EA045155B1 - METHOD AND KIT FOR PREDICTING THE RESULT OF AN ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY PROCEDURE - Google Patents
METHOD AND KIT FOR PREDICTING THE RESULT OF AN ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY PROCEDURE Download PDFInfo
- Publication number
- EA045155B1 EA045155B1 EA202092443 EA045155B1 EA 045155 B1 EA045155 B1 EA 045155B1 EA 202092443 EA202092443 EA 202092443 EA 045155 B1 EA045155 B1 EA 045155B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- pregnant
- icsi
- procedure
- eco
- art
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 145
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 title claims description 19
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims description 18
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 claims description 47
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 claims description 36
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 29
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 27
- 101001050487 Homo sapiens IST1 homolog Proteins 0.000 claims description 24
- 102100023423 IST1 homolog Human genes 0.000 claims description 24
- 241001324870 Lactobacillus iners Species 0.000 claims description 23
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 claims description 19
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000207202 Gardnerella Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 3
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 2
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241001453172 Fusobacteria Species 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241001261005 Verrucomicrobia Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical class C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940127234 oral contraceptive Drugs 0.000 description 1
- 239000003539 oral contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 229960000321 oxolinic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009933 reproductive health Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Настоящее изобретение относится к области репродукции человека, в особенности к ситуациям, в которых репродукция человека неудачна. В настоящее изобретение предложен надежный и высокоточный способ прогнозирования шанса того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), такая как экстракорпоральное оплодотворение и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ), не приведет к успешной беременности. В настоящем изобретении также предложены средства и способы для прогнозирования шанса того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), таких как экстракорпоральное оплодотворение и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ), приведет к успешной беременности.The present invention relates to the field of human reproduction, particularly to situations in which human reproduction has failed. The present invention provides a reliable and highly accurate method for predicting the chance that an assisted reproductive technology (ART) procedure, such as in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection (ICSI), will not result in a successful pregnancy. The present invention also provides means and methods for predicting the chance that an assisted reproductive technology (ART) procedure, such as in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection (ICSI), will result in a successful pregnancy.
Уровень техникиState of the art
Субфертильность затрагивает от 10 до 15% пар западной части мира. Такая субфертильность в половине случаев может быть отнесена к причинам, связанным с женской репродуктивной системой, в 2026% - с мужской, и в 25-30% причина неизвестна (Evers, J. L, 2002, Lancet 360:151-159). Многие пары обращаются к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ), таким как экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ), чтобы осуществить свое желание завести ребенка.Subfertility affects 10 to 15% of couples in the western part of the world. Such subfertility in half of the cases can be attributed to causes related to the female reproductive system, in 20-26% - to the male, and in 25-30% the cause is unknown (Evers, J. L, 2002, Lancet 360: 151-159). Many couples turn to assisted reproductive technologies (ART), such as in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI), to fulfill their desire to have a child.
Вероятность успеха этих методик составляет около 25% на начатый цикл (Andersen, A. et al., 2007, Hum. Reprod. 22:1513-1525). Если можно было улучшить этот показатель успешного исхода, то это было бы очень выгодно как эмоционально, так и экономически.The success rate of these techniques is about 25% per cycle initiated (Andersen, A. et al., 2007, Hum. Reprod. 22:1513-1525). If this success rate could be improved, it would be very beneficial both emotionally and economically.
Кроме того, учитывая личную и социальную нагрузку процедур ВРТ, желательно выявить пары с низкими шансами на успех на самом раннем этапе процедуры, чтобы им можно было предложить альтернативные процедуры для осуществления их желания завести ребенка.In addition, given the personal and social burden of ART procedures, it is desirable to identify couples with a low chance of success at the earliest possible stage of the procedure so that they can be offered alternative procedures to fulfill their desire to have a child.
Таким образом, как для улучшения подходов к лечению, так и для принятия решения в отдельных случаях о том, следует ли продолжать лечение, необходимы модели, которые могут точно прогнозировать, что женщина не забеременеет, и что женщина родит живого ребенка после ЭКО/ИКСИ.Thus, both to improve treatment approaches and to decide in individual cases whether to continue treatment, models that can accurately predict that a woman will not become pregnant and that a woman will have a live birth after IVF/ICSI are needed.
Уже более десяти лет существуют модели, которые прогнозируют шанс рождения живого ребенка на основе клинических данных, включая возраст, количество предыдущих неудачных попыток ЭКО и вероятную причину бесплодия (Templeton, W. et al., 1996, Lancet 348:1402-1406). Нельсон и Лоулор (Nelson, S.M. and Lawlor D.A. 2011, PLOS Medicine 8:1-10) разработали модель, основанную на собранных данных из более чем 140 000 женщин, с использованием стратификации по возрасту и причине бесплодия, используемой процедуре (или процедуре, которая будет использована), источника яйцеклетки и продолжительности желания иметь ребенка. В публикации Салеман и другие (J. Assisted Reproduction and Genetics 24: 395-399 (2007)) раскрыто обнаружение Lactobacillus и стафилококков в зависимости от исхода ЭКО/беременности. В ЕР 2742359 В1 описан способ прогнозирования шанса успешной или неудачной беременности у субъекта, основанный на относительном количестве бактерий, принадлежащих к группе Lactobacillus, и бактерий, принадлежащих к виду стафилококков, в образцах мочи или образцах, полученных из влагалища.For more than a decade, models have been available that predict the chance of a live birth based on clinical data, including age, number of previous IVF failures, and the likely cause of infertility (Templeton, W. et al., 1996, Lancet 348:1402-1406). Nelson and Lawlor (Nelson, S.M. and Lawlor D.A. 2011, PLOS Medicine 8:1-10) developed a model based on collected data from more than 140,000 women, using stratification by age and cause of infertility, procedure used (or procedure that will be used), the source of the egg and the duration of the desire to have a child. Saleman et al (J. Assisted Reproduction and Genetics 24: 395-399 (2007)) disclosed the detection of Lactobacillus and Staphylococci in relation to IVF/pregnancy outcome. EP 2742359 B1 describes a method for predicting the chance of a successful or unsuccessful pregnancy in a subject based on the relative abundance of bacteria belonging to the Lactobacillus group and bacteria belonging to the Staphylococcus species in urine samples or samples obtained from the vagina.
Тем не менее, остается потребность в более совершенных, надежных и простых в использовании способах, с целью ограничения количества ненужных процедур ВРТ и прогнозирования шанса неудачного исхода процедуры ВРТ. Это помогло бы сократить расходы на оказание медицинских услуг. Более того, женщин, желающих завести ребенка, можно было бы раньше ориентировать на альтернативные решения.However, there remains a need for better, more reliable, and easier-to-use methods to limit the number of unnecessary ART procedures and predict the chance of ART procedure failure. This would help reduce the cost of providing medical services. Moreover, women wishing to have a child could be oriented earlier towards alternative solutions.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
В настоящем изобретении предложен способ прогнозирования вероятности того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не приведет к беременности, в котором образец, полученный от субъекта, представляющего собой самку млекопитающего, до или во время процедуры ВРТ, анализируют на наличие Gardnerella vaginalis IST1 и дополнительно по меньшей мере на один из следующих параметров:The present invention provides a method for predicting the likelihood that an assisted reproductive technology (ART) procedure will not result in pregnancy, wherein a sample obtained from a female mammalian subject before or during the ART procedure is analyzed for the presence of Gardnerella vaginalis IST1 and additionally at least one of the following parameters:
a) Относительная численность видов Lactobacillus,a) Relative abundance of Lactobacillus species,
b) Относительная численность Lactobacillus jensenii,b) Relative abundance of Lactobacillus jensenii,
c) относительная численность протеобактерий, при этом делают вывод о том, что указанный субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если указанный образец содержит Gardnerella vaginalis IST1 и исполняется по меньшей мере одно из следующих условий:c) the relative abundance of Proteobacteria, concluding that the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the sample contains Gardnerella vaginalis IST1 and at least one of the following conditions is met:
I. Относительная численность видов Lactobacillus ниже значения, выбранного между 15 и 25%, илиI. The relative abundance of Lactobacillus species is below the value selected between 15 and 25%, or
II. Относительная численность Lactobacillus jensenii выше значения, выбранного между 25 и 45%, илиII. The relative abundance of Lactobacillus jensenii is greater than the value selected between 25 and 45%, or
III. Относительная численность протеобактерий превышает значение, выбранное между 18 и 38%.III. The relative abundance of Proteobacteria exceeds the value selected between 18 and 38%.
В настоящем изобретении также предложен набор для осуществления способа согласно настоящему изобретению, содержащий прямой праймер CTGGATCACCTCCTTTCTAWG (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер AGGCATCCRCCATGCGCCCT (SEQ ID NO: 2) для обнаружения продукта амплификации ДНК Gardnerella vaginalis IST1, где продукт амплификации ДНК Gardnerella vaginalis IST1 имеетThe present invention also provides a kit for implementing the method according to the present invention, containing a forward primer CTGGATCACCTCCTTTCTAWG (SEQ ID NO: 1) and a reverse primer AGGCATCCRCCATGCGCCCT (SEQ ID NO: 2) for detecting the DNA amplification product of Gardnerella vaginalis IST1, where the DNA amplification product of Gardnerella vaginalis IST1 has
- 1 045155 длину 428-430 нуклеотидов, где W обозначает А или Т и где R обозначает А или G.- 1 045155 length 428-430 nucleotides, where W denotes A or T and where R denotes A or G.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
В рамках настоящего изобретения предложен способ прогнозирования вероятности того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не приведет к беременности, в котором образец, полученный от субъекта, представляющего собой самку млекопитающего, до или во время процедуры ВРТ, анализируют на наличие Gardnerella vaginalis и дополнительно по меньшей мере на один из следующих параметров:The present invention provides a method for predicting the likelihood that an assisted reproductive technology (ART) procedure will not result in pregnancy, wherein a sample obtained from a female mammalian subject before or during the ART procedure is analyzed for the presence of Gardnerella vaginalis and additionally at least one of the following parameters:
a) относительная численность видов Lactobacillus,a) relative abundance of Lactobacillus species,
b) относительная численность Lactobacillus jensenii,b) relative abundance of Lactobacillus jensenii,
c) относительная численность протеобактерий, при этом делают вывод о том, что субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если образец содержит Gardnerella vaginalis IST1 и исполняется по меньшей мере одно из следующих условий:c) the relative abundance of Proteobacteria, concluding that the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the sample contains Gardnerella vaginalis IST1 and at least one of the following conditions is met:
I. Относительная численность видов Lactobacillus ниже значения, выбранного между 15 и 25%, илиI. The relative abundance of Lactobacillus species is below the value selected between 15 and 25%, or
II. Относительная численность Lactobacillus jensenii выше значения, выбранного между 25 и 45%, илиII. The relative abundance of Lactobacillus jensenii is greater than the value selected between 25 and 45%, or
III. Относительная численность протеобактерий превышает значение, выбранное между 18 и 38%.III. The relative abundance of Proteobacteria exceeds the value selected between 18 and 38%.
Значения, выбранные между 15% и 25%, 25% и 45% и 18% и 38% соответственно, также часто называют пороговыми значениями или предельными значениями. Указанные значения могут выбраны таким образом, чтобы обеспечить желаемую специфичность и чувствительность способа. Специалист в данной области техники хорошо знаком с возможностями и границами определения подходящей величины.Values chosen between 15% and 25%, 25% and 45%, and 18% and 38%, respectively, are also often called threshold values or limit values. These values can be selected to provide the desired specificity and sensitivity of the method. One skilled in the art will be well aware of the possibilities and limits of determining an appropriate value.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, как описано выше, определяют наличие Gardnerella vaginalis, а также относительную численность видов Lactobacillus, относительную численность Lactobacillus jensenii и относительную численность протеобактерий.In a preferred embodiment of the present invention, as described above, the presence of Gardnerella vaginalis is determined, as well as the relative abundance of Lactobacillus species, the relative abundance of Lactobacillus jensenii, and the relative abundance of Proteobacteria.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу, описанному выше, в котором Gardnerella vaginalis представляет собой Gardnerella vaginalis IST1. Gardnerella vaginalis IST1 определяют в настоящей заявке как специфический вид гарднереллы, который может быть идентифицирован путем проведения анализа популяции микробов во влагалище с использованием амплификации межгенных пространств (IS) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем (IS-pro technique, IS-Diagnostics, Амстердам, Нидерланды). IS-pro представляет собой эубактериальный подход, основанный на обнаружении и классификации длины области IS гена рРНК 16S-23S. Длина данной области IS специфична для каждого вида микроорганизмов. Gardnerella vaginalis IST1, которую далее определяют как вид Gardnerella vaginalis, обеспечивает получение специфического фрагмента IS длиной 428, 429 или 430 нуклеотидов при использовании праймеров SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.According to another preferred embodiment, the present invention relates to the method described above, in which the Gardnerella vaginalis is Gardnerella vaginalis IST1. Gardnerella vaginalis IST1 is defined herein as a specific species of Gardnerella that can be identified by analyzing the microbial population in the vagina using intergenic space (IS) amplification according to the protocol provided by the manufacturer (IS-pro technique, IS-Diagnostics, Amsterdam, Netherlands). IS-pro is a eubacterial approach based on the detection and length classification of the IS region of the 16S-23S rRNA gene. The length of this IS region is specific to each type of microorganism. Gardnerella vaginalis IST1, hereinafter designated as Gardnerella vaginalis species, produces a specific IS fragment of 428, 429, or 430 nucleotides in length when using primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
Термин процедура ВРТ используют для обозначения вспомогательной репродуктивной технологии. В частности, этот термин относится к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО), внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) и внутриматочной инсеминации (IUI).The term ART procedure is used to refer to assisted reproductive technology. Specifically, the term refers to in vitro fertilization (IVF), intracytoplasmic sperm injection (ICSI), and intrauterine insemination (IUI).
Термин относительная численность используют для обозначения доли от общего количества или числа бактерий в образце. Дробь выражается либо в процентах (%), либо в виде числа от 0 до 1.The term relative abundance is used to indicate the proportion of the total number or number of bacteria in a sample. A fraction is expressed either as a percentage (%) or as a number between 0 and 1.
Термин высокая вероятность в отношении прогнозирования шанса успеха или неудачи процедуры ВРТ используют для обозначения того, что прогнозируемый показатель успеха или неудачи выше, чем в общей популяции женщин, проходящих процедуру ВРТ. В частности, вероятность не забеременеть упоминается как повышенная, если субъект имеет более чем 60%-ный шанс, например 65%-ный шанс не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если выполняются описанные в настоящей заявке критерии отрицательного прогноза. Более 65% в этом отношении включает, например, более 77%, такие как 88% или выше, или даже 94% или выше.The term high probability in relation to predicting the chance of success or failure of an ART procedure is used to indicate that the predicted rate of success or failure is higher than in the general population of women undergoing ART. In particular, the probability of not becoming pregnant is said to be increased if the subject has a greater than 60% chance, for example, a 65% chance of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the negative prognosis criteria described herein are met. More than 65% in this regard includes, for example, more than 77%, such as 88% or higher, or even 94% or higher.
Кроме того, вероятность забеременеть увеличена, если субъект имеет более чем 35% - ный шанс забеременеть в результате процедуры ВРТ, если выполняются критерии положительного прогноза, описанные в настоящей заявке. Выше 35% в этом отношении означает 41%, 49% или даже 50% или более.In addition, the chance of becoming pregnant is increased if the subject has a greater than 35% chance of becoming pregnant as a result of the ART procedure if the positive prognosis criteria described in this application are met. Above 35% in this regard means 41%, 49% or even 50% or more.
Гарднерелла представляет собой это вариабельно окрашивающийся по Граму род факультативноанаэробных бактерий, единственным видом которых является Gardnerella vaginalis. Организмы представляют собой небольшие (1,0-1,5 мкм в диаметре) неспорообразующие, неподвижные коккобациллы. Когда-то классифицированные как Haemophilus vaginalis, а затем как Corynebacterium vaginalis, G. vaginalis растут как маленькие круглые выпуклые серые колонии на шоколадном агаре; они также растут на НВТ агаре. Селективной средой для G. vaginalis является кровяной агар с колистин-оксолиновой кислотой. Определение наличия Gardnerella vaginalis предпочтительно проводить посредством ПЦР, например количественной ПЦР.Gardnerella is a variable Gram-staining genus of facultative anaerobic bacteria, the only species of which is Gardnerella vaginalis. The organisms are small (1.0-1.5 µm in diameter), non-spore-forming, non-motile coccobacilli. Once classified as Haemophilus vaginalis and later as Corynebacterium vaginalis, G. vaginalis grows as small, round, raised gray colonies on chocolate agar; they also grow on HBT agar. The selective medium for G. vaginalis is colistin-oxolinic acid blood agar. Determination of the presence of Gardnerella vaginalis is preferably performed by PCR, such as quantitative PCR.
Лактобациллы (Lactobacillus) представляют собой род грамположительных, факультативноанаэробных или микроаэрофильных, палочковидных, не спорообразующих бактерий. Они являются основной частью группы молочнокислых бактерий (т.е. они превращают сахара в молочную кислоту). У человека они составляют значительный компонент микробиоты в таких участках организма как пищеваLactobacillus (Lactobacillus) is a genus of gram-positive, facultative anaerobic or microaerophilic, rod-shaped, non-spore-forming bacteria. They are a major part of the lactic acid bacteria group (i.e. they convert sugars into lactic acid). In humans, they constitute a significant component of the microbiota in such areas of the body as the food
- 2 045155 рительная система, мочевыделительная система и половая система. У женщин европейского происхождения виды Lactobacillus обычно составляют основную часть микробиоты влагалища. Lactobacillus образуют биопленки в микробиоте влагалища и кишечника, что позволяет им сохраняться в суровых условиях окружающей среды и поддерживать значительное количество популяций. Lactobacillus проявляют мутуалистические отношения с организмом человека, поскольку они защищают хозяина от потенциальных инвазий патогенов, а хозяин, в свою очередь, обеспечивает источник питательных веществ.- 2 045155 reproductive system, urinary system and reproductive system. In women of European descent, Lactobacillus species typically constitute the majority of the vaginal microbiota. Lactobacillus forms biofilms in the vaginal and intestinal microbiota, which allows them to persist in harsh environmental conditions and maintain significant populations. Lactobacillus exhibit a mutualistic relationship with the human body as they protect the host from potential pathogen invasions and the host in turn provides a source of nutrients.
Термин виды Lactobacillus (лактобацилл) используют в настоящей заявке для обозначения всех видов Lactobacillus в совокупности.The term Lactobacillus species is used in this application to refer to all Lactobacillus species collectively.
Lactobacillus jensenii является обычным обитателем нижних отделов половых путей у здоровых женщин. В нормальной популяции L. jensenii составляет около 23% естественной микрофлоры влагалища.Lactobacillus jensenii is a common inhabitant of the lower genital tract of healthy women. In the normal population, L. jensenii makes up about 23% of the natural vaginal microflora.
Протеобактерии являются основным типом бактерий. Они представляют собой грамотрицательные бактерии. Это означает, что они не сохраняют фиолетовую окраску при окрашивании по Граму. В тесте на окрашивание по Граму после кристаллического фиолетового добавляют контрастный краситель (обычно сафранин), окрашивающий все грамотрицательные бактерии в розовый цвет. Сам тест полезен для классификации двух различных типов бактерий на основе структурных различий их клеточных стенок.Proteobacteria are the main phylum of bacteria. They are gram-negative bacteria. This means that they do not retain a purple color when stained with Gram. In the Gram stain test, a counter dye (usually safranin) is added after crystal violet to turn all gram-negative bacteria pink. The test itself is useful for classifying two different types of bacteria based on structural differences in their cell walls.
Протеобактерии включают в себя широкий спектр патогенов, таких как кишечная палочка, сальмонелла, вибрион, хеликобактер и многие другие известные роды. Другие представляют собой свободноживущие организмы и включают в себя многие азотфиксирующие бактерии. Эту группу определяют в первую очередь на основании последовательности рибосомальной РНК (рРНК).Proteobacteria include a wide range of pathogens such as Escherichia coli, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, and many other known genera. Others are free-living organisms and include many nitrogen-fixing bacteria. This group is defined primarily based on the sequence of ribosomal RNA (rRNA).
Существует множество способов определения (идентификации) данных микроорганизмов, и специалист в данной области техники хорошо знаком со способами определения и количественной оценки относительных количеств гарднерелл, видов Lactobacillus, L. jensenii и протеобактерий в образце. Авторы настоящего изобретения приводят в настоящей заявке результаты исследования, в котором авторы настоящего изобретения определили наличие и относительное количество данных бактерий в образцах, полученных от популяции из 192 женщин, проходящих процедуру ВРТ.There are many ways to determine (identify) these microorganisms, and one skilled in the art will be well versed in methods for determining and quantifying the relative amounts of Gardnerella spp., Lactobacillus species, L. jensenii, and Proteobacteria in a sample. The present inventors report herein the results of a study in which the present inventors determined the presence and relative abundance of these bacteria in samples obtained from a population of 192 women undergoing ART.
Авторы настоящего изобретения соотнесли наличие и относительное количество этих микроорганизмов и обнаружили, что их наличие и/или численность свидетельствует о показателе успеха или неудачи процедуры ВРТ.The present inventors have correlated the presence and relative abundance of these microorganisms and have found that their presence and/or abundance is an indicator of success or failure of the ART procedure.
Из 192 женщин 125 не забеременели после первой попытки, тогда как 67 забеременели. Это означает, что показатель неудачи процедуры ВРТ составляет 65%, а показатель успеха составляет 35% (табл. 1 и табл. 6).Of the 192 women, 125 did not become pregnant after the first attempt, while 67 became pregnant. This means that the failure rate of the ART procedure is 65%, and the success rate is 35% (Table 1 and Table 6).
В способе согласно настоящему изобретению относительную численность конкретного вида или рода бактерий нужно сравнивать с заранее определенным эталонным значением или пороговым значением. Заранее определенное эталонное значение может быть любым подходящим пороговым значением. Этот способ определения подходящего порогового значения вполне соответствует навыкам специалиста в данной области техники, и значение может быть легко определено опытным путем.In the method of the present invention, the relative abundance of a particular species or genus of bacteria must be compared with a predetermined reference value or threshold value. The predetermined reference value may be any suitable threshold value. This method of determining a suitable threshold value is well within the skill of one skilled in the art, and the value can be easily determined empirically.
Предпочтительно, значение представляет собой значение, которое получено на основе бактериального состава образцов, полученных из сопоставимой популяции, применяемой в качестве тестируемой популяции. Еще более предпочтительным является эталонное значение, полученное на основе среднего значения нескольких независимых экспериментов по процедуре ВРТ в эталонной популяции. Специалисту в данной области понятны особенности определения эталонных значений для измерения и определения относительной численности бактерий.Preferably, the value is a value that is derived from the bacterial composition of samples obtained from a comparable population used as a test population. Even more preferably, a reference value is derived from the average of several independent ART experiments in a reference population. One skilled in the art will appreciate the specifics of determining reference values for measuring and determining the relative abundance of bacteria.
Следовательно, заранее определенное эталонное значение может быть определено эмпирически или произвольно выбрано для достижения соответствующей специфичности и/или чувствительности способа. Специалист в данной области техники в полной мере знает, как выбрать соответствующую эталонную величину. Специалист в данной области техники будет знать, как изменить заранее определенное эталонное значение, чтобы получить желаемую специфичность и чувствительность способа.Therefore, a predetermined reference value can be determined empirically or arbitrarily chosen to achieve appropriate specificity and/or sensitivity of the method. One skilled in the art will be fully aware of how to select an appropriate reference value. One skilled in the art will know how to change the predetermined reference value to obtain the desired specificity and sensitivity of the method.
Например, в способе, описанном выше, первое заранее определенное эталонное значение может составлять от 15 до 25%, например 20%, второе заранее определенное эталонное значение может составлять от 25 до 45%, например 35%, и третье заранее определенное эталонное значение может составлять от 18 до 38%, например 28%.For example, in the method described above, the first predetermined reference value may be from 15 to 25%, such as 20%, the second predetermined reference value may be from 25 to 45%, such as 35%, and the third predetermined reference value may be from 18 to 38%, for example 28%.
Когда первое, второе и третье эталонные значения были выбраны как 20%, 35% и 28% соответственно, и данные из табл. 6 объединены с данными микробного состава популяции бактерий влагалища, оказалось, что 32 из 125 неудачных исходов ВРТ могли быть правильно прогнозированы, то есть в 26% случаев, когда процедура ВРТ была неудачной, исход мог бы быть правильно прогнозирован (табл. 1).When the first, second and third reference values were selected as 20%, 35% and 28% respectively, and the data from Table. 6 combined with data on the microbial composition of the vaginal bacterial population, it turned out that 32 out of 125 unsuccessful ART outcomes could be correctly predicted, that is, in 26% of cases where the ART procedure was unsuccessful, the outcome could be correctly predicted (Table 1).
Таким образом, способ согласно настоящему изобретению, раскрытый выше, обеспечивает получение высоконадежных результатов, то есть только в двух случаях данный способ не смог прогнозировать неудачный исход процедуры ВРТ. В этих двух случаях процедура ВРТ привела к беременности, которая считается желаемым исходом, то есть успешным исходом. Таким образом, точность способа прогнозирования того, что субъект не забеременеет, как описано выше, составляет 32/34 = 94% (табл. 5).Thus, the method according to the present invention, disclosed above, provides highly reliable results, that is, only in two cases this method could not predict the unsuccessful outcome of the ART procedure. In these two cases, the ART procedure resulted in pregnancy, which is considered the desired outcome, that is, a successful outcome. Thus, the accuracy of the method for predicting that a subject will not become pregnant as described above is 32/34 = 94% (Table 5).
- 3 045155- 3 045155
Таблица 1. Корреляционная матрица, основанная по меньшей мере на одном из 4 параметровTable 1. Correlation matrix based on at least one of 4 parameters
Если описанный выше способ согласно настоящему изобретению был бы использован в качестве критерия для исключения женщин из этого исследования, то 34 женщины были бы исключены из этого исследования, и 158 вместо 192 женщин были бы допущены к процедуре, из которых 65 забеременели бы. Это означает, что вероятность успеха процедуры ВРТ в этом случае была бы увеличена с 67/192 = 35% до 65/158= 41%. Это значение представляет собой увеличение относительной эффективности процедуры ВРТ на 6%. Дополнительным преимуществом было бы то, что 34 женщинам не пришлось бы проходить процедуру или процедуры ВРТ до того, как им были бы предложены альтернативные подходы.If the method of the present invention described above were used as a criterion for excluding women from this study, then 34 women would be excluded from this study, and 158 instead of 192 women would be admitted to the procedure, of which 65 would become pregnant. This means that the probability of success of the ART procedure in this case would be increased from 67/192 = 35% to 65/158 = 41%. This value represents a 6% increase in the relative effectiveness of the ART procedure. An additional benefit would be that the 34 women would not have to undergo an ART procedure or procedures before being offered alternative approaches.
Если описанный способ применить к исследуемой популяции, процедура отбора привела бы к сокращению числа процедур ВРТ с 34/192 = 18%. Общая средняя стоимость процедур ВРТ, таких как ЭКО или ИКСИ, составляет порядка 5000 евро. В итоге применение способа согласно настоящему изобретению позволило бы сэкономить в среднем 900 евро на одного пациента ЭКО/ИКСИ, или, другими словами, затраты на процедуру были бы снижены на 18%.If the described method were applied to the study population, the selection procedure would lead to a reduction in the number of ART procedures from 34/192 = 18%. The overall average cost of ART procedures such as IVF or ICSI is around 5,000 euros. As a result, the application of the method according to the present invention would save an average of 900 euros per IVF/ICSI patient, or, in other words, the cost of the procedure would be reduced by 18%.
Авторы настоящего изобретения также определили прогностическую значимость способа, основанного на наличии только Gardnerella vaginalis, таких как G. vaginalis IST, в частности G. vaginalis IST1. Оказалось, что у женщин с Gardnerella vaginalis IST1 шанс не забеременеть был 88% (табл. 2, табл. 5). Следовательно, описанный выше способ, в котором Gardnerella vaginalis представляет собой G. vaginalis IST1, дал хорошие результаты.The present inventors also determined the prognostic value of a method based on the presence of only Gardnerella vaginalis, such as G. vaginalis IST, in particular G. vaginalis IST1. It turned out that women with Gardnerella vaginalis IST1 had an 88% chance of not getting pregnant (Table 2, Table 5). Therefore, the method described above in which Gardnerella vaginalis is G. vaginalis IST1 gave good results.
Таблица 2. Корреляционная матрица на основе Gardnerella vaginalis IST1Table 2. Correlation matrix based on Gardnerella vaginalis IST1
Следовательно, настоящее изобретение также относится к описанному выше способу, согласно которому в образце определяют наличие Gardnerella vaginalis, предпочтительно G. vaginalis IST, такой как G. vaginalis IST1, и где субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если образец содержит Gardnerella vaginalis, предпочтительно G. vaginalis IST1.Therefore, the present invention also relates to the method described above, wherein a sample is determined for the presence of Gardnerella vaginalis, preferably G. vaginalis IST, such as G. vaginalis IST1, and where the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the sample contains Gardnerella vaginalis, preferably G. vaginalis IST1.
Точность и другие характеристики этого способа, как описано выше, могут быть дополнительно улучшены путем применения способа, в котором измеряют по меньшей мере один из следующих параметров:The accuracy and other characteristics of this method, as described above, can be further improved by using a method that measures at least one of the following parameters:
a) Относительная численность видов Lactobacillus;a) Relative abundance of Lactobacillus species;
b) Относительная численность Lactobacillus jensenii;b) Relative abundance of Lactobacillus jensenii;
c) относительная численность протеобактерий, при этом делают вывод о том, что субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если образец содержит Gardnerella vaginalis IST1, и исполняется по меньшей мере одно из следующих условий:c) the relative abundance of Proteobacteria, concluding that the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the sample contains Gardnerella vaginalis IST1 and at least one of the following conditions is met:
I. Относительная численность видов Lactobacillus ниже значения, выбранного между 15 и 25%, илиI. The relative abundance of Lactobacillus species is below the value selected between 15 and 25%, or
II. Относительная численность Lactobacillus jensenii выше значения, выбранного между 25 и 45%, илиII. The relative abundance of Lactobacillus jensenii is greater than the value selected between 25 and 45%, or
III. Относительная численность протеобактерий превышает значение, выбранное между 18 и 38%.III. The relative abundance of Proteobacteria exceeds the value selected between 18 and 38%.
В случае применения данных критериев можно правильно прогнозировать результат в случае большего количества образцов.If these criteria are applied, the result can be correctly predicted in the case of a larger number of samples.
Из приведенных данных в табл. 6 понятно, что для 34 образцов из общего числа образцов, составляющего 192, было прогнозировано не наступление беременности. В случае тридцати двух из указанных 34 образцов можно получить правильный результат прогнозирования, путем использования способа согласно настоящему изобретению (табл. 1, табл. 6). Из 32 образцов, в отношении которых был сделан правильный прогноз, 15 были отнесены к наличию G. vaginalis IST1 (Критерий 1). Если бы этот критерий был объединен с критерием относительной численности видов Lactobacillus (критерий 2), составляющей менее 15%, то можно было бы сделать правильный прогноз в отношении дополнительных 7 образцов из указанных 32. Если бы Критерий 1 был объединен с критерием относительной численности Lactobacillus jensenii (критерий 3), превышающей 25%, то можно было бы сделать правильный прогноз в отношении дополнительных 6 образцов из указанных 32. Если бы Критерий 1 был объединен с критерием относи- 4 045155 тельной численности протеобактерий (критерий 4), превышающей 18%, то можно было бы сделать правильный прогноз в отношении дополнительных 5 образцов из указанных 32. Другие комбинации этих критериев также привели к улучшению способа. В приведенной ниже табл. 3 раскрыты значения правильных прогнозов в зависимости от используемых критериев. Если использовать все 4 критерия, то это обеспечивает обнаружение всех 32 образцов.From the data given in table. 6 it is clear that for 34 samples out of a total number of 192 samples, pregnancy was not predicted. In the case of thirty-two of these 34 samples, the correct prediction result can be obtained by using the method according to the present invention (Table 1, Table 6). Of the 32 samples that were correctly predicted, 15 were classified as having G. vaginalis IST1 (Criterion 1). If this criterion were combined with the criterion for the relative abundance of Lactobacillus species (criterion 2) being less than 15%, then an additional 7 samples out of the 32 would be correctly predicted. If Criterion 1 were combined with the criterion for the relative abundance of Lactobacillus jensenii (criterion 3) exceeding 25%, then a correct prediction could be made for an additional 6 samples out of the specified 32. If Criterion 1 were combined with the criterion of a relative abundance of proteobacteria (criterion 4) exceeding 18%, then a correct prediction could be made for an additional 5 samples out of the 32. Other combinations of these criteria also led to improvements in the method. In the table below. 3 reveals the values of correct predictions depending on the criteria used. If all 4 criteria are used, this ensures detection of all 32 samples.
Таблица 3. Правильный прогноз о не наступлении беременности на основе различных критериевTable 3. Correct prediction of non-pregnancy based on various criteria
Авторы настоящего изобретения также определили наличие двух видов Lactobacillus, L. crispatus и L. iners, в представленных образцах, используя методику ISPRO (Пример 4). Результаты приведены в табл. 7.The present inventors also determined the presence of two Lactobacillus species, L. crispatus and L. iners, in the submitted samples using the ISPRO method (Example 4). The results are shown in table. 7.
Lactobacillus crispatus является обычным обитателем нижних отделов половых путей у здоровых женщин. В нормальной популяции L. crispatus является доминирующим видом более чем у 30% всех женщин репродуктивного возраста.Lactobacillus crispatus is a common inhabitant of the lower genital tract of healthy women. In normal populations, L. crispatus is the dominant species in more than 30% of all women of reproductive age.
Lactobacillus iners также относится к роду Lactobacillus. Это грамположительная, каталазоотрицательная, факультативно анаэробная палочковидная бактерия. Lactobacillus iners в норме является обитателем нижних отделов половых путей у здоровых женщин. Геномы по меньшей мере 15 штаммов были секвенированы, и показано, что они кодируют от 1152 до 1506 белков. При этом данный вид имеет один из самых маленьких геномов Lactobacillus по сравнению с другими видами, такими как L. crispatus, которые обычно кодируют более чем в два раза больше белков.Lactobacillus iners also belongs to the genus Lactobacillus. It is a Gram-positive, catalase-negative, facultatively anaerobic, rod-shaped bacterium. Lactobacillus iners is normally found in the lower genital tract of healthy women. The genomes of at least 15 strains have been sequenced and are shown to encode between 1,152 and 1,506 proteins. However, this species has one of the smallest Lactobacillus genomes compared to other species, such as L. crispatus, which typically encode more than twice as many proteins.
Существует множество способов определения этих микроорганизмов, и специалист в данной области техники хорошо знаком с методиками определения и количественной оценки относительных количеств видов Lactobacillus, L. crispatus и L. iners в образце.There are many methods for identifying these microorganisms, and one skilled in the art will be well versed in techniques for determining and quantifying the relative amounts of Lactobacillus species, L. crispatus, and L. iners in a sample.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти два вида (L. crispatus и L. iners) также указывают на неудачу или успех процедуры ВРТ.The present inventors have found that these two species (L. crispatus and L. iners) also indicate failure or success of the ART procedure.
В частности, было обнаружено, что субъект имел высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительная численность Lactobacillus crispatus была выше четвертого заданного эталонного значения. Данное четвертое заранее определенное эталонное значение предпочтительно выбрано между 50 и 70%, например 60%. Когда в качестве четвертого эталонного значения было взято 60%, этому критерию соответствовали 65 женщин, из которых 15 забеременели в результате процедуры ВРТ (табл. 4). Это составляет показатель неудачи 77%, что выше, чем частота неудач во всей группе (табл. 5).Specifically, it was found that a subject had a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus crispatus was above the fourth predetermined reference value. This fourth predetermined reference value is preferably selected between 50 and 70%, for example 60%. When 60% was taken as the fourth reference value, 65 women met this criterion, of whom 15 became pregnant as a result of the ART procedure (Table 4). This represents a failure rate of 77%, which is higher than the failure rate of the entire group (Table 5).
Также было обнаружено, что у субъекта была высокая вероятность забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительная численность Lactobacillus crispatus была ниже пятого заранее заданного эталонного значения. Данное пятое заранее определенное эталонное значение предпочтительно выбрано между 50 и 70%, например 60%. Когда в качестве пятого эталонного значения было взято 60%, то ему соответствовали 127 женщин, из которых 52 забеременели в результате процедуры ВРТ (Табл.4). Это показатель успеха составляет 41%, что выше, чем показатель успеха во всей группе (Табл.5). Эти результаты приведены в табл. 4 и 5.It was also found that a subject had a high probability of becoming pregnant as a result of the ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus crispatus was below the fifth pre-specified reference value. This fifth predetermined reference value is preferably selected between 50 and 70%, for example 60%. When 60% was taken as the fifth reference value, 127 women met it, of whom 52 became pregnant as a result of the ART procedure (Table 4). This success rate is 41%, which is higher than the success rate of the entire group (Table 5). These results are shown in table. 4 and 5.
Таблица 4. Корреляционная матрица на основе L. crispatusTable 4. Correlation matrix based on L. crispatus
Авторы настоящего изобретения также определили относительную численность Lactobacillus iners и обнаружили, что субъект имел высокую вероятность забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительная численность Lactobacillus iners была выше шестого заданного эталонного значения. Данное шестое заранее определенное эталонное значение предпочтительно выбрано между 50 и 70%, например 60%. Когда в качестве шестого эталонного значения выбрано 60%, этому критерию соответствовали 38 женщин, из которых 19 забеременели в результате процедуры ВРТ (табл. 5). Это показатель успеха составляет 50%, чем показатель успеха во всей группе (табл. 5).The present inventors also determined the relative abundance of Lactobacillus iners and found that a subject had a high probability of becoming pregnant as a result of the ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus iners was above the sixth predetermined reference value. This sixth predetermined reference value is preferably selected between 50 and 70%, for example 60%. When 60% was selected as the sixth reference value, 38 women met this criterion, of whom 19 became pregnant as a result of the ART procedure (Table 5). This success rate is 50% than the success rate of the entire group (Table 5).
Следовательно, авторы настоящего изобретения описывают способ прогнозирования вероятностиTherefore, the authors of the present invention describe a method for predicting the probability
- 5 045155 того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не приведет к беременности, в котором образец, полученный от субъекта, представляющего собой самку млекопитающего, до или во время процедуры ВРТ, анализируют на относительную численность Lactobacillus crispatus, и при этом субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительная численность Lactobacillus crispatus превышает четвертое заранее определенное эталонное значение.- 5 045155 that the assisted reproductive technology (ART) procedure will not result in pregnancy, in which a sample obtained from a female mammalian subject before or during the ART procedure is analyzed for the relative abundance of Lactobacillus crispatus, and wherein the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus crispatus exceeds the fourth predetermined reference value.
Авторы настоящего изобретения также описывают способ прогнозирования вероятности того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) приведет к беременности, в котором образец, полученный от субъекта, представляющего собой самку млекопитающего, до или во время процедуры ВРТ, анализируют на относительную численность Lactobacillus crispatus, и в котором субъект имеет высокую вероятность забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительное обилие Lactobacillus crispatus ниже пятого заданного эталонного значения.The present inventors also describe a method for predicting the likelihood that an assisted reproductive technology (ART) procedure will result in pregnancy, in which a sample obtained from a female mammalian subject before or during the ART procedure is analyzed for the relative abundance of Lactobacillus crispatus, and in which a subject has a high probability of becoming pregnant as a result of an ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus crispatus is below the fifth specified reference value.
Авторы настоящего изобретения также описывают способ прогнозирования вероятности того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) приведет к беременности, в котором образец, полученный от субъекта, представляющего собой самку млекопитающего, до или во время процедуры ВРТ, анализируют на относительную численность Lactobacillus iners, и в котором субъект имеет высокую вероятность забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительная численность Lactobacillus iners ниже шестого заданного эталонного значения.The present inventors also describe a method for predicting the likelihood that an assisted reproductive technology (ART) procedure will result in pregnancy, in which a sample obtained from a female mammalian subject before or during an ART procedure is analyzed for the relative abundance of Lactobacillus iners, and in which a subject has a high probability of becoming pregnant as a result of an ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus iners is below the sixth specified reference value.
Авторы настоящего изобретения также описывают в настоящей заявке способ прогнозирования вероятности того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) приведет к беременности, в котором образец, полученный от самки млекопитающего до или во время процедуры ВРТ, анализируют на наличие Lactobacillus crispatus и Lactobacillus iners, в котором определяют относительные количества L. crispatus [LC] и L. iners [LI], и в котором вероятность беременности увеличена, если [LC] ниже седьмого заданного эталонного значения, при этомThe present inventors also describe herein a method for predicting the likelihood that an assisted reproductive technology (ART) procedure will result in pregnancy, in which a sample obtained from a female mammal before or during the ART procedure is analyzed for the presence of Lactobacillus crispatus and Lactobacillus iners, in in which the relative amounts of L. crispatus [LC] and L. iners [LI] are determined, and in which the probability of pregnancy is increased if [LC] is below a seventh predetermined reference value, wherein
a. [LC} <(а * [LI]) + b и b. [LC}> (с * [LI]) + d и, где а представляет собой значение в диапазоне от -0.55 и до -0.70, b представляет собой значение в диапазоне от 0.80 до 0.90, с представляет собой значение в диапазоне от -0.50 до -0.65 и d представляет собой значение в диапазоне от 0.3 и до 0.45.a. [LC} <(a * [LI]) + b and b. [LC}> (c * [LI]) + d and, where a is a value in the range from -0.55 to -0.70, b is a value in the range from 0.80 to 0.90, c is a value in the range from -0.50 to -0.65 and d represents a value in the range from 0.3 to 0.45.
В предпочтительном варианте реализации а = -0.62, b = 0.85, с = -0.58 и d = 0.38. В этом случае 77 из 192 женщин из описанного в настоящей заявке исследования признавали удовлетворяющими критерию, из которых 38 (49%) забеременели в результате процедуры ВРТ (табл. 5). Эти результаты графически представлены на фиг. 1.In the preferred embodiment, a = -0.62, b = 0.85, c = -0.58 and d = 0.38. In this case, 77 of the 192 women from the study described in this application were considered to meet the criterion, of whom 38 (49%) became pregnant as a result of the ART procedure (Table 5). These results are graphically presented in FIG. 1.
Особенно хорошие результаты были получены, когда заранее определенные четвертое, пятое, шестое и седьмое эталонные значения были независимо друг от друга выбраны между 50 и 70%, в частности 60%.Particularly good results were obtained when the predetermined fourth, fifth, sixth and seventh reference values were independently selected between 50 and 70%, in particular 60%.
Описание фигурыDescription of the figure
Диаграмма рассеяния данных, полученных с помощью одного из приведенных в настоящей заявке способов, в котором вероятность беременности увеличена, если [LC] ниже 60% и гдеScatter plot of data obtained using one of the methods described herein, in which the probability of pregnancy is increased if [LC] is below 60% and where
[LC} < (a* [LI]) + Ь, и при этом [LC} > (с * [LI]) + d, и при этом а = -0,62, b = 0.85, с = -0,58 и d = 0.38.[LC} < (a* [LI]) + b, and at the same time [LC} > (c * [LI]) + d, and at the same time a = -0.62, b = 0.85, c = -0, 58 and d = 0.38.
- 6 045155- 6 045155
Таблица 5Table 5
ПримерыExamples
Пример 1. Исследуемая популяцияExample 1. Study population
Данное проспективное исследование микробиома влагалища субфертильных женщин репродуктивного возраста было проведено в восьми центрах ЭКО в Нидерландах. Участвующими центрами были: Erasmus Medical Centre (Роттердам), Radboud UMC (Неймеген), UMC Utrecht (Утрехт), VU MC (Амстердам), Isala kliniek (Зволле), Sint Elisabeth Ziekenhuis (Тилбург), MC Kinderwens (Лейдердорп), MUMC+ (Маастрихт). Включения происходили в течение почти одного года (с 1 июня 2015 г. по 31 марта 2016 г.). Протокол был одобрен институциональным экспертным советом Медицинского центра Университета Эразма. От всех участников было получено информированное письменное согласие.This prospective study of the vaginal microbiome of subfertile women of reproductive age was conducted at eight IVF centers in the Netherlands. Participating centers were: Erasmus Medical Center (Rotterdam), Radboud UMC (Nijmegen), UMC Utrecht (Utrecht), VU MC (Amsterdam), Isala kliniek (Zwolle), Sint Elisabeth Ziekenhuis (Tilburg), MC Kinderwens (Leiderdorp), MUMC+ ( Maastricht). The inclusions occurred over a period of almost one year (from June 1, 2015 to March 31, 2016). The protocol was approved by the institutional review board of Erasmus University Medical Center. Informed written consent was obtained from all participants.
К участию в этом исследовании были приглашены посещавшие амбулаторию клиники репродуктивного здоровья женщины, которые должны были пройти свою первую процедуру ЭКО (с ИКСИ или без нее) в течение двух месяцев. Критерии, которые должны были выполняться: женщины в возрасте от 20 до 44 лет и наличие партнера-мужчины. Из исследования были исключены женщины с показанием к экстренному ЭКО из-за рака или других причин, с эндометриозом АФС III/IV и предварительно получавшие аналог гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), применявшие гормональные контрацептивы за 3 месяца до начала ЭКО или ЭКО-ИКСИ (исключая 3-недельное применение оральных контрацептивов с целью регуляции цикла) и имевшие в анамнезе предыдущую беременность или выкидыш.Women attending a reproductive health clinic who were scheduled to undergo their first IVF procedure (with or without ICSI) within two months were invited to participate in this study. The criteria that had to be met were women between the ages of 20 and 44 and having a male partner. Women with an indication for emergency IVF due to cancer or other reasons, with endometriosis APS III/IV and previously treated with a gonadotropin-releasing hormone analogue (GnRH) who used hormonal contraceptives 3 months before the start of IVF or IVF-ICSI were excluded from the study (excluding 3-week use of oral contraceptives to regulate the cycle) and had a history of previous pregnancy or miscarriage.
В данное исследование первоначально была включена 301 женщина. Двадцать одна пациентка была исключена на основании критериев исключения, еще 86 покинули исследование по личным или неизвестным причинам. Два образца были потеряны из-за ошибок обработки, поэтому в конечном итоге исследование проводили с образцами от 192 женщин.This study initially included 301 women. Twenty-one patients were excluded based on exclusion criteria, and another 86 left the study for personal or unknown reasons. Two samples were lost due to processing errors, so the study was ultimately conducted with samples from 192 women.
Пример 2. МатериалыExample 2. Materials
Участники самостоятельно делали влагалищный мазок до начала процедуры ЭКО или ЭКО-ИКСИ. Способ самостоятельного получения образца использовали, поскольку он является минимально инвазивным для пациента и поэтому пригоден для использования в повседневной практике. Образцы из влагалища были получены с помощью FLOQSwabs™ (Copan Italia S. р. А., Италия), участникам было поручено ввести тупфер на 3-5 см во влагалище, а затем тереть тупфер вдоль стенки влагалища в течение 10-15 с. После этой процедуры тупферы немедленно помещали в пробирки Эппендорф, заполненные восстанавливающим транспортным жидким буфером (RTF), полученным от IS-Diagnostics (IS-Diagnostics, Амстердам, Нидерланды). До проведения анализа образцы хранили при температуре от -20 до -80°С в морозильной камере.Participants self-administered a vaginal smear before starting IVF or IVF-ICSI. The self-sampling method was used because it is minimally invasive to the patient and therefore suitable for use in routine practice. Vaginal samples were obtained using FLOQSwabs™ (Copan Italia S. p. A., Italy), and participants were instructed to insert a swab 3–5 cm into the vagina and then rub the swab along the vaginal wall for 10–15 s. After this procedure, the swabs were immediately placed in Eppendorf tubes filled with reducing transport buffer (RTF) obtained from IS-Diagnostics (IS-Diagnostics, Amsterdam, the Netherlands). Before analysis, samples were stored at a temperature of -20 to -80°C in a freezer.
Образцы мочи собирали в стерильное устройство для сбора мочи объемом 100 мл. Образец объемом 10 мл центрифугировали в течение 10 мин при 1500 RCF. Супернатант сливали, а осадок повторно суспендировали в 3 мл мочи. Повторно суспендированный образец хранили для дальнейшей обработки при температуре -20°С.Urine samples were collected into a sterile 100-mL urine collection device. A 10 ml sample was centrifuged for 10 min at 1500 RCF. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 3 ml of urine. The re-suspended sample was stored for further processing at -20°C.
Образцы были доставлены на сухом льду из 8 клиник в микробиологическую лабораторию ISDiagnostics, где проводили анализы.Samples were transported on dry ice from 8 clinics to the ISDiagnostics microbiology laboratory, where tests were performed.
Пример 3. Выделение ДНКExample 3: DNA Isolation
Экстракцию ДНК проводили из влагалищных мазков с помощью автоматизированной машины для экстрации ДНК Chemagen (Chemagen, Baesweiler, Германия) с использованием набора для экстракции буккальных мазков в соответствии с инструкциями производителя. Сначала мазки размораживали и гомогенизировали (Vortex). 200 мкл образца инкубировали с 200 мкл лизисного буфера Chemagen и 10 мкл протеиназы K (Qiagen, Hilden, Германия) при 56°С при встряхивании при 500 об/мин. ДНК извлекали с помощью протокола buccal Swab Prefilling. Элюировали ДНК в 100 мкл буфера для элюирования ChemaDNA extraction was performed from vaginal swabs using a Chemagen automated DNA extraction machine (Chemagen, Baesweiler, Germany) using a buccal swab extraction kit according to the manufacturer's instructions. First, the smears were thawed and homogenized (Vortex). 200 μl of sample was incubated with 200 μl of Chemagen lysis buffer and 10 μl of proteinase K (Qiagen, Hilden, Germany) at 56°C with shaking at 500 rpm. DNA was extracted using the buccal Swab Prefilling protocol. DNA was eluted in 100 µl Chema elution buffer
- 7 045155 gen.- 7 045155 gen.
ДНК экстрагировали из концентрированных суспензий мочи с помощью автоматизированной машины для экстракции ДНК Chemagen (Perkin-Elmer, Baesweiler, Германия) с использованием набора для экстракции буккальных мазков в соответствии с инструкциями производителя. Кратко, образцы мочи были разморожены и перемешаны. 200 мкл образца инкубировали с 200 мкл лизисного буфера Chemagen и 10 мкл протеиназы К при 56°С при встряхивании на 500 об/мин. Элюировали ДНК в 100 мкл буфера для элюирования Chemagen.DNA was extracted from concentrated urine suspensions using a Chemagen automated DNA extraction machine (Perkin-Elmer, Baesweiler, Germany) using a buccal swab extraction kit according to the manufacturer's instructions. Briefly, urine samples were thawed and mixed. 200 μl of sample was incubated with 200 μl of Chemagen lysis buffer and 10 μl of proteinase K at 56°C with shaking at 500 rpm. DNA was eluted in 100 μl of Chemagen elution buffer.
Пример 4. Профилирование межгенного пространства (IS)Example 4: Intergenic Space (IS) Profiling
Амплификацию областей межгенных пространств (IS) проводили с помощью анализа IS-pro в соответствии с протоколом, предоставленным производителем (IS-Diagnostics, Амстердам, Нидерланды). ISpro представляет собой эубактериальный подход, основанный на обнаружении и классификации длины области IS гена рРНК 16S-23S. Длина этой области IS специфична для каждого вида микроорганизмов. Для таксономической классификации используются специфичные для типа организма флуоресцентно меченые ПЦР-праймеры.Amplification of intergenic space (IS) regions was performed using the IS-pro assay according to the protocol provided by the manufacturer (IS-Diagnostics, Amsterdam, The Netherlands). ISpro is a eubacterial approach based on the detection and length classification of the IS region of the 16S-23S rRNA gene. The length of this IS region is specific to each type of microorganism. Organism type-specific fluorescently labeled PCR primers are used for taxonomic classification.
Вкратце, процедура состоит из двух отдельных стандартных ПЦР: первая смесь ПЦР содержит два различных флуоресцентно меченых прямых праймера, нацеленных на различные бактериальные группы, и три обратных праймера, обеспечивающих универсальный охват этих групп. Первый прямой праймер специфичен для Типа Firmicutes, Actinobacteria, Fusobacteria и Verrucomicrobia (FAFV), а второй меченый прямой праймер специфичен для Типа Bacteroidetes. Отдельная ПЦР с меченым прямым праймером в сочетании с семью обратными праймерами специфична для Типа Proteobacteria [Budding, E. et al., J. Clin. Microbiol. (2016) 54: 934-943].Briefly, the procedure consists of two separate standard PCR assays: the first PCR mixture contains two different fluorescently labeled forward primers targeting different bacterial groups and three reverse primers to provide universal coverage of these groups. The first forward primer is specific for the Phylum Firmicutes, Actinobacteria, Fusobacteria and Verrucomicrobia (FAFV), and the second labeled forward primer is specific for the Phylum Bacteroidetes. A separate PCR with a labeled forward primer in combination with seven reverse primers is specific for the Proteobacteria phylum [Budding, E. et al., J. Clin. Microbiol. (2016) 54: 934-943].
Амплификацию проводили на ПЦР-системе GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). После ПЦР 5 мкл ПЦР-продукта смешивали с 20 мкл формамида и 0,2 мкл маркера нестандартного размера (IS-Diagnostics). Анализ фрагментов ДНК проводили на генетическом анализаторе ABI Prism 3500 (Applied Biosystems). Данные были проанализированы с помощью проприетарного программного комплекса IS-pro (IS-Diagnostics), и результаты представлены в виде микробных профилей. Автоматизированное определение видов по пикам IS-pro выполняли с помощью специального программного комплекса IS-pro (IS-Diagnostics), в котором пики связаны с базой данных, содержащей информацию о профиле IS > 500 видов микроорганизмов. Пики < 128 относительных единиц флуоресценции (RFU) рассматривали как фоновый шум и отбрасывали из дальнейшего анализа. Всю процедуру, от выделения ДНК до анализа данных, проводили в течение 5 ч.Amplification was performed on a GeneAmp 9700 PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA). After PCR, 5 μl of PCR product was mixed with 20 μl of formamide and 0.2 μl of a custom size marker (IS-Diagnostics). Analysis of DNA fragments was performed on an ABI Prism 3500 genetic analyzer (Applied Biosystems). Data were analyzed using proprietary IS-pro software (IS-Diagnostics) and results were presented in the form of microbial profiles. Automated identification of species from IS-pro peaks was performed using a special IS-pro software package (IS-Diagnostics), in which peaks are associated with a database containing information on the IS profile of > 500 species of microorganisms. Peaks <128 relative fluorescence units (RFU) were considered background noise and discarded from further analysis. The entire procedure, from DNA extraction to data analysis, was carried out within 5 hours.
Пример 5. Измерение результатовExample 5: Measuring Results
В качестве конечной точки использовался исход беременности после первого переноса эмбриона (ЕТ). Продолжающуюся беременность определяли как плод с сердечной активностью, установленной с помощью ультразвукового исследования между 7-9 неделями беременности.The end point was pregnancy outcome after the first embryo transfer (ET). An ongoing pregnancy was defined as a fetus with cardiac activity determined by ultrasound between 7 and 9 weeks of gestation.
Пример 6. Определение Gardnerella vaginalis IST1Example 6 Determination of Gardnerella vaginalis IST1
Gardnerella vaginalis IST1 идентифицировали путем проведения анализа популяции микробов влагалища с помощью методики IS-pro. G. vaginalis IST1 обнаруживали по наличию специфического ISфрагмента длиной 428-430 нуклеотидов.Gardnerella vaginalis IST1 was identified by analyzing the vaginal microbial population using the IS-pro technique. G. vaginalis IST1 was detected by the presence of a specific IS fragment with a length of 428-430 nucleotides.
Пример 7. Определение микробиомаExample 7: Microbiome Determination
Анализ микробиома проводили по методике IS-pro, описанной ранее [Automated Broad-Range Molecular Detection of Bacteria in Clinical Samples. Budding AE, Hoogewerf M, Vandenbroucke-Grauls CM, Savelkoul PH.. J Clin Microbiol. 2016 Apr;54(4):934-43. doi: 10.1128/JCM.02886-15. Epub 2016 Jan 13; IS-pro: high-throughput molecular fingerprinting of the intestinal microbiota., Budding AE, Grasman ME, Lin F, Bogaards JA, Soeltan-Kaersenhout DJ, Vandenbroucke-Grauls CM, van Bodegraven AA, Savelkoul PH.]Microbiome analysis was performed using the IS-pro method described previously [Automated Broad-Range Molecular Detection of Bacteria in Clinical Samples. Budding AE, Hoogewerf M, Vandenbroucke-Grauls CM, Savelkoul PH.. J Clin Microbiol. 2016 Apr;54(4):934-43. doi: 10.1128/JCM.02886-15. Epub 2016 Jan 13; IS-pro: high-throughput molecular fingerprinting of the intestinal microbiota., Budding AE, Grasman ME, Lin F, Bogaards JA, Soeltan-Kaersenhout DJ, Vandenbroucke-Grauls CM, van Bodegraven AA, Savelkoul PH.]
- 8 045155- 8 045155
Таблица 6. Микробный состав влагалищной флоры; прогноз шанса неудачи процедуры ВРТTable 6. Microbial composition of the vaginal flora; prediction of the chance of failure of the ART procedure
- 9 045155- 9 045155
- 10 045155- 10 045155
- 11 045155- 11 045155
Таблица 7. Микробный состав влагалищной флоры; прогноз шанса неудачи процедуры ВРТTable 7. Microbial composition of the vaginal flora; prediction of the chance of failure of the ART procedure
- 12 045155- 12 045155
- 13 045155- 13 045155
- 14 045155- 14 045155
Таким образом, представленные в настоящей заявке данные обеспечивают получение следующих выводов или положений.Thus, the data presented in this application provide the following conclusions or provisions.
Способ прогнозирования вероятности того, что процедура вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не приведет к беременности, в котором образец, полученный от субъекта, представляющего собой самку млекопитающего, до или во время процедуры ВРТ, анализируют по меньшей мере по одному из следующих параметров:A method of predicting the likelihood that an assisted reproductive technology (ART) procedure will not result in pregnancy, wherein a sample obtained from a female mammalian subject before or during the ART procedure is analyzed for at least one of the following parameters:
Наличие Gardnerella vaginalis;Presence of Gardnerella vaginalis;
Относительная численность видов Lactobacillus;Relative abundance of Lactobacillus species;
Относительная численность Lactobacillus jensenii;Relative abundance of Lactobacillus jensenii;
Относительная численность протеобактерий, при этом субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если образец включает Gardnerella vaginalis или если относительная численность видов Lactobacillus ниже первого заранее определенного эталонного значения, или если относительная численность Lactobacillus jensenii превышает второе заранее определенное эталонное значение, или если относительная численность протеобактерий превышает третье заранее определенное эталонное значение.The relative abundance of Proteobacteria, where the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the sample includes Gardnerella vaginalis, or if the relative abundance of Lactobacillus species is below a first predetermined reference value, or if the relative abundance of Lactobacillus jensenii is greater than a second predetermined reference value, or if the relative abundance of Proteobacteria exceeds a third predetermined reference value.
В описанном в настоящей заявке способе определяют наличие Gardnerella vaginalis в образце, при этом субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если образец содержит Gardnerella vaginalis, предпочтительно Gardnerella vaginalis IST1.In the method described herein, the presence of Gardnerella vaginalis in a sample is determined, and the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the sample contains Gardnerella vaginalis, preferably Gardnerella vaginalis IST1.
В описанном в настоящей заявке способе образец анализируют на следующие параметры:In the method described in this application, the sample is analyzed for the following parameters:
Относительная численность видов Lactobacillus;Relative abundance of Lactobacillus species;
Относительная численность Lactobacillus jensenii иRelative abundance of Lactobacillus jensenii and
Относительная численность протеобактерий, при этом субъект имеет высокую вероятность не забеременеть в результате процедуры ВРТ, если относительная численность видов Lactobacillus ниже первого заранее определенного эталонного значения, и/или если относительная численность Lactobacillus jensenii выше второго заранее определенного эталонного значения и/или если относительная численность протеобактерий выше третьего заранее определенного эталонного значения.Relative abundance of Proteobacteria, where the subject has a high probability of not becoming pregnant as a result of the ART procedure if the relative abundance of Lactobacillus species is below the first predetermined reference value, and/or if the relative abundance of Lactobacillus jensenii is above the second predetermined reference value, and/or if the relative abundance of Proteobacteria above the third predetermined reference value.
В описанном в настоящей заявке способе первое заранее определенное эталонное значение находится между 15 и 25%, второе заранее определенное эталонное значение находится между 25 и 45%, и третье заранее определенное эталонное значение находится между 18 и 38%.In the method described herein, the first predetermined reference value is between 15 and 25%, the second predetermined reference value is between 25 and 45%, and the third predetermined reference value is between 18 and 38%.
В описанном в настоящей заявке способе первое заранее определенное эталонное значение составляет 20%, второе заранее определенное эталонное значение составляет 35%, и третье заранее определенное эталонное значение составляет 28%.In the method described herein, the first predetermined reference value is 20%, the second predetermined reference value is 35%, and the third predetermined reference value is 28%.
--
Claims (1)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18173578.8 | 2018-05-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045155B1 true EA045155B1 (en) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | The changing landscape of the vaginal microbiome | |
| Heil et al. | Role for the mammalian female reproductive tract microbiome in pregnancy outcomes | |
| Allen-Daniels et al. | Identification of a gene in Mycoplasma hominis associated with preterm birth and microbial burden in intraamniotic infection | |
| Wang et al. | Comparative microbial analysis of paired amniotic fluid and cord blood from pregnancies complicated by preterm birth and early-onset neonatal sepsis | |
| Bretelle et al. | High Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis vaginal loads are associated with preterm birth | |
| Kamińska et al. | Is the role of human female reproductive tract microbiota underestimated? | |
| Stabel et al. | Clinical disease and stage of lactation influence shedding of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis into milk and colostrum of naturally infected dairy cows | |
| Ling et al. | Diversity of cervicovaginal microbiota associated with female lower genital tract infections | |
| DeLong et al. | Conceptual design of a universal donor screening approach for vaginal microbiota transplant | |
| MacPhee et al. | Influence of the vaginal microbiota on toxic shock syndrome toxin 1 production by Staphylococcus aureus | |
| Cobo et al. | Sensitivity and specificity of culture and PCR of smegma samples of bulls experimentally infected with Tritrichomonas foetus | |
| Giannattasio-Ferraz et al. | A common vaginal microbiota composition among breeds of Bos taurus indicus (Gyr and Nellore) | |
| Rowlands et al. | Microbial invasion of the amniotic cavity in midtrimester pregnancies using molecular microbiology | |
| Seo et al. | High prevalence of leptotrichia amnionii, atopobium vaginae, sneathia sanguinegens, and factor 1 microbes and association of spontaneous abortion among Korean women | |
| Wang et al. | Evaluation of the inhibitory effects of vaginal microorganisms on sperm motility in vitro | |
| Hashway et al. | Impact of a hormone‐releasing intrauterine system on the vaginal microbiome: a prospective baboon model | |
| Donders et al. | Role of molecular biology in diagnosis and characterization of vulvo-vaginitis in clinical practice | |
| Yan et al. | Alterations in the vaginal microbiota of patients with preterm premature rupture of membranes | |
| EP3797174B1 (en) | Method for predicting the outcome of an assisted reproductive technology procedure | |
| Carlstein et al. | Aerococcus christensenii as part of severe polymicrobial chorioamnionitis in a pregnant woman | |
| Thomson et al. | Characterization of microbial communities and predicted metabolic pathways in the uterus of healthy mares | |
| Berreta et al. | Microbial variability of commercial equine probiotics | |
| EA045155B1 (en) | METHOD AND KIT FOR PREDICTING THE RESULT OF AN ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY PROCEDURE | |
| Rahman et al. | Human vaginal microbiota colonization is regulated by female sex hormones in a mouse model | |
| Pusterla et al. | Multi-Centered Field Evaluation of a Salmonella spp. Point-of-Care PCR Assay Using Equine Feces and Environmental Samples |