EA045198B1 - MACROMOLECULAR PRODRUGS ON A POLYMER BASE - Google Patents
MACROMOLECULAR PRODRUGS ON A POLYMER BASE Download PDFInfo
- Publication number
- EA045198B1 EA045198B1 EA202190799 EA045198B1 EA 045198 B1 EA045198 B1 EA 045198B1 EA 202190799 EA202190799 EA 202190799 EA 045198 B1 EA045198 B1 EA 045198B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peg
- prodrug
- tumor
- treatment
- cells
- Prior art date
Links
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 title claims description 97
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 title claims description 97
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 96
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- FJHBVJOVLFPMQE-QFIPXVFZSA-N 7-Ethyl-10-Hydroxy-Camptothecin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CC)=C(CN3C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=C33)=O)C3=NC2=C1 FJHBVJOVLFPMQE-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 78
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 40
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 37
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 35
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 34
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 32
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 30
- VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N camptothecin Chemical compound C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 28
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 21
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 14
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 13
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 13
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 13
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 13
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 13
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 12
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 12
- -1 polyoxypropylene Polymers 0.000 description 12
- ABSNGNUGFQIDDO-UHFFFAOYSA-N 2-benzylguanidine Chemical compound NC(N)=NCC1=CC=CC=C1 ABSNGNUGFQIDDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 11
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N vorinostat Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960000237 vorinostat Drugs 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 9
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 8
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 8
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 8
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 8
- KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N Camptothecin Natural products CCC1(O)C(=O)OCC2=C1C=C3C4Nc5ccccc5C=C4CN3C2=O KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 7
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 229940127093 camptothecin Drugs 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N dl-camptothecin Natural products C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)C5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 5
- PTJWCLYPVFJWMP-UHFFFAOYSA-N 2-[[3-hydroxy-2-[[3-hydroxy-2,2-bis(hydroxymethyl)propoxy]methyl]-2-(hydroxymethyl)propoxy]methyl]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical group OCC(CO)(CO)COCC(CO)(CO)COCC(CO)(CO)CO PTJWCLYPVFJWMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MYQKIWCVEPUPIL-QFIPXVFZSA-N 7-ethylcamptothecin Chemical compound C1=CC=C2C(CC)=C(CN3C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=C33)=O)C3=NC2=C1 MYQKIWCVEPUPIL-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 4
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 4
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 238000011717 athymic nude mouse Methods 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- INVTYAOGFAGBOE-UHFFFAOYSA-N entinostat Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC(=O)OCC1=CC=CN=C1 INVTYAOGFAGBOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229950005837 entinostat Drugs 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 3
- 229940123780 DNA topoisomerase I inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical group CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000365 Topoisomerase I Inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical group OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 3
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000036558 skin tension Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000014061 Extranodal Extension Diseases 0.000 description 2
- 102100039996 Histone deacetylase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101001035024 Homo sapiens Histone deacetylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 101150108975 Rhd gene Proteins 0.000 description 2
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 108700022368 Whn Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011654 childhood malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 2
- 210000000028 corpus adiposum pararenale Anatomy 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- OAOSXODRWGDDCV-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine;4-methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 OAOSXODRWGDDCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 2
- ITJNARMNRKSWTA-UHFFFAOYSA-N nisoxetine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CCNC)OC1=CC=CC=C1OC ITJNARMNRKSWTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950004211 nisoxetine Drugs 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-chloro-diphenylsilane Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Si](Cl)(C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 2
- GWKLNCUXOUHWLL-UHFFFAOYSA-N 2-(2-phenylethyl)guanidine Chemical compound NC(=N)NCCC1=CC=CC=C1 GWKLNCUXOUHWLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101100087409 Arabidopsis thaliana RH18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100468589 Arabidopsis thaliana RH30 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108700012912 MYCN Proteins 0.000 description 1
- 101150022024 MYCN gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010049586 Norepinephrine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100033929 Sodium-dependent noradrenaline transporter Human genes 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N Tyramine Natural products NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 1
- ZULJYVVAYGFYKU-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;chloroform Chemical compound CC#N.ClC(Cl)Cl ZULJYVVAYGFYKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 231100000899 acute systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002888 effect on disease Effects 0.000 description 1
- 230000007608 epigenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- CBOIHMRHGLHBPB-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl Chemical group O[CH2] CBOIHMRHGLHBPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011368 intensive chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000008095 long lasting therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000011294 monotherapeutic Methods 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- GRJJQCWNZGRKAU-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;fluoride Chemical compound F.C1=CC=NC=C1 GRJJQCWNZGRKAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- GOQZIPJCBUYLIR-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-[n-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]-n'-(trifluoromethylsulfonyl)carbamimidoyl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC(=NS(=O)(=O)C(F)(F)F)NC(=O)OC(C)(C)C GOQZIPJCBUYLIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000037 tert-butyldiphenylsilyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[Si]([H])([*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229920000428 triblock copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 description 1
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O tyraminium Chemical compound [NH3+]CCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственную заявку (заявки)Cross reference to related application(s)
В настоящей заявке испрашивается преимущество даты подачи предварительной заявки США с серийным номером 62/732199, поданной 17 сентября 2018 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки для всех целей.This application claims benefit of the filing date of US Provisional Application Serial No. 62/732199, filed September 17, 2018, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.
Область, к которой относится изобретениеField to which the invention relates
Предложены макромолекулярные пролекарства, в которых аналоги камптотецина ковалентно связаны с полимерами через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях. Также предложены способы лечения рака, в частности нейробластомы, макромолекулярными пролекарствами.Macromolecular prodrugs have been proposed in which analogs of camptothecin are covalently linked to polymers through ester bonds that are labile under physiological conditions. Methods for treating cancer, in particular neuroblastoma, with macromolecular prodrugs are also proposed.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention
Нейробластома (NB) остается самой распространенной и смертельно опасной солидной опухолью детского возраста, на которую приходится 8-10% всех детских раковых заболеваний и 15% случаев смерти от рака у детей. Несмотря на улучшение показателей излечения других детских новообразований, выживаемость пациентов с NB отстает.Neuroblastoma (NB) remains the most common and deadly solid tumor of childhood, accounting for 8–10% of all childhood cancers and 15% of childhood cancer deaths. Despite improved cure rates for other childhood malignancies, survival for patients with NB lags.
Интенсивная мультимодальная терапия, используемая в настоящее время в клинике, терпит неудачу более чем у половины пациентов (у 50-60% пациентов наблюдается рецидив без каких-либо приводящих к выздоровлению методов консервативной терапии), причем наиболее серьезную терапевтическую проблему представляет подгруппа пациентов с отсутствием реакции на лечение, которую определяют как категорию сверхвысокого риска. В настоящее время к NB высокого риска с ее очень разнообразной этиологией и преобладанием биологически неблагоприятных вариантов применяют мощные противораковые средства в качестве лечения первой линии, включая ингибиторы топоизомеразы I семейства камптотецинов: топотекан и иринотекан. Однако их клиническое использование в контексте агрессивного заболевания остается неоптимальным, давая плохие результаты у пациентов с рецидивирующей или рефрактерной NB из-за дозолимитирующих побочных эффектов и приобретенной устойчивости к лекарственным средствам. Важно отметить, что неэффективность лечения у этих пациентов была связана с увеличением пороговых уровней лекарственных средств, необходимых для эффективного подавления роста NB клеток, на 1-3 порядка, достигая значений, недостижимых клинически.Intensive multimodal therapy currently used clinically fails in more than half of patients (50-60% of patients relapse without any curative conservative treatment), with the subgroup of patients who fail to respond the most serious therapeutic challenge for treatment, which is defined as an ultra-high-risk category. High-risk NB, with its highly diverse etiology and predominance of biologically unfavorable variants, is now treated with potent anticancer agents as first-line treatment, including the camptothecin family topoisomerase I inhibitors: topotecan and irinotecan. However, their clinical use in the context of aggressive disease remains suboptimal, yielding poor results in patients with relapsed or refractory NB due to dose-limiting side effects and acquired drug resistance. Importantly, treatment failure in these patients was associated with an increase in drug threshold levels required to effectively inhibit NB cell growth by 1 to 3 orders of magnitude, reaching values not achievable clinically.
Таким образом, для борьбы с рефрактерной NB необходимы альтернативные терапевтические подходы, которые могут заметно усилить внутриопухолевую доставку и продлить присутствие лекарственного средства на терапевтически эффективных уровнях без увеличения системного воздействия. Описанные в настоящей заявке варианты осуществления направлены на удовлетворение этой потребности.Thus, to combat refractory NB, alternative therapeutic approaches are needed that can markedly enhance intratumoral delivery and prolong drug presence at therapeutically effective levels without increasing systemic exposure. The embodiments described herein are aimed at meeting this need.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
В первом варианте осуществления представлено макромолекулярное пролекарство, которое представляет собой PEG-[SN22]4, который представлен следующей структурой:In the first embodiment, a macromolecular prodrug is provided, which is PEG-[SN22]4, which is represented by the following structure:
в котором n=110 в среднем иin which n=110 on average and
PE представляет собойPE represents
Н.С--'1N.S--'1
--К;С—С—СНэ-ъс—--TO ; S—S—SNe-ys—
В другом варианте осуществления представлен способ лечения нейробластомы путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства, как определено выше, нуждающемуся в этом субъекту.In another embodiment, a method of treating neuroblastoma is provided by administering an effective amount of a macromolecular prodrug, as defined above, to a subject in need thereof.
В другом варианте осуществления представлен способ лечения субъекта с солидной опухолью путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства, как определено выше, нуждающемуся в этом субъекту.In another embodiment, a method is provided for treating a subject with a solid tumor by administering an effective amount of a macromolecular prodrug, as defined above, to a subject in need thereof.
В другом варианте осуществления представлен способ лечения субъекта с опухолью головного мозга, путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства, как определено выше, нуждающемуся в этом субъекту.In another embodiment, a method of treating a subject with a brain tumor is provided by administering an effective amount of a macromolecular prodrug, as defined above, to a subject in need thereof.
В другом варианте осуществления нуждающимся в этом субъектом является человек.In another embodiment, the subject in need is a human.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фиг. 1: Ингибирование роста хеморезистентных NB клеток [BE(2)C] пролекарством PF108-(SN22)2 по сравнению с SN22 с или без Плюроника F-108 (дозы, эквивалентные 100 нМ SN22). Клетки, необраFig. 1: Inhibition of growth of chemoresistant NB cells [BE(2)C] by prodrug PF108-(SN22) 2 compared to SN22 with or without Pluronic F-108 (doses equivalent to 100 nM SN22). Cells, neobra
- 1 045198 ботанные или обработанные простым химически немодифицированным Плюроником F-108, были включены в качестве контроля. Протестированная продолжительность воздействия составила 24 ч и 30 мин (A и B соответственно). Рост клеток отслеживали с течением времени при помощи биолюминесценции. Результаты показаны как среднее значение ± SD (стандартное отклонение).- 1 045198 botanical or treated with simple chemically unmodified Pluronic F-108 were included as a control. The tested exposure durations were 24 h and 30 min (A and B, respectively). Cell growth was monitored over time using bioluminescence. Results are shown as mean ± SD (standard deviation).
Фиг. 2: Внутриопухолевые уровни SN22, доставленного в качестве пролекарства на основе полоксамера, в сравнении с SN38, вводимым в виде иринотекана, его клинически используемого водорастворимого предшественника (4 ч - 3 дня). Анализ осуществляли на модели ортотопического ксенотрансплантата рефрактерной NB. Бестимусным голым мышам (nu/nu) (n=5) инокулировали в надпочечниковую жировую подушку BE(2)C клетки (106 на животное), суспендированные в 20% Плюроник F-127 (50 мкл). Опухолям давали достичь размера 1,0±0,4 см3 под контролем методом биолюминесцентной визуализации. PF108-(SN22)2 или иринотекан (120 мкл) вводили при помощи инъекции в хвостовую вену в дозе, эквивалентной 10 мг/кг SN22 или SN38 соответственно. Опухоли собирали, взвешивали и анализировали при помощи ВЭЖХ для определения внутриопухолевых уровней лекарственного средства через 4, 24 и 72 ч. Нормализованные по массе концентрации лекарственного средства представлены в сравнении для двух групп как среднее значение ± SD.Fig. 2: Intratumoral levels of SN22 delivered as a poloxamer-based prodrug compared with SN38 administered as irinotecan, its clinically used water-soluble precursor (4 hours - 3 days). The analysis was performed in an orthotopic xenograft model of refractory NB. Athymic nude mice (nu/nu) (n=5) were inoculated into the adrenal fat pad with BE(2)C cells (10 6 per animal) suspended in 20% Pluronic F-127 (50 μl). Tumors were allowed to reach a size of 1.0 ± 0.4 cm 3 under bioluminescent imaging control. PF108-(SN22) 2 or irinotecan (120 μl) was administered by tail vein injection at a dose equivalent to 10 mg/kg SN22 or SN38, respectively. Tumors were harvested, weighed, and analyzed by HPLC to determine intratumoral drug levels at 4, 24, and 72 h. Weight-normalized drug concentrations are compared between the two groups as mean ± SD.
Фиг. 3: Терапевтическая эффективность PF108-(SN22)2 на ортотопической модели рефрактерной NB высокого риска. Мышам инокулировали 106 клеток BE(2)C, стабильно экспрессирующих люциферазу, в соответствии с процедурой, описанной в [44]. Лечение при помощи PF108-(SN22)2 осуществляли путем внутривенного введения в дозе, эквивалентной 10 мг/кг SN22 один раз в неделю в течение 4 недель. Иринотекан, вводимый два раза в неделю в дозе 10 мг/кг SN38, был включен в качестве положительного контроля. Физиологический раствор или химически немодифицированный Плюроник F-108 использовали в качестве отрицательных контролей. Опухоль-ассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа (репрезентативные изображения, полученные через 0-5 недель, показаны на (A). Количественные данные, представленные графически на (B), выражены как среднее значение ± SD. Кривые выживаемости для соответствующих групп животных в течение 5-недельного периода в этом исследовании показаны на (C).Fig. 3: Therapeutic efficacy of PF108-(SN22)2 in an orthotopic model of high-risk refractory NB. Mice were inoculated with 10 6 BE(2)C cells stably expressing luciferase according to the procedure described in [44]. Treatment with PF108-(SN22)2 was administered intravenously at a dose equivalent to 10 mg/kg SN22 once weekly for 4 weeks. Irinotecan administered twice weekly at a dose of 10 mg/kg SN38 was included as a positive control. Saline or chemically unmodified Pluronic F-108 were used as negative controls. Tumor-associated signal was monitored using quantitative bioluminescence analysis (representative images obtained at 0-5 weeks are shown in (A). Quantitative data presented graphically in (B) are expressed as mean ± SD. Survival curves for the corresponding groups of animals over the 5-week period in this study are shown in (C).
Фиг. 4: Исследование антипролиферативного эффекта пролекарства PF108-(SN22)2по сравнению со свободным SN22 с/без холостого Плюроника F-108. Реакцию на лечение сравнивали между NB клетками, проявляющими хемо-наивный фенотип по сравнению с хеморезистентным (IMR32 (A) и BE(2)C (B), соответственно), в зависимости от продолжительности воздействия (0,5, 4 и 24 ч) и дозы (эквивалентной 20, 40 и 80 нг SN22 на лунку). Ответ представлен как % ингибирования роста (среднее значение ± SD) через 7 дней после лечения.Fig. 4: Study of the antiproliferative effect of the prodrug PF108-(SN22) 2 compared to free SN22 with/without blank Pluronic F-108. Response to treatment was compared between NB cells exhibiting a chemo-naïve versus a chemo-resistant phenotype (IMR32 (A) and BE(2)C (B), respectively), depending on the duration of exposure (0.5, 4 and 24 h). and dose (equivalent to 20, 40 and 80 ng SN22 per well). The response is presented as % growth inhibition (mean ± SD) 7 days after treatment.
Фиг. 5: Распределение по органам и внутриопухолевые уровни SN22, доставленного в виде PF108(SN22)2 (4 ч - 3 дня). Анализ осуществляли в ортотопическихих ксенотрансплантатах BE(2)C, которым давали достичь размера 1,0±0,4 см3, под контролем методом биолюминесцентной визуализации. Пролекарство вводили при помощи инъекции в хвостовую вену в дозе, эквивалентной 10 мг/кг SN22. Анализ осуществляли флуориметрическим методом. Количество лекарственного средства показано как % введенной дозы на орган, представленное как среднее значение ± SD.Fig. 5: Organ distribution and intratumoral levels of SN22 delivered as PF108(SN22) 2 (4 hours - 3 days). The analysis was carried out in orthotopic BE(2)C xenografts, which were allowed to reach a size of 1.0±0.4 cm 3 under bioluminescence imaging monitoring. The prodrug was administered by tail vein injection at a dose equivalent to 10 mg/kg SN22. The analysis was carried out using the fluorimetric method. The amount of drug is shown as % of dose administered per organ, presented as mean ± SD.
Фиг. 6: Терапевтическая эффективность PF108-(SN22)2 на ортотопической модели хемо-наивной, MYCN-амплифицированной NB. Мышам инокулировали 106 экспрессирующих люциферазу клеток IMR32. Лечение иринотеканом или PF108-(SN22)2 (10 мг лекарственного средства на кг, 2х и 1х в неделю, соответственно, в течение 4 недель) начинали через 3 недели после инокуляции (A). Альтернативно, PF108-(SN22)2 вводили один раз в неделю в течение 3 недель животным, у которых NB опухоли были в 10 раз больше (B). Опухоль-ассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа. Количественные данные представлены как среднее значение ± SD.Fig. 6: Therapeutic efficacy of PF108-(SN22)2 in an orthotopic model of chemo-naïve, MYCN-amplified NB. Mice were inoculated with 10 6 luciferase-expressing IMR32 cells. Treatment with irinotecan or PF108-(SN22)2 (10 mg drug per kg, 2x and 1x per week, respectively, for 4 weeks) was started 3 weeks after inoculation (A). Alternatively, PF108-(SN22)2 was administered once a week for 3 weeks to animals whose NB tumors were 10 times larger (B). Tumor-associated signal was monitored using a quantitative bioluminescent assay. Quantitative data are presented as mean ± SD.
Фиг. 7: Экспрессия ABCG2 и рост NLF и трансфицированных клонов. (A) Вестерн-анализ осуществляли на NLF и трех одноклеточных клонах с антителом ABCG2 (Santa Cruz) по сравнению с актиновым контролем. Клоны 1, 2 и 3 имели следовые, низкие и промежуточные уровни экспрессии ABCG2, соответственно. (B) Рост NLF и ABCG2-экспрессирующих клонов в присутствии SN38 или SN22 (50 нг/мл). Рост показан на 4-й день.Fig. 7: ABCG2 expression and growth of NLF and transfected clones. (A) Western analysis was performed on NLF and three single-cell clones with ABCG2 antibody (Santa Cruz) compared to actin control. Clones 1, 2, and 3 had trace, low, and intermediate levels of ABCG2 expression, respectively. (B) Growth of NLF and ABCG2-expressing clones in the presence of SN38 or SN22 (50 ng/ml). Growth is shown on the 4th day.
Фиг. 8: Лечение ортотопической модели NB. Хеморезистентные, трансфицированные люциферазой SKNBE(2)C клетки (107) инъецировали в периренальную жировую подушку голых мышей. Мышей разделяли на пять групп: отсутствие лечения, или лечение холостым PEG, CPT-11, PEG-[SN38]4 или PEG[SN22]4 (10 животных на группу). Лечение начинали, когда опухоль достигала около 0,2 см3. Лечение при помощи либо PEG-[SN38]4, либо PEG-[SN22]4 приводило к регрессии опухоли, но только лечение при помощи PEG-[SN22]4 вызывало полное исчезновение опухоли.Fig. 8: Treatment of the orthotopic NB model. Chemoreresistant, luciferase-transfected SKNBE(2)C cells (107) were injected into the perirenal fat pad of nude mice. Mice were divided into five groups: no treatment, or treatment with blank PEG, CPT-11, PEG-[SN38] 4 or PEG[SN22]4 (10 animals per group). Treatment began when the tumor reached about 0.2 cm 3 . Treatment with either PEG-[SN38] 4 or PEG-[SN22] 4 resulted in tumor regression, but only treatment with PEG-[SN22]4 caused complete tumor resolution.
Фиг. 9: Эффективность PEG-[SN22]4 и PEG-[SN38]4 в модели трансгенных мышей TH-MYCN. Мышей обрабатывали физиологическим раствором (N=8), CPT-11 (15 мг/кг/доза; N=7), PEG-[SN38]4 (10 мг/кг/доза; N=6) или PEG-[SN22]4 (10 мг/кг/доза; N=6) в/в(внутривенно) через хвостовую вену один раз в неделю х 4 недель. Лечение начинали, когда мышам было около 5 недель с размером опухоли около 1-2 см3. Мышей исключали из исследования, когда у них проявлялись признаки дистресса из-за опухолевойFig. 9: Efficacy of PEG-[SN22] 4 and PEG-[SN38]4 in the TH-MYCN transgenic mouse model. Mice were treated with saline (N=8), CPT-11 (15 mg/kg/dose; N=7), PEG-[SN38] 4 (10 mg/kg/dose; N=6), or PEG-[SN22] 4 (10 mg/kg/dose; N=6) IV (intravenous) via tail vein once a week x 4 weeks. Treatment began when the mice were about 5 weeks old with a tumor size of about 1-2 cm 3 . Mice were excluded from the study when they showed signs of distress due to the tumor.
- 2 045198 нагрузки. PEG-[SN22]4 имел быструю регрессию опухоли, и при вскрытии через 180-200 дней опухоль не была обнаружена.- 2 045198 loads. PEG-[SN22]4 had rapid tumor regression, and no tumor was found at autopsy after 180–200 days.
Фиг. 10: Выживание ксенотрансплантатов EWS и RMS, обработанных PEG[SN22]4. Мышей обрабатывали физиологическим раствором, CPT-11 (15 мг/кг/доза) или PEG-[SN22]4 (10 мг/кг/доза) (N=10 для всех) в/в через хвостовую вену один раз в неделю х 4 недель. Слева: Выживаемость животных с ксенотрансплантатами в боковой области EWS клеточной линии TC-71 (хеморезистентные) после 4 недель лечения. Ни у одного из получавших PEG-[SN22]4 животных не было рецидива. Справа: Выживаемость животных с ксенотрансплантатами в боковой области альвеолярной (фьюжн-положительной) RMS клеточной линии Rh30 после 4 недель лечения. У двух животных, получавших PEG-[SN22]4, был поздний рецидив, и у одного была небольшая, медленно растущая опухоль, но у 7 других опухоль отсутствовала через 180-200 дней.Fig. 10: Survival of EWS and RMS xenografts treated with PEG[SN22] 4 . Mice were treated with saline, CPT-11 (15 mg/kg/dose) or PEG-[SN22] 4 (10 mg/kg/dose) (N=10 for all) IV via tail vein once a week x 4 weeks Left: Survival of animals with xenografts in the flank of the EWS cell line TC-71 (chemoresistant) after 4 weeks of treatment. None of the PEG-[SN22]4-treated animals relapsed. Right: Survival of animals with xenografts in the lateral region of the alveolar (fusion-positive) RMS cell line Rh30 after 4 weeks of treatment. Two animals treated with PEG-[SN22]4 had a late relapse and one had a small, slow-growing tumor, but 7 others were tumor-free after 180-200 days.
Фиг. 11: Внутриопухолевые уровни SN-38, доставленного в виде NET-нацеленного макромолекулярного пролекарства, разработанного с использованием 8-цепочечного PEG (40 кДа) в качестве носителя и BG в качестве таргетирующего лиганда ([PEG-SN38-BG]8). Анализ осуществляли на модели ортотопического ксенотрансплантата рефрактерной NB. Бестимусным голым мышам (nu/nu) (n=5) инокулировали в надпочечниковую жировую подушку BE(2)C клетки (106 на животное), суспендированные в 20% Плюроник F-127 (50 мкл). Опухолям давали достичь размера 1,0±0,4 см3 под контролем методом биолюминесцентной визуализации. [PEG-SN38-BG]8 вводили при помощи инъекции в хвостовую вену в дозе, эквивалентной 10 мг/кг SN-38. Опухоли собирали, взвешивали и анализировали при помощи ВЭЖХ. Нормализованные по массе концентрации лекарственного средства представлены как среднее значение ± SD.Fig. 11: Intratumoral levels of SN-38 delivered as a NET-targeted macromolecular prodrug designed using 8-chain PEG (40 kDa) as carrier and BG as targeting ligand ([PEG-SN38-BG]8). The analysis was performed in an orthotopic xenograft model of refractory NB. Athymic nude mice (nu/nu) (n=5) were inoculated into the adrenal fat pad with BE(2)C cells (10 6 per animal) suspended in 20% Pluronic F-127 (50 μl). Tumors were allowed to reach a size of 1.0 ± 0.4 cm 3 under bioluminescent imaging control. [PEG-SN38-BG]8 was administered via tail vein injection at a dose equivalent to 10 mg/kg SN-38. Tumors were collected, weighed, and analyzed by HPLC. Mass-normalized drug concentrations are presented as mean ± SD.
Фиг. 12: Терапевтическая эффективность [PEG-SN38-BG]8 на ортотопической модели рефрактерной NB высокого риска. Бестимусным голым мышам (nu/nu) инокулировали BE(2)C клетки (106), стабильно экспрессирующие люциферазу. Лечение при помощи [PEG-SN38-BG]8 осуществляли путем врутривенного введения в дозе, эквивалентной 10 мг/кг SN-38, два раза в неделю в течение 4 недель. Иринотекан, вводимый два раза в неделю в дозе 15 мг/кг, был включен в качестве положительного контроля. Группу мышей, которым вводили физиологический раствор (без лечения), использовали в качестве отрицательного контроля. В дополнительной группе пролекарство вводили по той же схеме животным, которым давали достичь в 10 раз большего размера опухоли (2,0 см3, 'большие опухоли'). Опухольассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа. Данные, представленные графически на (A), выражены как среднее значение ± SD. Кривые выживаемости для соответствующих групп животных в течение 190-дневного периода показаны на (B).Fig. 12: Therapeutic efficacy of [PEG-SN38-BG]8 in an orthotopic model of high-risk refractory NB. Athymic nude mice (nu/nu) were inoculated with BE(2)C cells (10 6 ) stably expressing luciferase. Treatment with [PEG-SN38-BG]8 was administered intravenously at a dose equivalent to 10 mg/kg SN-38 twice weekly for 4 weeks. Irinotecan administered twice weekly at a dose of 15 mg/kg was included as a positive control. A group of mice injected with saline (no treatment) was used as a negative control. In an additional group, the prodrug was administered using the same regimen to animals that were allowed to reach 10 times the tumor size (2.0 cm 3 , 'large tumors'). The tumor-associated signal was monitored using a quantitative bioluminescence assay. Data presented graphically in (A) are expressed as mean ± SD. Survival curves for the respective groups of animals over the 190-day period are shown in (B).
Фиг. 13: Оценка потенциирующего эффекта вориностата на антипролиферативные активности [PEG-SN38-BG]8 и SN-38 ((A) и (B), соответственно) в хеморезистентных NB клетках BE(2)C. В соответствии с вориностат-индуцированной NET экспрессией, которая, согласно сообщениям, достигала пика через 6 часов, для настоящего эксперимента был выбран период воздействия 6 часов. BE(2)C клетки инкубировали с [PEG-SN38-BG]8 или SN-38 при концентрациях, эквивалентных 25-100 нМ SN-38, с/без вориностата (1,25-5,0 мкМ). Рост клеток измеряли при помощи биолюминесценции. Данные BE(2)Cклеточного выживания через 6 дней после лечения анализировали на гипераддитивность с применением модели z=z0+A-x+B-y+C-[x-y] и определения значимости члена C, характеризующего взаимодействие.Fig. 13: Evaluation of the potentiating effect of vorinostat on the antiproliferative activities of [PEG-SN38-BG]8 and SN-38 ((A) and (B), respectively) in chemoresistant BE(2)C NB cells. According to vorinostat-induced NET expression, which was reported to peak at 6 h, an exposure period of 6 h was chosen for the present experiment. BE(2)C cells were incubated with [PEG-SN38-BG]8 or SN-38 at concentrations equivalent to 25–100 nM SN-38, with/without vorinostat (1.25–5.0 μM). Cell growth was measured using bioluminescence. BE(2)Cell survival data 6 days after treatment were analyzed for hyperadditivity using the z=z 0 +A-x+B-y+C-[xy] model and determining the significance of the interaction term C.
Фиг. 14: Антипролиферативный эффект [PEG-SN38-BG]8 пролекарства на NET-экспрессирующие хеморезистентные NB клетки, BE(2)C. Эффект на кинетику роста клеток исследовали в сравнении со свободным SN-38 или двухкомпонентным [PEG-SN38]8 без функционализации посредством BG (A). Клетки в течение 4 ч подвергали воздействию эквивалентных концентраций соединений, соответствующих 125 нМ SN-38. В дополнительном эксперименте (B), ответ на лечение [PEG-SN38-BG]8 исследовали с/без HDAC1-специфического ингибитора энтиностата (0-5 мкМ). Дозы пролекарства were варьировались в диапазоне, эквивалентном 0-100 нМ SN-38, и длительность воздействия фиксировали на уровне 6 часов. Рост клеток контролировали при помощи биолюминесценции. Ответ представлен как % клеточного выживания (среднее значение ± SD) через 6 дней после лечения. Экспериментальные данные анализировали на гипераддитивность с использованием модели z=z0+A-x+B-y+C-[x-y] и определения значимости члена C, характеризующего взаимодействие.Fig. 14: Antiproliferative effect of [PEG-SN38-BG]8 prodrug on NET-expressing chemoresistant NB cells, BE(2)C. The effect on cell growth kinetics was examined in comparison with free SN-38 or two-component [PEG-SN38]8 without BG functionalization (A). Cells were exposed to equivalent concentrations of compounds corresponding to 125 nM SN-38 for 4 h. In an additional experiment (B), response to [PEG-SN38-BG]8 treatment was examined with/without the HDAC1-specific inhibitor entinostat (0–5 μM). Doses of the prodrug were varied over a range equivalent to 0-100 nM SN-38, and the duration of exposure was fixed at 6 hours. Cell growth was monitored using bioluminescence. The response is presented as % cell survival (mean ± SD) 6 days after treatment. Experimental data were analyzed for hyperadditivity using the model z=z 0 +A-x+B-y+C-[xy] and determining the significance of the interaction term C.
Фиг. 15: Терапевтическая эффективность [PEG-SN38-BG]8 в модели ортотопического ксенотрансплантата хемо-наивной, MYCN-амплифицированной NB. Мышам инокулировали 106 экспрессирующих люциферазу IMR-32 клеток. Лечение водорастворимым предшественником SN-38 (иринотекан) или [PEG-SN38-BG]8 при дозах, эквивалентных 10 мг SN-38 на кг, 2х в неделю в течение 4 недель, начинали в день 21 после инокуляции. Опухоль-ассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа. Данные в (A) представлены как среднее значение ± SD. Репрезентативные биолюминесцентные изображения для каждой группы включены в (B).Fig. 15: Therapeutic efficacy of [PEG-SN38-BG]8 in an orthotopic xenograft model of chemo-naïve, MYCN-amplified NB. Mice were inoculated with 10 6 IMR-32 luciferase-expressing cells. Treatment with water-soluble precursor SN-38 (irinotecan) or [PEG-SN38-BG]8 at doses equivalent to 10 mg SN-38 per kg, 2x per week for 4 weeks, began on day 21 after inoculation. Tumor-associated signal was monitored using a quantitative bioluminescent assay. Data in (A) are presented as mean ± SD. Representative bioluminescent images for each group are included in (B).
Фиг. 16: Терапевтическая эффективность [PEG-SN38-BG]8 на ортотопической модели рефрактерной NB высокого риска. Бестимусным голым мышам (nu/nu) инокулировали BE(2)C клетки (106), стабильно экспрессирующие люциферазу. Лечение при помощи [PEG-SN38-BG]8 осуществляли путем врутривенFig. 16: Therapeutic efficacy of [PEG-SN38-BG]8 in an orthotopic model of high-risk refractory NB. Athymic nude mice (nu/nu) were inoculated with BE(2)C cells (10 6 ) stably expressing luciferase. Treatment with [PEG-SN38-BG]8 was carried out by vrutriven
- 3 045198 ного введения в дозе, эквивалентной 10 мг/кг SN-38, два раза в неделю в течение 4 недель. Иринотекан (15 мг/кг) и эквивалентную дозу двухкомпонентного [PEG-SN38]4, вводимую два раза в неделю, включали для сравнения. Группы мышей, которым вводили либо холостой PEG, либо физиологический раствор (без лечения), использовали в качестве отрицательных контролей (A). В эксперименте спасение пролекарство вводили с использованием такой же схемы введения животным, которых изначально лечили иринотеканом (15 мг/кг, 2х/неделя), у которых опухоли достигали 2,0 см3 через 2 недели (B). Опухольассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа. Данные представлены как среднее значение ± SD.- 3 045198 administration at a dose equivalent to 10 mg/kg SN-38, twice a week for 4 weeks. Irinotecan (15 mg/kg) and an equivalent dose of bicomponent [PEG-SN38] 4 administered twice weekly were included for comparison. Groups of mice injected with either PEG blank or saline (no treatment) were used as negative controls (A). In the rescue experiment, the prodrug was administered using the same dosing regimen to animals initially treated with irinotecan (15 mg/kg, 2x/week), in which tumors reached 2.0 cm 3 after 2 weeks (B). The tumor-associated signal was monitored using a quantitative bioluminescence assay. Data are presented as mean ± SD.
Фиг. 17: Терапевтическая эффективность [PEG-SN38-BG]8 на модели ортотопического ксенотрансплантата хемо-наивной, MYCN-амплифицированной NB. Мышам инокулировали 106 экспрессирующих люциферазу IMR-32 клеток. Лечение водорастворимым предшественником SN-38 (иринотекан) или [PEG-SN38-BG]8 при дозах, эквивалентных 10 мг SN-38 на кг, 2х/неделя в течение 4 недель начинали в день 21 после инокуляции. Опухоль-ассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа. Данные в (A) представлены как среднее значение ± SD. Репрезентативные изображения включены в (B).Fig. 17: Therapeutic efficacy of [PEG-SN38-BG]8 in an orthotopic xenograft model of chemo-naïve, MYCN-amplified NB. Mice were inoculated with 10 6 IMR-32 luciferase-expressing cells. Treatment with water-soluble precursor SN-38 (irinotecan) or [PEG-SN38-BG]8 at doses equivalent to 10 mg SN-38 per kg, 2x/week for 4 weeks, began on day 21 after inoculation. Tumor-associated signal was monitored using a quantitative bioluminescence assay. Data in (A) are presented as mean ± SD. Representative images are included in (B).
Фиг. 18: Терапевтическая эффективность [PEG-SN38-BG]8 в модели метастатической рефрактерной NB. Мышам вводили 106 экспрессирующих люциферазу BE(2)C клеток через хвостовую вену. Лечение начинали в день 25 иринотеканом (15 мг/кг) или [PEG-SN38-BG]8 в дозе, эквивалентной 10 мг SN-38 на кг (4 недель, 2х/неделя). Опухоль-ассоциированный сигнал контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа ((A), данные показаны как среднее значение ± SD). Репрезентативные изображения включены в (B).Fig. 18: Therapeutic efficacy of [PEG-SN38-BG]8 in a model of metastatic refractory NB. Mice were injected with 10 6 luciferase-expressing BE(2)C cells via the tail vein. Treatment was started on day 25 with irinotecan (15 mg/kg) or [PEG-SN38-BG]8 at a dose equivalent to 10 mg SN-38 per kg (4 weeks, 2x/week). Tumor-associated signal was monitored using a quantitative bioluminescence assay ((A), data shown as mean ± SD). Representative images are included in (B).
Фиг. 19: Антипролиферативный эффект PF68-SN38-BG пролекарства по сравнению с двухкомпонентным (не-таргетированным) PF68-SN38 и свободным SN-38 в качестве контролей. Ответ NB клеток, демонстрирующих приобретенную MDR (множественную лекарственную резистентность) [BE(2)C], после 15 мин воздействия показан в виде кривых роста (A) и в виде % ингибирования роста (B) через 6 дней после лечения как функция SN-38 эквивалентой дозы (0-25 нМ). Рост клеток контролировали при помощи биолюминесценции. Результаты показаны как среднее значение ± SD.Fig. 19: Antiproliferative effect of PF68-SN38-BG prodrug compared to two-component (non-targeted) PF68-SN38 and free SN-38 as controls. The response of NB cells exhibiting acquired MDR [BE(2)C] after 15 min of exposure is shown as growth curves (A) and as % growth inhibition (B) 6 days after treatment as a function of SN- 38 dose equivalents (0-25 nM). Cell growth was monitored using bioluminescence. Results are shown as mean ± SD.
Фиг. 20: NET-селективность антипролиферативного действия PF68-SN38-BG на хеморезистентные NB клетки BE(2)C. Рост клеток исследовали с/без NET ингибирования с использованием низоксетина (1 мкМ), в сравнении с двухкомпонентным PF68-SN38 без функционализации посредством BG (A). Клетки подвергали воздействию эквивалентных концентраций соединений в течение 15 мин. Экспериментальные данные через 6 дней после лечения анализировали методом ANOVA с использованием апостериорного критерия Тьюки.Fig. 20: NET selectivity of the antiproliferative effect of PF68-SN38-BG on chemoresistant NB BE(2)C cells. Cell growth was examined with/without NET inhibition using nisoxetine (1 μM), compared to the PF68-SN38 two-component without BG functionalization (A). Cells were exposed to equivalent concentrations of compounds for 15 min. Experimental data 6 days after treatment were analyzed by ANOVA using Tukey's post hoc test.
Фиг. 21: Терапевтическая эффективность NET-направленной доставки в модели рефрактерной NB. Мышей инокулировали в надпочечниковую жировую подушку 106 экспрессирующих люциферазу BE(2)C клеток. Лечение начинали либо иринотеканом (15 мг/кг), либо двухкомпонентной и трехкомпонентной конструкцией в дозе, эквивалентной 10 мг SN-38 на кг (4 недель, 2х/неделя, (A)). Альтернативно, опухолям давали достичь 2 см3 перед началом терапии (B). Прогрессирование заболевания контролировали при помощи количественного биолюминесцентного анализа. Данные роста опухоли показаны как среднее значение±SD.Fig. 21: Therapeutic efficacy of NET-targeted delivery in a model of refractory NB. Mice were inoculated into the adrenal fat pad with 10 6 luciferase-expressing BE(2)C cells. Treatment was initiated with either irinotecan (15 mg/kg) or a two- and three-component design at a dose equivalent to 10 mg SN-38 per kg (4 weeks, 2x/week, (A)). Alternatively, tumors were allowed to reach 2 cm 3 before starting therapy (B). Disease progression was monitored using quantitative bioluminescent assay. Tumor growth data are shown as mean±SD.
Фиг. 22: Хеморезистентные люцифераза-трансфицированные SKNBE(2)C клетки (107) инъецировали в периренальную жировую подушку голых мышей и наблюдали развитие опухоли. Мышей разделяли на пять групп: отсутствие лечения, или лечение холостым PEG, CPT-11, PEG-[SN22]4 или PEG-[SN38]4 (10 животных на группу). Лечение начинали, когда опухоль достигала около 0,2 см3. Размер опухоли быстро увеличивался в течение 2 недель в двух контрольных группах, и рост лишь немного задерживался при введении CPT-11. Лечение либо PEG-[SN22]4, либо PEG-[SN38]4 замедляло рост и затем опухоли регрессировали. Только PEG-[SN22]4 лечение вызывало полное исчезновение опухоли ((A) = визуализация; (B) = количественное определение).Fig. 22: Chemoresistant luciferase-transfected SKNBE(2)C cells (10 7 ) were injected into the perirenal fat pad of nude mice and tumor development was observed. Mice were divided into five groups: no treatment, or treatment with blank PEG, CPT-11, PEG-[SN22]4 or PEG-[SN38]4 (10 animals per group). Treatment began when the tumor reached about 0.2 cm 3 . Tumor size increased rapidly over 2 weeks in the two control groups, and growth was only slightly delayed when CPT-11 was administered. Treatment with either PEG-[SN22]4 or PEG-[SN38]4 slowed growth and tumors subsequently regressed. PEG-[SN22]4 treatment alone caused complete tumor resolution ((A) = imaging; (B) = quantification).
Подробное описание изобретения Первый вариант осуществленияDetailed Description of the Invention First Embodiment
В первом варианте осуществления описанного выше пролекарства по меньшей мере две молекулы аналога камптотецина ковалентно связаны с полоксамерным полимером через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях (например, 22°C, pH=7,2).In a first embodiment of the prodrug described above, at least two camptothecin analog molecules are covalently linked to a poloxamer polymer through ester bonds that are labile under physiological conditions (eg, 22°C, pH=7.2).
Аналоги камптотецина хорошо известны в данной области как ингибиторы топоизомеразы. Камтотецин как таковой представляет собой (S)-4-этил-4-гидрокси-1H-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-3,14-(4Н,12Н)-дион. Термин аналог камптотецина включает камптотецин. Предпочтительные аналоги камптотецина включают SN22 (7-этил-камптотецин), SN38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин) или их комбинацию.Camptothecin analogues are well known in the art as topoisomerase inhibitors. Camtothecin as such is (S)-4-ethyl-4-hydroxy-1H-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-3,14-(4H,12H) -dion. The term camptothecin analogue includes camptothecin. Preferred camptothecin analogs include SN22 (7-ethyl-camptothecin), SN38 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin), or a combination thereof.
Полоксамеры представляют собой неионные триблок-сополимеры, состоящие из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилен (поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилен (поли(этиленоксида)). Общее количество цепей полиоксиэтилена может составPoloxamers are nonionic triblock copolymers consisting of a central hydrophobic polyoxypropylene (poly(propylene oxide)) chain flanked by two hydrophilic polyoxyethylene (poly(ethylene oxide)) chains. The total number of polyoxyethylene chains can composition
- 4 045198 лять от 2 до 130. Количество оксипропиленовых звеньев может составлять от 15 до 67. Предпочтительно молекулярная масса полоксамера ниже порога клубочковой фильтрации (30-50 кДа). Эти полимеры имеют историю безопасного применения для людей и доступны в виде веществ фармацевтической категории (Kolliphor® P). Ряд полоксамеров был одобрен FDA в качестве эксципиентов и в настоящее время используется в клинической практике для различных целей. Все эти полоксамеры подходят для вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке.- 4 045198 range from 2 to 130. The number of oxypropylene units can range from 15 to 67. Preferably, the molecular weight of the poloxamer is below the glomerular filtration threshold (30-50 kDa). These polymers have a history of safe use in humans and are available as pharmaceutical grade substances (Kolliphor® P). A number of poloxamers have been approved by the FDA as excipients and are currently used in clinical practice for a variety of purposes. All of these poloxamers are suitable for the embodiments described herein.
Биологически значимые свойства полоксамеров, такие как размер молекул и гидрофильный/липофильный баланс, регулируют путем регулирования длины гидрофильных (A) и гидрофобных (B) блоков [A=поли(этиленоксид) (PEO) и B=поли(пропиленоксид) (PPO)], и их молярного соотношения. В отличие от химически гомогенных поли(этиленоксидов) ABA триблок-полоксамеры, сочетающие промежуточные длины средних PPO блоков со сравнительно высокими значениями гидрофильного/липофильного баланса, способны стабильно связываться с клеточными мембранами, что обеспечивает эффективный механизм проникновения в опухоли и расширение внутриопухолевого присутствия. Примеры полоксамеров включают Kolliphor® P188, P338 и P407.Biologically relevant properties of poloxamers, such as molecular size and hydrophilic/lipophilic balance, are controlled by adjusting the length of hydrophilic (A) and hydrophobic (B) blocks [A=poly(ethylene oxide) (PEO) and B=poly(propylene oxide) (PPO)] , and their molar ratio. In contrast to chemically homogeneous poly(ethylene oxides), ABA triblock poloxamers, which combine intermediate lengths of medium PPO blocks with relatively high hydrophilic/lipophilic balance values, are able to stably bind to cell membranes, which provides an effective mechanism for penetration into tumors and expansion of intratumoral presence. Examples of poloxamers include Kolliphor® P188, P338 and P407.
Аналоги камптотецина ковалентно связаны с полоксамерным полимером через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях (например, 22°C, pH=7,2). В одном варианте осуществления сложноэфирные связи представляют собой оксиацетатные сложноэфирные связи. Аналоги камптотецина предпочтительно связаны с полоксамерным полимером через гидроксильную группу в положении, соответствующем положению 20 в камптотецине.Camptothecin analogues are covalently linked to the poloxamer polymer through ester bonds that are labile under physiological conditions (eg, 22°C, pH=7.2). In one embodiment, the ester linkages are hydroxyacetate ester linkages. Camptothecin analogues are preferably linked to the poloxamer polymer via a hydroxyl group at a position corresponding to position 20 in camptothecin.
В другом варианте осуществления две молекулы аналога камптотецина ковалентно связаны с полоксамерным полимером. В предпочтительном варианте осуществления макромолекулярное пролекарство представляет собой PF108-(SN22)2, который представлен следующей структурой:In another embodiment, two camptothecin analog molecules are covalently linked to a poloxamer polymer. In a preferred embodiment, the macromolecular prodrug is PF108-(SN22) 2 which is represented by the following structure:
к + η = 270; m = 44k + η = 270; m = 44
Второй вариант осуществленияSecond embodiment
Во втором варианте осуществления описанного выше пролекарства по меньшей мере две молекулы аналога SN22 ковалентно связаны с PEG полимером через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях.In a second embodiment of the prodrug described above, at least two SN22 analogue molecules are covalently linked to a PEG polymer via ester bonds that are labile under physiological conditions.
Полиэтиленгликолевые (PEG) полимеры хорошо известны в данной области. PEG полимеры могут быть линейными и представлены формулой H-(O-CH2-CH2)n-OH. В другом варианте осуществления PEG полимер представляет собой полимер с разветвленной структурой. PEG полимеры с разветвленной структурой содержат от трех до десяти цепей PEG, исходящих из центральной сердцевинной группы. Особенно предпочтительны четыре PEG цепи. Предпочтительные центральные сердцевинные группы включают группу пентаэритрита и группу трипентаэритрита. PEG полимеры могут иметь молекулярную массу от 1000 до 100000 дальтон, включая все значения и поддиапазоны между ними, включая 2000, 5000, 10000, 25000, 35000, 50000, 75000 и 85000 дальтон.Polyethylene glycol (PEG) polymers are well known in the art. PEG polymers can be linear and are represented by the formula H-(O-CH 2 -CH 2 )n-OH. In another embodiment, the PEG polymer is a branched polymer. Branched PEG polymers contain three to ten PEG chains emanating from a central core group. Particularly preferred are four PEG chains. Preferred central core groups include a pentaerythritol group and a tripentaerythritol group. PEG polymers can have molecular weights from 1000 to 100,000 daltons, including all values and subranges in between, including 2000, 5000, 10000, 25000, 35000, 50000, 75000 and 85000 daltons.
В другом варианте осуществления две молекулы SN22 ковалентно связаны с линейным PEG полимером. В другом варианте осуществления четыре молекулы SN22 ковалентно связаны с PEG полимером с разветвленной структурой, имеющим четыре PEG цепи. В другом варианте осуществления более четырех и до восьми молекул SN22 ковалентно связаны с PEG полимером с разветвленной структурой. Предпочтительно, молекула SN22 ковалентно связана с каждой из цепей PEG в этих вариантах осуществления.In another embodiment, two SN22 molecules are covalently linked to a linear PEG polymer. In another embodiment, four SN22 molecules are covalently linked to a branched PEG polymer having four PEG chains. In another embodiment, more than four and up to eight SN22 molecules are covalently linked to a branched PEG polymer. Preferably, the SN22 molecule is covalently linked to each of the PEG chains in these embodiments.
SN22 группы ковалентно связаны с PEG полимером через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях (например, 22°C, pH=7,2). В одном варианте осуществления сложноэфирные связи представляют собой оксиацетатные сложноэфирные связи. Аналоги камптотецина предпочтительно связаны с PEG полимером через гидроксильную группу в положении, соответствующем положению 20 в камптотецине.The SN22 groups are covalently linked to the PEG polymer through ester bonds, which are labile under physiological conditions (eg 22°C, pH=7.2). In one embodiment, the ester linkages are hydroxyacetate ester linkages. Camptothecin analogues are preferably linked to the PEG polymer via a hydroxyl group at a position corresponding to position 20 in camptothecin.
В предпочтительном варианте осуществления макромолекулярное пролекарство представляет собой PEG-[SN22]4, который представлен следующей структурой:In a preferred embodiment, the macromolecular prodrug is PEG-[SN22] 4 , which has the following structure:
- 5 045198- 5 045198
η = 110 в среднемη = 110 on average
Н2С—H 2 C—
РЕ = сердцевина -н2С-С-СН2пентаэритрита н2С—PE = core -n 2 C-C-CH 2 pentaerythritol n 2 C—
В другом варианте осуществления пациент мог ранее получать лечение Темозоломидом (TMZ), который представляет собой пероральное химиотерапевтическое лекарственное средство. Такой предшествующий курс может обеспечить дополнительную эффективность, но может усилить проникновение в опухоль пролекарства. Темозоломид можно вводить в дозе от 20 до 250 мг/кг/день п/о (перорально) в течение нескольких дней, например, 5 дней, с последующим лечением пролекарством, например, начиная с 7 дня. Доза 100 мг/кг/день п/о является предпочтительной.In another embodiment, the patient may have previously been treated with Temozolomide (TMZ), which is an oral chemotherapy drug. This prior course may provide additional efficacy but may enhance tumor penetration of the prodrug. Temozolomide can be administered at a dose of 20 to 250 mg/kg/day po (orally) for several days, eg 5 days, followed by prodrug treatment, eg starting on day 7. A dose of 100 mg/kg/day po is preferred.
Третий вариант осуществленияThird embodiment
В третьем варианте осуществления описанного выше пролекарства по меньшей мере две молекулы аналога камптотецина ковалентно связаны с полимером через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях, при этом по меньшей мере один аналог камптотецина функционализирован по меньшей мере одним лигандом NE транспортера (NET).In a third embodiment of the prodrug described above, at least two camptothecin analog molecules are covalently linked to a polymer via ester bonds that are labile under physiological conditions, wherein at least one camptothecin analog is functionalized with at least one NE transporter (NET) ligand.
Аналог камптотецина может представлять собой SN22 (7-этил-камптотецин), SN38 (7-этил-10гидрокси-камптотецин) или их комбинацию. SN38 является особенно предпочтительным.The camptothecin analogue may be SN22 (7-ethyl-camptothecin), SN38 (7-ethyl-10hydroxy-camptothecin), or a combination thereof. SN38 is particularly preferred.
В другом варианте осуществления от двух до восьми молекул аналога камптотецина ковалентно связаны с полимером. Этот диапазон включает все конкретные значения и поддиапазоны между ними, такие как две, три, четыре, пять, шесть и семь молекул аналога камптотецина. Особенно предпочтительны восемь молекул аналога камптотецина, ковалентно связанных с полимером.In another embodiment, two to eight camptothecin analog molecules are covalently linked to the polymer. This range includes all specific values and subranges between them, such as two, three, four, five, six and seven camptothecin analog molecules. Particularly preferred are eight camptothecin analog molecules covalently linked to the polymer.
Полимер может представлять собой полоксамерный полимер или PEG полимер, как описано выше. Предпочтительным является PEG полимер с разветвленной структурой. В этом варианте осуществления PEG полимеры с разветвленной структурой содержат от трех до десяти PEG цепей, исходящих из центральной сердцевинной группы. От четырех до восьми PEG цепей являются особенно предпочтительными, особо предпочтительны восемь PEG цепей. Предпочтительные центральные сердцевинные группы включают группу пентаэритрита и группу трипентаэритрита. Группа трипентаэритрита особенно предпочтительна в качестве центральной сердцевинной группы.The polymer may be a poloxamer polymer or a PEG polymer as described above. Preferred is a PEG polymer with a branched structure. In this embodiment, the branched PEG polymers contain three to ten PEG chains emanating from a central core group. Four to eight PEG chains are particularly preferred, with eight PEG chains being particularly preferred. Preferred central core groups include a pentaerythritol group and a tripentaerythritol group. The tripentaerythritol group is particularly preferred as the central core group.
Аналоги камптотецина ковалентно связаны с полоксамерным полимером через сложноэфирные связи, которые являются лабильными в физиологических условиях (например, 22°C, pH=7,2). В одном варианте осуществления сложноэфирные связи представляют собой оксиацетатные сложноэфирные связи. Аналоги камптотецина предпочтительно связаны с полоксамерным полимером через гидроксильную группу в положении, соответствующем положению 20 в камптотецине.Camptothecin analogues are covalently linked to the poloxamer polymer through ester bonds that are labile under physiological conditions (eg, 22°C, pH=7.2). In one embodiment, the ester linkages are hydroxyacetate ester linkages. Camptothecin analogues are preferably linked to the poloxamer polymer via a hydroxyl group at a position corresponding to position 20 in camptothecin.
В этом варианте осуществления по меньшей мере один аналог камптотецина функционализирован по меньшей мере одним лигандом для транспортера норэпинефрина (NE), т.е. лигандом NE транспортера (NET). В одном варианте осуществления лиганд NE транспортера (NET) представляет собой фенэтилгуанидин, бензилгуанидин (BG) или тирамин. Бензилгуанидин особенно предпочтителен.In this embodiment, the at least one camptothecin analog is functionalized with at least one ligand for the norepinephrine (NE) transporter, i.e. ligand of the NE transporter (NET). In one embodiment, the NE transporter (NET) ligand is phenethylguanidine, benzylguanidine (BG), or tyramine. Benzylguanidine is particularly preferred.
В другом варианте осуществления лиганд NE транспортера (NET) ковалентно связан с аналогом камптотецина через сложноэфирную связь, которая является лабильной в физиологических условиях. В предпочтительном варианте осуществления сложноэфирная связь между лигандом NE транспортера (NET) и аналогом камптотецина представляет собой оксигексаноиловый эфир. В другом варианте осуществления сложноэфирная связь между лигандом NE транспортера (NET) и аналогом камптотецина представляет собой оксиэтоксипропаноиловый или оксиэтоксиэтоксипропаноиловый эфир.In another embodiment, an NE transporter (NET) ligand is covalently linked to a camptothecin analogue through an ester linkage that is labile under physiological conditions. In a preferred embodiment, the ester linkage between the NE transporter (NET) ligand and the camptothecin analogue is an oxyhexanoyl ester. In another embodiment, the ester linkage between the NE transporter (NET) ligand and the camptothecin analogue is an oxyethoxypropanoyl or oxyethoxyethoxypropanoyl ester.
В предпочтительном варианте осуществления макромолекулярное пролекарство представляет собой [PEG-SN38-BG]8, который представлен следующей структурой:In a preferred embodiment, the macromolecular prodrug is [PEG-SN38-BG]8, which is represented by the following structure:
- 6 045198- 6 045198
η = 110 в среднем н2с- н2с— н2С—η = 110 on average n 2 s- n 2 s— n 2 s—
ТР = сердцевина -н2с-с-сн2-о-сн2-с-сн2-о-сн2-с-сн2трипентаэритрита н2с- н2с- н2сСпособы леченияTR = core -n 2 s-s-sn 2 -o-sn 2 -s-sn 2 -o-sn 2 -s-sn 2 tripentaerythritol n 2 s-n 2 s-n 2 sTreatment methods
Как описано выше, макромолекулярное пролекарство можно использовать в способе лечения нейробластомы путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства нуждающемуся в этом субъекту.As described above, a macromolecular prodrug can be used in a method of treating neuroblastoma by administering an effective amount of the macromolecular prodrug to a subject in need thereof.
Макромолекулярное пролекарство, как описано выше, также можно использовать в способе лечения субъекта с солидной опухолью путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства нуждающемуся в этом субъекту.The macromolecular prodrug, as described above, can also be used in a method of treating a subject with a solid tumor by administering an effective amount of the macromolecular prodrug to the subject in need thereof.
Макромолекулярное пролекарство, как описано выше, также можно использовать в способе лечения субъекта с опухолью головного мозга путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства нуждающемуся в этом субъекту.The macromolecular prodrug, as described above, can also be used in a method of treating a subject with a brain tumor by administering an effective amount of the macromolecular prodrug to the subject in need thereof.
Макромолекулярное пролекарство, как описано выше, также можно использовать в способе лечения рака путем введения эффективного количества макромолекулярного пролекарства, как определено выше, нуждающемуся в этом субъекту.A macromolecular prodrug as described above can also be used in a method of treating cancer by administering an effective amount of a macromolecular prodrug as defined above to a subject in need thereof.
В этих вариантах осуществления нуждающийся в этом субъект предпочтительно представляет собой млекопитающее, особенно предпочтительно человека.In these embodiments, the subject in need thereof is preferably a mammal, especially preferably a human.
Макромолекулярное пролекарство можно вводить любым способом, обычно используемым в данной области. Способы введения включают парентеральный (внутривенный, внутримышечный и подкожный), пероральный, назальный, внутриглазной, трансмукозальный (буккальный, вагинальный и ректальный) и трансдермальный пути введения.The macromolecular prodrug can be administered by any method commonly used in the art. Routes of administration include parenteral (intravenous, intramuscular and subcutaneous), oral, nasal, intraocular, transmucosal (buccal, vaginal and rectal) and transdermal routes of administration.
Макромолекулярное пролекарство можно вводить в любой дозе, эффективной для лечения описанных в настоящей заявке состояний. Дозировка макромолекулярного пролекарства может составлять от 0,5 до 200 мг/кг на дозу.The macromolecular prodrug can be administered at any dose effective to treat the conditions described herein. The dosage of the macromolecular prodrug may range from 0.5 to 200 mg/kg per dose.
ПримерыExamples
Пример 1. PF108-(SN22)2Example 1. PF108-(SN22)2
1. Двухстадийный синтез пролекарства.1. Two-step synthesis of prodrug.
Окисление полоксамеров реактивом Джонса (CrO3/H2SO4) в THF при 22-25°C преобразует концевые группы CH2OH полимеров в концевые алкоксиацетат-карбоксильные группы, которые затем можно использовать для обратимого ковалентного связывания различных гидроксилсодержащих лекарственных средств через гидролизуемые сложноэфирные связи. Окисление Плюроник F-108 (Kolliphor P338) в условиях, описанных выше, приводило к получению полимера, содержащего 0,18 ммоль/г карбоксильных групп, как было определено с использованием 1H ЯМР по сигналу OCH2CO протонов. Аналогично, окисление Плюроник F-68 приводило к полимеру, содержащему 0,23 ммоль/г концевых карбоксильных групп. Дальнейшее конъюгирование карбоксилированного Плюроник F-108 с SN22 с использованием 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC) в качестве активирующего агента для карбоксильных групп, 4диметиламинопиридин тозилата (DPTS) в качестве катализатора и CH2Cl2 в качестве растворителя приводило к образованию полимерного конъюгата, содержащего 0,13 ммоль/г или 4,8 мас.% лекарственного средства. 1H ЯМР продемонстрировал, что SN-22 был ковалентно связан с полимером через сложноэфирные связи между карбоксильными группами карбоксилированного плюроника и 20-OH молекулы SN22. Плюроники сорта Kolliphor (табл. 1) и SN22 (чистота: >97%, ВЭЖХ) доступны от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) и AK Scientific (Union City, CA), соответственно.Oxidation of poloxamers with Jones' reagent (CrO 3 /H 2 SO 4 ) in THF at 22-25°C converts the CH2OH end groups of the polymers into alkoxyacetate-carboxyl end groups, which can then be used to reversibly covalently link various hydroxyl-containing drugs through hydrolyzable ester bonds. Oxidation of Pluronic F-108 (Kolliphor P338) under the conditions described above resulted in a polymer containing 0.18 mmol/g carboxyl groups, as determined using 1H NMR signal of OCH2CO protons. Similarly, oxidation of Pluronic F-68 resulted in a polymer containing 0.23 mmol/g carboxyl end groups. Further conjugation of carboxylated Pluronic F-108 to SN22 using 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) as an activating agent for carboxyl groups, 4-dimethylaminopyridine tosylate (DPTS) as a catalyst and CH 2 Cl 2 as a solvent resulted in the formation of a polymer conjugate containing 0.13 mmol/g or 4.8 wt.% of the drug. 1H NMR demonstrated that SN-22 was covalently linked to the polymer through ester bonds between the carboxyl groups of the carboxylated Pluronic and the 20-OH of the SN22 molecule. Pluronics grade Kolliphor (Table 1) and SN22 (purity: >97%, HPLC) are available from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) and AK Scientific (Union City, CA), respectively.
Для получения пролекарств SN38 с карбоксилированными Плюрониками 10-OH фенола в SN38 (чистота: >97%, AstaTech, Bristol, PA) сначала защищали 10-трет-бутилдифенилсилильной группой (TBDPS) воздействием трет-бутил(хлор)дифенилсилана (TBDPS-Cl) в присутствии имидазола в Nметилпирролидоне. В эксперименте, проводимом с целью определения осуществимости, полученный 10TBDPS-защищенный SN38 (полученный с выходом 97%) подвергали взаимодействию, как указано выше, с карбоксилированным Плюроником F-68, получая после снятия защиты (с использованием фторида пиридиния в CH2Cl2) целевой конъюгат, который, согласно данным 1H ЯМР содержал 0,17 ммоль/г или 6,6 мас.% SN38, ковалентно связанного через сложноэфирные связи посредством 20-OH.To prepare SN38 prodrugs with carboxylated Pluronics, the 10-OH phenol in SN38 (purity: >97%, AstaTech, Bristol, PA) was first protected with a 10-tert-butyldiphenylsilyl group (TBDPS) by exposure to tert-butyl(chloro)diphenylsilane (TBDPS-Cl). in the presence of imidazole in Nmethylpyrrolidone. In a feasibility experiment, the resulting 10TBDPS-protected SN38 (obtained in 97% yield) was reacted as above with carboxylated Pluronic F-68 to yield deprotected (using pyridinium fluoride in CH2Cl2 ) the target conjugate, which, according to 1H NMR data, contained 0.17 mmol/g or 6.6 wt.% SN38, covalently linked through ester bonds via 20-OH.
- 7 045198- 7 045198
Таблица 1. Полоксамерные полимеры фармацевтической категории, используемые для получения _________конъюгатов пролекарств, описанных в настоящей заявке._________Table 1. Pharmaceutical grade poloxamer polymers used to prepare _________prodrug conjugates described in this application._________
2. Полоксамер-SN22 пролекарство ингибирует рост хеморезистентных NB клеток.2. Poloxamer-SN22 prodrug inhibits the growth of chemoresistant NB cells.
Рефрактерная NB характеризуется сдвигом пороговых уровней лекарственного средства, необходимых для ингибирования роста NB клеток. Этот сдвиг, показанный во всех тестируемых парах клеточных линий, полученных от одних и тех же пациентов с прогрессирующим заболеванием во время индукционной терапии, по сравнению с моментом постановки диагноза до терапии, одновременно влияет на ответ на химиотерапевтические средства из разных химических и фармакологических семейств. PF108(SN22)2, пролекарство, созданное из Плюроника F-108 (Kolliphor P338) фармацевтической категории и SN22, испытывали против клеточной линии BE(2)C, демонстрирующей лекарственно-резистентный фенотип, связанный с приобретением мутации TP53 на кодоне 135 и потерей функции p53.Refractory NB is characterized by a shift in the threshold drug levels required to inhibit NB cell growth. This shift, shown in all tested pairs of cell lines derived from the same patients with progressive disease during induction therapy compared with the time of diagnosis before therapy, simultaneously influences the response to chemotherapeutic agents from different chemical and pharmacological families. PF108(SN22)2, a prodrug created from pharmaceutical grade Pluronic F-108 (Kolliphor P338) and SN22, was tested against the BE(2)C cell line exhibiting a drug-resistant phenotype associated with the acquisition of a TP53 mutation at codon 135 and loss of function p53.
После 24-часового воздействия PF108-(SN22)2 эффективно ингибировал рост клеток BE(2)C в течение 7 дней с эффективностью, аналогичной эффективности SN22 отдельно или в комбинации с химически немодифицированным Плюроником F-108 (PF108+SN22), тогда как при применении Pluronic F-108 без лекарственного средства никакого ингибирования роста клеток не наблюдали (фиг. 1A). Эффект PF108-(SN22)2 был заметно менее выражен, когда воздействие было ограничено 30 минутами (фиг. 1B), что позволяет предположить, что пролекарство в значительной степени остается интактным в этой временной шкале.After 24 hours of exposure, PF108-(SN22)2 effectively inhibited the growth of BE(2)C cells for 7 days with efficacy similar to that of SN22 alone or in combination with chemically unmodified Pluronic F-108 (PF108+SN22), whereas No inhibition of cell growth was observed using Pluronic F-108 without drug (Fig. 1A). The effect of PF108-(SN22)2 was noticeably less pronounced when exposure was limited to 30 min (Fig. 1B), suggesting that the prodrug remains largely intact on this time scale.
Для сравнения, при испытании против хемо-наивных NB клеток (IMR-32), пролекарство было равномерно эффективным в диапазоне доз, соответствующем 20-80 нМ SN22, и длительности воздействия от 30 мин до 24 ч, вызывая сильное ингибирование роста клеток IMR-32 (см. фиг. 4A). Это согласуется с отсутствием первичной резистентности в этой клеточной линии, полученной от ранее нелеченного пациента, что делает ее чувствительной к антипролиферативному эффекту активного SN22, присутствующего на значительно более низких уровнях. Важно отметить, что хотя свободный SN22 был включен в качестве положительного контроля в эксперименты с культурами клеток, он несовместим с фармацевтически приемлемыми носителями.In comparison, when tested against chemo-naïve NB cells (IMR-32), the prodrug was uniformly effective over a dose range corresponding to 20-80 nM SN22 and exposure durations from 30 min to 24 h, causing strong growth inhibition of IMR-32 cells (See Fig. 4A). This is consistent with the lack of primary resistance in this cell line, derived from a previously untreated patient, making it sensitive to the antiproliferative effect of active SN22 present at significantly lower levels. It is important to note that although free SN22 was included as a positive control in cell culture experiments, it is not compatible with pharmaceutically acceptable vehicles.
3. Доставка SN22 в качестве пролекарства с полоксамером достигает длительного воздействия в ортотопических BE(2)C опухолях.3. Delivery of SN22 as a prodrug with poloxamer achieves long-lasting effects in orthotopic BE(2)C tumors.
Сравнение между клетками BE(2)C, полученными при рецидиве после химиорадиотерапии, и клетками BE(1), полученными от того же пациента при постановке диагноза, продемонстрировало увеличение на порядок концентрации аналога камптотецина, SN38, необходимой для достижения ингибирования роста клеток на 90%: 25 по сравнению с 2 нг/мл соответственно. Важно отметить, что, как было показано, соответствующий внутриопухолевый уровень SN38 не может поддерживаться с использованием обычного лечения его предшественником, иринотеканом (CPT-11). Неспособность поддерживать эффективные местные уровни лекарственного средства без превышения максимально переносимой дозы является основной причиной неэффективности клинически используемых камптотецинов и других химиотерапевтических средств в условиях рецидивирующей и рефрактерной NB высокого риска. В соответствии с этими сообщениями, эти результаты показывают менее 25 нг/г и 2 нг/г SN38 в больших (>1 см3) BE(2)C ортотопических ксенотрансплантатах через 24 и 72 ч соответственно, после введения иринотекана (10 мг/кг). Для сравнения, SN22, доставляемый в эквивалентной дозе в качестве PF108-(SN22)2 стабильно присутствовал в опухолях на многократно более высоких уровнях: 2180±850 нг/г, 2140±520 нг/г и 1570±580 нг/г через 4, 24 и 72 часа, соответственно (фиг. 2), что свидетельствует о том, что доставка на основе полоксамерного пролекарства может поддерживать стабильные терапевтически эффективные уровни SN22, таким образом выполняя предварительное условие для длительного подавления роста NB опухоли.A comparison between BE(2)C cells obtained from relapse after chemoradiotherapy and BE(1) cells obtained from the same patient at diagnosis demonstrated an order of magnitude increase in the concentration of the camptothecin analogue, SN38, required to achieve 90% cell growth inhibition. : 25 versus 2 ng/ml respectively. Importantly, it has been shown that adequate intratumoral levels of SN38 cannot be maintained using conventional treatment with its precursor, irinotecan (CPT-11). The inability to maintain effective local drug levels without exceeding the maximum tolerated dose is a major reason for the failure of clinically used camptothecins and other chemotherapeutic agents in the setting of high-risk relapsed and refractory NB. Consistent with these reports, these results show less than 25 ng/g and 2 ng/g SN38 in large (>1 cm 3 ) BE(2)C orthotopic xenografts at 24 and 72 h, respectively, after administration of irinotecan (10 mg/kg ). In comparison, SN22, delivered at an equivalent dose as PF108-(SN22)2, was consistently present in tumors at many times higher levels: 2180±850 ng/g, 2140±520 ng/g and 1570±580 ng/g after 4. 24 and 72 hours, respectively (Figure 2), suggesting that poloxamer prodrug-based delivery can maintain stable therapeutically effective levels of SN22, thus fulfilling a prerequisite for long-term suppression of NB tumor growth.
4. Полоксамер-SN22 пролекарство сильно подавляет рост опухоли, продлевая выживаемость при лекарственно-резистентной NB.4. Poloxamer-SN22 prodrug potently inhibits tumor growth, prolonging survival in drug-resistant NB.
В соответствии с его устойчивым присутствием на внутриопухолевых уровнях выше 1,5 мкг/г, SN22, сформулированный и вводимый один раз в неделю в виде пролекарства на основе полоксамера, вызывал регрессию опухоли и сильно подавлял повторный рост ортотопических BE(2)C ксенотрансплантатов (фиг. 3A и B). Это, в свою очередь, приводило к значительному увеличению выживаемости животных (фиг. 3C), в отличие от незначительного противоопухолевого эффекта иринотекана, который в этом исследовании применяли в два раза чаще. Незначительный эффект иринотекана в этой модели NB (фиг. 3) демонстрирует адекватность подхода доклинической оценки, резюмируя серьезную проблему в достижении длительного терапевтического ответа в условиях агрессивной рефрактерной NB человека. Примечательно, что, в отличие от иринотекана, PF108-(SN22)2 был способен вызывать как уменьшение опуConsistent with its sustained presence at intratumoral levels above 1.5 μg/g, SN22 formulated and administered once weekly as a poloxamer prodrug induced tumor regression and potently suppressed regrowth of orthotopic BE(2)C xenografts (Fig. .3A and B). This, in turn, resulted in a significant increase in animal survival (Figure 3C), in contrast to the negligible antitumor effect of irinotecan, which was administered twice as often in this study. The modest effect of irinotecan in this NB model (Fig. 3) demonstrates the adequacy of the preclinical evaluation approach, summarizing a major challenge in achieving durable therapeutic response in the setting of aggressive refractory human NB. It is noteworthy that, unlike irinotecan, PF108-(SN22)2 was able to cause both a decrease in
- 8 045198 холи, так и стабилизировать заболевание, при этом не наблюдали прогрессирования во время и после периода лечения, состоящего только из четырех слабых доз (последнюю дозу PF108-(SN22)2 вводили на 21 день; показано на фиг. 3B). Замечательное противораковое действие полоксамер-SN22 пролекарства не сопровождалось признаками системной токсичности, такими как диарея, натяжение кожи (из-за обезвоживания), изъязвления кожи, анорексия, кахексия или замедление набора веса.- 8 045198 holi and stabilize the disease, while no progression was observed during and after a treatment period consisting of only four weak doses (the last dose of PF108-(SN22) 2 was administered on day 21; shown in Fig. 3B). The remarkable anticancer activity of the poloxamer-SN22 prodrug was not accompanied by signs of systemic toxicity such as diarrhea, skin tension (due to dehydration), skin ulceration, anorexia, cachexia, or decreased weight gain.
5. Пролекарство полоксамер-SN22: количественные исследования антипролиферативных эффектов на MYCN-амплифицированных NB клетках.5. Poloxamer-SN22 prodrug: quantitative studies of antiproliferative effects on MYCN-amplified NB cells.
Чтобы продемонстрировать возможность сравнительного изучения антипролиферативного эффекта полимерных пролекарств на NB-клетки с различными (хемо-наивными по сравнению с хеморезистентными) фенотипами, сравнивали эффект PF108-(SN22)2 на две клеточные линии, представляющие агрессивное MYCN-амплифицированное заболевание, до начала лечения и при рецидиве после интенсивной химио-радиотерапии (IMR-32 и BE(2)C соответственно).To demonstrate the feasibility of comparatively studying the antiproliferative effect of polymeric prodrugs on NB cells with different (chemo-naïve vs. chemoreresistant) phenotypes, the effect of PF108-(SN22)2 on two cell lines representing aggressive MYCN-amplified disease was compared before treatment and in case of relapse after intensive chemotherapy and radiotherapy (IMR-32 and BE(2)C, respectively).
Наблюдали сильное различие в паттернах ответа между хемо-наивными и хеморезистентными клетками: хотя рост IMR-32 ингибировался равномерно с высокой эффективностью при всех исследуемых диапазонах доз и продолжительности воздействия (фиг. 4A), BE(2)C клетки показали только ограниченное ингибирование роста при применении PF108-(SN22)2 при дозах <40 нг лекарственного средства на лунку или длительность воздействия <4 ч. Примечательно, что чувствительность этих клеток к свободному SN22 с химически немодифицированным плюроником F-108 или без него также сильно смещалась по сравнению с IMR-32 в сторону более высоких доз и более длительных воздействий, что согласуется с хеморезистентным фенотипом BE(2)C, демонстрирующим потерю функции p53 и пониженную чувствительность к различным семействам химиотерапевтических средств, как показано в предыдущих исследованиях.A strong difference in response patterns was observed between chemo-naïve and chemo-resistant cells: although growth was inhibited uniformly by IMR-32 with high efficiency across all dose ranges and exposure durations tested (Fig. 4A), BE(2)C cells showed only limited growth inhibition at treatment with PF108-(SN22)2 at doses <40 ng of drug per well or exposure duration <4 h. Notably, the sensitivity of these cells to free SN22 with or without chemically unmodified Pluronic F-108 was also strongly shifted compared to IMR- 32 toward higher doses and longer exposures, which is consistent with the chemoresistance phenotype of BE(2)C demonstrating loss of p53 function and reduced sensitivity to various families of chemotherapeutic agents, as shown in previous studies.
6. Сравнительное поглощение и удержание опухолью SN22, сформулированного в виде пролекарства с полоксамером.6. Comparative tumor uptake and retention of SN22 formulated as a poloxamer prodrug.
Эффективность подхода к доставке с использованием пролекарств на основе полоксамера продемонстрирована данными, показывающими быстрое поглощение опухолью и длительное внутриопухолевое удерживание SN22, вводимого в виде конъюгата PF108-(SN22)2 (фиг. 2 и 5). PF108-(SN22)2 обеспечивает пролонгированное присутствие лекарственного средства в ортотопических опухолях NB на уровнях примерно на два порядка выше, чем указанная в сообщениях эффективная локальная концентрация, необходимая для подавления роста хеморезистентных NB клеток.The effectiveness of the poloxamer-based prodrug delivery approach is demonstrated by data showing rapid tumor uptake and prolonged intratumoral retention of SN22 administered as the PF108-(SN22)2 conjugate (Figures 2 and 5). PF108-(SN22)2 provides prolonged drug presence in orthotopic NB tumors at levels approximately two orders of magnitude higher than the reported effective local concentration required to inhibit the growth of chemoresistant NB cells.
Анализ распределения в органах подтвердил быстрое накопление и длительное удержание SN22, доставляемого в виде пролекарства, с относительно небольшими количествами лекарственного средства, поглощаемыми органами ретикулоэндотелиальной системы, печенью и селезенкой. Значительное количество SN22, вводимого в виде PF108-(SN22)2, определено в крови через 4 и 24 ч после введения, что соответствует продолжающемуся накоплению лекарственного средства в опухоли в течение этого периода времени (фиг. 5). Это контрастирует с быстрым выведением лекарственного средства, наблюдаемым в периферических органах, селезенке, легких и почках. Важно отметить, что ингибиторы топоизомеразы I высокоспецифичны для делящихся клеток (S-фаза), в отличие от других химиотерапевтических средств, которые могут быть высоко цитотоксичными даже в отсутствие активной репликации.Organ distribution analysis confirmed the rapid accumulation and long-term retention of SN22 delivered as a prodrug, with relatively small amounts of drug being taken up by the reticuloendothelial organs, liver and spleen. Significant amounts of SN22 administered as PF108-(SN22)2 were detected in the blood at 4 and 24 hours post-administration, consistent with continued drug accumulation in the tumor during this time period (Fig. 5). This contrasts with the rapid drug clearance observed in peripheral organs, spleen, lungs and kidneys. It is important to note that topoisomerase I inhibitors are highly specific for dividing cells (S-phase), unlike other chemotherapeutic agents that can be highly cytotoxic even in the absence of active replication.
Наряду с ограниченной дистрибуцией и быстрым выведением лекарственного средства из периферических органов, наблюдаемым при доставке пролекарства на основе полоксамера, фармакологически селективный способ действия потенциально дополнительно снижает риск значительной системной токсичности, что согласуется с отсутствием симптомов острой системной токсичности (диарея, язвы, анорексия, кахексия или потеря массы тела).Along with the limited distribution and rapid clearance of drug from peripheral organs observed with poloxamer-based prodrug delivery, the pharmacologically selective mode of action potentially further reduces the risk of significant systemic toxicity, consistent with the absence of symptoms of acute systemic toxicity (diarrhea, ulcers, anorexia, cachexia, or weight loss).
7. Полоксамер-SN22 пролекарство вызывает сокращение и подавляет повторный рост малых и больших опухолей NB, демонстрируя транзиентный ответ на иринотекан.7. Poloxamer-SN22 prodrug induces contraction and inhibits regrowth of small and large NB tumors, demonstrating a transient response to irinotecan.
Эффективность стратегии пролекарства на основе полоксамера в обеспечении устойчивых противораковых эффектов на малые и большие опухоли NB была продемонстрирована экспериментально с использованием схемы введения PF108-(SN22)2 один раз в неделю (модель ортотопического ксенотрансплантата IMR-32, фиг. 6). Примечательно, что, несмотря на свой хемо-наивный фенотип, ортотопические NB опухоли, установленные с использованием MYCN-амплифицированных клеток IMR-32, показали только транзиентный ответ на иринотекан (вводимый х2 раза в неделю). Вместе с результатами, демонстрирующими эффективность пролекарственного подхода в модели BE(2)C ксенотрансплантата рефрактерного заболевания (фиг. 3), это обеспечивает убедительное доказательство в поддержку доставки на основе полоксамерного пролекарства в контексте NB высокого риска, демонстрируя ограниченный или неограниченный ответ на обычную химиотерапию.The effectiveness of the poloxamer-based prodrug strategy in providing sustained anticancer effects on small and large NB tumors was demonstrated experimentally using a once-weekly PF108-(SN22)2 dosing regimen (IMR-32 orthotopic xenograft model, Figure 6). Notably, despite their chemo-naïve phenotype, orthotopic NB tumors established using MYCN-amplified IMR-32 cells showed only a transient response to irinotecan (administered x2 weekly). Together with the results demonstrating the effectiveness of the prodrug approach in the BE(2)C xenograft model of refractory disease (Figure 3), this provides compelling evidence in support of poloxamer prodrug-based delivery in the context of high-risk NB, demonstrating limited or unrestricted response to conventional chemotherapy.
Пример 2. PEG-[SN22]4 Example 2. PEG-[SN22] 4
1. Синтез PEG-[SN22]4 1. Synthesis of PEG-[SN22] 4
Конъюгирование карбоксилированного 4-цепочечного PEG (JenKem Technology, Mn=20,553 Да) с SN22 с использованием 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC) в качестве активирующего агента для карбоксильных групп, 4-диметиламинопиридин тозилата (DPTS) в качестве катализатора и CH2Cl2 в каConjugation of carboxylated 4-chain PEG (JenKem Technology, Mn=20.553 Da) to SN22 using 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) as the carboxyl activator, 4-dimethylaminopyridine tosylate (DPTS) as catalyst and CH 2 Cl 2 in ka
- 9 045198 честве растворителя приводило к образованию полимерного конъюгата, содержащего 0,17 ммоль/г или 6,4 мас.% лекарственного средства. 1H ЯМР показал, что SN-22 был ковалентно связан с полимером сложноэфирными связями между карбоксильными группами карбоксилированного полимера и 20-OH SN22.- 9 045198 the quality of the solvent led to the formation of a polymer conjugate containing 0.17 mmol/g or 6.4 wt.% of the drug. 1H NMR showed that SN-22 was covalently linked to the polymer by ester bonds between the carboxyl groups of the carboxylated polymer and the 20-OH of SN22.
2. Результаты экспериментов2. Experimental results
Для оценки восприимчивости SN38 и SN22 к оттоку ABCG2 была идентифицирована ABCG2-ноль NB клеточная линия, NLF. NLF трансфицировали вектором экспрессии ABCG2, а затем отбирали одноклеточные клоны со следовыми, низкими и промежуточными уровнями экспрессии ABCG2 (фиг. 7A). Далее оценивали чувствительность NLF и ABCG2-экспрессирующих клонов к различным концентрациям SN38 или SN22 и непрерывно отслеживали рост с использованием системы анализа живых клеток IncuCyte® S3. Клоны с более высокими уровнями ABCG2 становились все более резистентными к SN38, при этом они оставались полностью чувствительными к SN22 (фиг. 7B). Это предполагает, что эндогенная экспрессия ABCG2, которая характеризует агрессивные NB и стволовые клетки NB, способствует лекарственной резистентности к иринотекану/SN38 и, возможно, другим химиотерапевтическим средствам, чувствительным к оттоку ABCG2.To assess the susceptibility of SN38 and SN22 to ABCG2 efflux, an ABCG2-null NB cell line, NLF, was identified. NLFs were transfected with the ABCG2 expression vector, and single-cell clones with trace, low, and intermediate levels of ABCG2 expression were then selected (Fig. 7A). Next, the sensitivity of NLF and ABCG2-expressing clones to various concentrations of SN38 or SN22 was assessed and growth was continuously monitored using the IncuCyte® S3 Live Cell Assay System. Clones with higher levels of ABCG2 became increasingly resistant to SN38, while they remained fully sensitive to SN22 (Fig. 7B). This suggests that endogenous ABCG2 expression, which characterizes aggressive NB and NB stem cells, contributes to drug resistance to irinotecan/SN38 and possibly other chemotherapeutic agents sensitive to ABCG2 efflux.
Для исследования различных схем SN22 при NB in vivo, осуществляли исследование с использованием модели NB ксенотрансплантата в боковой области мыши, субклона хемо-наивной SH-SY5Y NB линии у иммунодефицитных nu/nu мышей. В предварительном эксперименте оценивали две разные схемы лечения PEG-[SN22]4 (10 мг/кг/доза) по сравнению с CPT-11 (25 мг/кг/доза) в/в два раза в неделю в течение 4 недель. PEG-[SN22]4 вводили либо два раза в неделю в течение двух недель, либо один раз в неделю в течение четырех недель (по 4 дозы). Несмотря на то, что вводили вдвое большие дозы CPT-11 при 2,5х более высокой дозе = PEG-[SN22]4 был намного более эффективным в индукции ремиссии и увеличении периода выживания.To investigate different SN22 regimens for NB in vivo, a study was performed using a flank xenograft mouse model of NB, a subclone of the chemo-naïve SH-SY5Y NB line in immunodeficient nu/nu mice. A preliminary experiment evaluated two different treatment regimens of PEG-[SN22] 4 (10 mg/kg/dose) versus CPT-11 (25 mg/kg/dose) IV twice weekly for 4 weeks. PEG-[SN22]4 was administered either twice a week for two weeks or once a week for four weeks (4 doses). Despite administering twice the dose, CPT-11 at 2.5x higher dose = PEG-[SN22] 4 was much more effective in inducing remission and prolonging survival.
Далее PEG-[SN22]4, PEG-[SN38]4 и CPT-11 в мышиной модели NB ортотопического ксенотрансплантата с хеморезистентной линией NB SKNBE(2)C. BE(2)C клетки трансфицировали вектором экспрессии люциферазы для возможности биолюминесцентной визуализации. Мышей обрабатывали один раз в неделю в течение 4 недель либо PEG-[SN22]4 (10 мг/кг/доза), PEG-[SN38]4 (10 мг/кг/доза), либо CPT-11 (15 мг/кг/доза). В этой хеморезистентной модели CPT-11 не имел никакого эффекта, при этом как PEG-[SN22]4, так и PEG-[SN38]4 были чрезвычайно эффективны в уменьшении опухоли (фиг. 8). В то время как опухоли быстро возобновляли рост после прекращения лечения у мышей, получавших PEG[SN38]4, лечение PEG-[SN22]4 приводило к полному исчезновению опухолей и длительному ингибированию их роста после окончания периода лечения, что позволяет предположить, что PEG-[SN22]4 обладает превосходной эффективностью против рефрактерных заболеваний, предположительно из-за его способности преодолевать приобретенную лекарственную резистентность.Next, PEG-[SN22]4, PEG-[SN38]4 and CPT-11 in the NB orthotopic xenograft mouse model with the chemoresistant NB line SKNBE(2)C. BE(2)C cells were transfected with a luciferase expression vector to enable bioluminescence imaging. Mice were treated once weekly for 4 weeks with either PEG-[SN22]4 (10 mg/kg/dose), PEG-[SN38]4 (10 mg/kg/dose), or CPT-11 (15 mg/kg /dose). In this chemoresistance model, CPT-11 had no effect, while both PEG-[SN22] 4 and PEG-[SN38] 4 were extremely effective in tumor shrinkage (Fig. 8). While tumors rapidly resumed growth after cessation of treatment in mice treated with PEG[SN38] 4 , treatment with PEG-[SN22] 4 resulted in complete resolution of tumors and long-term inhibition of their growth after the end of the treatment period, suggesting that PEG-[SN22]4 [SN22] 4 has superior efficacy against refractory disease, presumably due to its ability to overcome acquired drug resistance.
PEG-[SN22]4 также использовали для лечения de novo NB в TH-MYCN трансгенной мышиной модели. Спонтанные опухоли развиваются в параспинальных ганглиях или надпочечниках к 4-5 неделям почти у всех мышей с двумя копиями трансгена. После пальпации опухоли (4-5 недель) мышей разделяли на 4 группы: контроль - без лечения; лечение CPT-11 (15 мг/кг/доза), PEG-[SN38]4 (10 мг/кг/доза) или PEG-[SN22]4 (10 мг/кг/доза). Мышей обрабатывали один раз в неделю в течение 4 недель. Опухоли быстро прогрессировали у животных, не получавших лечения, и рост опухоли лишь немного задерживался при лечении CPT-11. Мышей умерщвляли, когда у них появлялись клинические признаки опухолевой нагрузки. Однако, все опухоли регрессировали при лечении PEG-[SN22]4 и становились непальпируемыми в течение 1-2 недель лечения (фиг. 9). Они оставались непальпируемыми у всех мышей в течение более 180 дней после начала лечения SN22. Несколько таких мышей умерщвляли и место опухоли исследовали макроскопически и микроскопически, но никаких признаков опухоли не было обнаружено ни у одной из мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что PEG-[SN22]4 чрезвычайно эффективен против спонтанных опухолей, возникающих у иммунокомпетентных мышей, и даже четырех еженедельных доз было достаточно для обеспечения долговременной ремиссии и излечения у всех животных.PEG-[SN22] 4 has also been used to treat de novo NB in the TH-MYCN transgenic mouse model. Spontaneous tumors develop in the paraspinal ganglia or adrenal glands by 4–5 weeks in almost all mice with two copies of the transgene. After palpation of the tumor (4-5 weeks), the mice were divided into 4 groups: control - without treatment; treatment with CPT-11 (15 mg/kg/dose), PEG-[SN38] 4 (10 mg/kg/dose), or PEG-[SN22] 4 (10 mg/kg/dose). Mice were treated once a week for 4 weeks. Tumors progressed rapidly in untreated animals, and tumor growth was only slightly delayed by CPT-11 treatment. Mice were sacrificed when they showed clinical signs of tumor burden. However, all tumors regressed upon treatment with PEG-[SN22] 4 and became non-palpable within 1-2 weeks of treatment (Fig. 9). They remained non-palpable in all mice for more than 180 days after initiation of SN22 treatment. Several of these mice were sacrificed and the site of the tumor was examined macroscopically and microscopically, but no evidence of tumor was found in any of the mice. These data suggest that PEG-[SN22]4 is extremely effective against spontaneous tumors arising in immunocompetent mice, and even four weekly doses were sufficient to produce long-term remission and cure in all animals.
PEG-[SN22]4 использовали для лечения двух репрезентативных сарком, растущих как ксенотрансплантаты, аналогичным образом. Осуществляли обработку линии TC-71 хеморезистентной саркомы Юинга (EWS) и линии Rh30 альвеолярной (фьюжн-положительной) рабдомиосаркомы (RMS). Через 180 дней у всех EWS мышей не было пальпируемых опухолей, но у двух мышей с ксенотрансплантатами RMS рост опухоли возобновился примерно через 150 дней, и их пришлось умертвить (фиг. 10). Поскольку эти мышей обрабатывали только 4 еженедельными дозами одного лекарственного средства, возможно, что этих рецидивов можно было бы избежать с использованием более длительного лечения или комбинации с другим средством. Тем не менее, эти результаты в EWS и RMS демонстрируют, что эффективность PEG-[SN22]4 не ограничивается NB или уникальна для NB, но применима к другим солидным опухолям.PEG-[SN22]4 was used to treat two representative sarcomas growing as xenografts in a similar manner. The TC-71 chemoresistant Ewing's sarcoma (EWS) line and the Rh30 alveolar (fusion-positive) rhabdomyosarcoma (RMS) line were treated. After 180 days, all EWS mice were free of palpable tumors, but two mice with RMS xenografts resumed tumor growth after approximately 150 days and had to be sacrificed (Fig. 10). Because these mice were treated with only 4 weekly doses of a single drug, it is possible that these relapses could have been avoided by using longer treatment or a combination with another drug. However, these results in EWS and RMS demonstrate that the efficacy of PEG-[SN22]4 is not limited to NB or unique to NB, but is applicable to other solid tumors.
Представленные выше результаты показывают значительную эффективность PEG-[SN22]4 в уничтожении опухолей из NB ксенотрансплантатов, а также спонтанных NB, возникающих у иммунокомпетентных трансгенных животных. Большинство животных были вылечены, как было определено по бесThe results presented above demonstrate the significant efficacy of PEG-[SN22]4 in killing tumors from NB xenografts as well as spontaneous NB arising in immunocompetent transgenic animals. Most animals were cured, as determined by demon
- 10 045198 событийной выживаемости (EFS) в течение 180-200 дней от начала лечения. Аналогичные результаты были получены при обработке одной хеморезистентной EWS линии и одной фьюжн-положительной RMS линии в качестве ксенотрансплантатов в боковой области. Таким образом, PEG-[SN22]4 эффективен в качестве единственного средства для получения долгосрочной EFS в этих животных моделях агрессивных солидных опухолей у детей и других состояний, как описано в настоящей заявке.- 10 045198 event survival (EFS) within 180-200 days from the start of treatment. Similar results were obtained when one chemoresistant EWS line and one fusion-positive RMS line were treated as flank xenografts. Thus, PEG-[SN22] 4 is effective as a single agent for producing long-term EFS in these animal models of aggressive pediatric solid tumors and other conditions, as described herein.
Клеточные линии. Панель из 4 клеточных линий NB, представляющих основные генотипы (MYCN амплификация, делеция 1p36, мутация ALK) NB высокого риска, а также как хемо-наивные, так и хеморезистентные опухоли (SY5Y, IMR5, NLF, SKNBE2C), можно использовать для всех исследований in vitro и in vivo. Клетки выращивают в RPMI-1640 (Gibco) с 10% фетальной телячьей сывороткой (Cellgro) и поддерживают в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO2. Клетки собирают с использованием 0,02% Na4 EDTA в фосфатно-солевом буфере (PBS). Используемые RMS линии представляют собой RH18 и RH30 (эмбриональные, альвеолярные); EWS линии представляют собой TC32 и TC71 (диагностика, рецидив); и OS линии представляют собой U2OS и SAOS2.Cell lines. A panel of 4 NB cell lines representing major genotypes (MYCN amplification, 1p36 deletion, ALK mutation) high-risk NB, as well as both chemo-naïve and chemo-resistant tumors (SY5Y, IMR5, NLF, SKNBE2C), can be used for all studies in vitro and in vivo. Cells were grown in RPMI-1640 (Gibco) with 10% fetal bovine serum (Cellgro) and maintained in a humidified atmosphere of 95% air and 5% CO 2 . Cells are harvested using 0.02% Na 4 EDTA in phosphate buffered saline (PBS). The RMS lines used are RH18 and RH30 (embryonic, alveolar); EWS lines are TC32 and TC71 (diagnosis, relapse); and OS lines are U2OS and SAOS2.
МышиMice
Используют мышей Foxn1nu/Foxn1nu (JAX stock #007850) шестинедельного возраста от Jackson Laboratories. Мышей содержат в условиях контролируемой влажности и температуры в режиме свет/темнота с 12-часовыми интервалами. Эти мыши находятся в фоновом генотипе 129-SvJ. У мышей, гомозиготных по трансгену, обычно развивались опухоли в течение 4-5 недель.Six-week-old Foxn1 nu /Foxn1 nu mice (JAX stock #007850) from Jackson Laboratories were used. Mice were housed in a humidity- and temperature-controlled environment on a light/dark cycle at 12-hour intervals. These mice are in the 129-SvJ genotype background. Mice homozygous for the transgene typically developed tumors within 4-5 weeks.
Вводимые в бок ксенотрансплантатыXenografts inserted into the side
Мышам вводят SQ в правый бок 1 х 107 клеток NB, суспендированных в 0,1 мл матригеля (Corning, Tewksbury, MA). Опухоли измеряют вручную 2 раза в неделю в двух направлениях (мм) с использованием штангенциркуля. Объем (см3) рассчитывается следующим образом: [(0,523 х L х W2)/1000)], где L > W. Массу тела определяют 2х/неделя, и лечебные дозы корректируют, если изменение массы тела >10%. Мышей (n=10 на группу) обрабатывают при помощи PEG-[SN22]4 путем инъекции в хвостовую вену 1х/неделя в течение 4 недель, как только объемы опухоли достигают 0,2 см3 (2). PEG-[SN22]4 вводят в количестве 10 мг/кг/доза; CPT-11 (CPT-11; 15 мг/кг) или только носитель используют в качестве положительного и отрицательного контролей.Mice received SQ injections into the right flank with 1 x 10 7 NB cells suspended in 0.1 ml Matrigel (Corning, Tewksbury, MA). Tumors are measured manually 2 times a week in two directions (mm) using a caliper. Volume (cm 3 ) is calculated as follows: [(0.523 x L x W 2 )/1000)], where L > W. Body weight is determined 2x/week, and treatment doses are adjusted if the change in body weight is >10%. Mice (n=10 per group) are treated with PEG-[SN22]4 by tail vein injection 1x/week for 4 weeks once tumor volumes reach 0.2 cm 3 (2). PEG-[SN22]4 is administered at 10 mg/kg/dose; CPT-11 (CPT-11; 15 mg/kg) or vehicle alone were used as positive and negative controls.
Ортотопические ксенотрансплантатыOrthotopic xenografts
NB клетки, стабильно экспрессирующие люциферазу, имплантируют в количестве 106 клеток на животное в надпочечниковую жировую подушку голых бестимусных мышей (nu/nu). Опухоль проверяют и опухолевую нагрузку после этого контролировают два раза в неделю методом биолюминесцентной визуализации с использованием системы визуализации Xenogen IVIS (Perkin Elmer, Santa Clara, CA) в сочетании с программным обеспечением Living Image (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). После достижения размера опухоли 1 см3 (~28 дней после инокуляции) мышей с опухолями рандомизируют на группы по 10 животных и вводят в/в однократную дозу 120 мкл PEG-(SN22)4, CPT-11 или носителя, как указано выше.NB cells stably expressing luciferase were implanted at a rate of 106 cells per animal into the adrenal fat pad of nude nude (nu/nu) mice. The tumor is examined and tumor burden is then monitored twice weekly by bioluminescence imaging using the Xenogen IVIS imaging system (Perkin Elmer, Santa Clara, CA) in combination with Living Image software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Once tumor size reaches 1 cm 3 (∼28 days postinoculation), tumor-bearing mice are randomized into groups of 10 animals and given a single IV dose of 120 μl of PEG-(SN22)4, CPT-11, or vehicle as above.
Фармакокинетический анализ PEG-[SN22]4 и CPT-11Pharmacokinetic analysis of PEG-[SN22]4 and CPT-11
Мышам (n=3 на группу, на момент времени) с ксенотрансплантатами в боковой области вводят разовую дозу PEG-[SN22]4 в концентрации 10 мг/кг, или CPT-11 в концентрации 15 мг/кг в/в через хвостовую вену. Используют более низкую дозу, потому что CPT-11 является пролекарством, которое требует преобразования в активный SN38 в печени. Получают ретроорбитальную и терминальную кровь и собирают в пробирки объемом 2 мл, содержащие гепарин натрия (BD). Ткани (опухоль, легкое, печень, селезенка, почки) собирают после умерщвления через 4, 12, 24, 48 и 72 ч после перфузии сердца холодным физиологическим раствором и анализируют при помощи CHOP Pharmacology Core. Общие уровни SN38, SN22 и CPT-11 анализировают в крови мышей (разбавленной водой 1:1) и гомогенатах тканей методом СВЭЖХ-МС/МС.Mice (n=3 per group, per time point) with flank xenografts were administered a single dose of 10 mg/kg PEG-[SN22]4 or 15 mg/kg CPT-11 IV via the tail vein. A lower dose is used because CPT-11 is a prodrug that requires conversion to active SN38 in the liver. Retro-orbital and terminal blood is obtained and collected in 2 ml tubes containing sodium heparin (BD). Tissues (tumor, lung, liver, spleen, kidney) were collected postmortem at 4, 12, 24, 48, and 72 h after cardiac perfusion with cold saline and analyzed using the CHOP Pharmacology Core. Total levels of SN38, SN22 and CPT-11 were analyzed in mouse blood (diluted 1:1 in water) and tissue homogenates by UHPLC-MS/MS.
Пример 3. [PEG-SN38-BG]8Example 3. [PEG-SN38-BG]8
1. Синтез трехкомпонентного пролекарства на полимерной основе1. Synthesis of a three-component polymer-based prodrug
Пролекарства, как описано в настоящей заявке, несут либо восемь, либо две гибридных молекулы лекарственное средство-лиганд, связанных с разветвленным или линейным PEG носителем, соответственно, через расщепляемую in situ сложноэфирную связь. Их гидролитическая лабильность и скорость активации увеличены по сравнению с обычными (ациловыми) сложными эфирами из-за сильного эффекта электронного замещения алкоксиацетильной группы.Prodrugs, as described herein, carry either eight or two drug-ligand hybrid molecules linked to a branched or linear PEG carrier, respectively, via an in situ cleavable ester linkage. Their hydrolytic lability and activation rate are increased compared to conventional (acyl) esters due to the strong electronic substitution effect of the alkoxyacetyl group.
Сначала N-Boc-защищенную аминометилфеноксигексановую кислоту конъюгировали с SN-38 (AstaTech, Bristol, PA) с выходом 85% с использованием 4-N,N-диметиламинопиридин тозилата (DPTS) в качестве катализатора, 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC) в качестве активирующего агента для карбоксильных групп и дихлорметана в качестве растворителя. Защитную группу удаляли трифторуксусной кислотой и конъюгат подвергали взаимодействию в смеси тетрагидрофурана и дихлорметана с 1,3-ди-Boc-2-(трифторметилсульфонил)гуанидином в качестве гуанидинилирующего агента (выход: 75%). Низкомолекулярный конъюгат Boc-защищенного BG и SN-38, соединенный через гидролитически расщепляемый 6-гексаноиловый спейсер, затем присоединяли к карбоксилированному 8-цепочечномуFirst, N-Boc-protected aminomethylphenoxyhexanoic acid was conjugated to SN-38 (AstaTech, Bristol, PA) in 85% yield using 4-N,N-dimethylaminopyridine tosylate (DPTS) as a catalyst, 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in as an activating agent for carboxyl groups and dichloromethane as a solvent. The protecting group was removed with trifluoroacetic acid and the conjugate was reacted in a mixture of tetrahydrofuran and dichloromethane with 1,3-di-Boc-2-(trifluoromethylsulfonyl)guanidine as guanidinylating agent (yield: 75%). A low molecular weight conjugate of Boc-protected BG and SN-38, connected through a hydrolytically cleavable 6-hexanoyl spacer, was then attached to a carboxylated 8-chain
- 11 045198- 11 045198
PEG (JenKem Technology, Mn=37390 Да, PDI=1,06), также с использованием DPTS, DCC и дихлорметана в качестве катализатора, активатора и растворителя, соответственно.PEG (JenKem Technology, M n =37390 Da, PDI=1.06), also using DPTS, DCC and dichloromethane as catalyst, activator and solvent, respectively.
Для очистки полимер осаждали диэтиловым эфиром из раствора в бензоле, а остаточный DPTS удаляли промыванием водным сульфатом натрия (21% мас./мас.). Отсутствие подвижных соединений подтверждали на этой стадии анализом ТСХ (силикагель, хлороформ-ацетонитрил, 7:3). Наконец, защитные группы удаляли из гуанидиновых фрагментов обработкой трифторуксусной кислотой. Полученный полимер [PEG-SN38-BG]8 промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакууме. Структуру и эффективность функционализации продукта анализировали при помощи 1H ЯМР, показывшем 0,18 ммоль/г (7,1% по массе) SN-38 и эквивалентное количество BG, связанного с полимером. Чистоту подтверждали анализом ТСХ и 1H ЯМР.For purification, the polymer was precipitated with diethyl ether from a solution in benzene, and residual DPTS was removed by washing with aqueous sodium sulfate (21% w/w). The absence of mobile compounds was confirmed at this stage by TLC analysis (silica gel, chloroform-acetonitrile, 7:3). Finally, the protecting groups were removed from the guanidine moieties by treatment with trifluoroacetic acid. The resulting polymer [PEG-SN38-BG]8 was washed with diethyl ether and dried in vacuum. The structure and functionalization efficiency of the product was analyzed by 1H NMR showing 0.18 mmol/g (7.1 wt%) SN-38 and an equivalent amount of BG bound to the polymer. Purity was confirmed by TLC and 1 H NMR analysis.
2. Поглощение для таргетной терапии опухолей.2. Uptake for targeted tumor therapy.
SN-38, доставленный в виде BG-функционализированного пролекарства на основе 8-цепочечного PEG [PEG-SN38-BG]8, в эквивалентной дозе, соответствующей 10 мг SN-38 на кг, стабильно присутствовал в опухолях при концентрациях во много раз выше: 2,82±0,53 мкг/г, 4,46±1,59 мкг/г и 2,63±0,85 мкг/г через 1, 4 и 24 ч соответственно (фиг. 11), из чего можно сделать вывод, что доставка пролекарства на полимерной основе может обеспечить стабильные терапевтически эффективные уровни лекарственного средства, необходимые для подавления роста рефрактерных опухолей, не отвечающих на стандартные методы лечения.SN-38, delivered as a BG-functionalized 8-chain PEG prodrug [PEG-SN38-BG]8, at an equivalent dose corresponding to 10 mg SN-38 per kg, was stably present in tumors at concentrations many times higher: 2.82±0.53 µg/g, 4.46±1.59 µg/g and 2.63±0.85 µg/g after 1, 4 and 24 hours, respectively (Fig. 11), from which we can make conclusion that polymer-based prodrug delivery can provide sustained, therapeutically effective drug levels needed to inhibit the growth of refractory tumors that do not respond to standard treatments.
В соответствии с устойчивым внутриопухолевым присутствием SN-38 на уровнях, на два порядка превышающих заявленный терапевтический порог 25 нг/мл для лекарственно-резистентной NB клеточной линии BE(2)C, лекарственное средство, сформулированное и введенное в виде [PEG-SN38-BG]8, вызывало быструю регрессию опухоли и сильно подавляло повторный рост малых и больших ортотопических BE(2)C ксенотрансплантатов (фиг. 12A). Долговременный противораковый эффект пролекарства заметно увеличил бессобытийную выживаемость животных (t50% выживаемость 130 и 88 дней, соответственно, по сравнению с 12 днями для животных, не получавших лечения, фиг. 12B), в отличие от незначительного терапевтического эффекта и увеличения выживаемости при использовании иринотекана, вводимого в эквивалентной дозе в этом исследовании (t50% выживаемость в течение 20 дней).Consistent with the sustained intratumoral presence of SN-38 at levels two orders of magnitude higher than the reported therapeutic threshold of 25 ng/mL for the drug-resistant NB cell line BE(2)C, the drug formulated and administered as [PEG-SN38-BG ]8, caused rapid tumor regression and strongly suppressed the regrowth of small and large orthotopic BE(2)C xenografts (Fig. 12A). The long-term anticancer effect of the prodrug markedly increased event-free survival of animals (t 50 % survival of 130 and 88 days, respectively, compared with 12 days for untreated animals, Fig. 12B), in contrast to the negligible therapeutic effect and increased survival with irinotecan , administered at an equivalent dose in this study (t 50 % survival at 20 days).
Важно отметить, что незначительный эффект иринотекана в этой модели демонстрирует адекватность подхода доклинической оценки, резюмируя терапевтическую задачу достижения длительного клинически значимого ответа в условиях агрессивной, рефрактерной NB человека. В то же время, [PEGSN38-BG]8 был способен вызывать быстрое уменьшение опухоли и стабилизировать заболевание без прогрессирования, наблюдаемого во время и после периода лечения, состоящего из восьми доз (последнюю дозу вводили на 24 день). Примечательно, что во время лечения пролекарством [PEG-SN38-BG]8 не наблюдали никаких признаков системной токсичности, таких как диарея, натяжение кожи (из-за обезвоживания), изъязвления кожи, анорексия, кахексия или замедление набора веса.Importantly, the modest effect of irinotecan in this model demonstrates the adequacy of the preclinical evaluation approach, recapitulating the therapeutic challenge of achieving durable clinically meaningful responses in the setting of aggressive, refractory human NB. In contrast, [PEGSN38-BG]8 was able to induce rapid tumor shrinkage and stabilize disease without progression observed during and after a treatment period of eight doses (last dose administered on day 24). Notably, no signs of systemic toxicity such as diarrhea, skin tension (due to dehydration), skin ulceration, anorexia, cachexia, or decreased weight gain were observed during treatment with the [PEG-SN38-BG]8 prodrug.
3. Средства, усиливающие экспрессию NET, могут дополнительно улучшать эффективность нацеленных на поглощение-1 пролекарств.3. Agents that enhance NET expression may further improve the efficacy of uptake-1-targeted prodrugs.
Вориностат, являющийся сильным ингибитором pan-HDAC с профилем токсичности, который в значительной степени не перекрывается с профилем ингибиторов топоизомеразы I, как было показано, существенно увеличивал экспрессию NET в опухолях NB и сенсибилизировал опухолевые клетки к препаратам камптотецина путем ингибирования экспрессии ферментов для репарации разрывов ДНК и стимулирования индуцированного повреждением ДНК апоптоза [44], оба эффекта имеют значение для усиления таргетной терапии нейроэндокринных опухолей с использованием BG-функционализированных пролекарств SN-38. Исследовали потенцирующий эффект вориностата на ингибирование роста клеток BE(2)C при помощи [PEG-SN38-BG]8 по сравнению с SN-38.Vorinostat, a potent pan-HDAC inhibitor with a toxicity profile that does not largely overlap with that of topoisomerase I inhibitors, has been shown to significantly increase NET expression in NB tumors and sensitize tumor cells to camptothecin drugs by inhibiting the expression of DNA break repair enzymes and promoting DNA damage-induced apoptosis [44], both effects have implications for enhancing targeted therapy of neuroendocrine tumors using BG-functionalized SN-38 prodrugs. The potentiating effect of vorinostat on growth inhibition of BE(2)C cells by [PEG-SN38-BG]8 versus SN-38 was examined.
Вориностат заметно усиливал антипролиферативный эффект [PEG-SN38-BG]8 (p< 0,0001 для члена взаимодействия C в выражении z=z0+A-x+B-y+C-[x-y], фиг. 13A), но также имел умеренный синергизм с химически немодифицированным SN-38 (P=0,087 для C, фиг. 13B). Это согласуется с комбинированными, связанными и не связанными с экспрессией NET механизмами потенцирования лекарственного средства, демонстрируемыми вориностатом, добавляя еще большее усиление ингибирования роста клеток NB BG-функционализированным пролекарством. Примечательно, что в диапазоне низких микромолярных концентраций (1-5 мкМ), где вориностат сильно усиливал действие пролекарства, его собственный эффект ингибирования роста клеток BE(2)C был только умеренным (фиг. 13A), что согласуется с умеренной монотерапевтической активностью вориностата в доклинических моделях NB.Vorinostat markedly enhanced the antiproliferative effect of [PEG-SN38-BG]8 (p < 0.0001 for interaction term C in the expression z=z 0 +A-x+B-y+C-[xy], Fig. 13A), but also had moderate synergism with chemically unmodified SN-38 (P=0.087 for C, Fig. 13B). This is consistent with the combined, NET expression-related and non-NET expression-related mechanisms of drug potentiation demonstrated by vorinostat, adding further enhancement of NB cell growth inhibition by the BG-functionalized prodrug. Notably, in the low micromolar concentration range (1-5 μM), where vorinostat strongly potentiated the effect of the prodrug, its intrinsic effect of inhibiting the growth of BE(2)C cells was only moderate (Fig. 13A), which is consistent with the moderate monotherapeutic activity of vorinostat in preclinical models NB.
4. Опосредованное пролекарством ингибирование роста хеморезистентных NB клеток и его фармакологическое потенциирование.4. Prodrug-mediated inhibition of the growth of chemoresistant NB cells and its pharmacological potentiation.
Чтобы оценить специфический вклад таргетирующего лиганда, включенного в структуру пролекарства, активность ингибирования клеточного роста [PEG-SN38-BG]8 на NET-экспрессирующих хеморезистентных клетках NB сравнивали с контрольной молекулой, [PEG-SN38]8, сконструированной аналогичным образом, но без BG фрагмента. Кроме того, установив, что ингибитор pan-HDAC, который, как показано, положительно регулирует экспрессию NET и усиливает поглощение-1 в NB клетках и ксеTo evaluate the specific contribution of the targeting ligand included in the prodrug structure, the cell growth inhibitory activity of [PEG-SN38-BG]8 on NET-expressing chemoresistant NB cells was compared with a control molecule, [PEG-SN38]8, constructed similarly but without BG fragment. Furthermore, having established that a pan-HDAC inhibitor, which has been shown to positively regulate NET expression and enhance uptake-1 in NB cells and x
- 12 045198 нотрансплантатах опухоли, сильно усиливает антипролиферативный эффект [PEG-SN38-BG]8 на NETэкспрессирующих клетках NB (фиг. 13), была рассмотрена гипотеза о том, что селективный ингибитор HDAC со специфичностью для подсемейства HD типа 1 (энтиностат) также будет синергетически взаимодействовать с [PEG-SN38-BG]8.- 12 045198 tumor grafts, strongly enhances the antiproliferative effect of [PEG-SN38-BG]8 on NET-expressing NB cells (Fig. 13), the hypothesis was considered that a selective HDAC inhibitor with specificity for the HD type 1 subfamily (entinostat) would also interact synergistically with [PEG-SN38-BG] 8 .
Сильное различие в способности подавлять пролиферацию хеморезистентных NB клеток наблюдали между трехкомпонентным пролекарством и двухкомпонентной контрольной конструкцией, собранной без лиганда BG. В то время как рост NET-экспрессирующих клеток BE(2)C ингибировался [PEGSN38-BG]8 с высокой эффективностью, сопоставимой с активностью свободного SN-38 в in vitro условиях прямого контакта лекарственное средство-клетка, двухкомпонентная конструкция, [PEG-SN38]8, была заметно менее эффективна (фиг. 14A), указывая на важность трехкомпонентной конструкции и роли BG в усилении антипролиферативного ответа. В отдельном исследовании сильный потенцирующий эффект на опосредованное пролекарством подавление роста клеток NB был показан для HDAC1-специфического блокатора энтиностата (фиг. 14B, p<0,001 для члена взаимодействия C). Интересно, что это открытие предполагает, что энтиностат, высокоселективное нехимиотерапевтическое средство с эпигенетическим механизмом действия, может синергетически взаимодействовать с BG-функционализированными терапевтическими средствами, возможно за счет усиления их поглощения, подобно химически отличному ингибитору рап-HDAC вориностату.A strong difference in the ability to suppress the proliferation of chemoresistant NB cells was observed between the three-component prodrug and the two-component control construct assembled without the BG ligand. While the growth of NET-expressing BE(2)C cells was inhibited by [PEGSN38-BG]8 with high potency comparable to that of free SN-38 in an in vitro direct drug-cell contact two-component design, [PEG-SN38 ]8 was markedly less effective (Fig. 14A), indicating the importance of the three-component design and the role of BG in enhancing the antiproliferative response. In a separate study, a strong potentiation effect on prodrug-mediated inhibition of NB cell growth was shown for the HDAC1-specific blocker entinostat (Fig. 14B, p<0.001 for interaction term C). Interestingly, this finding suggests that entinostat, a highly selective non-chemotherapeutic agent with an epigenetic mechanism of action, may interact synergistically with BG-functionalized therapeutics, possibly by enhancing their uptake, similar to the chemically distinct rap-HDAC inhibitor vorinostat.
5. Сравнительное поглощение и удержание опухолью SN-38, сформулированного в виде NETнацеленного пролекарства.5. Comparative tumor uptake and retention of SN-38 formulated as a NET-targeted prodrug.
Эффективность терапевтической стратегии на основе пролекарств была продемонстрирована в исследованиях, показывающих быстрое поглощение опухолью и длительное внутриопухолевое удержание SN-38, доставленного в виде трехкомпонентного пролекарства [PEG-SN38-BG]8 (фиг. 11 и табл. 2). В отличие от SN-38, вводимого в форме его клинически используемого фармакологически неактивного предшественника (иринотекана), доставка на основе пролекарства обеспечивает локализацию и устойчивое внутриопухолевое присутствие SN-38 на уровнях примерно на два порядка выше, чем указанная в сообщениях концентрация SN-38, требуемая для подавления роста хеморезистентных NB клеток BE(2)C. Анализ осуществляли в больших ортотопических ксенотрансплантатах BE(2)C (1,0±0,4 см3, n=5) с использованием анализа ВЭЖХ.The effectiveness of a prodrug-based therapeutic strategy was demonstrated in studies showing rapid tumor uptake and prolonged intratumoral retention of SN-38 delivered as a ternary prodrug [PEG-SN38-BG]8 (Fig. 11 and Table 2). Unlike SN-38 administered in the form of its clinically used pharmacologically inactive precursor (irinotecan), prodrug-based delivery ensures localization and sustained intratumoral presence of SN-38 at levels approximately two orders of magnitude higher than the reported concentration of SN-38. required to suppress the growth of chemoresistant NB BE(2)C cells. The analysis was performed in large orthotopic BE(2)C xenografts (1.0±0.4 cm 3 , n=5) using HPLC analysis.
Таблица 2. Внутриопухолевые уровни лекарственного средства, выраженные как % дозы на грамм опухоли (представлены как среднее значение ± SD)Table 2. Intratumoral drug levels expressed as % dose per gram of tumor (presented as mean ± SD)
6. Пролекарство [PEG-SN38-BG]8 вызывает регрессию опухоли и достигает излечения в модели агрессивной NB, демонстрируя только временный ответ на обычную терапию.6. Prodrug [PEG-SN38-BG]8 induces tumor regression and achieves cure in an aggressive NB model, demonstrating only a transient response to conventional therapy.
Эффективность стратегии трехкомпонентного пролекарства в обеспечении устойчивых противоопухолевых эффектов против агрессивных NB опухолей была экспериментально показана на модели ортотопического ксенотрансплантата IMR-32 (фиг. 15). [PEG-SN38-BG]8, вводимый два раза в неделю в течение 4 недель, вызывал быстрое уменьшение опухоли без последующего повторного роста в модели хемо-наивного MYCN-амплифицированного заболевания. Это контрастирует с опухолями, которые начинают повторно расти сразу после прекращения лечения, в группе животных, получавших предшественник SN-38 иринотекан (фиг. 15A, B). Вместе с результатами, демонстрирующими эффективность пролекарственного подхода в BE(2)C модели ксенотрансплантата рефрактерного заболевания (фиг. 12), это обеспечивает убедительное доказательство в поддержку доставки на основе трехкомпонентного пролекарства в контексте NB высокого риска, демонстрируя ограниченный или отсутствие ответа на обычную химиотерапию.The effectiveness of the three-component prodrug strategy in providing durable antitumor effects against aggressive NB tumors was experimentally demonstrated in the IMR-32 orthotopic xenograft model (Fig. 15). [PEG-SN38-BG]8 administered twice weekly for 4 weeks caused rapid tumor shrinkage without subsequent regrowth in a chemo-naïve MYCN-amplified disease model. This is in contrast to tumors that began to re-grow immediately after cessation of treatment in the group of animals treated with the SN-38 precursor irinotecan (Fig. 15A,B). Together with the results demonstrating the effectiveness of the prodrug approach in the BE(2)C xenograft model of refractory disease (Figure 12), this provides compelling evidence in support of triple prodrug-based delivery in the context of high-risk NB demonstrating limited or no response to conventional chemotherapy.
7. Трехкомпонентные конструкции демонстрируют потенциал для лечения мультилекарственнорезистентной нейробластомы высокого риска.7. Three-component constructs show potential for the treatment of high-risk multidrug-resistant neuroblastoma.
SN-38, сформулированный и вводимый в течение 4 недель (2х/неделя) в виде Транспортер норэпинефрина (NET)-нацеленного полимер-связанного пролекарства, вызывал быструю регрессию опухоли, полностью подавлял повторный рост хеморезистентных ортотопических ксенотрансплантатов BE(2)C и значительно увеличивал бессобытийную выживаемость (> 14 недель, фиг. 16A). Это отличается от иринотекана, не имеющего противоопухолевого эффекта в этой модели, а также является значительным улучшением по сравнению с двухкомпонентным контролем [PEG-SN38]4, который ингибировал рост опухоли только на время периода лечения (фиг. 16A). Кроме того, перевод животных, у которых во время лечения иринотеканом быстро развились большие опухоли (2 см3), на [PEG-SN38-BG]8 вызывал уменьшение размеров их опухолей и оставлял их неопределяемыми в течение > 12 недель (исследование спасения, фиг. 16B).SN-38, formulated and administered for 4 weeks (2x/week) as a norepinephrine transporter (NET)-targeted polymer-linked prodrug, caused rapid tumor regression, completely suppressed regrowth of chemoresistant orthotopic BE(2)C xenografts, and significantly increased event-free survival (>14 weeks, Fig. 16A). This is in contrast to irinotecan, which had no antitumor effect in this model, and is also a significant improvement over the two-component control [PEG-SN38] 4 , which inhibited tumor growth only during the treatment period (Fig. 16A). In addition, switching animals that rapidly developed large tumors (2 cm 3 ) during irinotecan treatment to [PEG-SN38-BG]8 caused their tumors to shrink in size and remain undetectable for >12 weeks (rescue study, Fig. .16B).
Важно отметить, что отсутствие противоопухолевого эффекта, проявляемого иринотеканом, аналоIt is important to note that the lack of antitumor effect exhibited by irinotecan is similar
- 13 045198 гично отсутствию ответа, наблюдаемого у пациентов с NB ультравысокого риска, показывает, что доклинические модели точно воспроизводят клиническое поведение рефрактерной NB. Примечательно, что длительный и сильный терапевтический эффект, наблюдаемый при использовании [PEG-SN38-BG]8, не сопровождался признаками системной токсичности (диарея, натяжение кожи или изъязвления, анорексия, кахексия или замедление набора массы тела).- 13 045198 consistent with the lack of response observed in patients with ultra-high-risk NB, shows that preclinical models accurately reproduce the clinical behavior of refractory NB. Notably, the long-lasting and potent therapeutic effect observed with [PEG-SN38-BG]8 was not accompanied by signs of systemic toxicity (diarrhea, skin tension or ulceration, anorexia, cachexia, or decreased weight gain).
При испытании в экспериментальных условиях, моделирующих менее терапевтически сложное хемо-наивное заболевание, иринотекан был способен подавлять рост опухоли на протяжении лечения (4 недели), тогда как [PEG-SN38-BG]8, вводимый в течение того же периода времени, полностью устранял NB опухоли (нет заметного повторного роста через 30 недель, фиг. 17). Эти результаты свидетельствуют о том, что NET-нацеленная доставка с пролекарством, связанным с полимерным носителем, может быть оптимизирована для успешного лечения различных стадий (впервые диагностированной или рецидивирующей) агрессивной MYCN-амплифицированной NB.When tested in an experimental setting simulating a less therapeutically challenging chemo-naïve disease, irinotecan was able to suppress tumor growth over the course of treatment (4 weeks), whereas [PEG-SN38-BG]8 administered over the same period of time completely eliminated NB tumors (no noticeable regrowth after 30 weeks, Fig. 17). These results suggest that NET-targeted delivery with a prodrug bound to a polymer carrier can be optimized for the successful treatment of different stages (newly diagnosed or relapsed) of aggressive MYCN-amplified NB.
8. Пролекарство [PEG-SN38-BG]8 вызывает регрессию и подавляет повторный рост диссеминированных опухолевых отложений в модели метастатической лекарственно-резистентной NB.8. Prodrug [PEG-SN38-BG]8 induces regression and suppresses regrowth of disseminated tumor deposits in a model of metastatic drug-resistant NB.
Эффективность NET-нацеленной доставки лекарственного средства на основе трехкомпонентного пролекарства в достижении длительных терапевтических эффектов против диссеминированной хеморезистентной NB оценивали на мышиной модели метастатического рефрактерного заболевания (фиг. 18). [PEG-SN38-BG]8, вводимый в течение 4 недель, вызывал быстрое устранение установленных многоочаговых опухолевых отложений без заметного повторного роста в течение более 15 недель. Напротив, иринотекан, вводимый два раза в неделю в дозе 15 мг/кг, не оказывал значительного влияния на прогрессирование заболевания (фиг. 18A, B). В совокупности с экспериментально продемонстрированной эффективностью NET-нацеленного трехкомпонентного пролекарства против ортотопических рефрактерных опухолей (фиг. 16) эти результаты убедительно подтверждают обоснованность стратегии разработки пролекарства и ее терапевтический потенциал против как локализованных, так и диссеминированных заболеваний высокого риска, не отвечающих на традиционную терапию.The effectiveness of NET-targeted drug delivery based on a ternary prodrug in achieving long-lasting therapeutic effects against disseminated chemorefractory NB was assessed in a mouse model of metastatic refractory disease (Fig. 18). [PEG-SN38-BG]8 administered for 4 weeks caused rapid clearance of established multifocal tumor deposits without significant regrowth for more than 15 weeks. In contrast, irinotecan administered twice weekly at a dose of 15 mg/kg had no significant effect on disease progression (Fig. 18A, B). Taken together with the experimentally demonstrated efficacy of the NET-targeted triple prodrug against orthotopic refractory tumors (Figure 16), these results strongly support the rationale for the prodrug development strategy and its therapeutic potential against both localized and disseminated high-risk disease unresponsive to conventional therapy.
9. Опосредованное пролекарством ингибирование роста MYCN-амплифицированных мультилекарственно-резистентных NB клеток.9. Prodrug-mediated inhibition of growth of MYCN-amplified multidrug-resistant NB cells.
Наблюдали сильное различие в паттернах ответа, когда хеморезистентные NB клетки [BE(2)C] обрабатывали NET-нацеленным трехкомпонентным пролекарством (PF68-SN38-BG), по сравнению с нетаргетированным двухкомпонентным контролем (PF68-SN38) и свободным SN-38. В соответствии с хеморезистентным фенотипом BE(2)C, демонстрирующим потерю функции p53, рост клеток BE(2)C незначительно подавлялся свободным SN-38. Он также показал ограниченный и транзиентный ответ на PF68-SN38. Холостой Плюроник F-68 не влиял на рост клеток. Однако 15-минутное воздействие PF68SN38-BG в дозах >5 нМ SN-38 приводило к сильному и продолжительному антипролиферативному эффекту (фиг. 19).A dramatic difference in response patterns was observed when chemoresistant NB cells [BE(2)C] were treated with a NET-targeted three-component prodrug (PF68-SN38-BG), compared with an untargeted two-component control (PF68-SN38) and free SN-38. Consistent with the BE(2)C chemoresistance phenotype demonstrating loss of p53 function, BE(2)C cell growth was only slightly inhibited by free SN-38. It also showed a limited and transient response to PF68-SN38. Blank Pluronic F-68 had no effect on cell growth. However, 15-minute exposure to PF68SN38-BG at doses of >5 nM SN-38 resulted in a strong and long-lasting antiproliferative effect (Fig. 19).
Для оценки специфического вклада аффинности к NET, встроенной в дизайн пролекарства, ингибирующую рост BE(2)C активность PF68-SN38-BG испытывали с/без специфического блокатора NET (низоксетин, 1 мкМ). Двухкомпонентный PF68-SN38, включенный в качестве контроля, показал самую низкую ингибирующую активность при дозах < 20 нМ SN-38. Эффект трехкомпонентного PF68-SN38-BG был заметно сильнее (P=0,020), но частично обратим посредством блокады NET (фиг. 20), подтверждая роль таргетирования NET.To evaluate the specific contribution of NET affinity built into the prodrug design, the BE(2)C growth inhibitory activity of PF68-SN38-BG was tested with/without a specific NET blocker (nisoxetine, 1 μM). The two-component PF68-SN38 included as a control showed the lowest inhibitory activity at doses <20 nM SN-38. The effect of the PF68-SN38-BG tripartite was markedly stronger (P=0.020) but partially reversible by NET blockade (Figure 20), supporting a role for NET targeting.
В соответствии с этими результатами трехкомпонентное NET-нацеленное пролекарство, синтезированное аналогично с использованием Плюроника F-108 и вводимое в течение 4 недель (2х/неделя), вызывало быструю регрессию ортотопических BE(2)C опухолевых ксенотрансплантатов, в отличие от незначительного эффекта иринотекана в этой модели рефрактерной NB (фиг. 21A 20A). Также в отличие от двухкомпонентного PF108-SN38, трехкомпонентное пролекарство стабилизировало заболевание без прогрессирования в течение всего периода лечения. Кроме того, животные, быстро приближающиеся к конечной точке, демонстрировали заметное уменьшение опухоли при лечении пролекарством (исследование спасение, фиг. 21B).Consistent with these results, a three-component NET-targeting prodrug, synthesized similarly using Pluronic F-108 and administered for 4 weeks (2x/week), caused rapid regression of orthotopic BE(2)C tumor xenografts, in contrast to the negligible effect of irinotecan in this model of refractory NB (Fig. 21A 20A). Also unlike the two-component PF108-SN38, the three-component prodrug stabilized the disease without progression throughout the treatment period. In addition, animals rapidly approaching the endpoint showed marked tumor reduction when treated with the prodrug (rescue study, FIG. 21B).
10. Сравнение PEG-[SN22]4 с PEG-[SN38]4 в ортотопическом ксенотрансплантате NB10. Comparison of PEG-[SN22]4 with PEG-[SN38]4 in an orthotopic NB xenograft
PEG-[SN22]4 сравнивали с PEG-[SN38]4 в ортотопическом ксенотрансплантате NB с хеморезистентной NB линией SKNBE(2)C. BE(2)C клетки трансфицировали вектором экспрессии люциферазы для возможности биолюминесцентной визуализации. Мышей обрабатывали один раз в неделю в течение четырех недель либо PEG-[SN22]4 (10 мг/кг/доза), PEG-[Sn38]4 (10 мг/кг/доза), либо CPT-11 (15 мг/кг/доза). В этой хеморезистентной модели CPT-11 имел очень небольшой эффект, тогда как и PEG[SN22]4 и PEG-[SN38]4 были чрезвычайно эффективны в уменьшении опухоли (фиг. 22). Лечение при помощи PEG-[SN22]4 приводило к полному исчезновению опухоли к 2-3 неделям, но небольшая опухоль оставалась видимой у мышей, обработанных PEG-[SN38]4. Это говорит о том, что PEG-[SN22]4 имеет более высокую эффективность в этой мышиной модели NB ксенотрансплантата человека.PEG-[SN22]4 was compared with PEG-[SN38]4 in the orthotopic NB xenograft with the chemoresistant NB line SKNBE(2)C. BE(2)C cells were transfected with a luciferase expression vector to enable bioluminescence imaging. Mice were treated once a week for four weeks with either PEG-[SN22]4 (10 mg/kg/dose), PEG-[Sn38]4 (10 mg/kg/dose), or CPT-11 (15 mg/kg /dose). In this chemoresistance model, CPT-11 had very little effect, whereas both PEG[SN22]4 and PEG-[SN38]4 were extremely effective in tumor shrinkage (Fig. 22). Treatment with PEG-[SN22]4 resulted in complete tumor resolution by 2–3 weeks, but small tumors remained visible in PEG-[SN38]4-treated mice. This suggests that PEG-[SN22]4 has higher efficacy in this human xenograft NB mouse model.
Хотя изобретение проиллюстрировано и описано в настоящей заявке со ссылкой на конкретные варианты осуществления, изобретение не предназначено для ограничения описанными выше деталями.Although the invention is illustrated and described in this application with reference to specific embodiments, the invention is not intended to be limited to the details described above.
- 14 045198- 14 045198
Напротив, возможно осуществление различных модификаций в деталях в пределах объема и диапазона эквивалентов формулы изобретения и без отклонения от изобретения.On the contrary, it is possible to make various modifications in detail within the scope and range of equivalents of the claims and without deviating from the invention.
Claims (7)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/732,199 | 2018-09-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045198B1 true EA045198B1 (en) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230414766A1 (en) | Polymer-based macromolecular prodrugs | |
| US10238630B2 (en) | Use of eribulin and poly (ADP ribose) polymerase (PARP) inhibitors as combination therapy for the treatment of cancer | |
| Kehrer et al. | Modulation of camptothecin analogs in the treatment of cancer: a review | |
| US11857634B2 (en) | Cationic amphiphilic polymers for codelivery of hydrophobic agents and nucleic acids | |
| EP2341774B1 (en) | Treatment of neuroblastoma with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin | |
| CN104788523A (en) | Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates | |
| EP3148529A1 (en) | Compounds for treating brain cancer | |
| BRPI0807232A2 (en) | TREATMENT OF RESISTANT OR REFRACTIONAL CANCERS WITH 7-ETIL-10-HYDROXYCAMPTOTECIN MULTI-ARM POLYMERIC CONJUGATE | |
| JP2002507571A (en) | Antitumor composition containing a synergistic combination of anthracycline derivative and camptothecin derivative | |
| JP5881782B2 (en) | Pharmaceutical composition or combination | |
| EA045198B1 (en) | MACROMOLECULAR PRODRUGS ON A POLYMER BASE | |
| EP4230205A1 (en) | Antitumor pharmaceutical composition and application thereof | |
| US20230414762A1 (en) | Prostate-specific membrane antigen (psma)-targeted prodrug for selective killing of cells expressing psma | |
| JP5843086B2 (en) | Use of polymerized cyclic nitroxide radical compounds to enhance the action of therapeutically active substances | |
| KR101678881B1 (en) | Anticancer agent having no side effects | |
| US20040204435A1 (en) | Alternating treatment with topoisomerase I and topoisomerase II inhibitors | |
| Picken | Prodrug approaches to reduce treprostinil toxicity | |
| WO2022235889A1 (en) | Hsp90-binding conjugates and formulations thereof | |
| KEMP | Stimuli-responsive nanomedicine for synergistic cancer therapy | |
| Furuhata et al. | Pharmacological properties of T-3762, a novel fluoroquinolone antimicrobial agent in parenteral use. III. Chemical structures and dermovascular permeability-increasing activities |