EA045004B1

EA045004B1 - METHODS FOR REMOVAL OF UNDESIRABLE COMPONENTS IN MULTISTAGE CHROMATOGRAPHIC PROCESSES

Info

Publication number: EA045004B1
Application number: EA202290040
Authority: EA
Inventors: Трэвис Трэн; Эндрю Тастиан; Марк Чибороски
Original assignee: Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2023-10-26

Description

Область техникиField of technology

Настоящее изобретение относится к способам удаления нежелательных компонентов из потока хроматографического процесса для очистки белковых продуктов, например очистки гетеродимерных белков из сложной смеси белков с помощью аффинной хроматографии. В частности, указанные способы включают выделение гетеродимера (содержащего биспецифическое антитело) из сложной смеси мономеров и гомодимеров с помощью аффинной хроматографии (включая хроматографию с белком А), в которой очищенный гетеродимер собирается в элюате с низким содержанием соли и проводимостью для облегчения дальнейшей последующей обработки гетеродимерного белка.The present invention relates to methods for removing undesirable components from a chromatographic process stream for the purification of protein products, for example the purification of heterodimeric proteins from a complex mixture of proteins using affinity chromatography. In particular, these methods involve isolating a heterodimer (containing a bispecific antibody) from a complex mixture of monomers and homodimers using affinity chromatography (including Protein A chromatography) in which the purified heterodimer is collected in a low salt and conductivity eluate to facilitate further downstream processing of the heterodimer squirrel.

Уровень техникиState of the art

Для очистки белковых продуктов часто требуется многостадийный процесс с использованием различных стадий хроматографии для удаления примесей, таких как белки клетки-хозяина, ДНК и нежелательные соединения белкового продукта. Во многих случаях компоненты хроматографических колонок или буферов образуют часть элюата, выделяемого на каждой стадии хроматографии, но эти компоненты могут быть нежелательными на последующих стадиях процесса. Например, высокие концентрации соли могут использовать для облегчения отделения белкового продукта от примесей или нежелательных соединений молекул, но соль может быть несовместима с последующими стадиями процесса, такими как дополнительные стадии хроматографии или инактивация вирусов.Purification of protein products often requires a multi-step process using various chromatography steps to remove impurities such as host cell proteins, DNA, and unwanted compounds in the protein product. In many cases, components of chromatography columns or buffers form part of the eluate recovered at each chromatography step, but these components may be undesirable in subsequent steps of the process. For example, high concentrations of salt may be used to facilitate separation of the protein product from impurities or unwanted molecular compounds, but the salt may be incompatible with subsequent process steps such as additional chromatography steps or virus inactivation.

Было предложено множество форматов биспецифических антител, которые в настоящее время находятся на стадии разработки. Один из таких форматов основан на стандартном полностью человеческом антителе к IgG, имеющем улучшенный фармакокинетический профиль и минимальную иммуногенность (см. патент США № 8586713, который полностью включен в настоящий документ). Одна общая легкая цепь и две отдельные тяжелые цепи объединяются с образованием биспецифического антитела. Одна из тяжелых цепей содержит замещенную последовательность Fc (далее Fc*), которая снижает или устраняет связывание Fc* с белком A. Например, одна такая последовательность Fc* содержит замещения H435R/Y436F (по системе нумерации ЕС; H95R/Y96F по системе нумерации экзонов IMGT) в CH3домене. Коэкспрессия двух тяжелых цепей и общей легкой цепи приводит к образованию трех продуктов: два из них являются гомодимерными для тяжелых цепей, а один из них является требуемым гетеродимерным биспецифическим продуктом. Последовательность Fc* обеспечивает селективную очистку биспецифического продукта FcFc* на коммерчески доступных колонках для аффинной хроматографии благодаря промежуточной аффинности связывания с белком A по сравнению с гомодимером тяжелой цепи FcFc с высокой авидностью или гомодимером Fc*Fc* со слабым связыванием.Many bispecific antibody formats have been proposed and are currently under development. One such format is based on a standard fully human anti-IgG antibody that has an improved pharmacokinetic profile and minimal immunogenicity (see US Pat. No. 8,586,713, which is incorporated herein in its entirety). One common light chain and two separate heavy chains combine to form a bispecific antibody. One of the heavy chains contains a substituted Fc sequence (hereinafter Fc*), which reduces or eliminates the binding of Fc* to protein A. For example, one such Fc* sequence contains substitutions H435R/Y436F (according to the EU numbering system; H95R/Y96F according to the exon numbering system IMGT) in the CH3 domain. Coexpression of two heavy chains and a common light chain results in three products: two of them are homodimeric for the heavy chains, and one of them is the desired heterodimeric bispecific product. The Fc* sequence allows selective purification of the bispecific FcFc* product on commercially available affinity chromatography columns due to its intermediate binding affinity to protein A compared to the high avidity FcFc heavy chain homodimer or the weak binding Fc*Fc* homodimer.

Для достижения очистки биспецифического гетеродимера в промышленном масштабе требуется хорошее разделение между гомодимером FcFc, гетеродимером Fc*Fc и гомодимером Fc*Fc*, наряду с такими факторами, как объем обрабатываемого материала, а также стоимость и необходимая площадь для оборудования и материалов, используемых в процессе очистки.To achieve industrial-scale purification of a bispecific heterodimer, good separation between FcFc homodimer, Fc*Fc heterodimer, and Fc*Fc* homodimer is required, along with factors such as the volume of material processed and the cost and space requirements for equipment and materials used in the process. cleaning.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

В одном или более аспектах или вариантах реализации данное изобретение относится к способам удаления компонента из хроматографического элюата, включающим: (а) выполнение первой стадии хроматографии, на которой компонент присутствует в первом буфере, нанесенном на колонку для хроматографии; (b) сбор промежуточного элюата с первой стадии хроматографии, при этом промежуточный элюат содержит белковый продукт и компонент; (c) повторное нанесение промежуточного элюата на колонку для хроматографии и элюирование белкового продукта вторым буфером, содержащим компонент в концентрации ниже, чем концентрация промежуточного элюата; (d) сбор хроматографического элюата со стадии (c), при этом компонент присутствует в хроматографическом элюате в концентрации ниже, чем концентрация промежуточного элюата; и (е) нанесение хроматографического элюата на следующей стадии процесса. В некоторых вариантах реализации компонент отсутствует во втором буфере.In one or more aspects or embodiments, the present invention provides methods for removing a component from a chromatographic eluate, comprising: (a) performing a first chromatography step in which the component is present in a first buffer applied to a chromatography column; (b) collecting the intermediate eluate from the first chromatography step, wherein the intermediate eluate contains a protein product and a component; (c) reapplying the intermediate eluate to the chromatography column and eluting the protein product with a second buffer containing the component at a concentration lower than the concentration of the intermediate eluate; (d) collecting the chromatographic eluate from step (c), wherein the component is present in the chromatographic eluate at a concentration lower than the concentration of the intermediate eluate; and (e) applying the chromatographic eluate in the next step of the process. In some implementations, the component is not present in the second buffer.

В некоторых вариантах реализации компонент представляет собой соль. В некоторых случаях концентрация соли в промежуточном элюате превышает 50 ммоль. В некоторых случаях концентрация соли в промежуточном элюате составляет > 100 ммоль, > 250 ммоль, > 500 ммоль, > 600 ммоль, > 700 ммоль, > 800 ммоль, > 900 ммоль или > 1000 ммоль. В некоторых случаях концентрация соли в промежуточном элюате составляет 500 ммоль ± 50 ммоль.In some embodiments, the component is a salt. In some cases, the salt concentration in the intermediate eluate exceeds 50 mmol. In some cases, the salt concentration in the intermediate eluate is >100 mmol, >250 mmol, >500 mmol, >600 mmol, >700 mmol, >800 mmol, >900 mmol, or >1000 mmol. In some cases, the salt concentration in the intermediate eluate is 500 mmol ± 50 mmol.

В некоторых вариантах реализации первая стадия хроматографии выбрана из аффинной хроматографии или ионообменной хроматографии. В некоторых вариантах реализации последующая стадия процесса представляет собой вторую стадию хроматографии. В некоторых случаях последующую стадию процесса выбирают из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии со смешанным режимом, хроматографии гидрофобного взаимодействия или инактивации вирусов.In some embodiments, the first chromatography step is selected from affinity chromatography or ion exchange chromatography. In some embodiments, the subsequent process step is a second chromatography step. In some cases, the subsequent process step is selected from affinity chromatography, ion exchange chromatography, mixed mode chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or virus inactivation.

В некоторых вариантах реализации белковый продукт представляет собой антитело (например, биспецифическое антитело).In some embodiments, the protein product is an antibody (eg, a bispecific antibody).

В одном или более аспектах и вариантах реализации данное изобретение относится к способам очистки гетеродимерного белка, такого как, например, биспецифическое антитело, от сложной смеси белков, которые содержат гомодимеры и гетеродимеры, с использованием процесса аффинного захвата и элюиIn one or more aspects and embodiments, the present invention provides methods for purifying a heterodimeric protein, such as, for example, a bispecific antibody, from a complex mixture of proteins that contain homodimers and heterodimers, using an affinity capture and elution process

- 1 045004 рования.- 1 045004 roving.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ очистки гетеродимерного белка, включающий: (а) введение смеси гетеродимерного белка и примесей в аффинную матрицу, содержащую белок-связывающий лиганд, при этом гетеродимерный белок содержит первый и второй полипептиды с различной аффинностью для белок-связывающего лиганда, и при этом по меньшей мере одна примесь связывает белок-связывающий лиганд, и по меньшей мере одна примесь не связывает белоксвязывающий лиганд; (b) промывку аффинной матрицы первым промывочным буфером, имеющим концентрацию соли более 200 ммоль и первый pH от 5 до 9, для удаления примесей; (c) элюирование и сбор гетеродимерного белка из аффинной матрицы в первом элюирующем буфере, содержащем соль в концентрации более 200 ммоль и вторым pH от 4 до 5, для получения очищенного гетеродимерного белка в первом элюате; (d) промывку аффинной матрицы вторым промывочным буфером, имеющим третий pH менее 4, для удаления примесей; (e) уравновешивание аффинной матрицы до четвертого pH от 5 до 9; (f) нейтрализацию первого элюата до pH от 5 до 9 с последующим повторным нанесением первого элюата на аффинную матрицу; (g) промывку аффинной матрицы третьим промывочным буфером, содержащим менее 100 ммоль соли; и (h) элюирование и сбор очищенного гетеродимерного белка во втором элюате, при этом второй элюат содержит менее 100 ммоль соли. В различных вариантах реализации способа очищенный гетеродимерный белок элюируют и собирают во втором элюате посредством третьего промывочного буфера. В некоторых вариантах реализации способа третий промывочный буфер содержит менее 50 ммоль соли.In one aspect, the present invention provides a method for purifying a heterodimeric protein, comprising: (a) introducing a mixture of the heterodimeric protein and impurities into an affinity matrix containing a protein-binding ligand, wherein the heterodimeric protein contains first and second polypeptides with different affinities for the protein-binding ligand, and wherein at least one impurity binds a protein-binding ligand, and at least one impurity does not bind a protein-binding ligand; (b) washing the affinity matrix with a first wash buffer having a salt concentration of more than 200 mmol and a first pH of 5 to 9 to remove impurities; (c) eluting and collecting the heterodimeric protein from the affinity matrix in a first elution buffer containing a salt at a concentration of greater than 200 mmol and a second pH of 4 to 5 to obtain the purified heterodimeric protein in the first eluate; (d) washing the affinity matrix with a second wash buffer having a third pH of less than 4 to remove impurities; (e) equilibrating the affinity matrix to a fourth pH of 5 to 9; (f) neutralizing the first eluate to a pH of 5 to 9, followed by reapplying the first eluate to the affinity matrix; (g) washing the affinity matrix with a third wash buffer containing less than 100 mmol of salt; and (h) eluting and collecting the purified heterodimeric protein in a second eluate, wherein the second eluate contains less than 100 mmol of salt. In various embodiments of the method, the purified heterodimeric protein is eluted and collected in a second eluate through a third wash buffer. In some embodiments of the method, the third wash buffer contains less than 50 mmol of salt.

В некоторых вариантах реализации примеси содержат гомодимерные соединения первого и второго полипептидов.In some embodiments, the impurities comprise homodimeric compounds of the first and second polypeptides.

В некоторых вариантах реализации белок-связывающий лиганд представляет собой белок A, а аффинная матрица содержит лиганд белка A, прикрепленный к субстрату. В некоторых случаях лиганд белка A представляет собой сконструированный белок A, содержащий тетрамер Z-домена, сконструированный белок A, содержащий тетрамер Y-домена, или сконструированный белок A, в котором отсутствуют D-домены и E-домены. В одном варианте реализации лиганд белка A содержит тетрамер Z-домена.In some embodiments, the protein binding ligand is Protein A and the affinity matrix comprises a Protein A ligand attached to a substrate. In some cases, the Protein A ligand is an engineered Protein A containing a Z-domain tetramer, an engineered Protein A containing a Y-domain tetramer, or an engineered Protein A lacking the D and E domains. In one embodiment, the Protein A ligand comprises a Z domain tetramer.

В некоторых вариантах реализации белок-связывающий лиганд представляет собой белок G, а аффинная матрица содержит лиганд белка G, прикрепленный к субстрату.In some embodiments, the protein binding ligand is a G protein and the affinity matrix comprises a G protein ligand attached to a substrate.

В различных вариантах реализации способа субстрат представляет собой частицу, а аффинная матрица содержит совокупность частиц со средним диаметром от 25 до 100 мкм. В некоторых вариантах реализации частицы имеют средний диаметр от 40 до 60 мкм. В некоторых вариантах реализации частицы имеют средний диаметр от 45 до 55 мкм. В некоторых вариантах реализации частицы имеют средний диаметр около 50 мкм. В некоторых случаях частицы содержат поры, имеющие средний диаметр около 1100 А.In various embodiments of the method, the substrate is a particle, and the affinity matrix contains a collection of particles with an average diameter from 25 to 100 μm. In some embodiments, the particles have an average diameter of 40 to 60 microns. In some embodiments, the particles have an average diameter of 45 to 55 microns. In some embodiments, the particles have an average diameter of about 50 microns. In some cases, the particles contain pores with an average diameter of about 1100 A.

В различных вариантах реализации субстрат содержит любое одно или более из агарозы, поли(стиролдивинилбензола), полиметакрилата, целлюлозы, стекла с заданным размером пор и сферического диоксида кремния.In various embodiments, the substrate comprises any one or more of agarose, poly(styrene divinylbenzene), polymethacrylate, cellulose, defined pore glass, and spherical silica.

В некоторых вариантах реализации способа первый элюирующий буфер содержит соль в концентрации более 250 ммоль. В некоторых случаях концентрация соли составляет более 300 ммоль или более 400 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация соли составляет около 500 ммоль.In some embodiments of the method, the first elution buffer contains salt at a concentration of greater than 250 mmol. In some cases, the salt concentration is more than 300 mmol or more than 400 mmol. In some embodiments, the salt concentration is about 500 mmol.

В различных вариантах реализации способа соль выбрана из соли, содержащей: (i) Cl^-, Br^-, I^-, NO3^-, N(CH3)₄ ⁺, NH4⁺, Cs⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, H⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Al³⁺; или (ii) CaCl2, MgCl₂ или NaCl.In various embodiments of the method, the salt is selected from a salt containing: (i) Cl ^- , Br ^- , I ^- , NO3 ^- , N(CH3) ₄ ⁺ , NH4 ⁺ , Cs ⁺ , Rb ⁺ , K ⁺ , Na ⁺ , H ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Al ³⁺ ; or (ii) CaCl2, _MgCl2 or NaCl.

В различных вариантах реализации способа второй элюат содержит менее 50 ммоль соли. В некоторых вариантах реализации второй элюат содержит менее 10 ммоль соли.In various embodiments of the method, the second eluate contains less than 50 mmol of salt. In some embodiments, the second eluate contains less than 10 mmol of salt.

В различных вариантах реализации способа первый полипептид содержит CH3-домен, который способен связываться с белок-связывающим лигандом, а второй полипептид содержит CH3-домен, который не способен связываться с белок-связывающим лигандом. В некоторых вариантах реализации первый полипептид содержит CH3-домен, который способен связываться с белком A, а второй полипептид содержит CH3-домен, который не способен связываться с белком A. В некоторых вариантах реализации первый полипептид содержит CH3-домен, который способен связываться с белком G, а второй полипептид содержит CH3-домен, который не способен связываться с белком G. В различных вариантах реализации второй полипептид содержит замещение HY на RF в своем CH3-домене.In various embodiments of the method, the first polypeptide contains a CH3 domain that is capable of binding to a protein-binding ligand, and the second polypeptide contains a CH3 domain that is not capable of binding to a protein-binding ligand. In some embodiments, the first polypeptide contains a CH3 domain that is capable of binding to protein A, and the second polypeptide contains a CH3 domain that is not capable of binding to protein A. In some embodiments, the first polypeptide contains a CH3 domain that is capable of binding to protein G, and the second polypeptide contains a CH3 domain that is incapable of binding to the G protein. In various embodiments, the second polypeptide contains an HY to RF substitution in its CH3 domain.

В различных вариантах реализации способа первый pH составляет от 6 до 8. В некоторых вариантах реализации второй pH составляет от 4,0 до 4,25. В некоторых случаях второй pH составляет 4,10 ± 0,05. В некоторых вариантах реализации третий pH составляет от 2,8 до 3,5. В некоторых вариантах реализации четвертый pH составляет от 6 до 8.In various embodiments of the method, the first pH is from 6 to 8. In some embodiments, the second pH is from 4.0 to 4.25. In some cases the second pH is 4.10 ± 0.05. In some embodiments, the third pH is between 2.8 and 3.5. In some embodiments, the fourth pH is between 6 and 8.

В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает дополнительную стадию хроматографии или стадию инактивации вирусов после элюирования и сбора очищенного гетеродимерного белка в элюате с низким содержанием соли (например, менее 100 ммоль, менее 50 ммоль или менее 25 ммоль). В некоторых случаях проводимость очищенной композиции снижается до < 5,0 мСм/см. В некоторых случаях проводимость очищенной композиции снижается до < 2,0 мСм/см. В некоторых варианIn some embodiments, the method further includes an additional chromatography step or a virus inactivation step after eluting and collecting the purified heterodimeric protein in a low salt eluate (eg, less than 100 mmol, less than 50 mmol, or less than 25 mmol). In some cases, the conductivity of the purified composition is reduced to <5.0 mS/cm. In some cases, the conductivity of the purified composition is reduced to <2.0 mS/cm. In some variants

- 2 045004 тах реализации стадию дополнительной хроматографии или стадию инактивации вирусов проводят в условиях с содержанием соли менее 100 ммоль. В некоторых случаях дополнительная стадия хроматографии включает ионообменную хроматографию. В некоторых вариантах реализации ионообменная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию и проводится в условиях с содержанием соли менее 50 ммоль.- 2 045004 when implementing the additional chromatography stage or the virus inactivation stage, it is carried out under conditions with a salt content of less than 100 mmol. In some cases, an additional chromatography step includes ion exchange chromatography. In some embodiments, the ion exchange chromatography is anion exchange chromatography and is carried out under conditions with a salt content of less than 50 mmol.

В различных вариантах реализации способа гетеродимерный белок представляет собой биспецифический антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах реализации биспецифический антигенсвязывающий белок представляет собой биспецифическое антитело.In various embodiments of the method, the heterodimeric protein is a bispecific antigen-binding protein. In some embodiments, the bispecific antigen binding protein is a bispecific antibody.

В различных вариантах реализации любые отличительные признаки или компоненты вариантов реализации, описанных выше или далее в настоящем документе, можно комбинировать, и такие комбинации включены в объем настоящего изобретения. Любое конкретное значение, указанное выше или далее в настоящем документе, можно комбинировать с другим связанным значением, указанным выше или далее в настоящем документе, для приведения диапазона, в котором указанные значения представляют собой верхний и нижний пределы диапазона, и такие диапазоны включены в объем настоящего изобретения.In various embodiments, any features or components of the embodiments described above or hereinafter may be combined, and such combinations are included within the scope of the present invention. Any particular value set forth above or hereinafter may be combined with another related value set forth above or hereinafter to produce a range in which said values represent the upper and lower limits of the range, and such ranges are included within the scope of this inventions.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На чертеже представлено изображение процесса очистки в соответствии с вариантом реализации изобретения.The drawing shows an illustration of a cleaning process in accordance with an embodiment of the invention.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Прежде чем обратиться к описанию настоящего изобретения, следует понять, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, так как указанные способы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не является ограничивающей, так как объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.Before turning to the description of the present invention, it should be understood that the present invention is not limited to the specific methods and experimental conditions described, since these methods and conditions may vary. It should also be understood that the terminology used herein is intended to describe specific embodiments only and is not limiting, as the scope of the present invention is limited only by the appended claims.

Если отсутствуют иные определения, то все технические и научные термины в настоящем документе имеют значения, общепринятые специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемый в данном документе термин около при использовании в отношении конкретного приведенного числового значения означает, что значение может отличаться от приведенного значения не более чем на 1%. Например, в настоящем документе выражение около 100 включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art to which this invention relates. As used herein, the term about, when used in relation to a specific numerical value given, means that the value may differ from the given value by no more than 1%. For example, as used herein, the expression about 100 includes 99 and 101 and all values in between (eg, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).

Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее. Содержание всех патентов, заявок и непатентных публикаций, упомянутых в настоящем описании, включено в настоящий документе во всей полноте посредством ссылок.Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, preferred methods and materials are described below. The contents of all patents, applications and non-patent publications mentioned in this specification are incorporated herein in their entirety by reference.

Общие сведенияGeneral information

Настоящее изобретение основано по меньшей мере частично на открытии того, что повторное нанесение нейтрализованного элюата, содержащего очищенный гетеродимерный белок (например, биспецифическое антитело), на ту же аффинную матрицу, которую используют для очистки белка, может значительно повысить общий выход продукта и свести к минимуму присутствие высокомолекулярных соединений при одновременном снижении затрат и занимаемой площади системы очистки для крупномасштабного коммерческого производства. Стоимость материалов и требуемая площадь для крупномасштабного производства и очистки терапевтических биспецифических антител представляют собой серьезные вопросы. Повторное использование хроматографических колонок для нескольких процессов сводит к минимуму стоимость материалов колонок (например, хроматографическая среда или смола), а также площадь, занимаемую оборудованием, необходимым для получения требуемого продукта. Очистка биспецифических антител с помощью аффинной хроматографии была описана ранее, но в этих процессах обычно используют две отдельные колонки для аффинной хроматографии (например, MabSelect SuRe™ и MabCapture A™) и используют ультрафильтрацию/диафильтрацию или солеустойчивые мультимодальные смолы для удаления солей из стадии процесса аффинной хроматографии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании одной колонки для обеих стадий обработки с помощью аффинной хроматографии общий выход продукта может быть значительно улучшен (в среднем примерно до 92% по сравнению со средним показателем около 77% при использовании двух отдельных колонок), и соли, используемые для обеспечения надежного отделения гетеродимера от гомодимерных примесей, могут быть удалены без необходимости ультрафильтрации или диафильтрации, что снижает затраты и занимаемую площадь, обеспечивая при этом поток продукта для дополнительной хроматографии или других стадий заключительной очистки без необходимости в дорогостоящих солеустойчивых материалах.The present invention is based at least in part on the discovery that recoating a neutralized eluate containing a purified heterodimeric protein (e.g., a bispecific antibody) onto the same affinity matrix used to purify the protein can significantly increase overall product yield and minimize presence of high molecular weight compounds while reducing the cost and footprint of the purification system for large-scale commercial production. The cost of materials and space requirements for large-scale production and purification of therapeutic bispecific antibodies are significant issues. Reusing chromatography columns across multiple processes minimizes the cost of column materials (such as chromatography media or resin) as well as the equipment footprint required to obtain the desired product. Purification of bispecific antibodies by affinity chromatography has been described previously, but these processes typically use two separate affinity chromatography columns (e.g., MabSelect SuRe™ and MabCapture A™) and use ultrafiltration/diafiltration or salt-tolerant multimodal resins to remove salts from the affinity process step chromatography. The present inventors have discovered that by using a single column for both affinity chromatography processing steps, the overall yield of product can be significantly improved (to an average of about 92% compared to an average of about 77% when using two separate columns), and salts, used to provide reliable separation of heterodimer from homodimer impurities can be removed without the need for ultrafiltration or diafiltration, reducing cost and footprint while providing product flow for additional chromatography or other final purification steps without the need for expensive salt-tolerant materials.

ОпределенияDefinitions

Используемый в данном документе термин антитело включает молекулы иммуноглобулина, состоящие из четырех полипептидных цепей - двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей - соединен- 3 045004 ных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. В VH- и VL-областях можно дополнительно выделить области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые разделены более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR тяжелой цепи можно сокращенно обозначить как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR легкой цепи можно сокращенно обозначить как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Термин высокоаффинное антитело относится к тем антителам, которые имеют аффинность связывания с их мишенью по меньшей мере 10^-9 моль, по меньшей мере 10^-1 моль; не менее 10^-11 моль; или по меньшей мере 10^-12 моль, как измерено методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™ или определением аффинности в растворе методом трехфазного ИФА.As used herein, the term antibody includes immunoglobulin molecules consisting of four polypeptide chains—two heavy (H) chains and two light (L) chains—linked by disulfide bonds. Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated herein as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one domain, CL. The VH and VL regions can further be distinguished by regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), which are separated by more conserved regions called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from amino terminus to carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (heavy chain CDRs can be abbreviated as HCDR1, HCDR2 and HCDR3; light chain CDRs chains can be abbreviated as LCDR1, LCDR2 and LCDR3. The term high affinity antibody refers to those antibodies that have a binding affinity for their target of at least 10 ^-9 mol, at least 10 ^-1 mol, at least 10 ^-11 mol, or at least 10 ^-12 mol, as measured by surface plasmon resonance, eg BIACORE™, or solution affinity determination by three-phase ELISA.

Фраза биспецифическое антитело включает антитело, способное селективно связывать два или более эпитопов. Биспецифические антитела обычно содержат две разные тяжелые цепи, причем каждая тяжелая цепь специфически связывает другой эпитоп - либо с двумя разными молекулами (например, антигенами), либо с одной и той же молекулой (например, с одним и тем же антигеном). Если биспецифическое антитело способно селективно связывать два разных эпитопа (первый эпитоп и второй эпитоп), аффинность первой тяжелой цепи для первого эпитопа обычно будет по меньшей мере на один к двум, трем или четырем порядкам величины ниже, чем аффинность первой тяжелой цепи для второго эпитопа, и наоборот. Эпитопы, распознаваемые биспецифическим антителом, могут быть на одной и той же или на другой мишени (например, на одном и том же или другом белке). Биспецифические антитела могут быть получены, например, путем комбинирования тяжелых цепей, распознающих разные эпитопы одного и того же антигена. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные последовательности тяжелой цепи, которые распознают разные эпитопы одного и того же антигена, могут быть слиты с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими разные константные области тяжелой цепи, и такие последовательности могут быть экспрессированы в клетке, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина. Типичное биспецифическое антитело содержит две тяжелые цепи, каждая из которых содержит три CDR тяжелой цепи, за которыми следует (от N-конца к C-концу) CH1-домен, шарнир, CH2-домен и CH3-домен, а также легкая цепь иммуноглобулина, которая либо не придает антигенсвязывающей специфичности, но может связываться с каждой тяжелой цепью, либо может связываться с каждой тяжелой цепью и может связывать один или более эпитопов, связанных антигенсвязывающими областями тяжелой цепи, либо может связываться с каждой тяжелой цепью и обеспечивает связывание одной или обеих тяжелых цепей с одним или обоими эпитопами.The phrase bispecific antibody includes an antibody capable of selectively binding two or more epitopes. Bispecific antibodies typically contain two different heavy chains, with each heavy chain specifically binding to a different epitope—either to two different molecules (eg, antigens) or to the same molecule (eg, the same antigen). If a bispecific antibody is capable of selectively binding two different epitopes (a first epitope and a second epitope), the affinity of the first heavy chain for the first epitope will typically be at least one to two, three, or four orders of magnitude lower than the affinity of the first heavy chain for the second epitope. and vice versa. The epitopes recognized by a bispecific antibody may be on the same or a different target (eg, the same or a different protein). Bispecific antibodies can be obtained, for example, by combining heavy chains that recognize different epitopes of the same antigen. For example, nucleic acid sequences encoding heavy chain variable sequences that recognize different epitopes of the same antigen can be fused to nucleic acid sequences encoding different heavy chain constant regions, and such sequences can be expressed in a cell that expresses the light chain immunoglobulin. A typical bispecific antibody contains two heavy chains, each containing three heavy chain CDRs followed (from N-terminus to C-terminus) by a CH1 domain, a hinge, a CH2 domain, and a CH3 domain, as well as an immunoglobulin light chain. which either does not confer antigen-binding specificity but can bind to each heavy chain, or can bind to each heavy chain and can bind one or more epitopes bound by antigen-binding regions of the heavy chain, or can bind to each heavy chain and provides binding to one or both heavy chains chains with one or both epitopes.

В различных вариантах реализации способов, обсуждаемых в данном документе, гетеродимерные белки, биспецифические антитела, Fc-содержащие белки и т.п. могут иметь изотип IgG. В некоторых случаях гетеродимерные белки, биспецифические антитела, Fc-содержащие белки и т.п. имеют изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых случаях гетеродимерные белки, биспецифические антитела, Fcсодержащие белки и т.п. имеют изотип IgG1. В некоторых случаях гетеродимерные белки, биспецифические антитела, Fc-содержащие белки и т.п. имеют изотип IgG4. В различных вариантах реализации гетеродимерные белки, биспецифические антитела, Fc-содержащие белки и т.п. являются полностью человеческими.In various embodiments of the methods discussed herein, heterodimeric proteins, bispecific antibodies, Fc-containing proteins, and the like. may be of the IgG isotype. In some cases, heterodimeric proteins, bispecific antibodies, Fc-containing proteins, etc. have an isotype of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In some cases, heterodimeric proteins, bispecific antibodies, Fc-containing proteins, etc. have the IgG1 isotype. In some cases, heterodimeric proteins, bispecific antibodies, Fc-containing proteins, etc. have the IgG4 isotype. In various embodiments, heterodimeric proteins, bispecific antibodies, Fc-containing proteins, and the like. are completely human.

Фраза тяжелая цепь или тяжелая цепь иммуноглобулина включает последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает вариабельный домен тяжелой цепи. Вариабельные домены тяжелой цепи включают три CDR тяжелой цепи и четыре области FR, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают CDR, CDR и FR и их комбинации. Типичная тяжелая цепь за вариабельным доменом (от N-конца к C-концу) имеет CH1домен, шарнир, CH2-домен и CH3-домен. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает фрагмент, который способен специфически распознавать антиген (например, распознавать антиген с KD в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне), который способен экспрессироваться и секретироваться из клетки и который содержит по меньшей мере одну CDR.The phrase heavy chain or immunoglobulin heavy chain includes the sequence of the immunoglobulin heavy chain constant region from any organism and, unless otherwise indicated, includes the heavy chain variable domain. Heavy chain variable domains include three heavy chain CDRs and four FR regions unless otherwise noted. Heavy chain fragments include CDR, CDR and FR and combinations thereof. A typical heavy chain behind the variable domain (from N-terminus to C-terminus) has a CH1 domain, a hinge, a CH2 domain, and a CH3 domain. A functional heavy chain fragment includes a fragment that is capable of specifically recognizing an antigen (eg, recognizing an antigen with a KD in the micromolar, nanomolar or picomolar range), that is capable of being expressed and secreted from a cell, and that contains at least one CDR.

Фраза легкая цепь включает последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает легкие цепи каппа и лямбда человека. Вариабельные (VL) домены легкой цепи обычно содержат три CDR легкой цепи и четыре каркасных (FR) области, если не указано иное. Обычно полноразмерная легкая цепь содержит от аминоконца до карбоксильного конца VL домен, который содержит FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и константный домен легкой цепи. Легкие цепи, которые можно использовать с данным изобретением, включают цепи, которые, например, не связывают селективно ни первый, ни второй антиген, селективно связываемый антигенсвязывающим белком. Подходящие легкие цепи включают цепи, которые могут быть идентифицированы путем скрининга наиболее часто используемых легких цепей в существующих библиотекахThe phrase light chain includes the immunoglobulin light chain constant region sequence from any organism and, unless otherwise noted, includes human kappa and lambda light chains. Light chain variable (VL) domains typically contain three light chain CDRs and four framework (FR) regions, unless otherwise noted. Typically, a full-length light chain contains from the amino terminus to the carboxyl terminus a VL domain, which contains FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, and a light chain constant domain. Light chains that can be used with the present invention include chains that, for example, do not selectively bind either a first or a second antigen selectively bound by an antigen binding protein. Suitable light chains include those that can be identified by screening the most commonly used light chains in existing libraries

- 4 045004 антител (влажные библиотеки или компьютерное моделирование эксперимента), причем легкие цепи существенно не влияют на аффинность и/или селективность антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающих белков. Подходящие легкие цепи включают цепи, которые могут связывать один или оба эпитопа, которые связаны антигенсвязывающими областями антигенсвязывающего белка.- 4 045004 antibodies (wet libraries or computer simulation of the experiment), and the light chains do not significantly affect the affinity and/or selectivity of the antigen-binding domains of the antigen-binding proteins. Suitable light chains include chains that can bind one or both epitopes that are bound by the antigen binding regions of the antigen binding protein.

Фраза вариабельный домен включает аминокислотную последовательность легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина (при необходимости модифицированную), которая содержит следующие аминокислотные области в последовательности от N-конца к C-концу (если не указано иное): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельный домен включает аминокислотную последовательность, способную складываться в канонический домен (VH или VL), имеющий структуру двойного бета-листа, при этом бета-листы соединены дисульфидной связью между остатком первого бета-листа и второго беталиста.The phrase variable domain includes the amino acid sequence of an immunoglobulin light or heavy chain (modified as necessary) which contains the following amino acid regions in sequence from N-terminus to C-terminus (unless otherwise indicated): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 , FR4. The variable domain comprises an amino acid sequence capable of folding into a canonical domain (VH or VL) having a double beta sheet structure, the beta sheets being linked by a disulfide bond between the residue of the first beta sheet and the second beta sheet.

Фраза определяющая комплементарность область или термин CDR включает аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты генов иммуноглобулинов организма, которая в норме (т.е. у животного дикого типа) появляется между двумя каркасными областями в вариабельной области легкой или тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина (например, антитело или рецептор Т-клетки). CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевой линии или перегруппированной или неперегруппированной последовательностью, и, например, наивной или зрелой В-клеткой или Т-клеткой. В некоторых случаях (например, для CDR3) CDR могут кодироваться двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевой линии), которые не являются смежными (например, в неперегруппированной последовательности нуклеиновой кислоты), но являются смежными в последовательности нуклеиновой кислоты В-клетки, например, в результате сплайсинга или соединения последовательностей (например, рекомбинация V-D-J с образованием CDR3 тяжелой цепи).The phrase complementarity determining region or the term CDR includes the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence of the immunoglobulin genes of an organism that normally (i.e., in a wild-type animal) appears between two framework regions in the light or heavy chain variable region of an immunoglobulin molecule (e.g., an antibody or T cell receptor). The CDR may be encoded by, for example, a germline sequence or a rearranged or non-rearranged sequence, and, for example, a naïve or mature B cell or T cell. In some cases (eg, for CDR3), CDRs may be encoded by two or more sequences (eg, germline sequences) that are not contiguous (eg, in a non-rearranged nucleic acid sequence) but are contiguous in a B cell nucleic acid sequence, e.g. , as a result of splicing or joining of sequences (for example, V-D-J recombination to form CDR3 of the heavy chain).

Фраза Fc-содержащий белок включает антитела, биспецифические антитела, гетеродимерные белки и иммуноадгезины и другие связывающие белки, которые включают по меньшей мере функциональную часть CH2-области и CH3-области иммуноглобулина. Функциональная часть относится к CH2-области и CH3-области, которая может связываться с рецептором Fc (например, FcyR; или FcRn, т.е. неонатальным рецептором Fc) и/или которая может участвовать в активации комплемента. Если CH2область и CH3-область содержит делеции, замещения и/или вставки или другие модификации, которые делают ее неспособной связывать какой-либо рецептор Fc, а также неспособной активировать комплемент, CH2-область и CH3-область не является функциональной.The phrase Fc-containing protein includes antibodies, bispecific antibodies, heterodimeric proteins and immunoadhesins and other binding proteins that include at least a functional portion of the CH2 region and CH3 region of an immunoglobulin. The functional part refers to the CH2 region and the CH3 region, which can bind to the Fc receptor (eg FcyR; or FcRn, ie neonatal Fc receptor) and/or which can participate in complement activation. If the CH2 region and CH3 region contain deletions, substitutions and/or insertions or other modifications that render it unable to bind any Fc receptor and also unable to activate complement, the CH2 region and CH3 region are not functional.

Fc-содержащие белки могут содержать модификации в доменах иммуноглобулинов, в том числе случаи, когда модификации влияют на одну или более эффекторных функций связывающего белка (например, модификации, которые влияют на связывание FcyR, связывание FcRn и, следовательно, время полужизни и/или активность CDC). Такие модификации включают, но не ограничиваются ими, следующие модификации и их комбинации со ссылкой на нумерацию ЕС константной области иммуноглобулина: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 и 439.Fc-containing proteins may contain modifications in immunoglobulin domains, including cases where modifications affect one or more effector functions of the binding protein (for example, modifications that affect FcyR binding, FcRn binding, and therefore half-life and/or activity CDC). Such modifications include, but are not limited to, the following modifications and combinations thereof with reference to the EC numbering of the immunoglobulin constant region: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269 , 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312 , 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360 and 439 .

Например, и не в качестве ограничения, связывающий белок представляет собой Fc-содержащий белок и демонстрирует увеличенное время полужизни в сыворотке крови (по сравнению с тем же Fcсодержащим белком без указанной(ых) модификации(й)) и имеет модификацию в положении 250 (например, E или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или T), 254 (например, S или T) и 256 (например, S/R/Q/E/D или T); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, L/R/SI/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В другом примере модификация может включать модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254T и 256E); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L) и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308P).For example, and not by way of limitation, the binding protein is an Fc-containing protein and exhibits an increased serum half-life (compared to the same Fc-containing protein without the specified modification(s)) and has a modification at position 250 (eg , E or Q); 250 and 428 (for example, L or F); 252 (eg L/Y/F/W or T), 254 (eg S or T) and 256 (eg S/R/Q/E/D or T); or modification at position 428 and/or 433 (eg, L/R/SI/P/Q or K) and/or 434 (eg, H/F or Y); or modification at position 250 and/or 428; or a modification at positions 307 or 308 (eg, 308F, V308F) and 434. In another example, the modification may include modification to 428L (eg, M428L) and 434S (eg, N434S); modification 428L, 259I (for example, V259I) and 308F (for example, V308F); modification 433K (for example, H433K) and 434 (for example, 434Y); modification of 252, 254 and 256 (for example, 252Y, 254T and 256E); modification 250Q and 428L (for example, T250Q and M428L) and modification 307 and/or 308 (for example, 308F or 308P).

Термин звездообразное замещение, Fc* и HC* включает любую молекулу, тяжелую цепь иммуноглобулина, фрагмент Fc, Fc-содержащую молекулу, гетеродимерный белок и т.п., которые содержат последовательность в CH3-домене, которая отменяет связывание с белком A. Специфические модификации, такие как H95R и Y96F, которые могут уменьшать или отменять связывание белка A в CH3-домене, обсуждаются в US 8,586,713. Эта дипептидная мутация обозначается как звездообразное замещение.The term star substitution, Fc* and HC* includes any molecule, immunoglobulin heavy chain, Fc fragment, Fc-containing molecule, heterodimeric protein, etc., which contains a sequence in the CH3 domain that abolishes binding to protein A. Specific Modifications , such as H95R and Y96F, which can reduce or abolish protein A binding in the CH3 domain, are discussed in US 8,586,713. This dipeptide mutation is referred to as a star substitution.

Термин клетка включает любую клетку, которая подходит для экспрессии последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Клетки включают клетки прокариот и эукариот (одноклеточные или многоклеточные), бактериальные клетки (например, штаммы E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, грибковые клетки, дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae, S. pombe, P.The term cell includes any cell that is suitable for expressing a recombinant nucleic acid sequence. Cells include prokaryotic and eukaryotic cells (unicellular or multicellular), bacterial cells (e.g. strains of E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), mycobacterial cells, fungal cells, yeast cells (e.g. S. cerevisiae , S. pombe, P.

- 5 045004 pastoris, P. methanolica и т.д.), растительные клетки, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, клетки насекомых, инфицированные бакуловирусом, Trichoplusia ni и т.д.), клетки животных, не относящиеся к человеку, клетки человека или слитые клетки, такие как, например, гибридомы или квадрогибридомы. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, примата, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах реализации клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: CHO (например, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетки сетчатки глаза, Vero, CV1, почки (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHk), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (например, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (эпидермальная), CV-1, U937, 3T3, L-клетки, C127-клетки, SP2/0, NS-0, MMT 060562, клетки Сертоли, клетки BRL 3A, клетки HT1080, миеломной клетки, опухолевой клетки и клеточной линии, полученной из вышеупомянутой клетки. В некоторых вариантах реализации клетка содержит один или более вирусных генов, например клетку сетчатки глаза, экспрессирующую вирусный ген (например, клетка PER.C6™).- 5 045004 pastoris, P. methanolica, etc.), plant cells, insect cells (e.g. SF-9, SF-21, insect cells infected with baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), animal cells, not human, human cells or fusion cells, such as, for example, hybridomas or quadhybridomas. In some embodiments, the cell is a human, monkey, primate, hamster, rat, or mouse cell. In some embodiments, the cell is eukaryotic and is selected from the following cells: CHO (e.g., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (e.g., COS-7), retinal cells, Vero, CV1, kidney (e.g. , HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHk), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (e.g. BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV -1, U937, 3T3, L cells, C127 cells, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli cells, BRL 3A cells, HT1080 cells, myeloma cell, tumor cell and a cell line derived from the above cell. In some embodiments, the cell contains one or more viral genes, such as a retinal cell expressing a viral gene (eg, a PER.C6™ cell).

Фраза модификатор подвижной фазы включает функциональные группы, которые снижают эффект или нарушают неспецифические (т.е. неаффинные) ионные и другие нековалентные взаимодействия между белками. Модификаторы подвижной фазы включают, например, соли, ионные комбинации металлов группы I и группы II с ацетатом, бикарбонатом, карбонатом, галогеном (например, хлоридом или фторидом), нитратом, фосфатом или сульфатом. Неограничивающий иллюстративный список модификаторов подвижной фазы включает соли ацетата бериллия, лития, натрия и калия; бикарбонаты натрия и калия; карбонаты лития, натрия, калия и цезия; хлориды лития, натрия, калия, цезия и магния; фториды натрия и калия; нитраты натрия, калия и кальция; фосфаты натрия и калия и сульфаты кальция и магния.The phrase mobile phase modifier includes functional groups that reduce the effect of or disrupt nonspecific (i.e., nonaffinity) ionic and other noncovalent interactions between proteins. Mobile phase modifiers include, for example, salts, ionic combinations of Group I and Group II metals with acetate, bicarbonate, carbonate, halogen (eg, chloride or fluoride), nitrate, phosphate or sulfate. A non-limiting illustrative list of mobile phase modifiers includes beryllium, lithium, sodium and potassium acetate salts; sodium and potassium bicarbonates; lithium, sodium, potassium and cesium carbonates; lithium, sodium, potassium, cesium and magnesium chlorides; sodium and potassium fluorides; sodium, potassium and calcium nitrates; sodium and potassium phosphates and calcium and magnesium sulfates.

Модификаторы подвижной фазы также включают хаотропные агенты, которые ослабляют нековалентные силы или иным образом препятствуют им и увеличивают энтропию в биомолекулярных системах. Неограничивающие примеры хаотропных агентов включают бутанол, хлорид кальция, этанол, хлорид гуанидиния, перхлорат лития, ацетат лития, хлорид магния, фенол, пропанол, додецилсульфат натрия, тиомочевину и мочевину. Хаотропные агенты включают соли, влияющие на растворимость белков. Более хаотропные анионы включают, например, хлорид, нитрат, бромид, хлорат, йодид, перхлорат и тиоцианат. Более хаотропные катионы включают, например, литий, магний, кальций и гуанидиний.Mobile phase modifiers also include chaotropic agents that weaken or otherwise interfere with noncovalent forces and increase entropy in biomolecular systems. Non-limiting examples of chaotropic agents include butanol, calcium chloride, ethanol, guanidinium chloride, lithium perchlorate, lithium acetate, magnesium chloride, phenol, propanol, sodium dodecyl sulfate, thiourea and urea. Chaotropic agents include salts that affect protein solubility. More chaotropic anions include, for example, chloride, nitrate, bromide, chlorate, iodide, perchlorate and thiocyanate. More chaotropic cations include, for example, lithium, magnesium, calcium and guanidinium.

Модификаторы подвижной фазы включают функциональные группы, которые влияют на ионные или другие нековалентные взаимодействия, которые при добавлении к градиенту или стадии pH или при уравновешивании носителя белка A в модификаторе подвижной фазы и применении стадии или градиента pH приводит к увеличению расстояния единицы pH между элюированием гомодимерного IgG и гетеродимерного IgG (например, человеческого IgG дикого типа и того же IgG, но содержащего одну или более модификаций его CH3-домена, как описано в данном документе). Подходящая концентрация модификатора подвижной фазы может быть определена по его концентрации с использованием той же колонки, стадии или градиента pH с увеличением концентрации модификатора подвижной фазы до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное расстояние pH при данной стадии pH или градиенте pH. Модификаторы подвижной фазы могут также включать неполярные модификаторы, включая, например, пропиленгликоль, этиленгликоль и тому подобное.Mobile phase modifiers include functional groups that influence ionic or other non-covalent interactions that, when added to a pH gradient or step or when equilibrated with a protein A carrier in the mobile phase modifier and application of a pH step or gradient, results in an increase in the pH unit distance between homodimeric IgG elution and heterodimeric IgG (eg, wild-type human IgG and the same IgG but containing one or more modifications of its CH3 domain, as described herein). The appropriate mobile phase modifier concentration can be determined by using the same column, pH step, or pH gradient, increasing the mobile phase modifier concentration until the maximum pH distance is reached at a given pH step or pH gradient. Mobile phase modifiers may also include non-polar modifiers including, for example, propylene glycol, ethylene glycol and the like.

Используемый в данном документе термин аффинная хроматография представляет собой хроматографический способ, в котором используют специфические обратимые взаимодействия между биомолекулами, а не общие свойства биомолекулы, такие как изоэлектрическая точка, гидрофобность или размер, для реализации хроматографического разделения. Аффинная хроматография с белком А или хроматография с белком А относится к способу специфической аффинной хроматографии, в котором используют аффинность IgG связывающих доменов белка А к Fc-части молекулы иммуноглобулина. Эта Fc-часть содержит константные CH2- и CH3-домены иммуноглобулина человека или животного или домены иммуноглобулина, по существу аналогичные им. Белок A включает нативный белок из клеточной стенки Staphylococcus aureus, белок A, полученный рекомбинантными или синтетическими способом, и варианты, которые сохраняют способность связываться с областью Fc. На практике хроматография с белком А включает использование белка А, иммобилизованного на твердой подложке. См. Gagnon, Protern A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, 1996. Белок G и белок L также можно использовать для аффинной хроматографии. Твердая подложка представляет собой неводную матрицу, с которой сцепляется белок А. Такие подложки включают агарозу, сефарозу, стекло, диоксид кремния, полистирол, нитроцеллюлозу, древесный уголь, песок, целлюлозу и любой другой подходящий материал. Такие материалы хорошо известны в данной области техники. Для прикрепления второго белка к твердой подложке можно использовать любой подходящий способ. Способы прикрепления белков к подходящим твердым подложкам хорошо известны в данной области техники. См., например, Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357371, 1990. Такие твердые подложки с иммобилизованным белком А и без него легко доступны из многих коммерческих источников, включая такие, как Vector Laboratory (Бурлингем, Калифорния), Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния), BioRad (Геркулес, Калифорния), Amersham Biosciences (часть GE Healthcare, Упсала, Швеция), Pall (Порт Вашингтон, Нью-Йорк) и EMD-Millipore (Биллерика, МассаAs used herein, the term affinity chromatography is a chromatographic technique that uses specific reversible interactions between biomolecules, rather than general properties of the biomolecule, such as isoelectric point, hydrophobicity, or size, to achieve chromatographic separation. Protein A affinity chromatography or Protein A chromatography refers to a specific affinity chromatography method that utilizes the affinity of the IgG binding domains of Protein A for the Fc portion of an immunoglobulin molecule. This Fc portion contains the CH2 and CH3 constant domains of human or animal immunoglobulin or immunoglobulin domains substantially similar to them. Protein A includes native protein from the cell wall of Staphylococcus aureus, protein A produced by recombinant or synthetic methods, and variants that retain the ability to bind to the Fc region. In practice, Protein A chromatography involves the use of Protein A immobilized on a solid support. See Gagnon, Protern A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, 1996. Protein G and protein L can also be used for affinity chromatography. The solid support is a non-aqueous matrix to which Protein A adheres. Such supports include agarose, sepharose, glass, silica, polystyrene, nitrocellulose, charcoal, sand, cellulose and any other suitable material. Such materials are well known in the art. Any suitable method may be used to attach the second protein to the solid support. Methods for attaching proteins to suitable solid supports are well known in the art. See, for example, Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357371, 1990. Such solid supports with and without immobilized Protein A are readily available from many commercial sources, including such as Vector Laboratory (Burlingame, Calif. ), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), BioRad (Hercules, CA), Amersham Biosciences (part of GE Healthcare, Uppsala, Sweden), Pall (Port Washington, NY), and EMD-Millipore (Billerica, MA

- 6 045004 чусетс). Белок А, иммобилизованный на матрице из пористого стекла, коммерчески доступен как PROSEP®-A (миллипор). Твердая фаза также может представлять собой матрицу на основе агарозы. Белок А, иммобилизованный на агарозной матрице, коммерчески доступен как MABSELECT™ (Amersham Biosciences).- 6 045004 Chusets). Protein A immobilized on a porous glass matrix is commercially available as PROSEP®-A (millipore). The solid phase may also be an agarose-based matrix. Protein A immobilized on an agarose matrix is commercially available as MABSELECT™ (Amersham Biosciences).

Аффинная хроматография также включает среды, которые можно использовать для селективного связывания и, следовательно, очистки антител, фрагментов антител или химерных слитых белков, которые содержат домены и/или последовательности иммуноглобулинов. Антитела включают типы IgG, IgA, IgM, IgY, IgD и IgE. Антитела также включают одноцепочечные антитела, такие как антитела верблюдовых, сконструированные антитела верблюдовых, одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, наноантитела и т.п. Фрагменты антител включают последовательности VH, VL, CL, CH. Фрагменты антител и слитые белки, содержащие последовательности антител, включают, например, F(ab')₃, F(ab')2, Fab, Fc, Fv, dsFv, (scFv)2, scFv, scAb, миниантитела, диатела, триатела, тетратела, слитые с Fc белки, молекулы-ловушки и т.п. (см. Ayyar et al., Methods 56 (2012): 116-129). Такие среды для аффинной хроматографии могут содержать лиганды, которые селективно связывают антитела, их фрагменты, а слитые белки содержат эти фрагменты. Такие лиганды включают связывающие антитела белки, рецепторы бактериального происхождения, антигены, лектины или анти-антитела, направленные на молекулу-мишень, антитело, требующее очистки. Например, аффинные лиганды, происходящие от верблюдовых, направленные против любого одного или более из IgG-CH1, IgG-Fc, IgG-CH3, IgG1, LC-каппа, LC-лямбда, IgG3/4, IgA, IgM и т.п., используемые в качестве аффинных лигандов (коммерчески доступные как смолы для хроматографии CAPTURESELECT, Life Technologies, Inc., Карлсбад, Калифорния).Affinity chromatography also includes media that can be used to selectively bind and therefore purify antibodies, antibody fragments, or chimeric fusion proteins that contain immunoglobulin domains and/or sequences. Antibodies include IgG, IgA, IgM, IgY, IgD and IgE types. Antibodies also include single chain antibodies such as camelid antibodies, engineered camelid antibodies, single chain antibodies, single domain antibodies, nanoantibodies, and the like. Antibody fragments include the sequences VH, VL, CL, CH. Antibody fragments and fusion proteins containing antibody sequences include, for example, F(ab') ₃ , F(ab')2, Fab, Fc, Fv, dsFv, (scFv)2, scFv, scAb, mini-antibodies, diabodies, tri-bodies , tetrabodies, Fc fusion proteins, decoy molecules, etc. (see Ayyar et al., Methods 56 (2012): 116-129). Such affinity chromatography media may contain ligands that selectively bind antibodies, fragments thereof, and fusion proteins containing these fragments. Such ligands include antibody-binding proteins, bacterial-derived receptors, antigens, lectins, or anti-antibodies directed to the target molecule, antibody requiring purification. For example, camelid-derived affinity ligands directed against any one or more of IgG-CH1, IgG-Fc, IgG-CH3, IgG1, LC-kappa, LC-lambda, IgG3/4, IgA, IgM, and the like. , used as affinity ligands (commercially available as CAPTURESELECT chromatography resins, Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA).

Способы удаления нежелательных компонентов из потоков очисткиWays to remove unwanted components from cleanup streams

Варианты реализации способов по настоящему изобретению включают способы удаления нежелательных компонентов из технологического потока для очистки белковых продуктов. Указанные способы предназначены для удаления одного или более компонентов (например, химического компонента или соли) из элюата, полученного на стадии хроматографии, который может быть вредным для последующей стадии процесса. В некоторых вариантах реализации способ включает: (а) выполнение первой стадии хроматографии, на которой компонент присутствует в первом буфере, нанесенном на колонку для хроматографии; (b) сбор промежуточного элюата с первой стадии хроматографии, при этом промежуточный элюат содержит белковый продукт и компонент; (c) повторное нанесение промежуточного элюата на колонку для хроматографии и элюирование белкового продукта вторым буфером, содержащим компонент в концентрации ниже, чем концентрация промежуточного элюата; (d) сбор хроматографического элюата со стадии (c), при этом компонент присутствует в хроматографическом элюате в концентрации ниже, чем концентрация промежуточного элюата; и (е) нанесение хроматографического элюата на следующей стадии процесса. В некоторых вариантах реализации компонент отсутствует во втором буфере.Embodiments of the methods of the present invention include methods for removing unwanted components from a process stream to purify protein products. These methods are intended to remove one or more components (eg, a chemical component or a salt) from the eluate obtained from a chromatography step that may be detrimental to a subsequent process step. In some embodiments, the method includes: (a) performing a first chromatography step in which the component is present in a first buffer applied to the chromatography column; (b) collecting the intermediate eluate from the first chromatography step, wherein the intermediate eluate contains a protein product and a component; (c) reapplying the intermediate eluate to the chromatography column and eluting the protein product with a second buffer containing the component at a concentration lower than the concentration of the intermediate eluate; (d) collecting the chromatographic eluate from step (c), wherein the component is present in the chromatographic eluate at a concentration lower than the concentration of the intermediate eluate; and (e) applying the chromatographic eluate in the next step of the process. In some implementations, the component is not present in the second buffer.

Как более подробно обсуждается ниже в связи со способами очистки гетеродимерных белков, в некоторых вариантах реализации компонент представляет собой соль. В некоторых случаях концентрация соли в промежуточном элюате превышает 50 ммоль. В некоторых случаях концентрация соли в промежуточном элюате составляет > 100 ммоль, > 150 ммоль, > 200 ммоль, > 250 ммоль, > 300 ммоль, > 350 ммоль, > 400 ммоль, > 450 ммоль, > 500 ммоль, > 600 ммоль, > 700 ммоль, > 800 ммоль, > 900 ммоль или > 1000 ммоль. В некоторых случаях концентрация соли в промежуточном элюате составляет 500 ммоль ± 50 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация соли в промежуточном элюате составляет 250 ммоль, 300 ммоль, 350 ммоль, 400 ммоль, 450 ммоль, 500 ммоль, 550 ммоль или 600 ммоль, причем каждое значение включает отклонение ± 10%.As discussed in more detail below in connection with methods for purifying heterodimeric proteins, in some embodiments the component is a salt. In some cases, the salt concentration in the intermediate eluate exceeds 50 mmol. In some cases, the salt concentration in the intermediate eluate is > 100 mmol, > 150 mmol, > 200 mmol, > 250 mmol, > 300 mmol, > 350 mmol, > 400 mmol, > 450 mmol, > 500 mmol, > 600 mmol, > 700 mmol, > 800 mmol, > 900 mmol or > 1000 mmol. In some cases, the salt concentration in the intermediate eluate is 500 mmol ± 50 mmol. In some embodiments, the salt concentration in the intermediate eluate is 250 mmol, 300 mmol, 350 mmol, 400 mmol, 450 mmol, 500 mmol, 550 mmol, or 600 mmol, each value including a deviation of ±10%.

В некоторых вариантах реализации первая стадия хроматографии выбрана из аффинной хроматографии или ионообменной хроматографии. В некоторых вариантах реализации последующая стадия процесса представляет собой вторую стадию хроматографии. В некоторых случаях последующую стадию процесса выбирают из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии со смешанным режимом или инактивации вирусов. В некоторых случаях обсуждаемые в данном документе способы можно использовать между двумя стадиями ионного обмена, при этом первая стадия ионного обмена увеличивает проводимость пула выше верхнего предела, при котором последующую стадию ионного обмена можно выполнять надлежащим образом. В некоторых случаях обсуждаемые в данном документе способы можно использовать между двумя стадиями хроматографии, при этом на первой стадии вводят химический компонент, который должен быть удален для того, чтобы последующая стадия хроматографии выполнялась надлежащим образом. В некоторых случаях обсуждаемые в данном документе способы можно использовать перед вирусной фильтрацией, чтобы снизить проводимость и, следовательно, повысить эффективность фильтрации и сократить время анализа. В некоторых случаях обсуждаемые в данном документе способы можно использовать перед хроматографией со смешанным режимом (MMC) для удаления химических компонентов, которые мешают среде MMC или разрушают ее. Например, желательно удалить из потока цитрат, который несовместим с керамическим гидроксиапатитом.In some embodiments, the first chromatography step is selected from affinity chromatography or ion exchange chromatography. In some embodiments, the subsequent process step is a second chromatography step. In some cases, the subsequent process step is selected from affinity chromatography, ion exchange chromatography, mixed mode chromatography, or virus inactivation. In some cases, the methods discussed herein can be used between two ion exchange stages, with the first ion exchange stage increasing the conductivity of the pool above the upper limit at which the subsequent ion exchange stage can be properly performed. In some cases, the methods discussed herein can be used between two chromatography steps, with the first step introducing a chemical component that must be removed in order for the subsequent chromatography step to perform properly. In some cases, the methods discussed herein can be used before viral filtration to reduce conductivity and therefore increase filtration efficiency and reduce analysis time. In some cases, the methods discussed herein can be used prior to mixed mode chromatography (MMC) to remove chemical components that interfere with or disrupt the MMC environment. For example, it is desirable to remove citrate from the stream, which is incompatible with ceramic hydroxyapatite.

В некоторых вариантах реализации белковый продукт представляет собой антитело (например,In some embodiments, the protein product is an antibody (e.g.

- 7 045004 биспецифическое антитело).- 7 045004 bispecific antibody).

Способы очистки гетеродимерных белковMethods for purifying heterodimeric proteins

Варианты реализации способов по настоящему изобретению включают стадии, проиллюстрированные на фиг. 1. Например, способы очистки гетеродимерного белка включают: (а) загрузку смеси гетеродимерного белка и примесей на аффинную матрицу, (b) промывку аффинной матрицы первым промывочным буфером при pH 5-8 и концентрации соли более 200 ммоль, (c) элюирование и сбор гетеродимерного белка с помощью первого элюирующего буфера при pH 4-5 и концентрации соли более 200 ммоль, (d) промывку аффинной матрицы вторым промывочным буфером при pH менее 4, (e) уравновешивание аффинной матрицы до pH от 5-9, (f) нейтрализацию элюата, содержащего гетеродимерный белок, до pH 5-9 и повторное нанесение нейтрализованного элюата на аффинную матрицу, (g) промывку аффинной матрицы третьим промывочным буфером, содержащим менее 100 ммоль соли, и (h) элюирование и сбор гетеродимерного белка в элюате, содержащем менее 100 ммоль соли. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают стадию начального уравновешивания, на которой аффинная матрица уравновешивается до pH 5-9. В некоторых вариантах реализации способы дополнительно включают промывку аффинной матрицы промывочным буфером с содержанием соли менее 100 ммоль после промывки первым промывочным буфером, но перед элюированием и сбором гетеродимерного белка.Embodiments of the methods of the present invention include the steps illustrated in FIG. 1. For example, methods for purifying a heterodimeric protein include: (a) loading a mixture of heterodimeric protein and impurities onto an affinity matrix, (b) washing the affinity matrix with a first wash buffer at pH 5-8 and a salt concentration greater than 200 mmol, (c) elution and collection heterodimeric protein using a first elution buffer at pH 4-5 and a salt concentration greater than 200 mmol, (d) washing the affinity matrix with a second wash buffer at pH less than 4, (e) equilibrating the affinity matrix to a pH of 5-9, (f) neutralization eluate containing the heterodimeric protein to pH 5-9 and reapplying the neutralized eluate to the affinity matrix, (g) washing the affinity matrix with a third wash buffer containing less than 100 mM salt, and (h) eluting and collecting the heterodimeric protein in the eluate containing less 100 mmol salt. In some embodiments, the methods further include an initial equilibration step in which the affinity matrix is equilibrated to a pH of 5-9. In some embodiments, the methods further comprise washing the affinity matrix with a wash buffer containing less than 100 mM salt after washing with the first wash buffer but before eluting and collecting the heterodimeric protein.

В различных вариантах реализации загрузка смеси гетеродимерного белка и примесей на аффинную матрицу включает загрузку осветленной клеточной культуры из одного или более биореакторов, содержащих клетки, экспрессирующие нуклеотидные последовательности, кодирующие гетеродимерный белок. Например, клетки могут экспрессировать нуклеотиды, кодирующие каждую из тяжелых и легких цепей, образующих биспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело CD3xCD20, биспецифическое антитело METxMET, в котором два плеча связывают отдельные эпитопы MET, биспецифическое антитело CD3xBCMA, биспецифическое антитело CD22xCD28, биспецифическое антитело PSMAxCD28, биспецифическое антитело CD3xPSMA, биспецифическое антитело CD3xMUC16, биспецифическое антитело CD3xSTEAP2 и т.п.). В некоторых случаях каждое из антигенсвязывающих плеч биспецифического антитела содержит общую легкую цепь. Осветленная клеточная культура будет содержать гетеродимерный белок (например, биспецифическое антитело), а также примеси, такие как гомодимерные соединения, белки клетки-хозяина и ДНК. В некоторых случаях гетеродимерный белок может продуцироваться в эукариотических клетках, таких как, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО).In various embodiments, loading a mixture of heterodimeric protein and impurities onto an affinity matrix includes loading a clarified cell culture from one or more bioreactors containing cells expressing nucleotide sequences encoding the heterodimeric protein. For example, cells may express nucleotides encoding each of the heavy and light chains that make up a bispecific antibody (e.g., CD3xCD20 bispecific antibody, METxMET bispecific antibody, in which two arms bind distinct MET epitopes, CD3xBCMA bispecific antibody, CD22xCD28 bispecific antibody, PSMAxCD28 bispecific antibody, CD3xPSMA bispecific antibody, CD3xMUC16 bispecific antibody, CD3xSTEAP2 bispecific antibody, etc.). In some cases, each of the antigen-binding arms of a bispecific antibody contains a common light chain. A clarified cell culture will contain heterodimeric protein (eg, a bispecific antibody) as well as contaminants such as homodimeric compounds, host cell proteins, and DNA. In some cases, a heterodimeric protein can be produced in eukaryotic cells, such as, for example, Chinese hamster ovary (CHO) cells.

В некоторых вариантах реализации смесь, загруженная на аффинную матрицу, включает смесь белков, содержащих: (i) первый гомодимер, содержащий две копии первого полипептида, (ii) гетеродимер, содержащий первый полипептид и второй полипептид, и (iii) второй гомодимер, содержащий две копии второго полипептида. Первый и второй полипептиды имеют различную аффинность для аффинной матрицы таким образом, что первый гомодимер, гетеродимер и второй гомодимер могут быть разделены на основании дифференциального связывания с аффинной матрицей. Дифференциальным связыванием с аффинной матрицей можно манипулировать, изменяя, среди прочего, pH и/или ионную силу раствора, прошедшего через аффинную матрицу.In some embodiments, the mixture loaded onto the affinity matrix includes a mixture of proteins comprising: (i) a first homodimer containing two copies of a first polypeptide, (ii) a heterodimer containing a first polypeptide and a second polypeptide, and (iii) a second homodimer containing two copies of the second polypeptide. The first and second polypeptides have different affinities for the affinity matrix such that the first homodimer, heterodimer, and second homodimer can be separated based on differential binding to the affinity matrix. Differential binding to the affinity matrix can be manipulated by changing, among other things, the pH and/or ionic strength of the solution passed through the affinity matrix.

В различных вариантах реализации соль, обсуждаемая ниже или далее в настоящем документе в связи с любым буфером или элюатом (или иным образом), представляет собой соль, содержащую Cl^-, Br^-, I^-, NO3^-, N(CH3)₄ ⁺, NH4⁺, Cs⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, H⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ или Al³⁺. В некоторых вариантах реализации соль содержит Na⁺, H⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ или Al³⁺. В некоторых вариантах реализации соль содержит Cl^-, Br^-, I^-, NO3^- или ClO4^-. В некоторых вариантах реализации соль содержит комбинации Na⁺, H⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ или Al³⁺ с Cl^-, Br^-, I^-, NO3^- или lO4^-. В некоторых вариантах реализации соль выбрана из CaCl2, MgCl₂ или NaCl. В некоторых вариантах реализации соль представляет собой NaCl. В некоторых вариантах реализации соль представляет собой CaCl₂. В некоторых вариантах реализации соль представляет собой MgCl2.In various embodiments, a salt discussed below or hereinafter in connection with any buffer or eluate (or otherwise) is a salt containing Cl ^- , Br ^- , I ^- , NO3 ^- , N(CH3) ₄ ⁺ , NH4 ⁺ , Cs ⁺ , Rb ⁺ , K ⁺ , Na ⁺ , H ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ or Al ³⁺ . In some embodiments, the salt contains Na ⁺ , H ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ^{2+ ,} or Al ³⁺ . In some embodiments, the salt contains Cl ^- , Br ^- , I ^- , NO3 ^- or ClO4 ^- . In some embodiments, the salt contains combinations of Na ⁺ , H ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ or Al ³⁺ with Cl ^- , Br ^- , I ^- , NO3 ^- or lO4 ^- . In some embodiments, the salt is selected from CaCl2, _MgCl2 , or NaCl. In some embodiments, the salt is NaCl. In some embodiments, the salt is CaCl ₂ . In some embodiments, the salt is MgCl2.

После загрузки осветленной клеточной культуры аффинную матрицу промывают промывочным буфером (первым промывочным буфером на фиг. 1), содержащим более 200 ммоль соли и имеющим pH от 5 до 9. В некоторых случаях pH промывочного буфера составляет от 6 до 8. В некоторых случаях pH промывочного буфера составляет от около 7 до около 7,5. В различных вариантах реализации pH промывочного буфера составляет или составляет около 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. В некоторых вариантах реализации pH промывочного буфера составляет или составляет около 7,2. В различных вариантах реализации буфер может представлять собой любой буфер, способный поддерживать pH в требуемой точке или в требуемом диапазоне. В различных вариантах реализации концентрация буфера может составлять от около 5 до около 100 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 5 до около 15 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 5 до около 50 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 10 до около 25 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 20 до около 40 ммоль. ВAfter loading the clarified cell culture, the affinity matrix is washed with a wash buffer (the first wash buffer in Fig. 1) containing more than 200 mmol of salt and having a pH of 5 to 9. In some cases, the pH of the wash buffer is between 6 and 8. In some cases, the pH of the wash buffer is buffer is from about 7 to about 7.5. In various embodiments, the pH of the wash buffer is or is about 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 , 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7 ,2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 , 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 or 9.0. In some embodiments, the pH of the wash buffer is at or about 7.2. In various embodiments, the buffer can be any buffer capable of maintaining the pH at a desired point or range. In various embodiments, the buffer concentration can range from about 5 to about 100 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 5 to about 15 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 5 to about 50 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 10 to about 25 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 20 to about 40 mmol. IN

- 8 045004 некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 30 до около 50 ммоль. В различных вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 5 ммоль, 6 ммоль, 7 ммоль, 8 ммоль, 9 ммоль, 10 ммоль, 11 ммоль, 12 ммоль, 13 ммоль, 14 ммоль, 15 ммоль, 16 ммоль, 17 ммоль, 18 ммоль, 19 ммоль, 20 ммоль, 21 ммоль, 22 ммоль, 23 ммоль, 24 ммоль, 25 ммоль, 26 ммоль, 27 ммоль, 28 ммоль, 29 ммоль, 30 ммоль, 31 ммоль, 32 ммоль, 33 ммоль, 34 ммоль, 35 ммоль, 36 ммоль, 37 ммоль, 38 ммоль, 39 ммоль, 40 ммоль, 41 ммоль, 42 ммоль, 43 ммоль, 44 ммоль, 45 ммоль, 46 ммоль, 47 ммоль, 48 ммоль, 49 ммоль или 50 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация промывочного буфера составляет или составляет около 10 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация промывочного буфера составляет или составляет около 40 ммоль. В некоторых вариантах реализации промывочный буфер представляет собой фосфат натрия.- 8 045004 In some cases, the buffer concentration is from about 30 to about 50 mmol. In various embodiments, the buffer concentration is at or about 5 mmol, 6 mmol, 7 mmol, 8 mmol, 9 mmol, 10 mmol, 11 mmol, 12 mmol, 13 mmol, 14 mmol, 15 mmol, 16 mmol, 17 mmol, 18 mmol, 19 mmol, 20 mmol, 21 mmol, 22 mmol, 23 mmol, 24 mmol, 25 mmol, 26 mmol, 27 mmol, 28 mmol, 29 mmol, 30 mmol, 31 mmol, 32 mmol, 33 mmol, 34 mmol, 35 mmol, 36 mmol, 37 mmol, 38 mmol, 39 mmol, 40 mmol, 41 mmol, 42 mmol, 43 mmol, 44 mmol, 45 mmol, 46 mmol, 47 mmol, 48 mmol, 49 mmol or 50 mmol. In some embodiments, the concentration of the wash buffer is at or about 10 mmol. In some embodiments, the concentration of the wash buffer is at or about 40 mmol. In some embodiments, the wash buffer is sodium phosphate.

В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации от около 200 до около 800 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации от около 250 до около 750 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации от около 300 до около 700 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации от около 350 до около 650 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации от около 400 до около 600 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации от около 450 до около 550 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит соль в концентрации около 200 ммоль, 210 ммоль, 220 ммоль, 225 ммоль, 230 ммоль, 240 ммоль, 250 ммоль, 260 ммоль, 270 ммоль, 275 ммоль, 280 ммоль, 290 ммоль, 300 ммоль, 310 ммоль, 320 ммоль, 325 ммоль, 330 ммоль, 340 ммоль, 350 ммоль, 360 ммоль, 370 ммоль, 375 ммоль, 380 ммоль, 390 ммоль, 400 ммоль, 410 ммоль, 420 ммоль, 425 ммоль, 430 ммоль, 440 ммоль, 450 ммоль, 460 ммоль, 470 ммоль, 475 ммоль, 480 ммоль, 490 ммоль, 500 ммоль, 510 ммоль, 520 ммоль, 525 ммоль, 530 ммоль, 540 ммоль, 550 ммоль, 560 ммоль, 570 ммоль ммоль, 575 ммоль, 580 ммоль, 590 ммоль, 600 ммоль, 610 ммоль, 620 ммоль, 625 ммоль, 630 ммоль, 640 ммоль, 650 ммоль, 660 ммоль, 670 ммоль, 675 ммоль, 680 ммоль, 690 ммоль, 700 ммоль, 710 ммоль, 720 ммоль, 725 ммоль, 730 ммоль, 740 ммоль, 750 ммоль, 760 ммоль, 770 ммоль, 780 ммоль, 790 ммоль или 800 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация соли промывочного буфера составляет или составляет около 500 ммоль. В некоторых вариантах реализации промывочный буфер содержит около 500 ммоль NaCl. В некоторых случаях эта промывка аффинной матрицы удаляет несвязанные примеси, такие как белок клетки-хозяина, ДНК и гомодимерные соединения с небольшой аффинностью или без аффинности для материала аффинной матрицы (например, белок А).In some cases, the wash buffer contains salt at a concentration of from about 200 to about 800 mmol. In some cases, the wash buffer contains salt at a concentration of from about 250 to about 750 mmol. In some cases, the wash buffer contains salt at a concentration of about 300 to about 700 mmol. In some cases, the wash buffer contains salt at a concentration of from about 350 to about 650 mmol. In some cases, the wash buffer contains salt at a concentration of about 400 to about 600 mmol. In some cases, the wash buffer contains salt at a concentration of about 450 to about 550 mmol. In some cases, the wash buffer contains salt at concentrations of about 200 mmol, 210 mmol, 220 mmol, 225 mmol, 230 mmol, 240 mmol, 250 mmol, 260 mmol, 270 mmol, 275 mmol, 280 mmol, 290 mmol, 300 mmol, 310 mmol, 320 mmol, 325 mmol, 330 mmol, 340 mmol, 350 mmol, 360 mmol, 370 mmol, 375 mmol, 380 mmol, 390 mmol, 400 mmol, 410 mmol, 420 mmol, 425 mmol, 430 mmol, 440 mmol, 450 mmol, 460 mmol, 470 mmol, 475 mmol, 480 mmol, 490 mmol, 500 mmol, 510 mmol, 520 mmol, 525 mmol, 530 mmol, 540 mmol, 550 mmol, 560 mmol, 570 mmol mmol, 575 mmol, 580 mmol, 590 mmol, 600 mmol, 610 mmol, 620 mmol, 625 mmol, 630 mmol, 640 mmol, 650 mmol, 660 mmol, 670 mmol, 675 mmol, 680 mmol, 690 mmol, 700 mmol, 710 mmol, 720 mmol, 725 mmol, 730 mmol, 740 mmol, 750 mmol, 760 mmol, 770 mmol, 780 mmol, 790 mmol or 800 mmol. In some embodiments, the wash buffer salt concentration is at or about 500 mmol. In some embodiments, the wash buffer contains about 500 mM NaCl. In some cases, this affinity matrix wash removes unbound contaminants such as host cell protein, DNA, and homodimeric compounds with little or no affinity for the affinity matrix material (eg, protein A).

В некоторых вариантах реализации способы включают необязательную вторую промывку перед элюированием гетеродимерного белка промывочным буфером, содержащим небольшое количество соли (< 25 ммоль) или не содержащим соль, при pH от 5 до 9. В некоторых вариантах реализации этот промывочный буфер содержит от около 10 до около 50 ммоль трис [трис(гидроксиметил)аминометан]], фосфат натрия, или ацетат, или их комбинации. В различных вариантах реализации этот промывочный буфер имеет pH, равный pH первого промывочного буфера, описанного выше.In some embodiments, the methods include an optional second wash before eluting the heterodimeric protein with a wash buffer containing a small amount of salt (<25 mmol) or no salt, at a pH of 5 to 9. In some embodiments, the wash buffer contains from about 10 to about 50 mmol tris [tris(hydroxymethyl)aminomethane]], sodium phosphate, or acetate, or combinations thereof. In various embodiments, this wash buffer has a pH equal to the pH of the first wash buffer described above.

После промывки или промывок, описанных выше, гетеродимерный белок элюируют из аффинной матрицы в элюирующем буфере (первый элюирующий буфер на фиг. 1) и собирают в элюате. Элюирующий буфер имеет pH от около 4 до около 5 и содержит соль в концентрации более 200 ммоль. В некоторых вариантах реализации pH элюирующего буфера составляет от около 4,0 до около 4,2. В некоторых вариантах реализации pH элюирующего буфера составляет от около 4,4 до около 4,6. В различных вариантах реализации pH элюирующего буфера составляет или составляет около 4,0, 4,05, 4,1, 4,15, 4,2, 4,25, 4,3, 4,35, 4,4, 4,45, 4,5, 4,55, 4,6, 4,65, 4,7, 4,75, 4,8, 4,85, 4,9, 4,95 или 5,0. В некоторых вариантах реализации pH элюирующего буфера составляет 4,1. В некоторых вариантах реализации pH элюирующего буфера составляет 4,55. В различных вариантах реализации буфер может представлять собой любой буфер, способный поддерживать pH в требуемой точке или в требуемом диапазоне. В различных вариантах реализации концентрация буфера может составлять от около 5 до около 100 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 25 до около 55 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 30 до около 50 ммоль. В различных вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 30 ммоль, 31 ммоль, 32 ммоль, 33 ммоль, 34 ммоль, 35 ммоль, 36 ммоль, 37 ммоль, 38 ммоль, 39 ммоль, 40 ммоль, 41 ммоль, 42 ммоль, 43 ммоль, 44 ммоль, 45 ммоль, 46 ммоль, 47 ммоль, 48 ммоль, 49 ммоль или 50 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация элюирующего буфера составляет или составляет около 40 ммоль. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер представляет собой уксусную кислоту. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер представляет собой ацетат.After the wash or washes described above, the heterodimeric protein is eluted from the affinity matrix in an elution buffer (first elution buffer in Figure 1) and collected in the eluate. The elution buffer has a pH of about 4 to about 5 and contains salt at a concentration of greater than 200 mmol. In some embodiments, the pH of the elution buffer is from about 4.0 to about 4.2. In some embodiments, the pH of the elution buffer is from about 4.4 to about 4.6. In various embodiments, the pH of the elution buffer is or is about 4.0, 4.05, 4.1, 4.15, 4.2, 4.25, 4.3, 4.35, 4.4, 4.45 , 4.5, 4.55, 4.6, 4.65, 4.7, 4.75, 4.8, 4.85, 4.9, 4.95 or 5.0. In some embodiments, the pH of the elution buffer is 4.1. In some embodiments, the pH of the elution buffer is 4.55. In various embodiments, the buffer can be any buffer capable of maintaining the pH at a desired point or range. In various embodiments, the buffer concentration can range from about 5 to about 100 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 25 to about 55 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 30 to about 50 mmol. In various embodiments, the buffer concentration is at or about 30 mmol, 31 mmol, 32 mmol, 33 mmol, 34 mmol, 35 mmol, 36 mmol, 37 mmol, 38 mmol, 39 mmol, 40 mmol, 41 mmol, 42 mmol, 43 mmol, 44 mmol, 45 mmol, 46 mmol, 47 mmol, 48 mmol, 49 mmol or 50 mmol. In some embodiments, the concentration of the elution buffer is at or about 40 mmol. In some embodiments, the elution buffer is acetic acid. In some embodiments, the elution buffer is acetate.

В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации от около 200 до около 800 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации от около 250 до около 750 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации от около 300 до около 700 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации от около 350 до около 650 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации от около 400 до около 600 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации от около 450 до около 550 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит соль в концентрации,In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration of from about 200 to about 800 mmol. In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration of from about 250 to about 750 mmol. In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration of from about 300 to about 700 mmol. In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration of from about 350 to about 650 mmol. In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration of about 400 to about 600 mmol. In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration of about 450 to about 550 mmol. In some cases, the elution buffer contains salt at a concentration

- 9 045004 составляющей ровно или около 200 ммоль, 210, ммоль, 220 ммоль, 225 ммоль, 230 ммоль, 240 ммоль, 250 ммоль, 260 ммоль, 270 ммоль, 275 ммоль, 280 ммоль, 290 ммоль, 300 ммоль, 310 ммоль, 320 ммоль,325 ммоль, 330 ммоль, 340 ммоль, 350 ммоль, 360 ммоль, 370 ммоль, 375 ммоль, 380 ммоль, 390 ммоль,400 ммоль, 410 ммоль, 420 ммоль, 425 ммоль, 430 ммоль, 440 ммоль, 450 ммоль, 460 ммоль, 470 ммоль,475 ммоль, 480 ммоль, 490 ммоль, 500 ммоль, 510 ммоль, 520 ммоль, 525 ммоль, 530 ммоль, 540 ммоль,550 ммоль, 560 ммоль, 570 ммоль ммоль, 575 ммоль, 580 ммоль, 590 ммоль, 600 ммоль, 610 ммоль, 620 ммоль, 625 ммоль, 630 ммоль, 640 ммоль, 650 ммоль, 660 ммоль, 670 ммоль, 675 ммоль, 680 ммоль,690 ммоль, 700 ммоль, 710 ммоль, 720 ммоль, 725 ммоль, 730 ммоль, 740 ммоль, 750 ммоль, 760 ммоль,770 ммоль, 780 ммоль, 790 ммоль или 800 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация соли в элюирующем буфере составляет или составляет около 500 ммоль. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер содержит около 500 ммоль NaCl. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер содержит около 500 ммоль CaCl₂. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер содержит около 500 ммоль MgCl₂.- 9 045004 components exactly or about 200 mmol, 210, mmol, 220 mmol, 225 mmol, 230 mmol, 240 mmol, 250 mmol, 260 mmol, 270 mmol, 275 mmol, 280 mmol, 290 mmol, 300 mmol, 310 mmol, 320 mmol, 325 mmol, 330 mmol, 340 mmol, 350 mmol, 360 mmol, 370 mmol, 375 mmol, 380 mmol, 390 mmol, 400 mmol, 410 mmol, 420 mmol, 425 mmol, 430 mmol, 440 mmol, 450 mmol , 460 mmol, 470 mmol,475 mmol, 480 mmol, 490 mmol, 500 mmol, 510 mmol, 520 mmol, 525 mmol, 530 mmol, 540 mmol,550 mmol, 560 mmol, 570 mmol mmol, 575 mmol, 580 mmol, 590 mmol, 600 mmol, 610 mmol, 620 mmol, 625 mmol, 630 mmol, 640 mmol, 650 mmol, 660 mmol, 670 mmol, 675 mmol, 680 mmol, 690 mmol, 700 mmol, 710 mmol, 720 mmol, 725 mmol , 730 mmol, 740 mmol, 750 mmol, 760 mmol, 770 mmol, 780 mmol, 790 mmol or 800 mmol. In some embodiments, the salt concentration in the elution buffer is at or about 500 mmol. In some embodiments, the elution buffer contains about 500 mmol NaCl. In some embodiments, the elution buffer contains about 500 mmol of CaCl ₂ . In some embodiments, the elution buffer contains about 500 mmol of MgCl ₂ .

После элюирования и сбора гетеродимерного белка из аффинной матрицы аффинную матрицу промывают промывочным буфером (вторым промывочным буфером на фиг. 1) при pH менее около 4. В некоторых вариантах реализации pH промывочного буфера составляет от около 2,5 до около 3,5. В некоторых вариантах реализации pH промывочного буфера составляет 3,0 ± 0,2. В различных вариантах реализации pH промывочного буфера составляет или составляет около 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8 или 3,9. Промывочный буфер может содержать любой подходящий материал для обеспечения pH или диапазона pH, указанных выше. В некоторых вариантах реализации промывочный буфер содержит уксусную кислоту в концентрации от около 20 до около 60 ммоль. В некоторых вариантах реализации промывочный буфер содержит уксусную кислоту в концентрации от около 30 до около 50 ммоль. В некоторых случаях промывочный буфер содержит около 40 ммоль уксусной кислоты. В некоторых случаях эта промывка аффинной матрицы удаляет ранее связанные примеси, такие как гомодимерные соединения с большей аффинностью к материалу аффинной матрицы (например, белок A), чем у гетеродимерного белка. В некоторых случаях способы по настоящему изобретению могут также включать дополнительную промывку аффинной матрицы буфером, имеющим более низкий pH (например, 2,45 ± 0,2) и более высокую концентрацию буферного материала (например, 500 ммоль уксусной кислоты), чем у промывочного буфера, обсуждаемого непосредственно выше.After eluting and collecting the heterodimeric protein from the affinity matrix, the affinity matrix is washed with a wash buffer (second wash buffer in FIG. 1) at a pH less than about 4. In some embodiments, the pH of the wash buffer is from about 2.5 to about 3.5. In some embodiments, the pH of the wash buffer is 3.0 ± 0.2. In various embodiments, the pH of the wash buffer is or is about 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 , 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 or 3.9. The wash buffer may contain any suitable material to provide the pH or pH range specified above. In some embodiments, the wash buffer contains acetic acid at a concentration of from about 20 to about 60 mmol. In some embodiments, the wash buffer contains acetic acid at a concentration of about 30 to about 50 mmol. In some cases, the wash buffer contains about 40 mmol of acetic acid. In some cases, this affinity matrix wash removes previously bound contaminants, such as homodimeric compounds with greater affinity for the affinity matrix material (eg, protein A) than the heterodimeric protein. In some cases, the methods of the present invention may also include additional washing of the affinity matrix with a buffer having a lower pH (for example, 2.45 ± 0.2) and a higher concentration of buffer material (for example, 500 mmol acetic acid) than the wash buffer , discussed directly above.

После удаления дополнительных примесей с помощью промывки (или промывок), описанной выше, аффинную матрицу повторно уравновешивают до pH от 5 до 9. В различных вариантах реализации аффинная матрица уравновешена до pH, составляющего ровно или около 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. В некоторых вариантах реализации аффинная матрица уравновешена до pH около 7,2. Уравновешивание может быть выполнено с помощью уравновешивающего буфера, имеющего требуемый pH. В различных вариантах реализации буфер может представлять собой любой буфер, способный поддерживать pH в требуемой точке или в требуемом диапазоне. В различных вариантах реализации концентрация буфера может составлять от около 5 до около 100 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 10 до около 30 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 30 до около 50 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 40 до около 60 ммоль. В различных вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 10 ммоль, 11 ммоль, 12 ммоль, 13 ммоль, 14 ммоль, 15 ммоль, 16 ммоль, 17 ммоль, 18 ммоль, 19 ммоль, 20 ммоль, 21 ммоль, 22 ммоль, 23 ммоль, 24 ммоль, 25 ммоль, 26 ммоль, ммоль, 28 ммоль, 29 ммоль, 30 ммоль, 31 ммоль, 32 ммоль, 33 ммоль, 34 ммоль, 35 ммоль, 36 ммоль, ммоль, 38 ммоль, 39 ммоль, 40 ммоль, 41 ммоль, 42 ммоль, 43 ммоль, 44 ммоль, 45 ммоль, 46 ммоль, ммоль, 48 ммоль, 49 ммоль, 50 ммоль, 51 ммоль, 52 ммоль, 53 ммоль, 54 ммоль, 55 ммоль, 56 ммоль, ммоль, 58 ммоль, 59 ммоль или 60 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 20 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 40 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 50 ммоль. В некоторых вариантах реализации буфер представляет собой фосфат натрия. В некоторых вариантах реализации указанный буфер содержит от около 10 ммоль до около 50 ммоль трис, фосфата натрия, или ацетата, или их комбинаций.After removing additional impurities using the wash(es) described above, the affinity matrix is re-equilibrated to a pH of 5 to 9. In various embodiments, the affinity matrix is equilibrated to a pH of exactly or about 5.0, 5.1, 5, 2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7, 7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 or 9.0. In some embodiments, the affinity matrix is equilibrated to a pH of about 7.2. Equilibration can be accomplished using an equilibration buffer having the desired pH. In various embodiments, the buffer can be any buffer capable of maintaining the pH at a desired point or range. In various embodiments, the buffer concentration may range from about 5 to about 100 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 10 to about 30 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 30 to about 50 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 40 to about 60 mmol. In various embodiments, the buffer concentration is or is about 10 mmol, 11 mmol, 12 mmol, 13 mmol, 14 mmol, 15 mmol, 16 mmol, 17 mmol, 18 mmol, 19 mmol, 20 mmol, 21 mmol, 22 mmol, 23 mmol, 24 mmol, 25 mmol, 26 mmol, mmol, 28 mmol, 29 mmol, 30 mmol, 31 mmol, 32 mmol, 33 mmol, 34 mmol, 35 mmol, 36 mmol, mmol, 38 mmol, 39 mmol, 40 mmol , 41 mmol, 42 mmol, 43 mmol, 44 mmol, 45 mmol, 46 mmol, mmol, 48 mmol, 49 mmol, 50 mmol, 51 mmol, 52 mmol, 53 mmol, 54 mmol, 55 mmol, 56 mmol, mmol, 58 mmol, 59 mmol or 60 mmol. In some embodiments, the buffer concentration is at or about 20 mmol. In some embodiments, the buffer concentration is at or about 40 mmol. In some embodiments, the buffer concentration is at or about 50 mmol. In some embodiments, the buffer is sodium phosphate. In some embodiments, the buffer contains from about 10 mmol to about 50 mmol Tris, sodium phosphate, or acetate, or combinations thereof.

После уравновешивания аффинной матрицы нейтрализованный элюат, содержащий гетеродимерный белок (теперь очищенный от гомодимерных примесей и других примесей), повторно наносят на ту же аффинную матрицу, которую использовали в стадиях процесса очистки, описанных выше, при pH от 5 до 9. В различных вариантах реализации нейтрализованный элюат повторно наносят на аффинную матрицу при pH около 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6.7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. В некоторых вариантах реализации pH составляет или составляет около 7,2.After equilibration of the affinity matrix, the neutralized eluate containing the heterodimeric protein (now purified of homodimeric impurities and other impurities) is reapplied to the same affinity matrix used in the purification process steps described above at a pH of 5 to 9. In various embodiments, the neutralized eluate is reapplied to the affinity matrix at a pH of about 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8, 5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 or 9.0. In some embodiments, the pH is at or about 7.2.

После повторного нанесения нейтрализованного элюата на аффинную матрицу матрицу промывают промывочным буфером (третим промывочным буфером на фиг. 1) при нейтральном pH и концентрацииAfter reapplying the neutralized eluate to the affinity matrix, the matrix is washed with wash buffer (third wash buffer in Figure 1) at neutral pH and concentration

- 10 045004 соли менее 100 ммоль. В общем, pH этого промывочного буфера будет точно соответствовать pH нейтрализованного элюата, повторно нанесенного на аффинную матрицу, как обсуждалось выше. В различных вариантах реализации концентрация соли в этом промывочном буфере будет составлять от около 0 до около 100 ммоль, от около 0 до около 75 ммоль, от около 0 до около 50 ммоль, от около 0 до около 25 ммоль или от около 0 до около 10 ммоль. В различных вариантах реализации концентрация соли в этом промывочном буфере составляет или составляет около 99 ммоль, 95 ммоль, 90 ммоль, 85 ммоль, 80 ммоль, 75 ммоль, 70 ммоль, 65 ммоль, 60 ммоль, 55 ммоль, 50 ммоль, 45 ммоль, 40 ммоль, 35 ммоль, 30 ммоль, 25 ммоль, 20 ммоль, 15 ммоль, 10 ммоль, 5 ммоль или меньше, равно или 0 ммоль. В различных вариантах реализации буфер может представлять собой любой буфер, способный поддерживать pH в требуемой точке или в требуемом диапазоне. В различных вариантах реализации концентрация буфера может составлять от около 5 до около 100 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 10 до около 30 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 30 до около 50 ммоль. В некоторых случаях концентрация буфера составляет от около 40 до около 60 ммоль. В различных вариантах реализации концентрация буфера составляет или составляет около 10 ммоль, 11 ммоль, 12 ммоль, 13 ммоль, 14 ммоль, 15 ммоль, 16 ммоль, 17 ммоль, 18 ммоль, 19 ммоль, 20 ммоль, 21 ммоль, 22 ммоль, 23 ммоль, 24 ммоль, 25 ммоль, 26 ммоль, 27 ммоль, 28 ммоль, 29 ммоль, 30 ммоль,31 ммоль, 32 ммоль, 33 ммоль, 34 ммоль, 35 ммоль, 36 ммоль, 37 ммоль, 38 ммоль, 39 ммоль, 40 ммоль,41 ммоль, 42 ммоль, 43 ммоль, 44 ммоль, 45 ммоль, 46 ммоль, 47 ммоль, 48 ммоль, 49 ммоль, 50 ммоль,51 ммоль, 52 ммоль, 53 ммоль, 54 ммоль, 55 ммоль, 56 ммоль, 57 ммоль, 58 ммоль, 59 ммоль или 60 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация промывочного буфера составляет или составляет около 20 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация промывочного буфера составляет или составляет около 40 ммоль. В некоторых вариантах реализации концентрация промывочного буфера составляет или составляет около 50 ммоль. В некоторых вариантах реализации промывочный буфер представляет собой фосфат натрия. В некоторых вариантах реализации этот промывочный буфер содержит от около 10 ммоль до около 50 ммоль трис, фосфата натрия, или ацетата, или их комбинаций.- 10 045004 salts less than 100 mmol. In general, the pH of this wash buffer will closely match the pH of the neutralized eluate reapplied to the affinity matrix as discussed above. In various embodiments, the salt concentration in this wash buffer will be from about 0 to about 100 mmol, from about 0 to about 75 mmol, from about 0 to about 50 mmol, from about 0 to about 25 mmol, or from about 0 to about 10 mmol. In various embodiments, the salt concentration in this wash buffer is or is about 99 mmol, 95 mmol, 90 mmol, 85 mmol, 80 mmol, 75 mmol, 70 mmol, 65 mmol, 60 mmol, 55 mmol, 50 mmol, 45 mmol, 40 mmol, 35 mmol, 30 mmol, 25 mmol, 20 mmol, 15 mmol, 10 mmol, 5 mmol or less, equal to or 0 mmol. In various embodiments, the buffer can be any buffer capable of maintaining the pH at a desired point or range. In various embodiments, the buffer concentration may range from about 5 to about 100 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 10 to about 30 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 30 to about 50 mmol. In some cases, the buffer concentration is from about 40 to about 60 mmol. In various embodiments, the buffer concentration is or is about 10 mmol, 11 mmol, 12 mmol, 13 mmol, 14 mmol, 15 mmol, 16 mmol, 17 mmol, 18 mmol, 19 mmol, 20 mmol, 21 mmol, 22 mmol, 23 mmol, 24 mmol, 25 mmol, 26 mmol, 27 mmol, 28 mmol, 29 mmol, 30 mmol, 31 mmol, 32 mmol, 33 mmol, 34 mmol, 35 mmol, 36 mmol, 37 mmol, 38 mmol, 39 mmol, 40 mmol, 41 mmol, 42 mmol, 43 mmol, 44 mmol, 45 mmol, 46 mmol, 47 mmol, 48 mmol, 49 mmol, 50 mmol, 51 mmol, 52 mmol, 53 mmol, 54 mmol, 55 mmol, 56 mmol , 57 mmol, 58 mmol, 59 mmol or 60 mmol. In some embodiments, the concentration of the wash buffer is at or about 20 mmol. In some embodiments, the concentration of the wash buffer is at or about 40 mmol. In some embodiments, the concentration of the wash buffer is at or about 50 mmol. In some embodiments, the wash buffer is sodium phosphate. In some embodiments, the wash buffer contains from about 10 mmol to about 50 mmol Tris, sodium phosphate, or acetate, or combinations thereof.

После промывки, описанной выше, очищенный гетеродимерный белок элюируют и собирают из аффинной матрицы в элюате, содержащем менее около 100 ммоль соли. В различных вариантах реализации концентрация соли в элюате составляет или составляет около 99 ммоль, 95 ммоль, 90 ммоль, 85 ммоль, 80 ммоль, 75 ммоль, 70 ммоль, 65 ммоль, 60 ммоль, 55 ммоль, 50 ммоль, 45 ммоль, 40 ммоль, 35 ммоль, 30 ммоль, 25 ммоль, 20 ммоль, 15 ммоль, 10 ммоль, 5 ммоль или меньше, равно или 0 ммоль. Как правило, элюирование гетеродимерного белка проводят с помощью буфера с pH менее около 4. В некоторых вариантах реализации pH буфера для элюирования составляет от около 2,5 до около 3,5. В некоторых вариантах реализации pH буфера для элюирования составляет 3,0 ± 0,2. В различных вариантах реализации pH буфера для элюирования составляет или составляет около 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8 или 3,9. Буфер для элюирования может содержать любой подходящий материал для обеспечения pH или диапазона pH, указанного выше. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер содержит уксусную кислоту в концентрации от около 20 до около 60 ммоль. В некоторых вариантах реализации элюирующий буфер содержит уксусную кислоту в концентрации от около 30 моль до около 50 ммоль. В некоторых случаях элюирующий буфер содержит около 40 ммоль уксусной кислоты.After the washing described above, the purified heterodimeric protein is eluted and collected from the affinity matrix in an eluate containing less than about 100 mmol of salt. In various embodiments, the salt concentration in the eluate is or is about 99 mmol, 95 mmol, 90 mmol, 85 mmol, 80 mmol, 75 mmol, 70 mmol, 65 mmol, 60 mmol, 55 mmol, 50 mmol, 45 mmol, 40 mmol , 35 mmol, 30 mmol, 25 mmol, 20 mmol, 15 mmol, 10 mmol, 5 mmol or less, equal to or 0 mmol. Typically, the heterodimeric protein is eluted using a buffer with a pH less than about 4. In some embodiments, the pH of the elution buffer is from about 2.5 to about 3.5. In some embodiments, the pH of the elution buffer is 3.0 ± 0.2. In various embodiments, the pH of the elution buffer is or is about 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3. 4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 or 3.9. The elution buffer may contain any suitable material to provide the pH or pH range specified above. In some embodiments, the elution buffer contains acetic acid at a concentration of from about 20 to about 60 mmol. In some embodiments, the elution buffer contains acetic acid at a concentration of from about 30 moles to about 50 mmol. In some cases, the elution buffer contains about 40 mmol of acetic acid.

В различных вариантах реализации загрузка аффинной матрицы из осветленной клеточной культуры или из нейтрализованного элюата, содержащего гетеродимерный белок, может включать добавление материала с концентрацией до около 75 г/л смолы аффинной матрицы. В различных вариантах реализации аффинная матрица загружена менее или ровно 65 г/л, 60 г/л, 55 г/л или 50 г/л материала.In various embodiments, loading the affinity matrix from a clarified cell culture or from a neutralized eluate containing a heterodimeric protein may involve adding up to about 75 g/L of affinity matrix resin material. In various embodiments, the affinity matrix is loaded with less than or exactly 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, or 50 g/L of material.

В различных вариантах реализации способов, описанных в данном документе, ни диафильтрацию, ни ультрафильтрацию не используют для удаления солей из очищенного гетеродимерного белкового элюата. Разбавление требуемого продукта также не является необходимым для снижения концентрации соли для последующей обработки. Это снижение концентрации соли без разбавления, ультрафильтрации или диафильтрации уменьшает количество оборудование и площадь резервуаров, необходимых для очистки этих биспецифических антител.In various embodiments of the methods described herein, neither diafiltration nor ultrafiltration is used to remove salts from the purified heterodimeric protein eluate. Dilution of the desired product is also not necessary to reduce the salt concentration for subsequent processing. This reduction in salt concentration without dilution, ultrafiltration or diafiltration reduces the amount of equipment and tank space required to purify these bispecific antibodies.

В некоторых вариантах реализации аффинная матрица содержит лиганд (например, белок A), прикрепленный к субстрату. В некоторых случаях субстрат представляет собой шарик или частицу таким образом, что аффинная матрица представляет собой совокупность частиц, прикрепленных к лиганду. В различных вариантах реализации лиганд представляет собой белок A или белок G. Когда лиганд представляет собой белок A, белок A может представлять собой природный или модифицированный стафилококковый белок A, или он может представлять собой сконструированный белок A. Конструированный белок A может представлять собой, например, тетрамер Z-домена, тетрамер Y-домена или сконструированный белок A, в котором отсутствуют домены D и E. Эти сконструированные образцы белка А не способны связываться (или связываться с очень низкой аффинностью, если вообще связываются) с VH3доменом иммуноглобулина, но все же могут связываться с CH3-доменами IgG1, IgG2 и IgG4.In some embodiments, the affinity matrix contains a ligand (eg, protein A) attached to a substrate. In some cases, the substrate is a bead or particle such that the affinity matrix is a collection of particles attached to a ligand. In various embodiments, the ligand is protein A or protein G. When the ligand is protein A, protein A may be natural or modified staphylococcal protein A, or it may be an engineered protein A. The engineered protein A may be, for example, a Z-domain tetramer, a Y-domain tetramer, or an engineered protein A lacking domains D and E. These engineered protein A specimens are unable to bind (or bind with very low affinity, if at all) to the VH3 domain of immunoglobulin, but can still bind to the CH3 domains of IgG1, IgG2 and IgG4.

В некоторых случаях субстрат аффинной матрицы содержит агарозу, полистиролдивинилбензол, полиметакрилат, стекло с заданным размером пор, сферический диоксид кремния, целлюлозу и т.п. илиIn some cases, the affinity matrix substrate contains agarose, polystyrene divinylbenzene, polymethacrylate, controlled pore glass, spherical silica, cellulose, and the like. or

- 11 045004 изготовлен из них. В вариантах реализации, в которых субстрат имеет форму шарика или частицы, средний диаметр частиц составляет от 25 до 100 мкм. В некоторых вариантах реализации средний диаметр частиц составляет от около 40 до около 60 мкм. В некоторых вариантах реализации средний диаметр частиц составляет от около 45 до около 55 мкм. В некоторых вариантах реализации средний диаметр частиц составляет около 40 мкм, 41 мкм, 42 мкм, 43 мкм, 44 мкм, 45 мкм, 46 мкм, 47 мкм, 48 мкм, 49 мкм, 50 мкм, 51 мкм, 52 мкм, 53 мкм, 54 мкм или 55 мкм. В некоторых случаях средний диаметр частиц составляет около 45 мкм. В некоторых случаях средний диаметр частиц составляет около 50 мкм. В некоторых вариантах реализации средний диаметр частиц составляет 35 мкм, 45 мкм, 60 мкм, 75 мкм или 85 мкм. В некоторых вариантах реализации частицы содержат поры, имеющие средний диаметр около 1000 А, 1050 А, 1100 А, 1150 А или 1200 А. В некоторых вариантах реализации частицы содержат поры, имеющие средний диаметр около 1100 А.- 11 045004 is made from them. In embodiments in which the substrate is in the form of a bead or particle, the average particle diameter is from 25 to 100 microns. In some embodiments, the average particle diameter is from about 40 to about 60 microns. In some embodiments, the average particle diameter is from about 45 to about 55 microns. In some embodiments, the average particle diameter is about 40 μm, 41 μm, 42 μm, 43 μm, 44 μm, 45 μm, 46 μm, 47 μm, 48 μm, 49 μm, 50 μm, 51 μm, 52 μm, 53 μm , 54 µm or 55 µm. In some cases the average particle diameter is about 45 µm. In some cases the average particle diameter is about 50 µm. In some embodiments, the average particle diameter is 35 μm, 45 μm, 60 μm, 75 μm, or 85 μm. In some embodiments, the particles comprise pores having an average diameter of about 1000 A, 1050 A, 1100 A, 1150 A, or 1200 A. In some embodiments, the particles contain pores having an average diameter of about 1100 A.

В некоторых вариантах реализации способов гетеродимерный белок представляет собой биспецифическое антитело, содержащее первый полипептид, содержащий СНЗ-домен, который способен связываться с белком A (Fc), и второй полипептид, содержащий СНЗ-домен, который не способен связываться с белком А (Fc*). В некоторых случаях второй полипептид содержит замещение H435R/Y436F (по системе нумерации ЕС; H95R/Y96F по системе нумерации экзонов IMGT) в своем СН3-домене (также известном как Fc* или звездообразное замещение). Таким образом, в некоторых вариантах реализации первый гомодимер представляет собой моноспецифическое антитело, имеющее два незамещенных СН3-домена (т.е. FcFc); второй гомодимер представляет собой моноспецифическое антитело, имеющее два замещенных СН3-домена H435R/Y436F (т.е. Fc*Fc*); и гетеродимерный белок представляет собой биспецифическое антитело, имеющее один незамещенный СН3-домен и один замещенный СН3-домен H435R/Y436F (т.е. Fc*Fc).In some embodiments of the methods, the heterodimeric protein is a bispecific antibody comprising a first CH3 domain-containing polypeptide that is capable of binding to protein A (Fc) and a second polypeptide containing a CH3 domain that is not capable of binding to protein A (Fc* ). In some cases, the second polypeptide contains an H435R/Y436F (EC numbering system; H95R/Y96F IMGT exon numbering system) substitution in its CH3 domain (also known as an Fc* or star substitution). Thus, in some embodiments, the first homodimer is a monospecific antibody having two unsubstituted CH3 domains (ie, FcFc); the second homodimer is a monospecific antibody having two substituted CH3 domains H435R/Y436F (ie Fc*Fc*); and the heterodimeric protein is a bispecific antibody having one unsubstituted CH3 domain and one substituted H435R/Y436F CH3 domain (ie, Fc*Fc).

ПримерыExamples

Пример 1. Очистка биспецифического антитела (BsAb1) CD3xCD20.Example 1. Purification of CD3xCD20 bispecific antibody (BsAb1).

Очистку BsAb1 выполняли в виде двухстадийного процесса, включая стадию хроматографии с аффинным разделением и стадию хроматографии с аффинным захватом. На стадии аффинного разделения биспецифическое антитело захватывается из осветленной кондиционированной среды, тем самым уменьшая объем продукта, повышая концентрацию белка и повышая биспецифическую чистоту за счет удаления гомодимерных соединений Fc*Fc* и FcFc. После элюирования биспецифического антитела в процессе аффинного разделения элюат доводили до более высокого pH (~7,2) для подготовки к последующей повторной загрузке на ту же аффинную колонку с целью замены буфера и инактивации вирусов. На стадии аффинного захвата биспецифическое антитело захватывалось из пула разделения нейтральной аффинности, тем самым уменьшая объем продукта, увеличивая концентрацию белка и удаляя соль из элюата, используемого на стадии аффинного разделения: все это без необходимости ультрафильтрации, диафильтрации или разбавления, что могло бы привести к повышенным требованиям к оборудованию и емкости. На обеих хроматографических стадиях использовали одну и ту же матрицу, содержащую смолу pcc MabSelect SuRe™ (GE Healthcare Life Sciences), которая содержит тетрамер Z-домена.Purification of BsAb1 was performed as a two-step process, including an affinity separation chromatography step and an affinity capture chromatography step. In the affinity separation step, the bispecific antibody is captured from the clarified conditioned medium, thereby reducing the product volume, increasing the protein concentration, and increasing the bispecific purity by removing the Fc*Fc* and FcFc homodimeric compounds. After elution of the bispecific antibody during the affinity separation process, the eluate was adjusted to a higher pH (∼7.2) in preparation for subsequent reloading onto the same affinity column for buffer exchange and virus inactivation. In the affinity capture step, the bispecific antibody was captured from the neutral affinity separation pool, thereby reducing product volume, increasing protein concentration, and removing salt from the eluate used in the affinity separation step: all without the need for ultrafiltration, diafiltration, or dilution, which could lead to increased equipment and capacity requirements. Both chromatographic steps used the same matrix containing pcc MabSelect SuRe™ resin (GE Healthcare Life Sciences), which contains a Z-domain tetramer.

За процессом аффинного захвата следовала инактивация вирусов, которая включала поддержание пула биспецифических антител при pH 3,50-3,65 (с 0,25 ммоль глицина HCl) в течение 30-50 мин. За фильтрацией пула биспецифических антител следовала инактивация вирусов при нейтральном pH.The affinity capture process was followed by virus inactivation, which involved maintaining the bispecific antibody pool at pH 3.50–3.65 (with 0.25 mM glycine HCl) for 30–50 min. Filtration of the bispecific antibody pool was followed by inactivation of the viruses at neutral pH.

Процесс очистки включал стадии аффинного разделения и аффинного захвата, показанные в табл. 1 и 2 соответственно.The purification process included the affinity separation and affinity capture steps shown in Table 1. 1 and 2 respectively.

Таблица 1. Стадии процесса аффинного разделенияTable 1. Stages of the affine separation process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 20 ммоль фосфата натрия, pH 7,2 ± ОД 20 mmol sodium phosphate, pH 7.2 ± OD 2CV 2CV 6 6 Загрузка Loading Осветленная клеточная культура Clarified cell culture < 65,0 г/л смолы < 65.0 g/l resin 6 6 Промывка 1 Flushing 1 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 3CV 3CV 6 6 Промывка 2 Flushing 2 20 ммоль фосфата натрия, pH 7,2 ± 20 mmol sodium phosphate, pH 7.2 ± 2 СУ 2 SU 6 6

- 12 045004- 12 045004

0,1 0.1 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, 500 ммоль NaCl, pH 4,10 ± 0,05 40 mmol acetic acid, 500 mmol NaCl, pH 4.10 ± 0.05 6CV 6CV 6 6 Очистка 1 Cleaning 1 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 2CV 2CV 6 6 Очистка 2 Cleaning 2 500 ммоль уксусная кислота, pH 2,45 ± 0,20 500 mmol acetic acid, pH 2.45 ± 0.20 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Таблица 2. Стадии процесса аффинного захватаTable 2. Stages of the affine capture process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 20 ммоль фосфата натрия, pH 7,2 ± од 20 mmol sodium phosphate, pH 7.2 ± od 2CV 2CV 6 6 Загрузка Loading Нейтрализованный пул аффинного разделения Neutralized affine partition pool < 65,0 г/л смолы < 65.0 g/l resin 6 6 Промывка Flushing 20 ммоль фосфата натрия, pH 7,2 ± 0,1 20 mmol sodium phosphate, pH 7.2 ± 0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 3,5 CV 3.5CV 8 8 Очистка Cleaning 500 ммоль уксусной кислоты, pH 2,45 ± 0,20 500 mmol acetic acid, pH 2.45 ± 0.20 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Результаты: многократные циклы очистки дали среднюю биспецифическую чистоту 97,1% с биспецифическим выходом через фильтрацию после инактивации вирусов 92,8% для BsAb1. Было достигнуто снижение проводимости с около 71,79 мСм/см до < 2,0 мСм/см. Сравнимые результаты были достигнуты для BsAb1, причем на стадии элюирования процесса аффинного разделения использовали 500 ммоль CaCl₂ при pH 4,45 вместо хлорида натрия, указанного в табл. 1.Results: Multiple purification cycles yielded an average bispecific purity of 97.1% with a bispecific filtration yield after viral inactivation of 92.8% for BsAb1. A reduction in conductivity from about 71.79 mS/cm to <2.0 mS/cm was achieved. Comparable results were achieved for BsAb1, and at the elution stage of the affinity separation process, 500 mmol CaCl ₂ was used at pH 4.45 instead of the sodium chloride indicated in the table. 1.

Пример 2. Очистка биспецифического антитела (BsAb2) METxMET (различные эпитопы).Example 2: Purification of bispecific antibody (BsAb2) METxMET (various epitopes).

Очистку BsAb2 выполняли в соответствии с процессом, описанным в примере 1, но включали стадии аффинного разделения и аффинного захвата, показанные в табл. 3 и 4, соответственно.Purification of BsAb2 was performed in accordance with the process described in example 1, but included the affinity separation and affinity capture steps shown in table. 3 and 4, respectively.

Таблица 3. Стадии процесса аффинного разделенияTable 3. Stages of the affine separation process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 3CV 3CV 6 6 Загрузка Loading Осветленная клеточная культура Clarified cell culture < 60,0 г/л смолы < 60.0 g/l resin 6 6 Промывка 1 Flushing 1 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 5CV 5CV 6 6 Промывка 2 Flushing 2 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль ацетата, 500 ммоль СаС1₂, pH 4,55 ±0,0540 mmol acetate, 500 mmol CaCl ₂ , pH 4.55 ±0.05 7CV 7CV 6 6 Очистка 1 Cleaning 1 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 2CV 2CV 6 6 Очистка 2 Cleaning 2 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

- 13 045004- 13 045004

Таблица 4. Стадии процесса аффинного захватаTable 4. Stages of the affine capture process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 4CV 4CV 6 6 Загрузка Loading Нейтрализованный пул аффинного разделения Neutralized affine partition pool < 60,0 г/л смолы < 60.0 g/l resin 6 6 Промывка Flushing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 3,5 CV 3.5CV 8 8 Очистка Cleaning 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Результаты: многократные циклы очистки дали среднюю биспецифическую чистоту 96,0 ± 0,7% с биспецифическим выходом через фильтрацию после инактивации вирусов 90,9% для BsAb2. Было достигнуто снижение проводимости с около 70,75 мСм/см до < 2,0 мСм/см.Results: Multiple purification cycles yielded an average bispecific purity of 96.0 ± 0.7% with a bispecific filtration yield after viral inactivation of 90.9% for BsAb2. A reduction in conductivity from about 70.75 mS/cm to <2.0 mS/cm was achieved.

Пример 3. Очистка биспецифического антитела (BsAb3) BCMAxCD3.Example 3: Purification of the bispecific antibody (BsAb3) BCMAxCD3.

Очистку BsAb3 проводили в соответствии с процессом, описанным в примере 1, но включали стадии аффинного разделения и аффинного захвата, показанные в табл. 5 и 6 соответственно.Purification of BsAb3 was carried out in accordance with the process described in example 1, but included the affinity separation and affinity capture steps shown in table. 5 and 6 respectively.

Таблица 5. Стадии процесса аффинного разделенияTable 5. Stages of the affine separation process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCI, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 3CV 3CV 6 6 Загрузка Loading Осветленная клеточная культура Clarified cell culture < 60,0 г/л смолы < 60.0 g/l resin 6 6 Промывка 1 Flushing 1 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCI, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 3CV 3CV 6 6 Промывка 2 Flushing 2 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль ацетата, 500 ммоль СаСЬ, pH 4,55 ±0,05 40 mmol acetate, 500 mmol CaCL, pH 4.55 ±0.05 6CV 6CV 6 6 Очистка 1 Cleaning 1 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ± 0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ± 0.2 2CV 2CV 6 6 Очистка 2 Cleaning 2 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Таблица 6. Стадии процесса аффинного захватаTable 6. Stages of the affine capture process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 4CV 4CV 6 6 Загрузка Loading Нейтрализованный пул аффинного разделения Neutralized affine partition pool < 50,0 г/л смолы < 50.0 g/l resin 6 6 Промывка Flushing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 3,5 CV 3.5CV 8 8 Очистка Cleaning 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Результаты: многократные циклы очистки дали среднюю биспецифическую чистоту 97,4% ± 0,5% с биспецифическим выходом через фильтрацию после инактивации вирусов 93,4% для BsAb3. Было достигнуто снижение проводимости с около 72,80 мСм/см до < 2,0 мСм/см.Results: Multiple purification cycles yielded an average bispecific purity of 97.4% ± 0.5% with a bispecific filtration yield after viral inactivation of 93.4% for BsAb3. A reduction in conductivity from about 72.80 mS/cm to <2.0 mS/cm was achieved.

Пример 4. Очистка биспецифического антитела (BsAb4) BCMAxCD3.Example 4: Purification of the bispecific antibody (BsAb4) BCMxCD3.

Очистку BsAb4 проводили в соответствии с процессом, описанным в примере 1, но включали стадии аффинного разделения и аффинного захвата, показанные в табл. 7 и 8 соответственно.Purification of BsAb4 was carried out in accordance with the process described in example 1, but included the affinity separation and affinity capture steps shown in table. 7 and 8 respectively.

- 14 045004- 14 045004

Таблица 7. Стадии процесса аффинного разделенияTable 7. Stages of the affine separation process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 3CV 3CV 6 6 Загрузка Loading Осветленная клеточная культура Clarified cell culture < 55,0 г/л смолы < 55.0 g/l resin 6 6 Промывка 1 Flushing 1 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 3CV 3CV 6 6 Промывка 2 Flushing 2 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль ацетата, 500 ммоль СаС1г, pH 4,55 ±0,05 40 mmol acetate, 500 mmol CaClg, pH 4.55 ±0.05 6CV 6CV 6 6 Очистка 1 Cleaning 1 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 2CV 2CV 6 6 Очистка 2 Cleaning 2 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Таблица 8. Стадии процесса аффинного захватаTable 8. Stages of the affine capture process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 4CV 4CV 6 6 Загрузка Loading Нейтрализованный пул аффинного разделения Neutralized affine partition pool < 55,0 г/л смолы < 55.0 g/l resin 6 6 Промывка Flushing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 3,5 СУ 3.5 SU 8 8 Очистка Cleaning 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2 СУ 2 SU 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Результаты: многократные циклы очистки дали среднюю биспецифическую чистоту 94,6% ± 1,0% с биспецифическим выходом через фильтрацию после инактивации вирусов 86,0% для BsAb4. Достигнуто снижение проводимости с около 70,78 мСм/см до < 2,0 мСм/см.Results: Multiple purification cycles yielded an average bispecific purity of 94.6% ± 1.0% with a bispecific filtration yield after viral inactivation of 86.0% for BsAb4. A reduction in conductivity from about 70.78 mS/cm to <2.0 mS/cm was achieved.

Пример 5. Очистка биспецифического антитела (BsAb5) PSMAxCD28.Example 5: Purification of bispecific antibody (BsAb5) PSMAxCD28.

Очистку BsAb5 проводили в соответствии с процессом, описанным в примере 1, но включали стадии аффинного разделения и аффинного захвата, показанные в табл. 9 и 10 соответственно.Purification of BsAb5 was carried out in accordance with the process described in example 1, but included the affinity separation and affinity capture steps shown in table. 9 and 10 respectively.

Таблица 9. Стадии процесса аффинного разделенияTable 9. Stages of the affine separation process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 4CV 4CV 6 6 Загрузка Loading Осветленная клеточная культура Clarified cell culture < 55,0 г/л смолы < 55.0 g/l resin 6 6 Промывка 1 Flushing 1 10 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCl, pH 7,2 ±0,1 10 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 5CV 5CV 6 6 Промывка 2 Flushing 2 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль ацетата, 500 ммоль СаСЬ, pH 4,50 ±0,05 40 mmol acetate, 500 mmol CaCL, pH 4.50 ±0.05 7CV 7CV 6 6 Очистка 1 Cleaning 1 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 3CV 3CV 6 6 Очистка 2 Cleaning 2 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

- 15 045004- 15 045004

Таблица 10. Стадии процесса аффинного захватаTable 10. Stages of the affine capture process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ±0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ±0.1 5CV 5CV 6 6 Загрузка Loading Нейтрализованный пул аффинного разделения Neutralized affine partition pool < 58,0 г/л смолы < 58.0 g/l resin 6 6 Промывка Flushing 50 ммоль Трис, pH 7,2 ± 0,1 50 mmol Tris, pH 7.2 ± 0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 3,5 CV 3.5CV 8 8 Очистка Cleaning 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Результаты: многократные циклы очистки дали среднюю биспецифическую чистоту 96,1% ± 0,9% с биспецифическим выходом через фильтрацию после инактивации вирусов 92,4% для BsAb5. Достигнуто снижение проводимости с около 75,09 мСм/см до < 2,0 мСм/см.Results: Multiple purification cycles yielded an average bispecific purity of 96.1% ± 0.9% with a bispecific filtration yield after viral inactivation of 92.4% for BsAb5. A reduction in conductivity from about 75.09 mS/cm to < 2.0 mS/cm was achieved.

Пример 6. Очистка биспецифического антитела (BsAb6) CD22xCD28.Example 6: Purification of CD22xCD28 bispecific antibody (BsAb6).

Очистку BsAb6 проводили в соответствии с процессом, описанным в примере 1, но включали стадии аффинного разделения и аффинного захвата, показанные в табл. 11 и 12 соответственно.Purification of BsAb6 was carried out in accordance with the process described in example 1, but included the affinity separation and affinity capture steps shown in table. 11 and 12 respectively.

Таблица 11. Стадии процесса аффинного разделенияTable 11. Stages of the affine separation process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 40 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCI, pH 7,2 ±0,1 40 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Загрузка Loading Осветленная клеточная культура Clarified cell culture < 55,0 г/л смолы < 55.0 g/l resin 6 6 Промывка 1 Flushing 1 40 ммоль фосфата натрия, 500 ммоль NaCI, pH 7,2 ±0,1 40 mmol sodium phosphate, 500 mmol NaCl, pH 7.2 ±0.1 5CV 5CV 6 6 Промывка 2 Flushing 2 40 ммоль Трис, 10 ммоль ацетата, pH 7,2 ±0,1 40 mmol Tris, 10 mmol acetate, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль ацетата, 500 ммоль СаСЦ, pH 4,55 ±0,05 40 mmol acetate, 500 mmol CaSC, pH 4.55 ±0.05 7CV 7CV 6 6 Очистка 1 Cleaning 1 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ±0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ±0.2 2CV 2CV 6 6 Очистка 2 Cleaning 2 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2CV 2CV 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Таблица 12, Стадии процесса аффинного захватаTable 12, Stages of the affine capture process

Описание Description Раствор Solution Объем Volume Время пребывания (мин) Residence time (min) Уравновешивание Balancing 40 ммоль Трис, 10 ммоль ацетата, pH 7,2 ± 0,1 40 mmol Tris, 10 mmol acetate, pH 7.2 ± 0.1 2,5 CV 2.5CV 6 6 Загрузка Loading Нейтрализованный пул аффинного разделения Neutralized affine partition pool < 60,0 г/л смолы < 60.0 g/l resins 6 6 Промывка Flushing 40 ммоль Трис, 10 ммоль ацетата, pH 7,2 ±0,1 40 mmol Tris, 10 mmol acetate, pH 7.2 ±0.1 2CV 2CV 6 6 Элюирование Elution 40 ммоль уксусной кислоты, pH 3,0 ± 0,2 40 mmol acetic acid, pH 3.0 ± 0.2 3,5 СУ 3.5 SU 8 8 Очистка Cleaning 500 ммоль уксусной кислоты 500 mmol acetic acid 2 СУ 2 SU 6 6

CV - объем колонкиCV - column volume

Результаты: многократные циклы очистки дали среднюю биспецифическую чистоту 96,5% ± 0,7% с биспецифическим выходом через фильтрацию после инактивации вирусов 92,8% для BsAb6. Было достигнуто снижение проводимости с около 71,78 мСм/см до < 2,0 мСм/см.Results: Multiple purification cycles yielded an average bispecific purity of 96.5% ± 0.7% with a bispecific filtration yield after viral inactivation of 92.8% for BsAb6. A reduction in conductivity from about 71.78 mS/cm to <2.0 mS/cm was achieved.

Claims

Example 7: Improving the quality of the product obtained by affinity desalting compared to ultrafiltration/diafiltration (UFDF)

Measurements of high molecular weight (HMW) compounds present in the BsAb1 (CD3xCD20) composition demonstrate the additional benefit of using re-coating of the purified heterodimer product onto an existing affinity column compared to the use of ultrafiltration/diafiltration (UFDF). As shown in the table below. 13, reapplying the purified bispecific antibody to the existing affinity column further reduced the HMW of the compound by 0.88%, while the use of UFDF increased the HMW of the same purified bispecific antibody by 0.12%.

______Table 13. Changes in high-molar compounds______

Removing salt Loading HMW% Pool HMW% ΔHMW%

UFDF 0.73 0.85 +0.12

Reapplying to an Affinity Chromatography Column 4.78 3.90 -0.88

The scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described herein. On the contrary, various modifications of the invention other than those described herein will become apparent to those skilled in the art upon examination of the foregoing description. These modifications are intended to be included within the scope of the appended claims.

CLAIM

1. A method for purifying a heterodimeric protein, including:

(a) introducing a mixture of the heterodimeric protein and impurities into an affinity matrix containing a protein-binding ligand, wherein the heterodimeric protein contains first and second polypeptides with different affinities for the protein-binding ligand, and wherein at least one impurity binds the protein-binding ligand and at least one impurity does not bind a protein-binding ligand;

(b) washing the affinity matrix with a first wash buffer containing a salt at a concentration greater than 200 mmol and a first pH between 5 and 9 to remove impurities;

(c) eluting and collecting the heterodimeric protein from the affinity matrix in a first elution buffer containing a salt concentration of greater than 200 mmol and a second pH of 4 to 5 to obtain the purified heterodimeric protein in the first eluate;

(d) washing the affinity matrix with a second wash buffer having a third pH of less than 4 to remove impurities;

(e) equilibrating the affinity matrix to a fourth pH of 5 to 9;

(f) neutralizing the first eluate to a pH of 5 to 9, followed by reapplying the first eluate to the affinity matrix;

(g) washing the affinity matrix with a third wash buffer containing less than 100 mmol of salt; and (h) eluting and collecting the purified heterodimeric protein in a second eluate, wherein the second eluate contains less than 100 mmol of salt.

2. Method according to claim 1, characterized in that the third wash buffer contains less than 50 mmol of salt.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the impurities contain homodimeric compounds of the first and second polypeptides.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the protein-binding ligand is protein A, and the affinity matrix contains a protein A ligand attached to the substrate.

5. The method according to claim 4, characterized in that the protein A ligand is an engineered protein A containing a Z-domain tetramer, an engineered protein A containing a Y-domain tetramer, or an engineered protein A lacking D- and E- domains.

6. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the protein-binding ligand is a G protein and the affinity matrix contains a G protein ligand attached to a substrate.

7. The method according to any one of claims 4-6, characterized in that the substrate is a particle, and the affinity matrix contains a collection of particles having an average diameter from 25 to 100 μm.

8. The method according to claim 7, characterized in that the particles have an average diameter from 40 to 60 microns.

9. Method according to claim 8, characterized in that the particles have an average diameter from 45 to 55 microns.

10. The method according to claim 9, characterized in that the particles have an average diameter of about 50 microns.

- 17 045004

11. A method according to any one of claims 4 to 10, characterized in that the substrate contains any one or more of agarose, poly(styrene divinylbenzene), polymethacrylate, cellulose, controlled pore glass and spherical silica.

12. Method according to any one of claims 4-11, characterized in that the particles contain pores having an average diameter of about 1100A.

13. Method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the first elution buffer contains salt in a concentration of more than 250 mmol.

14. The method according to claim 13, characterized in that the salt concentration is more than 300 mmol or more than 400 mmol.

15. Method according to claim 14, characterized in that the salt concentration is about 500 mmol.

16. Method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the salt is selected from a salt containing:

(i) Cl', Br ^- , I ^- , NO ₃ -, N(CH ₃ ) ₄ ⁺ , NH4 ⁺ , Cs ⁺ , Rb ⁺ , K ⁺ , Na ⁺ , H ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Al ³⁺ ;

(ii) combinations of Na ⁺ , H ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ or Al ³⁺ with Cl ^- , Br ^- , I ^- , NO3 ^- , or ClO4 ^- , or (iii) CaCl2, MgCl2 or NaCl.

17. Method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the second eluate contains less than 50 mmol of salt.

18. Method according to claim 17, characterized in that the second eluate contains less than 10 mmol of salt.

19. Method according to any one of claims 1 to 18, characterized in that the purified heterodimeric protein is eluted and collected in a second eluate by means of a third wash buffer.

20. The method according to any one of claims 1 to 19, characterized in that the first polypeptide contains a CH3 domain that is capable of binding to a protein-binding ligand, and the second polypeptide contains a CH3 domain that is not capable of binding to a protein-binding ligand.

21. The method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the first polypeptide contains a CH3 domain that is capable of binding to protein A, and the second polypeptide contains a CH3 domain that is not capable of binding to protein A.

22. The method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the first polypeptide contains a CH3 domain that is capable of binding to the G protein, and the second polypeptide contains a CH3 domain that is not capable of binding to the G protein.

23. The method according to claim 21, characterized in that the second polypeptide contains an HY to RF substitution in its CH3 domain.

24. Method according to any one of claims 1 to 23, characterized in that the first pH is from 6 to 8.

25. Method according to any one of claims 1 to 24, characterized in that the second pH is from 4.0 to 4.25.

26. The method according to claim 25, characterized in that the second pH is 4.10 ± 0.05.

27. Method according to any one of claims 1 to 26, characterized in that the third pH is from 2.8 to 3.5.

28. Method according to any one of claims 1 to 27, characterized in that the fourth pH is from 6 to 8.

29. The method according to any one of claims 1 to 28, further comprising an additional chromatography step or a virus inactivation step after step (h).

30. The method according to claim 29, characterized in that the additional chromatography step or virus inactivation step is carried out under conditions with a salt content of less than 100 mmol.

31. The method according to claim 30, characterized in that the additional chromatography step includes ion exchange chromatography.

32. The method according to claim 31, characterized in that the ion exchange chromatography is anion exchange chromatography and is carried out under conditions with a salt content of less than 50 mmol.

33. The method according to any one of claims 1 to 32, characterized in that the heterodimeric protein is a bispecific antigen-binding protein.

34. The method according to claim 33, characterized in that the bispecific antigen-binding protein is a bispecific antibody.

- 18 045004

Eurasian Patent Organization, EAPO

Russia, 109012, Moscow, Maly Cherkassky lane, 2