиц/мл натриевой соли пенициллина G, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина, 25 мкг/мл гентамицина, 20% фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ глутамина. Использовали семи-восьми недельных самок голых мышей (nu/nu, Harlan) (массы тела в диапазоне от 17,0 до 26,4 г в начале исследования). Животные получали воду и корм ad libitum. Мышей размещали в условиях, удовлетворяющих рекомендациям руководства по уходу и использованию лабораторных животных. Уход за животными и программа использования были аккредитованы AAALAC. В 0 день, 1x10e7 клеток MKN45 инокулировали подкожно в 200 мкл 50% матригеля в PBS в бок каждой мыши. В 7 день, животных рассортировали в пять групп (n=10) со средним объемом опухоли от 80 до 120 мм3 и начали обработку. Антитела против c-Met (008, 058, 069) инъецировали в хвостовую вену (в.в.). Антитело G11-HZ использовали в качестве антитела положительного контроля, а антитело изотипического контроля использовали в качестве антитела отрицательного контроля. Все мыши получили 40 мг/кг антитела на 7 день и 20 мг/кг антитела на 14,21 и 28 день.Human gastric adenocarcinoma cells MKN45 were cultured at 37°C and 5% CO 2 in RPMI-1640 medium containing 100 units/ml sodium penicillin G, 100 μg/ml streptomycin sulfate, 25 μg/ml gentamicin, 20% fetal bovine serum and 2 mM glutamine. Seven to eight week old female nude mice (nu/nu, Harlan) (body weight ranging from 17.0 to 26.4 g at baseline) were used. Animals received water and food ad libitum. Mice were housed under conditions that met the recommendations of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The animal care and utilization program has been accredited by AAALAC. On day 0, 1x10e 7 MKN45 cells were inoculated subcutaneously in 200 μl of 50% Matrigel in PBS into the flank of each mouse. On day 7, animals were sorted into five groups (n=10) with an average tumor volume of 80 to 120 mm3 and treatment began. Antibodies against c-Met (008, 058, 069) were injected into the tail vein (i.v.). The G11-HZ antibody was used as a positive control antibody, and the isotype control antibody was used as a negative control antibody. All mice received 40 mg/kg antibody on day 7 and 20 mg/kg antibody on days 14, 21, and 28.
Опухоли измеряли дважды в неделю с помощью штангенциркуля до конечного объема опухоли 700 мм3 или до конца исследования (день 62). На фиг. 10 и 11 показано, что рост опухоли клеток MKN45 был значимо замедлен антителами 008, 058, 069, и контрольным антителом G11-HZ по сравнению с обработкой антителом изотипического контроля.Tumors were measured twice weekly using calipers until a final tumor volume of 700 mm 3 or until the end of the study (day 62). In fig. 10 and 11 show that tumor growth of MKN45 cells was significantly slowed by antibodies 008, 058, 069, and control antibody G11-HZ compared to treatment with isotype control antibody.
Пример 22. Снижение остаточной агонистической активности IgG1-антител против c-Met путем ослабления конформационной гибкостиExample 22 Reduction of residual agonist activity of anti-c-Met IgG1 antibodies by reducing conformational flexibility
Естественный лиганд c-Met, HGF, является функциональным димером, который индуцирует димеризацию двух молекул c-Met. Последующее внутриклеточное фосфорилирование внутриклеточного домена c-Met приводит к активации нескольких сигнальных путей, которые вовлечены в пролиферацию, инвазию и выживание клеток. Большинство бивалентных антител, индуцированных против c-Met, демонстрируют сравнимые с HGF эффекты на направление развития клеток, особенно когда связываемые антителом эпитопы в c-Met расположены около или в домене SEMA.The natural ligand of c-Met, HGF, is a functional dimer that induces dimerization of two c-Met molecules. Subsequent intracellular phosphorylation of the intracellular domain of c-Met leads to the activation of several signaling pathways that are involved in cell proliferation, invasion, and survival. Most bivalent antibodies raised against c-Met exhibit effects comparable to HGF on cell guidance, especially when the antibody-binding epitopes in c-Met are located near or in the SEMA domain.
Для минимизации потенциальной остаточной агонистической активности бивалентных антител IgG1, была использована стратегия уменьшения конформационной гибкости. В IgG1 у плечей Fab естьTo minimize potential residual agonist activity of bivalent IgG1 antibodies, a strategy to reduce conformational flexibility was used. In IgG1, Fab arms have
- 46 045516 большая степень свободы для движения относительно домена Fc. Наибольшие конформационные изменения являются результатом гибкости шарнира, который позволяет широкий диапазон углов Fab-Fc (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton and LA. Wilson. 2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility. J. Mol. Biol. 319: 9-18). Один путь уменьшения гибкости Fab-плеча в иммуноглобулинах заключается в предотвращении образования дисульфидных связей между легкой и тяжелой цепью посредством генетической модификации. В естественном антителе IgG1 легкая цепь соединена ковалентно с тяжелой цепью через дисульфидную связь, соединяющую С-концевой цистеин легкой цепи с цистеином в позиции 220 (С220 по нумерации EU) в шарнире Fc тяжелой цепи. Либо путем мутации аминокислоты С220 в серин или любую другую естественную аминокислоту, либо путем полного удаления шарнира, либо путем замены шарнира IgG1 на шарнир IgG3, образуется молекула, в которой легкие цепи соединены через их С-концевые цистеины, аналогично ситуации, обнаруженной в человеческом изотипе IgA2m(1). Это приводит к сниженной гибкости Fab относительно Fc и следовательно снижает способность к перекрестному связыванию, что показано в сравнительных исследованиях агонистического антитела против c-Met (5D5) в формате IgA2m(1) и IgG1 при анализе жизнеспособности KP4 (фиг. 12).- 46 045516 greater degree of freedom for movement relative to the Fc domain. The largest conformational changes result from the flexibility of the hinge, which allows a wide range of Fab-Fc angles (Ollmann Saphire, E., R.L. Stanfield, M.D.M. Crispin, P.W.H.I. Parren, P.M. Rudd, R.A. Dwek, D.R. Burton and L.A. Wilson. 2002. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility. J. Mol. Biol. 319: 9-18). One way to reduce the flexibility of the Fab arm in immunoglobulins is to prevent the formation of disulfide bonds between the light and heavy chains through genetic modification. In the natural IgG1 antibody, the light chain is linked covalently to the heavy chain through a disulfide bond connecting the C-terminal cysteine of the light chain to the cysteine at position 220 (C220 in EU numbering) in the heavy chain Fc hinge. Either by mutating amino acid C220 to serine or any other naturally occurring amino acid, or by removing the hinge entirely, or by replacing the IgG1 hinge with an IgG3 hinge, a molecule is produced in which the light chains are connected through their C-terminal cysteines, similar to the situation found in the human isotype IgA2m(1). This results in reduced flexibility of the Fab relative to the Fc and consequently reduced cross-linking ability, as shown in comparative studies of the c-Met agonist antibody (5D5) in IgA2m(1) format and IgG1 in the KP4 viability assay (Fig. 12).
Другая стратегия уменьшения гибкости молекулы IgG1 заключается в замене шарнира IgG1 на шарнир IgG2 или IgG2-nодобный шарнир. (Dangl et al. EMBO J. 1988; 7:1989-94). Данная шарнирная область имеет два свойства, отличные от свойств шарнира IgG1, которые, как считается, делают молекулу менее гибкой. Во-первых, по сравнению с шарниром IgG1 шарнир IgG2 на 3 аминокислоты короче. Вовторых* шарнир IgG2 содержит дополнительный цистеин, таким образом, образуется три, вместо двух, дисульфидных мостика внутри тяжелой цепи. В ином случае, может быть введен вариант шарнира IgG1, который имеет сходство с шарниром IgG2. Этот мутант (ТН7А6-9) (WO2010063746) содержит мутацию Т223С и две делеции (K222 и Т225) для образования более короткого шарнира с дополнительным цис теином.Another strategy to reduce the flexibility of the IgG1 molecule is to replace the IgG1 hinge with an IgG2 hinge or an IgG2-like hinge. (Dangl et al. EMBO J. 1988; 7:1989-94). This hinge region has two properties that are different from those of the IgG1 hinge, which are thought to make the molecule less flexible. First, compared to the IgG1 hinge, the IgG2 hinge is 3 amino acids shorter. Second*, the IgG2 hinge contains an additional cysteine, thus forming three, instead of two, disulfide bridges within the heavy chain. Alternatively, a variant IgG1 hinge may be introduced that is similar to the IgG2 hinge. This mutant (TH7A6-9) (WO2010063746) contains the T223C mutation and two deletions (K222 and T225) to form a shorter hinge with an additional cysteine.
Пример 23. Получение молекул IgG1 с пониженной гибкостью (жесткие молекулы IgG1)Example 23: Preparation of IgG1 Molecules with Reduced Flexibility (Rigid IgG1 Molecules)
Клонирование и экспрессияCloning and expression
Мутантные антитела IgG1 были разработаны и клонированы с помощью стандартных молекулярнобиологических методов. Обзор последовательностей всех полученных мутаций шарнирной области представлен в табл. 8 ниже.Mutant IgG1 antibodies were developed and cloned using standard molecular biology techniques. An overview of the sequences of all hinge region mutations obtained is presented in Table 1. 8 below.
Таблица 8. Аминокислотная последовательность шарнира мутантных IgG1-антител. Делеции отмечены '-', а мутации подчеркнуты.Table 8. Amino acid sequence of the hinge of mutant IgG1 antibodies. Deletions are marked with '-' and mutations are underlined.
IgGl Дикий ТипIgGl Wild Type
IgGl maPHHp-IgG2IgGl ma P HHp-IgG2
IgGl АС220IgGl AC220
IgGl C220SIgGl C220S
IgGl ΤΗ7Δ6-9IgGl ΤΗ7Δ6-9
IgGl с удаленным шарниром (Uni-IgGl)IgGl with hinge removed (Uni-IgGl)
IgGl IIIaPHHp-IgG3IgGl IIIa P HHp-IgG3
EPKSCDKTHTCPPCP ERKCCVE—СРРСР EPKS-DKTHTCPPCP EPKSSDKTHTCPPCP EPKSCD-CH-CPPCPEPKSCDKTHTCPPCP ERKCCVE—СРРСС EPKS-DKTHTCPPCP EPKSSDKTHTCPPCP EPKSCD-CH-CPPCP
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
Для экспрессии полученных жестких антител IgG1 в клетках млекопитающих, константную область НС из IgG1, содержащую мутации в области шарнира (см. выше таблицу 8), синтезировали в виде конструкта с оптимизированными кодонами в векторе для экспрессии в млекопитающих pcDNA3.3 (Invitrogen). Отдельный вектор сконструировали путем вставки оптимизированной по кодонам константной области в область человеческой легкой цепи каппа в pcDNA3.3. Области VH и VL клона 069 и контрольного антитела 5D5 вставляли в плазмиду с константной областью НС и плазмиду с легкой цепью каппа, что дает вектора для экспрессии (мутированных) тяжелой и легкой цепей специфических антител. Котрансфекция векторов с тяжелой и легкой цепями специфического антитела в клетках HEK-293F (Invitrogen), приводила к временной выработке мутантных антител. Очистку антител осуществляли с помощью аффинной колоночной хроматографии с протеином А (как описано в примере 11).To express the resulting IgG1 rigid antibodies in mammalian cells, the HC constant region from IgG1 containing mutations in the hinge region (see Table 8 above) was synthesized as a codon optimized construct in the mammalian expression vector pcDNA3.3 (Invitrogen). A separate vector was constructed by inserting a codon optimized constant region into the human kappa light chain region of pcDNA3.3. The VH and VL regions of clone 069 and the control antibody 5D5 were inserted into a HC constant region plasmid and a kappa light chain plasmid to provide vectors for the expression of the (mutated) heavy and light chains of specific antibodies. Cotransfection of specific antibody heavy and light chain vectors into HEK-293F cells (Invitrogen) resulted in transient production of mutant antibodies. Antibody purification was carried out using Protein A affinity column chromatography (as described in Example 11).
Определение биохимических характеристикDetermination of biochemical characteristics
Временная экспрессияTemporal Expression
Все мутанты экспрессировались на достаточных уровнях и не демонстрировали аберрантное образование мультимеров, что было определено посредством MS (>99% чистоты) и ДСН-ПААГ.All mutants were expressed at sufficient levels and did not exhibit aberrant multimer formation as determined by MS (>99% purity) and SDS-PAGE.
Результаты ДСН-ПААГ представлены на фиг. 13. Наблюдали в мутантах С220 (C220S и ДС220) и вариантах IgG1 с удаленным шарниром (варианты IgG1 с удаленным шарниром также называются UniBody-IgG1 или Uni-IgG1) спаривание легких цепей, видимое в виде белковой полосы около 50 кДа при анализе в невосстанавливающем ДСН-ПААГ. Вариант с шарниром IgG3 также продемонстрировал спаривание легких цепей, тогда как вариант с шарниром IgG2 и мутант IgG1 TH7A6-9 продемонстрировали нормальное спаривание легкой и тяжелой цепей.The results of SDS-PAGE are presented in Fig. 13. In C220 mutants (C220S and DS220) and hinge-deleted IgG1 variants (hinge-deleted IgG1 variants are also called UniBody-IgG1 or Uni-IgG1), light chain pairing was observed, visible as a protein band of about 50 kDa when analyzed in non-reducing SDS -PAAG. The IgG3 hinge variant also showed light chain pairing, whereas the IgG2 hinge variant and the IgG1 mutant TH7A6-9 showed normal light and heavy chain pairing.
Пример 24. Свойства связывания мутантов с c-MetExample 24 Binding properties of c-Met mutants
Свойства связывания мутантов с c-Met тестировали с помощью тИФА. Лунки планшета для тИФА покрывали в течение ночи при 4°С rhHGF R/Fc Chimera (R&D Systems; Cat.358MT/CF) в PBS (1 мкг/мл). Затем лунки для тИФА отмывали PBST (PBS, дополненный 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Звейндрехт,The c-Met binding properties of the mutants were tested by ELISA. ELISA plate wells were coated overnight at 4°C with rhHGF R/Fc Chimera (R&D Systems; Cat.358MT/CF) in PBS (1 μg/ml). The ELISA wells were then washed with PBST (PBS supplemented with 0.05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht,
- 47 045516- 47 045516
Нидерланды]) и блокировали в течение одного часа при комнатной температуре (КТ) PBSTC (PBST, дополненный 2% (об./об.) куриной сывороткой [Gibco, Пейсли, Шотландия]). После этого, лунки отмывали PBST и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителами против c-Met и вариантами, серийно разведенными в PBSTC (10 мкл/мл в 4-кратных разведениях). Несвязанное антитело отмывали с помощью PBST, и антитело, связанное с покрытием определяли при инкубации в течение одного часа при КТ с козьими F(ab')2-HRP против человеческих IgG, разведенных в PBST (Jackson cat.no. 109035-097). После отмывки, реакцию визуализировали 15-минутной инкубацией с 2,2'-азино-бис (3этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислотой (ABTS: развести одну таблетку ABTS в 50 мл буфера ABTS [Roche Diagnostics, Алмер, Нидерланды]) при КТ с защитой от света. Окрашивание останавливали путем добавления равного объема щавелевой кислоты (Sigma-Aldrich, Звейндрехт, Нидерланды). Флуоресценцию при 405 нм измеряли с помощью ридера микротитрационных планшетов (Biotek Instruments, Винуски, США). Все мутанты связывались с c-Met со сравнимой наблюдаемой аффинностью (ЕС50) (фиг. 14). В табл. 10 представлены значения EC50 мутантов, полученных в данном эксперименте.Netherlands]) and blocked for one hour at room temperature (RT) with PBSTC (PBST supplemented with 2% (v/v) chicken serum [Gibco, Paisley, Scotland]). Thereafter, wells were washed with PBST and incubated for 1 h at room temperature with antibodies against c-Met and variants serially diluted in PBSTC (10 μl/ml in 4-fold dilutions). Unbound antibody was washed with PBST, and coating bound antibody was detected by incubation for one hour at RT with goat F(ab')2-HRP anti-human IgG diluted in PBST (Jackson cat. no. 109035-097). After washing, the reaction was visualized by 15 min incubation with 2,2'-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS: dilute one ABTS tablet in 50 ml ABTS buffer [Roche Diagnostics, Almere, the Netherlands]) at RT with protection from light. Staining was stopped by adding an equal volume of oxalic acid (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands). Fluorescence at 405 nm was measured using a microtiter plate reader (Biotek Instruments, Winooski, USA). All mutants bound to c-Met with comparable observed affinity (EC50) (Fig. 14) Table 10 shows the EC50 values of the mutants obtained in this experiment.
Таблица 9. Значения EC50, определенные с помощью тИФАTable 9. EC 50 values determined using ELISA
Пример 25. Сниженный агонистический эффект жестких IgG1-антител против c-MetExample 25 Reduced agonist effect of rigid IgG1 antibodies against c-Met
Фосфорилирование рецепторовPhosphorylation of receptors
Для определения агонистических свойств защищенных антител исследовали воздействие антител на фосфорилирование c-Met. После димеризации двух соседствующих рецепторов c-Met либо естественным лигандом HGF, либо большинством бивалентных антител, три остатка тирозина (позиции 1230, 1234 и 1235) во внутриклеточном домене c-Met становятся перекрестно фосфорилированными, после чего происходит дальнейшее фосфорилирование нескольких других аминокислот внутриклеточного домена и активация нескольких сигнальных каскадов. Димеризацию и активацию c-Met можно, следовательно, отслеживать с помощью антител, специфичных к фосфорилированному в этих позициях рецептору, и таким образом можно использовать в качестве данных о потенциальном агонизме антител против c-Met.To determine the agonistic properties of the protected antibodies, the effect of the antibodies on c-Met phosphorylation was examined. Following dimerization of two adjacent c-Met receptors by either the natural HGF ligand or most bivalent antibodies, three tyrosine residues (positions 1230, 1234, and 1235) in the c-Met intracellular domain become cross-phosphorylated, followed by further phosphorylation of several other amino acids in the intracellular domain and activation of several signaling cascades. Dimerization and activation of c-Met can therefore be monitored using antibodies specific to the receptor phosphorylated at these positions and thus can be used as data on the potential agonism of anti-c-Met antibodies.
Клетки А549, CCL-185 полученные из АТСС, выращивали в сыворотке, содержащей среду DMEM, до достижения 70% конфлюэнтности. После трипсинизации и отмывки клетки рассевали в 6-луночном культуральном планшете по 1*10е6 клеток/лунку, в культуральную среду, содержащую сыворотку. После ночной инкубации клетки обрабатывали либо HGF (R&D systems; cat. 294-HG) (50 нг/мл), либо панелью антител (30 мкг/мл) и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Клетки затем отмывали дважды ледяным PBS и лизировали буфером для лизирования (Cell Signaling; cat. 9803) дополненным коктейлем ингибиторов протеаз (Roche; cat. 11836170001), образцы хранили при -80°С. Активацию рецептора определяли измерением фосфорилирования посредством вестерн-блоттинга с помощью антител, специфичных к фосфо-c-Met. Белки в клеточном лизате разделяли на 4-12% геле ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем окрашивали антителом, специфичным к фосфорилированному c-Met (Y1234/1235) (Cell Signaling, cat: 3129). Для контроля загрузки геля использовали антитела против общего c-Met и бета-актина. Результаты вестерн-блоттинга представлены на фиг. 15.A549, CCL-185 cells obtained from ATCC were grown in serum containing DMEM until 70% confluence was achieved. After trypsinization and washing, the cells were seeded in a 6-well culture plate at 1*10e6 cells/well in a culture medium containing serum. After overnight incubation, cells were treated with either HGF (R&D systems; cat. 294-HG) (50 ng/ml) or a panel of antibodies (30 μg/ml) and incubated for 15 min at 37°C. Cells were then washed twice with ice-cold PBS and lysed with lysis buffer (Cell Signaling; cat. 9803) supplemented with protease inhibitor cocktail (Roche; cat. 11836170001), and samples were stored at -80°C. Receptor activation was determined by measuring phosphorylation by Western blotting using phospho-c-Met-specific antibodies. Proteins in the cell lysate were separated on a 4-12% SDS-PAGE gel and transferred to a nitrocellulose membrane, which was then stained with an antibody specific for phosphorylated c-Met (Y1234/1235) (Cell Signaling, cat: 3129). Antibodies against total c-Met and beta-actin were used to control gel loading. The results of Western blotting are presented in Fig. 15.
Контроли среды тканевой культуры и клетки, обработанные моновалентным форматом UniBody антитела 5D5, не продемонстрировали фосфорилирования рецептора. Напротив, вестерн-блоттинг клеток, обработанных положительным контролем HGF или антителом-агонистом IgG1-1016-058, продемонстрировал четкую полосу ожидаемой массы. Антитело IgG1-1016-069 продемонстрировало низкое, но детектируемое фосфорилирование рецептора, что указывает на то, что имеет место некоторое перекрестное связывание рецептора. Однако варианты, которые были разработаны для уменьшения гибкости молекулы антитела, продемонстрировали минимальную активацию рецептора, вплоть до уровня, сравнимого с уровнями детектируемыми в клетках, обработанных моновалентным контролем Uni-5D5-TE (фиг. 15).Tissue culture media controls and cells treated with monovalent UniBody antibody 5D5 format did not demonstrate receptor phosphorylation. In contrast, Western blot analysis of cells treated with the positive control HGF or the agonist antibody IgG1-1016-058 demonstrated a clear band of the expected mass. Antibody IgG1-1016-069 showed low but detectable phosphorylation of the receptor, indicating that some cross-linking of the receptor occurs. However, variants that were designed to reduce the flexibility of the antibody molecule showed minimal receptor activation, to levels comparable to those detected in cells treated with the monovalent control Uni-5D5-TE (Fig. 15).
Эффект антител c-Met на пролиферацию NCI-H441 in vitroEffect of c-Met antibodies on NCI-H441 proliferation in vitro
Потенциальную пролиферативную агонистическую активность антител против с-Met тестировали с помощью клеточной линии легочной аденокарциномы NCI-H441 (АТСС, НТВ-174™), которая экспрессирует высокие уровни c-Met, но не продуцирует его лиганд HGF. Клетки NCI-H441 рассевали в 96луночные планшеты для тканевых культур (Greiner bio-one, Фриккенхаузен, Германия) (5000 клеток/лунку) в RPMI (Lonza) без сыворотки. Разведения антитела против c-Met (66,7 нМ) готовили в RPMI без сыворотки и добавляли к клеткам. Через 7 дней инкубации при 37°С/5% СО2, количество жизнеспособных клеток подсчитывали с помощью Alamarblue (BioSource International, Сан-Франциско, США) согласно инструкции производителя. Флуоресценцию отслеживали с помощью ридера EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Турку, Финляндия) со стандартными параметрами для Alamarblue.The potential proliferative agonist activity of anti-c-Met antibodies was tested using the lung adenocarcinoma cell line NCI-H441 (ATCC, NTV-174™), which expresses high levels of c-Met but does not produce its ligand HGF. NCI-H441 cells were seeded into 96-well tissue culture plates (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) (5000 cells/well) in RPMI (Lonza) without serum. Dilutions of anti-c-Met antibody (66.7 nM) were prepared in serum-free RPMI and added to the cells. After 7 days of incubation at 37°C/5% CO 2 , the number of viable cells was counted using Alamarblue (BioSource International, San Francisco, USA) according to the manufacturer's instructions. Fluorescence was monitored using an EnVision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Finland) with standard parameters for Alamarblue.
Как видно из фиг. 17 пролиферация клеток NCI-H441 сильно индуцируется агонистическими конAs can be seen from Fig. 17 proliferation of NCI-H441 cells is strongly induced by agonistic con
- 48 045516 трольными мАТ IgG1-058 и IgG1-5D5. Антитело IgG1-1016-069 также продемонстрировало агонистический эффект по сравнению с клетками, обработанными изотипическим контролем. Агонистическая активность IgG1-1016-069 может быть полностью устранена путем введения мутаций в С220, C220S и -del, и частично вариантами с шарниром IgG2 и ТН7А6-9 или с каркасом IgG2. Контрольные образцы, обработанные изотипным контролем и моновалентной версией 5D5 (Uni-5D5-ТЕ), не индуцировали рост клеток.- 48 045516 troll mAbs IgG1-058 and IgG1-5D5. The IgG1-1016-069 antibody also demonstrated an agonistic effect compared to cells treated with isotype control. The agonistic activity of IgG1-1016-069 can be completely eliminated by introducing mutations in C220, C220S and -del, and partially by variants with the IgG2 hinge and TH7A6-9 or with the IgG2 frame. Control samples treated with isotype control and the monovalent version of 5D5 (Uni-5D5-TE) did not induce cell growth.
Анализ жизнеспособности KP4KP4 Viability Assay
Способность ингибировать HGF-зависимые клетки также была определена для мутантов антитела против c-Met в анализе жизнеспособности KP4 (см. пример 19 для экспериментальных процедур). Результаты представлены на фиг. 17. Эффективность мутантов на основе IgG1-1016-069 полностью сохранялась или была незначительно лучше в С220-мутантах. Примечательно, что внесение мутации в С220 в агонистичное антитело 5D5 приводит к значительному снижению жизнеспособности KP4. Отсутствие агонистического эффекта у антител 058 и 5D5 в формате IgG1 наблюдали из-за высокой экспрессии HGF клетками KP4 (аутокринная петля HGF).The ability to inhibit HGF-dependent cells was also determined for anti-c-Met antibody mutants in the KP4 viability assay (see Example 19 for experimental procedures). The results are presented in Fig. 17. The effectiveness of IgG1-1016-069 mutants was completely preserved or was slightly better in C220 mutants. Notably, introducing a mutation at C220 into the agonistic antibody 5D5 resulted in a significant reduction in KP4 viability. The lack of agonistic effect of antibodies 058 and 5D5 in IgG1 format was observed due to the high expression of HGF by KP4 cells (HGF autocrine loop).
Отрицательная модуляцияNegative modulation
Отрицательная модуляция, индуцированная антагонистичными антителами, представляет собой механизм действия терапевтических антител против c-Met. Соответственно, в одном воплощении искомыми являются антитела с пониженными агонистическими свойствами, но с сохранившейся способностью индуцировать отрицательную модуляцию c-Met. Для определения отрицательного потенциала антител, клетки А549 (CCL-185, полученные из АТСС) рассевали в 6-луночные планшеты для тканевых культур (500 000 клеток/лунку) в клеточную культуральную среду с сывороткой и культивировали в течение ночи при 37°С. На следующее утро антитела против c-Met добавляли в конечной концентрации 10 мкг/мл и планшет инкубировали следующие 2 дня при 37°С. После отмывки PBS, клетки лизировали инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре с 250 мкл буфера для лизиса (Cell signaling, Данверс, США). Общий белок подсчитывали с помощью реактива для определения белка с бицинхолиновой кислотой (англ. bicinchoninic acid, BCA) (Pierce), следуя протоколу производителя. Уровни белка c-Met в клеточных лизатах подсчитывали с помощью специфичного к c-Met сэндвич-тИФА. С этой целью, лунки планшетов для тИФА покрывали в течение ночи при 4°С козьим антителом против человеческого c-Met, направленного против внеклеточного домена c-Met (R&D systems), разведенным в PBS (1 мкг/мл). Затем лунки для тИФА отмывали PBST (PBS, дополненный 0,05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Звейндрехт, Нидерланды]) и блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) PBSTC (PBST, дополненный 2% (об./об.) куриной сывороткой [Gibco, Пейсли, Шотландия]). Добавляли неразведенные клеточные лизаты (100 мкл) и инкубировали один час при КТ. После отмывки PBST лунки инкубировали один час при комнатной температуре с мышиным антителом против внутриклеточного остатка тирозина -1234 человеческого c-Met (Cell signaling), разведенного 1:1000 в PBSC. Лунки опять отмывали PBST и инкубировали в течение 1 ч при КТ с козьим антителом против мышиного Fc-HRP (Jackson), разведенным 1:5000 в PBSC. После отмывки PBST, реакцию визуализировали после 30-минутной инкубации с 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислотой (ABTS: развести одну таблетку ABTS в 50 мл буфера ABTS [Roche Diagnostics, Алмер, Нидерланды]) при КТ с защитой от света. Окрашивание останавливали путем добавления равного объема щавелевой кислоты (Sigma-Aldrich, Звейндрехт, Нидерланды). Флуоресценцию при 405 нм измеряли с помощью ридера микротитрационных планшетов (Biotek Instruments, Винуски, США). Как видно из фиг. 18 все мутанты антитела 069 были способны индуцировать отрицательную модуляцию.Negative modulation induced by antagonistic antibodies is the mechanism of action of therapeutic antibodies against c-Met. Accordingly, in one embodiment, antibodies are sought that have reduced agonistic properties but retain the ability to induce negative modulation of c-Met. To determine antibody negative potential, A549 cells (CCL-185, obtained from ATCC) were seeded into 6-well tissue culture plates (500,000 cells/well) in cell culture medium with serum and cultured overnight at 37°C. The next morning, anti-c-Met antibody was added at a final concentration of 10 μg/ml and the plate was incubated for the next 2 days at 37°C. After washing with PBS, cells were lysed by incubation for 30 min at room temperature with 250 μl of lysis buffer (Cell signaling, Danvers, USA). Total protein was calculated using bicinchoninic acid (BCA) protein reagent (Pierce) following the manufacturer's protocol. c-Met protein levels in cell lysates were quantified using a c-Met-specific sandwich ELISA. To this end, ELISA plate wells were coated overnight at 4°C with goat anti-human c-Met antibody directed against the extracellular domain of c-Met (R&D systems) diluted in PBS (1 μg/ml). ELISA wells were then washed with PBST (PBS supplemented with 0.05% Tween-20 [Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands]) and blocked for 1 h at room temperature (RT) with PBSTC (PBST supplemented with 2% (v/v) vol.) chicken whey [Gibco, Paisley, Scotland]). Undiluted cell lysates (100 μl) were added and incubated for one hour at RT. After washing with PBST, the wells were incubated for one hour at room temperature with a mouse antibody against the intracellular tyrosine residue -1234 of human c-Met (Cell signaling) diluted 1:1000 in PBSC. Wells were again washed with PBST and incubated for 1 h at RT with goat anti-mouse Fc-HRP antibody (Jackson) diluted 1:5000 in PBSC. After washing with PBST, the reaction was visualized after 30 min incubation with 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS: dilute one ABTS tablet in 50 ml ABTS buffer [Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands]) at CT with protection from light. Staining was stopped by adding an equal volume of oxalic acid (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands). Fluorescence at 405 nm was measured using a microtiter plate reader (Biotek Instruments, Winooski, USA). As seen in Fig. 18 all antibody 069 mutants were able to induce negative modulation.
Пример 26. Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC)Example 26 Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC)
Клетки MKN45 (приобретенные у RIKEN BioResource Center, Цукуба, Япония, RCB1001) собирали (5x106 клеток), отмывали (дважды в PBS, 1500 об./мин, 5 мин) и собирали в 1 мл среды RPMI 1640, дополненной 10% сывороткой CCS (cosmic calf serum) (HyClone, Логан, Юта, США), к которой добавляли 200 мкКи 51Cr (Хром-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Розендал, Нидерланды). Смесь инкубировали в перемешиваемой водяной бане в течение 1,5 ч при 37°С. После отмывки клеток (дважды в PBS, 1500 об./мин, 5 мин), клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% CCS, подсчитывали по включению трипанового синего и разводили до концентрации 1x105 клеток/мл.MKN45 cells (purchased from RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japan, RCB1001) were collected (5x106 cells), washed (twice in PBS, 1500 rpm, 5 min) and collected in 1 ml RPMI 1640 medium supplemented with 10% CCS serum (cosmic calf serum) (HyClone, Logan, Utah, USA), to which 200 μCi of 51 Cr (Chrome-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, the Netherlands) was added. The mixture was incubated in a stirred water bath for 1.5 h at 37°C. After washing the cells (twice in PBS, 1500 rpm, 5 min), the cells were resuspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% CCS, counted for trypan blue incorporation, and diluted to a concentration of 1x105 cells/ml.
При этом мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из свежих лейкотромбоцитарных слоев (Sanquin, Амстердам, Нидерланды) с помощью стандартного центрифугирования в градиенте плотности фиколла согласно инструкциям производителя (среда для отделения лимфоцитов; Lonza, Вервье, Франция). После ресуспендирования в среде RPMI 1640, дополненной 10% CCS, клетки подсчитывали по включению трипанового синего и концентрировали до 1x107 клеток/мл.In this case, peripheral blood mononuclear cells were isolated from fresh buffy coats (Sanquin, Amsterdam, the Netherlands) using standard Ficoll density gradient centrifugation according to the manufacturer's instructions (lymphocyte separation medium; Lonza, Verviers, France). After resuspension in RPMI 1640 medium supplemented with 10% CCS, cells were counted by trypan blue incorporation and concentrated to 1x107 cells/ml.
Для каждого эксперимента ADCC, 50 мкл меченных 51Cr клеток MKN45 (5000 клеток) предварительно инкубировали с 15 мкг/мл антитела против c-Met в конечном объеме 100 мкл среды RPMI, дополненной 10% CCS, в 96-луночном микротитрационном планшете. После 15 минут при КТ, добавляли 50 пкл РВМС (500,000 клеток), с получением соотношения эффектора к мишени 100:1. Максимальное количество лизиса клеток определяли инкубацией 50 мкл меченных 51Cr клеток MKN45 (5000 клеток) с 100For each ADCC experiment, 50 μl of 51 Cr-labeled MKN45 cells (5000 cells) were preincubated with 15 μg/ml anti-c-Met antibody in a final volume of 100 μl of RPMI medium supplemented with 10% CCS in a 96-well microtiter plate. After 15 minutes at RT, 50 pL of PBMC (500,000 cells) was added, resulting in an effector to target ratio of 100:1. The maximum amount of cell lysis was determined by incubating 50 μl of 51 Cr-labeled MKN45 cells (5000 cells) with 100
--
Claims (39)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/312,622 | 2010-03-10 | ||
DKPA201000191 | 2010-03-10 | ||
DKPA201000862 | 2010-09-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045516B1 true EA045516B1 (en) | 2023-11-30 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2019283925B2 (en) | Monoclonal antibodies against c-Met | |
JP6082344B2 (en) | Monoclonal antibody against HER2 epitope | |
DK2545077T3 (en) | Monoclonal antibodies to c-Met | |
EA045516B1 (en) | MONOCLONAL ANTIBODIES TO C-MET | |
NZ761608A (en) | Systems and methods for load balancing across media server instances | |
NZ761608B2 (en) | Systems and methods for merging and compressing compact tori |