EA045437B1 - HUMAN ANTIBODIES TO BET V 1 AND METHODS OF THEIR APPLICATION - Google Patents
HUMAN ANTIBODIES TO BET V 1 AND METHODS OF THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA045437B1 EA045437B1 EA201992651 EA045437B1 EA 045437 B1 EA045437 B1 EA 045437B1 EA 201992651 EA201992651 EA 201992651 EA 045437 B1 EA045437 B1 EA 045437B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- bet
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 58
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 347
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 345
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 262
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 258
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 242
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 240
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 240
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 147
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 claims description 81
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 claims description 81
- 241000219427 Fagales Species 0.000 claims description 80
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 78
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 70
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 60
- PORMUFZNYQJOEI-UHFFFAOYSA-N sumatriptan succinate Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O.CNS(=O)(=O)CC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 PORMUFZNYQJOEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 46
- 102000006392 myotrophin Human genes 0.000 claims description 41
- 108010058605 myotrophin Proteins 0.000 claims description 41
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 37
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 claims description 34
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 claims description 34
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 32
- 235000009131 Betula nigra Nutrition 0.000 claims description 30
- 244000276440 Betula nigra Species 0.000 claims description 30
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 30
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 30
- 235000010928 Betula populifolia Nutrition 0.000 claims description 29
- 244000089654 Betula populifolia Species 0.000 claims description 29
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 29
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 27
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 25
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 12
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 11
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 9
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims description 9
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims description 9
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 claims description 8
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 claims description 8
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 7
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 claims description 6
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000850 decongestant Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 claims 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 87
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 40
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 32
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 25
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 23
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 22
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 20
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 20
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 18
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 14
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 12
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 12
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 10
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 8
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 8
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 8
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 8
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710171134 Protein Bet Proteins 0.000 description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 6
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 5
- 235000001543 Corylus americana Nutrition 0.000 description 5
- 240000007582 Corylus avellana Species 0.000 description 5
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 description 5
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 5
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 5
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 5
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 5
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 4
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 4
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 4
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 4
- 241000726811 Carpinus betulus Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 3
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000726768 Carpinus Species 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 3
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 3
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 102220490345 S-adenosylhomocysteine hydrolase-like protein 1_S85A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- -1 phosphoryl groups Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 3
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 3
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 2
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 2
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 2
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 2
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 2
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 2
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 2
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 101100290060 Drosophila virilis Mal-B2 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010028735 Nasal congestion Diseases 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 2
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 2
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 2
- 235000009137 Quercus alba Nutrition 0.000 description 2
- 244000274906 Quercus alba Species 0.000 description 2
- 241000220221 Rosales Species 0.000 description 2
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 2
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 2
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 2
- 230000009285 allergic inflammation Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 2
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940032238 cat hair extract Drugs 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 208000027744 congestion Diseases 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000011201 multiple comparisons test Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009116 palliative therapy Methods 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- ORMNNUPLFAPCFD-DVLYDCSHSA-M phenethicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 ORMNNUPLFAPCFD-DVLYDCSHSA-M 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940046536 tree pollen allergenic extract Drugs 0.000 description 2
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 101100516975 Arabidopsis thaliana NPY1 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 description 1
- 241000219429 Betula Species 0.000 description 1
- 238000010152 Bonferroni least significant difference Methods 0.000 description 1
- 241001070941 Castanea Species 0.000 description 1
- 235000014036 Castanea Nutrition 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010052140 Eye pruritus Diseases 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000736192 Ostrya virginiana Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000168 bronchodilator agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940015979 epipen Drugs 0.000 description 1
- 210000004955 epithelial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940062714 humalog mix Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 229940090048 pen injector Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеField of technology to which the present invention relates
Настоящее изобретение относится к антителам человека и антигенсвязывающим фрагментам антител человека, которые связывают с аллергеном пыльцы березы, Bet v 1, терапевтическим композициям, содержащим антитела, и способам применения антител.The present invention relates to human antibodies and antigen-binding fragments of human antibodies that bind to the birch pollen allergen, Bet v 1, therapeutic compositions containing antibodies, and methods of using antibodies.
Перечень последовательностейList of sequences
Официальная копия перечня последовательностей подана одновременно с описанием изобретения в электронном виде посредством EFS-Web в виде отформатированного в соответствии с ASCII (Американский стандартный код обмена информацией) перечня последовательностей с названием файла 10301WO01_SEQ_LIST_ST25, датой создания 31 марта 2018 г. и размером, составляющим 137 KB. Перечень последовательностей, содержащийся в этом отформатированном согласно ASCII документе, является частью настоящего описания изобретения и тем самым полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.An official copy of the sequence listing is filed simultaneously with the specification electronically via EFS-Web as an ASCII (American Standard Information Interchange Code) formatted sequence listing with file name 10301WO01_SEQ_LIST_ST25, creation date March 31, 2018, and size 137 KB . The sequence listing contained in this ASCII formatted document is part of the present specification and is hereby incorporated by reference in its entirety.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Береза является преобладающей причиной возникновения аллергии у 23% пациентов с аллергией в США и 14% пациентов с аллергией в Европе (отчет Datamonitor report on Allergic Rhinitis, июль 2010 г.) и основной причиной аллергии 1 типа весной в Европе, Северной Америке, России и Австралии (Breiteneder et al., EMBO J. 1989, 8(7): 1935-8). Белок Bet v 1 является основным аллергеном березы, идентифицированным в пыльце Betula verrucosa (дерево европейской белой березы, синонимом также является название Betula pendula) и отвечает за связывание IgE более чем у 95% пациентов с аллергией на пыльцу березы (Breiteneder, выше). Bet v 1 представляет собой небольшой 7-цепочечный антипараллельный βлист с тремя α-спиралями и известной кристаллической структурой (Kofler et al., 2012, 422(1): 109-23; Markovic-Housley et al., J Mol Biol. 2003, 325(1): 123-33; Spangfort et al., J. Immunol. 2003, 171(6): 308490). Международная патентная публикация WO 94/10194 относится к пептидам, полученным из деревьев порядка Букоцветных (Fagales).Birch is the predominant cause of allergy in 23% of allergy patients in the United States and 14% of allergy patients in Europe (Datamonitor report on Allergic Rhinitis, July 2010) and the leading cause of type 1 allergies in the spring in Europe, North America, Russia and Australia (Breiteneder et al., EMBO J. 1989, 8(7): 1935-8). Bet v 1 protein is the major birch allergen identified in the pollen of Betula verrucosa (European white birch tree, also synonymous with Betula pendula) and is responsible for binding IgE in more than 95% of patients with birch pollen allergy (Breiteneder, supra). Bet v 1 is a small 7-stranded antiparallel βsheet with three α-helices and a known crystal structure (Kofler et al., 2012, 422(1): 109-23; Markovic-Housley et al., J Mol Biol. 2003, 325(1): 123-33; Spangfort et al., J. Immunol. 2003, 171(6): 308490). International patent publication WO 94/10194 relates to peptides obtained from trees of the order Fagales.
Шестьдесят процентов пациентов с аллергией на пыльцу березы реагируют исключительно на Bet v 1 (Jarolim et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1989, 88(1-2): 180-2). Одна береза может производить до пяти миллионов пыльцевых зерен, которые перемещаются по воздуху на расстояние до 100 ярдов от дерева. Симптомы аллергии на пыльцу березы могут варьироваться от легкого ринита и конъюнктивита до угрожающих жизни астматических реакций.Sixty percent of patients with birch pollen allergy respond exclusively to Bet v 1 (Jarolim et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1989, 88(1-2): 180-2). A single birch tree can produce up to five million pollen grains that travel through the air up to 100 yards from the tree. Symptoms of a birch pollen allergy can range from mild rhinitis and conjunctivitis to life-threatening asthmatic reactions.
Иммуноглобулин Е (IgE) отвечает за гиперчувствительность 1 типа, которая проявляется в аллергическом рините, аллергическом конъюнктивите, сенной лихорадке, аллергической бронхиальной астме, аллергии на пчелиный яд и аллергии на пищевые продукты. IgE циркулирует в крови и связывается с высокоаффинными рецепторами FcεR1α для IgE на базофилах и тучных клетках. При большинстве аллергических ответов аллергены попадают в организм при вдыхании, проглатывании или через кожу. Затем аллерген связывается с предварительно образованным IgE, уже связанным с высокоаффинным рецептором на поверхностях тучных клеток и базофилов, что приводит к перекрестному сшиванию нескольких молекул IgE и запуску высвобождения гистамина и других медиаторов воспаления, вызывающих различные аллергические симптомы.Immunoglobulin E (IgE) is responsible for type 1 hypersensitivity, which manifests itself in allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, hay fever, allergic bronchial asthma, bee venom allergy and food allergies. IgE circulates in the blood and binds to the high-affinity IgE receptors FcεR1α on basophils and mast cells. In most allergic responses, allergens enter the body through inhalation, ingestion, or through the skin. The allergen then binds to preformed IgE, already bound to a high-affinity receptor on the surfaces of mast cells and basophils, resulting in cross-linking of several IgE molecules and triggering the release of histamine and other inflammatory mediators, causing various allergic symptoms.
Лечение аллергии включает в себя стероиды для подавления иммунной активности и бронходилататоры для облегчения симптомов бронхиальной астмы. Десенсибилизирующую терапию также используют для пациентов с тяжелой аллергией. Комбинации пептидных вакцин были испытаны для десенсибилизации людей к определенным аллергенам, например Bet v 1 (см. патент США № 9017689). Для лечения аллергий были предложены антитела, поскольку они могут блокировать проникновение молекул аллергенов в ткани слизистой оболочки или могут связывать аллерген до того, как у него появится возможность связываться с IgE, связанным с высокоаффинным рецептором на тучных клетках или базофилах, таким образом предотвращая высвобождение гистамина и других медиаторов воспаления из этих клеток.Treatment for allergies includes steroids to suppress immune activity and bronchodilators to relieve asthma symptoms. Desensitization therapy is also used for patients with severe allergies. Combinations of peptide vaccines have been tested to desensitize people to certain allergens, such as Bet v 1 (see US Patent No. 9017689). Antibodies have been proposed for the treatment of allergies because they can block the penetration of allergen molecules into mucosal tissues or can bind the allergen before it has a chance to bind to IgE bound to the high affinity receptor on mast cells or basophils, thereby preventing the release of histamine and other inflammatory mediators from these cells.
В патенте США № 5670626 описано применение моноклональных антител для лечения IgEопосредованных аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит, аллергическая бронхиальная астма и аллергический конъюнктивит, путем блокирования связывания аллергенов с тканью слизистой оболочки. В патенте США № 6849259 описано применение аллерген-специфических антител для ингибирования аллергического воспаления в in vivo модели аллергии у мышей. Были описаны системы антител на основе молока и яиц. Например, в заявке на выдачу патента США № US 2003/0003133 A1 раскрыто использование молока в качестве носителя для аллергенов для индукции оральной толерантности к пыльце березы и другим аллергенам. Композиции и способы снижения аллергического ответа у животного на аллерген в окружающей среде посредством использования молекулы, которая ингибирует способность аллергена связываться с тучными клетками, были описаны в международной патентной публикации WO 1994/024164 А2. Другие антитела к Bet v 1 были упомянуты в патентном документе США №2010/0034812.US Pat. No. 5,670,626 describes the use of monoclonal antibodies to treat IgE-mediated allergic diseases such as allergic rhinitis, allergic bronchial asthma and allergic conjunctivitis by blocking the binding of allergens to mucosal tissue. US Pat. No. 6,849,259 describes the use of allergen-specific antibodies to inhibit allergic inflammation in an in vivo mouse model of allergy. Antibody systems based on milk and eggs have been described. For example, US Patent Application No. US 2003/0003133 A1 discloses the use of milk as an allergen carrier for inducing oral tolerance to birch pollen and other allergens. Compositions and methods of reducing the allergic response in an animal to an allergen in the environment by using a molecule that inhibits the ability of the allergen to bind to mast cells have been described in international patent publication WO 1994/024164 A2. Other antibodies to Bet v 1 were mentioned in US patent document No. 2010/0034812.
Настоящее изобретение направлено на преодоление одной или нескольких проблем, обсуждаемых выше.The present invention is directed to overcome one or more of the problems discussed above.
- 1 045437- 1 045437
Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief Disclosure of the Present Invention
В настоящем документе предусмотрены полностью человеческие моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают пыльцу березы, например натуральный Bet v 1, экстракт пыльцы березы Betula pendula (ВРЕ), ВРЕ Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia. Антитела могут являться применимыми для связывания аллергена Bet v 1 in vivo после воздействия аллергена березы на сенсибилизированного пациента и, как таковые, могут действовать либо для стимуляции удаления природного Bet v 1, экстракта пыльцы березы Betula pendula (ВРЕ), ВРЕ Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia, либо для блокирования связывания аллергена с предварительно образованным IgE на поверхности тучных клеток или базофилов. Таким образом, антитела, описанные в настоящем документе, могут предотвращать высвобождение гистамина или других медиаторов воспаления из тучных клеток или базофилов, тем самым предотвращая или уменьшая неблагоприятные эффекты, наблюдаемые у пациентов, сенсибилизированных к аллергену березы. Согласно определенным вариантам осуществления антитела могут быть способны уменьшать, минимизировать или предотвращать по меньшей мере один симптом у пациента, чувствительного к аллергену березы или аллергену, родственному аллергену березы, такой как чихание, конгестия, заложенность носа, кашель, одышка, бронхоспазм, ринит или конъюнктивит. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела могут быть способны предотвращать даже более серьезные осложнения in vivo, связанные с воздействием аллергена пыльцы березы на сенсибилизированных индивидуумов, такие как астматические реакции, анафилаксия или даже смерть.Provided herein are fully human monoclonal antibodies and antigen binding fragments thereof that bind birch pollen, such as natural Bet v 1, Betula pendula birch pollen extract (BPE), Betula nigra BPE or Betula populifolia BPE. The antibodies may be useful for binding Bet v 1 allergen in vivo following exposure of a sensitized patient to birch allergen and, as such, may act to promote the removal of either natural Bet v 1, Betula pendula birch pollen extract (BPE), Betula nigra BPE or Betula BPE populifolia, or to block the binding of the allergen to pre-formed IgE on the surface of mast cells or basophils. Thus, the antibodies described herein may prevent the release of histamine or other inflammatory mediators from mast cells or basophils, thereby preventing or reducing the adverse effects observed in patients sensitized to birch allergen. In certain embodiments, the antibodies may be capable of reducing, minimizing, or preventing at least one symptom in a patient sensitive to a birch allergen or a birch allergen-related allergen, such as sneezing, congestion, nasal congestion, cough, shortness of breath, bronchospasm, rhinitis, or conjunctivitis. . In some embodiments, the antibodies may be capable of preventing even more serious in vivo complications associated with birch pollen allergen exposure in sensitized individuals, such as asthmatic reactions, anaphylaxis, or even death.
Предусмотренные в настоящем документе антитела могут являться полноразмерными, например, антитело IgG1 или/и IgG4, или могут содержать только антигенсвязывающую часть, например, фрагмент Fab, F(ab')2 или scFv, и могут быть модифицированы, чтобы повлиять на функциональность, например, для устранения остаточных эффекторных функций (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164: 1925-1933).Antibodies provided herein may be full length, such as an IgG1 and/or IgG4 antibody, or may contain only an antigen binding portion, such as a Fab, F(ab')2, or scFv fragment, and may be modified to affect functionality, e.g. , to eliminate residual effector functions (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164: 1925-1933).
Первый аспект настоящего изобретения относится к выделенному моноклональному антителу человека или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с природным Bet v 1, экстрактом пыльцы березы Betula pendula (ВРЕ), ВРЕ Betula nigra и/или ВРЕ Betula populifolia.The first aspect of the present invention relates to an isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds to natural Bet v 1, Betula pendula birch pollen extract (BPE), Betula nigra BPE and/or Betula populifolia BPE.
Согласно одному варианту осуществления выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание природного Bet v 1, ВРЕ Betula pendula, ВРЕ Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia с аллерген-специфическим IgE.In one embodiment, the isolated human monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof inhibits the binding of naturally occurring Bet v 1, Betula pendula BPE, Betula nigra BPE, or Betula populifolia BPE to allergen-specific IgE.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Bet v 1 с KD, равной или составляющей меньше чем 10-8 М. Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Bet v 1 с KD, находящейся в диапазоне от приблизительно 10-8 до приблизительно 10-11 М. Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Bet v 1 с KD, равной или составляющей меньше чем 27,9 нМ. Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с Bet v 1 с KD, равной, находящейся в диапазоне от приблизительно 0,66 нМ до приблизительно 27,9 нМ.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen-binding fragment thereof binds to Bet v 1 with a KD equal to or less than 10 -8 M. In one embodiment, the human antibody or antigen-binding fragment thereof binds to Bet v 1 with a KD located at range from about 10 -8 to about 10 -11 M. In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof binds to Bet v 1 with a KD equal to or less than 27.9 nM. In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof binds to Bet v 1 with a K D ranging from about 0.66 nM to about 27.9 nM.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело.In one embodiment, the isolated human antibody is a fully human monoclonal antibody.
Согласно одному варианту осуществления выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент вступает в перекрестную реакцию с одним или несколькими аллергенами, выбранными из группы, состоящей из Aln g1, Cor a1, Car b1, Que a1, Api g2, Api g1, Dau c1, Mal d1, Ost c1, Fag s1 и Cas s1. Такие аллергены также можно назвать белками PR-10, или так называемыми белками, связанными с патогенезом (PR). Дополнительные белки PR-10 (представители семейства Bet v 1) также включают в себя Act с 8 и Act d 8 (киви), Ara h 8 (арахис), Pru ar 1 (абрикос), Pru av 1 (вишня), Pru р 1 (персик), Pyr с 1 (груша), Gly m 4 (соя), Vig r 1 (золотистая фасоль), Sola I 4 (помидор), Cuc m 3 (дыня), Rub i 1 (малина), и Fra a 1 (клубника). Указанные аллергены также можно считать аллергенами, родственными Fagales.In one embodiment, the isolated human monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof cross-reacts with one or more allergens selected from the group consisting of Aln g1, Cor a1, Car b1, Que a1, Api g2, Api g1, Dau c1, Mal d1, Ost c1, Fag s1 and Cas s1. Such allergens can also be called PR-10 proteins, or so-called pathogenesis-related (PR) proteins. Additional PR-10 proteins (members of the Bet v 1 family) also include Act c 8 and Act d 8 (kiwi), Ara h 8 (peanut), Pru ar 1 (apricot), Pru av 1 (cherry), Pru p 1 (peach), Pyr s 1 (pear), Gly m 4 (soybean), Vig r 1 (golden bean), Sola I 4 (tomato), Cuc m 3 (melon), Rub i 1 (raspberry), and Fra a 1 (strawberry). These allergens can also be considered Fagales-related allergens.
Согласно одному варианту осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вступает в перекрестную реакцию с одним или несколькими аллергенами, выбранными из группы, состоящей из Aln g1, Mal d1, Api g1, Car b1 и Cor a1.In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof cross-reacts with one or more allergens selected from the group consisting of Aln g1, Mal d1, Api g1, Car b1 and Cor a1.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в пределах любой из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290; и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в пределах любой из последовательностей вариабельной области легкой цепи (LCVR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298. Способы и техники идентификации CDR в пределах аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR хорошо известны в настоящей области техники и их можно использовать для идентификации CDR в пределах заданных аминокислотных последовательностей HCVR и/или LCVR, раскрытых в настоящем документе. Иллюстративные соглашения, которые можно использовать для идентификации границ CDR, включают в себя, например, определение согласно Kabat, определение согласно Chothia и определение AbM. В общих чер- 2 045437 тах, определение согласно Kabat основано на изменчивости последовательности, определение согласно Chothia основано на расположении областей структурной петли, а определение AbM является сочетанием подходов Kabat и Chothia. См., например, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., (1997), J. Mol. Biol. 273:927-948; и Martin et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:9268-9272. Общедоступные базы данных также доступны для идентификации последовательностей CDR в пределах антитела.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises three heavy chain CDRs (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) contained within any of the heavy chain variable region (HCVR) sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 and 290; and three light chain CDRs (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) contained within any of the light chain variable region (LCVR) sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106 , 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 and 298. Methods and techniques for identifying CDRs within the HCVR and LCVR amino acid sequences are well known in the art and can be used to identify CDRs within the specified amino acid sequences of HCVR and/or LCVR disclosed herein. Illustrative conventions that may be used to identify the boundaries of the CDR include, for example, the Kabat definition, the Chothia definition, and the AbM definition. In general terms, the Kabat definition is based on sequence variability, the Chothia definition is based on the location of structural loop regions, and the AbM definition is a combination of the Kabat and Chothia approaches. See, for example, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., (1997), J. Mol. Biol. 273:927-948; and Martin et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:9268–9272. Public databases are also available to identify CDR sequences within an antibody.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в пределах любой из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 146, 98 и 290; и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в пределах любой из последовательностей вариабельной области легкой цепи (LCVR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 154, 106 и 298.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises three heavy chain CDRs (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) contained within any of the heavy chain variable region (HCVR) sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 114, 146, 98 and 290; and three light chain CDRs (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) contained within any of the light chain variable region (LCVR) sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 122, 154, 106 and 298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178 , 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 and 290.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 146, 98 и 290.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114, 146, 98 and 290.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises an LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186 , 202, 218, 234, 250, 266 and 298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 154, 106 и 298.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises an LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 122, 154, 106, and 298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (a) HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290; и (b) LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises: (a) an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146 , 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 and 290; and (b) LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250 , 266 and 298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (a) HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 146, 98 и 290; и (b) LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 154, 106 и 298.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises: (a) an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114, 146, 98 and 290; and (b) LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 122, 154, 106 and 298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит следующее:In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises the following:
(a) домен HCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 и 292;(a) an HCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244 , 260, 276, 284 and 292;
(b) домен HCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 и 294;(b) an HCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246 , 262, 278, 286 and 294;
(c) домен HCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 и 296;(c) an HCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248 , 264, 280, 288 and 296;
(d) домен LCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 и 300;(d) an LCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252 , 268 and 300;
(e) домен LCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 и 302; и (f) домен LCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272 и 304.(e) an LCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254 , 270 and 302; and (f) an LCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272 and 304.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 и 290/298.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises a pair of amino acid sequences HCVR/LCVR selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82 /90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266 , 282/266 and 290/298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114/122, 146/154, 98/106 и 290/298.In one embodiment, the isolated human antibody or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence pair HCVR/LCVR selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114/122, 146/154, 98/106 and 290/298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 146/154 и 290/298.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises an HCVR/LCVR amino acid sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 146/154 and 290/298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 44 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 44 до - 3 045437In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid residues ranging from about position 23 to about position 44 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from approximately position 44 to - 3 045437
NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно 70 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 57 до приблизительно 70 согласно SEQ ID NO: 306; и аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 81 до приблизительно 96 согласно SEQ ID NO: 306.NO: 306; amino acid residues ranging from about position 44 to about 70 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about 2 to about 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about 57 to about 70 according to SEQ ID NO: 306; and amino acid residues ranging from about 81 to about 96 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 44 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 23 to about position 44 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 44 to about position 70 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 56 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 44 to about position 56 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 2 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 2 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 57 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 57 to about position 70 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 57 до приблизительно положения 66 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 57 to about position 66 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 81 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 81 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 81 до приблизительно положения 89 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with amino acid residues ranging from about position 81 to about position 89 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310 и 311. Эпитопы, содержащие SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310 или 311, можно удлинить на 1-5 аминокислот или 5-10 аминокислот, либо на С-конце, либо на N-конце. Например, эпитоп согласно SEQ ID NO: 311 при удлинении на 5-10 аминокислот охватывает эпитоп согласно SEQ ID NO: 115. Другими словами, эпитоп, содержащий SEQ ID NO: 311, например, включает в себя эпитоп согласно SEQ ID NO: 315.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 307, 308, 309, 310 and 311. Epitopes, containing SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310 or 311, can be extended by 1-5 amino acids or 5-10 amino acids, either at the C-terminus or at the N-terminus. For example, the epitope of SEQ ID NO: 311, when extended by 5-10 amino acids, encompasses the epitope of SEQ ID NO: 115. In other words, the epitope containing SEQ ID NO: 311, for example, includes the epitope of SEQ ID NO: 315.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с SEQ ID NO: 307.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 is reacted with SEQ ID NO: 307.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с SEQ ID NO: 308.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 is reacted with SEQ ID NO: 308.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с SEQ ID NO: 309.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 is reacted with SEQ ID NO: 309.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с SEQ ID NO: 310.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 is reacted with SEQ ID NO: 310.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с SEQ ID NO: 311.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 is reacted with SEQ ID NO: 311.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют с SEQ ID NO: 315.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 is reacted with SEQ ID NO: 315.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязы- 4 045437 вающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, взаимодействуют по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 и 315, и содержат пару последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ IDIn one embodiment, an isolated human antibody or antigen-binding fragment thereof that binds Bet v 1 reacts with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 and 315, and contain an HCVR/LCVR sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID
NO: 114/122, 146/154, 98/106 и 290/298.NO: 114/122, 146/154, 98/106 and 290/298.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые взаимодействуют с SEQ ID NO: 307, содержат три HCDR, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи согласно SEQ ID NO: 146, и три LCDR, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи согласно SEQ ID NO: 154.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that reacts with SEQ ID NO: 307 comprises three HCDRs contained in the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 146 and three LCDRs contained in the light chain variable region of SEQ ID NO: 154.
Согласно одному варианту осуществления выделенное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые взаимодействуют с SEQ ID NO: 310, содержат три HCDR, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи согласно SEQ ID NO: 290, и три LCDR, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи согласно SEQ ID NO: 298.In one embodiment, an isolated human antibody or antigen binding fragment thereof that reacts with SEQ ID NO: 310 comprises three HCDRs contained in the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 290 and three LCDRs contained in the light chain variable region of SEQ ID NO: 298.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 148, 150 и 152 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 156, 158 и 160 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 148, 150 and 152, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 156, 158 and 160 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 292, 294 и 296 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 300, 302 и 304 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 292, 294 and 296, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 300, 302 and 304 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 4, 6 и 8 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 12, 14 и 16 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 4, 6 and 8, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 12, 14 and 16 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 20, 22 и 24 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 28, 30 и 32 соответственно.In one embodiment, the human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 20, 22 and 24, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 28, 30 and 32 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 36, 38 и 40 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 44, 46 и 48 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 36, 38 and 40, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 44, 46 and 48 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 52, 54 и 56 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 60, 62 и 64 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 52, 54 and 56, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 60, 62 and 64 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 68, 70 и 72 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 76, 78 и 80 соответственно.In one embodiment, the human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 68, 70 and 72, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 76, 78 and 80 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 84, 86 и 88 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 92, 94 и 96 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 84, 86 and 88, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 92, 94 and 96 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 100, 102 и 104 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 108, 110 и 112 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 100, 102 and 104, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 108, 110 and 112 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 116, 118 и 120 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 124, 126 и 128 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 116, 118 and 120, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 124, 126 and 128 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 132, 134 и 136 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 140, 142 и 144 соответственно.In one embodiment, the human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 132, 134 and 136, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 140, 142 and 144 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 164, 166 и 168 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 172, 174 и 176 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 164, 166 and 168, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 172, 174 and 176 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 иIn one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2, and
- 5 045437- 5 045437
HCDR3 согласно SEQ ID NO: 180, 182 и 184 соответственно и аминокислотные последовательностиHCDR3 according to SEQ ID NO: 180, 182 and 184 respectively and amino acid sequences
LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 188, 190 и 192 соответственно.LCDR1, LCDR2 and LCDR3 according to SEQ ID NO: 188, 190 and 192, respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 196, 198 и 200 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 204, 206 и 208 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 196, 198 and 200, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 204, 206 and 208 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 212, 214 и 216 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 220, 222 и 224 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 212, 214 and 216, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 220, 222 and 224 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 228, 230 и 232 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 236, 238 и 234 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 228, 230 and 232, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 236, 238 and 234 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 244, 246 и 248 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 252, 254 и 256 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NOs: 244, 246 and 248, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NOs: 252, 254 and 256 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 260, 262 и 264 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 268, 270 и 272 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 260, 262 and 264, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 268, 270 and 272 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 276, 278 и 280 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 268, 270 и 272 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 276, 278 and 280, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 268, 270 and 272 respectively.
Согласно одному варианту осуществления антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержат аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 согласно SEQ ID NO: 284, 286 и 288 соответственно и аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 согласно SEQ ID NO: 268, 270 и 272 соответственно.In one embodiment, a human antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1 comprises the amino acid sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 284, 286 and 288, respectively, and the amino acid sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 268, 270 and 272 respectively.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к полностью человеческому моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с природным Bet v 1, BPE березы Betula pendula, BPE Betula nigra или BPE Betula populifolia, причем антитело или его фрагмент проявляет одну или несколько следующих характеристик: (i) содержит HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (ii) содержит LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (iii) содержит домен HCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 и 296, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272 и 304, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (iv) содержит домен HCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 и 292, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен HCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 и 294, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен LCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 и 300, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной изIn one embodiment, the present invention provides a fully human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds to native Bet v 1, Betula pendula BPE, Betula nigra BPE or Betula populifolia BPE, wherein the antibody or fragment thereof exhibits one or more of the following characteristics: (i) contains HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242 , 258, 274, 282 and 290, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (ii) contains an LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250 , 266 and 298, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (iii) contains an HCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 and 296, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and an LCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272 and 304, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (iv) contains an HCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 and 292, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; HCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 and 294, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; LCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 and 300, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and an LCDR2 domain with an amino acid sequence selected from
- 6 045437 группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 и 302, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (v) связывается с Bet v 1 с KD, равной или составляющей меньше чем 10-8 и находящейся в диапазоне от приблизительно 10-8 до приблизительно 10'11; (vi) демонстрирует эффективность по меньшей мере в одной модели анафилаксии или воспаления на животных; или (vii) конкурирует с эталонным антителом за связывание с природным Bet v 1, ВРЕ березы Betula pendula, BPE Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia.- 6 045437 group consisting of SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 and 302, or substantially a similar sequence that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (v) binds to Bet v 1 with a K D equal to or less than 10 -8 and ranging from about 10 -8 to about 10'11; (vi) demonstrates efficacy in at least one animal model of anaphylaxis or inflammation; or (vii) competes with the reference antibody for binding to natural Bet v 1, Betula pendula birch BPE, Betula nigra BPE or Betula populifolia BPE.
Согласно одному варианту осуществления эталонное антитело может включать в себя, например, антитела с комбинацией пар аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 и 290/298.In one embodiment, the reference antibody may include, for example, antibodies with a combination of heavy chain and light chain amino acid sequence pairs selected from the group consisting of 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74 , 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274 /266, 282/266 and 290/298.
Настоящее изобретение относится к антителам с модифицированным профилем гликозилирования. В некоторых применениях применимой может являться модификация для удаления нежелательных сайтов гликозилирования, или например, удаление фукозного фрагмента для увеличения функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al., 2002, JBC 277: 26733). В других применениях модификацию галактозилирования можно осуществить для модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC).The present invention relates to antibodies with a modified glycosylation profile. In some applications, modification to remove undesired glycosylation sites, or for example, removal of the fucose moiety to enhance antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function may be useful (see Shield et al., 2002, JBC 277: 26733). In other applications, modification of galactosylation can be carried out to modify complement dependent cytotoxicity (CDC).
Согласно второму аспекту предусмотрено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за специфическое связывание с природным Bet v 1, ВРЕ березы Betula pendula, BPE Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащими определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), причем HCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290; и CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем LCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298.In a second aspect, an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof is provided that competes for specific binding to native Bet v 1, Betula pendula birch BPE, Betula nigra BPE or Betula populifolia BPE with the antibody or antigen-binding fragment containing complementarity determining regions (CDRs) of the severe variable region chain (HCVR), wherein HCVR is characterized by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226 , 242, 258, 274, 282 and 290; and a light chain variable region (LCVR) CDR, wherein the LCVR is characterized by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 and 298.
Согласно одному варианту осуществления предусмотрено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за специфическое связывание с природным Bet v 1, ВРЕ березы Betula pendula, BPE Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащими определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), причем HCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 146, 98 и 290; и CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем LCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 154, 106 и 298.In one embodiment, an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof is provided that competes for specific binding to native Bet v 1, Betula pendula BPE, Betula nigra BPE, or Betula populifolia BPE with the antibody or antigen-binding fragment containing complementarity determining regions (CDRs) of the variable region heavy chain (HCVR), wherein HCVR is characterized by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114, 146, 98 and 290; and a light chain variable region (LCVR) CDR, wherein the LCVR is characterized by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 122, 154, 106 and 298.
Согласно родственному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые конкурируют за специфическое связывание с природным Bet v 1, ВРЕ березы Betula pendula, BPE Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащими CDR тяжелой и легкой цепей, содержащиеся в пределах пар последовательностей тяжелой и легкой цепей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 и 290/298.In a related embodiment, the present invention provides an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that competes for specific binding to native Bet v 1, Betula pendula birch BPE, Betula nigra BPE or Betula populifolia BPE with an antibody or antigen binding fragment containing heavy and light chain CDRs contained within pairs of heavy and light chain sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114 /122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 and 290/298 .
Согласно третьему аспекту предусмотрено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом на Bet v 1, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), причем HCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290; и CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем LCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298.According to a third aspect, there is provided an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds to the same epitope on Bet v 1 as the antibody or antigen binding fragment comprising heavy chain variable region (HCVR) complementarity determining regions (CDRs), wherein the HCVR is characterized by an amino acid sequence, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 and 290; and a light chain variable region (LCVR) CDR, wherein the LCVR is characterized by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 and 298.
Согласно одному варианту осуществления предусмотрено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом на Bet v 1, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), причем HCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 146, 98 и 290; и CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем LCVR характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 154, 106 и 298.In one embodiment, an isolated antibody or antigen binding fragment thereof is provided that binds to the same epitope on Bet v 1 as the antibody or antigen binding fragment comprising heavy chain variable region (HCVR) complementarity determining regions (CDRs), wherein the HCVR is characterized by an amino acid sequence , selected from the group consisting of SEQ ID NO: 114, 146, 98 and 290; and a light chain variable region (LCVR) CDR, wherein the LCVR is characterized by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 122, 154, 106 and 298.
Согласно родственному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом на Bet v 1, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR тяжелой и легкой цепей, содержащиеся в пределах пар последовательностей тяжелой и легкой цепей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186,In a related embodiment, provided herein is an isolated antibody or antigen binding fragment thereof that binds to the same epitope on Bet v 1 as the antibody or antigen binding fragment comprising heavy and light chain CDRs contained within pairs of heavy and light chain sequences, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186,
- 7 045437- 7 045437
194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 и 290/298.194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 and 290/298.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела к Bet v 1 или их фрагменты. Рекомбинантные экспрессионные векторы, несущие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, в которых такие векторы были введены, также предусмотрены в настоящем документе, как и способы получения антител путем культивирования клетокхозяев при условиях, обеспечивающих возможность получения антител, и выделения полученных антител.According to a fourth aspect, the present invention relates to nucleic acid molecules encoding antibodies to Bet v 1 or fragments thereof. Recombinant expression vectors carrying such nucleic acids and host cells into which such vectors have been introduced are also provided herein, as are methods for producing antibodies by culturing host cells under conditions that allow antibody production and isolating the resulting antibodies.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие моноклональное антитело человека или его фрагмент, которые связываются с природным Bet v 1, BPE Betula pendula, ВРЕ Betula nigra или BPE Betula populifolia.In one embodiment, provided herein are nucleic acid molecules encoding a human monoclonal antibody or fragment thereof that binds native Bet v 1, Betula pendula BPE, Betula nigra BPE, or Betula populifolia BPE.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрено антитело или его фрагмент, содержащие HCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 281 и 289, или по существу идентичной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% гомологией по отношению к ним.In one embodiment, provided herein is an antibody or fragment thereof comprising an HCVR encoded by a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145 , 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 281, and 289, or a substantially identical sequence having at least 90, at least 95, at least 98, or at least 99% homology in attitude towards them.
Согласно одному варианту осуществления HCVR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113, 145, 257 и 289.In one embodiment, HCVR is encoded by a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 113, 145, 257, and 289.
Согласно одному варианту осуществления антитело или его фрагмент дополнительно содержит LCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265 и 297, или по существу идентичной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% гомологией по отношению к ним.In one embodiment, the antibody or fragment thereof further comprises an LCVR encoded by a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185 , 201, 217, 233, 249, 265 and 297, or a substantially identical sequence having at least 90, at least 95, at least 98 or at least 99% homology thereto.
Согласно одному варианту осуществления LCVR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121, 153, 265 и 297.In one embodiment, the LCVR is encoded by a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 121, 153, 265, and 297.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие домен HCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 287 и 295, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271 и 303, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.In one embodiment, provided herein is an antibody or antigen binding fragment of an antibody comprising an HCDR3 domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 287 and 295, or a substantially similar sequence thereof which is characterized by at least 90, at least 95, at least 98 or at least 99% sequence identity; and an LCDR3 domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271 and 303, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90, at least 95, at least 98, or at least 99% sequence identity.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрено антитело или его фрагмент, дополнительно содержащие домен HCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 283 и 291, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен HCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 285 и 293, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен LCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267 и 299, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269 и 301, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.In one embodiment, provided herein is an antibody or fragment thereof further comprising an HCDR1 domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 283 and 291, or a substantially similar sequence thereof that is characterized by at least 90, at least 95, at least 98, or at least 99% sequence identity; HCDR2 domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261 , 277, 285 and 293, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90, at least 95, at least 98, or at least 99% sequence identity; LCDR1 domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267 and 299, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90, at least 95, at least 98, or at least 99% sequence identity; and an LCDR2 domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269 and 301, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90, at least 95, at least 98, or at least 99% sequence identity.
Согласно пятому аспекту предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество одного или нескольких выделенных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1, ВРЕ березы Betula pendula, BPE Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.According to a fifth aspect, there is provided a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of one or more isolated human antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to natural Bet v 1, Betula pendula birch BPE, Betula nigra BPE or Betula populifolia BPE, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество двух или более выделенных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с Bet v 1, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.In one embodiment, the pharmaceutical composition contains a therapeutically effective amount of two or more isolated human antibodies or antigen binding fragments thereof that bind to Bet v 1, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит следующее:According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains the following:
- 8 045437- 8 045437
а) первое выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, которые содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 146; и LCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено вa) a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, which contains HCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 146; and LCVR with amino acid sequence as presented in
SEQ ID NO: 154;SEQ ID NO: 154;
b) второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, которые содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 98 и 290; и LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 106 и 298; иb) a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, which contains an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114, 98 and 290; and LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 122, 106 and 298; And
c) одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.c) one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит следующее:According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains the following:
a) первое выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, которые содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 290; и LCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 298;a) a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, which contains an HCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 290; and LCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 298;
b) второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, которые содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114, 146 и 98; и LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, 154 и 106; иb) a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, which contains an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114, 146 and 98; and LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 122, 154 and 106; And
с) одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.c) one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит следующее:According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains the following:
a) первое выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, которые содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 146; и LCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 154;a) a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, which contains HCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 146; and LCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 154;
b) второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, которые содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 290; и LCVR с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 298; иb) a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, which contains an HCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 290; and LCVR with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 298; And
c) одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.c) one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит следующее:According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains the following:
a) первое выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие HCVR с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 146, и LCVR с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 154;a) a first isolated human monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising an HCVR with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 146, and an LCVR with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 154;
b) второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие HCVR с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 290, и LCVR с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 298;b) a second isolated human monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, comprising an HCVR having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 290, and an LCVR having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 298;
c) одно или несколько дополнительных выделенных моноклональных антител человека или антигенсвязывающих фрагментов, содержащих HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114 и 98, и LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122 и 106; иc) one or more additional isolated human monoclonal antibodies or antigen binding fragments comprising an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114 and 98, and an LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 122 and 106; And
d) одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.d) one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит следующее:According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains the following:
пе рвое выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, состоящую из SEQ ID NO: 146/154;a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, comprising the amino acid sequence pair HCVR/LCVR consisting of SEQ ID NO: 146/154;
второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 114/122, 98/106 и 290/298; и одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, comprising a pair of amino acid sequences HCVR/LCVR selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 114/122, 98/106 and 290/298; and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит следующее:According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains the following:
пе рвое выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, состоящую из SEQ ID NO: 146/154;a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, comprising the amino acid sequence pair HCVR/LCVR consisting of SEQ ID NO: 146/154;
второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, состоящую из SEQ ID NO: 290/298; и одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, comprising the amino acid sequence pair HCVR/LCVR consisting of SEQ ID NO: 290/298; and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит два или более выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с Bet v 1, содержащих пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 и 290/298; и одноIn one embodiment, the pharmaceutical composition comprises two or more isolated human monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof that bind to Bet v 1 containing HCVR/LCVR amino acid sequence pairs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2/10, 18/ 26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 and 290/298; and one
- 9 045437 или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.- 9 045437 or several pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит три или более выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с Bet v 1, содержащих пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 и 290/298; и одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises three or more isolated human monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof that bind to Bet v 1 containing HCVR/LCVR amino acid sequence pairs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2/10, 18/ 26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/266, 282/266 and 290/298; and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит четыре выделенных моноклональных антитела человека, которые связываются с Bet v 1, или их антигенсвязывающие фрагменты, причем антитела человека или их антигенсвязывающие фрагменты содержат пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 114/122, 146/154, 98/106 и 290/298; и одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises four isolated human monoclonal antibodies that bind to Bet v 1, or antigen binding fragments thereof, wherein the human antibodies or antigen binding fragments thereof comprise HCVR/LCVR amino acid sequence pairs according to SEQ ID NO: 114/122, 146/ 154, 98/106 and 290/298; and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело, обозначенное Н4Н16992Р, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 146/154; антитело, обозначенное Н4Н17082Р2, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 290/298; и антитело, обозначенное Н4Н17038Р2, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 98/106.According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains an antibody designated H4H16992P, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 146/154; an antibody designated H4H17082P2, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 290/298; and an antibody designated H4H17038P2, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 98/106.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело, обозначенное Н4Н16992Р, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 146/154; антитело, обозначенное Н4Н17082Р2, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 290/298; антитело, обозначенное Н4Н17038Р2, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 98/106; и антитело, обозначенное Н4Н16987Р, характеризующееся парой аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 114/122.According to one embodiment, the pharmaceutical composition contains an antibody designated H4H16992P, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 146/154; an antibody designated H4H17082P2, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 290/298; an antibody designated H4H17038P2, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 98/106; and an antibody designated H4H16987P, characterized by the amino acid sequence pair HCVR/LCVR according to SEQ ID NO: 114/122.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, причем первое антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 44 согласно SEQ ID NO: 306, и второго выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, причем второе антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, wherein the first antibody or fragment thereof reacts with amino acid residues ranging from about position 23 to about position 44 according to SEQ ID NO: 306, and a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, wherein the second antibody or fragment thereof reacts with amino acid residues ranging from about position 44 to about position 70 according to SEQ ID NO: : 306, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем первое антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306, и второго выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, причем второе антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотными остатками, находящимися в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 56 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a first isolated human monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that binds Bet v 1, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the first antibody or fragment thereof reacts with amino acid residues located in range from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306, and a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, wherein the second antibody or fragment thereof reacts with amino acid residues ranging from about position 44 to approximately position 56 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем первое антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 307, и второе выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с Bet v 1, причем второе антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 308, 309, 310, 311 или 315.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the first antibody or fragment thereof reacts with an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 307, and a second isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, wherein the second antibody or fragment thereof reacts with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 308, 309, 310, 311 or 315.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, и одного или нескольких дополнительных выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с Bet v 1, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем первое антитело или его фрагмент взаимодействует по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно 56 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находя- 10 045437 щихся в диапазоне от приблизительно 57 до приблизительно 70 согласно SEQ ID NO: 306; и аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 81 до 89 или приблизительно 81 до приблизительно 96 согласно SEQ ID NO: 306.In one embodiment, the pharmaceutical composition contains a therapeutically effective amount of a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, and one or more additional isolated human monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof that bind Bet v 1, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the first antibody or fragment thereof reacts with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid residues ranging from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 44 to about 56 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about 2 to about 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about 57 to about 70 according to SEQ ID NO: 306; and amino acid residues ranging from about 81 to about 89 or about 81 to about 96 according to SEQ ID NO: 306.
Согласно одному варианту осуществления одно или несколько дополнительных выделенных моноклональных антител человека или их фрагментов взаимодействуют по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно 56 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 57 до приблизительно 70 согласно SEQ ID NO: 306; и аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно 81 до 89 или приблизительно 81 до приблизительно 96 согласно SEQ ID NO: 306, причем по меньшей мере одно из одного или нескольких дополнительных выделенных моноклональных антител человека взаимодействует с другой аминокислотной последовательностью, чем первое выделенное моноклональное антитело человека.In one embodiment, one or more additional isolated human monoclonal antibodies or fragments thereof react with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid residues ranging from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306 ; amino acid residues ranging from about position 44 to about 56 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about 2 to about 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about 57 to about 70 according to SEQ ID NO: 306; and amino acid residues ranging from about 81 to about 89 or about 81 to about 96 according to SEQ ID NO: 306, wherein at least one of the one or more additional isolated human monoclonal antibodies reacts with a different amino acid sequence than the first isolated monoclonal antibody person.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество первого выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, и одного или нескольких дополнительных выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с Bet v 1, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем первое антитело или его фрагмент взаимодействует с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 307, и причем одно или несколько дополнительных антител или их фрагментов взаимодействуют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 308, 309, 310, 311 и 315.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of a first isolated human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, and one or more additional isolated human monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof that bind Bet v 1, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the first antibody or fragment thereof is reacted with an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 307, and wherein one or more additional antibodies or fragments thereof are reacted with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 308, 309, 310, 311 and 315.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество по меньшей мере двух выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1 или ВРЕ, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем по меньшей мере два антитела не конкурируют за связывание с природным Bet v 1 или ВРЕ. Согласно некоторым аспектам антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитела к Bet v 1, Н4Н16992Р и Н4Н17082Р2, содержащие пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 146/154 и 290/298 соответственно.In one embodiment, the pharmaceutical composition contains a therapeutically effective amount of at least two isolated human monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to naturally occurring Bet v 1 or BPE, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the at least two antibodies do not compete for binding with natural Bet v 1 or BPE. In some aspects, the antibodies or antigen binding fragments thereof are antibodies to Bet v 1, H4H16992P and H4H17082P2 comprising the HCVR/LCVR amino acid sequence pairs of SEQ ID NO: 146/154 and 290/298, respectively.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество по меньшей мере трех выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1 или ВРЕ, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем по меньшей мере три антитела не конкурируют за связывание с природным Bet v 1 или ВРЕ. Согласно некоторым аспектам антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитела к Bet v 1, Н4Н16992Р, Н4Н17082Р2 и Н4Н17038Р2, содержащие пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 146/154, 290/298 и 98/106 соответственно.In one embodiment, the pharmaceutical composition contains a therapeutically effective amount of at least three isolated human monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to naturally occurring Bet v 1 or BPE, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the at least three antibodies are not compete for binding with natural Bet v 1 or BPE. In some aspects, the antibodies or antigen binding fragments thereof are antibodies to Bet v 1, H4H16992P, H4H17082P2 and H4H17038P2 comprising the HCVR/LCVR amino acid sequence pairs of SEQ ID NO: 146/154, 290/298 and 98/106, respectively.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество по меньшей мере четырех выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1 или ВРЕ, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем по меньшей мере четыре антитела не конкурируют за связывание с природным Bet v 1 или ВРЕ. Согласно некоторым аспектам антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитела к Bet v 1, Н4Н16992Р, Н4Н17082Р2, Н4Н17038Р2 и Н4Н16987Р, содержащие пары аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR согласно SEQ ID NO: 146/154, 290/298, 98/106, и 114/122 соответственно.In one embodiment, the pharmaceutical composition contains a therapeutically effective amount of at least four isolated human monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to naturally occurring Bet v 1 or BPE, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the at least four antibodies are not compete for binding with natural Bet v 1 or BPE. In some aspects, the antibodies or antigen binding fragments thereof are antibodies to Bet v 1, H4H16992P, H4H17082P2, H4H17038P2, and H4H16987P, comprising the HCVR/LCVR amino acid sequence pairs of SEQ ID NOs: 146/154, 290/298, 98/106, and 114 /122 respectively.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с Bet v 1, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вступают в перекрестную реакцию с одним или несколькими аллергенами, выбранными из группы, состоящей из Aln g1, Cor a1, Car b1, Que a1, Api g2, Api g1, Dau c1, Mal d1, Ost c1, Fag s1 и Cas s1. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вступает в перекрестную реакцию с одним или несколькими аллергенами, выбранными из группы, состоящей из Aln g1, Mal d1, Api g1, Car b1 и Cor a1.In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of an isolated human monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that binds Bet v 1, together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof cross-reacts with one or more allergens selected from the group consisting of Aln g1, Cor a1, Car b1, Que a1, Api g2, Api g1, Dau c1, Mal d1, Ost c1, Fag s1 and Cas s1. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof cross-reacts with one or more allergens selected from the group consisting of Aln g1, Mal d1, Api g1, Car b1, and Cor a1.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к композиции, которая представляет собой комбинацию терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител к Bet v 1 или их антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению и терапевтически эффективное количество второго терапевтического средства вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.In one embodiment, the present invention provides a composition that is a combination of a therapeutically effective amount of one or more anti-Bet v 1 antibodies or antigen binding fragments thereof according to the present invention and a therapeutically effective amount of a second therapeutic agent together with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
- 11 045437- 11 045437
Второе терапевтическое средство может представлять собой низкомолекулярное лекарственное средство, белок/полипептид, антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, такую как антисмысловая молекула, или киРНК. Второе терапевтическое средство может являться синтетическим или происходящим из природного источника.The second therapeutic agent may be a small molecule drug, a protein/polypeptide, an antibody, a nucleic acid molecule such as an antisense molecule, or a siRNA. The second therapeutic agent may be synthetic or derived from a natural source.
Второе терапевтическое средство может представлять собой любое средство, которое эффективно сочетается с антителом или его фрагментом согласно настоящему изобретению, например, второе антитело, отличное от описанных в настоящем документе, которое способно блокировать связывание Bet v 1 с присутствующим на тучных клетках или базофилах IgE. Вторым терапевтическим средством также может являться любое средство, которое используют в качестве стандарта лечения аллергического ответа на любой аллерген. Такое второе терапевтическое средство может представлять собой антигистамин, эпинефрин, противозастойное средство, кортикостероид или пептидную вакцину.The second therapeutic agent may be any agent that is effectively combined with an antibody or fragment thereof of the present invention, for example, a second antibody other than those described herein that is capable of blocking the binding of Bet v 1 to IgE present on mast cells or basophils. The second therapeutic agent may also be any agent that is used as a standard of care for the treatment of an allergic response to any allergen. Such second therapeutic agent may be an antihistamine, epinephrine, decongestant, corticosteroid, or peptide vaccine.
Согласно определенным вариантам осуществления второе терапевтическое средство может представлять собой средство, которое помогает нейтрализовать или уменьшить любой(ые) возможный(е) побочный(е) эффект(ы), связанный(е) с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела согласно настоящему изобретению, если такой(ие) побочный(е) эффект(ы) должно(ы) произойти.In certain embodiments, the second therapeutic agent may be an agent that helps neutralize or reduce any potential side effect(s) associated with the antibody or antigen binding fragment of an antibody of the present invention, if any. side effect(s) should occur.
Также следует понимать, что антитела и фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению можно применять в видах комбинированной терапии, т.е. антитела и фармацевтически приемлемые композиции можно вводить одновременно, до или после одного или нескольких других требуемых терапевтических средств или медицинских процедур, включая в себя, например, в комбинации со схемой аллерген-специфической иммунотерапии (SIT), когда антитела вводят до или во время SIT. Конкретная комбинация видов лечения (терапевтических средств или процедур) для применения в комбинированной схеме будет учитывать совместимость требуемых терапевтических средств и/или процедур и требуемого терапевтического эффекта, который должен быть достигнут. Также следует понимать, что применяемые виды терапии могут достигать требуемого эффекта в отношении того же нарушения (например, антитело можно вводить одновременно с другим средством, применяемым для лечения того же нарушения), или они могут достигать различных эффектов (например, контроль любых неблагоприятных эффектов). Используемые в настоящем документе дополнительные терапевтические средства, которые, как правило, вводят для лечения или предотвращения конкретного заболевания или состояния, являются подходящими для заболевания или состояния, подлежащих лечению.It should also be understood that the antibodies and pharmaceutically acceptable compositions of the present invention can be used in combination therapies, i.e. The antibodies and pharmaceutically acceptable compositions can be administered simultaneously, before or after one or more other desired therapeutic agents or medical procedures, including, for example, in combination with an allergen-specific immunotherapy (SIT) regimen where the antibodies are administered before or during SIT. The specific combination of treatments (therapeutic agents or procedures) to be used in a combination regimen will take into account the compatibility of the required therapeutic agents and/or procedures and the desired therapeutic effect to be achieved. It should also be understood that the therapies used may achieve the desired effect for the same disorder (e.g., the antibody may be administered concomitantly with another agent used to treat the same disorder), or they may achieve different effects (e.g., control of any adverse effects). . As used herein, additional therapeutic agents that are typically administered to treat or prevent a specific disease or condition are appropriate for the disease or condition being treated.
При совместном введении нескольких терапевтических средств дозировки можно соответствующим образом скорректировать, как это установлено в соответствующей области техники.When multiple therapeutic agents are coadministered, dosages can be adjusted accordingly, as established in the art.
Согласно шестому аспекту предусмотрен способ лечения пациента, который демонстрирует чувствительность или аллергический ответ по отношению к белку Fagales, родственному Fagales аллергену, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1, или лечения по меньшей мере одного симптома или осложнения, ассоциированного с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к белку Fagales, родственному Fagales аллергену, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1, предусматривающий введение эффективного количества одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra или ВРЕ Betula populifolia, или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra или BPE Betula populifolia, нуждающемуся в этом пациенту, причем чувствительность или аллергический ответ по отношению к белку Fagales, родственному Fagales аллергену, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1 или предотвращается, или уменьшается по степени тяжести и/или продолжительности, или по меньшей мере один симптом или осложнение, ассоциированные с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к белку Fagales, родственному Fagales аллергену, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1, предотвращаются или уменьшаются по интенсивности, или частота и/или продолжительность или степень тяжести чувствительности или аллергического ответа по отношению к белку Fagales, родственному Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1 снижается после введения одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их фрагментов, которые связываются с природным Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra или BPE Betula populifolia, или после введения композиции, содержащей любое одно или несколько указанных выше антител.According to a sixth aspect, there is provided a method of treating a patient who exhibits a sensitivity or allergic response to Fagales protein, a Fagales-related allergen, birch pollen or an extract thereof, or Bet v 1 protein, or treating at least one symptom or complication associated with the sensitivity or allergic response. a response to Fagales protein, Fagales-related allergen, birch pollen or an extract thereof, or Bet v 1 protein, involving the administration of an effective amount of one or more isolated human monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to natural Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra or BPE Betula populifolia, or a pharmaceutical composition containing an effective amount of one or more isolated human monoclonal antibodies or fragments thereof that bind to natural Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra or BPE Betula populifolia, to a patient in need thereof wherein sensitivity or allergic response to Fagales protein, Fagales-related allergen, birch pollen or an extract thereof, or Bet v 1 protein is either prevented or reduced in severity and/or duration, or at least one symptom or complication associated with sensitivity or allergic response to Fagales protein, Fagales-related allergen, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1 protein is prevented or reduced in intensity, or the frequency and/or duration or severity of sensitivity or allergic response to Fagales protein, related Fagales, birch pollen or its extract or protein Bet v 1 is reduced after administration of one or more isolated human monoclonal antibodies or fragments thereof that bind to natural Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra or BPE Betula populifolia, or after administration a composition containing any one or more of the above antibodies.
Согласно некоторым вариантам осуществления экстракт пыльцы березы выбирают из группы, состоящей из природного Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra и BPE Betula populifolia.In some embodiments, the birch pollen extract is selected from the group consisting of natural Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra, and BPE Betula populifolia.
Согласно некоторым вариантам осуществления лечение приводит к снижению аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, аллергической бронхиальной астмы или анафилактической реакции после воздействия на пациента белка Fagales, родственного Fagales аллергена, пыльцы березы или ее экстракта или белка Bet v 1.In some embodiments, the treatment results in a reduction in allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic bronchial asthma, or anaphylactic reaction following exposure of the patient to Fagales protein, a Fagales-related allergen, birch pollen or an extract thereof, or Bet v 1 protein.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает введение эффективного количества второго терапевтического средства, применимого для ослабления аллергического ответа на белок Fagales, родственный Fagales аллерген, пыльцу березы или ее экстракт или белок Bet v 1. Второе терапевтическое средство можно выбрать из группы, состоящей из кортикостероида,In some embodiments, the method further comprises administering an effective amount of a second therapeutic agent useful for attenuating the allergic response to Fagales protein, Fagales-related allergen, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1 protein. The second therapeutic agent may be selected from the group consisting of a corticosteroid,
- 12 045437 бронходилататора, антигистаминного средства, эпинефрина, противозастойного средства, другого отличающегося антитела к Bet v 1 и пептидной вакцины.- 12 045437 bronchodilator, antihistamine, epinephrine, decongestant, other different Bet v 1 antibody and peptide vaccine.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает лечение пациента с помощью схемы аллерген-специфической иммунотерапии (SIT) сразу после или одновременно с антителами или их фрагментами или фармацевтической композицией, содержащей антитела.In some embodiments, the method further comprises treating the patient with an allergen-specific immunotherapy (SIT) regimen immediately following or concurrently with the antibodies or fragments thereof or a pharmaceutical composition containing the antibodies.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пациента с аллергией на Fagales, который демонстрирует чувствительность или аллергический ответ по отношению к одному или нескольким аллергенам Fagales или родственным аллергенам Fagales, или лечения по меньшей мере одного симптома или осложнения, ассоциированного с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к одному или нескольким аллергенам Fagales или родственным аллергенам Fagales, предусматривающему введение эффективного количества одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с Bet v 1, или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их фрагментов, которые связываются с Bet v 1, нуждающемуся в этом пациенту, причем чувствительность или аллергический ответ по отношению к аллергену Fagales или родственному Fagales аллергену или предотвращается, или уменьшается по степени тяжести и/или продолжительности, или по меньшей мере один симптом или осложнение, ассоциированные с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к аллергену Fagales или родственного Fagales аллергена, предотвращаются или уменьшаются по интенсивности, или частота и/или продолжительность или степень тяжести чувствительности или аллергического ответа по отношению к аллергену Fagales или родственного Fagales аллергена снижается после введения одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их фрагментов, которые связываются с Bet v 1, или после введения композиции, содержащей любое одно или несколько указанных выше антител.In one embodiment, the present invention provides a method of treating a patient with a Fagales allergy who exhibits a sensitivity or allergic response to one or more Fagales allergens or related Fagales allergens, or treating at least one symptom or complication associated with the sensitivity or allergic response. a response to one or more Fagales allergens or related Fagales allergens, comprising the administration of an effective amount of one or more isolated human monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof that bind to Bet v 1, or a pharmaceutical composition containing an effective amount of one or more isolated human monoclonal antibodies human or fragments thereof that bind to Bet v 1, to a patient in need thereof, wherein sensitivity or allergic response to the Fagales or Fagales-related allergen is either prevented or reduced in severity and/or duration, or at least one symptom or a complication associated with a sensitivity or allergic response to the Fagales or Fagales-related allergen is prevented or reduced in intensity, or the frequency and/or duration or severity of the sensitivity or allergic response to the Fagales or Fagales-related allergen is reduced after administration one or more isolated human monoclonal antibodies or fragments thereof that bind to Bet v 1, or after administration of a composition containing any one or more of the above antibodies.
Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько аллергенов Fagales выбраны из группы, состоящей из Bet v 1, Aln g1, Cor a1, Car b1 и Que a1.In some embodiments, the one or more Fagales allergens are selected from the group consisting of Bet v 1, Aln g1, Cor a1, Car b1, and Que a1.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько антител, описанных в настоящем документе, которые связываются с природным Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra и BPE Betula populifolia, для применения при лечении пациента, который демонстрирует чувствительность или аллергический ответ по отношению к белку Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1, или для лечения по меньшей мере одного симптома или осложнения, ассоциированного с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к белку Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1, причем чувствительность или аллергический ответ по отношению к белку Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1 или предотвращается, или уменьшается по степени тяжести и/или продолжительности, или по меньшей мере один симптом или осложнение, ассоциированные с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к белку Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1, предотвращаются или уменьшаются по интенсивности, или частота и/или продолжительность или степень тяжести чувствительности или аллергического ответа по отношению к белку Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1 снижается.In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising one or more antibodies described herein that bind to natural Bet v 1, BPE Betula pendula, BPE Betula nigra and BPE Betula populifolia, for use in treating a patient who exhibits sensitivity or allergic response to Fagales protein, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1 protein, or for the treatment of at least one symptom or complication associated with sensitivity or allergic response to Fagales protein, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1 protein, wherein sensitivity or allergic response to Fagales protein, birch pollen or an extract thereof, or Bet v 1 protein is either prevented or reduced in severity and/or duration, or at least one symptom or complication associated with sensitivity or allergic response to Fagales protein, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1 protein, is prevented or reduced in intensity, or the frequency and/or duration or severity of sensitivity or allergic response to Fagales protein, birch pollen or its extract or protein Bet v 1 decreases.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько антител согласно настоящему изобретению, которые связываются с Bet v 1, в получении лекарственного средства для применения при лечении пациента, который демонстрирует чувствительность или аллергический ответ по отношению к пыльце березы или ее экстракту или к белку Bet v 1, или для лечения по меньшей мере одного симптома или осложнения, ассоциированного с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к пыльце березы или ее экстракту, или к белку Bet v 1, причем чувствительность или аллергический ответ по отношению к пыльце березы или ее экстракту или к белку Bet v 1 или предотвращается, или уменьшается по степени тяжести и/или продолжительности, или по меньшей мере один симптом или осложнение, ассоциированные с чувствительностью или аллергическим ответом по отношению к пыльце березы или ее экстракту или к белку Bet v 1, предотвращаются или уменьшаются по интенсивности, или частота и/или продолжительность или степень тяжести чувствительности или аллергического ответа по отношению к пыльце березы или ее экстракту или к белку Bet v 1 снижается.In one embodiment, the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition containing one or more antibodies of the present invention that bind to Bet v 1 in the preparation of a medicament for use in treating a patient who exhibits a sensitivity or allergic response to birch pollen or an extract thereof or to the Bet v 1 protein, or for the treatment of at least one symptom or complication associated with a sensitivity or allergic response to birch pollen or an extract thereof, or to the Bet v 1 protein, wherein the sensitivity or allergic response to birch pollen or extract thereof or protein Bet v 1 is either prevented or reduced in severity and/or duration, or at least one symptom or complication associated with sensitivity or allergic response to birch pollen or extract thereof or protein Bet v 1 are prevented or reduced in intensity, or the frequency and/or duration or severity of sensitivity or allergic response to birch pollen or extract thereof or to Bet v 1 protein is reduced.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, как описано выше, причем композицию вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством, применимым для уменьшения аллергического ответа по отношению к белку Fagales, пыльце березы или ее экстракту или белку Bet v 1. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, как описано выше, причем второе терапевтическое средство выбрано из кортикостероида, бронходилататора, антигистаминного средства, эпинефрина, противозастойного средства, другого отличающегося антитела к Bet v 1 и пептидной вакцины.In one embodiment, the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition as described above, wherein the composition is administered in combination with a second therapeutic agent useful for reducing an allergic response to Fagales protein, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1 protein. In one embodiment In an embodiment, the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition as described above, wherein the second therapeutic agent is selected from a corticosteroid, a bronchodilator, an antihistamine, epinephrine, a decongestant, another different anti-Bet v 1 antibody, and a peptide vaccine.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению, которые связываются с Bet v 1, могут быть способны снижать, минимизировать или предотвращать поIn certain embodiments, antibodies of the present invention that bind to Bet v 1 may be capable of reducing, minimizing, or preventing
- 13 045437 меньшей мере один симптом у пациента, чувствительного к пыльце березы или Bet v 1, такой как чихание, конгестия, заложенность носа, кашель, одышка, бронхоспазм, ринит или конъюнктивит.- 13 045437 at least one symptom in a patient sensitive to birch pollen or Bet v 1, such as sneezing, congestion, nasal congestion, cough, shortness of breath, bronchospasm, rhinitis or conjunctivitis.
Согласно одному варианту осуществления антитела согласно настоящему изобретению, которые связываются с Bet v 1, или композицию, содержащую одно или несколько антител согласно настоящему изобретению, можно использовать для профилактики более серьезных in vivo осложнений, ассоциированных с аллергией на Bet v 1, включая в себя астматические реакции, анафилактический шок или даже смерть в результате анафилаксии.In one embodiment, antibodies of the present invention that bind to Bet v 1, or a composition containing one or more antibodies of the present invention, can be used to prevent more serious in vivo complications associated with Bet v 1 allergy, including asthmatic reactions, anaphylactic shock, or even death due to anaphylaxis.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическую композицию вводят пациенту в комбинации со вторым терапевтическим средством.In one embodiment, the pharmaceutical composition is administered to a patient in combination with a second therapeutic agent.
Согласно другому варианту осуществления второе терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из антигистаминного средства, эпинефрина, противозастойного средства, кортикостероида, другого отличающегося антитела к Bet v 1, пептидной вакцины и любой другой паллиативной терапии, применимой для снижения степени тяжести аллергического ответа или для уменьшения интенсивности по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с аллергическим ответом.In another embodiment, the second therapeutic agent is selected from the group consisting of an antihistamine, epinephrine, a decongestant, a corticosteroid, another different anti-Bet v 1 antibody, a peptide vaccine, and any other palliative therapy useful to reduce the severity of the allergic response or to reduce the intensity at least one symptom associated with an allergic response.
Согласно другому варианту осуществления фармацевтическую композицию вводят одновременно, перед или после одного или нескольких других требуемых терапевтических средств или медицинский процедур, включая в себя, например, введение перед или одновременно со схемой аллергенспецифической иммунотерапии (SIT). Согласно некоторым аспектам применение схемы SIT вместе с антителами, предусмотренными в настоящем документе, обеспечивает синергический эффект.In another embodiment, the pharmaceutical composition is administered simultaneously with, before, or after one or more other desired therapeutic agents or medical procedures, including, for example, administration before or simultaneously with an allergen-specific immunotherapy (SIT) regimen. In some aspects, use of a SIT regimen in conjunction with antibodies provided herein provides a synergistic effect.
Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ усиления эффективности и/или безопасности схемы аллерген-специфической иммунотерапии (SIT), причем способ предусматривает введение эффективного количества одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов, как предусмотрено в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких выделенных моноклональных антител человека или их фрагментов, нуждающемуся в этом пациенту непосредственно до или одновременно со схемой SIT, причем степень тяжести аллергического ответа на схему SIT уменьшается. Согласно некоторым вариантам осуществления схема SIT содержит фазу введения увеличивающихся доз с последующей поддерживающей фазой. Согласно некоторым вариантам осуществления схема SIT представляет собой схему молниеносной (rush) SIT.In one embodiment, there is provided a method of enhancing the effectiveness and/or safety of an allergen-specific immunotherapy (SIT) regimen, the method comprising administering an effective amount of one or more isolated human monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof, as provided herein, or a pharmaceutical composition comprising an effective amount of one or more isolated human monoclonal antibodies or fragments thereof, to a patient in need thereof, immediately prior to or concurrently with the SIT regimen, wherein the severity of the allergic response to the SIT regimen is reduced. In some embodiments, the SIT regimen comprises an escalating dose phase followed by a maintenance phase. In some embodiments, the SIT scheme is a rush SIT scheme.
Согласно дополнительному аспекту предусмотрен способ профилактики или снижения дегрануляции тучных клеток, ассоциированной с белком Fagales, родственным Fagales аллергеном, пыльцой березы или экстрактом пыльцы березы или сенсибилизацией с помощью Bet v 1, причем способ предусматривает введение фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, нуждающемуся в этом пациенту.In a further aspect, there is provided a method of preventing or reducing mast cell degranulation associated with Fagales protein, a Fagales-related allergen, birch pollen or birch pollen extract, or sensitization with Bet v 1, the method comprising administering a pharmaceutical composition described herein to a person in need thereof. to the patient.
Согласно некоторым вариантам осуществления ВРЕ выбран из группы, состоящей из природного Bet v 1, ВРЕ Betula pendula, ВРЕ Betula nigra и ВРЕ Betula populifolia.In some embodiments, the BPE is selected from the group consisting of natural Bet v 1, Betula pendula BPE, Betula nigra BPE, and Betula populifolia BPE.
Другие варианты осуществления станут очевидными из обзора последующего подробного описания.Other embodiments will become apparent from a review of the following detailed description.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
На фиг. 1 представлено эпитопное картирование на основании обмена H-D/MS для взаимодействия Н4Н16992Р с Bet v 1.In fig. Figure 1 shows epitope mapping based on H-D/MS exchange for the interaction of H4H16992P with Bet v 1.
На фиг. 2 представлено эпитопное картирование на основании обмена H-D/MS для взаимодействия Н4Н17082Р с Bet v 1.In fig. Figure 2 shows epitope mapping based on H-D/MS exchange for the interaction of H4H17082P with Bet v 1.
На фиг. 3 представлено эпитопное картирование на основании обмена H-D/MS для взаимодействия Н4Н17038Р2 с Bet v 1.In fig. Figure 3 shows epitope mapping based on H-D/MS exchange for the interaction of H4H17038P2 with Bet v 1.
На фиг. 4 представлено эпитопное картирование на основании обмена H-D/MS для взаимодействия Н4Н16987Р с Bet v 1.In fig. Figure 4 shows epitope mapping based on H-D/MS exchange for the interaction of H4H16987P with Bet v 1.
На фиг. 5 представлено эпитопное картирование на основании обмена H-D/MS для взаимодействия Н4Н16992Р, Н4Н17082Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н16987Р с Bet v 1.In fig. Figure 5 shows epitope mapping based on H-D/MS exchange for the interaction of H4H16992P, H4H17082P, H4H17038P2 and H4H16987P with Bet v 1.
На фиг. 6 представлена диаграмма протокола, используемого для определения эффективности комбинаций антител в блокировании дегрануляции тучных клеток, индуцированной Bet v 1, в модели PCA у гуманизированной мыши.In fig. 6 is a diagram of the protocol used to determine the effectiveness of antibody combinations in blocking Bet v 1-induced mast cell degranulation in a humanized mouse model of PCA.
На фиг. 7 показана способность комбинации антител к Bet v 1 блокировать дегрануляцию тучных клеток в модели РСА у гуманизированной мыши с использованием содержащих IgE сывороток, полученных от трех чувствительных к Bet v 1 доноров.In fig. 7 shows the ability of a combination of anti-Bet v 1 antibodies to block mast cell degranulation in a humanized mouse model of RSA using IgE-containing sera obtained from three Bet v 1-sensitive donors.
На фиг. 8 показаны два графика, причем на первом показаны репрезентативные данные, показывающие комбинации антител к Bet v 1, которые блокируют активацию базофилов в РВМС, полученных от одного донора с аллергией на пыльцу березы. На гистограмме представлены данные, показывающие процент блокирования активации базофилов в РВМС, полученных от нескольких доноров, с помощью комбинаций антител к Bet v 1, по отношению к каждому антителу отдельно.In fig. 8 shows two graphs, the first showing representative data showing combinations of antibodies to Bet v 1 that block basophil activation in PBMCs obtained from a single birch pollen allergic donor. The histogram presents data showing the percentage of blocking of basophil activation in PBMCs obtained from several donors using combinations of antibodies to Bet v 1, in relation to each antibody separately.
Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention
Прежде чем будут описаны настоящие композиции и способы, следует понимать, что настоящееBefore the present compositions and methods are described, it should be understood that the present
- 14 045437 изобретение не ограничено конкретными описанными композициями и способами, а также экспериментальными условиями, поскольку такие способы, композиции и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.- 14 045437 the invention is not limited to the specific compositions and methods described, as well as experimental conditions, since such methods, compositions and conditions may vary. It should also be understood that the terminology used herein is intended to describe specific embodiments only and is not intended to be limiting, as the scope of the present invention will be limited only by the appended claims.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистом в настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемый в настоящем документе термин приблизительно при использовании в отношении конкретного приведенного числового значения означает, что значение может отличаться от приведенного значения не более чем на 1%. Например, используемое в настоящем документе выражение приблизительно 100 включает в себя 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which this invention relates. As used herein, the term approximate, when used in relation to a specific numerical value given, means that the value may differ from the given value by no more than 1%. For example, as used herein, the expression approximately 100 includes 99 and 101 and all values in between (eg, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).
Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом применении или испытании настоящего изобретения, ниже описаны предпочтительные способы и материалы.Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, preferred methods and materials are described below.
ОпределенияDefinitions
Используемый в настоящем документе термин Bet v 1 относится по меньшей мере к одному белку Bet v 1, либо в природной/нативной форме, либо полученному рекомбинантным путем. Белок Bet v 1 содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 306 и последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 305. Природный белок Bet v 1 характеризуется размером, составляющим приблизительно 17 кДа, и существует в виде 7-цепочечного антипараллельного β-листа (β1-β7), двух коротких α-спиралей (α1 и α2), соединяющих β1 и β2, длинной С-концевой α-спирали (α3) и мотива богатой глицином петли между β2 и β3 (Kofler et al. (2012) J. Mol. Biol. 422(1): 109-123). Полученный рекомбинантным путем мутантный Bet v 1, SEQ ID NO: 312, содержит G2-N160 согласно Uniprot P15494 с заменой S85A и содержит Мус-Мус-гексагистидиновую метку. Аминокислотная последовательность Bet v 1 от Uniprot: Р15494, т.е. SEQ ID NO: 314, также может относиться к Bet v 1.As used herein, the term Bet v 1 refers to at least one Bet v 1 protein, either in natural/native form or produced recombinantly. The Bet v 1 protein contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 306 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 305. The native Bet v 1 protein is approximately 17 kDa in size and exists as a 7-stranded antiparallel β-sheet (β1 -β7), two short α-helices (α1 and α2) connecting β1 and β2, a long C-terminal α-helix (α3), and a glycine-rich loop motif between β2 and β3 (Kofler et al. (2012) J. Mol Biol 422(1): 109-123). The recombinantly produced mutant Bet v 1, SEQ ID NO: 312, contains G2-N160 according to Uniprot P15494 with an S85A substitution and contains a Myc-Myc-hexahistidine tag. Amino acid sequence of Bet v 1 from Uniprot: P15494, i.e. SEQ ID NO: 314, may also refer to Bet v 1.
Bet v 1 представляет собой полипептид, содержащий или, альтернативно, состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 306 или SEQ ID NO: 314 или гомологичной им последовательности. Используемая в настоящем документе фраза последовательность, гомологичная последовательности согласно SEQ ID NO: 306 или SEQ ID NO: 314, относится к полипептиду, который характеризуется идентичностью в отношении SEQ ID NO: 306 или SEQ ID NO: 314, которая составляет больше чем 70, предпочтительно больше чем 80, более предпочтительно больше чем 90 и даже более предпочтительно больше чем 95%.Bet v 1 is a polypeptide containing, or alternatively consisting of, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 306 or SEQ ID NO: 314 or a sequence homologous thereto. As used herein, the phrase sequence homologous to SEQ ID NO: 306 or SEQ ID NO: 314 refers to a polypeptide that has an identity to SEQ ID NO: 306 or SEQ ID NO: 314 that is greater than 70, preferably greater than 80, more preferably greater than 90 and even more preferably greater than 95%.
Используемый в настоящем документе термин фрагмент Bet v 1 относится к полипептиду, содержащему или, альтернативно, состоящему по меньшей мере из одного антигенного сайта Bet v 1. Согласно одному варианту осуществления используемый в настоящем документе термин фрагмент Bet v 1 относится к полипептиду, содержащему или, альтернативно, состоящему по меньшей мере из двух антигенных сайтов Bet v 1. Согласно одному варианту осуществления антигенные сайты связаны ковалентно. Согласно одному варианту осуществления антигенные сайты связаны с помощью по меньшей мере одной пептидной связи. Согласно одному варианту осуществления два антигенных сайта связаны с помощью по меньшей мере одной пептидной связи и спейсера между антигенными сайтами. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере два антигенных сайта содержат аминокислотные последовательности 23-44 и 44-56 согласно Uniprot P15494. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере два антигенных сайта содержат аминокислотную последовательность в пределах любой из SEQ ID NO: 306, 307, 308, 309, 310, 311 и 315. Согласно одному варианту осуществления любой из фрагментов Bet v 1 способен нидуцировать продукцию антител in vivo, которые специфически связываются с встречающимся в природе Bet v 1 или с полученным рекомбинантным путем Bet v 1.As used herein, the term Bet v 1 fragment refers to a polypeptide containing, or alternatively consisting of, at least one Bet v 1 antigenic site. In one embodiment, the term Bet v 1 fragment, as used herein, refers to a polypeptide containing or, alternatively, consisting of at least two Bet v 1 antigenic sites. In one embodiment, the antigenic sites are linked covalently. In one embodiment, the antigenic sites are linked by at least one peptide bond. In one embodiment, two antigenic sites are linked by at least one peptide bond and a spacer between the antigenic sites. In one embodiment, the at least two antigenic sites comprise amino acid sequences 23-44 and 44-56 according to Uniprot P15494. In one embodiment, at least two antigenic sites comprise an amino acid sequence within any of SEQ ID NOs: 306, 307, 308, 309, 310, 311, and 315. In one embodiment, any of the Bet v 1 fragments is capable of inducing antibody production in vivo that specifically bind to naturally occurring Bet v 1 or recombinantly produced Bet v 1.
Используемый в настоящем документе термин антитело означает любую антигенсвязывающую молекулу или молекулярный комплекс, содержащие по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), которая специфически связывается или взаимодействует с конкретным антигеном (например, Bet v 1). Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин антитело включает в себя молекулы иммуноглобулина, состоящие из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных между собой дисульфидными связями (т.е. полные молекулы антител), и, а также их мультимеры (например, IgM) или их антигенсвязывающие фрагменты. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (состоящей из доменов CH1, CH2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи ((LCVR или VL) и константной области легкой цепи (CL). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с областями, которые являются более консервативными, которые называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1,As used herein, the term antibody means any antigen-binding molecule or molecular complex containing at least one complementarity determining region (CDR) that specifically binds or interacts with a particular antigen (eg, Bet v 1). The term antibody, as used herein, is intended to include immunoglobulin molecules consisting of four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains linked together by disulfide bonds (i.e., complete antibody molecules), and, as well as their multimers (eg, IgM) or their antigen-binding fragments. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (HCVR or VH) and a heavy chain constant region (consisting of CH1, CH2 and CH3 domains). Each light chain consists of a light chain variable region ((LCVR or VL ) and a light chain constant region ( CL ). The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs), which alternate with regions that are more conserved, which are called framework regions (FR).Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1,
- 15 045437- 15 045437
CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения FR антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) могут являться идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть естественным образом или синтетически модифицированными. Аминокислотную консенсусную последовательность можно определить на основании параллельного анализа двух или больше CDR.CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. In certain embodiments of the present invention, the FR antibody (or antigen binding fragment thereof) may be identical to human germline sequences or may be naturally or synthetically modified. The amino acid consensus sequence can be determined based on parallel analysis of two or more CDRs.
Кроме того, возможна замена одного или нескольких остатков CDR или пропуск одной или нескольких CDR. В научной литературе описаны антитела, которые для связывания могут обойтись без одной или двух CDR. Padlan с соавт. (1995 FASEB J. 9: 133-139) проанализировали области контакта между антителами и их антигенами, основываясь на опубликованных кристаллических структурах, и пришли к выводу, что только приблизительно одна пятая - одна третья остатков CDR действительно контактируют с антигеном. Padlan также обнаружил много антител, в которых одна или две CDR не характеризуются наличием аминокислот, контактирующих с антигеном (см. также Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).In addition, it is possible to replace one or more CDR residues or omit one or more CDRs. The scientific literature describes antibodies that can dispense with one or two CDRs to bind. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9: 133-139) analyzed the contact regions between antibodies and their antigens based on published crystal structures and concluded that only approximately one-fifth to one-third of the CDR residues actually contact the antigen. Padlan has also found many antibodies in which one or two CDRs do not have antigen-contacting amino acids (see also Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
Остатки CDR, не контактирующие с антигеном, можно идентифицировать на основании предыдущих исследований (например, остатки Н60-Н65 в CDRH2 часто не требуются) из областей CDR согласно Kabat, лежащих вне CDR согласно Chothia, путем молекулярного моделирования и/или опытным путем. Если CDR или его остаток(остатки) опущен(ы), ее(их), как правило, заменяют аминокислотой, занимающей соответствующее положение в другой последовательности антитела человека или консенсусе таких последовательностей. Положения для замены в пределах CDR и аминокислоты для замены также можно выбрать опытным путем. Эмпирические замены могут представлять собой консервативные или неконсервативные замены.Non-antigen contact CDR residues can be identified based on previous studies (eg, residues H60-H65 in CDRH2 are often not required) from Kabat CDR regions outside the Chothia CDR, by molecular modeling and/or empirically. If a CDR or residue(s) thereof is omitted, it is typically replaced with an amino acid occupying the corresponding position in another human antibody sequence or consensus of such sequences. The positions to be replaced within the CDR and the amino acid to be replaced can also be selected empirically. Empirical substitutions may be conservative or non-conservative substitutions.
Полностью человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с Bet v 1, как раскрыто в настоящем документе, могут содержать одну или несколько аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии. Такие мутации можно легко установить путем сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Согласно настоящему изобретению предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые происходят из любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, причем одна или несколько аминокислот в пределах одной или нескольких каркасных областей и/или областей CDR мутированы до соответствующего(их) остатка(ов) зародышевой линии, из которой происходит антитело, или до соответствующего(их) остатка(ов) другой последовательности зародышевой линии человека или до консервативной аминокислотной замены соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности обобщенно в настоящем документе называются мутации зародышевой линии). Средний специалист в настоящей области техники, начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем документе, может легко получить различные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. Согласно определенным вариантам осуществления все остатки каркасной области и/или области CDR в пределах доменов VH и/или VL подвергают обратной мутации до остатков, встречающихся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой происходит антитело. Согласно другим вариантам осуществления только определенные остатки подвергают обратной мутации до исходной последовательности зародышевой линии, например, только мутированные остатки, встречающиеся в пределах первых 8 аминокислот FR1 или в пределах последних 8 аминокислот FR4, или только мутированные остатки, встречающиеся в пределах CDR1, CDR2 или CDR3. Согласно другим вариантам осуществления один или несколько остатков каркасной области и/или области CDR подвергают мутации до соответствующего(их) остатка(ов) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело изначально).Fully human monoclonal antibodies that specifically bind to Bet v 1, as disclosed herein, may contain one or more amino acid substitutions, insertions and/or deletions in the framework regions and/or CDR regions of the heavy and light chain variable domains compared to the corresponding germline sequences. Such mutations can be readily identified by comparing the amino acid sequences disclosed herein with germline sequences available, for example, from publicly available antibody sequence databases. The present invention provides antibodies and antigen binding fragments thereof that are derived from any of the amino acid sequences disclosed herein, wherein one or more amino acids within one or more framework regions and/or CDR regions are mutated to the corresponding residue(s) the germline from which the antibody is derived, or to the corresponding residue(s) of another human germline sequence or to a conservative amino acid substitution of the corresponding germline residue(s) (such sequence changes are collectively referred to herein as germline mutations). Starting with the heavy and light chain variable region sequences disclosed herein, one of ordinary skill in the art can readily produce various antibodies and antigen binding fragments that contain one or more individual germline mutations or combinations thereof. In certain embodiments, all framework and/or CDR region residues within the V H and/or V L domains are backmutated to residues found in the original germline sequence from which the antibody is derived. In other embodiments, only certain residues are backmutated to the original germline sequence, e.g., only mutated residues occurring within the first 8 amino acids of FR1 or within the last 8 amino acids of FR4, or only mutated residues occurring within CDR1, CDR2, or CDR3 . In other embodiments, one or more residues of the framework region and/or CDR region are mutated to the corresponding residue(s) of another germline sequence (i.e., a germline sequence that is different from the germline sequence from which the antibody initially).
Более того, антитела согласно настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или больше мутаций зародышевой линии в пределах каркасных областей и/или областей CDR, например, причем определенные индивидуальные остатки мутированы до соответствующего остатка конкретной последовательности зародышевой линии, при этом другие определенные остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохраняются или подвергаются мутации до соответствующего остатка отличающейся последовательности зародышевой линии. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько мутаций зародышевой линии, можно легко испытать в отношении одного или нескольких требуемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, увеличенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от конкретной ситуации), сниженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные этим общим способом, предусмотрены настоящим изобретением.Moreover, antibodies of the present invention may contain any combination of two or more germline mutations within framework regions and/or CDR regions, for example, wherein certain individual residues are mutated to the corresponding residue of a particular germline sequence, and other certain residues that differ from the original germline sequence and are retained or mutated to the corresponding residue of the divergent germline sequence. Once produced, antibodies and antigen binding fragments that contain one or more germline mutations can be readily tested for one or more desired properties, such as improved binding specificity, increased binding affinity, improved or enhanced antagonistic or agonistic biological properties (depending on the specific situations), reduced immunogenicity, etc. Antibodies and antigen binding fragments produced by this general method are provided by the present invention.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены полностью человеческие моноклональ- 16 045437 ные антитела, содержащие варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе, с одной или несколькими консервативными заменами. Например, согласно настоящему изобретению предусмотрены антитела с аминокислотными последовательностями HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или меньше, 8 или меньше, 6 или меньше, 4 или меньше и т.д. консервативными аминокислотными заменами по отношению к любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе.The present invention also provides fully human monoclonal antibodies containing variants of any of the HCVR, LCVR and/or CDR amino acid sequences disclosed herein with one or more conservative substitutions. For example, the present invention provides antibodies with amino acid sequences HCVR, LCVR and/or CDR, for example, 10 or less, 8 or less, 6 or less, 4 or less, etc. conservative amino acid substitutions with respect to any of the HCVR, LCVR and/or CDR amino acid sequences disclosed herein.
Используемый в настоящем документе термин антитело человека включает в себя не встречающиеся в природе антитела человека. Термин включает в себя антитела, которые рекомбинантно получены в организме не являющегося человеком млекопитающего или в клетках не являющегося человеком млекопитающего. Подразумевается, что термин включает в себя антитела, выделенные из организма субъекта-человека или образованные в организме субъекта-человека.As used herein, the term human antibody includes non-naturally occurring human antibodies. The term includes antibodies that are recombinantly produced in the body of a non-human mammal or in the cells of a non-human mammal. The term is intended to include antibodies isolated from or produced in the body of a human subject.
Согласно некоторым вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой рекомбинантные и/или не встречающиеся в природе антитела человека. Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин рекомбинантное антитело человека включает в себя все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина (описано дополнительно ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека (описано дополнительно ниже), антитела, выделенные из организма животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других средств, которые включают в себя сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Согласно определенным вариантам осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают in vitro мутагенезу (или, если используют животное, которое является трансгенным в отношении последовательностей Ig человека, in vivo соматическому мутагенезу) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, наряду с тем, что они относятся к последовательностям VH и VL зародышевой линии человека, могут не существовать в природе в пределах репертуара антител зародышевой линии человека in vivo.In some embodiments, the antibodies of the present invention may be recombinant and/or non-naturally occurring human antibodies. As used herein, the term recombinant human antibody is intended to include all human antibodies that are produced, expressed, generated, or isolated by recombinant methods, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector transfected into a host cell (described further). below), antibodies isolated from a recombinant, combinatorial human antibody library (described further below), antibodies isolated from an animal (for example, a mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes (see, for example, Taylor et al. ( 1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) or antibodies produced, expressed, created or isolated by any other means that involve splicing human immunoglobulin gene sequences with other DNA sequences. In certain embodiments, such recombinant human antibodies are subjected to in vitro mutagenesis (or, if an animal that is transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the V H and V L regions of the recombinant antibodies are sequences which, while related to human germline VH and VL sequences, may not naturally exist within the human germline antibody repertoire in vivo.
Антитела человека могут существовать в двух формах, которые связаны с гетерогенностью шарнира. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильный четырехцепочечный конструкт приблизительно 150-160 кДа, в котором димеры удерживаются вместе дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны через межцепочечные дисульфидные связи, и образуется молекула, составляющая приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитела). Эти формы чрезвычайно трудно разделить, даже после аффинной очистки.Human antibodies can exist in two forms, which are related to the heterogeneity of the hinge. In one form, the immunoglobulin molecule contains a stable four-chain construct of approximately 150-160 kDa in which the dimers are held together by a disulfide bond between the heavy chains. In the second form, the dimers are not linked through interchain disulfide bonds, and a molecule of approximately 75-80 kDa is formed, consisting of covalently linked light and heavy chains (half-antibodies). These forms are extremely difficult to separate, even after affinity purification.
Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG обусловлена без ограничения структурными различиями, связанными с изотипом шарнирной области антитела. Одна аминокислотная замена в шарнирной области шарнира IgG4 человека может значительно уменьшить появление второй формы (Angal et al., 1993, Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых с использованием шарнира IgG1 человека. Настоящее изобретение охватывает антитела, характеризующиеся одной или несколькими мутациями в шарнире, области CH2 или CH3, которые могут являться желательными, например, при производстве, для улучшения выхода требуемой формы антитела.The frequency of occurrence of the second form in different intact IgG isotypes is due, without limitation, to structural differences associated with the isotype of the antibody hinge region. A single amino acid substitution in the hinge region of the human IgG4 hinge can significantly reduce the occurrence of the second form (Angal et al., 1993, Molecular Immunology 30:105) to levels typically observed using the human IgG1 hinge. The present invention covers antibodies characterized by one or more mutations in the hinge, CH2 or CH3 region, which may be desirable, for example, in production, to improve the yield of the desired form of the antibody.
Используемое в настоящем документе выражение антигенсвязывающая молекула означает белок, полипептид или молекулярный комплекс, содержащий или состоящий по меньшей мере из одной определяющей комплементарность области (CDR), которая отдельно или в комбинации с одной или несколькими дополнительными CDR и/или каркасными областями (FR), специфически связывается с конкретным антигеном. Согласно определенным вариантам осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или фрагмент антитела, как эти термины определены в другом месте в настоящем документе.As used herein, the expression antigen binding molecule means a protein, polypeptide or molecular complex containing or consisting of at least one complementarity determining region (CDR), which alone or in combination with one or more additional CDRs and/or framework regions (FR), binds specifically to a specific antigen. In certain embodiments, the antigen binding molecule is an antibody or antibody fragment, as those terms are defined elsewhere herein.
Фраза специфически связывает или специфически связывается с или тому подобное означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который является относительно стабильным при физиологических условиях. Специфическое связывание может характеризоваться равновесной константой диссоциации, равной по меньшей мере приблизительно 1x10’6 М или меньше (например, меньшее значение KD обозначает более плотное связывание). Способы определения того, являются ли две молекулы специфически связывающимися, хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и тому подобное. Как описано в настоящем документе, антитела, которые специфически связываются с Bet v 1, были идентифицированы с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, BIACORE™.The phrase specifically binds or specifically binds to or the like means that the antibody or antigen-binding fragment thereof forms a complex with an antigen that is relatively stable under physiological conditions. Specific binding may have an equilibrium dissociation constant of at least about 1x10'6 M or less (eg, a lower KD value indicates tighter binding). Methods for determining whether two molecules are specifically binding are well known in the art and include, for example, equilibrium dialysis, surface plasmon resonance, and the like. As described herein, antibodies that specifically bind to Bet v 1 have been identified using surface plasmon resonance, such as BIACORE™.
Фраза высокоаффинное антитело относится к тем моноклональным антителам, которые характеризуются аффинностью связывания с Bet v 1, выраженной как KD, составляющей по меньшей мере, 10’8 The phrase high-affinity antibody refers to those monoclonal antibodies that have a binding affinity for Bet v 1, expressed as a KD, of at least 10'8
- 17 045437- 17 045437
М; предпочтительно 10-9 М; более предпочтительно 10-10 М, еще более предпочтительно 10-11 М, еще более предпочтительно 10-12 М, как измерено поверхностным плазмонным резонансом, например,M; preferably 10 -9 M; more preferably 10 -10 M, even more preferably 10 -11 M, even more preferably 10 -12 M, as measured by surface plasmon resonance, e.g.
BIACORE ™ или анализом аффинности в растворе методом ELISA.BIACORE™ or solution affinity ELISA.
Под термином медленная скорость диссоциации, Koff или kd подразумевается антитело, которое диссоциирует от Bet v 1с константой скорости, составляющей 1x10’3-c’1 или менее, предпочтительно 1x10’4-c’1 или менее, что определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, BIACORE™.By the term slow dissociation rate, Koff or kd is meant an antibody that dissociates from Bet v 1 with a rate constant of 1x10' 3 -c'1 or less, preferably 1x10' 4 -c'1 or less, as determined by surface plasmon resonance eg BIACORE™.
Используемые в настоящем документе термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и тому подобное включают в себя любой встречающийся в природе, ферментативно полученный, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Используемые в настоящем документе термины антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с Bet v 1.As used herein, the terms antigen binding portion of an antibody, antigen binding fragment of an antibody, and the like include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic or genetically engineered polypeptide or glycoprotein that specifically binds an antigen to form a complex. As used herein, the terms antigen binding antibody fragment or antibody fragment refer to one or more antibody fragments that retain the ability to bind Bet v 1.
Согласно конкретным вариантам осуществления антитело или фрагменты антитела согласно настоящему изобретению могут являться конъюгированными с терапевтическим фрагментом (иммуноконъюгат), таким как кортикостероид, второе антитело к Bet v 1 или эпинефрин, вакцина или любой другой терапевтический компонент, применимый для лечения аллергического ответа на Bet v 1.In specific embodiments, the antibody or antibody fragments of the present invention may be conjugated to a therapeutic moiety (immunoconjugate), such as a corticosteroid, a second anti-Bet v 1 antibody, or epinephrine, a vaccine, or any other therapeutic moiety useful for treating an allergic response to Bet v 1 .
Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой выделенные антитела. Используемый в настоящем документе термин выделенное антитело означает антитело, которое идентифицировали и отделили и/или извлекли по меньшей мере из одного компонента его природного окружения. Например, антитело, которое отделили или удалили по меньшей мере из одного компонента организма или из ткани или клетки, в которых антитело существует в природе или производится в природе, представляет собой выделенное антитело для целей настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает в себя антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела представляют собой антитела, подвергнутые по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело может по существу не содержать другой клеточный материал и/или химические соединения.The antibodies of the present invention may be isolated antibodies. As used herein, the term isolated antibody means an antibody that has been identified and separated and/or recovered from at least one component of its natural environment. For example, an antibody that is separated or removed from at least one component of the body or from a tissue or cell in which the antibody naturally exists or is produced in nature is an isolated antibody for purposes of the present invention. The isolated antibody also includes the antibody in situ in the recombinant cell. Isolated antibodies are antibodies that have been subjected to at least one purification or isolation step. In certain embodiments, the isolated antibody may be substantially free of other cellular material and/or chemical compounds.
Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело может по существу не содержащим других антител (Ab), характеризующихся другими антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с Bet v 1 или его фрагментом, по существу не содержит антитела, которые специфически связываются с антигенами, отличными от антигенов Fagales или, согласно некоторым аспектам, отличными от Bet v 1.In certain embodiments, the isolated antibody may be substantially free of other antibodies (Abs) having different antigen specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds to Bet v 1 or a fragment thereof is substantially free of antibodies that specifically bind to antigens different from Fagales antigens or, in some aspects, different from Bet v 1.
Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин блокирующее антитело или нейтрализующее антитело (или антитело, которое нейтрализует активность Bet v 1) обозначает антитело или его антигенсвязывающую часть, связывание которых с Bet v 1 приводит к ингибированию по меньшей мере одной биологической активности Bet v 1. Например, антитело согласно настоящему изобретению может помочь в предотвращении первичного аллергического ответа на Bet v 1. Альтернативно, антитело согласно настоящему изобретению может демонстрировать способность предотвратить вторичный аллергический ответ на Bet v 1 или по меньшей мере один симптом аллергического ответа на Bet v 1, включая в себя чихание, кашель, астматическое состояние или анафилактическую реакцию, вызванные Bet v 1. Это ингибирование биологической активности Bet v 1 можно оценить путем измерения одного или нескольких показателей биологической активности Bet v 1 с помощью одного или нескольких стандартных анализов in vitro или in vivo (таких как анализ пассивной кожной анафилаксии, как описано в настоящем документе) или других анализов in vivo, известных в настоящей области техники (например, другие модели на животных для оценки защиты от стимуляции с помощью Bet v 1 после введения одного или нескольких антител, описанных в настоящем документе).As used herein, the term blocking antibody or neutralizing antibody (or antibody that neutralizes the activity of Bet v 1) is intended to mean an antibody or antigen binding portion thereof whose binding to Bet v 1 results in inhibition of at least one biological activity of Bet v 1. For example, an antibody of the present invention may help prevent a primary allergic response to Bet v 1. Alternatively, an antibody of the present invention may demonstrate the ability to prevent a secondary allergic response to Bet v 1 or at least one symptom of an allergic response to Bet v 1, including sneezing, coughing, asthmatic condition or anaphylactic reaction caused by Bet v 1. This inhibition of the biological activity of Bet v 1 can be assessed by measuring one or more indicators of the biological activity of Bet v 1 using one or more standard in vitro or in vivo assays (such as a passive cutaneous anaphylaxis assay as described herein) or other in vivo assays known in the art (eg, other animal models to evaluate protection from challenge with Bet v 1 following administration of one or more antibodies described herein document).
Используемый в настоящем документе термин поверхностный плазмонный резонанс относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать биомолекулярные взаимодействия в режиме реального времени путем обнаружения изменений концентраций белка в пределах матрицы биосенсора, например, с использованием системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor АВ, Упсала, Швеция и Пискатауэй, Нью-Джерси).As used herein, the term surface plasmon resonance refers to an optical phenomenon that allows the analysis of biomolecular interactions in real time by detecting changes in protein concentrations within a biosensor matrix, for example, using the BIACORE™ system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, New Jersey).
Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин KD относится к равновесной константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.The term K D as used herein is intended to refer to the equilibrium dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction.
Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим сайтом связывания с антигеном в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Отдельный антиген может содержать больше одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями на антигене и могут характеризоваться различными биологическими эффектами. Термин эпитоп также относится к сайту на антигене, на который отвечают В и/или Тклетки. Это также относится к области антигена, которая связана антителом. Эпитопы могут являться либо линейными, либо конформационными. Линейный эпитоп образован смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационный эпитоп образован пространственно смежнымиThe term epitope refers to an antigenic determinant that interacts with a specific antigen-binding site in the variable region of the antibody molecule, known as the paratope. A single antigen may contain more than one epitope. Thus, different antibodies may bind to different regions on the antigen and may have different biological effects. The term epitope also refers to the site on an antigen to which B and/or T cells respond. This also refers to the region of the antigen that is bound by the antibody. Epitopes can be either linear or conformational. A linear epitope is formed by adjacent amino acid residues in a polypeptide chain. The conformational epitope is formed by spatially adjacent
- 18 045437 аминокислотами из различных сегментов неразветвленной полипептидной цепи. Согласно определенным вариантам осуществления эпитопы могут включать в себя детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахара, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и, согласно определенным вариантам осуществления, могут характеризоваться специфическими характеристиками трехмерной структуры и/или специфическими характеристиками заряда. Эпитопы можно определить как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, являются подклассом структурных эпитопов и содержат те остатки, которые непосредственно вносят вклад в аффинность взаимодействия. Эпитопы, образованные из расположенных рядом аминокислот, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные за счет сворачивания в третичную структуру, как правило, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает в себя по меньшей мере 3, а более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.- 18 045437 amino acids from various segments of the unbranched polypeptide chain. In certain embodiments, epitopes may include determinants that are reactive surface groups of molecules, such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl groups, or sulfonyl groups, and, in certain embodiments, may have specific three-dimensional structure characteristics and/or specific charge characteristics. Epitopes can be defined as structural or functional. Functional epitopes are generally a subclass of structural epitopes and contain those residues that directly contribute to the affinity of the interaction. Epitopes formed from adjacent amino acids are typically retained when exposed to denaturing solvents, whereas epitopes formed by folding into a tertiary structure are typically lost when exposed to denaturing solvents. An epitope typically includes at least 3, and more typically at least 5 or 8-10 amino acids in a unique spatial conformation.
Термин существенная идентичность или по существу идентичный, когда он относится к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, указывает на то, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или цепью, комплементарной ей) существует идентичность нуклеотидной последовательности по меньшей мере приблизительно в 90% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, как измерено с помощью любого известного алгоритма измерения идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP, как обсуждается ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся существенной идентичностью по отношению к эталонной молекуле нуклеиновой кислоты, может в определенных случаях кодировать полипептид, характеризующийся такой же или по существу сходной аминокислотной последовательностью, как и полипептид, кодируемый эталонной молекулой нуклеиновой кислоты.The term substantial identity or substantially identical, when referring to a nucleic acid or fragment thereof, indicates that, when optimally aligned with corresponding nucleotide insertions or deletions with another nucleic acid (or a strand complementary thereto), there is at least nucleotide sequence identity about 90%, and more preferably at least about 95, 96, 97, 98, or 99% of the nucleotide bases, as measured by any known sequence identity measurement algorithm, such as FASTA, BLAST, or GAP, as discussed below. A nucleic acid molecule having substantial identity to a reference nucleic acid molecule may, in certain cases, encode a polypeptide having the same or substantially similar amino acid sequence as the polypeptide encoded by the reference nucleic acid molecule.
Применительно к полипептидам термин существенное сходство или по существу сходные означает, что две пептидные последовательности, при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием штрафов за введение пропусков по умолчанию, характеризуются по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, даже более предпочтительно по меньшей мере 95, 98 или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком, содержащим боковую цепь (группу R) со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислота замена по существу не будет изменять функциональные свойства белка. В случаях, где две или больше аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, идентичность последовательностей в процентах или степень сходства в процентах можно скорректировать в сторону увеличения, чтобы скорректировать консервативную природу замены. Средства для осуществления этой регулировки хорошо известны специалистам в настоящей области техники. (См., например, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают в себя (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатически-гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; (3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислотные боковые цепи: аспартат и глутамат, и (7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются следующие: валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагинглутамин. Альтернативно, консервативной заменой является любое изменение, характеризующееся положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992, Science 256: 1443-1445). Умеренно консервативная замена представляет собой любое изменение, характеризующееся неотрицательным значением в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250.As applied to polypeptides, the term substantially similar or substantially similar means that the two peptide sequences, when optimally aligned, for example using the GAP or BESTFIT programs using default gap penalties, have at least 90% sequence identity, even more preferably at least 95, 98 or 99% sequence identity. Preferably, positions of residues that are not identical are distinguished by conservative amino acid substitutions. A conservative amino acid substitution is one in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue containing a side chain (R group) with similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). Typically, a conservative amino acid substitution will not substantially change the functional properties of the protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percentage sequence identity or percentage similarity may be adjusted upward to correct for the conservative nature of the substitution. The means for making this adjustment are well known to those skilled in the art. (See, for example, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Examples of groups of amino acids that contain side chains with similar chemical properties include (1) aliphatic side chains: glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine; (2) aliphatic hydroxyl side chains: serine and threonine; (3) amide-containing side chains: asparagine and glutamine; (4) aromatic side chains: phenylalanine, tyrosine and tryptophan; (5) main side chains: lysine, arginine and histidine; (6) acid side chains: aspartate and glutamate, and (7) sulfur side chains: cysteine and methionine. Preferred groups of conservative amino acid substitutions are as follows: valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamate-aspartate and asparagyne glutamine. Alternatively, a conservative replacement is any change characterized by a positive value in the PAM250 log-likelihood matrix disclosed in Gonnet et al. (1992, Science 256: 1443-1445). A moderately conservative substitution is any change characterized by a non-negative value in the PAM250 log-likelihood matrix.
Сходство последовательностей для полипептидов, как правило, измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей.Sequence similarity for polypeptides is typically measured using sequence analysis software.
Программное обеспечение для анализа белка сопоставляет сходные последовательности с использованием показателей сходства, присвоенных различным заменам, делециям и другим модификациям, включая в себя консервативные аминокислотные замены. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как GAP и BESTFIT, которые можно использовать с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близко родственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды из разных видов организмов или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнить с использованием FASTA, программы в GCG версии 6.1, с использованием параметров по умолчанию или рекомендуемых параметров. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и идентичность последовательностей в процентах областей наиProtein analysis software matches similar sequences using similarity scores assigned to various substitutions, deletions and other modifications, including conserved amino acid substitutions. For example, GCG software contains programs such as GAP and BESTFIT that can be used with default parameters to determine sequence homology or sequence identity between closely related polypeptides, such as homologous polypeptides from different species of organisms or between a wild-type protein and its mutein. See, for example, GCG version 6.1. Polypeptide sequences can also be compared using FASTA, a program in GCG version 6.1, using default or recommended parameters. FASTA (e.g., FASTA2 and FASTA3) provides alignments and percentage sequence identities of regions of the highest
- 19 045437 лучшего перекрытия между запрашиваемой последовательностью и последовательностями поиска (Pearson, 2000, ранее). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно настоящему изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. (См., например, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 и 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)- 19 045437 better overlap between the query sequence and the search sequences (Pearson, 2000, earlier). Another preferred algorithm when comparing a sequence of the present invention to a database containing a large number of sequences from various organisms is the BLAST computer program, especially BLASTP or TBLASTN, using default parameters. (See, for example, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 and 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)
Под фразой терапевтически эффективное количество подразумевается количество, которое обеспечивает тот требуемый эффект, для которого его вводят. Точное количество будет зависеть от цели лечения и будет определяться специалистом в настоящей области техники с использованием известных техник (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).By the phrase a therapeutically effective amount is meant an amount that provides the desired effect for which it is administered. The exact amount will depend on the purpose of treatment and will be determined by one skilled in the art using known techniques (see, for example, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Антитела согласно настоящему изобретению можно использовать для десенсибилизации индивидуума с аллергией на Fagales. Термин десенсибилизировать определяют в настоящем документе как уменьшение аллергической реактивности индивидуума с аллергией на Fagales на воздействие аллергена Fagales, такого как пыльца березы, например, Bet v 1, Aln g1, Cor a1, Car b1, Que a1, Api g2, Api g1, Dau c1, Mal d1, Ost c1, Fag s1 и/или Cas s1 (до уровня, меньшего, чем тот, который в противном случае испытывал бы индивидуум с аллергией на Fagales), или родственного Fagales аллергена. Термин десенсибилизировать дополнительно определяют в настоящем документе как уменьшение аллергической реактивности индивидуума по отношению к белкам PR-10, включая в себя Act с 8 и Act d 8 (киви), Ara h 8 (арахис), Pru ar 1 (абрикос), Pru av 1 (вишня), Pru p 1 (персик), Pyr с 1 (груша), Gly m 4 (соя), Vig r 1 (золотистая фасоль), Sola I 4 (помидор), Cuc m 3 (дыня), Rub i 1 (малина), и Fra a 1 (клубника).Antibodies of the present invention can be used to desensitize an individual allergic to Fagales. The term desensitize is defined herein as reducing the allergic reactivity of an individual with a Fagales allergy to exposure to a Fagales allergen, such as birch pollen, for example, Bet v 1, Aln g1, Cor a1, Car b1, Que a1, Api g2, Api g1, Dau c1, Mal d1, Ost c1, Fag s1 and/or Cas s1 (to a level less than what an individual allergic to Fagales would otherwise experience), or a Fagales-related allergen. The term desensitize is further defined herein as reducing an individual's allergic reactivity to PR-10 proteins, including Act c 8 and Act d 8 (kiwi), Ara h 8 (peanut), Pru ar 1 (apricot), Pru av 1 (cherry), Pru p 1 (peach), Pyr s 1 (pear), Gly m 4 (soybean), Vig r 1 (golden bean), Sola I 4 (tomato), Cuc m 3 (melon), Rub i 1 (raspberry), and Fra a 1 (strawberry).
Общее описание.General description.
Деревья, принадлежащие к порядку Fagales, являются источником симптомов весенней аллергии, и основной аллерген березы, Bet v 1, отвечает за связывание IgE более чем у 95% пациентов с аллергией на пыльцу березы (Breiteneder, EMBO J. 1989, 8(7): 1935-8). Береза является преобладающей причиной возникновения аллергии у 23% пациентов с аллергией в США и 14% пациентов с аллергией в Европе. (Отчет DataMonitor report on Allergic Rhinitis, июль 2010 г.). Степень тяжести симптомов у людей, которые демонстрируют чувствительность к пыльце березы, варьируется от относительно легкого ринита и конъюнктивита до потенциально опасного для жизни астматического состояния. Было показано, что у более 60% пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы, присутствуют IgE-антитела к этому Bet v 1 (Jarolim et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1989, 88(1-2): 180-2).Trees belonging to the order Fagales are the source of spring allergy symptoms, and the major birch allergen, Bet v 1, is responsible for IgE binding in more than 95% of patients with birch pollen allergy (Breiteneder, EMBO J. 1989, 8(7): 1935-8). Birch is the predominant cause of allergy in 23% of allergy patients in the United States and 14% of allergy patients in Europe. (DataMonitor report on Allergic Rhinitis, July 2010). The severity of symptoms in people who demonstrate sensitivity to birch pollen ranges from relatively mild rhinitis and conjunctivitis to a potentially life-threatening asthmatic condition. It has been shown that more than 60% of patients suffering from birch pollen allergy have IgE antibodies to this Bet v 1 (Jarolim et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1989, 88(1-2): 180-2) .
Деревья Fagales демонстрируют четкое географическое распределение, где береза и ольха являются эндемичными в северных частях Европы и Северной Америки, в то время как лещина, граб и дуб предпочитают более теплый климат, таким образом заселяя скорее южные части этих континентов. Совместные популяции всех пяти видов часто встречаются в зонах умеренного климата (Spieksma FTM. Regional European pollen calendars. D'Amato G, Spieksma FTM, Bonini S, ред. Allergenic pollen and pollinosis in Europe. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 1991. pp. 49-65). Несколько деревьев Betulaceae, в том числе ольха, лещина и граб, способны инициировать сенсибилизацию к аллергенам, подобным Bet v 1, у восприимчивых людей, что приводит к выработке в высокой степени перекрестно-реактивных IgE-антител. (Hauser, et al., 2011, Clin Exp Allergy. 41: 1804-14).Fagales trees show a clear geographical distribution, with birch and alder being endemic to the northern parts of Europe and North America, while hazel, hornbeam and oak prefer warmer climates, thus inhabiting more southern parts of these continents. Joint populations of all five species often occur in temperate zones (Spieksma FTM. Regional European pollen calendars. D'Amato G, Spieksma FTM, Bonini S, eds. Allergenic pollen and pollinosis in Europe. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 1991. pp. 49-65). Several Betulaceae trees, including alder, hazel, and hornbeam, are capable of initiating sensitization to Bet v 1-like allergens in susceptible individuals, resulting in the production of highly cross-reactive IgE antibodies. (Hauser, et al., 2011, Clin Exp Allergy. 41: 1804-14).
Аллергены порядка Fagales или аллергены Fagales, как определено в настоящем документе, включают в себя пыльцу березы (Bet v 1), пыльцу ольхи (Aln g1 и Aln g4), пыльцу лещины (Cor a1, Cor a2, Cor a8, Cor a9, Cor a10, Cor a11, Cor a12, Cor a13 и Cor a14), пыльцу граба (Car b1), пыльцу хмелеграба (Ost c1), пыльцу каштана (Cas s1, Cas s5, Cas s8 и Cas s9), пыльцу бука (Fag s1i) и пыльцу белого дуба (Que a1 и Que a2). Из аллергенов, не являющихся аллергенами березовой пыльцы, Aln g1, Cor a1, Car b1, Ost c1, Cas s1, Fag s1 и Que a1 являются подобными или родственными Bet v 1, т.е. представляют собой родственные Fagales аллергены. Эти аллергены также экспрессируются в орехах деревьев Fagales и в плодах неродственных деревьев, принадлежащих к порядку Rosales.Allergens of the order Fagales or Fagales allergens as defined herein include birch pollen (Bet v 1), alder pollen (Aln g1 and Aln g4), hazel pollen (Cor a1, Cor a2, Cor a8, Cor a9, Cor a10, Cor a11, Cor a12, Cor a13 and Cor a14), hornbeam pollen (Car b1), hop hornbeam pollen (Ost c1), chestnut pollen (Cas s1, Cas s5, Cas s8 and Cas s9), beech pollen (Fag s1i ) and white oak pollen (Que a1 and Que a2). Of the allergens that are not birch pollen allergens, Aln g1, Cor a1, Car b1, Ost c1, Cas s1, Fag s1 and Que a1 are similar or related to Bet v 1, i.e. are related Fagales allergens. These allergens are also expressed in the nuts of Fagales trees and in the fruits of unrelated trees belonging to the order Rosales.
Перекрестная реактивность этих аллергенов может вызвать симптомы пищевой аллергии у пациентов с аллергией на пыльцу. Типичные перекрестно-реактивные формы пищевой аллергии включают в себя аллергию на яблоки, вишню, абрикос, грушу, люцерну, горох, сою, помидоры, сельдерей, морковь и спаржу. (Allergens and Allergen Immunotherapy: Subcutaneous, Sublingual, and Oral, 5-е изд. Richard F. Lockey, Dennis K. Ledford, редакторы. CRC Press, Taylor & Francis Group, London, NY, 2014. pp. 114, 118119).Cross-reactivity of these allergens can cause food allergy symptoms in patients with pollen allergies. Typical cross-reactive forms of food allergies include allergies to apples, cherries, apricots, pears, alfalfa, peas, soybeans, tomatoes, celery, carrots, and asparagus. (Allergens and Allergen Immunotherapy: Subcutaneous, Sublingual, and Oral, 5th ed. Richard F. Lockey, Dennis K. Ledford, editors. CRC Press, Taylor & Francis Group, London, NY, 2014. pp. 114, 118119) .
Используемая в настоящем документе фраза аллерген Fagales включает в себя родственные Fagales аллергены. Согласно некоторым вариантам осуществления родственный аллерген Fagales определяют как белок, характеризующийся общей гомологией последовательности с Bet v 1, составляющей по меньшей мере приблизительно 35%, или гомологией последовательности с эпитопом 1 Bet v 1, составляющей по меньшей мере приблизительно 50%, или гомологией последовательности с эпитопом 2 Bet v 1, составляющей по меньшей мере приблизительно 40%, или гомологией последовательности с эпитопом 3 Bet v 1, составляющей по меньшей мере приблизительно 25%, или гомологией последовательности с эпитопом 4 Bet v 1, составляющей по меньшей мере приблизительно 15%. Согласно некоторым вариантам осуществления родственный аллерген Fagales определяют как белок, с которым перекрестно реаAs used herein, the phrase Fagales allergen includes Fagales-related allergens. In some embodiments, a Fagales related allergen is defined as a protein having at least about 35% overall sequence homology with Bet v 1, or sequence homology with Bet v 1 epitope 1 of at least about 50%, or sequence homology with epitope 2 of Bet v 1 of at least about 40%, or sequence homology to epitope 3 of Bet v 1 of at least about 25%, or sequence homology of epitope 4 of Bet v 1 of at least about 15%. In some embodiments, a Fagales related allergen is defined as a protein that cross-reacts with
- 20 045437 гируют антитела к Bet v 1, включая в себя аллергены из порядка Rosales.- 20 045437 antibodies to Bet v 1 are generated, including allergens from the Rosales order.
Иммуноглобулин Е (IgE) отвечает за гиперчувствительность 1 типа, которая проявляется в аллергическом рините, аллергическом конъюнктивите, сенной лихорадке, аллергической бронхиальной астме, аллергии на пчелиный яд и аллергии на пищевые продукты. IgE циркулирует в крови и связывается с высокоаффинными Fc-рецепторами для IgE на базофилах и тучных клетках. При большинстве аллергических ответов аллергены попадают в организм при вдыхании, проглатывании или через кожу. Затем аллерген связывается с предварительно образованным IgE, уже связанным с высокоаффинным рецептором на поверхностях тучных клеток и базофилов, что приводит к перекрестному сшиванию нескольких молекул IgE и запуску высвобождения гистамина и других медиаторов воспаления, вызывающих различные аллергические симптомы.Immunoglobulin E (IgE) is responsible for type 1 hypersensitivity, which manifests itself in allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, hay fever, allergic bronchial asthma, bee venom allergy and food allergies. IgE circulates in the blood and binds to high-affinity Fc receptors for IgE on basophils and mast cells. In most allergic responses, allergens enter the body through inhalation, ingestion, or through the skin. The allergen then binds to preformed IgE, already bound to a high-affinity receptor on the surfaces of mast cells and basophils, resulting in cross-linking of several IgE molecules and triggering the release of histamine and other inflammatory mediators, causing various allergic symptoms.
Лечение аллергии на пыльцу березы включает в себя десенсибилизирующую терапию, которая включает в себя повторные инъекции с увеличением дозировки либо неочищенного экстракта пыльцы березы, либо коротких пептидов, полученных из Bet v 1. Недостатки аллерген-специфической иммунотерапии включают в себя длительную продолжительность лечения, что приводит к проблемам с соблюдением пациентом схемы лечения и частым аллергическим ответами (до 30%) на вводимый белок. Десенсибилизирующая терапия может занять несколько лет, прежде чем лечение считается эффективным. Успешное лечение зависит от состава и качества экстракта, и лечение противопоказано пациентам с тяжелой бронхиальной астмой/пищевой аллергией из-за риска тяжелых неблагоприятных эффектов, опосредованных IgE. Соответственно, в области лечения аллергии на пыльцу березы существует потребность в альтернативных стратегиях лечения пациентов, чувствительных к аллергенам Fagales, в частности Bet v 1.Treatment of birch pollen allergy involves desensitization therapy, which involves repeated injections with increasing dosages of either crude birch pollen extract or short peptides derived from Bet v 1. Disadvantages of allergen-specific immunotherapy include the long duration of treatment, which leads to to problems with patient compliance with the treatment regimen and frequent allergic responses (up to 30%) to the administered protein. Desensitization therapy may take several years before treatment is considered effective. Successful treatment depends on the composition and quality of the extract, and treatment is contraindicated in patients with severe asthma/food allergies due to the risk of severe IgE-mediated adverse effects. Accordingly, there is a need in the field of birch pollen allergy treatment for alternative treatment strategies for patients sensitive to Fagales allergens, in particular Bet v 1.
Антитела были предложены в качестве общей стратегии лечения аллергий, поскольку они могут блокировать проникновение молекул аллергенов в ткани слизистой оболочки или могут связывать аллерген до того, как он сможет связываться с IgE, связанным с высокоаффинным рецептором на тучных клетках или базофилах, таким образом предотвращая высвобождение гистамина и других медиаторов воспаления из этих клеток. В патенте США № 5670626 описано применение моноклональных антител для лечения IgE-опосредованных аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит, аллергическая бронхиальная астма и аллергический конъюнктивит, путем блокирования связывания аллергенов с тканью слизистой оболочки. В патенте США № 6849259 описано применение аллерген-специфических антител для ингибирования аллергического воспаления на in vivo модели аллергии у мышей. Описаны системы антител на основе молока и яиц. Например, в US 20030003133 A1 раскрыто использование молока в качестве носителя для аллергенов для индукции оральной толерантности к пыльце березы и другим аллергенам. Композиции и способы снижения аллергического ответа у животного на аллерген в окружающей среде путем использования молекулы, которая ингибирует способность аллергена связываться с тучными клетками, были описаны в международной патентной публикации WO 1994/024164 А2. Другие антитела к Bet v 1 были упомянуты в патентном документе США № 2010/0034812.Antibodies have been proposed as a general strategy for the treatment of allergies because they can block the penetration of allergen molecules into mucosal tissues or can bind the allergen before it can bind to IgE bound to the high affinity receptor on mast cells or basophils, thus preventing the release of histamine and other inflammatory mediators from these cells. US Pat. No. 5,670,626 describes the use of monoclonal antibodies to treat IgE-mediated allergic diseases such as allergic rhinitis, allergic bronchial asthma and allergic conjunctivitis by blocking the binding of allergens to mucosal tissue. US Pat. No. 6,849,259 describes the use of allergen-specific antibodies to inhibit allergic inflammation in an in vivo model of allergy in mice. Antibody systems based on milk and eggs have been described. For example, US 20030003133 A1 discloses the use of milk as an allergen carrier for inducing oral tolerance to birch pollen and other allergens. Compositions and methods of reducing the allergic response in an animal to an allergen in the environment by using a molecule that inhibits the ability of the allergen to bind to mast cells have been described in international patent publication WO 1994/024164 A2. Other antibodies to Bet v 1 were mentioned in US patent document No. 2010/0034812.
Полностью человеческие антитела, описанные в настоящем документе, демонстрируют специфическое связывание с Bet v 1 и могут являться применимыми для лечения пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы, в частности, у пациентов, которые демонстрируют чувствительность к аллергену Bet v 1. Применение таких антител может являться эффективным средством лечения пациентов, страдающих аллергией на пыльцу деревьев Fagales, или их можно использовать для предотвращения повышенного ответа на Bet v 1 при вторичном воздействии или сопутствующих симптомов, связанных с аллергией, или можно использовать для уменьшения степени тяжести и/или продолжительности аллергического ответа, связанного с первичным воздействием аллергена пыльцы березы или с рецидивом симптомов при вторичном воздействии. Их можно использовать отдельно или в качестве вспомогательной терапии с другими терапевтическими компонентами или способами, известными в настоящей области техники, для лечения таких аллергий, такими как без ограничения лечение с помощью кортикостероидов или эпинефрина. Их можно использовать в сочетании со вторым или третьим отличающимся антителом, специфическим в отношении Bet v 1. Их можно использовать с аллерген-специфической иммунотерапией (SIT). Согласно некоторым вариантам осуществления комбинация с SIT в результате является синергически эффективной.The fully human antibodies described herein exhibit specific binding to Bet v 1 and may be useful for the treatment of patients suffering from birch pollen allergy, in particular in patients who demonstrate sensitivity to the Bet v 1 allergen. Use of such antibodies may be effective treatment for patients allergic to Fagales tree pollen, or can be used to prevent an increased response to Bet v 1 upon secondary exposure or associated allergy-related symptoms, or can be used to reduce the severity and/or duration of an allergic response associated with primary exposure to birch pollen allergen or with relapse of symptoms upon secondary exposure. They can be used alone or as an adjuvant therapy with other therapeutic components or methods known in the art for the treatment of such allergies, such as, but not limited to, treatment with corticosteroids or epinephrine. They can be used in combination with a second or third different antibody specific for Bet v 1. They can be used with allergen-specific immunotherapy (SIT). In some embodiments, the combination with SIT results in a synergistically effective combination.
В отличие от десенсибилизирующей терапии лечение с помощью антител, описанных в настоящем документе, может обеспечить эффективное облегчение в течение приблизительно 2 недель после начала лечения или в течение приблизительно 10 дней или приблизительно 8 дней после начала лечения. В комбинации с воздействием белка или пептидов Bet v 1 или одного или нескольких дополнительных аллергенов Fagales, лечение с помощью полностью человеческих антител, описанных в настоящем документе, может не только блокировать аллергический ответ, но может более эффективно или синергически снижать чувствительность пациентов, страдающих аллергией на пыльцу деревьев Fagales.In contrast to desensitization therapy, treatment with the antibodies described herein can provide effective relief within approximately 2 weeks of initiation of treatment or within approximately 10 days or approximately 8 days of initiation of treatment. When combined with exposure to Bet v 1 protein or peptides or one or more additional Fagales allergens, treatment with the fully human antibodies described herein may not only block the allergic response, but may more effectively or synergistically desensitize patients allergic to pollen from Fagales trees.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению получают из организма мышей, иммунизированных первичным иммуногеном, таким как природный Bet v 1, который можно приобрести коммерческим путем (например, у Indoor Biotechnologies, VA, № по кат. NA-BV1-1) или можно получить рекомбинантным способом. Полноразмерная аминокислотная последо- 21 045437 вательность Bet v 1 показана как SEQ ID NO: 306. Полноразмерную аминокислотную последовательность Bet v 1 также можно найти в SEQ ID NO: 314 от Uniprot: P15494.In certain embodiments, the antibodies of the present invention are obtained from mice immunized with a primary immunogen, such as natural Bet v 1, which can be purchased commercially (for example, from Indoor Biotechnologies, VA, Cat. No. NA-BV1-1) or can obtained recombinantly. The full length amino acid sequence of Bet v 1 is shown as SEQ ID NO: 306. The full length amino acid sequence of Bet v 1 can also be found in SEQ ID NO: 314 from Uniprot: P15494.
Иммуноген может представлять собой биологически активный и/или иммуногенный фрагмент природного, нативного или полученного рекомбинантным способом Bet v 1 или ДНК, кодирующую его активный фрагмент. Фрагмент может быть получен или из N-конца, или из С-конца Bet v 1 или из любого сайта в аминокислотной последовательности Bet v 1.The immunogen may be a biologically active and/or immunogenic fragment of natural, native or recombinantly produced Bet v 1 or DNA encoding its active fragment. The fragment may be derived from either the N-terminus or the C-terminus of Bet v 1 or from any site in the amino acid sequence of Bet v 1.
Антигенсвязывающие фрагменты антител Если специально не указано иное, используемый в настоящем документе термин антитело следует понимать как включающий в себя молекулы антител, содержащие две тяжелые цепи иммуноглобулина и две легкие цепи иммуноглобулина (т.е. полные молекулы антитела), а также их антигенсвязывающие фрагменты. Используемые в настоящем документе термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и тому подобное включают в себя любой встречающийся в природе, полученный ферментативно, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывается с антигеном с образованием комплекса. Используемые в настоящем документе термины антигенсвязывающая часть антитела или фрагмент антитела относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с Bet v 1. Фрагмент антитела может включать в себя фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2, фрагмент Fv, фрагмент dAb, фрагмент, содержащий CDR, или выделенную CDR. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно получить, например, из полных молекул антитела с использованием любых подходящих стандартных техник, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные техники генной инженерии, предусматривающие манипуляции с ДНК и экспрессию ДНК, кодирующую вариабельные и (необязательно) константные домены антитела. Такая ДНК известна и/или легко доступна, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (включая в себя, например, фаговые библиотеки антител), или же ее можно синтезировать. ДНК можно секвенировать и воздействовать на нее химически или с использованием техник молекулярной биологии, например, для расположения одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов в подходящую конфигурацию или для введения кодонов, создания цистеиновых остатков, модификации, добавления или удаления аминокислот и т.д.Antigen-Binding Antibody Fragments Unless specifically stated otherwise, the term antibody as used herein should be understood to include antibody molecules containing two immunoglobulin heavy chains and two immunoglobulin light chains (ie, complete antibody molecules), as well as antigen-binding fragments thereof. As used herein, the terms antigen binding portion of an antibody, antigen binding fragment of an antibody, and the like include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic or genetically engineered polypeptide or glycoprotein that specifically binds to an antigen to form a complex. As used herein, the terms antigen binding portion of an antibody or antibody fragment refer to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to Bet v 1. An antibody fragment may include a Fab fragment, an F(ab')2 fragment, an Fv fragment, a dAb, fragment containing CDR, or isolated CDR. Antigen-binding antibody fragments can be prepared, for example, from complete antibody molecules using any suitable standard techniques, such as proteolytic digestion or recombinant genetic engineering techniques involving DNA manipulation and expression of DNA encoding antibody variable and (optionally) constant domains. Such DNA is known and/or readily available, for example, from commercial sources, DNA libraries (including, for example, phage antibody libraries), or can be synthesized. DNA can be sequenced and manipulated chemically or using molecular biology techniques, for example to arrange one or more variable and/or constant domains into a suitable configuration or to introduce codons, create cysteine residues, modify, add or remove amino acids, etc. .
Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают в себя следующее: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')2; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие звенья, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенная определяющая комплементарность область (CDR), такая как пептид CDR3) или пептид с ограниченной конформационной свободой FR3-CDR3-FR4. Другие сконструированные молекулы, такие как доменспецифические антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленными доменами, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, миниантитела, наноантитела (например моновалентные наноантитела, бивалентные наноантитела и т.д.), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP) и вариабельные домены IgNAR акулы, также включены в объем используемое в настоящем документе выражения антигенсвязывающий фрагмент.Non-limiting examples of antigen binding fragments include the following: (i) Fab fragments; (ii) fragments F(ab') 2 ; (iii) Fd fragments; (iv) Fv fragments; (v) single chain Fv molecules (scFv); (vi) dAb fragments; and (vii) minimal recognition units consisting of amino acid residues that mimic the hypervariable region of an antibody (eg, a dedicated complementarity determining region (CDR) such as the CDR3 peptide) or a conformationally restricted peptide FR3-CDR3-FR4. Other engineered molecules such as domain-specific antibodies, single-domain antibodies, domain-deleted antibodies, chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, diabodies, tri-bodies, tetrabodies, mini-antibodies, nanoantibodies (e.g. monovalent nanoantibodies, bivalent nanoantibodies, etc.), immunopharmaceuticals small modular protein (SMIP) and shark IgNAR variable domains are also included within the scope of the expression antigen binding fragment as used herein.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, будет содержать по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может характеризоваться любым размером или аминокислотным составом и, как правило, будет содержать по меньшей мере одну CDR, которая является смежной или расположена в одной рамке считывания с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, содержащих домен VH, ассоциированный с доменом VL, домены VH и VL могут быть расположены относительно друг друга в любом подходящем расположении. Например, вариабельная область может являться димерной и может содержать димеры VH-VH, VH-VL или VLVL. Альтернативно, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH или VL.An antigen binding fragment of an antibody will typically contain at least one variable domain. The variable domain can be of any size or amino acid composition and will typically contain at least one CDR that is adjacent or in the same reading frame as one or more framework sequences. In antigen binding fragments containing a V H domain associated with a V L domain, the V H and V L domains may be located relative to each other in any suitable arrangement. For example, the variable region may be dimeric and may contain VH-VH, VH-VL, or VLVL dimers. Alternatively, the antigen binding fragment of the antibody may comprise a monomeric VH or VL domain.
Согласно определенным вариантам осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие, иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно обнаружить в пределах антигенсвязывающего фрагмента антитела согласно настоящему изобретению, включают в себя следующее: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH Ch1-Ch2; (v) Vh -Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh -Ch2-Ch3; (vii) Vh -Cl; (viii) Vl -Ch1; (ix) Vl -Ch2; (x) Vl -Ch3; (xi) VL -Ch1-Ch2; (xii) VL -Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) VL -Ch2-Ch3; и (xiv) VL -CL. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включая в себя любую из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть либо напрямую связаны друг с другом, либо могут быть связаны с помощью полной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, что дает в результате гибкое или полугибкое соединение между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Более того, антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) любой из конфигураций вариабельных и константных доменов, перечисленных выше, в некова- 22 045437 лентной ассоциации друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами VH или VL (например, с помощью дисульфидной(ых) связи(ей))In certain embodiments, an antigen binding fragment of an antibody may comprise at least one variable domain covalently linked to at least one constant domain. Non-limiting, exemplary configurations of variable and constant domains that may be found within an antigen binding fragment of an antibody of the present invention include the following: (i) V H -C H 1; (ii) V H -C H 2; (iii) V H -C H 3; (iv) V H Ch1-Ch2; (v) Vh -Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh -Ch2-Ch3; (vii) Vh -Cl; (viii) Vl -Ch1; (ix) Vl -Ch2; (x) Vl -Ch3; (xi) V L -C h 1-C h 2; (xii) V L -C h 1-C h 2-C h 3; (xiii) V L -C h 2-C h 3; and (xiv) V L -C L . In any configuration of variable and constant domains, including any of the exemplary configurations listed above, the variable and constant domains can either be directly linked to each other or can be linked through a full or partial hinge or linker region. The hinge region may consist of at least 2 (eg, 5, 10, 15, 20, 40, 60 or more) amino acids, resulting in a flexible or semi-flexible connection between adjacent variable and/or constant domains in a single polypeptide molecule. Moreover, the antigen binding fragment of an antibody of the present invention may comprise a homodimer or heterodimer (or other multimer) of any of the variable and constant domain configurations listed above in non-covalent association with each other and/or with one or more monomeric VH domains or V L (for example, via disulfide bond(s))
Получение антител человека.Obtaining human antibodies.
Способы получения антител человека в трансгенных мышах известны в настоящей области техники. Любые такие известные способы можно использовать в контексте настоящего изобретения для получения антител человека, которые специфически связываются с Bet v 1.Methods for producing human antibodies in transgenic mice are known in the art. Any such known methods can be used in the context of the present invention to obtain human antibodies that specifically bind to Bet v 1.
При использовании технологии VELOCIMMUNE™ (см., например, патент США № 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) или любого другого известного способа для создания моноклональных антитела вначале выделяют высокоаффинные химерные антитела к Bet v 1 с вариабельной областью человека и константной областью мыши. Технология VELOCIMMUNE® включает в себя создание трансгенной мыши с геномом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанные с эндогенными локусами константной области мыши, так что мышь вырабатывает антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелой и легкой цепей человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело.When using VELOCIMMUNE™ technology (see, for example, US Patent No. 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) or any other known method for creating monoclonal antibodies, first, high-affinity chimeric antibodies to Bet v 1 with a human variable region and a mouse constant region are isolated. VELOCIMMUNE® technology involves the creation of a transgenic mouse with a genome containing human heavy and light chain variable regions operably linked to endogenous mouse constant region loci such that the mouse produces an antibody containing the human variable region and the mouse constant region in response to antigen stimulation . DNA encoding the variable regions of the heavy and light chains of the antibody is isolated and operably linked to DNA encoding the constant regions of the human heavy and light chains. The DNA is then expressed in a cell capable of expressing a fully human antibody.
Как правило, мышь VELOCIMMUNE® сенсибилизируют представляющим интерес антигеном, и лимфатические клетки (такие как В-клетки) извлекают из организма мышей, которые экспрессируют антитела. Лимфатические клетки могут сливать с линией клеток миеломы для получения иммортализованных гибридомных клеточных линий, и такие гибридомные клеточные линии подвергают скринингу и отбирают для идентификации гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфические в отношении представляющего интерес антигена. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепей, можно выделить и связать с требуемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепей. Такой белок антитела может продуцироваться в клетке, такой как клетка СНО. Альтернативно, ДНК, кодирующую антигенспецифические химерные антитела или вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, можно выделить непосредственно из антигенспецифических лимфоцитов.Typically, a VELOCIMMUNE® mouse is sensitized with an antigen of interest, and lymphatic cells (such as B cells) are recovered from the mice that express the antibodies. Lymphatic cells can be fused with a myeloma cell line to produce immortalized hybridoma cell lines, and such hybridoma cell lines are screened and selected to identify hybridoma cell lines that produce antibodies specific for the antigen of interest. DNA encoding the heavy chain and light chain variable regions can be isolated and linked to the desired heavy chain and light chain isotype constant regions. Such an antibody protein may be produced in a cell, such as a CHO cell. Alternatively, DNA encoding antigen-specific chimeric antibodies or light and heavy chain variable domains can be isolated directly from antigen-specific lymphocytes.
Сначала выделяют высокоаффинные химерные антитела с вариабельной областью человека и константной областью мыши. Как и в разделе экспериментов ниже, определяют характеристики антител и выбирают антитела в отношении требуемых характеристик, включая в себя аффинность, селективность, эпитоп и т.д. Константные области мыши заменяют требуемой константной областью человека, например, IgG1 или IgG4 дикого типа или модифицированным IgG1 или IgG4 для создания полностью человеческого антитела согласно настоящему изобретению. В то время как выбранная константная область может варьироваться в зависимости от конкретного применения, характеристики высокой аффинности связывания антигена и целевой специфичности находятся в вариабельной области.First, high-affinity chimeric antibodies with a human variable region and a mouse constant region are isolated. As in the experiments section below, antibody characteristics are determined and antibodies are selected for desired characteristics including affinity, selectivity, epitope, etc. The mouse constant regions are replaced with the desired human constant region, for example, wild-type IgG1 or IgG4 or modified IgG1 or IgG4 to create a fully human antibody of the present invention. While the selected constant region may vary depending on the specific application, the characteristics of high antigen binding affinity and target specificity are found in the variable region.
Как правило, антитела согласно настоящему изобретению обладают очень высокими аффинностями, как правило, с KD от приблизительно 10-12 до приблизительно 10-9 М при измерении по связыванию с антигеном, либо иммобилизованным на твердой фазе, либо в жидкой фазе. Константные области мыши заменяют требуемыми константными областями человека для создания полностью человеческих антител согласно настоящему изобретению. В то время как выбранная константная область может варьироваться в зависимости от конкретного применения, характеристики высокоаффинного связывания с антигеном и характеристики специфичности по отношении к мишени находятся в вариабельной области.In general, the antibodies of the present invention have very high affinities, typically with a K D of from about 10 -12 to about 10 -9 M when measured by binding to antigen, either immobilized on a solid phase or in a liquid phase. Mouse constant regions are replaced with the desired human constant regions to create fully human antibodies according to the present invention. While the selected constant region may vary depending on the particular application, the high affinity antigen binding characteristics and target specificity characteristics are in the variable region.
Биоэквиваленты.Bioequivalents.
Антитела к Bet v 1 и фрагменты антител согласно настоящему изобретению охватывают белки с аминокислотными последовательностями, которые отличаются от аминокислотных последовательностей описанных антител, но которые сохраняют способность связываться с Bet v 1. Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одну или несколько вставок, делеций или замен аминокислот по сравнению с исходной последовательностью, но проявляют биологическую активность, которая является по существу эквивалентной активности описанных антител. Аналогично, кодирующие антитело последовательности ДНК согласно настоящему изобретению охватывают последовательности, которые содержат одну или несколько вставок, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрытой последовательностью, но которые кодируют антитело или фрагмент антитела, которые являются по существу биоэквивалентом по отношению к антителу или фрагменту антитела согласно настоящему изобретению.The anti-Bet v 1 antibodies and antibody fragments of the present invention cover proteins with amino acid sequences that differ from the amino acid sequences of the described antibodies, but which retain the ability to bind to Bet v 1. Such variant antibodies and antibody fragments contain one or more insertions, deletions or substitutions amino acids compared to the original sequence, but exhibit biological activity that is substantially equivalent to the activity of the described antibodies. Likewise, antibody-encoding DNA sequences of the present invention include sequences that contain one or more insertions, deletions, or nucleotide substitutions relative to the disclosed sequence, but that encode an antibody or antibody fragment that is substantially bioequivalent to the antibody or antibody fragment of the present invention.
Два антигенсвязывающих белка или антитела, считаются биоэквивалентными, если, например, они представляют собой фармацевтические эквиваленты или фармацевтические альтернативы, скорость и степень абсорбции которых не показывают значительного различия при введении в одной и той же молярной дозе в аналогичных условиях эксперимента, либо в виде одной дозы, либо в виде нескольких доз. Некоторые антитела будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по скорости их абсорбции, и все же их можно считать биоэквивалентными, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются преднамеренными и отраже- 23 045437 ны на этикетке, не имеют существенного значения для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при постоянном применении, и считаются с медицинской точки зрения незначительными для конкретного исследуемого лекарственного продукта.Two antigen-binding proteins or antibodies are considered bioequivalent if, for example, they are pharmaceutical equivalents or pharmaceutical alternatives whose rate and extent of absorption do not show significant differences when administered at the same molar dose under similar experimental conditions or as a single dose , or in the form of several doses. Some antibodies will be considered equivalents or pharmaceutical alternatives if they are equivalent in their extent of absorption, but not in their rate of absorption, and may still be considered bioequivalent because such differences in rate of absorption are intentional and reflected on the label, not are essential to achieving effective concentrations of the drug in the body, for example, with chronic use, and are considered medically insignificant for the particular drug product being studied.
Согласно одному варианту осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если отсутствуют клинически значимые различия в их безопасности, чистоте и эффективности.In one embodiment, two antigen binding proteins are bioequivalent if there are no clinically significant differences in their safety, purity, or potency.
Согласно одному варианту осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если пациент может переключаться один или несколько раз между эталонным продуктом и биологическим продуктом без ожидаемого увеличения риска неблагоприятных эффектов, включая в себя клинически значимое изменение иммуногенности или пониженную эффективность, по сравнению с продолжением терапии без такого переключения.In one embodiment, two antigen binding proteins are bioequivalent if the patient can switch one or more times between the reference product and the biological product without an expected increase in the risk of adverse effects, including a clinically significant change in immunogenicity or reduced efficacy, compared to continuing therapy without such switching .
Согласно одному варианту осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если оба они действуют посредством общего механизма или механизмов действия для условия или условий использования, в той степени, в которой такие механизмы являются известными.In one embodiment, two antigen binding proteins are bioequivalent if they both act through a common mechanism or mechanisms of action for the condition or conditions of use, to the extent such mechanisms are known.
Биоэквивалентность можно продемонстрировать с помощью способов in vivo и in vitro. Измерения биоэквивалентности включают в себя, например, (а) тест in vivo у людей или других млекопитающих, в котором концентрацию антитела или его метаболитов измеряют в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости как функцию времени; (b) тест in vitro, который коррелировал с данными о биодоступности in vivo у человека и является обоснованно прогностическим в отношении этих данных; (с) тест in vivo у людей или других млекопитающих, в котором соответствующий острый фармакологический эффект антитела (или его мишени) измеряют как функцию времени; и (d) хорошо контролируемое клиническое испытание, которое устанавливает безопасность, эффективность или биодоступность или биоэквивалентность антитела.Bioequivalence can be demonstrated using in vivo and in vitro methods. Bioequivalence measurements include, for example, (a) an in vivo test in humans or other mammals in which the concentration of an antibody or its metabolites is measured in blood, plasma, serum or other biological fluid as a function of time; (b) an in vitro test that has been correlated with and is reasonably predictive of in vivo bioavailability data in humans; (c) an in vivo test in humans or other mammals in which the relevant acute pharmacological effect of the antibody (or its target) is measured as a function of time; and (d) a well-controlled clinical trial that establishes the safety, efficacy or bioavailability or bioequivalence of the antibody.
Биоэквивалентные варианты антител согласно настоящему изобретению можно сконструировать, например, путем осуществления различных замен остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, не являющихся необходимыми для биологической активности. Например, остатки цистеина, не являющиеся необходимыми для биологической активности, можно удалить или заменить другими аминокислотами для предотвращения образования ненужных или неправильных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать в себя варианты антител, содержащие аминокислотные замены, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например, мутации, которые устраняют или удаляют гликозилирование.Bioequivalent variants of the antibodies of the present invention can be constructed, for example, by making various substitutions of residues or sequences or removing terminal or internal residues or sequences that are not essential for biological activity. For example, cysteine residues that are not essential for biological activity can be removed or replaced with other amino acids to prevent the formation of unnecessary or irregular intramolecular disulfide bridges upon renaturation. In other contexts, bioequivalent antibodies may include antibody variants containing amino acid substitutions that modify the glycosylation characteristics of the antibodies, such as mutations that eliminate or remove glycosylation.
Биологические характеристики антител.Biological characteristics of antibodies.
Как правило, антитела согласно настоящему изобретению могут функционировать путем связывания с Bet v 1, фрагментом Bet v 1 или с Bet v 1 и одним или нескольким аллергенами Fagales или аллергенами, родственными Fagales.In general, antibodies of the present invention may function by binding to Bet v 1, a fragment of Bet v 1, or Bet v 1 and one or more Fagales allergens or Fagales-related allergens.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению могут связываться с эпитопом или фрагментом, расположенным в пределах белка Bet v 1, например, эпитопом или фрагментом, охватывающим аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; эпитопом или фрагментом, охватывающим аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно 56 согласно SEQ ID NO: 306; эпитопом или фрагментом, охватывающим аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 19 согласно SEQ ID NO: 306; эпитопом или фрагментом, охватывающим аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно 57 до приблизительно 70 согласно SEQ ID NO: 306; или эпитопом или фрагментом, охватывающим аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно 81 до приблизительно 89 или приблизительно 81 до приблизительно 96 согласно SEQ ID NO: 306. Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению могут связываться по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 и 315, причем последовательность эпитопа можно удлинить на 1-5 аминокислот или приблизительно 5 - приблизительно 10 аминокислот либо на С-конце, либо на N-конце.In certain embodiments, antibodies of the present invention may bind to an epitope or fragment located within the Bet v 1 protein, for example, an epitope or fragment spanning amino acid residues ranging from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306 ; an epitope or fragment comprising amino acid residues ranging from about position 44 to about 56 according to SEQ ID NO: 306; an epitope or fragment comprising amino acid residues ranging from about 2 to about 19 according to SEQ ID NO: 306; an epitope or fragment comprising amino acid residues ranging from about 57 to about 70 according to SEQ ID NO: 306; or an epitope or fragment comprising amino acid residues ranging from about 81 to about 89 or about 81 to about 96 according to SEQ ID NO: 306. In certain embodiments, the antibodies of the present invention can bind to at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 307, 308, 309, 310, 311 and 315, wherein the epitope sequence can be extended by 1-5 amino acids or about 5 to about 10 amino acids at either the C-terminus or the N-terminus.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению могут функционировать путем блокирования или ингибирования связывания IgE с тучными клетками или базофилами у пациента, чувствительного к аллергену Bet v 1. Согласно определенным вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе антитела ингибируют или блокируют активацию базофилов, например, по меньшей мере приблизительно на 70%, по сравнению с антителом изотипического контроля. Согласно определенным вариантам осуществления антитела ингибируют или блокируют дегрануляцию тучных клеток, например, по меньшей мере на приблизительно 70%, или по меньшей мере на приблизительно 75%, или по меньшей мере на приблизительно 80%, или по меньшей мере на приблизительно 85%, или по меньшей мере на приблизительно 90%, или по меньшей мере на приблизительно 95%, по сравнению с антителом изотипического контроля.In certain embodiments, the antibodies of the present invention may function by blocking or inhibiting the binding of IgE to mast cells or basophils in a patient sensitive to the Bet v 1 allergen. In certain embodiments, the antibodies provided herein inhibit or block the activation of basophils, for example, at least at least approximately 70% compared to the isotype control antibody. In certain embodiments, the antibodies inhibit or block mast cell degranulation, for example, by at least about 70%, or at least about 75%, or at least about 80%, or at least about 85%, or at least about 90%, or at least about 95%, compared to the isotype control antibody.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к полностью челове- 24 045437 ческому моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с Bet v 1, причем антитело или его фрагмент проявляет одну или несколько следующих характеристик: (i) содержит HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (ii) содержит LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (iii) содержит домен HCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 и 296, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272 и 304, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (iv) содержит домен HCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 и 292, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен HCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 и 294, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен LCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 и 300, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 и 302, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (v) связывается с Bet v 1с KD, равной или составляющей меньше чем 10-8 или находящейся в диапазоне от приблизительно 10-8 до приблизительно 10-11; (vi) демонстрирует эффективность по меньшей мере в одной модели анафилаксии или воспаления на животных; или (vii) конкурирует с эталонным антителом за связывание с Bet v 1.In one embodiment, the present invention provides a fully human monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds Bet v 1, wherein the antibody or fragment thereof exhibits one or more of the following characteristics: (i) contains an HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 and 290, or a substantially similar sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (ii) contains an LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250 , 266 and 298, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (iii) contains an HCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 and 296, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and an LCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272 and 304, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (iv) contains an HCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 and 292, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; HCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 and 294, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; LCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 and 300, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and an LCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 and 302, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (v) associated with a Bet v 1c KD equal to or less than 10 -8 or ranging from about 10 -8 to about 10 -11 ; (vi) demonstrates efficacy in at least one animal model of anaphylaxis or inflammation; or (vii) competes with a reference antibody for binding to Bet v 1.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению комбинации двух или более полностью человеческих антител согласно настоящему изобретению или их фрагментов для получения композиции, причем антитела связываются с Bet v 1, и причем каждое антитело или его фрагмент, содержащиеся в композиции, проявляют одну или несколько следующих характеристик: (i) содержит HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 и 290, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (ii) содержит LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266 и 298, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (iii) содержит домен HCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 и 296, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 24о, 256, 272 и 304, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (iv) содержит домен HCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 и 292, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен HCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118,In one embodiment, the present invention relates to the use of a combination of two or more fully human antibodies of the present invention or fragments thereof to produce a composition, wherein the antibodies bind to Bet v 1, and wherein each antibody or fragment thereof contained in the composition exhibits one or more the following characteristics: (i) contains HCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 282 and 290, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (ii) contains an LCVR with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250 , 266 and 298, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (iii) contains an HCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 288 and 296, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and an LCDR3 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 24o, 256, 272 and 304, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (iv) contains an HCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 284 and 292, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; HCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118,
- 25 045437- 25 045437
134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 и 294, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен LCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 и 300, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен LCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 и 302, или по существу сходной с ними последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; (v) связывается с Bet v 1 с KD, равной или составляющей меньше чем 10-8 или находящейся в диапазоне от приблизительно 10-8 до приблизительно 10-11; (vi) демонстрирует эффективность по меньшей мере в одной модели анафилаксии или воспаления на животных; или (vii) конкурирует с эталонным антителом за связывание с Bet v 1.134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 286 and 294, or a substantially similar sequence thereto that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity; LCDR1 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268 and 300, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and an LCDR2 domain with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 and 302, or a substantially similar sequence thereto that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; (v) binds to Bet v 1 with a K D equal to or less than 10 -8 or ranging from about 10 -8 to about 10 -11 ; (vi) demonstrates efficacy in at least one animal model of anaphylaxis or inflammation; or (vii) competes with a reference antibody for binding to Bet v 1.
Определенные антитела к Bet v 1 согласно настоящему изобретению при использовании их отдельно или в комбинации способны связываться и нейтрализовать по меньшей мере один биологический эффект Bet v 1, как определено в анализах in vitro или in vivo. Способность антител согласно настоящему изобретению связываться и нейтрализовать активность Bet v 1 можно измерить с использованием любого стандартного способа, известного специалистам в настоящей области техники, включая в себя анализы связывания или анализы нейтрализации активности (например, защита от анафилаксии), как описано в настоящем документе.Certain anti-Bet v 1 antibodies of the present invention, when used alone or in combination, are capable of binding to and neutralizing at least one biological effect of Bet v 1, as determined by in vitro or in vivo assays. The ability of the antibodies of the present invention to bind and neutralize Bet v 1 activity can be measured using any standard method known to those skilled in the art, including binding assays or neutralizing activity assays (eg, protection against anaphylaxis), as described herein.
Неограничивающие иллюстративные анализы in vitro для измерения активности связывания проиллюстрированы в примере 3 в настоящем документе. В примере 3 аффинности связывания и кинетические константы антител человека к Bet v 1 определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса.Non-limiting exemplary in vitro assays for measuring binding activity are illustrated in Example 3 herein. In Example 3, the binding affinities and kinetic constants of human antibodies to Bet v 1 were determined using surface plasmon resonance.
Белки или пептиды Bet v 1 можно модифицировать для включения в них вставки или замены определенных остатков для мечения или в целях конъюгации с молекулами-носителями, такими как KLH. Например, цистеин можно добавить либо на N-конце, либо на С-конце пептида, либо можно добавить линкерную последовательность для получения пептида для конъюгации, например, с KLH для иммунизации. Антитела, специфические по отношению к Bet v 1, могут не содержать дополнительные метки или фрагменты, или они могут содержать N-концевую или С-концевую метку или фрагмент. Согласно одному варианту осуществления метка или фрагмент представляет собой биотин. В анализе связывания местоположение метки (если таковая присутствует) может определять ориентацию пептида относительно поверхности, с которой связан этот пептид. Например, если поверхность покрыта авидином, пептид, содержащий N-концевой биотин, будет ориентирован так, что С-концевая часть пептида будет дистальной по отношению к поверхности.Bet v 1 proteins or peptides can be modified to include the insertion or substitution of certain residues for labeling or for conjugation with carrier molecules such as KLH. For example, a cysteine can be added at either the N-terminus or the C-terminus of the peptide, or a linker sequence can be added to produce a peptide for conjugation, for example, with KLH for immunization. Antibodies specific for Bet v 1 may not contain additional tags or fragments, or they may contain an N-terminal or C-terminal tag or fragment. In one embodiment, the tag or moiety is biotin. In a binding assay, the location of the label (if present) can determine the orientation of the peptide relative to the surface to which the peptide is bound. For example, if the surface is coated with avidin, the peptide containing N-terminal biotin will be oriented such that the C-terminal part of the peptide is distal to the surface.
Картирование эпитопов и родственные технологии.Epitope mapping and related technologies.
Используемый в настоящем документе термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим сайтом связывания с антигеном в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Отдельный антиген может содержать больше одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями на антигене и могут характеризоваться различными биологическими эффектами. Эпитопы могут являться либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образован пространственно смежными аминокислотами из различных сегментов неразветвленной полипептидной цепи. Линейный эпитоп образован смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В определенных случаях эпитоп может включать в себя фрагменты сахаридов, фосфорилированные группы или сульфонильные группы на антигене.As used herein, the term epitope refers to an antigenic determinant that interacts with a specific antigen binding site in the variable region of an antibody molecule known as a paratope. A single antigen may contain more than one epitope. Thus, different antibodies may bind to different regions on the antigen and may have different biological effects. Epitopes can be either conformational or linear. A conformational epitope is formed by spatially adjacent amino acids from different segments of an unbranched polypeptide chain. A linear epitope is formed by adjacent amino acid residues in a polypeptide chain. In certain cases, the epitope may include saccharide moieties, phosphorylated groups, or sulfonyl groups on the antigen.
В настоящем документе предусмотрены антитела к Bet v 1, которые взаимодействуют с одним или несколькими аминокислотами, обнаруженными в пределах молекулы Bet v 1, включая в себя, например, любой фрагмент Bet v 1, показанный в SEQ ID NO: 306, или в пределах сопоставимых областей полученного рекомбинантным способом белка Bet v 1. Эпитоп, с которым связываются антитела, может состоять из одной непрерывной последовательности из 3 или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислот, расположенных в пределах молекулы Bet v 1. Иллюстративные непрерывные последовательности включают в себя аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 44 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 38 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 41 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 26 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 29 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоProvided herein are anti-Bet v 1 antibodies that react with one or more amino acids found within the Bet v 1 molecule, including, for example, any Bet v 1 fragment shown in SEQ ID NO: 306, or within comparable regions of the recombinantly produced Bet v 1 protein. The epitope to which antibodies bind may consist of one contiguous sequence of 3 or more (for example, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more) amino acids located within the Bet v 1 molecule. Exemplary contiguous sequences include amino acid residues ranging from about position 23 to about position 44 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 23 to about position 38 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 23 to about position 41 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 26 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 29 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 44 to about position 70 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues in the range
- 26 045437 не от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 56 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 45 до приблизительно положения 56 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 2 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 5 до приблизительно положения 10 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 5 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 8 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 11 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 57 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 57 до приблизительно положения 66 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 81 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 84 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 85 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306; и аминокислотные остатки, находящиеся в диапазоне от приблизительно положения 81 до приблизительно положения 89 согласно SEQ ID NO: 306. Дополнительные иллюстративные непрерывные последовательности включают в себя по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 и 315, причем такую последовательность можно удлинить на приблизительно 1 - приблизительно 5 аминокислот или приблизительно 5 - приблизительно 10 аминокислот, либо на С-конце, либо на N-конце. Альтернативно, эпитоп может состоять из множества несмежных аминокислот (или аминокислотных последовательностей), расположенных в пределах молекулы Bet v 1 (например, конформационный эпитоп).- 26 045437 not from about position 44 to about position 56 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 45 to about position 56 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 2 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 5 to about position 10 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 5 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 8 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 11 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 57 to about position 70 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 57 to about position 66 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 81 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 84 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 85 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306; and amino acid residues ranging from about position 81 to about position 89 according to SEQ ID NO: 306. Additional exemplary contiguous sequences include at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 and 315, which sequence may be extended by about 1 to about 5 amino acids or about 5 to about 10 amino acids, either at the C-terminus or the N-terminus. Alternatively, the epitope may consist of multiple non-contiguous amino acids (or amino acid sequences) located within the Bet v 1 molecule (eg, a conformational epitope).
Различные техники, известные средним специалистам в настоящей области техники, можно использовать для определения того, взаимодействует ли антитело с одной или несколькими аминокислотами в пределах полипептида или белка. Иллюстративные техники включают в себя, например, рутинные анализы перекрестного блокирования, такие как анализы, описанные в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Другие способы включают в себя анализ с помощью аланинсканирующего мутагенеза, пептидный блоттинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), анализ расщепления пептидов, кристаллографические исследования и анализ ЯМР. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопов, экстракция эпитопов и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496). Другим способом, который можно применять для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым взаимодействует антитело, является водороднодейтериевый обмен, обнаруживаемый посредством масс-спектрометрии. В общих чертах, способ водородно-дейтериевого обмена предусматривает мечение дейтерием представляющего интерес белка с последующим связыванием антитела с меченным дейтерием белком. Затем комплекс белок-антитело переносят в воду и способные к обмену протоны в аминокислотах, которые защищены комплексом антитела, подвергаются обратному обмену дейтерия на водород с более медленной скоростью, чем способные к обмену протоны в аминокислотах, которые не являются частью границы раздела. В результате аминокислоты, которые образуют часть границы раздела белок/антитело, могут сохранять дейтерий и, следовательно, проявлять относительно большую массу по сравнению с аминокислотами, не включенными в границу раздела. После диссоциации антитела целевой белок подвергают протеазному расщеплению и масс-спектрометрическому анализу, таким образом выявляя меченные дейтерием остатки, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми взаимодействует антитело. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Рентгеноструктурный анализ комплекса антитела с антигеном также можно использовать в целях картирования эпитопов.Various techniques known to those of ordinary skill in the art can be used to determine whether an antibody reacts with one or more amino acids within a polypeptide or protein. Exemplary techniques include, for example, routine cross-blocking assays such as those described in Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Other methods include alanine scanning mutagenesis analysis, peptide blotting (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), peptide digestion assay, crystallographic studies and NMR analysis. In addition, methods such as epitope excision, epitope extraction, and chemical modification of antigens can be used (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496). Another method that can be used to identify amino acids in a polypeptide with which an antibody reacts is hydrogen-deuterium exchange, detected by mass spectrometry. In general terms, the hydrogen-deuterium exchange method involves labeling a protein of interest with deuterium, followed by binding of the antibody to the deuterium-labeled protein. The protein-antibody complex is then transferred to water and the exchangeable protons in the amino acids that are protected by the antibody complex undergo back exchange of deuterium for hydrogen at a slower rate than the exchangeable protons in the amino acids that are not part of the interface. As a result, amino acids that form part of the protein/antibody interface may retain deuterium and therefore exhibit relatively greater mass compared to amino acids not included in the interface. Once the antibody is dissociated, the target protein is subjected to protease digestion and mass spectrometric analysis, thereby identifying deuterium-labeled residues that correspond to the specific amino acids with which the antibody interacts. See, for example, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. X-ray diffraction analysis of the antibody-antigen complex can also be used for epitope mapping purposes.
Анализ профиля на основе модификаций (MAP - от англ. Modification-Assisted Profiling))), также известный как анализ профиля антител на основе структуры антигенов (ASAP - от англ. Antigen Structure-based Antibody Profiling))), представляет собой способ распределения по категориям больших количеств моноклональных антител, направленных против одного и того же антигена, в соответствии со сходствами профиля связывания каждого антитела с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигена (US 2004/0101920). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, либо явно отличающийся от эпитопа, представленного другой категорией, либо частично перекрывающийся с ним. Эта технология позволяет быстро отфильтровать генетически идентичные антитела, так что определение характеристик может быть сосредоточено на генетически отличных антителах. В случае использования для скрининга гибридом MAP может облегчать идентификацию редких гибридомных клонов, которые продуцируют моноклональные антитела с требуемыми характеристиками. MAP можно использовать для сортировки антител согласно настоящему изобретению по группам антител, связывающихся с различными эпитопами.Modification-Assisted Profiling (MAP), also known as Antigen Structure-based Antibody Profiling (ASAP), is a method of distributing categories of large numbers of monoclonal antibodies directed against the same antigen, according to the similarities in the binding profile of each antibody to chemically or enzymatically modified antigen surfaces (US 2004/0101920). Each category may reflect a unique epitope, either clearly different from or partially overlapping with the epitope represented by another category. This technology allows genetically identical antibodies to be quickly filtered out so that characterization can focus on genetically distinct antibodies. When used for hybridoma screening, MAP can facilitate the identification of rare hybridoma clones that produce monoclonal antibodies with the desired characteristics. MAP can be used to sort the antibodies of the present invention into groups of antibodies that bind to different epitopes.
- 27 045437- 27 045437
Согласно определенным вариантам осуществления антитела к Bet v 1 или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с эпитопом в пределах Bet v 1, в природной или нативной форме, как проиллюстрировано в SEQ ID NO: 306 или SEQ ID NO: 314 (аминокислотная последовательность Bet v 1 из Uniprot: P15494), или полученного рекомбинантным способом белка или с их фрагментом. Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению, как показано в табл. 1, взаимодействуют по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 44 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 38 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 23 до приблизительно положения 41 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 26 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 29 до приблизительно положения 43 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 44 до приблизительно положения 56 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 45 до приблизительно положения 56 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 2 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 5 до приблизительно положения 10 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 5 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 8 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 11 до приблизительно положения 19 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 57 до приблизительно положения 70 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 57 до приблизительно положения 66 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 81 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 84 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306; аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 85 до приблизительно положения 96 согласно SEQ ID NO: 306; и аминокислотных остатков, находящихся в диапазоне от приблизительно положения 81 до приблизительно положения 89 согласно SEQ ID NO: 306. Указанные области дополнительно проиллюстрированы в SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 и 315.In certain embodiments, anti-Bet v 1 antibodies or antigen-binding fragments thereof bind to an epitope within Bet v 1, in natural or native form, as illustrated in SEQ ID NO: 306 or SEQ ID NO: 314 (amino acid sequence of Bet v 1 from Uniprot : P15494), or a recombinantly obtained protein or a fragment thereof. According to certain embodiments of the antibodies of the present invention, as shown in table. 1, interact with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid residues ranging from about position 23 to about position 44 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 23 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 23 to about position 38 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 23 to about position 41 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 26 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 29 to about position 43 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 44 to about position 70 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 44 to about position 56 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 45 to about position 56 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 2 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 5 to about position 10 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 5 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 8 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 11 to about position 19 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 57 to about position 70 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 57 to about position 66 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 81 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 84 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306; amino acid residues ranging from about position 85 to about position 96 according to SEQ ID NO: 306; and amino acid residues ranging from about position 81 to about position 89 according to SEQ ID NO: 306. These regions are further illustrated in SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 and 315.
Настоящее изобретение также относится к антителам к Bet v 1, которые связываются с тем же эпитопом или частью эпитопа, что и любое из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе в табл. 1, или антитело с последовательностями CDR любого из иллюстративных антител, описанных в табл. 1. Аналогично, настоящее изобретение также относится к антителам к Bet v 1, которые конкурируют за связывание с Bet v 1 или фрагментом Bet v 1с любым из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе в таблице 1, или антителом с последовательностями CDR любого из иллюстративных антител, описанных в табл. 1.The present invention also provides anti-Bet v 1 antibodies that bind to the same epitope or portion of an epitope as any of the specific exemplary antibodies described herein in Table. 1, or an antibody with the CDR sequences of any of the exemplary antibodies described in table. 1. Likewise, the present invention also provides antibodies to Bet v 1 that compete for binding to Bet v 1 or a fragment of Bet v 1 with any of the specific exemplary antibodies described herein in Table 1, or an antibody with the CDR sequences of any of the exemplary antibodies described in table. 1.
Можно легко определить, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело к Bet v 1, или конкурирует за связывание с ним, с использованием рутинных способов, известных в настоящей области техники. Например, для определения того, связывается ли исследуемое антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело к Bet v 1 согласно настоящему изобретению, эталонному антителу позволяют связываться с белком или пептидом Bet v 1 в насыщающих условиях. Затем оценивают способность исследуемого антитела связываться с молекулой Bet v 1. Если исследуемое антитело способно связываться с Bet v 1 после насыщающего связывания с эталонным антителом к Bet v 1, можно сделать вывод, что исследуемое антитело связывается с другим эпитопом по сравнению с эталонным антителом к Bet v 1. С другой стороны, если исследуемое антитело не способно связываться с молекулой Bet v 1 после насыщающего связывания с эталонным антителом к Bet v 1, тогда исследуемое антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, связанный эталонным антителом к Bet v 1 антитело согласно настоящему изобретению.Whether an antibody binds to the same epitope as or competes with the reference anti-Bet v 1 antibody can be readily determined using routine methods known in the art. For example, to determine whether a test antibody binds to the same epitope as a reference anti-Bet v 1 antibody of the present invention, the reference antibody is allowed to bind to the Bet v 1 protein or peptide under saturating conditions. The ability of the test antibody to bind to the Bet v 1 molecule is then assessed. If the test antibody is able to bind to Bet v 1 after saturating binding to the reference Bet v 1 antibody, it can be concluded that the test antibody binds to a different epitope compared to the reference Bet antibody v 1. On the other hand, if the test antibody is unable to bind to the Bet v 1 molecule after saturating binding to the reference Bet v 1 antibody, then the test antibody may bind to the same epitope as the epitope bound by the reference Bet v 1 antibody antibody according to the present invention.
Для определения того, конкурирует ли антитело за связывание с эталонным антителом к Bet v 1, описанную выше методологию связывания выполняют в двух ориентациях: в первой ориентации эталонному антителу позволяют связываться с молекулой Bet v 1 в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания исследуемого антитела с молекулой Bet v 1. Во второй ориентации исследуемому антителу позволяют связываться с молекулой Bet v 1 в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания эталонного антитела с молекулой Bet v 1. Если в обеих ориентациях только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой Bet v 1, то делают вывод, что исследуемое антите- 28 045437 ло и эталонное антитело конкурируют за связывание с Bet v 1. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, может необязательно связываться с таким же эпитопом, что и эталонное антитело, но может стерически блокировать связывание эталонного антитела путем связывания перекрывающегося или смежного эпитопа.To determine whether an antibody competes for binding to a reference Bet v 1 antibody, the binding methodology described above is performed in two orientations: in the first orientation, the reference antibody is allowed to bind to the Bet v 1 molecule under saturating conditions, followed by assessment of binding of the test antibody to the Bet molecule v 1. In the second orientation, the test antibody is allowed to bind to the Bet v 1 molecule under saturating conditions, followed by an assessment of the binding of the reference antibody to the Bet v 1 molecule. If in both orientations only the first (saturating) antibody is able to bind to the Bet v 1 molecule, then do conclusion that the test antibody and the reference antibody compete for binding to Bet v 1. One skilled in the art will appreciate that an antibody that competes for binding to the reference antibody may not necessarily bind to the same epitope as the reference antibody, but can sterically block binding of the reference antibody by binding to an overlapping or adjacent epitope.
Два антитела связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом, если каждое конкурентно ингибирует (блокирует) связывание другого с антигеном. Иными словами, 1-, 5-, 10-, 20- или 100кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или даже 99%, как измерено в конкурентном анализе связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Альтернативно, два антитела характеризуются одним и тем же эпитопом, если по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, уменьшают или устраняют связывание другого. Два антитела характеризуются перекрывающимися эпитопами, если некоторые аминокислотные мутации, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, уменьшают или устраняют связывание другого.Two antibodies bind to the same or overlapping epitope if each competitively inhibits (blocks) the other's binding to the antigen. That is, a 1-, 5-, 10-, 20-, or 100-fold excess of one antibody inhibits the binding of the other by at least 50%, but preferably by 75%, 90%, or even 99%, as measured in a competitive binding assay (see ., for example, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Alternatively, two antibodies are characterized by the same epitope if substantially all amino acid mutations in the antigen that reduce or eliminate the binding of one antibody reduce or eliminate the binding of the other. Two antibodies are characterized by overlapping epitopes if some amino acid mutations that reduce or eliminate the binding of one antibody reduce or eliminate the binding of the other.
Затем можно провести дополнительные рутинные эксперименты (например, пептидные мутации и анализы связывания), чтобы подтвердить, действительно ли наблюдаемое отсутствие связывания исследуемого антитела связано со связыванием с тем же эпитопом, что и у эталонного антитела, или же стерическое блокирование (или другое явление) является причиной отсутствия наблюдаемого связывания. Эксперименты такого рода можно выполнить с использованием ELISA, RIA, поверхностного плазмонного резонанса, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного в настоящей области техники.Additional routine experiments (e.g., peptide mutations and binding assays) can then be performed to confirm whether the observed lack of binding of the test antibody is indeed due to binding to the same epitope as the reference antibody, or whether steric blocking (or other phenomenon) is reason for the lack of observed binding. Experiments of this nature can be performed using ELISA, RIA, surface plasmon resonance, flow cytometry, or any other quantitative or qualitative antibody binding assay available in the art.
Иммуноконъюгаты.Immunoconjugates.
Настоящее изобретение включает в себя человеческое моноклональное антитело к Bet v 1, конъюгированное с терапевтическим фрагментом (иммуноконъюгат), таким как средство, способное снижать тяжесть аллергического ответа на аллерген Bet v 1, или в окружающей среде, в которой присутствуют деревья Fagales, или уменьшать интенсивность по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с воздействием пыльцы березы или аллергена Bet v 1, включая в себя ринит, конъюнктивит или затруднение дыхания или их тяжесть. Такое средство может представлять собой кортикостероид, второе отличающееся антитело к Bet v 1 или вакцину. Тип терапевтического фрагмента, который может быть конъюгирован с антителом к Bet v 1, будет учитывать состояние, подлежащее лечению, и требуемый терапевтический эффект, который должен быть достигнут. В качестве альтернативы, если требуемый терапевтический эффект заключается в лечении осложнений или симптомов, ассоциированных с воздействием аллергена Bet v 1, или любого другого состояния, возникающего в результате такого воздействия, такого как без ограничения ринит или конъюнктивит, предпочтительным может являться конъюгирование средства, подходящего для лечения последствий или симптомов состояния или для ослабления любых побочных эффектов антител согласно настоящему изобретению. Примеры подходящих средств для образования иммуноконъюгатов известны в настоящей области техники, см., например, международную патентную публикацию WO 05/103081.The present invention includes a human monoclonal antibody to Bet v 1 conjugated to a therapeutic moiety (immunoconjugate), such as an agent capable of reducing the severity of the allergic response to the Bet v 1 allergen, or in an environment in which Fagales trees are present, or reducing the intensity at least one symptom associated with exposure to birch pollen or Bet v 1 allergen, including rhinitis, conjunctivitis or difficulty breathing or the severity thereof. Such an agent may be a corticosteroid, a second different Bet v 1 antibody, or a vaccine. The type of therapeutic moiety that can be conjugated to the anti-Bet v 1 antibody will take into account the condition being treated and the desired therapeutic effect to be achieved. Alternatively, if the desired therapeutic effect is to treat complications or symptoms associated with exposure to the Bet v 1 allergen, or any other condition resulting from such exposure, such as, without limitation, rhinitis or conjunctivitis, it may be advantageous to conjugate an agent suitable for treating the consequences or symptoms of a condition or to reduce any side effects of antibodies according to the present invention. Examples of suitable means for forming immunoconjugates are known in the art, see, for example, international patent publication WO 05/103081.
Терапевтическое введение и составы.Therapeutic administration and formulations.
Настоящее изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим антитела к Bet v 1 или их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению. Введение терапевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением будут осуществлять подходящим путем, включая в себя без ограничения внутривенно, подкожно, внутримышечно, интраназально, с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами, которые включены в составы для обеспечения улучшенной транспортировки, доставки, переносимости и тому подобного. Множество приемлемых составов можно найти в рецептурном справочнике, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти составы включают в себя, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, содержащие липиды (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™), ДНК-конъюгаты, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии карбовакс (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.The present invention relates to therapeutic compositions containing antibodies to Bet v 1 or antigen binding fragments thereof according to the present invention. Administration of therapeutic compositions in accordance with the present invention will be carried out by suitable routes, including, without limitation, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intranasally, with suitable carriers, excipients and other means that are included in the formulations to provide improved transport, delivery, tolerability and the like. similar. Many acceptable formulations can be found in the formulary known to all pharmaceutical chemists: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. These formulations include, for example, powders, pastes, ointments, jellies, waxes, oils, lipids, lipid containing (cationic or anionic) vesicles (such as LIPOFECTIN™), DNA conjugates, anhydrous absorbent pastes, oil-in-emulsions. water and water-in-oil, carbowax emulsions (polyethylene glycols with different molecular weights), semi-solid gels and semi-solid mixtures containing carbowax. See also Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238–311.
Доза антитела может варьироваться в зависимости от возраста и размеров пациента, которому вводят дозу, целевого заболевания, состояний, пути введения и тому подобного. Когда антитело согласно настоящему изобретению используют для лечения ринита или конъюнктивита, ассоциированных с воздействием пыльцы с дерева Fagales, или пыльцы березы, или Bet v 1, у индивидуума с чувствительностью к Bet v 1, или для предотвращения анафилактической реакции на аллерген Fagales или для уменьшения тяжести аллергического ответа целесообразно внутривенно вводить антитело согласно настоящему изобретению, как правило, в однократной дозе, составляющей приблизительно 0,01 - приблизительно 30 мг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно 0,02 - приблизительно 7, приблизительно 0,03 - приблизительно 5 или приблизительно 0,05 - приблизительно 3 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести состояния частоту и продолжительность лечения можно скорректировать. Согласно определенным вариантам осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящемуThe dosage of the antibody may vary depending on the age and size of the patient being dosed, the target disease, conditions, route of administration, and the like. When an antibody of the present invention is used to treat rhinitis or conjunctivitis associated with exposure to Fagales tree pollen, or birch pollen, or Bet v 1, in an individual with sensitivity to Bet v 1, or to prevent an anaphylactic reaction to a Fagales allergen or to reduce the severity allergic response, it is advisable to administer intravenously the antibody of the present invention, typically in a single dose of about 0.01 to about 30 mg/kg body weight, more preferably about 0.02 to about 7, about 0.03 to about 5, or about 0.05 - approximately 3 mg/kg body weight. Depending on the severity of the condition, the frequency and duration of treatment can be adjusted. In certain embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present
- 29 045437 изобретению можно вводить в виде начальной дозы, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,1 мг - приблизительно 800 мг, приблизительно 1 - приблизительно 500 мг, приблизительно 5 - приблизительно 300 мг или приблизительно 10 - приблизительно 200 мг, до приблизительно 100 мг или до приблизительно 50 мг. Согласно определенным вариантам осуществления за начальной дозой может следовать введение второй или множества последующих доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в количестве, которое может являться приблизительно таким же или меньшим, чем количество начальной дозы, причем интервал между последующими дозами составляет по меньшей мере 1 день - 3 дня; по меньшей мере одну неделю, по меньшей мере 2 недели; по меньшей мере 3 недели; по меньшей мере 4 недели; по меньшей мере 5 недель; по меньшей мере 6 недель; по меньшей мере 7 недель; по меньшей мере 8 недель; по меньшей мере 9 недель; по меньшей мере 10 недель; по меньшей мере 12 недель; или по меньшей мере 14 недель.- 29 045437 the invention can be administered as an initial dose of at least about 0.1 mg - about 800 mg, about 1 - about 500 mg, about 5 - about 300 mg, or about 10 - about 200 mg, up to about 100 mg or up to approximately 50 mg. In certain embodiments, the initial dose may be followed by a second or multiple subsequent doses of an antibody or antigen-binding fragment thereof in an amount that may be approximately the same as or less than the amount of the initial dose, with the interval between subsequent doses being at least 1 day to 3 days. day; at least one week, at least 2 weeks; at least 3 weeks; at least 4 weeks; at least 5 weeks; at least 6 weeks; at least 7 weeks; at least 8 weeks; at least 9 weeks; at least 10 weeks; at least 12 weeks; or at least 14 weeks.
Известны различные системы доставки, которые можно использовать для введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения включают в себя без ограничения интрадермальный, трансдермальный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизистые оболочки (например, через слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может являться системным или местным.Various delivery systems are known that can be used to administer the pharmaceutical composition of the present invention, for example, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing mutant viruses, receptor-mediated endocytosis (see, for example, Wu et al. (1987) J Biol Chem 262:4429–4432). Routes of administration include, but are not limited to, intradermal, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The composition can be administered by any convenient route, for example, by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucous membranes (for example, through the oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.) and can be administered together with other biological active means. Administration may be systemic or local.
Фармацевтическую композицию можно доставлять в везикуле, в частности липосоме (см., например, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533).The pharmaceutical composition can be delivered in a vesicle, in particular a liposome (see, for example, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533).
В определенных ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в системе контролируемого высвобождения. Согласно одному варианту осуществления можно использовать насос. Согласно другому варианту осуществления можно использовать полимерные материалы. Согласно еще одному варианту осуществления систему контролируемого высвобождения можно поместить в непосредственной близости от мишени композиции, таким образом, понадобится лишь доля системной дозы.In certain situations, the pharmaceutical composition can be delivered in a controlled release system. According to one embodiment, a pump may be used. According to another embodiment, polymeric materials can be used. In yet another embodiment, the controlled release system can be placed in close proximity to the target of the composition, thus requiring only a fraction of the systemic dose.
Инъекционные препараты могут включать в себя лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий и т.д. Эти инъекционные препараты можно получить общеизвестными способами. Например, инъекционные препараты можно получить, например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования описанного выше антитела или его соли в стерильной водной среде или масляной среде, обычно используемых для инъекций. В качестве водной среды для инъекций существует, например, физиологический солевой раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные средства и т.д., которые можно использовать в комбинации с подходящим солюбилизирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностноактивное вещество [например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) аддукт гидрогенизированного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной среды используют, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которые можно использовать в комбинации с солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Полученной таким образом инъекцией предпочтительно заполняют соответствующую ампулу.Injectable preparations may include dosage forms for intravenous, subcutaneous, intradermal and intramuscular injections, drip infusions, etc. These injectable preparations can be prepared by generally known methods. For example, injectable preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-described antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily medium commonly used for injection. As the aqueous injection medium, there are, for example, physiological saline solution, isotonic solution containing glucose and other auxiliaries, etc., which can be used in combination with a suitable solubilizing agent such as alcohol (eg ethanol), polyhydric alcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant [eg polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)], etc. As the oil medium, for example, sesame oil, soybean oil, etc. are used, which can be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. The injection thus obtained is preferably filled into a suitable ampoule.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно доставлять подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и шприца. Кроме того, в отношении подкожной доставки, устройство доставки шприц-ручка легко находит применение при доставке фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Такое устройство доставки шприц-ручка может являться многоразовым или одноразовым. В многоразовом устройстве доставки шприц-ручка, как правило, используют сменный картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Как только вся фармацевтическая композиция в картридже была введена и картридж пуст, пустой картридж можно легко выбросить и заменить новым картриджем, который содержит фармацевтическую композицию. После этого устройство доставки шприц-ручку можно повторно использовать. В одноразовом устройстве доставки шприце-ручке нет сменного картриджа. Напротив, одноразовое устройство доставки шприц-ручка поставляется предварительно заполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре внутри устройства. Как только резервуар освобождается от фармацевтической композиции, все устройство выбрасывают.The pharmaceutical composition of the present invention can be delivered subcutaneously or intravenously using a standard needle and syringe. Moreover, with respect to subcutaneous delivery, the pen delivery device easily finds use in delivering the pharmaceutical composition of the present invention. Such a pen delivery device can be reusable or disposable. A reusable pen delivery device typically uses a replaceable cartridge that contains a pharmaceutical composition. Once all of the pharmaceutical composition in the cartridge has been administered and the cartridge is empty, the empty cartridge can be easily discarded and replaced with a new cartridge that contains the pharmaceutical composition. The pen delivery device can then be reused. The disposable pen delivery device does not have a replaceable cartridge. In contrast, a disposable pen delivery device comes pre-filled with a pharmaceutical composition contained in a reservoir within the device. Once the reservoir is empty of the pharmaceutical composition, the entire device is discarded.
Многочисленные многоразовые устройства доставки шприцы-ручки и автоинъекторы находят применение в подкожной доставке фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Примеры включают в себя без ограничения следующее: AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), шприц-ручка DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), шприц-ручка HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручка HUMALOG™, шприц-ручка HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Inn.), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (NovoNumerous reusable pen and auto-injector delivery devices are used in the subcutaneous delivery of the pharmaceutical composition of the present invention. Examples include, without limitation, the following: AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, pen HUMALOG™, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Inn.), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo
- 30 045437- 30 045437
Nordisk, Copenhagen, Denmark), шприц-ручка BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), называя лишь несколько из них. Примеры одноразовых устройств доставки шприц-ручка, находящих свое применение в подкожной доставке фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения следующее: шприц-ручка SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинъектор SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, Calif.), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) и шприц-ручка HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, 111.), называя лишь несколько из них.Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ and OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), to name just a few . Examples of disposable pen delivery devices useful in the subcutaneous delivery of a pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, the following: SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) and KWIKPEN™ (Eli Lilly ), SURECLICK™ autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, Calif.), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), and HUMIRA™ pen (Abbott Labs, Abbott Park, 111.), to name only several of them.
Фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения, описанные выше, преимущественно получают в виде лекарственных форм в стандартной дозе, которая соответствует дозе активных ингредиентов. Такие лекарственные формы в стандартной дозе включают в себя, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т.д. Количество содержащегося в них вышеупомянутого антитела, как правило, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг на лекарственную форму в стандартной дозе; особенно в форме инъекций предпочтительно, чтобы указанное антитело содержалось в количестве, составляющем от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг для других лекарственных форм.The pharmaceutical compositions for oral or parenteral use described above are advantageously prepared in unit dose dosage forms that correspond to the dose of the active ingredients. Such unit dose dosage forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc. The amount of the above-mentioned antibody contained therein is generally from about 5 to about 500 mg per unit dose dosage form; especially in injection form, it is preferred that the antibody be contained in an amount of from about 5 to about 100 mg and from about 10 to about 250 mg for other dosage forms.
Терапевтические применения антител.Therapeutic applications of antibodies.
Благодаря их взаимодействия с Bet v 1 антитела согласно настоящему изобретению являются применимыми для лечения первичного ответа после воздействия на человека аллергена Fagales, пыльцы березы или окружающей среды, содержащей белок Bet v 1, или по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с аллергическим ответом, такого как зуд в глазах, конъюнктивит, ринит, одышка, затрудненное дыхание или для предотвращения вторичного ответа на аллерген Bet v 1, включая в себя более серьезную анафилактическую реакцию, или для уменьшения тяжести, продолжительности и/или частоты симптомов после повторного воздействия аллергена Fagales. Соответственно, предусмотрено, что антитела согласно настоящему изобретению можно использовать профилактически или терапевтически.Due to their interaction with Bet v 1, the antibodies of the present invention are useful for treating the primary response following human exposure to Fagales allergen, birch pollen, or an environment containing the Bet v 1 protein, or at least one symptom associated with an allergic response, such as itchy eyes, conjunctivitis, rhinitis, shortness of breath, difficulty breathing, or to prevent a secondary response to the Bet v 1 allergen, including a more severe anaphylactic reaction, or to reduce the severity, duration and/or frequency of symptoms after re-exposure to the Fagales allergen. Accordingly, it is contemplated that the antibodies of the present invention may be used prophylactically or therapeutically.
Согласно дополнительно варианту осуществления настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению используют для получения фармацевтической композиции для лечения пациентов, страдающих чувствительностью к пыльце березы или ее экстракту и/или белку Bet v 1. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению используют для получения фармацевтической композиции для снижения тяжести первичного воздействия Bet v 1 или для снижения тяжести, продолжительности и/или количества аллергических ответов на Bet v 1. Согласно дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению используют в качестве вспомогательной терапии с помощью любого другого средства, применимого для лечения аллергенов Fagales, включая в себя кортикостероиды, вакцины, аллерген-специфическую иммунотерапию (SIT) или любую другую паллиативную терапию, известную специалистам в настоящей области техники.According to a further embodiment of the present invention, the antibodies of the present invention are used to produce a pharmaceutical composition for the treatment of patients suffering from sensitivity to birch pollen or its extract and/or Bet v 1 protein. In yet another embodiment of the present invention, the antibodies of the present invention are used to obtain a pharmaceutical compositions for reducing the severity of initial exposure to Bet v 1 or to reduce the severity, duration and/or number of allergic responses to Bet v 1. In a further embodiment of the present invention, the antibodies of the present invention are used as an adjuvant therapy with any other agent useful for treating Fagales allergens, including corticosteroids, vaccines, allergen-specific immunotherapy (SIT), or any other palliative therapy known to those skilled in the art.
Виды комбинированной терапии.Types of combination therapy.
Виды комбинированной терапии могут включать в себя антитело к Bet v 1 согласно настоящему изобретению и любое дополнительное терапевтические средство, которое можно эффективно комбинировать с антителом согласно настоящему изобретению или с биологически активным фрагментом антитела согласно настоящему изобретению.Combination therapies may include an anti-Bet v 1 antibody of the present invention and any additional therapeutic agent that can be effectively combined with an antibody of the present invention or a biologically active fragment of an antibody of the present invention.
Например, второе терапевтическое средство можно использовать для помощи в уменьшении аллергических симптомов после воздействия аллергена Fagales, пыльцы березы или ее экстракта или Bet v 1, или воздействия окружающей среды, в которой присутствуют и цветут деревья Fagales, такое как кортикостероид. Антитела также могут использовать в сочетании с другими видами терапии, такими как вакцина, специфическая для аллергена Bet v 1. Дополнительный(е) терапевтически активный(е) компонент(ы) можно вводить до, одновременно или после введения антитела к Bet v 1 согласно настоящему изобретению. Для целей настоящего раскрытия такие схемы введения считаются введением антитела к Bet v 1 в комбинации со вторым терапевтически активным компонентом.For example, a second therapeutic agent may be used to help reduce allergic symptoms following exposure to Fagales allergen, birch pollen or extract thereof, or Bet v 1, or exposure to an environment in which Fagales trees are present and flowering, such as a corticosteroid. The antibodies may also be used in combination with other therapies, such as a Bet v 1 allergen-specific vaccine. Additional therapeutically active component(s) may be administered before, simultaneously with, or after administration of the Bet v 1 antibody herein. invention. For purposes of the present disclosure, such administration regimens are considered to be administration of an anti-Bet v 1 antibody in combination with a second therapeutically active component.
Аллерген-специфическая иммунотерапия (SIT).Allergen-specific immunotherapy (SIT).
Используемые в настоящем документе выражения аллерген-специфическая иммунотерапия, специфическая иммунотерапия, SIT, схема SIT и тому подобное относятся к повторному введению аллергена пациенту с течением времени в качестве средства для лечения или предотвращения аллергии и аллергических ответов или для уменьшения или устранения аллергических ответов. В типичной схеме SIT небольшие количества аллергена первоначально вводят пациенту с аллергией, после чего следует введение повышенных количеств аллергена. В определенных случаях схема SIT включает в себя по меньшей мере две последовательные фазы: (1) фазу введения увеличивающихся доз и (2) поддерживающую фазу. В фазе введения увеличивающихся доз увеличивающиеся дозы аллергена вводят до тех пор, пока не будет достигнута эффективная и безопасная доза. Дозу, которую устанавливают в конце фазы введения увеличивающихся доз, затем вводят пациенту в течение поддерживающей фазы. Продолжительность фазы введения увеличивающихся доз может составлять несколько недель или несколько месяAs used herein, the expressions allergen-specific immunotherapy, specific immunotherapy, SIT, SIT regimen, and the like refer to the repeated administration of an allergen to a patient over time as a means to treat or prevent allergies and allergic responses or to reduce or eliminate allergic responses. In a typical SIT regimen, small amounts of allergen are initially administered to the allergic patient, followed by administration of increasing amounts of allergen. In certain cases, the SIT regimen includes at least two sequential phases: (1) an escalating dose phase and (2) a maintenance phase. In the escalating dose phase, increasing doses of the allergen are administered until an effective and safe dose is reached. The dose that is established at the end of the escalating phase is then administered to the patient during the maintenance phase. The duration of the increasing dose phase may be several weeks or several months.
- 31 045437 цев. Однако согласно определенным вариантам осуществления фаза введения увеличивающихся доз характеризуется существенно более короткой продолжительностью (например, менее одной недели, менее 6 дней, менее 5 дней, менее 4 дней, менее 3 дней или менее 2 дней). Схемы SIT, включающие в себя фазу введения увеличивающихся доз, составляющую менее 5 дней, иногда называют молниеносной иммунотерапией или молниеносной SIT. Поддерживающая фаза схемы SIT может длиться несколько недель, несколько месяцев, несколько лет или неопределенно долго.- 31 045437 tsev. However, in certain embodiments, the escalating dose phase is characterized by a substantially shorter duration (eg, less than one week, less than 6 days, less than 5 days, less than 4 days, less than 3 days, or less than 2 days). SIT regimens that include an escalating dose phase of less than 5 days are sometimes called fulminant immunotherapy or fulminant SIT. The maintenance phase of the SIT regimen may last several weeks, several months, several years, or indefinitely.
Схемы введения.Administration schemes.
В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения пациенту можно вводить несколько доз одного или нескольких антител к Bet v 1 (комбинации антител) в течение определенного периода времени. Способы согласно этому аспекту настоящего изобретения предусматривают последовательное введение пациенту нескольких доз антитела, комбинации антител. Используемый в настоящем документе термин последовательное введение означает, что каждую дозу антитело или комбинации антител вводят пациенту в разные моменты времени, например, в разные дни, разделенные заданным интервалом (например, часами, днями, неделями или месяцами). Согласно настоящему изобретению предусмотрены способы, которые предусматривают последовательное введение пациенту одной начальной дозы антитела или комбинации антител с последующей одной или несколькими вторичными дозами антитела и необязательно последующей одной или несколькими третичными дозами антитела.In accordance with certain embodiments of the present invention, multiple doses of one or more anti-Bet v 1 antibodies (antibody combinations) may be administered to a patient over a period of time. Methods according to this aspect of the present invention involve sequentially administering multiple doses of an antibody, a combination of antibodies, to a patient. As used herein, the term sequential administration means that each dose of the antibody or combination of antibodies is administered to the patient at different points in time, for example, on different days separated by a predetermined interval (for example, hours, days, weeks or months). The present invention provides methods that involve sequentially administering to a patient one initial dose of an antibody or combination of antibodies, followed by one or more secondary doses of the antibody, and optionally followed by one or more tertiary doses of the antibody.
Термины начальная доза, вторичные дозы и третичные дозы относятся к временной последовательности введения антитела или комбинации антител согласно настоящему изобретению. Таким образом, начальная доза представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения (ее также называют исходной дозой); вторичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; и третичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Начальная, вторичная и третичная дозы могут содержать одинаковое количество антитела или комбинации антител, но, как правило, могут отличаться друг от друга с точки зрения частоты введения. Тем не менее, согласно определенным вариантам осуществления количество антитела или комбинации антител, содержащееся в начальной, вторичной и/или третичной дозах, варьируется относительно друг друга (например, его корректируют выше или ниже в зависимости от ситуации) в течение курса лечения. Согласно определенным вариантам осуществления две или больше (например, 2, 3, 4 или 5) доз вводят в начале схемы лечения в виде насыщающих доз, после которых вводят последующие дозы, которые вводят реже (например, поддерживающие дозы).The terms initial dose, secondary doses and tertiary doses refer to the time sequence of administration of the antibody or combination of antibodies according to the present invention. Thus, the starting dose is the dose that is administered at the beginning of the treatment regimen (also called the initial dose); secondary doses are doses that are administered after the initial dose; and tertiary doses are doses that are administered after secondary doses. The initial, secondary and tertiary doses may contain the same amount of antibody or combination of antibodies, but generally may differ from each other in terms of frequency of administration. However, in certain embodiments, the amount of antibody or combination of antibodies contained in the initial, secondary and/or tertiary doses varies relative to each other (eg, it is adjusted higher or lower depending on the situation) during the course of treatment. In certain embodiments, two or more (eg, 2, 3, 4, or 5) doses are administered at the beginning of the treatment regimen as loading doses, followed by subsequent doses that are administered less frequently (eg, maintenance doses).
Согласно одному иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-26 (например, 1, 1%, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17%, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26% или больше) недель после непосредственно предшествующей дозы. Используемая в настоящем документе фраза непосредственно предшествующая доза в последовательности нескольких введений означает дозу антитела или комбинации антител, которую вводят пациенту до введения непосредственно следующей дозы в последовательности без какихлибо промежуточных доз.According to one exemplary embodiment of the present invention, each secondary and/or tertiary dose is administered at 1-26 intervals (e.g., 1.1%, 2.2%, 3.3%, 4.4%, 5.5%, 6.6 %, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16 %, 17, 17%, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26 % or more) weeks after the immediately preceding dose. As used herein, the phrase immediately preceding dose in a sequence of administrations means a dose of an antibody or combination of antibodies that is administered to a patient before the administration of the immediately next dose in a sequence, without any intervening doses.
Способы согласно этому аспекту настоящего изобретения могут предусматривать введение пациенту любого количества вторичных и/или третичных доз антитела или комбинации антител. Например, согласно определенным вариантам осуществления пациенту вводят только одну вторичную дозу. Согласно другим вариантам осуществления пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) вторичных доз. Аналогично, согласно определенным вариантам осуществления пациенту вводят только одну третичную дозу. Согласно другим вариантам осуществления вводят пациенту две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) третичных доз.Methods according to this aspect of the present invention may involve administering to a patient any number of secondary and/or tertiary doses of an antibody or combination of antibodies. For example, in certain embodiments, only one secondary dose is administered to the patient. In other embodiments, the patient is administered two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more) secondary doses. Likewise, in certain embodiments, only one tertiary dose is administered to the patient. In other embodiments, two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more) tertiary doses are administered to the patient.
Согласно вариантам осуществления, включающим в себя множество вторичных доз, каждую вторичную дозу можно вводить с той же частотой, что и другие вторичные дозы. Например, каждую вторичную дозу можно вводить пациенту через 1-2 недели после непосредственно предшествующей дозы. Аналогично, согласно вариантам осуществления, включающим в себя множественные третичные дозы, каждую третичную дозу можно вводить с той же частотой, что и другие третичные дозы. Например, каждую третичную дозу можно вводить пациенту через 2-4 недели после непосредственно предшествующей дозы. Альтернативно, частота, с которой вторичные и/или третичные дозы вводят пациенту, может варьироваться в течение курса лечения. Частота введения также может быть скорректирована в течение курса лечения врачом в зависимости от потребностей конкретного пациента после клинического обследования.In embodiments that include multiple secondary doses, each secondary dose may be administered at the same frequency as the other secondary doses. For example, each secondary dose can be administered to the patient 1-2 weeks after the immediately preceding dose. Likewise, in embodiments involving multiple tertiary doses, each tertiary dose can be administered at the same frequency as the other tertiary doses. For example, each tertiary dose may be administered to the patient 2-4 weeks after the immediately preceding dose. Alternatively, the frequency with which secondary and/or tertiary doses are administered to the patient may vary during the course of treatment. The frequency of administration may also be adjusted during the course of treatment by the physician depending on the needs of the individual patient after clinical examination.
Диагностические применения антител.Diagnostic applications of antibodies.
Антитела к Bet v 1 согласно настоящему изобретению также можно использовать для обнаружения и/или измерения Bet v 1 в образце, например, для диагностических целей. Предусмотрено, что подтверждение аллергического ответа, предположительно вызванного Bet v 1, можно осуществить путем измерения наличия какого-либо Bet v 1 путем использования любого одного или нескольких антител согласно настоящему изобретению. Иллюстративные диагностические анализы в отношении Bet v 1 могутAntibodies to Bet v 1 according to the present invention can also be used to detect and/or measure Bet v 1 in a sample, for example, for diagnostic purposes. It is contemplated that confirmation of an allergic response suspected of being caused by Bet v 1 can be accomplished by measuring the presence of any Bet v 1 using any one or more antibodies of the present invention. Illustrative diagnostic tests regarding Bet v 1 may
- 32 045437 включать в себя, например, приведение в контакт образца, полученного от пациента, с антителом к Bet v 1 согласно настоящему изобретению, причем антитело к Bet v 1 метят обнаруживаемой меткой или репортерной молекулой или используют в качестве лиганда захвата для селективного выделения белка Bet v 1 из образцов пациента. Альтернативно, немеченое антитело к Bet v 1 можно использовать в диагностических целях в комбинации со вторичным антителом, которое само является меченным обнаруживаемой меткой. Обнаруживаемая метка или репортерная молекула может представлять собой радиоактивный изотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35S или 125I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как изотиоцианат флуоресцеина или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, βгалактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные иллюстративные анализы, которые можно использовать для обнаружения или измерения Bet v 1 в образце, включают в себя иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS).- 32 045437 include, for example, contacting a sample obtained from a patient with an antibody to Bet v 1 according to the present invention, wherein the antibody to Bet v 1 is labeled with a detectable label or reporter molecule or used as a capture ligand for selective isolation of the protein Bet v 1 from patient samples. Alternatively, an unlabeled anti-Bet v 1 antibody can be used for diagnostic purposes in combination with a secondary antibody that is itself labeled with a detectable label. The detectable label or reporter molecule may be a radioactive isotope such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S or 125 I; a fluorescent or chemiluminescent moiety such as fluorescein isothiocyanate or rhodamine; or an enzyme such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, horseradish peroxidase or luciferase. Specific exemplary assays that can be used to detect or measure Bet v 1 in a sample include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence-activated cell sorting (FACS).
Образцы, которые можно использовать в диагностических анализах Bet v 1 в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя любой образец ткани или жидкости, полученный от пациента, который содержит определяемые количества белка Bet v 1 или его фрагментов при нормальных или патологических условиях. Как правило, содержания Bet v 1 в конкретном образце, полученном от здорового/не страдающего аллергией пациента (например, пациента, не пораженного чувствительностью, ассоциированной с присутствием Bet v 1) будут измерять для первоначального установления исходного, или стандартного содержания Bet v 1. Затем это исходное содержание Bet v 1 можно сравнить с содержаниями Bet v 1, измеренными в образцах, полученных от лиц, у которых подозревают наличие чувствительности к Bet v 1 в пыльце березы или симптомов, связанных с таким состоянием.Samples that can be used in Bet v 1 diagnostic assays in accordance with the present invention include any tissue or fluid sample obtained from a patient that contains detectable amounts of Bet v 1 protein or fragments thereof under normal or pathological conditions. Typically, the Bet v 1 content of a particular sample obtained from a healthy/non-allergic patient (eg, a patient not affected by sensitivities associated with the presence of Bet v 1) will be measured to initially establish a baseline, or standard Bet v 1 content. this initial Bet v 1 content can be compared with Bet v 1 contents measured in samples obtained from individuals suspected of having sensitivity to Bet v 1 in birch pollen or symptoms associated with such a condition.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на ряд вариантов осуществления, специалистам в настоящей области техники понятно, что изменения в форме и деталях могут быть внесены в различные варианты осуществления, раскрытые в настоящем документе, не отклоняясь от сущности и объема настоящего изобретения и то, что различные варианты осуществления, раскрытые в настоящем документе, не предназначены для ограничения объема формулы настоящего изобретения.While the present invention has been specifically shown and described with reference to a number of embodiments, those skilled in the art will appreciate that changes in form and detail may be made to the various embodiments disclosed herein without departing from the spirit and the scope of the present invention and that the various embodiments disclosed herein are not intended to limit the scope of the claims of the present invention.
ПримерыExamples
Следующие примеры предоставлены таким образом, чтобы средние специалисты в настоящей области техники имели полное раскрытие и описание того, как реализовать и применить способы и композиции согласно настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают своим изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности по отношению к используемым числам (например, количествам, температуре и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части даны по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление равно атмосферному или близко к нему.The following examples are provided so that those of ordinary skill in the art will have full disclosure and description of how to make and apply the methods and compositions of the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors of the present invention believe to be their invention. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numbers used (e.g. quantities, temperatures, etc.), but some experimental errors and deviations should be taken into account. Unless otherwise noted, parts are by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric pressure.
Пример 1. Создание антител человека к Bet v 1.Example 1. Generation of human antibodies to Bet v 1.
Иммуноген, содержащий любое из следующего, можно использовать для создания антител к Bet v 1. Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению получают из организма мышей, иммунизированных первичным иммуногеном, таким как полноразмерный природный Bet v 1 (nBet v 1), который можно приобрести коммерчески (например, у Stallergenes Greer, Lenoir, NC, № по кат. XP527D3A25) или выделить из пыльцы березы (см., например, Buters, et al. (2012), Atomospheric Environment 55:496-505) или который можно быть получить рекомбинантным способом (см. идентификационный номер GenBank P 15494 в отношении полноразмерной аминокислотной последовательности Bet v 1) или фрагменты белка Bet v 1, с последующей иммунизацией вторичным иммуногеном или иммуногенно активным фрагментом природного белка. Различные конструкты можно получить с использованием частей белка Bet v 1, известных специалистам в настоящей области техники. Эти конструкты можно использовать отдельно или в различных комбинациях, чтобы вызывать ответы антител in vivo. Например, рекомбинантные конструкты Bet v 1, такие как примеры, представленные в SEQ ID NO: 307, 308, 309, 310, 311 и 315, или их фрагменты, можно использовать в качестве иммуногенов.An immunogen containing any of the following can be used to generate antibodies to Bet v 1. In certain embodiments, the antibodies of the present invention are obtained from mice immunized with a primary immunogen, such as full-length natural Bet v 1 (nBet v 1), which is commercially available commercially (eg, Stallergenes Greer, Lenoir, NC, cat. no. XP527D3A25) or isolated from birch pollen (see, for example, Buters, et al. (2012), Atomospheric Environment 55:496-505) or which can be obtain recombinantly (see GenBank accession number P 15494 for the full-length amino acid sequence of Bet v 1) or fragments of the Bet v 1 protein, followed by immunization with a secondary immunogen or an immunogenically active fragment of the native protein. Various constructs can be prepared using portions of the Bet v 1 protein known to those skilled in the art. These constructs can be used alone or in various combinations to induce antibody responses in vivo. For example, recombinant Bet v 1 constructs, such as the examples set forth in SEQ ID NOs: 307, 308, 309, 310, 311 and 315, or fragments thereof, can be used as immunogens.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела согласно настоящему изобретению получают из организма мышей, иммунизированных первичным иммуногеном, таким как биологически активный и/или иммуногенный фрагмент природного Bet v 1 или ДНК, кодирующая его активный фрагмент. Фрагмент может быть получен из N-концевой или С-концевой части Bet v 1.In certain embodiments, the antibodies of the present invention are obtained from mice immunized with a primary immunogen, such as a biologically active and/or immunogenic fragment of native Bet v 1 or DNA encoding an active fragment thereof. The fragment may be derived from the N-terminal or C-terminal portion of Bet v 1.
Согласно определенным вариантам осуществления рекомбинантные конструкты белка Bet v 1, используемые в исследованиях, описанных в настоящем документе, могут также включать в себя Сконцевую метку (myc-myc-гексагистидиновая метка), как указано ниже. Согласно другим вариантам осуществления рекомбинантный конструкт белка Bet v 1 включает в себя аминокислоты G2-N160 согласно Uniprot P15494. Согласно некоторым вариантам осуществления конструкт содержит замену S85A. Белки экспрессировали в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Экзогенная сигнальная последовательность, используемая для стимуляции экспрессии в клетках СНО, не включена в перечни последовательностей.In certain embodiments, the recombinant Bet v 1 protein constructs used in the studies described herein may also include a C-terminal tag (myc-myc-hexahistidine tag) as described below. In other embodiments, the recombinant Bet v 1 protein construct includes amino acids G2-N160 according to Uniprot P15494. In some embodiments, the construct comprises an S85A replacement. The proteins were expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. The exogenous signal sequence used to stimulate expression in CHO cells is not included in the sequence listings.
- 33 045437- 33 045437
Согласно определенным вариантам осуществления иммуноген может представлять собой фрагмент Bet v 1 или слитый белок, который содержит любой один или несколько из следующего: i) аминокислотные остатки 23-43 Bet v 1 (см. Uniprot P15494, а также SEQ ID NO: 307); ii) аминокислотные остатки 4456 Bet v 1 (см. Uniprot P15494, а также SEQ ID NO: 308); iii) аминокислотные остатки 2-19 Bet v 1 (см. Uniprot P15494, а также SEQ ID NO: 309); iv) аминокислотные остатки 57-70 Bet v 1 (см. Uniprot P15494, а также SEQ ID NO: 310); v) аминокислотные остатки 81-89 Bet v 1 (см. Uniprot P15494, а также SEQ ID NO: 311) и vi) аминокислотные остатки 81-96 Bet v 1 (см. Uniprot P15494, а также SEQ ID NO: 315).In certain embodiments, the immunogen may be a Bet v 1 fragment or fusion protein that contains any one or more of the following: i) Bet v 1 amino acid residues 23-43 (see Uniprot P15494 as well as SEQ ID NO: 307); ii) amino acid residues 4456 Bet v 1 (see Uniprot P15494 and also SEQ ID NO: 308); iii) amino acid residues 2-19 Bet v 1 (see Uniprot P15494 and also SEQ ID NO: 309); iv) amino acid residues 57-70 Bet v 1 (see Uniprot P15494 and also SEQ ID NO: 310); v) amino acid residues 81-89 Bet v 1 (see Uniprot P15494 and SEQ ID NO: 311) and vi) amino acid residues 81-96 Bet v 1 (see Uniprot P15494 and SEQ ID NO: 315).
Согласно определенным вариантам осуществления антитела, которые связываются с специфически с Bet v 1, можно получить с использованием фрагментов указанных выше областей или пептидов, которые выходят за пределы обозначенных областей на приблизительно 5 - приблизительно 20 аминокислотных остатков от одного или обоих из N- или С-конца областей, описанных в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления любую комбинацию указанных выше областей или их фрагментов можно использовать в получении специфических по отношению к Bet v 1 антител. Согласно определенным вариантам осуществления любую одну или несколько указанных выше областей Bet v 1 или их фрагментов можно использовать для получения моноспецифических, биспецифических или мультиспецифических антител.In certain embodiments, antibodies that bind specifically to Bet v 1 can be prepared using fragments of the above regions or peptides that extend beyond the designated regions by about 5 to about 20 amino acid residues from one or both of the N- or C- end of the areas described in this document. In certain embodiments, any combination of the above regions or fragments thereof can be used in the production of Bet v 1 specific antibodies. In certain embodiments, any one or more of the above Bet v 1 regions or fragments thereof can be used to produce monospecific, bispecific, or multispecific antibodies.
Полноразмерное белки или их фрагменты, которые использовали в качестве иммуногенов, как указано выше, вводили напрямую, с адъювантом для стимуляции иммунного ответа, мыши VELOCIMMUNE®, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и каппа легкой цепей иммуноглобулина человека.The full-length proteins or fragments thereof, which were used as immunogens as described above, were administered directly, with an adjuvant to stimulate an immune response, to a VELOCIMMUNE® mouse containing DNA encoding the variable regions of the human immunoglobulin heavy and kappa light chains.
Антитела к Bet v 1 выделяют непосредственно из антиген-положительных В-клеток без слияния с миеломными клетками, как описано в патенте США № 7582298. С использованием этого способа получали несколько полностью человеческих антител к Bet v 1 (т.е. антитела, обладающие вариабельными доменами человека и константными доменами человека); иллюстративные антитела, образованные таким образом, обозначили следующим образом: Н4Н16943Р, Н4Н16946Р, Н4Н16950Р, Н4Н16960Р, Н4Н16967Р, Н4Н16971Р, Н4Н16979Р, Н4Н16987Р, Н4Н16991Р, Н4Н16992Р, Н4Н17001Р, Н4Н17015Р, Н4Н17027Р, Н4Н17028Р, Н4Н17031Р, Н4Н17033Р, Н4Н17038Р2, Н4Н17045Р2, Н4Н17067Р2 и Н4Н17082Р2.Antibodies to Bet v 1 are isolated directly from antigen-positive B cells without fusion with myeloma cells, as described in US patent No. 7582298. Using this method, several fully human antibodies to Bet v 1 (ie antibodies having variable human domains and human constant domains); Exemplary antibodies thus formed are designated as follows: H4H16943P, H4H16946P, H4H16950P, H4H16960P, H4H16967P, H4H16971P, H4H16979P, H4H16987P, H4H16991P, H4H16992P, H4H1 7001R, N4N17015R, N4N17027R, N4N17028R, N4N17031R, N4N17033R, N4N17038R2, N4N17045R2, N4N17067R2 and N4N17082R2 .
Биологические свойства иллюстративных антител, созданных в соответствии со способами настоящего примера, описаны подробно в примерах, представленных ниже.The biological properties of exemplary antibodies generated in accordance with the methods of this example are described in detail in the examples presented below.
Пример 2. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей.Example 2 Amino acid sequences of the heavy and light chains.
В табл. 1а представлены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR выбранных антител к Bet v 1. В табл. 1b представлены идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR выбранных антител к Bet v 1.In table 1a shows identifiers of amino acid sequences of the variable regions of the heavy and light chains and CDRs of selected antibodies to Bet v 1. Table. 1b shows nucleic acid sequence identifiers of the heavy and light chain variable regions and CDRs of selected antibodies to Bet v 1.
Таблица 1a ______Идентификаторы аминокислотных последовательностей______Table 1a ______Aino acid sequence identifiers______
- 34 045437- 34 045437
Таблица lblb table
Идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислотыNucleic acid sequence identifiers
Антитела, как правило, в настоящем документе называют согласно следующей номенклатуре: приставка Fc (например, Ή4Η, Ή2Μ и т.д.) с последующим числовым идентификатором (например, 16943 17001 и т.д.), за которым следует суффикс ”Р” или Р2. Приставки Н4Н и Н2М в обозначениях антител, используемых в настоящем документе указывают на конкретный изотип Fe-области антитела. Таким образом, в соответствии с этой номенклатурой антитело в настоящем документе может называться, например, Ή4Η16943Ρ и т.д. так как Ή4Η обозначает антитело, которое содержит Fc IgG4 человека (все вариабельные области являются полностью человеческими, что обозначено первой Ή в обозначении антитела). Среднему специалисту в настоящей области техники понятно, что антитело с конкретным изотипом Fc можно превратить в антитело с другим изотипом Fc (например, антитело с Fc IgGl мыши можно превратить в антитело с IgG4 человека и т.д.), но в любом случае вариабельные домены (включая в себя CDR), которые указаны с помощью числовых идентификаторов, показанных в табл. 1, будут оставаться прежними, и, как предполагают, свойства связывания с антигеном являются идентичными или по существу сходными независимо от природы Fc-домена.Antibodies are generally referred to herein according to the following nomenclature: the prefix Fc (e.g., Ή4Η, Ή2Μ, etc.) followed by a numerical identifier (e.g., 16943 17001, etc.), followed by the suffix “P.” or P2. The prefixes H4H and H2M in the designations of antibodies used herein indicate a particular isotype of the Fe region of the antibody. Thus, according to this nomenclature, the antibody herein may be referred to as, for example, Ή4Η16943Ρ, etc. since Ή4Η denotes an antibody that contains a human IgG4 Fc (all variable regions are fully human, as indicated by the first Ή in the antibody designation). One of ordinary skill in the art will appreciate that an antibody with a particular Fc isotype can be converted into an antibody with a different Fc isotype (e.g., a mouse IgGl Fc antibody can be converted into a human IgG4 antibody, etc.), but in any case the variable domains (including CDRs), which are indicated using the numeric identifiers shown in table. 1 will remain the same and the antigen binding properties are expected to be identical or substantially similar regardless of the nature of the Fc domain.
В табл. 1с представлены идентификаторы аминокислотных последовательностей полноразмерных тяжелой и легкой цепей выбранных антител к Bet ν 1.In table Figure 1c shows the amino acid sequence identifiers of the full-length heavy and light chains of selected antibodies to Bet ν 1.
Таблица 1сTable 1c
Идентификаторы аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепейHeavy and light chain amino acid sequence identifiers
Пример 3. Связывание антитела с Bet ν 1, как определено с помощью поверхностного плазмонногоExample 3 Antibody Binding to Bet ν 1 as Determined by Surface Plasmon
-35045437 резонанса.-35045437 resonance.
Константы равновесия диссоциации (Ко) для связывания природного Bet v1 с очищенными моноклональными антителами к Bet v 1 определяли с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса в режиме реального времени (SPR-Biacore) с использованием прибора Biacore 4000. Все исследования связывания проводили в рабочем буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) при 25°C и 37°C. Поверхность сенсора Biacore вначале дериватизировали путем аминного сочетания с моноклональным мышиным антителом к Fc человека (GE, № по кат. BR-1008-39) для захвата моноклональных антител к Bet v 1. Различные концентрации природного Bet v 1 (Indoor, № по кат. NA-BV1-1) или реагента произведенного СНО рекомбинантного Bet v 1, содержащего мутацию S85A с С-концевой myc-myc гексагистидиновой меткой (мутантный Bet v 1-MMH; SEQ ID NO: 312) вначале получали в рабочем буфере HBS-ET (100 нМ - 1,23 нМ; серийно разведенный в 3 раза) и их вводили на поверхность, содержащую моноклональные антитела к Bet v 1, захваченные антителами к Fc человека, в течение 4 мин со скоростью потока, составляющей 30 мкл/мин, при этом диссоциацию связанного с моноклональным антителом реагента Bet v 1 подвергали мониторингу в течение 10 мин в рабочем буфере HBS-ET. Кинетические константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли путем аппроксимации сенсограмм связывания в режиме реального времени к 1:1 модели связывания с ограничением переноса массы с использованием программного обеспечения для подбора аппроксимирующей кривой Scrubber 2.0c. Константы равновесия диссоциации для связывания (KD) и диссоциативные периоды полужизни (t½) рассчитывали из кинетических констант скорости следующим образом:Dissociation equilibrium constants (Ko) for the binding of native Bet v1 to purified monoclonal antibodies to Bet v 1 were determined using a real-time surface plasmon resonance biosensor (SPR-Biacore) using a Biacore 4000 instrument. All binding studies were performed in a running buffer containing 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.05% v/v. surfactant Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET) at 25°C and 37°C. The Biacore sensor surface was first derivatized by amine coupling with a mouse monoclonal anti-human Fc antibody (GE, Cat. No. BR-1008-39) to capture the monoclonal antibodies to Bet v 1. Various concentrations of natural Bet v 1 (Indoor, Cat. No. BR-1008-39) NA-BV1-1) or a reagent produced by CHO recombinant Bet v 1 containing the S85A mutation with a C-terminal myc-myc hexahistidine tag (mutant Bet v 1-MMH; SEQ ID NO: 312) was first prepared in HBS-ET running buffer ( 100 nM - 1.23 nM; serially diluted 3 times) and were injected onto a surface containing anti-Bet v 1 monoclonal antibodies captured by anti-human Fc antibodies for 4 minutes at a flow rate of 30 μl/min, while dissociation of Bet v 1 monoclonal antibody reagent bound was monitored for 10 min in HBS-ET running buffer. Kinetic rate constants for association (k a ) and dissociation (k d ) were determined by fitting real-time binding sensorgrams to a 1:1 mass transfer-limited binding model using Scrubber 2.0c curve fitting software. Equilibrium dissociation constants for binding (KD) and dissociative half-lives (t½) were calculated from the kinetic rate constants as follows:
kd 1п(2)kd 1п(2)
KD = 5—, и th = ~гг ka kdK D = 5—, and th = ~gg ka kd
Параметры кинетики связывания для природного Bet v 1 и мутантного Bet v 1-MMH с различными моноклональные антитела к Bet v 1 согласно настоящему изобретению при 25°C и 37°C показаны в табл. 2-5.The binding kinetics parameters for natural Bet v 1 and mutant Bet v 1-MMH with various monoclonal antibodies to Bet v 1 according to the present invention at 25°C and 37°C are shown in table. 2-5.
При 25°C все моноклональные антитела к Bet v 1 согласно настоящему изобретению связывались с природным Bet v 1 со значениями KD, находящимися в диапазоне от 0,66 нМ до 13,5 нМ, как показано в табл. 2. При 37°C все моноклональные антитела к Bet v 1 согласно настоящему изобретению связывались с природным Bet v 1 со значениями KD, находящимися в диапазоне от 1,59 нМ до 27,9 нМ, как показано в табл. 3. Как при 25°C, так и при и 37°C антитело изотипического контроля не демонстрировало какоголибо измеримого связывания с природным Bet v 1.At 25°C, all monoclonal antibodies to Bet v 1 according to the present invention bound to natural Bet v 1 with KD values ranging from 0.66 nM to 13.5 nM, as shown in table. 2. At 37°C, all monoclonal antibodies to Bet v 1 according to the present invention bound to natural Bet v 1 with KD values ranging from 1.59 nM to 27.9 nM, as shown in table. 3. At both 25°C and 37°C, the isotype control antibody did not demonstrate any measurable binding to native Bet v 1.
Как при 25°C, так и при и 37°C 3 из 20 моноклональных антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению не связывались с мутантным Bet v 1-MMH. При 25°C 17 из 20 моноклональных антител к Bet v 1 связывались с мутантным Bet v 1-MMH со значениями Kd, находящимися в диапазоне от 348 пМ до 43,8 нМ, как показано в табл. 4. При 37°C 17 из 20 моноклональных антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению связывались с мутантным Bet v 1-MMH со значениями KD, находящимися в диапазоне от 655 пМ до 106 нМ, как показано в табл. 5. Как при 25°C, так и при и 37°C антитело изотипического контроля не демонстрировало какого-либо измеримого связывания с мутантным Bet v 1-MMH.At both 25°C and 37°C, 3 of 20 monoclonal antibodies to Bet v 1 according to the present invention did not bind to mutant Bet v 1-MMH. At 25°C, 17 of 20 monoclonal antibodies to Bet v 1 bound to mutant Bet v 1-MMH with Kd values ranging from 348 pM to 43.8 nM, as shown in table. 4. At 37°C, 17 of the 20 monoclonal antibodies to Bet v 1 according to the present invention bound to the mutant Bet v 1-MMH with K D values ranging from 655 pM to 106 nM, as shown in table. 5. At both 25°C and 37°C, the isotype control antibody did not show any measurable binding to the Betv mutant 1-MMH.
- 36 045437- 36 045437
Таблица 2table 2
Параметры кинетики связывания природного Bet v 1, связывающегося с __________Моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°C_______Parameters of the binding kinetics of natural Bet v 1 binding to __________Monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C_______
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 37 045437- 37 045437
Таблица 3Table 3
Параметры кинетики связывания природного Bet v 1, связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 37°CBinding kinetics parameters of natural Bet v 1 binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 37°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 38 045437- 38 045437
Таблица 4Table 4
Параметры кинетики связывания мутантного Bet v 1-MMH, связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°CBinding kinetics parameters of mutant Bet v 1-MMH binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 39 045437- 39 045437
Таблица 5Table 5
Параметры кинетики связывания мутантного Bet v 1-MMH, связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 37°CBinding kinetics parameters of mutant Bet v 1-MMH binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 37°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
Пример 4. Связывание антитела с родственными аллергенами, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса.Example 4 Antibody binding to related allergens as determined by surface plasmon resonance.
Константы равновесия диссоциации (KD) для связывания различных родственных аллергенов с очищенными моноклональными антителами к Bet v 1 определяли с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса в режиме реального времени (SPR-Biacore) с использованием прибора Biacore 4000. Все исследования связывания проводили в рабочем буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) при 25°C. Поверхность сенсора Biacore вначале дериватизировали путем аминного сочетания с моноклональным мышиным антителом к Fc человека (GE, № по кат. BR-1008-39) для захвата моноклональных антител к Bet v 1. Исследования связывания проводили на следующих родственных аллергенах: ольха (Aln g 1, MyBiosource, № по кат. MBS1041484), яблоко (Mal d 1, MyBiosource, № по кат. MBS1224919), морковь (Dau с 1.2, MyBiosource, № по кат. MBS1212920), сельдерей (Api g 1, MyBiosource, № по кат. MBS1171376), сельдерей (Api g 2, MyBiosource, № по кат. MBS1047880), граб обыкновенный (Car b 1 изоформа 1А и 1B, MyBiosource, № по кат. MBS1200018), граб обыкновенный (Car b 1 изоформа 2, MyBiosource, № по кат. MBS1043940), лещина (Cor A 1, MyBiosource, № по кат. MBS5304600) и белый дуб (Que a 1, MyBiosource, № по кат. MBS1258822). Различные концентрации родственных аллергенов получали в рабочем буфере HBS-ET (100 нМ - 6,25 нМ; серийно разведенный в 4 раза) и затем их вводили на поверхность, содержащую моноклональные антитела к Bet v 1, захваченные антителами к Fc человека, в течение 3 мин со скоростью потока, составляющей 30 мкл/мин, при этом диссоциацию связанных с моноклональным антителом аллергенов подвергали мониторингу в течение 8 мин в рабочем буфере HBSET. Кинетические константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли путем аппроксимации сенсограмм связывания в режиме реального времени к 1:1 модели связывания с ограничением переноса массы с использованием программного обеспечения для подбора аппроксимирующей кривой Scrubber 2.0с. Константы равновесия диссоциации для связывания (KD) и диссоциативные периоды полужизни (t½) рассчитывали из кинетических констант скорости следующим образом:Dissociation equilibrium constants (KD) for the binding of various related allergens to purified anti-Bet v 1 monoclonal antibodies were determined using a real-time surface plasmon resonance biosensor (SPR-Biacore) using a Biacore 4000 instrument. All binding studies were performed in a running buffer containing 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.05% v/v. surfactant Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET) at 25°C. The Biacore sensor surface was first derivatized by amine coupling with a monoclonal mouse anti-human Fc antibody (GE, cat. no. BR-1008-39) to capture the monoclonal antibodies to Bet v 1. Binding studies were performed on the following related allergens: alder (Aln g 1 , MyBiosource, cat. no. MBS1041484), apple (Mal d 1, MyBiosource, cat. no. MBS1224919), carrot (Dau with 1.2, MyBiosource, cat. no. MBS1212920), celery (Api g 1, MyBiosource, cat. no. cat. MBS1171376), celery (Api g 2, MyBiosource, cat. no. MBS1047880), common hornbeam (Car b 1 isoform 1A and 1B, MyBiosource, cat. no. MBS1200018), common hornbeam (Car b 1 isoform 2, MyBiosource , cat. no. MBS1043940), hazel (Cor A 1, MyBiosource, cat. no. MBS5304600) and white oak (Que a 1, MyBiosource, cat. no. MBS1258822). Various concentrations of related allergens were prepared in HBS-ET working buffer (100 nM - 6.25 nM; serially diluted 4-fold) and then applied to a surface containing monoclonal antibodies to Bet v 1 captured by antibodies to human Fc for 3 min at a flow rate of 30 μl/min, while the dissociation of monoclonal antibody-bound allergens was monitored for 8 min in HBSET running buffer. Kinetic rate constants for association ( ka ) and dissociation (kd) were determined by fitting real-time binding sensorgrams to a 1:1 mass transfer-limited binding model using Scrubber 2.0c curve fitting software. Dissociation equilibrium constants for binding ( KD ) and dissociative half-lives (t½) were calculated from the kinetic rate constants as follows:
- 40 045437 ln(2) kd kd- 40 045437 ln(2) kd kd
Kd = t— , и 1½ = kaKd = t— , and 1½ = ka
Параметры кинетики связывания для родственных аллергенов с различными моноклональными антителами к Bet v 1 согласно настоящему изобретению при 25°C показаны в табл. 6-11.The binding kinetics parameters for related allergens with various monoclonal antibodies to Bet v 1 according to the present invention at 25°C are shown in table. 6-11.
Как показано в табл. 6 при 25°C 9 из 20 антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению продемонстрировали измеримое связывание с Aln g 1 со значениями KD, находящимися в диапазоне от 1,03 нМ - 175 нМ. Другие 11 антител не продемонстрировали какого-либо измеримого связывания с Aln g 1 при исследуемых условиях.As shown in table. 6 at 25°C 9 of 20 anti-Bet v 1 antibodies according to the present invention showed measurable binding to Aln g 1 with KD values ranging from 1.03 nM - 175 nM. The other 11 antibodies did not demonstrate any measurable binding to Aln g 1 under the conditions tested.
Как показано в табл. 7 при 25°C два из 20 антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению продемонстрировали измеримое связывание с Mal d 1 со значениями KD, составляющими 29,8 нМ и 494 нМ. Другие 18 антител не продемонстрировали какого-либо измеримого связывания с Mal d 1 при исследуемых условиях.As shown in table. 7 at 25°C, two of the 20 anti-Bet v 1 antibodies of the present invention showed measurable binding to Mal d 1 with K D values of 29.8 nM and 494 nM. The other 18 antibodies did not demonstrate any measurable binding to Mal d 1 under the conditions tested.
Как показано в табл. 8 при 25°C одно из антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению продемонстрировало измеримое связывание с Api g 1 со значением KD, составляющим 167 нМ. Другие 19 антитела не продемонстрировали какого-либо измеримого связывания с Api g 1 при исследуемых усло виях.As shown in table. 8 at 25°C, one of the anti-Bet v 1 antibodies of the present invention showed measurable binding to Api g 1 with a KD value of 167 nM. The other 19 antibodies did not demonstrate any measurable binding to Api g 1 under the conditions tested.
Как показано в табл. 9 при 25°C 8 из 20 антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению продемонстрировали измеримое связывание с изоформой 1А и 1B Car b 1 со значениями KD, находящимися в диапазоне от 1,2 нМ до 380 нМ. Другие 12 антител не продемонстрировали какого-либо измеримого связывания с изоформой 1А и 1В Car b 1 при исследуемых условиях.As shown in table. 9 at 25°C 8 of the 20 anti-Bet v 1 antibodies of the present invention demonstrated measurable binding to Car b 1 isoform 1A and 1B with KD values ranging from 1.2 nM to 380 nM. The other 12 antibodies did not demonstrate any measurable binding to Car b 1 isoforms 1A and 1B under the conditions tested.
Как показано в табл. 10 при 25°C 14 из 20 антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению продемонстрировали измеримое связывание с изоформой 2 Car b 1 со значениями KD, находящимися в диапазоне от 335 пМ до 564 нМ. Другие 6 антител не продемонстрировали какого-либо измеримого связывания с изоформой 2 Car b 1 при исследуемых условиях.As shown in table. 10 at 25°C, 14 of 20 anti-Bet v 1 antibodies according to the present invention showed measurable binding to Car b 1 isoform 2 with K D values ranging from 335 pM to 564 nM. The other 6 antibodies did not demonstrate any measurable binding to Car b 1 isoform 2 under the conditions tested.
Как показано в табл. 11 при 25°C одно из антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению продемонстрировали измеримое связывание с Cor A 1 со значением KD, составляющим 396 нМ. Другие 19 антител не продемонстрировали какого-либо измеримого связывания с Cor A 1 при исследуемых условиях.As shown in table. 11 at 25°C, one of the anti-Bet v 1 antibodies of the present invention showed measurable binding to Cor A 1 with a KD value of 396 nM. The other 19 antibodies did not demonstrate any measurable binding to Cor A 1 under the conditions tested.
Ни одно из антител согласно настоящему изобретению не продемонстрировало измеримого связывания с Dau с 1.2, Api g 2 или Que a 1 при исследуемых условиях (данные не показаны). Антитело изотипического контроля не продемонстрировало какого-либо измеримого связывания с каким-либо исследуемым аллергеном.None of the antibodies of the present invention demonstrated measurable binding to Dau c 1.2, Api g 2 or Que a 1 under the conditions tested (data not shown). The isotype control antibody did not demonstrate any measurable binding to any allergen tested.
- 41 045437- 41 045437
Таблица 6Table 6
Параметры кинетики связывания аллергена ольхи (Aln g1), связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°CBinding kinetics parameters of alder allergen (Aln g1) binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 42 045437- 42 045437
Таблица 7Table 7
Параметры кинетики связывания аллергена яблока (Mal d 1), связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°CBinding kinetics parameters of apple allergen (Mal d 1) binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 43 045437- 43 045437
Таблица 8Table 8
Параметры кинетики связывания аллергена сельдерея (Api g 1), связывающегося с _____________моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°C_____________Parameters of the binding kinetics of celery allergen (Api g 1) binding to _____________monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C_____________
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 44 045437- 44 045437
Таблица 9Table 9
Параметры кинетики связывания аллергена граба обыкновенного (изоформа 1А и 1B Car b 1), ____связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°C____Parameters of the binding kinetics of the common hornbeam allergen (isoforms 1A and 1B Car b 1), ____binding with monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C____
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 45 045437- 45 045437
Таблица 10Table 10
Параметры кинетики связывания аллергена граба обыкновенного (изоформа 2 Car b1), связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°CBinding kinetics parameters of the common hornbeam allergen (car b1 isoform 2) binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
- 46 045437- 46 045437
Таблица 11Table 11
Параметры кинетики связывания аллергена лещины (Cor A 1), связывающегося с моноклональными антителами к Bet v 1 при 25°CParameters of the binding kinetics of hazel allergen (Cor A 1) binding to monoclonal antibodies to Bet v 1 at 25°C
*NB указывает на то, что связывание не наблюдалось в текущих условиях эксперимента.*NB indicates that binding was not observed under the current experimental conditions.
Пример 5. Блокирование связывания Bet v 1с аллерген-специфическим IgE антителами IgG к Bet v 1.Example 5. Blocking the binding of Bet v 1 to allergen-specific IgE with IgG antibodies to Bet v 1.
Способность отдельных антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению или комбинаций антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению блокировать связывание Bet v 1 с захваченным на планшете IgE из плазмы/сыворотки донора-человека с аллергией определяли с использованием ELISA. Антитела испытывали либо отдельно, либо в поликлональных смесях. Для анализа планшеты для микротитрования покрывали в течение ночи при 4°C белком внеклеточного домена FcεR1α человека (высокоаффинный рецептор для IgE), который получали с С-концевой меткой Fc мыши (hFc8R1a-mFc; SEQ ID NO: 313). Затем планшеты блокировали 0,5% BSA (мас./об.) в течение 1 ч при комнатной температуре. Плазму от доноров с аллергией разбавляли и затем захватывали общий IgE на поверхности, покрытой рецептором. Постоянное количество 0,1 нМ меченного биотином природного Bet v 1 (Indoor Biotechnologies, № по кат. NA-BV1-1) предварительно смешивали с антителами к Bet v 1, в одной концентрации 1 мкг/мл или в серийных разведениях, начиная с 10 мкг/мл или 1 мкг/мл каждого антитела и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы взаимодействие Bet v 1 с антителом достигло равновесия. Затем смесь антитело-Bet v 1 добавляли в покрытый IgE планшет в течение 1 ч. Затем планшеты промывали и количество природного Bet v 1, связанного с планшетом, обнаруживали с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, № по кат. N200/QJ223091), в разведении 1:10000 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты затем промывали PBS-T между каждой стадией протокола ELISA, описанного выше. Для развития колориметрической реакции в планшеты добавляли субстрат ТМВ/Н2О2 (BD Pharmingen, реагент А, № по кат. 51-2602KC + реагент В, № по кат. 51-2607KC) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали с использованием 2н. серной кислоты (H2SO4; VWR, № по кат. BDH3500-1). Впоследствии оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Victor, Perkin Elmer) при 450 нм. Процент блокирования рассчитывали с использованием самой высокой концентрации антител, используемой в каждом анализе, как описано ниже.The ability of individual anti-Bet v 1 antibodies of the present invention or combinations of anti-Bet v 1 antibodies of the present invention to block the binding of Bet v 1 to plate-captured IgE from the plasma/serum of an allergic human donor was determined using ELISA. Antibodies were tested either alone or in polyclonal mixtures. For the assay, microtiter plates were coated overnight at 4°C with human FcεR1α (high affinity receptor for IgE) extracellular domain protein, which was prepared with a C-terminal mouse Fc tag (hFc8R1a-mFc; SEQ ID NO: 313). The plates were then blocked with 0.5% BSA (w/v) for 1 h at room temperature. Plasma from allergic donors was diluted and then total IgE was captured on the receptor-coated surface. A constant amount of 0.1 nM biotin-labeled native Bet v 1 (Indoor Biotechnologies, cat. no. NA-BV1-1) was premixed with antibodies to Bet v 1, at a single concentration of 1 μg/ml or in serial dilutions starting from 10 µg/ml or 1 µg/ml of each antibody and incubated for 1 hour at room temperature to allow the interaction of Bet v 1 with the antibody to reach equilibrium. The antibody-Bet v 1 mixture was then added to the IgE-coated plate for 1 hour. The plates were then washed and the amount of native Bet v 1 bound to the plate was detected using horseradish peroxidase-conjugated streptavidin (Thermo Scientific, cat. no. N200/ QJ223091), diluted 1:10000 and incubated for 1 hour at room temperature. The plates were then washed with PBS-T between each step of the ELISA protocol described above. To develop a colorimetric reaction, the TMB/H2O2 substrate (BD Pharmingen, reagent A, cat. no. 51-2602KC + reagent B, cat. no. 51-2607KC) was added to the plates and incubated for 20 min at room temperature. The reaction was stopped using 2N. sulfuric acid (H 2 SO 4 ; VWR, cat. no. BDH3500-1). Subsequently, the absorbance was measured using a spectrophotometer (Victor, Perkin Elmer) at 450 nm. Percent blocking was calculated using the highest antibody concentration used in each assay as described below.
- 47 045437- 47 045437
Блокирование, % = (Л450 без антитела) - (Л450 в самой высокой концентрации антитела) х100 (А450 без антитела) антител к Bet v 1 исследовали в качестве отдельных антител в отношении их способности блокировать связывание Bet v 1 с захваченным на планшете IgE их плазмы донора - человека с аллергией с использованием описанного анализа ELISA. Отдельные моноклональные антитела были способны частично блокировать связывание IgE с Bet v 1 на 8,5-64%, что подчеркивает поликлональность IgE. 7 антител показали блокирование, находящееся в диапазоне от 36-64%, при самой высокой исследуемой концентрации антитела, составляющей 10 мкг/мл, как показано в табл. 12.Blocking, % = (A450 without antibody) - (A450 at the highest antibody concentration) x 100 (A450 without antibody) antibodies to Bet v 1 were tested as individual antibodies for their ability to block the binding of Bet v 1 to plate-captured plasma IgE donor - a person with allergies using the described ELISA test. Individual monoclonal antibodies were able to partially block IgE binding to Bet v 1 by 8.5-64%, highlighting the polyclonality of IgE. 7 antibodies showed blocking ranging from 36-64%, at the highest antibody concentration tested, 10 μg/ml, as shown in table. 12.
Четыре антитела к Bet v 1, Н4Н17082Р2, Н4Н17038Р2, Н4Н16987Р и Н4Н16992Р, исследовали в анализе блокирования в одной точке. Комбинация Н4Н17082Р2 и Н4Н16992Р продемонстрировала больше чем 90% блокирование у 7 из 10 доноров IgE. Комбинации трех и четырех моноклональных антител продемонстрировали сходные результаты и, по-видимому, не добавили какого-либо дополнительного блокирующего эффекта по сравнению с комбинацией двух антител, Н4Н17082Р2 и Н4Н16992Р, как показано в табл. 13.Four antibodies to Bet v 1, H4H17082P2, H4H17038P2, H4H16987P and H4H16992P, were tested in a single point blocking assay. The combination of H4H17082P2 and H4H16992P demonstrated greater than 90% blocking in 7 of 10 IgE donors. Combinations of three and four monoclonal antibodies showed similar results and did not appear to add any additional blocking effect compared to the combination of two antibodies, H4H17082P2 and H4H16992P, as shown in Table 1. 13.
Четыре моноклональных антитела, Н4Н17082Р2, Н4Н17038Р2, Н4Н16987Р и Н4Н16992Р, впоследствии испытывали в качестве отдельных антител и комбинаций из 2, 3 и 4 моноклональных антител в анализе зависимости блокирования от дозы с образцами от 3 доноров IgE. Результаты показали, что комбинация двух моноклональных антител к Bet v 1, H4H17082P2 и Н4Н16992Р, блокировала связывание Bet v 1 с аллерген-специфическим IgE больше чем 90% и близко к исходному уровню у 3 доноров, как показано в табл. 14. Исследуемые комбинации 3- и 4- антител показали сходную широту и интенсивность блокирующей активности. В качестве положительного контроля очищенный мышиный поликлональный IgG к Bet v 1 продемонстрировал >90% блокирования.Four monoclonal antibodies, H4H17082P2, H4H17038P2, H4H16987P and H4H16992P, were subsequently tested as single antibodies and combinations of 2, 3 and 4 monoclonal antibodies in a dose response blocking assay with samples from 3 IgE donors. The results showed that the combination of two monoclonal antibodies to Bet v 1, H4H17082P2 and H4H16992P, blocked the binding of Bet v 1 to allergen-specific IgE by more than 90% and close to baseline in 3 donors, as shown in Table 1. 14. The studied combinations of 3- and 4-antibodies showed a similar breadth and intensity of blocking activity. As a positive control, purified mouse polyclonal IgG to Bet v 1 demonstrated >90% blocking.
Таблица 12Table 12
Антитела к Bet v 1, блокирующие связывание Bet v 1 с аллерген-специфическим IgEAntibodies to Bet v 1, blocking the binding of Bet v 1 to allergen-specific IgE
Для этих анализов плазму донора с аллергией разводили 1:50.For these tests, plasma from an allergic donor was diluted 1:50.
- 48 045437- 48 045437
Таблица 13Table 13
Отдельные антитела и комбинации антител, блокирующие связываниеSingle antibodies and combinations of antibodies that block binding
Bet v 1 с аллерген-специфическим IgEBet v 1 with allergen-specific IgE
- 49 045437- 49 045437
Плазму доноров с аллергией нормировали к титру или 1:20 (6 доноров), или 1:10 (3 донора), или 1:9 (1 донор) Bet v 1-специфического IgE и затем разводили 1:50 для этого анализа.Plasma from allergic donors was normalized to a titer of either 1:20 (6 donors), 1:10 (3 donors), or 1:9 (1 donor) Bet v 1-specific IgE and then diluted 1:50 for this assay.
Таблица 14Table 14
Комбинации антител, блокирующие связывание Bet v 1 с аллерген-специфическим IgECombinations of antibodies that block the binding of Bet v 1 to allergen-specific IgE
- 50 045437- 50 045437
Пример 6. Эпитопное картирование антител к Bet v 1, связывающихся с Bet v 1, с помощью водородно-дейтериевого (H/D) обмена.Example 6 Epitope mapping of anti-Bet v 1 antibodies binding to Bet v 1 using hydrogen-deuterium (H/D) exchange.
Для определения аминокислотных остатков Bet v 1 [(аминокислоты M1-N160 согласно Uniprot P15494], с которыми взаимодействуют Н4Н16992Р2, Н4Н17082Р2, Н4Н17038Р2 и Н4Н16987Р, выполняли эпитопное картирование с помощью H/D-обмена с масс-спектрометрией. Общее описание способа обмена H/D изложено, например, в Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; и Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.To determine the amino acid residues of Bet v 1 [(amino acids M1-N160 according to Uniprot P15494], with which H4H16992P2, H4H17082P2, H4H17038P2 and H4H16987P interact, epitope mapping was performed using H/D exchange with mass spectrometry. General description of the H/ exchange method D is set out, for example, in Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259 and Engen and Smith (2001) Anal Chem 73:256A-265A.
Эксперименты HDX-MS проводили на интегрированной платформе Waters HDX/MS, состоящей из системы Leaptec HDX PAL для мечения дейтерием, Waters Acquity M-Class (вспомогательное устройство управления растворителями) для обработки и загрузки образца, Waters Acquity M-Class (устройство управления растворителями μBinary) для аналитического градиента колонки и масс-спектрометра Synapt G2-Si для измерения массы пептидного пептида.HDX-MS experiments were performed on an integrated Waters HDX/MS platform consisting of a Leaptec HDX PAL system for deuterium labeling, a Waters Acquity M-Class (solvent management auxiliary) for sample processing and loading, a Waters Acquity M-Class (μBinary solvent management device) ) for analytical gradient column and Synapt G2-Si mass spectrometer to measure peptide mass.
Раствор для мечения получали в 10 мМ буфере PBS в D2O при pD 7,0 (эквивалентно рН 6,6). Для мечения дейтерием 3,8 мкл природного Bet v 1 (Indoor Biotech, № по кат. NA-BV1-1, 28 пмоль/мкл), Bet v 1, предварительно смешанного с каждым антителом, или смесь всех 4 антител к Bet v 1 в молярном соотношении 1:1 инкубировали с 56,2 мкл D2O-раствора для мечения в различные моменты времени (например, недейтерированный контроль = 0 с, меченый в течение 1 мин, 5 мин, 10 мин и 20 мин). Дейтерирование гасили путем переноса 50 мкл образца в 50 мкл предварительно охлажденного 0,2 М ТСЕР, 6 М гуанидинхлорида в 100 мМ фосфатном буфере, рН 2,5 (буфер гашения), и смешанный образец инкубировали при 1,0°C в течение 2 мин. Затем подвергнутый гашению образец вводили в устройство управления Waters HDX Manager для онлайн-расщепления пепсином/протеазой XIII. Расщепленные пептиды захватывали на предварительной колонке ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7 мкм, 2,1x5 мм VanGuard при 0°C и элюировали на аналитической колонке ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7 мкм, 1,0x50 мм в течение 9 минутного градиентного разделения 5-40% В (подвижная фаза А: 0,1% муравьиная кислота в воде, подвижная фаза В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Масс-спектрометр устанавливали на напряжение на конусе, составляющее 37 В, время сканирования 0,5 с и диапазон масса/заряд 50-1700 Th.The labeling solution was prepared in 10 mM PBS buffer in D2O at pD 7.0 (equivalent to pH 6.6). For deuterium labeling, 3.8 µl of natural Bet v 1 (Indoor Biotech, Cat. No. NA-BV1-1, 28 pmol/µl), Bet v 1 premixed with each antibody, or a mixture of all 4 Bet v 1 antibodies at a molar ratio of 1:1 incubated with 56.2 μl of D 2 O-labeling solution at various time points (eg, non-deuterated control = 0 s, labeled for 1 min, 5 min, 10 min and 20 min). Deuteration was quenched by transferring 50 μL of sample to 50 μL of pre-cooled 0.2 M TCEP, 6 M guanidine chloride in 100 mM phosphate buffer, pH 2.5 (quenching buffer), and the mixed sample was incubated at 1.0°C for 2 min. . The quenched sample was then introduced into the Waters HDX Manager for online pepsin/protease XIII digestion. Digested peptides were captured on an ACQUITY UPLC VEN C18 1.7 μm, 2.1 x 5 mm VanGuard precolumn at 0°C and eluted on an ACQUITY UPLC VEN C18 1.7 μm, 1.0 x 50 mm analytical column over a 9-minute 5-minute gradient separation. 40% B (mobile phase A: 0.1% formic acid in water, mobile phase B: 0.1% formic acid in acetonitrile). The mass spectrometer was set to a cone voltage of 37 V, a scan time of 0.5 s, and a mass/charge range of 50–1700 Th.
Для идентификации пептидов из Bet v 1 данные LC- MSE от недейтерированного образца обрабатывали и проводили поиск в базе данных, включая в себя Bet v 1 и ее рандомизированную последовательность, с помощью программного обеспечения Waters ProteinLynx Global Server (PLGS). Идентифицированные пептиды импортировали в программное обеспечение DynamX и фильтровали по двум критериям: 1) минимальное количество продуктов на аминокислоту: 0,3 и 2) порог файла репликации: 3. Программное обеспечение DynamX затем автоматически определило поглощение дейтерия каждым пептидом на основании времени удерживания и высокой точности массы (<10 м.д.) в нескольких временных точках с 3 повторениями в каждый момент времени.To identify peptides from Bet v 1, LC-MS E data from the non-deuterated sample were processed and a database search including Bet v 1 and its randomized sequence was performed using Waters ProteinLynx Global Server (PLGS) software. Identified peptides were imported into DynamX software and filtered using two criteria: 1) minimum number of products per amino acid: 0.3 and 2) replication file threshold: 3. DynamX software then automatically determined the deuterium uptake of each peptide based on retention time and high accuracy mass (<10 ppm) at several time points with 3 repetitions at each time point.
С использованием онлайн-колонки, содержащей пепсин/протеазу XIII, в сочетании со сбором дан- 51 045437 ных MSE, в общей сложности 36 пептидов из Bet v 1 были воспроизводимо идентифицированы при отсутствии или в присутствии антитела, что составляет 91,2% охвата последовательности. Пептиды со значительно сниженным поглощением дейтерирования, когда они связаны с комбинациями 4 антител Н4Н16992Р2, Н4Н17082Р2, Н4Н17038Р2, Н4Н16987Р, проиллюстрированы на фиг. 1-4 и 5 соответственно. Зарегистрированная масса пептида соответствует среднему значению центроидной массы МН + из трех параллелей Bet v 1 в комплексе с антителом или антителами к Bet v 1.Using an online pepsin/protease XIII column coupled with MS E data collection, a total of 36 peptides from Bet v 1 were reproducibly identified in the absence or presence of antibody, representing 91.2% coverage sequences. Peptides with significantly reduced deuteration uptake when coupled to antibody combinations H4H16992P2, H4H17082P2, H4H17038P2, H4H16987P are illustrated in FIG. 1-4 and 5 respectively. The recorded peptide mass corresponds to the average value of the centroid mass of MH+ from three parallels of Bet v 1 in complex with the antibody or antibodies to Bet v 1.
Как показано на фиг. 1, пептиды, соответствующие аминокислотам 23-43 (FILDGDNLFPKVAPQAISSVE, SEQ ID NO: 307), характеризовались более медленной скоростью дейтерирования в присутствии Н4Н16992Р.As shown in FIG. 1, peptides corresponding to amino acids 23-43 (FILDGDNLFPKVAPQAISSVE, SEQ ID NO: 307) were characterized by a slower rate of deuteration in the presence of H4H16992P.
Как показано на фиг. 2, пептиды, соответствующие аминокислотам 44-56 (NIEGNGGPGTIKK, SEQ ID NO: 308), характеризовались более медленной скоростью дейтерирования в присутствии Н4Н17082Р.As shown in FIG. 2, peptides corresponding to amino acids 44-56 (NIEGNGGPGTIKK, SEQ ID NO: 308) were characterized by a slower rate of deuteration in the presence of H4H17082P.
Как показано на фиг. 3, пептиды, соответствующие аминокислотам 2-19 (GVFNYETETTSVIPAARL, SEQ ID NO: 309), характеризовались более медленной скоростью дейтерирования в присутствии Н4Н17038Р2.As shown in FIG. 3, peptides corresponding to amino acids 2-19 (GVFNYETETTSVIPAARL, SEQ ID NO: 309) were characterized by a slower rate of deuteration in the presence of H4H17038P2.
Как показано на фиг. 4, пептиды, соответствующие аминокислотам 57-70 (ISFPEGFPFKYVKD, SEQ ID NO: 310) и 81-96 (KYNYSVIEGGPIGDTL, SEQ ID NO: 315), характеризовались более медленной скоростью дейтерирования в присутствии Н4Н16987Р.As shown in FIG. 4, peptides corresponding to amino acids 57-70 (ISFPEGFPFKYVKD, SEQ ID NO: 310) and 81-96 (KYNYSVIEGGPIGDTL, SEQ ID NO: 315) were characterized by a slower rate of deuteration in the presence of H4H16987P.
Как показано на фиг. 5, пептиды, соответствующие аминокислотам 23-43 (FILDGDNLFPKVAPQAISSVE, SEQ ID NO: 307), аминокислотам 44-56 (NIEGNGGPGTIKK, SEQ ID NO: 308), 2-19 (GVFNYETETTSVIPAARL, SEQ ID NO: 309), аминокислотам 57-70 (ISFPEGFPFKYVKD, SEQ ID NO: 310) и 81-96 (KYNYSVIEGGPIGDTL, SEQ ID NO: 315), характеризовались более медленными скоростями дейтерирования в присутствии комбинации 4 антител к Bet v 1 (H4H16992P, Н4Н17082Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н16987Р).As shown in FIG. 5, peptides corresponding to amino acids 23-43 (FILDGDNLFPKVAPQAISSVE, SEQ ID NO: 307), amino acids 44-56 (NIEGNGGPGTIKK, SEQ ID NO: 308), 2-19 (GVFNYETETTSVIPAARL, SEQ ID NO: 309), amino acids 57-70 (ISFPEGFPFKYVKD, SEQ ID NO: 310) and 81-96 (KYNYSVIEGGPIGDTL, SEQ ID NO: 315), were characterized by slower deuteration rates in the presence of a combination of 4 antibodies to Bet v 1 (H4H16992P, H4H17082P, H4H17038P2 and H4H16987P).
Кроме того, невысокий уровень защиты наблюдали для пептида 23-43 в присутствии Н4Н17082Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н16987Р, что указывает на то, что эта область могла представлять вторичный эпитоп для этих моноклональных антител.In addition, a low level of protection was observed for peptide 23-43 in the presence of H4H17082P, H4H17038P2 and H4H16987P, indicating that this region could represent a secondary epitope for these monoclonal antibodies.
Пример 7. Эффект антител к Bet v 1 на модель пассивной кожной анафилаксии (PCA) in vivo.Example 7: Effect of anti-Bet v 1 antibodies on an in vivo model of passive cutaneous anaphylaxis (PCA).
Для определения эффективности антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению в отношении блокирования индуцированной аллергеном дегрануляции тучных клеток использовали модель пассивной кожной анафилаксии (РСА) in vivo. Эта модель предусматривает интрадермальную инъекцию аллергенспецифической иммунной сыворотки в локальную область на коже с последующей внутривенной инъекцией антигена вместе с красителем. Аллергический ответ вызывает расширение капилляров и повышенную проницаемость сосудов в месте сенсибилизации, что приводит к преимущественному накоплению красителя в этом месте. Краситель можно экстрагировать из ткани и количественно определить спектрофотометрически. Экстравазацию красителя в ткань, сенсибилизированную исследуемой иммунной сывороткой, можно затем сопоставить с экстравазацией в ткань, сенсибилизированную нерелевантной иммунной сывороткой.To determine the effectiveness of the anti-Bet v 1 antibodies of the present invention in blocking allergen-induced mast cell degranulation, an in vivo passive cutaneous anaphylaxis (PCA) model was used. This model involves intradermal injection of an allergen-specific immune serum into a local area on the skin, followed by intravenous injection of antigen along with dye. The allergic response causes dilation of capillaries and increased vascular permeability at the site of sensitization, which leads to the preferential accumulation of dye in this place. The dye can be extracted from the tissue and quantified spectrophotometrically. Extravasation of dye into tissue sensitized with the immune serum of interest can then be compared with extravasation into tissue sensitized with the irrelevant immune serum.
Иммунные сыворотки получали для использования в анализе путем иммунизации мышей Balb/c 5 мкг природного белка Bet v 1 (Indoor Biotechnologies, № по кат. NA-BV1-1) в растворе 1 мг/мл квасцов в 1х забуференном фосфатом солевом растворе (PBS) в день 0. Через неделю (день 7) сенсибилизированным мышам вводили бустер-дозу 5 мкг природного белка Bet v 1 в растворе 1 мг/мл квасцов в 1х PBS. Через две недели после бустер-дозы мышей подвергали интраназальной стимуляции через дыхательные пути с помощью 0,5 мкг природного белка Bet v 1 в 20 мкл PBS в дни 21, 24 и 28. Затем мышей умерщвляли на 31 день и собирали сыворотку. Общую концентрацию IgE в выделенной иммунной сыворотке определяли с использованием набора ELISA OptEIA™ (BD Biosciences, № по кат. 555248) в соответствии с инструкциями производителя. Конечную концентрацию иммунной сыворотки Bet v 1 разбавляли до 2600 нг/мл IgE в PBS.Immune sera were prepared for use in the assay by immunizing Balb/c mice with 5 μg of native Bet v 1 protein (Indoor Biotechnologies, cat. no. NA-BV1-1) in a solution of 1 mg/ml alum in 1x phosphate buffered saline (PBS). on day 0. A week later (day 7), sensitized mice were given a booster dose of 5 μg of natural Bet v 1 protein in a solution of 1 mg/ml alum in 1x PBS. Two weeks after the boost dose, mice were given intranasal airway challenge with 0.5 μg of native Bet v 1 protein in 20 μl of PBS on days 21, 24, and 28. Mice were then sacrificed on day 31 and serum was collected. Total IgE concentration in isolated immune serum was determined using the OptEIA™ ELISA kit (BD Biosciences, Cat. No. 555248) according to the manufacturer's instructions. The final concentration of Bet v 1 immune serum was diluted to 2600 ng/ml IgE in PBS.
Иммунные сыворотки, используемые в качестве отрицательного контроля в анализе, получали путем иммунизации мышей Balb/c с помощью 5 мкг природного белка Fel d 1, очищенного из экстракта шерсти кошки (Indoor Biotechnologies, № по кат. LTN-FD1-1), в растворе 1 мг/мл квасцов в PBS на 0 день. Мышам вводили бустер-дозу - 5 мкг белка Fel d 1 с растворе 1 мг/мл квасцов в PBS на 14 и 21 день. Через неделю после последней бустер-дозы (28 день) мышей умерщвляли и собирали сыворотку. Общую концентрацию IgE в выделенной иммунной сыворотке определяли с использованием набора ELISA OptEIA™ (BD Biosciences, № по кат. 555248) в соответствии с инструкциями производителя. Конечную концентрацию иммунных сывороток разбавляли до 2500 нг/мл IgE в PBS.Immune sera used as a negative control in the assay were prepared by immunizing Balb/c mice with 5 μg of natural Fel d 1 protein purified from cat hair extract (Indoor Biotechnologies, Cat. No. LTN-FD1-1) in solution 1 mg/ml alum in PBS on day 0. Mice were given a booster dose of 5 μg of Fel d 1 protein with a solution of 1 mg/ml alum in PBS on days 14 and 21. One week after the last booster dose (day 28), mice were sacrificed and serum was collected. Total IgE concentration in isolated immune serum was determined using the OptEIA™ ELISA kit (BD Biosciences, Cat. No. 555248) according to the manufacturer's instructions. The final concentration of immune sera was diluted to 2500 ng/ml IgE in PBS.
Для анализов РСА группам мышей Balb/c (n>5 на эксперимент) сначала подкожно вводили либо антитело изотипического контроля, либо антитело к Bet v 1, либо комбинацию антител к Bet v 1 в дозе, составляющей 1 мг/кг (общая доза антитела). Через три дня после введения антитела 10 мкл либо 1,5 нг иммунной сыворотки Bet v 1, либо 3 нг иммунной сыворотки - отрицательного контроля вводили с помощью инъекции в правое и левое уши мышей в каждой группе соответственно. Через двадцать четыре часа после местного введения аллерген-специфических иммунных сывороток мышей подвергали стиму- 52 045437 ляции путем внутривенной инъекции (100 мкл на мышь) раствора 1 мкг/мл природного Bet v 1, растворенного в PBS, содержащего 0,5% (мас./об.) красителя Эванса голубого (Sigma Aldrich, № по кат. Е2129).For PCA assays, groups of Balb/c mice (n>5 per experiment) were first subcutaneously injected with either an isotype control antibody, an anti-Bet v 1 antibody, or a combination of anti-Bet v 1 antibodies at a dose of 1 mg/kg (total antibody dose). . Three days after antibody administration, 10 μl of either 1.5 ng Bet v 1 immune serum or 3 ng negative control immune serum were injected into the right and left ears of mice in each group, respectively. Twenty-four hours after local administration of allergen-specific immune sera, mice were stimulated by intravenous injection (100 μl per mouse) of a solution of 1 μg/ml natural Bet v 1 dissolved in PBS containing 0.5% (wt. /vol.) Evans blue dye (Sigma Aldrich, cat. No. E2129).
Через один час после стимуляции антигеном мышей умерщвляли, их уши отрезали, помещали в 1 мл формамида и затем инкубировали в течение 3 дней при 50-56°C для экстракции красителя Эванса голубого.One hour after antigen stimulation, mice were sacrificed, their ears were cut off, placed in 1 ml of formamide and then incubated for 3 days at 50-56°C to extract Evans blue dye.
Затем ткань ушей удаляли из формамида, промокали для удаления избытка жидкости и взвешивали. Аликвоты по двести микролитров каждого экстракта формамида переносили в 96-луночные планшеты в двух параллелях и затем измеряли их оптическую плотность при 620 нм. Измеренную оптическую плотность преобразовывали в концентрацию красителя Эванса голубого с использованием стандартной кривой и представляли как нг красителя Эванса голубого на мг ткани. Средние значения ± стандартное отклонение приведены в таблице 15 для каждой группы. Разность средних по сравнению с изотипическим контролем рассчитывали с использованием критерия множественных сравнений Бонферрони в GraphPad Prism.The ear tissue was then removed from the formamide, blotted to remove excess liquid, and weighed. Two hundred microliter aliquots of each formamide extract were transferred into 96-well plates in duplicate and then their absorbance was measured at 620 nm. The measured absorbance was converted to Evans blue concentration using a standard curve and reported as ng Evans blue per mg tissue. Means ± standard deviations are shown in Table 15 for each group. Mean differences compared to isotype controls were calculated using Bonferroni's multiple comparisons test in GraphPad Prism.
Как показано в табл. 15, в первом исследовании отдельное антитело к Bet v 1, Н4Н17082Р2, не продемонстрировало значимого снижения экстравазации красителя по сравнению с изотипическим контролем. В отличие от этого в исследовании 2 комбинация двух антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению (Н4Н16992Р и Н4Н17082Р2) и комбинация четырех антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению (Н4Н16992Р, Н4Н17082Р2, Н4Н17038Р2 и Н4Н16987Р) продемонстрировала значимое снижение экстравазации красителя по сравнению с лечением с помощью изотипического контроля, со снижением, составляющим 35,26 и 36,49 нг/мг соответственно. Аналогично, в исследовании 3 комбинация двух антител к Bet v 1 согласно настоящему изобретению (Н4Н16992Р и Н4Н17082Р2) вновь продемонстрировала значимое снижение экстравазации красителя по сравнению с лечением с помощью изотипического контроля со снижением, составляющим 41,09 нг/мг. Как было ранее продемонстрировано в исследовании 1, в исследовании 3 отдельное антитело к Bet v 1, H4H17082P2, не продемонстрировало значимое снижение экстравазации красителя по сравнению с изотипическим контролем. Однако другое отдельное антитело, Н4Н16992Р, продемонстрировало значимое снижение экстравазации красителя по сравнению с изотипическим контролем со снижением, составляющим 25,86 нг/мг. Из проведенных исследований отдельное антитело Н4Н16992Р, комбинация из двух антител Н4Н17082Р2 + Н4Н16992Р, а также комбинация из четырех антител Н4Н17082Р2 + Н4Н16992Р + Н4Н17038Р2 + Н4Н16987Р были способны блокировать дегрануляцию тучных клеток, о чем свидетельствует значимое снижение экстравазации красителя по сравнению с изотипическим контролем в модели пассивной кожной анафилаксии in vivo, как было определено с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Бонферрони. Антитело Н4Н17082Р2 отдельно не могло блокировать дегрануляцию тучных клеток, на что указывает увеличение экстравазации красителя по сравнению с изотипом в двух проведенных исследованиях. Количество мышей, использованных на группу (n), указано в скобках в таблице.As shown in table. 15, in the first study, a single anti-Bet v 1 antibody, H4H17082P2, did not demonstrate a significant reduction in dye extravasation compared with the isotype control. In contrast, in Study 2, the combination of two anti-Bet v 1 antibodies according to the present invention (H4H16992P and H4H17082P2) and the combination of four anti-Bet v 1 antibodies according to the present invention (H4H16992P, H4H17082P2, H4H17038P2 and H4H16987P) showed a significant reduction in dye extravasation compared with treatment with isotype control, with a decrease of 35.26 and 36.49 ng/mg, respectively. Similarly, in Study 3, the combination of two anti-Bet v 1 antibodies of the present invention (H4H16992P and H4H17082P2) again demonstrated a significant reduction in dye extravasation compared to isotype control treatment with a reduction of 41.09 ng/mg. As previously demonstrated in Study 1, in Study 3 a single anti-Bet v 1 antibody, H4H17082P2, did not demonstrate a significant reduction in dye extravasation compared with the isotype control. However, another single antibody, H4H16992P, showed a significant reduction in dye extravasation compared to the isotype control with a reduction of 25.86 ng/mg. From the studies conducted, a single antibody H4H16992P, a combination of two antibodies H4H17082P2 + H4H16992P, and a combination of four antibodies H4H17082P2 + H4H16992P + H4H17038P2 + H4H16987P were able to block mast cell degranulation, as evidenced by a significant decrease in dye extravasation compared to the isotype control in the passive model cutaneous anaphylaxis in vivo as determined by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. Antibody H4H17082P2 alone failed to block mast cell degranulation, as indicated by increased dye extravasation compared with isotype in two studies performed. The number of mice used per group (n) is indicated in parentheses in the table.
- 53 045437- 53 045437
Таблица 15Table 15
Эффект антител к Bet v 1 в модели пассивной кожной анафилаксии in vivoEffect of antibodies to Bet v 1 in an in vivo model of passive cutaneous anaphylaxis
мг/кг - общая концентрация антител, используемая для всех групп лечения с помощью антител.mg/kg is the total antibody concentration used for all antibody treatment groups.
*Р<,05, ***Р<,001, ***Р<,0001 п=число мышей в каждой группе.*P<.05, ***P<.001, ***P<.0001 p=number of mice in each group.
Пример 8. Эффект антител к Bet v 1 по отношению к трем различным экстрактам пыльцы березы в модели пассивной кожной анафилаксии (PCA) in vivo.Example 8: Effect of anti-Bet v 1 antibodies against three different birch pollen extracts in an in vivo model of passive cutaneous anaphylaxis (PCA).
Предусмотренные в настоящем документе антитела к Bet v 1 исследовали в отношении эффективности блокирования индуцированной аллергеном дегрануляции тучных клеток в модели пассивной кожной анафилаксии (РСА) in vivo. Аллерген-специфическую иммунную сыворотку трансдермально вводили с помощью инъекции в локальную область на коже с последующей внутривенной инъекцией антигена вместе с красителем. Аллергический ответ вызывает расширение капилляров и повышенную проницаемость сосудов в месте сенсибилизации, что приводит к преимущественному накоплению красителя в этом месте. Краситель можно экстрагировать из ткани и количественно определить спектрофотометрически. Экстравазацию красителя в ткань, сенсибилизированную исследуемой иммунной сывороткой, можно затем сравнить с экстравазацией в ткань, сенсибилизированную нерелевантной иммунной сывороткой.Anti-Bet v 1 antibodies provided herein were tested for effectiveness in blocking allergen-induced mast cell degranulation in an in vivo model of passive cutaneous anaphylaxis (PCA). Allergen-specific immune serum was administered transdermally by injection into a local area on the skin, followed by intravenous injection of the antigen along with the dye. The allergic response causes dilation of capillaries and increased vascular permeability at the site of sensitization, which leads to the preferential accumulation of dye in this place. The dye can be extracted from the tissue and quantified spectrophotometrically. Extravasation of dye into tissue sensitized with the immune serum of interest can then be compared with extravasation into tissue sensitized with an irrelevant immune serum.
Иммунные сыворотки к природному Bet v 1, экстракту пыльцы березы (ВРЕ) Betula pendula (также известной как Betula verrucosa, BPE Betula nigra и ВРЕ Betula populifolia получали для применения в анализе путем иммунизации мышей Balb/c с помощью 5 мкг природного белка Bet v 1 (Indoor Biotechnologies, № по кат. NA-BV1-1, № партии 36164) или 5 мкг ВРЕ Betula pendula (Stallargenes Greer, № по кат. XP527D3A25, № партии 277329), Betula nigra (Stallargenes Greer № по кат. XP79D3A25, № партии 285077) или Betula populifolia (Stallargenes Greer № по кат. XP80D3A2.5, № партии 273622) в растворе 1 мг/мл квасцов в 1х забуференном фосфатом солевом растворе (PBS) в день 0. Через неделю (день 7) сенсибилизированным мышам вводили бустер-дозу 5 мкг природного белка Bet v 1 или 5 мкг соответствующего ВРЕ (Betula pendula, nigra или populifolia) в растворе 1 мг/мл квасцов в 1 х PBS. Через две недели после бустер-дозы мышей подвергали интраназальной стимуляции через дыхательные пути с помощью 0,5 мкг природного белка Bet v 1 или 0,5 мкг соответствующего экстракта пыльцы березы в 20 мкл 1х PBS в дни 21, 24 и 28. Затем мышей умерщвляли на 31 день и собирали сыворотку. Общую концентрацию IgE в выделенных партиях иммунной сыворотке определяли с использованием набора ELISA OptEIA™ (BD Biosciences, № по кат. 555248) в соответствии с инструкциями производителя. Конечную концентрацию иммунных сывороток Bet v 1 разбавляли до 2500 нг/мл IgE в PBS и конечную концентрацию партий иммунных сывороток экстрактов пыльцы березы разбавляли до 3000 нг/мл для Betula pendula, 1900 нг/мл для Betula nigra и 3700 нг/мл для Betula populifolia.Immune sera to natural Bet v 1, birch pollen extract (BPE) Betula pendula (also known as Betula verrucosa, BPE Betula nigra and BPE Betula populifolia) were prepared for use in the assay by immunizing Balb/c mice with 5 μg of natural Bet v 1 protein (Indoor Biotechnologies, Cat. No. NA-BV1-1, Lot No. 36164) or 5 μg BPE Betula pendula (Stallargenes Greer, Cat. No. XP527D3A25, Lot No. 277329), Betula nigra (Stallargenes Greer Cat. No. XP79D3A25, Lot No. 285077) or Betula populifolia (Stallargenes Greer Cat No. XP80D3A2.5, Lot No. 273622) in a solution of 1 mg/ml alum in 1x phosphate buffered saline (PBS) on day 0. One week later (day 7) in sensitized mice a booster dose of 5 μg of natural protein Bet v 1 or 5 μg of the corresponding BPE (Betula pendula, nigra or populifolia) in a solution of 1 mg/ml alum in 1 x PBS was administered.Two weeks after the boost dose, mice were subjected to intranasal stimulation through the respiratory tract with 0.5 μg of native Bet v 1 protein or 0.5 μg of the corresponding birch pollen extract in 20 μl of 1x PBS on days 21, 24, and 28. Mice were then sacrificed on day 31 and serum was collected. Total IgE concentration in isolated immune serum batches was determined using the OptEIA™ ELISA kit (BD Biosciences, Cat. No. 555248) according to the manufacturer's instructions. The final concentration of Bet v 1 immune sera was diluted to 2500 ng/ml IgE in PBS and the final concentration of birch pollen extract immune sera batches was diluted to 3000 ng/ml for Betula pendula, 1900 ng/ml for Betula nigra and 3700 ng/ml for Betula populifolia .
Иммунные сыворотки, используемые в качестве отрицательного контроля в анализе, получали путем иммунизации мышей Balb/c с помощью 5 мкг природного белка Fel d 1, очищенного из экстракта шерсти кошки (Indoor Biotechnologies, № по кат. LTN-FD1-1, № партии 36099), в растворе 1 мг/мл квас- 54 045437 цов в 1х PBS. Мышам вводили бустер-дозу - 5 мкг белка Fel d 1 с растворе 1 мг/мл квасцов в 1х PBS на и 21 день. Через неделю после последней бустер-дозы (28 день) мышей умерщвляли и собирали сыворотку. Общую концентрацию IgE в выделенной иммунной сыворотке определяли с использованием набора ELISA OptEIA™ (BD Biosciences, № по кат. 555248) в соответствии с инструкциями производителя.Immune sera used as a negative control in the assay were obtained by immunizing Balb/c mice with 5 μg of natural Fel d 1 protein purified from cat hair extract (Indoor Biotechnologies, Cat. No. LTN-FD1-1, Lot No. 36099 ), in a solution of 1 mg/ml alum in 1x PBS. Mice were administered a booster dose of 5 μg of Fel d 1 protein with a solution of 1 mg/ml alum in 1x PBS on and 21 days. One week after the last booster dose (day 28), mice were sacrificed and serum was collected. Total IgE concentration in isolated immune serum was determined using the OptEIA™ ELISA kit (BD Biosciences, Cat. No. 555248) according to the manufacturer's instructions.
Конечную концентрацию иммунных сывороток разбавляли до 4800 нг/мл IgE в PBS.The final concentration of immune sera was diluted to 4800 ng/ml IgE in PBS.
Для анализов РСА группам мышей Balb/c (n>4 на эксперимент, повторяли три раза) сначала подкожно вводили либо антитело изотипического контроля, либо комбинацию двух антител к Bet v 1 в дозе, составляющей 1 мг/кг (общая доза антитела). Через три дня после введения антитела 10 мкл либо 1 нг иммунной сыворотки Bet v 1, либо 25 нг иммунной сыворотки Betula pendula, 25 нг иммунной сыворотки Betula nigra или 25 нг иммунной сыворотки Betula populifolia вводили с помощью инъекции в правое мышей в каждой соответствующей группе. В левые уши вводили 1 нг или 25 нг Fel d 1 (отрицательный контроль) для соответствия концентрации иммунной сыворотки в соответствующем правом ухе. Через двадцать четыре часа после местного введения аллерген-специфических иммунных сывороток мышей подвергали стимуляции путем внутривенной инъекции (100 мкл на мышь) раствора 1 мкг/мл природного Bet v 1 (№ по кат. NA-BV1-1, № партии 36164) или 1 мкг/мл соответствующего ВРЕ (Stallargenes Greer, № по кат. XP527D3A25, № партии 277329, № по кат. XP79D3A25, № партии 285077 и № по кат. XP80D3A2.5, № партии 273622), растворенных в 1х PBS, содержащего 0,5% (мас./об.) красителя Эванса голубого (Sigma Aldrich, № по кат. Е2129). Через один час после стимуляции антигеном мышей умерщвляли, их уши отрезали, помещали в 1 мл формамида и затем инкубировали в течение 3 дней при 50°C для экстракции красителя Эванса голубого. Затем ткань ушей удаляли из формамида, промокали для удаления избытка жидкости и взвешивали. Аликвоты по двести микролитров каждого экстракта формамида переносили в 96-луночные планшеты в двух параллелях. Измеряли оптическую плотность полученных супернатантов при 620 нм. Измеренную оптическую плотность преобразовывали в концентрацию красителя Эванса голубого с использованием стандартной кривой и представляли как нг красителя Эванса голубого на мг ткани уха. Средние значения ± стандартное отклонение приведены в табл. 16 для каждой группы. Разность средних по сравнению с изотипическим контролем рассчитывали с использованием критерия множественных сравнений Бонферрони в GraphPad Prism.For PCA assays, groups of Balb/c mice (n>4 per experiment, repeated three times) were first subcutaneously injected with either an isotype control antibody or a combination of two anti-Bet v 1 antibodies at a dose of 1 mg/kg (total antibody dose). Three days after antibody administration, 10 μl of either 1 ng Bet v 1 immune serum, 25 ng Betula pendula immune serum, 25 ng Betula nigra immune serum, or 25 ng Betula populifolia immune serum was injected into the right of mice in each respective group. The left ears were injected with 1 ng or 25 ng Fel d 1 (negative control) to match the immune serum concentration in the corresponding right ear. Twenty-four hours after local administration of allergen-specific immune sera, mice were challenged by intravenous injection (100 μl per mouse) of a 1 μg/ml solution of natural Bet v 1 (cat. no. NA-BV1-1, lot no. 36164) or 1 µg/ml of the corresponding BPE (Stallargenes Greer, Cat. No. XP527D3A25, Lot No. 277329, Cat. No. XP79D3A25, Lot No. 285077 and Cat. No. XP80D3A2.5, Lot No. 273622) dissolved in 1x PBS containing 0. 5% (w/v) Evans blue dye (Sigma Aldrich, cat. no. E2129). One hour after antigen stimulation, mice were sacrificed, their ears were cut off, placed in 1 ml of formamide and then incubated for 3 days at 50°C to extract Evans blue dye. The ear tissue was then removed from the formamide, blotted to remove excess liquid, and weighed. Two hundred microliter aliquots of each formamide extract were transferred into 96-well plates in duplicate. The optical density of the resulting supernatants was measured at 620 nm. The measured absorbance was converted to Evans blue concentration using a standard curve and reported as ng Evans blue per mg ear tissue. Mean values ± standard deviation are given in table. 16 for each group. Mean differences compared to isotype controls were calculated using Bonferroni's multiple comparisons test in GraphPad Prism.
В табл. 16 продемонстрирована эффективность комбинации двух антител к Bet v 1, H4H16992P и Н4Н17082Р2, на что указывает значимое снижение экстравазации красителя по сравнению с изотипическим контролем во всех исследованных группах. Как показано, комбинация из двух моноклональных антител к Bet v 1, Н4Н17082Р2/Н4Н16992Р, блокирует дегрануляцию тучных клеток в модели пассивной кожной анафилаксии in vivo в ответ на сенсибилизацию и последующую стимуляцию с помощью природного Bet v 1 по сравнению с изотипическим контролем, демонстрируя значимое снижение экстравазации красителя, составляющее 88,34. Аналогично, снижение экстравазации красителя также наблюдается в группе, получившей лечение с помощью Н4Н17082Р2/Н4Н16992Р для всех трех экстрактов пыльцы березы по сравнению с соответствующими группами изотипического контроля со статистически значимыми снижениями, составляющими 62,52 для Betula pendula, 71,19 для Betula nigra и 91,47 для Betula populifolia. Разность средних по сравнению с изотипическим контролем рассчитывали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Бонферрони. Количество мышей, использованных на группу (n), указано в скобках в таблицах.In table 16 demonstrates the effectiveness of the combination of two antibodies to Bet v 1, H4H16992P and H4H17082P2, as indicated by a significant decrease in dye extravasation compared to the isotype control in all studied groups. As shown, a combination of two monoclonal antibodies to Bet v 1, H4H17082P2/H4H16992P, blocks mast cell degranulation in an in vivo model of passive cutaneous anaphylaxis in response to sensitization and subsequent stimulation with natural Bet v 1 compared to isotype control, demonstrating a significant reduction extravasation of dye, amounting to 88.34. Similarly, a decrease in dye extravasation was also observed in the H4H17082P2/H4H16992P treated group for all three birch pollen extracts compared to the corresponding isotype control groups with statistically significant reductions of 62.52 for Betula pendula, 71.19 for Betula nigra and 91.47 for Betula populifolia. The difference in means compared to the isotype control was calculated using two-way analysis of variance with Bonferroni's post hoc test. The number of mice used per group (n) is indicated in parentheses in the tables.
- 55 045437- 55 045437
Таблица 16Table 16
Эффект антител к Bet v 1 в модели пассивной кожной анафилаксии (РСА) in vivoEffect of antibodies to Bet v 1 in a model of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in vivo
мг/кг - общая концентрация антител, используемая для всех групп лечения с помощью антитела. *Р<,05, ***Р<,001, ***Р<,0001 п=число мышей на группу.mg/kg is the total antibody concentration used for all antibody treatment groups. *P<.05, ***P<.001, ***P<.0001 n=number of mice per group.
Пример 9. Перекрестная конкуренция между моноклональными антителами к Bet v 1.Example 9. Cross competition between monoclonal antibodies to Bet v 1.
Конкуренцию связывания в пределах панели различных моноклональных антител к Bet v 1 определяли с использованием анализа интерферометрии биослоя без меток в реальном времени на биосенсорной платформе Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Весь эксперимент проводили при 25°C в буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, 1 мг/мл BSA, рН 7,4 (HBS-EBT) со встряхиванием планшета со скоростью, составляющей 1000 об/мин. Для оценки того, способны ли два антитела конкурировать друг с другом за связывание с их соответствующими эпитопами на рекомбинантном мутантном Bet v 1, экспрессированном с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (мутантный Bet v 1-ММН; SEQ ID NO: 312), приблизительно ~0,21 нМ мутантного Bet v 1-MMH вначале захватывали на наконечниках биосенсора Octet, покрытых антителами к пентагистидиновой метке (Fortebio Inc, № по кат. 18-5122) путем погружения наконечников биосенсора в течение 90 с в лунки, содержащие 5 мкг/мл раствора мутантного Bet v 1-ММН. Наконечники биосенсора с захваченным антигеном затем насыщали первым моноклональным антителом к Bet v 1 (которое затем называют mAb-1) путем погружения в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора mAb-1, в течение 4 мин. Затем наконечники биосенсора последовательно погружали в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора второго моноклонального антитела к Bet v 1 (которое затем называют mAb-2) на 3 мин. Наконечники биосенсора промывали в буфере HBS-EBT между каждой стадией эксперимента. Ответ связывания в режиме реального времени подвергали мониторингу в течение всего эксперимента и регистрировали ответ связывания в конце каждой стадии. Ответ связывания mAb-2 с мутантным Bet v 1-ММН, предварительно образовавшим комплекс с mAb-1, сравнивали и определяли конкурентное/неконкурентное поведение различных моноклональных антител к Bet v 1, как показано в табл. 17.Binding competition within a panel of different anti-Bet v 1 mAbs was determined using real-time label-free biolayer interferometry analysis on the Octet HTX biosensor platform (Pall ForteBio Corp.). The entire experiment was performed at 25°C in a buffer containing 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% v/v. surfactant Tween-20, 1 mg/ml BSA, pH 7.4 (HBS-EBT) with shaking the plate at a speed of 1000 rpm. To assess whether two antibodies are able to compete with each other for binding to their respective epitopes on a recombinant mutant Bet v 1 expressed with a C-terminal myc-myc-hexahistidine tag (mutant Bet v 1-MMH; SEQ ID NO: 312) , approximately ∼0.21 nM mutant Bet v 1-MMH was first captured on Octet biosensor tips coated with anti-pentahistidine tag antibodies (Fortebio Inc, cat. no. 18-5122) by dipping the biosensor tips for 90 s into wells containing 5 µg/ml solution of mutant Bet v 1-MMN. The antigen-captured biosensor tips were then saturated with the first monoclonal antibody to Bet v 1 (then called mAb-1) by dipping into wells containing 50 μg/mL mAb-1 solution for 4 min. The biosensor tips were then sequentially immersed into wells containing a 50 μg/mL solution of a second monoclonal antibody to Bet v 1 (then called mAb-2) for 3 min. The biosensor tips were washed in HBS-EBT buffer between each experimental step. The binding response was monitored in real time throughout the experiment and the binding response was recorded at the end of each step. The binding response of mAb-2 to mutant Bet v 1-MMN, which had previously formed a complex with mAb-1, was compared and the competitive/non-competitive behavior of various monoclonal antibodies to Bet v 1 was determined, as shown in table. 17.
Три из 20 моноклональных антител к Bet v 1 не связывались с мутантным Bet v 1-MMH и данные в отношении перекрестной конкуренции были признаны неубедительными.Three of 20 monoclonal antibodies to Bet v 1 did not bind to mutant Bet v 1-MMH and the cross-competition data were considered inconclusive.
- 56 045437- 56 045437
Таблица 17Table 17
Перекрестная конкуренция между моноклональными антителами к Bet v 1 mAb-1 mAb-2, которое конкурирует с mAb-1Cross competition between monoclonal antibodies to Bet v 1 mAb-1 mAb-2, which competes with mAb-1
- 57 045437- 57 045437
- 58 045437- 58 045437
*IC указывает на то, что моноклональные антитела к Bet v 1 не связывались с мутантным Bet v 1MMH, и данные в отношении перекрестной конкуренции были признаны неубедительными.*IC indicates that monoclonal antibodies to Bet v 1 did not bind to the Bet v 1MMH mutant and the cross-competition data were considered inconclusive.
Пример 10. Способность комбинаций антител к Bet v 1 блокировать дегрануляцию тучных клеток, индуцированную Bet v 1 в модели РСА у гуманизированных мышей.Example 10. The ability of combinations of antibodies to Bet v 1 to block mast cell degranulation induced by Bet v 1 in a humanized mouse model of RSA.
Для изучения поликлональности ответа аллерген-специфического IgE у людей с аллергией на березу использовали модель гуманизированной в отношении FcεR1α мыши для облегчения связывания IgE человека с FcεR1α на поверхности тучных клеток мыши. Поскольку IgE человека не может связываться с мышиным FcεR1α, создали генетически модифицированную мышь, где эндогенный мышиный FcεR1α заменили соответствующей последовательностью FcεR1α человека и обозначили как FcεR1αhu/hu. Мышей FcεR1αhu/hu валидировали для использования в этой модели, демонстрируя поверхностную экспрессию FccR1a человека и способность отвечать на активацию аллерген:IgE в модели пассивной кожной анафилаксии (РСА) способом, сравнимым с мышами дикого типа. Эта модель РСА включает в себя интрадермальную инъекцию аллерген-специфических сывороток человека в локальную область на коже с последующей внутривенной инъекцией релевантного аллергена вместе с красителем. Аллергический ответ вызывает расширение капилляров и повышенную проницаемость сосудов в месте сенсибилизации, что приводит к преимущественному накоплению красителя в этом месте. Краситель можно экстрагировать из ткани и количественно определить спектрофотометрически. Экстравазацию красителя в ткани, сенсибилизированной исследуемой иммунной сывороткой, сравнивают с экстравазацией в ткани, сенсибилизированной не аллерген-специфическими сыворотками человека.To study the polyclonality of the allergen-specific IgE response in humans with birch allergy, an FcεR1α humanized mouse model was used to facilitate binding of human IgE to FcεR1α on the surface of mouse mast cells. Since human IgE cannot bind to murine FcεR1α, a genetically modified mouse was created where the endogenous murine FcεR1α was replaced with the corresponding human FcεR1α sequence and designated FcεR1α hu/hu . FcεR1α hu/hu mice were validated for use in this model, demonstrating surface expression of human FccR1a and the ability to respond to allergen:IgE activation in a passive cutaneous anaphylaxis (PCA) model in a manner comparable to wild-type mice. This RSA model involves intradermal injection of allergen-specific human serums into a local area on the skin, followed by intravenous injection of the relevant allergen along with a dye. The allergic response causes dilation of capillaries and increased vascular permeability at the site of sensitization, which leads to the preferential accumulation of dye in this place. The dye can be extracted from the tissue and quantified spectrophotometrically. Dye extravasation in tissue sensitized with the test immune serum is compared with extravasation in tissue sensitized with non-allergen-specific human sera.
Способы.Ways.
Для определения влияния антител к Bet v 1 на дегрануляцию тучных клеток в этой модели, гуманизированные в отношении FcεR1α мыши получали подкожную инъекцию изотипического контрольного антитела или комбинации антител к Bet v 1 в день 1. Для каждого донора-человека проводили два независимых эксперимента, n=5 мышей на группу с объединенными данными. Группы состояли из следующего: не включающий в себя моноклональное антитело отрицательный контроль, отрицательный изотипический контроль, группа лечения двумя антителами к Bet v 1 REGN5713+REGN5715 и группа лечения тремя антителами к Bet v 1 REGN5713+REGN5714+REGN5715. Общая концентрация или концентрация комбинированных антител составляла 1 мг/кг или концентрация антитела изотипического контроля IgG4 (антитело к IL6R2 в качестве отрицательного изотипического контроля). Три дня спустя сыворотку от пациентов с аллергией на березу или сыворотку от пациентов без аллергии на березу (отрицательный контроль) вводили интрадермально (ID) в правое и левое уши, соответственно, позволяя аллергенспецифическому IgE связываться с FcεRI на тучных клетках. Чтобы гарантировать, что в эксперименте использовалось одинаковое количество аллерген-специфического IgE от каждого донора, каждую инъекцию иммунной сыворотки нормализовали по концентрации Bet v 1-специфического IgE ImmunoCAP®, составляющей 10 кЕа/л.To determine the effect of anti-Bet v 1 antibodies on mast cell degranulation in this model, FcεR1α humanized mice received a subcutaneous injection of an isotype control antibody or a combination of anti-Bet v 1 antibodies on day 1. Two independent experiments were performed for each human donor, n= 5 mice per group with pooled data. The groups consisted of the following: no monoclonal antibody negative control, negative isotype control, two Bet v 1 antibody treatment group REGN5713+REGN5715 and a three Bet v 1 antibody treatment group REGN5713+REGN5714+REGN5715. The total or combined antibody concentration was 1 mg/kg or the IgG4 isotype control antibody concentration (anti-IL6R2 antibody as a negative isotype control). Three days later, serum from patients with birch allergy or serum from patients without birch allergy (negative control) was injected intradermally (ID) into the right and left ears, respectively, allowing allergen-specific IgE to bind to FcεRI on mast cells. To ensure that the experiment used the same amount of allergen-specific IgE from each donor, each immune serum injection was normalized to the ImmunoCAP® Bet v 1-specific IgE concentration of 10 kU a /L.
- 59 045437- 59 045437
[Через двадцать четыре часа после местного введения аллерген-специфических антител мышей стимулировали с помощью внутривенной инъекции 1 мкг Bet v 1, разведенного в PBS, содержащем 0,5% красителя Эванса голубого. Через час после стимуляции аллергеном мышей умерщвляли. Краситель Эванса голубой экстрагировали из ушной ткани и количественно определяли спектрофотометрически с использованием стандартной кривой. (См. диаграмму используемого протокола на фиг. 6). Снижение экстравазации красителя Эванса голубого рассчитывали в среднем путем вычитания концентрации красителя Эванса голубого (нормализованной по массе ткани уха) для уха, в которое вводили сыворотку, специфическую в отношении аллергена березы, в получавшей лечение с помощью антител группе, B(mAb, i), из группы, получавшей лечение с помощью антитела изотипического контроля, В (изотип, среднее). Затем это число разделили на разницу между В(изотип, среднее) и концентрацией красителя для уха, в которое вводили не специфическую в отношении аллергена сыворотку, в получавшей лечение с помощью антител группе [N(mAb, i)], и умножали на 100 с получением общего среднего процентного снижения экстравазации красителя (% снижения). Уравнение показано ниже:[Twenty-four hours after topical administration of allergen-specific antibodies, mice were stimulated with an intravenous injection of 1 μg of Bet v 1 diluted in PBS containing 0.5% Evans blue dye. One hour after allergen stimulation, mice were sacrificed. Evans blue dye was extracted from ear tissue and quantified spectrophotometrically using a standard curve. (See Figure 6 for a diagram of the protocol used.) The reduction in Evans Blue extravasation was calculated on average by subtracting the Evans Blue concentration (normalized to ear tissue mass) for the birch allergen-specific serum-treated ear in the antibody-treated group, B(mAb, i), from the group treated with isotype control antibody, B (isotype, mean). This number was then divided by the difference between B(isotype, mean) and the concentration of ear dye injected with non-allergen-specific serum in the antibody-treated group [N(mAb, i)], and multiplied by 100 s obtaining an overall average percentage reduction in dye extravasation (% reduction). The equation is shown below:
.% снижения (среднее) = 100* [В(изотип, среднее) - В(шАЬ, 1)]/[В(изотип, среднее) N(mAb, i)].% reduction (average) = 100* [B(isotype, average) - B(mAb, 1)]/[B(isotype, average) N(mAb, i)]
Увеличение % снижения в утечке красителя в получившей лечение с помощью антитела к Bet v 1 группе по сравнению с группой отрицательного изотипического контроля представляет собой меру эффективности антитела к Bet v 1 или комбинаций антител в блокировании дегрануляции тучных клеток.The increase in % reduction in dye leakage in the anti-Bet v 1 antibody-treated group compared with the negative isotype control group is a measure of the effectiveness of the anti-Bet v 1 antibody or combinations of antibodies in blocking mast cell degranulation.
Результаты.Results.
В этой модели комбинированное использование антител к Bet v 1, обозначенных Н4Н16992Р (также обозначаемое как REGN5713), Н4Н17038Р2 (также обозначаемое как REGN5714) и Н4Н17082Р2 (также обозначаемое как REGN5715), продемонстрировало максимальное блокирование опосредованного IgE ответа при использовании сывороток, содержащих IgE, от 3/3 доноров с аллергией на березу (см. фиг. 7). Использование сывороток от донора с аллергией на березу 25609, Н4Н16992Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н17082Р2 в комбинации показало 95% блокаду дегрануляции тучных клеток по сравнению с изотипическим контролем (различие средних -42,04 +/-6,9 (р <0,0001)) и комбинированное использование Н4Н16992Р и Н4Н17082Р2 показало 93% блокаду дегрануляции тучных клеток по сравнению с изотипическим контролем (различие средних -41,74 +/-3,7 (р<0,0001)). Использование сывороток от донора с аллергией на березу 23658, Н4Н16992Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н17082Р2 в комбинации показало 90% блокаду дегрануляции тучных клеток по сравнению с изотипическим контролем (различие средних -53,67 +/7,1 (р<0,0001)) и Н4Н16992Р в комбинации с Н4Н17082Р2 показало 74% блокаду дегрануляции тучных клеток по сравнению с изотипическим контролем (различие средних -44,58 +/-11,4 (р<0,0001)). В итоге, использование сывороток от донора с аллергией на березу 25414, Н4Н16992Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н17082Р2 в комбинации показало 92% блокаду дегрануляции тучных клеток по сравнению с изотипическим контролем (различие средних -39,72 +/-7,5 (р<0,0001)) и Н4Н16992Р в комбинации с Н4Н17082Р2 показало 80% блокаду дегрануляции тучных клеток по сравнению с изотипическим контролем (различие средних -34,27 +/-7,8 (р<0,0001)).In this model, the combined use of antibodies to Bet v 1, designated H4H16992P (also designated REGN5713), H4H17038P2 (also designated REGN5714), and H4H17082P2 (also designated REGN5715), demonstrated maximal blocking of the IgE-mediated response when using sera containing IgE against 3/3 of donors are allergic to birch (see Fig. 7). The use of sera from a donor with an allergy to birch 25609, H4H16992R, H4H17038R2 and H4H17082R2 in combination showed a 95% blockade of mast cell degranulation compared to the isotype control (mean difference -42.04 +/-6.9 (p <0.0001)) and the combined use of H4H16992P and H4H17082P2 showed a 93% block of mast cell degranulation compared with isotype control (mean difference -41.74 +/-3.7 (p < 0.0001)). The use of sera from a donor with an allergy to birch 23658, H4H16992R, H4H17038R2 and H4H17082R2 in combination showed a 90% blockade of mast cell degranulation compared to the isotype control (mean difference -53.67 +/7.1 (p <0.0001)) and H4H16992P in combination with H4H17082P2 showed a 74% blockade of mast cell degranulation compared to isotype control (mean difference -44.58 +/-11.4 (p < 0.0001)). As a result, the use of sera from a donor with an allergy to birch 25414, H4H16992R, H4H17038R2 and H4H17082R2 in combination showed a 92% blockade of mast cell degranulation compared to the isotype control (mean difference -39.72 +/-7.5 (p < 0. 0001)) and H4H16992P in combination with H4H17082P2 showed an 80% blockade of mast cell degranulation compared to the isotype control (mean difference -34.27 +/-7.8 (p < 0.0001)).
Пример 11. Способность комбинаций антител к Bet v 1 блокировать активацию базофилов в анализе фосфоресцентной проточной цитометрии с использованием фосфо-Erk.Example 11: Ability of anti-Bet v 1 antibody combinations to block basophil activation in a phosphorescence flow cytometry assay using phospho-Erk.
Ответ IgE человека исследовали путем испытания эффекта различных комбинаций антител к Bet v 1 H4H16992P (также обозначаемое как REGN5713), Н4Н17038Р2 (также обозначаемое как REGN5714) и Н4Н17082Р2 (также обозначаемое как REGN5715) на ингибирование активации базофилов с использованием образцов от 8 индивидуумов с аллергией на березу. Более конкретно, для оценки связывания с FcsR и активации базофилы исследовали в функциональном анализе на основе фосфоресцентной проточной цитометрии, в котором измеряют фосфорилирование киназы ERK, приближенного показателя активации базофилов и дегрануляции (Liu, Y. et al. (2007), J Exp Med 204, 93-103.The human IgE response was examined by testing the effect of various combinations of anti-Bet v 1 antibodies H4H16992P (also referred to as REGN5713), H4H17038P2 (also referred to as REGN5714) and H4H17082P2 (also referred to as REGN5715) on inhibition of basophil activation using samples from 8 individuals allergic to birch More specifically, to assess FcsR binding and activation, basophils were examined in a phosphorescence flow cytometry-based functional assay that measures phosphorylation of ERK kinase, a proxy for basophil activation and degranulation (Liu, Y. et al. (2007), J Exp Med 204 , 93-103.
Способы.Ways.
Производили забор крови у пациентов с аллергией на березу (n=8) и РВМС выделяли центрифугированием с плотностью на слое фиколла, отмывали, ресуспендировали и высевали в виде отдельных точек в 96-луночном формате. Параллельно готовили планшет 2-кратной стимуляции, который включал в себя эффект дозы очищенного Bet v 1, а также эффекты доз антител к Bet v 1 и комбинаций антител (2,56 пМ-200 нМ), смешанных с постоянной дозой (конечная концентрация 100 пМ) очищенного природного Bet v 1. Клетки стимулировали и затем окрашивали коктейлем антител, содержащим антитела pErk-Alexa 488, CD123-BUV395 и HLA-DR-APC. После окрашивания данные получали с использованием инструмента LSR-Fortessa и проанализировали путем расчета MFI окрашивания фосфорилированного Erk в пределах гейта базофилов. Процент максимального ингибирования рассчитывали как: 100-((100х максимальный ответ антитела)/ответ изотипа). Максимальным ответом антитела являлась средняя медианная интенсивность флуоресценции (MFI) фосфорилированного Erk в трех верхних дозах антитела на кривой зависимости ответа от дозы (плато кривой) минус исходное значение MFI (средняя для нестимулированных образцов в параллелях), а ответ изотипа представляет собой среднее всех значений MFI в эффекте дозы антитело изотипического контроля, производимого Regeneron (REGN1945 антитело к Fel d 1 IgG4P)Blood was collected from patients with birch allergy (n=8) and PBMCs were isolated by density centrifugation on a Ficoll layer, washed, resuspended and seeded as individual spots in a 96-well format. A 2-fold stimulation plate was prepared in parallel, which included the dose effect of purified Bet v 1, as well as the effects of doses of anti-Bet v 1 antibodies and combinations of antibodies (2.56 pM-200 nM) mixed with a constant dose (final concentration 100 pM ) purified natural Bet v 1. Cells were stimulated and then stained with an antibody cocktail containing pErk-Alexa 488, CD123-BUV395 and HLA-DR-APC antibodies. After staining, data were acquired using the LSR-Fortessa instrument and analyzed by calculating the MFI of phosphorylated Erk staining within the basophil gate. The percentage of maximum inhibition was calculated as: 100-((100x maximum antibody response)/isotype response). The maximum antibody response was the average median fluorescence intensity (MFI) of phosphorylated Erk at the top three antibody doses on the dose response curve (plateau of the curve) minus the baseline MFI value (average of unstimulated samples in parallel), and the isotype response was the average of all MFI values in a dose response isotype control antibody produced by Regeneron (REGN1945 anti-Fel d 1 IgG4 P antibody)
- 60 045437 минус исходное значение MFI.- 60 045437 minus the original MFI value.
Результаты.Results.
Базофилы от всех 8 индивидуумов с аллергией на пыльцу березы ответили на стимуляцию Bet v 1 с различной интенсивностью. См. фиг. 8. Н4Н16992Р, Н4Н17038Р2 и Н4Н17082Р2 ингибировали по меньшей мере 70% активации базофилов у 8/8 доноров, тогда как комбинация Н4Н16992Р с Н4Н17082Р2 достигала такой же величины ингибирования у 6/8 доноров. Примечательно, что отдельные антитела при испытании отдельно демонстрировали высокую степень вариабельности в способности влиять на связывание аллергена с IgE. H4H16992P достигало >70% блокады у 3/8 доноров, а Н4Н17082Р2 достигало 70% блокады активации базофилов у 4/8 доноров. Н4Н17038Р2 продемонстрировало 70% блокирование только у 1/8 исследованных доноров.Basophils from all 8 individuals with birch pollen allergy responded to Bet v 1 stimulation with varying intensities. See fig. 8. H4H16992P, H4H17038P2 and H4H17082P2 inhibited at least 70% of basophil activation in 8/8 donors, while the combination of H4H16992P with H4H17082P2 achieved the same amount of inhibition in 6/8 donors. Notably, individual antibodies, when tested separately, showed a high degree of variability in their ability to influence allergen binding to IgE. H4H16992P achieved >70% blockade in 3/8 donors, and H4H17082P2 achieved 70% blockade of basophil activation in 4/8 donors. H4H17038P2 demonstrated 70% blocking in only 1/8 of the donors tested.
Пример 12. Определение одновременного связывания трех моноклональных антител к Bet v 1 с природным Bet v 1.Example 12. Determination of simultaneous binding of three monoclonal antibodies to Bet v 1 with natural Bet v 1.
Этот эксперимент проводили, чтобы убедиться, что эпитопы связывания трех выбранных моноклональных антител к Bet v 1 являлись уникальными и что независимо от порядка связывания моноклональных антител стерическое препятствие не проявлялось при одновременном связывании трех антител. Кроме того, оценивали зависимую от порядка конкуренцию между тремя моноклональными антителами к Bet v 1.This experiment was performed to ensure that the binding epitopes of the three selected anti-Bet v 1 monoclonal antibodies were unique and that, regardless of the order of binding of the monoclonal antibodies, steric hindrance did not occur when the three antibodies were bound simultaneously. In addition, order-dependent competition between three anti-Bet v 1 monoclonal antibodies was assessed.
Одновременное связывание трех моноклональных антител к Bet v 1 с одним и тем же Bet v 1 определяли с использованием биосенсорной платформы Biacore 3000 на основе поверхностного плазмонного резонанса без меток в режиме реального времени (GE Healthcare). Весь эксперимент проводили при 25°C в рабочем буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностноактивного вещества Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET). Антитела иммобилизовали на разных поверхностях сенсора СМ5 с использованием химии EDC/NHS для достижения уровней иммобилизации, составляющих 5000-13000 РЕ. REGN1945 (моноклональное антитело к Fel d 1) также иммобилизовали в качестве отрицательного контроля. Природный Bet v 1 (nBet v 1), 10 нМ или 20 нМ, вводили поверх различных поверхностей сенсора, иммобилизованных моноклональными антителами к Bet v 1, в течение 10-12 секунд с последующим последовательным введением различных моноклональных антител к Bet v 1 в течение 6 мин при скорости потока, составляющей 15 мкл/мин.Simultaneous binding of three anti-Bet v 1 monoclonal antibodies to the same Bet v 1 was determined using the Biacore 3000 real-time label-free surface plasmon resonance biosensing platform (GE Healthcare). The entire experiment was performed at 25°C in a running buffer containing 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% v/v. surfactant Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET). Antibodies were immobilized on different surfaces of the CM5 sensor using EDC/NHS chemistry to achieve immobilization levels of 5000-13000 RU. REGN1945 (monoclonal antibody against Fel d 1) was also immobilized as a negative control. Natural Bet v 1 (nBet v 1), 10 nM or 20 nM, was injected on top of various sensor surfaces immobilized with monoclonal antibodies to Bet v 1 for 10-12 seconds, followed by sequential injection of different monoclonal antibodies to Bet v 1 for 6 min at a flow rate of 15 µl/min.
Связывание различных моноклональных антител к Bet v 1 с nBet v 1, связанным с поверхностью сенсора, иммобилизованной моноклональным антителом, измеряли с использованием Scrubber 2.0с. Результаты показаны в табл. 18. Сигнал связывания менее 1 РЕ (RU, резонансная единица) указывает на то, что связывание не наблюдалось при введении моноклонального антитела к Bet v 1, в то время как более высокий сигнал связывания (более 2 РЕ) представляет отсутствие конкуренции. Все три моноклональных антитела к Bet v 1, включенные в этот пример, были способны одновременно связываться с nBet v 1, и на реакцию связывания не влиял порядок, в котором добавляли антитела.The binding of various anti-Bet v 1 monoclonal antibodies to nBet v 1 bound to the monoclonal antibody-immobilized sensor surface was measured using Scrubber 2.0c. The results are shown in table. 18. A binding signal of less than 1 RU (RU, resonance unit) indicates that no binding was observed upon administration of the anti-Bet v 1 monoclonal antibody, while a higher binding signal (greater than 2 RU) represents no competition. All three anti-Bet v 1 monoclonal antibodies included in this example were able to bind nBet v 1 simultaneously, and the binding reaction was not affected by the order in which the antibodies were added.
--
Claims (41)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/513,872 | 2017-06-01 | ||
US62/571,696 | 2017-10-12 | ||
US62/662,165 | 2018-04-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045437B1 true EA045437B1 (en) | 2023-11-24 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6603269B2 (en) | Human antibody against Fel d1 and method of use thereof | |
CA2695997C (en) | High affinity human antibodies to human nerve growth factor | |
JP2024040526A (en) | High affinity human antibodies to human il-4 receptor | |
JP7458453B2 (en) | Human antibodies against BET V 1 and methods of use thereof | |
US20230203141A1 (en) | Methods of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies | |
EA045437B1 (en) | HUMAN ANTIBODIES TO BET V 1 AND METHODS OF THEIR APPLICATION | |
BR122022004090B1 (en) | PHARMACEUTICAL COMPOSITION, AND, USE OF THE PHARMACEUTICAL COMPOSITION |