EA045330B1 - COMBINATION THERAPY INCLUDING A KRASG12C INHIBITOR AND ONE OR MORE ADDITIONAL PHARMACEUTICALLY ACTIVE AGENTS FOR THE TREATMENT OF CANCER - Google Patents

COMBINATION THERAPY INCLUDING A KRASG12C INHIBITOR AND ONE OR MORE ADDITIONAL PHARMACEUTICALLY ACTIVE AGENTS FOR THE TREATMENT OF CANCER Download PDF

Info

Publication number
EA045330B1
EA045330B1 EA202191415 EA045330B1 EA 045330 B1 EA045330 B1 EA 045330B1 EA 202191415 EA202191415 EA 202191415 EA 045330 B1 EA045330 B1 EA 045330B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
inhibitor
cancer
antibody
kras
pharmaceutically active
Prior art date
Application number
EA202191415
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Джеймс Расселл Липфорд
Джуд Роберт Кэнон
Анн Й. Саики
Карен Луиз Рекс
Original Assignee
Эмджен Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эмджен Инк. filed Critical Эмджен Инк.
Publication of EA045330B1 publication Critical patent/EA045330B1/en

Links

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications

Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество на основании предварительной заявки на патент США № 62/865819, поданной 24 июня 2019 года, предварительной заявки на патент США № 62/821376, поданной 20 марта 2019 года, и предварительной заявки на патент США № 62/769355, поданной 19 ноября 2018 года, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в их полных объемах для всех целей.This application claims priority and benefit from U.S. Provisional Patent Application No. 62/865819, filed June 24, 2019, U.S. Provisional Patent Application No. 62/821376, filed March 20, 2019, and U.S. Provisional Patent Application No. 62/769355. , filed November 19, 2018, all of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

Перечни последовательностейSequence listings

Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в электронной форме. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием А-2326-US-NP_SeqList_102919_ST25.txt, созданного 29 октября 2019 года, размер которого составляет 15,4 КБ. Информация о перечне последовательностей в электронной форме включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.This application is submitted together with a sequence listing in electronic form. The sequence listing is presented as a file called A-2326-US-NP_SeqList_102919_ST25.txt, created on October 29, 2019, which is 15.4 KB in size. The electronic sequence listing information is incorporated herein by reference in its entirety.

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

В настоящем изобретении предусмотрена комбинированная терапия, которая включает ингибитор KRAS и одно или несколько дополнительных фармацевтически активных средств, в частности, для лечения видов рака. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат ингибитор KRAS и одно или несколько дополнительных фармацевтически активных средств, для лечения видов рака.The present invention provides a combination therapy that includes a KRAS inhibitor and one or more additional pharmaceutically active agents, particularly for the treatment of cancers. The present invention also relates to pharmaceutical compositions that contain a KRAS inhibitor and one or more additional pharmaceutically active agents for the treatment of cancers.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Мутации гена KRAS распространены при раке поджелудочной железы, аденокарциноме легкого, колоректальном раке, раке желчного пузыря, раке щитовидной железы и раке желчных протоков. Мутации KRAS также наблюдаются у приблизительно 25% пациентов с NSCLC, и некоторые исследования указывают на то, что мутации KRAS являются негативным прогностическим фактором у пациентов с NSCLC. Недавно было обнаружено, что мутации гомолога вирусного онкогена V-Ki-ras2 саркомы крыс Кирстен (KRAS) придают устойчивость к видам терапии, целенаправленно воздействующим на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), при колоректальном раке; соответственно, мутационный статус KRAS может предоставлять важную информацию перед назначением терапии с использованием TKI. В совокупности, в медицине существует необходимость в новых способах лечения пациентов с раком поджелудочной железы, аденокарциномой легкого или колоректальным раком, особенно для тех, у кого были диагностированы такие виды рака, характеризующиеся мутацией KRAS, и в том числе для тех, у кого наблюдалось прогрессирование после химиотерапии. Онкогенные мутации KRAS по остаткам G12, G13 и Q61 представляют собой наиболее распространенные мутации RAS, обнаруженные в солидных злокачественных опухолях. Недавно было продемонстрировано, что на KRASG12C можно нацеливать ковалентные низкомолекулярные ингибиторы, которые вступают в реакцию с мутантным цистеином, прилегающим к карману связывания II (SIIP), блокируя KRAS в его неактивном состоянии, связанном с GDP.KRAS gene mutations are common in pancreatic cancer, lung adenocarcinoma, colorectal cancer, gallbladder cancer, thyroid cancer, and bile duct cancer. KRAS mutations are also observed in approximately 25% of patients with NSCLC, and some studies indicate that KRAS mutations are a negative prognostic factor in patients with NSCLC. Recently, mutations in the Kirsten rat sarcoma viral oncogene V-Ki-ras2 homolog (KRAS) homolog were found to confer resistance to epidermal growth factor receptor (EGFR)-targeting therapies in colorectal cancer; accordingly, KRAS mutational status may provide important information before initiating TKI therapy. Taken together, there is a medical need for new ways to treat patients with pancreatic cancer, lung adenocarcinoma or colorectal cancer, especially for those who have been diagnosed with such cancers characterized by a KRAS mutation, including those who have progressed after chemotherapy. Oncogenic KRAS mutations at residues G12, G13, and Q61 are the most common RAS mutations found in solid malignancies. Recently, it was demonstrated that KRAS G12C can be targeted with covalent small molecule inhibitors that react with a mutant cysteine adjacent to binding pocket II (SIIP), blocking KRAS in its inactive GDP-bound state.

KRAS является наиболее часто мутируемым онкогеном при раке человека и кодирует ключевой сигнальный белок в опухолях. Мутантная форма KRASG12C содержит цистеин, который был использован для создания ковалентных ингибиторов с многообещающей доклинической активностью. Авторы настоящего изобретения оптимизировали серию ингибиторов с новыми связывающими взаимодействиями и заметно повысили эффективность и селективность. Эти усилия привели к открытию AMG 510, первого ингибитора KRASg12C, находящегося в стадии клинической разработки. В доклинических исследованиях лечение с помощью AMG 510 привело к регрессии опухолей с KRAS p.G12C и значительно улучшило противоопухолевую эффективность химиотерапии и средств направленного действия. У иммунокомпетентных мышей лечение с помощью AMG 510 привело к провоспалительному микроокружению опухоли и обеспечило излечение на длительное время в сочетании с ингибированием иммунных контрольных точек. У вылеченных мышей не происходил рост изогенных опухолей с KRAS p.G12D, что свидетельствует об адаптивном иммунитете в отношении гетерологичных антигенов. AMG 510 продемонстрировал предварительное доказательство клинической противоопухолевой активности в первой когорте с введением дозы и представляет собой потенциально трансформирующую терапию для пациентов, для которых отсутствует эффективные виды лечения.KRAS is the most frequently mutated oncogene in human cancer and encodes a key signaling protein in tumors. The mutant form of KRAS G12C contains a cysteine, which has been used to create covalent inhibitors with promising preclinical activity. The inventors of the present invention have optimized a series of inhibitors with new binding interactions and have significantly improved the potency and selectivity. These efforts led to the discovery of AMG 510, the first KRAS g12C inhibitor in clinical development. In preclinical studies, treatment with AMG 510 resulted in regression of KRAS p.G12C tumors and significantly improved the antitumor efficacy of chemotherapy and targeted agents. In immunocompetent mice, treatment with AMG 510 resulted in a pro-inflammatory tumor microenvironment and provided long-term cure when combined with immune checkpoint inhibition. The cured mice did not grow isogenic tumors with KRAS p.G12D, indicating adaptive immunity against heterologous antigens. AMG 510 demonstrated preliminary evidence of clinical antitumor activity in the first dose-dose cohort and represents a potentially transformative therapy for patients for whom there are no effective treatments.

Онкопротеин KRAS представляет собой GTP-азу, которая является важным медиатором внутриклеточных сигнальных путей, вовлеченных в рост и выживание опухолевых клеток. В нормальных клетках KRAS функционирует как молекулярный переключатель, обеспечивающий чередование неактивного GDP-связанного и активного GTP-связанного состояний. Переходу между этими состояниями способствуют факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), которые загружают GTP и активируют KRAS, и гидролиз GTP, который катализируется активирующими GTP-азу белками (GAP), для инактивации KRAS. Связывание GTP с KRAS способствует связыванию эффекторов, запускающих пути передачи сигнала, включающие RAF-MEK-ERK (MAPK). Соматические активирующие мутации в KRAS являются признаком рака и предотвращают ассоциацию GAP, тем самым стабилизируя связывание эффекторов и усиливая передачу сигнала KRAS. Пациенты с опухолями, содержащими мутантную форму KRAS, характеризуются значительно худшими исходами и худшим прогнозом. Хотя существуют клинически одобренные ингибиторы нескольких белков пути MAPK (например, MEK, BRAF, EGFR) для подгруппыThe KRAS oncoprotein is a GTPase that is an important mediator of intracellular signaling pathways involved in the growth and survival of tumor cells. In normal cells, KRAS functions as a molecular switch that alternates between an inactive GDP-bound and an active GTP-bound state. The transition between these states is facilitated by guanine nucleotide exchange factors (GEFs), which load GTP and activate KRAS, and GTP hydrolysis, which is catalyzed by GTPase-activating proteins (GAPs), to inactivate KRAS. GTP binding to KRAS promotes the binding of effectors that trigger signal transduction pathways involving RAF-MEK-ERK (MAPK). Somatic activating mutations in KRAS are a hallmark of cancer and prevent GAP association, thereby stabilizing effector binding and enhancing KRAS signaling. Patients with tumors containing a mutant form of KRAS have significantly worse outcomes and prognosis. Although there are clinically approved inhibitors of several MAPK pathway proteins (eg, MEK, BRAF, EGFR) for a subset of

- 1 045330 типов опухолей, на сегодняшний день не существует клинических молекул, селективных в отношении опухолей, содержащих мутантную форму KRAS. Более того, несколько нацеленных на путь MAPK терапевтических средств противопоказаны для лечения опухолей, содержащих мутантную форму KRAS, изза отсутствия клинической эффективности. Кроме того, не селективные в отношении опухоли или мутанта терапевтические средства могут вызывать токсичность в отношении мишени из-за ингибирования передачи сигнала MAPK в нормальных клетках. Это может ограничивать применимость комбинации таких средств со стандартным лечением или иммунотерапией. Таким образом, существует острая неудовлетворенная потребность в разработке селективных в отношении опухоли терапевтических средств, которые не создают препятствий для нормальных клеток.- 1,045,330 tumor types, to date there are no clinical molecules that are selective for tumors containing a mutant form of KRAS. Moreover, several MAPK pathway-targeted therapeutics are contraindicated for the treatment of KRAS mutant tumors due to lack of clinical efficacy. In addition, non-tumor or mutant-selective therapeutics may cause on-target toxicity due to inhibition of MAPK signaling in normal cells. This may limit the utility of combining such agents with standard treatment or immunotherapy. Thus, there is a critical unmet need to develop tumor-selective therapeutics that do not interfere with normal cells.

KRAS p.G12C присутствует в приблизительно 13% случаев аденокарциномы легкого, 3% случаев колоректального рака и 2% случаев других солидных опухолей. Мутантный цистеин остатков KRASG12C, прилегающий к карману (Р2) находится в неактивной связанной с GDP форме KRAS. Близость Р2 и мутантного цистеина обуславливает обширный поиск ковалентных ингибиторов. Первый зарегистрированный электрофильный скрининг KRASG12C привел к возможной идентификации ARS-1620, который демонстрирует эффективность in vivo на доклинических моделях с KRAS p.G12C. При этом ARS-1620 от компании Araxes Pharma стал важной вехой в доказательстве концепции селективного в отношении мутанта ингибирования KRAS, он был позиционирован как соединение-инструмент для доклинических исследований. Ученые из Amgen, Inc. идентифицировали серию новых молекул на основе акриламида, которые используют ранее не использовавшуюся бороздку на поверхности KRASG12C, как молекулы, характеризующиеся значительным повышением эффективности и селективности. Интенсивный электрофильный скрининг и дизайн на основе структуры привели к открытию AMG 510, первого ингибитора KRASg12C, который прошел клиническое тестирование на людях (см. www.clinicaltrials.gov NCT03600883). В настоящем изобретении предусмотрена убедительная доклиническая активность AMG 510, его способность усиливать уничтожение опухолевых клеток в виде монотерапии или в комбинации с другими терапевтическими средствами, а также сильное влияние на инфильтрацию иммунных клеток, что делает микроокружение опухоли чрезвычайно чувствительным к иммунотерапии. В данном документе также представлено предварительное доказательство клинической эффективности.KRAS p.G12C is present in approximately 13% of lung adenocarcinomas, 3% of colorectal cancers, and 2% of other solid tumors. The mutant cysteine of KRAS G12C residues adjacent to the pocket (P2) is in the inactive GDP-bound form of KRAS. The proximity of P2 and mutant cysteine leads to an extensive search for covalent inhibitors. The first reported electrophilic screen for KRAS G12C led to the eventual identification of ARS-1620, which demonstrates in vivo efficacy in preclinical models with KRAS p.G12C. In doing so, Araxes Pharma's ARS-1620 marked a milestone in proof of concept for mutant-selective KRAS inhibition and was positioned as a tool compound for preclinical development. Scientists from Amgen, Inc. have identified a series of new acrylamide-based molecules that exploit a previously unexploited groove on the surface of KRAS G12C as having significantly improved potency and selectivity. Intensive electrophilic screening and structure-based design led to the discovery of AMG 510, the first KRAS g12C inhibitor to enter clinical testing in humans (see www.clinicaltrials.gov NCT03600883). The present invention provides compelling preclinical activity of AMG 510, its ability to enhance tumor cell killing as monotherapy or in combination with other therapeutic agents, and its potent effect on immune cell infiltration, making the tumor microenvironment extremely sensitive to immunotherapy. This paper also provides preliminary evidence of clinical effectiveness.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую AMG 510 или его фармацевтически приемлемую соль, и одно или несколько терапевтических или фармацевтически актив-The present invention includes a pharmaceutical composition containing AMG 510 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more therapeutic or pharmaceutically active

ных средств и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.nic agents and a pharmaceutically acceptable excipient.

Настоящее изобретение дополнительно включает способ лечения видов рака, таких как солидные опухоли, включая без ограничения рак легкого, толстой кишки и поджелудочной железы, с помощью комбинации AMG 510 или фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одного терапевтического средства, при этом терапевтическое средство выбрано из антитела к PD-1, химиотерапевтического средства, ингибитора MEK, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2, ингибитора PI3K и ингибитора AKT.The present invention further includes a method of treating cancers such as solid tumors, including but not limited to lung, colon and pancreatic cancer, using a combination of AMG 510 or a pharmaceutically acceptable salt and at least one therapeutic agent, wherein the therapeutic agent is selected from an antibody to PD-1, chemotherapy agent, MEK inhibitor, EGFR inhibitor, TOR inhibitor, SHP2 inhibitor, PI3K inhibitor and AKT inhibitor.

Настоящее изобретение дополнительно включает выделенную линию клеток, содержащих два аллеля KRASg12C, при этом линия клеток представляет собой СТ-26 KRAS P.G12C.The present invention further includes an isolated cell line containing two KRAS g12C alleles, wherein the cell line is CT-26 KRAS P.G12C.

Настоящее изобретение дополнительно включает способ создания линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12C, при этом способ включает:The present invention further includes a method for creating a cell line containing two KRAS G12C alleles, the method comprising:

a) инкубирование линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12C, с конструкцией CRISPR, которая индуцирует замещение нуклеотида в каждом из двух аллелей KRAS, таким образом образуются два аллеля KRaSg12C; иa) incubating a cell line containing two KRAS G12C alleles with a CRISPR construct that induces a nucleotide substitution in each of the two KRAS alleles, thereby producing two KRaS g12C alleles; And

b) выделение линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12C b) isolation of a cell line containing two KRAS G12C alleles

Первый ряд вариантов осуществления.First row of embodiments.

1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака поджелудочной железы, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и по меньшей мере одного хи миотерапевтического средства.1. In one embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating pancreatic cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and at least one chemotherapy agent.

2. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и по меньшей мере одного химиотерапевтического средства.2. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and at least one chemotherapeutic agent.

- 2 045330- 2 045330

3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 2, где рак толстой кишки характеризуется мутацией KRASp.GHC.3. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 2, wherein the colon cancer is characterized by a KRASp.GHC mutation.

4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака легкого, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и химиотерапевтического средства.4. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating lung cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a chemotherapeutic agent.

В некоторых таких вариантах осуществления рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого.In some such embodiments, the lung cancer is non-small cell lung cancer.

5. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 1, где рак поджелудочной железы характеризуется мутацией KRAS p.G12C.5. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 1, wherein the pancreatic cancer is characterized by the KRAS p.G12C mutation.

6. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 1-5, где химиотерапевтическое средство представляет собой карбоплатин.6. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any one of embodiments 1-5, wherein the chemotherapeutic agent is carboplatin.

7. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака поджелудочной железы, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора MEK.7. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating pancreatic cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a MEK inhibitor.

8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора MEK.8. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a MEK inhibitor.

9. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака легкого, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора MEK.9. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating lung cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a MEK inhibitor.

10. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 9, где рак легкого характеризуется мутацией p.KRAS G12C.10. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of Embodiment 9, wherein the lung cancer is characterized by the p.KRAS G12C mutation.

11. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 7-10, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.11. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any one of embodiments 7-10, wherein the MEK inhibitor is trametinib.

12. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 7-10, где ингибитор МЕК представляет собой пимасертиб, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973 или AZD8330.12. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any one of embodiments 7-10, wherein the MEK inhibitor is pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973, or AZD8330.

13. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака поджелудочной железы, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора EGFR.13. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating pancreatic cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an EGFR inhibitor.

14. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора EGFR.14. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an EGFR inhibitor.

15. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака легкого, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора EGFR.15. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating lung cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an EGFR inhibitor.

16. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 13-15, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.16. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any of embodiments 13-15, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.

17. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 13 и 15, где ингибитор EGFR представляет собой эрлотиниб.17. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any of embodiments 13 and 15, wherein the EGFR inhibitor is erlotinib.

18. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 15, где ингибитор EGFR представляет собой лапатиниб.18. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 15, wherein the EGFR inhibitor is lapatinib.

19. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака поджелудочной железы, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора SHP2.19. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating pancreatic cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an SHP2 inhibitor.

20. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора SHP2.20. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an SHP2 inhibitor.

21. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака легкого, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора SHP2.21. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating lung cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an SHP2 inhibitor.

22. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 19-21, где ингибитор SHP2 выбран из RMC-455022. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any of embodiments 19-21, wherein the SHP2 inhibitor is selected from RMC-4550

23. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 22, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.23. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 22, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550.

24. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака поджелудочной железы, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора PI3K.24. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating pancreatic cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a PI3K inhibitor.

- 3 045330- 3 045330

25. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора PI3K.25. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a PI3K inhibitor.

26. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака легкого, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора PI3K.26. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating lung cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and a PI3K inhibitor.

27. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 24-26, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511.27. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any one of embodiments 24-26, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511.

28. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 26, где ингибитор PI3K представляет собой бупарлисиб.28. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 26, wherein the PI3K inhibitor is buparlisib.

29. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака поджелудочной железы, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора AKT.29. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating pancreatic cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an AKT inhibitor.

30. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака легкого, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и ингибитора AKT.30. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating lung cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an AKT inhibitor.

31. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 29-30, где ингибитор AKT представляет собой AZD5363.31. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of any one of embodiments 29-30, wherein the AKT inhibitor is AZD5363.

32. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и антитела к EGFR.32. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an anti-EGFR antibody.

33. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 32, где антитело к EGFR представляет собой цетуксимаб.33. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 32, wherein the anti-EGFR antibody is cetuximab.

32. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака толстой кишки, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и антитела к PD-1.32. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating colon cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and an anti-PD-1 antibody.

33. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 32, где антитело к PD-1 выбрано из AMG 404, пембролизумаба и ниволумаба.33. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 32, wherein the anti-PD-1 antibody is selected from AMG 404, pembrolizumab and nivolumab.

34. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 33, где антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб.34. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 33, wherein the anti-PD-1 antibody is pembrolizumab.

35. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 33, где антитело к PD-1 представляет собой AMG 404.35. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 33, wherein the anti-PD-1 antibody is AMG 404.

36. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 33, где антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб.36. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 33, wherein the anti-PD-1 antibody is nivolumab.

37. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает37. In another embodiment of the present invention, the present invention includes

М Ν—у < > / °н Ме УЛ -УЧ N /—N /—J X—N / F ° ЛУЛ 'Ре—V / фармацевтическую композицию, содержащую N или его фармацевтически приемлемую соль, карбоплатин и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.M Ν—у <> / °н Me UL -UCH N /—N /— J X—N / F ° LUL 'Re—V / pharmaceutical composition containing N or its pharmaceutically acceptable salt, carboplatin and a pharmaceutically acceptable excipient.

38. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает м38. In another embodiment of the present invention, the present invention includes m

N—у < > / он Ме УЛ УЛ ?N—у <> / he Me UL UL ?

N у— N у—J N y— N y— J

N / F фармацевтическую композицию, содержащую N—' или его фармацевтически приемлемую соль, траметиниб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.N/F pharmaceutical composition containing N— ' or its pharmaceutically acceptable salt, trametinib and a pharmaceutically acceptable excipient.

39. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает39. In another embodiment of the present invention, the present invention includes

- 4 045330 фармацевтическую композицию, содержащую- 4 045330 pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, афатиниб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, afatinib and a pharmaceutically acceptable excipient.

40. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую40. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, эрлотиниб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, erlotinib and a pharmaceutically acceptable excipient.

41. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую41. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, лапатиниб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, lapatinib and a pharmaceutically acceptable excipient.

42. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую42. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, RMC-4550 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, RMC-4550 and a pharmaceutically acceptable excipient.

43. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую43. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, AMG 511 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, AMG 511 and a pharmaceutically acceptable excipient.

44. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую44. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, бупарлисиб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, buparlisib and a pharmaceutically acceptable excipient.

45. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает45. In another embodiment of the present invention, the present invention includes

- 5 045330 фармацевтическую композицию, содержащую- 5 045330 pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, AZD5363 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, AZD5363 and a pharmaceutically acceptable excipient.

46. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую46. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, цетуксимаб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, cetuximab and a pharmaceutically acceptable excipient.

47. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую47. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, антитело к PD-1 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an anti-PD-1 antibody and a pharmaceutically acceptable excipient.

48. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую48. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, AMG 404 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, AMG 404 and a pharmaceutically acceptable excipient.

49. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую49. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, пембролизумаб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, pembrolizumab and a pharmaceutically acceptable excipient.

50. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает м фармацевтическую композицию, содержащую50. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a pharmaceutical composition containing

или его фармацевтически приемлемую соль, ниволумаб и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, nivolumab and a pharmaceutically acceptable excipient.

51. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает51. In another embodiment of the present invention, the present invention includes

- 6 045330 способ по любому из вариантов осуществления 1-4 или 7-36, где ингибитор KRASG12C представляет собой- 6 045330 method according to any one of embodiments 1-4 or 7-36, where the KRAS G12C inhibitor is

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

52. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора MEK для лечения солидной опухоли.52. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a MEK inhibitor drug for the treatment of a solid tumor.

53. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора MEK для лечения рака легкого.53. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a MEK inhibitor drug for the treatment of lung cancer.

54. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора MEK для лечения рака толстой кишки.54. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a MEK inhibitor drug for the treatment of colon cancer.

55. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора MEK для лечения рака поджелудочной железы.55. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a MEK inhibitor drug for the treatment of pancreatic cancer.

56. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе химиотерапевтического средства для лечения солидной опухоли.56. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a chemotherapeutic drug for the treatment of a solid tumor.

57. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе химиотерапевтического средства для лечения рака легкого.57. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a chemotherapeutic drug for the treatment of lung cancer.

58. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе химиотерапевтического средства для лечения рака толстой кишки.58. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a chemotherapeutic drug for the treatment of colon cancer.

59. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе химиотерапевтического средства для лечения рака поджелудочной железы.59. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and a chemotherapeutic drug for the treatment of pancreatic cancer.

60. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора EGFR для лечения солидной опухоли.60. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an EGFR inhibitor drug for the treatment of a solid tumor.

61. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора EGFR для лечения рака легкого.61. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an EGFR inhibitor drug for the treatment of lung cancer.

62. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и на основе ингибитора EGFR для лечения рака толстой кишки.62. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an EGFR inhibitor drug for the treatment of colon cancer.

63. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе ингибитора EGFR для лечения рака поджелудочной железы.63. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an EGFR inhibitor drug for the treatment of pancreatic cancer.

64. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе антитела к PD-1 для лечения солидной опухоли.64. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an anti-PD-1 antibody drug for the treatment of a solid tumor.

65. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе антитела к PD-1 для лечения рака легкого.65. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an anti-PD-1 antibody drug for the treatment of lung cancer.

66. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе антитела к PD-1 для лечения рака толстой кишки.66. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an anti-PD-1 antibody drug for the treatment of colon cancer.

67. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе антитела к PD-1 для лечения рака поджелудочной железы.67. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an anti-PD-1 antibody drug for the treatment of pancreatic cancer.

68. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение ингибитора KRASG12C в комбинации с химиотерапевтическим средством для изготовления лекарственного препарата для контроля или лечения рака поджелудочной железы, рака легкого или рака толстой кишки у субъекта.68. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the use of a KRAS G12C inhibitor in combination with a chemotherapeutic agent for the manufacture of a medicament for the control or treatment of pancreatic cancer, lung cancer or colon cancer in a subject.

- 7 045330- 7 045330

69. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение ингибитора KRASG12C в комбинации с ингибитором MEK для изготовления лекарственного препарата для контроля или лечения рака поджелудочной железы, рака легкого или рака толстой кишки у субъекта.69. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the use of a KRAS G12C inhibitor in combination with a MEK inhibitor for the manufacture of a medicament for the control or treatment of pancreatic cancer, lung cancer or colon cancer in a subject.

70. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение ингибитора KRASG12C в комбинации с ингибитором EGFR для изготовления лекарственного препарата для контроля или лечения рака поджелудочной железы, рака легкого или рака толстой кишки у субъекта.70. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the use of a KRAS G12C inhibitor in combination with an EGFR inhibitor for the manufacture of a medicament for the control or treatment of pancreatic cancer, lung cancer or colon cancer in a subject.

71. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение ингибитора KRASG12C в комбинации с антителом к PD-1 для изготовления лекарственного препарата для контроля или лечения рака поджелудочной железы, рака легкого или рака толстой кишки у субъекта.71. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the use of a KRAS inhibitor G12C in combination with an anti-PD-1 antibody for the manufacture of a medicament for the control or treatment of pancreatic cancer, lung cancer or colon cancer in a subject.

72. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает выделенную линию клеток, содержащих два аллеля KRASG12C 72. In another embodiment of the present invention, the present invention includes an isolated cell line containing two KRAS G12C alleles

73. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает линию клеток по варианту осуществления 68, где линия клеток представляет собой СТ-26 KRAS p.G12C.73. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the cell line of Embodiment 68, wherein the cell line is CT-26 KRAS p.G12C.

74. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ создания линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12C, при этом способ включает:74. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method for creating a cell line containing two KRAS G12C alleles, the method comprising:

a) инкубирование линии клеток, содержащих два аллеля KRAS G12D, с конструкцией CRISPR, которая индуцирует замещение нуклеотида в каждом из двух аллелей KRAS, таким образом образуются два аллеля KRASG12C; иa) incubating a cell line containing two KRAS G12D alleles with a CRISPR construct that induces a nucleotide substitution in each of the two KRAS alleles, thereby producing two KRAS G12C alleles; And

b) выделение линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12C.b) isolating a cell line containing two KRAS G12C alleles.

75. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 70, где конструкция CRISPR содержит последовательность CTTGTGATGGTTGGAGCTGA (SEQ Ш NO.: 21).75. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 70, wherein the CRISPR construct contains the sequence CTTGTGATGGTTGGAGCTGA (SEQ ID NO.: 21).

76. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ лечения рака, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и по меньшей мере одного дополнительного химиотерапевтического средства.76. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a method of treating cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and at least one additional chemotherapeutic agent.

77. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию лекарственного препарата на основе ингибитора KRASG12C и лекарственного препарата на основе антитела к PD-1 для лечения солидной опухоли.77. In another embodiment of the present invention, the present invention includes a combination of a KRAS G12C inhibitor drug and an anti-PD-1 antibody drug for the treatment of a solid tumor.

78. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение ингибитора KRASG12C в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным химиотерапевтическим средством для изготовления лекарственного препарата для контроля или лечения рака поджелудочной железы, рака легкого или рака толстой кишки у субъекта.78. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the use of a KRAS G12C inhibitor in combination with at least one additional chemotherapeutic agent for the manufacture of a medicament for the control or treatment of pancreatic cancer, lung cancer or colon cancer in a subject.

79. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 76, где ингибитор KRASG12C представляет собой79. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the method of embodiment 76, wherein the KRAS G12C inhibitor is

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

80. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает комбинацию по варианту осуществления 77, где ингибитор KRASG12C представляет собой80. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the combination of Embodiment 77, wherein the KRAS G12C inhibitor is

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

81. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение по варианту осуществления 78, где ингибитор KRASG12C представляет собой81. In another embodiment of the present invention, the present invention includes the use of embodiment 78, wherein the KRAS G12C inhibitor is

- 8 045330- 8 045330

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

82. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает применение по варианту осуществления 78, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).82. In another embodiment of the present invention, the present invention includes use as in embodiment 78, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).

Второй ряд вариантов осуществления.Second row of embodiments.

1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу лечения рака, при этом способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора KRASG12C и по меньшей мере одного дополнительного фар мацевтически активного средства.1. In another embodiment of the present invention, the present invention provides a method for treating cancer, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a KRAS G12C inhibitor and at least one additional pharmaceutically active agent.

2. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 1, где ингибитор KRASG12C представляет собой2. In a further embodiment, the method of embodiment 1 is provided, wherein the KRAS G12C inhibitor is

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

3. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 1, где рак характеризуется мутацией KRAS p.G12C.3. In a further embodiment, the method of embodiment 1 is provided, wherein the cancer is characterized by the KRAS p.G12C mutation.

4. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 1, где рак представляет собой рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак легкого, аппендикса, эндометрия или тонкого кишечника.4. In a further embodiment, the method of embodiment 1 is provided, wherein the cancer is pancreatic, colorectal, lung, appendix, endometrial, or small intestinal cancer.

5. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 4, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.5. In a further embodiment, the method of embodiment 4 is provided, wherein the cancer is pancreatic cancer.

6. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 4, где рак представляет собой колоректальный рак.6. In a further embodiment, the method of embodiment 4 is provided, wherein the cancer is colorectal cancer.

7. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 4, где рак представляет собой рак легкого.7. In a further embodiment, the method of embodiment 4 is provided, wherein the cancer is lung cancer.

8. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 7, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).8. In a further embodiment, the method of embodiment 7 is provided, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).

9. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 4, где рак представляет собой рак аппендикса.9. In a further embodiment, the method of embodiment 4 is provided, wherein the cancer is appendiceal cancer.

10. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 4, где рак представляет собой рак эндометрия.10. In a further embodiment, the method of embodiment 4 is provided, wherein the cancer is endometrial cancer.

11. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 4, где рак представляет собой рак тонкого кишечника.11. In a further embodiment, the method of embodiment 4 is provided, wherein the cancer is small intestinal cancer.

12. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 1, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин, ингибитор на основе антитела к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор TOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.12. In a further embodiment, the method of embodiment 1 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin, an anti-PD-1 antibody inhibitor, a MEK inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, an SHP2 inhibitor, a PI3K inhibitor, or AKT inhibitor.

13. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин.13. In a further embodiment, the method of embodiment 12 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin.

14. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор на основе антитела к PD-1.14. In a further embodiment, the method of embodiment 12 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody inhibitor.

15. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 14, где ингибитор на основе антитела к PD-1 выбран из AMG 404, пембролизумаба и ниволумаба.15. In a further embodiment, the method of embodiment 14 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is selected from AMG 404, pembrolizumab and nivolumab.

16. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 15, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб.16. In a further embodiment, the method of embodiment 15 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is pembrolizumab.

17. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 15, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой AMG 404.17. In a further embodiment, the method of embodiment 15 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is AMG 404.

- 9 045330- 9 045330

18. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления18. In a further embodiment, a method according to embodiment is provided

15, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой ниволумаб.15, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is nivolumab.

19. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления19. In a further embodiment, a method according to embodiment is provided

12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор MEK.12, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is a MEK inhibitor.

20. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 19, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб, пимасертиб, PD-325901, MEK162, ТАК-733, GDC-0973 или AZD8330.20. In a further embodiment, the method of embodiment 19 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib, pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973, or AZD8330.

21. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 20, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.21. In a further embodiment, the method of embodiment 20 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib.

22. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.22. In a further embodiment, the method of embodiment 12 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor.

23. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 22, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб, эрлотиниб, лапатиниб или цетуксимаб.23. In a further embodiment, the method of embodiment 22 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib, erlotinib, lapatinib, or cetuximab.

24. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 23, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.24. In a further embodiment, the method of embodiment 23 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.

25. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 23, где ингибитор EGFR представляет собой цетуксимаб.25. In a further embodiment, the method of embodiment 23 is provided, wherein the EGFR inhibitor is cetuximab.

26. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.26. In a further embodiment, the method of embodiment 12 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor.

27. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 26, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.27. In a further embodiment, the method of embodiment 26 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550.

28. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 26, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.28. In a further embodiment, the method of embodiment 26 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630.

29. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор PI3K.29. In a further embodiment, the method of embodiment 12 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is a PI3K inhibitor.

30. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 29, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511 или бупарлисиб.30. In a further embodiment, the method of embodiment 29 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511 or buparlisib.

31. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 30, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511.31. In a further embodiment, the method of embodiment 30 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511.

32. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 30, где ингибитор PI3K представляет собой бупарлисиб.32. In a further embodiment, the method of embodiment 30 is provided, wherein the PI3K inhibitor is buparlisib.

33. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 12, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор AKT.33. In a further embodiment, the method of embodiment 12 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an AKT inhibitor.

34. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 33, где ингибитор AKT представляет собой AZD5363.34. In a further embodiment, the method of embodiment 33 is provided, wherein the AKT inhibitor is AZD5363.

35. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, со держащая или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.35. In a further embodiment, a pharmaceutical composition is provided comprising either a pharmaceutically acceptable salt thereof, at least one additional pharmaceutically active agent, and a pharmaceutically acceptable excipient.

36. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 35, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин, ингибитор на основе антитела к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор TOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.36. In a further embodiment, the composition of embodiment 35 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin, an anti-PD-1 antibody inhibitor, a MEK inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, a SHP2 inhibitor, a PI3K inhibitor, or AKT inhibitor.

37. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин.37. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin.

38. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор на основе антитела к PD-1.38. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody inhibitor.

- 10 045330- 10 045330

39. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 38, где ингибитор на основе антитела к PD-1 выбран из AMG 404, пембролизумаба и ниволумаба.39. In a further embodiment, the composition of embodiment 38 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is selected from AMG 404, pembrolizumab, and nivolumab.

40. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 39, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб.40. In a further embodiment, the composition of embodiment 39 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is pembrolizumab.

41. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 39, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой AMG 404.41. In a further embodiment, the composition of embodiment 39 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is AMG 404.

42. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 39, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой ниволумаб.42. In a further embodiment, the composition of embodiment 39 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is nivolumab.

43. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор MEK.43. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is a MEK inhibitor.

44. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 43, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб, пимасертиб, PD-325901, MEK162, TAK733, GDC-0973 или AZD8330.44. In a further embodiment, the composition of embodiment 43 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib, pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK733, GDC-0973, or AZD8330.

45. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 44, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.45. In a further embodiment, the composition of embodiment 44 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib.

46. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.46. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor.

47. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 46, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб, эрлотиниб, лапатиниб или цетуксимаб.47. In a further embodiment, the composition of embodiment 46 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib, erlotinib, lapatinib, or cetuximab.

48. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 47, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.48. In a further embodiment, the composition of embodiment 47 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.

49. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 47, где ингибитор EGFR представляет собой цетуксимаб.49. In a further embodiment, the composition of embodiment 47 is provided, wherein the EGFR inhibitor is cetuximab.

50. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.50. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor.

51. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 50, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.51. In a further embodiment, the composition of embodiment 50 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550.

52. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 50, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.52. In a further embodiment, the composition of embodiment 50 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630.

53. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор PI3K.53. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is a PI3K inhibitor.

54. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 53, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511 или бупарлисиб.54. In a further embodiment, the composition of embodiment 53 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511 or buparlisib.

55. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 54, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511.55. In a further embodiment, the composition of embodiment 54 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511.

56. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 54, где ингибитор PI3K представляет собой бупарлисиб.56. In a further embodiment, the composition of embodiment 54 is provided, wherein the PI3K inhibitor is buparlisib.

57. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 36, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор AKT.57. In a further embodiment, the composition of embodiment 36 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an AKT inhibitor.

58. В дополнительном варианте осуществления предусмотрена композиция по варианту осуществления 57, где ингибитор AKT представляет собой AZD5363.58. In a further embodiment, the composition of embodiment 57 is provided, wherein the AKT inhibitor is AZD5363.

59. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор, содержащий ингибитор KRASg12C или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно дополнительное фарма цевтически активное средство.59. In a further embodiment, a kit is provided comprising a KRAS g12C inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof and at least one additional pharmaceutically active agent.

60. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 59, где ингибитор KRASg12C представляет собой60. In a further embodiment, the kit of embodiment 59 is provided, wherein the KRAS g12C inhibitor is

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

61. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 59, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой кар-61. In a further embodiment, the kit of embodiment 59 is provided, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is a car-

- 11 045330 боплатин, ингибитор на основе антитела к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор TOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.- 11 045330 boplatin, anti-PD-1 inhibitor, MEK inhibitor, EGFR inhibitor, TOR inhibitor, SHP2 inhibitor, PI3K inhibitor or AKT inhibitor.

62. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 59, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин.62. In a further embodiment, the kit of embodiment 59 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin.

63. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 59, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор на основе антитела к PD-1.63. In a further embodiment, the kit of embodiment 59 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody inhibitor.

64. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 63, где ингибитор на основе антитела к PD-1 выбран из AMG 404, пембролизумаба и ниволумаба.64. In a further embodiment, the kit of embodiment 63 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is selected from AMG 404, pembrolizumab, and nivolumab.

65. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 64, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб.65. In a further embodiment, the kit of embodiment 64 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is pembrolizumab.

66. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 64, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой AMG 404.66. In a further embodiment, the kit of embodiment 64 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is AMG 404.

67. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 64, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой ниволумаб.67. In a further embodiment, the kit of embodiment 64 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is nivolumab.

68. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 61, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор MEK.68. In a further embodiment, the kit of embodiment 61 is provided, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is a MEK inhibitor.

69. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианте осуществления 68, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб, пимасертиб, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC0973 или AZD8330.69. In a further embodiment, the kit of embodiment 68 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib, pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC0973, or AZD8330.

70. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 69, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.70. In a further embodiment, the kit of embodiment 69 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib.

71. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 61, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.71. In a further embodiment, the kit of embodiment 61 is provided, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor.

72. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 61, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб, эрлотиниб, лапатиниб или цетуксимаб.72. In a further embodiment, the kit of embodiment 61 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib, erlotinib, lapatinib, or cetuximab.

73. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 62, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.73. In a further embodiment, the kit of embodiment 62 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.

74. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 62, где ингибитор EGFR представляет собой цетуксимаб.74. In a further embodiment, the kit of embodiment 62 is provided, wherein the EGFR inhibitor is cetuximab.

75. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 61, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.75. In a further embodiment, the kit of embodiment 61 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor.

76. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 75, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.76. In a further embodiment, the kit of embodiment 75 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550.

77. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 75, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.77. In a further embodiment, the kit of embodiment 75 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630.

78. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 61, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор PI3K.78. In a further embodiment, the kit of embodiment 61 is provided, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is a PI3K inhibitor.

79. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 78, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511 или бупарлисиб.79. In a further embodiment, the kit of embodiment 78 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511 or buparlisib.

80. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 79, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511.80. In a further embodiment, the kit of embodiment 79 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511.

81. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 79, где ингибитор PI3K представляет собой бупарлисиб.81. In a further embodiment, the kit of embodiment 79 is provided, wherein the PI3K inhibitor is buparlisib.

82. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 61, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор AKT.82. In a further embodiment, the kit of embodiment 61 is provided, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an AKT inhibitor.

83. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 82, где ингибитор AKT представляет собой AZD5363.83. In a further embodiment, the kit of embodiment 82 is provided, wherein the AKT inhibitor is AZD5363.

84. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 59, где набор предназначен для лечения рака.84. In a further embodiment, the kit of embodiment 59 is provided, wherein the kit is for the treatment of cancer.

85. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 84, где рак характеризуется мутацией KRAS p.G12C.85. In a further embodiment, the kit of embodiment 84 is provided, wherein the cancer is characterized by the KRAS p.G12C mutation.

86. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 84, где рак представляет собой рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак легкого, аппендикса, эндометрия или тонкого кишечника.86. In a further embodiment, the kit of embodiment 84 is provided, wherein the cancer is pancreatic, colorectal, lung, appendix, endometrial, or small intestinal cancer.

87. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 86, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.87. In a further embodiment, the kit of embodiment 86 is provided, wherein the cancer is pancreatic cancer.

- 12 045330- 12 045330

88. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 86, где рак представляет собой колоректальный рак.88. In a further embodiment, the kit of embodiment 86 is provided, wherein the cancer is colorectal cancer.

89. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 86, где рак представляет собой рак легкого.89. In a further embodiment, the kit of embodiment 86 is provided, wherein the cancer is lung cancer.

90. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 89, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).90. In a further embodiment, the kit of embodiment 89 is provided, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).

91. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 86, где рак представляет собой рак аппендикса.91. In a further embodiment, the kit of embodiment 86 is provided, wherein the cancer is appendiceal cancer.

92. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 86, где рак представляет собой рак эндометрия.92. In a further embodiment, the kit of embodiment 86 is provided, wherein the cancer is endometrial cancer.

93. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен набор по варианту осуществления 86, где рак представляет собой рак тонкого кишечника.93. In a further embodiment, the kit of embodiment 86 is provided, wherein the cancer is small intestinal cancer.

94. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено применение ингибитора KRASG12C в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным химиотерапевтическим средством для изготовления лекарственного препарата для контроля или лечения рака у субъекта.94. In a further embodiment, the KRAS G12C inhibitor is used in combination with at least one additional chemotherapeutic agent to manufacture a medicament for controlling or treating cancer in a subject.

95. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено применение по варианту осуществм95. In a further embodiment, provision is made for use in an embodiment

N—\ < > / он (sy—N /=\ )=\ Ме УЛN—\ <> / he (sy—N /=\ )=\ Me UL

N /-N /—J / F ° “УЧ /рг—ς' V ления 94, где ингибитор KRASG12C представляет собой или его фармацевтически приемлемую соль.N /-N /— J / F ° “УЧ /рг — ς' V leniya 94, where the KRAS inhibitor G12C is or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

96. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение, которое представляет собой ингибитор KRASg12C, для применения в лечении рака по меньшей мере с одним дополнительным фармацевтически активным средством.96. In a further embodiment, a compound is provided that is a KRAS g12C inhibitor for use in the treatment of cancer with at least one additional pharmaceutically active agent.

97. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществм97. In a further embodiment, a connection is provided according to an embodiment

ления 96, где ингибитор KRASG12C представляет собой n=Z или его фармацевтически приемлемую соль.96, wherein the KRAS inhibitor G12C is n=Z or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

98. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 96, где рак характеризуется мутацией KRAS p.G12C.98. In a further embodiment, the compound of embodiment 96 is provided, wherein the cancer is characterized by the KRAS p.G12C mutation.

99. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 96, где рак представляет собой рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак легкого, аппендикса, эндометрия или тонкого кишечника.99. In a further embodiment, the compound of embodiment 96 is provided, wherein the cancer is pancreatic, colorectal, lung, appendix, endometrial, or small intestinal cancer.

100. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 99, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.100. In a further embodiment, the compound of embodiment 99 is provided, wherein the cancer is pancreatic cancer.

101. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 99, где рак представляет собой колоректальный рак.101. In a further embodiment, the compound of embodiment 99 is provided, wherein the cancer is colorectal cancer.

102. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 99, где рак представляет собой рак легкого.102. In a further embodiment, the compound of embodiment 99 is provided, wherein the cancer is lung cancer.

103. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 102, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).103. In a further embodiment, the compound of embodiment 102 is provided, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).

104. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 99, где рак представляет собой рак аппендикса.104. In a further embodiment, the connection of embodiment 99 is provided, wherein the cancer is appendiceal cancer.

105. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 99, где рак представляет собой рак эндометрия.105. In a further embodiment, the compound of embodiment 99 is provided, wherein the cancer is endometrial cancer.

106. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 99, где рак представляет собой рак тонкого кишечника.106. In a further embodiment, the compound of embodiment 99 is provided, wherein the cancer is small intestinal cancer.

107. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 96, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин, ингибитор на основе антитела к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор TOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.107. In a further embodiment, the compound of Embodiment 96 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin, an anti-PD-1 antibody inhibitor, a MEK inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, a SHP2 inhibitor, a PI3K inhibitor, or AKT inhibitor.

- 13 045330- 13 045330

108. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин.108. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin.

109. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор на основе антитела к PD-1.109. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody inhibitor.

110. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 109, где ингибитор на основе антитела к PD-1 выбран из AMG 404, пембролизумаба и ниволумаба.110. In a further embodiment, the compound of embodiment 109 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is selected from AMG 404, pembrolizumab, and nivolumab.

111. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 110, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб.111. In a further embodiment, the compound of embodiment 110 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is pembrolizumab.

112. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 110, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой AMG 404.112. In a further embodiment, the compound of embodiment 110 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is AMG 404.

113. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 110, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой ниволумаб.113. In a further embodiment, the compound of embodiment 110 is provided, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is nivolumab.

114. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор MEK.114. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is a MEK inhibitor.

115. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 114, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб, пимасертиб, PD-325901, MEK162, TAK733, GDC-0973 или AZD8330.115. In a further embodiment, the compound of embodiment 114 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib, pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK733, GDC-0973, or AZD8330.

116. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 115, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.116. In a further embodiment, the compound of embodiment 115 is provided, wherein the MEK inhibitor is trametinib.

117. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.117. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor.

118. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 117, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб, эрлотиниб, лапатиниб или цетуксимаб.118. In a further embodiment, the compound of embodiment 117 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib, erlotinib, lapatinib, or cetuximab.

119. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 118, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.119. In a further embodiment, the compound of embodiment 118 is provided, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.

120. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 118, где ингибитор EGFR представляет собой цетуксимаб.120. In a further embodiment, the compound of embodiment 118 is provided, wherein the EGFR inhibitor is cetuximab.

121. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.121. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor.

122. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 121, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.122. In a further embodiment, the compound of embodiment 121 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550.

123. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 121, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.123. In a further embodiment, the compound of embodiment 121 is provided, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630.

124. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор PI3K.124. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is a PI3K inhibitor.

125. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 124, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511 или бупарлисиб.125. In a further embodiment, the compound of embodiment 124 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511 or buparlisib.

126. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 125, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511.126. In a further embodiment, the compound of embodiment 125 is provided, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511.

127. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 125, где ингибитор PI3K представляет собой бупарлисиб.127. In a further embodiment, the compound of embodiment 125 is provided, wherein the PI3K inhibitor is buparlisib.

128. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 107, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор AKT.128. In a further embodiment, the compound of embodiment 107 is provided, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an AKT inhibitor.

129. В дополнительном варианте осуществления предусмотрено соединение по варианту осуществления 128, где ингибитор AKT представляет собой AZD5363.129. In a further embodiment, the compound of embodiment 128 is provided, wherein the AKT inhibitor is AZD5363.

130. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 1, где ингибитор KRASG12C и по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство вводят одновременно.130. In a further embodiment, the method of embodiment 1 is provided, wherein the KRAS G12C inhibitor and at least one additional pharmaceutically active agent are administered simultaneously.

131. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ по варианту осуществления 1, где ингибитор KRASG12C и по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство вводят отдельно.131. In a further embodiment, the method of embodiment 1 is provided, wherein the KRAS G12C inhibitor and at least one additional pharmaceutically active agent are administered separately.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает применение комбинации, включающей ингибитор KRASG12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT. Дополнительный вариант осуществле- 14 045330 ния настоящего изобретения включает применение комбинации для лечения рака, при этом комбинация включает ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT. Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ применения комбинации, включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT, для лечения рака. Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает применение комбинации для лечения рака, при этом комбинация включает ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT, при этом применение включает самостоятельное введение комбинации.A further embodiment of the present invention includes the use of a combination comprising a KRAS G12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapeutic agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, an SHP2 inhibitor, or an AKT inhibitor. A further embodiment of the present invention includes the use of a combination for the treatment of cancer, wherein the combination comprises a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapeutic agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor , SHP2 inhibitor or AKT inhibitor. A further embodiment of the present invention includes a method of using a combination comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapy agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, a SHP2 inhibitor or an AKT inhibitor, for the treatment of cancer. A further embodiment of the present invention includes the use of a combination for the treatment of cancer, wherein the combination comprises a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapy agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, an SHP2 inhibitor, or AKT inhibitor, and use includes self-administration of the combination.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ лечения рака, включающий назначение комбинации, дополнительно включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT. Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ лечения рака, предусматривающий назначение субъекту, нуждающемуся в этом, комбинации, дополнительно включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT.A further embodiment of the present invention includes a method of treating cancer comprising administering a combination further comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapy agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, an SHP2 inhibitor, or AKT inhibitor. A further embodiment of the present invention includes a method of treating cancer comprising administering to a subject in need thereof a combination further comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapeutic agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, TOR inhibitor, SHP2 inhibitor or AKT inhibitor.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ лечения рака с использованием комбинации, включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT, при этом такой способ дополнительно включает описание указанной комбинации в формуляре и предписание пациенту, нуждающемуся в таком лечении рака.A further embodiment of the present invention includes a method of treating cancer using a combination comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapy agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, an SHP2 inhibitor or an AKT inhibitor wherein such method further includes describing said combination in a formulary and prescribing it to a patient in need of such cancer treatment.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ применения комбинации, включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT, для лечения рака, при этом такой способ включает приобретение указанной комбинации для самостоятельного введения пациентом, нуждающимся в таком лечении рака.A further embodiment of the present invention includes a method of using a combination comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapy agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, a SHP2 inhibitor or an AKT inhibitor, for the treatment of cancer, wherein such method includes purchasing said combination for self-administration by a patient in need of such cancer treatment.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ лечения рака, включающий инструктирование субъекта, нуждающегося в таком лечении, в отношении введения комбинации, включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора на основе антитела к PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT.A further embodiment of the present invention includes a method of treating cancer, comprising instructing a subject in need of such treatment to administer a combination comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapeutic agent, an anti-PD-1 antibody inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, a SHP2 inhibitor, or an AKT inhibitor.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ лечения рака, включающий:A further embodiment of the present invention includes a method of treating cancer, comprising:

А) назначение,A) purpose

B) продажу или рекламу для продажи,B) selling or advertising for sale,

С) приобретение,C) acquisition,

D) инструктирование в отношении самостоятельного введения илиD) instructions regarding self-administration or

E) введение комбинации, описанной в данном документе, при этом комбинация была одобрена регулирующим органом для лечения рака у субъекта, нуждающегося в лечении рака.E) administering a combination described herein, wherein the combination has been approved by a regulatory authority for the treatment of cancer in a subject in need of treatment for cancer.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ обеспечения комбинации, включающей ингибитор KRASg12C с другим терапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства, ингибитора PD-1, ингибитора MEK, селективного ингибитора PI3K, ингибитора EGFR, ингибитора TOR, ингибитора SHP2 или ингибитора AKT, для лечения рака, при этом указанный способ предусматривает возмещение затрат врачу, фармацевту, пациенту или страховой компании за продажу указанной комбинации.A further embodiment of the present invention includes a method of providing a combination comprising a KRAS g12C inhibitor with another therapeutic agent selected from a chemotherapy agent, a PD-1 inhibitor, a MEK inhibitor, a selective PI3K inhibitor, an EGFR inhibitor, a TOR inhibitor, a SHP2 inhibitor or an AKT inhibitor, for the treatment of cancer, wherein the method provides reimbursement to the physician, pharmacist, patient or insurance company for the sale of the combination.

Для ясности термин инструктирование предназначен для включения информации на этикетке, одобренной регулирующим органом, в дополнение к его общепринятому определению.For clarity, the term guidance is intended to include regulatory approval label information in addition to its generally accepted definition.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На фиг. 1 показано, что AMG 510 в комбинации с карбоплатином усиливает супрессию роста опухоли NCI-H358 NSCLC.In fig. Figure 1 shows that AMG 510 in combination with carboplatin enhances tumor suppression of NCI-H358 NSCLC.

На фиг. 2 показано, что AMG 510, объединенный с ингибитором MEK PD-325901, приводит к повышенной эффективности на модели ксенотрансплантата NSCLC NCI-H358.In fig. Figure 2 shows that AMG 510 combined with the MEK inhibitor PD-325901 results in increased efficacy in the NSCLC NCI-H358 xenograft model.

На фиг. 3 показано, что AMG 510 подавляет in vivo рост опухолей СТ-26 KRAS P.G12C.In fig. Figure 3 shows that AMG 510 suppresses the in vivo growth of CT-26 KRAS P.G12C tumors.

На фиг. 4 показано, что AMG 510, объединенный с антителом к PD-1, приводит к повышению выживаемости и излечению на длительное время на мышиной модели рака с мутацией KRAS p.G12C.In fig. Figure 4 shows that AMG 510 combined with an anti-PD-1 antibody leads to increased survival and long-term cure in a mouse model of cancer with the KRAS p.G12C mutation.

- 15 045330- 15 045330

На фиг. 5 показано, что обработка с помощью AMG 510 приводит к усилению инфильтрации CD8+ и CD4+ Т-клеток в опухоли СТ-26 G12C-H10.In fig. Figure 5 shows that treatment with AMG 510 leads to increased infiltration of CD8+ and CD4+ T cells in the CT-26 G12C-H10 tumor.

На фиг. 6 показано, что обработка с помощью AMG 510 приводит к повышению PD-L1положительных нейтрофилов в опухолях СТ-26 G12C-H10.In fig. Figure 6 shows that treatment with AMG 510 leads to an increase in PD-L1 positive neutrophils in CT-26 G12C-H10 tumors.

На фиг. 7 показано, что матрица избытка величины аддитивности идентифицирует области синергетического взаимодействия.In fig. Figure 7 shows that the additivity excess matrix identifies areas of synergistic interaction.

На фиг. 8 показана экспериментально полученная аддитивность на модели матриц самопересечения.In fig. Figure 8 shows the experimentally obtained additivity on the model of self-intersection matrices.

На фиг. 9 показано, что AMG 510 синергирует как с RMC-4550 (SHP2i), так и с траметинибом (MEKi) с достижением уничтожения клеток в линии клеток NCI-H358.In fig. Figure 9 shows that AMG 510 synergizes with both RMC-4550 (SHP2i) and trametinib (MEKi) to achieve cell killing in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 10 показано, что отсутствие активности отдельного средства с афатинибом или RMC-4550 может способствовать более слабому синергизму в линии клеток MIA РаСА-2.In fig. 10 shows that the lack of activity of a single agent with afatinib or RMC-4550 may contribute to weaker synergy in the MIA PaCA-2 cell line.

На фиг. 11 показано, что комбинации в 3D культуре могут демонстрировать повышенный синергизм.In fig. 11 shows that combinations in 3D culture can demonstrate increased synergy.

На фиг. 12 показано, что комбинация AMG 510 X траметиниб действуют синергетически в NCIH358.In fig. Figure 12 shows that AMG 510 X trametinib act synergistically in NCIH358.

На фиг. 13 показано самопересечение AMG в линии клеток NCI-H358.In fig. 13 shows AMG self-intersection in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 14 показано самопересечения траметиниба в линии клеток NCI-H358.In fig. Figure 14 shows self-crossing of trametinib in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 15 показано, что комбинация AMG 510 X траметиниб демонстрирует слабый синергизм в линии клеток MIA РаСа-2.In fig. 15 shows that the AMG 510 X trametinib combination shows weak synergy in the MIA PaCa-2 cell line.

На фиг. 16 показано, что 3D культура улучшает синергизм комбинации AMG 510 X траметиниб в MIA РаСа-2.In fig. 16 shows that 3D culture improves the synergism of the AMG 510 X trametinib combination in MIA PaCa-2.

На фиг. 17 показана комбинация AMG 510 X траметиниб (3D) в линии клеток NCI-H1373.In fig. 17 shows the AMG 510 X trametinib (3D) combination in the NCI-H1373 cell line.

На фиг. 18 показано, что комбинация AMG 510 X траметиниб демонстрирует слабый синергизм изза высокой эффективности каждого отдельного средства в СТ-26 KRAS p.G12C.In fig. 18 shows that the combination of AMG 510 X trametinib demonstrates weak synergism due to the high effectiveness of each individual agent in CT-26 KRAS p.G12C.

На фиг. 19 показано, что комбинация AMG 510 X PD-325901 демонстрирует слабый синергизм в MIA РаСа-2.In fig. 19 shows that the combination of AMG 510 X PD-325901 shows weak synergism in MIA PaCa-2.

На фиг. 20 показано, что комбинация AMG 510 X траметиниб оказывает синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 20 shows that the combination of AMG 510 X trametinib has a synergistic effect in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 21 показано, что комбинация AMG 510 X афатиниб оказывает слабое синергетическое действие в линии клеток MIA РаСа-2.In fig. 21 shows that the AMG 510 X afatinib combination has a weak synergistic effect in the MIA PaCa-2 cell line.

На фиг. 22 показано, что 3D культура не улучшает синергизм комбинации AMG 510 X афатиниб в линии клеток MIA РаСа-2.In fig. 22 shows that 3D culture does not improve the synergism of the AMG 510 X afatinib combination in the MIA PaCa-2 cell line.

На фиг. 23 показана комбинация AMG 510 X афатиниб (3D) в линии клеток NCI-H1373.In fig. 23 shows the AMG 510 X afatinib (3D) combination in the NCI-H1373 cell line.

На фиг. 24 показано, что комбинация AMG 510 X афатиниб оказывает умеренное синергетическое действие в СТ-26 KRAS p.G12C.In fig. 24 shows that the AMG 510 X afatinib combination has a moderate synergistic effect in CT-26 KRAS p.G12C.

На фиг. 25 показано, что комбинация AMG 510 X лапатиниб оказывает синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 25 shows that the combination of AMG 510 X lapatinib has a synergistic effect in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 26 показано, что комбинация AMG X эрлотиниб оказывает умеренное синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 26 shows that the AMG X erlotinib combination has moderate synergistic effects in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 27 показано, что синергизм комбинации AMG 510 X эрлотиниб не наблюдается в линии клеток MIA РаСа-2 из-за отсутствия активности эрлотиниба.In fig. 27 shows that synergism of the AMG 510 X erlotinib combination is not observed in the MIA PaCa-2 cell line due to the lack of activity of erlotinib.

На фиг. 28 показано, что синергизм комбинации AMG 510 X цетуксимаб не наблюдается в SW837 из-за отсутствия активности цетуксимаба in vivo.In fig. 28 shows that synergism of the AMG 510 X cetuximab combination is not observed in SW837 due to the lack of in vivo activity of cetuximab.

На фиг. 29 показано, что комбинация AMG 510 X RMC-4550 оказывает синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 29 shows that the combination of AMG 510 X RMC-4550 has a synergistic effect in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 30 показано, что комбинация AMG 510 X RMC-4550 оказывает слабое синергетическое действие в линии клеток MIA РаСа-2.In fig. 30 shows that the combination of AMG 510 X RMC-4550 has a weak synergistic effect in the MIA PaCa-2 cell line.

На фиг. 31 показано, что комбинация AMG 510 X RMC-4550 оказывает умеренное синергетическое действие в СТ-26 KRAS p.G12C.In fig. 31 shows that the combination of AMG 510 X RMC-4550 has a moderate synergistic effect in ST-26 KRAS p.G12C.

На фиг. 32 показано, что комбинация AMG 510 X AMG 511 оказывает умеренное синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 32 shows that the combination of AMG 510 X AMG 511 has a moderate synergistic effect in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 33 показано, что комбинация AMG 510 X AMG 511 оказывает слабое синергетическое действие в линии клеток MIA РаСа-2.In fig. 33 shows that the combination of AMG 510 X AMG 511 has a weak synergistic effect in the MIA PaCa-2 cell line.

На фиг. 34 показано, что комбинация AMG 510 X AMG 511 оказывает умеренное синергетическое действие в СТ-26 KRAS p.G12C.In fig. 34 shows that the combination AMG 510 X AMG 511 has a moderate synergistic effect in ST-26 KRAS p.G12C.

На фиг. 35 показано, что комбинация AMG 510 X бупарлисиб (BKM120) оказывает умеренное синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 35 shows that the combination of AMG 510 X buparlisib (BKM120) has a moderate synergistic effect in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 36 показано, что AMG 510 X AZD5363 оказывает слабое синергетическое действие в линии клеток NCI-H358.In fig. 36 shows that AMG 510 X AZD5363 has a weak synergistic effect in the NCI-H358 cell line.

На фиг. 37 показано, что AMG 5120 X AZD5363 оказывает слабое синергетическое действие в MIA PaCa-2.In fig. 37 shows that AMG 5120 X AZD5363 has a weak synergistic effect in MIA PaCa-2.

- 16 045330- 16 045330

На фиг. 38 показано, что AMG 510 подавляет передачу сигнала KRAS в СТ-26 KRAS p.G12C в 2D культуре.In fig. 38 shows that AMG 510 suppresses KRAS signaling in CT-26 KRAS p.G12C in 2D culture.

На фиг. 39 показано, что клетки СТ-26 KRAS p.G12C чувствительны к AMG 510 в 3D культуре.In fig. 39 shows that CT-26 KRAS p.G12C cells are sensitive to AMG 510 in 3D culture.

На фиг. 40а показана рентгеновская сокристаллическая структура KRASG12C/C51S/C80L/Cn8S, связанная с GDP и ARS-1620 (PDB ID: 5V9U).In fig. Figure 40a shows the X-ray cocrystal structure of KRAS G12C/C51S/C80L/Cn8S bound to GDP and ARS-1620 (PDB ID: 5V9U).

На фиг. 40b показана рентгеновская сокристаллическая структура kraSg12C/C51S/C80l/c118S, связанная с GDP и AMG 510 при разрешении 1,65 A (PDB ID: еще не назначен).In fig. 40b shows the X-ray cocrystal structure of kraS g12C/C51S/C80l/c118S bound to GDP and AMG 510 at 1.65 A resolution (PDB ID: not yet assigned).

На фиг. 40с показана биохимическая активность AMG 510 и ARS-1620, измеренная в анализе катализируемого SOS1 обмена нуклеотидов с очищенным белком kraSg12C/c118A или KRASc118A, n=4.In fig. 40c shows the biochemical activity of AMG 510 and ARS-1620 measured in an SOS1-catalyzed nucleotide exchange assay with purified kraS g12C/c118A or KRAS c118A protein, n=4.

На фиг. 40d показаны кинетические свойства AMG 510 и ARS-1620, определяемые с помощью масс-спектрометрии (n>2).In fig. 40d shows the kinetic properties of AMG 510 and ARS-1620 determined by mass spectrometry (n>2).

На фиг. 40е показана клеточная активность AMG 510 и ARS-1620 в NCI-H358 и MIA PaCa-2, измеренная с помощью ингибирования фосфорилирования ERK1/2 после 2-часовой обработки (n=2).In fig. Figure 40f shows cellular activity of AMG 510 and ARS-1620 in NCI-H358 and MIA PaCa-2 measured by inhibition of ERK1/2 phosphorylation after 2 hour treatment (n=2).

На фиг. 40f показано ингибирование фосфорилирования ERK и занятость KRASG12C AMG 510 в клетках NCI-H358 и MIA PaCa-2 после 2-часовой обработки (n=3).In fig. 40f shows inhibition of ERK phosphorylation and KRAS G12C occupancy by AMG 510 in NCI-H358 and MIA PaCa-2 cells after 2 hour treatment (n=3).

На фиг. 40g показана клеточная активность AMG 510 и ARS-1620 в NCI-H358 и MIA PaCa-2, измеренная с помощью эффектов в отношении жизнеспособности клеток после 72-часовой обработки (n=3).In fig. 40g shows the cellular activity of AMG 510 and ARS-1620 in NCI-H358 and MIA PaCa-2 measured by effects on cell viability after 72 hour treatment (n=3).

На фиг. 40h показаны кинетические свойства AMG 510 и ARS-1620, определяемые с помощью ингибирования фосфорилирования ERK (n>2).In fig. 40h shows the kinetic properties of AMG 510 and ARS-1620 determined by inhibition of ERK phosphorylation (n>2).

На фиг. 41а показан эффект в отношении клеточной передачи сигнала в NCI-H358 или MIA PaCa-2 после 4- или 24-часовой обработки зависимым от дозы AMG 510.In fig. 41a shows the effect on cell signaling in NCI-H358 or MIA PaCa-2 after 4 or 24 hours of dose-dependent treatment with AMG 510.

На фиг. 41b показан эффект в отношении клеточной передачи сигнала в NCI-H358 или MIA PaCa-2 после обработки с помощью 0,1 мкМ AMG 510 в моменты времени до 24 ч.In fig. 41b shows the effect on cell signaling in NCI-H358 or MIA PaCa-2 following treatment with 0.1 µM AMG 510 at time points up to 24 hours.

На фиг. 41с показана клеточная активность AMG 510 на панели линий клеток с мутантом KRAS p.G12C и линий клеток без мутанта KRAS p.G12C, измеренная с помощью ингибирования фосфорилирования ERK1/2 после 2-часовой обработки (n>2).In fig. 41c shows the cellular activity of AMG 510 in a panel of KRAS p.G12C mutant cell lines and non-KRAS p.G12C mutant cell lines measured by inhibition of ERK1/2 phosphorylation after 2 hours of treatment (n>2).

На фиг. 41d показана клеточная активность AMG 510 на панели линий клеток с мутантом KRAS p.G12C и линий клеток без мутанта KRAS p.G12C, измеренная с помощью эффектов в отношении жизнеспособности клеток после 72-часовой обработки.In fig. 41d shows the cellular activity of AMG 510 in a panel of KRAS p.G12C mutant cell lines and non-KRAS p.G12C mutant cell lines, measured by effects on cell viability after 72 hour treatment.

На фиг. 41e показаны кривые зависимости жизнеспособности от дозы, которые являются иллюстративными примерами по меньшей мере n=1 экспериментов. Эффект 72-часовой обработки с помощью AMG 510 в отношении жизнеспособности клеток в условиях адгерентного монослоя или сфероидной культуры (n=2).In fig. 41e shows viability versus dose curves that are illustrative examples of at least n=1 experiments. Effect of 72-hour treatment with AMG 510 on cell viability in adherent monolayer or spheroid culture conditions (n=2).

На фиг. 41f показан анализ цистеинового протеома лизатов цельных клеток NCI-H358 после 4часовой обработки с помощью 1 мкМ AMG 510 (n=5).In fig. 41f shows cysteine proteome analysis of NCI-H358 whole cell lysates after 4 hours treatment with 1 µM AMG 510 (n=5).

На фиг. 42a-d показано, что AMG 510 подавляет фосфорилирование ERK1/2 в опухолях с мутантом KRAS p.G12C in vivo. Мышам, несущим опухоли MIA PaCa-2 T2 (фиг. 42а, с, d) или NCI-H358 (фиг. 42b) давали однократную дозу либо среды-носителя перорально, либо AMG 510 перорально (все другие столбики) и собирали через 2 часа (фиг. 42а, b) или через указанное время (фиг. 42с, d) и оценивали по уровням p-ERK, измеренным с помощью иммуноанализа MSD. Собирали образцы плазмы крови и опухоли и анализировали в отношении концентраций AMG 510 (красные треугольники, черные незаштрихованные кружочки соответственно). Данные представлены как процент контроля по сравнению со средойносителем. Данные представляют среднее значение объема опухоли ±SEM (n=3/груnпа). Фиг. 42a-d: ****Р<0,0001; *Р<0,05 по ДанНанетту.In fig. 42a-d show that AMG 510 suppresses ERK1/2 phosphorylation in KRAS p.G12C mutant tumors in vivo. Mice bearing MIA PaCa-2 T2 (FIG. 42a, c, d) or NCI-H358 (FIG. 42b) tumors were given a single dose of either vehicle orally or AMG 510 orally (all other bars) and collected 2 hours later. (Fig. 42a, b) or at the indicated times (Fig. 42c, d) and assessed by p-ERK levels measured using the MSD immunoassay. Plasma and tumor samples were collected and analyzed for AMG 510 concentrations (red triangles, black open circles, respectively). Data are presented as percentage of control compared to vehicle. Data represent mean tumor volume ±SEM (n=3/group). Fig. 42a-d: ****P<0.0001; *P<0.05 according to DanNanette.

На фиг. 42е показаны результаты обработки с помощью AMG 510 по режиму введения дозы в ковалентной модификации KRASG12C с использованием масс-спектрометрии с корреляцией по ингибированию p-ERK у мышей, несущих MIA PaCa-2 Т2.In fig. 42e shows the results of AMG 510 treatment at a covalent modification of KRAS G12C dosing regimen using mass spectrometry with correlation for p-ERK inhibition in mice bearing MIA PaCa-2 T2.

На фиг. 42f показаны результаты обработки с помощью AMG 510 по режиму введения дозы в ковалентной модификации KRASG12C с использованием масс-спектрометрии с корреляцией по ингибированию p-ERK у мышей, несущих NCI-H358.In fig. 42f shows the results of AMG 510 treatment at a covalent modification of KRAS G12C dosing regimen using mass spectrometry with correlation for p-ERK inhibition in NCI-H358-bearing mice.

На фиг. 42g показаны результаты обработки с помощью AMG 510 в течение некоторого времени в ковалентной модификации KRASG12C с использованием масс-спектрометрии с корреляцией по ингибированию p-ERK у мышей, несущих MIA PaCa-2 Т2.In fig. 42g shows the results of treatment with AMG 510 over time in the covalent modification of KRAS G12C using mass spectrometry with correlation for p-ERK inhibition in mice bearing MIA PaCa-2 T2.

На фиг. 43а показано, что мышам с установленными опухолями MIA PaCa-2 Т2 KRAS p.G12C, вводили дозу либо среды-носителя, либо AMG 510. AMG 510 селективно ингибирует рост опухолей с мутантом KRAS p.G12C in vivo.In fig. 43a shows that mice bearing established MIA PaCa-2 T2 KRAS p.G12C tumors were dosed with either vehicle or AMG 510. AMG 510 selectively inhibits the growth of KRAS p.G12C mutant tumors in vivo.

На фиг. 43b показано, что мышам с установленными опухолями NCI-H358 KRAS p.G12C вводили дозу либо среды-носителя, либо AMG 510. AMG 510 селективно ингибирует рост опухолей с мутантом KRAS p.G12C in vivo.In fig. 43b shows that mice bearing established NCI-H358 KRAS p.G12C tumors were dosed with either vehicle or AMG 510. AMG 510 selectively inhibits the growth of KRAS p.G12C mutant tumors in vivo.

На фиг. 43с показано, что мышам с установленными опухолями СТ-26 KRAS p.G12C вводили дозу либо среды-носителя, либо AMG 510. AMG 510 селективно ингибирует рост опухолей с мутантом KRAS p.G12C in vivo.In fig. 43c shows that mice bearing established CT-26 KRAS p.G12C tumors were dosed with either vehicle or AMG 510. AMG 510 selectively inhibits the growth of KRAS p.G12C mutant tumors in vivo.

- 17 045330- 17 045330

На фиг. 43d показаны эффекты роста опухоли на модели KRASG12C NSCLC PDX с мышами, обработанными либо средой-носителем, либо AMG 510. AMG 510 селективно ингибирует рост опухолей с мутантом KRAS p.G12C in vivo.In fig. 43d shows the effects of tumor growth in the KRAS G12C NSCLC PDX model with mice treated with either vehicle or AMG 510. AMG 510 selectively inhibits the growth of KRAS p.G12C mutant tumors in vivo.

На фиг. 43а, b, с и d данные представляют среднее значение объема опухоли ±SEM (n=10/груnпа). Фиг. 43а, b и с: ****P<0,0001, *Р<0,05 для сравнений получающей среду-носитель группы с обработанной группой по Даннетту, #Р<0,05 для регрессии, определяемой с помощью парного t-критерия, и ****P<0,0001 по двухфакторному ANOVA с RM.In fig. 43a, b, c and d data represent the mean tumor volume ±SEM (n=10/group). Fig. 43a, b and c: ****P<0.0001, *P<0.05 for comparisons of vehicle group with Dunnett's treated group, #P<0.05 for regression determined by paired t- criterion, and ****P<0.0001 by two-way ANOVA with RM.

На фиг. 43е показаны изображения СТ двух пациентов с карциномой легкого с KRAS p.G12C, которых лечили с помощью AMG 510. Иллюстративные изображения до обработки (исходный уровень) и поле обработки (Rx). Крайний слева: верхние панели представляют верхнюю левую долю легкого, а нижние панели представляют нижнюю правую долю легкого. Крайний справа: верхняя панель представляет верхнюю левую долю легкого; нижняя панель представляет плевру. AMG 510 селективно ингибирует рост опухолей с мутантом KRAS p.G12C in vivo.In fig. 43e shows CT images of two patients with KRAS p.G12C lung carcinoma who were treated with AMG 510. Illustrative images before treatment (baseline) and treatment field (R x ). Far left: The top panels represent the upper left lobe of the lung and the bottom panels represent the lower right lobe of the lung. Far right: top panel represents the upper left lobe of the lung; the bottom panel represents the pleura. AMG 510 selectively inhibits the growth of KRAS p.G12C mutant tumors in vivo.

На фиг. 43f и 47 показано, что мышам, несущим опухоли СТ-26 KRAS p.G12C, вводили дозу средыносителя или AMG 510. Отдельные графики опухоли СТ-26 KRAS p.G12C 510 мышей, обработанных с помощью AMG (100 мг/кг).In fig. 43f and 47 show that mice bearing CT-26 KRAS p.G12C tumors were dosed with vehicle or AMG 510. Separate plots of CT-26 KRAS p.G12C 510 tumors from mice treated with AMG (100 mg/kg).

На фиг. 43g и 47 проиллюстрировано, что мышам, несущим опухоли СТ-26 KRAS p.G12C, вводили дозу среды-носителя или AMG 510. Отдельные графики опухоли СТ-26 KRAS p.G12C 510 мышей, обработанных с помощью AMG (200 мг/кг). Продолжающаяся обработка получающей 100 мг/кг группы показало, что регрессия не была устойчивой (фиг. 43f), возможно, из-за неполного ингибирования p-ERK (фиг. 47а). Поэтому оценивали дозу 200 мг/кг AMG 510, которая привела к почти полному ингибированию p-ERK (фиг. 47а) и привела к длительному излечению в восьми из десяти случаях (фиг. 43g), при этом уровни AMG 510 в плазме крови были чуть ниже клеточной IC90 (фиг. 47h).In fig. 43g and 47 illustrate that mice bearing CT-26 KRAS p.G12C tumors were dosed with vehicle or AMG 510. Separate plots of CT-26 KRAS p.G12C 510 tumors from mice treated with AMG (200 mg/kg) . Continued treatment of the 100 mg/kg group showed that regression was not sustained (Fig. 43f), possibly due to incomplete inhibition of p-ERK (Fig. 47a). Therefore, a dose of 200 mg/kg AMG 510 was evaluated, which resulted in almost complete inhibition of p-ERK (Fig. 47a) and resulted in long-term cure in eight out of ten cases (Fig. 43g), while plasma AMG 510 levels were slightly below the cellular IC 90 (Fig. 47h).

На фиг. 44а показан AMG 510 в комбинации с карбоплатином на ксенотрансплантатах опухоли NCI-H358.In fig. Figure 44a shows AMG 510 in combination with carboplatin on NCI-H358 tumor xenografts.

На фиг. 44b показаны баллы синергизма для комбинаций AMG 510 с нацеливаемыми средствами, рассчитанные с использованием алгоритма избытка величины аддитивности Loewe и представленные в виде тепловой карты, при этом более высокие баллы (темный красный цвет) обозначают более сильные синергетические взаимодействия.In fig. 44b shows synergy scores for combinations of AMG 510 with targeted agents, calculated using Loewe's excess additivity algorithm and plotted as a heat map, with higher scores (dark red) indicating stronger synergistic interactions.

На фиг. 44с показан AMG 510 в комбинации с ингибитором MEK (PD-0325901) на ксенотрансплантатах опухоли NCI-H358.In fig. 44c shows AMG 510 in combination with a MEK inhibitor (PD-0325901) on NCI-H358 tumor xenografts.

На фиг. 44а и с данные представляют среднее значение объема опухоли ±SEM (n=10/груnпа). а: ***Р<0,001 для сравнения комбинированного лечения с каждым отдельным средством по Даннетту, #Р<0,001 для регрессии, определяемой с помощью парного t-критерия. с: ****Р<0,001 для комбинированного лечения по сравнению с каждым отдельным средством по Даннетту, #Р<0,001 для регрессии, определяемой с помощью парного t-критерия. Результаты для всех обработанных групп были значимыми по сравнению с получающими среду-носитель (****P<0,0001 по Даннетту).In fig. 44a and c data represent the mean tumor volume ±SEM (n=10/group). a: ***P<0.001 for Dunnett's comparison of combination treatment with each individual treatment, #P<0.001 for regression determined by paired t-test. c: ****P<0.001 for combination treatment versus each individual treatment by Dunnett, #P<0.001 for regression determined by paired t-test. The results for all treated groups were significant compared with those receiving vehicle (****P<0.0001 by Dunnett).

На фиг. 45а показан рост опухоли СТ-26 KRAS p.G12C у отдельных мышей, обработанных одним из среды-носителя, AMG 510, антитела к PD-1 или AMG 510 в комбинации с антителом к PD-1 (n=10/груnпа). Линии с кружками показывают мышей без опухолей.In fig. 45a shows CT-26 KRAS p.G12C tumor growth in individual mice treated with either vehicle, AMG 510, anti-PD-1 antibody, or AMG 510 in combination with anti-PD-1 antibody (n=10/group). Circled lines indicate tumor-free mice.

На фиг. 45b показан анализ Каплана-Мейера суррогатной конечнойточки выживаемости (размер опухоли > 800 мм3). ****P<0,001 по Коксу-Мантелю для контроля средой-носителем; #Р<0,005 для комбинации по сравнению с AMG 510 или антителом к PD-1 отдельно.In fig. Figure 45b shows Kaplan-Meier analysis of the surrogate endpoint of survival (tumor size > 800 mm 3 ). ****P<0.001 Cox-Mantel for vehicle control; #P<0.005 for combination versus AMG 510 or anti-PD-1 alone.

На фиг. 45с показаны опухоли СТ-26 KRAS p.G12C мышей, обрабатываемых на протяжении четырех дней одним из среды-носителя, AMG 510, антитела к PD-1 или AMG 510 в комбинации с антителом к PD-1, или MEKi и иммунофенотипированных с помощью проточной цитометрии (n=8/груnпа). ****Р<0,0001, ***Р<0,001, **Р<0,01, *Р<0,05 по Тьюки по сравнению с контролем средой-носителем; NS=не значимое.In fig. 45c shows tumors from CT-26 KRAS p.G12C mice treated for four days with one of vehicle, AMG 510, anti-PD-1 antibody, or AMG 510 in combination with anti-PD-1 antibody, or MEKi and immunophenotyped by flow-through cytometry (n=8/group). ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05 according to Tukey compared to vehicle control; NS=not significant.

На фиг. 45d показана РНК, которая была выделена из опухолей СТ-26 KRAS p.G12C после двух дней обработки (n=5/груnпа). Экспрессию генов и баллы рассчитывали с помощью технологии NanoString (см. способы). ****P<0,0001, ***P<0,001 по Тьюки.In fig. 45d shows RNA that was isolated from CT-26 KRAS p.G12C tumors after two days of treatment (n=5/group). Gene expression and scores were calculated using NanoString technology (see methods). ****P<0.0001, ***P<0.001 by Tukey.

На фиг. 45е показана экспрессия на клеточной поверхности антигена H-2Kd МНС класса I на клетках СТ-26 KRAS p.G12C после 24-часовой обработки с помощью AMG 510 в присутствии или в отсутствие интерферона гамма (IFNy), измеренная с помощью проточной цитометрии. Уровни секретируемого IFN-γ измеряли с помощью анализа ELISpot (n=4-5/груnпа).In fig. Figure 45e shows cell surface expression of MHC class I H-2K d antigen on CT-26 KRAS p.G12C cells after 24 hours treatment with AMG 510 in the presence or absence of interferon gamma (IFNy), measured by flow cytometry. Secreted IFN-γ levels were measured by ELISpot assay (n=4-5/group).

На фиг. 45f показан рост отдельных опухолей у мышей, которых подвергали обработке с помощью AMG 510 плюс обработка антителом к PD-1 и повторно сенсибилизировали клетками СТ-26 KRAS p.G12C, СТ-26 или 4Т1.In fig. 45f shows the growth of individual tumors in mice that were treated with AMG 510 plus anti-PD-1 antibody treatment and re-coated with CT-26 KRAS p.G12C, CT-26 or 4T1 cells.

На фиг. 45g показано, что спленоциты собирали и заражали указанными клетками СТ-26, СТ-26 KRAS p.G12C или 4Т1. *Р=0,0269 для сравнения контроля с комбинацией с помощью непарного tкритерия.In fig. 45g shows that splenocytes were collected and infected with the indicated CT-26, CT-26 KRAS p.G12C or 4T1 cells. *P=0.0269 for comparison of control with combination using unpaired t test.

- 18 045330- 18 045330

На фиг. 45h показано, что обработка с помощью AMG 510 индуцирует провоспалительное микроокружение опухоли. Опухоли СТ-26 KRAS p.G12C мышей, обрабатываемых на протяжении четырех дней одним из среды-носителя, AMG 510, антитела к PD-1 или AMG 510 в комбинации с антителом к PD-1 или MEKi, иммунофенотипировали с помощью иммуногистохимии (n=5/группа), иммуногистохимического окрашивания в отношении CD3/Ki67. Иммунопозитивное окрашивание в отношении Ki67 является синим и окрашивает ядра, а иммунопозитивное окрашивание в отношении CD3 и CD8 является коричневым и окрашивает цитоплазму. Стрелки в h указывают на примеры клеток с двойной иммунопозитивностью в отношении CD3 и Ki67.In fig. 45h shows that treatment with AMG 510 induces a proinflammatory tumor microenvironment. Tumors from CT-26 KRAS p.G12C mice treated for four days with either vehicle, AMG 510, anti-PD-1, or AMG 510 in combination with anti-PD-1 or MEKi were immunophenotyped by immunohistochemistry (n= 5/group), immunohistochemical staining for CD3/Ki67. Immunopositive staining for Ki67 is blue and stains the nuclei, and immunopositive staining for CD3 and CD8 is brown and stains the cytoplasm. Arrows in h indicate examples of cells with dual immunopositivity for CD3 and Ki67.

На фиг. 45i показано, что обработка с помощью AMG 510 индуцирует провоспалительное микроокружение опухоли, опухоли СТ-26 KRAS p.G12C мышей, обрабатываемых на протяжении четырех дней одним из среды-носителя, AMG 510, антитела к PD-1 или AMG 510 в комбинации с антителом к PD-1 или MEKi, иммунофенотипировали с помощью иммуногистохимии (n=5/груnпа), иммуногистохимического окрашивания в отношении CD8. Иммунопозитивное окрашивание в отношении Ki67 является синим и окрашивает ядра, а иммунопозитивное окрашивание в отношении CD3 и CD8 является коричневым и окрашивает цитоплазму.In fig. 45i shows that treatment with AMG 510 induces a pro-inflammatory tumor microenvironment in CT-26 KRAS p.G12C mouse tumors treated for four days with either vehicle, AMG 510, anti-PD-1 antibody, or AMG 510 in combination with antibody to PD-1 or MEKi, immunophenotyped using immunohistochemistry (n=5/group), immunohistochemical staining for CD8. Immunopositive staining for Ki67 is blue and stains the nuclei, and immunopositive staining for CD3 and CD8 is brown and stains the cytoplasm.

На фиг. 46а показана биохимическая активность AMG 510 и его реакционноспособного пропионамидного аналога, измеренная в анализе катализируемого SOS1 обмена нуклеотидов с очищенным белком KRASG1 C C A или KRASC1 (n>2). На всех фигурах 46а-е данные представляют среднее значение ±SD для числа указанных независимых повторностей.In fig. 46a shows the biochemical activity of AMG 510 and its reactive propionamide analog measured in an SOS1-catalyzed nucleotide exchange assay with purified KRASG 1 CCA or KRAS C1 protein (n>2). In all Figures 46a-1, data represent the mean ±SD of the number of independent replicates indicated.

На фиг. 46b показаны вычисленные максимальные скорости реакции и концентрации, при которых достигается полумаксимальная скорость AMG 510 и ARS-1620.In fig. Figure 46b shows the calculated maximum reaction rates and concentrations at which the half-maximum rate of the AMG 510 and ARS-1620 is achieved.

На фиг. 46с показано ингибирование фосфорилирования ERK с помощью RMC-4550 в клетках NCIH358 с t1/2=12,2 мин (n=2).In fig. 46c shows inhibition of ERK phosphorylation by RMC-4550 in NCIH358 cells with t 1/2 =12.2 min (n=2).

На фиг. 46d показан эффект 72-часовой обработки с помощью AMG 510 в отношении жизнеспособности клеток в условиях адгерентного монослоя или сфероидной культуры в MIA PaCa-2 и NCIH1373 (n=2).In fig. 46d shows the effect of 72 hours treatment with AMG 510 on cell viability under adherent monolayer or spheroid culture conditions in MIA PaCa-2 and NCIH1373 (n=2).

На фиг. 46е показано определение периода полувыведения KRAS в клетках MIA PaCa-2 и NCIH358 с помощью введение метки стабильного изотопа в клеточную культуру с помощью аминокислот (SILAC).In fig. 46e shows the determination of the half-life of KRAS in MIA PaCa-2 and NCIH358 cells using stable isotope labeling of cell culture with amino acids (SILAC).

На фиг. 47а-с показано, что несущих опухоль СТ-26 KRAS p.G12C мышей обрабатывали однократной дозой среды-носителя перорально или указанными дозами AMG 510 перорально и собирали через 2 ч. Уровни p-ERK измеряли с помощью иммуноанализа MSD. Собирали образцы плазмы крови и опухоли и анализировали в отношении концентраций AMG 510 (красные треугольники, черные незаштрихованные кружочки соответственно). Данные представлены как процент контроля (РОС) по сравнению со средой-носителем. ****P<0,0001, *Р<0,05 по Даннетту по сравнению со средой-носителем.In fig. 47a-c show that CT-26 KRAS p.G12C tumor-bearing mice were treated with a single dose of vehicle vehicle orally or the indicated doses of AMG 510 orally and collected 2 hours later. p-ERK levels were measured using the MSD immunoassay. Plasma and tumor samples were collected and analyzed for AMG 510 concentrations (red triangles, black open circles, respectively). Data are presented as percentage of control (POC) compared to vehicle. ****P<0.0001, *P<0.05 according to Dunnett compared with vehicle medium.

На фиг. 47d показано, что обработка с помощью AMG 510 приводит к ковалентной модификации KRASg12C, обратно коррелирующей с ингибированием p-ERK.In fig. 47d shows that treatment with AMG 510 results in a covalent modification of KRAS g12C , which inversely correlates with p-ERK inhibition.

На фиг. 47е показан эффект AMG 510 в отношении роста опухоли на модели ксенотрансплантата SW480-1AC.In fig. 47e shows the effect of AMG 510 on tumor growth in the SW480-1AC xenograft model.

На фиг. 47f показан эффект обработки с помощью AMG 510 в отношении роста опухоли на модели KRASG12C SCLC PDX. На фиг. 47е и f показано, что обработку начинали, когда опухоль достигала приблизительно 200 мм3. ****P<0,0001 по двухфакторному ANOVA с RM.In fig. 47f shows the effect of AMG 510 treatment on tumor growth in the KRAS G12C SCLC PDX model. In fig. 47e and f show that treatment began when the tumor reached approximately 200 mm 3 . ****P<0.0001 by two-way ANOVA with RM.

На фиг. 47g показаны уровни AMG 510 в плазме крови особей с ксенотрансплантатом MIA PaCa-2 Т2, NCI-H358.In fig. 47g shows plasma levels of AMG 510 from MIA PaCa-2 T2 xenograft individuals, NCI-H358.

На фиг. 47h показаны уровни AMG 510 в плазме крови особей с ксенотрансплантатом СТ-26 KRAS p.G12C.In fig. 47h shows the levels of AMG 510 in the blood plasma of individuals with a CT-26 KRAS p.G12C xenograft.

На фиг. 47i показаны отдельные графики для опухоли СТ-26 KRAS p.G12C обработанных с помощью AMG 510 мышей (200 мг/кг) среди голых мышей BALB/c от дня 14 до дня 32.In fig. 47i shows individual graphs for CT-26 KRAS p.G12C tumor treated with AMG 510 mice (200 mg/kg) among BALB/c nude mice from day 14 to day 32.

На фиг. 47j показаны изображения СТ двух пациентов с карциномой легкого с KRAS p.G12C, которых подвергали обработке с помощью AMG 510. Дополнительные иллюстративные изображения до обработки (исходный уровень) и после обработки (Rx) пациентов, ранее описанные на фигуре 43d (крайние левые слева сверху вниз): верхняя левая доля легкого, нижняя левая доля легкого, лимфатический узел, верхняя левая доля легкого, верхняя левая доля легкого. Крайние правые сверху вниз: нижняя левая доля легкого, нижняя левая доля легкого, плевра и надпочечник.In fig. 47j shows CT images of two KRAS p.G12C lung carcinoma patients who were treated with AMG 510. Additional illustrative pre-treatment (baseline) and post-treatment (R x ) images of the patients previously described in Figure 43d (far left from top to bottom): upper left lobe of the lung, lower left lobe of the lung, lymph node, upper left lobe of the lung, upper left lobe of the lung. Far right from top to bottom: lower left lobe of the lung, lower left lobe of the lung, pleura and adrenal gland.

На фиг. 47k показан AMG 510 в качестве отдельного средства или в комбинации с карбоплатином на ксенотрансплантатах опухоли NCI-H358. ****P<0,0001 по Даннетту для сравнения с контролем средой-носителем, #Р<0,001 для регрессии, определяемой с помощью парного t-критерия.In fig. 47k shows AMG 510 alone or in combination with carboplatin in NCI-H358 tumor xenografts. ****Dunnett's P<0.0001 for comparison with vehicle control, #P<0.001 for regression determined by paired t-test.

На фиг. 48 показаны матрицы ингибирования роста и избытка величины аддитивности Loewe для AMG 510, вводимого дозой в комбинации с нацеливаемыми средствами в указанной линии клеток, при этом более темными цветами обозначены более сильное уничтожение клеток (ингибирование роста) и более сильное синергетическое взаимодействие (избыток Loewe). Приведены максимальная тестируемая концентрация ингибиторов и диапазон доз, охватываемый матрицами в каждой комбинации. ОтдельныеIn fig. 48 shows growth inhibition and Loewe additivity excess matrices for AMG 510 dosed in combination with targeted agents in a given cell line, with darker colors indicating stronger cell killing (growth inhibition) and stronger synergistic interaction (Loewe excess). The maximum inhibitor concentration tested and the dose range covered by the matrices in each combination are given. Separate

- 19 045330 гетерологичные комбинации (АхВ) оценивали путем сравнения их соответствующих баллов синергизма с баллами их компонентов в самопересечении (Ах А или ВхВ). Гетерологические комбинации считали синергическими только тогда, когда их балл синергизма в три раза превышал балл синергизма любого компонента в самопересечении.- 19 045330 heterologous combinations (AxB) were evaluated by comparing their respective synergy scores with the scores of their components in the self-intersection (Ax A or BxB). Heterologous combinations were considered synergistic only when their synergy score was three times the synergy score of any component in the self-intersection.

На фиг. 49а показана клеточная активность AMG 510 и ингибитора MEK траметиниба в линии клеток СТ-26 KRAS p.G12C и родительской линии клеток СТ-26, измеренная с помощью ингибирования фосфорилирования ERK1/2 после 2-часовой обработки (n>2).In fig. 49a shows the cellular activity of AMG 510 and the MEK inhibitor trametinib in the CT-26 KRAS p.G12C cell line and the parental CT-26 cell line measured by inhibition of ERK1/2 phosphorylation after 2 hours of treatment (n>2).

На фиг. 49b показана клеточная активность AMG 510 и ингибитора MEK траметиниба в линии клеток СТ-26 KRAS p.G12C и родительской линии клеток СТ-26, измеренная с помощью эффектов в отношении жизнеспособности клеток после 72-часовой обработки в сфероидной культуре (n=2).In fig. 49b shows the cellular activity of AMG 510 and the MEK inhibitor trametinib in the CT-26 KRAS p.G12C cell line and the parent CT-26 cell line, measured by effects on cell viability after 72 hours treatment in spheroid culture (n=2).

На фиг. 50а показаны опухоли СТ-26 KRAS p.G12C мышей, обрабатываемых в течение четырех дней одним из среды-носителя, AMG 510, антитела к PD-1, AMG 510 плюс антитело к PD-1 или MEKi, и иммунофенотипированных с помощью проточной цитометрии (n=8/груnпа).In fig. 50a shows tumors from CT-26 KRAS p.G12C mice treated for four days with one of vehicle, AMG 510, anti-PD-1, AMG 510 plus anti-PD-1, or MEKi, and immunophenotyped by flow cytometry ( n=8/group).

На фиг. 50b показано, что несущих опухоль СТ-26 KRAS p.G12C мышей обрабатывали однократной дозой среды-носителя перорально (черный столбик) или указанной дозой MEKi перорально (синий столбик) и собирали через 2 ч. Уровни р-ERK измеряли с помощью иммуноанализа MSD. Собирали образцы плазмы крови и опухоли и анализировали в отношении концентрации MEKi (красные треугольники, черный незаштрихованный кружок соответственно). Данные представлены как процент контроля (РОС) по сравнению со средой-носителем.In fig. 50b shows that CT-26 KRAS p.G12C tumor-bearing mice were treated with a single dose of vehicle vehicle orally (black bar) or the indicated dose of MEKi orally (blue bar) and collected 2 hours later. p-ERK levels were measured using the MSD immunoassay. Plasma and tumor samples were collected and analyzed for MEKi concentration (red triangles, black open circle, respectively). Data are presented as percentage of control (POC) compared to vehicle.

На фиг. 50с показано, что эффект обработки с помощью MEKi в отношении роста опухоли в течение некоторого времени измеряли у несущих опухоль СТ-26 KRAS p.G12C мышей. Данные представляют среднее значение объема опухоли ±SEM (n=10/груnпа).In fig. 50c shows that the effect of MEKi treatment on tumor growth over time was measured in CT-26 KRAS p.G12C tumor-bearing mice. Data represent mean tumor volume ±SEM (n=10/group).

На фиг. 50d показаны объемы опухоли у несущих опухоль СТ-26 KRAS p.G12C мышей, которых лечили в течение четырех дней одним из среды-носителя, AMG 510, антитела к PD-1, AMG 510 плюс антитело к PD-1 или MEKi. Данные представляют среднее значение объема опухоли ±SEM (n=8/груnпа).In fig. 50d shows tumor volumes in CT-26 KRAS p.G12C tumor-bearing mice that were treated for four days with one of vehicle, AMG 510, anti-PD-1 antibody, AMG 510 plus anti-PD-1 antibody, or MEKi. Data represent mean tumor volume ±SEM (n=8/group).

На фиг. 50е показана РНК, которая была выделена из опухолей СТ-26 KRAS p.G12C через два дня обработки. Экспрессию генов и баллы рассчитывали с помощью технологии NanoString (n=5/груnпа).In fig. Figure 50 shows RNA that was isolated from CT-26 KRAS p.G12C tumors after two days of treatment. Gene expression and scores were calculated using NanoString technology (n=5/group).

На фиг. 50f показана экспрессия на клеточной поверхности антигенов МНС класса I (H-2Dd и H2Ld) на клетках СТ-26 KRAS p.G12C после 24-часовой обработки с помощью AMG 510 в присутствии или в отсутствие IFNy, измеренная с помощью проточной цитометрии.In fig. 50f shows cell surface expression of MHC class I antigens (H-2D d and H2L d ) on CT-26 KRAS p.G12C cells after 24 hours treatment with AMG 510 in the presence or absence of IFNy, measured by flow cytometry.

На фиг. 50g показаны кривые роста у мышей Balb/c, несущих опухоли либо СТ-26, либо СТ-26 KRAS p.G12C.In fig. 50g shows growth curves of Balb/c mice bearing either CT-26 or CT-26 KRAS p.G12C tumors.

На фиг. 50h показано количественное определение транскрипта CXCL10 или CXCL11, а также секретируемого белка IP-10 после 24-часовой обработки родительских клеток СТ-26 или СТ-26 KRAS p.G12C с помощью AMG 510 или MEKi.In fig. 50h shows quantification of CXCL10 or CXCL11 transcript and secreted IP-10 protein after 24-hour treatment of parental CT-26 or CT-26 KRAS p.G12C cells with AMG 510 or MEKi.

На фиг. 50i показана экспрессия на клеточной поверхности антигенов МНС класса I (HLA, H-2Dd и H-2Kd) на клетках СТ-26 KRAS p.G12C после 24-часовой обработки с помощью SW-1573, после 48часовой обработки с помощью MIA РаСА-2 и после 48-часовой обработки с помощью AMG 510 в присутствии или в отсутствие IFNy, измеренная с помощью проточной цитометрии.In fig. 50i shows cell surface expression of MHC class I antigens (HLA, H-2D d and H-2K d ) on CT-26 KRAS p.G12C cells after 24-hour treatment with SW-1573, after 48-hour treatment with MIA RaCA -2 and after 48 hours of treatment with AMG 510 in the presence or absence of IFNy, measured by flow cytometry.

На фиг. 50а, b, с и е *Р<0,05 по Тьюки для контроля средой-носителем; NS представляет собой отсутствие значимости; ***Р<0,001 по Даннетту по сравнению со средой-носителем и ****P<0,0001 по Даннетту по сравнению с контролем средой-носителем.In fig. 50a, b, c and e *P < 0.05 Tukey for vehicle control; NS represents lack of significance; ***Dunnett's P<0.001 versus vehicle and ****P<0.0001 Dunnett versus vehicle control.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

В настоящем изобретении предусмотрена комбинированная терапия, которая включает ингибитор KRASg12C и одно или несколько дополнительных фармацевтически активных средств, в частности, для лечения видов рака. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат ингибитор KRASG12C и одно или несколько дополнительных фармацевтически активных средств, для лечения видов рака. Соединения, раскрытые в данном документе, включают все фармацевтически приемлемые меченные изотопами соединения, при этом один или несколько атомов соединений, раскрытых в данном документе, заменены атомами, имеющими такое же атомное число, но атомную массу или массовое число, отличные от атомной массы или массового числа, обычно обнаруживаемых в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в раскрытые соединения, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора, хлора и йода, такие как 2Н, 3Н, ПС, 13С, 14С, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31Р, 32Р, 35S, 18F, 36Cl, 123I и 125I соответственно. Такие меченные радиоактивным изотопом соединения могут применяться для способствования определению или измерению эффективности соединений посредством описания, например, места или механизма действия или аффинности связывания с фармакологически важным местом действия. Некоторые меченные изотопами соединения по настоящему изобретению, например, соединения, в которые включен радиоактивный изотоп, являются применимыми в исследованиях распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Радиоактивные изотопы тритий, т.е. 3Н, и углерод-14, т.е. 14С, являются, в частности, применимыми для данной цели с учетом легкости их введения и готовых средств для их обнаружения.The present invention provides a combination therapy that includes a KRAS g12C inhibitor and one or more additional pharmaceutically active agents, particularly for the treatment of cancers. The present invention also provides pharmaceutical compositions that contain a KRAS G12C inhibitor and one or more additional pharmaceutically active agents for the treatment of cancers. The compounds disclosed herein include all pharmaceutically acceptable isotopically labeled compounds wherein one or more atoms of the compounds disclosed herein are replaced by atoms having the same atomic number but an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number numbers commonly found in nature. Examples of isotopes that may be included in the disclosed compounds include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, fluorine, chlorine and iodine, such as 2H , 3H , PS , 13C , 14C , 13N , 15 N, 15 O, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, 123 I and 125 I, respectively. Such radiolabeled compounds may be used to help determine or measure the potency of the compounds by describing, for example, the site or mechanism of action or binding affinity to a pharmacologically important site of action. Certain isotope-labeled compounds of the present invention, for example, compounds into which a radioactive isotope is included, are useful in drug and/or substrate tissue distribution studies. Radioactive isotopes tritium, i.e. 3 H, and carbon-14, i.e. 14 C are particularly suitable for this purpose given the ease of their administration and the ready means for their detection.

- 20 045330- 20 045330

Замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, т.е. 2Н, может предоставлять некоторые терапевтические преимущества, возникающие вследствие более высокой устойчивости к инактивации в процессе метаболизма, например, повышенный период полувыведения in vivo или сниженные требования к дозировке, и, следовательно, является более предпочтительным в некоторых обстоятельствах.Substitution with heavier isotopes such as deuterium, i.e. 2H may provide some therapeutic benefits resulting from greater resistance to inactivation by metabolism, such as increased in vivo half-life or reduced dosage requirements, and is therefore preferred in some circumstances.

Замещение позитронно-активными изотопами, такими как ПС, 18F, 15O и 13N, может применяться в исследованиях с использованием позитронно-эмиссионной топографии (PET) для определения степени занятости рецептора субстратом. Меченные изотопами соединения со структурой (I), как правило, могут быть получены с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, или с помощью способов, аналогичных способам, описанным в разделах Препараты и Примеры, как изложено ниже, с применением соответствующего меченного изотопом реагента вместо немеченого реагента, используемого ранее.Substitution with positron-active isotopes such as PS , 18 F, 15 O and 13 N can be used in positron emission topography (PET) studies to determine the extent of receptor occupancy by a substrate. Isotopically labeled compounds of structure (I) can generally be prepared by conventional techniques known to those skilled in the art, or by methods similar to those described in the Preparations and Examples sections, as set forth below, using the appropriate labeled isotope of the reagent instead of the unlabeled reagent used previously.

Меченные изотопами соединения, раскрытые в данном документе, как правило, могут быть получены с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, или с помощью способов, аналогичных способам, описанным в прилагаемых примерах и схемах, с применением соответствующего меченного изотопом реагента вместо немеченого реагента, используемого ранее.The isotope-labeled compounds disclosed herein generally can be prepared by conventional techniques known to those skilled in the art, or by methods similar to those described in the accompanying Examples and Schemes using the appropriate isotope-labeled reagent in place of the unlabeled reagent. reagent used previously.

Некоторые из соединений, раскрытые в данном документе, могут существовать в виде стереоизомеров (т.е. изомеров, которые отличаются лишь пространственным расположением атомов), включая оптические изомеры и конформационные изомеры (или конформеры). Соединения, раскрытые в данном документе, включают все стереоизомеры как в виде чистых препаратов отдельных стереоизомеров, так и в виде обогащенных препаратов каждого стереоизомера, и как рацемические смеси таких стереоизомеров, так и отдельные диастереомеры и энантиомеры, которые могут быть разделены в соответствии со способами, которые известны специалистам в данной области техники. Кроме того, соединения, раскрытые в данном документе, включают все таутомерные формы соединений.Some of the compounds disclosed herein may exist as stereoisomers (ie, isomers that differ only in the spatial arrangement of the atoms), including optical isomers and conformational isomers (or conformers). The compounds disclosed herein include all stereoisomers, both as pure preparations of the individual stereoisomers and as fortified preparations of each stereoisomer, and both racemic mixtures of such stereoisomers and the individual diastereomers and enantiomers, which can be separated according to methods which are known to those skilled in the art. In addition, the compounds disclosed herein include all tautomeric forms of the compounds.

Некоторые из соединений, раскрытых в данном документе, могут существовать в виде атропоизомеров, которые являются конформационными стереоизомерами, которые возникают, когда вращение вокруг одинарной связи в молекуле предотвращается или сильно замедляется в результате стерических взаимодействий с другими частями молекулы. Соединения, раскрытые в данном документе, включают все атропоизомеры как в виде чистых препаратов отдельных атропоизомеров, так и в виде обогащенных препаратов каждого атропоизомера или неспецифическую смесь каждого атропоизомера. В тех случаях, если вращательный барьер вокруг одинарной связи достаточно высок, и взаимопревращение между конформациями является достаточно медленным, то могут допускаться разделение и выделение изомерных видов молекул. Разделение и выделение изомерных видов молекул соответственно обозначается хорошо известными и общепринятыми символами М или Р.Some of the compounds disclosed herein may exist as atropoisomers, which are conformational stereoisomers that occur when rotation around a single bond in a molecule is prevented or greatly retarded as a result of steric interactions with other parts of the molecule. The compounds disclosed herein include all atropisomers, both as pure preparations of the individual atropisomers, fortified preparations of each atropisomer, or a nonspecific mixture of each atropisomer. In cases where the rotational barrier around a single bond is sufficiently high and the interconversion between conformations is sufficiently slow, then separation and isolation of isomeric species of molecules may be allowed. The separation and isolation of isomeric species of molecules are respectively indicated by the well-known and generally accepted symbols M or P.

В другом варианте осуществления такие соединения могут использоваться в качестве промежуточных соединений в способе получения соединений в настоящей заявке.In another embodiment, such compounds may be used as intermediates in the process for preparing the compounds of the present application.

В другом варианте осуществления такие соединения могут находиться в форме фармацевтически приемлемой соли и в фармацевтическом составе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.In another embodiment, such compounds may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt and in a pharmaceutical composition with a pharmaceutically acceptable excipient.

Также в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, которые содержат соединение, раскрытое в данном документе, вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, таким как, например, разбавитель или носитель. Соединения и фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, предусматривают таковые, где соединение может быть введено в эффективном количестве для достижения своего предназначения. Введение соединения описано более подробно ниже.Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain a compound disclosed herein together with a pharmaceutically acceptable excipient, such as, for example, a diluent or carrier. Compounds and pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention are those where the compound can be administered in an effective amount to achieve its intended purpose. The administration of the compound is described in more detail below.

В другом варианте осуществления такие соединения могут использоваться в качестве промежуточных соединений в способе получения соединений в настоящей заявке.In another embodiment, such compounds may be used as intermediates in the process for preparing the compounds of the present application.

В другом варианте осуществления такие соединения могут находиться в форме фармацевтически приемлемой соли и в фармацевтическом составе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.In another embodiment, such compounds may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt and in a pharmaceutical composition with a pharmaceutically acceptable excipient.

Также в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, которые содержат соединение, раскрытое в данном документе, вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, таким как, например, разбавитель или носитель. Соединения и фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, предусматривают таковые, где соединение может быть введено в эффективном количестве для достижения своего предназначения. Введение соединения описано более подробно ниже.Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain a compound disclosed herein together with a pharmaceutically acceptable excipient, such as, for example, a diluent or carrier. Compounds and pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention are those where the compound can be administered in an effective amount to achieve its intended purpose. The administration of the compound is described in more detail below.

Подходящие фармацевтические составы могут быть определены специалистом в данной области техники в зависимости от пути введения и необходимой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1435-712 (18th ed., Mack Publishing Co, Истон, Пенсильвания, 1990 г.). Составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость in vivo высвобождения и скорость in vivo выведения введенных средств. В зависимости от пути введения подходящая доза может быть рассчитана в соответствии с весом тела, площадью поверхности тела или размером органов. Специалисты в данной области техники обычно проводят дальнейшее уточнение расчетов, необходимых для определения соответст- 21 045330 вующей лечебной дозы, без излишних экспериментов, особенно с учетом информации о дозе и анализов, раскрытых в данном документе, а также фармакокинетических данных, которые можно получить в клинических испытаниях на животных или людях.Suitable pharmaceutical formulations can be determined by one skilled in the art depending on the route of administration and the required dose. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1435-712 ( 18th ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990). The formulations may affect the physical state, stability, in vivo release rate, and in vivo elimination rate of the administered agents. Depending on the route of administration, the appropriate dose may be calculated according to body weight, body surface area or organ size. It is customary for those skilled in the art to further refine the calculations necessary to determine the appropriate treatment dose without undue experimentation, especially in light of the dose information and assays disclosed herein as well as the pharmacokinetic data that can be obtained in clinical trials. tests on animals or humans.

Фразы фармацевтически приемлемый или фармакологически приемлемый относятся к молекулярным веществам и композициям, которые не вызывают побочных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении животному или человеку. Применяемый в данном документе термин фармацевтически приемлемый включает все возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие абсорбцию, и т.п. Применение таких вспомогательных веществ для фармацевтически активных веществ широко известно в уровне техники. За исключением случаев, когда какие-либо традиционные среды или средство несовместимы с терапевтическими композициями, предполагается их применение в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции. В иллюстративных вариантах осуществления состав может содержать сухую кукурузную патоку, высокоолеиновое сафлоровое масло, кокосовое масло, соевое масло, L-лейцин, трехосновный фосфат кальция, L-тирозин, L-пролин, L-лизина ацетат, DATEM (эмульгатор), L-глутамин, L-валин, двухосновный фосфат калия, L-изолейцин, L-аргинин, L-аланин, глицин, L-аспарагин моногидрат, L-серин, цитрат калия, L-треонин, цитрат натрия, хлорид магния, L-гистидин, L-метионин, аскорбиновую кислоту, карбонат кальция, L-глутаминовую кислоту, L-цистина дигидрохлорид, L-триптофан, L-аспарагиновую кислоту, холинхлорид, таурин, м-инозитол, сульфат железа(П), аскорбилпальмитат, сульфат цинка, Lкарнитин, альфа-токоферилацетат, хлорид натрия, ниацинамид, смешанные токоферолы, пантотенат кальция, сульфат меди(П), тиаминхлорид гидрохлорид, витамин А пальмитат, сульфат марганца, рибофлавин, пиридоксин гидрохлорид, фолиевую кислоту, бета-каротин, иодид калия, филлохинон, биотин, селенат натрия, треххлористый хром, молибдат натрия, витамин D3 и цианокобаламин.The phrases pharmaceutically acceptable or pharmacologically acceptable refer to molecular substances and compositions that do not cause adverse, allergic or other adverse reactions when administered to an animal or human. As used herein, the term pharmaceutically acceptable includes all possible solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and absorption retarding agents, and the like. The use of such excipients for pharmaceutically active substances is widely known in the art. Unless any conventional media or agent is incompatible with the therapeutic compositions, their use in the therapeutic compositions is intended. Additional active ingredients may also be included in the compositions. In illustrative embodiments, the formulation may contain corn syrup powder, high oleic safflower oil, coconut oil, soybean oil, L-leucine, tribasic calcium phosphate, L-tyrosine, L-proline, L-lysine acetate, DATEM (emulsifier), L-glutamine , L-valine, dibasic potassium phosphate, L-isoleucine, L-arginine, L-alanine, glycine, L-asparagine monohydrate, L-serine, potassium citrate, L-threonine, sodium citrate, magnesium chloride, L-histidine, L -methionine, ascorbic acid, calcium carbonate, L-glutamic acid, L-cystine dihydrochloride, L-tryptophan, L-aspartic acid, choline chloride, taurine, m-inositol, iron (II) sulfate, ascorbyl palmitate, zinc sulfate, L-carnitine, alpha -tocopheryl acetate, sodium chloride, niacinamide, mixed tocopherols, calcium pantothenate, copper(II) sulfate, thiamine chloride hydrochloride, vitamin A palmitate, manganese sulfate, riboflavin, pyridoxine hydrochloride, folic acid, beta-carotene, potassium iodide, phylloquinone, biotin, selenate sodium, chromium trichloride, sodium molybdate, vitamin D3 and cyanocobalamin.

Соединение может присутствовать в фармацевтической композиции в виде фармацевтически приемлемой соли. Применяемая в данном документе фраза фармацевтически приемлемые соли включает, например, соли присоединения основания и соли присоединения кислоты.The compound may be present in the pharmaceutical composition as a pharmaceutically acceptable salt. As used herein, the phrase pharmaceutically acceptable salts includes, for example, base addition salts and acid addition salts.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы с помощью металлов или аминов, таких как щелочные и щелочноземельные металлы или органические амины. Фармацевтически приемлемые соли соединений также могут быть получены с помощью фармацевтически приемлемого катиона. Подходящие фармацевтически приемлемые катионы широко известны специалистам в данной области техники и включают щелочной, щелочноземельный, аммонийный катионы и катионы четвертичного аммония. Также возможным является использование карбонатов или гидрокарбонатов. Примеры металлов, применяемых в качестве катионов, представляют собой натрий, калий, магний, аммоний, кальций или трехвалентное железо и т.п. Примеры подходящих аминов включают изопропиламин, триметиламин, гистидин, К,К'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин.Pharmaceutically acceptable base addition salts can be formed with metals or amines, such as alkali and alkaline earth metals or organic amines. Pharmaceutically acceptable salts of the compounds can also be prepared using a pharmaceutically acceptable cation. Suitable pharmaceutically acceptable cations are widely known to those skilled in the art and include alkaline, alkaline earth, ammonium and quaternary ammonium cations. It is also possible to use carbonates or bicarbonates. Examples of metals used as cations are sodium, potassium, magnesium, ammonium, calcium or ferric iron and the like. Examples of suitable amines include isopropylamine, trimethylamine, histidine, K,K'-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, dicyclohexylamine, ethylenediamine, N-methylglucamine and procaine.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты включают соли неорганических или органических кислот. Примеры подходящих солей присоединения кислоты включают гидрохлориды, формиаты, ацетаты, цитраты, салицилаты, нитраты, фосфаты. Другие подходящие фармацевтически приемлемые соли широко известны специалистам в данной области техники и включают, например, соли, образованные с помощью муравьиной, уксусной, лимонной, щавелевой, винной или миндальной кислот, с помощью хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты или фосфорной кислоты; с помощью органических карбоновых, сульфоновых, сульфо- или фосфокислот или Nзамещенных сульфаминовых кислот, например, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты (TFA), пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, гидроксималеиновой кислоты, метилмалеиновой кислоты, фумаровой кислоты, яблочной кислоты, винной кислоты, молочной кислоты, щавелевой кислоты, глюконовой кислоты, глюкаровой кислоты, глюкуроновой кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, салициловой кислоты, 4-аминосалициловой кислоты, 2-феноксибензойной кислоты, 2-ацетоксибензойной кислоты, эмбоновой кислоты, никотиновой кислоты или изоникотиновой кислоты и с помощью аминокислот, таких как 20 альфа-аминокислот, вовлеченные в синтез белков в природе, например, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, а также с помощью фенилуксусной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, 2-гидроксиэтансульфоновой кислоты, этан-1,2-дисульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, 4-метилбензолсульфоновой кислоты, нафталин-2-сульфоновой кислоты, нафталин-1,5-дисульфоновой кислоты, 2- или 3-фосфоглицерата, глюкозо-6-фосфата, N-циклогексилсульфаминовой кислоты (с образованием цикламатов) или с помощью других кислотных органических соединений, таких как аскорбиновая кислота.Pharmaceutically acceptable acid addition salts include salts of inorganic or organic acids. Examples of suitable acid addition salts include hydrochlorides, formates, acetates, citrates, salicylates, nitrates, phosphates. Other suitable pharmaceutically acceptable salts are well known to those skilled in the art and include, for example, those formed with formic, acetic, citric, oxalic, tartaric or mandelic acids, with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid or phosphoric acid; with organic carboxylic, sulfonic, sulfo- or phosphoric acids or N-substituted sulfamic acids, for example acetic acid, trifluoroacetic acid (TFA), propionic acid, glycolic acid, succinic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, methylmaleic acid, fumaric acid, malic acid , tartaric acid, lactic acid, oxalic acid, gluconic acid, glucaric acid, glucuronic acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-acetoxybenzoic acid, embonic acid acid, nicotinic acid or isonicotinic acid and with amino acids such as the 20 alpha amino acids involved in the synthesis of proteins in nature, for example glutamic acid or aspartic acid, as well as with phenylacetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid acid, ethane-1,2-disulfonic acid, benzenesulfonic acid, 4-methylbenzenesulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, naphthalene-1,5-disulfonic acid, 2- or 3-phosphoglycerate, glucose-6-phosphate, N- cyclohexylsulfamic acid (to form cyclamates) or with other acidic organic compounds such as ascorbic acid.

Фармацевтические композиции, содержащие соединения, раскрытые в данном документе, могут быть изготовлены традиционным способом, например, посредством способов традиционного смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсуляции, захвата или лиофилизации. Надлежащий состав зависит от выбранного пути введения.Pharmaceutical compositions containing the compounds disclosed herein can be prepared in conventional manner, for example, through conventional mixing, dissolving, granulating, dragee-making, trituration, emulsification, encapsulation, entrapment, or lyophilization processes. The appropriate formulation depends on the route of administration chosen.

Подходящие композиции для перорального введения могут быть легко составлены путем объедине- 22 045330 ния соединения, раскрытого в данном документе, с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как носители, широко известные в уровне техники. Такие вспомогательные вещества и носители позволяют составлять соединения по настоящему изобретению в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема внутрь пациентом, который подлежит лечению. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены путем добавления к соединению, раскрытому в данном документе, твердого вспомогательного вещества, необязательно измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления при необходимости подходящих вспомогательных средств с получением таблеток или ядер драже. Подходящие вспомогательные вещества включают, например, наполнители и целлюлозные препараты. При необходимости могут быть добавлены вещества для улучшения распадаемости таблеток. Фармацевтически приемлемые ингредиенты хорошо известны для различных типов составов и могут представлять собой, например, связующие (например, природные или синтетические полимеры), смазывающие вещества, поверхностно-активные вещества, подсластители и ароматизирующие средства, материалы для нанесения покрытия, консерванты, красители, загустители, вспомогательные вещества, антимикробные средства, антиоксиданты и носители для различных типов составов.Suitable compositions for oral administration can be readily formulated by combining the compound disclosed herein with pharmaceutically acceptable excipients, such as carriers well known in the art. Such excipients and carriers allow the compounds of the present invention to be formulated into tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, and the like. for oral administration by the patient being treated. Pharmaceutical preparations for oral use can be prepared by adding a solid excipient to a compound disclosed herein, optionally grinding the resulting mixture, and processing the mixture into granules after adding suitable excipients, if necessary, to obtain tablets or dragee cores. Suitable excipients include, for example, fillers and cellulosic preparations. If necessary, substances can be added to improve the disintegration of tablets. Pharmaceutically acceptable ingredients are well known for various types of formulations and may include, for example, binders (e.g., natural or synthetic polymers), lubricants, surfactants, sweeteners and flavoring agents, coating materials, preservatives, colorants, thickeners, excipients, antimicrobial agents, antioxidants and carriers for various types of formulations.

Если терапевтически эффективное количество соединения, раскрытого в данном документе, вводят перорально, то композиция, как правило, находится в форме твердого состава (например, таблетки, капсулы, пилюли, порошка или пастилки) или жидкого состава (например, водной суспензии, раствора, настойки или сиропа).If a therapeutically effective amount of a compound disclosed herein is administered orally, the composition will typically be in the form of a solid formulation (e.g., tablet, capsule, pellet, powder or lozenge) or liquid formulation (e.g., aqueous suspension, solution, tincture or syrup).

При введении в форме таблетки композиция может дополнительно содержать функциональное твердое вещество и/или твердый носитель, такой как желатин или вспомогательное средство. Таблетка, капсула и порошок могут содержать от приблизительно 1 до приблизительно 95% соединения и предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 90% соединения.When administered in tablet form, the composition may further comprise a functional solid and/or a solid carrier such as gelatin or an excipient. The tablet, capsule and powder may contain from about 1 to about 95% of the compound, and preferably from about 15 to about 90% of the compound.

При введении в форме жидкости или суспензии могут быть добавлены функциональная жидкость и/или жидкий носитель, такой как вода, углеводородный носитель или масла животного или растительного происхождения. Жидкая форма композиции может дополнительно содержать физиологический раствор, растворы сахарных спиртов, растворы декстрозы или других сахаридов или гликоли. При введении в форме жидкости или суспензии композиция может содержать от приблизительно 0,5 до приблизительно 90% по весу соединения, раскрытого в данном документе, и предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 50% соединения, раскрытого в данном документе. В одном варианте осуществления предусмотрено, что жидкий носитель является неводным или по сути неводным. Композиция, предназначенная для введения в форме жидкости, может поставляться в виде быстрорастворимого твердого состава или суспензии для растворения непосредственно перед введением.When administered in the form of a liquid or suspension, a functional liquid and/or a liquid carrier such as water, a hydrocarbon carrier, or oils of animal or plant origin may be added. The liquid form of the composition may further contain saline, solutions of sugar alcohols, solutions of dextrose or other saccharides or glycols. When administered in liquid or suspension form, the composition may contain from about 0.5 to about 90% by weight of a compound disclosed herein, and preferably from about 1 to about 50% by weight of a compound disclosed herein. In one embodiment, the liquid carrier is provided to be non-aqueous or substantially non-aqueous. The composition, intended for administration in liquid form, may be supplied as a rapidly dissolving solid formulation or as a suspension for dissolution immediately prior to administration.

Если терапевтически эффективное количество соединения, раскрытого в данном документе, вводят посредством внутривенной, кожной или подкожной инъекции, композиция находится в форме апирогенного, приемлемого для парентерального введения водного раствора. Получение таких приемлемых для парентерального введения растворов, имеющих соответствующие pH, изотоничность, стабильность и т.п., находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Предпочтительная композиция для внутривенной, кожной или подкожной инъекции, как правило, содержит в дополнение к соединению, раскрытому в данном документе, изотоническую среду-носитель. Такие композиции могут быть получены для введения в виде растворов свободного основания или фармакологически приемлемых солей в воде, соответствующим образом смешанных с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В обычных условиях хранения и применения такие препараты могут необязательно содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.When a therapeutically effective amount of a compound disclosed herein is administered by intravenous, dermal, or subcutaneous injection, the composition is in the form of a pyrogen-free, parenterally acceptable aqueous solution. The preparation of such parenterally acceptable solutions having appropriate pH, isotonicity, stability, etc. is within the skill of one skilled in the art. A preferred composition for intravenous, dermal, or subcutaneous injection typically contains, in addition to the compound disclosed herein, an isotonic carrier medium. Such compositions can be prepared for administration as solutions of the free base or pharmacologically acceptable salts in water suitably mixed with a surfactant such as hydroxypropylcellulose. Dispersions can also be obtained in glycerin, liquid polyethylene glycols and mixtures thereof, as well as in oils. Under normal conditions of storage and use, such preparations may not necessarily contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.

Инъекционные композиции могут включать стерильные водные растворы, суспензии или дисперсии и стерильные порошки для немедленного получения стерильных инъекционных растворов, суспензий или дисперсий. Во всех вариантах осуществления форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить шприцем. Она должна быть устойчивой в условиях изготовления и хранения и должна противостоять загрязняющему действию микроорганизмов, таких как бактерии и грибы, благодаря необязательному включению консерванта. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси, а также растительные масла. В одном варианте осуществления предусмотрено, что носитель является неводным или по сути неводным. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц соединения в варианте осуществления в виде дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть вызвано различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тиомерсалом и т.п. Во множестве вариантов осуществления будет предпочтительным включение изотонических средств, например, Сахаров или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута путем применения в композициях средств замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.Injectable compositions may include sterile aqueous solutions, suspensions or dispersions and sterile powders for the immediate preparation of sterile injectable solutions, suspensions or dispersions. In all embodiments, the form must be sterile and must be fluid to the extent that it can be easily syringed. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must resist the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi through the optional inclusion of a preservative. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyol (eg, glycerin, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. In one embodiment, the carrier is provided to be non-aqueous or substantially non-aqueous. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by maintaining the desired particle size of the compound in the dispersion embodiment, and by the use of surfactants. Prevention of exposure to microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thiomersal, etc. In many embodiments, it will be preferred to include isotonic agents, for example, Sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of injectable compositions can be achieved by using absorption retarding agents in the compositions, for example aluminum monostearate and gelatin.

- 23 045330- 23 045330

Стерильные инъекционные растворы получают путем дополнения по мере необходимости активных соединений в требуемом количестве в соответствующем растворителе различными другими ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В варианте осуществления, представляющем собой стерильные порошки, предназначенные для получения стерильных инъекционных растворов, предпочтительные способы получения представляют собой методики вакуумной сушки и лиофильной сушки, которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.Sterile injection solutions are prepared by supplementing the active compounds in the required quantity in an appropriate diluent as needed with the various other ingredients listed above, followed by sterilization by filtration. Typically, dispersions are prepared by incorporating various sterilized active ingredients into a sterile carrier medium that contains the basic dispersion medium and the required other ingredients listed above. In the embodiment of sterile powders intended for the preparation of sterile injectable solutions, preferred production methods are vacuum drying and freeze drying techniques that provide a powder of the active ingredient plus any additional required ingredient from a pre-sterile filtered solution thereof.

Составы с медленным высвобождением или замедленным высвобождением также могут быть получены с целью достижения контролируемого высвобождения активного соединения в контакте с жидкостями организма в желудочно-кишечном тракте и для обеспечения по сути постоянного и эффективного уровня активного соединения в плазме крови. Например, высвобождение может контролироваться одним или несколькими из растворения, диффузии и ионного обмена. Кроме того, подход с медленным высвобождением может усиливать абсорбцию через насыщаемые или ограничивающие пути в желудочно-кишечном тракте. Например, для данной цели соединение может быть встроено в полимерную матрицу из биологически разлагаемого полимера, водорастворимого полимера или смеси обоих и необязательно подходящих поверхностно-активных веществ. В данном контексте встраивание может означать включение микрочастиц в матрицу полимеров. Составы с контролируемым высвобождением также получают путем инкапсуляции диспергированных микрочастиц или эмульгированных микрокапель с помощью известных технологий дисперсионного или эмульсионного покрытия.Slow-release or sustained-release formulations may also be prepared to achieve controlled release of the active compound in contact with body fluids in the gastrointestinal tract and to provide a substantially constant and effective plasma level of the active compound. For example, release may be controlled by one or more of dissolution, diffusion, and ion exchange. Additionally, a slow-release approach may enhance absorption through saturable or limiting pathways in the gastrointestinal tract. For example, for this purpose, the compound may be incorporated into a polymer matrix of a biodegradable polymer, a water-soluble polymer, or a mixture of both and optionally suitable surfactants. In this context, embedding may mean the incorporation of microparticles into a matrix of polymers. Controlled release formulations are also prepared by encapsulating dispersed microparticles or emulsified microdroplets using known dispersion or emulsion coating technologies.

Для введения путем ингаляции соединения по настоящему изобретению удобно доставлять в форме подачи распыляемого аэрозоля из упаковок под давлением или с помощью небулайзера с использованием подходящего пропеллента. В варианте осуществления аэрозоля под давлением единица дозирования может быть определена путем предоставления клапана для доставки отмеренного количества. Для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут быть составлены капсулы и картриджи, например, из желатина, содержащие порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.For administration by inhalation, the compounds of the present invention are conveniently delivered in the form of a nebulized aerosol from pressurized packages or by nebulizer using a suitable propellant. In a pressurized aerosol embodiment, a dosage unit may be defined by providing a valve to deliver a metered amount. For use in an inhaler or insufflator, capsules and cartridges, for example gelatin, can be formulated containing a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.

Соединения, раскрытые в данном документе, могут быть составлены для парентерального введения путем инъекции (например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии). Составы для инъекции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме (например, в ампулах или в многодозовых контейнерах) с добавленным консервантом. Композиции могут принимать формы, такие как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах-носителях, и могут содержать вспомогательные средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.The compounds disclosed herein may be formulated for parenteral administration by injection (eg, bolus injection or continuous infusion). Injectable formulations may be presented in unit dosage form (eg, ampoules or multi-dose containers) with an added preservative. The compositions may take forms such as suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous carrier vehicles, and may contain formulation auxiliaries such as suspending, stabilizing and/or dispersing agents.

Фармацевтические составы, предназначенные для парентерального введения, включают водные растворы соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии соединений могут быть получены в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или среды-носители включают жирные масла или синтетические сложные эфиры жирной кислоты. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии. Необязательно суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или средства, которые повышают растворимость соединений и обеспечивают получение высококонцентрированных растворов. Альтернативно композиция по настоящему изобретению может находиться в форме порошка, предназначенного для разбавления подходящей средой-носителем (например, стерильной апирогенной водой) перед применением.Pharmaceutical compositions intended for parenteral administration include aqueous solutions of the compounds in water-soluble form. In addition, suspensions of the compounds can be prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or carrier media include fatty oils or synthetic fatty acid esters. Aqueous injection suspensions may contain substances that increase the viscosity of the suspension. Optionally, the suspension may also contain suitable stabilizers or agents that increase the solubility of the compounds and provide highly concentrated solutions. Alternatively, the composition of the present invention may be in the form of a powder for dilution with a suitable carrier medium (eg, sterile pyrogen-free water) before use.

Соединения, раскрытые в данном документе также могут быть составлены в композиции для ректального введения, такие как суппозитории или удерживающие клизмы (например, содержащие традиционные суппозиторные основы). В дополнение к составам, описанным ранее, соединения также могут быть составлены в виде депо-препарата. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, соединения могут быть составлены с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменных смол или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.The compounds disclosed herein may also be formulated into compositions for rectal administration, such as suppositories or retention enemas (eg, containing traditional suppository bases). In addition to the formulations described previously, the compounds may also be formulated as a depot formulation. Such long-acting formulations can be administered by implantation (eg, subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. Thus, for example, the compounds may be formulated using suitable polymeric or hydrophobic materials (eg, as an emulsion in a suitable oil) or ion exchange resins, or as sparingly soluble derivatives, eg, as a sparingly soluble salt.

В частности, соединение, раскрытое в данном документе, можно вводить перорально, буккально или сублингвально в форме таблеток, содержащих вспомогательные вещества, такие как крахмал или лактоза, или в капсулах или вагинальных суппозиториях, либо отдельно, либо в смеси со вспомогательными веществами, или в форме настоек или суспензий, содержащих ароматизирующие или красящие средства. Такие жидкие препараты могут быть получены с использованием фармацевтически приемлемых добавок, таких как суспендирующие средства. Соединение также можно вводить парентерально, например внутривенно, внутримышечно, подкожно или интракоронарно. Для парентерального введения соединение лучше всего применять в форме стерильного водного раствора, который может содержатьIn particular, the compound disclosed herein can be administered orally, buccally or sublingually in the form of tablets containing excipients such as starch or lactose, or in capsules or vaginal suppositories, either alone or mixed with excipients, or in in the form of tinctures or suspensions containing flavoring or coloring agents. Such liquid preparations can be prepared using pharmaceutically acceptable additives such as suspending agents. The compound can also be administered parenterally, for example intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intracoronarily. For parenteral administration, the compound is best administered in the form of a sterile aqueous solution, which may contain

- 24 045330 другие вещества, например соли или сахарные спирты, такие как маннит или глюкоза, для придания раствору изотоничности с кровью.- 24 045330 other substances, for example salts or sugar alcohols such as mannitol or glucose, to make the solution isotonic with blood.

Для ветеринарного применения соединение, раскрытое в данном документе, вводят в виде подходящего приемлемого состава в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринарный врач может легко определить режим дозирования и путь введения, который наиболее подходит для конкретного животного.For veterinary use, the compound disclosed herein is administered in a suitable acceptable formulation in accordance with normal veterinary practice. The veterinarian can easily determine the dosage regimen and route of administration that is most appropriate for a particular animal.

В некоторых вариантах осуществления все необходимые компоненты для лечения нарушения, связанного с KRAS, с применением соединения, раскрытого в данном документе, либо отдельно, либо в комбинации с другим средством, или для вмешательства, традиционно выполняемого для лечения такого заболевания, могут быть упакованы в набор. Конкретно, в настоящем изобретении предусмотрен набор для применения при терапевтическом вмешательстве при заболевании, содержащий упакованный комплект лекарственных препаратов, которые включают соединение, раскрытое в данном документе, а также буферы и другие компоненты, предназначенные для получения доставляемых форм указанных лекарственных препаратов, и/или устройства для доставки таких лекарственных препаратов, и/или любые средства, которые применяют в комбинированной терапии с соединением, раскрытым в данном документе, и/или инструкции для лечения заболевания, находящиеся в упаковке с лекарственными препаратами. Инструкции могут быть зафиксированы на любом материальном носителе, таком как печатная бумага или считываемый компьютером магнитный или оптический носитель, или инструкции могут предоставляться в виде ссылки на удаленный компьютерный источник данных, такой как страница всемирной компьютерной сети, доступная через интернет.In some embodiments, all of the necessary components for treating a KRAS disorder using a compound disclosed herein, either alone or in combination with another agent, or for an intervention traditionally performed to treat such disorder, may be packaged in a kit . Specifically, the present invention provides a kit for use in a therapeutic intervention for a disease, containing a packaged set of drugs that include a compound disclosed herein, as well as buffers and other components intended to obtain the delivered forms of these drugs, and/or devices for the delivery of such drugs, and/or any agents that are used in combination therapy with a compound disclosed herein and/or instructions for the treatment of a disease contained in the packaging of the drugs. The instructions may be recorded on any tangible medium, such as printed paper or computer-readable magnetic or optical media, or the instructions may be provided in the form of a link to a remote computer data source, such as a World Wide Web page accessible via the Internet.

Терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное для лечения или предупреждения развития или для ослабления существующих симптомов у субъекта, лечение которого осуществляют. Определение эффективных количеств находится в пределах компетенции специалистов в данной области, особенно в свете подробного раскрытия, представленного в данном документе. Как правило, терапевтически эффективная доза относится к такому количеству соединения, которое приводит к достижению необходимого эффекта. Например, в одном предпочтительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество соединения, раскрытого в данном документе, снижает активность KRAS на по меньшей мере 5% по сравнению с контролем, на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или на по меньшей мере 90%.A therapeutically effective amount means an amount effective to treat or prevent the development or amelioration of existing symptoms in the subject being treated. Determination of effective amounts is within the skill of the art, especially in light of the detailed disclosure presented herein. Generally, a therapeutically effective dose refers to that amount of a compound that produces the desired effect. For example, in one preferred embodiment, a therapeutically effective amount of a compound disclosed herein reduces KRAS activity by at least 5% compared to control, by at least 10%, by at least 15%, by at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% or at least 90%.

Количество вводимого соединения может зависеть от субъекта, лечение которого осуществляют, от возраста, состояния здоровья, пола и веса субъекта, вида одновременного лечения (если оно применяется), тяжести заболевания, характера необходимого эффекта, способа и частоты лечения и решения лечащего врача. Частота введения доз также может зависеть от фармакодинамических эффектов в отношении давления кислорода в артериальной крови. Однако наиболее предпочтительная доза может быть адаптирована в отношении отдельного субъекта, как это понятно и может быть определено специалистом в данной области без излишних экспериментов. Обычно это предусматривает корректировку стандартной дозы (например, снижение дозы, если пациент имеет низкий вес тела).The amount of compound administered may depend on the subject being treated, the age, health status, sex and weight of the subject, the type of concurrent treatment (if any), the severity of the disease, the nature of the desired effect, the method and frequency of treatment, and the judgment of the attending physician. Dosing frequency may also depend on pharmacodynamic effects on arterial oxygen pressure. However, the most preferred dosage may be tailored to the individual subject as will be understood and can be determined by one skilled in the art without undue experimentation. This usually involves adjusting the standard dose (eg, reducing the dose if the patient has low body weight).

Хотя индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств соединения находится в пределах квалификации специалистов в данной области. Для введения человеку при радикальном или профилактическом лечении состояний и нарушений, идентифицированных в данном документе, например, типичные дозы соединений по настоящему изобретению могут составлять от приблизительно 0,05 мг/кг/сутки до приблизительно 50 мг/кг/сутки, например по меньшей мере 0,05 мг/кг, по меньшей мере 0,08 мг/кг, по меньшей мере 0,1 мг/кг, по меньшей мере 0,2 мг/кг, по меньшей мере 0,3 мг/кг, по меньшей мере 0,4 мг/кг или по меньшей мере 0,5 мг/кг и предпочтительно 50 мг/кг или меньше, 40 мг/кг или меньше, 30 мг/кг или меньше, 20 мг/кг или меньше или 10 мг/кг или меньше, что может составлять, например, от приблизительно 2,5 мг/сутки (0,5 мг/кгх5 кг) до приблизительно 5000 мг/сутки (50 мг/кгх100 кг). Например, дозы соединений могут составлять от приблизительно 0,1 мг/кг/сутки до приблизительно 50 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,05 мг/кг/сутки до приблизительно 10 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,05 мг/кг/сутки до приблизительно 5 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,05 мг/кг/сутки до приблизительно 3 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,07 мг/кг/сутки до приблизительно 3 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,09 мг/кг/сутки до приблизительно 3 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,05 мг/кг/сутки до приблизительно 0,1 мг/кг/сутки, от приблизительно 0,1 мг/кг/сутки до приблизительно 1 мг/кг/сутки, от приблизительно 1 мг/кг/сутки до приблизительно 10 мг/кг/сутки, от приблизительно 1 мг/кг/сутки до приблизительно 5 мг/кг/сутки, от приблизительно 1 мг/кг/сутки до приблизительно 3 мг/кг/сутки, от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 1000 мг/сутки, от приблизительно 20 мг/сутки до приблизительно 750 мг/сутки, от приблизительно 3 мг/сутки до приблизительно 500 мг/сутки, от приблизительно 5 мг/сутки до приблизительно 250 мг/сутки, от приблизительно 10 мг/сутки до приблизительно 100 мг/сутки, от приблизительно 3 мг/сутки до приблизительно 10 мг/суткиAlthough individual needs vary, determination of optimal ranges of effective amounts of a compound is within the skill of those skilled in the art. For administration to humans for the definitive or prophylactic treatment of conditions and disorders identified herein, for example, typical doses of the compounds of the present invention may range from about 0.05 mg/kg/day to about 50 mg/kg/day, such as at least 0.05 mg/kg, at least 0.08 mg/kg, at least 0.1 mg/kg, at least 0.2 mg/kg, at least 0.3 mg/kg, at least 0.4 mg/kg or at least 0.5 mg/kg and preferably 50 mg/kg or less, 40 mg/kg or less, 30 mg/kg or less, 20 mg/kg or less or 10 mg/kg or less, which may be, for example, from about 2.5 mg/day (0.5 mg/kg x 5 kg) to about 5000 mg/day (50 mg/kg x 100 kg). For example, dosages of the compounds may range from about 0.1 mg/kg/day to about 50 mg/kg/day, from about 0.05 mg/kg/day to about 10 mg/kg/day, from about 0.05 mg /kg/day to about 5 mg/kg/day, from about 0.05 mg/kg/day to about 3 mg/kg/day, from about 0.07 mg/kg/day to about 3 mg/kg/day , from about 0.09 mg/kg/day to about 3 mg/kg/day, from about 0.05 mg/kg/day to about 0.1 mg/kg/day, from about 0.1 mg/kg/day day to about 1 mg/kg/day, from about 1 mg/kg/day to about 10 mg/kg/day, from about 1 mg/kg/day to about 5 mg/kg/day, from about 1 mg/kg /day to about 3 mg/kg/day, from about 1 mg/day to about 1000 mg/day, from about 20 mg/day to about 750 mg/day, from about 3 mg/day to about 500 mg/day, about 5 mg/day to about 250 mg/day, about 10 mg/day to about 100 mg/day, about 3 mg/day to about 10 mg/day

- 25 045330 или от приблизительно 100 мг/сутки до приблизительно 250 мг/сутки. Такие дозы могут быть введены в однократной дозе или они могут быть поделены на несколько доз.- 25 045330 or from approximately 100 mg/day to approximately 250 mg/day. Such doses may be administered in a single dose or they may be divided into several doses.

Способы применения ингибиторов KRASG12C.Methods of using KRAS G12C inhibitors.

В настоящем изобретении предусмотрен способ ингибирования RAS-опосредованной сигнальной системы клетки, предусматривающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством одного или нескольких соединений, раскрытых в данном документе. Ингибирование RAS-опосредованной передачи сигнала может быть оценено и продемонстрировано широким спектром путей, известных из уровня техники.The present invention provides a method of inhibiting RAS-mediated cell signaling, comprising contacting the cell with an effective amount of one or more compounds disclosed herein. Inhibition of RAS-mediated signal transduction can be assessed and demonstrated by a wide range of pathways known in the art.

Неограничивающие примеры включают демонстрацию: (а) снижения GTP-азной активности RAS; (b) снижения аффинности связывания GTP или повышения аффинности связывания GDP; (с) повышения Koff GTP или снижения Koff GDP; (d) снижения уровней молекул, опосредующих передачу сигнала, расположенных ниже в пути RAS, например, снижения уровней pMEK, pERK или pAKT; и/или (е) снижения степени связывания комплекса RAS с расположенными ниже в пути сигнальными молекулами, включая без ограничения Raf. Наборы и коммерчески доступные анализы могут быть использованы для определения одного или нескольких из вышеуказанных.Non-limiting examples include demonstrating: (a) decreased GTPase activity of RAS; (b) decreasing the binding affinity of GTP or increasing the binding affinity of GDP; (c) increasing Koff GTP or decreasing Koff GDP; (d) reducing the levels of signal transduction molecules located downstream in the RAS pathway, for example, reducing the levels of pMEK, pERK or pAKT; and/or (f) reducing the extent of binding of the RAS complex to downstream signaling molecules, including but not limited to Raf. Kits and commercially available assays can be used to determine one or more of the above.

В раскрытии также предусмотрены способы применения соединений или фармацевтических композиций по настоящему изобретению для лечения болезненных состояний, включая без ограничения состояния, связанные с мутацией G12C KRAS, HRAS или NRAS (например, рак).The disclosure also provides methods of using the compounds or pharmaceutical compositions of the present invention to treat disease states, including, without limitation, conditions associated with the G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutation (eg, cancer).

В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ лечения рака, причем способ предусматривает введение эффективного количества любой из вышеуказанных фармацевтических композиций, содержащих соединение, раскрытое в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления рак опосредован мутацией G12C KRAS, HRAS или NRAS. В различных вариантах осуществления рак представляет собой рак поджелудочной железы, колоректальный рак или рак легкого. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак желчного пузыря, рак щитовидной железы и рак желчных протоков.In some embodiments, a method of treating cancer is provided, the method comprising administering an effective amount of any of the above pharmaceutical compositions containing a compound disclosed herein to a subject in need thereof. In some embodiments, the cancer is mediated by the G12C mutation of KRAS, HRAS, or NRAS. In various embodiments, the cancer is pancreatic cancer, colorectal cancer, or lung cancer. In some embodiments, the cancer is gallbladder cancer, thyroid cancer, and bile duct cancer.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, при этом указанный способ предусматривает определение того, есть ли у субъекта мутация G12C KRAS, HRAS или NRAS, и, если у субъекта определено наличие мутации G12C KRAS, HRAS или NRAS, то - введение субъекту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного соединения, раскрытого в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли.In some embodiments, the present invention provides a method of treating a disorder in a subject in need thereof, the method comprising determining whether the subject has a G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutation and, if the subject is determined to have a G12C KRAS, HRAS mutation or NRAS, then - administering to a subject a therapeutically effective dose of at least one compound disclosed herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Раскрытые соединения ингибируют независимый от якорных белков рост клеток и, следовательно, имеют потенциал к ингибированию метастаз опухолей. Соответственно, в другом варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ ингибирования метастаз опухолей, причем способ предусматривает введение эффективного количества соединения, раскрытого в данном документе.The disclosed compounds inhibit anchorage protein-independent cell growth and therefore have the potential to inhibit tumor metastasis. Accordingly, in another embodiment, the present invention provides a method of inhibiting tumor metastases, the method comprising administering an effective amount of a compound disclosed herein.

Мутации G12C KRAS, HRAS или NRAS также были идентифицированы при гемобластозах (например, виды рака, при которых поражается кровь, костный мозг и/или лимфатические узлы). Соответственно, некоторые варианты осуществления направлены на введение раскрытых соединений (например, в форме фармацевтической композиции) пациенту, нуждающемуся в лечении гемобластоза. Такие формы рака включают без ограничения лейкозы и лимфомы. Например, раскрытые в настоящем документе соединения могут использоваться для лечения заболеваний, таких как острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), лимфома из малых лимфоцитов (SLL), хронический миелолейкоз (CML), острый моноцитарный лейкоз (AMoL) и/или другие виды лейкоза. В других вариантах осуществления соединения применимы для лечения лимфом, таких как все подтипы лимфомы Ходжкина или неходжкинских лимфом. В различных вариантах осуществления соединения применимы для лечения злокачественных новообразований из плазматических клеток, таких как множественная миелома, лимфома из клеток мантийной зоны и макроглобулинемия Вальденстрема.G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutations have also been identified in hematologic malignancies (eg, cancers that involve the blood, bone marrow, and/or lymph nodes). Accordingly, some embodiments are directed to administering the disclosed compounds (eg, in the form of a pharmaceutical composition) to a patient in need of treatment for hematological malignancies. Such cancers include, but are not limited to, leukemias and lymphomas. For example, the compounds disclosed herein can be used to treat diseases such as acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myelogenous leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), small lymphocyte lymphoma (SLL), chronic myelogenous leukemia (CML), acute monocytic leukemia (AMoL) and/or other types of leukemia. In other embodiments, the compounds are useful for treating lymphomas, such as all subtypes of Hodgkin's lymphoma or non-Hodgkin's lymphomas. In various embodiments, the compounds are useful for treating plasma cell malignancies such as multiple myeloma, mantle cell lymphoma, and Waldenström's macroglobulinemia.

Определение того, предусматривает ли опухоль или рак мутацию G12C KRAS, HRAS или NRAS, может быть выполнено путем оценки нуклеотидной последовательности, кодирующей белок KRAS, HRAS или NRAS, путем оценки аминокислотной последовательности белка KRAS, HRAS или NRAS или путем оценки характеристик предполагаемого мутантного белка KRAS, HRAS или NRAS. Последовательность дикого типа KRAS, HRAS или NRAS человека известна в уровне техники (например № доступа NP203524).Determining whether a tumor or cancer contains a G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutation can be made by assessing the nucleotide sequence encoding a KRAS, HRAS, or NRAS protein, by assessing the amino acid sequence of a KRAS, HRAS, or NRAS protein, or by assessing the characteristics of a putative mutant KRAS protein , HRAS or NRAS. The sequence of wild type human KRAS, HRAS or NRAS is known in the art (eg accession no. NP203524).

Способы выявления мутации в нуклеотидной последовательности KRAS, HRAS или NRAS известны специалистам в данной области техники. Такие способы включают без ограничения анализы, в которых используется полимеразная цепная реакция-полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (PCRRFLP), анализы, в которых используется полимеразная цепная реакция-одноцепочечный конформационный полиморфизм (PCR-SSCP), анализы в которых используется ПЦР в режиме реального времени, секвенирование продуктов ПЦР, анализы, в которых используется проводимая в отношении мутантного аллеля специфическая ПЦР-амплификация (MASA), прямое секвенирование, реакции удлинения праймера, электрофорез, лигирование олигонуклеотидных зондов, гибридизационные анализы, анализы Taq- 26 045330Methods for detecting a mutation in a KRAS, HRAS, or NRAS nucleotide sequence are known to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) assays, polymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism (PCR-SSCP) assays, real-time PCR assays, sequencing of PCR products, tests using mutant allele specific PCR amplification (MASA), direct sequencing, primer extension reactions, electrophoresis, oligonucleotide probe ligation, hybridization assays, Taq-26 045330

Man, SNP-генотипирование, анализы плавления с высокой разрешающей способностью и микроматричные анализы. В некоторых вариантах осуществления образцы оценивают в отношении мутаций G12C KRAS, HRAS или NRAS с помощью ПЦР в режиме реального времени. При ПЦР в режиме реального времени применяют флуоресцентные зонды, специфичные в отношении мутаций G12C KRAS, HRAS или NRAS. Когда присутствует мутация, зонд связывается и выявляется флуоресценция. В некоторых вариантах осуществления мутацию G12C KRAS, HRAS или NRAS идентифицируют с применением способа прямого секвенирования специфических участков (например, экзон 2 и/или экзон 3) в гене KRAS, HRAS или NRAS. Данная методика позволит идентифицировать все возможные мутации в секвенированном участке.Man, SNP genotyping, high resolution melting assays and microarray analyses. In some embodiments, samples are assessed for G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutations using real-time PCR. Real-time PCR uses fluorescent probes specific for the G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutations. When a mutation is present, the probe binds and fluorescence is detected. In some embodiments, the G12C mutation of KRAS, HRAS, or NRAS is identified using a method of direct sequencing of specific regions (eg, exon 2 and/or exon 3) in the KRAS, HRAS, or NRAS gene. This technique will allow us to identify all possible mutations in the sequenced region.

Способы выявления мутации в белке KRAS, HRAS или NRAS известны специалистам в данной области техники. Такие способы включают без ограничения выявление мутантных KRAS, HRAS или NRAS с применением связывающего средства (например, антитела), специфичного в отношении мутантного белка, электрофорез белков и Вестерн-блоттинг, а также прямое секвенирование пептида.Methods for detecting mutations in a KRAS, HRAS, or NRAS protein are known to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, detection of mutant KRAS, HRAS, or NRAS using a binding agent (eg, antibody) specific for the mutant protein, protein electrophoresis and Western blotting, and direct peptide sequencing.

В способах определения того, предусматривает ли опухоль или рак мутацию G12C KRAS, HRAS или NRAS, может использоваться ряд образцов. В некоторых вариантах осуществления образец отбирают у субъекта, имеющего опухоль или рак. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой свежий образец опухоли/рака. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой замороженный образец опухоли/рака. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой фиксированный в формалине образец, залитый в парафин. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец циркулирующих опухолевых клеток (СТС). В некоторых вариантах осуществления образец перерабатывается в клеточный лизат. В некоторых вариантах осуществления образец перерабатывается в ДНК или РНК.Methods for determining whether a tumor or cancer contains a G12C KRAS, HRAS, or NRAS mutation may use a number of samples. In some embodiments, the sample is collected from a subject having a tumor or cancer. In some embodiments, the sample is a fresh tumor/cancer sample. In some embodiments, the sample is a frozen tumor/cancer sample. In some embodiments, the sample is a formalin-fixed, paraffin-embedded sample. In some embodiments, the sample is a circulating tumor cell (CTC) sample. In some embodiments, the sample is processed into a cell lysate. In some embodiments, the sample is processed into DNA or RNA.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения гиперпролиферативного нарушения у млекопитающего, который предусматривает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения, раскрытого в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах осуществления указанный способ относится к лечению субъекта, который страдает от рака, такого как острый миелоидный лейкоз, рак у подростков, рак надпочечников в детском возрасте, виды рака, связанные со СПИДом (например, лимфома и саркома Капоши), рак анального канала, рак червеобразного отростка, астроцитомы, атипичный тератоид, базально-клеточный рак, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, глиома ствола головного мозга, опухоль головного мозга, рак молочной железы, бронхиальные опухоли, лимфома Беркитта, карциноидная опухоль, атипичный тератоид, эмбриональные опухоли, эмбрионально-клеточная опухоль, первичная лимфома, рак шейки матки, виды рака в детском возрасте, хордома, опухоли сердца, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), хронические миелопролиферативные нарушения, рак толстой кишки, колоректальный рак, краниофарингиома, кожная Т-клеточная лимфома, внепеченочная протоковая карцинома in situ (DCIS), эмбриональные опухоли, рак CNS, рак эндометрия, эпендимома, рак пищевода, эстезионейробластома, саркома Юинга, внечерепная эмбрионально-клеточная опухоль, внегонадная эмбрионально-клеточная опухоль, рак глаза, фиброзная гистиоцитома кости, рак желчного пузыря, рак ЖКТ, карциноидная опухоль ЖКТ, желудочно-кишечные стромальные опухоли (GIST), эмбрионально-клеточная опухоль, гестационная трофобластическая опухоль, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, рак сердца, рак печени, лимфома Ходжкина, гипофарингеальный рак, внутриглазная меланома, опухоли островков поджелудочной железы, нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы, рак почки, рак гортани, рак губ и полости рта, рак печени, лобулярная карцинома in situ (LCIS), рак легкого, лимфома, метастатический плоскоклеточный рак шеи со скрытым первичным заболеванием, срединная карцинома, рак ротовой полости, синдромы множественных эндокринных неоплазий, множественная миелома/неоплазия плазматических клеток, фунгоидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелодиспластические/миелопролиферативные неоплазий, множественная миелома, карцинома из клеток Меркеля, злокачественная мезотелиома, злокачественная фиброзная гистиоцитома кости и остеосаркома, рак полости носа и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластома, неходжкинская лимфома, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак полости рта, рак губ и полости рта, рак ротоглотки, рак яичников, рак поджелудочной железы, папилломатоз, параганглиома, рак околоносовых пазух и полости носа, рак околощитовидной железы, рак полового члена, рак глотки, плевропульмональная бластома, первичная лимфома центральной нервной системы (ЦНС), рак предстательной железы, рак прямой кишки, переходно-клеточный рак, ретинобластома, рабдомиосаркома, рак слюнной железы, рак кожи, рак желудка (ЖКТ), мелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника, саркома мягких тканей, Тклеточная лимфома, рак яичка, рак горла, тимома и рак вилочковой железы, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, трофобластическая опухоль, необычные виды рака у детей, рак мочеиспускательного канала, саркома матки, рак влагалища, рак вульвы или вирус-индуцированный рак. В некоторых вариантах осуществления указанный способ относится к лечению неракового гиперпролиферативного нарушения, такого как доброкачественная гиперплазия кожи (например, псориаз), рестеноз или нарушение, связанное с предстательной железой (например, доброкачественная гипертрофия предстательной железы (ВРН)).The present invention also provides a method of treating a hyperproliferative disorder in a mammal, which comprises administering to said mammal a therapeutically effective amount of a compound disclosed herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In some embodiments, the method relates to treating a subject who is suffering from cancer, such as acute myeloid leukemia, adolescent cancer, childhood adrenal cancer, AIDS-related cancers (eg, lymphoma and Kaposi's sarcoma), anal cancer , appendix cancer, astrocytomas, atypical teratoid, basal cell carcinoma, bile duct cancer, bladder cancer, bone cancer, brainstem glioma, brain tumor, breast cancer, bronchial tumors, Burkitt's lymphoma, carcinoid tumor, atypical teratoid , embryonal tumors, embryonal cell tumor, primary lymphoma, cervical cancer, childhood cancers, chordoma, cardiac tumors, chronic lymphocytic leukemia (CLL), chronic myelogenous leukemia (CML), chronic myeloproliferative disorders, colon cancer, colorectal cancer , craniopharyngioma, cutaneous T-cell lymphoma, extrahepatic ductal carcinoma in situ (DCIS), embryonal tumors, CNS cancer, endometrial cancer, ependymoma, esophageal cancer, esthesioneuroblastoma, Ewing's sarcoma, extracranial germinal cell tumor, extragonadal germinal cell tumor, cancer eyes, fibrous bone histiocytoma, gallbladder cancer, GI cancer, GI carcinoid tumor, gastrointestinal stromal tumors (GIST), germinal cell tumor, gestational trophoblastic tumor, hairy cell leukemia, head and neck cancer, heart cancer, liver cancer, lymphoma Hodgkin's, hypopharyngeal cancer, intraocular melanoma, pancreatic islet tumors, pancreatic neuroendocrine tumors, kidney cancer, laryngeal cancer, lip and oral cavity cancer, liver cancer, lobular carcinoma in situ (LCIS), lung cancer, lymphoma, metastatic squamous cell carcinoma of the neck with occult primary disease, midline carcinoma, oral cancer, multiple endocrine neoplasia syndromes, multiple myeloma/plasma cell neoplasia, mycosis fungoides, myelodysplastic syndromes, myelodysplastic/myeloproliferative neoplasias, multiple myeloma, Merkel cell carcinoma, malignant mesothelioma, malignant fibrous bone histiocytoma and osteosarcoma, nasal and sinus cancer, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, non-Hodgkin's lymphoma, non-small cell lung cancer (NSCLC), oral cavity cancer, lip and oral cavity cancer, oropharyngeal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, papillomatosis, paraganglioma, cancer paranasal sinuses and nasal cavity, parathyroid cancer, penile cancer, pharyngeal cancer, pleuropulmonary blastoma, primary central nervous system (CNS) lymphoma, prostate cancer, rectal cancer, transitional cell cancer, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, salivary gland cancer, skin cancer, stomach cancer (GIT), small cell lung cancer, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, T-cell lymphoma, testicular cancer, throat cancer, thymoma and thymus cancer, thyroid cancer, transitional cell carcinoma of the renal pelvis and ureter, trophoblastic tumor, unusual childhood cancers, urethral cancer, uterine sarcoma, vaginal cancer, vulvar cancer, or virus-induced cancer. In some embodiments, the method relates to the treatment of a noncancerous hyperproliferative disorder, such as benign cutaneous hyperplasia (eg, psoriasis), restenosis, or a prostate-related disorder (eg, benign prostatic hypertrophy (BPH)).

- 27 045330- 27 045330

В некоторых вариантах осуществления способы лечения направлены на лечение видов рака легкого, причем способы предусматривают введение эффективного количества любого из вышеописанных соединений (или фармацевтической композиции, содержащей его) субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), например аденокарциному, плоскоклеточный рак легкого или крупноклеточный рак легкого. В некоторых вариантах осуществления рак легкого представляет собой мелкоклеточный рак легкого. Другие виды рака легкого, которые можно лечить с помощью раскрытых соединений, включают без ограничения железистые опухоли, карциноидные опухоли и недифференцированные виды рака.In some embodiments, the treatment methods are directed to the treatment of lung cancers, the methods comprising administering an effective amount of any of the above-described compounds (or a pharmaceutical composition containing the same) to a subject in need thereof. In some embodiments, the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC), such as adenocarcinoma, squamous cell lung cancer, or large cell lung cancer. In some embodiments, the lung cancer is small cell lung cancer. Other types of lung cancer that can be treated with the disclosed compounds include, but are not limited to, glandular tumors, carcinoid tumors, and undifferentiated cancers.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы модулирования активности G12С-мутантного белка KRAS, HRAS или NRAS, осуществляемые путем приведения белка в контакт с эффективным количеством соединения по настоящему изобретению. Модуляция может представлять собой ингибирование или активирование активности белка. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности белка, осуществляемые путем приведения G12С-мутантного белка KRAS, HRAS или NRAS в контакт с эффективным количеством соединения по настоящему изобретению в растворе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12С-мутантного белка KRAS, HRAS или NRAS, осуществляемые путем приведения клетки, ткани или органа, которые экспрессируют белок, представляющий интерес, в контакт. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности белка у субъекта, включая без ограничения грызунов и млекопитающих (например, человека), осуществляемые путем введения субъекту эффективного количества соединения по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления процент модуляции превышает 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления процент ингибирования превышает 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%.The present invention further provides methods for modulating the activity of a G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein by contacting the protein with an effective amount of a compound of the present invention. Modulation may be inhibition or activation of protein activity. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting protein activity by contacting a G12C mutant KRAS, HRAS, or NRAS protein with an effective amount of a compound of the present invention in solution. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting the activity of a G12C mutant KRAS, HRAS, or NRAS protein by bringing a cell, tissue, or organ that expresses the protein of interest into contact. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting protein activity in a subject, including, but not limited to, rodents and mammals (eg, humans), by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention. In some embodiments, the modulation percentage is greater than 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%. In some embodiments, the percentage of inhibition is greater than 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS в клетке, осуществляемые путем приведения указанной клетки в контакт с количеством соединения по настоящему изобретению, достаточным для ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS в указанной клетке. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS в ткани, осуществляемые путем приведения указанной ткани в контакт с количеством соединения по настоящему изобретению, достаточным для ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS в указанной ткани. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS в организме, осуществляемые путем приведения указанного организма в контакт с количеством соединения по настоящему изобретению, достаточным для ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS в указанном организме. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS у животного, осуществляемые путем приведения указанного животного в контакт с количеством соединения по настоящему изобретению, достаточным для ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS у указанного животного. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS у млекопитающего, осуществляемые путем приведения указанного млекопитающего в контакт с количеством соединения по настоящему изобретению, достаточным для ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS у указанного млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS у человека, осуществляемые путем приведения указанного человека в контакт с количеством соединения по настоящему изобретению, достаточным для ингибирования активности G12C KRAS, HRAS или NRAS у указанного человека. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения заболевания, опосредованного активностью G12C KRAS, HRAS или NRAS у субъекта, нуждающегося в таком лечении.In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in a cell by contacting said cell with an amount of a compound of the present invention sufficient to inhibit G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in the cell. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in tissue by contacting said tissue with an amount of a compound of the present invention sufficient to inhibit G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in said tissue. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in an organism by contacting the organism with an amount of a compound of the present invention sufficient to inhibit G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in the organism. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in an animal by contacting said animal with an amount of a compound of the present invention sufficient to inhibit G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in said animal. In some embodiments, the present invention provides methods for inhibiting G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in a mammal by contacting said mammal with an amount of a compound of the present invention sufficient to inhibit G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in said mammal. In some embodiments, the present invention provides methods of inhibiting G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in a human by contacting said human with an amount of a compound of the present invention sufficient to inhibit G12C KRAS, HRAS, or NRAS activity in said human. The present invention provides methods for treating a disease mediated by G12C KRAS, HRAS or NRAS activity in a subject in need of such treatment.

Комбинированная терапия.Combination therapy.

В настоящем изобретении также предусмотрены способы осуществления вариантов комбинированной терапии, в которых средство, о котором известно, что оно модулирует другие пути, или другие компоненты того же пути, или даже перекрывающиеся наборы целевых ферментов применяются в комбинации с соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью. В одном аспекте такая терапия включает без ограничения комбинацию одного или нескольких соединений по настоящему изобретению с химиотерапевтическими средствами, терапевтическими антителами и лучевой терапией, предназначенную для обеспечения синергетического или аддитивного терапевтического эффекта.The present invention also provides methods for implementing combination therapy options in which an agent known to modulate other pathways, or other components of the same pathway, or even overlapping sets of target enzymes, is used in combination with a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable formulation thereof. salt. In one aspect, such therapy includes, without limitation, the combination of one or more compounds of the present invention with chemotherapeutic agents, therapeutic antibodies, and radiation therapy designed to provide a synergistic or additive therapeutic effect.

Множество химиотерапевтических веществ в настоящее время известны в уровне техники и могут быть применены в комбинации с соединениями по настоящему изобретению. Соединения или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации по меньшей мере с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое вещество выбрано из группы, состоящей из ингибиторов митоза, алкилиA variety of chemotherapeutic agents are currently known in the art and can be used in combination with the compounds of the present invention. The compounds or pharmaceutical compositions of the present invention can be used in combination with at least one or more chemotherapeutic agents. In some embodiments, the chemotherapeutic agent is selected from the group consisting of mitosis inhibitors, alkyl

- 28 045330 рующих средств, антиметаболитов, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов факторов роста, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомеразы, модификаторов биологического ответа, антигормонов, ингибиторов ангиогенеза и антиандрогенов. Неограничивающими примерами являются химиотерапевтические средства, цитотоксические средства и непептидные малые молекулы, такие как Gleevec® (иматиниб мезилат), Kyprolis® (карфилзомиб), Velcade® (бортезомиб), Casodex (бикалутамид), Iressa® (гефитиниб), Venclexta (венетоклакс) и Adriamycin (докорубицин), а также носитель химиотерапевтических средств. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (Cytoxan™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорциклофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихимицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, Casodex™, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эсорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; ингибиторы синтеза гормонов коры надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсаторы фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфомитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например паклитаксел и доцетаксел; ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из приведенных выше.- 28 045330 excipients, antimetabolites, intercalating antibiotics, growth factor inhibitors, cell cycle inhibitors, enzymes, topoisomerase inhibitors, biological response modifiers, antihormones, angiogenesis inhibitors and antiandrogens. Non-limiting examples include chemotherapeutic agents, cytotoxic agents and non-peptide small molecules such as Gleevec® (imatinib mesylate), Kyprolis® (carfilzomib), Velcade® (bortezomib), Casodex (bicalutamide), Iressa® (gefitinib), Venclexta (venetoclax) and Adriamycin (docorubicin), also a carrier of chemotherapeutic agents. Non-limiting examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (Cytoxan™); alkylsulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa and uredopa; ethylene imines and methyl melamines, including altretamine, triethylene melamine, triethylene phosphoramide, triethylene thiophosphoramide and trimethylol melamine; nitrogen mustards, such as chlorambucil, chlornaphazine, chlorocyclophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembiquin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard; nitrosoureas such as carmustine, chlorzotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotics such as aclacinomycins, actinomycin, anthramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, calicheycin, carabicin, carminomycin, carcinophilin, Casodex™, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, epirubicin , esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, cinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprin, thioguanine; pyrimidine analogues such as ancytabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocytabine, floxuridine; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epithiostanol, mepithiostane, testolactone; inhibitors of adrenal hormone synthesis, such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid compensators such as frolinic acid; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diaziquon; elfomitin; elliptinium acetate; ethoglucide; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamole; nitracrine; pentostatin; phenomet; pirarubicin; podophyllic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK; razoxane; sisofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquon; 2,2',2-trichlorotriethylamine; urethane; vindesine; dacarbazine; mannomustin; mitobronitol; mitolactol; pipobromance; gacytosine; arabinoside (Ara-C); cyclophosphamide; thiotepa; taxanes, such as paclitaxel and docetaxel; retinoic acid; esperamycins; capecitabine and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above.

Также в качестве подходящих химиотерапевтических веществ, улучшающих состояние клеток, включены антигормональные средства, которые действуют для регулирования или ингибирования действия гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, в том числе, например, тамоксифен, (Nolvadex™), ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (фарестон); а также антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; камптотецин-11 (СРТ-11); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO).Also included as suitable cell-enhancing chemotherapeutic agents are antihormonal agents that act to regulate or inhibit the action of hormones on tumors, such as antiestrogens, including, for example, tamoxifen, (Nolvadex™), raloxifene, aromatase inhibitors 4(5 )-imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY 117018, onapristone and toremifene (Fareston); as well as antiandrogens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide and goserelin; chlorambucil; gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogues such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitomycin C; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine; navelbine; Novantrone; teniposide; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; camptothecin-11 (CPT-11); topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO).

При необходимости соединения или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять в комбинации с обычно прописываемыми противораковыми лекарственными средствами, такими как Herceptin®, Avastin®, Erbitux®, Rituxan®, Taxol®, Arimidex®, Taxotere®, ABVD, авицин, абаговомаб, акридина карбоксамид, адекатумумаб, 17-N-аллиламино-17-деметоксигелданамицин, альфарадин, альвоцидиб, З-аминопиридин-2-карбоксальдегид тиосемикарбазон, амонафид, антрацендион, иммунотоксины к CD22, противоопухолевые, антитуморогенные травы, апазиквон, атипримод, азатиоприн, белотекан, бендамустин, BIBW 2992, бирикодар, бросталлицин, бриостатин, бутионин сульфоксимин, CBV (химиотерапия), каликулин, неспецифические противоопухолевые средства клеточного цикла, дихлоруксусная кислота, дискодермолид, эльсамитруцин, эноцитабин, эпотилон, эрибулин, эверолимус, эксатекан, эксисулинд, ферругинол, фородезин, фосфэстрол, режим химиотерапии ICE, IT-101, имексон, имиквимод, индолокарбазол, ирофулвен, ланиквидар, ларотаксел, леналидомид, лукантон, луртотекан, мафосфамид, митозоломид, нафоксидин, недаплатин, олапариб, ортатаксел, РАС-1, экстракт азимины, пиксантрон, ингибитор протеасомы, ребеккамицин, резиквимод, рубитекан, SN-38, салиноспорамид А, сапацитабин, Stanford V, свайнсонин, талапорфин, тариквидар, тегафур-урацил, темодар, тесетаксел, триплатины тетранитрат, трис(2-хлорэтил)амин, троксацитабин, урамустин, вадимезан, винфлунин, ZD6126 или зосуквидар.If necessary, the compounds or pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with commonly prescribed anti-cancer drugs such as Herceptin®, Avastin®, Erbitux®, Rituxan®, Taxol®, Arimidex®, Taxotere®, ABVD, Avicin, Abagovomab, Acridine carboxamide, adecatumumab, 17-N-allylamino-17-demethoxygeldanamycin, alpharadine, alvocidib, 3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone, amonafide, anthracenedione, CD22 immunotoxins, antitumor, antitumorigenic herbs, apaziquone, atiprimod, azathioprine, belote kan, bendamustine, BIBW 2992, biricodar, brostallicin, bryostatin, buthionine sulfoximine, CBV (chemotherapy), calyculin, non-specific cell cycle antitumor agents, dichloroacetic acid, discodermolide, elsamitrucin, enocytabine, epothilone, eribulin, everolimus, exatecan, exisulind, ferruginol, forodesine, fosfestrol, chemotherapy regimen ICE, IT-101, imexone, imiquimod, indolocarbazole, irofulven, laniquidar, larotaxel, lenalidomide, lucanton, lurtothecan, mafosfamide, mitozolomide, nafoxidine, nedaplatin, olaparib, ortataxel, PAC-1, pawpaw extract, pixantrone, proteasome inhibitor, rebeccamycin, resiquimod, rubitecan, SN-38, salinosporamide A, sapacitabine, Stanford V, swainsonine, talaporfin, tariquidar, tegafur-uracil, temodar, tesetaxel, triplatinum tetranitrate, tris(2-chloroethyl)amine, troxacitabine, uramustine, vadimezan, vinflunine , ZD6126 or zosuquidar.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу применения соединений или фармаThe present invention further relates to a method of using compounds or pharmaceuticals

- 29 045330 цевтических композиций, предусмотренных в данном документе, в комбинации с лучевой терапией для ингибирования аномального роста клеток или лечения гиперпролиферативного нарушения у млекопитающего. Методики применения лучевой терапии известны из уровня техники, и данные методики можно применять в комбинированной терапии, описанной в данном документе. Введение соединения по настоящему изобретению в данной комбинированной терапии может быть определено, как описано в данном документе.- 29 045330 ceutical compositions provided herein, in combination with radiation therapy to inhibit abnormal cell growth or treat a hyperproliferative disorder in a mammal. Techniques for administering radiation therapy are known in the art, and these techniques can be used in the combination therapy described herein. Administration of a compound of the present invention in a given combination therapy can be determined as described herein.

Лучевую терапию можно применять посредством одного из нескольких способов или комбинации способов, включая без ограничения наружную лучевую терапию, внутреннюю лучевую терапию, лучевую терапию, обеспечиваемую имплантатом, стереотаксическую радиохирургию, системную лучевую терапию, радиотерапию и постоянную или временную внутритканевую брахитерапию. Применяемый в данном документе термин брахитерапия относится к лучевой терапии, осуществляемой посредством пространственно ограниченного радиоактивного материала, вводимого в организм в опухоль или около опухоли или в другое место пролиферативной вследствие заболевания ткани. Термин без ограничения предназначен для включения воздействия радиоактивных изотопов (например, At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 и радиоактивных изотопов Lu). Подходящие источники излучения для применения в качестве средства, улучшающего состояние клеток, по настоящему изобретению включают как твердые вещества, так и жидкости. В качестве неограничивающего примера источником излучения может быть радионуклид, такой как I-125, I-131, Yb-169, Ir-192 в качестве твердого источника, I-125 в качестве твердого источника, или другие радионуклиды, которые излучают фотоны, бетачастицы, гамма-излучение или другие лучи, оказывающие терапевтическое действие. Радиоактивный материал также может представлять собой текучую среду, полученную из любого раствора радионуклида(радионуклидов), например, раствора I-125 или I-131, или радиоактивная текучая среда может быть получена с использованием взвеси подходящей текучей среды, содержащей небольшие частицы твердых радионуклидов, таких как Au-198, Y-90. Более того, радионуклид(радионуклиды) может(могут) быть включен(включены) в состав геля ИЛИ радиоактивных микросфер.Radiation therapy can be administered through one of several modalities or a combination of modalities, including, but not limited to, external beam radiation therapy, internal radiation therapy, implant-delivered radiation therapy, stereotactic radiosurgery, systemic radiation therapy, radiation therapy, and permanent or temporary interstitial brachytherapy. As used herein, the term brachytherapy refers to radiation therapy delivered by spatially confined radioactive material introduced into the body at or near a tumor or other site of proliferative tissue due to disease. The term is intended to include, without limitation, exposure to radioactive isotopes (e.g., At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 and radioactive isotopes Lu). Suitable radiation sources for use as a cell enhancer of the present invention include both solids and liquids. By way of non-limiting example, the radiation source may be a radionuclide such as I-125, I-131, Yb-169, Ir-192 as a solid source, I-125 as a solid source, or other radionuclides that emit photons, beta particles, gamma radiation or other rays that have a therapeutic effect. The radioactive material may also be a fluid prepared from any solution of radionuclide(s), for example a solution of I-125 or I-131, or the radioactive fluid may be prepared using a slurry of a suitable fluid containing small particles of solid radionuclides such as like Au-198, Y-90. Moreover, radionuclide(s) may be included in the gel OR radioactive microspheres.

Соединения или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно применять в комбинации с количеством одного или нескольких веществ, выбранных из химиотерапевтических средств, антиангиогенных средств, ингибиторов передачи сигнала, антипролиферативных средств, ингибиторов гликолиза или ингибиторов аутофагии.The compounds or pharmaceutical compositions of the present invention can be used in combination with an amount of one or more substances selected from chemotherapeutic agents, antiangiogenic agents, signal transduction inhibitors, antiproliferative agents, glycolysis inhibitors or autophagy inhibitors.

Антиангиогенные средства, такие как ингибиторы MMP-2 (матриксной металлопротеиназы 2), ингибиторы MMP-9 (матриксной металлопротеиназы 9) и ингибиторы СОХ-11 (циклооксигеназы 11), можно применять в сочетании с соединением по настоящему изобретению и фармацевтическими композициями, описанными в данном документе. Антиангиогенные средства включают, например, рапамицин, темсиролимус (CCI-779), эверолимус (RAD001), сорафениб, сунитиниб и бевацизумаб. Примеры применимых ингибиторов СОХ-II включают алекоксиб, валдекоксиб и рофекоксиб. Примеры применимых ингибиторов матриксной металлопротеиназы описаны в WO 96/33172, WO 96/27583, публикации заявки на европейский патент ЕР0818442, публикации заявки на европейский патент EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, Wo 98/30566, публикации заявки на европейский патент 606046, публикации заявки на европейский патент 931788, wO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO1999007675, публикации заявки на европейский патент EP 1786785, публикации заявки на европейский патент № EP 1181017, публикации заявки на патент США № US20090012085, публикации заявки на патент США US5863949, публикации заявки на патент США US5861510 и публикации заявки на европейский патент EP 0780386, все из которых включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки. Предпочтительными ингибиторами MMP-2 и MMP-9 являются таковые, которые имеют небольшую активность ингибирования MMP-1 или не имеют ее. Более предпочтительными являются ингибиторы, которые селективно ингибируют MMP-2 и/или АМР-9 по сравнению с другими матриксными металлопротеиназами (т.е. МАР-1, MMP-3, MMP-4, MMP5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 и MMP-13). Некоторыми конкретными примерами ингибиторов MMP, применимых в настоящем изобретении, являются AG-3340, RO 32-3555 и RS 13-0830.Antiangiogenic agents such as MMP-2 (matrix metalloproteinase 2) inhibitors, MMP-9 (matrix metalloproteinase 9) inhibitors and COX-11 (cyclooxygenase 11) inhibitors can be used in combination with the compound of the present invention and the pharmaceutical compositions described herein. document. Antiangiogenic agents include, for example, rapamycin, temsirolimus (CCI-779), everolimus (RAD001), sorafenib, sunitinib and bevacizumab. Examples of useful COX-II inhibitors include alecoxib, valdecoxib and rofecoxib. Examples of useful matrix metalloproteinase inhibitors are described in WO 96/33172, WO 96/27583, European Patent Application Publication EP0818442, European Patent Application Publication EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/ 34915, WO 98/33768, Wo 98/30566, publications of the European patent application 606046, publications of the European patent application 931788, wO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO1999007675, publications applications European Patent Application Publication EP 1786785, European Patent Application Publication No. EP 1181017, US Patent Application Publication No. US20090012085, US Patent Application Publication US5863949, US Patent Application Publication US5861510 and European Patent Application Publication EP 0780386, all of which are included in this document in its entirety by reference. Preferred MMP-2 and MMP-9 inhibitors are those that have little or no MMP-1 inhibitory activity. More preferred are inhibitors that selectively inhibit MMP-2 and/or AMP-9 over other matrix metalloproteinases (i.e. MAP-1, MMP-3, MMP-4, MMP5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 and MMP-13). Some specific examples of MMP inhibitors useful in the present invention are AG-3340, RO 32-3555 and RS 13-0830.

Соединения по настоящему изобретению также можно применять в вариантах совместной терапии с другими противораковыми средствами, такими как ацеманнан, акларубицин, альдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, альтретамин, амифостин, аминолевулиновая кислота, амрубицин, амсакрин, анагрелид, анастрозол, ANCER, анцестим, арглабин, триоксид мышьяка, ВАМ 002 (Novelos), бексаротен, бикалутамид, броксуридин, капецитабин, целмолейкин, цетрореликс, кладрибин, клотримазол, цитарабин окфосфат, DA 3030 (Dong-А), даклизумаб, денилейкин дифтитокс, деслорелин, дексразоксан, дилазеп, доцетаксел, докозанол, доксеркальциферол, доксифлуридин, доксорубицин, бромокриптин, кармустин, цитарабин, фторурацил, HIT-диклофенак, интерферон альфа, даунорубицин, доксорубицин, третиноин, эдельфозин, эдреколомаб, эфлорнитин, эмитефур, эпирубицин, эпоэтин бета, этопозида фосфат, экземестан, экзисулинд, фадрозол, филграстим, финастерид, флударабина фосфат, форместан, фотемустин, нитрат галлия, гемцитабин, гемтузумаб зогамицин, комбинация гимерацил/отерацил/тегафур, гликопин, гозерелин, гептаплатин, хорионический гонадотропин человека, зародышевый альфа-фетопротеин челоThe compounds of the present invention can also be used in combination therapy with other anticancer agents, such as acemannan, aclarubicin, aldesleukin, alemtuzumab, alitretinoin, altretamine, amifostine, aminolevulinic acid, amrubicin, amsacrine, anagrelide, anastrozole, ANCER, ancestim, arglabin, trioxide arsenic, BAM 002 (Novelos), bexarotene, bicalutamide, broxuridine, capecitabine, celmoleukin, cetrorelix, cladribine, clotrimazole, cytarabine oxphosphate, DA 3030 (Dong-A), daclizumab, denileukin diftitox, deslorelin, dexrazoxane, dilazep, docetaxel, docosanol , doxercalciferol, doxifluridine, doxorubicin, bromocriptine, carmustine, cytarabine, fluorouracil, HIT-diclofenac, interferon alpha, daunorubicin, doxorubicin, tretinoin, edelfosine, edrecolomab, eflornithine, emitefur, epirubicin, epoetin beta, etoposide phosphate, exemestane, exisulind, fadrozole , filgrastim , finasteride, fludarabine phosphate, formestane, fotemustine, gallium nitrate, gemcitabine, gemtuzumab zogamycin, gimeracil/oteracil/tegafur combination, glycopin, goserelin, heptaplatin, human chorionic gonadotropin, human germline alpha-fetoprotein

- 30 045330 века, ибандроновая кислота, идарубицин, (имиквимод, интерферон альфа, интерферон альфа природный, интерферон альфа-2, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, интерферон альфа-N1, интерферон альфа-n3, интерферон альфакон-1, интерферон-альфа, природный интерферон-бета, интерферон-бета-1а, интерферон бета-1b, интерферон-гамма, природный интерферон гамма-1a, интерферон гамма-1b, интерлейкин-1бета, йобенгуан, иринотекан, ирсогладин, ланреотид, LC 9018 (Yakult), лефлуномид, ленограстим, лентинана сульфат, летрозол, лейкоцитарный альфа-интерферон, лейпрорелин, левамизол+фторурацил, лиарозол, лобаплатин, лонидамин, ловастатин, мазопрокол, меларсопрол, метоклопрамид, мифепристон, милтефозин, миримостим, некомплементарная двухцепочечная РНК, митогуазон, митолактол, митоксантрон, молграмостим, нафарелин, налоксон+пентазоцин, нартограстим, недаплатин, нилутамид, носкапин, новый эритропоэз-стимулирующий белок, октреотид NSC 631570, опрелвекин, озатерон, оксалиплатин, паклитаксел, памидроновая кислота, пегаспаргаза, пегинтерферон-альфа-2b, натрия пентозана полисульфат, пентостатин, пицибанил, пирарубицин, антитимоцитарные поликлональные антитела кролика, полиэтиленгликоль интерферон-альфа-2а, порфимер натрия, ралоксифен, ралтитрексед, разбуриказа, рения Re 186 этидронат, RII ретинамид, ритуксимаб, ромуртид, самария (153 Sm) лексидронам, сарграмостим, сизофиран, собузоксан, сонермин, стронция-89 хлорид, сурамин, тазонермин, тазаротен, тегафур, темопорфин, темозоломид, тенипозид, тетрахлордекаоксид, талидомид, тимальфазин, тиротропин альфа, топотекан, торемифен, тоситумомаб-иод 131, трастузумаб, треосульфан, третиноин, трилостан, триметрексат, трипторелин, фактор некроза опухоли альфа, природный, убенимекс, вакцина от рака мочевого пузыря, вакцина Маруямы, вакцина на основе лизата меланомы, валрубицин, вертепорфин, винорелбин, вирулизин, зиностатин стималамер или золедроновая кислота; абареликс; АЕ 941 (Aetema), амбамустин, антисмысловой олигонуклеотид, bcl-2 (Genta), APC 8015 (Dendreon), цетуксимаб, децитабин, дексаминоглутетимид, диазиквон, EL 532 (Elan), EM 800 (Endorecherche), энилурацил, этанидазол, фенретинид, филграстим SD01 (Amgen), фулвестрант, галоцитабин, гастрин 17 иммуноген, HLA-B7 для генной терапии (Vical), гранулоцитный макрофаговый колониестимулирующий фактор, гистамин дигидрохлорид, ибритумомаб тиуксетан, иломастат, IM 862 (Cytran), интерлейкин-2, ипроксифен, LDI 200 (Milkhaus), леридистим, линтузумаб, моноклональное антитело СА 125 (Biomira), противораковые моноклональные антитела (Japan Pharmaceutical Development), моноклональные антитела HER-2 и Fc (Medarex), идиотипическое моноклональное антитело 105AD7 (CRC Technology), идиотипическое моноклональное антитело СЕА (Trilex), моноклональное антитело LYM-1-иод 131 (Techniclone), моноклональное антитело к полиморфному эпителиальному муцину, меченное иттрием 90 (Antisoma), маримастат, меногарил, митумомаб, мотексафин гадолиний, MX 6 (Galderma), неларабин, нолатрексед, белок Р30, пегвизомант, пеметрексед, порфиромицин, приномастат, RL 0903 (Shire), рубитекан, сатраплатин, фенилацетат натрия, спарфозиновая кислота, SRL 172 (SR Pharma), SU 5416 (SUGEN), ТА 077 (Tanabe), тетратиомолибдат, талибластин, тромбопоэтин, этилэтиопурпурин олова, тирапазамин, противораковая вакцина (Biomira), противомеланомная вакцина (Нью-Йоркский университет), противомеланомная вакцина (институт Слоуна-Кеттеринга), вакцина на основе онколизата меланомы (Нью-Йоркский медицинский колледж), вакцина на основе лизатов клеток вирусной меланомы (Королевская больница Ньюкасла) или валсподар.- 30 045330 century, ibandronic acid, idarubicin, (imiquimod, interferon alpha, natural interferon alpha, interferon alpha-2, interferon alpha-2a, interferon alpha-2b, interferon alpha-N1, interferon alpha-n 3 , interferon alphacon-1 , interferon-alpha, natural interferon-beta, interferon-beta-1a, interferon beta-1b, interferon-gamma, natural interferon gamma-1a, interferon gamma-1b, interleukin-1beta, yobenguane, irinotecan, irsogladin, lanreotide, LC 9018 (Yakult), leflunomide, lenograstim, lentinan sulfate, letrozole, leukocyte alpha interferon, leuprorelin, levamisole + fluorouracil, liarozole, lobaplatin, lonidamine, lovastatin, mazoprocol, melarsoprol, metoclopramide, mifepristone, miltefosine, mirimostim, non-complementary double-strand pure RNA, mitoguazone, mitolactol, mitoxantrone, molgramostim, nafarelin, naloxone+pentazocine, nartograstim, nedaplatin, nilutamide, noscapine, new erythropoiesis-stimulating protein, octreotide NSC 631570, oprelvequin, osaterone, oxaliplatin, paclitaxel, pamidronic acid, pegaspargase, peginterfer he-alpha-2b, sodium pentosan polysulfate, pentostatin, picibanil, pyrarubicin, rabbit antithymocyte polyclonal antibodies, polyethylene glycol interferon-alpha-2a, sodium porfimer, raloxifene, raltitrexed, razburicase, rhenium Re 186 etidronate, RII retinamide, rituximab, romurtide, samarium (153 Sm) lexidronam, s argramostim , sisofiran, sobuzoxane, sonermine, strontium-89 chloride, suramin, tazonermine, tazarotene, tegafur, temoporfin, temozolomide, teniposide, tetrachlordecaoxide, thalidomide, thymalfasin, thyrotropin alfa, topotecan, toremifene, tositumomab-iodine 131, trastuzumab, treosulfan, tretinoin , trilostane, trimetrexate, triptorelin, tumor necrosis factor alpha, natural, ubenimex, bladder cancer vaccine, Maruyama vaccine, melanoma lysate vaccine, valrubicin, verteporfin, vinorelbine, virulysin, zinostatin stimalamer, or zoledronic acid; abarelix; AE 941 (Aetema), ambamustine, antisense oligonucleotide, bcl-2 (Genta), APC 8015 (Dendreon), cetuximab, decitabine, dexaminoglutethimide, diaziquon, EL 532 (Elan), EM 800 (Endorecherche), eniluracil, etanidazole, fenretinide, filgrastim SD01 (Amgen), fulvestrant, halocitabine, gastrin 17 immunogen, HLA-B7 for gene therapy (Vical), granulocyte macrophage colony-stimulating factor, histamine dihydrochloride, ibritumomab tiuxetan, ilomastat, IM 862 (Cytran), interleukin-2, iproxifen, LDI 200 (Milkhaus), leridistim, lintuzumab, monoclonal antibody CA 125 (Biomira), anticancer monoclonal antibodies (Japan Pharmaceutical Development), monoclonal antibodies HER-2 and Fc (Medarex), idiotypic monoclonal antibody 105AD7 (CRC Technology), idiotypic monoclonal antibody CEA (Trilex), monoclonal antibody LYM-1-iodine 131 (Techniclone), monoclonal antibody to polymorphic epithelial mucin, yttrium 90 labeled (Antisoma), marimastat, menogaryl, mitumomab, motexafine gadolinium, MX 6 (Galderma), nelarabine, nolatrexed, protein P30, pegvisomant, pemetrexed, porfiromycin, prinomastat, RL 0903 (Shire), rubitecan, satraplatin, sodium phenylacetate, sparphosic acid, SRL 172 (SR Pharma), SU 5416 (SUGEN), TA 077 (Tanabe), tetrathiomolybdate, taliblastin, thrombopoietin , ethylethiopurpurine stannous, tirapazamine, cancer vaccine (Biomira), melanoma vaccine (NYU), melanoma vaccine (Sloan-Kettering Institute), melanoma oncolysate vaccine (New York Medical College), viral melanoma cell lysate vaccine (Royal Newcastle Hospital) or valspodar.

Соединения по настоящему изобретению можно дополнительно применять с ингибиторами VEGFR. Другие соединения, описанные в следующих патентах и заявках на патенты, можно применять в комбинированной терапии: US 6258812, US 2003/0105091, WO 01/37820, US 6235764, WO 01/32651, US 6630500, US 6515004, US 6713485, US 5521184, US 5770599, US 5747498, WO 02/68406, WO 02/66470, WO 02/55501, WO 04/05279, WO 04/07481, WO 04/07458, WO 04/09784, WO 02/59110, WO 99/45009, WO 00/59509, WO 99/61422, US 5990141, WO 00/12089 и WO 00/02871.The compounds of the present invention can additionally be used with VEGFR inhibitors. Other compounds described in the following patents and patents can be used in combined therapy: US 6258812, US 2003/0105091, Wo 01/37820, US 6235764, Wo 01/32651, US 6630500, US 6515004, US 6713485, US 552111 84 , US 5770599, US 5747498, WO 02/68406, WO 02/66470, WO 02/55501, WO 04/05279, WO 04/07481, WO 04/07458, WO 04/09784, WO 02/59110, WO 9 9/ 45009, WO 00/59509, WO 99/61422, US 5990141, WO 00/12089 and WO 00/02871.

В некоторых вариантах осуществления комбинация предусматривает композицию по настоящему изобретению в комбинации с по меньшей мере одним антиангиогенным средством. К таким средствам относятся без ограничения полученные in vitro синтетическим путем химические композиции, антитела, антигенсвязывающие участки, радионуклиды, а также их комбинации и конъюгаты. Средство может представлять собой агонист, антагонист, аллостерический модулятор, токсин или, более широко, может действовать ингибирующим или стимулирующим образом на свою мишень (например, активация или ингибирование рецептора или фермента) и тем самым способствует гибели клеток или останавливает клеточный рост.In some embodiments, the combination includes a composition of the present invention in combination with at least one antiangiogenic agent. Such agents include, without limitation, chemical compositions produced in vitro synthetically, antibodies, antigen-binding sites, radionuclides, as well as their combinations and conjugates. The agent may be an agonist, antagonist, allosteric modulator, toxin or, more generally, may act in an inhibitory or stimulatory manner on its target (eg, activation or inhibition of a receptor or enzyme) and thereby promote cell death or arrest cell growth.

В совокупности антитела образуют семейство белков плазмы крови, известных как иммуноглобулины, и содержат домены иммуноглобулинов (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed., Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, 1999). Используемый в данном документе термин антитело относится к белку в общепринятом формате иммуноглобулина, содержащему тяжелые и легкие цепи и содержащему вариабельные и константные области. Например, антитело может представлять собой IgG, который характеризуется Y-образной структурой из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну легкую (как правило, имеющую молекулярный вес, составляющий приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (как правило, имеющую молекулярный вес, составляющий приблизительно 50-70 кДа). Антитело имеет вариабельную область и константную область. В форматах IgG вариабельная область обычно содержит приблизительно 100-110 илиCollectively, antibodies form a family of plasma proteins known as immunoglobulins and contain immunoglobulin domains (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed., Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, 1999). As used herein, the term antibody refers to a protein in a conventional immunoglobulin format containing heavy and light chains and containing variable and constant regions. For example, the antibody may be an IgG that is characterized by a Y-shaped structure of two identical pairs of polypeptide chains, each pair containing one light chain (typically having a molecular weight of approximately 25 kDa) and one heavy chain (typically having a molecular weight of approximately 50-70 kDa). An antibody has a variable region and a constant region. In IgG formats, the variable region typically contains approximately 100-110 or

- 31 045330 больше аминокислот, содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), в первую очередь отвечает за распознавание антигена и существенно отличается среди других антител, которые связываются с различными антигенами. Константная область позволяет антителу рекрутировать клетки и молекулы иммунной системы. Вариабельная область состоит из N-концевых областей каждой легкой цепи и тяжелой цепи, тогда как константная область состоит из С-концевых частей каждой из тяжелых и легких цепей. (Janeway et al., Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).- 31 045330 more amino acids, contains three complementarity determining regions (CDRs), is primarily responsible for antigen recognition and differs significantly among other antibodies that bind to different antigens. The constant region allows the antibody to recruit cells and molecules of the immune system. The variable region consists of the N-terminal regions of each light chain and heavy chain, while the constant region consists of the C-terminal portions of each of the heavy and light chains. (Janeway et al., Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).

Общая структура и свойства CDR антител были описаны в уровне техники. Вкратце, в остове антитела CDR встроены в каркас вариабельной области тяжелой и легкой цепей, где они составляют области, главным образом отвечающие за связывание и распознавание антигена. Как правило, вариабельная область содержит по меньшей мере три CDR тяжелой или легкой цепей (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; см. также Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883) в пределах каркасной области (обозначенные как каркасные области 1-4, FR1, FR2, FR3 и FR4 согласно Kabat et al., 1991; см. также Chothia and Lesk, 1987, выше).The general structure and properties of CDR antibodies have been described in the prior art. Briefly, in the antibody backbone, CDRs are integrated into the variable region framework of the heavy and light chains, where they constitute the regions primarily responsible for antigen binding and recognition. Typically, the variable region contains at least three heavy or light chain CDRs (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; see also Chothia and Lesk, 1987, J Mol Biol 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883) within the framework region (designated framework regions 1-4, FR1, FR2, FR3 and FR4 according to Kabat et al. , 1991; see also Chothia and Lesk, 1987, above).

Антитела могут содержать любую константную область, известную в уровне техники. Человеческие легкие цепи классифицируют как легкие каппа- и лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируют как мю-, дельта-, гамма-, альфа- или эпсилон-цепи, и они определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включая без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включая без ограничения IgM1 и IgM2. Варианты осуществления настоящего изобретения включают все такие классы или изотипы антител. Константная область легкой цепи может представлять собой, например, константную область легкой цепи каппа- или лямбда-типа, например, человеческую константную область легкой цепи каппа- или лямбда-типа. Константная область тяжелой цепи может представлять собой, например, константные области тяжелой цепи альфа-, дельта-, эпсилон-, гамма- или мю-типа, например, человеческую константную область тяжелой цепи альфа-, дельта-, эпсилон-, гамма- или мю-типа. Соответственно, в иллюстративных вариантах осуществления антитело представляет собой антитело изотипа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM, включая любое из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.Antibodies may contain any constant region known in the art. Human light chains are classified as kappa and lambda light chains. Heavy chains are classified as mu, delta, gamma, alpha, or epsilon chains, and they define the isotype of the antibody as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. IgG has several subclasses, including but not limited to IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. IgM has subclasses including, but not limited to, IgM1 and IgM2. Embodiments of the present invention include all such classes or isotypes of antibodies. The light chain constant region may be, for example, a kappa or lambda light chain constant region, for example a human kappa or lambda light chain constant region. The heavy chain constant region may be, for example, alpha, delta, epsilon, gamma or mu heavy chain constant regions, for example a human alpha, delta, epsilon, gamma or mu heavy chain constant region -type. Accordingly, in illustrative embodiments, the antibody is an antibody of the IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM isotype, including any of IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.

Антитело может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность, которая в значительное степени сходна с встречающимся в природе антителом, продуцируемым млекопитающим, например, мышью, кроликом, козой, лошадью, курицей, хомяком, человеком и т.п. В этом отношении антитело можно рассматривать как антитело млекопитающего, например, антитело мыши, антитело кролика, антитело козы, антитело лошади, антитело курицы, антитело хомяка, антитело человека и т.п. В определенных аспектах антитело представляет собой человеческое антитело. В определенных аспектах антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. Термин химерное антитело относится к антителу, содержащему домены из двух или более различных антител. Химерное антитело может, например, содержать константные домены от одного вида и вариабельные домены от второго или, в более общем случае, может содержать фрагменты аминокислотной последовательности от по меньшей мере двух видов. Химерное антитело также может содержать домены двух или больше различных антител от одного и того же вида. Термин гуманизированное при использовании в отношении антител относится к антителам, содержащим по меньшей мере области CDR из источника, отличного от человека, сконструированные таким образом, чтобы они имели структуру и иммунологическую функцию, более сходные с таковыми у настоящих человеческих антител, чем у антител из исходного источника. Например, гуманизация может включать прививание CDR из антитела, отличного от человеческого, такого как мышиное антитело, на человеческое антитело. Гуманизация также может включать селективные аминокислотные замены для получения отличной от человеческой последовательности, более сходной с человеческой последовательностью.The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. In some embodiments, the antibody contains a sequence that is substantially similar to a naturally occurring antibody produced by a mammal, such as a mouse, rabbit, goat, horse, chicken, hamster, human, and the like. In this regard, the antibody can be considered as a mammalian antibody, for example, a mouse antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, a horse antibody, a chicken antibody, a hamster antibody, a human antibody, and the like. In certain aspects, the antibody is a human antibody. In certain aspects, the antibody is a chimeric antibody or a humanized antibody. The term chimeric antibody refers to an antibody containing domains from two or more different antibodies. A chimeric antibody may, for example, contain constant domains from one species and variable domains from a second, or more generally may contain amino acid sequence fragments from at least two species. A chimeric antibody may also contain domains from two or more different antibodies from the same species. The term humanized, when used in relation to antibodies, refers to antibodies containing at least CDR regions from a non-human source engineered to have a structure and immunological function more similar to those of actual human antibodies than to antibodies from the source. source. For example, humanization may involve grafting a CDR from a non-human antibody, such as a mouse antibody, onto a human antibody. Humanization may also include selective amino acid substitutions to produce a non-human sequence that is more similar to the human sequence.

Антитело можно расщеплять на фрагменты с помощью ферментов, таких как, например, папаин и пепсин. Папаин расщепляет антитело с образованием двух Fab-фрагментов и одного Fc-фрагмента. Пепсин расщепляет антитело с образованием F(ab')2-фрагмента и pFc'-фрагмента. Используемый в данном документе термин антигенсвязывающий фрагмент антитела относится к части молекулы антитела, которая способна к связыванию антигена антитела и также известна как антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающая часть. В иллюстративных примерах антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой Fab-фрагмент или F(ab')2-фрагмент.The antibody can be broken down into fragments using enzymes such as papain and pepsin. Papain cleaves the antibody to form two Fab fragments and one Fc fragment. Pepsin cleaves the antibody to form the F(ab') 2 fragment and the pFc' fragment. As used herein, the term antigen binding fragment of an antibody refers to a portion of an antibody molecule that is capable of binding an antibody antigen and is also known as an antigen binding fragment or antigen binding portion. In illustrative examples, the antigen binding fragment of the antibody is a Fab fragment or an F(ab') 2 fragment.

Архитектуру антител использовали для создания растущего спектра альтернативных форматов, который охватывает диапазон молекулярных масс по меньшей мере приблизительно 12-150 кДа и характеризуется диапазоном валентности (n) от мономерных (n=1), до димерных (n=2), до тримерных (n=3), до тетрамерных (n=4) и потенциально более высокого порядка; такие альтернативные форматы в данном документе называются белковыми продуктами на основе антител. Белковые продукты на основе антител включают белковые продукты на основе структуры полного антитела и белковые продукты, которые имитируют фрагменты антитела, сохраняющие полную антигенсвязывающую способность, например,Antibody architecture has been used to create a growing range of alternative formats that spans a molecular weight range of at least approximately 12-150 kDa and is characterized by a range of valencies (n) from monomeric (n=1), to dimeric (n=2), to trimeric (n =3), to tetrameric (n=4) and potentially higher order; such alternative formats are referred to herein as antibody-based protein products. Antibody protein products include protein products based on the structure of the complete antibody and protein products that mimic antibody fragments that retain full antigen-binding capacity, e.g.

- 32 045330 scFv, Fab и VHH/VH (обсуждаемые ниже). Наименьшим антигенсвязывающим фрагментом антитела, который сохраняет свой полный антигенсвязывающий участок, является Fv-фрагмент, который полностью состоит из вариабельных (V) областей. Растворимый гибкий аминокислотный пептидный линкер применяют для присоединения V-областей к scFv-фрагменту (одноцепочечный вариабельный фрагмент) для стабилизации молекулы, или константные (С) домены добавляют к V-областям с получением Fabфрагмента [антигенсвязывающего фрагмента]. Как scFv-, так и Fab-фрагменты могут быть легко получены в клетках-хозяевах, например, прокариотических клетках-хозяевах. Другие белковые продукты на основе антитела включают scFv, стабилизированный дисульфидными связями (ds-scFv), одноцепочечный Fab (scFab), а также ди- и мультимерные форматы антител, такие как диа-, триа- и тетратела, или миниантитела (мини-Ab), которые включают различные форматы, состоящие из scFv, связанных с олигомеризующимися доменами. Наименьшие фрагменты представляют собой VHH/VH из тяжелой цепи Ab верблюдовых, а также однодоменные Ab (sdAb). Структурным элементом, который чаще всего используется для создания новых форматов антитела, является фрагмент антитела, представляющий собой одноцепочечный вариабельный (V) домен (scFv), который содержит V-домены из тяжелой и легкой цепей (VH- и VL-домен), связанные с помощью пептидного линкера из ~15 аминокислотных остатков. Пептитело или продукт слияния пептида и Fc представляет собой еще один белковый продукт на основе антитела. Структура пептитела состоит из биологически активного пептида, привитого на Fc-домен. Пептитела хорошо описаны в уровне техники. См., например, Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).- 32 045330 scFv, Fab and VHH/VH (discussed below). The smallest antigen-binding fragment of an antibody that retains its complete antigen-binding region is the Fv fragment, which consists entirely of variable (V) regions. A soluble, flexible amino acid peptide linker is used to attach V regions to the scFv fragment (single chain variable fragment) to stabilize the molecule, or constant (C) domains are added to the V regions to produce a Fab fragment [antigen binding fragment]. Both scFv and Fab fragments can be readily produced in host cells, for example, prokaryotic host cells. Other antibody-based protein products include disulfide-stabilized scFv (ds-scFv), single-chain Fab (scFab), and di- and multimeric antibody formats such as dia-, tria-, and tetrabodies, or mini-Abs. , which include various formats consisting of scFvs associated with oligomerizing domains. The smallest fragments are VHH/VH from camelid heavy chain Abs, as well as single domain Abs (sdAbs). The structural element most often used to create new antibody formats is the antibody fragment, which is a single chain variable (V) domain (scFv), which contains the heavy and light chain V domains (VH and VL domain) associated with using a peptide linker of ~15 amino acid residues. The peptibody or peptide-Fc fusion product is another antibody-based protein product. The peptibody structure consists of a biologically active peptide grafted onto an Fc domain. Peptibodies are well described in the prior art. See, for example, Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).

Другие белковые продукты на основе антител включают одноцепочечное антитело (SCA); диатело; триатело; тетратело; биспецифические или триспецифические антитела и т.п. Биспецифические антитела можно разделить на пять основных классов: BsIgG, дополненные IgG, фрагменты BsAb, биспецифические слитые белки и конъюгаты BsAb. См., например, Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97106 (2015).Other antibody-based protein products include single chain antibody (SCA); diabody; triatelo; tetrabody; bispecific or trispecific antibodies, etc. Bispecific antibodies can be divided into five main classes: BsIgG, complemented IgG, BsAb fragments, bispecific fusion proteins and BsAb conjugates. See, for example, Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97106 (2015).

Иллюстративные антиангиогенные средства включают ERBITUX™ (IMC-C225), средства, ингибирующие KDR (рецептор домена киназы) (например, антитела и антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с рецептором домена киназы), средства, представляющие собой антитела к VEGF (например, антитела и антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с VEGF, или растворимые рецепторы VEGF или их лигандсвязывающий участок), такие как AVASTIN™ или VEGF-TRAP™, и средства, представляющие собой антитела к рецептору VEGF (например, антитела или антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с ним), средства, ингибирующие EGFR (например, антитела или антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с ним), такие как Vectibix (панитумумаб), IRESSA™ (гефитиниб), TARCEVA™ (эрлотиниб), средства, представляющие собой антитела к Ang1 и Ang2 (например, антитела или антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с ним или с их рецепторами, например, Tie2/Tek), а также ингибирующие средства, представляющие собой антитела к Tie2-киназе (например, антитела или антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с ней). Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут содержать одно или несколько средств (например, антитела, антигенсвязывающие участки или растворимые рецепторы), которые специфически связываются и ингибируют активность факторов роста, таких как антагонисты фактора роста гепатоцитов (HGF, также известного как рассеивающий фактор) и антитела или антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с его рецептором c-met.Exemplary antiangiogenic agents include ERBITUX™ (IMC-C225), KDR (kinase domain receptor) inhibitory agents (e.g., antibodies and antigen binding sites that specifically bind to the receptor kinase domain), anti-VEGF agents (e.g., antibodies and antigen-binding sites that specifically bind to VEGF, or soluble VEGF receptors or a ligand-binding site thereof), such as AVASTIN™ or VEGF-TRAP™, and VEGF receptor antibody agents (e.g., antibodies or antigen-binding sites that specifically bind to agents that inhibit EGFR (e.g., antibodies or antigen-binding sites that specifically bind to it), such as Vectibix (panitumumab), IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA™ (erlotinib), anti-Ang1 and Ang2 anti-EGFR agents (e.g., antibodies or antigen-binding sites that specifically bind to it or its receptors, e.g., Tie2/Tek), as well as inhibitory agents that are antibodies to Tie2 kinase (e.g., antibodies or antigen-binding sites that specifically bind to it ). The pharmaceutical compositions of the present invention may also contain one or more agents (for example, antibodies, antigen-binding sites or soluble receptors) that specifically bind to and inhibit the activity of growth factors, such as hepatocyte growth factor (HGF, also known as scattering factor) antagonists and antibodies or antigen-binding sites that specifically bind to its c-met receptor.

Другие антиангиогенные средства включают кампат, IL-8, B-FGF, антагонисты Tek (Ceretti et al., публикация заявки на патент США № 2003/0162712, патент США № 6413932), средства, представляющие собой антитела к TWEAK (например, специфически связывающиеся антитела или антигенсвязывающие участки или антагонисты растворимого рецептора TWEAK, см. Wiley, патент США № 6727225), домен дизинтегрина ADAM в качестве антагониста связывания интегрина с его лигандами (Fanslow et al., публикация заявки на патент США № 2002/0042368), специфически связывающиеся антитела к ephрецептору и/или антитела к эфрину или антигенсвязывающие участки (патенты США №№ 5981245, 5728813, 5969110, 6596852, 6232447, 6057124 и члены их патентного семейства) и антагонисты, представляющие собой антитела к PDGF-BB (например, специфически связывающиеся антитела или антигенсвязывающие участки), а также антитела или антигенсвязывающие участки, специфически связывающиеся с PDGF-BB-лигандами, и средства, представляющие собой ингибиторы PDGFR-киназы (например, антитела или антигенсвязывающие участки, которые специфически связываются с ней).Other anti-angiogenic agents include Campath, IL-8, B-FGF, Tek antagonists (Ceretti et al., US Patent Application Publication No. 2003/0162712, US Patent No. 6,413,932), anti-TWEAK antibody agents (eg, specifically binding antibodies or antigen binding sites or soluble receptor antagonists TWEAK, see Wiley, US patent No. 6727225), ADAM disintegrin domain as an antagonist of integrin binding to its ligands (Fanslow et al., publication of US patent application No. 2002/0042368), specifically binding anti-ephreceptor antibodies and/or anti-ephrin antibodies or antigen binding sites (US Pat. Nos. 5,981,245, 5,728,813, 5,969,110, 6,596,852, 6,232,447, 6,057,124 and members thereof) and antagonists that are anti-PDGF-BB antibodies (e.g., specific binding antibodies or antigen-binding sites), as well as antibodies or antigen-binding sites that specifically bind to PDGF-BB ligands, and agents that are inhibitors of PDGFR kinase (eg, antibodies or antigen-binding sites that specifically bind thereto).

Дополнительные антиангиогенные/противоопухолевые средства включают: SD-7784 (Pfizer, США); циленгитид (Merck KGaA, Германия, EPO 770622); пегаптаниб октанатрия (Gilead Sciences, США); альфастатин (BioActa, Великобритания); M-PGA (Celgene, США, US 5712291); иломастат (Arriva, США, US 5892112); эмаксаниб (Pfizer, США, US 5792783); ваталаниб (Novartis, Швейцария); 2-метоксиэстрадиол (EntreMed, США); TLC ELL-12, (Elan, Ирландия); анекортав ацетат (Alcon, США); моноклональное антитело альфа-0148 (Amgen, США); СЕР-7055 (Cephalon, США); моноклональное антитело к Vn (Crucell, Нидерланды) DAC:антиангиоген (ConjuChem, Канада); ангиоцидин (InKine Pharmaceutical, США); KM2550 (Kyowa Hakko, Япония); SU-0879 (Pfizer, США); CGP-79787 (Novartis, Швейцария, EP 970070); техAdditional antiangiogenic/antitumor agents include: SD-7784 (Pfizer, USA); cilengitide (Merck KGaA, Germany, EPO 770622); pegaptanib octasodium (Gilead Sciences, USA); alfastatin (BioActa, UK); M-PGA (Celgene, USA, US 5712291); ilomastat (Arriva, USA, US 5892112); emaxanib (Pfizer, USA, US 5792783); vatalanib (Novartis, Switzerland); 2-methoxyestradiol (EntreMed, USA); TLC ELL-12, (Elan, Ireland); anecortave acetate (Alcon, USA); monoclonal antibody alpha-0148 (Amgen, USA); CEP-7055 (Cephalon, USA); monoclonal antibody to Vn (Crucell, Netherlands) DAC:antiangiogen (ConjuChem, Canada); angiocidin (InKine Pharmaceutical, USA); KM2550 (Kyowa Hakko, Japan); SU-0879 (Pfizer, USA); CGP-79787 (Novartis, Switzerland, EP 970070); those

- 33 045330 нология ARGENT (Ariad, США); YIGSR-Stealth, (Johnson & Johnson, США); фрагмент фибриногена-Е (BioActa, Великобритания); ингибитор ангиогенеза (Trigen, Великобритания); ТВС-1635 (Encysive Pharmaceuticals, США); SC-236 (Pfizer, США); АВТ-567 (Abbott, США); метастатин (EntreMed, США); ингибитор ангиогенеза (Tripep, Швеция); маспин (Sosei, Япония); 2-метоксиэстрадиол (Oncology Sciences Corporation, США); ER-68203-00 (IVAX, США); бенефин (Lane Labs, США); Tz-93 (Tsumura, Япония); TAN-1120 (Takeda, Япония); FR-111142 (Fujisawa, Япония, JP 02233610); тромбоцитарный фактор 4 (RepliGen, США, EP 407122); антагонист фактора роста сосудистого эндотелия (Borean, Denmark); бевацизумаб (pINN), (Genentech, США); ингибиторы ангиогенеза (SUGEN, США); XL 784 (Exelixis, США); XL 647 (Exelixis, США); моноклональное антитело, альфа5бетаЗ интегрин второго поколения (Applied Molecular Evolution, США, и Medlmmune, США); средство для генной терапии ретинопатии (Oxford BioMedica, Великобритания); энзастаурина гидрохлорид (USAN), (Lilly, США); СЕР 7055, (Cephalon, США, и Sanofi-Synthelabo, Франция); ВС 1 (Genoa Institute of Cancer Research, Италия); ингибитор ангиогенеза (Alchemia, Австралия); антагонист VEGF (Regeneron, США); антиангиогенные препараты на основе rBPI 21 и BPI (ХОМА, США); PI 88 (Progen, Австралия); циленгитид (pINN), (Merck KGaA, Германия; Мюнхенский технический университет, Германия, Scripps Clinic and Research Foundation, США); цетуксимаб (INN), (Aventis, Франция); AVE 8062 (Ajinomoto, Япония); AS 1404 (Cancer Research Laboratory, Новая Зеландия); SG 292 (Telios, США); эндостатин (Бостонский детский госпиталь, США); ATN 161 (Attenuon, США); ангиостатин (Бостонский детский госпиталь, США); 2-метоксиэстрадиол (Бостонский детский госпиталь, США); ZD 6474 (AstraZeneca, Великобритания); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, Великобритания); PPI 2458 (Praecis, США); AZD 9935 (AstraZeneca, Великобритания); AZD 2171 (AstraZeneca, Великобритания); ваталаниб (pINN), (Novartis, Швейцария и Schering AG, Германия); ингибиторы пути тканевого фактора (EntreMed, США); пегаптаниб (Pinn), (Gilead Sciences, США); ксанторизол, (Yonsei University, Южная Корея); генноинженерная вакцина, VEGF-2, (Scripps Clinic and Research Foundation, США); SPV5.2 (Supratek, Канада); SDX 103 (Калифорнийский университет в Сан-Диего, США); РХ 478 (ProlX, США); метастатин, (EntreMed, США); тропонин I, (Гарвардский университет, США); SU 6668 (SUGEN, США); OXI 4503 (OXiGENE, США); о-гуанидины (Dimensional Pharmaceuticals, США); мотупорамин С (Университет Британской Колумбии, Канада); CDP 791 (Celltech Group, Великобритания); атипримод (pINN), (GlaxoSmithKline, Великобритания); Е 7820 (Eisai, Япония); CYC 381 (Гарвардский университет, США); АЕ 941 (Aeterna, Канада); вакцина от ангиогенеза (EntreMed, США); ингибитор активатора плазминогена урокиназы (Dendreon, США); оглуфанид (pINN), (Melmotte, США); ингибиторы HIF-1 альфа (Xenova, Великобритания); СЕР 5214 (Cephalon, США); BAY RES 2622 (Bayer, Германия); ангиоцидин (InKine, США); А6 (Angstrom, США); KR 31372 (Корейский исследовательский институт химической технологии, Южная Корея); GW 2286 (GlaxoSmithKline, Великобритания); ЕНТ 0101 (ExonHit, Франция); СР 868596 (Pfizer, США); СР 564959 (OSI, США); СР 547632 (Pfizer, США); 786034 (GlaxoSmithKline, Великобритания); KRN 633 (Kirin Brewery, Япония); система внутриглазной доставки лекарственных средств, 2-метоксиэстрадиол (EntreMed, США); ангинекс, (Маастрихтский университет, Нидерланды, и Миннесотский университет, США); АВТ 510 (Abbott, США); AAL 993 (Novartis, Швейцария); VEGI (ProteomTech, США); ингибиторы фактора некроза опухоли альфа (Национальный институт старения, США); SU 11248 (Pfizer, США и SUGEN, США); АВТ 518 (Abbott, США); YH16 (Yantai Rongchang, Китай); S-3APG (Бостонский детский госпиталь, США, и EntreMed, США); моноклональное антитело, KDR (ImClone Systems, США); моноклональное антитело, альфа5бета1 (Protein Design, США); ингибитор киназы KDR (Celltech Group, Великобритания, и Johnson & Johnson, США); GFB 116 (Южно-Флоридский университет, США, и Йельский университет, США); CS 706 (Sankyo, Япония); пролекарство комбретастатин А4 (Университет штата Аризона, США); хондроитиназа АС (IBEX, Канада); BAY RES 2690 (Bayer, Германия); AGM 1470 (Гарвардский университет, США; Takeda, Япония, и ТАР, США); AG 13925 (Agouron, США); тетратиомолибдат (Мичиганский университет, США); GCS 100 (Университет Уэйна, США), CV 247 (Ivy Medical, Великобритания); CKD 732 (Chong Kun Dang, Южная Корея); моноклональное антитело, фактор роста сосудистого эндотелия (Xenova, Великобритания); ирсогладин (INN), (Nippon Shinyaku, Япония); RG 13577 (Aventis, Франция); WX 360 (Wilex, Германия); скваламин (pINN), (Genaera, США); RPI 4610 (Sirna, США); средство терапии рака (Marinova, Австралия); ингибиторы гепараназы (InSight, Израиль); KL 3106 (Kolon, Южная Корея); хонокиол (Университет Эмори, США); ZK CDK (Schering AG, Германия); ZK Angio (Schering AG, Германия); ZK 229561 (Novartis, Швейцария, и Schering AG, Германия); XMP 300 (ХОМА, США); VGA 1102 (Taisho, Япония); модуляторы рецепторов VEGF (Pharmacopeia, США); антагонисты VE-кадгерина-2 (ImClone Systems, США); вазостатин (Национальный институт здоровья, США); вакцина Flk-1 (ImClone Systems, США); TZ 93 (Tsumura, Япония); тумстатин (Beth Israel Hospital, США); укороченный растворимый FLT 1 (рецептор 1 фактора роста сосудистого эндотелия), (Merck & Co, США); лиганды Tie-2 (Regeneron, США) и ингибитор тромбоспондина 1 (Allegheny Health, Education and Research Foundation, США).- 33 045330 nology ARGENT (Ariad, USA); YIGSR-Stealth, (Johnson & Johnson, USA); fibrinogen fragment-E (BioActa, UK); angiogenesis inhibitor (Trigen, UK); TVS-1635 (Encysive Pharmaceuticals, USA); SC-236 (Pfizer, USA); AVT-567 (Abbott, USA); metastatin (EntreMed, USA); angiogenesis inhibitor (Tripep, Sweden); maspin (Sosei, Japan); 2-methoxyestradiol (Oncology Sciences Corporation, USA); ER-68203-00 (IVAX, USA); benefin (Lane Labs, USA); Tz-93 (Tsumura, Japan); TAN-1120 (Takeda, Japan); FR-111142 (Fujisawa, Japan, JP 02233610); platelet factor 4 (RepliGen, USA, EP 407122); vascular endothelial growth factor antagonist (Borean, Denmark); bevacizumab (pINN), (Genentech, USA); angiogenesis inhibitors (SUGEN, USA); XL 784 (Exelixis, USA); XL 647 (Exelixis, USA); monoclonal antibody, second generation alpha5beta3 integrin (Applied Molecular Evolution, USA, and Medlmmune, USA); a product for gene therapy of retinopathy (Oxford BioMedica, UK); enzastaurine hydrochloride (USAN), (Lilly, USA); CEP 7055, (Cephalon, USA, and Sanofi-Synthelabo, France); BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research, Italy); angiogenesis inhibitor (Alchemia, Australia); VEGF antagonist (Regeneron, USA); antiangiogenic drugs based on rBPI 21 and BPI (HOMA, USA); PI 88 (Progen, Australia); cilengitide (pINN), (Merck KGaA, Germany; Technical University of Munich, Germany, Scripps Clinic and Research Foundation, USA); cetuximab (INN), (Aventis, France); AVE 8062 (Ajinomoto, Japan); AS 1404 (Cancer Research Laboratory, New Zealand); SG 292 (Telios, USA); endostatin (Boston Children's Hospital, USA); ATN 161 (Attenuon, USA); angiostatin (Boston Children's Hospital, USA); 2-methoxyestradiol (Boston Children's Hospital, USA); ZD 6474 (AstraZeneca, UK); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, UK); PPI 2458 (Praecis, USA); AZD 9935 (AstraZeneca, UK); AZD 2171 (AstraZeneca, UK); vatalanib (pINN), (Novartis, Switzerland and Schering AG, Germany); tissue factor pathway inhibitors (EntreMed, USA); pegaptanib (Pinn), (Gilead Sciences, USA); xanthorizol, (Yonsei University, South Korea); genetically engineered vaccine, VEGF-2, (Scripps Clinic and Research Foundation, USA); SPV5.2 (Supratek, Canada); SDX 103 (University of California at San Diego, USA); РХ 478 (ProlX, USA); metastatin, (EntreMed, USA); Troponin I, (Harvard University, USA); SU 6668 (SUGEN, USA); OXI 4503 (OXiGENE, USA); o-guanidines (Dimensional Pharmaceuticals, USA); motuporamine C (University of British Columbia, Canada); CDP 791 (Celltech Group, UK); atiprimod (pINN), (GlaxoSmithKline, UK); E 7820 (Eisai, Japan); CYC 381 (Harvard University, USA); AE 941 (Aeterna, Canada); angiogenesis vaccine (EntreMed, USA); urokinase plasminogen activator inhibitor (Dendreon, USA); oglufanide (pINN), (Melmotte, USA); HIF-1 alpha inhibitors (Xenova, UK); CEP 5214 (Cephalon, USA); BAY RES 2622 (Bayer, Germany); angiocidin (InKine, USA); A6 (Angstrom, USA); KR 31372 (Korea Chemical Technology Research Institute, South Korea); GW 2286 (GlaxoSmithKline, UK); UNT 0101 (ExonHit, France); CP 868596 (Pfizer, USA); CP 564959 (OSI, USA); CP 547632 (Pfizer, USA); 786034 (GlaxoSmithKline, UK); KRN 633 (Kirin Brewery, Japan); intraocular drug delivery system, 2-methoxyestradiol (EntreMed, USA); Anginex, (Maastricht University, the Netherlands, and the University of Minnesota, USA); ABT 510 (Abbott, USA); AAL 993 (Novartis, Switzerland); VEGI (ProteomTech, USA); tumor necrosis factor alpha inhibitors (National Institute on Aging, USA); SU 11248 (Pfizer, USA and SUGEN, USA); ABT 518 (Abbott, USA); YH16 (Yantai Rongchang, China); S-3APG (Boston Children's Hospital, USA, and EntreMed, USA); monoclonal antibody, KDR (ImClone Systems, USA); monoclonal antibody, alpha5beta1 (Protein Design, USA); KDR kinase inhibitor (Celltech Group, UK, and Johnson & Johnson, USA); GFB 116 (University of South Florida, USA, and Yale University, USA); CS 706 (Sankyo, Japan); prodrug combretastatin A4 (Arizona State University, USA); chondroitinase AC (IBEX, Canada); BAY RES 2690 (Bayer, Germany); AGM 1470 (Harvard University, USA; Takeda, Japan, and TAR, USA); AG 13925 (Agouron, USA); tetrathiomolybdate (University of Michigan, USA); GCS 100 (Wayne University, USA), CV 247 (Ivy Medical, UK); CKD 732 (Chong Kun Dang, South Korea); monoclonal antibody, vascular endothelial growth factor (Xenova, UK); Irsogladine (INN), (Nippon Shinyaku, Japan); RG 13577 (Aventis, France); WX 360 (Wilex, Germany); squalamine (pINN), (Genaera, USA); RPI 4610 (Sirna, USA); cancer therapy (Marinova, Australia); heparanase inhibitors (InSight, Israel); KL 3106 (Kolon, South Korea); honokiol (Emory University, USA); ZK CDK (Schering AG, Germany); ZK Angio (Schering AG, Germany); ZK 229561 (Novartis, Switzerland, and Schering AG, Germany); XMP 300 (HOMA, USA); VGA 1102 (Taisho, Japan); VEGF receptor modulators (Pharmacopeia, USA); VE-cadherin-2 antagonists (ImClone Systems, USA); vasostatin (National Institute of Health, USA); Flk-1 vaccine (ImClone Systems, USA); TZ 93 (Tsumura, Japan); tumstatin (Beth Israel Hospital, USA); shortened soluble FLT 1 (vascular endothelial growth factor receptor 1), (Merck & Co, USA); Tie-2 ligands (Regeneron, USA) and thrombospondin 1 inhibitor (Allegheny Health, Education and Research Foundation, USA).

Ингибиторы аутофагии включают без ограничения хлорохин, 3-метиладенин, гидроксихлорохин (Plaquenil™), бафиломицин А1, 5-амино-4-имидазолкарбоксамидрибозид (AICAR), токсины водорослей, подавляющие аутофагию, которые ингибируют протеинфосфатазы типа 2А или типа 1, аналоги сАМР и лекарственные средства, которые повышают уровни сАМР, такие как аденозин, LY204002, N6- 34 045330 меркаптопуринрибозид и винбластин. Кроме того, также можно применять антисмысловую или siRNA, которая ингибирует экспрессию белков, в том числе без ограничения ATG5 (которые вовлечены в аутофагию).Autophagy inhibitors include, but are not limited to, chloroquine, 3-methyladenine, hydroxychloroquine (Plaquenil™), bafilomycin A1, 5-amino-4-imidazole carboxamide riboside (AICAR), algal toxins that inhibit autophagy that inhibit protein phosphatases type 2A or type 1, cAMP analogues, and drugs agents that increase cAMP levels such as adenosine, LY204002, N6-34 045330 mercaptopurine riboside and vinblastine. In addition, antisense or siRNA that inhibits the expression of proteins, including but not limited to ATG5 (which are involved in autophagy), can also be used.

Дополнительные фармацевтически активные соединения/средства, которые можно применять в лечении видов рака и которые можно применять в комбинации с одним или несколькими соединениями по настоящему изобретению включают эпоэтин альфа, дарбэпоэтин альфа, панитумумаб, пэгфилграстим, палифермин, филграстим, деносумаб, анцестим, AMG 102, AMG 176, AMG 386, AMG 479, AMG 655, AMG 745, AMG 951 и AMG 706 или их фармацевтически приемлемые соли.Additional pharmaceutically active compounds/agents that can be used in the treatment of cancers and that can be used in combination with one or more compounds of the present invention include epoetin alfa, darbepoetin alfa, panitumumab, pegfilgrastim, palifermin, filgrastim, denosumab, ancestim, AMG 102, AMG 176, AMG 386, AMG 479, AMG 655, AMG 745, AMG 951 and AMG 706 or pharmaceutically acceptable salts thereof.

В некоторых вариантах осуществления композицию, представленную в данном документе, вводят совместно с химиотерапевтическим средством. Подходящие химиотерапевтические средства могут включать природные продукты, такие как алкалоиды барвинка (например, винбластин, винкристин и винорелбин), паклитаксел, эпидиподофиллотоксины (например, этопозид и тенипозид), антибиотики (например, дактиномицин (актиномицин D), даунорубицин, доксорубицин и идарубицин), антрациклины, митоксантрон, блеомицины, пликамицин (митрамицин), митомицин, ферменты (например, Lаспарагиназа, которая системно метаболизирует L-аспарагин и лишает его клетки, которые не обладают способностью синтезировать собственный аспарагин), антитромбоцитарные средства, антипролиферативные/антимитотические алкилирующие средства, такие как азотистые иприты (например, мехлорэтамин, циклофосфамид и аналоги, мелфалан и хлорамбуцил), этиленимины и метилмеламины (например, гексаметилмеламин и тиотепа), ингибиторы CDK (например, селициклиб, UCN-01, P1446A-05, PD0332991, динациклиб, Р27-00, АТ-7519, RGB286638 и SCH727965), алкилсульфонаты (например, бусульфан), производные нитрозомочевины (например, кармустин (BCNU) и аналоги, а также стрептозоцин), тразенес-дакарбазинин (DTIC), антипролиферативные/антимитотические антиметаболиты, такие как аналоги фолиевой кислоты (например, метотрексат), пиримидиновые аналоги (например, фторурацил, флоксуридин и цитарабин), пуриновые аналоги и родственные ингибиторы (например, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин и 2-хлордезоксиаденозин), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, экземестан и летрозол) и координационные комплексы платины (например, цисплатин и карбоплатин), прокарбазин, гидроксимочевина, митотан, аминоглутетимид, ингибиторы гистондезацетилазы (HDAC) (например, трихостатин, натрия бутират, апицидан, субероиланилидгидроаминовая кислота, вориностат, LBH 589, ромидепсин, ACY-1215 и панобиностат), ингибиторы mTor (например, темсиролимус, эверолимус, ридафоролимус и сиролимус), ингибиторы KSP(Eg5) (например, Array 520), связывающиеся с ДНК средства (например, Zalypsis), ингибитор PI3K дельта (например, GS-1101 и TGR-1202), ингибитор PI3K дельта и гамма (например, CAL-130), ингибитор мультикиназы (например, TG02 и сорафениб), гормоны (например, эстроген) и агонисты гормонов, такие как агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH) (например, гозерелин, лейпролид и трипторелин), BAFF-нейтрализующее антитело (например, LY2127399), ингибиторы IKK, ингибиторы p38MAPK, антитела к IL-6 (например, CNTO328), ингибиторы теломеразы (например, GRN163L), ингибиторы авроракиназы (например, MLN8237), моноклональные антитела поверхности клеток (например, антитела к CD38 (HUMAX-CD38), антитела к CS1 (например, элотузумаб), ингибиторы HSP90 (например, 17 AAG и KOS 953), ингибиторы PI3K/Akt (например, перифозин), ингибитор Akt (например, GSK-2141795), ингибиторы РКС (например, энзастаурин), разновидности FTI (например, Zarnestra™), антитела к CD138 (например, ВТ062), ингибитор специфичной киназы Torc1/2 (например, INK128), ингибитор киназы (например, GS-1101), ER/UPR нацеливающее средство (например, МКС-3946), ингибитор cFMS (например, ARRY-382), ингибитор JAK1/2 (например, CYT387), ингибитор PARP (например, олапариб и велипариб (АВТ-888)), антагонист BCL-2. Другие химиотерапевтические средства могут включать мехлорэтамин, камптотецин, ифосфамид, тамоксифен, ралоксифен, гемцитабин, навелбин, сорафениб или любой аналог или производный вариант вышеуказанных.In some embodiments, a composition provided herein is administered in conjunction with a chemotherapeutic agent. Suitable chemotherapeutic agents may include natural products such as vinca alkaloids (eg, vinblastine, vincristine and vinorelbine), paclitaxel, epidipodophyllotoxins (eg, etoposide and teniposide), antibiotics (eg, dactinomycin (actinomycin D), daunorubicin, doxorubicin and idarubicin), anthracyclines, mitoxantrone, bleomycins, plicamycin (mithramycin), mitomycin, enzymes (e.g. L-asparaginase, which systemically metabolizes L-asparagine and deprives it of cells that do not have the ability to synthesize their own asparagine), antiplatelet agents, antiproliferative/antimitotic alkylating agents such as nitrogen mustards (eg, mechlorethamine, cyclophosphamide and analogues, melphalan and chlorambucil), ethylenimines and methylmelamines (eg, hexamethylmelamine and thiotepa), CDK inhibitors (eg, seliciclib, UCN-01, P1446A-05, PD0332991, dinaciclib, P27-00, AT-7519, RGB286638 and SCH727965), alkyl sulfonates (eg, busulfan), nitrosourea derivatives (eg, carmustine (BCNU) and analogs, and streptozocin), trazenes-dacarbazinine (DTIC), antiproliferative/antimitotic antimetabolites such as folic acid analogs (eg, methotrexate), pyrimidine analogues (eg, fluorouracil, floxuridine and cytarabine), purine analogues and related inhibitors (eg, mercaptopurine, thioguanine, pentostatin and 2-chlorodeoxyadenosine), aromatase inhibitors (eg, anastrozole, exemestane and letrozole) and coordination platinum complexes (eg, cisplatin and carboplatin), procarbazine, hydroxyurea, mitotane, aminoglutethimide, histone deacetylase (HDAC) inhibitors (eg, trichostatin, sodium butyrate, apicidan, suberoylanilide hydroamic acid, vorinostat, LBH 589, romidepsin, ACY-1215 and panobinostat), mTor inhibitors (eg, temsirolimus, everolimus, ridaforolimus and sirolimus), KSP(Eg5) inhibitors (eg, Array 520), DNA binding agents (eg, Zalypsis), PI3K delta inhibitor (eg, GS-1101 and TGR-1202) , PI3K delta and gamma inhibitor (eg, CAL-130), multikinase inhibitor (eg, TG02 and sorafenib), hormones (eg, estrogen), and hormone agonists such as luteinizing hormone releasing factor (LHRH) agonists (eg, goserelin, leuprolide and triptorelin), BAFF neutralizing antibody (eg, LY2127399), IKK inhibitors, p38MAPK inhibitors, anti-IL-6 antibodies (eg, CNTO328), telomerase inhibitors (eg, GRN163L), aurorakinase inhibitors (eg, MLN8237), monoclonal antibodies cell surface (eg, anti-CD38 (HUMAX-CD38), anti-CS1 (eg, elotuzumab), HSP90 inhibitors (eg, 17 AAG and KOS 953), PI3K/Akt inhibitors (eg, perifosine), Akt inhibitor (eg, GSK-2141795), PKC inhibitors (eg, enzastaurine), FTI species (eg, Zarnestra™), anti-CD138 antibodies (eg, BT062), Torc1/2 specific kinase inhibitor (eg, INK128), kinase inhibitor (eg, GS- 1101), ER/UPR targeting agent (eg, MKS-3946), cFMS inhibitor (eg, ARRY-382), JAK1/2 inhibitor (eg, CYT387), PARP inhibitor (eg, olaparib and veliparib (ABT-888)) , a BCL-2 antagonist. Other chemotherapeutic agents may include mechlorethamine, camptothecin, ifosfamide, tamoxifen, raloxifene, gemcitabine, navelbine, sorafenib, or any analog or derivative of the above.

Соединения по настоящему изобретению также можно применять в комбинации с лучевой терапией, гормональной терапией, хирургией и иммунотерапией, при этом такие виды терапии широко известны специалистам в данной области техники.The compounds of the present invention can also be used in combination with radiation therapy, hormonal therapy, surgery and immunotherapy, such therapies being well known to those skilled in the art.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию, представленную в данном документе, вводят совместно со стероидом. Подходящие стероиды могут включать без ограничения 21ацетоксипрегненолон, алклометазон, алгестон, амцинонид, беклометазон, бетаметазон, будесонид, хлорпреднизон, клобетазол, клокортолон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакорт, десонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флунизолид, флуопинолон ацетонид, флуоцинонид, флуокортин бутил, флуокортолон, флуорометолон, флуперолона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, флурандренолид, флутиказона пропионат, формокортал, галцинонид, галобетазола пропионат, галометазон, гидрокортизон, лотепреднол этабонат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпреднизолон, мометазона фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолон 25-диэтиламиноацетат, преднизолон натрия фосфат, преднизон, преднивал, преднилиден, римексолон, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолон ацетонид, триамцинолон бенетонид, триамцинолон гексацетонид, а также их соли и/или производные. В конкретном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению также можно при- 35 045330 менять в комбинации с дополнительными фармацевтически активными средствами, которые лечат тошноту. Примеры средств, которые можно применять для лечения тошноты, включают дронабинол, гранисетрон, метоклопрамид, ондансетрон и прохлорпемазин или их фармацевтически приемлемые соли.In some embodiments, a pharmaceutical composition provided herein is co-administered with a steroid. Suitable steroids may include, but are not limited to, acetoxypregnenolone, alklometasone, algestone, amcinonide, beclomethasone, betamethasone, budesonide, chlorprednisone, clobetasol, clocortolone, cloprednol, corticosterone, cortisone, cortivasol, deflazacort, desonide, deoxymethasone, dexamethasone, diflorasone, diflucortolone, difuprednate, enoxolone, fluazacort, flucloronide, flumethasone, flunisolide, fluopinolone acetonide, fluocinonide, fluocortin butyl, fluocortolone, fluorometholone, fluperolone acetate, fluprednidene acetate, fluprednisolone, flurandrenolide, fluticasone propionate, formocortal, galcinonide, halobet azole propionate, halomethasone, hydrocortisone, loteprednol etabonate, mazipredone, medrisone , meprednisone, methylprednisolone, mometasone furoate, paramethasone, prednicarbate, prednisolone, prednisolone 25-diethylaminoacetate, prednisolone sodium phosphate, prednisone, prednival, prednilidene, rimexolone, thixocortol, triamcinolone, triamcinolone acetonide, triamcinolone benetonide, triamcinolone hexacetonide, as well as their salts and/ or derivatives. In a specific embodiment, the compounds of the present invention may also be used in combination with additional pharmaceutically active agents that treat nausea. Examples of agents that can be used to treat nausea include dronabinol, granisetron, metoclopramide, ondansetron and prochlorpemazine or pharmaceutically acceptable salts thereof.

Ингибиторы KRASg12C по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с ингибиторами киназы Aurora, такими как обнаруженные в опубликованной PCT заявке WO2011/031842. Конкретным соединением является AMG 900 (пример 1 из WO2011/031842, включенной в данный документ посредством ссылки для всех целей).The KRAS g12C inhibitors of the present invention can be used in combination with Aurora kinase inhibitors, such as those found in PCT published application WO2011/031842. The specific compound is AMG 900 (Example 1 of WO2011/031842, incorporated herein by reference for all purposes).

Ингибиторы KRASg12C по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с ингибиторами пути МАР-киназы. Примерами белков в пути МАР-киназы, который может быть ингибирован, и ингибиторы таких белков, используемые в комбинации с ингибиторами KRASg12C, являются ингибиторы BRAF, ингибиторы Pan-RAF и ингибиторы MEK. Существуют три основных изоформы RAF: ARAF, BRAF и CRAF. Ингибитор всех типов RAF демонстрирует ингибиторную активность в отношении более чем одной изоформы RAF. Напротив, ингибитор BRAF демонстрирует более высокую ингибиторную активность (или селективность) в отношении BRAF, чем других белков RAF.The KRAS g12C inhibitors of the present invention can be used in combination with inhibitors of the MAP kinase pathway. Examples of proteins in the MAP kinase pathway that can be inhibited, and inhibitors of such proteins used in combination with KRAS g12C inhibitors, are BRAF inhibitors, Pan-RAF inhibitors and MEK inhibitors. There are three main isoforms of RAF: ARAF, BRAF and CRAF. An all-RAF inhibitor exhibits inhibitory activity against more than one RAF isoform. In contrast, a BRAF inhibitor exhibits higher inhibitory activity (or selectivity) against BRAF than other RAF proteins.

Соединения по настоящему изобретению также можно применять в комбинации с дополнительным фармацевтически активным соединением, которое нарушает или ингибирует пути передачи сигнала RAS-RAF-ERK или PI3K-AKT-TOR. В других таких комбинациях дополнительным фармацевтически активным соединением является антагонист PD-1 и PD-L1. Соединения или фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно применять в комбинации с количеством одного или нескольких веществ, выбранных из ингибиторов EGFR, ингибиторов MEK, ингибиторов PI3K, ингибиторов AKT, ингибиторов TOR, ингибиторов Mcl-Ι, ингибиторов BCL-2, ингибиторов SHP2, ингибиторов протеасом и иммунных терапевтических средств, включая моноклональные антитела, иммуномодуляторные имиды (IMiD), средства, представляющие собой антитела к PD-1 (или в качестве альтернативы ингибитора PD-1), антитела к PDL-1, антитела к CTLA4, антитела к LAG1 и антитела к ОХ40, агонисты GITR, CAR-T-клеток и BiTE.The compounds of the present invention can also be used in combination with an additional pharmaceutically active compound that disrupts or inhibits the RAS-RAF-ERK or PI3K-AKT-TOR signaling pathways. In other such combinations, the additional pharmaceutically active compound is a PD-1 and PD-L1 antagonist. The compounds or pharmaceutical compositions of the present invention can also be used in combination with an amount of one or more substances selected from EGFR inhibitors, MEK inhibitors, PI3K inhibitors, AKT inhibitors, TOR inhibitors, Mcl-Ι inhibitors, BCL-2 inhibitors, SHP2 inhibitors, proteasome and immune therapeutics, including monoclonal antibodies, immunomodulatory imides (IMiDs), anti-PD-1 antibodies (or alternatively a PD-1 inhibitor), anti-PDL-1 antibodies, anti-CTLA4 antibodies, anti-LAG1 antibodies, and antibodies to OX40, GITR, CAR-T cell and BiTE agonists.

Ингибиторы EGFR включают без ограничения низкомолекулярные антагонисты, ингибиторы на основе антител или специфические антисмысловые нуклеотид или siRNA. Ингибиторы EGFR, которые могут быть использованы в комбинациях по настоящему изобретению, включают без ограничения афатиниб (торговая марка Gilotrif®, коммерчески доступный от компании Boehringer Ingelheim), эрлотиниб (торговая марка Tarceva®, коммерчески доступный от компании Genetech/Astellas) и лапатиниб (торговая марка Tykerb®, коммерчески доступный от компании Novartis). Ингибиторы KRASg12C также можно применять в комбинации с антителами к EGFR в настоящем изобретении. Антитела к EGFR, которые можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, включают без ограничения цетуксимаб (торговая марка Erbitux от компании Lilly). Применимые ингибиторы EGFR на основе антител включают панитумумаб (Vectibix), залутумумаб, нимотузумаб и матузумаб.EGFR inhibitors include, but are not limited to, small molecule antagonists, antibody-based inhibitors, or specific antisense nucleotides or siRNAs. EGFR inhibitors that can be used in the combinations of the present invention include, but are not limited to, afatinib (brand name Gilotrif®, commercially available from Boehringer Ingelheim), erlotinib (brand name Tarceva®, commercially available from Genetech/Astellas) and lapatinib (trademark Tykerb® brand, commercially available from Novartis). KRAS g12C inhibitors can also be used in combination with anti-EGFR antibodies in the present invention. Anti-EGFR antibodies that can be used in the combinations of the present invention include, but are not limited to, cetuximab (trade name Erbitux from Lilly). Useful antibody-based EGFR inhibitors include panitumumab (Vectibix), zalutumumab, nimotuzumab, and matuzumab.

Неограничивающие примеры низкомолекулярных ингибиторов EGFR включают любой из ингибиторов EGFR, описанных в следующих патентных публикациях, и все фармацевтически приемлемые соли и сольваты указанных ингибиторов EGFR: заявка на европейский патент EP 520722, опубликованная 30 декабря 1992 г.; заявка на европейский патент EP 566226, опубликованная 20 октября 1993 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 96/33980, опубликованная 31 октября 1996 г.; патент США № 5747498, выданный 5 мая 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 96/30347, опубликованная 3 октября 1996 г.; заявка на европейский патент EP 787772, опубликованная 6 августа 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/30034, опубликованная 21 августа 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/30044, опубликованная 21 августа 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/38994, опубликованная 23 октября 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/49688, опубликованная 31 декабря 1997 г.; заявка на европейский патент EP 837063, опубликованная 22 апреля 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/02434, опубликованная 22 января 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/38983, опубликованная 23 октября 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 95/19774, опубликованная 27 июля 1995 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 95/19970, опубликованная 27 июля 1995 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/13771, опубликованная 17 апреля 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/02437, опубликованная 22 января 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/02438, опубликованная 22 января 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/32881, опубликованная 12 сентября 1997 г.; заявка на патент Германии DE 19629652, опубликованная 29 января 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/33798, опубликованная 6 августа 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/32880, опубликованная 12 сентября 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/32880, опубликованная 12 сентября 1997 г.; заявка на европейский патент EP 682027, опубликованная 15 ноября 1995 г.; публикация поданной согласно PCT международной заяв- 36 045330 ки WO 97/02266, опубликованная 23 января 197 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/27199, опубликованная 31 июля 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/07726, опубликованная 26 февраля 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/34895, опубликованная 25 сентября 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 96/31510', опубликованная 10 октября 1996 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/14449, опубликованная 9 апреля 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/14450, опубликованная 9 апреля 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/14451, опубликованная 9 апреля 1998 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 95/09847, опубликованная 13 апреля 1995 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 97/19065, опубликованная 29 мая 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 98/17662, опубликованная 30 апреля, 1998 г.; патент США № 5789427, выданный 4 августа 1998 г.; патент США № 5650415, выданный 22 июля 1997 г.; патент США № 5656643, выданный 12 августа 1997 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 99/35146, опубликованная 15 июля 1999 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 99/35132, опубликованная 15 июля 1999 г.; публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 99/07701, опубликованная 18 февраля 1999 г.; и публикация поданной согласно PCT международной заявки WO 92/20642, опубликованная 26 ноября 1992 г. Дополнительные неограничивающие примеры низкомолекулярных ингибиторов EGFR включают любой из ингибиторов EGFR, описанный в Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12): 1599-1625.Non-limiting examples of small molecule EGFR inhibitors include any of the EGFR inhibitors described in the following patent publications, and all pharmaceutically acceptable salts and solvates of these EGFR inhibitors: European patent application EP 520722, published December 30, 1992; European patent application EP 566226, published October 20, 1993; publication of PCT international application WO 96/33980, published on October 31, 1996; US Patent No. 5,747,498, issued May 5, 1998; publication of PCT international application WO 96/30347, published on October 3, 1996; European patent application EP 787772, published 6 August 1997; publication of PCT international application WO 97/30034, published on August 21, 1997; publication of PCT international application WO 97/30044, published on August 21, 1997; publication of PCT international application WO 97/38994, published on October 23, 1997; publication of PCT international application WO 97/49688, published on December 31, 1997; European patent application EP 837063, published April 22, 1998; publication of PCT international application WO 98/02434, published on January 22, 1998; publication of PCT international application WO 97/38983, published on October 23, 1997; publication of PCT international application WO 95/19774, published on July 27, 1995; publication of PCT international application WO 95/19970, published on July 27, 1995; publication of PCT international application WO 97/13771, published April 17, 1997; publication of PCT international application WO 98/02437, published on January 22, 1998; publication of PCT international application WO 98/02438, published on January 22, 1998; publication of PCT international application WO 97/32881, published on September 12, 1997; German patent application DE 19629652, published January 29, 1998; publication of PCT international application WO 98/33798, published on August 6, 1998; publication of PCT international application WO 97/32880, published on September 12, 1997; publication of PCT international application WO 97/32880, published on September 12, 1997; European patent application EP 682027, published November 15, 1995; publication of PCT international application WO 97/02266, published on January 23, 197; publication of PCT international application WO 97/27199, published on July 31, 1997; publication of PCT international application WO 98/07726, published on February 26, 1998; publication of PCT international application WO 97/34895, published September 25, 1997; publication of PCT international application WO 96/31510', published on October 10, 1996; publication of PCT international application WO 98/14449, published April 9, 1998; publication of PCT international application WO 98/14450, published on April 9, 1998; publication of PCT international application WO 98/14451, published on April 9, 1998; publication of PCT international application WO 95/09847, published April 13, 1995; publication of PCT international application WO 97/19065, published on May 29, 1997; publication of PCT international application WO 98/17662, published April 30, 1998; US Patent No. 5,789,427, issued August 4, 1998; US Patent No. 5650415, issued July 22, 1997; US Patent No. 5656643, issued August 12, 1997; publication of PCT international application WO 99/35146, published on July 15, 1999; publication of PCT international application WO 99/35132, published on July 15, 1999; publication of PCT international application WO 99/07701, published on February 18, 1999; and publication of PCT-filed international application WO 92/20642, published November 26, 1992. Additional non-limiting examples of small molecule EGFR inhibitors include any of the EGFR inhibitors described in Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12): 1599-1625.

Ингибиторы EGFR на основе антител включают любое антитело к EGFR или фрагмент антитела, которые могут частично или полностью блокировать активацию EGFR с помощью его природного лиганда. Неограничивающие примеры ингибиторов EGFR на основе антител включают таковые, описанные в Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cancer 67:247-253; Teramoto, Т., et al., 1996, Cancer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M, et al., 1999, Cancer Res. 15:59(8): 1935-40 и Yang, X., et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243. Таким образом, ингибитор EGFR может представлять собой моноклональное антитело Mab E7.6.3 (Yang, 1999 выше) или Mab С225 (№ доступа АТСС НВ8508) или антитело или фрагмент антитела, характеризующиеся специфичностью связывания с ним.Antibody-based EGFR inhibitors include any anti-EGFR antibody or antibody fragment that can partially or completely block activation of EGFR by its natural ligand. Non-limiting examples of antibody-based EGFR inhibitors include those described in Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J Cancer 67:247–253; Teramoto, T., et al., 1996, Cancer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M, et al., 1999, Cancer Res. 15:59(8): 1935-40 and Yang, X., et al., 1999, Cancer Res. 59:1236–1243. Thus, the EGFR inhibitor may be a monoclonal antibody Mab E7.6.3 (Yang, 1999 supra) or Mab C225 (ATCC Accession No. HB8508) or an antibody or antibody fragment having binding specificity thereto.

Ингибиторы KRASg12C по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с ингибиторами MEK, такими как обнаруженные в опубликованной PCT заявке WO2002/006213. Конкретным соединением является N-(((2R)-2,3-дигидроксипропил)окси)-3,4-дифтор-2-((2-фтор-4йодфенил)амино)бензамид, также известный как AMG 1009089 или 1009089 (пример 39).The KRAS g12C inhibitors of the present invention can be used in combination with MEK inhibitors, such as those found in PCT published application WO2002/006213. The specific compound is N-(((2R)-2,3-dihydroxypropyl)oxy)-3,4-difluoro-2-((2-fluoro-4iodophenyl)amino)benzamide, also known as AMG 1009089 or 1009089 (Example 39 ).

Ингибиторы KRASg12C по настоящему изобретению можно применять в комбинации с ингибиторами BRAF, такими как обнаруженные в опубликованной PCT заявке WO2008/153947. Конкретным соединением является AMG 2112819 (также известный как 2112819) (пример 56). Другим конкретным ингибитором BRAF, который можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, является дабрафениб. Другим ингибитором BRAF, который можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, является вемурафениб.The KRAS g12C inhibitors of the present invention can be used in combination with BRAF inhibitors, such as those found in PCT published application WO2008/153947. The specific compound is AMG 2112819 (also known as 2112819) (Example 56). Another specific BRAF inhibitor that can be used in the combinations of the present invention is dabrafenib. Another BRAF inhibitor that can be used in the combinations of the present invention is vemurafenib.

Ингибиторы всех типов RAF также можно применять вместе с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению. Конкретный ингибитор всех типов RAF включает RAF265 и MLN2480.Inhibitors of all types of RAF can also be used together with KRAS G12C inhibitors in the combinations of the present invention. Specific inhibitors of all types of RAF include RAF265 and MLN2480.

Ингибиторы KRASg12C по настоящему изобретению можно применять в комбинации с ингибиторами MEK. Конкретные ингибиторы MEK, которые можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, включают PD-325901, траметиниб, пимасертиб, MEK 162 [также известный как биниметиниб], TAK-733, GDC-0973 и AZD8330. Конкретный ингибитор MEK, который можно применять вместе с ингибитором KRASg12C в комбинациях по настоящему изобретению, представляет собой траметиниб (торговая марка Mekinist®, коммерчески доступный от компании Novartis Pharmaceuticals Corp.). Другой конкретный ингибитор MEK представляет собой N-(((2R)-2,3-дигидроксипропил)окси)-3,4-дифтор-2-((2фтор-4-йодфенил)амино)бензамид, также известный как AMG 1009089, 1009089 или PD-325901. Другой конкретный ингибитор MEK, который можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, включает кобиметиниб.The KRAS g12C inhibitors of the present invention can be used in combination with MEK inhibitors. Specific MEK inhibitors that can be used in the combinations of the present invention include PD-325901, trametinib, pimasertib, MEK 162 [also known as binimetinib], TAK-733, GDC-0973 and AZD8330. A particular MEK inhibitor that can be used together with a KRAS g12C inhibitor in the combinations of the present invention is trametinib (brand name Mekinist®, commercially available from Novartis Pharmaceuticals Corp.). Another specific MEK inhibitor is N-(((2R)-2,3-dihydroxypropyl)oxy)-3,4-difluoro-2-((2fluoro-4-iodophenyl)amino)benzamide, also known as AMG 1009089, 1009089 or PD-325901. Another specific MEK inhibitor that can be used in the combinations of the present invention includes cobimetinib.

Ингибиторы MEK включают без ограничения CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, ARRY-142886 и ARRY-438162.MEK inhibitors include, but are not limited to, CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, ARRY-142886, and ARRY-438162.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими фармацевтическими средствами, которые являются ингибитором белка в пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Примеры белков в пути PI3K включают PI3K, mTOR и PKB (также известный как Akt или AKT). Белок PI3K существует в нескольких изоформах, включая α, β, δ или γ. Предполагается, что ингибитор PI3K, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть селективным в отношении одной или нескольких изоформ. Под селективным подразумевается, что соединения ингибируют одну или несколько изоформ в большей степени, чем другие изоформы. Селективность представляет собой концепцию, хорошо известную специалистам в данной области, и ее можно измерить с помощью хорошо известных in vitro или клеточныхIn another aspect, the present invention relates to the use of a compound of the present invention in combination with one or more pharmaceutical agents that are an inhibitor of a protein in the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. Examples of proteins in the PI3K pathway include PI3K, mTOR, and PKB (also known as Akt or AKT). The PI3K protein exists in several isoforms, including α, β, δ, or γ. It is contemplated that a PI3K inhibitor that may be used in the present invention may be selective for one or more isoforms. By selective is meant that the compounds inhibit one or more isoforms to a greater extent than other isoforms. Selectivity is a concept well known to those skilled in the art and can be measured using well known in vitro or cellular assays.

- 37 045330 анализов активности. Предпочтительная селективность включает селективность, которая более чем в 2 раза, предпочтительно в 10 раз или более предпочтительно в 100 раз больше в отношении одной или нескольких изоформ, чем других изоформ. В одном аспекте ингибиторы PI3K, которые могут быть использованы в комбинации с соединениями по настоящему изобретению, являются селективными ингибиторами PI3Ka. В другом аспекте соединение представляет собой селективный ингибитор PI3Kδ. В еще одном аспекте соединение представляет собой селективный ингибитор PI3Ke.- 37 045330 activity analyses. Preferred selectivity includes selectivity that is greater than 2-fold, preferably 10-fold, or more preferably 100-fold greater for one or more isoforms than for other isoforms. In one aspect, PI3K inhibitors that can be used in combination with the compounds of the present invention are selective PI3Ka inhibitors. In another aspect, the compound is a selective inhibitor of PI3Kδ. In yet another aspect, the compound is a selective PI3Ke inhibitor.

Примеры ингибиторов PI3K, которые можно применять в комбинации с одним или несколькими соединениями по настоящему изобретению, включают раскрытые в следующих документах: опубликованная согласно PCT заявка № WO2010/151791; опубликованная согласно PCT заявка № WO2010/151737; опубликованная согласно PCT заявка №WO2010/151735; опубликованная согласно PCT заявка № WO2010151740; опубликованная согласно PCT заявка № WO2008/118455; опубликованная согласно PCT заявка № WO2008/118454; опубликованная согласно PCT заявка № WO2008/118468; опубликованная заявка на патент США № US201003 31293; опубликованная заявка на патент США № US20100331306; опубликованная заявка на патент США № US20090023761; опубликованная заявка на патент США № US20090030002; опубликованная заявка на патент США № US20090137581; опубликованная заявка на патент США № US2009/0054405; опубликованная заявка на патент США № US2009/0163489; опубликованная заявка на патент США № US2010/0273764; опубликованная заявка на патент США № US2011/0092504 или опубликованная согласно PCT заявка № WO2010/108074. PI3K ингибиторы включают без ограничения вортманнин, 17-гидроксивортманниновые аналоги, описанные в WO 06/044453, 4-[2-(1H-индазол-4-ил)-6-[[4-(метилсульфонил)пиnеразин-1-ил]метил]тиено[3,2d]пиримидин-4-ил]морфолин (также известный как GDC 0941 и описанный в PCT-публикациях №№ WO 09/036082 и WO 09/055730), 2-метил-2-[4-[3-метил-2-оксо-8-(хинолин-3-ил)-2,3-дигидроимидазо[4,5с]хинолин-1-ил]фенил]пропионитрил (также известный как BEZ 235 или NVP-BEZ 235 и описанный в PCT-публикации № WO 06/122806), (S)-1-(4-((2-(2-αминопиримидин-5-ил)-7-метил-4-морфолинотиено[3,2-d]nиримидин-6-ил)метил)пиперазин-1-ил)-2-гидроkсunропан-1-он (описанный в PCTпубликации № WO 2008/070740), LY294002 (2-(4-морфолинил)-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-он, доступный от Axon Medchem), PI 103 гидрохлорид (3-[4-(4-морфолинилпиридо-[3',2':4,5]фуро[3,2-б]пиримидин2-ил]фенол гидрохлорид, доступный от Axon Medchem), PIK 75 (N'-[(1Е)-(6-бромимидазо[1,2-а]пиридин3-ил)метилен]-N,2-диметил-5-нитробензолсульфоно-гидразид гидрохлорид, доступный от Axon Medchem), PIK 90 (N-(7,8-диметокси-2,3-дигидро-имидазо[1,2-с]хиназолин-5-ил)-никотuнамид, доступный от Axon Medchem), GDC-0941 бисмезилат (2-(1Н-индазол-4-ил)-6-(4-метансульфонил-пиперазин-1илметил)-4-морфолин-4-ил-тиено[3,2-d]пиримидинбисмезилат, доступный от Axon Medchem), AS252424 (5-[1-[5-(4-фтор-2-гидроксифенил)-фуран-2-ил]-мет-(Z)-илиден]-тиазолидин-2,4-дион, доступный от Axon Medchem) и TGX-221 (7-метил-2-(4-морфолинил)-9-[1-(фениламино)этил]-4Н-пиридо-[1,2а]пиримидин-4-он, доступный от Axon Medchem), XL-765 и XL-147. Другие ингибиторы PI3K включают деметоксивиридин, перифосин, CAL101, РХ-866, BEZ235, SF1126, INK1117, IPI-145, BKM120, XL147, XL765, паломид 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103, GNE477, CUDC-907 и AEZS-136.Examples of PI3K inhibitors that can be used in combination with one or more compounds of the present invention include those disclosed in the following documents: PCT published application No. WO2010/151791; Published PCT Application No. WO2010/151737; published PCT application No. WO2010/151735; Published PCT Application No. WO2010151740; Published PCT Application No. WO2008/118455; Published PCT Application No. WO2008/118454; Published PCT Application No. WO2008/118468; US Patent Application Published No. US201003 31293; US Patent Application Published No. US20100331306; US Patent Application Published No. US20090023761; Published US Patent Application No. US20090030002; US Patent Application Published No. US20090137581; US Patent Application Published No. US2009/0054405; US Patent Application Published No. US2009/0163489; US Patent Application Published No. US2010/0273764; US Published Patent Application No. US2011/0092504 or PCT Published Application No. WO2010/108074. PI3K inhibitors include, but are not limited to, wortmannin, 17-hydroxywortmannin analogues described in WO 06/044453, 4-[2-(1H-indazol-4-yl)-6-[[4-(methylsulfonyl)pinerazin-1-yl]methyl ]thieno[3,2d]pyrimidin-4-yl]morpholine (also known as GDC 0941 and described in PCT Publication Nos. WO 09/036082 and WO 09/055730), 2-methyl-2-[4-[3 -methyl-2-oxo-8-(quinolin-3-yl)-2,3-dihydroimidazo[4,5c]quinolin-1-yl]phenyl]propionitrile (also known as BEZ 235 or NVP-BEZ 235 and described in PCT Publication No. WO 06/122806), (S)-1-(4-((2-(2-αminopyrimidin-5-yl)-7-methyl-4-morpholothieno[3,2-d]nirimidin-6 -yl)methyl)piperazin-1-yl)-2-hydroxyunropan-1-one (described in PCT Publication No. WO 2008/070740), LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran- 4-one, available from Axon Medchem), PI 103 hydrochloride (3-[4-(4-morpholinylpyrido-[3',2':4,5]furo[3,2-b]pyrimidin2-yl]phenol hydrochloride, available from Axon Medchem), PIK 75 (N'-[(1E)-(6-bromimidazo[1,2-a]pyridin3-yl)methylene]-N,2-dimethyl-5-nitrobenzenesulfonohydrazide hydrochloride, available from Axon Medchem), PIK 90 (N-(7,8-dimethoxy-2,3-dihydro-imidazo[1,2-c]quinazolin-5-yl)-nicotunamide, available from Axon Medchem), GDC-0941 bismesylate ( 2-(1H-Indazol-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-1ylmethyl)-4-morpholin-4-yl-thieno[3,2-d]pyrimidine bismesylate, available from Axon Medchem), AS252424 ( 5-[1-[5-(4-fluoro-2-hydroxyphenyl)-furan-2-yl]-meth-(Z)-ylidene]-thiazolidine-2,4-dione, available from Axon Medchem) and TGX- 221 (7-methyl-2-(4-morpholinyl)-9-[1-(phenylamino)ethyl]-4H-pyrido-[1,2a]pyrimidin-4-one, available from Axon Medchem), XL-765 and XL-147. Other PI3K inhibitors include demethoxyviridine, perifosine, CAL101, PX-866, BEZ235, SF1126, INK1117, IPI-145, BKM120, XL147, XL765, palomide 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103 , GNE477, CUDC-907 and AEZS-136.

Предпочтительные ингибиторы PI3K для применения в комбинации с соединением по настоящемуPreferred PI3K inhibitors for use in combination with a compound of the present

- 38 045330- 38 045330

Также предпочтительным является соединение приведенной ниже формулы IIa или его фармацевтически приемлемая соль,Also preferred is a compound of formula IIa below or a pharmaceutically acceptable salt thereof,

Па где X1 представляет собой фтор или водород; Y1 представляет собой водород или метил; и Z представляет собой водород или метил. Конкретный ингибитор PI3K, который можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, представляет собой AMG 511 (также известный как AMG 2539965 или 2539965), который представлен в примере 148 из опубликованной согласно PCT заявки WO2010/126895.Pa where X 1 represents fluorine or hydrogen; Y 1 represents hydrogen or methyl; and Z is hydrogen or methyl. A particular PI3K inhibitor that can be used in the combinations of the present invention is AMG 511 (also known as AMG 2539965 or 2539965), which is presented in Example 148 of PCT published application WO2010/126895.

Другие ингибиторы PI3K, которые можно применять в комбинации с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению, включая ингибиторы всех типов PI3K, такие как BKM120 и GDC-0941; селективные ингибиторы PI3Ka, такие как BYL719; и селективные ингибиторы PI3Ke, такие как GSK-2636771.Other PI3K inhibitors that can be used in combination with KRAS G12C inhibitors in the combinations of the present invention include inhibitors of all types of PI3K, such as BKM120 and GDC-0941; selective PI3Ka inhibitors such as BYL719; and selective PI3Ke inhibitors such as GSK-2636771.

Известны соединения, которые ингибируют как PI3K, так и mTOR (двойные ингибиторы). В еще одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение двойных и ингибиторов PI3K и mTOR для применения в комбинации с ингибиторами KRASG12C. Примером конкретного двойного ингибитора является GDC-0980.Compounds are known that inhibit both PI3K and mTOR (dual inhibitors). In yet another aspect, the present invention provides for the use of dual PI3K and mTOR inhibitors for use in combination with KRAS G12C inhibitors. An example of a specific dual inhibitor is GDC-0980.

Ингибиторы KRASg12C также можно применять в комбинации с ингибиторами SHP2 в настоящем изобретении. Ингибиторы SHP2, которые можно применять в комбинациях по настоящему изобретению, включают без ограничения SHP099 и RMC-4550 или RMC-4630 от компании Revolutions Medicines в Редвуд-Сити, Калифорния.KRAS g12C inhibitors can also be used in combination with SHP2 inhibitors in the present invention. SHP2 inhibitors that can be used in combinations of the present invention include, but are not limited to, SHP099 and RMC-4550 or RMC-4630 from Revolutions Medicines in Redwood City, California.

mTOR является белком в пути PI3K. Другим аспектом настоящего изобретения является применение ингибитора mTOR в комбинации с ингибиторами KRASg12C Ингибиторы mTOR, которые можно применять в комбинации с соединением по настоящему изобретению, включают раскрытые в следующих документах: опубликованная согласно PCT заявка № WO2010/132598 и опубликованная согласно PCT заявка № WO2010/096314. Ингибиторы mTOR, которые можно применять в комбинации с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению, включают AZD2014 и MLN0128.mTOR is a protein in the PI3K pathway. Another aspect of the present invention is the use of an mTOR inhibitor in combination with KRAS g12C inhibitors. mTOR inhibitors that can be used in combination with a compound of the present invention include those disclosed in PCT Published Application No. WO2010/132598 and PCT Published Application No. WO2010/ 096314. mTOR inhibitors that can be used in combination with KRASG12C inhibitors in the combinations of the present invention include AZD2014 and MLN0128.

Ингибиторы TOR включают без ограничения AP-23573, CCI-779, эверолимус, RAD-001, рапамицин, темсиролимус, АТР-конкурентные ингибиторы TORC1/TORC2, включая PI-103, PP242, PP30 и Torin 1. Другие ингибиторы TOR в энхансере FKBP12; рапамицины и их производные, включая: CCI-779 (темсиролимус), RAD001 (эверолимус; WO 9409010) и АР23573; рапалоги, например, как раскрыто в WO 98/02441 и WO 01/14387, например, АР23573, АР23464 или АР23841; 40-(2-гидроксиэтил)рапамицин, 40[3-гидрокси(гидроксиметил)метилпропаноат]-рапамицин (также называемый СС1779), 40-эпи(тетразолит)-рапамицин (также называемый АВТ578), 32-деоксорапамицин, 16-пентинилокси-32(S)дигидрорапамицин и другие производные, раскрытые в WO 05005434; производные, раскрытые в патенте США № 5258389, WO 94/090101, WO 92/05179, патенте США № 5118677, патенте США № 5118678, патенте США № 5100883, патенте США № 5151413, патенте США № 5120842, WO 93/111130, WO 94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691, WO 96/41807, WO 96/41807 и патенте США № 5256790; фосфор-содержащие рапамициновые производные (например, WO 05016252); 4Н-1бензопиран-4-оновые производные (например, предварительная заявка на патент США № 60/528340).TOR inhibitors include, but are not limited to, AP-23573, CCI-779, everolimus, RAD-001, rapamycin, temsirolimus, ATP-competitive TORC1/TORC2 inhibitors including PI-103, PP242, PP30 and Torin 1. Other TOR inhibitors at the FKBP12 enhancer; rapamycins and their derivatives, including: CCI-779 (temsirolimus), RAD001 (everolimus; WO 9409010) and AP23573; rapalogues, for example, as disclosed in WO 98/02441 and WO 01/14387, for example AP23573, AP23464 or AP23841; 40-(2-hydroxyethyl)rapamycin, 40[3-hydroxy(hydroxymethyl)methylpropanoate]-rapamycin (also called CC1779), 40-epi(tetrazolyte)-rapamycin (also called ABT578), 32-deoxorapamycin, 16-pentynyloxy-32 (S)dihydrorapamycin and other derivatives disclosed in WO 05005434; derivatives disclosed in US Patent No. 5258389, WO 94/090101, WO 92/05179, US Patent No. 5118677, US Patent No. 5118678, US Patent No. 5100883, US Patent No. 5151413, US Patent No. 5120842, WO 93/111130 , W.O. 94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691, WO 96/41807, WO 96/41807 and US patent No. 5256790; phosphorus-containing rapamycin derivatives (eg WO 05016252); 4H-1benzopyran-4-one derivatives (eg, US Provisional Patent Application No. 60/528,340).

РКВ (АКТ) также является белком в пути PI3K. Другим аспектом настоящего изобретения является применение ингибитора AKT в комбинации с ингибитором KRASg12C. Ингибиторы AKT, которые можно применять в комбинации с соединением по настоящему изобретению, включают раскрытые в следующих документах: патент США № 7354944. патент США № 7700636. патент США № 7919514. патент США № 7514566. публикация заявки на патент США № US 2009/0270445 А1. патент США № 7919504. патент США № 7897619 или опубликованная согласно PCT заявка № WO 2010/083246 А1. Конкретные ингибиторы AKT, которые можно применять в комбинации с ингибиторами KRASg12C в комбинациях по настоящему изобретению, включают MK-2206, GDC-0068 и AZD5363.PKV (AKT) is also a protein in the PI3K pathway. Another aspect of the present invention is the use of an AKT inhibitor in combination with a KRAS g12C inhibitor. AKT inhibitors that can be used in combination with a compound of the present invention include those disclosed in: US Patent No. 7354944. US Patent No. 7700636. US Patent No. 7919514. US Patent No. 7514566. US Patent Application Publication No. US 2009/0270445 A1. US Patent No. 7919504. US Patent No. 7897619 or PCT Published Application No. WO 2010/083246 A1. Specific AKT inhibitors that can be used in combination with KRAS g12C inhibitors in the combinations of the present invention include MK-2206, GDC-0068 and AZD5363.

Ингибиторы AKT включают без ограничения Akt-1-1 (ингибирует Akt1) (Barnett et al. (2005) Biochem. J., 385 (Pt. 2), 399-408); Akt-1-1,2 (ингибирует Ak1 и 2) (Barnett et al. (2005) Biochem. J. 385 (Pt. 2), 399-408); API-59CJ-Ome (например, Jin et al. (2004) Br. J. Cancer 91, 1808-12); 1-Н-имидазо[4,5с]пиридиниловые соединения (например, WO 05011700); индол-3-карбинол и его производные (например, патент США № 6656963; Sarkar and Li (2004) J Nutr. 134(12 Suppl), 3493S-3498S); перифосин (на- 39 045330 пример, мешает мембранной локализации Akt; Dasmahapatra et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10(15), 524252, 2004); эфир фосфатидилинозитола, липидные аналоги (например, Gills and Dennis (2004) Expert. Opin.AKT inhibitors include, but are not limited to, Akt-1-1 (inhibits Akt1) (Barnett et al. (2005) Biochem. J., 385 (Pt. 2), 399-408); Akt-1-1,2 (inhibits Ak1 and 2) (Barnett et al. (2005) Biochem. J. 385 (Pt. 2), 399-408); API-59CJ-Ome (eg, Jin et al. (2004) Br. J. Cancer 91, 1808-12); 1-H-imidazo[4,5c]pyridinyl compounds (eg WO 05011700); indole-3-carbinol and derivatives thereof (eg, US Pat. No. 6,656,963; Sarkar and Li (2004) J Nutr. 134(12 Suppl), 3493S-3498S); perifosine (for example, interferes with the membrane localization of Akt; Dasmahapatra et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10(15), 524252, 2004); phosphatidylinositol ester, lipid analogues (e.g. Gills and Dennis (2004) Expert. Opin.

Investig. Drugs 13, 787-97); и трицирибин (TCN или API-2 или NCI идентификатор: NSC 154020; Yang et al. (2004) Cancer Res. 64, 4394-9).Investig. Drugs 13, 787-97); and triciribine (TCN or API-2 or NCI identifier: NSC 154020; Yang et al. (2004) Cancer Res. 64, 4394-9).

Ингибиторы MCL-1 включают без ограничения AMG-176, МЖ665 и S63845. Белок миелоидноклеточного лейкоза-1 (MCL-1) является одним из ключевых антиапоптотических представителей семейства белков В-клеточной лимфомы-2 (BCL-2). Сверхэкспрессия MCL-1 была тесно связана с прогрессированием опухоли, а также с устойчивостью не только к традиционным химиотерапевтическим средствам, но также и к нацеливаемым терапевтическим средствам, включая ингибиторы BCL-2, такие как АВТ-263.MCL-1 inhibitors include, but are not limited to, AMG-176, MJ665, and S63845. Myeloid cell leukemia protein-1 (MCL-1) is one of the key anti-apoptotic members of the B-cell lymphoma-2 (BCL-2) protein family. MCL-1 overexpression has been closely associated with tumor progression as well as resistance not only to traditional chemotherapeutic agents, but also to targeted therapeutics, including BCL-2 inhibitors such as ABT-263.

Ингибиторы протеасом включают без ограничения Kyprolis® (карфилзомиб), Velcade® (бортезомид) и опрозомиб.Proteasome inhibitors include, but are not limited to, Kyprolis® (carfilzomib), Velcade® (bortezomide), and oprosomib.

Иммунные терапевтические препараты включают без ограничения средства, представляющие собой антитела к PD-1, средства, представляющие собой антитела к PDL-1, средства, представляющие собой антитела к CTLA-4, средства, представляющие собой антитела к LAG1, и средства, представляющие собой антитела к ОХ40.Immune therapeutic drugs include, but are not limited to, anti-PD-1 antibody agents, anti-PDL-1 antibody agents, anti-CTLA-4 antibody agents, anti-LAG1 antibody agents, and anti-PDL-1 antibody agents. to OX40.

Моноклональные антитела включают без ограничения Darzalex® (даратумумаб), Herceptin® (трастизумаб), Avastin® (бевацизумаб), Rituxan® (ритуксимаб), Lucentis® (ранибизумаб) и Eylea (афлиберцепт).Monoclonal antibodies include, but are not limited to, Darzalex® (daratumumab), Herceptin® (trastizumab), Avastin® (bevacizumab), Rituxan® (rituximab), Lucentis® (ranibizumab), and Eylea (aflibercept).

Иммуномодулирующие средства (IMiD) представляют собой класс иммуномодулирующих лекарственных средств (лекарственных средств, которые регулируют иммунные ответы), содержащих имидную группу. Класс IMiD включает талидомид и его аналоги (леналидомид, помалидомид и апремиласт).Immunomodulatory drugs (IMiDs) are a class of immunomodulatory drugs (drugs that regulate immune responses) containing an imide group. The IMiD class includes thalidomide and its analogues (lenalidomide, pomalidomide and apremilast).

Ингибиторы на основе антитела к PD-1, в том числе без ограничения антитела, включают без ограничения пембролизумаб (Keytruda®) и ниволумаб (Opdivo®). Иллюстративные антитела к PD-1 и способы их применения описаны Goldberg et al., Blood 110(1):186-192 (2007), Thompson et al., Clin. Cancer Res. 13(6): 1757-1761 (2007) и Korman et al., международная заявка № PCT/JP2006/309606 (публикация № WO 2006/121168 A1), каждый из которых прямо включен посредством ссылки в данном документе. Включают: Yervoy™ (ипилимумаб) или тремелимумаб (к CTLA-4), галиксимаб (к В7.1), BMS-936558 (к PD-1), MK-3475 (к PD-1), AMP224 (к B7DC), BMS-936559 (к В7-Н1), MPDL3280A (к В7-Н1), MEDI-570 (к ICOS), AMG557 (к В7Н2), MGA271 (к В7Н3), IMP321 (к LAG-3), BMS-663513 (к CD137), PF-05082566 (к CD137), CDX-1127 (к CD27), антитела к ОХ40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (к OX40L), атацицепт (к TACI), CP-870893 (к CD40), лукатумумаб (к CD40), дацетузумаб (к CD40), муромонаб-CD3 (к CD3), ипилумумаб (к CTLA-4). Иммунные терапевтические препараты также включают генетически сконструированные Т-клетки (например, клетки CAR-T) и биспецифические антитела (например, BiTE).Anti-PD-1 antibody inhibitors, including but not limited to antibodies, include but are not limited to pembrolizumab (Keytruda®) and nivolumab (Opdivo®). Exemplary anti-PD-1 antibodies and methods of use thereof are described in Goldberg et al., Blood 110(1):186-192 (2007), Thompson et al., Clin. Cancer Res. 13(6): 1757-1761 (2007) and Korman et al., International Application No. PCT/JP2006/309606 (Publication No. WO 2006/121168 A1), each of which is expressly incorporated by reference herein. Includes: Yervoy™ (ipilimumab) or tremelimumab (CTLA-4), galiximab (B7.1), BMS-936558 (PD-1), MK-3475 (PD-1), AMP224 (B7DC), BMS-936559 (to B7-H1), MPDL3280A (to B7-H1), MEDI-570 (to ICOS), AMG557 (to B7N2), MGA271 (to B7N3), IMP321 (to LAG-3), BMS-663513 ( anti-CD137), PF-05082566 (anti-CD137), CDX-1127 (anti-CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (anti-OX40L), atacicept (anti-TACI), CP-870893 (anti-CD40), lucatumumab (anti-CD40), dacetuzumab (anti-CD40), muromonab-CD3 (anti-CD3), ipilumumab (anti-CTLA-4). Immune therapeutics also include genetically engineered T cells (eg, CAR-T cells) and bispecific antibodies (eg, BiTE).

В конкретном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению применяют в комбинации с антителом к PD-1, таким как AMG 404. В определенном варианте осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающий фрагмент антитела) содержит 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 аминокислотных последовательностей CDR под SEQ ID NO: 1-6 (представляющие НС CDR1, НС CDR2, НС CDR3, LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3, в этом порядке). В определенных вариантах осуществления антитело к PD1 (или его антигенсвязывающий фрагмент антитела) содержит все 6 из аминокислотных последовательностей CDR под SEQ ID NO: 1-6. В других вариантах осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающий фрагмент антитела) содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 7 или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только одной или двумя аминокислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70% идентичностью последовательности, или (b) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO: 8 или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только одной или двумя аминокислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70% идентичностью последовательности. В иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающий фрагмент антитела) содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO: 8. В других вариантах осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающий фрагмент антитела) содержит (а) аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только одной или двумя аминокислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70% идентичностью последовательности; или (b) аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10 или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только одной или двумя аминокислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70% идентичностью последовательности. В иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающий фрагмент антитела) содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10.In a particular embodiment, the compounds of the present invention are used in combination with an anti-PD-1 antibody, such as AMG 404. In a particular embodiment, the anti-PD-1 antibody (or an antigen-binding antibody fragment thereof) comprises 1, 2, 3, 4, 5, or all 6 CDR amino acid sequences under SEQ ID NO: 1-6 (representing HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 and LC CDR3, in that order). In certain embodiments, the anti-PD1 antibody (or an antigen binding antibody fragment thereof) contains all 6 of the CDR amino acid sequences of SEQ ID NO: 1-6. In other embodiments, an anti-PD-1 antibody (or an antigen-binding antibody fragment thereof) comprises (a) the heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or a sequence variant thereof, that differs in only one or two amino acids, or that characterized by at least or approximately 70% sequence identity, or (b) the amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 8 or a sequence variant thereof that differs in only one or two amino acids or that is characterized by at least or approximately 70% sequence identity. In an illustrative embodiment, the anti-PD-1 antibody (or an antigen-binding antibody fragment thereof) comprises the heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In other embodiments, the anti-PD antibody -1 (or an antigen binding antibody fragment thereof) contains (a) the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or a sequence variant thereof, that differs in only one or two amino acids or that is characterized by at least or about 70% identity sequences; or (b) the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence variant thereof that differs in only one or two amino acids or that has at least or about 70% sequence identity. In an illustrative embodiment, the anti-PD-1 antibody (or an antigen binding antibody fragment thereof) comprises the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены последовательности нуклеиновой кислоThe present invention further provides nucleic acid sequences

- 40 045330 ты, кодирующие антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающую часть). В иллюстративных аспектах антитело содержит 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 CDR, кодируемых нуклеиновой(нуклеиновыми) кислотой(кислотами) под SEQ ID NO: 11-16 (представляющие НС CDR1, НС CDR2, НС CDR3, LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3, в этом порядке). В другом иллюстративном аспекте антитело содержит все 6 CDR, кодируемых нуклеиновыми кислотами под SEQ ID NO: 11-16. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающая часть) содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 17, или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеиновыми кислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности, или (b) вариабельную область легкой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 18, или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеиновыми кислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности. В иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающая часть) содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 18. В других вариантах осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающая часть) содержит (а) тяжелую цепь, кодируемую SEQ ID NO: 19, или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеиновыми кислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности, или (b) легкую цепь, кодируемую SEQ ID NO: 20, или последовательность, вариантную по отношению к ней, которая отличается только 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеиновыми кислотами или которая характеризуется по меньшей мере или приблизительно 70%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности. В иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 (или его антигенсвязывающая часть) содержит тяжелую цепь, кодируемую SEQ ID NO: 19, и легкую цепь, кодируемую SEQ ID NO: 20. Клетки СТ-26 KRAS p.G12C получали из мышиной колоректальной линии Т-26 (АТСС) с использованием технологии CRISPR для замещения обоих аллелей KRAS p.G12D с помощью p.G12C (ThermoFisher Scientific), что кодируется SEQ ID NO: 21.___________________________________- 40 045330 you, encoding an antibody to PD-1 (or its antigen-binding part). In illustrative aspects, the antibody contains 1, 2, 3, 4, 5, or all 6 CDRs encoded by the nucleic acid(s) of SEQ ID NO: 11-16 (representing HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 and LC CDR3, in that order). In another illustrative aspect, the antibody contains all 6 CDRs encoded by the nucleic acids of SEQ ID NOs: 11-16. In some embodiments, the anti-PD-1 antibody (or an antigen-binding portion thereof) comprises (a) a heavy chain variable region encoded by SEQ ID NO: 17, or a sequence variant thereof that differs only 1, 2, 3, 4 , 5 or 6 nucleic acids or which has at least or about 70%, 85%, 90% or 95% sequence identity, or (b) the light chain variable region encoded by SEQ ID NO: 18, or a sequence variant with respect to thereto, which differs in only 1, 2, 3, 4, 5 or 6 nucleic acids or which has at least or about 70%, 85%, 90% or 95% sequence identity. In an illustrative embodiment, the anti-PD-1 antibody (or an antigen-binding portion thereof) comprises a heavy chain variable region encoded by SEQ ID NO: 17 and a light chain variable region encoded by SEQ ID NO: 18. In other embodiments, the anti-PD-1 antibody (or an antigen-binding portion thereof) contains (a) the heavy chain encoded by SEQ ID NO: 19, or a sequence variant thereof, which differs in only 1, 2, 3, 4, 5 or 6 nucleic acids or which is characterized by at least at least about 70%, 85%, 90%, or 95% sequence identity, or (b) the light chain encoded by SEQ ID NO: 20, or a sequence variant thereof that differs by only 1, 2, 3, 4 , 5 or 6 nucleic acids or which has at least or about 70%, 85%, 90% or 95% sequence identity. In an illustrative embodiment, the anti-PD-1 antibody (or antigen-binding portion thereof) comprises a heavy chain encoded by SEQ ID NO: 19 and a light chain encoded by SEQ ID NO: 20. CT-26 KRAS p.G12C cells were derived from a murine colorectal line T-26 (ATCC) using CRISPR technology to replace both alleles of KRAS p.G12D with p.G12C (ThermoFisher Scientific), which is encoded by SEQ ID NO: 21.___________________________

SEQ ID NO. SEQ ID NO. Тип последовательности Sequence type Последовательность Subsequence 1 1 БЕЛОК PROTEIN Ser Туг Asp Met Ser Ser Tyr Asp Met Ser 2 2 БЕЛОК PROTEIN Leu He Ser Gly Gly Gly Ser Gin Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Vai Lys Leu He Ser Gly Gly Gly Ser Gin Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Vai Lys 3 3 БЕЛОК PROTEIN Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Vai Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Vai 4 4 БЕЛОК PROTEIN Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Asn Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Asn Trp Leu Ala

- 41 045330- 41 045330

5 5 БЕЛОК PROTEIN Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 6 6 БЕЛОК PROTEIN Gin Gin Ala Glu Ser Phe Pro His Thr Gin Gin Ala Glu Ser Phe Pro His Thr 7 7 БЕЛОК PROTEIN Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ser Leu lie Ser Gly Gly Gly Ser Gin Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ser Leu lie Ser Gly Gly Gly Ser Gin Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 8 8 БЕЛОК PROTEIN Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Glu Ser Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu He Lys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Glu Ser Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu He Lys 9 9 БЕЛОК PROTEIN Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ser Leu He Ser Gly Gly Gly Ser Gin Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ser Leu He Ser Gly Gly Gly Ser Gin Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

- 42 045330- 42 045330

Thr Leu Туг Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gin Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr Leu Thug Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gin Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

- 43 045330- 43 045330

10 10 БЕЛОК PROTEIN Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Glu Ser Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu He Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Glu Ser Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu He Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys и And ДНК DNA agctatgaca tgagc agctatgaca tgagc 12 12 ДНК DNA cttattagtg gtggtggtag tcaaacatac tacgcagaat ccgtgaaggg c cttattagtg gtggtggtag tcaaacatac tacgcagaat ccgtgaaggg c 13 13 ДНК DNA cccagtggcc actacttcta cgctatggac gtc cccagtggcc actacttcta cgctatggac gtc 14 14 ДНК DNA cgggcgagtc agggtattag caactggtta gcc cgggcgagtc agggtattag caactggtta gcc 15 15 ДНК DNA gctgcatcca gtttgcaaag t gctgcatcca gtttgcaaag t 16 16 ДНК DNA caacaggctg aaagtttccc tcacact caacaggctg aaagtttccc tcacact 17 17 ДНК DNA gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc

- 44 045330- 44 045330

ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgaca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggaatg ggtctcactt attagtggtg gtggtagtca aacatactac gcagaatccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat atttctgtgc gtcccccagt ggccactact tctacgctat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgaca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggaatg ggtctcactt attagtggtg gtggtagtca aacatactac gcagaatccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctg tat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat atttctgtgc gtcccccagt ggccactact tctacgctat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 18 18 ДНК DNA gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aactggttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctgaaagtt tccctcacac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aactggttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctgaaagtt tccctcacac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a 19 19 ДНК DNA atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg cgctgtgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgacatgag ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggaatgggtc tcacttatta gtggtggtgg tagtcaaaca tactacgcag aatccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatattt ctgtgcgtcc cccagtggcc actacttcta cgctatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg cgctgtgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgacatgag ctgggtccgc cagg ctccag ggaaggggct ggaatgggtc tcacttatta gtggtggtgg tagtcaaaca tactacgcag aatccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatattt ctgtgcgtcc cccagtggcc actacttcta c gctatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt

- 45 045330- 45 045330

gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgtg cgaggagcag tacggcagca cgtaccgttg cgtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgag ccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgtg cgaggagcag tacggcagca cgtaccgttg cgtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaagccctcc ca gcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggct ct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 20 20 ДНК DNA atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg cgctgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcttccgtgt ctgcatctgt tggagacaga gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcaact ggttagcctg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tttgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ccctcaccat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttactattgt caacaggctg aaagtttccc tcacactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacga acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg cgctgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcttccgtgt ctgcatctgt tggagacaga gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcaact ggttagcctg gtatcagcag aa accaggga aagcccctaa gctcctgatc tttgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ccctcaccat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttactattgt caacaggctg aaagtttccc tcacactttc ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacga acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc

- 46 045330- 46 045330

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 21 21 БЕЛОК PROTEIN Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala

Агонисты GITR включают без ограничения слитые белки GITR и антитела к GITR (например, бивалентные антитела к GITR), такие как белок слияния GITR, описанный в патенте США № 6111090box.c, европейском патенте № 090505В1, патенте США № 8586023, PCT-публикациях №№ WO 2010/003118 и 2011/090754, или антитело к GITR, описанное, например, в патенте США № 7025962, европейском патенте № 1947183В1, патенте США № 7812135, патенте США № 8388967, патенте США № 8591886, европейском патенте № EP 1866339, PCT-публикации № WO 2011/028683, PCT-публикации № WO 2013/039954, PCT-публикации № WO 2005/007190, PCT-публикации № WO 2007/133822, PCTпубликации № WO 2005/055808, PCT-публикации № WO 99/40196, PCT-публикации № WO 2001/03720, PCT-публикации № WO 99/20758, PCT-публикации № WO 2006/083289, PCT-публикации № WO 2005/115451, патенте США № 7618632 и PCT-публикации № WO 2011/051726.GITR agonists include, but are not limited to, GITR fusion proteins and anti-GITR antibodies (eg, bivalent anti-GITR antibodies), such as the GITR fusion protein described in US Patent No. 6111090box.c, European Patent No. 090505B1, US Patent No. 8586023, PCT Publications No. No. WO 2010/003118 and 2011/090754, or an anti-GITR antibody described, for example, in US Patent No. 7025962, European Patent No. 1947183B1, US Patent No. 7812135, US Patent No. 8388967, US Patent No. 8591886, European Patent No. EP 1866339 , PCT Publication No. WO 2011/028683, PCT Publication No. WO 2013/039954, PCT Publication No. WO 2005/007190, PCT Publication No. WO 2007/133822, PCT Publication No. WO 2005/055808, PCT Publication No. WO 9 9 /40196, PCT Publication No. WO 2001/03720, PCT Publication No. WO 99/20758, PCT Publication No. WO 2006/083289, PCT Publication No. WO 2005/115451, US Patent No. 7618632 and PCT Publication No. WO 2011 /051726.

Ингибиторы KRASG12C также можно применять в комбинации с ингибиторами CDK4 и/или 6 в настоящем изобретении. Ингибиторы CDK 4 и/или 6, которые могут быть использованы в комбинациях по настоящему изобретению, включают без ограничения раскрытые в следующих документах: опубликованная согласно PCT заявка № WO 2009/085185 или публикация заявки на патент США № US2011/0097305.KRAS G12C inhibitors can also be used in combination with CDK4 and/or 6 inhibitors in the present invention. CDK 4 and/or 6 inhibitors that may be used in the combinations of the present invention include, but are not limited to, those disclosed in PCT Publication No. WO 2009/085185 or US Patent Application Publication No. US2011/0097305.

Другие соединения, которые можно применять в комбинации с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению, включая соединения, которые ингибируют белки, являющиеся частью врожденного пути апоптоза. Примеры таких соединений включают без ограничения ингибиторы Bcl2/BclxL, такие как навитоклакс, и ингибиторы Bcl2, такие как АВТ-199.Other compounds that can be used in combination with KRAS G12C inhibitors in the combinations of the present invention, including compounds that inhibit proteins that are part of the innate apoptosis pathway. Examples of such compounds include, but are not limited to, Bcl2/BclxL inhibitors such as navitoclax and Bcl2 inhibitors such as ABT-199.

Другие соединения, которые можно применять в комбинации с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению, включают ингибиторы BCR-ABL, такие как без ограничения дасатиниб, и ингибиторы HDAC, такие как панобиностат.Other compounds that may be used in combination with KRAS G12C inhibitors in the combinations of the present invention include BCR-ABL inhibitors, such as, but not limited to, dasatinib, and HDAC inhibitors, such as panobinostat.

Другие соединения, которые могут быть использованы в комбинации с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению, включают средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин; ингибиторы топоизомеразы II, обычно из класса антрациклина, такие как доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, эпирубицин, пэгилированный липосомный доксорубицин гидрохлорид, миоцет и этопозид; ингибиторы топоизомеразы I, такие как иринотекан (СРТ-11); алкилирующие ДНК средства, такие как темозоломид; и нуклеозидные аналоги, такие как цитарабин и децитабин.Other compounds that may be used in combination with KRAS G12C inhibitors in the combinations of the present invention include platinum-based agents such as cisplatin, carboplatin and oxaliplatin; topoisomerase II inhibitors, usually from the anthracycline class, such as doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, epirubicin, pegylated liposomal doxorubicin hydrochloride, myocet and etoposide; topoisomerase I inhibitors such as irinotecan (CPT-11); DNA alkylating agents such as temozolomide; and nucleoside analogues such as cytarabine and decitabine.

Другие соединения, которые могут быть использованы в комбинации с ингибиторами KRASG12C в комбинациях по настоящему изобретению, включают ингибиторы рецепторной и нерецепторной киназы, включая ингибиторы тирозинкиназы. Пример таких соединений включает иматиниб, дасатиниб, понатиниб, босутиниб, нилотиниб, квизартиниб, мидостаурин, эрлотиниб и лапатиниб.Other compounds that may be used in combination with KRAS G12C inhibitors in the combinations of the present invention include receptor and non-receptor kinase inhibitors, including tyrosine kinase inhibitors. Examples of such compounds include imatinib, dasatinib, ponatinib, bosutinib, nilotinib, quizartinib, midostaurin, erlotinib and lapatinib.

Соединения, описанные в данном документе, можно применять в комбинации со средствами, раскрытыми в данном документе, или другими подходящими средствами в зависимости от состояния, лечение которого осуществляют. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления одно или несколько соединений по настоящему изобретению будут вводить совместно с другими средствами, описанными выше. При применении в комбинированной терапии соединения, описанные в данном документе, вводят одновременно или раздельно со вторым средством. Данное введение в комбинации может включать одновременное введение двух средств в одной и той же лекарственной форме, одновременное введение в отдельных лекарственных формах и раздельное введение. То есть соединение, описанное в данном документе, и любое из средств, описанных выше, могут быть составлены вместе в одной и той же лекарственной форме и введены одновременно. Альтернативно соединение по настоящему изобретению и любое из средств, описанных выше, можно вводить одновременно, при этом оба средства присутствуют в отдельных составах. В другом альтернативном варианте за введением соединения по настоящему изобретению может сразу следовать введение любого из средств, описанных выше, или наоборот. В некоторых вариантах осуществления протокола раздельного введения соединение по настоящему изобретению и любое из средств, описанных выше, вводят с интервалом в несколько минут, или с интервалом в несколько часов, или с интервалом в несколько дней.The compounds described herein may be used in combination with the agents disclosed herein or other suitable agents depending on the condition being treated. Therefore, in some embodiments, one or more compounds of the present invention will be administered in conjunction with other agents described above. When used in combination therapy, the compounds described herein are administered simultaneously or separately with a second agent. This combination administration may include simultaneous administration of two agents in the same dosage form, simultaneous administration in separate dosage forms, and separate administration. That is, the compound described herein and any of the agents described above can be formulated together in the same dosage form and administered simultaneously. Alternatively, the compound of the present invention and any of the agents described above can be administered simultaneously, with both agents present in separate formulations. In another alternative, administration of a compound of the present invention may be immediately followed by administration of any of the agents described above, or vice versa. In some embodiments of a separate administration protocol, a compound of the present invention and any of the agents described above are administered several minutes apart, or several hours apart, or several days apart.

Поскольку в одном аспекте настоящего изобретения предусмотрено лечение заболевания/состояний с помощью комбинации фармацевтически активных соединений, которые можно вводить раздельно, настоящее изобретение дополнительно относится к объединению отдельных фармацевтических композиSince one aspect of the present invention provides for the treatment of disease/conditions with a combination of pharmaceutically active compounds that can be administered separately, the present invention further relates to combining separate pharmaceutical compositions

- 47 045330 ций в форме набора. Набор содержит две отдельные фармацевтические композиции: соединение по настоящему изобретению и второе фармацевтическое соединение. Набор содержит контейнер для содержания отдельных композиций, такой как разделенный на части флакон или пакет из фольги, разделенный на части. Дополнительные примеры контейнеров включают шприцы, коробки и мягкие резервуары. В некоторых вариантах осуществления набор содержит инструкции по применению отдельных компонентов. Форма набора особенно предпочтительна, когда отдельные компоненты предпочтительно вводят в разных лекарственных формах (например, перорально и парентерально), вводят с различными интервалами между введением лекарственного средства, или когда подбор дозы отдельных компонентов комбинации будет назначаться специалистом в области здравоохранения, который прописывает лечение.- 47 045330 tions in the form of a set. The kit contains two separate pharmaceutical compositions: a compound of the present invention and a second pharmaceutical compound. The kit contains a container for containing individual compositions, such as a divided bottle or a divided foil pouch. Additional examples of containers include syringes, boxes, and flexible reservoirs. In some embodiments, the kit contains instructions for use of the individual components. The kit form is particularly advantageous when the individual components are preferably administered in different dosage forms (eg, orally and parenterally), administered at different dosage intervals, or when dosing of the individual components of the combination will be directed by the health care professional who prescribes the treatment.

Синтез AMG 510.AMG 510 synthesis.

Ингибиторы KRASg12C по настоящему изобретению включают раскрытые в опубликованной со-KRAS g12C inhibitors of the present invention include those disclosed in the published

гласно PCT заявке WO 2018/119183. Синтез AMG 510, имеющего структуру N , изложен в U.S.S.N. 15/984855, поданной 21 мая 2018 года, формула изобретения которой заявляет приоритет и преимущество предварительной заявки № 62/509629, поданной 22 мая 2017 года, как описано ниже.according to PCT application WO 2018/119183. The synthesis of AMG 510 having structure N is set forth in USSN 15/984855, filed May 21, 2018, the claims of which claim priority and benefit from Provisional Application No. 62/509629, filed May 22, 2017, as described below.

6-Фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропанил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-он получали с использованием следующего способа, в котором конечный продукт отделяли для выделения М-атропоизомера.6-Fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl)-3-pyridinyl)-4-((2S)-2-methyl-4-( 2propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one was prepared using the following method, in which the final product was separated to isolate the M-atropoisomer.

(1) (СОС1;2· THF' 75 °C(1) (ССО1; 2 THF' 75 °C

Промежуточное соединение SIntermediate S

DIPEA·DIPEA

Стадия 1. 2,6-Дихлор-5-фторникотинамид (промежуточное соединение S). К смеси 2,6-дихлор-5фтор-никотиновой кислоты (4,0 г, 19,1 ммоль, AstaTech Inc., Бристоль, Пенсильвания) в дихлорметане (48 мл) добавляли оксалилхлорид (2 М раствор в DCM, 11,9 мл, 23,8 ммоль) с последующим добавлением каталитического количества DMF (0,05 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрировали. Остаток растворяли в 1,4-диоксане (48 мл) и охлаждали до 0°С. Медленно добавляли раствор гидроксида аммония (основание 28,0-30% NH3, 3,6 мл, 28,6 ммоль) с помощью шприца. Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин, а затем концентрировали. Остаток разбавляли с помощью смеси 1:1 EtOAc/гептан и встряхивали в течение 5 мин, затем фильтровали. Отфильтрованные твердые вещества удаляли и оставшийся исходный раствор частично концентрировали до половины объема и фильтровали. Отфильтрованные твердые вещества промывали сStep 1: 2,6-Dichloro-5-fluoronicotinamide (intermediate S). To a mixture of 2,6-dichloro-5fluoro-nicotinic acid (4.0 g, 19.1 mmol, AstaTech Inc., Bristol, PA) in dichloromethane (48 ml) was added oxalyl chloride (2 M solution in DCM, 11.9 ml , 23.8 mmol) followed by the addition of a catalytic amount of DMF (0.05 ml). The reaction mixture was stirred at room temperature overnight and then concentrated. The residue was dissolved in 1,4-dioxane (48 ml) and cooled to 0°C. Ammonium hydroxide solution (28.0-30% NH3 base, 3.6 mL, 28.6 mmol) was added slowly using a syringe. The resulting mixture was stirred at 0°C for 30 minutes and then concentrated. The residue was diluted with 1:1 EtOAc/heptane and shaken for 5 minutes, then filtered. The filtered solids were removed and the remaining stock solution was partially concentrated to half volume and filtered. The filtered solids were washed with

- 48 045330 помощью гептана и высушивали в печи с пониженным давлением (45°С) в течение ночи с получением- 48 045330 using heptane and dried in a reduced pressure oven (45°C) overnight to obtain

2,6-дихлор-5-фторникотинамида. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ ppm 8,23 (d, J=7,9 Гц, 1H) 8,09 (br s, 1H)2,6-dichloro-5-fluoronicotinamide. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.23 (d, J=7.9 Hz, 1H) 8.09 (br s, 1H)

7,93 (br s, 1H), масса/заряд (ESI, +ve ион): 210,9 (M+H)+.7.93 (br s, 1H), mass/charge (ESI, +ve ion): 210.9 (M+H) + .

Стадия 2. 2,6-Дихлор-5-фтор-N-((2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)карбамоил)никотинамид. К охлажденной льдом взвеси 2,6-дихлор-5-фторникотинамида (промежуточное соединение S, 5,0 г, 23,9 ммоль) в THF (20 мл) медленно добавляли оксалилхлорид (2 М раствор в DCM, 14,4 мл, 28,8 ммоль) с помощью шприца. Полученную смесь нагревали при 75°С в течение 1 ч, затем нагревание останавливали и реакционную смесь концентрировали до половины объема. После охлаждения до 0°С добавляли THF (20 мл) с последующим добавлением по каплям раствора 2-изопропил-4-метилпиридин-3-амина (промежуточное соединение R, 3,59 г, 23,92 ммоль) в THF (10 мл) с помощью канюли. Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч, а затем гасили с помощью смеси 1: 1 солевого раствора и насыщенного водного раствора хлорида аммония. Смесь экстрагировали с помощью EtOAc (3х), и объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали с получением 2,6-дихлор-5-фтор-N-((2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)карбамоил)никотинамида. Данный материал применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. Масса/заряд (ESI, +ve ион): 385,1 (М+Н)+.Step 2. 2,6-Dichloro-5-fluoro-N-((2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)carbamoyl)nicotinamide. To an ice-cooled slurry of 2,6-dichloro-5-fluoronicotinamide (intermediate S, 5.0 g, 23.9 mmol) in THF (20 mL) was added slowly oxalyl chloride (2 M solution in DCM, 14.4 mL, 28 .8 mmol) using a syringe. The resulting mixture was heated at 75°C for 1 hour, then the heating was stopped and the reaction mixture was concentrated to half the volume. After cooling to 0°C, THF (20 ml) was added followed by dropwise addition of a solution of 2-isopropyl-4-methylpyridin-3-amine (intermediate R, 3.59 g, 23.92 mmol) in THF (10 ml) using a cannula. The resulting mixture was stirred at 0°C for 1 hour and then quenched using a 1:1 mixture of saline and saturated aqueous ammonium chloride. The mixture was extracted with EtOAc (3x) and the combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to give 2,6-dichloro-5-fluoro-N-((2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)carbamoyl) nicotinamide. This material was used in the next step without further purification. Mass/charge (ESI, +ve ion): 385.1 (M+H) + .

Стадия 3. 7-Хлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин2,4(1Н,3Н)-дион. К охлажденному льдом раствору 2,6-дихлор-5-фтор-N-((2-изопропил-4-метилпиридин3-ил)карбамоил)никотинамида (9,2 г, 24,0 ммоль) в THF (40 мл) медленно добавляли KHMDS (1 М раствор в THF, 50,2 мл, 50,2 ммоль) с помощью шприца. Ледяную баню удаляли и полученную смесь перемешивали в течение 40 мин. при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили с помощью насыщенного водного раствора хлорида аммония и экстрагировали с помощью EtOAc (3х). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: 0-50% 3:1 EtOAc-EtOH/гептан) с получением 7хлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2,4(1H,3Н)-диона. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ ppm 12,27 (br s, 1H), 8,48-8,55 (m, 2H), 7,29 (d, J=4,8 Гц, 1H), 2,87 (quin, J=6,6 Гц, 1H), 1,99-2,06 (m, 3H), 1,09 (d, J=6,6 Гц, 3H), 1,01 (d, J=6,6 Гц, 3H). 19F ЯМР (376 МГц, DMSO-d6) δ: 126,90 (s, 1F), масса/заряд (ESI, +ve ион): 349,1 (M+H)+.Step 3. 7-Chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidine2,4(1H,3H)-dione. To an ice-cooled solution of 2,6-dichloro-5-fluoro-N-((2-isopropyl-4-methylpyridin3-yl)carbamoyl)nicotinamide (9.2 g, 24.0 mmol) in THF (40 mL) was added slowly KHMDS (1 M solution in THF, 50.2 ml, 50.2 mmol) using a syringe. The ice bath was removed and the resulting mixture was stirred for 40 minutes. at room temperature. The reaction mixture was quenched with saturated aqueous ammonium chloride and extracted with EtOAc (3x). The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. The residue was purified by silica gel chromatography (eluent: 0-50% 3:1 EtOAc-EtOH/heptane) to give 7chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2,3 -d]pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 12.27 (br s, 1H), 8.48-8.55 (m, 2H), 7.29 (d, J=4.8 Hz, 1H ), 2.87 (quin, J=6.6 Hz, 1H), 1.99-2.06 (m, 3H), 1.09 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.01 (d, J=6.6 Hz, 3H). 19 F NMR (376 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 126.90 (s, 1F), mass/charge (ESI, +ve ion): 349.1 (M+H) + .

Стадия 4. 4,7-Дихлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)он. К раствору 7-хлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин2,4(1Н,3Н)-диона (4,7 г, 13,5 ммоль) и DIPEA (3,5 мл, 20,2 ммоль) в ацетонитриле (20 мл) по каплям добавляли оксихлорид фосфора (1,63 мл, 17,5 ммоль) с помощью шприца. Полученную смесь нагревали при 80°С в течение 1 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали с получением 4,7-дихлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-она. Данный материал применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. Масса/заряд (ESI, +ve ион): 367,1 (М+Н)+.Step 4. 4,7-Dichloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)one. To a solution of 7-chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidine2,4(1H,3H)-dione (4.7 g, 13 .5 mmol) and DIPEA (3.5 mL, 20.2 mmol) in acetonitrile (20 mL), phosphorus oxychloride (1.63 mL, 17.5 mmol) was added dropwise using a syringe. The resulting mixture was heated at 80°C for 1 hour and then cooled to room temperature and concentrated to give 4,7-dichloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2 ,3-d]pyrimidin-2(1H)-one. This material was used in the next step without further purification. Mass/charge (ESI, +ve ion): 367.1 (M+H) + .

Стадия 5. (S)-трет-Бутил-4-(7-хлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)-2-оксо-1,2дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил)-3-метилпиперазин-1-карбоксилат. К охлажденному льдом раствору 4,7-дихлор-6-фтор-1 -(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1 Н)-она (13,5 ммоль) в ацетонитриле (20 мл) добавляли DIPEA (7,1 мл, 40,3 ммоль) с последующим добавлением (S)-4N-Boc-2-метилпиперазина (3,23 г, 16,1 ммоль, Combi-Blocks, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч, затем разбавляли с помощью холодного насыщенного водного раствора бикарбоната натрия (200 мл) и EtOAc (300 мл). Смесь перемешивали в течение дополнительных 5 мин, слои разделяли и водный слой экстрагировали с помощью дополнительного количества EtOAc (1х). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: 0-50% EtOAc/гептан) с получением (S)-трет-бутил-4-(7-хлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4метилпиридин-3-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил)-3-метилпиперазин-1-карбоксилата. Масса/заряд (ESI, +ve ион): 531,2 (М+Н)+.Step 5. (S)-tert-Butyl-4-(7-chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)-2-oxo-1,2dihydropyrido[2,3- d]pyrimidin-4-yl)-3-methylpiperazine-1-carboxylate. To an ice-cooled solution of 4,7-dichloro-6-fluoro-1 -(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1 H)-one (13.5 mmol) in acetonitrile (20 ml) was added DIPEA (7.1 ml, 40.3 mmol) followed by (S)-4N-Boc-2-methylpiperazine (3.23 g, 16.1 mmol, Combi-Blocks, Inc., San Diego, California, USA). The resulting mixture was warmed to room temperature and stirred for 1 hour, then diluted with cold saturated aqueous sodium bicarbonate (200 ml) and EtOAc (300 ml). The mixture was stirred for an additional 5 minutes, the layers were separated and the aqueous layer was extracted with additional EtOAc (1x). The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. The residue was purified by silica gel chromatography (eluent: 0-50% EtOAc/heptane) to give (S)-tert-butyl-4-(7-chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4methylpyridin-3-yl )-2-oxo-1,2-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-3-methylpiperazine-1-carboxylate. Mass/charge (ESI, +ve ion): 531.2 (M+H) + .

Стадия 6. (3S)-трет-Бутил-4-(6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(2-изопропил-4-метилпиридин3-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил)-3-метилпиперазин-1-карбоксилат. Смесь (S)трет-бутил-4-(7-хлор-6-фтор-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил)-3-метилпиперазин-1-карбоксилата (4,3 г, 8,1 ммоль), трифтор(2-фтор-6гидроксифенил)бората калия (промежуточное соединение Q, 2,9 г, 10,5 ммоль), ацетата калия (3,2 г, 32,4 ммоль) и [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(П), комплекса с дихлорметаном (661 мг, 0,81 ммоль) в 1,4-диоксане (80 мл) дегазировали с помощью азота в течение 1 мин. Добавляли дезоксигенированную воду (14 мл) и полученную смесь нагревали при 90°С в течение 1 ч. Обеспечивали охлаждение реакционной смеси до комнатной температуры, гасили ее с помощью полунасыщенного водного раствора бикарбоната натрия и экстрагировали с помощью EtOAc (2х) и DCM (1х). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: 0-60% 3:1 EtOAc-EtOH/гептан) с получением (3S)Step 6. (3S)-tert-Butyl-4-(6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin3-yl)-2-oxo-1, 2-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-3-methylpiperazine-1-carboxylate. A mixture of (S)tert-butyl-4-(7-chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)-2-oxo-1,2-dihydropyrido[2,3-d ]pyrimidin-4-yl)-3-methylpiperazin-1-carboxylate (4.3 g, 8.1 mmol), potassium trifluoro(2-fluoro-6hydroxyphenyl)borate (intermediate Q, 2.9 g, 10.5 mmol), potassium acetate (3.2 g, 32.4 mmol) and [1,1'-bis-(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(P), complexed with dichloromethane (661 mg, 0.81 mmol) in 1, 4-dioxane (80 ml) was degassed with nitrogen for 1 min. Deoxygenated water (14 ml) was added and the resulting mixture was heated at 90°C for 1 hour. Allow the reaction mixture to cool to room temperature, quench it with semi-saturated aqueous sodium bicarbonate and extract with EtOAc (2x) and DCM (1x) . The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. The residue was purified by silica gel chromatography (eluent: 0-60% 3:1 EtOAc-EtOH/heptane) to give (3S)

- 49 045330 трет-бутил-4-(6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(2-изопропил-4-метилпиридин-3-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил)-3-метилпиперазин-1-карбоксилата. 1Н ЯМР (400 МГц, DMSO-D6) δ ppm 10,19 (br s, 1Н), 8,38 (d, J=5,0 Гц, 1Н), 8,26 (dd, J=12,5, 9,2 Гц, 1Н), 7,23-7,28 (m, 1Н), 7,18 (d, J=5,0 Гц, 1Н), 6,72 (d, J=8,0 Гц, 1Н), 6,68 (t, J=8,9 Гц, 1Н), 4,77-4,98 (m, 1H), 4,24 (br t, J=14,2 Гц, 1Н), 3,93-4,08 (m, 1Н), 3,84 (br d, J=12,9 Гц, 1Н), 3,52-3,75 (m, 1H), 3,07-3,28 (m, 1H), 2,62-2,74 (m, 1H), 1,86-1,93 (m, 3H), 1,43-1,48 (m, 9 H), 1,35 (dd, J=10,8, 6,8 Гц, 3H), 1,26-1,32 (m, 1Н), 1,07 (dd, J=6,6, 1,7 Гц, 3Н), 0,93 (dd, J=6,6, 2,1 Гц, 3Н). 19F ЯМР (376 МГц, DMSO-d6) δ: -115,65 (s, 1F), -128,62 (s, 1F), масса/заряд (ESI, +ve ион): 607,3 (M+H)+.- 49 045330 tert-butyl-4-(6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)-2-oxo-1,2- Dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-3-methylpiperazine-1-carboxylate. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ ppm 10.19 (br s, 1H), 8.38 (d, J=5.0 Hz, 1H), 8.26 (dd, J=12.5, 9.2 Hz, 1H), 7.23-7.28 (m, 1H), 7.18 (d, J=5.0 Hz, 1H), 6.72 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.68 (t, J=8.9 Hz, 1H), 4.77-4.98 (m, 1H), 4.24 (br t, J=14.2 Hz, 1H), 3 .93-4.08 (m, 1H), 3.84 (br d, J=12.9 Hz, 1H), 3.52-3.75 (m, 1H), 3.07-3.28 ( m, 1H), 2.62-2.74 (m, 1H), 1.86-1.93 (m, 3H), 1.43-1.48 (m, 9 H), 1.35 (dd , J=10.8, 6.8 Hz, 3H), 1.26-1.32 (m, 1H), 1.07 (dd, J=6.6, 1.7 Hz, 3H), 0, 93 (dd, J=6.6, 2.1 Hz, 3H). 19 F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ: -115.65 (s, 1F), -128.62 (s, 1F), mass/charge (ESI, +ve ion): 607.3 (M+ H) + .

Стадия 7. 6-Фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропанил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2метил-4-(2-пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-он. Трифторуксусную кислоту (25 мл, 324 ммоль) добавляли к раствору (3S)-трет-бутил-4-(6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(2изопропил-4-метилпиридин-3-ил)-2-оксо-1,2-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил)-3-метилпиперазин1-карбоксилата (6,3 г, 10,4 ммоль) в DCM (30 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем концентрировали. Остаток растворяли в DCM (30 мл), охлаждали до 0°С и последовательно обрабатывали с помощью DIPEA (7,3 мл, 41,7 ммоль) и раствора акрилоилхлорида (0,849 мл, 10,4 ммоль) в DCM (3 мл; добавляли по каплям с помощью шприца). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин, затем гасили с помощью полунасыщенного водного раствора бикарбоната натрия и экстрагировали с помощью DCM (2х). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали. Хроматографическая очистка остатка (силикагель; элюент: 0-100% EtOAc-EtOH (3:1)/гептан) с последующим хиральным разделением с использова нием высокоэффективной жидкостной хроматографии (Chiralpak IC, 30x250 мм, 5 мкм, 55% МеОН/CO2, 120 мл/мин, 102 бар; собирали соединение первого элюируемого пика) обеспечивала AMG 510 (2,25 г, выход 43%). 6-Фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропанил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2метил-4-(2-пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1H)-он. 1Н ЯМР (400 МГц, DMSO-D6) δ ppm 10,20 (s, 1Н), 8,39 (d, J=4,8 Гц, 1Н), 8,24-8,34 (m, 1H), 7,23-7,32 (m, 1H), 7,19 (d, J=5,0 Гц, 1Н), 6,87 (td, J=16,3, 11,0 Гц, 1Н), 6,74 (d, J=8,6 Гц, 1Н), 6,69 (t, J=8,6 Гц, 1Н), 6,21 (br d, J=16,2 Гц, 1Н), 5,74-5,80 (m, 1Н), 4,91 (br s, 1Н), 4,23-4,45 (m, 2 Н), 3,97-4,21 (m, 1Н), 3,44-3,79 (m, 2Н), 3,11-3,31 (m, 1Н), 2,67-2,77 (m, 1Н), 1,91 (s, 3Н), 1,35 (d, J=6,8 Гц, 3Н), 1,08 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0,94 (d, J=6,8 Гц, 3Н). 19F ЯМР (376 МГц, DMSO-d6) δ ppm - 115,64 (s, 1F), -128,63 (s, 1F), масса/заряд (ESI, +ve ион): 561,2 (M+H)+.Step 7. 6-Fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl)-3-pyridinyl)-4-((2S)-2methyl-4- (2-propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one. Trifluoroacetic acid (25 ml, 324 mmol) was added to a solution of (3S)-tert-butyl-4-(6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(2isopropyl-4-methylpyridinium-3- yl)-2-oxo-1,2-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-3-methylpiperazine 1-carboxylate (6.3 g, 10.4 mmol) in DCM (30 ml). The resulting mixture was stirred at room temperature for 1 hour and then concentrated. The residue was dissolved in DCM (30 ml), cooled to 0°C and treated successively with DIPEA (7.3 ml, 41.7 mmol) and a solution of acryloyl chloride (0.849 ml, 10.4 mmol) in DCM (3 ml; added drop by drop using a syringe). The reaction mixture was stirred at 0°C for 10 min, then quenched with semi-saturated aqueous sodium bicarbonate and extracted with DCM (2x). The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. Chromatographic purification of the residue (silica gel; eluent: 0-100% EtOAc-EtOH (3:1)/heptane) followed by chiral separation using high performance liquid chromatography (Chiralpak IC, 30x250 mm, 5 µm, 55% MeOH/CO2, 120 ml/min, 102 bar; first eluting peak compound collected) provided AMG 510 (2.25 g, 43% yield). 6-Fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl)-3-pyridinyl)-4-((2S)-2methyl-4-(2- propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ ppm 10.20 (s, 1H), 8.39 (d, J=4.8 Hz, 1H), 8.24-8.34 (m, 1H) , 7.23-7.32 (m, 1H), 7.19 (d, J=5.0 Hz, 1H), 6.87 (td, J=16.3, 11.0 Hz, 1H), 6.74 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.69 (t, J=8.6 Hz, 1H), 6.21 (br d, J=16.2 Hz, 1H), 5 .74-5.80 (m, 1H), 4.91 (br s, 1H), 4.23-4.45 (m, 2H), 3.97-4.21 (m, 1H), 3 .44-3.79 (m, 2H), 3.11-3.31 (m, 1H), 2.67-2.77 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.35 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.08 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.94 (d, J=6.8 Hz, 3H). 19 F NMR (376 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm - 115.64 (s, 1F), -128.63 (s, 1F), mass/charge (ESI, +ve ion): 561.2 (M +H) + .

AMG 510, как указано в данном документе, представляет собой М-атропоизомер 6-фтор-7-(2-фтор6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропанил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2-пропеноил)-1 пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-она, характеризующегося формулой или его фармацевтически приемлемую соль.AMG 510, as defined herein, is the M-atropoisomer of 6-fluoro-7-(2-fluoro6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl)-3-pyridinyl)-4- ((2S)-2-methyl-4-(2-propenoyl)-1 piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one, characterized by the formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Синтез промежуточных соединений.Synthesis of intermediate compounds.

p<dppf)2a2, i-PrZnBr,p<dppf) 2 a 2 , i-PrZnBr,

THF, 60 ’СTHF, 60 'C

2-Изопропил-4-метилпиридин-3-амин (R). Добавляли комплекс [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(П) с дихлорметаном (79 мг, 0,10 ммоль) во взвесь 3-амино-2-бром-4пиколина (3; 360 мг, 1,9 ммоль, Combi-Blocks, San Diego, CA) в THF (4 мл) и полученную смесь продували аргоном в течение 2 мин. Добавляли 2-пропилцинк бромида (0,5 М раствор в THF, 5,40 мл, 2,7 ммоль) и полученный раствор нагревали при 60°С в течение 17 ч, затем обеспечивали охлаждение до комнатной температуры. Добавляли воду (10 мл) и 1 н. водный NaOH (20 мл) и полученную смесь экстрагировали с помощью EtOAc (2х). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали in vacuo. Хроматографическая очистка остатка (силикагель; элюент: 0-15% MeOH/DCM) давала R (284 мг, выход 98%). 1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 7,66 p.p.m. (d, J=4,6 Гц, 1H), 6,78 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,72 (br s, 2H), 3,14-3,25 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,14 (d, J=6,8 Гц, 6Н); масса/заряд (ESI, +ve ион): 151,1 (M+H)+.2-Isopropyl-4-methylpyridin-3-amine (R). [1,1'-Bis-(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II) complex with dichloromethane (79 mg, 0.10 mmol) was added to a suspension of 3-amino-2-bromo-4picoline (3; 360 mg, 1.9 mmol, Combi-Blocks, San Diego, CA) in THF (4 ml) and the resulting mixture was purged with argon for 2 min. 2-propylzinc bromide (0.5 M solution in THF, 5.40 mL, 2.7 mmol) was added and the resulting solution was heated at 60° C. for 17 hours, then allowed to cool to room temperature. Added water (10 ml) and 1 N. aqueous NaOH (20 ml) and the resulting mixture was extracted with EtOAc (2x). The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo. Chromatographic purification of the residue (silica gel; eluent: 0-15% MeOH/DCM) gave R (284 mg, 98% yield). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.66 ppm (d, J=4.6 Hz, 1H), 6.78 (d, J=4.8 Hz, 1H), 4.72 (br s, 2H), 3.14-3.25 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.14 (d, J=6.8 Hz, 6H); mass/charge (ESI, +ve ion): 151.1 (M+H) + .

- 50 045330- 50 045330

F F /=С KF, Е-(+)-винная кислота, /=С .F F /=C KF, E-(+)-tartaric acid, /=C.

Z Х_В(он)2 .____________£ J-bf^Z Х_ В (he) 2 .__________£ J-bf^

V CH3CN/THF,k.t. \ он 9 OH Q (2-Фтор-6-гидроксифенил)калия трифторборат (Q). Раствор фторида калия (44,7 г, 770 ммоль) в воде (75 мл) добавляли к суспензии (2-фтор-6-гидроксифенил)бороновой кислоты (9; 30 г, 192 ммоль, Combi-Blocks, Сан-Диего, Калифорния) в ацетонитриле (750 мл). Через 2 мин перемешивания раствор L(+)-винной кислоты (72,2 г, 481 ммоль) в THF (375 мл) добавляли в течение 10 мин. Полученную смесь механически перемешивали в течение 1 ч. Суспендированные твердые вещества удаляли фильтрацией и промывали небольшим количеством THF. Затем объединенный фильтрат частично концентрировали in vacuo до начала осаждения твердых веществ. Фильтрат охлаждали до -20°С и перемешивали в течение 16 ч, затем медленно нагревали до температуры окружающей среды. Добавляли 2-пропанол (20 мл) и осажденные твердые вещества собирали путем фильтрации и промывали 2-пропанолом с получением 27,5 г твердого вещества. Фильтрат снова частично концентрировали (до наблюдения осаждения), охлаждали до -20°С и перемешивали в течение 20 мин. Добавляли дополнительный 2-пропанол и осажденное твердое вещество собирали путем фильтрации и промывали 2-пропанолом. Две партии твердого вещества объединяли с получением Q (34,6 г, выход 82%). 1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 8,07 p.p.m. (q, J=14,7 Гц, 1H), 6,93 (q, J=7,5 Гц, 1H), 6,30-6,38 (m, 2H).V CH 3 CN/THF,kt \ he 9 OH Q (2-Fluoro-6-hydroxyphenyl)potassium trifluoroborate (Q). A solution of potassium fluoride (44.7 g, 770 mmol) in water (75 ml) was added to a suspension of (2-fluoro-6-hydroxyphenyl)boronic acid (9; 30 g, 192 mmol, Combi-Blocks, San Diego, CA ) in acetonitrile (750 ml). After 2 minutes of stirring, a solution of L(+)-tartaric acid (72.2 g, 481 mmol) in THF (375 ml) was added over 10 minutes. The resulting mixture was mechanically stirred for 1 hour. Suspended solids were removed by filtration and washed with a small amount of THF. The combined filtrate was then partially concentrated in vacuo until solids began to precipitate. The filtrate was cooled to -20°C and stirred for 16 hours, then slowly warmed to ambient temperature. 2-propanol (20 ml) was added and the precipitated solids were collected by filtration and washed with 2-propanol to obtain 27.5 g of solid. The filtrate was again partially concentrated (until precipitation was observed), cooled to -20°C and stirred for 20 minutes. Additional 2-propanol was added and the precipitated solid was collected by filtration and washed with 2-propanol. Two batches of solid were combined to give Q (34.6 g, 82% yield). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ 8.07 ppm (q, J=14.7 Hz, 1H), 6.93 (q, J=7.5 Hz, 1H), 6, 30-6.38 (m, 2H).

Синтез пропионамида AMG 510Synthesis of propionamide AMG 510

(М)-6 и (М)-11. Рацемическое соединение 6 разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Chiralpak AD, 21x250 мм, 5 мкм, 40% МеОН/CO2, 80 мл/мин, 110 бар; собирали соединение второго элюируемого пика) с получением (М)-6, которое превращали в (М)-11 с использованием процедур, представленных для рацемических субстратов.(M)-6 and (M)-11. Racemic compound 6 was separated by high performance liquid chromatography (Chiralpak AD, 21x250 mm, 5 µm, 40% MeOH/CO 2 , 80 ml/min, 110 bar; the second eluting peak compound was collected) to give (M)-6, which was converted in (M)-11 using the procedures presented for racemic substrates.

(М)-6-Фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропaнил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2-метил4-пропаноил-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-он (пропионамид AMG 510). Трифторуксусную кислоту (4,0 мл, 51,9 ммоль) добавляли в раствор (М)-11 (0,196 г, 0,323 ммоль) в DCM (5 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем смесь концентрировали in vacuo и обеспечивали поглощение остатка в DCM (10 мл), охлаждали до 0°С и последовательно обрабатывали с помощью DIPEA (0,169 мл, 0,969 ммоль) и пропионилхлорида (0,016 мл, 0,194 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин, затем разбавляли насыщенным водным бикарбонатом натрия и экстрагировали с помощью DCM (2x). Объединенные экстракты высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали in vacuo. Хроматографическая очистка остатка (силикагель; элюент: 0-70% EtOAc-EtOH (3:1)/гептан) обеспечивали AMG 510 пропионамид (0,180 г, выход 99%). 1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 10,20 p.p.m (s, 1H), 8,40 (d, J=5,0 Гц, 1H), 8,27 (br dd, J=15,1, 9,3 Гц, 1H), 7,27 (m, 1H), 7,21 (br d, J=4,8 Гц, 1H), 6,73 (d, J=8,3 Гц, 1H), 6,69 (t, J=8,9 Гц, 1H), 4,87 (br s, 1H), 4,31 (m, 1,5H), 4,21 (br d, J=13,5 Гц, 0,5Н), 3,94 (br d, J=12,2 Гц, 0,5Н), 3,82 (br d, J=13,3 Гц, 0,5Н), 3,62-3,76 (m, 1H), 3,52-3,62 (m, 0,5H), 3,43-3,51 (m, 0,5H), 3,18 (br dd, J=13,3, 3,3 Гц, 0,5H), 3,06 (br t, J=10,7 Гц, 0,5H), 2,73 (br dd, J=10,5, 6,1 Гц, 1H), 2,33-2,48 (m, 2H), 1,91 (s, 3H), 1,29-1,42 (m, 3H), 0,981,12 (m, 6H), 0,94 (d, J=6,6 Гц, 3H); масса/заряд (ESI, +ve ион): 563,2 (M+H)+.(M)-6-Fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl)-3-pyridinyl)-4-((2S)-2-methyl4 -propanoyl-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one (propionamide AMG 510). Trifluoroacetic acid (4.0 mL, 51.9 mmol) was added to a solution of (M)-11 (0.196 g, 0.323 mmol) in DCM (5 mL) and the resulting mixture was stirred at room temperature for 20 min. The mixture was then concentrated in vacuo and the residue absorbed into DCM (10 mL), cooled to 0° C. and treated sequentially with DIPEA (0.169 mL, 0.969 mmol) and propionyl chloride (0.016 mL, 0.194 mmol). The resulting mixture was stirred at 0°C for 10 min, then diluted with saturated aqueous sodium bicarbonate and extracted with DCM (2x). The combined extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo. Chromatographic purification of the residue (silica gel; eluent: 0-70% EtOAc-EtOH (3:1)/heptane) provided AMG 510 propionamide (0.180 g, 99% yield). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ 10.20 ppm (s, 1H), 8.40 (d, J=5.0 Hz, 1H), 8.27 (br dd, J= 15.1, 9.3 Hz, 1H), 7.27 (m, 1H), 7.21 (br d, J=4.8 Hz, 1H), 6.73 (d, J=8.3 Hz , 1H), 6.69 (t, J=8.9 Hz, 1H), 4.87 (br s, 1H), 4.31 (m, 1.5H), 4.21 (br d, J= 13.5 Hz, 0.5H), 3.94 (br d, J=12.2 Hz, 0.5H), 3.82 (br d, J=13.3 Hz, 0.5H), 3, 62-3.76 (m, 1H), 3.52-3.62 (m, 0.5H), 3.43-3.51 (m, 0.5H), 3.18 (br dd, J= 13.3, 3.3 Hz, 0.5H), 3.06 (br t, J=10.7 Hz, 0.5H), 2.73 (br dd, J=10.5, 6.1 Hz , 1H), 2.33-2.48 (m, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.29-1.42 (m, 3H), 0.981.12 (m, 6H), 0, 94 (d, J=6.6 Hz, 3H); mass/charge (ESI, +ve ion): 563.2 (M+H)+.

В альтернативном способе синтезировали AMG 510 и соответствующие промежуточные соединения описаны в предварительной заявке на патент США № 62/768802, поданной 16 ноября 2018 года. Альтернативный способ предусматривает следующие стадии, где разделение rac-диона на стадиях 4 и 5 обеспечивает успешное разделение атропоизомеров.In an alternative method, AMG 510 was synthesized and the corresponding intermediates are described in US Provisional Patent Application No. 62/768802, filed November 16, 2018. An alternative method involves the following steps, where the separation of the rac-dione in steps 4 and 5 provides successful separation of the atropisomers.

- 51 045330- 51 045330

Соединение 9Connection 9

Выход 80%Yield 80%

Описание способа. Стадия 1. F i (COCI)2 F НО ii. nh4oh h2n уЧЧ ч * ЧСУс| СГ 1 СГ i КИСЛОТА АМИД CAS 82671 -06-5 CAS 113237-20-0Description of the method. Stage 1. F i (COCI)2 F HO ii. nh 4 oh h 2 n uChch h * Chsu s| SG 1 SG i ACID AMIDE CAS 82671 -06-5 CAS 113237-20-0 Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль ) MW (g/mol) Эквивален ты/объем ы Equivalent/volume s Моли Moli Теоретическ ое количество Theoretical quantity 2,6-Дихл ор-5 -фтор-3 пиридинкарбоновая кислота 2,6-Dichlor or-5-fluoro-3 pyridinecarboxylic acid 82671-06-5 82671-06-5 209,99 209.99 1,0 экв. 1.0 eq. 119,1 119.1 25 кг 25 kg DCM DCM 74-09-2 74-09-2 84,93 84.93 16,51 экв. 16.51 eq. 2354,9 2354.9 200 кг 200 kg DMF DMF 68-12-2 68-12-2 73,09 73.09 0,068 экв. 0.068 eq. 8,1 8.1 592 г (627 мл) 592 g (627 ml) Оксалилхлорид Oxalyl chloride 79-37-8 79-37-8 126,93 126.93 1,25 экв. 1.25 eq. 148,9 148.9 18,9 кг 18.9 kg Гидроксид аммония Ammonium hydroxide 1336-21-6 1336-21-6 35,05 35.05 5 экв. 5 eq. 595,5 595.5 40,2 л 40.2 l Вода Water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 н. д. n. d. н. д. n. d. 261 л 261 l

В раствор 2,6-дихлор-5-фтор-3-пиридинкарбоновой кислоты (соединения 1) (25 кг; 119,1 моль) в дихлорметане (167 кг) и DMF (592 г) добавляли оксалилхлорид (18,9 кг; 148,9 моль) при поддержанииTo a solution of 2,6-dichloro-5-fluoro-3-pyridinecarboxylic acid (compound 1) (25 kg; 119.1 mol) in dichloromethane (167 kg) and DMF (592 g) was added oxalyl chloride (18.9 kg; 148 .9 mol) while maintaining

- 52 045330 внутренней температуры на уровне от 15 до 20°С. Добавляли дополнительное количество дихлорметана (33 кг) в качестве промывки и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали, затем гасили гидроксидом аммония (40,2 л; 595,5 моль) при поддержании внутренней температуры на уровне 0 ±10°С. Полученную взвесь перемешивали в течение 90 мин, затем продукт собирали посредством фильтрации. Отфильтрованные твердые вещества промывали деионизированной водой (3x87 л) и высушивали с получением 2,6-дихлор-5-фторникотинамида (соединения 2).- 52 045330 internal temperature at 15 to 20°C. Additional dichloromethane (33 kg) was added as a rinse and the reaction mixture was stirred for 2 hours. The reaction mixture was cooled, then quenched with ammonium hydroxide (40.2 L; 595.5 mol) while maintaining the internal temperature at 0 ± 10 °C . The resulting slurry was stirred for 90 minutes, then the product was collected by filtration. The filtered solids were washed with deionized water (3x87 L) and dried to obtain 2,6-dichloro-5-fluoronicotinamide (compound 2).

Стадия 2.Stage 2.

(CQClb нагревание. ” р с обратным ' холодильником(CQClb heating. "p with reflux" condenser

АМВД2AMVD2

GAS 113237-2043'GAS 113237-2043'

GAS 1698293-93*4GAS 1698293-93*4

Материал Material № CAS No. CAS MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквиваленты/объемы Equivalents/volumes Моли Moli Теоретичес кое количество Theoretical quantity Амид (2,6-дихлор-5фторникотинамид) Amide (2,6-dichloro-5fluoronicotinamide) 11323 7-20-0 11323 7-20-0 209,99 209.99 1,0 экв. 1.0 eq. 77,8 77.8 16,27 кг 16.27 kg Оксалилхлорид Oxalyl chloride 79-37- 8 79-37- 8 126,93 126.93 1,2 экв. 1.2 eq. 93,8 93.8 11,9 кг (7,9 л) 11.9 kg (7.9 l) Дихлорметан Dichloromethane 75-09- 2 75-09- 2 84,93 84.93 н. д. n. d. н. д. n. d. 730,7 кг (551,5 л) 730.7 kg (551.5 l) DCM раствор анилина 2-изопропил-4- DCM solution aniline 2-isopropyl-4- 16982 93-93- 4 16982 93-93- 4 150,22 150.22 1,1 экв. 1.1 eq. 85,9 85.9 12,9 кг (вес содержащег ОСЯ 12.9 kg (weight including AXLE метилпиридин-3 амин methylpyridine-3 amine анилина) aniline)

В реактор А в раствор 2,6-дихлор-5-фторникотинамида (соединения 2) (16,27 кг; 77,8 моль) в дихлорметане (359,5 кг) добавляли оксалилхлорид (11,9 кг; 93,8 моль) при поддержании температуры на уровне <25°С в течение 75 мин. Затем полученный раствор нагревали до 40°С±3°С и выдерживали в течение 3 ч. Раствор дистиллировали с использованием вакуума с удалением дихлорметана до тех пор, пока раствор не оказывался ниже мешалки. Затем добавляли дихлорметан (300 кг) и смесь охлаждали до 0±5°С. В чистый сухой реактор (реактор В) добавляли 2-изопропил-4-метилпиридин-3-амин (ANILINE) (12,9 кг; 85,9 моль), а затем дихлорметан (102,6 кг). Раствор анилина азеотропно высушивали посредством вакуумной дистилляции при поддержании внутренней температуры на уровне от 20 до 25°) с заме щением дополнительным количеством дихлорметана до достижения высушивания раствора согласно анализу KF (предел <0,05%). Объем раствора доводили до объема приблизительно 23 л дихлорметаном. Затем в реактор А добавляли высушенный раствор анилина при поддержании внутренней температуры на уровне 0±5°С в течение всей процедуры добавления. Затем смесь нагревали до 23°С и выдерживали в течение 1 ч, раствор окончательно фильтровали в чистый реактор с получением 2,6-дихлор-5-фтор-Ы-((2изопропил-4-метилпиридин-3-ил)карбамоил)никотинамида (соединения 3) в виде раствора в DCM и использовали непосредственно на следующей стадии.In reactor A, oxalyl chloride (11.9 kg, 93.8 mol) was added to a solution of 2,6-dichloro-5-fluoronicotinamide (compound 2) (16.27 kg; 77.8 mol) in dichloromethane (359.5 kg). while maintaining the temperature at <25°C for 75 minutes. The resulting solution was then heated to 40°C ± 3°C and kept for 3 hours. The solution was distilled using vacuum to remove dichloromethane until the solution was below the stirrer. Dichloromethane (300 kg) was then added and the mixture was cooled to 0±5°C. To a clean, dry reactor (Reactor B) 2-isopropyl-4-methylpyridin-3-amine (ANILINE) (12.9 kg; 85.9 mol) was added followed by dichloromethane (102.6 kg). The aniline solution was azeotropically dried by vacuum distillation while maintaining the internal temperature at 20 to 25°, replacing with additional dichloromethane until the solution was dry by KF analysis (limit <0.05%). The solution was made up to approximately 23 L with dichloromethane. The dried aniline solution was then added to reactor A while maintaining the internal temperature at 0±5°C throughout the addition procedure. The mixture was then heated to 23°C and kept for 1 hour, the solution was finally filtered into a clean reactor to obtain 2,6-dichloro-5-fluoro-N-((2isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)carbamoyl)nicotinamide ( compound 3) as a solution in DCM and used directly in the next step.

Стадия 3.Stage 3.

FF

МОЧЕВИНА 3 гас-ДИОН4UREA 3 gas-DION4

- 53 045330- 53 045330

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквивалент ы/объемы Equivalents/volumes Моли Moli Теоретическое количество Theoretical quantity Мочевина, раствор в DCM 2,6-дихлор-5-фторЛ-{[4-метил-2(пропан-2ил)пиридин-3ил] карбамоил } пири дин-3 -карбоксамид Urea, solution in DCM 2,6-dichloro-5-fluoroL-{[4-methyl-2(propan-2yl)pyridin-3yl]carbamoyl}pyridine-3-carboxamide и. д. And. d. 385,22 385.22 1,0 экв. 1.0 eq. 38,9 38.9 208,3 кг (15 кг содержащегося веса) 208.3 kg (15 kg contained weight) 2- Метилтетрагидрофу ран 2- Methyltetrahydrofuran 96-47-9 96-47-9 86,13 86.13 н. д. n. d. н. д. n. d. 308 кг (358 л) 308 kg (358 l) Трет-бутоксид натрия Sodium tert-butoxide 865-48-5 865-48-5 96,11 96.11 2,0 экв. 2.0 eq. 97,8 97.8 9,4 кг 9.4 kg Хлорид аммония Ammonium chloride 12125- 02-9 12125- 02-9 53,49 53.49 н. д. n. d. 430 430 23,0 кг 23.0 kg Хлористоводородна я кислота Hydrochloric I'm acid 7467-0Ι- Ο 7467-0Ι- Ο 36,46 36.46 н. д. n. d. 41 41 1,6 кг 1.6 kg Сульфат магния Magnesium sulfate 7487-88- 9 7487-88- 9 120,37 120.37 н. д. n. d. 195 195 23,5 кг 23.5 kg Хлорид натрия Sodium chloride 7647-14- 5 7647-14- 5 58,44 58.44 н. д. n. d. 282 282 16,5 кг 16.5 kg Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,21 100.21 н. д. n. d. н. д. n. d. 94 л 94 l 10% лимонная кислота 10% lemon acid 75 кг 75 kg

В растворе 2,6-дихлор-5-фтор-N- {[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]карбамоил} пиридин-3карбоксамида в дихлорметане (UREA (соединение 3)) (15 кг содержащегося веса; 38,9 моль) растворитель заменяли на 2-MeTHF с использованием вакуумной дистилляции при поддержании внутренней температуры на уровне 20-25°С. Объем в реакторе доводили до 40 л, а затем загружали дополнительное количество 2-MeTHF (105,4 кг). Добавляли трет-бутоксид натрия (9,4 кг; 97,8 моль) при поддержании 5-10°С. Содержимое нагревали до 23°С и перемешивали в течение 3 ч. Затем содержимое охлаждали до 0-5°С и добавляли хлорид аммония (23,0 кг; 430 моль) в виде раствора в 60 л деионизированной воды. Смесь нагревали до 20°С и добавляли деионизированную воду (15 л), и дополнительно выдерживали в течение 30 мин. Перемешивание останавливали и слои разделяли. Водный слой удаляли и в органический слой добавляли деионизированную воду (81,7 л). Получали смесь конц. HCl (1,5 кг) и воды (9 л), затем медленно добавляли ее в реактор до тех пор, пока измеренное значение pH не достигало 4-5. Слои разделяли и водный слой обратно экстрагировали с использованием 2MeTHF (42,2 кг). Два органических слоя объединяли и промывали 10% раствором лимонной кислоты (75 кг), а затем смесью воды (81,7 л) и насыщенного NaCl (19,8 кг). Затем органический слой промывали насыщенным бикарбонатом натрия (75 кг), повторяя при необходимости до достижения целевого уровня pH водного раствора, составляющего > 7,0. Органический слой снова промывали солевым раствором (54,7 кг), а затем высушивали над сульфатом магния (5 кг). Смесь фильтровали для удаления сульфата магния, промывая фильтрованный слой с помощью 2-MeTHF (49,2 кг). Объединенный фильтрат и смывы дистиллировали с использованием вакуума до объема 40 л. Концентрированный раствор нагревали до 55°С и медленно добавляли гептан (10-12 кг) до достижения точки помутнения. Раствор охлаждали до 23°С в течение 2 ч, затем добавляли гептан (27,3 кг) в течение 2 ч. Взвесь продукта выдерживали в течение 3 ч при 20-25°С, затем фильтровали и промывали смесью 2-MeTHF (2,8 кг) и гептана (9 кг). Продукт высушивали с использованием азота и вакуума с получением твердого 7-хлор-6-фтор-1 -(2-изопропил-4-метилпиридин-3 -ил)пиридо [2,3-d] пиримидин2,4(1Н,3Н)-диона (rac-диона (соединения 4)).In a solution of 2,6-dichloro-5-fluoro-N-{[4-methyl-2-(propan-2-yl)pyridin-3-yl]carbamoyl}pyridin-3carboxamide in dichloromethane (UREA (compound 3)) ( 15 kg contained weight; 38.9 mol) solvent was replaced with 2-MeTHF using vacuum distillation while maintaining internal temperature at 20-25°C. The reactor volume was adjusted to 40 L and then additional 2-MeTHF (105.4 kg) was charged. Sodium tert-butoxide (9.4 kg; 97.8 mol) was added while maintaining 5-10°C. The contents were heated to 23°C and stirred for 3 hours. The contents were then cooled to 0-5°C and ammonium chloride (23.0 kg; 430 mol) was added as a solution in 60 L of deionized water. The mixture was heated to 20°C and deionized water (15 L) was added and kept for an additional 30 min. Stirring was stopped and the layers were separated. The aqueous layer was removed and deionized water (81.7 L) was added to the organic layer. A mixture of conc. HCl (1.5 kg) and water (9 L), then slowly added to the reactor until the measured pH value reached 4-5. The layers were separated and the aqueous layer was back-extracted using 2MeTHF (42.2 kg). The two organic layers were combined and washed with 10% citric acid (75 kg) followed by a mixture of water (81.7 L) and saturated NaCl (19.8 kg). The organic layer was then washed with saturated sodium bicarbonate (75 kg), repeating as necessary until the target aqueous solution pH was >7.0. The organic layer was washed again with brine (54.7 kg) and then dried over magnesium sulfate (5 kg). The mixture was filtered to remove magnesium sulfate, washing the filter layer with 2-MeTHF (49.2 kg). The combined filtrate and washings were distilled using vacuum to a volume of 40 L. The concentrated solution was heated to 55°C and heptane (10-12 kg) was slowly added until the cloud point was reached. The solution was cooled to 23°C over 2 hours, then heptane (27.3 kg) was added over 2 hours. The product slurry was kept for 3 hours at 20-25°C, then filtered and washed with a mixture of 2-MeTHF (2, 8 kg) and heptane (9 kg). The product was dried using nitrogen and vacuum to give solid 7-chloro-6-fluoro-1-(2-isopropyl-4-methylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidine2,4(1H,3H)- dione (rac-dione (compound 4)).

- 54 045330- 54 045330

Стадия 4.Stage 4.

Сокристалл м-дион DBTAm-Dione DBTA cocrystal

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквивале нты/объе мы Equivalents/volumes Моли Moli Теоретичес кое количество Theoretical quantity Rac-дион Rac-dione н. д. n. d. 348,76 348.76 1,0 1.0 - - - - (+)-2,3 - Дибензоил-D- винная кислота (+)-2,3 - Dibenzoyl-D- wine acid 17026-42-5 17026-42-5 358,30 358.30 2,0 2.0 - - - - 2-Метилтетрагидрофуран 2-Methyltetrahydrofuran 96-47-9 96-47-9 86,13 86.13 7,0 7.0 - - - - Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,21 100.21 2,0 2.0 - - - - Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,21 100.21 з,о h,o - - - - 2-Метилтетрагидрофуран 2-Methyltetrahydrofuran 96-47-9 96-47-9 86,13 86.13 4,0 4.0 - - - - Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,21 100.21 2,0 2.0 - - - -

В сосуд с перемешиваемой суспензией соединения 4 (1,0 экв.) в 2-метилтетрагидрофуране (7,0 л/кг) добавляли (+)-2,3-дибензоил-D-винную кислоту (2,0 экв.) в атмосфере азота. 2-MeTHF является хиральным, но его применяют в качестве рацемической смеси. Различные энантиомеры 2-MeTHF случайным образом включены в сокристал. Полученную суспензию нагревали до 75°С и выдерживали при 75°С до тех пор, пока не наблюдали полное растворение (<30 мин). Полученный раствор окончательно фильтровали при 75°С во второй сосуд. В окончательно отфильтрованный раствор загружали н-гептан (2,0 л/кг) при скорости, которая обеспечивала поддержание внутренней температуры выше 65°С. Затем раствор охлаждали до 60°С, вводили затравку из кристаллов (0,01 кг/кг) и оставляли для отстаивания в течение 30 мин. Полученную суспензию охлаждали до 20°С в течение 4 ч, а затем отбирали образцы для анализа хиральной чистоты посредством HPLC. В суспензию загружали н-гептан (3,0 л/кг), а затем выдерживали в течение 4 ч при 20°С в атмосфере азота. Суспензию фильтровали и выделенные твердые вещества промывали два раза с помощью (2:1) н-гептана:2-метилтетрагидрофурана (3,0 л/кг). Материал высушивали с помощью азота и вакуума с получением комплекса М-дион:DBTA: Me-THF (соединения 4а).(+)-2,3-Dibenzoyl-D-tartaric acid (2.0 equiv) was added to a vessel containing a stirred suspension of compound 4 (1.0 eq.) in 2-methyltetrahydrofuran (7.0 L/kg) under atmosphere. nitrogen. 2-MeTHF is chiral, but is used as a racemic mixture. Different enantiomers of 2-MeTHF are randomly included in the cocrystal. The resulting suspension was heated to 75°C and maintained at 75°C until complete dissolution was observed (<30 min). The resulting solution was finally filtered at 75°C into a second vessel. The final filtered solution was charged with n-heptane (2.0 L/kg) at a rate that maintained the internal temperature above 65°C. Then the solution was cooled to 60°C, a seed of crystals (0.01 kg/kg) was introduced and left to settle for 30 minutes. The resulting suspension was cooled to 20°C for 4 hours, and then samples were taken for analysis of chiral purity by HPLC. n-heptane (3.0 l/kg) was loaded into the suspension and then kept for 4 hours at 20°C in a nitrogen atmosphere. The suspension was filtered and the isolated solids were washed twice with (2:1) n-heptane:2-methyltetrahydrofuran (3.0 L/kg). The material was dried under nitrogen and vacuum to obtain the M-dione:DBTA:Me-THF complex (compound 4a).

- 55 045330- 55 045330

Стадия 5.Stage 5.

MeMe

Сокристалл м-даонШВТА/2-MeTHF 4аCocrystal m-daonSHVTA/2-MeTHF 4a

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) MW (g/mol) Эквивале нты/объем ы Equivalents/volumes Моли Moli Т еоретическое количество Theoretical quantity Сокриталл М- дион/DBTA/Me-THF Socrytal M- dione/DBTA/Me-THF и. д. And. d. 1228,08 1228.08 1,0 1.0 74,2 74.2 46,9 кг (25,9 кг, с учетом поправки на М-дион) 46.9 kg (25.9 kg, adjusted for M-dion) Метил-от/?еотбутиловый эфир Methyl-ot/?eobutyl ether 1634-04-4 1634-04-4 88,15 88.15 45,0 45.0 17593 17593 2100 л 2100 l Гидрофосфат динатрия Disodium hydrogen phosphate 7558-79-4 7558-79-4 141,96 141.96 2,0 2.0 148,4 148.4 21,1 кг 21.1 kg Вода, очищенная по USP Purified water USP В необходимом количестве In the required quantity Сульфат магния Magnesium sulfate 7487-88-9 7487-88-9 120,37 120.37 и. д. And. d. и. д. And. d. 25 кг 25 kg Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,20 100.20 60,0 60.0 19322 19322 2835 л 2835 l

В сосуде А суспензию гидрофосфата динатрия (21,1 кг, 2,0 экв.) в деионизированной воде (296,8 л, 6,3 л/кг) перемешивали до тех пор, пока не наблюдали растворение (>30 мин). В сосуде В суспензию комплекса М-дион:DBTA: Me-THF (композиция 4а) [46,9 кг (25,9 кг, с учетом поправки на М-дион, 1,0 экв.)] в метил-трет-бутиловом эфире (517,8 L, 11,0 л/кг) перемешивали в течение 15-30 мин. Полученный раствор из сосуда А добавляли в сосуд В, а затем смесь перемешивали в течение более 3 часов. Перемешивание останавливали и двухфазную смесь для разделения в течение более 30 мин. Нижнюю водную фазу удаляли, а затем осуществляли обратное экстрагирование метил-трет-бутиловым эфиром (77,7 л, 1,7 л/кг). Органические фазы объединяли в сосуде В и высушивали с помощью сульфата магния (24,8 кг, 0,529 кг/кг). Полученную суспензию из сосуда В перемешивали в течение более трех часов, а затем фильтровали в сосуд С. В сосуд В загружали промывку в виде метил-трет-бутилового эфира (46,9 л, 1,0 л/кг), а затем фильтровали в сосуд С. Содержимое сосуда С охлаждали до 10°С, а затем дистиллировали под вакуумом при медленном нагревании до 35°С. Дистилляцию продолжали до сбора 320350 кг (6,8-7,5 кг/кг) метил-трет-бутилового эфира. После охлаждения содержимого сосуда С до 20°С загружали н-гептан (278,7 л, 5,9 л/кг) в течение одного часа, а затем дистиллировали под вакуумом при медленном нагревании до 35°С. Дистилляцию продолжали до сбора 190-200 кг (4,1-4,3 кг/кг) смеси метил-трет-бутилового эфира и н-гептана. После охлаждения содержимого сосуда С до 20°С загружали нгептан (278,7 л, 5,9 л/кг) второй раз в течение одного часа, а затем дистиллировали под вакуумом при медленном нагревании до 35°С. Дистилляцию продолжали до сбора 190-200 кг (4,1-4,3 кг/кг) смеси метил-трет-бутилового эфира и н-гептана. После охлаждения содержимого сосуда С до 20°С загружали нгептан (195,9 л, 4,2 л/кг) загружали третий раз в течение одного часа, а затем отбирали образец для анализа состава растворителя с помощью GC анализа. Суспензию в сосуде С продолжали перемешивать в течение более одного часа. Суспензию фильтровали, а затем промывали промывкой в виде н-гептана (68,6 л, 1,5 л/кг) из сосуда С. Выделенные твердые вещества высушивали при 50°С и образец рассматривали в отношении соответствия исходного материала. Получали 7-хлор-6-фтор-(1М)-1-[4-метил-2- 56 045330 (проnан-2-ил)пиридин-3-ил]nиридо[2,3-d]пиримидин-2,4(Ш,3H)-дион (М-дион), соединение 5М.In vessel A, a suspension of disodium hydrogen phosphate (21.1 kg, 2.0 eq) in deionized water (296.8 L, 6.3 L/kg) was stirred until dissolution was observed (>30 min). In vessel B, a suspension of M-dione:DBTA:Me-THF complex (composition 4a) [46.9 kg (25.9 kg adjusted for M-dione, 1.0 eq.)] in methyl tert-butyl ether (517.8 L, 11.0 l/kg) was stirred for 15-30 minutes. The resulting solution from vessel A was added to vessel B, and then the mixture was stirred for more than 3 hours. Stirring was stopped and the two-phase mixture was separated for more than 30 min. The lower aqueous phase was removed and then back-extracted with methyl tert-butyl ether (77.7 L, 1.7 L/kg). The organic phases were combined in vessel B and dried with magnesium sulfate (24.8 kg, 0.529 kg/kg). The resulting suspension from Vessel B was stirred for over three hours and then filtered into Vessel C. Vessel B was charged with methyl tert-butyl ether wash (46.9 L, 1.0 L/kg) and then filtered into vessel C. The contents of vessel C were cooled to 10°C and then distilled under vacuum while heating slowly to 35°C. Distillation was continued until 320,350 kg (6.8-7.5 kg/kg) of methyl tert-butyl ether was collected. After cooling the contents of vessel C to 20°C, n-heptane (278.7 L, 5.9 L/kg) was charged over one hour and then distilled under vacuum while heating slowly to 35°C. Distillation was continued until 190-200 kg (4.1-4.3 kg/kg) of a mixture of methyl tert-butyl ether and n-heptane was collected. After cooling the contents of vessel C to 20°C, nheptane (278.7 L, 5.9 L/kg) was charged a second time within one hour and then distilled under vacuum while heating slowly to 35°C. Distillation was continued until 190-200 kg (4.1-4.3 kg/kg) of a mixture of methyl tert-butyl ether and n-heptane was collected. After cooling the contents of vessel C to 20° C., nheptane (195.9 L, 4.2 L/kg) was loaded a third time within one hour, and then a sample was taken for solvent composition analysis by GC analysis. The suspension in vessel C continued to stir for more than one hour. The suspension was filtered and then washed with n-heptane wash (68.6 L, 1.5 L/kg) from vessel C. The isolated solids were dried at 50° C. and the sample was examined for consistency with the starting material. We obtained 7-chloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-methyl-2-56 045330 (pronan-2-yl)pyridin-3-yl]nirido[2,3-d]pyrimidin-2,4 (III,3H)-dione (M-dione), compound 5M.

Вышеупомянутый способ первого поколения успешно масштабировали на 200+ кг исходного материала rac-диона (соединения 5). В этом способе затравка кристаллизации термодинамически стабильной кристаллической формой rac-диона (которая проявляет низкую растворимость) может вызывать негодность партии. На основе последующих исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что увеличение эквивалентов DBTA и снижение температуры затравки путем регулирования графика загрузки гептана повышает надежность способа. Улучшенный способ устойчив в отношении присутствия термодинамически стабильной кристаллической формы rac-диона и обеспечивает успешное разделение атропоизомеров. Последующие партии будут включать улучшенный способ для крупномасштабного изготовления.The above first generation method was successfully scaled up to 200+ kg of rac-dione starting material (compound 5). In this method, seeding crystallization with a thermodynamically stable crystalline form of the rac-dione (which exhibits low solubility) can cause batch failure. Based on subsequent studies, the present inventors have discovered that increasing DBTA equivalents and decreasing seed temperature by adjusting the heptane loading schedule improves process reliability. The improved method is robust to the presence of the thermodynamically stable crystalline form of the rac-dione and provides successful separation of atropisomers. Subsequent batches will include an improved method for large-scale production.

Стадия 6.Stage 6.

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) MW (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes Моли Moli Т еоретическое количество Theoretical quantity М-дион M-dion н. д. n. d. 348,76 348.76 1 экв. 1 eq. 9,8 9.8 3,7 кг 3.7 kg Толуол Toluene 108-88-3 108-88-3 92,14 92.14 н. д. n. d. 375 375 34,6 кг (40 л) 34.6 kg (40 l) Фосфорилхлорид Phosphoryl chloride 10025-87-3 10025-87-3 153,33 153.33 1,2 экв. 1.2 eq. И,7 I,7 1,8 кг (1,1 л) 1.8 kg (1.1 l) Ν,Ν- Диизопропил- этиламин Ν,Ν- Diisopropyl- ethylamine 7087-68-5 7087-68-5 129,24 129.24 3,0 экв. 3.0 eq. 29,4 29.4 3,8 кг (5,1 л) 3.8 kg (5.1 l) (s)-1 -Вос-3 - метилпиперазин (s)-1 -Sun-3 - methylpiperazine 147081-29-6 147081-29-6 200,28 200.28 1,1 экв. 1.1 eq. 10,8 10.8 2,214 кг 2.214 kg Бикарбонат натрия Bicarbonate of soda 144-55-8 144-55-8 84,01 84.01 н. д. n. d. н. д. n. d. 973 г 973 g Дихлорметан Dichloromethane 75-09-2 75-09-2 84,93 84.93 н. д. n. d. 871 871 74 кг (55,6 л) 74 kg (55.6 l) Хлорид натрия Sodium chloride 7647-14-5 7647-14-5 58,44 58.44 н. д. n. d. 103 103 6,0 кг 6.0 kg Этилацетат Ethyl acetate 141-78-6 141-78-6 88,11 88.11 н. д. n. d. 288 288 25,4 кг (28,2 л) 25.4 kg (28.2 l)

7-Хлор-6-фтор-(1М)-1-[4-метил-2-(проnан-2-ил)пиридин-3-ил]nиридо[2,3-d]пиримидин-2,4(1H,3H)дион (М-дион) (3,7 кг; 9,8 моль) объединяли в реакторе (А) с 10,5 кг толуола и перегоняли в масло для удаления воды при поддержании заданной температуры 45°С. Толуол (21 кг) добавляли к остатку и смесь перемешивали в течение 30 мин. при 40-45°С. Содержимое охлаждали до 22°С, затем добавляли фосфорилхлорид (1,8 кг; 11,7 моль). Смесь охлаждали до 0-5°С перед добавлением N,Nдиизопропилэтиламина (2,5 кг; 19,34 моль) при поддержании температуры на уровне <5°С. Раствор выдерживали в течение 3 ч при 22°С. В отдельном реакторе (В) (B)-1-boc-3-метилnиnеразин (2,21 кг; 10,8 моль) и N,N-диизоπроπилэтиламин (1,26 кг; 9,75 моль)) объединяли в толуоле (6 кг), а затем загружали в реактор (А) при поддержании температуры на уровне <25°С. Реакционную смесь выдерживали в течение 15 мин. при 22°С, затем гасили бикарбонатом натрия (973 г) в воде (12,9 л) при поддержании температуры на уровне <25°С. Смесь перемешивали в течение 30 мин, затем добавляли DCM (36,8 кг), продолжая перемешивание в течение 1 ч. Обеспечивали разделение слоев и нижний органический слой сливали в реактор (С). Водный слой в реакторе (А) подвергали обратной экстракции с использованием DCM (18,4 кг) и объединенные органические слои промывали солевым раствором (6,0 кг NaCl; 16,5 кг деионизированной воды). Органический слой дистиллировали при атмосферном давлении, поддерживая внутреннюю температуру на уровне от 45 до 55°С. DCM в ходе дистилляции заменяли на раствор для азеотропной сушки. После дистилляции объем раствора доводили до 19 л с использованием DCM. Раствор охлаждали до 30°С и окончательно фильтровали. Фильтрат объединяли с этилацетатом (8,5 кг), а затем дистиллировали при атмосферном давлении до сбора 11-13 кг в резервуаре. В раствор вводили затравку в7-Chloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-methyl-2-(pronan-2-yl)pyridin-3-yl]nirido[2,3-d]pyrimidine-2,4(1H, 3H)dione (M-dione) (3.7 kg; 9.8 mol) was combined in reactor (A) with 10.5 kg of toluene and distilled into oil to remove water while maintaining a set temperature of 45°C. Toluene (21 kg) was added to the residue and the mixture was stirred for 30 minutes. at 40-45°C. The contents were cooled to 22°C, then phosphoryl chloride (1.8 kg; 11.7 mol) was added. The mixture was cooled to 0-5°C before adding N,Ndiisopropylethylamine (2.5 kg; 19.34 mol) while maintaining the temperature at <5°C. The solution was kept for 3 hours at 22°C. In a separate reactor (B), (B)-1-boc-3-methylninerazine (2.21 kg; 10.8 mol) and N,N-diisopropylethylamine (1.26 kg; 9.75 mol)) were combined in toluene ( 6 kg) and then loaded into reactor (A) while maintaining the temperature at <25°C. The reaction mixture was kept for 15 minutes. at 22°C, then quenched with sodium bicarbonate (973 g) in water (12.9 L) while maintaining the temperature at <25°C. The mixture was stirred for 30 minutes, then DCM (36.8 kg) was added while stirring continued for 1 hour. The layers were separated and the lower organic layer was poured into reactor (C). The aqueous layer in reactor (A) was back-extracted using DCM (18.4 kg) and the combined organic layers were washed with brine (6.0 kg NaCl; 16.5 kg deionized water). The organic layer was distilled at atmospheric pressure, maintaining the internal temperature at 45 to 55°C. DCM was replaced during distillation with azeotropic drying solution. After distillation, the volume of the solution was brought to 19 L using DCM. The solution was cooled to 30°C and finally filtered. The filtrate was combined with ethyl acetate (8.5 kg) and then distilled at atmospheric pressure to collect 11-13 kg in the tank. A seed was introduced into the solution

- 57 045330 виде 30 г исходного продукта и выдерживали в течение 1 ч при 25-30°С, затем дополнительно дистиллировали при атмосферном давлении при внутренней температуре 45-55°С до сбора 8,2 кг дистиллята. Взвесь охлаждали до 22°С и выдерживали на протяжении ночи, затем дополнительно охлаждали до 05°С. Продукт собирали путем фильтрации и промывали два раза с использованием этилацетата (по 4,2 кг каждый раз). Осадок на фильтре высушивали с помощью азота и вакуума с получением трет-бутил-(3S)4-{7-хлор-6-фтор-( 1М)-1 - [4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3 -ил] -2-оксо-1,2-дигидропиридо [2,3й]пиримидин-4-ил}-3-метилпиперазин-1-карбоксилата (соединение 6, пипазолин).- 57 045330 in the form of 30 g of the original product and kept for 1 hour at 25-30°C, then further distilled at atmospheric pressure at an internal temperature of 45-55°C until 8.2 kg of distillate was collected. The suspension was cooled to 22°C and kept overnight, then further cooled to 05°C. The product was collected by filtration and washed twice with ethyl acetate (4.2 kg each time). The filter cake was dried under nitrogen and vacuum to give tert-butyl-(3S)4-{7-chloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-methyl-2-(propan-2-yl)pyridine -3-yl]-2-oxo-1,2-dihydropyrido[2,3d]pyrimidin-4-yl}-3-methylpiperazine-1-carboxylate (compound 6, pipezoline).

Стадия 7.Stage 7.

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) MW (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes Моли Moli Теорети ческое количес тво Theoretical quantity [1,1 '-Бис(дифенилфосфино) ферроцен]дихлорпалладий (П) [1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium (P) 72287-26-4 72287-26-4 731,714 731.714 0,020 0.020 1,01 1.01 0,74 кг 0.74 kg Дихлорметан Dichloromethane 75-09-2 75-09-2 84,93 84.93 - - н. д. n. d. 400 кг 400 kg 1,4-диоксан 1,4-dioxane 123-91-1 123-91-1 88,1052 88.1052 5,0 5.0 н. д. n. d. 168 кг 168 kg Дигидрат динатриевой соли этилендиаминтетраухсусной кислоты Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate 6381-92-6 6381-92-6 336,207 336.207 1,0 1.0 45,2 45.2 15,2 кг 15.2 kg

- 58 045330- 58 045330

Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,21 100.21 - - - - 200 кг 200 kg Азот Nitrogen - - - - - - - - В необходи МОМ количест ве The required PTO quantity Пипазолин Pipazoline н. д. n. d. 531,0 531.0 1,0 1.0 45,2 45.2 24,0 кг 24.0 kg Ацетат калия Potassium acetate 127-08-2 127-08-2 98,1417 98.1417 5,0 5.0 225,99 225.99 22,2 кг 22.2 kg Трифтор(2-фтор-6гидроксифенил)борат калия Potassium trifluoro(2-fluoro-6hydroxyphenyl)borate н. д. n. d. 233,03 233.03 1,20 1.20 54,24 54.24 12,6 кг 12.6 kg 2-Пропанол 2-Propanol 67-63-0 67-63-0 66,10 66.10 - - н. д. n. d. 850 кг 850 kg Si-тиол Si-thiol н. д. n. d. н. д. n. d. - - н. д. n. d. 13,2 кг 13.2 kg Гидроксид натрия Sodium hydroxide 1310-73-2 1310-73-2 40,00 40.00 - - - - 6,5 кг 6.5 kg Вода, очищенная по USP USP purified water - - - - - - - - В необходи МОМ количест ве The required PTO quantity

В реактор добавляли дегазированный диоксан (74,2 кг), трет-бутил-(3S)-4-{7-хлор-6-фтор-(1M)-1[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]-2-оксо-1,2-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил}-3-метилпиперазин-1-карбоксилат (соединение 6, пипазолин) (24,0 кг, 45,2 моль), ацетат калия (22,2 кг, 45,2 моль) и (dppf)PdCl2 (0,74 кг, 1,01 моль). В реакторе создавали инертную атмосферу с помощью газообразного азота. Раствор продували газообразным азотом до достижения содержания кислорода, составляющего <500 мг/л. Реакционную смесь нагревали до 87,5°С. Раствор трифтор(2-фтор-6-гидроксифенил)бората калия (12,6 кг, 54,3 моль) в дегазированном диоксане (49,4 кг) и дегазированной воде (14,4 кг) с содержанием кислорода <500 мг/л переносили в реакционную смесь, поддерживая внутреннюю температуру на уровне 82,5°С±7,5°С. Реакционную смесь доводили до 87,5°С±1,5°С и перемешивали в течение 75 мин ±15 мин. Загружали 1,0 М раствор EDTA (47,3 кг), а затем воду (40,1 кг) в реактор при поддержании внутренней температуры 85°С±5°С. Реакционную смесь охлаждали до 20°С ±3°С в течение >2 ч, а затем перемешивали в течение >16 ч. Реакционную смесь фильтровали и неочищенные твердые вещества промывали водой (3x120 кг). Твердые вещества промывали смесью гептана (28,8 кг) и 2-пропанола (33,1 кг), а затем высушивали при <50°С в течение >10 ч. В чистый реактор загружали неочищенные твердые вещества и дихлорметан (240 кг). Содержимое перемешивали при 20°С±5°С в течение >30 мин. В реактор добавляли Si-тиол (144 кг) и дихлорметан (14,9 кг). Реакционную смесь перемешивали при 20°С±5°С в течение 18 ч. Реакционную смесь фильтровали и промывали дихлорметаном (84 кг). Раствор дистиллировали и растворитель заменяли на 2-пропанол. Реакционную смесь нагревали до 60°С±3°С и загружали гептан (108 кг) при поддержании температуры реакционной смеси на уровне 60°С±3°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 45 мин, а затем охлаждали и перемешивали при 20°С±5°С в течение 2,5 ч. Реакционную смесь фильтровали и промывали 50% об./об. гептан/2-пропанол (61,9 кг). Выделенные твердые вещества высушивали при <50°С в течение >12 ч. с получением трет-бутил-(3S)-4-{6фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-(1М)-1-[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]-2-оксо-1,2дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил}-3-метилпиперазин-1 -карбоксилата (соединение 7, биарил).Degassed dioxane (74.2 kg), tert-butyl-(3S)-4-{7-chloro-6-fluoro-(1M)-1[4-methyl-2-(propan-2-yl) was added to the reactor. pyridin-3-yl]-2-oxo-1,2-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-yl}-3-methylpiperazine-1-carboxylate (compound 6, pipazoline) (24.0 kg, 45 .2 mol), potassium acetate (22.2 kg, 45.2 mol) and (dppf)PdCl 2 (0.74 kg, 1.01 mol). An inert atmosphere was created in the reactor using nitrogen gas. The solution was purged with nitrogen gas until the oxygen content was <500 mg/L. The reaction mixture was heated to 87.5°C. A solution of potassium trifluoro(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)borate (12.6 kg, 54.3 mol) in degassed dioxane (49.4 kg) and degassed water (14.4 kg) with an oxygen content of <500 mg/l transferred to the reaction mixture, maintaining the internal temperature at 82.5°C ± 7.5°C. The reaction mixture was brought to 87.5°C ± 1.5°C and stirred for 75 min ± 15 min. A 1.0 M EDTA solution (47.3 kg) and then water (40.1 kg) were charged into the reactor while maintaining the internal temperature at 85°C ± 5°C. The reaction mixture was cooled to 20°C ±3°C for >2 hours and then stirred for >16 hours. The reaction mixture was filtered and the crude solids were washed with water (3x120 kg). The solids were washed with a mixture of heptane (28.8 kg) and 2-propanol (33.1 kg) and then dried at <50°C for >10 hours. The clean reactor was charged with crude solids and dichloromethane (240 kg). The contents were stirred at 20°C±5°C for >30 minutes. Si-thiol (144 kg) and dichloromethane (14.9 kg) were added to the reactor. The reaction mixture was stirred at 20°C±5°C for 18 hours. The reaction mixture was filtered and washed with dichloromethane (84 kg). The solution was distilled and the solvent was replaced with 2-propanol. The reaction mixture was heated to 60°C±3°C and heptane (108 kg) was charged while maintaining the temperature of the reaction mixture at 60°C±3°C. The reaction mixture was stirred for 45 minutes and then cooled and stirred at 20°C±5°C for 2.5 hours. The reaction mixture was filtered and washed with 50% v/v. heptane/2-propanol (61.9 kg). The isolated solids were dried at <50°C for >12 hours to give tert-butyl-(3S)-4-{6fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-(1M)-1-[4 -methyl-2-(propan-2-yl)pyridin-3-yl]-2-oxo-1,2dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-yl}-3-methylpiperazin-1-carboxylate (compound 7 , biaryl).

- 59 045330- 59 045330

Стадия 8.Stage 8.

Общее примечание. Все эквиваленты и объемы указаны относительно биарила 7.General note. All equivalents and volumes are relative to biaryl 7.

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes Моли Moli Т еоретическое количество Theoretical quantity Биарил 7 Biaryl 7 н. д. n. d. 606,67 606.67 1,0 экв. 1.0 eq. 5,27 5.27 2,75 кг 2.75 kg TFA T.F.A. 76-05-1 76-05-1 114,02 114.02 11 экв. 11 eq. 49,7 49.7 5,67 кг 5.67 kg DCM DCM 74-09-2 74-09-2 84,93 84.93 5 об. 5 rev. н. д. n. d. 13,71 л 13.71 l метанол methanol 67-56-1 67-56-1 32,04 32.04 5 об. 5 rev. и. д. And. d. 13,71 л 13.71 l Вода Water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 20 об. 20 rev. н. д. n. d. 54,8 л 54.8 l Карбонат калия Carbonate potassium 584-08-7 584-08-7 138,20 138.20 18 экв. 18 eq. 94,91 94.91 11,24 кг 11.24 kg DCM DCM 74-09-2 74-09-2 84,93 84.93 1 об. 1 rev. н. д. n. d. 2,75 л 2.75 l Вода Water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 10 об. 10 rev. н. д. n. d. 27,5 л 27.5 l Вода Water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 10 об. 10 rev. и. д. And. d. 27,5 л 27.5 l

В реактор добавляли трет-бутuл-(3S)-4-{6-фтор-7-(2-фтор-6-гuдроkсuфенuл)-(1М)-1-[4-метил-2(пропан-2-uл)пиридuн-3-ил]-2-оксо-1,2-дигидропuридо[2,3-d]пиримидин-4-ил}-3-метилпиперазин-1карбоксилат (соединение 7, биарил) (2,75 кг, 5,27 моль), DCM (13,7 л) и TFA (5,67 кг, 49,7 моль). Реакционную смесь перемешивали в течение 8-16 ч при 20±5°С. Во второй реактор добавляли карбонат калия (11,24 кг), воду (54,8 л) и метанол (13,7 л) для образования гомогенного раствора. Реакционную смесь добавляли в раствор карбоната калия в течение 2 ч. Смесь перемешивали при 20±5°С в течение еще 12 ч. Полученную взвесь фильтровали и промывали водой (2x27,5 л). Влажный фильтрационный осадок высушивали в течение 24 ч. с получением 6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-4-[(28)-2-метилпиперазин-1ил]-(1М)-1-[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1H)-она (соединения 8, DESBOC).Tert-butyl-(3S)-4-{6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-(1M)-1-[4-methyl-2(propan-2-yl)pyridine was added to the reactor -3-yl]-2-oxo-1,2-dihydropurido[2,3-d]pyrimidin-4-yl}-3-methylpiperazine-1carboxylate (compound 7, biaryl) (2.75 kg, 5.27 mol ), DCM (13.7 L) and TFA (5.67 kg, 49.7 mol). The reaction mixture was stirred for 8-16 hours at 20±5°C. Potassium carbonate (11.24 kg), water (54.8 L) and methanol (13.7 L) were added to the second reactor to form a homogeneous solution. The reaction mixture was added to the potassium carbonate solution over 2 hours. The mixture was stirred at 20±5°C for another 12 hours. The resulting slurry was filtered and washed with water (2x27.5 l). The wet filter cake was dried for 24 hours to obtain 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-4-[(28)-2-methylpiperazin-1yl]-(1M)-1-[4- methyl-2-(propan-2-yl)pyridin-3-yl]pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one (compounds 8, DESBOC).

Стадия 9.Stage 9.

Общее примечание.General note.

Все эквиваленты и объемы указаны относительно Des-BOC.All equivalents and volumes are relative to Des-BOC.

- 60 045330- 60 045330

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes ммоль mmol масса weight объем volume Des-BOS Des-BOS н. д. n. d. 506,56 506.56 1,0 экв. 1.0 eq. 308,4 308.4 156,25 г 156.25 g - - Акрилоилхлор Acryloylchlor 814-68-6 814-68-6 90,51 90.51 1,3 экв. 1.3 eq. 401,0 401.0 36,29 г 36.29 g - - идИ1 ID1 - - NMP N- Метилпирроли донЫ2 NMP N- Methylpyrroles donN2 872-50-4 872-50-4 99,13 99.13 4 об. 4 rev. н. д. n. d. - - 625 мл 625 ml Вода Water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 20 об. 20 rev. н. д. n. d. 3125g 3125g 3125 мл 3125 ml Na2HPO4N3 Na2HPO4N3 7558-79-4 7558-79-4 141,96 141.96 4 экв. 4 eq. 1233,6 1233.6 175,12 г 175.12 g - - Вода Water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 20 об. 20 rev. н. д. n. d. 3125 г 3125 g 3,125 мл 3.125 ml

6-Фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-4-[(2S)-2-метилпиперазин-1-ил]-(1М)-1-[4-метил-2-(пропан-2ил)пиридин-3-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1H)-он (соединение 8, DESBOC) (156,25 г) объединяли с Nметилпирролидоном (625 мл) и перемешивали при температуре окружающей среды. В полученный раствор добавляли акрилоилхлорид (36,29 г; 401,0 ммоль) при поддерж ании внутренней температуры на уровне <30°С. Содержимое перемешивали в течение 2 ч при 25°С. В отдельном реакторе получали раствор гидрофосфата натрия (175,1 г; 1234 ммоль) в деионизированной воде (3,1 л).6-Fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-4-[(2S)-2-methylpiperazin-1-yl]-(1M)-1-[4-methyl-2-(propan-2yl) Pyridin-3-yl]pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one (compound 8, DESBOC) (156.25 g) was combined with Nmethylpyrrolidone (625 ml) and stirred at ambient temperature. Acryloyl chloride (36.29 g, 401.0 mmol) was added to the resulting solution while maintaining the internal temperature at <30°C. The contents were stirred for 2 hours at 25°C. In a separate reactor, a solution of sodium hydrogen phosphate (175.1 g; 1234 mmol) in deionized water (3.1 L) was prepared.

Затем раствор неочищенного продукта переносили в реактор, содержащий раствор гидрофосфата натрия, в течение >2 ч при 25°С. Взвесь нагревали до 45°С в середине добавления и после завершения добавления выдерживали в течение 2 ч при той же температуре. Смесь охлаждали до 25°С и выдерживали в течение 4 ч перед сбором твердых веществ путем вакуумной фильтрации. Твердые вещества дважды промывали водой (по 1,5 л каждый раз) и продукт высушивали в азоте и под вакуумом с получением продукта 6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-(1М)-1-[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]-4-[(2S)-2метил-4-(проп-2-еноил)пиперазин-1-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1H)-она (неочищенное соединение 9). N4The crude product solution was then transferred to a reactor containing sodium hydrogen phosphate solution for >2 hours at 25°C. The slurry was heated to 45°C midway through the addition and, once addition was complete, held for 2 hours at the same temperature. The mixture was cooled to 25°C and held for 4 hours before collecting the solids by vacuum filtration. The solids were washed twice with water (1.5 L each time) and the product was dried under nitrogen and vacuum to give the product 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-(1M)-1-[4- methyl-2-(propan-2-yl)pyridin-3-yl]-4-[(2S)-2methyl-4-(prop-2-enoyl)piperazin-1-yl]pyrido[2,3-d] pyrimidin-2(1H)-one (crude compound 9). N4

Стадия 10.Stage 10.

i. 4:1 этанол/вода (9,4 об.);i. 4:1 ethanol/water (9.4 vol);

1,5 экв. уксусная кислота, нагревание1.5 eq. acetic acid, heating

Окончательная фильтрация . Добавление воды (15,5 об.) . Фильтрация, промывка этанолом/водойFinal filtration. Adding water (15.5 vol). Filtration, ethanol/water washing

Неочищенное соединение 9Crude compound 9

Общее примечание.General note.

Все эквиваленты и объемы указаны относительно неочищенного лекарственного вещества.All equivalents and volumes are relative to the crude drug substance.

- 61 045330- 61 045330

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes ммоль mmol масса weight объем volume Неочищенное соединение 9 Crude compound 9 н. д. n. d. 560,60 560.60 1,0 экв. 1.0 eq. 253,9 253.9 142,33 г 142.33 g - - Этанол (крепость 200) Ethanol (200 proof) 64-17-5 64-17-5 - - 7,5 об. 7.5 rev. - - - - 1067 мл 1067 ml Вода по USP USP water - - 18,02 18.02 1,9 об. 1.9 rev. - - - - 270 мл 270 ml Уксусная кислота Acetic acid 64-19-7 64-19-7 60,05 60.05 1,5 экв. 1.5 eq. 380,8 380.8 22,87 г 22.87 g 21,82 мл 21.82 ml Вода WFI Water WFI - - 18,02 18.02 15,5 об. 15.5 rev. - - - - 2200 мл 2200 ml Этанол (для промывки) Ethanol (for rinsing) 64-17-5 64-17-5 - - 2,5 об. 2.5 rev. - - - - 356 мл 356 ml Вода WFI (для промывки) WFI water (for rinsing) - - - - 5,0 об. 5.0 rev. - - - - 712 мл 712 ml Затравка соединением Seed connection - - 560,60 560.60 0 0 - - 0,3-0,7 г 0.3-0.7 g - - 9N5 9N5

6-Фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-(1М)-1-[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]-4-[(28)-2метил-4-(проп-2-еноил)пиперазин-1-ил]пиридо[2,3-й]пиримидин-2(1Н)-он (неочищенное соединение 9) (142,33 г; 253,9 ммоль) объединяли с этанолом (996 мл) и водой (270 мл). Добавляли уксусную кислоту (21,8 мл; 380,8 ммоль) и смесь нагревали до 75°С для образования раствора, который окончательно фильтровали в чистый реактор. Раствор охлаждали до 45°С, а затем добавляли воду (1067 мл) при поддержании внутренней температуры на уровне >40°С. В раствор вводили затравку в виде исходного соединения 9 и полученную смесь выдерживали в течение 30 мин. Затем добавляли воду (1138 мл) в течение 2 ч. Смесь охлаждали до 25°С и выдерживали в течение 8 ч, после чего собирали твердое вещество путем вакуумной фильтрации и промывали с использованием смеси этанола (355,8 мл) и воды (711,6 мл). Твердое вещество высушивали с использованием вакуума и азота с получением 6-фтор-7-(2-фтор-6гидроксифенил)-(1М)-1-[4-метил-2-(пропан-2-ил)пиридин-3-ил]-4-[(28)-2-метил-4-(проп-2-еноил)пиперазин-1-ил]пиридо[2,3-й]пиримидин-2(1Н)-она (соединение 9).6-Fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-(1M)-1-[4-methyl-2-(propan-2-yl)pyridin-3-yl]-4-[(28)- 2Methyl-4-(prop-2-enoyl)piperazin-1-yl]pyrido[2,3-th]pyrimidin-2(1H)-one (crude 9) (142.33 g, 253.9 mmol) was combined with ethanol (996 ml) and water (270 ml). Acetic acid (21.8 ml; 380.8 mmol) was added and the mixture was heated to 75°C to form a solution, which was finally filtered into a clean reactor. The solution was cooled to 45°C and then water (1067 ml) was added while maintaining the internal temperature at >40°C. The solution was seeded with starting compound 9 and the resulting mixture was kept for 30 min. Water (1138 ml) was then added over 2 hours. The mixture was cooled to 25°C and held for 8 hours, after which the solid was collected by vacuum filtration and washed with a mixture of ethanol (355.8 ml) and water (711, 6 ml). The solid was dried using vacuum and nitrogen to give 6-fluoro-7-(2-fluoro-6hydroxyphenyl)-(1M)-1-[4-methyl-2-(propan-2-yl)pyridin-3-yl] -4-[(28)-2-methyl-4-(prop-2-enoyl)piperazin-1-yl]pyrido[2,3-th]pyrimidin-2(1H)-one (compound 9).

Схема реакции стадии А1 и таблица загрузкиReaction scheme of stage A1 and loading table

i.H-BuLi, диизопропиламинi.H-BuLi, diisopropylamine

И. В(ЕЮ)з —----------------------iii. НС1(водн;)I. V(EY)z —---------------------iii. HC1(aq ; )

3-фторанизол (2-фтор-6-метоксифенил)бороновая кислота3-fluoroanisole (2-fluoro-6-methoxyphenyl)boronic acid

-62045330-62045330

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) MW (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/ volumes мол. they say Масса (г) Weight (G) Объем (л) Volume (l) З-Фторанизол Z-Fluoroanisole 456-49-5 456-49-5 126,13 126.13 1,0 1.0 1,19 1.19 150 150 0,136 0.136 н-Бутиллитий (2,5 М в гексане) n-Butyllithium (2.5 M in hexane) 109-72-8 109-72-8 64,06 64.06 1,5 1.5 1,78 1.78 н. д. n. d. 0,712 0.712 Диизопропилами н Diisopropyls n 108-18-9 108-18-9 101,19 101.19 1,4 1.4 1,66 1.66 168 168 0,233 0.233 Триэтилборат Triethylborate 150-46-9 150-46-9 145,99 145.99 2,0 2.0 2,38 2.38 347,5 347.5 0,405 0.405 тетрагидрофуран tetrahydrofuran 109-99-9 109-99-9 72,11 72.11 12 об. 12 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 1,8 1.8 Хлористоводоро дная кислота (2N) Hydrochloric acid (2N) 7647-01-0 7647-01-0 36,46 36.46 10 об. 10 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 1,5 1.5 Метил-третбутиловый эфир Methyl tert-butyl ether 1634-04-4 1634-04-4 88,15 88.15 12 об. 12 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 1,8 1.8 Г ептан Heptane 142-82-5 142-82-5 100,20 100.20 10,5 об. 10.5 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 1,575 1.575

В реактор А загружали THF (6 об.) и диизопропиламин (1,4 экв.). Полученный раствор охлаждали до -70°С и медленно добавляли н-BuLi (2,5 М в гексане, 1,5 экв.). После завершения добавления медленно добавляли раствор 3-фторанизола (1,0 экв.) в THF (6 об.) и поддерживали при -70°С в течение 5 мин. Медленно добавляли B(EtO)3 (2,0 экв.) и поддерживали при -70°С в течение 10 мин. Реакционную смесь гасили с помощью 2 н. НС1. Погашенную реакционную смесь экстрагировали с помощью МТВЕ (3x4 об.). Объединенные органические фазы концентрировали до суммарных объемов 1,5~3. Гептан добавляли по каплям (7-9 об.), смесь охлаждали до 0-10°С и перемешивали в течение 3 ч. Смесь фильтровали и промывали гептаном (1,5 об.). Твердое вещество высушивали в азоте при <30°С с получением (2-фтор-6метоксифенил)бороновой кислоты.Reactor A was charged with THF (6 vol) and diisopropylamine (1.4 eq). The resulting solution was cooled to -70°C and n-BuLi (2.5 M in hexane, 1.5 eq.) was added slowly. After addition was complete, a solution of 3-fluoroanisole (1.0 eq) in THF (6 vol) was slowly added and maintained at -70°C for 5 minutes. B(EtO) 3 (2.0 eq) was added slowly and maintained at -70°C for 10 min. The reaction mixture was quenched with 2 N. NS1. The quenched reaction mixture was extracted with MTBE (3x4 vol). The combined organic phases were concentrated to a total volume of 1.5~3. Heptane was added dropwise (7-9 vol.), the mixture was cooled to 0-10°C and stirred for 3 hours. The mixture was filtered and washed with heptane (1.5 vol.). The solid was dried under nitrogen at <30°C to give (2-fluoro-6methoxyphenyl)boronic acid.

Схема реакции стадии А2 и таблица загрузки.Reaction scheme for step A2 and loading table.

(2-фтор-6-метоксифенил)бороновая кислота (2-фтор-6Гидроксифенил)бороновая кислота(2-fluoro-6-methoxyphenyl)boronic acid (2-fluoro-6-Hydroxyphenyl)boronic acid

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) MW (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes мол. they say Масса (г) Weight (G) Объем (л) Volume (l) (2-Фтор-6метоксифенил)боронов ая кислота. (2-Fluoro-6methoxyphenyl)boronic acid. 78495- 63-3 78495- 63-3 169,95 169.95 1,0 1.0 0,118 0.118 20 20 н. д. n. d. Трибромид бора Boron tribromide 10294- 33-4 10294- 33-4 250,52 250.52 1,5 1.5 0,177 0.177 44,2 44.2 0,017 0.017 Дихлорметан Dichloromethane 75-09-2 75-09-2 84,93 84.93 4 об. 4 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 0,080 0.080 Вода Water 7732- 18-5 7732- 18-5 18,02 18.02 13 об. 13 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 0,26 0.26 Метил-трет-бутиловый эфир Methyl tert-butyl ether 1634- 04-4 1634- 04-4 88,15 88.15 13 об. 13 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 0,26 0.26 Г ептан Heptane 142-82- 5 142-82- 5 100,20 100.20 10 об. 10 rev. н. д. n. d. н. д. n. d. 0,20 0.20

В реактор А загружали дихлорметан (4 об.) и 2-фтор-6-метокси-4-метилфенилбороновую кислоту (1 экв.). Реакционную смесь охлаждали до -30°С и по каплям добавляли 1,5 ВВг3 (1,5 экв.). По завершении добавления смесь нагревали до 25°C и перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили в ледяной (0-5°С) воде (10 об.). Добавляли МТВЕ (10 об.) и смесь нагревали до 25°С и перемешивали в течение 1-2 ч. или до растворения всех твердых веществ. Водную фазу выделяли и экстрагировали с помощьюReactor A was charged with dichloromethane (4 vol.) and 2-fluoro-6-methoxy-4-methylphenylboronic acid (1 eq.). The reaction mixture was cooled to -30°C and 1.5 VBr 3 (1.5 eq.) was added dropwise. Upon completion of the addition, the mixture was heated to 25°C and stirred for 2 hours. The reaction mixture was quenched in ice-cold (0-5°C) water (10 vol.). MTBE (10 vol) was added and the mixture was heated to 25°C and stirred for 1-2 hours or until all solids had dissolved. The aqueous phase was isolated and extracted using

-63 045330-63 045330

МТВЕ (3 об.). Объединенные органические экстракты промывали водой (3 об.), а затем концентрировали до суммарных объемов 1. В смесь добавляли гептан (10 об.) и перемешивали в течение 2 ч. Полученный продукт выделяли путем фильтрации и высушивали при <30°С с получением (2-фтор-6гидроксифенил)бороновой кислоты.MTBE (3 vol.). The combined organic extracts were washed with water (3 vol) and then concentrated to a total volume of 1. Heptane (10 vol) was added to the mixture and stirred for 2 hours. The resulting product was isolated by filtration and dried at <30°C to obtain ( 2-fluoro-6hydroxyphenyl)boronic acid.

Схема реакции стадии АЗ и таблица загрузки.Reaction diagram of the AZ stage and loading table.

БоронатBoronat

Бороновая кислотаBoronic acid

Материал Material № CAS CAS No. MW (г/моль) M.W. (g/mol) Эквиваленты/ объемы Equivalents/volumes мол. they say Масса (кг) Weight (kg) Объем (л) Volume (l) (2-Фтор-6гидроксифенил) бороновая кислота (2-Fluoro-6hydroxyphenyl)boronic acid 1256345-60-4 1256345-60-4 155,92 155.92 1,0 1.0 89,79 89.79 14,00 14.00 н. д. n. d. Моногидрат лимонной кислоты Citric acid monohydrate 5949-29-1 5949-29-1 210,14 210.14 1,64 1.64 147,26 147.26 30,94 30.94 н. д. n. d. Ацетонитрил Acetonitrile 75-05-8 75-05-8 41,05 41.05 21 об. 21 rev. н. д. n. d. 220,1 220.1 294 294 Фторид калия Potassium fluoride 7789-23-3 7789-23-3 58,10 58.10 4,00 4.00 359,16 359.16 20,87 20.87 н. д. n. d. Вода по USP USP water 7732-18-5 7732-18-5 18,02 18.02 2,0 об. 2.0 rev. н. д. n. d. 28,00 28.00 28,00 28.00 Целит Celite н. д. n. d. н. д. n. d. н. д. n. d. н. д. n. d. 7,00 7.00 н. д. n. d. 2-Пропанол 2-Propanol 67-63-0 67-63-0 60,10 60.10 25 об. 25 rev. н. д. n. d. 275 275 350 350

Стадия АЗ. Фторид калия (21,0 кг; 20,87 моль) объединяли с водой (28 л) в реакторе (реакторе А) и содержимое перемешивали в течение 30 мин. В отдельный реактор (реактор В) загружали (2-фтор-6гидроксифенил)бороновую кислоту (14,00 кг, 89,79 моль), а затем ацетонитрил (206,1 кг) и лимонную кислоту (30,94 кг; 147,26 моль) при 25 С. Содержимое реактора А добавляли в реактор В при 25°С и перемешивали при этой температуре в течение 10 ч. Реакционную смесь фильтровали через слой целита (7,0 кг) и промывали ацетонитрилом (42 кг). Фильтрат объединяли с изопропанолом (56 кг), а затем дистиллировали в вакууме при температуре <35°C, заменяя дистиллированный объем в реакторе изопропанолом, и повторяли при необходимости до завершения замены растворителя с ацетонитрила на изопропанол. Взвесь охлаждали до 15°С и выдерживали в течение 1 ч, затем фильтровали и промывали с помощью 28 кг изопропанола. Остаток на фильтре высушивали с использованием вакуума и азота и упаковывали с получением соединения АЗ.Stage AZ. Potassium fluoride (21.0 kg; 20.87 mol) was combined with water (28 L) in a reactor (reactor A) and the contents were stirred for 30 minutes. A separate reactor (reactor B) was charged with (2-fluoro-6hydroxyphenyl)boronic acid (14.00 kg, 89.79 mol), followed by acetonitrile (206.1 kg) and citric acid (30.94 kg, 147.26 mol) at 25 C. The contents of reactor A were added to reactor B at 25° C. and stirred at this temperature for 10 hours. The reaction mixture was filtered through a pad of celite (7.0 kg) and washed with acetonitrile (42 kg). The filtrate was combined with isopropanol (56 kg) and then distilled in vacuo at <35°C, replacing the distilled volume in the reactor with isopropanol, and repeating as necessary until the solvent change from acetonitrile to isopropanol was completed. The suspension was cooled to 15°C and kept for 1 hour, then filtered and washed with 28 kg of isopropanol. The filter cake was dried using vacuum and nitrogen and packaged to give compound AZ.

Разделение соединения 5 М-диона.Separation of the 5 M-dione compound.

Хроматографическое разделение промежуточного соединения М-диона.Chromatographic separation of the M-dione intermediate.

Использовали ряд хиральных хроматографических методик и способов для выделения М-диона из соединения 4. Методики и неподвижные фазы хорошо известны в уровне техники и описаны в табл. 1.A number of chiral chromatographic techniques and methods were used to isolate the M-dione from compound 4. The techniques and stationary phases are well known in the art and are described in Table. 1.

Соединение 4Connection 4

-64045330-64045330

Таблица 1Table 1

Методика Methodology Неподвижная фаза Stationary phase Подвижная фаза Mobile phase Выходл Output l SFC SFC Chiralpak® AD Chiralpak® AD 40% метанол/60% CO2* 40% methanol/60% CO2* -95% -95% HPLC HPLC Chiralpak® AD Chiralpak® AD 90/10/0,1 этанол/метанол/ триэтиламин 90/10/0.1 ethanol/methanol/triethylamine -94% -94% HPLC HPLC Chiralpak® IG Chiralpak® IG 60/40/0,1 этанол/метанол/ триэтиламин 60/40/0.1 ethanol/methanol/triethylamine -92% -92% Псевдодвижущийся слой (SMB) Pseudo-moving layer (SMB) Chiralpak® IC Chiralpak® IC Ацетонитрил Acetonitrile - 96% - 96%

Л Выход определяют как % доступного М-диона, который был извлечен при необходимой чистоте ее > 98%. L Yield is defined as the % of available M-dione that was recovered at a required purity of >98%.

*Такое выделение проводили несколько раз. Для каждой партии материала подвижная фаза могла быть слегка модифицирована для приспособления к вариациям в партиях. Дополнительные подвижные фазы, используемые для очистки, включали:*This isolation was carried out several times. For each batch of material, the mobile phase could be slightly modified to accommodate batch variations. Additional mobile phases used for purification included:

1) 25/75 метанол/СО2,1) 25/75 methanol/CO 2 ,

2) 30/70 метанол/СО2 и2) 30/70 methanol/CO 2 and

3) 50/50 метанол/СО2.3) 50/50 methanol/ CO2 .

Методики SFC, HPLC и SMB хорошо известны в уровне техники и неподвижные фазы Chiralpak® коммерчески доступны из коммерческих источников, таких как компании Fisher Scientific и Daicel Corporation.SFC, HPLC and SMB techniques are well known in the art and Chiralpak® stationary phases are commercially available from commercial sources such as Fisher Scientific and Daicel Corporation.

Однако требуется разрабатывать более эффективный способ выделения М-диона (соединение 5).However, it is necessary to develop a more efficient method for isolating M-dione (compound 5).

Классическое разделение.Classic division.

Настоящее изобретение направлено на разработку эффективного способа классического разделения для рацемата М/Р-диона (соединение 4).The present invention is directed to the development of an efficient classical separation method for the M/P-dione racemate (compound 4).

В общей сложности проводили 100 экспериментов скрининга сокристаллов и идентифицировали три потенциальных сокристалла диона. На основании соотношения наибольших площадей М/Р-диона в остаточном твердом веществе и соотношения наименьших площадей в супернатанте выбирали (+)-2,3дибензоил-О-винную кислоту (DBTA) в качестве хирального реагента для разделения.A total of 100 cocrystal screening experiments were performed and three potential dione cocrystals were identified. Based on the ratio of the largest areas of M/P-dione in the residual solid and the ratio of the smallest areas in the supernatant, (+)-2,3dibenzoyl-O-tartaric acid (DBTA) was selected as the chiral reagent for separation.

Согласно результатам 100 экспериментов скрининга сокристаллов и еще 20 скринингов растворителей обнаружили, что 2-MeTHF/н-гептан обеспечивает лучший результат разделения, чем другие системы растворителей. На основании результатов растворимости сокристалла М-диона и сокристалла Рдиона в различных соотношениях 2-MeTHF и н-гептана выбирали 2-MeTHF/н-гептан (1,4:1, об./об.) в качестве оптимальной композиции растворителя для разделения.Based on the results of 100 cocrystal screening experiments and another 20 solvent screenings, 2-MeTHF/n-heptane was found to provide better separation results than other solvent systems. Based on the solubility results of M-dione cocrystal and Rdione cocrystal in different ratios of 2-MeTHF and n-heptane, 2-MeTHF/n-heptane (1.4:1, v/v) was selected as the optimal solvent composition for separation.

Чтобы выяснить любое возможное превращение формы в рацемат диона или М/Р-диона во время способа кристаллизации с хиральным разделением, определяли растворимость сокристалла М-диона, сокристалла Р-диона, смеси сокристаллов М+Р-диона (1:1, мас./мас.), рацемат диона и DBTA при различных температурах в 2-MeTHF/H-гептане (1,4:1, об./об.). Для сокристаллов М-диона и сокристаллов Рдиона при различных температурах в течение 7 дней не наблюдали изменения формы. Однако рацемат диона типа С получали после перемешивания сокристаллической смеси М+Р-диона (1:1, мас./мас.) при различных температурах в течение 7 дней. Рацемат диона типа D (20 и 30°С) или рацемат диона типа С (40, 50, 60 и 65°С) наблюдали после перемешивания рацемата диона при соответствующих температурах в течение 7 дней. Растворимость ~ 100 мг/мл наблюдали для DBTA при всех температурах.To investigate any possible conversion of the dione or M/P-dione racemate form during the chiral resolution crystallization process, the solubility of the M-dione cocrystal, P-dione cocrystal, and a mixture of M+P-dione cocrystals (1:1, wt/wt) was determined. wt.), dione racemate and DBTA at various temperatures in 2-MeTHF/H-heptane (1.4:1, v/v). No shape changes were observed for M-dione cocrystals and Rdione cocrystals at different temperatures for 7 days. However, the type C dione racemate was obtained after stirring the M+P-dione cocrystal mixture (1:1, w/w) at different temperatures for 7 days. Type D dione racemate (20 and 30°C) or type C dione racemate (40, 50, 60 and 65°C) were observed after stirring the dione racemate at corresponding temperatures for 7 days. Solubility of ~100 mg/mL was observed for DBTA at all temperatures.

Для дальнейшей оптимизации способа разделения строили тройную фазовую диаграмму сокристалла М/Р-диона на основе результатов равновесной растворимости, а точка эвтектики не была получена вероятно потому, что рацемат типа С мог кристаллизоваться, когда присутствовали сокристалл Мдиона и сокристалл Р-диона. Другую тройную фазовую диаграмму М/Р-диона строили на основе результатов равновесной растворимости, а точка эвтектики не была получена вероятно потому, что рацемат диона типа С или типа D мог кристаллизоваться, когда присутствовали как М-дион, так и Р-дион.To further optimize the separation method, the ternary phase diagram of the M/P-dione cocrystal was constructed based on the equilibrium solubility results, and the eutectic point was not obtained, probably because the type C racemate could crystallize when the Mdione cocrystal and the P-dione cocrystal were present. Another ternary phase diagram of the M/P-dione was constructed based on the equilibrium solubility results, and the eutectic point was not obtained, probably because the racemate of the type C or type D dione could crystallize when both the M-dione and P-dione were present.

Таким образом, идентифицировали хиральный реагент (DBTA) и систему растворителей ((2MeTHF/н-гептан (1,4:1, об./об.)) для разделения рацемата диона. Процесс мелкомасштабной кристаллизации с использованием реагентов разделения и системы растворителей может обеспечить выход Мдиона 39% и чистоту ее 99%. Кроме того, во время скрининговых экспериментов наблюдали и исследовали полиморфизм рацемата диона.Thus, a chiral reagent (DBTA) and a solvent system ((2MeTHF/n-heptane (1.4:1, v/v))) have been identified for the resolution of the dione racemate. A small-scale crystallization process using the resolution reagents and solvent system can achieve The yield of Mdione is 39% and its purity is 99%.In addition, polymorphism of the dione racemate was observed and studied during screening experiments.

Соединения по настоящему изобретению также можно применять в комбинации с фармацевтически активными средствами, которые лечат тошноту. Примеры средств, которые можно применять для лечения тошноты, включают дронабинол, гранисетрон, метоклопрамид, ондансетрон и прохлорпемазин или их фармацевтически приемлемые соли.The compounds of the present invention can also be used in combination with pharmaceutically active agents that treat nausea. Examples of agents that can be used to treat nausea include dronabinol, granisetron, metoclopramide, ondansetron and prochlorpemazine or pharmaceutically acceptable salts thereof.

Соединение по настоящему изобретению также можно применять в комбинации с лучевой терапией, гормональной терапией, хирургией и иммунотерапией, при этом такие виды терапии широко известны специалистам в данной области техники.The compound of the present invention can also be used in combination with radiation therapy, hormonal therapy, surgery and immunotherapy, such therapies being well known to those skilled in the art.

- 65 045330- 65 045330

Поскольку в одном аспекте настоящего изобретения предусмотрено лечение заболевания/состояний с помощью комбинации фармацевтически активных соединений, которые можно вводить раздельно, настоящее изобретение дополнительно относится к объединению отдельных фармацевтических композиций в форме набора. Набор содержит две отдельные фармацевтические композиции: соединение по настоящему изобретению и второе фармацевтическое соединение. Набор содержит контейнер для содержания отдельных композиций, такой как разделенный на части флакон или пакет из фольги, разделенный на части. Дополнительные примеры контейнеров включают шприцы, коробки и мягкие резервуары. Как правило, набор содержит инструкции по применению отдельных компонентов. Форма набора особенно предпочтительна, когда отдельные компоненты предпочтительно вводят в разных лекарственных формах (например, перорально и парентерально), вводят с различными интервалами между введением лекарственного средства, или когда подбор дозы отдельных компонентов комбинации будет назначаться терапевтом или ветеринаром.Since one aspect of the present invention provides for the treatment of disease/conditions with a combination of pharmaceutically active compounds that can be administered separately, the present invention further relates to combining separate pharmaceutical compositions in the form of a kit. The kit contains two separate pharmaceutical compositions: a compound of the present invention and a second pharmaceutical compound. The kit contains a container for containing individual compositions, such as a divided bottle or a divided foil pouch. Additional examples of containers include syringes, boxes, and flexible reservoirs. Typically, the kit contains instructions for using the individual components. The kit form is particularly preferred when the individual components are preferably administered in different dosage forms (eg, orally and parenterally), administered at different dosing intervals, or when dosing of the individual components of the combination will be directed by a physician or veterinarian.

Примером такого набора является так называемая блистерная упаковка. Блистерные упаковки хорошо известны в упаковочной промышленности и широко используются для упаковки фармацевтических стандартных лекарственных форм (таблеток, капсул и т.п.). Блистерные упаковки в основном состоят из листа относительно жесткого материала, покрытого фольгой, предпочтительно из прозрачного пластического материала. В ходе процесса упаковки в пластиковой фольге формируют углубления. Углубления соответствуют размеру и форме таблеток или капсул, подлежащих упаковке. Далее таблетки или капсулы помещают в углубления и листом относительно жесткого материала герметизируют пластиковую фольгу со стороны, противоположной направлению формирования углублений. В результате таблетки или капсулы оказываются герметично запечатанными в углублениях между пластиковой фольгой и листом. Предпочтительно прочность листа является такой, что таблетки или капсулы могут быть извлечены из блистерной упаковки вручную при приложении давления на углубления с образованием отверстия в листе на месте углубления. Далее таблетку или капсулу извлекают через указанное отверстие.An example of such a set is the so-called blister packaging. Blister packs are well known in the packaging industry and are widely used for packaging pharmaceutical unit dosage forms (tablets, capsules, etc.). Blister packs generally consist of a sheet of relatively rigid material covered with foil, preferably a transparent plastic material. During the packaging process, indentations are formed into the plastic foil. The recesses correspond to the size and shape of the tablets or capsules to be packaged. Next, the tablets or capsules are placed in the recesses and a sheet of relatively rigid material is sealed with plastic foil on the side opposite to the direction in which the recesses are formed. As a result, the tablets or capsules are hermetically sealed in the recesses between the plastic foil and the sheet. Preferably, the strength of the sheet is such that the tablets or capsules can be removed from the blister pack by hand by applying pressure to the indentations to form a hole in the sheet at the indentation location. Next, the tablet or capsule is removed through the indicated hole.

Может требоваться обеспечение средства напоминания на наборе, например, в виде цифр рядом с таблетками или капсулами, при этом цифры будут соответствовать дням режима, в которые следует принимать таблетки или капсулы, обозначенные таким образом. Другой пример такого средства напоминания представляет собой календарь, напечатанный на карточке, например, следующим образом: первая неделя, понедельник, вторник, _ и т д. _ вторая неделя, понедельник, вторник, _ и т. д. Другие вариации средств напоминания будут очевидными. Суточная доза может представлять собой одну таблетку или капсулу, или несколько пилюль или капсул для приема в конкретный день. Кроме того, суточная доза соединения по настоящему изобретению может состоять из одной таблетки или капсулы, тогда как суточная доза второго соединения может состоять из нескольких таблеток или капсул, и наоборот. Это должно отображаться в средстве напоминания и способствовать правильному введению активных средств.It may be necessary to provide a means of reminder on the kit, for example in the form of numbers next to the tablets or capsules, the numbers corresponding to the days of the regimen on which the tablets or capsules so marked should be taken. Another example of such a reminder is a calendar printed on a card, for example as follows: first week, Monday, Tuesday, _ etc. _ second week, Monday, Tuesday, _ etc. Other variations of reminders will be obvious . The daily dose may be one tablet or capsule, or several tablets or capsules to be taken on a given day. In addition, a daily dose of a compound of the present invention may consist of one tablet or capsule, while a daily dose of a second compound may consist of several tablets or capsules, and vice versa. This should be displayed in the reminder tool and facilitate the correct administration of active agents.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается диспенсер, сконструированный для отпуска суточных доз во время и в порядке их предусмотренного применения. Предпочтительно диспенсер оборудован средством напоминания, чтобы дополнительно облегчить соблюдение пациентом режима. Примером такого средства напоминания является механический счетчик, который показывает количество отпущенных суточных доз. Другой пример такого средства напоминания представляет собой средство напоминания с питанием от аккумулятора в виде микрочипа, соединенного с жидкокристаллическим экраном или звуковым сигналом напоминания, который, например, считывает дату отпуска предыдущей суточной дозы и/или напоминает о времени приема следующей дозы.In another specific embodiment, the present invention provides a dispenser designed to dispense daily doses during and in the order of their intended use. Preferably, the dispenser is equipped with a reminder to further facilitate patient compliance. An example of such a reminder is a mechanical counter that shows the number of daily doses dispensed. Another example of such a reminder means is a battery-powered reminder means in the form of a microchip coupled to a liquid crystal display or an audible reminder that, for example, reads the dispensing date of the previous daily dose and/or reminds about the time of the next dose.

Соединения по настоящему изобретению и другие фармацевтически активные соединения, при необходимости, могут быть введены пациенту либо перорально, ректально, парентерально (например, внутривенно, внутримышечно или подкожно), интрацистернально, внутривагинально, внутрибрюшинно, интравезикально, местно (например, порошки, мази или капли), либо в качестве буккального или назального спрея. Предусмотрены все способы, которые применяют специалисты в данной области техники для введения фармацевтически активного средства.The compounds of the present invention and other pharmaceutically active compounds, as appropriate, can be administered to a patient either orally, rectally, parenterally (e.g., intravenously, intramuscularly, or subcutaneously), intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, intravesically, topically (e.g., powders, ointments, or drops ), either as a buccal or nasal spray. All methods used by those skilled in the art for administering a pharmaceutically active agent are provided.

Композиции, подходящие для парентеральной инъекции, могут предусматривать физиологически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и стерильные порошки для восстановления в стерильные инъекционные растворы или дисперсии. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или сред-носителей включают воду, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и т.п.), их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.Compositions suitable for parenteral injection may include physiologically acceptable sterile aqueous or non-aqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, and sterile powders for reconstitution into sterile injectable solutions or dispersions. Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers, diluents, solvents or carrier media include water, ethanol, polyols (propylene glycol, polyethylene glycol, glycerin, etc.), suitable mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters , such as ethyl oleate. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants.

Такие композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие средства, эмульгирующие средства и диспергирующие средства. Загрязнение микроорганизмами может быть предупреждено добавлением различных противобактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Кроме того, может быть желательнымSuch compositions may also contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents and dispersing agents. Microbial contamination can be prevented by the addition of various antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, etc. Additionally, it may be desirable

- 66 045330 включение средств для поддержания изотоничности, например, Сахаров, хлорида натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция инъекционных фармацевтических композиций может быть достигнута за счет использования средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.- 66 045330 inclusion of agents to maintain isotonicity, for example, Sugars, sodium chloride, etc. Prolonged absorption of injectable pharmaceutical compositions can be achieved through the use of absorption retardants, such as aluminum monostearate and gelatin.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешано по меньшей мере с одним обычным инертным вспомогательным средством (или носителем), таким как цитрат натрия или гидрофосфат кальция, или (а) наполнителями или сухими разбавителями, такими как виды крахмала, лактоза, сахароза, маннит и кремниевая кислота; (b) связующими средствами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и акациевая камедь; (с) увлажняющими средствами, такими как глицерин; (d) разрыхляющими средствами, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые сложные силикаты и карбонат натрия; (а) средствами, замедляющими растворение, такими как парафин; (f) средствами, ускоряющими абсорбцию, такими как соединения четвертичного аммония; (g) смачивающими средствами, такими как цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (h) адсорбентами, такими как каолин и бентонит; и (i) смазывающими средствами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае капсул и таблеток лекарственная форма может также содержать буферные средства.Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, powders and granules. In such solid dosage forms, the active compound is mixed with at least one conventional inert excipient (or carrier) such as sodium citrate or calcium hydrogen phosphate, or (a) excipients or dry diluents such as starches, lactose, sucrose, mannitol and silicic acid; (b) binders such as carboxymethylcellulose, alginates, gelatin, polyvinylpyrrolidone, sucrose and acacia gum; (c) humectants such as glycerin; (d) disintegrating agents such as agar-agar, calcium carbonate, potato or tapioca starch, alginic acid, certain complex silicates and sodium carbonate; (a) dissolution retardants such as paraffin; (f) absorption accelerating agents such as quaternary ammonium compounds; (g) wetting agents such as cetyl alcohol and glycerol monostearate; (h) adsorbents such as kaolin and bentonite; and (i) lubricants such as talc, calcium stearate, magnesium stearate, solid polyethylene glycols, sodium lauryl sulfate, or mixtures thereof. In the case of capsules and tablets, the dosage form may also contain buffering agents.

Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягких и твердых заполненных желатиновых капсулах с применением таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.Solid compositions of this type can also be used as fillers in soft and hard filled gelatin capsules using excipients such as lactose or milk sugar, as well as high molecular weight polyethylene glycols and the like.

Твердые лекарственные формы, такие как таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы, могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в уровне техники. Они также могут содержать средства, придающие непрозрачность, а также могут представлять собой такие композиции, которые высвобождают активное соединение или соединения в определенной части кишечного тракта замедленным способом. Примерами заливочных композиций, которые могут использоваться, являются полимерные вещества и воски. Активное соединение также может быть в микроинкапсулированной форме, при необходимости, с одним или несколькими описанными выше вспомогательными средствами.Solid dosage forms, such as tablets, dragees, capsules, pills and granules, can be prepared with coatings and coatings, such as enteric coatings and other coatings well known in the art. They may also contain opacifiers and may also be compositions that release the active compound or compounds in a specific part of the intestinal tract in a delayed manner. Examples of potting compositions that can be used are polymeric substances and waxes. The active compound may also be in microencapsulated form, optionally with one or more of the auxiliaries described above.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и настойки. В дополнение к активным соединениям, жидкая лекарственная форма может содержать инертные разбавители, обычно применяемые в уровне техники, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, в частности, хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирной кислоты сорбитана или смеси указанных веществ и т.п.Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups and tinctures. In addition to the active compounds, the liquid dosage form may contain inert diluents commonly used in the art, such as water or other solvents, solubilizing agents and emulsifiers, such as ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol , 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils, in particular cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerin, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene glycols and sorbitan fatty acid esters or mixtures of these substances, etc. .P.

Помимо таких инертных разбавителей, композиция может включать адъюванты, такие как смачивающие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы. Суспензии в дополнение к активному соединению могут содержать суспендирующие средства, как например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант или смеси указанных веществ и т.п.In addition to such inert diluents, the composition may include adjuvants such as wetting agents, emulsifying and suspending agents, sweeteners, flavoring agents and fragrances. Suspensions, in addition to the active compound, may contain suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth or mixtures of these substances and the like.

Композиции для ректального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут быть получены путем смешивания соединений по настоящему изобретению с подходящими нераздражающими вспомогательными веществами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или суппозиторный воск, которые являются твердыми при обычной комнатной температуре, но жидкими при температуре тела и, таким образом, плавятся в прямой кишке или полости влагалища и высвобождают активный компонент.Compositions for rectal administration are preferably suppositories, which can be prepared by mixing the compounds of the present invention with suitable non-irritating excipients or carriers, such as cocoa butter, polyethylene glycol or suppository wax, which are solid at normal room temperature but liquid at body temperature and thus melt in the rectum or vaginal cavity and release the active component.

Лекарственные формы для местного введения соединения по настоящему изобретению включают мази, порошки, спреи и ингаляционные формы. Активное соединение или соединения смешивают в стерильных условиях с физиологически приемлемым носителем и любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут быть необходимы. Глазные составы, глазные мази, порошки и растворы также предусмотрены в объеме настоящего изобретения.Dosage forms for topical administration of a compound of the present invention include ointments, powders, sprays and inhalation forms. The active compound or compounds are mixed under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and any preservatives, buffers or propellants that may be necessary. Ophthalmic compositions, ophthalmic ointments, powders and solutions are also provided within the scope of the present invention.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить пациенту с уровнями доз, находящимися в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 3000 мг в сутки. Для нормального взрослого человека с массой тела приблизительно 70 кг обычно будет достаточной доза в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мг на килограмм массы тела. Конкретная доза и диапазон доз, которые можно применять, зависят от множества факторов, в том числе потребностей пациента, тяжести состояния или заболевания, подлежащего лечению, и фармакологической активности вводимого соединения. Конкретная доза соединения по настоящему изобретению представляет собой дозу, одобренную FDA, если соединение одобрено.The compounds of the present invention can be administered to a patient at dosage levels ranging from about 0.1 to about 3000 mg per day. For a normal adult weighing approximately 70 kg, a dose in the range of about 0.01 to about 100 mg per kilogram of body weight will usually be sufficient. The specific dosage and range of dosages that may be used depend on a variety of factors, including the needs of the patient, the severity of the condition or disease being treated, and the pharmacological activity of the compound administered. The specific dose of a compound of the present invention is the dose approved by the FDA if the compound is approved.

- 67 045330- 67 045330

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтически приемлемых солей, сложных эфиров, амидов или пролекарств. Термин соли относится к неорганическим и органическим солям соединений по настоящему изобретению. Соли могут быть получены in situ в ходе заключительного выделения и очистки соединения или посредством отдельного осуществления реакции очищенного соединения в форме его свободных основания или кислоты с подходящими органическими или неорганическими основанием или кислотой и выделения полученной таким образом соли. Иллюстративные соли включают соли, представляющие собой гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, нитрат, ацетат, оксалат, пальмитат, стеарат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат и лаурилсульфонат и т.п. Соли могут включать соли на основе катионов щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний и т.п., а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, в том числе без ограничения аммония, тетраметиламмония, тетраэтиламмония, метиламина, диметиламина, триметиламина, триэтиламина, этиламина и т.п. См., например, S. M. Berge, et al., Pharmaceutical Salts, J Pharm Sci, 66: 1-19 (1977).The compounds of the present invention can be administered as pharmaceutically acceptable salts, esters, amides or prodrugs. The term salts refers to inorganic and organic salts of the compounds of the present invention. The salts may be prepared in situ during the final isolation and purification of the compound or by separately reacting the purified compound in its free base or acid form with a suitable organic or inorganic base or acid and isolating the salt thus obtained. Exemplary salts include hydrobromide, hydrochloride, sulfate, bisulfate, nitrate, acetate, oxalate, palmitate, stearate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mesylate salts. , glucoheptonate, lactobionate and lauryl sulfonate, etc. Salts may include salts based on alkali and alkaline earth metal cations such as sodium, lithium, potassium, calcium, magnesium and the like, as well as non-toxic ammonium, quaternary ammonium and amine cations, including but not limited to ammonium, tetramethylammonium, tetraethylammonium , methylamine, dimethylamine, trimethylamine, triethylamine, ethylamine, etc. See, for example, S. M. Berge, et al., Pharmaceutical Salts, J Pharm Sci, 66: 1-19 (1977).

Примеры фармацевтически приемлемых сложных эфиров соединения по настоящему изобретению включают С1-С8алкиловые сложные эфиры. Приемлемые сложные эфиры также включают в себя С5С7циклоалкиловые сложные эфиры, а также арилалкиловые сложные эфиры, такие как бензил. Обычно используют С1-С4алкиловые сложные эфиры. Сложные эфиры соединений по настоящему изобретению могут быть получены согласно способам, хорошо известным в уровне техники.Examples of pharmaceutically acceptable esters of the compounds of the present invention include C1- C8 alkyl esters. Suitable esters also include C 5 C 7 cycloalkyl esters as well as arylalkyl esters such as benzyl. Typically C1- C4 alkyl esters are used. The esters of the compounds of the present invention can be prepared according to methods well known in the art.

Примеры фармацевтически приемлемых амидов соединения по настоящему изобретению включают амиды, полученные из аммония, первичные С1-С8алкиламины и вторичные С1-С8диалкиламины. В случае вторичных аминов амин также может иметь форму 5- или 6-членной гетероциклоалкильной группы, содержащей по меньшей мере один атом азота. Обычно используют амиды, полученные из аммония, первичные C1-С3алкиламины и вторичные С1-С2диалкиламины. Амиды соединения по настоящему изобретению могут быть получены согласно способам, хорошо известным специалистам в уровне техники.Examples of pharmaceutically acceptable amides of the compounds of the present invention include amides derived from ammonium, primary C1- C8 alkylamines and secondary C1- C8 dialkylamines. In the case of secondary amines, the amine may also be in the form of a 5- or 6-membered heterocycloalkyl group containing at least one nitrogen atom. Ammonium-derived amides, primary C 1 -C 3 alkylamines and secondary C1-C2 dialkylamines are commonly used. The amides of the compounds of the present invention can be prepared according to methods well known to those skilled in the art.

Термин пролекарство означает соединения, которые преобразуются in vivo с получением соединения согласно настоящему изобретению. Преобразование может происходить с помощью различных механизмов, например, посредством гидролиза в крови. Обсуждение применения пролекарств представлено в Т. Higuchi and W. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S., и в Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.The term prodrug refers to compounds that are converted in vivo to produce a compound of the present invention. Conversion can occur through various mechanisms, for example through hydrolysis in the blood. A discussion of the use of prodrugs is presented in T. Higuchi and W. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S., and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Для иллюстрации, поскольку соединение согласно настоящему изобретению содержит функциональную группу карбоновой кислоты, пролекарство может содержать сложный эфир, образованный путем замены атома водорода кислотной группы группой, такой как (С1-С8алкил, (С2С12)алканоилоксиметил, 1-(алканоилокси)этил, содержащий от 4 до 9 атомов углерода, 1-метил-1(алканоилокси)этил, содержащий от 5 до 10 атомов углерода, алкоксикарбонилоксиметил, содержащий от 3 до 6 атомов углерода, 1-(алкоксикарбонилокси)этил, содержащий от 4 до 7 атомов углерода, 1метил-1-(алкоксикарбонилокси)этил, содержащий от 5 до 8 атомов углерода, N-(алкоксикарбонил)аминометил, содержащий от 3 до 9 атомов углерода, 1-(N-(алкоксикарбонил)аминометил, содержащий от 4 до 10 атомов углерода, 3-фталидил, 4-кротонолактонил, гамма-бутиролактон-4-ил, ди-Ν,Ν(С1-С2)алкиламино(С2-С3)алкил (такой как β-диметиламиноэтил), карбамоил-(С1-С2)алкил, N,N-ди(С1С2)алкилкарбамоил-(С1-С2)алкил и пиперидино-, пирролидино- или морфолино(С2_3)алкил.By way of illustration, since the compound of the present invention contains a carboxylic acid functionality, the prodrug may contain an ester formed by replacing the hydrogen atom of an acidic group with a group such as (C1- C8 alkyl, ( C2C12 )alkanoyloxymethyl, 1-( alkanoyloxy )ethyl containing from 4 to 9 carbon atoms, 1-methyl-1(alkanoyloxy)ethyl containing from 5 to 10 carbon atoms, alkoxycarbonyloxymethyl containing from 3 to 6 carbon atoms, 1-(alkoxycarbonyloxy)ethyl containing from 4 to 7 carbon atoms, 1methyl-1-(alkoxycarbonyloxy)ethyl containing from 5 to 8 carbon atoms, N-(alkoxycarbonyl)aminomethyl containing from 3 to 9 carbon atoms, 1-(N-(alkoxycarbonyl)aminomethyl containing from 4 to 10 carbons, 3-phthalidyl, 4-crotonolactonyl, gamma-butyrolacton-4-yl, di-N,N(C 1 -C 2 )alkylamino(C 2 -C 3 )alkyl (such as β-dimethylaminoethyl), carbamoyl - ( C1- C2 )alkyl, N,N-di( C1C2 )alkylcarbamoyl-( C1 - C2 )alkyl and piperidino-, pyrrolidino- or morpholino( C2_3 )alkyl.

Соединения по настоящему изобретению могут содержать асимметричные или хиральные центры и, следовательно, существовать в различных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединения, а также их смеси, в том числе рацемические смеси, составляют часть настоящего изобретения. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены все геометрические и позиционные изомеры. Например, если соединение содержит двойную связь, предусмотрены как цис-, так и транс-формы (обозначенные как Z и Е, соответственно), а также смеси.The compounds of the present invention may contain asymmetric or chiral centers and, therefore, exist in different stereoisomeric forms. All stereoisomeric forms of the compound, as well as mixtures thereof, including racemic mixtures, are intended to form part of the present invention. In addition, all geometric and positional isomers are contemplated by the present invention. For example, if a compound contains a double bond, both cis and trans forms (denoted Z and E, respectively) as well as mixtures are provided.

Смесь стереоизомеров, такая как диастереомерные смеси, может быть разделена на ее отдельные стереохимические компоненты, исходя из их физико-химических различий, с помощью известных способов, таких как хроматография и/или фракционная кристаллизация. Энантиомеры также могут быть разделены путем превращения энантиомерной смеси в диастереомерную смесь путем осуществления реакции с соответствующим оптически активным соединением (например, спиртом), разделения диастереомеров и превращения (например, в результате гидролиза) отдельных диастереомеров в соответствующие чистые энантиомеры. Также некоторые соединения могут быть атропоизомерами (например, замещенными биарилами).A mixture of stereoisomers, such as diastereomeric mixtures, can be separated into its individual stereochemical components based on their physicochemical differences using known methods such as chromatography and/or fractional crystallization. Enantiomers can also be separated by converting an enantiomeric mixture into a diastereomeric mixture by reacting with an appropriate optically active compound (eg, alcohol), separating the diastereomers, and converting (eg, by hydrolysis) the individual diastereomers into the corresponding pure enantiomers. Also, some compounds may be atropisomers (for example, substituted biaryls).

Соединения по настоящему изобретению могут находиться в несольватированной, а также сольватированной формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода (гидрат), этанол и т.п. В настоящем изобретении предусмотрены и охвачены как сольватированные, так и несольватированные формы.The compounds of the present invention may be in unsolvated as well as solvated forms with pharmaceutically acceptable solvents such as water (hydrate), ethanol, and the like. Both solvated and non-solvated forms are contemplated and covered by the present invention.

Также возможно, что соединения по настоящему изобретению могут находиться в различных таутомерных формах. Предусмотрены все таутомеры соединения по настоящему изобретению. Например,It is also possible that the compounds of the present invention may exist in different tautomeric forms. All tautomers of the compounds of the present invention are provided. For example,

- 68 045330 все таутомерные формы тетразольного фрагмента включены в настоящее изобретение. Кроме того, например, все кето-енольные или имин-енаминные формы соединений включены в настоящее изобретение.- 68 045330 all tautomeric forms of the tetrazole moiety are included in the present invention. In addition, for example, all keto-enol or imine-enamine forms of the compounds are included in the present invention.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что названия и структуры соединений, содержащиеся в данном документе, могут быть основаны на конкретном таутомере соединения. Хотя могут применяться название или структура только для конкретного таутомера, подразумевается, что в настоящем изобретении охвачены все таутомеры, если не указано иное.Those skilled in the art will appreciate that the names and structures of compounds contained herein may be based on the specific tautomer of the compound. Although the name or structure of only a particular tautomer may be used, all tautomers are intended to be covered by the present invention unless otherwise indicated.

Также подразумевается, что в настоящем изобретении охвачены соединения, которые синтезированы in vitro с применением лабораторных методик, таких как широко известные специалистам в области химического синтеза; или синтезированы с применением методик in vivo, например, посредством метаболизма, ферментации, расщепления и т.п. Также предусматривается, что соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы с применением комбинации методик in vitro и in vivo.It is also intended that the present invention cover compounds that are synthesized in vitro using laboratory techniques such as those generally known to those skilled in the art of chemical synthesis; or synthesized using in vivo techniques, for example, through metabolism, fermentation, degradation, and the like. It is also contemplated that the compounds of the present invention can be synthesized using a combination of in vitro and in vivo techniques.

Настоящее изобретение также включает меченные изотопами соединения, идентичные приведенным в данном документе, за исключением того факта, что один или несколько атомов заменены атомом с атомной массой или массовым числом, отличными от атомной массы или массового числа, обычно обнаруженных в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как 2Н, 3Н, 13С, 14С, 15N, 16О, 170,180,31Р, 32Р, 35S, 18F и 36Cl. В одном аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, где один или несколько атомов водорода заменены атомами дейтерия (2Н).The present invention also includes isotopically labeled compounds identical to those provided herein, except for the fact that one or more atoms are replaced by an atom with an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number typically found in nature. Examples of isotopes that may be included in the compounds of the present invention include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, fluorine and chlorine, such as 2H , 3H , 13C, 14C , 15N , 16O , 17 0, 18 0, 31 R, 32 R, 35 S, 18 F and 36 Cl. In one aspect, the present invention relates to compounds where one or more hydrogen atoms are replaced by deuterium atoms ( 2H ).

Соединения по настоящему изобретению, которые содержат вышеупомянутые изотопы и/или другие изотопы других атомов, входят в объем настоящего изобретения. Некоторые меченные изотопами соединения по настоящему изобретению, например, соединения, в которые включены радиоактивные изотопы, такие как 3Н и 14С, применимы для анализов распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Содержащие тритий, т.е. 3Н, углерод-14, т.е. 14С, изотопы особенно предпочтительны вследствие простоты их получения и обнаружения. Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, т.е. 2Н, может предоставлять некоторые терапевтические преимущества, возникающие вследствие более высокой устойчивости к инактивации в процессе метаболизма, например, повышенный период полувыведения in vivo или сниженные требования к дозировке, и, следовательно, могут быть более предпочтительными в некоторых обстоятельствах. Меченные изотопами соединения по настоящему изобретению в основном могут быть получены путем замены немеченного изотопами реагента легко доступным меченным изотопами реагентом.Compounds of the present invention that contain the above-mentioned isotopes and/or other isotopes of other atoms are within the scope of the present invention. Some isotope-labeled compounds of the present invention, for example, compounds into which radioactive isotopes such as 3 H and 14 C are included, are useful for drug and/or substrate tissue distribution assays. Containing tritium, i.e. 3 H, carbon-14, i.e. 14 C isotopes are particularly preferred due to their ease of preparation and detection. In addition, substitution with heavier isotopes such as deuterium, e.g. 2H may provide some therapeutic benefits resulting from greater resistance to inactivation by metabolism, such as increased in vivo half-life or reduced dosage requirements, and may therefore be preferred in some circumstances. The isotopically labeled compounds of the present invention can generally be prepared by replacing the non-isotopically labeled reagent with a readily available isotopically labeled reagent.

Соединения по настоящему изобретению могут существовать в различных твердых состояниях, в том числе кристаллических состояниях и в аморфном состоянии. Различные кристаллические состояния, также называемые полиморфами, и аморфные состояния соединений по настоящему изобретению рассматриваются как часть настоящего изобретения.The compounds of the present invention may exist in a variety of solid states, including crystalline states and an amorphous state. Various crystalline states, also called polymorphs, and amorphous states of the compounds of the present invention are contemplated as part of the present invention.

При синтезе соединений по настоящему изобретению может требоваться использование некоторых уходящих групп. Термин уходящие группы (LG) как правило относится к группам, которые могут быть замещены нуклеофилом. Такие уходящие группы известны в уровне техники. Примеры уходящих групп включают без ограничения галогениды (например, I, Br, F, Cl), сульфонаты (например, мезилат, тозилат), сульфиды (например, SCH3), N-гидроксисукцинимид, N-гидроксибензотриазол и т.п. Примеры нуклеофилов включают без ограничения амины, тиолы, спирты, реактивы Гриньяра, анионные формы (например, алкоксиды, амиды, карбанионы) и т.п.The synthesis of the compounds of the present invention may require the use of certain leaving groups. The term leaving group (LG) generally refers to groups that can be substituted by a nucleophile. Such leaving groups are known in the art. Examples of leaving groups include, but are not limited to, halides (eg, I, Br, F, Cl), sulfonates (eg, mesylate, tosylate), sulfides (eg, SCH 3 ), N-hydroxysuccinimide, N-hydroxybenzotriazole, and the like. Examples of nucleophiles include, but are not limited to, amines, thiols, alcohols, Grignard reagents, anionic forms (eg, alkoxides, amides, carbanions), and the like.

Все патенты, патентные заявки и другие документы, изложенные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.All patents, patent applications and other documents set forth herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Примеры, представленные ниже, иллюстрируют конкретные варианты осуществления настоящего изобретения. Такие примеры предназначены для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема формулы изобретения каким-либо образом.The examples presented below illustrate specific embodiments of the present invention. Such examples are intended to be illustrative and are not intended to limit the scope of the claims in any way.

ПримерыExamples

AMG 510 был разработан как перорально биодоступный ковалентный ингибитор KRASG12C с мощной биохимической и клеточной активностью и высокой эффективностью in vivo. Анализ цистеинового протеома клеток NCI-H358, обработанных AMG 510, показал, что только G12С-содержащий пептид KRAS был ковалентно модифицирован. AMG 510 ингибировал SOS-катализируемый обмен нуклеотидов рекомбинантного мутанта KRASG12C/C118A, но оказывал минимальное влияние на KRASC118A, который является диким типом в положении 12. В клеточных анализах AMG 510 ковалентно модифицировал KRASg12C и ингибировал передачу сигнала KRASG12C, что измеряли по фосфорилированию ERK1/2 во всех тестируемых линиях клеток, мутантных по KRAS p.G12C, но не ингибировал фосфорилирование ERK1/2 в линии клеток с различными другими мутациями KRAS. AMG 510 также селективно ухудшал жизнеспособность линий клеток, мутантных по KRASp.G12C, но не влиял на линии клеток с другими мутациями KRAS. Фармакодинамические анализы in vivo продемонстрировали зависимое от дозы и времени ингибирование передачи сигнала KRASG12C, что измеряли по фосфорилированию ERK1/2 (p-ERK) в ксенотрансплантатах опухолей поджелудочной железы человека (MIA PaCa-2 Т2) и NSCLC (NCI-H358). Ковалентную модификацию KRASG12C с помощью AMG 510 измеряли с помощью масс-спектрометрии и коррелировали с ингибированием p-ERK в опухолях. Исследования временной динамики на несущихAMG 510 was developed as an orally bioavailable covalent KRAS G12C inhibitor with potent biochemical and cellular activity and high in vivo efficacy. Analysis of the cysteine proteome of NCI-H358 cells treated with AMG 510 showed that only the G12C-containing KRAS peptide was covalently modified. AMG 510 inhibited SOS-catalyzed nucleotide exchange of the recombinant KRAS G12C/C118A mutant but had minimal effect on KRAS C118A , which is wild type at position 12. In cell-based assays, AMG 510 covalently modified KRAS g12C and inhibited KRAS G12C signaling, as measured by phosphorylation of ERK1/2 in all KRAS p.G12C mutant cell lines tested, but did not inhibit ERK1/2 phosphorylation in cell lines with various other KRAS mutations. AMG 510 also selectively impaired the viability of KRASp.G12C mutant cell lines but had no effect on cell lines with other KRAS mutations. In vivo pharmacodynamic assays demonstrated dose- and time-dependent inhibition of KRAS G12C signaling as measured by ERK1/2 phosphorylation (p-ERK) in human pancreatic tumor xenografts (MIA PaCa-2 T2) and NSCLC (NCI-H358). Covalent modification of KRAS G12C by AMG 510 was measured by mass spectrometry and correlated with p-ERK inhibition in tumors. Time dynamics studies on carriers

- 69 045330 опухоль мышах показали, что воздействие AMG 510 в плазме крови достигает пикового значения через 0,5 часа после введения дозы, за которым с небольшим отставанием следует ингибирование p-ERK в опухолях. AMG 510 значительно ингибировал рост ксенотрансплантатов MIA PaCa-2 Т2 и NCI-H358 и приводил к регрессии опухоли при более высоких дозах. Обработка линий KRAS p.G12C ковалентными ингибиторами KRASG12C усиливала экспрессию HLA. Комбинированное лечение с помощью AMG 510с ингибиторами других путей клеточной передачи сигнала продемонстрировало синергетические эффекты в отношении жизнеспособности клеток. Комбинированное лечение с помощью AMG 510 со стандартным лечением карбоплатином продемонстрировало усиленное ингибирование роста опухоли NCI-H358 по сравнению с любым отдельным средством. Аналогичным образом, AMG 510 в комбинации с ингибитором MEK приводил к повышенной противоопухолевой эффективности по сравнению с любым отдельным средством.- 69 045330 tumor mice showed that AMG 510 exposure in plasma peaks at 0.5 hours post-dose, followed by p-ERK inhibition in tumors with a slight lag. AMG 510 significantly inhibited the growth of MIA PaCa-2 T2 and NCI-H358 xenografts and resulted in tumor regression at higher doses. Treatment of KRAS p.G12C lines with covalent KRAS G12C inhibitors enhanced HLA expression. Combination treatment with AMG 510 with inhibitors of other cell signaling pathways demonstrated synergistic effects on cell viability. Combination treatment with AMG 510 with standard carboplatin treatment demonstrated enhanced inhibition of NCI-H358 tumor growth compared with either agent alone. Likewise, AMG 510 in combination with a MEK inhibitor resulted in increased antitumor efficacy compared with either agent alone.

Для тестирования влияния ингибирования KRASG12C на иммунный надзор in vivo создавали новую линию сингенных опухолевых клеток, которая подходит для тестирования AMG 510 в комбинации с терапевтическими средствами на основе ингибиторов контрольных точек и, таким образом, охарактеризована in vitro. В заново разработанной модели рака с мутантом KRAS-G12C обработка AMG 510 значительно ингибировала рост опухоли и вызывала регрессию. Поразительно, но комбинация AMG 510 с ингибитором иммунных контрольных точек приводила к заметному повышению общей выживаемости и приводила к длительному излечению. Иммунофенотипирование мышиных опухолей KRAS p.G12C выявило значительное увеличение инфильтрации Т-клеток после обработки, что позволяет предположить, что AMG 510 может индуцировать микроокружение опухоли, более чувствительное к ингибированию иммунных контрольных точек.To test the effect of KRAS G12C inhibition on immune surveillance in vivo, a new syngeneic tumor cell line was generated that is suitable for testing AMG 510 in combination with checkpoint inhibitor therapeutics and has thus been characterized in vitro. In a newly developed KRAS-G12C mutant cancer model, treatment with AMG 510 significantly inhibited tumor growth and induced regression. Strikingly, the combination of AMG 510 with an immune checkpoint inhibitor resulted in a marked improvement in overall survival and resulted in long-term cure. Immunophenotyping of KRAS p.G12C mouse tumors revealed a significant increase in T cell infiltration after treatment, suggesting that AMG 510 may induce a tumor microenvironment more sensitive to immune checkpoint inhibition.

Новая сингенная модель опухоли СТ-26 KRAS p.G12C.New syngeneic tumor model CT-26 KRAS p.G12C.

Мышиные клетки СТ26 (опухоль толстой кишки № 26) были получены в 1975 году путем воздействия на мышей BALB/c N-нитрозо-N-метилуретана (NMU), что привело к быстрорастущей карциноме IV стадии, которая легко имплантируется и быстро метастазирует. Карцинома толстой кишки СТ26, использованная в более чем 500 опубликованных исследованиях, является одной из наиболее часто используемых линий клеток при разработке лекарственных средств. С помощью этих клеток были изучены многочисленные цитотоксические средства, а также терапевтические средства, нацеленные на определенные пути передачи сигнала. Более того, поскольку модель СТ26 на мышах BALB/c обеспечивает сингенную тест-систему in vivo, ее часто используют для разработки и тестирования иммунотерапевтических концепций. ВМС Genomics. 2014 Mar 13; 15:190. doi: 10.1186/1471-2164-15-190. Immunomic, genomic and transcriptomic characterization of CT26 colorectal carcinoma.Murine CT26 cells (colon tumor #26) were generated in 1975 by exposing BALB/c mice to N-nitroso-N-methylurethane (NMU), resulting in a fast-growing stage IV carcinoma that implants easily and metastasizes rapidly. Used in more than 500 published studies, CT26 colon carcinoma is one of the most commonly used cell lines in drug development. Numerous cytotoxic agents, as well as therapeutics targeting specific signal transduction pathways, have been studied using these cells. Moreover, since the BALB/c mouse model of CT26 provides a syngeneic in vivo test system, it is often used to develop and test immunotherapeutic concepts. Navy Genomics. 2014 Mar 13; 15:190. doi:10.1186/1471-2164-15-190. Immunomic, genomic and transcriptomic characterization of CT26 colorectal carcinoma.

Сингенную модель опухоли СТ-26 KRAS p.G12C разрабатывали для проведения комбинированных исследований с линиями клеток и иммунотерапией, как показано в табл. А и на фиг. 3, 4, 5, 6, 18, 24, 31, 34, 38 и 39. Линию сингенных опухолевых клеток СТ-26 выбирали на основании того, что она имеет мутацию KRAS-G12D, присутствующую в родительской линии. Присутствие мутации KRAS-G12D предполагает, что рост и выживаемость линии клеток могут управляться конститутивной передачей сигналов KRAS (G12D) и потенциально могут быть чувствительны в отношении ингибирования KRAS. Клетки СТ-26 KRAS p.G12C получали из линии клеток колоректальной опухоли мыши СТ-26. Использовали технологию CRISPR, описанную в предшествующем уровне техники Liang et al. (Journal of Biotechnology 241 (2017) 136-146), для замены обоих аллелей KRAS p.G12D на KRAS p.G12C с использованием последовательности CTTGTGATGGTTGGAGCTGA (SEQ ID NO: 21). Клон 10 определяли как гомозиготный по аллелю KRAS p.G12C с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) и идентифицировали как СТ-26 KRAS G12C-H10. Эту новую выделенную линию сингенных опухолевых клеток СТ-26 KRAS p.G12C, которая обеспечивает ингибирование передачи сигнала KRAS с помощью AMG 510, использовали для всех исследований СТ-26 G12C in vivo (см. фиг. 3, 4, 5 и 6) и исследований in vitro (см. фиг. 18, 24, 31, 34, 38 и 39).The syngeneic CT-26 KRAS p.G12C tumor model was developed for combination studies with cell lines and immunotherapy, as shown in Table. And in fig. 3, 4, 5, 6, 18, 24, 31, 34, 38 and 39. The syngeneic tumor cell line CT-26 was selected based on the fact that it has the KRAS-G12D mutation present in the parental line. The presence of the KRAS-G12D mutation suggests that the growth and survival of the cell line may be driven by constitutive KRAS (G12D) signaling and could potentially be sensitive to KRAS inhibition. CT-26 KRAS p.G12C cells were obtained from the mouse colorectal tumor cell line CT-26. The CRISPR technology described in the prior art of Liang et al. was used. (Journal of Biotechnology 241 (2017) 136-146), to replace both alleles of KRAS p.G12D with KRAS p.G12C using the sequence CTTGTGATGGTTGGAGCTGA (SEQ ID NO: 21). Clone 10 was determined to be homozygous for the KRAS p.G12C allele by next generation sequencing (NGS) and identified as CT-26 KRAS G12C-H10. This new isolated syngeneic tumor cell line CT-26 KRAS p.G12C, which mediates inhibition of KRAS signaling by AMG 510, was used for all CT-26 G12C in vivo studies (see Figs. 3, 4, 5 and 6) and in vitro studies (see Figs. 18, 24, 31, 34, 38 and 39).

Настоящее изобретение охватывает новую линию выделенных клеток, содержащих два аллеля KRASg12C, и способ получения линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12C, при этом способ включает:The present invention provides a new isolated cell line containing two KRAS g12C alleles and a method for producing a cell line containing two KRAS G12C alleles, the method comprising:

a) инкубирование линии клеток, содержащих два аллеля KRASG12D, с конструкцией CRISPR, которая индуцирует замещение нуклеотида в каждом из двух аллелей KRAS, таким образом образуются два аллеля KRaSg12C; иa) incubating a cell line containing two KRAS G12D alleles with a CRISPR construct that induces a nucleotide substitution in each of the two KRAS alleles, thereby producing two KRaS g12C alleles; And

b) выделение линии клеток, содержащих два аллеля KRAS.b) isolating a cell line containing two KRAS alleles.

Секвенирование следующего поколения (NGS), также известное как высокопроизводительное секвенирование, представляет собой универсальный термин, используемый для описания ряда различных современных технологий секвенирования, включающих секвенирование Illumina (Solexa), секвенирование Roche 454, секвенирование Ion torrent: Proton/PGM, секвенирование SOLiD™.Next-generation sequencing (NGS), also known as high-throughput sequencing, is a catch-all term used to describe a number of different modern sequencing technologies, including Illumina sequencing (Solexa), Roche 454 sequencing, Ion torrent: Proton/PGM sequencing, SOLiD™ sequencing.

В настоящем изобретении использовали платформу Ion Torrent™ Personal Genome Machine™, коммерчески доступную от компании Thermo-Fisher Scientific. Эти новейшие технологии позволяют ученым секвенировать ДНК и РНК намного быстрее и дешевле, чем ранее использовавшееся секвенирование поThe present invention used the Ion Torrent™ Personal Genome Machine™ platform, commercially available from Thermo-Fisher Scientific. These emerging technologies allow scientists to sequence DNA and RNA much faster and cheaper than previously used DNA sequencing.

- 70 045330- 70 045330

Сэнгеру.Sanger.

Исследования комбинации на клетках in vitro.In vitro cell combination studies.

Линии клеток приобретали в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Немецкой коллекции микроорганизмов и культур клеток (DSMZ) и Японской коллекции исследовательских биоресурсов (JCRB). Каждую линию культивировали в рекомендованной для нее питательной среде.Cell lines were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC), the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), and the Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB). Each line was cultivated in the nutrient medium recommended for it.

Для двухкомпонентных комбинаций соединений клетки высевали в 96-луночные или 384-луночные планшеты для культивирования клеток при начальной плотности, варьирующей от 500 до 2500 клеток на лунку.For two-component compound combinations, cells were seeded in 96-well or 384-well cell culture plates at initial densities ranging from 500 to 2500 cells per well.

Спустя от 16 до 24 ч соединения добавляли в планшеты для культивирования в матричном формате, при котором одно средство титровали по оси х, а второе средство - по оси y.After 16 to 24 hours, compounds were added to culture plates in a matrix format in which one agent was titrated along the x-axis and the second agent was titrated along the y-axis.

Для всех комбинаций, тестируемых на любой из представленных линий клеток, начальную высокую концентрацию и коэффициент разбавления каждого соединения выбирали для точного определения максимума кривой, минимума кривой и наклона диапазона доз, выбранных для формата скрининга комбинации. Наборы для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega) использовали для определения количества жизнеспособных клеток.For all combinations tested in any of the cell lines presented, the initial high concentration and dilution factor of each compound were chosen to accurately determine the curve maximum, curve minimum, and slope of the dose range selected for the combination screening format. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kits (Promega) were used to determine the number of viable cells.

Люминесценцию измеряли с помощью многоканального считывающего устройства EnVision® (Perkin Elmer) для каждой линии клеток в нулевой момент времени (V0) до добавления соединений, а также через 72 ч после обработки соединением. Ингибирование роста (GI) рассчитывали по 200балльной шкале в соответствии со следующими уравнениями, где V72 представляло собой люминесценцию контроля DMSO через 72 ч, а Т72 представляло собой люминесценцию обработанного соединением образца, если T72>VO, то GI=100x(1-((T72-V0)/(V72-V0))); если T72<VO, то GI=100x(1-((T72-V0)/V0)). Значения GI, составляющие 0, 100 и 200 представляют неингибированный рост клеток (т.е. кнтроль DMSO), стаз клеток и полное уничтожение клеток соответственно. Сигмоидальные кривые зависимости ответа от дозы строили с использованием 4-параметрической логистической модели. Данные анализировали в отношении синергетических взаимодействий с использованием аналитического программного обеспечения Chalice™ (Zalicus), которое генерировало баллы синергизма на основе модели аддитивности Loewe.Luminescence was measured using an EnVision® multichannel reader (Perkin Elmer) for each cell line at time zero (V0) before addition of compounds, and 72 h after compound treatment. Growth inhibition (GI) was calculated on a 200 point scale according to the following equations, where V72 was the luminescence of the DMSO control at 72 hours and T72 was the luminescence of the compound treated sample, if T72>VO then GI=100x(1-((T72 -V0)/(V72-V0))); if T72<VO, then GI=100x(1-((T72-V0)/V0)). GI values of 0, 100, and 200 represent uninhibited cell growth (ie, DMSO control), cell stasis, and complete cell killing, respectively. Sigmoidal dose response curves were constructed using a 4-parameter logistic model. Data were analyzed for synergistic interactions using Chalice™ analytical software (Zalicus), which generated synergy scores based on the Loewe additivity model.

Ингибирование роста для каждой лунки матрицы рассчитывали, как описано ранее, и данные анализировали на предмет синергетических взаимодействий с использованием аналитического программного обеспечения Chalice™ (Zalicus; Кембридж, Массачусетс) которое генерировало баллы синергизма на основе модели аддитивности Loewe (Lehar, J., et al. (2009). Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity. Nat Biotech 27(7): 659-666) и Rickles, et al. (2012) Adenosine A2A and Beta-2 Adrenergic Receptor Agonists: Novel Selective and Synergistic Multiple Myeloma Targets Discovered through Systematic Combination Screening Mol Cancer Therapeutics 11 (7):1432.Growth inhibition for each matrix well was calculated as previously described, and data were analyzed for synergistic interactions using Chalice™ analytical software (Zalicus; Cambridge, MA) which generated synergy scores based on the Loewe additivity model (Lehar, J., et al (2009) Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity. Nat Biotech 27(7): 659-666) and Rickles, et al. (2012) Adenosine A2A and Beta-2 Adrenergic Receptor Agonists: Novel Selective and Synergistic Multiple Myeloma Targets Discovered through Systematic Combination Screening Mol Cancer Therapeutics 11 (7):1432.

Модель ADD (аддитивности) Loewe (как показано на фиг. 7-37) позволяет количественно оценить эффекты комбинации. Сначала комбинации ранжировали по избытку величины аддитивности, что определяется как величина ADD=ΣCX,CY (Idata-ILoewe), где lLoewe(CX,CY), что представляет собой ингибирование, которое удовлетворяет (CX/ECX)+(CY/ECY)=1, a ECX,Y представляют собой эффективные концентрации при ILoewe для кривых отдельного средства. Также использовали баллы синергизма, где балл синергизма S=logfx logfY ΣIdata(Idata-ILoewe), суммированный для всех пар концентраций, не относящихся к отдельному средству, и где log fX,Y представляет собой натуральный логарифм факторов разбавления, применяемых для каждого отдельного средства. Это позволяет эффективно вычислить объем между измеренной поверхностью и поверхностью аддитивного ответа Loewe, взвешенный по высокой степени ингибирования и откорректированное с учетом различных факторов разбавления. Неопределенность σS вычисляли для каждого балла синергизма на основании измеренных ошибок для значений Idata и распространения стандартной ошибки.Loewe's ADD (additivity) model (as shown in Figure 7-37) allows the effects of a combination to be quantified. First, the combinations were ranked by the excess amount of additivity, which is defined as the value ADD=ΣC X ,C Y (I data -I Loewe ), where lL oe we(C X ,C Y ), which represents the inhibition that satisfies (C X / EC X )+(C Y /EC Y )=1, and EC X , Y are the effective concentrations at Loewe's I for the individual agent curves. Synergy scores were also used, where the synergy score S=logf x logfY ΣI data (I data -I Loewe ) summed for all pairs of concentrations not related to an individual agent, and where log f X , Y is the natural logarithm of the dilution factors used for each individual product. This allows the volume between the measured surface and the Loewe additive response surface to be efficiently calculated, weighted by the high degree of inhibition and corrected for various dilution factors. The uncertainty σ S was calculated for each synergy score based on the measured errors for the Idata values and the standard error propagation.

В примерах показано, что матрицы ингибирования роста (%) содержат консенсусные значения ингибирования роста, вычисленные по данным люминесценции с использованием описанных выше формул; матрицы модели ADD ингибирования роста (%) содержат предсказанные значения ингибирования роста, основанные на модели аддитивности Loewe, которые получены из смоделированных кривых ингибирования роста для отдельного средства; и матрицы избытка величины ADD ингибирования роста (%) содержат значения ингибирования роста в избытке относительно модели аддитивности. Модель аддитивности служит нулевой гипотезой и допускает отсутствие синергетического взаимодействия между двумя средствами. Любая активность, наблюдаемая после вычитания модели ADD из матрицы зависимости ответа ингибирования роста от дозы (=избыток ADD ингибирования роста), является показателем синергизма.The examples show that growth inhibition matrices (%) contain consensus growth inhibition values calculated from luminescence data using the formulas described above; The growth inhibition (%) ADD model matrices contain predicted growth inhibition values based on the Loewe additivity model, which are derived from the simulated growth inhibition curves for an individual agent; and growth inhibition ADD value excess matrices (%) contain growth inhibition values in excess relative to the additivity model. The additivity model serves as the null hypothesis and assumes that there is no synergistic interaction between the two treatments. Any activity observed after subtracting the ADD model from the growth inhibition dose response matrix (=excess growth inhibition ADD) is an indicator of synergy.

В приведенной ниже табл. А показаны специфические in vitro комбинации ингибитора KRASG12C с одним или несколькими дополнительными фармацевтически активными средствами для конкретных типов рака. Данные, полученные и обобщенные на фигурах 7-39, показывают, что комбинации, представленные в таблице А, демонстрируют повышенную противораковую активность по сравнению с ожидаемой, когда отдельные компоненты комбинированной терапии используются по отдельности. СледуетIn the table below. And specific in vitro combinations of a KRASG12C inhibitor with one or more additional pharmaceutically active agents for specific cancer types are indicated. The data obtained and summarized in Figures 7-39 indicate that the combinations presented in Table A demonstrate increased anticancer activity compared to that expected when the individual components of the combination therapy are used alone. Should

- 71 045330 отметить, что величина наблюдаемого терапевтического синергизма может варьировать в зависимости от типа рака, подвергаемого лечению, и используемого средства.- 71 045330 note that the magnitude of the observed therapeutic synergy may vary depending on the type of cancer being treated and the agent used.

Таблица АTable A

EGFRi EGFRi SHP2i SHP2i MEKi MEKi ΡΙ3ΚΪ ΡΙ3ΚΪ AKTi AKTi Ab к EGFR Ab to EGFR AMG 510 Афатин иб AMG 510 Afatin ib AMG 510 Эрлотин иб AMG 510 Erlotin ib AMG 510 Лапатин иб AMG 510 Lapatin ib AMG 510 RMC- 4550 AMG 510 RMC- 4550 AMG 510 Траме тиниб AMG 510 Trame tinib AMG 510 AMG 511 AMG 510 AMG 511 AMG 510 Бупарли сиб AMG 510 Buparli sib AMG 510 AZD5363 AMG 510 AZD5363 AMG 510 Цетук симиб AMG 510 Tsetuk simib NCI-H358 (легкое) NCI-H358 (lung) 22,3 22.3 12,4 12.4 19,7 19.7 25 25 17 17 10,5 10.5 13,5 13.5 4,53 4.53 — — MIA РаСа-2 (поджелу дочная железа) MIA PaCa-2 (pancreas) 4,7 4.7 2,07 2.07 — — 6,36 6.36 3,06 3.06 5,53 5.53 — — 2,67 2.67 — — MIA РаСа-2 3D M.I.A. RaSa-2 3D 2,76 2.76 — — — — — — 7,46 7.46 — — — — — — — — NCIН1373 3D (легкое) NCHIH1373 3D (lung) 8,7* 8.7* — — — — — — 11,8 11.8 — — — — — — — — СТ-26 KRAS p.G12C 3D (толстая кишка мыши) ST-26 KRAS p.G12C 3D (mouse colon) 10,8* 10.8* — — — — 11,7* 11.7* 2,63 2.63 10,8 10.8 — — — — — — SW837 (толстая кишка) SW837 (large intestine) — — — — — — — — — — — — — — — — 2,96 2.96

Нецелевые эффекты при более высоких концентрациях, возможно, способствуют повышению баллов синергизма.Off-target effects at higher concentrations may contribute to higher synergy scores.

Исследования комбинации на ксенотрансплантате опухоли in vivo.In vivo tumor xenograft combination studies.

Исследования на ксенотрансплантате опухоли in vivo проводили в соответствии со следующими общими процедурами.In vivo tumor xenograft studies were performed according to the following general procedures.

Опухолевые клетки культивировали, собирали и подкожно имплантировали в правый бок самок бестимусных голых мышей. По достижении опухолями приблизительно 200 мм3 мышей рандомизировали на группы лечения (n=10/группа) и начинали лечение (в дни, указанные на графиках). Размеры опухолей и массы тела измеряли 2-3 раза в неделю. Объем опухоли измеряли с помощью электронных штангенциркулей, вычисляли как Lx WxH и выражали в мм3. Статистическую значимость наблюдаемых отличий между кривыми роста оценивали с помощью дисперсионного анализа результатов повторных измерений (RMANOVA) данных логарифмически трансформированного объема опухоли со скорректированными по Даннетту множественными сравнениями показателей контрольной группы с группами лечения. В случае исследований комбинации проводили RMANOVA с группой обработки комбинации, сравниваяTumor cells were cultured, harvested, and subcutaneously implanted into the right flank of female athymic nude mice. Once tumors reached approximately 200 mm 3 , mice were randomized into treatment groups (n=10/group) and treatment was started (on the days indicated in the graphs). Tumor size and body weight were measured 2-3 times a week. Tumor volume was measured using electronic calipers, calculated as LxWxH and expressed in mm3 . The statistical significance of observed differences between growth curves was assessed using repeated measures analysis of variance (RMANOVA) on log-transformed tumor volume data with Dunnett's adjusted multiple comparisons between control and treatment groups. For combination studies, an RMANOVA was performed with combination treatment group comparing

- 72 045330 один к одному с каждой группой обработки отдельным средством.- 72 045330 one to one with each treatment group with a separate agent.

Матрица на мембранной подложке BD Matrigel™ представляет собой солюбилизированный препарат на мембранной подложке, экстрагированный из саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).BD Matrigel™ Membrane Supported Matrix is a solubilized membrane supported formulation extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma (BD Biosciences, San Jose, CA).

Все исследования проводили вслепую.All studies were conducted blindly.

На фиг. 3, 4, 5 и 6 антитело к PD-1 мыши (клон 29F.1A12) является коммерчески доступным от компании Bio X Cell, Западный Ливан, Нью-Гэмпшир.In fig. Anti-mouse PD-1 3, 4, 5, and 6 (clone 29F.1A12) is commercially available from Bio X Cell, West Lebanon, NH.

На фиг. 1, 2, 3, 4, 5 и 6 показаны специфические комбинации ингибитора KRASG12C in vivo с одним или несколькими дополнительными фармацевтически активными средствами для конкретных типов рака. Данные, полученные и обобщенные на фигурах, показывают, что комбинации, представленные на фигурах, демонстрируют повышенную противораковую активность по сравнению с ожидаемой, когда отдельные компоненты комбинированной терапии используются по отдельности. Следует отметить, что величина наблюдаемого терапевтического синергизма может варьировать в зависимости от типа рака, подвергаемого лечению, и используемого средства.In fig. 1, 2, 3, 4, 5 and 6 show specific in vivo combinations of a KRAS G12C inhibitor with one or more additional pharmaceutically active agents for specific cancer types. The data obtained and summarized in the figures indicate that the combinations presented in the figures demonstrate increased anticancer activity compared to that expected when the individual components of the combination therapy are used alone. It should be noted that the magnitude of therapeutic synergy observed may vary depending on the type of cancer being treated and the agent used.

На фиг. 4 комбинированная обработка с помощью AMG 510 и антитела к PD1 (клон 29F.1A12) в модели сингенной опухоли CT26-KRASG12C привело к значительному повышению выживаемости и привело к длительному излечению по сравнению с обработкой отдельным средством. Монотерапия AMG 510 или монотерапия антителом к PD1 приводила к замедлению роста опухоли по сравнению с контрольной группой.In fig. 4, combination treatment with AMG 510 and anti-PD1 antibody (clone 29F.1A12) in the CT26-KRAS G12C syngeneic tumor model resulted in significantly improved survival and resulted in durable cure compared with treatment with a single agent. AMG 510 monotherapy or anti-PD1 antibody monotherapy resulted in slower tumor growth compared to the control group.

Каждая обработка с помощью монотерапии приводила к полному ответу 1/10 объекта. Комбинированное лечение с помощью AMG 510+антитело к PD1 приводило к полному ответу 9/10 субъектов. Это считали надежным излечением, и у этих 9 мышей не осталось опухолей после прекращения обработки (день 43) вплоть до дня 57, когда исследование было завершено.Each monotherapy treatment resulted in a complete response in 1/10 of the subjects. Combination treatment with AMG 510+anti-PD1 antibody resulted in a complete response in 9/10 subjects. This was considered a reliable cure, and these 9 mice remained tumor-free after treatment was stopped (day 43) until day 57, when the study was completed.

Повышенные связывание и эффективность AMG 510.Increased binding and efficiency of AMG 510.

Хотя ARS-1620 подтвердил подход прямого ингибирования KRASG12C, идентификация улучшенных ингибиторов, подходящих для клинического тестирования, оказалась сложной. Авторы настоящего изобретения считают, что серьезной проблемой является недостаточная эффективность из-за небольшого объема аллостерического кармана, занятого ARS-1620, что дает ограниченные возможности для дополнительных взаимодействий белок-лиганд. Это было проиллюстрировано рентгеновской кристаллической структурой ковалентного комплекса KRASG12C/ARS-1620 (фиг. 40а), в которой водородная связь между ARS-1620 и гистидином 95 (Н95) заметно выделялась (пунктирная линия). Прорывом стало открытие того, что бороздка на поверхности, образованная альтернативной ориентацией Н95, может быть занята замещенными ароматическими кольцами, что усиливает взаимодействие с KRASG12C. AMG 510 стал лучшим кандидатом в кампании по оптимизации молекул, связывающих бороздки Н95, поскольку он представлял собой сочетание улучшенной эффективности и благоприятных для разработки свойств. Рентгеновская сокристаллическая структура ковалентного комплекса AMG 510-KRASG12C (фиг. 40b) подчеркивает связывание AMG 510 в кармане Р2 KRAS. Изопропил-метилпиридиновый заместитель занимает бороздку между Y96, Н95 и Q99 и входит в непрерывную сеть из 25 ван-дер-ваальсовых контактов лиганд-белок, простирающуюся от остова спирали 2 (Н95, Y96) до остова гибкой петли переключателя II (Е62, Е63).Although ARS-1620 validated the direct KRAS G12C inhibition approach, identifying improved inhibitors suitable for clinical testing has proven difficult. The present inventors believe that a major problem is the lack of efficiency due to the small volume of the allosteric pocket occupied by ARS-1620, which provides limited opportunities for additional protein-ligand interactions. This was illustrated by the X-ray crystal structure of the KRAS G12C /ARS-1620 covalent complex (Figure 40a), in which the hydrogen bond between ARS-1620 and histidine 95 (H95) was prominent (dashed line). A breakthrough was the discovery that the surface groove formed by the alternative orientation of H95 could be occupied by substituted aromatic rings, enhancing the interaction with KRAS G12C . AMG 510 was the top candidate in the H95 groove-binding molecule optimization campaign because it represented a combination of improved potency and development-friendly properties. The X-ray cocrystal structure of the AMG 510-KRAS G12C covalent complex (Fig. 40b) highlights the binding of AMG 510 in the P2 pocket of KRAS. The isopropylmethylpyridine substituent occupies the groove between Y96, H95 and Q99 and is part of a continuous network of 25 van der Waals ligand-protein contacts extending from the backbone of helix 2 (H95, Y96) to the backbone of flexible loop II (E62, E63) .

Чтобы оценить влияние, которое усиленные взаимодействия оказали в отношении эффективности AMG 510, авторы настоящего изобретения использовали два анализа, в которых использовали рекомбинантный GDP-связанный KRASC118A или krasg12C/c118A c дополнительной заменой цистеина на аланин в остатке 118, чтобы избежать реактивности с цистеинами, отличными от С12. В ферментативном анализе обмена нуклеотидов использовали катализируемый SOS1 обмен GDP/GTP для обеспечения связывания RAS-связывающего домена (RBD) c-RAF с обеими версиями KRAS. В 40-минутной реакции AMG 510 демонстрировал в ~10 раз большую эффективность (средняя IC50=0,09 мкМ), чем ARS-1620 (фиг. 40с). AMG 510 заметно не ингибировал KRASC118A (фиг. 40с), а нереакционноспособный аналог AMG 510 имел минимальную активность в этих анализах (фиг. 46а). Кинетические показатели реакции между AMG 510 и GDP-KRASG12C/C118A в условиях кажущегося первого порядка измеряли с помощью массспектрометрии (MS). С помощью нелинейной аппроксимации данных зависимости скорости от концентрации (фиг. 40d) установили максимальную скорость реакции kinact=0,85±0,08 с-1 и концентрацию AMG 510 при полумаксимальной скорости KI=8,6E-05 ± 1,4Е-05 М с получением соотношения kinact/KI 9,8Е+03 ± 1,8Е+03 M’1c’1. Кинетические показатели реакции между AMG 510 и krasg12C/c118A были значительно улучшены по сравнению с ARS-1620. По сравнению с клиническими нацеленными на цистеин ингибиторами киназы AMG 510 характеризовался значительно большей kinact, что согласуется с механизмом индуцированного KRAS катализа, который был ранее описан для ARS-1620. Неспецифическая реактивность AMG 510 с 5 мМ глутатионом была относительно низкой (AMG 510 t1/2=196 мин) и находилась в пределах диапазона клинических ковалентных акриламидов.To evaluate the impact that enhanced interactions had on the efficacy of AMG 510, we used two assays that used recombinant GDP-linked KRAS C118A or kras g12C/c118A with an additional cysteine to alanine substitution at residue 118 to avoid reactivity with cysteines , different from C12. The enzymatic nucleotide exchange assay used SOS1-catalyzed GDP/GTP exchange to mediate binding of the RAS binding domain (RBD) of c-RAF to both versions of KRAS. In a 40-minute reaction, AMG 510 exhibited ~10-fold greater potency (average IC50=0.09 μM) than ARS-1620 (Figure 40c). AMG 510 did not noticeably inhibit KRAS C118A (Fig. 40c), and the non-reactive analogue AMG 510 had minimal activity in these assays (Fig. 46a). The reaction kinetics between AMG 510 and GDP-KRAS G12C/C118A under apparent first order conditions were measured using mass spectrometry (MS). Using a nonlinear approximation of the rate-concentration data (Fig. 40d), the maximum reaction rate kinact = 0.85 ± 0.08 s -1 and the concentration of AMG 510 at half-maximum rate KI = 8.6E-05 ± 1.4E-05 were established M to obtain the ratio kinact/KI 9.8E+03 ± 1.8E+03 M' 1 s' 1 . The reaction kinetics between AMG 510 and kras g12C/c118A were significantly improved compared to ARS-1620. Compared to clinical cysteine-targeted kinase inhibitors, AMG 510 had significantly greater kinact, consistent with the mechanism of KRAS-induced catalysis that was previously described for ARS-1620. The nonspecific reactivity of AMG 510 with 5 mM glutathione was relatively low (AMG 510 t 1/2 =196 min) and within the range of clinical covalent acrylamides.

Ингибирование передачи сигнала и роста опухолевых клеток.Inhibition of signal transduction and tumor cell growth.

Клеточную активность AMG 510 оценивали путем измерения базального фосфорилированияCellular activity of AMG 510 was assessed by measuring basal phosphorylation

- 73 045330- 73 045330

ERK1/2 (p-ERK) и с помощью MS для обнаружения ковалентной конъюгации (т.е. занятости) KRASG12C AMG 510. В двух линиях клеток KRAS p.G12C AMG 510 сильно ингибировал p-ERK (IC50 ~0,02 и 0,03 мкМ соответственно) до почти неопределяемых уровней после 2-часовой обработки и был в 20 раз эффективнее, чем ARS-1620 (фиг. 40е). Это ингибирование точно коррелировало с занятостью KRASG12C AMG 510 с почти максимальными уровнями, достигнутыми в обоих анализах при ~ 0,2 мкМ (фиг. 40f). AMG 510 также сильно снижал жизнеспособность клеток в обеих линиях (IC50 ~ 0,006 мкМ и 0,009 мкМ, ~ в 40 раз сильнее, чем ARS-1620) (фиг. 40g).ERK1/2 (p-ERK) and using MS to detect covalent conjugation (i.e. occupancy) of KRAS G12C AMG 510. In two cell lines, KRAS p.G12C AMG 510 strongly inhibited p-ERK (IC50 ~0.02 and 0.03 µM, respectively) to almost undetectable levels after 2-hour treatment and was 20 times more effective than ARS-1620 (Fig. 40e). This inhibition correlated closely with KRAS G12C occupancy by AMG 510, with near maximal levels achieved in both assays at ~0.2 μM (Figure 40f). AMG 510 also strongly reduced cell viability in both lines (IC50 ~0.006 µM and 0.009 µM, ~40 times stronger than ARS-1620) (Fig. 40g).

Клеточные кинетические показатели AMG 510 в двух линиях клеток KRAS p.G12C определяли с использованием зависимости ингибирования p-ERK от времени и концентрации, что отражает занятость KRASg12C AMG 510. Скорость ингибирования р-ERK увеличивалась с увеличением концентрации AMG 510, при этом насыщение происходило при концентрациях выше 3 мкМ. Аппроксимации по кривой зависимости скорости от концентрации для AMG 510 и ARS-1620 (фиг. 40h и 46b) показывают, что клеточная кинетическая эффективность ингибирования KRASG12C с помощью AMG 510 была в приблизительно 23 раза выше, чем ARS-1620. Максимальная скорость ингибирования фосфорилирования ERK с помощью AMG 510 (8.9Е-04 с-1) в приблизительно 2 раза выше скорости лимитирующего скорость гидролиза GTP-KRASg12C, предложенной в недавней кинетической модели (оцениваемая скорость по ингибированию EGFR=4,2 E-04 с-1; t1/2=27,4 мин). Чтобы обеспечить альтернативную оценку скорости гидролиза GTP с помощью KRASg12C, использовали ингибитор SHP2 для устранения всей восходящей передачи сигнала к KRAS. Этот эксперимент дал скорость клеточного гидролиза GTP 9,4Е-04 с-1, (t1/2=12,2 мин; фиг. 46с), что соответствует скорости, наблюдаемой для AMG 510.Cellular kinetics of AMG 510 in two KRAS p.G12C cell lines were determined using p-ERK inhibition versus time and concentration, which reflects KRAS g12C occupancy by AMG 510. The rate of p-ERK inhibition increased with increasing AMG 510 concentration, and saturation occurred at concentrations above 3 µM. Concentration rate curve fits for AMG 510 and ARS-1620 (FIGS. 40h and 46b) indicate that the cellular kinetic efficiency of KRAS G12C inhibition by AMG 510 was approximately 23-fold higher than ARS-1620. The maximum rate of inhibition of ERK phosphorylation by AMG 510 (8.9E-04 s -1 ) is approximately 2 times the rate of rate-limiting hydrolysis of GTP-KRAS g12C proposed in a recent kinetic model (estimated rate from EGFR inhibition = 4.2 E-04 s -1 ; t1/2=27.4 min). To provide an alternative estimate of the rate of GTP hydrolysis by KRAS g12C , the SHP2 inhibitor was used to eliminate all upstream signaling to KRAS. This experiment gave a cellular GTP hydrolysis rate of 9.4E-04 s -1 (t1/2=12.2 min; Fig. 46c), which is similar to the rate observed for AMG 510.

Для более широкого оценивания воздействия ингибирования KRAS на передачу сигнала две линии клеток обрабатывали несколькими дозами AMG 510 в течение 4 и 24 ч и проводили вестерн-блоттинг для оценивания множественных узлов передачи сигнала (фиг. 41а). Образование ковалентного аддукта AMG 510 с KRASg12C обнаруживали по сдвигу подвижности более медленно мигрирующей полосы KRAS (верхняя стрелка). Этот вид молекулы, характеризующийся сдвигом, накапливался с увеличением времени и дозы и соответствовал последующему ингибированию пути MAPK (т.е. p-MEK1/2 и pERK1/2) в обеих линиях клеток (фиг. 41а, 41b). Ингибирование KRAS с помощью AMG 510 также привело к накоплению активного EGFR (p-EGFR Y1068). Ингибирование фосфорилирования AKT (р-АКТ) было очевидным в одной линии, но снижение фосфорилирования рибосомного белка S6 (p-S6) наблюдали через 24 часа в обеих линиях. Расщепление каспазы-3 также наблюдали через 24 ч, что свидетельствует об индукции апоптоза. В более продолжительном периоде времени обработка с помощью AMG 510 при 0,1 мкМ (рис. 41b) вызвала быстрые (<2 ч) и устойчивые (>24 ч) эффекты в отношении MAPK и EGFR, тогда как p-S6 и расщепление каспазой проявились через 8-16 часов после обработки в обеих линиях.To more broadly evaluate the impact of KRAS inhibition on signal transduction, two cell lines were treated with multiple doses of AMG 510 for 4 and 24 hours and Western blotting was performed to evaluate multiple signal transduction nodes (Fig. 41a). The formation of a covalent adduct of AMG 510 with KRAS g12C was detected by a mobility shift of the slower migrating KRAS band (top arrow). This shift molecule species accumulated with increasing time and dose and corresponded to subsequent inhibition of the MAPK pathway (ie p-MEK1/2 and pERK1/2) in both cell lines (Fig. 41a, 41b). Inhibition of KRAS by AMG 510 also resulted in the accumulation of active EGFR (p-EGFR Y1068). Inhibition of AKT phosphorylation (r-AKT) was evident in one line, but a decrease in ribosomal protein S6 phosphorylation (p-S6) was observed after 24 hours in both lines. Cleavage of caspase-3 was also observed after 24 h, indicating the induction of apoptosis. Over a longer period of time, treatment with AMG 510 at 0.1 µM (Fig. 41b) caused rapid (<2 h) and sustained (>24 h) effects on MAPK and EGFR, while p-S6 and caspase cleavage appeared 8-16 hours after treatment in both lines.

Для оценки активности и селективности AMG 510 профилировали в 22 линиях клеток, несущих либо гетерозиготные, либо гомозиготные мутации KRAS p.G12C или KRAS, отличные от p.G12C, а также линии KRAS дикого типа (WT). 2-часовая обработка с помощью AMG 510 подавляла базисный p-ERK во всех линиях клеток KRAS p.G12C со значениями IC50, варьирующими от 0,010 мкМ до 0,123 мкМ (фиг. 41с и дополнительная табл. 1). AMG 510 не ингибировал p-ERK ни в каких отличных от KRAS p.G12C линиях (IC50>10 мкМ; фиг. 41с и дополнительная табл. 1).To evaluate activity and selectivity, AMG 510 was profiled in 22 cell lines carrying either heterozygous or homozygous KRAS p.G12C or KRAS non-p.G12C mutations, as well as wild-type (WT) KRAS lines. 2-hour treatment with AMG 510 suppressed basal p-ERK in all KRAS p.G12C cell lines with IC 50 values ranging from 0.010 μM to 0.123 μM (Fig. 41c and Supplementary Table 1). AMG 510 did not inhibit p-ERK in any non-KRAS p.G12C lines (IC 50 >10 µM; Fig. 41c and Supplementary Table 1).

В анализах жизнеспособности клеток AMG 510 нарушал рост всех гомозиготных и гетерозиготных линий клеток KRAS p.G12C, кроме SW1573, со значениями IC50, варьирующими от 0,004 мкМ до 0,032 мкМ (фиг. 41d и дополнительная табл. 1). Хотя все линии KRAS p.G12C демонстрировали подобное максимальное ингибирование p-ERK, максимальное влияние в отношении жизнеспособности клеток варьировало. Линии клеток с мутациями KRAS, отличными от p. G12C, или с мутациями в генах, отличных от KRAS, были нечувствительны в отношении AMG 510 (IC50>7,5 мкМ; фиг. 41d и дополнительная табл. 1). Подгруппу линий клеток KRAS p.G12C выбирали для оценки жизнеспособности в условиях низкой адгезии для индуцирования образования сфероидов. Как сообщалось для других ингибиторов KRASG12C, эти условия повышали чувствительность всех тестируемых линий в отношении AMG 510 и приводили к 20кратному увеличению активности и 2,5-кратному увеличению максимального ингибирования (фиг. 41е, фиг. 46d и дополнительная табл. 1). SW1573 оставался минимально чувствительным, возможно, из-за сопутствующей драйверной мутации, Р1КЗСАр.К1 11E.In cell viability assays, AMG 510 impaired the growth of all homozygous and heterozygous KRAS p.G12C cell lines except SW1573, with IC 50 values ranging from 0.004 μM to 0.032 μM (Fig. 41d and Supplementary Table 1). Although all KRAS p.G12C lines showed similar maximal inhibition of p-ERK, the maximal effect on cell viability varied. Cell lines with KRAS mutations other than p. G12C, or with mutations in genes other than KRAS, were insensitive to AMG 510 (IC 50 >7.5 μM; Fig. 41d and Supplementary Table 1). A subset of KRAS p.G12C cell lines was selected to evaluate viability under low adhesion conditions to induce spheroid formation. As reported for other KRAS G12C inhibitors, these conditions increased the sensitivity of all tested lines to AMG 510 and resulted in a 20-fold increase in activity and a 2.5-fold increase in maximum inhibition (Fig. 41e, Fig. 46d and Supplementary Table 1). SW1573 remained minimally sensitive, possibly due to a concomitant driver mutation, P1K3CAr.K1 11E.

Для дополнительного определения селективности ковалентного взаимодействия AMG 510 с KRASg12C и идентифицирования других потенциально нецелевых цистеин-содержащих белков в клетках осуществляли профилирование цистеинового протеома с помощью MS, как описано. После обработки клеток с помощью DMSO или 1 мкМ AMG 510 (>30-кратная IC50 p-ERK) в течение 4 ч обогащали цистеиновый протеом и идентифицировали пептиды. Среди 6451 уникального содержащего цистеин пептида пептид Cys12 из KRASG12C был единственным идентифицированным пептидом, который отвечал критериям ковалентного взаимодействия с мишенью (фиг. 41f).To further determine the selectivity of the covalent interaction of AMG 510 with KRAS g12C and to identify other potentially off-target cysteine-containing proteins in cells, cysteine proteome profiling was performed by MS as described. After treating cells with DMSO or 1 μM AMG 510 (>30-fold IC50 of p-ERK) for 4 h, the cysteine proteome was enriched and peptides were identified. Among the 6451 unique cysteine-containing peptides, the Cys12 peptide from KRAS G12C was the only peptide identified that met the criteria for covalent interaction with the target (Figure 41f).

AMG 510 ингибирует передачу сигнала KRAS in vivo.AMG 510 inhibits KRAS signaling in vivo.

Эффект пероральной обработки AMG 510 в отношении передачи сигнала KRASG12C оценивали с помощью фармакодинамических (PD) анализов, измеряющих р-ERK. В опухолях человека, несущихThe effect of oral treatment with AMG 510 on KRAS G12C signaling was assessed using pharmacodynamic (PD) assays measuring p-ERK. In human tumors carrying

- 74 045330- 74 045330

KRAS p.G12C, AMG 510 ингибировал p-ERK зависимым от дозы образом через 2 ч после обработки (фиг. 42а, b). Ингибирование р-ERK после обработки с помощью AMG 510 (100 мг/кг) варьировало от 69% (MIA PaCa-2 Т2) до 83% (NCI-H358) снижения по сравнению с контролем. Подобные эффекты AMG 510 в отношении уровней p-ERK наблюдали на модели опухоли мыши (фиг. 47а) с использованием сингенной линии СТ-26 KRAS p.G12C, которую создавали с использованием технологии CRISPR. Анализы PD с течением времени продемонстрировали пиковое воздействие AMG 510 на плазму крови и опухоль через 0,5 часа после однократной дозы (10 мг/кг), что привело к максимальному ингибированию р-ERK через 2-4 ч после обработки и к устойчивому значительному ингибированию в течение 48 ч (фиг. 42с, 42d). Это согласуется с относительно продолжительным периодом полувыведения белка KRASG12C от 20 до 24 ч (фиг. 46е).KRAS p.G12C, AMG 510 inhibited p-ERK in a dose-dependent manner 2 hours after treatment (Fig. 42a, b). Inhibition of p-ERK following treatment with AMG 510 (100 mg/kg) ranged from 69% (MIA PaCa-2 T2) to 83% (NCI-H358) reduction compared to control. Similar effects of AMG 510 on p-ERK levels were observed in a mouse tumor model (Fig. 47a) using the syngeneic CT-26 KRAS p.G12C line, which was generated using CRISPR technology. PD time course assays demonstrated peak plasma and tumor effects of AMG 510 at 0.5 hours after a single dose (10 mg/kg), resulting in maximum p-ERK inhibition 2-4 hours after treatment and sustained significant inhibition within 48 hours (Fig. 42c, 42d). This is consistent with the relatively long half-life of the KRAS G12C protein of 20 to 24 hours (Fig. 46e).

Кроме того, в параллельных экспериментах занятость KRASG12C AMG 510 измеряли с помощью MS и она приближалась к 100% при максимальной дозе (100 мг/кг), что коррелирует с максимальной супрессией p-ERK (фиг. 42е и 42f). Исследования временной динамики показали, что частичную занятость AMG 510 обнаруживали через 0,5 ч, а занятость ~ 100% наблюдали через 2 ч (фиг. 42g).Additionally, in parallel experiments, KRAS G12C AMG 510 occupancy was measured by MS and approached 100% at the highest dose (100 mg/kg), which correlates with maximum p-ERK suppression (Figures 42e and 42f). Time course studies showed that partial occupancy of AMG 510 was detected after 0.5 h, and ~100% occupancy was observed after 2 h (Fig. 42g).

Селективное в отношении мутанта ингибирование опухоли in vivo.Mutant-selective tumor inhibition in vivo.

AMG 510 оценивали в отношении его способности ингибировать рост ксенотрансплантатов опухоли человека KRAS p.G12C и KRAS p.G12V (SW480-1AC) у мышей. AMG 510 значительно ингибировал рост опухолей MIA PaCa-2 Т2 и NCI-H358 при всех уровнях доз, при этом регрессию опухоли наблюдали при более высоких дозах (фиг. 43а, 43b). Напротив, обработка с помощью AMG 510 не влияла на рост опухоли KRAS p.G12V (фиг. 47b). Уровни AMG 510 в плазме крови были сопоставимыми во всех моделях (данные не показаны). В мышиной модели опухоли СТ-26 KRAS p.G12C, выращенной на иммунокомпетентных мышах, AMG 510 приводил к ингибированию роста и регрессии опухоли при максимальной дозе (фиг. 43с). У двух из 10 мышей (в получающей 100 мг/кг группе) не обнаруживали опухоли, когда исследование было прекращено в день 29. AMG 510 также значительно ингибировал рост человеческих полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX), мутантных по KRAS p. G12C, у мышей (фиг. 43d и 47с).AMG 510 was evaluated for its ability to inhibit the growth of KRAS p.G12C and KRAS p.G12V (SW480-1AC) human tumor xenografts in mice. AMG 510 significantly inhibited the growth of MIA PaCa-2 T2 and NCI-H358 tumors at all dose levels, with tumor regression observed at higher doses (Fig. 43a, 43b). In contrast, treatment with AMG 510 had no effect on KRAS p.G12V tumor growth (Fig. 47b). Plasma levels of AMG 510 were comparable in all models (data not shown). In the CT-26 KRAS p.G12C mouse tumor model grown in immunocompetent mice, AMG 510 resulted in tumor growth inhibition and tumor regression at the highest dose (Fig. 43c). Two of 10 mice (in the 100 mg/kg group) were tumor free when the study was stopped on day 29. AMG 510 also significantly inhibited the growth of human KRAS p mutant patient-derived xenografts (PDX). G12C, in mice (Figs. 43d and 47c).

Доказательства клинической активности.Evidence of clinical activity.

Повышенная активность, высокая эффективность и благоприятный фармацевтический профиль AMG 510 обеспечили выбор его в качестве первого ингибитора KRASG12C для участия в клинических испытаниях (Clinical trials.gov NCT03600883). Примечательно, что в первых двух когортах пациентов обработка с помощью AMG 510 привела к объективным частичным ответам (согласно RECIST 1.1) у двух пациентов с NSCLC KRAS p.G12C (фиг. 43е и 47d). Оба пациента прогрессировали на нескольких предшествующих системных курсах лечения, включающих карбоплатин, пеметрексед и ниволумаб, с документированным прогрессированием заболевания. Первый пациент демонстрировал уменьшение опухоли на 34% через 6 недель лечения с помощью AMG 510. Второй респондент показал уменьшение опухоли на 67% всего через 2 недели лечения с помощью AMG 510. Эти пациенты продолжали лечение с помощью AMG 510 через 6 месяцев и 2 месяца соответственно (на момент даты подачи настоящей предварительной заявки на патент в США). Нежелательные явления не регистрировали. Эти пациенты стали первыми, кто отвечал на специфический в отношении мутанта ингибитор KRAS, что стало важной вехой для пациентов с опухолями, мутантными по KRAS p.G12C.The enhanced activity, high efficacy and favorable pharmaceutical profile of AMG 510 led to its selection as the first KRAS G12C inhibitor to enter clinical trials (Clinical trials.gov NCT03600883). Notably, in the first two patient cohorts, treatment with AMG 510 resulted in objective partial responses (as measured by RECIST 1.1) in two patients with NSCLC KRAS p.G12C (Figures 43e and 47d). Both patients had progressed on multiple prior systemic treatments, including carboplatin, pemetrexed, and nivolumab, with documented disease progression. The first responder demonstrated a 34% tumor reduction after 6 weeks of treatment with AMG 510. The second responder showed a 67% tumor reduction after just 2 weeks of treatment with AMG 510. These patients continued treatment with AMG 510 after 6 months and 2 months respectively (as of the filing date of this US provisional patent application). No adverse events were recorded. These patients were the first to respond to a mutant-specific KRAS inhibitor, marking an important milestone for patients with KRAS p.G12C mutant tumors.

Повышенная эффективность в комбинации.Increased efficiency in combination.

Учитывая высокую распространенность KRAS p.G12C при аденокарциноме легкого на модели NCIH358 исследовали комбинированное лечение с помощью AMG 510 с карбоплатином, стандартным химиотерапевтическим средством для лечения рака легкого. Лечение любым отдельным средством (AMG 510 или карбоплатином) приводило к значительному ингибированию роста опухоли (фиг. 44а). Однако комбинированное лечение при различных дозах привело к значительному повышению противоопухолевой эффективности (фиг. 44а и 47е). Насколько известно авторам настоящего изобретения это первая демонстрация повышенной эффективности от комбинации селективного в отношении мутанта ингибитора KRAS с химиотерапевтическим средством, что обеспечивает обоснование такого подхода в клинике.Given the high prevalence of KRAS p.G12C in lung adenocarcinoma, combination treatment with AMG 510 with carboplatin, a standard chemotherapeutic agent for the treatment of lung cancer, was investigated in the NCIH358 model. Treatment with either individual agent (AMG 510 or carboplatin) resulted in significant inhibition of tumor growth (Fig. 44a). However, combination treatment at different doses resulted in a significant increase in antitumor efficacy (Figs. 44a and 47e). To our knowledge, this is the first demonstration of increased efficacy from the combination of a mutant-selective KRAS inhibitor with a chemotherapeutic agent, providing clinical rationale for this approach.

Клинически подтвержденная стратегия комбинирования ингибиторов BRAF и MEK предполагает, что комбинации с AMG 510 и другими ингибиторами сигнальных путей MAPK (и АКТ) могут усиливать уничтожение опухолевых клеток и преодолевать устойчивость26. Поэтому эксперименты с комбинацией in vitro проводили на нескольких линиях клеток KRAS p.G12C с матрицами AMG 510 и ингибиторами киназ HER, EGFR, SHP2, PI3K, AKT и MEK (фиг. 48). Как показывает индуцирование p-EGFR с помощью AMG 510 (фиг. 41а), комбинация AMG 510 с несколькими средствами приводила к синергетическому уничтожению опухолевых клеток в NCI-H358 (фиг. 44b и 48). Синергизм был более ограниченным в других линиях, но комбинация с MEKi была синергетической во многих условиях и усиливалась в условиях сфероидного роста (фиг. 44b). Значительно повышенная противоопухолевая активность также наблюдалась in vivo с минимально эффективной дозой AMG 510 в комбинации с MEKi по сравнению с любым одним отдельным средством (фиг. 44с). Вместе эти данные подтверждают вызывающий интерес клинический подход комбинирования AMG 510 со средствами, нацеленными на другие узлы путиA clinically validated strategy of combining BRAF and MEK inhibitors suggests that combinations with AMG 510 and other MAPK (and AKT) signaling pathway inhibitors may enhance tumor cell killing and overcome resistance 26 . Therefore, in vitro combination experiments were performed on several KRAS p.G12C cell lines with AMG 510 matrices and inhibitors of HER, EGFR, SHP2, PI3K, AKT and MEK kinases (Fig. 48). As shown by the induction of p-EGFR by AMG 510 (Fig. 41a), the combination of AMG 510 with several agents resulted in synergistic killing of tumor cells in NCI-H358 (Fig. 44b and 48). Synergy was more limited in other lines, but the combination with MEKi was synergistic under many conditions and enhanced under spheroid growth conditions (Figure 44b). Significantly increased antitumor activity was also observed in vivo with the minimum effective dose of AMG 510 in combination with MEKi compared to any single agent (Fig. 44c). Together, these data support an exciting clinical approach of combining AMG 510 with agents targeting other pathway nodes

- 75 045330- 75 045330

МАРК, для подавления остаточной или обходной передачи сигнала, которые могут ограничивать эффективность или вызывать устойчивость.MAPK, to suppress residual or bypass signaling that may limit effectiveness or cause persistence.

Провоспалительное микроокружение опухоли.Proinflammatory tumor microenvironment.

Блокада оси иммунных контрольных точек программируемой клеточной смерти 1/лиганда программируемой смерти 1 (PD-1/PD-L1) клинически подтверждена и одобрена для некоторых онкологических пациентов. Активность терапии AMG 510 в комбинации с антителом к PD-1 оценивали в иммунокомпетентных условиях на модели СТ-26 KRAS p.G12C. Эта линия зависит от аллеля KRAS p.G12C (фиг. 49а, b) и была чувствительна в отношении AMG 510 (фиг. 43с и 47а). Как показано ранее (фиг. 43с), AMG 510 приводил к регрессии опухоли в качестве единственного средства (фиг. 45а). Однако с течением времени только 1 из 10 опухолей оставалась полностью регрессивной (фиг. 45а). Монотерапия антителом к PD-1 приводила к замедленному росту опухоли и только 1 из 10 опухолей проявляла полную регрессию. Поразительно, что комбинированное лечение привело к полному ответу у 9 из 10 пациентов (фиг. 45а). Лечение прекращали через 43 дня и за мышами продолжали наблюдение в течение еще 112 дней. У всех пациентов с полным ответом на комбинированное лечение по-прежнему не было выявляемых опухолей, что указывает на то, что комбинация AMG 510 с антителом к PD-1 приводит к длительному излечению. При использовании суррогатной конечной точки выживаемости (объем опухоли> 800 мм3), комбинированное лечение приводило к заметному увеличению выживаемости по сравнению с видами монотерапии (фиг. 45b).Blockade of the programmed cell death 1/programmed death ligand 1 (PD-1/PD-L1) immune checkpoint axis has been clinically validated and approved for select cancer patients. The activity of AMG 510 therapy in combination with an anti-PD-1 antibody was assessed in immunocompetent conditions using the CT-26 KRAS p.G12C model. This line is dependent on the KRAS p.G12C allele (Fig. 49a, b) and was sensitive to AMG 510 (Fig. 43c and 47a). As shown previously (Fig. 43c), AMG 510 resulted in tumor regression as a single agent (Fig. 45a). However, over time, only 1 out of 10 tumors remained completely regressive (Fig. 45a). Monotherapy with anti-PD-1 antibody resulted in delayed tumor growth and only 1 in 10 tumors showed complete regression. Strikingly, the combination treatment resulted in a complete response in 9 out of 10 patients (Fig. 45a). Treatment was stopped after 43 days and the mice continued to be monitored for an additional 112 days. All patients with a complete response to the combination treatment remained free of detectable tumors, indicating that the combination of AMG 510 with an anti-PD-1 antibody results in a durable cure. When using a surrogate endpoint of survival (tumor volume >800 mm 3 ), combination treatment resulted in a marked increase in survival compared with monotherapies (Fig. 45b).

Чтобы понять эффекты лечения в отношении композиции иммунных клеток в опухолях, опухоли СТ-26 KRAS p.G12C иммунофенотипировали после лечения. Через 4 дней лечения AMG 510 приводил к заметному увеличению инфильтрации Т-клеток, в первую очередь CD8+ Т-клеток (фиг. 45с и 50а). Повышенную инфильтрацию CD8+Т-клеток также наблюдали в получающей комбинацию группе, в первую очередь за счет AMG 510, поскольку этого не происходило после монотерапии антителома к PD-1. В качестве дополнительного компаратора ингибитор MEK (MEKi), который блокировал передачу сигналов MAPK ниже RAS (фиг. 50b) и приводил к подобному ингибированию роста опухоли СТ-26 KRAS p.G12C, как и AMG 510 (фиг. 50с, 50d), не влияет на количество инфильтрирующихся CD8+ Т-клеток (фиг. 45с). Обработка с помощью AMG 510 также приводила к повышенной инфильтрации макрофагов и дендритных клеток, чего не наблюдали с MEKi (фиг. 45с). Экспрессия PD-1 на CD8+ Т-клетках умеренно увеличивалась посредством как AMG 510, так и MEKi (фиг. 44а). РНК цельной опухоли очищали после обработки и оценивали профили транскрипции на панели иммунных генов. Всего через 2 дня лечения ингибирование KRASG12C с помощью AMG 510 индуцировало провоспалительное микроокружение, характеризующееся повышенной передачей сигнала интерферона, процессингом антигена, цитотоксической активностью и активностью NK-клеток, а также маркерами стимуляции врожденного иммунитета, которые были значительно выше по сравнению с эффектами, индуцированными ингибированием MEK (фиг. 45d и 44е). AMG 510 также индуцировал экспрессию белков MHC-I на опухолевых клетках СТ-26 KRAS p.G12C (фиг. 45е и 50f). Эти данные предполагают, что лечебные эффекты AMG 510 в отношении опухолевых клеток могут приводить к усилению Т-клеточного примирования и распознавания антигена. Для тестирования этого, вылеченным мышам после комбинированного лечения (фиг. 45а) повторно вводили двусторонние опухоли СТ-26 KRAS p.G12C и родительские СТ-26 (KRAS p.G12D) или СТ-26 KRAS p.G12C, а также неродственную модель опухоли молочной железы мыши 4Т1. Все опухоли 4Т1 (4/4) выросли, но ни одна (0/8) из опухолей СТ-26 KRAS p.G12C не установилась (фиг. 45f). Примечательно, что все мыши, получавшие родительские опухоли СТ-26, не имели опухолей через 40 дней (фиг. 45f). В отдельной контрольной группе наивных мышей выросли 15 из 15 (100% случаев) родительских опухолей СТ-26 и СТ-26 KRAS p.G12C (фиг. 50g). Спленоциты, собранные у вылеченных мышей, стимулировали либо опухолевыми клетками СТ-26, СТ-26 KRAS p.G12C, либо 4Т1, и уровни секретируемого IFN-γ измеряли в качестве маркера опухолеспецифического примирования и активности Т-клеток. Клетки СТ-26 KRAS p.G12C и родительские клетки СТ-26 вызывали ~ 3-кратное увеличение IFN-γ, которое не индуцировалось клетками 4Т1 (фиг. 45g).To understand the effects of treatment on immune cell composition in tumors, CT-26 KRAS p.G12C tumors were immunophenotyped after treatment. After 4 days of treatment, AMG 510 resulted in a marked increase in T cell infiltration, primarily CD8+ T cells (Figures 45c and 50a). Increased CD8+ T cell infiltration was also observed in the combination group, primarily due to AMG 510, as this did not occur after anti-PD-1 monotherapy. As an additional comparator, the MEK inhibitor (MEKi), which blocked MAPK signaling downstream of RAS (Fig. 50b) and resulted in similar inhibition of CT-26 KRAS p.G12C tumor growth as AMG 510 (Fig. 50c, 50d), did not influences the number of infiltrating CD8+ T cells (Fig. 45c). Treatment with AMG 510 also resulted in increased macrophage and dendritic cell infiltration, which was not observed with MEKi (Fig. 45c). PD-1 expression on CD8+ T cells was moderately increased by both AMG 510 and MEKi (Fig. 44a). Whole tumor RNA was purified after treatment and transcriptional profiles were assessed on a panel of immune genes. After just 2 days of treatment, inhibition of KRAS G12C with AMG 510 induced a pro-inflammatory microenvironment characterized by increased interferon signaling, antigen processing, cytotoxic and NK cell activity, and markers of innate immune stimulation that were significantly higher compared to the effects induced by inhibition of MEK (Figs. 45d and 44e). AMG 510 also induced the expression of MHC-I proteins on CT-26 KRAS p.G12C tumor cells (Figs. 45e and 50f). These data suggest that the therapeutic effects of AMG 510 on tumor cells may result in enhanced T cell priming and antigen recognition. To test this, cured mice from combination treatment (Fig. 45a) were reinjected with bilateral CT-26 KRAS p.G12C and parental CT-26 (KRAS p.G12D) or CT-26 KRAS p.G12C tumors, as well as an unrelated tumor model 4T1 mouse mammary gland. All 4T1 tumors (4/4) grew, but none (0/8) of the CT-26 KRAS p.G12C tumors established (Fig. 45f). Notably, all mice treated with parental CT-26 tumors were tumor-free after 40 days (Figure 45f). In a separate control group of naïve mice, 15 of 15 (100% of cases) parental CT-26 and CT-26 KRAS p.G12C tumors grew (Fig. 50g). Splenocytes collected from cured mice were stimulated with either CT-26, CT-26 KRAS p.G12C, or 4T1 tumor cells, and levels of secreted IFN-γ were measured as a marker of tumor-specific priming and T cell activity. CT-26 KRAS p.G12C cells and parental CT-26 cells induced a ~3-fold increase in IFN-γ that was not induced by 4T1 cells (Figure 45g).

ОбсуждениеDiscussion

Открытие нового взаимодействия с бороздкой Н95 KRASG12C позволило заметно повысить эффективность и идентифицировать AMG 510, первый в своем классе пероральный ингибитор KRASG12C с доказательствами клинической активности у пациентов. AMG 510 селективно нацеливается на опухоли KRAS p.G12C и комбинируется с цитотоксическими и нацеливаемыми средствами для синергетического уничтожения опухолевых клеток. Гибель опухолевых клеток, индуцированная AMG 510, приводила к воспаленному микроокружению опухоли, которое в высокой степени реагировало на ингибирование иммунных контрольных точек. Комбинированное лечение с помощью антитела к PD-1 и MEKi продемонстрировало убедительную доклиническую эффективность в нескольких отчетах, и это было связано с повышенной Т-клеточной инфильтрацией. В настоящем исследовании инфильтрация иммунных клеток после селективного ингибирования KRASG12C была значительно более устойчивой, чем инфильтрация, индуцированная MEKi. В отличие от описанных эффектов неселективных в отношении опухоли MEKi, которые блокируют размножение и примирование Т-клеток, селективное ингибирование KRASG12C с по- 76 045330 мощью AMG 510 приводило к усиленному примированию Т-клеток. Эти данные подтверждают модель улучшенного распознавания антигена и Т-клеток памяти, в которой индуцированная AMG 510 гибель опухолевых клеток в комбинации с обработкой антителом к PD-1 приводит к адаптивному иммунному ответу, так что опухоли, не относящиеся к p.G12C, распознаются и уничтожаются. Существуют достаточные доказательства того, что статус внутриопухолевой мутации KRAS может быть гетерогенным как в пределах одной опухоли, так и между первичными и метастатическими участками. Взятые вместе, данные по настоящему изобретению позволяют предположить, что AMG 510 может быть эффективным противоопухолевым средством даже в условиях, когда экспрессия KRASG12C является гетерогенной.The discovery of a novel interaction with the H95 groove of KRAS G12C has led to a marked increase in potency and the identification of AMG 510, a first-in-class oral KRAS G12C inhibitor with evidence of clinical activity in patients. AMG 510 selectively targets KRAS p.G12C tumors and is combined with cytotoxic and targeted agents to synergistically kill tumor cells. Tumor cell death induced by AMG 510 resulted in an inflamed tumor microenvironment that was highly responsive to immune checkpoint inhibition. Combination treatment with anti-PD-1 antibody and MEKi demonstrated compelling preclinical efficacy in several reports and was associated with increased T-cell infiltration. In the present study, immune cell infiltration following selective inhibition of KRAS G12C was significantly more robust than MEKi-induced infiltration. In contrast to the reported effects of nontumor-selective MEKi, which block T cell expansion and priming, selective inhibition of KRAS G12C with AMG 510 resulted in enhanced T cell priming. These data support a model of enhanced antigen recognition and memory T cells in which AMG 510-induced tumor cell death in combination with anti-PD-1 antibody treatment results in an adaptive immune response such that non-p.G12C tumors are recognized and eliminated . There is sufficient evidence that intratumoral KRAS mutation status can be heterogeneous both within the same tumor and between primary and metastatic sites. Taken together, the data of the present invention suggest that AMG 510 may be an effective antitumor agent even in conditions where KRAS G12C expression is heterogeneous.

СпособыMethods

Рекомбинантные белки.Recombinant proteins.

Рекомбинантный His-меченный krasg12C/c118A человека (1-169), c-RAF GST человека (1-149) и Hisмеченный KRASC118A человека (1-169) были экспрессированы в Escherichia coli и очищены с использованием аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Рекомбинантный His-меченный SOS1 человека (564-1049, оптимизированный по кодонам насекомого) был экспрессирован в Trichoplucia ni и очищен с использованием аффинной хроматографии; после удаления His-метки он был дополнительно очищен с помощью эксклюзионной хроматографии. Конструкцию мутанта с заменой цистеина в легкой цепи использовали для исследований сокристаллизации на основании работы Ostrem et al. Рекомбинантный His-меченый krasg12C/c15S/C80l/c118S человека (1-169) был экспрессирован в Е. coli и очищен с использованием аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии с удалением His-метки для кристаллизации.Recombinant His-tagged human kras g12C/c118A (1-169), human c-RAF GST (1-149), and His-tagged human KRAS C118A (1-169) were expressed in Escherichia coli and purified using affinity chromatography and size exclusion chromatography. Recombinant His-tagged human SOS1 (564-1049, insect codon optimized) was expressed in Trichoplucia ni and purified using affinity chromatography; after removal of the His tag, it was further purified by size exclusion chromatography. A light chain cysteine substitution mutant construct was used for cocrystallization studies based on the work of Ostrem et al. Recombinant His-tagged human kras g12C/c15S/C80l/c118S (1-169) was expressed in E. coli and purified using affinity chromatography, ion exchange chromatography, and size exclusion chromatography to remove the His tag for crystallization.

Соединения и антитела.Compounds and antibodies.

ARS-1620, PD-0325901, траметиниб, афатиниб, эрлотиниб, RMC-4550 и AZD5363 получали из коммерческих источников. AMG 511 синтезировали самостоятельно. Синтез AMG 510 и его нереакционноспособного пропионамида описан в данном документе. Исходные растворы AMG 510 и всех других ингибиторов, используемых для экспериментов in vitro, получали в виде 10 мМ растворов в 100% диметилсульфоксиде (DMSO). Для исследований in vivo AMG 510 и MEKi (PD-0325901) составляли в 2% НРМС, 1% Tween 80 и вводили через желудочный зонд ежедневно в дозе 10 мл/кг. Исходный раствор карбоплатина в дозе 10 мг/мл дополнительно разбавляли до 5 мг/мл или 3 мг/мл в 1% PBS и вводили посредством внутрибрюшинной инъекции (IP) один раз в неделю. Клон 29F.1A12 антитела крысы к PD1 мыши химеризовали с содержанием остова мышиного IgG1. Кроме того, вводили молчащую мутацию Fc-рецептора N297G в область тяжелой цепи IgG для снижения эффекторной функции. Антитело 29F.1A12 к PD-1 разбавляли в 1X PBS до концентрации 500 мкг/мл и вводили один раз каждые 3 дня, всего 3 IP инъекции. Все антитела, используемые для вестерн-блоттинга, приобретали в компании Cell Signaling, за исключением антител к RAS (Abcam), антител к фосфо-ERK1/2 (ThermoFisher Scientific) и антител к бета-актинHRP (Sigma).ARS-1620, PD-0325901, trametinib, afatinib, erlotinib, RMC-4550, and AZD5363 were obtained from commercial sources. AMG 511 was synthesized independently. The synthesis of AMG 510 and its unreactive propionamide is described herein. Stock solutions of AMG 510 and all other inhibitors used for in vitro experiments were prepared as 10 mM solutions in 100% dimethyl sulfoxide (DMSO). For in vivo studies, AMG 510 and MEKi (PD-0325901) were formulated in 2% HPMC, 1% Tween 80 and gavaged daily at 10 mL/kg. Carboplatin stock solution 10 mg/mL was further diluted to 5 mg/mL or 3 mg/mL in 1% PBS and administered via intraperitoneal injection (IP) once weekly. The rat anti-mouse PD1 antibody clone 29F.1A12 was chimerized to contain a mouse IgG1 backbone. In addition, a silent Fc receptor mutation N297G was introduced into the IgG heavy chain region to reduce effector function. Anti-PD-1 antibody 29F.1A12 was diluted in 1X PBS to a concentration of 500 μg/ml and administered once every 3 days for a total of 3 IP injections. All antibodies used for Western blotting were purchased from Cell Signaling, with the exception of anti-RAS (Abcam), anti-phospho-ERK1/2 (ThermoFisher Scientific), and anti-beta-actinHRP (Sigma).

Линии клеток.Cell lines.

Все линии клеток приобретали в Американской коллекции типовых культур (АТСС), за исключением KM12 и NCI-H3122, которые получали из Национального института рака. Линии клеток аутентифицировали с помощью профилирования с коротким тандемным повтором (STR). Для улучшения кинетических показателей роста in vivo получали клетки MIA PaCa-2 T2 и SW48O-1AC путем пассирования клеток MIA РаСа-2 и SW480 соответственно мышам. Клетки СТ-26 KRAS p.G12C получали из мышиной колоректальной линии СТ-26 (АТСС) с использованием технологии CRISPR для замещения обоих аллелей KRAS p.G12D с помощью p.G12C (ThermoFisher Scientific). Клон H10 определяли как гомозиготный по аллелю KRAS p.G12C, идентифицировали как СТ-26 KRAS p.GJ2C-H10 и обозначали как СТ-26 KRAS p.G12C. Все линии клеток культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1х пенициллин/стрептомицин/L-глутамин при 37°С, 5% CO2 в увлажненном инкубаторе.All cell lines were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC), with the exception of KM12 and NCI-H3122, which were obtained from the National Cancer Institute. Cell lines were authenticated using short tandem repeat (STR) profiling. To improve growth kinetics in vivo, MIA PaCa-2 T2 and SW48O-1AC cells were obtained by passage of MIA PaCa-2 and SW480 cells, respectively, to mice. CT-26 KRAS p.G12C cells were generated from the CT-26 mouse colorectal cell line (ATCC) using CRISPR technology to replace both alleles of KRAS p.G12D with p.G12C (ThermoFisher Scientific). Clone H10 was determined to be homozygous for the KRAS p.G12C allele, identified as CT-26 KRAS p.GJ2C-H10, and designated CT-26 KRAS p.G12C. All cell lines were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1x penicillin/streptomycin/L-glutamine at 37°C, 5% CO2 in a humidified incubator.

Рентгеновская кристаллография.X-ray crystallography.

Очищенный немеченный krasg12C/C51S/C80l/c118S (kraS) в 20 мМ HEPES, pH 7,5, 150 мМ NaCl концентрировали до 40 мг/мл и добавляли к двукратному молярному избытку твердого соединения AMG 510, растворенного в DMSO. Образец белкового комплекса помещали на орбитальный шейкер при к.т. на 16 ч, а затем подвергали центрифужной фильтрации. Сокристаллизацию проводили с использованием способа диффузии паров в сидячей капле. Смешивали образец белкового комплекса KRAS-AMG 510 и буфер для кристаллизации (1 мМ MgCl2, 0,1 М MES, pH 6,5, 30 вес./об.% полиэтиленгликоля 4000). Сплюснутые стержневидные кристаллы появлялись за одни сутки при 20°С.Purified unlabeled kras g12C/C51S/C80l/c118S (kraS) in 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl was concentrated to 40 mg/ml and added to a two-fold molar excess of solid AMG 510 dissolved in DMSO. A sample of the protein complex was placed on an orbital shaker at room temperature. for 16 hours and then subjected to centrifugal filtration. Cocrystallization was carried out using the sessile drop vapor diffusion method. A sample of the KRAS-AMG 510 protein complex and crystallization buffer (1 mM MgCl 2 , 0.1 M MES, pH 6.5, 30 wt/vol% polyethylene glycol 4000) were mixed. Flattened rod-shaped crystals appeared in one day at 20°C.

Кристалл уравновешивали в буфере для кристаллизации в качестве криопротектора перед замораживанием в жидком азоте. Набор данных собирали на кремниевом пиксельном детекторе Pilatus 6M в Advanced Light Source Beamline 5.0.1 при длине волны 0,97741А и температуре 100 К. Данные интегрировали и масштабировали с помощью HKL2000. Кристаллы принадлежат к орторомбической пространственной группе P212121 с параметрами элементарной ячейки а=40,9А, b=58,4A, с=65,9А, α=90°, β=90°, γ=90° (см. дополнительную табл. 2). Структуру определяли путем молекулярного замещения с использоThe crystal was equilibrated in crystallization buffer as a cryoprotectant before freezing in liquid nitrogen. The data set was collected on a Pilatus 6M silicon pixel detector in Advanced Light Source Beamline 5.0.1 at a wavelength of 0.97741 A and a temperature of 100 K. Data were integrated and scaled using HKL2000. The crystals belong to the orthorhombic space group P212121 with unit cell parameters a=40.9A, b=58.4A, c=65.9A, α=90°, β=90°, γ=90° (see Supplementary Table 2 ). The structure was determined by molecular replacement using

- 77 045330 ванием MolRep со структурой Аро KRAS в качестве модели поиска. В асимметричной единице содержится одна молекула белка. Структуру уточняли с использованием Refmac5, а построение модели производили с помощью графической программы Coot. Лиганд получали с использованием PRODRG. Структуру KRASg12C/C51S/C80l/C118S, связанную с GDP и AMG 510, уточняли до 1,65А, при этом значение Rфактора составляло 18,1%, и Rfree 21,5%. Статистические характеристики по карте Рамачандрана были на 98,2% благоприятными, 1,8% допустимыми, без каких-либо отклонений. Аминокислотные остатки 105107 были неразрешенными в кристаллической структуре. Атомные координаты и структурные факторы будут помещены в банк данных белков (ID-код PDB: еще не присвоен).- 77 045330 using MolRep with the Apo KRAS structure as a search model. An asymmetric unit contains one protein molecule. The structure was refined using Refmac5, and the model was built using the graphical program Coot. The ligand was prepared using PRODRG. The structure of KRAS g12C/C51S/C80l/C118S associated with GDP and AMG 510 was refined to 1.65 A, with an R factor of 18.1% and an R free of 21.5%. The statistical characteristics of the Ramachandran chart were 98.2% favorable, 1.8% acceptable, without any abnormality. Amino acid residues 105107 were unresolved in the crystal structure. Atomic coordinates and structure factors will be deposited in the Protein Data Bank (PDB ID: not yet assigned).

Анализ обмена связанных нуклеотидов.Analysis of exchange of bound nucleotides.

Ингибирование активности катализируемого SOS1 обмена нуклеотидов krasg12C/C118A или KRASC118A измеряли с использованием технологии Alpha (гомогенного анализа усиления люминесценции при сближении). 20 нМ связанного с GDP человеческого белка kraSg12C/C118A или KRASC118A инкубировали с двукратным серийно разбавленным AMG 510 или DMSO в течение 5 минут при комнатной температуре (к. т.) в реакционном буфере (25 мМ HEPES, pH 7,4; 10 мМ MgCl2; 0,01% Triton Х-100). Для всех последующих стадий к реакционному буферу добавляли DTT до конечной концентрации 1 мМ. Затем GTP и SOS-1 добавляли в реакционный буфер с DTT при конечных концентрациях 1,25 мМ или 500 нМ соответственно и инкубировали при к.т. в течение 30 мин. Наконец, добавляли c-RAF RBD (конечная концентрация 50 нМ), донорные гранулы глутатиона Alpha (PerkinElmer; конечная концентрация 20 мкг/мл) и акцепторные гранулы хелата никеля AlphaLISA® (PerkinElmer; конечная концентрация 20 мкг/мл), все разбавленные в реакционном буфере с DTT. Реакционную смесь инкубировали при к.т. в течение 5 мин, а затем планшеты считывали на EnVision® Multilabel Reader с использованием протокола AlphaScreen. Сигнал люминесценции измеряли при 570 нм через 180 мс после возбуждения при 680 нм. Интенсивность сигнала соответствовала ассоциации c-RAF RBD с kraSg12C/C118A или KRASC118A связанным с GTP и была нормализована к контролю DMSO.Inhibition of SOS1-catalyzed nucleotide exchange activity by kras g12C/C118A or KRAS C118A was measured using Alpha (Homogeneous Proximity Luminescence Enhancement Assay) technology. 20 nM GDP-bound human kraS g12C/C118A or KRAS C118A protein was incubated with 2-fold serially diluted AMG 510 or DMSO for 5 minutes at room temperature (RT) in reaction buffer (25 mM HEPES, pH 7.4; 10 mM MgCl 2 ; 0.01% Triton X-100). For all subsequent steps, DTT was added to the reaction buffer to a final concentration of 1 mM. GTP and SOS-1 were then added to the reaction buffer with DTT at final concentrations of 1.25 mM or 500 nM, respectively, and incubated at RT. within 30 min. Finally, c-RAF RBD (50 nM final concentration), Alpha glutathione donor beads (PerkinElmer; 20 μg/mL final concentration), and AlphaLISA® nickel chelate acceptor beads (PerkinElmer; 20 μg/mL final concentration) were all added, all diluted in the reaction buffer with DTT. The reaction mixture was incubated at room temperature. for 5 min, and then the plates were read on the EnVision® Multilabel Reader using the AlphaScreen protocol. The luminescence signal was measured at 570 nm 180 ms after excitation at 680 nm. Signal intensity corresponded to the association of c-RAF RBD with GTP-bound kraS g12C/C118A or KRAS C118A and was normalized to the DMSO control.

Анализы фосфорилирования ERK1/2.ERK1/2 phosphorylation assays.

Для клеточных анализов высевали по 2,5Е+04 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали при 37°С, 5% СО2 на протяжении ночи. На следующий день к клеткам добавляли 3-кратно серийно разбавленное соединение или DMSO и планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 2 часов. После обработки клетки промывали ледяным PBS и лизировали в буфере для лизиса RIPA (50 мМ трисHCl, pH 7,5; 1% Igepal; 0,5% дезоксихолата натрия; 150 мМ NaCl; 0,1% додецилсульфата натрия), содержащем протеазу и ингибиторы фосфатазы. Уровни базисного фосфорилирования ERK1/2 измеряли в обработанных клеточных лизатах с использованием наборов Phospho-ERKl/2 Whole Cell Lysate (Meso Scale Discovery) в соответствии с протоколом изготовителя. Интенсивность сигнала соответствовала уровням фосфо-ERK1/2 и была нормализована к контролю DMSO.For cellular assays, 2.5E+04 cells per well were seeded in 96-well plates and incubated at 37°C, 5% CO 2 overnight. The next day, 3-fold serial diluted compound or DMSO was added to the cells and the plates were incubated at 37°C, 5% CO 2 for 2 hours. After treatment, cells were washed with ice-cold PBS and lysed in RIPA lysis buffer (50 mM TrisHCl, pH 7.5; 1% Igepal; 0.5% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 0.1% sodium dodecyl sulfate) containing protease and inhibitors phosphatases. Basal ERK1/2 phosphorylation levels were measured in treated cell lysates using Phospho-ERKl/2 Whole Cell Lysate kits (Meso Scale Discovery) according to the manufacturer's protocol. Signal intensity corresponded to phospho-ERK1/2 levels and was normalized to the DMSO control.

Для лизатов опухолевых клеток из фармакодинамических анализов in vivo 50 мкг общего белка на образец анализировали с использованием наборов Phospho-ERKl/2 and Total ERK1/2 Whole Cell Lysate (Meso Scale Discovery) в соответствии с протоколом изготовителя. Сигнал фосфо-ERK1/2 нормализовали по сигналу общего ERK1/2 для данного образца и рассчитывали % ингибирования фосфорилирования ERK относительно обрабатываемой средой-носителем группы.For tumor cell lysates from in vivo pharmacodynamic assays, 50 μg of total protein per sample was analyzed using Phospho-ERKl/2 and Total ERK1/2 Whole Cell Lysate kits (Meso Scale Discovery) according to the manufacturer's protocol. The phospho-ERK1/2 signal was normalized to the total ERK1/2 signal for a given sample and the % inhibition of ERK phosphorylation relative to the vehicle-treated group was calculated.

Анализы жизнеспособности клеток.Cell viability assays.

Для анализа жизнеспособности адгерентных клеток высевали по 0,5-1,0Е+03 клеток на лунку в 384луночные планшеты (или по 2,5-4,0Е+04 клеток на лунку в 96-луночные планшеты) и инкубировали при 37°С, 5% СО2 на протяжении ночи. На следующий день к клеткам добавляли серийно разбавленное соединение или DMSO и планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 72 ч. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием набора Luminescent Cell Viability Assay CellTiter-GloR (Promega) в соответствии с протоколом изготовителя. Сигнал люминесценции обработанных образцов нормализовали по контролю DMSO.To analyze the viability of adherent cells, 0.5-1.0E+03 cells per well were seeded in 384-well plates (or 2.5-4.0E+04 cells per well in 96-well plates) and incubated at 37°C. 5% CO 2 overnight. The next day, serially diluted compound or DMSO was added to the cells and the plates were incubated at 37°C, 5% CO 2 for 72 hours. Cell viability was measured using the Luminescent Cell Viability Assay CellTiter-GloR kit (Promega) according to the manufacturer's protocol. The luminescence signal of the treated samples was normalized to the DMSO control.

Для анализов жизнеспособности сфероидных клеток высевали по 2,5-4,0Е+04 клеток на лунку в 96луночные микропланшеты для сфероидной культуры и инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч. Применяли ту же процедуру, что и описанная выше, за исключением того, что жизнеспособность измеряли с использованием набора CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega) в соответствии с протоколом изготовителя.For spheroid cell viability assays, 2.5-4.0E+04 cells per well were seeded in 96-well spheroid culture microplates and incubated at 37°C, 5% CO 2 for 24 hours. The same procedure as described above was used. , except that viability was measured using the CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay kit (Promega) according to the manufacturer's protocol.

Исследования синергетической комбинации.Synergistic combination studies.

Комбинированные эксперименты для оценки синергетических взаимодействий AMG 510 с другими ингибиторами in vitro проводили, как описано ранее (Saiki, A. Y. et al. MDM2 antagonists synergize broadly and robustly with compounds targeting fundamental oncogenic signaling pathways. Oncotarget 5, 2030-2043, doi:10,18632/oncotarget, 1918 (2014)).Combined experiments to evaluate the synergistic interactions of AMG 510 with other inhibitors in vitro were performed as described previously (Saiki, A. Y. et al. MDM2 antagonists synergize broadly and robustly with compounds targeting fundamental oncogenic signaling pathways. Oncotarget 5, 2030-2043, doi:10, 18632/oncotarget, 1918 (2014)).

Кинетические анализы.Kinetic analyses.

Образование ковалентных аддуктов ингибитор-KRAS измеряли с использованием MS как описано ранее44. Значения относительного % связывания для различных концентраций ингибитора при разном времени инкубации подгоняли к экспоненциальному уравнению с получением значений kobs для каждойThe formation of covalent inhibitor‐KRAS adducts was measured using MS as described previously 44 . The relative % binding values for different inhibitor concentrations at different incubation times were fitted to an exponential equation to obtain ko bs values for each

- 78 045330 тестируемой концентрации с использованием Prism (программное обеспечение GraphPad). Затем полученные значения kobs пересчитывали в зависимости от концентрации ингибитора с получением значений kinact и Ki.- 78 045330 concentration tested using Prism (GraphPad software). Then the obtained ko bs values were recalculated depending on the inhibitor concentration to obtain the kinact and Ki values.

Для определения кинетических значений образования ковалентного аддукта ингибитор-KRASG12C в клетках измеряли уровни базисного фосфорилирования ERK1/2 после обработки различными концентрациями ингибитора при разном времени инкубации точно так, как описано выше, и значения % активности использовали для кинетических расчетов.To determine the kinetic values for the formation of covalent inhibitor-KRAS G12C adduct in cells, basal phosphorylation levels of ERK1/2 were measured after treatment with various concentrations of inhibitor at various incubation times exactly as described above, and the % activity values were used for kinetic calculations.

Цистеиновый протеомный анализ.Cysteine proteomic analysis.

Клетки NCI-H358 немелкоклеточного рака легкого человека высевали при 2,0Е+06 клеток/10 см планшет и инкубировали при 37°С, 5% CO2 на протяжении ночи. На следующий день клетки обрабатывали с помощью 1 мкМ AMG 510 или DMSO (n=5) и инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 4 ч. После обработки клетки промывали ледяным PBS, содержащим ингибиторы протеаз, а затем удаляли из планшетов. Осадки мгновенно замороженных клеток обрабатывали в IQ Proteomics, LLC с помощью масс-спектрометрии (MS) в соответствии с их протоколом, описанным Patricelli et al. Вкратце, осадок клеток лизировали и обрабатывали 100 мкМ дестиобиотинйодацетамидом для мечения оставшихся непрореагировавших цистеинов, подвергшихся воздействию растворителя. После расщепления трипсином смесь пептидов, полученную из каждого образца, метили реагентами изобарической метки ТМТ-10 plex (Tandem Mass Tag) (ThermoFisher Scientific). После мечения образцы смешивали перед обогащением дестиобиотинилированными пептидами с использованием стрептавидин-агарозы высокой емкости. Обогащенные пептиды анализировали с помощью нано-LC-MS с использованием трехчасового градиента и способа MS3 на основе синхронного выбора предшественников (SPS) на масс-спектрометре Orbitrap Lumos (ThermoFisher Scientific). Идентификацию дестиобиотинилированных пептидов осуществляли путем поиска в базе данных с помощью специализированного информационного конвейера, разработанного в лаборатории Gygi в Гарвардской медицинской школе, который использует SEQUEST. Все спектры сравнивали с базой данных последовательностей белков Human Uniprot (2018), к которой была добавлена последовательность мутантного белка KRASG12C и общие контаминанты. Пептиды и белки фильтровали до 1% доли ложноположительных результатов (FDR) и только те пептиды, которые соответствовали критерию минимального отношения сигнала к шуму 200 и чистоты выделения более 50%, использовали для количественного анализа. Всю обработку данных для статистического анализа проводили в Microsoft Excel с использованием нормализованных пиковых количественных показателей цистеинсодержащих пептидов. Log2-кратные изменения рассчитывали между образцами групп, получающих контроль DMSO, и групп, обработанных с помощью AMG 510. Проводили двусторонний t-тест для каждого пептида для оценивания статистической значимости разницы между образцами групп, подвергающихся обработке, и групп с получением контроля DMSO, при условии равной дисперсии. Строили диаграмму volcano, показывающую отрицательные Р-значения log10, нанесенные напротив log2-кратных изменений для каждого дестиобиотинилированного цистеинсодержащего пептида. Пептиды, которые демонстрировали снижение количественных показателей в log2 раза больше 2 и Р-значение меньше 0,0001, обозначали как ковалентные мишени для AMG 510 (n=5 биологических повторностей).NCI-H358 human non-small cell lung cancer cells were seeded at 2.0E+06 cells/10 cm plate and incubated at 37°C, 5% CO 2 overnight. The next day, cells were treated with 1 μM AMG 510 or DMSO (n=5) and incubated at 37°C, 5% CO 2 for 4 hours. After treatment, cells were washed with ice-cold PBS containing protease inhibitors and then removed from the plates . Flash-frozen cell pellets were processed at IQ Proteomics, LLC using mass spectrometry (MS) according to their protocol described by Patricelli et al. Briefly, the cell pellet was lysed and treated with 100 μM desthiobiotiniodoacetamide to label the remaining unreacted solvent-exposed cysteines. After trypsin digestion, the peptide mixture obtained from each sample was labeled with TMT-10 plex isobaric tag reagents (Tandem Mass Tag) (ThermoFisher Scientific). After labeling, samples were mixed before enrichment for desthiobiotinylated peptides using high-capacity streptavidin agarose. Enriched peptides were analyzed by nano-LC-MS using a 3-h gradient and synchronous precursor selection (SPS) MS3 method on an Orbitrap Lumos mass spectrometer (ThermoFisher Scientific). Identification of desthiobiotinylated peptides was accomplished by database searching using a custom information pipeline developed in the Gygi laboratory at Harvard Medical School that uses SEQUEST. All spectra were compared with the Human Uniprot (2018) protein sequence database, to which the KRAS G12C mutant protein sequence and common contaminants were added. Peptides and proteins were filtered to a 1% false positive rate (FDR), and only those peptides that met the criteria of a minimum signal-to-noise ratio of 200 and an isolation purity greater than 50% were used for quantitative analysis. All data processing for statistical analysis was performed in Microsoft Excel using normalized peak counts of cysteine-containing peptides. Log2 fold changes were calculated between samples from the DMSO control and AMG 510 treated groups. A two-tailed t test was performed for each peptide to assess the statistical significance of the difference between samples from the DMSO control and DMSO control groups, at condition of equal variance. A volcano plot was generated showing the negative log 10 P-values plotted against the log 2 fold changes for each desthiobiotinylated cysteine-containing peptide. Peptides that exhibited a log2 -fold reduction greater than 2 and a P-value less than 0.0001 were designated as covalent targets for AMG 510 (n=5 biological replicates).

Исследования на животных.Animal studies.

Все экспериментальные процедуры на животных проводили в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных Amgen и Ассоциации по оцениванию и аккредитации стандартов ухода за лабораторными животными. Во всех исследованиях использовали самок бестимусных голых мышей или самок Balb/c возрастом от 4 до 7 недель (Charles River Laboratories). Бестимусных голых мышей содержали по пять на каждую клетку с фильтром в стерильном помещении, а мышей Balb/c содержали по пять в клетке с фильтром в нестерильном помещении в комнате с контролируемой средой (температура 23±2°С, относительная влажность 50±20%) при 12-часовом цикле свет/темнота. Мышей кормили коммерческим кормом для грызунов.All animal experimental procedures were performed in accordance with the guidelines of the Amgen Institutional Animal Care and Use Committee and the Association for the Evaluation and Accreditation of Standards of Laboratory Animal Care. Female athymic nude mice or female Balb/c mice, 4 to 7 weeks old (Charles River Laboratories), were used in all studies. Athymic nude mice were housed five per filter cage in a sterile room, and Balb/c mice were housed five per filter cage in a nonsterile environment in a controlled environment room (temperature 23 ± 2°C, relative humidity 50 ± 20%) on a 12 hour light/dark cycle. Mice were fed a commercial rodent chow.

Анализ экспрессии гена.Gene expression analysis.

Общую РНК очищали с помощью наборов RNeasy Mini (QIAGEN) из опухолей СТ-26 KRAS p.G12C с обработкой средой-носителем перорально, AMG 510 перорально (100 мг/кг QD) или MEKi перорально (PD0325901, 10 мг/кг QD) в течение двух дней (n=5/группа). Определяли количество РНК с помощью DropSense 96 (PerkinElmer Inc). 300 нг РНК анализировали на nCounter™ (NanoString Technologies) с панелью иммунного профилирования в отношении всех видов рака мыши, содержащей 750 генов-мишеней, 20 генов домашнего хозяйства, 8 внутренних отрицательных контролей и 6 внутренних положительных контролей. Необработанные данные проверяли на качество, нормализовали и анализировали с помощью программного обеспечения nSolver (NanoString Technologies). Необработанные данные преобразовывали в log2 и выполняли статистические анализы. Баллы пути (балл интерферона, балл процессирования антигена, балл МНС, балл TLR и балл функции Тклеток) и баллы профилирования клеток (балл NK-клеток, балл цитотоксических клеток и балл CD45) получали с помощью nSolver Advanced Analysis (NanoString Technologies).Total RNA was purified using RNeasy Mini kits (QIAGEN) from CT-26 KRAS p.G12C tumors treated with vehicle orally, AMG 510 orally (100 mg/kg QD), or MEKi orally (PD0325901, 10 mg/kg QD) at over two days (n=5/group). RNA was quantified using DropSense 96 (PerkinElmer Inc). 300 ng RNA was analyzed on nCounter™ (NanoString Technologies) with a mouse all cancer immune profiling panel containing 750 target genes, 20 housekeeping genes, 8 internal negative controls and 6 internal positive controls. Raw data were quality checked, normalized, and analyzed using nSolver software (NanoString Technologies). Raw data were log2 transformed and statistical analyzes were performed. Pathway scores (interferon score, antigen processing score, MHC score, TLR score, and T cell function score) and cell profiling scores (NK cell score, cytotoxic cell score, and CD45 score) were obtained using nSolver Advanced Analysis (NanoString Technologies).

См. дополнительную табл. 3А, табл. 3В, табл. 3С, табл. 3D и табл. 3Е для получения подробного перечня генов, включенных в каждый балл, и р-значений, используемых для расчета баллов пути и про- 79 045330 филирования клеток.See additional table. 3A, table. 3B, tab. 3C, table. 3D and table 3E for a detailed list of genes included in each score and p-values used to calculate pathway scores and cell profiling.

Фармакодинамический анализ опухоли.Pharmacodynamic analysis of the tumor.

Эффект AMG 510 в отношении фосфорилирования ERK1/2 оценивали на несущих опухоль MIA PaCa-2 Т2, NCI-H358 и СТ-26 KRAS p.G12C мышах. Опухолевые клетки MIA PaCa-2 Т2 или NCI-H358 (5,0Е+06 клеток) вводили посредством подкожной инъекции в бок самок бестимусных голых мышей в соотношении клеток к матригелю 2:1 (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния). Мышам вводили однократную пероральную дозу либо среды-носителя, либо AMG 510 (0,3, 1, 3, 10, 30 и 100 мг/кг), когда средний размер опухоли достигал ~300-600 мм3 (n=3/груnпа), и собирали через 2 ч. Однократную пероральную дозу AMG 510 (10 мг/кг) использовали для исследований временной динамики. Самкам мышей Balb/c вводили посредством подкожной инъекции клеток опухоли СТ-26 KRAS p.G12C (3,0E+05 клеток). Мышей рандомизировали на группы (n=3/груnпа), когда средний объем опухоли составлял 486 мм3, вводили однократную пероральную дозу либо среды-носителя, либо AMG 510 (3, 10, 30 или 100 мг/кг), либо MEKi (PD-0325901, 10 мг/кг) и собирали через 2 ч. Во всех исследованиях анализировали плазму крови и опухоль для определения концентраций тестируемого изделия. Образцы опухолей также собирали в указанные моменты времени, мгновенно замораживали в жидком азоте и обрабатывали для биоанализа или измельчали с использованием cryoPREP® Dry Impactor (Covaris). Измельченные образцы ресуспендировали в буфере для лизиса RIPA, содержащем ингибиторы протеазы и фосфатазы, и гомогенизировали. Затем очищенные лизаты анализировали в отношении уровней фосфорилирования ERK1/2, как описано выше, и в отношении ковалентной модификации KRASG12C с помощью MS.The effect of AMG 510 on ERK1/2 phosphorylation was assessed in tumor-bearing MIA PaCa-2 T2, NCI-H358 and CT-26 KRAS p.G12C mice. MIA PaCa-2 T2 or NCI-H358 tumor cells (5.0E+06 cells) were administered by subcutaneous injection into the flank of female athymic nude mice at a cell to Matrigel ratio of 2:1 (BD Bioscience, San Jose, CA). Mice were given a single oral dose of either vehicle or AMG 510 (0.3, 1, 3, 10, 30 and 100 mg/kg) when the average tumor size reached ~300-600 mm 3 (n=3/group). , and collected after 2 hours. A single oral dose of AMG 510 (10 mg/kg) was used for time course studies. Female Balb/c mice were treated by subcutaneous injection of CT-26 KRAS p.G12C tumor cells (3.0E+05 cells). Mice were randomized into groups (n=3/group) when the mean tumor volume was 486 mm 3 and received a single oral dose of either vehicle, AMG 510 (3, 10, 30 or 100 mg/kg) or MEKi (PD -0325901, 10 mg/kg) and collected after 2 hours. In all studies, blood plasma and tumor were analyzed to determine test article concentrations. Tumor samples were also collected at the indicated time points, flash frozen in liquid nitrogen, and processed for bioassay or crushed using cryoPREP® Dry Impactor (Covaris). Ground samples were resuspended in RIPA lysis buffer containing protease and phosphatase inhibitors and homogenized. Cleared lysates were then analyzed for ERK1/2 phosphorylation levels as described above and for covalent modification of KRAS G12C by MS.

Ксенотрансплантат и сингенные исследования.Xenograft and syngeneic studies.

Клетки MIA PaCa-2 Т2, NCI-H358 или SW480-1AC (5,0Е+06 клеток с матригелем в соотношении 2:1) вводили посредством подкожной инъекции в бок самок бестимусных голых мышей (n=10/груnпа). Лечение начинали, когда опухоли были установлены и составляли приблизительно 170 мм3 для исследований MIA PaCa-2 Т2 и NCI-H358 или приблизительно 200 мм3 для модели SW480-1AC. В исследованиях зависимости ответа от дозы мыши получали либо среду-носитель перорально (QD), либо AMG 510 перорально (3, 10, 30 и 100 мг/кг QD). В исследовании комбинации NCI-H358 с AMG 510 и карбоплатином мышей рандомизировали на 8 групп (n=10/груnпа) и вводили одно из среды-носителя перорально (QD) + PBS внутрибрюшинно (1х/неделя); AMG 510 перорально (10 или 30 мг/кг QD) + PBS внутрибрюшинно (1х/неделя); среды-носителя перорально (QD) + карбоплатин (50 или 100 мг/кг) внутрибрюшинно (1х/неделя); AMG 510 перорально (10 или 30 мг/кг QD) + карбоплатин (50 или 100 мг/кг) внутрибрюшинно (1х/неделя). Для исследования комбинации с AMG 510 и MEKi мышей рандомизировали на 4 группы n=10/груnпа и вводили одно из среды-носителя перорально (QD); AMG 510 перорально (10 мг/кг QD); MEKi перорально (1 мг/кг QD); AMG 510 перорально (10 мг/кг QD) + MEKi перорально (1 мг/кг QD). Для сингенных исследований клетки СТ-26 KRAS p.G12C (3,0Е+05 клеток) вводили посредством подкожной инъекции в бок самкам мышей Balb/c. Лечение начинали, когда опухоли устанавливались и составляли приблизительно 170 мм3 для исследований зависимости ответа от дозы и приблизительно 130 мм3 для исследования комбинации, n=10/груnпа; за исключением исследования зависимости ответа от дозы MEKi, где n=8/группа. В исследованиях зависимости ответа от дозы мыши получали либо средуноситель перорально (QD), AMG 510 перорально (3, 10, 30 и 100 мг/кг QD), либо MEKi (PD-0325901) перорально (1, 3 или 10 мг/кг QD). В исследовании комбинации мышей рандомизировали на 4 групп n=10/груnпа и вводили одно из среды-носителя перорально (QD) + PBS внутрибрюшинно (Q3Dχ3); AMG 510 перорально (100 мг/кг QD) + PBS внутрибрюшинно (Q3Dχ3); среды-носителя перорально (QD) + антитело к PD-1 (29F,1A12; 100 мкг/доза, Q3Dx3) внутрибрюшинно; AMG 510 перорально (100 мг/кг QD) + антитело к PD-1 (29F, 1A12; 100 мкг/доза, Q3Dx3) внутрибрюшинно с 15 дня до 43 дня. Исследования комбинированного лечения проводили в слепом режиме. Размеры опухоли оценивали два раза в неделю с помощью электронного цифрового штангенциркуля Pro-Max (Japan Micrometer Mfg. Co. LTD), объем опухоли вычисляли с использованием формулы: длина х ширина х высота, и выражали в мм3. На моделях PDX KRAS p.G12C легкого мышам подкожно имплантировали фрагменты опухоли размером ~70 мг. Мышей рандомизировали, когда объемы опухоли составляли приблизительно 160-200 мм3, и вводили либо среду-носитель перорально (QD), либо AMG 510 перорально (100 мг/кг QD) через день после рандомизации. Размеры опухоли снимали два раза в неделю с использованием формулы: ширина2хдлинах0,52 и выражали в мм3. Данные выражены как среднее значение ±SEM.MIA PaCa-2 T2, NCI-H358 or SW480-1AC cells (5.0E+06 cells with Matrigel in a 2:1 ratio) were administered by subcutaneous injection into the flank of female athymic nude mice (n=10/group). Treatment began when tumors were established and were approximately 170 mm 3 for the MIA PaCa-2 T2 and NCI-H358 studies or approximately 200 mm 3 for the SW480-1AC model. In dose response studies, mice received either vehicle orally (QD) or AMG 510 orally (3, 10, 30, and 100 mg/kg QD). In a combination study of NCI-H358 with AMG 510 and carboplatin, mice were randomized into 8 groups (n=10/group) and administered one of vehicle orally (QD) + PBS intraperitoneally (1x/week); AMG 510 orally (10 or 30 mg/kg QD) + PBS intraperitoneally (1x/week); carrier medium orally (QD) + carboplatin (50 or 100 mg/kg) intraperitoneally (1x/week); AMG 510 orally (10 or 30 mg/kg QD) + carboplatin (50 or 100 mg/kg) intraperitoneally (1x/week). For the combination study with AMG 510 and MEKi, mice were randomized into 4 groups n=10/group and administered one of the vehicle orally (QD); AMG 510 orally (10 mg/kg QD); MEKi orally (1 mg/kg QD); AMG 510 orally (10 mg/kg QD) + MEKi orally (1 mg/kg QD). For syngeneic studies, CT-26 KRAS p.G12C cells (3.0E+05 cells) were administered via subcutaneous injection into the flank of female Balb/c mice. Treatment began when tumors were established and were approximately 170 mm 3 for dose response studies and approximately 130 mm 3 for combination studies, n=10/group; except for the MEKi dose response study, where n=8/group. In dose response studies, mice received either vehicle orally (QD), AMG 510 orally (3, 10, 30, and 100 mg/kg QD), or MEKi (PD-0325901) orally (1, 3, or 10 mg/kg QD ). In the combination study, mice were randomized into 4 groups n=10/group and administered one of the vehicle orally (QD) + PBS intraperitoneally (Q3Dχ3); AMG 510 orally (100 mg/kg QD) + PBS intraperitoneally (Q3Dχ3); vehicle vehicle orally (QD) + anti-PD-1 antibody (29F,1A12; 100 μg/dose, Q3Dx3) intraperitoneally; AMG 510 oral (100 mg/kg QD) + anti-PD-1 antibody (29F, 1A12; 100 mcg/dose, Q3Dx3) intraperitoneal from day 15 to day 43. Combination treatment studies were conducted in a blinded manner. Tumor size was assessed twice a week using a Pro-Max electronic digital caliper (Japan Micrometer Mfg. Co. LTD), and tumor volume was calculated using the formula: length x width x height, and expressed in mm 3 . In PDX KRAS p.G12C lung models, mice were subcutaneously implanted with ~70 mg tumor fragments. Mice were randomized when tumor volumes were approximately 160-200 mm 3 and administered either oral vehicle (QD) or oral AMG 510 (100 mg/kg QD) one day after randomization. Tumor dimensions were measured twice a week using the formula: width 2 x length 0.52 and expressed in mm 3 . Data are expressed as mean ±SEM.

Выявление конъюгата AMG 510-KRASG12C.Identification of the AMG 510-KRAS G12C conjugate.

Антитело к RAS человека (антитело к RAS) приобретали у компании Abcam и биотинилировали с помощью EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoFisher Scientific) с использованием протокола, описанного изготовителем. Остаточный биотин удаляли, полученное антитело к RAS с биотином загружали в гранулы Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 (ThermoFisher Scientific) в соотношении 1:1 на один час при к.т. со встряхиванием. Лизаты из обработанных in vitro клеток или обработанных in vivo клеток опухоли, описанных ранее, инкубировали с гранулами биотинилированного антитела к RAS в течение 3 ч при к.т. со встряхиванием. Гранулы промывали с помощью PBST (3х) с использованием магнита, затем с помощью PBS (1 х), а потом с помощью воды (1х). Образцы элюировали из гранул с использованием 2% водAnti-human RAS antibody (anti-RAS antibody) was purchased from Abcam and biotinylated with EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoFisher Scientific) using the protocol described by the manufacturer. Residual biotin was removed, and the resulting anti-RAS antibody with biotin was loaded into Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 beads (ThermoFisher Scientific) in a 1:1 ratio for one hour at RT. with shaking. Lysates from in vitro-treated cells or in vivo-treated tumor cells described previously were incubated with biotinylated anti-RAS antibody beads for 3 h at RT. with shaking. The beads were washed with PBST (3x) using a magnet, then with PBS (1x), and then with water (1x). Samples were eluted from the beads using 2% water

- 80 045330 ной муравьиной кислоты/10% водного ацетонитрила, а затем инкубировали при к.т. со встряхиванием в течение 10 мин. Супернатант переносили в 96-луночный планшет и высушивали. Образцы ресуспендировали в буфере для денатурации (10 мМ ТСЕР, 8 М мочевина) и инкубировали при 65°С со встряхиванием в течение 15 мин. Добавляли йодацетамид (40 мМ) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, защищая от света. Добавляли 50 мМ NH4HCO3 и трипсин (0,01 мкг/мкл) и образцы расщепляли в течение ночи при 37°С в течение ~16-20 ч, затем окончательно гасили муравьиной кислотой с получением конечной концентрации 1 об./об.%. Затем образцы анализировали с помощью жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) с применением мониторинга множественных реакций (MRM) в режиме положительной ионизации с использованием 6500 QTRAP (AB SCIEX), соединенного с Acquity UPLC (Waters). Образцы вводили в колонку Acquity UPLC ВЕН С8 1,7мкм, 2,1x100 мм (Waters). Подвижные фазы состояли из подвижной фазы А (вода+0,1% муравьиная кислота) и подвижной фазы В (ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота). Градиент LC представлял собой 5-50% В за 5 мин, 50-95% В за 0,5 мин и 95% В за 1 мин. Осуществляли мониторинг следующих пептидов KRASG12C LVVVGAC(CAM)GVGK (529,8- >846,3) и модифицированного AMG 510 KRASG12C AMG 510LVVVGAC(CAM)GVGK (521,4— 675,2). Занятость вычисляли как процент модифицированного AMG 510 пептида KRASG12C, нормализованного по сумме немодифицированного и модифицированного пептида KRASG12C - 80 045330 formic acid/10% aqueous acetonitrile and then incubated at room temperature. with shaking for 10 minutes. The supernatant was transferred to a 96-well plate and dried. Samples were resuspended in denaturation buffer (10 mM TCEP, 8 M urea) and incubated at 65°C with shaking for 15 min. Iodoacetamide (40 mM) was added and incubated at 37°C for 30 min, protected from light. 50 mM NH 4 HCO 3 and trypsin (0.01 μg/μl) were added and samples were digested overnight at 37°C for ~16-20 h, then finally quenched with formic acid to obtain a final concentration of 1 v/v. %. Samples were then analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM) in positive ionization mode using a 6500 QTRAP (AB SCIEX) coupled to an Acquity UPLC (Waters). Samples were injected into an Acquity UPLC VEN C8 1.7 µm, 2.1x100 mm column (Waters). The mobile phases consisted of mobile phase A (water + 0.1% formic acid) and mobile phase B (acetonitrile + 0.1% formic acid). The LC gradient was 5–50% B in 5 min, 50–95% B in 0.5 min, and 95% B in 1 min. The following peptides KRAS G12C LVVVGAC(CAM)GVGK (529.8->846.3) and modified AMG 510 KRAS G12C AMG 510LVVVGAC(CAM)GVGK (521.4-675.2) were monitored. Occupancy was calculated as the percentage of AMG 510 modified KRAS G12C peptide normalized by the sum of unmodified and modified KRAS G12C peptide

Проточная цитометрия.Flow cytometry.

Для анализа in vitro эффекта AMG 510 в отношении экспрессии антигена МНС класса I высевали клетки СТ-26 KRAS p.G12C (5,0E+04 клеток/лунка) в 96-луночный планшет и обрабатывали трехкратным серийным разведением AMG 510 в отсутствие или в присутствии IFNy при конечной концентрации 25 или 250 пг/мл. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 24 ч. Клетки без помощи фермента отсоединяли от лунок, промывали буфером для окрашивания (PBS/0,5% BSA), а затем инкубировали с РЕ-конъюгированными антителами H-2Dd, H-2Kj или H-2Ld (BioLegend) в течение 30 мин на льду. После промывки клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания, содержащем SYTOX Blue Dead Cell Stain (Life Technologies), а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Сбор данных и анализ осуществляли на проточном цитометре BD LSRFortessa с использованием программного обеспечения BD FACSDiva.To analyze the in vitro effect of AMG 510 on MHC class I antigen expression, CT-26 KRAS p.G12C cells (5.0E+04 cells/well) were seeded in a 96-well plate and treated with a three-fold serial dilution of AMG 510 in the absence or presence IFNy at a final concentration of 25 or 250 pg/ml. The plates were incubated at 37°C, 5% CO2 for 24 hours. Cells were detached from the wells without enzyme, washed with staining buffer (PBS/0.5% BSA), and then incubated with PE-conjugated H-2D d antibodies. H-2K j or H-2L d (BioLegend) for 30 min on ice. After washing, cells were resuspended in staining buffer containing SYTOX Blue Dead Cell Stain (Life Technologies) and then analyzed by flow cytometry. Data acquisition and analysis were performed on a BD LSRFortessa flow cytometer using BD FACSDiva software.

Для исследований in vivo клетки СТ-26 KRAS p.G12C имплантировали самкам мышей Balb/c возрастом приблизительно 6 недель. В день 22 после имплантации мышей рандомизировали в получающую четырехдневное введение дозы когорту, состоящую из 5 групп по n=8/груnпа, получавших одно из среды-носителя перорально (QD) + PBS внутрибрюшинно (Q3Dx2); AMG 510 перорально (100 мг/кг QD) + PBS внутрибрюшинно (Q3Dx2); среды-носителя перорально (QD) + антитело к PD-1 (29F,1A12; 100 мкг/доза, Q3Dx2) внутрибрюшинно; AMG 510 перорально (100 мг/кг QD) + антитело к PD-1 (29F,1A12; 100 мкг/доза, Q3Dx2) внутрибрюшинно или MEKi перорально (10 мг/кг, QD) + PBS внутрибрюшинно (Q3Dx2) в течение 4 дней. После четырех дней введения дозы опухоли собирали и отделяли от окружающей фасции, взвешивали, механически измельчалии помещали в Liberase TL (0,2 мг/мл, Roche) и ДНКазу I (20 мкг/мл, Ambion). Затем находящиеся в растворе опухоли механически гомогенизировали с использованием мягкого диссоциатора MACS (Miltenyi Biotech) и инкубировали при 37°С в течение 15 мин на встряхивателе пробирок MACSmix (Miltenyi Biotech). Затем клетки обрабатывали с помощью 0,02% EDTA (Sigma) и термоинактивированным FBS (ThermoFisher Scientific) и пропускали через фильтр с размером пор 70 мкм для удаления комков. Затем клетки центрифугировали, супернатант удаляли, а клеточный осадок затем ресуспендировали в LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain (ThermoFisher Scientific) в течение 30 мин. Затем проводили окрашивание клеточной поверхности указанными антителами (дополнительная таблица 4) перед фиксацией и пермеабилизацией клеток (Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set, eBiosciences) для внутриклеточного окрашивания. Добавляли CountBright™ Absolute Counting Beads (ThermoFisher Scientific) в каждую лунку для образцов, чтобы обеспечить подсчет клеток перед анализом на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences). Все анализы проводили с помощью программного обеспечения FlowJo v10 (FlowJo). Абсолютное количество клеток определяли путем нормализации количества клеток к зарегистрированным гранулам, деленного на объем проанализированной аликвоты опухоли и массу опухоли.For in vivo studies, CT-26 KRAS p.G12C cells were implanted into female Balb/c mice approximately 6 weeks old. At day 22 postimplantation, mice were randomized into a 4-day dosing cohort consisting of 5 groups of n=8/group receiving either vehicle orally (QD) + PBS intraperitoneally (Q3Dx2); AMG 510 orally (100 mg/kg QD) + PBS intraperitoneally (Q3Dx2); vehicle vehicle orally (QD) + anti-PD-1 antibody (29F,1A12; 100 μg/dose, Q3Dx2) intraperitoneally; AMG 510 orally (100 mg/kg QD) + anti-PD-1 antibody (29F,1A12; 100 mcg/dose, Q3Dx2) intraperitoneal or MEKi orally (10 mg/kg, QD) + PBS intraperitoneal (Q3Dx2) for 4 days . After four days of dosing, tumors were harvested and separated from the surrounding fascia, weighed, and mechanically minced into Liberase TL (0.2 mg/mL, Roche) and DNase I (20 μg/mL, Ambion). Then, the tumors in solution were mechanically homogenized using a MACS soft dissociator (Miltenyi Biotech) and incubated at 37°C for 15 min on a MACSmix tube shaker (Miltenyi Biotech). Cells were then treated with 0.02% EDTA (Sigma) and heat-inactivated FBS (ThermoFisher Scientific) and passed through a 70-μm pore size filter to remove clumps. The cells were then centrifuged, the supernatant was removed, and the cell pellet was then resuspended in LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain (ThermoFisher Scientific) for 30 min. Cell surface staining was then performed with the indicated antibodies (Supplementary Table 4) before cell fixation and permeabilization (Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set, eBiosciences) for intracellular staining. CountBright™ Absolute Counting Beads (ThermoFisher Scientific) were added to each sample well to allow cell counts prior to analysis on an LSR II flow cytometer (BD Biosciences). All analyzes were performed using FlowJo v10 software (FlowJo). Absolute cell counts were determined by normalizing cell counts to recorded beads divided by the volume of tumor aliquot analyzed and tumor weight.

Иммуноферментные спот-анализы (ELISpot).Enzyme-linked immunosorbent spot assays (ELISpot).

Антигенспецифический Т-клеточный ответ оценивали с использованием анализа ELISpot IFN-γ (Cellular Technology Ltd.). Спленоциты собирали (n=4-5/груnпа) и использовали в анализе ELISpot цельных клеток. Вкратце, 2,5Е+05 спленоцитов смешивали с 2,5Е+04 опухолевыми клетками СТ-26, СТ-26 KRAS p.G12C или 4Т1 и инкубировали при 37°С в течение 20 ч. Использовали анализатор CTLS6 Fluorospot (Cellular Technology Ltd.) для подсчета пятен.Antigen-specific T cell responses were assessed using the IFN-γ ELISpot assay (Cellular Technology Ltd.). Splenocytes were collected (n=4-5/group) and used in whole cell ELISpot assay. Briefly, 2.5E+05 splenocytes were mixed with 2.5E+04 CT-26, CT-26 KRAS p.G12C or 4T1 tumor cells and incubated at 37°C for 20 hours. A CTLS6 Fluorospot analyzer (Cellular Technology Ltd.) was used. ) to count spots.

Статистический анализ.Statistical analysis.

Фармакодинамические эксперименты анализировали с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета. Для исследований эффективности проводили дисперсионный анализ повторных измерений (RMANOVA) с последующим апостериорным критерием Даннетта сPharmacodynamic experiments were analyzed using one-way ANOVA followed by Dunnett's post hoc test. For efficacy studies, repeated measures analysis of variance (RMANOVA) was performed followed by Dunnett's post hoc test with

- 81 045330 использованием GraphPad Prism 7.04. Регрессионный анализ проводили с помощью парного t-критерия. Статистический анализ выживаемости определяли с помощью оценки Каплана-Мейера с логарифмическим рангом Мантела-Кокса для сравнения кривых с использованием GraphPad Prism 7.04. Данные проточной цитометрии анализировали с помощью двухфакторного ANOVA для множественных сравнений с последующим апостериорным тестом Тьюки. Данные NanoString анализировали с помощью однофакторного ANOVA для множественных сравнений с последующим апостериорным тестом Тьюки. Сравнение данных ELISpot проводили с помощью непарного t-критерия с использованием GraphPad Prism.- 81 045330 using GraphPad Prism 7.04. Regression analysis was performed using a paired t test. Statistical analysis of survival was determined using Kaplan-Meier estimator with Mantel-Cox log-rank for comparison of curves using GraphPad Prism 7.04. Flow cytometry data were analyzed using two-way ANOVA for multiple comparisons followed by Tukey's post hoc test. NanoString data were analyzed using one-way ANOVA for multiple comparisons followed by Tukey's post hoc test. Comparisons between ELISpot data were performed using an unpaired t test using GraphPad Prism.

Биоаналитические способы LC-MS/MS для AMG 510.Bioanalytical methods LC-MS/MS for AMG 510.

Гомогенаты опухолевой ткани получали путем добавления воды к ткани (4:1 мл:г) с использованием гранул из карбида вольфрама в TissueLyzer (Qiagen). К 20 мкл образца (гомогената плазмы крови или опухолевой ткани) добавляли 100 мкл ацетонитрила, содержащего IS (200 нг/мл толбутамида), образец перемешивали на вортексе в течение 10 мин, центрифугировали при 3500 g в течение 10 мин и собирали 90 мкл супернатанта. К собранному супернатанту добавляли 100 мкл воды (содержащей 0,1% муравьиной кислоты) и 5 мкл полученного раствора вводили в систему LC-MS/MS. Хроматографического разделения достигали с использованием Phenomenex Kinetex C18 50x2,1 мм, 2,7 мкм, поддерживаемого при 50°С, с использованием 0,1% муравьиной кислоты в H2O (подвижная фаза А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (подвижная фаза В). Градиент хроматографии был следующим: изократический от 0 мин до 0,1 мин с 10% подвижной фазы В, линейное увеличение от 0,1 до 0,85 мин до 95% подвижной фазы В, изократическая задержка от 0,85 до 1,10 мин с 95% подвижной фазы В, линейное уменьшение от 1,10 до 1,11 мин до 10% подвижной фазы В, изократическая задержка от 1,11 до 1,40 мин с 10% подвижной фазы В. Для анализа обычно использовали масс-спектрометр API 4000 и запускали в режиме определения положительных ионов ESI после MS/MS перехода 561,179 > 134,100 (AMG 510) и 271,100 > 134,100 (толбутамид). Площади пиков интегрировали с помощью Analyst® (Sciex). После интегрирования площадей пиков данные экспортировали в Watson LIMS™ (ThermoFisher Scientific) и концентрации определяли с помощью взвешенной (1/х2) линейной регрессии соотношений площадей пиков (площадь пика AMG 510/площадь пика IS) по сравнению с номинальными концентрациями калибровочных стандартов плазмы крови. Диапазон калибровки для AMG 510 в плазме крови составлял от 1,0 до 10000 нг/мл (LLOQ 1,0 нг/мл). Диапазон калибровки для AMG 510 в гомогенате опухолевой ткани составлял от 5,0 до 50000 нг/мл (LLOQ 5,0 нг/мл).Tumor tissue homogenates were prepared by adding water to the tissue (4:1 ml:g) using tungsten carbide beads in a TissueLyzer (Qiagen). To 20 μl of a sample (blood plasma or tumor tissue homogenate), 100 μl of acetonitrile containing IS (200 ng/ml tolbutamide) was added, the sample was vortexed for 10 min, centrifuged at 3500 g for 10 min, and 90 μl of the supernatant was collected. 100 μL of water (containing 0.1% formic acid) was added to the collected supernatant, and 5 μL of the resulting solution was injected into the LC-MS/MS system. Chromatographic separation was achieved using Phenomenex Kinetex C18 50x2.1 mm, 2.7 µm maintained at 50°C using 0.1% formic acid in H2O (mobile phase A) and 0.1% formic acid in acetonitrile (mobile phase B). The chromatography gradient was as follows: isocratic from 0 min to 0.1 min with 10% mobile phase B, linear increase from 0.1 to 0.85 min to 95% mobile phase B, isocratic delay from 0.85 to 1.10 min with 95% mobile phase B, linear decrease from 1.10 to 1.11 min to 10% mobile phase B, isocratic delay from 1.11 to 1.40 min with 10% mobile phase B. A mass spectrometer was typically used for analysis API 4000 and run in ESI positive ion detection mode after MS/MS transition 561,179 > 134,100 (AMG 510) and 271,100 > 134,100 (tolbutamide). Peak areas were integrated using Analyst® (Sciex). After peak area integration, data were exported to Watson LIMS™ (ThermoFisher Scientific) and concentrations were determined using weighted (1/× 2 ) linear regression of peak area ratios (AMG 510 peak area/IS peak area) against nominal concentrations of plasma calibration standards . The calibration range for AMG 510 in plasma was 1.0 to 10,000 ng/mL (LLOQ 1.0 ng/mL). The calibration range for AMG 510 in tumor tissue homogenate was 5.0 to 50,000 ng/mL (LLOQ 5.0 ng/mL).

Мечение стабильного изотопа аминокислотами в культуре клеток (SILAC).Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC).

Легкую среду (LM) получали путем добавления следующих компонентов до конечного объема 1 л: 100 мл диализированного FBS, 10,4 г порошкообразной среды RPMI-1640, 2 г бикарбоната натрия, 200 мг L-аргинина, 48 мг L-лизина, 100 мг L-лейцина и 1x Pen-Strep, которые фильтровали с помощью системы фильтра с размером пор 0,22 мкм. Тяжелую среду (НМ) получалитак же, как LM, но 100 мг [13С6]L-лейцина (Cambridge Isotope Laboratories) заменяли необогащенным изотопом L-лейцином. Клетки MIA PaCa-2 и NCI-H358 высевали (3Е+05 клеток) в колбы Т75 с LM, LM меняли ежедневно. Через 48 ч клетки промывали с помощью 1x PBS и среду заменяли на НМ, НМ меняли ежедневно в течение 4 дней. В день 6 клетки промывали с помощью 1x PBS и среду заменяли на LM, LM меняли ежедневно. Начиная со дня 6 образцы MIA PaCa-2 собирали через 0, 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 30, 36, 48 и 72 ч. Начиная со дня 6 образцы NCI-H358 собирали через 0, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72 и 96 ч. Отдельные колбы Т75, полученные в трех повторностях, собирали в каждый момент времени и обрабатывали для получения лизатов.Light medium (LM) was prepared by adding the following to a final volume of 1 L: 100 ml dialyzed FBS, 10.4 g powdered RPMI-1640 medium, 2 g sodium bicarbonate, 200 mg L-arginine, 48 mg L-lysine, 100 mg L-Leucine and 1x Pen-Strep, which was filtered using a 0.22 micron pore size filter system. Heavy medium (HM) was prepared in the same way as LM, but 100 mg of [ 13C6 ]L-leucine (Cambridge Isotope Laboratories) was replaced with unenriched isotope L-leucine. MIA PaCa-2 and NCI-H358 cells were seeded (3E+05 cells) in T75 flasks with LM, LM was changed daily. After 48 h, cells were washed with 1x PBS and the medium was replaced with NM, NM was changed daily for 4 days. On day 6, cells were washed with 1x PBS and the medium was replaced with LM, LM was changed daily. Starting on day 6, MIA PaCa-2 samples were collected at 0, 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 30, 36, 48, and 72 hours. Starting on day 6, NCI-H358 samples were collected at 0, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72, and 96 h. Individual T75 flasks obtained in triplicate were collected at each time point and processed to obtain lysates.

Сбор образца SILAC и получение белка лизата.Collect SILAC sample and obtain protein lysate.

Колбы Т75 промывали с помощью 1x PBS, обрабатывали трипсином и инкубировали в течение 2 мин с последующим добавлением ледяного PBS, содержащего 10% диализированного FBS. Клетки хорошо перемешивали и собирали с последующим подсчетом клеток с использованием Vi-CELL XR. Оставшиеся клетки центрифугировали и промывали ледяным PBS (без Mg+2, без Са+2). Клетки снова центрифугировали, PBS удаляли и клетки лизировали в небольшом объеме ледяного RIPA, содержащего ингибиторы фосфатазы (PhosSTOP, Roche) и протеазы (полностью без EDTA, Roche). Полученные лизаты перемешивали на вортексе, помещали на лед на 10 мин, центрифугировали для удаления нерастворимого дебриса, а затем хранили при -80°С до дальнейшей обработки.T75 flasks were washed with 1x PBS, trypsinized, and incubated for 2 min followed by the addition of ice-cold PBS containing 10% dialyzed FBS. Cells were mixed well and collected, followed by cell counting using Vi-CELL XR. The remaining cells were centrifuged and washed with ice-cold PBS (no Mg +2 , no Ca +2 ). Cells were centrifuged again, PBS was removed, and cells were lysed in a small volume of ice-cold RIPA containing phosphatase (PhosSTOP, Roche) and protease inhibitors (all EDTA-free, Roche). The resulting lysates were vortexed, placed on ice for 10 min, centrifuged to remove insoluble debris, and then stored at -80°C until further processing.

Определение целевого периода полувыведения KRASG12C с помощью SILAC Антитело к RAS человека (антитело к RAS) приобретали у компании Abcam и биотинилировали с помощью EZ-Link NHSPEG4-Biotin (ThermoFisher Scientific) с использованием протокола, описанного изготовителем. Остаточный биотин удаляли, полученное антитело к RAS с биотином загружали в гранулы Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 (ThermoFisher Scientific) в течение 1,5 ч при к.т. со встряхиванием. Клеточный лизат (описанный выше) инкубировали с гранулами биотинилированного антитела к RAS в течение 2 ч при к.т. со встряхиванием. Гранулы промывали с помощью PBST (3x) с использованием магнита, затем с помощью PBS (1x). Образцы элюировали из гранул с использованием 3% водной муравьиной кислоты/30% водного ACN с последующей инкубацией при к.т. со встряхиванием в течение 10 мин. Супернатанты переносили в 96-луночный планшет и высушивали. Образцы ресуспендировали в буфере для денатурации (10 мМ ТСЕР, 8 М мочевина) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч с использованием водяной бани. ДоDetermination of the target half-life of KRAS G12C using SILAC Anti-human RAS antibody (anti-RAS antibody) was purchased from Abcam and biotinylated using EZ-Link NHSPEG4-Biotin (ThermoFisher Scientific) using the protocol described by the manufacturer. Residual biotin was removed, and the resulting anti-RAS antibody with biotin was loaded into Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 beads (ThermoFisher Scientific) for 1.5 h at RT. with shaking. The cell lysate (described above) was incubated with biotinylated anti-RAS antibody beads for 2 h at RT. with shaking. The beads were washed with PBST (3x) using a magnet, then with PBS (1x). Samples were eluted from the beads using 3% aqueous formic acid/30% aqueous ACN followed by incubation at RT. with shaking for 10 minutes. Supernatants were transferred to a 96-well plate and dried. Samples were resuspended in denaturation buffer (10 mM TCEP, 8 M urea) and incubated at 37°C for 1 h using a water bath. Before

- 82 045330 бавляли йодацетамид (40 мМ) и инкубировали при 25°С в течение 1 ч, защищая от света. Добавляли 50 мМ NH4HCO3 и трипсин (0,1 мкг/мкл) и образцы расщепляли при 37°С в течение 24 ч, затем окончательно гасили муравьиной кислотой с получением конечной концентрации 1 об./об.%. Образцы концентрировали до приблизительно 80 мкл перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Образцы анализировали с помощью жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) с применением мониторинга множественных реакций (MRM) в режиме положительной ионизации с использованием 6500 QTRAP (АВ SCIEX), соединенного с Acquity UPLC (Waters). Образцы вводили в колонку Acquity UPLC ВЕН С8 1,7мкм, 2,1 х 100 мм (Waters). Подвижные фазы состояли из подвижной фазы А (вода+0,1% муравьиная кислота) и подвижной фазы В (ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота). Градиент LC представлял собой 5-50% В за 5 мин, 50-95% В за 0,5 мин и 95% В за 1 мин. Следующие пептиды для KRASG12C (LVVVGAC(CAM)GVGK (529,8^846,3) и 13C-LVVVGAC(CAM)GVGK (532,8^846,3)) и RAS WT (LVVVGAGGVGK (478,3^743,2) и 13C-LVVVGAGGVGK (481,3^743,2)) использовали для мониторинга перехода от мечения тяжелыми изотопами к мечению легкими изотопами. Относительный изотопный состав (RIA) определяли с использованием следующей формулы:- 82 045330 iodoacetamide (40 mM) was added and incubated at 25°C for 1 hour, protected from light. 50 mM NH 4 HCO 3 and trypsin (0.1 μg/μl) were added and samples were digested at 37°C for 24 h, then finally quenched with formic acid to obtain a final concentration of 1 v/v%. Samples were concentrated to approximately 80 μL before analysis by mass spectrometry. Samples were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM) in positive ionization mode using a 6500 QTRAP (AB SCIEX) coupled to an Acquity UPLC (Waters). Samples were injected into an Acquity UPLC VEN C8 1.7 µm, 2.1 x 100 mm column (Waters). The mobile phases consisted of mobile phase A (water + 0.1% formic acid) and mobile phase B (acetonitrile + 0.1% formic acid). The LC gradient was 5–50% B in 5 min, 50–95% B in 0.5 min, and 95% B in 1 min. The following peptides for KRAS G12C (LVVVGAC(CAM)GVGK (529.8^846.3) and 13C-LVVVGAC(CAM)GVGK (532.8^846.3)) and RAS WT (LVVVGAGGVGK (478.3^743, 2) and 13C-LVVVGAGGVGK (481.3^743.2)) were used to monitor the transition from heavy isotope labeling to light isotope labeling. Relative isotopic composition (RIA) was determined using the following formula:

А,A,

R1A = д heavy---Ат -I- Ai light ^heavyR1A = d heavy---At -I- Ai light ^heavy

Определение с помощью SILAC периода полувыведения KRAS.Determination of the half-life of KRAS using SILAC.

Чтобы учесть влияние роста клеток на определение периода полувыведения белка, количество клеток и данные RIA, связанные с каждым моментом времени, одновременно подгоняли к серии уравнений для определения периода полувыведения KRASG12C в клетках MIA PaCa-2 и NCI-H358. Использовали следующие уравнения:To account for the effect of cell growth on protein half-life determination, cell counts and RIA data associated with each time point were simultaneously fitted to a series of equations to determine the half-life of KRAS G12C in MIA PaCa-2 and NCI-H358 cells. The following equations were used:

Уравнение первого порядка для пептида тяжелой цепи:The first order equation for a heavy chain peptide is:

d Hv — = -kdec Hvd Hv — = -k dec Hv

Уравнение первого порядка для пептида легкой цепи:The first order equation for a light chain peptide is:

d It х ч клеткапеш ч клеткапеш — = kdec (Hv0 + lt0) - kdec It + ——— (Hv0 + lt0) kdec - kdec ——— It dt клетка(0) клетка^)d It x h cell pawn h cell pesh — = k dec (Hv 0 + lt 0 ) - k dec It + ——— (Hv 0 + lt 0 ) k dec - k dec ——— It dt cell ( 0 ) cell ^)

Уравнение первого порядка для роста клеток:First order equation for cell growth:

d клеткапеш dtd cell pesh dt

Дополнительные уравнения:Additional equations:

= _^dii (клетка^) + клеткапеш) ksyn — ^decCHVg + Ιίθ)= _ ^dii (cell^) + cell pesh ) ksyn - ^decCHVg + Ιίθ)

0,693 Период полувыведения = η—— kdec0.693 Half-life = η—— kdec

Время 0 определяется как время, когда НМ изменяли на LM, Hv представляет собой концентрацию пептида тяжелой цепи, lt представляет собой концентрацию пептида легкой цепи, клеткаnew представляет собой число новых клеток, kdec представляет собой константу скорости первого порядка для разложения, ksyn представляет собой константу скорости нулевого порядка для синтеза, kdil представляет собой константу скорости первого порядка для роста клеток, клетка (0) представляет собой число клеток в момент времени 0, Hv(0) представляет собой концентрацию пептида тяжелой цепи в момент времени 0, lt(0) представляет собой концентрацию пептида легкой цепи в момент времени 0. Использовали ступенчатый подход для моделирования, при этом на первой стадии kdil оценивали по числу клеток, а на второй стадии kdec оценивали с использованием приведенных выше уравнений.Time 0 is defined as the time when HM was changed to LM, Hv represents the concentration of the heavy chain peptide, lt represents the concentration of the light chain peptide, cell new represents the number of new cells, kd ec represents the first order rate constant for degradation, k syn represents is the zero-order rate constant for synthesis, kdil is the first-order rate constant for cell growth, cell (0) is the number of cells at time 0, Hv(0) is the heavy chain peptide concentration at time 0, lt( 0 ) is the light chain peptide concentration at time 0. A stepwise modeling approach was used, with kdil in the first step being estimated from cell number and in the second step kdec being estimated using the above equations.

kdil оценивали путем количественного определения числа клеток после замены на LM и применения следующего уравнения: А=А0с-ыл, где А и А0 представляют собой число клеток в момент времени t и 0 соответственно.kdil was estimated by quantifying the number of cells after replacement with LM and applying the following equation: A = A 0 syl , where A and A 0 represent the number of cells at time t and 0, respectively.

- 83 045330- 83 045330

Дополнительная таблица 1Supplementary Table 1

Данные клеточного анализаCellular analysis data

Мутация Mutation Линия клеток Cell line Ткань происхожд ения Fabric of origin IC50 базисного p-ERKl/2 (мкМ) IC50 of basal p-ERKl/2 (µM) Жизнеспосо бность клеток 1С50 (мкМ)Cell viability 1C 50 (µM) Жизнеспосо бность сфероидных клеток 1С50 (мкМ)Viability of spheroid cells 1C 50 (µM) KRAS p.G12C гомозигот ная KRAS p.G12C homozygous MIA РаСа-2 MIA RaSa-2 Поджелудо чная железа Pancreas gland 0,036 ± 0,002 0.036 ± 0.002 0,005 ± 0,001 0.005 ± 0.001 0,001 ±0,001 0.001 ±0.001 NCI-H1373 NCI-H1373 Легкое Lung 0,010 ±0,0001 0.010 ±0.0001 0,020 ± 0,006 0.020 ± 0.006 0,005 ± 0,002 0.005 ± 0.002 NCI-H2030 NCI-H2030 Легкое Lung 0,040 ± 0,020 0.040 ± 0.020 0,006 ± 0,003 0.006 ± 0.003 ND ND NCI-H2122 NCI-H2122 Легкое Lung 0,123 ±0,006 0.123 ±0.006 0,032 ± 0,005 0.032 ± 0.005 0,009 ± 0,002 0.009 ± 0.002 SW1463 SW1463 Толстый кишечник Colon 0,033 ± 0,004 0.033 ± 0.004 0,015 ±0,007 0.015 ±0.007 ND ND SW1573 SW1573 Легкое Lung 0,027 ±0,001 0.027 ±0.001 >7,5 >7.5 > 10 > 10 UM-UC-3 UM-UC-3 Мочевой пузырь Uric bubble 0,029 ±0,016 0.029 ±0.016 0,005 ± 0,001 0.005 ± 0.001 ND ND KRAS p.G12C гетерозиг отная KRAS p.G12C heterozygous Calu-1 Calu-1 Легкое Lung 0,013 ± 0,004 0.013 ± 0.004 0,004 ± 0,001 0.004 ± 0.001 ND ND NCI-H1792 NCI-H1792 Легкое Lung 0,045 ± 0,023 0.045 ± 0.023 0,011 ± 0,008 0.011 ± 0.008 ND ND NCI-H23 NCI-H23 Легкое Lung 0,090 ±0,017 0.090 ±0.017 0,006 ± 0,001 0.006 ± 0.001 ND ND NCI-H358 NCI-H358 Легкое Lung 0,035 ± 0,003 0.035 ± 0.003 0,004 ± 0,001 0.004 ± 0.001 0,003 ± 0,002 0.003 ± 0.002 SW837 SW837 Толстый кишечник Colon 0,018 ± 0,002 0.018 ± 0.002 0,009 ± 0,006 0.009 ± 0.006 ND ND KRAS р. G12D гомозигот ная KRAS r. G12D homozygous AsPC-1 AsPC-1 Поджелудо чная железа Pancreas > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRAS KRAS А-427 A-427 Легкое Lung > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND

- 84 045330- 84 045330

р. G12D гетерозиг отная R. G12D heterozygous LS 174Т LS 174T Толстый кишечник Colon > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRAS p.G12V гомозигот ная KRAS p.G12V homozygous SW480 SW480 Толстый кишечник Colon > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRAS p.G12S гомозигот ная KRAS p.G12S homozygous А549 A549 Легкое Lung > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRAS p.G13C гетерозиг отная KRAS p.G13C heterozygous NCI-H1355 NCI-H1355 Легкое Lung > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND XR45WT EGFR р.Е746_А7 5 Odel XR45WT EGFR p.E746_A7 5 Odel НСС-827 NSS-827 Легкое Lung > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRASWT Слияние EML4- ALK KRASWT Merger EML4- ALK NCI-H1322 NCI-H1322 Легкое Lung > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRASWT Слияние ТРМЗ- NTRK KRASWT Merger TRMZ- NTRK КМ12 KM12 Толстый кишечник Colon > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND KRASWT BRAF р. V600E KRASWT BRAF r. V600E COLO-205 COLO-205 Толстый кишечник Colon > 10 > 10 >7,5 >7.5 ND ND

Пояснения мутаций получали из Каталога соматических мутаций при раке (COSMIC)1 или Misale et al. 20 1 92. Средние значения IC50 для анализов базисного фосфорилирования ERK1/2 и жизнеспособности клеток получали по меньшей мере в n=2 экспериментах. ND=не определено.Mutation explanations were obtained from the Catalog of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) 1 or Misale et al. 20 1 92. Average IC 50 values for basal ERK1/2 phosphorylation and cell viability assays were obtained from at least n=2 experiments. ND=not defined.

Дополнительная таблица 2Supplementary Table 2

Сбор данных и уточнение статистических характеристик (молекулярного замещения)Data collection and clarification of statistical characteristics (molecular substitution)

KRASC,I2C/C5IS4^KRAS C,I2C/C5IS4 ^

Сбор данных Data collection Пространственная группа Space group Р21 2121 P21 2121 Клеточные размеры a, b, c (А) Cell sizes a, b, c (A) 40,87, 58,42, 65,89 40.87, 58.42, 65.89

- 85 045330- 85 045330

α, β, γ (°) α, β, γ (°) 90, 90, 90 90, 90, 90 Разрешение (А) Resolution (A) 30,0-1,65 (1,71-1,65) 30.0-1.65 (1.71-1.65) Rsym Rsym 0,162 (0,521) 0.162 (0.521) I/σΙ I/σΙ 6,9 (2,5) 6.9 (2.5) Завершенность (%) Completeness (%) 97,0 (96,3) 97.0 (96.3) Избыточность Redundancy 4,4 (4,2) 4.4 (4.2) Уточнение Clarification Разрешение (А) Resolution (A) 30,00-1,65 30.00-1.65 Число отражений Number of reflections 18077 18077 Rwork/Rfree Rwork/Rfree 0,1809/0,2152 0.1809/0.2152 Число атомов Number of atoms 1613 1613 Белок Protein 1336 1336 Лиганд/ион Ligand/ion 70 70 Вода Water 207 207 B-факторы B-factors 24,8 24.8 Белок Protein 24,3 24.3 Лиганд/ион Ligand/ion 24,1 24.1 Вода Water 34,1 34.1 Среднеквадратичные отклонения Standard deviations Длины связей (А) Углы связей (°) Bond lengths (A) Bond angles (°) 0,005 1,08 0.005 1.08

Для этой структуры собирали один набор данных по кристаллу. *Значения в скобках относятся к оболочке с самым высоким разрешением.One set of crystal data was collected for this structure. *Values in parentheses refer to the highest resolution shell.

- 86 045330- 86 045330

Дополнительная таблица 3. Анализ для оценки пути генной экспрессии.Supplementary Table 3. Analysis to Evaluate Gene Expression Pathways.

Дополнительная таблица 3АSupplementary Table 3A

Гены, участвующие в вычислении оценки функции Т- Genes involved in calculating the T-function score Р-значение P-value Гены, участвующие в вычислении оценки функции Т- Genes involved in calculating the T-function score Р-значение P-value клеток пути cell path клеток пути cell path STAT1 STAT1 1,72Е-09 1.72E-09 LCP1 LCP1 1,20Е-04 1.20E-04 Н2-Т23 N2-T23 2,70E-09 2.70E-09 IKZF2 IKZF2 1,46Е-04 1.46E-04 ADA ADA 5,22E-09 5.22E-09 S0CS1 S0CS1 1,63Е-04 1.63E-04 EGR1 EGR1 7,09E-09 7.09E-09 TCF7 TCF7 2,02Е-04 2.02E-04 TGFB3 TGFB3 l,22E-08 l,22E-08 СЕВРВ SEVRV 2,26Е-04 2.26E-04 TLR6 TLR6 l,24E-08 l,24E-08 IL1R1 IL1R1 5,42Е-04 5.42E-04 ITGA1 ITGA1 E40E-08 E40E-08 JAK3 JAK3 6,60Е-04 6.60E-04 THY1 THY1 l,65E-08 l,65E-08 PVRL2 PVRL2 6,90Е-04 6.90E-04 NFATC2 NFATC2 2,31E-08 2.31E-08 CD1D1 CD1D1 8,57Е-04 8.57E-04 Н2-АВ1 H2-AV1 3,62E-08 3.62E-08 CD274 CD274 8,63Е-04 8.63E-04 Н2-АА H2-AA 4,93E-08 4.93E-08 ICOS ICOS 9,52Е-04 9.52E-04 CTSH CTSH 5,80E-08 5.80E-08 TNFSF13B TNFSF13B 9,63Е-04 9.63E-04 CD48 CD48 6,78E-08 6.78E-08 IL4RA IL4RA 1,02Е-03 1.02E-03 ITGAL ITGAL 6,82E-08 6.82E-08 STAT4 STAT4 1,07Е-03 1.07E-03 CD74 CD74 7,35E-08 7.35E-08 FAS F.A.S. 1,09Е-03 1.09E-03 ITGAM ITGAM 8,78E-08 8.78E-08 LGALS3 LGALS3 1,18Е-03 1.18E-03 IL2RG IL2RG 8,97E-08 8.97E-08 IL13RA1 IL13RA1 1,28Е-03 1.28E-03 H2-DMA H2-DMA l,33E-07 l,33E-07 IFNG IFNG Е29Е-03 E29E-03 CD83 CD83 l,41E-07 l,41E-07 FASL FASL 1,39Е-03 1.39E-03 TNFRSF14 TNFRSF14 l,48E-07 l,48E-07 IRF4 IRF4 1,47Е-03 1.47E-03 MAF MAF l,60E-07 l,60E-07 TRAF6 TRAF6 Е63Е-03 E63E-03 CD247 CD247 l,66E-07 l,66E-07 CD2 CD2 1,65Е-03 1.65E-03 PTPRC PTPRC l,70E-07 l,70E-07 TIGIT TIGIT 1,65Е-03 1.65E-03 TAPI TAPI 2,32E-07 2.32E-07 TLR4 TLR4 1,69Е-03 1.69E-03 CD3G CD3G 2,80E-07 2.80E-07 CD47 CD47 2,26Е-03 2.26E-03 MILL2 MILL2 3,39E-07 3.39E-07 VEGFA VEGFA 2,31Е-03 2.31E-03 CD27 CD27 3,64E-07 3.64E-07 PDCD1LG2 PDCD1LG2 2,47Е-03 2.47E-03 LCK LCK 4,04E-07 4.04E-07 BCL6 BCL6 2,48Е-03 2.48E-03 CD3E CD3E 4,62E-07 4.62E-07 IL12RB1 IL12RB1 3,49Е-03 3.49E-03 SPP1 SPP1 5,19E-07 5.19E-07 RORA RORA 3,60Е-03 3.60E-03 IKZF1 IKZF1 5,24E-07 5.24E-07 NFKB1 NFKB1 3,96Е-03 3.96E-03

- 87 045330- 87 045330

CCR2 CCR2 7,34E-07 7.34E-07 CXCL12 CXCL12 4,63E-03 4.63E-03 ZAP70 ZAP70 7,73E-07 7.73E-07 RIPK2 RIPK2 4,83E-03 4.83E-03 NFАТС1 NFATC1 8,07E-07 8.07E-07 GFI1 GFI1 4,88E-03 4.88E-03 LAG3 LAG3 8,54E-07 8.54E-07 IL15 IL15 5,01E-03 5.01E-03 IREI IREI 8,95E-07 8.95E-07 IL12B IL12B 5,09E-03 5.09E-03 SYK SYK 9,31E-07 9.31E-07 IL2RA IL2RA 5,56E-03 5.56E-03 IRF8 IRF8 1Д7Е-06 1D7E-06 CD276 CD276 6,24E-03 6.24E-03 PSMB10 PSMB10 1Д7Е-06 1D7E-06 BTLA BTLA 6,27E-03 6.27E-03 XCL1 XCL1 l,36E-06 l,36E-06 FOXP3 FOXP3 6,70E-03 6.70E-03 PVR PVR l,54E-06 l,54E-06 ANXA1 ANXA1 7,25E-03 7.25E-03 CXCR3 CXCR3 l,54E-06 l,54E-06 S0CS3 S0CS3 7,29E-03 7.29E-03 CD3D CD3D l,56E-06 l,56E-06 CD40 CD40 7,52E-03 7.52E-03 IL18R1 IL18R1 l,93E-06 l,93E-06 CD80 CD80 l,21E-02 l,21E-02 EOMES EOMES l,95E-06 l.95E-06 MAPK1 MAPK1 Ц22Е-02 Ts22E-02 PSEN2 PSEN2 2,40E-06 2.40E-06 MAP3K7 MAP3K7 Ц43Е-02 Ts43E-02 CCL5 CCL5 3,67E-06 3.67E-06 TRP53 TRP53 Ц46Е-02 Ts46E-02 IFNAR1 IFNAR1 3,85E-06 3.85E-06 TRAF2 TRAF2 l,59E-02 l,59E-02 JAKI JAKI 4,90E-06 4.90E-06 IL12RB2 IL12RB2 Ц78Е-02 Ts78E-02 CXCR4 CXCR4 4,94E-06 4.94E-06 NOS2 NOS2 Ц79Е-02 Ts79E-02 CARD11 CARD11 6,83E-06 6.83E-06 TGFB1 TGFB1 2,02E-02 2.02E-02 ICAM1 ICAM1 6,84E-06 6.84E-06 JAK2 JAK2 2,46E-02 2.46E-02 FCGR4 FCGR4 6,94E-06 6.94E-06 SPN SPN 2,48E-02 2.48E-02 IL1B IL1B 7,10E-06 7.10E-06 YY1 YY1 2,53E-02 2.53E-02 CCL2 CCL2 7,33E-06 7.33E-06 STAT6 STAT6 2,90E-02 2.90E-02 CMA1 CMA1 7,69E-06 7.69E-06 CCL3 CCL3 2,97E-02 2.97E-02 H2-K1 H2-K1 9,48E-06 9.48E-06 MAPK8 MAPK8 3,73E-02 3.73E-02 VCAM1 VCAM1 l,03E-05 l,03E-05 IL7R IL7R 5,28E-02 5.28E-02 IL6ST IL6ST 1Д6Е-05 1D6E-05 TNFSF11 TNFSF11 5,45E-02 5.45E-02 BCL2 BCL2 l,21E-05 l,21E-05 CCND3 CCND3 6,50E-02 6.50E-02 ICOSL ICOSL l,35E-05 l,35E-05 TNF TNF Ц23Е-01 Ts23E-01 TYK2 TYK2 l,57E-05 l,57E-05 CSF2 CSF2 l,54E-01 l,54E-01 ITGB2 ITGB2 l,62E-05 l,62E-05 RELB RELB l,55E-01 l,55E-01 CD86 CD86 l,68E-05 l,68E-05 CCL11 CCL11 Ц73Е-01 Ts73E-01

- 88 045330- 88 045330

IL18RAP IL18RAP 1,72Е-05 1.72E-05 SELL SELL 1,91Е-01 1.91E-01 CCR5 CCR5 1,74Е-05 1.74E-05 ITGAX ITGAX 2Д1Е-01 2D1E-01 ITK ITK 1,84Е-05 1.84E-05 CCR7 CCR7 2Д7Е-01 2D7E-01 ITCH ITCH 1,94Е-05 1.94E-05 TNFRSF4 TNFRSF4 2,31Е-01 2.31E-01 IL18 IL18 2,01Е-05 2.01E-05 RPS6 RPS6 2,43Е-01 2.43E-01 CD8A CD8A 2,41Е-05 2.41E-05 HAVCR2 HAVCR2 3,ОЗЕ-О1 3, OZE-O1 REL REL 2,69Е-05 2.69E-05 TNFSF18 TNFSF18 3,43Е-01 3.43E-01 CD8B1 CD8B1 3,06Е-05 3.06E-05 FLT3 FLT3 3,64Е-01 3.64E-01 CD5 CD5 3,39Е-05 3.39E-05 GZMB GZMB 3,89Е-01 3.89E-01 H2-D1 H2-D1 3,80Е-05 3.80E-05 FUT7 FUT7 4,36Е-01 4.36E-01 STAT5B STAT5B 3,93Е-05 3.93E-05 IDOI IDOI 4,69Е-01 4.69E-01 PDCD1 PDCD1 5Д0Е-05 5D0E-05 CASP3 CASP3 4,78Е-01 4.78E-01 CCL7 CCL7 5,31Е-05 5.31E-05 CCR6 CCR6 5,02Е-01 5.02E-01 CREBBP CREBBP 5,39Е-05 5.39E-05 TMED1 TMED1 5,07Е-01 5.07E-01 Н2-МЗ N2-MZ 5,67Е-05 5.67E-05 BCL10 BCL10 5,21Е-01 5.21E-01 CD4 CD4 5,83Е-05 5.83E-05 CXCL13 CXCL13 6,89Е-01 6.89E-01 ТВХ21 TVH21 7Д4Е-05 7D4E-05 CD28 CD28 7,48Е-01 7.48E-01 PSEN1 PSEN1 7,20Е-05 7.20E-05 TNFSF14 TNFSF14 7,51Е-01 7.51E-01 GATA3 GATA3 7,48Е-05 7.48E-05 CTLA4 CTLA4 7,97Е-01 7.97E-01 POU2F2 POU2F2 7,52Е-05 7.52E-05 CD40LG CD40LG 8Д7Е-01 8D7E-01 ТХК THC 8,94Е-05 8.94E-05 IL7 IL7 8,86Е-01 8.86E-01 DPP4 DPP4 9,70Е-05 9.70E-05 RORC RORC 1,00Е+00 1.00E+00

Дополнительная таблица 3 ВSupplementary Table 3 B

Гены, участвующие в вычислении оценки пути интерферона Genes involved in interferon pathway score calculation Р-значение P-value Гены, участвующие в вычислении оценки пути интерферона Genes involved in interferon pathway score calculation Р-значение P-value GBP5 GBP5 7,49Е-09 7.49E-09 DDX58 DDX58 1,73Е-05 1.73E-05 IFIT3 IFIT3 2,66Е-08 2.66E-08 IFIT2 IFIT2 5Д7Е-05 5D7E-05 Н2-АВ1 H2-AV1 3,62Е-08 3.62E-08 ТВК1 TVK1 5,83Е-05 5.83E-05 Н2-АА H2-AA 4,93Е-08 4.93E-08 IFI35 IFI35 7,52Е-05 7.52E-05 IFI44L IFI44L 8,05Е-08 8.05E-08 SH2D1B1 SH2D1B1 4,08Е-04 4.08E-04 IFNAR2 IFNAR2 1Д ЗЕ-07 1D ZE-07 IFITM2 IFITM2 5,30Е-04 5.30E-04

- 89 045330- 89 045330

IRGM2 IRGM2 1Д8Е-07 1D8E-07 IFI27 IFI27 6,90Е-04 6.90E-04 СПТА SPTA 1,68Е-07 1.68E-07 ULBP1 ULBP1 9,81Е-04 9.81E-04 CD3E CD3E 4,62Е-07 4.62E-07 ТМЕМ173 TMEM173 1Д0Е-03 1D0E-03 IFNGR1 IFNGR1 5,77Е-07 5.77E-07 Н60А H60A 2,91Е-03 2.91E-03 IF ПИ IF PI 7,59Е-07 7.59E-07 IFIT1 IFIT1 3,52Е-03 3.52E-03 IRF8 IRF8 1Д7Е-06 1D7E-06 IL12RB2 IL12RB2 1,78Е-02 1.78E-02 IRF7 IRF7 1Д9Е-06 1D9E-06 NOS2 NOS2 1,79Е-02 1.79E-02 NLRC5 NLRC5 1,46Е-06 1.46E-06 RUNX3 RUNX3 9,02Е-02 9.02E-02 EOMES EOMES 1,95Е-06 1.95E-06 CCR7 CCR7 2Д7Е-01 2D7E-01 IFNAR1 IFNAR1 3,85Е-06 3.85E-06 FADD FADD 2Д7Е-01 2D7E-01 CXCL16 CXCL16 6,82Е-06 6.82E-06 IFITM1 IFITM1 6Д0Е-01 6D0E-01 IFI44 IFI44 8,06Е-06 8.06E-06 MAVS MAVS 8,59Е-01 8.59E-01

Дополнительная таблица 3СSupplementary Table 3C

Гены, участвующие в вычислении оценки пути МНС Genes involved in MHC pathway score calculation Р-значение P-value Н2-Т23 N2-T23 2,70Е-09 2.70E-09 KLRK1 KLRK1 3,47Е-08 3.47E-08 Н2-АВ1 H2-AV1 3,62Е-08 3.62E-08 Н2-ЕВ1 H2-EB1 4,45Е-08 4.45E-08 Н2-АА H2-AA 4,93Е-08 4.93E-08 CTSH CTSH 5,80Е-08 5.80E-08 CD74 CD74 7Д5Е-08 7D5E-08 MR1 MR1 9,98Е-08 9.98E-08 H2-DMA H2-DMA 1ДЗЕ-07 1DZE-07 СПТА SPTA 1,68Е-07 1.68E-07 ТАР1 TAR1 2Д2Е-07 2D2E-07 FCER1G FCER1G 2Д1Е-07 2D1E-07 LAG3 LAG3 8Д4Е-07 8D4E-07 CD 160 CD 160 1,02Е-06 1.02E-06 FCGR3 FCGR3 1,1 ЗЕ-06 1.1 ZE-06 NLRC5 NLRC5 1,46Е-06 1.46E-06 FCGR1 FCGR1 1Д0Е-06 1D0E-06 ТАРВР TARVR 1ДЗЕ-06 1DZE-06

- 90 045330- 90 045330

H2-K1 H2-K1 9,48Е-06 9.48E-06 H2-D1 H2-D1 3,80Е-05 3.80E-05 TAP2 TAP2 4,89Е-05 4.89E-05 PML P.M.L. 5,37Е-05 5.37E-05 H2-M3 H2-M3 5,67Е-05 5.67E-05 FCGR2B FCGR2B 6,05Е-05 6.05E-05 H2-DMB1 H2-DMB1 1,80Е-04 1.80E-04 CD1D1 CD1D1 8,57Е-04 8.57E-04 H2-DMB2 H2-DMB2 1Д7Е-02 1D7E-02 H2-Q2 H2-Q2 4,41Е-02 4.41E-02 H2-OB H2-OB 1,92Е-01 1.92E-01 CD40LG CD40LG 8Д7Е-01 8D7E-01 Дополнительная таблица 3D Additional table 3D Гены, участвующие в вычислении Genes involved in calculation Р-значение P-value оценки пути процессирования антигена assessing the antigen processing pathway Н2-Т23 N2-T23 2,70Е-09 2.70E-09 Н2-АВ1 H2-AV1 3,62Е-08 3.62E-08 Н2-ЕВ1 H2-EB1 4,45Е-08 4.45E-08 Н2-АА H2-AA 4,93Е-08 4.93E-08 Н2-ЕА-Р N2-EA-R 4,94Е-08 4.94E-08 NOD1 NOD1 4,97Е-08 4.97E-08 CD74 CD74 7,35Е-08 7.35E-08 MR1 MR1 9,98Е-08 9.98E-08 H2-DMA H2-DMA 1,ЗЗЕ-07 1,ZZE-07 PSMB8 PSMB8 2,03Е-07 2.03E-07 ТАР1 TAR1 2,32Е-07 2.32E-07 FCER1G FCER1G 2/HE-07 2/HE-07 FCGR3 FCGR3 1,1 ЗЕ-06 1.1 ZE-06 FCGR1 FCGR1 1,50Е-06 1.50E-06 ТАРВР TARVR 1,53Е-06 1.53E-06 PSMB9 PSMB9 2,02Е-06 2.02E-06 SLC11A1 SLC11A1 2,53Е-06 2.53E-06 ICAM1 ICAM1 6,84Е-06 6.84E-06

- 91 045330- 91 045330

H2-K1 H2-K1 9,48Е-06 9.48E-06 H2-D1 H2-D1 3,80Е-05 3.80E-05 TAP2 TAP2 4,89Е-05 4.89E-05 H2-M3 H2-M3 5,67Е-05 5.67E-05 FCGR2B FCGR2B 6,05Е-05 6.05E-05 H2-DMB1 H2-DMB1 1,80Е-04 1.80E-04 CD1D1 CD1D1 8,57Е-04 8.57E-04 H2-DMB2 H2-DMB2 1,17Е-02 1.17E-02 H2-Q2 H2-Q2 4,41Е-02 4.41E-02 RELB RELB 1,55Е-01 1.55E-01 H2-OB H2-OB 1,92Е-01 1.92E-01 CCR7 CCR7 2Д7Е-01 2D7E-01 NOD2 NOD2 2,69Е-01 2.69E-01 Гены, участвующие в вычислении оценки пути TLR TLR6 TICAM2 TLR7 TLR8 TLR9 TLR1 TLR2 CD86 TLR3 ТВК1 IRAK2 PRKCE TIC АМ 1 Genes involved in TLR pathway score calculation TLR6 TICAM2 TLR7 TLR8 TLR9 TLR1 TLR2 CD86 TLR3 TVK1 IRAK2 PRKCE TIC AM 1 Дополнительная таблица 3Е Р-значение 1,24Е-08 1,88Е-08 4,46Е-08 9,04Е-08 1,23Е-07 2,11Е-07 3,63Е-06 1,68Е-05 2,63Е-05 5,83Е-05 1,44Е-04 3,72Е-04 8,09Е-04 Supplementary Table 3E P-value 1.24E-08 1.88E-08 4.46E-08 9.04E-08 1.23E-07 2.11E-07 3.63E-06 1.68E-05 2.63E-05 5.83E-05 1.44E-04 3.72E-04 8.09E-04 IRF4 IRF4 1,47Е-03 1.47E-03 TRAF6 TRAF6 1,63Е-03 1.63E-03 TLR4 TLR4 1,69Е-03 1.69E-03 TLR5 TLR5 1,90Е-03 1.90E-03

- 92 045330- 92 045330

MYD88 MYD88 4,49Е-03 4.49E-03 GFI1 GFI1 4,88Е-03 4.88E-03 МАРЗК7 MARZK7 1,43Е-02 1.43E-02 IRF3 IRF3 3,71Е-02 3.71E-02 МАРКАРК2 MARKARK2 1,16Е-01 1.16E-01 IRAKI IRAKI 1,39Е-01 1.39E-01 NFKBIA NFKBIA 1,62Е-01 1.62E-01 TRAF3 TRAF3 6,07Е-01 6.07E-01 TIRAP TIRAP 9,18Е-01 9.18E-01

Дополнительная таблица 4Supplementary Table 4

Антитела для проточной цитометрии ___________________Antibodies for flow cytometry ___________________

Антитело Antibody Клон Clone № по каталогу No. by catalog Поставщик Provider Антитело BUV737 крысы к CD4 мыши Antibody BUV737 rat to CD4 mice RM4-5 RM4-5 564933 564933 BD Biosciences BD Biosciences Антитело BV421 крысы к CD8a мыши Rat antibody BV421 CD8a mice 53-6,7 53-6.7 563898 563898 BD Biosciences BD Biosciences Антитело BV510 крысы к CD 11b Antibody BV510 rat to CD 11b М1/70 M1/70 562950 562950 BD Biosciences BD Biosciences Антитело BUV737 крысы к CD 11b Antibody BUV737 rat to CD 11b М1/70 M1/70 564443 564443 BD Biosciences BD Biosciences Антитело BV421 хомяка к CD 11с мыши Hamster BV421 antibody CD 11c mouse HL3 HL3 562782 562782 BD Biosciences BD Biosciences Антитело ВВ700 крысы к CD 19 мыши Rat antibody BB700 CD 19 mouse 1D3 1D3 566411 566411 BD Biosciences BD Biosciences Антитело FITC крысы к CD24 мыши Rat FITC antibody to CD24 mice М1/69 M1/69 11-0242-81 11-0242-81 ThermoFisher Scientific ThermoFisher Scientific Антитело BV650 крысы к CD25 мыши Antibody BV650 rat to CD25 mouse РС61 RS61 564021 564021 BD Biosciences BD Biosciences Антитело BV786 мыши к CD45.2 мыши Antibody BV786 mouse to CD45.2 mice 104 104 563686 563686 BD Biosciences BD Biosciences Антитело АРС/Су7 крысы к CD90.2 мыши Rat APC/Cy7 antibody CD90.2 mice 30-Н12 30-N12 105328 105328 BioLegend BioLegend Антитело АРС хомяка к CD 103 мыши Hamster APC antibody CD 103 mouse 2Е7 2E7 17-1031-80 17-1031-80 ThermoFisher Scientific ThermoFisher Scientific

--

Claims (69)

Антитело РЕ крысы к CD274 мыши MIH5 558091 BD BiosciencesRat PE antibody to CD274 mice MIH5 558091 BD Biosciences Антитело РЕ хомяка к CD279 (PD-1) мыши J43 12-9985-82 ThermoFisher ScientificHamster PE antibody to mouse CD279 (PD-1) J43 12-9985-82 ThermoFisher Scientific Антитело FITC крысы к CD335 (NKp46) мыши 29А1,4 560756 BD BiosciencesRat FITC anti-mouse CD335 (NKp46) antibody 29A1.4 560756 BD Biosciences Антитело BV650 крысы к F4/80 мыши ВМ8 123149 BioLegendAntibody BV650 rat to F4/80 mouse VM8 123149 BioLegend Антитело АРС крысы к FOXP3 мыши FJK-16S 17-5773 ThermoFisher ScientificRat APC antibody to FOXP3 mice FJK-16S 17-5773 ThermoFisher Scientific Антитело ВV711 крысы к Ly-бС мыши НК1,4 128037 BioLegendRat anti-mouse Ly-bC antibody BV711 NK1,4 128037 BioLegend Антитело АРС-Н7 крысы к Ly-6G мыши 1А8 565369 BD BiosciencesAntibody APC-H7 rat to mouse Ly-6G 1A8 565369 BD Biosciences Антитело BV510 крысы к IA/I-E (МНСП) мыши М5/114,15,2 107635 BioLegendRat anti-mouse IA/I-E (MNSP) antibody BV510 M5/114.15.2 107635 BioLegend Антитело ВV711 хомяка к TCR β-цепи мыши Н57-597 563135 BD BiosciencesHamster antibody BV711 to mouse TCR β-chain H57-597 563135 BD Biosciences Настоящее изобретение описано с использованием предпочтительных вариантов осуществления. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено раскрытыми вариантами осуществления. Понятно, что, учитывая описание вариантов осуществления настоящего изобретения, приведенных в данном документе, специалист в данной области может выполнить различные модификации. Такие модификации охватываются формулой изобретения, приведенной ниже.The present invention has been described using preferred embodiments. However, it should be understood that the present invention is not limited to the disclosed embodiments. It will be understood that, given the description of the embodiments of the present invention given herein, various modifications can be made by one skilled in the art. Such modifications are covered by the claims below. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение комбинации для лечения рака, опосредованного мутацией KRAS G12C, где комбинация включает:1. Use of a combination for the treatment of cancer mediated by the KRAS G12C mutation, where the combination includes: a) терапевтически эффективное количество (1М)-6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2(2-пропанил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2-пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин2(1H)-она (соторасиб) или его фармацевтически приемлемую соль иa) a therapeutically effective amount of (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2(2-propanyl)-3-pyridinyl)-4-((2S) -2-methyl-4-(2-propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin2(1H)-one (sothorasib) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and b) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного фармацевтически активного средства, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин, антитело к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор mTOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.b) a therapeutically effective amount of at least one additional pharmaceutically active agent, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin, anti-PD-1 antibody, MEK inhibitor, EGFR inhibitor, mTOR inhibitor, SHP2 inhibitor, PI3K inhibitor or AKT inhibitor . 2. Применение по п.1, где рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки, рак аппендикса, колоректальный рак, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак желудка, рак полости носа, рак головного мозга или рак желчных протоков.2. Use according to claim 1, wherein the cancer is non-small cell lung cancer, small bowel cancer, appendix cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, pancreatic cancer, skin cancer, stomach cancer, nasal cancer, brain cancer or bile duct cancer . 3. Применение по п.1 или 2, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.3. Use according to claim 1 or 2, wherein the cancer is pancreatic cancer. 4. Применение по п.1 или 2, где рак представляет собой колоректальный рак.4. Use according to claim 1 or 2, wherein the cancer is colorectal cancer. 5. Применение по п.1 или 2, где рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого.5. Use according to claim 1 or 2, wherein the cancer is non-small cell lung cancer. 6. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одним дополнительным фармацевтически активным средством является карбоплатин.6. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin. 7. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой антитело к PD-1.7. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody. 8. Применение по п.7, где антитело к PD-1 представляет собой AMG 404, пембролизумаб или ниволумаб.8. Use according to claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody is AMG 404, pembrolizumab or nivolumab. 9. Применение по п.7, где антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб.9. Use according to claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody is pembrolizumab. 10. Применение по п.7, где антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб.10. Use according to claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody is nivolumab. 11. Применение по п.7, где антитело к PD-1 содержит аминокислотную последовательность, определяющую комплементарность (CDR) области тяжелой цепи (НС) 1, содержащую SEQ ID NO: 1, амино-11. Use according to claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody comprises the amino acid sequence complementarity determining region (CDR) of the heavy chain region (HC) 1 containing SEQ ID NO: 1, amino- - 94 045330 кислотную последовательность CDR2 НС, содержащую SEQ ID NO: 2; аминокислотную последовательность НС CDR3, содержащую SEQ ID NO: 3; аминокислотную последовательность легкой цепи (LC)- 94 045330 acidic sequence CDR2 HC containing SEQ ID NO: 2; amino acid sequence of HC CDR3 containing SEQ ID NO: 3; light chain (LC) amino acid sequence CDR1, содержащую SEQ ID NO: 4; аминокислотную последовательность LC CDR2, содержащую SEQ IDCDR1 containing SEQ ID NO: 4; amino acid sequence LC CDR2 containing SEQ ID NO: 5; и аминокислотную последовательность LC CDR3, содержащую SEQ ID NO: 6.NO: 5; and the amino acid sequence of LC CDR3 containing SEQ ID NO: 6. 12. Применение по п.7, где антитело к PD-1 содержит последовательность области тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и области легкой цепи SEQ ID NO: 8.12. Use according to claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody contains the sequence of the heavy chain region of SEQ ID NO: 7 and the light chain region of SEQ ID NO: 8. 13. Применение по п.7, где антитело к PD-1 содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10.13. The use of claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody comprises a heavy chain sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain sequence of SEQ ID NO: 10. 14. Применение по п.7, где антитело к PD-1 представляет собой AMG 404.14. Use according to claim 7, wherein the anti-PD-1 antibody is AMG 404. 15. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор MEK.15. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is a MEK inhibitor. 16. Применение по п.15, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб, пимасертиб, PD325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973 или AZD8330.16. The use of claim 15, wherein the MEK inhibitor is trametinib, pimasertib, PD325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973 or AZD8330. 17. Применение по п.16, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.17. Use according to claim 16, wherein the MEK inhibitor is trametinib. 18. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.18. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor. 19. Применение по п.18, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб, эрлотиниб, лапатиниб, цетуксимаб или панитумумаб.19. Use according to claim 18, wherein the EGFR inhibitor is afatinib, erlotinib, lapatinib, cetuximab or panitumumab. 20. Применение по п.19, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.20. Use according to claim 19, wherein the EGFR inhibitor is afatinib. 21. Применение по п.19, где ингибитор EGFR представляет собой панитумумаб.21. Use according to claim 19, wherein the EGFR inhibitor is panitumumab. 22. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.22. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor. 23. Применение по п.22, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.23. Use according to claim 22, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550. 24. Применение по п.22, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.24. Use according to claim 22, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630. 25. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор mTOR.25. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an mTOR inhibitor. 26. Применение по п.25, где ингибитор mTOR представляет собой рапамицин или эверолимус.26. Use according to claim 25, wherein the mTOR inhibitor is rapamycin or everolimus. 27. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор PI3K.27. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is a PI3K inhibitor. 28. Применение по п.27, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511 или бупарлисиб.28. Use according to claim 27, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511 or buparlisib. 29. Применение по п.28, где ингибитор PI3K представляет собой AMG 511.29. Use according to claim 28, wherein the PI3K inhibitor is AMG 511. 30. Применение по п.28, где ингибитор PI3K представляет собой бупарлисиб.30. Use according to claim 28, wherein the PI3K inhibitor is buparlisib. 31. Применение по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор AKT.31. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an AKT inhibitor. 32. Применение по п.31, где ингибитор AKT представляет собой AZD5363.32. Use according to claim 31, wherein the AKT inhibitor is AZD5363. 33. Применение по любому из пп.1-32, где пациент является взрослым.33. Use according to any one of claims 1 to 32, where the patient is an adult. 34. Применение по любому из пп.1-33, где (1М)-6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2пропанил)-3 -пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2-пропеноил)-1 -пиперазинил)пиридо[2,3 -d]пиримидин-2( 1 Н)-он и дополнительное фармацевтически активное средство вводят одновременно как отдельные лекарственные средства или раздельно.34. Use according to any one of claims 1 to 33, where (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2propanyl)-3-pyridinyl) -4-((2S)-2-methyl-4-(2-propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one and the additional pharmaceutically active agent are administered simultaneously as separate medicines or separately. 35. Способ лечения рака, опосредованного мутацией KRAS G12C, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества (1М)-6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4метuл-2-(2-nропанuл)-3-пuридинuл)-4-((2S)-2-метuл-4-(2-пропеноuл)-1-пиперαзинuл)пuридо[2,3-d]пuрuмидин2(1Н)-она (соторасиб) и терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного фармацевтически активного средства, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин, антитело к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор mTOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.35. A method of treating cancer mediated by the KRAS G12C mutation, comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4methyl-2-( 2-propanyl)-3-pyridinyl)-4-((2S)-2-methyl-4-(2-propenol)-1-piperαzinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin2(1H)-one (sotorasib) and a therapeutically effective amount of at least one additional pharmaceutically active agent, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin, an anti-PD-1 antibody, a MEK inhibitor, an EGFR inhibitor, an mTOR inhibitor, a SHP2 inhibitor, a PI3K inhibitor, or an AKT inhibitor. 36. Способ по п.35, где рак представляет собой рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак легкого, рак аппендикса, рак эндометрия или рак тонкой кишки.36. The method of claim 35, wherein the cancer is pancreatic cancer, colorectal cancer, lung cancer, appendix cancer, endometrial cancer or small bowel cancer. 37. Способ по п.35 или 36, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.37. The method according to claim 35 or 36, wherein the cancer is pancreatic cancer. 38. Способ по п.35 или 36, где рак представляет собой колоректальный рак.38. The method according to claim 35 or 36, wherein the cancer is colorectal cancer. 39. Способ по п.35 или 36, отличающийся тем, что рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).39. The method according to claim 35 or 36, characterized in that the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC). 40. Способ по любому из пп.35-39, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин.40. The method according to any one of claims 35-39, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin. 41. Способ по любому из пп.35-39, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор на основе антитела к PD-1.41. The method according to any one of claims 35-39, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody inhibitor. 42. Способ по п.41, где ингибитор на основе антитела к PD-1 выбирают из AMG 404, пембролизумаба и ниволумаба.42. The method of claim 41, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is selected from AMG 404, pembrolizumab and nivolumab. 43. Способ по п.41, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб.43. The method of claim 41, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is pembrolizumab. 44. Способ по любому из пп.35-39, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор MEK.44. The method according to any one of claims 35-39, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is a MEK inhibitor. - 95 045330- 95 045330 45. Способ по п.44, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб, пимасертиб, PD-325901,45. The method of claim 44, wherein the MEK inhibitor is trametinib, pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973 или AZD8330.MEK162, TAK-733, GDC-0973 or AZD8330. 46. Способ по п.44, где ингибитор MEK представляет собой траметиниб.46. The method of claim 44, wherein the MEK inhibitor is trametinib. 47. Способ по любому из пп.35-39, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.47. The method according to any one of claims 35-39, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor. 48. Способ по п.47, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб, эрлотиниб, лапатиниб, цетуксимаб или панитумумаб.48. The method of claim 47, wherein the EGFR inhibitor is afatinib, erlotinib, lapatinib, cetuximab or panitumumab. 49. Способ по п.47, где ингибитор EGFR представляет собой афатиниб.49. The method of claim 47, wherein the EGFR inhibitor is afatinib. 50. Способ по п.47, где ингибитор EGFR представляет собой панитумумаб.50. The method of claim 47, wherein the EGFR inhibitor is panitumumab. 51. Способ по любому из пп.35-39, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.51. The method according to any one of claims 35 to 39, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor. 52. Способ по п.51, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4550.52. The method of claim 51, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4550. 53. Способ по п.51, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.53. The method of claim 51, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630. 54. Способ по любому из пп.35-53, где пациент является взрослым.54. The method according to any one of claims 35-53, where the patient is an adult. 55. Способ по любому из пп.35-54, где (1М)-6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2пропанил)-3-пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2-пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин2(1Н)-он и дополнительное фармацевтически активное средство вводят одновременно как отдельные лекарственные средства или раздельно.55. Method according to any one of claims 35-54, where (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2propanyl)-3-pyridinyl) -4-((2S)-2-methyl-4-(2-propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin2(1H)-one and the additional pharmaceutically active agent are administered simultaneously as separate drugs or apart. 56. Набор для лечения рака, опосредованного мутацией KRAS G12C, содержащий терапевтически эффективное количество (1М)-6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропанил)-3пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2-пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-она (соторасиб) или его фармацевтически приемлемой соли; и терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного фармацевтически активного средства, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой карбоплатин, антитело к PD-1, ингибитор MEK, ингибитор EGFR, ингибитор mTOR, ингибитор SHP2, ингибитор PI3K или ингибитор AKT.56. A kit for the treatment of cancer mediated by the KRAS G12C mutation, containing a therapeutically effective amount of (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl) -3pyridinyl)-4-((2S)-2-methyl-4-(2-propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one (sotorasib) or a pharmaceutically acceptable compound thereof salt; and a therapeutically effective amount of at least one additional pharmaceutically active agent, wherein the at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin, an anti-PD-1 antibody, a MEK inhibitor, an EGFR inhibitor, an mTOR inhibitor, a SHP2 inhibitor, a PI3K inhibitor, or an AKT inhibitor. 57. Набор по п.56, где рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки, рак аппендикса, колоректальный рак, рак эндометрия, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак желудка, рак полости носа, рак головного мозга или рак желчного протока.57. The kit of claim 56, wherein the cancer is non-small cell lung cancer, small bowel cancer, appendix cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, pancreatic cancer, skin cancer, stomach cancer, nasal cancer, brain cancer or bile duct cancer . 58. Набор по п.56 или 57, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.58. The kit according to claim 56 or 57, wherein the cancer is pancreatic cancer. 59. Набор по п.56 или 57, где рак представляет собой колоректальный рак.59. The kit according to claim 56 or 57, wherein the cancer is colorectal cancer. 60. Набор по п.56 или 57, где рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого.60. The kit according to claim 56 or 57, wherein the cancer is non-small cell lung cancer. 61. Набор по любому из пп.56-60, где по меньшей мере одним дополнительным фармацевтически активным средством является карбоплатин.61. The kit according to any one of claims 56 to 60, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is carboplatin. 62. Набор по любому из пп.56-60, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор на основе антитела к PD-1.62. The kit according to any one of claims 56-60, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an anti-PD-1 antibody inhibitor. 63. Набор по п.62, где ингибитор на основе антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб.63. The kit of claim 62, wherein the anti-PD-1 antibody inhibitor is pembrolizumab. 64. Набор по любому из пп.56-60, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор EGFR.64. The kit according to any one of claims 56-60, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an EGFR inhibitor. 65. Набор по п.64, где ингибитор EGFR представляет собой панитумумаб.65. The kit according to claim 64, wherein the EGFR inhibitor is panitumumab. 66. Набор по любому из пп.56-60, где по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой ингибитор SHP2.66. The kit according to any one of claims 56-60, wherein at least one additional pharmaceutically active agent is an SHP2 inhibitor. 67. Набор по п.66, где ингибитор SHP2 представляет собой RMC 4630.67. The kit according to claim 66, wherein the SHP2 inhibitor is RMC 4630. 68. Набор по любому из пп.56-67, где пациент является взрослым.68. The kit according to any one of claims 56-67, where the patient is an adult. 69. Набор по любому из пп.56-68, где (1М)-6-фтор-7-(2-фтор-6-гидроксифенил)-1-(4-метил-2-(2-пропанил)3-пиридинил)-4-((2S)-2-метил-4-(2-пропеноил)-1-пиперазинил)пиридо[2,3-d]пиримидин-2(1Н)-он и дополнительное фармацевтически активное средство вводят одновременно как отдельные лекарственные средства или раздельно.69. The kit according to any one of claims 56-68, where (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)-1-(4-methyl-2-(2-propanyl)3-pyridinyl )-4-((2S)-2-methyl-4-(2-propenoyl)-1-piperazinyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-one and the additional pharmaceutically active agent are administered simultaneously as separate medicines or separately.
EA202191415 2018-11-19 2019-11-18 COMBINATION THERAPY INCLUDING A KRASG12C INHIBITOR AND ONE OR MORE ADDITIONAL PHARMACEUTICALLY ACTIVE AGENTS FOR THE TREATMENT OF CANCER EA045330B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/769,355 2018-11-19
US62/821,376 2019-03-20
US62/865,819 2019-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045330B1 true EA045330B1 (en) 2023-11-16

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11918584B2 (en) Combination therapy including a KRASG12C inhibitor and one or more additional pharmaceutically active agents for the treatment of cancers
US11306087B2 (en) Inhibitors of KRAS G12C and methods of using the same
JP7357644B2 (en) KRAS G12C inhibitors for treating cancer
CN113015724A (en) Improved synthesis of key intermediates of KRAS G12C inhibitor compounds
CN114728960A (en) Improved synthesis of KRAS G12C inhibitor compounds
JP2023501522A (en) Improved Synthesis of KRAS G12C Inhibitor Compounds
TW202308632A (en) Methods for inhibiting ras
JP2024501280A (en) SOS1 inhibitors and their uses
Lipford et al. Combination therapy including a KRASG12c inhibitor and one or more additional pharmaceutically active agents for the treatment of cancers
EA045330B1 (en) COMBINATION THERAPY INCLUDING A KRASG12C INHIBITOR AND ONE OR MORE ADDITIONAL PHARMACEUTICALLY ACTIVE AGENTS FOR THE TREATMENT OF CANCER
US20230338342A1 (en) Methods of treating ribonucleotide reductase-related diseases with a ribonucleotide reductase inhibitor
WO2023172940A1 (en) Methods for treating immune refractory lung cancer
EA045678B1 (en) IMPROVED SYNTHESIS OF A KEY INTERMEDIATE TO PRODUCE A G12C KRAS INHIBITOR COMPOUND