EA044699B1 - Терапевтические вакцины против бета-амилоида - Google Patents
Терапевтические вакцины против бета-амилоида Download PDFInfo
- Publication number
- EA044699B1 EA044699B1 EA202092403 EA044699B1 EA 044699 B1 EA044699 B1 EA 044699B1 EA 202092403 EA202092403 EA 202092403 EA 044699 B1 EA044699 B1 EA 044699B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- universal
- cell epitope
- vaccine composition
- peptide
- aci
- Prior art date
Links
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 title claims description 34
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 title claims description 34
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 162
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 150
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 150
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 78
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 76
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 60
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 60
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 60
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 26
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 16
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 15
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 14
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims description 14
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 8
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 7
- 101100309516 Stachybotrys chartarum (strain CBS 109288 / IBT 7711) SAT17 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 4
- 101100256180 Stachybotrys chartarum (strain CBS 109288 / IBT 7711) SAT13 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100309514 Stachybotrys chartarum (strain CBS 109288 / IBT 7711) SAT15 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100095038 Stachybotrys chartarum (strain CBS 109288 / IBT 7711) SAT6 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 claims description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 3
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 43
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 42
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 42
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 35
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 31
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 30
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 19
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 14
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 12
- 239000010408 film Substances 0.000 description 12
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 11
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 11
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 11
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 11
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 7
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 5
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 description 4
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 201000008319 inclusion body myositis Diseases 0.000 description 4
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 206010007509 Cardiac amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 2
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N abts Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007087 memory ability Effects 0.000 description 2
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 2
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SAPODVLQBCAODP-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-3-ethylaniline Chemical compound CCC1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 SAPODVLQBCAODP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 1
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 1
- 108090000613 Cathepsin S Proteins 0.000 description 1
- 102100035654 Cathepsin S Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- -1 Leu Chemical compound 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 102100026450 POU domain, class 3, transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710133389 POU domain, class 3, transcription factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010057517 Strep-avidin conjugated horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000863 loss of memory Toxicity 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007121 neuropathological change Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к терапевтическим вакцинам против бета-амилоида и их применениям для лечения и профилактики заболевания. Вакцины содержат Άβ-производные пептидные Вклеточные антигены и Т-клеточные эпитопы.
Раскрытие настоящего изобретения
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой тяжелое прогрессирующее дегенеративное нарушение, характеризующееся потерей когнитивных функций, включая память, а также потерей способности выполнять обычную повседневную деятельность. AD поражает приблизительно 40 миллионов пациентов во всем мире, и это число быстро растет по мере старения популяции. Основным невропатологическим изменением в головном мозге пациентов с AD является гибель нейронов, в основном в областях, связанных с памятью и когнитивной деятельностью (Soto, 1999). Одним из наиболее ярких патологических признаков AD является обильное присутствие бета-амилоидных (Άβ) бляшек в головном мозге больных (Soto, 1999). Άβ-бляшки образованы пептидом Άβ длиной от 39 до 43 аминокислот, который в своей природной непатологической форме находится в конформации случайной спирали. При переходе в патологическое состояние он трансформируется в основном во вторичную структуру β-листа, спонтанно агрегируя в нерастворимые бляшки.
Немногочисленные доступные в настоящее время терапии для AD рассматриваются как преимущественно симптоматические по своему действию. Несмотря на значительные усилия, прилагаемые в течение многих лет для разработки терапий, на сегодняшний день нет ни одной одобренной терапии, модифицирующей AD. Были предприняты попытки разработать иммунотерапевтическое средство, которое бы нейтрализовало патологический Άβ в пораженном головном мозге в течение длительного периода времени (Winblad, 2014). Вакцины обладают преимуществом, стоящим в том, что они стимулируют иммунную систему для выработки пула немного различных, но весьма специфических антител, в то время как ответ может быть вызван повторно дополнительными вакцинациями, если это необходимо.
Однако подход активной иммунизации (вакцинации) против Άβ имеет несколько основных проблем. Бета-амилоид представляет собой, так называемый, аутоантиген, воздействию которого человеческий организм постоянно подвергается. Следовательно, довольно сложно нарушить иммунную толерантность и вызвать иммунный ответ против него. Кроме того, довольно сложно вызвать сильный иммунный ответ на вакцину у пожилых и больных людей, таких как пациенты с AD, из-за их ослабленной иммунной системы и уменьшенного количества иммунных клеток.
Несмотря на эти проблемы, в первоначальном исследовании вакцина на основе полноразмерного Άβ1-42 (AN1792) вызвала иммунный ответ и показала многообещающую эффективность с более медленным снижением когнитивных функций у пациентов, которые получили вакцину, чем у пациентов, получивших плацебо (Gilman, 2005). Однако у 6% подвергнутых лечению пациентов развился менингоэнцефалит, воспалительная реакция, которая, как полагают, является следствием опосредованного Тклетками ответа на полноразмерный Άβ1-42 (Orgogozo, 2003).
Другая известная вакцина против Άβ, ACI-24, содержит последовательность из 15 аминокислот, полностью идентичную человеческой последовательности 1-15 бета-амилоида (WO 2007/068411). Этот пептидный антиген связан с липосомальным носителем с целью стимуляции антител против Άβ, избегая при этом менингоэнцефалита и кровоизлияния (Muhs, 2007, Pihlgren, 2013). Выбор пептида Aβ1-15, служащего в качестве антигена, был основан на том факте, что эта последовательность содержит Вклеточный эпитоп, но не имеет сильного Т-клеточного реакционного сайта полноразмерного Άβ1-42 (Monsonego, 2003), который рассматривается как причина нежелательных воспалительных реакций. Было показано, что ACI-24 действует посредством одновременной активации В-клеточного рецептора, специфичного для Aβ1-15, и Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), активируемых монофосфорил-липидом A (MPLA), адъювантом, присутствующим в вакцине ACI-24 (Pihlgren, 2013).
Άктивация пролиферации и продуцирования иммуноглобулина (Ig) В-клеток происходит путем перекрестного связывания рецептора Ig на поверхности В-клеток. Для того чтобы повысить продукцию антител второй сигнал может быть обеспечен хелперной Т-клеткой, активируемой Т-клеточным эпитопом. Т-клеточные эпитопы, представленные молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) (для человека обозначается как антиген лейкоцитов человека (HLA)) на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АРС), способствуют дифференцировке когнатных хелперных Т-клеток, способных продуцировать IFNy и IL-4. Высвобождение цитокинов и костимулирующие сигналы между активированными Т- и В-клетками усиливают иммунные ответы и переключение классов. После первичной вакцинации необученные Т-клетки пролиферируют и дифференцируют в эффекторные клетки. Небольшая часть этих клеток будет образовывать пул долгоживущих Т-клеток памяти, способных быстро пролиферировать при повторной встрече с когнатным пептидом после повторной вакцинации (Sallusto, 2010). Так называемые универсальные Т-клеточные эпитопы специфичны для Т-клеток, которые присутствуют у подавляющего большинства человеческой популяции. Обычно они происходят из антигенов, которым люди обычно подвергаются в течение своей жизни (например, столбняк, вирус гриппа и т.д.). Способность Т-клеточного эпитопа активировать Т-клетки является результатом по меньшей мере двух взаимо- 1 044699 дополняющих свойств: i) аффинности связывания с бороздкой HLA, означающей силу связывания, а также ii) его способности связывать различные гаплотипы HLA неизбирательным образом, что означает способность охватывать очень разные в отношении различий в экспрессии молекул HLA человеческие популяции.
Существует потребность в разработке вакцины против Ав, обладающей высокой иммуногенностью при сохранении хорошего профиля безопасности. Эта потребность была удовлетворена путем включения универсального Т-клеточного эпитопа в липосомальную вакцину ACI-24. Поскольку вакцина ACI-24 характеризуется присутствием Ae1-15 на поверхности липосомы, включение универсальных Тклеточных эпитопов на поверхность липосомы рассматривалось авторами настоящего изобретения как путь первого выбора для повышения эффективности вакцины. Однако неожиданно было обнаружено, что включение универсальных Т-клеточных эпитопов на поверхность липосомы не привело к повышению (или существенному повышению) эффективности вакцины. Таким образом, как раскрыто в настоящем документе, был принят подход инкапсуляции, который, как было показано, обеспечивает повышенную эффективность. Включение универсального Т-клеточного эпитопа внутрь липосомальной вакцины, как было показано в настоящем документе, повышает (или существенно геморрагия) эффективность вакцины при сохранении хорошего профиля безопасности благодаря активации Т-клеток, которая не направлена на Ав. Однако при разработке такого подхода возникло несколько проблем. Во-первых, разработанные согласно настоящему изобретению универсальные Т-клеточные эпитопы имеют тенденцию быть гидрофобными, что затрудняет инкапсуляцию в липосомах. Во-вторых, с целью повышения иммуногенности часто комбинируют множество универсальных Т-клеточных эпитопов. Однако выход пептидного синтеза и вероятность успеха снижаются по мере увеличения длины пептидов. В-третьих, заряд выбранных универсальных Т-клеточных эпитопов влияет на эффективность инкапсуляции и экспериментальные условия, необходимые для обеспечения инкапсуляции, из-за отрицательно заряженной липосомальной мембраны.
Соответственно настоящее изобретение относится к липосомальной вакцинной композиции, содержащей:
a) β-амилоид (Ав)-производный пептидный В-клеточный антиген, представленный на поверхности липосомы, и
b) пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, инкапсулированный внутри липосомы.
Особенно предпочтительная вакцинная композиция содержит вакцину ACI-24, модифицированную таким образом, что она включает пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, инкапсулированный внутри липосомы. Липосома является примером носителя. Таким образом, носителем обычно является липосома, но он может представлять собой любой носитель, который подходит для представления Ав-производного пептидного антигена на поверхности таким же образом, как это достигается посредством липосомы (в которой Ав-производный пептидный антиген принимает преимущественно конформацию β-листа), а также инкапсулирует пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп. Примеры включают везикулы и корпускулярные тела.
Термин универсальный Т-клеточный эпитоп означает эпитоп, который является специфическим для Т-клеток, которые присутствуют у большей части человеческой популяции. Они обычно происходят из антигенов, которым люди обычно подвергаются в течение своей жизни. Примеры включают антигены, включенные в обычно применяемые вакцины. Конкретными примерами являются Т-клеточные эпитопы, включенные в столбняк, вирус гриппа и дифтерию, а также гемоцианин лимфы улитки (KLH) и вирус Эпштейна-Барр (EBV). Универсальная способность Т-клеточного эпитопа активировать Тклетки является результатом по меньшей мере двух взаимодополняющих свойств: i) аффинности связывания с бороздкой HLA, означающей силу связывания, а также ii) его способности связывать различные гаплотипы HLA неизбирательным образом, что означает способность охватывать очень разные в отношении различий в экспрессии молекул HLA человеческие популяции. Универсальные Т-клеточные эпитопы могут связываться с большинством аллелей МНС класса II, присутствующих е человеческой популяции. Таким образом, универсальные Т-клеточные эпитопы, включенные в вакцинные композиции согласно настоящему изобретению, могут быть способны стимулировать CD4 Т-клеточный ответ. Таким образом, универсальные Т-клеточные эпитопы, включенные в вакцинные композиции согласно настоящему изобретению, могут быть способны стимулировать ответ хелперных Т-клеток, что усиливает продукцию (Ав-специфических) антител В-клетками.
Универсальные Т-клеточные эпитопы, включенные в вакцинные композиции согласно настоящему изобретению, как правило, синтезируют посредством твердофазного синтеза. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления универсальные Т-клеточные эпитопы синтезируют твердофазным синтезом. Эта и другие практические проблемы инкапсуляции означают, что согласно некоторым неограничивающим вариантам осуществления пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, имеет длину не более 85, 80, 75 или 70 аминокислот. Минимальная длина пептида Т-клеточного эпитопа для обеспечения достаточной иммуногенности обычно составляет приблизительно 10 аминокислот. Таким образом, минимальная длина пептида обычно составляет приблизительно 10 аминокислот для обес- 2 044699 печения получения Т-клеточного эпитопа с достаточной иммуногенностью. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид имеет длину по меньшей мере 20 аминокислот. Согласно другим вариантам осуществления пептид имеет длину от 30 до 60 аминокислот, что основано на предпочтительной минимальной длине универсального Т-клеточного эпитопа и предпочтении в пептиде, содержащем по меньшей мере два, три или четыре (связанных) универсальных Т-клеточных эпитопа.
Также было обнаружено, что универсальные Т-клеточные эпитопы, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, обычно являются гидрофобными. Это создает дополнительные проблемы для их синтеза, очистки и инкапсуляции в липосомы из-за их взаимодействия с липидами. Процент гидрофобности вычисляют путем деления общего числа гидрофобных аминокислот (Phe, Ile, Leu, Met, Val, Tip, Ala и Pro) на общее число аминокислот либо в пептиде в целом, содержащем универсальный Т-клеточный эпитоп (при рассмотрении всего пептида), либо в отдельном Т-клеточном эпитопе (при рассмотрении каждого универсального Т-клеточного эпитопа отдельно) и умножения на 100. Гидрофобные аминокислоты в контексте настоящего изобретения определяются как лейцин (Leu), изолейцин (Ile), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp), валин (Val), метионин (Met), пролин (Pro) и аланин (Ala).
Таким образом, в общем, пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, содержит по меньшей мере 30% гидрофобных аминокислот. Это означает, что по меньшей мере 30% аминокислот в пептиде в целом, содержащем универсальный Т-клеточный эпитоп, являются гидрофобными аминокислотами. Большинство протестированных пептидов, содержащих универсальные Т-клеточные эпитопы, содержат до 50% гидрофобных аминокислот. В некоторых случаях пептид может содержать по меньшей мере 35, 40, 45 или 50% гидрофобных аминокислот.
Для повышения уровней иммуногенности предпочтительно, чтобы вакцинная композиция содержала по меньшей мере два разных универсальных Т-клеточных эпитопа, инкапсулированных внутри липосомы. Из-за липосомальной емкости в сочетании с гидрофобностью пептидов и ограничениями синтеза, в идеале, каждый универсальный Т-клеточный эпитоп обычно имеет длину не более 30 аминокислот, предпочтительно не более 20 аминокислот, и еще более предпочтительно представляет собой область длиной приблизительно 10-20 аминокислот. Как поясняется далее в настоящем документе, авторы настоящего изобретения обнаружили, что более длинные универсальные Т-клеточные эпитопы можно эффективно укоротить до длины 10-20 аминокислот при сохранении иммуногенности. Укороченные пептиды были сконструированы путем селекции в последовательности каждого отдельного Т-клеточного эпитопа наиболее иммуногенной более короткой подпоследовательности, обычно длиной приблизительно 15 аминокислот, на основе предсказанных in silico горячих точек Т-клеточного эпитопа. Для выполнения этого анализа доступны различные программные обеспечения, включая платформу для скрининга иммуногенности EpiVax (доступна по ссылке http://www.epivax.com). Другие примеры включают SYFPEITHI (см. Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic: SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics (1999) 50: 213-219; доступна по ссылке http://www.syfpeithi.com), SVMHC (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16844990) и базу данных IEBD (Vita R, Overton JA, Greenbaum JA, Ponomarenko J, Clark JD, Cantrell JR, Wheeler DK, Gabbard JL, Hix D, Sette A, Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 2014 Oct 9. pii: gku938. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25300482; доступна по ссылке http://www.iedb.org/).
Согласно некоторым вариантам осуществления каждый универсальный Т-клеточный эпитоп содержит по меньшей мере 30% гидрофобных аминокислот. Это означает, что по меньшей мере 30% аминокислот в отдельном универсальном Т-клеточном эпитопе являются гидрофобными аминокислотами. Для специфических эпитопов это значение может составлять до 80% гидрофобных аминокислот. В некоторых случаях может быть по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80% гидрофобных аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления максимально может содержаться 80% гидрофобных аминокислот, что означает, что максимальный диапазон может составлять от 30 до 80% гидрофобных аминокислот.
Для того чтобы сбалансировать улучшенную иммуногенность с практическими проблемами инкапсуляции, вакцинная композиция может содержать два, три или четыре разных универсальных Тклеточных эпитопа, инкапсулированных в носителе. Если инкапсулировано большее количество разных универсальных Т-клеточных эпитопов (особенно 3 или 4), их предпочтительно укоротить до длины приблизительно 10-20 аминокислот, как, например, приблизительно 15 аминокислот. Предпочтительно, чтобы множество разных универсальных Т-клеточных эпитопов были включены в один и тот же пептид, который инкапсулируют. Таким образом, синтетические пептидные конструкции, содержащие множество разных универсальных Т-клеточных эпитопов, представляют собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления пептид содержит по меньшей мере два разных универсальных Т-клеточного эпитопа. В более конкретных вариантах осуществления пептид содержит два, три или четыре универсальных Т-клеточных эпитопа. Если в синтетическую пептидную конструкцию включены по меньшей мере два универсальных Т-клеточных эпитопа, они могут быть соединены линкером. Линкер используется для физического соединения универсальных Т-клеточных эпитопов друг с другом таким образом, чтобы не снижать иммуногенность связанных эпитопов. Подходящие линкеры для соединения аминокислот друг с другом хорошо известны в данной об- 3 044699 ласти техники. Предпочтительные линкеры сами по себе являются линкерами на основе аминокислот, то есть пептидными линкерами. Таким образом, они могут соединять универсальные Т-клеточные эпитопы друг с другом посредством пептидных связей. Линкером является линкер, который обеспечивает правильный процессинг универсальных Т-клеточных эпитопов. Презентация антигена молекулами МНС класса II требует проникновения антигенов в эндосомнальный-лизосомальный компартмент. Эти антигены затем процессируются протеолитическими ферментами, среди которых лизосомальные цистеиновые протеазы семейства папаина составляют важную подгруппу. Сгенерированные пептиды связываются с молекулами МНС класса II, и затем презентируются на поверхности профессиональных антигенпрезентирующих клеток (АРС), включая макрофаги, дендритные клетки (DC) и В-клетки (Lutzner and Kalbacher 2008). Таким образом, предпочтительно линкер содержит субстрат для лизосомальной цистеиновой протеазы семейства папаина. Линкер может содержать субстрат для одного или нескольких из катепсина S, катепсина В и катепсина L. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит, состоит по существу из или состоит из по меньшей мере двух или по меньшей мере трех аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислот VVR, TVGLR, KVSVR, PMGAP или PMGLP.
Поэтому пептиды, содержащие два универсальных Т-клеточных эпитопа, могут представлять собой линейные пептиды в форме:
[универсальный Т-клеточный эпитоп 1]-[линкер]-[универсальный Т-клеточный эпитоп 2].
Поэтому пептиды, содержащие три универсальных Т-клеточных эпитопа, могут представлять собой линейные пептиды в форме:
[универсальный Т-клеточный эпитоп 1]-[линкер]-[универсальный Т-клеточный эпитоп 2]-[линкер][универсальный Т-клеточный эпитоп 3].
Поэтому пептиды, содержащие четыре универсальных Т-клеточных эпитопа, могут представлять собой линейные пептиды в форме:
[универсальный Т-клеточный эпитоп 1]-[линкер]-[универсальный Т-клеточный эпитоп 2]-[линкер][универсальный Т-клеточный эпитоп 3]-[линкер]-[универсальный Т-клеточный эпитоп 4].
Необходимо отметить, что линкеры не должны быть одинаковыми между каждой парой связанных универсальных Т-клеточных эпитопов. Таким образом, например, линкер между универсальным Тклеточным эпитопом 1 и универсальным Т-клеточным эпитопом 2 может отличаться от линкера между универсальным Т-клеточным эпитопом 2 и универсальным Т-клеточным эпитопом 3. В случае четырех универсальных Т-клеточных эпитопов каждый из трех линкеров может быть отличным, или два линкера могут быть одинаковыми, а третий линкер может быть другим (в любом порядке). Согласно некоторым вариантам осуществления, где в пептид включено множество линкеров, они все являются одинаковыми.
При разработке подходящих пептидов для инкапсуляции авторы настоящего изобретения исследовали ряд источников универсальных Т-клеточных эпитопов. Согласно некоторым вариантам осуществления универсальные Т-клеточные эпитопы происходят из дифтерийного токсина, столбнячного токсина, вируса Эпштейна-Барр, гемагглютинина вируса гриппа и/или гемоцианина лимфы улитки. Поэтому специфические предпочтительные комбинации универсальных Т-клеточных эпитопов выбраны из:
a) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа дифтерийного токсина и столбнячного токсина;
b) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа вируса Эпштейна-Барр и столбнячного токсина;
c) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа вируса Эпштейна-Барр, столбнячного токсина и гемоцианина лимфы улитки; или
d) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа гемагглютинина вируса гриппа, дифтерийного токсина, столбнячного токсина и вируса Эпштейна-Барр.
Такие комбинации предпочтительно представлены в форме с линкером, как пояснено выше. Во избежание недопонимания, хотя комбинации предпочтительно включены в указанном порядке, они могут быть включены в альтернативном порядке.
Например, если имеется три универсальных Т-клеточных эпитопа А, В и С, они могут быть включены в любом из порядков ABC, АСВ, ВАС, ВСА, CAB или СВА.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к специфическим пептидам, содержащим множество разных универсальных Т-клеточных эпитопов. Такие пептиды предпочтительно включены в вакцинные композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, пептиды, применяемые согласно настоящему изобретению, содержат, состоят по существу из или состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 (SAT42), SEQ ID NO: 2 (SAT43), SEQ ID NO: 3 (SAT44), SEQ ID HET: 4 (SAT47). Композиция этих пептидов пояснена более подробно ниже со ссылкой на табл. 2.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к специфическим пептидам, содержащим один универсальный Т-клеточный эпитоп. Такие пептиды предпочтительно включены в вакцинные композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, пептиды, используемые согласно настоящему изобретению, содержат, состоят по существу из или состоят из аминокислотной по
- 4 044699 следовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5 (SAT6), SEQ ID NO: 6 (SAT13), SEQ ID NO: 7 (SAT15), SEQ ID HET: 8 (SAT17). Композиция этих пептидов поясняется более подробно ниже со ссылкой на табл. 1. Комбинации этих пептидов, при необходимости укороченных до 10-20 аминокислот в длину, также могут быть включены в вакцинные композиции согласно настоящему изобретению. Комбинированные пептиды предпочтительно соединены одним или несколькими линкерами, как определено в настоящем документе.
Ав-производный пептидный антиген представлен на поверхности липосомы. Как правило, это осуществляют путем вставки во внешнюю поверхность липосомы. Вставка во внешнюю поверхность липосомы может быть облегчена путем присоединения Ав-производного пептидного антигена к фрагменту, который вставляется во внешнюю поверхность липосомы. Липосомой может быть любая липосома, которая подходит для представления Ав-производного пептидного антигена на поверхности, а также инкапсулирует пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп. Как правило, этот фрагмент содержит гидрофобный фрагмент для обеспечения вставки в липидный бислой липосомы. Фрагментом может быть любой подходящий фрагмент, но предпочтительно жирная кислота. Жирная кислота может содержать пальмитоильный остаток. Предпочтительная конструкция, как в ACI-24, содержит Авпроизводный пептидный антиген (Ав(1-15) в ACI-24), присоединенный к двум пальмитоильным остаткам в N- и С-концевых областях пептида. Таким образом, пептидный антиген является тетрапальмитоилированным. Этому может способствовать включение двух остатков лизина в N- и С-концевые области Ав-производного пептидного антигена. Остатки лизина пальмитоилированы.
Согласно некоторым вариантам осуществления липосома имеет отрицательный поверхностный заряд, липосома является анионной. Предпочтительно липосома содержит фосфолипиды и, еще более предпочтительно, фосфолипиды содержат димирситоил-фосфатидилхолин (DMPC) и димирситоилфосфатидилглицерин (DMPG). Липосома может дополнительно содержать холестерин. Молярные соотношения этих трех компонентов могут составлять 9:1:7 согласно некоторым вариантам осуществления.
Поэтому наиболее предпочтительная конструкция содержит Ав-производный пептидный антиген, восстановленный в липосоме. Соответственно, эти композиции согласно настоящему изобретению в общем можно обозначить в настоящем документе как липосомальная вакцинная композиция согласно настоящему изобретению.
Ав-производный пептидный антиген вызывает у субъекта В-клеточный ответ. Он представляет собой В-клеточный антиген. Как уже пояснено, Ав бляшки образованы пептидом Ав длиной от 39 до 43 аминокислот, который в своей природной непатологической форме находится в конформации случайной спирали. При переходе в патологическое состояние он трансформируется в основном во вторичную структуру в-листа, спонтанно агрегируя в нерастворимые бляшки. Таким образом, Ав-производный пептидный антиген определен в настоящем документе как пептидный антиген, полученный из (максимум) 43 аминокислот бета-амилоида, но который не является полноразмерным Ав. Более конкретно, Авпроизводный пептидный антиген включает иммунодоминантный В-клеточный эпитоп из Ав(1-42), но не содержит Т-клеточный эпитоп, обнаруживаемый в Ав(1-42). Поэтому согласно некоторым вариантам осуществления Ав-производный пептидный антиген содержит, состоит по существу из или состоит из 13-15 смежных аминокислот из 17 N-концевых аминокислот Ав. Следует отметить, что Ав-производный пептидный антиген может быть предоставлен в контексте более крупной пептидной молекулы, остальная часть которой не происходит из аминокислотной последовательности Ав. Например, пептид может включать дополнительные остатки, такие как остатки лизина, для облегчения пальмитоилирования. Эти остатки обычно находятся на N- и С-концах пептида. В этом контексте термин состоит по существу из означает, что Ав-производный пептидный антиген включает от 13 до 15 смежных аминокислот из 17 Nконцевых аминокислот Ав, но может включать ограниченное число дополнительных остатков, например, четыре остатки лизина, для облегчения пальмитоилирования. Предпочтительный Ав-производный пептидный антиген содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислот 1-15 бета-амилоида, что можно обозначать как Ав(1-15) (WO 2007/068411, ACI-24).
Ав-производный пептидный антиген, включенный в композиции согласно настоящему изобретению, принимает вторичную структуру, которая воспроизводит патологическую форму Ав. Предпочтительно Ав-производный пептидный антиген принимает вторичную структуру, имеющую конформацию в-листа. Еще более предпочтительно Ав-производный пептидный антиген принимает преимущественно конформацию в-листа, когда представлен на поверхности липосомы.
Композиции согласно настоящему изобретению, как правило, содержат по меньшей мере один адъювант. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению содержат два адъюванта. Целью адъюванта (адъювантов) является усиление или стимуляция иммунного ответа у субъекта. Предпочтительно по меньшей мере один адъювант является частью носителя (в отличие от инкапсуляции в носителе). Таким образом, по меньшей мере один адъювант может составлять часть липосомы, он может составлять часть липидного бислоя. Поэтому адъювантом может быть адъювант на основе липида. Адъювант может быть по меньшей мере частично
- 5 044699 представлен на поверхности липосомы, что может быть следствием того, что адъювант является частью липидного бислоя. Согласно другому варианту осуществления один или несколько адъювантов, образующих часть липосомы, могут быть комбинированы с инкапсулируемым адъювантом. Согласно другим вариантам осуществления один или несколько адъювантов, образующих часть липосомы, могут быть смешаны с дополнительным адъювантом (таким как Alum или CpG) при формировании липосом. Носитель (липосома) может функционировать как адъювант при добавлении в липосому монофосфориллипида A (MPLA), причем этот термин охватывает производные MPLA, такие как монофосфорилгексаацил-липид А, 3-деацил (синтетический) (3D-(6-ацил) PHAD®), PHAD® (фосфорилированный гексаацилдисахарид), MPL. Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления композиции дополнительно содержат MPLA. MPLA, как правило, добавляют в ходе образования липосом (как описано ниже). Таким образом, предпочтительные липосомы содержат димирситоил-фосфатидилхолин (DMPC), димирситоил-фосфатидилглицерин (DMPG), холестерин и MPLA. Согласно некоторым вариантам осуществления молярные соотношения этих четырех компонентов могут составлять 9:1:7:0,05.
Другие адъюванты, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, среди прочего включают гидроксид алюминия (Alum) и/или CpG.
Вакцинные композиции согласно настоящему изобретению вводят субъектам для лечения, профилактики, индукции защитного иммунного ответа против или облегчения симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, связанными с бета-амилоидом, или состоянием, характеризующимся потерей когнитивной способности памяти или связанным с ней. Таким образом, вакцинные композиции могут иметь как профилактическое, так и терапевтическое применение. Субъектом является млекопитающее и, как правило, человек.
Связанным с бета-амилоидом заболеванием или состоянием может быть неврологическое нарушение, такое как болезнь Альцгеймера (AD). Другие примеры заболеваний или состояний, связанных с бета-амилоидом, согласно настоящему изобретению включают легкое когнитивное нарушение (MCI), синдром Дауна, кардиальный амилоидоз, церебральную амилоидную ангиопатию (САА), рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, ALS (боковой амиотрофический склероз), диабет у взрослых, миозит с включенными тельцами (IBM), амилоидоз глаза, глаукому, дегенерацию желтого пятна, решетчатую дистрофию и неврит зрительного нерва. Многие из этих состояний характеризуются потерей когнитивной способности памяти или связаны с ней. Таким образом, состояния, характеризующиеся потерей когнитивной способности памяти или связанные с ней, в соответствии с настоящим изобретением включают AD, легкое когнитивное нарушение (MCI), синдром Дауна, кардиальный амилоидоз, церебральную амилоидную ангиопатию (САА), рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, ALS (боковой амиотрофический склероз) и миозит с включенными тельцами (IBM).
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, индукции защитного иммунного ответа против или облегчения симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, связанными с бета-амилоидом, или состоянием, характеризующимся потерей когнитивной способности памяти или связанным с ней, причем способ включает введение субъекту вакцинной композиции согласно настоящему изобретению.
Такие способы также могут быть выполнены в форме медицинского применения вакцинных композиций согласно настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции согласно настоящему изобретению для применения для лечения, профилактики, индукции защитного иммунного ответа против или облегчения симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, связанным с бета-амилоидом, или состоянием, характеризующимся потерей когнитивной способности памяти или связанным с ней, у субъекта.
Подобным образом, настоящее изобретение относится к применению вакцинных композиций согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для применения для лечения, профилактики, индукции защитного иммунного ответа против или облегчения симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, связанным с бета-амилоидом, или состоянием, характеризующимся потерей когнитивной способности памяти или связанным с ней, у субъекта.
Все варианты осуществления в данном документе относятся к таким способам или медицинским применениям, независимо от их способа выполнения. Введение вакцинной композиции согласно настоящему изобретению субъекту приводит к продукции, как правило поликлональных, антител IgG, которые связываются с патологическими формами Ав. Как уже пояснено, эти патологические формы Ав содержат мультимеры в-листа. Поэтому продуцированные антитела можно назвать Авспецифическими антителами.
Способность антитела связывать антиген-мишень в основном регулируется двумя параметрами, аффинностью и авидностью. Аффинность антитела является мерой силы моновалентного взаимодействия между антителом и его антигеном. Авидность антител включает усиление связывания посредством более чем одной точки взаимодействия между антигеном и антителом. Связывающая способность поликлональных сывороток, индуцированная вакцинацией, зависит от обоих вышеупомянутых параметров (Siegrist, 2013). В общем это называют авидностью поликлонального ответа, поскольку очень трудно
- 6 044699 оценить аффинность и авидность независимо друг от друга. Как более подробно пояснено в настоящем документе, см. пример 4 (пункт 4.2), авторы настоящего изобретения разработали анализ ELISA, в котором общее связывание сывороток, содержащих поликлональные антитела, с более низкой и более высокой концентрацией антигена оценивают параллельно (Martineau, 2010). Соотношение между низким и высоким сигналом покрытия (сигнал представляет собой концентрацию связанного антитела) выражен как индекс авидности. Более высокое значение индекса (ближе к 1) указывает на улучшенную общую силу связывания по сравнению с более низким значением индекса (ближе к 0). Увеличение индекса авидности с течением времени указывает на общее созревание авидности индуцированных вакциной антител. В настоящем документе показано (см. пример 4 и фиг. 4), что иммунизация с использованием вакцинных композиций согласно настоящему изобретению, которые содержат инкапсулированный пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, дает улучшенный эффект созревания по сравнению с иммунизацией с использованием ACI-24 (без инкапсулированного пептида, содержащего универсальный Т-клеточный эпитоп).
Вакцинные композиции согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту любым подходящим способом введения. Как известно специалисту, вакцинные композиции можно вводить местным, пероральным, ректальным, назальным или парентеральным (например, внутривенным, внутрикожным, подкожным или внутримышечным) путями. Кроме того, вакцинные композиции могут быть включены в матрицы с замедленным высвобождением, такие как биоразлагаемые полимеры, причем полимеры имплантируют поблизости от или в непосредственной близости от места, где желательна доставка. Однако согласно предпочтительным вариантам осуществления вакцинную композицию вводят внутримышечно или подкожно.
Вакцинные композиции согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту один раз с получением защитного иммунного ответа. Однако согласно некоторым вариантам осуществления вакцинные композиции согласно настоящему изобретению вводят несколько раз одному и тому же субъекту. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать так называемые режимы прайм-буст. Введение вакцины обычно разделяют промежуточным периодом времени продолжительностью по меньшей мере 1 неделя и часто приблизительно 1-12 месяцев. Не желая связывать себя какойлибо конкретной гипотезой полагают, что вполне вероятно, что добавление универсального Тклеточного эпитопа к ACI-24 усиливает иммунный ответ против Ав посредством обеспечения второго сигнала от активированных Т-клеток, специфичных для когнатного Т-клеточного эпитопа. Вакцинные композиции согласно настоящему изобретению представляют собой новый мощный терапевтический подход для профилактики и лечения связанного с бета-амилоидом заболевания или состояния, такого как AD. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый раз вводят одну и ту же вакцинную композицию, что представляет собой гомологичную схему вакцинации. Гомологичная вакцинация относится к режиму иммунизации с использованием одной и той же вакцины как для первичной (первая иммунизация), так и для бустерной (второй или любой последующей иммунизации).
С другой стороны, гетерологичная иммунизация прайм-буст требует, чтобы при первичной и по меньшей мере в некоторых последующих иммунизациях использовались разные вакцины. Согласно некоторым вариантам осуществления вакцинные композиции согласно настоящему изобретению вводят несколько раз одному и тому же субъекту в гетерологичной комбинации прайм-буст с другими вакцинами анти-Ав, несущими пептидные антигены, полученные из любой части белка Ав, которые могут включать пептидные антигены, полученные за пределами Ав(1-15) области. Согласно некоторым вариантам осуществления вакцинные композиции согласно настоящему изобретению вводят несколько раз одному и тому же субъекту в гетерологичной комбинации прайм-буст с другими вакцинами анти-Ав, несущими те же пептидные антигены, которые включены в липосомальные вакцинные композиции согласно настоящему изобретению, которые могут содержать Ав(1-15) пептидные антигены. Согласно некоторым вариантам осуществления вакцинные композиции согласно настоящему изобретению, предпочтительно содержащие Ав (1-15) пептидные антигены, вводят несколько раз одному и тому же субъекту в гетерологичной комбинации прайм-буст с другими анти-Ав вакцинами, несущими соответствующие Ав-производные пептидные антигены, предпочтительно Ав(1-15) пептидные антигены. Примеры антиАв вакцин, которые можно вводить при гетерологичной вакцинации прайм-буст вместе с вакцинными композициями согласно настоящему изобретению, содержащими Ав-производные антигены, включают без ограничения вакцину Аβ(1-15)-PADRE (Agadjanyan et al., 2005; Ghochikyan et al., 2006), вакцину Ав(1-15)-дифтерийный токсоид (DT) или вакцину CRM (WO 2010016912), вакцину на основе тандемного повтора лизин-связанного Ав(1-15) (Maier et al., 2006), вакцину на основе дендримерного Ав(1-15) (Seabrook et al., 2006), вакцину на основе Аβ(1-15)-DT конъюгата (Liu et al. 2013), вакцину на основе Ав(1-6), связанного с бактериофагом QP, покрытым белком (Windblad et al. 2012), вакцину Аβ(1-7)-CRM (Arai et al. 2015), вакцину Nterm Aβ-KLH (Schneeberger et al. 2010).
Кроме того, настоящее изобретение относится к наборам, содержащим вакцинные композиции согласно настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение относится к набору для лечения, профилактики, индукции защитного иммунного ответа против или облегчения симптомов, связан
- 7 044699 ных с заболеванием или состоянием, связанными с бета-амилоидом, или состоянием, характеризующимся потерей когнитивной способности памяти или связанным с ней, содержащему (липосомальную) вакцинную композицию согласно настоящему изобретению, как описано в настоящем документе. Такие наборы могут быть снабжены подходящими инструкциями по применению. Инструкции по применению могут пояснять график введения композиций. Следовательно, наборы могут включать несколько (отдельных) доз вакцинных композиций согласно настоящему изобретению. Инструкции по применению могут дополнительно пояснять условия хранения композиций, особенно в течение периода времени между введением доз вакцинных композиций. Эти наборы могут применяться для всех релевантных способов согласно настоящему изобретения, как раскрыто в настоящем документе.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения липосомальных вакцинных композиций согласно настоящему изобретению. Такие способы могут предусматривать следующие стадии:
a) получение липидной пленки;
b) регидратация липидной пленки в буфере, содержащем пептид, содержащий универсальный Тклеточный эпитоп;
c) получение липосом из регидратированной липидной пленки, которая инкапсулирует пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, с образованием раствора, содержащего липосомы, которые содержат инкапсулированный универсальный Т-клеточный эпитоп;
d) добавление β-амилоид (Ав)-производного пептидного антигена в раствор и поддержание раствора в условиях, приводящих к вставке β-амилоид (Ав)-производного пептидного антигена в липидный бислой липосом.
В настоящем документе приведены примеры таких способов, признаки которых могут быть применены к этим аспектам настоящего изобретения. В общем, способы могут предусматривать образование тонкой липидной пленки с последующей гомогенизацией и экструзией. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления липидную пленку получают путем растворения липида в этаноле и последующего выпаривания этанола в вакууме. Предпочтительные липидные компоненты пояснены в отношении липосомальных вакцинных композиций согласно настоящему изобретению и включают DMPC, DMPG, холестерин и MPLA (в качестве адъюванта). Молярные соотношения этих компонентов могут составлять 9:1:7:0,05. Такие молярные соотношения также применимы к липосомальным вакцинным композициям согласно настоящему изобретению. Возможно потребуется солюбилизация липидных компонентов при повышенной температуре. Повышенная температура может составлять от 40 до 80°C, как например приблизительно 60°C.
На стадии b буфер, используемый для регидратации, может зависеть от используемого пептида, содержащего универсальный Т-клеточный эпитоп. В общем можно использовать любой подходящий буфер. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер включает ацетат натрия или PBS. Если SAT42 должен быть инкапсулирован, то буфером может быть ацетат натрия. Если необходимо инкапсулировать один или несколько из SAT43, SAT44 или SAT47, буфером может быть PBS. Во всех случаях к буферу можно добавить DMSO, как например 5% DMSO. Регидратацию можно проводить при перемешивании образца.
На стадии с липосомы могут быть получены путем встряхивания в присутствии шариков. Можно использовать любые подходящие шарики. Например, шарики могут быть стеклянными. На этой стадии могут образовываться многослойные везикулы, которые впоследствии превращаются в липосомы, содержащие липидный бислой. Это превращение может происходить в течение нескольких, как например 5-15, предпочтительно 10 циклов замораживания-оттаивания. За циклами замораживания-оттаивания может следовать гомогенизация. За этим может последовать экструзия по размеру. Согласно некоторым вариантам осуществления липосомы выдавливаю через поры с диаметром (или максимальным размером) приблизительно 0,08-0,1 мкм. Это может быть осуществлено посредством мембраны, такой как поликарбонатная мембрана. Экструдированные липосомы можно концентрировать, например, используя форму фильтрации, такую как ультрафильтрация.
Стадия d приводит к вставке β-амилоид (Ав)-производного пептидного антигена в липидный бислой липосом. Необходимые условия могут включать перемешивание в течение 10-60 мин, как например приблизительно 30 мин, при температуре 25-35°C, как например приблизительно 30°C. Предпочтительным β-амилоид (Ав)-производным пептидным антигеном является тетрапальмитоилированный пептид, содержащий Ae1-15. Этот пептид включает по два остатка лизина на каждом конце с образованием тетрапальмитоилированного пептида. Пептид можно предварительно растворить в гидрофосфате динатрия перед впрыском в липосомальный раствор.
Способ может дополнительно предусматривать фильтрацию вакцинной композиции в качестве заключительной стадии. Она может быть проведена в стерильных условиях. Фильтрация может быть проведена через мембрану с размером пор 0,2 мкм. Подходящие мембраны включают мембраны из простого полиэфирсульфона (PES), которые могут быть выполнены в форме шприцевого фильтра. Затем полученную вакцинную композицию можно хранить в подходящих условиях до использования, например, в хо
- 8 044699 лодильнике (например, при температуре около 5°C).
Альтернативные способы получения липосомальных вакцинных композиций согласно настоящему изобретению могут основываться на впрыске поперечного потока, как проиллюстрировано в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способам получения липосомальных вакцинных композиций согласно настоящему изобретению путем впрыска поперечного потока. Эти способы могут быть особенно применимы к композициям, инкапсулирующим SAT44 или SAT47. Такие способы могут предусматривать следующие стадии:
a) растворение липидов (и адъюванта, если он основан на липиде), образующих липосомы, в растворе;
b) растворение пептида, содержащего универсальный Т-клеточный эпитоп, в растворе;
c) смешивание растворов со стадий а и b, с использованием модуля впрыска поперечного потока, с образованием промежуточных липосом, которые инкапсулируют пептид, содержащий универсальный Тклеточный эпитоп;
d) экструзию промежуточных липосом через мембрану для уменьшения их размера и полидисперсности;
e) смешивание раствора, содержащего β-амилоид (Ав)-производный пептидный антиген, с раствором, полученным на стадии d, с использованием модуля впрыска поперечного потока, что приводит к вставке β-амилоида (Ав)-производного пептидного антигена в липидный бислой липосом.
В данном документе приведены примеры таких способов, признаки которых могут быть применены к этим аспектам настоящего изобретения. В общих чертах, в способах используют впрыск поперечного потока для инкапсуляции пептида, содержащего универсальный Т-клеточный эпитоп, и для вставки βамилоид (Ав)-производного пептидного антигена в липидный бислой липосом.
На стадии а липиды (которые могут содержать адъювант, такой как адъювант MPLA, как описано в настоящем документе) обычно растворяют в этаноле. Этанолом может быть 90-100% этанол, например, 96% этанол. Растворение можно ускорить при нагревании, например, до температуры от 40 до 80°C, как например приблизительно 60°C. Предпочтительные липидные компоненты пояснены в отношении липосомальных вакцинных композиций согласно настоящему изобретению и включают DMPC, DMPG, холестерин и MPLA (в качестве адъюванта). Молярные соотношения этих компонентов могут составлять 9:1:7:0,05. Такие молярные соотношения также применимы к липосомальным вакцинным композиция согласно настоящему изобретению.
На стадии b пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, растворяют. Пептид можно растворить в подходящем буфере (таком как His-сахарозный буфер) с помощью агитации, такой как обработка ультразвуком, согласно некоторым вариантам осуществления.
На стадии с растворы со стадий а и b смешивают с использованием модуля для впрыска поперечного потока с образованием промежуточных липосом, которые инкапсулируют пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп. Перед этой стадией растворы со стадий а и b могут быть подвергнуты фильтрации. Подходящий размер пор для фильтра может составлять около 0,2 мкм. Растворы можно использовать в любой подходящей концентрации. После фильтрации растворы можно нагреть до температуры от 30 до 60°C, как, например, приблизительно 40°C. Липосомы образуются путем впрыска двух растворов (со стадии а и b) через модуль поперечного потока (где встречаются 2 раствора). Обычно это проводят при определенной скорости потока и температуре, как легко понять специалисту (подходящие температуры указаны выше). Согласно некоторым вариантам осуществления после образования липосом может быть добавлен буфер, обычно для снижения концентрации этанола. Можно использовать любой подходящий буфер, такой как His-сахарозный буфер.
На стадии d промежуточные липосомы экструдируют через мембрану для уменьшения их размера и полидисперсности. Образованные липосомы в растворе инкапсулируют пептид, составляющий универсальный Т-клеточный эпитоп. Можно использовать любую подходящую мембрану. Подходящий размер пор может составлять около 100 нм. Подходящим типом мембраны является поликарбонатная мембрана. Эту стадию можно проводить при любой подходящей температуре, предпочтительно при комнатной температуре (например, приблизительно 25°C). После этой стадии может быть проведена стадия фильтрации, такая как ультра/диафильтрация, для удаления этанола. Для этой стадии можно использовать любую подходящую мембрану, такую как половолоконная мембрана с отсекаемой молекулярной массой приблизительно 500 кДа. Стадию замены буфера можно выполнять в дисперсном буфере. Предпочтительным дисперсным буфером является PBS. PBS может иметь подходящее значение рН, такое как от 6 до 8, в частности, около 6,9. Для этого может потребоваться от 5 до 15, например, приблизительно 10 обменов объема. Перед стадией е липосомы можно разбавить в дисперсном буфере до желаемой концентрации. Желаемая концентрация может находиться в диапазоне 0,1-10 мг/мл, например, приблизительно 1 мг/мл. Перед стадией е содержащий липосомы раствор можно нагреть до подходящей температуры, например, от 30 до 60°C, предпочтительно приблизительно 35°C.
Стадия е предусматривает смешивание раствора, содержащего β-амилоид (Ав) -производный пептидный антиген, с раствором со стадии d с использованием модуля впрыска поперечного потока. Как
- 9 044699 раскрывается в настоящем документе, β-амилоид (Ав)-производный пептидный антиген предпочтительно является липидированным (например, тетрапальмитоилированным), что применяется с соответствующими изменениями. Перед смешиванием β-амилоид (Ав)-производный пептидный антиген обычно растворяют в подходящем буферном растворе, таком как 10% об./мас. раствор Beta-OG в буфере 10 мМ Na2HPO4, рН 11,4. Раствор обычно нагревают до подходящей температуры, например, до температуры от 30 до 80°C, такой как приблизительно 60°C. При необходимости раствор можно дополнительно разбавить для обеспечения подходящей концентрации β-амилоид (Ав)-производного пептидного антигена. Подходящая концентрация может находиться в диапазоне 0,1-10 мг/мл, например, приблизительно 1 мг/мл. Значение рН обычно поддерживают в диапазоне 11-12, например, приблизительно 11, предпочтительно 11,4. Смешивание раствора, содержащего β-амилоид (Ав)-производный пептидный антиген, с раствором со стадии d с использованием модуля впрыска поперечного потока приводит к вставке βамилоид (Аβ)-производного пептидного антигена во внешний липидный бислой липосом. Смесь можно инкубировать в течение фиксированного периода времени при подходящей температуре, чтобы облегчить вставку β-амилоид (Аβ)-производного пептидного антигена в липидный бислой липосом. Подходящий период времени может находиться в диапазоне 20-120 мин, например, приблизительно 30 мин. Подходящая температура может составлять от 30 до 60°C, предпочтительно приблизительно 35°C. Инкубацию можно проводить при агитации, например, при перемешивании.
После стадии е продукт может быть извлечен для включения в композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, продукт может быть составлен в виде липосомальной вакцинной композиции согласно настоящему изобретению. Это может включать стадию ультра/диафильтрации для удаления бета-OG из буферного раствора. Для этой стадии можно использовать любую подходящую мембрану, такую как половолоконная мембрана с отсекаемой молекулярной массой около 500 кДа. Ультра/диафильтрация может предусматривать стадию замены буфера на конечный буфер. Предпочтительным конечным буфером является His-сахарозный буфер, который может содержать 10 мМ гистидин, 250 мМ сахарозу. Для этого может потребоваться от 5 до 15, например, приблизительно 10 обменов объема. Для достижения предпочтительного конечного объема может быть проведена стадия концентрирования. Также может быть проведена стадия заключительной (стерильной) фильтрации. На этой стадии можно использовать картриджный фильтр. Стадию фильтрации можно проводить через фильтр с любым подходящим размером пор, например, приблизительно 0,2 мкм. Фильтрацию можно производить в стерильных условиях. Затем полученную вакцинную композицию можно хранить в подходящих условиях до использования, например, в холодильнике (например, при температуре около 5°C).
Краткое описание чертежей
Фиг 1. (А) Анализ Aβ 1-42-специфических IgG антител посредством ELISA в плазме мышей C57BL/6 на день 21 (ACI-24.046) или день 7 (ACI-24, ACI-24.043, aCi-24.044) до (забор крови до иммунизации) и на дни 7, 21 и 35 после 1ой иммунизации указанными вакцинами (стрелки указывают моменты времени иммунизации). Результаты выражены в виде геометрического среднего значения с доверительным интервалом +/- 95% (CI) в нг/мл для n=5 мышей на группу. Ось X показывает дни обработок/забора крови, а ось Y показывает титры антител, выраженные в нг/мл. (В) Анализ Aβ1-42-специфических IgG антител посредством ELISA в плазме мышей C57BL/6 на день 21 (ACI-24.046) или день 7 (ACI-24, ACI24.043, ACI-24.044) до (забор крови до иммунизации) и день 21 после 1ой иммунизации указанными вакцинами. Результаты выражены в виде геометрического среднего значения с доверительным интервалом +/- 95% CI в нг/мл для n=5 мышей на группу. Статистический критерий среди разных групп на 21 день: критерий Крускала-Уоллиса с множественными сравнениями Данна. * р<0,05; ** р<0,01. Ось X показывает индивидуальную плазму из групп, иммунизированных указанными вакцинами, тогда как ось Y показывает титры антител, выраженные в нг/мл.
Фиг 2. (А) Анализ ингибирования самоассоциации Аβ1-42 посредством анализа ELISA антител IgG в плазме мышей C57BL/6 на день 21 или день 7 до (пунктирные линии) и день 21 после 1ой иммунизации (жирные линии) указанными вакцинами. Результаты выражены в виде среднего значения +/- стандартное отклонение для 5 мышей на группу в отношении процента ингибирования самоассоциации Аβ1-42. Ось X показывает серийные разведения плазмы, тогда как ось Y показывает процент ингибирования самоассоциации Аβ1-42. (В) Ингибирование самоассоциации Аβ1-42, показанное как процент (%) ингибирования на день 21 минус % ингибирования на день -21 или день -7 (базовое значение - забор крови до иммунизации) при разведении плазмы 1/25. Ось X показывает группы, обработанные указанными вакцинами, тогда как ось Y показывает процент ингибирования самоассоциации Аβ1-42 после вычитания базового значения.
Фиг 3. Анализ специфических для олигомера Аβ1-42 антител IgG посредством ELISA в плазме мышей C57BL/6 на день 21 (ACI-24.046) или день 7 (ACI-24, ACI-24.043, ACI-24.044) до и день 21 после 1ой иммунизации указанными вакцинами. Результаты выражены в виде геометрического среднего значения с доверительным интервалом +/- 95% CI в нг/мл для 5 мышей на группу. Статистический критерий среди разных групп на день 21: критерий Крускала-Уоллиса с множественными сравнениями Данна. * р<0,05; ** р<0,01. Ось X показывает группы, иммунизированные указанными вакцинами, тогда как ось
- 10 044699
Y показывает титры антител, выраженные в нг/мл.
Фиг 4. Анализ Αβ1-42 - авидности антител IgG посредством ELISA в плазме мышей C57BL/6 на дни 7 и 21 после 1ой иммунизации указанными вакцинами. Результаты выражены в виде геометрического среднего значения с доверительным интервалом +/- 95% CI для индекса авидности для 5 мышей на группу. Статистический критерий среди разных групп на день 21: критерий Крускала-Уоллиса с множественными сравнениями Данна. * р<0,05; ** р<0,01. Ось X показывает группы, иммунизированные указанными вакцинами, тогда как ось Y показывает индекс авидности.
Фиг 5. Анализ специфических для олигомера Ав антител посредством MSD в сыворотке яванских макак до первой иммунизацией (день 1) и через 1 неделю после третьей иммунизации (день 64) у макак, иммунизированных ACI-24.046 (SAT44, n=8), ACI-24.045 (SAT43, n=4) или ACI-24.043 (SAT47, n=4). Результаты выражены в виде геометрического среднего значения с доверительным интервалом +/- 95% CI в AU/мл. Ось X показывает индивидуальную плазму из групп, иммунизированных указанными вакцинами, тогда как ось Y показывает титры антител, выраженные в AU/мл.
Фиг 6. Анализ Ae 1-42-специфических IgG антител посредством ELISA в плазме мышей C57BL/6 через 7 дней после 3ей иммунизации (день 36) вакцинами ACI-24 и ACI-24.046 (SAT44) (А) или вакцинами ACI-24 и ACI-24.043 (SAT47) (В). Результаты выражены в виде геометрического среднего значения с доверительным интервалом +/- 95% CI в нг/мл для n=10 мышей на группу. Ось X показывает вакцины, использованные для иммунизации каждой конкретной группы, а ось Y показывает титры антител, выраженные в нг/мл. статистический критерий: критерий Манна-Уитни между ACI-24 и указанной вакциной. *р<0,05; **р<0,01, ***р<0,001.
Таблица аббревиатур___________________________________________________________
| ABTS | 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) |
| Αβ | бета-амилоид (abeta) |
| Ас2О | уксусный ангидрид |
| AD | болезнь Альцгеймера |
| АР | щелочная фосфатаза |
| АРС | антигенпрезентирующие клетки |
| BSA | бычий сывороточный альбумин |
| AU/мл | произвольные единицы/мл |
| 01 | доверительный интервал |
| DMF | диметилформамид |
| DMPC | 1,2-димир исто ил-sn - гл и церо-З -фосф ох ол ин |
| DMPG | 1,2-ди миристоил-sn-гл ицеро-3 -фосфорил гл и церин |
- 11 044699
| DMSO | диметилсульфоксид |
| EL1SA | ферментный иммуносорбентный анализ |
| HLA | антиген лейкоцитов человека |
| ВЭЖХ | высокоэффективная жидкостная хроматография |
| НКР | пероксидаза хрена |
| 1g | иммуноглобулин |
| KLH | гемоцианин лимфы улитки |
| MPLA | монофосфорил-липид А |
| мс | масс-спектрометрия |
| MSD | среднемасштабное выявление (Meso Scale Discovery) |
| Ра! 1-15 | тетралал ьмитоил ирован н ы й А β 1 -15 |
| PBS | фосфатно-буферный солевой раствор |
| PES | простой полиэфирсульфои |
| pNPP | п-нитрофен и лфосф ат |
| S.C. | подкожно |
| ТМВ | гетрам етилбензидин |
| TFA | трифторуксусная кислота |
| T1S | 'гр и изопропи лс ил ан |
| TLR4 | Toll-подобный рецептор 4 |
| Beta-OG | н-октил-р-П-глюкопиранозид |
Настоящее изобретение станет более понятно посредством следующих неограничивающих примеров.
Пример 1. Конструирование новых Т-клеточных эпитопов.
Способность Т-клеточного эпитопа активировать Т-клетки (индекс иммуногенности) является результатом двух взаимодополняющих свойств: i) аффинности с HLA, а также ii) его способности связывать различные гаплотипы HLA неизбирательным образом. Оценку in silico (Epivax) нескольких Тклеточных эпитопов различного происхождения выполняли с целью выбора пептидов с наивысшим индексом иммуногенности. На предварительной стадии оценивали 10 различных пептидов разного происхождения (гемоцианин лимфы улитки-KLH, дифтерийный токсин, вирус гриппа, вирус Эпштейна-Барр и вирус герпеса). Пептиды с наилучшим индексом иммуногенности (выше 10) были отобраны на основе их возможной высокой иммуногенности у людей, исходя из их предсказанной аффинности с HLA и охвата гаплотипов HLA (выбранные пептидные последовательности показаны в табл. 1).
- 12044699
Таблица 1
| Название | Последовательность | Происхождение пептида |
| SAT6 | STLEYFI.YDPIFFLHHSNTDRLWAIWQAI. QKYRGKPYNTANCAIVRHDTY (SEQ ID NO 5) | KLH |
| SAT13 | VEmNTEEIVAQSIALSSLMV (SEQ ГО NO: 6) | Дифтерийный токсин |
| SAT15 | roGVKLESMGVYQrLAIYSWASSL (SEQ ГО NO: 7) | Гемагглютинин вируса гриппа |
| SAT17 | VYGGSKTSLYNLRRGTALAI (SEQ ГО NO: 8) | Вирус Эпштейна-Барр |
Согласно результатам скрининга отдельных пептидов конструировали комбинированные смешанные пептиды, состоящие из 2 или 3 иммуногенных Т-клеточных эпитопов разного происхождения (названные SAT42, SAT43 и SAT44), и смешанные пептиды, состоящие из укороченных пептидов (например, SAT47 и SAT43) (табл. 2). Укороченные пептиды конструировали путем выбора в последовательности каждого отдельного Т-клеточного эпитопа наиболее иммуногенной 15-мерной пептидной последовательности на основе предсказанных in silico горячих точек Т-клеточного эпитопа. Задача состояла в увеличении индекса иммуногенности без увеличения размера конечного смешанного пептида из-за ограничений пептидного синтеза и способа инкапсуляции вакцины. Вкратце, выход пептидного синтеза и вероятность успеха снижаются с увеличением длины пептидов, особенно до длины более 30 аминокислот, и, кроме того, пептиды состоят в основном из гидрофобных остатков, как раскрыто в настоящем документе для пептидов Т-клеточных эпитопов. Кроме того, коэффициент инкапсуляции пептида снижается с увеличением длины пептида, поскольку шансы разместить его в просвете липосом уменьшаются по мере увеличения длины пептида. Индекс иммуногенности in silico этих 4 смешанных Т-клеточных эпитопов был очень высоким и, что важно, выше, чем у однокомпонентных пептидов, что подтверждает, что объединение пептидов различного происхождения может улучшить аффинность с HLA и охват гаплотипов HLA (последовательности смешанных Т-клеточных эпитопов приведены в табл. 2).
- 13 044699
Таблица 2
| Название | Последовательность | Модель пептида | Происхождение пептида |
| SAT42 | VHHNTEEIVAQSIALSSLMVPMG APQYIKANSKF1GITEL (SEQIDNO: 1) | SAT13+PMGAP+ Столбнячный токсин | Дифтерийный токе и н+Столбнячный ТОКСИН |
| SAT43 | VYGGSKTSLYNLRRGTALAIVV RQYIKANSKFIGITELVVRPIFFLH HSNTDRLWAI (SEQ ID NO. 2) | SAT17+VVR+ Столбнячный ТОКСИН+ VVR+ SAT6 | Вирус ЭпштейнаБарр+ Столбиячный токсин-!- KLH |
| SAT44 | VYGGSKTSLYNLRRGTALAIVV RQYIKANSKF1G1TEL (SEQIDNO: 3) | SAT17+VVR+ Столбнячный токсин | Вирус ЭпштейнаБарр+ Столбнячный токсин |
| SAT47 | SMGVYQ1LAIYSTVVRIVAQSIAL SSWRYTKANSKFIGVVRLYNLR RGTAL (SEQIDNO: 4) | SAT15+VVR+SA T13+WR*Ctoa6 НЯЧНЫЙ ТОКСИН-!· WR+ SAT 17 | Ге магглютинии вируса гриппа·*· Дифтерийный токе и н-!-СтолбНЯЧ- НЫЙ токсин*- Вирус Эпштейна- Барр |
Пример 2. Синтез и составление вакцины.
Общий способ синтеза и очистки пептида универсального Т-клеточного эпитопа.
Т-клеточные пептиды получали линейным твердофазным пептидным синтезом (SPPS) на 2хлортритиловой смоле с использованием стандартной химической методики Fmoc. Стандартную методику связывания выполняли с использованием 3,0 эквивалентов аминокислоты и связывающего реагента в присутствии 3,0 эквивалентов основания в DMF в течение 1 ч при комнатной температуре. Для сложных для связывания последовательностей применяли двойное связывание с увеличенным временем реакции. После завершения аминокислотного связывания проводили стадию кэппирования ацетилирования с использованием 5,0 эквивалентов Ас2О в пиридине для прекращения нежелательного удлинения пептидной цепи. Смолу промывали DMF, и группу Fmoc удаляли, используя 20% пиперидин в DMF в течение 5 мин. После завершения SPPS выполняли общее удаление защитной группы и отщепляли пептид от смолы с использованием стандартного раствора для отщепления продукта (TFA/TIS/вода) в течение 2 ч при комнатной температуре. Смолу фильтровали и промывали TFA. Затем неочищенный продукт осаждали 10-кратным избыточным объемом холодного простого изопропилового эфира/гексана, и твердое вещество отфильтровывали с использованием стеклянной фритты и сушили в вакууме. Неочищенный пептид очищали на колонке с обращенной фазой С18, используя градиент растворителя А (вода, 0,1% TFA) и растворителя В (ацетонитрил, 0,1% TFA) в системе препаративной ВЭЖХ. Фракции ВЭЖХ, содержащие желаемый пептид с чистотой выше 90%, объединяли, разбавляли водой и подвергали ионному обмену. Желаемые ионообменные фракции лиофилизировали. Идентичность и чистоту конечного пептида определяли и подтверждали посредством анализа ВЭЖХ-МС.
Получение вакцин ACI-24.043/ACI-24.044/ACI-24.045/ACI-24.046/ (тонкая липидная пленка).
Вакцины, содержащие инкапсулированный пептид Т-клеточных эпитопов, получали методом тонких липидных пленок с последующей гомогенизацией и экструзией. Прежде всего посредством солюбилизации DMPC, DMPG (Lipoid, Germany), холестерина и монофосфорилгексаацил-липида А, 3деацилсинтетического или 3D-(6-ацил) PHAD™ (Avanti Polar Lipids, США) при молярных соотношениях 9:1:7:0,05 в этаноле при 60°C, соответственно. Этанол выпаривали на вакуумном роторном испарителе с получением тонкой липидной пленки.
Липидную пленку регидратировали одним из следующих буферов (в зависимости от пептида Т- 14 044699 клеточного эпитопа, который необходимо инкапсулировать):
мМ ацетат натрия, рН 4 (Fluka), 5% DMSO (Sigma Aldrich) в воде MilliQ, содержащий 0,8 мг/мл пептида Т-клеточного эпитопа SAT42, или
0,1 х PBS, рН 7,4, 5% DMSO (все Sigma-Aldrich) в воде MilliQ, содержащий 0,3-0,4 мг/мл пептида Т-клеточного эпитопа SAT43, SAT44 или SAT47.
Раствор осторожно перемешивали в течение 15 мин. Затем образец интенсивно встряхивали в присутствии стеклянных шариков. Полученные многослойные везикулы подвергали 10 циклам замораживания-оттаивания (жидкий N2 и водяная баня при 37°C) и подвергали гомогенизации с последующей последовательной экструзией через поликарбонатные мембраны (Whatman, UK) с размером пор 0,1/0,08 мкм. Обе стадии гомогенизации и экструзии были выполнены с использованием EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canada). Экструдированные липосомы концентрировали ультрафильтрацией, и буфер заменяли на PBS, рН 7,4, посредством диафильтрации (10-кратный обмен). Полученные липосомы разбавляли в PBS, рН 7,4 и нагревали до 30°C перед добавлением Pal1-15.
Тетрапальмитоилированный пептид человека Pal1-15 (Bachem AG, USA) растворяли в 10 мМ Na2HPO4, рН 11,4, в воде MilliQ с 1% β-OG (Sigma-Aldrich, США), впрыскивали в липосомальный раствор при 30°C и перемешивали в течение 30 мин с последующими стадиями концентрирования посредством ультрафильтрации и разбавления в PBS, рН 7,4, посредством диафильтрации. Затем полученные липосомы стерильно фильтровали, пропуская через шприцевые фильтры с мембраной из простого полиэфирсульфона (PES) 0,2 мкм, и хранили при 5°C.
Получение вакцины ACI-24.043 (впрыск поперечного потока).
Липиды (DMPG, DMPC, холестерин и 3D-(6-ацил) PHAD™ (Avanti Polar Lipids, USA)) растворяли в 96% EtOH в нагревательном шкафу при 60°C. После полного растворения липидов раствор фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм в систему впрыска, которую нагревали до 60°C. Подробно, соответствующее количество ACI-24.043 (SAT47) диспергировали в EtOH при комнатной температуре с помощью обработки ультразвуком (концентрация EtOH, как правило, составляет 2% об./об. от конечного раствора SAT47). После завершения диспергирования пептида добавляли His-сахарозный буфер (10 мМ гистидин, 250 мМ сахароза) с достижением массового соотношения лекарственного средства и липида 1/50. Раствор SAT47 фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм (фильтр Sartoscale) в сосуд для впрыска буфера, который затем нагревали до 40°C. Липосомы образовывались в месте впрыска, когда раствор липид/EtOH и впрыскиваемый буфер смешивались. Сразу после образования липосом проводили оперативную стадию разбавления с применением 10 мМ гистидина, 250 мМ сахарозы, для уменьшения концентрации EtOH. Промежуточные липосомы экструдировали через поликарбонатные мембраны с размером пор 100 нм (1 проход) при комнатной температуре. Ультра-/диафильтрацию (UDF) с применением половолоконной мембраны (MWCO: 500 кДа) проводили для удаления EtOH, и буфер обменивали на PBS, рН 6,9 (10 обменов объема). Липосомы SAT47 затем разбавляли с применением дисперсного буфера (PBS, рН 6,9) до общей концентрации липидов, равной 1 мг/мл, и нагревали до 35°C. Pal1-15 растворяли в 10% мас./об. растворе бета-OG в буфере 10 мМ Na2HPO4, рН 11,4, при 60°C, и затем растворяли тем же буфером до конечной концентрации 1 мг/мл. Значение рН доводили до 11,4. После смешивания этих двух растворов с применением модуля впрыска поперечного потока, липосомальную суспензию затем инкубировали при 35°C в течение 30 мин при перемешивании с обеспечением полной вставки Pal1-15. Вторую стадию UDF с применением половолоконной мембраны (MWCO: 500 кДа) проводили для удаления бета-OG и обмена буфера на 10 мМ гистидин, 250 мМ сахарозу (10 обменов объема). Продукт концентрировали до его конечного объема и фильтровали через шприцевые фильтры 0,2 мкм Acrodisc mPES.
Получение вакцины ACI-24.046 (впрыск поперечного потока).
Липиды (DMPG, DMPC, холестерин и 3D-(6-ацил) PHAD™ (Avanti Polar Lipids, USA)) растворяли в 96% EtOH в нагревательном шкафу при 60°C. После полного растворения липидов раствор фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм в систему впрыска, которую нагревали до 60°C. Одновременно ACI-24.046 (SAT44) растворяли в буфере для впрыска (10 мМ гистидина, 250 мМ сахарозы) при 40°C. После завершения растворения SAT44, раствор фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм (Sartoscale) в сосуд для впрыска буфера, который нагревали до 40°C. Липосомы образовывались в месте впрыска, когда раствор липид/EtOH и впрыскиваемый буфер смешивались. Сразу после образования липосом проводили оперативную стадию разбавления с применением 10 мМ гистидина, 250 мМ сахарозы, для уменьшения концентрации EtOH. Промежуточные липосомы экструдировали через поликарбонатные мембраны с размером пор 100 нм (1 проход) при комнатной температуре. Ультра-/диафильтрацию (UDF) с применением половолоконной мембраны (MWCO: 500 кДа) проводили для удаления EtOH, и буфер обменивали на PBS, рН 6,9 (10 обменов объема). Липосомы SAT44 затем разбавляли с применением дисперсного буфера (PBS, рН 6,9) до общей концентрации липидов, равной 1 мг/мл, и нагревали до 35°C. Pal1-15 растворяли в 10% мас./об. растворе бета-OG в буфере 10 мМ Na2HPO4, pH 11,4, при 60°C, и затем растворяли тем же буфером до конечной концентрации 1 мг/мл. Значение рН проверяли и аккуратно доводили до 11,4. После смешивания этих двух растворов с применением модуля для впрыска, липосо- 15 044699 мальную суспензию затем инкубировали при 35°C в течение 30 мин при перемешивании с обеспечением полной вставки Pal1-15. Вторую стадию UDF с применением половолоконной мембраны (MWCO: 500 кДа) проводили для удаления бета-OG и обмена буфера на 10 мМ гистидин, 250 мМ сахарозу (10 обменов объема). Продукт концентрировали до его конечного объема и фильтровали через шприцевые фильтры 0,2 мкм Acrodisc mPES.
Пример 3. Концептуальные (РоС) in vivo исследования иммуногенности вакцин с инкапсулированными Т-клеточными эпитопами.
После успешной инкапсуляции различных Т-клеточных эпитопов иммуногенность вакцин, содержащих инкапсулированные Т-клеточные эпитопы с высоким индексом иммуногенности SAT42, SAT44 и SAT47 (вакцины ACI-24.044, ACI-24.046 и ACI-24.043 соответственно), исследовали in vivo по сравнению с вакциной ACI-24. Мышам C57BL/6 дикого типа вводили в общей сложности три подкожных (s.c.) иммунизации на дни 0, 14 и 28 вакцин ACI-24, ACI-24.044 (с инкапсулированным SAT42), ACI-24.046 (с инкапсулированным SAT44) и ACI-24.043 (с инкапсулированным SAT47). Образцы крови брали на день -21 (ACI-24.046) или день -7 (ACI-24, ACI-24.043, ACI-24.044) (забор крови до иммунизации), и дни 7, 21 и 35 для измерения титров Ae 1-42-специфических IgG посредством ELISA.
Планшеты покрывали 10 мкг/мл пептидной пленки человеческого Ав 1-42 (Bachem, Switzerland) на всю ночь при 4°C. После промывания 0,05% Tween 20/PBS и блокирования с помощью 1% BSA/0,05% Tween/PBS на планшеты добавляли серийные разведения плазмы и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После промывки планшеты инкубировали с конъюгированными с щелочной фосфатазой (АР) антителами против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch, PA, USA) в течение 2 ч при 37°C. После окончательной промывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом АР (pNPP) и считывали при 405 нм с использованием планшетного ридера для ELISA. Результаты выражены со ссылкой на серийные разведения коммерчески доступного антитела (6Е10, Biolegend, UK, кат. № 803002). На фиг. 1А показаны титры Ав 1-42-специфического IgG, индуцированные вакциной ACI-24 с инкапсулированным Т-клеточным эпитопом или без него, в зависимости от времени. Несмотря на то, что вакцина ACI-24 показала самые высокие титры Ae 1-42-специфического IgG на день 7 после 1ой иммунизации, увеличение титров антител наблюдалось после 2-й и 3-й иммунизации, когда Т-клеточный эпитоп был инкапсулирован в вакцине ACI-24.
Результаты, приведенные на фиг. 1В, показывают, что иммунизация вакцинами ACI-24, содержащими инкапсулированные Т-клеточные эпитопы, вызвала увеличение титров Ав-специфических антител по сравнению с ACI-24, что достигло статистической значимости для группы, иммунизированной вакциной ACI-24.043 (с инкапсулированными SAT47).
Вакцины с инкапсулированными SAT42, SAT43, SAT44 или SAT47 были протестированы в исследовании на яванских макаках. Четыре макаки на группу получали подкожно три раза в месяц иммунизацию (день 1, 29 и 57) вакциной ACI-24.044 (инкапсулированный SAT 42 - две группы с 8 макаками в общем), вакциной ACI-24.046 (инкапсулированный SAT 44-2 две группы с 8 макаками в общем), вакциной ACI-24.045 (инкапсулированный SAT 43-4 макаки) или вакциной ACI-24.043 (инкапсулированный SAT 47-4 макаки). Кровь брали перед первой иммунизацией (день 1) и через 1 и 3 недели после каждой иммунизации (дни 8, 22, 36, 50, 64 и 78) для измерения титров Ae 1-42-специфического IgG с помощью ELISA.
Планшеты покрывали с 10 мкг/мл пептидной пленки человеческого Ав1-42 (Bachem, Switzerland) на всю ночь при 4°C. После промывания 0,05% Tween 20/PBS и блокирования с помощью 1% BSA/0,05% Tween 20/PBS на планшеты добавляли 8 двукратных серийных разведений сыворотки и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После промывания планшеты инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) антителом против IgG обезьяны (KPL, кат. № 07411021) в течение 2 ч при 37°C. После промывания планшеты инкубировали с 50 мкл ABTS/H2O2 (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6сульфоновая кислота) (субстрат HRP) и считывали при 405 нм через один час с использованием ридера планшетов для ELISA. Результаты приведены со ссылкой на серийные разведения положительного пула макак, используемого в качестве стандарта.
Иммуногенность вакцин с различными Т-клеточными эпитопами сравнивали с вакциной ACI-24. В табл. 3 показано кратное увеличение титра Ав-специфических антител по сравнению с вакциной ACI-24 через 1 неделю после третьей иммунизации. Все протестированные вакцин: ACI-24.046 (SAT44), ACI24.043 (SAT47) ACI-24.045 (SAT43) и ACI-24.044 (SAT42) вызывали увеличение титров антител по меньшей мере в 7 раз (ACI-24.044 с инкапсулированным SAT42), по сравнению с титрами, индуцированными вакциной ACI-24. Вакцина ACI-24.043 (с инкапсулированным SAT47) и ACI-24.046 (с инкапсулированным SAT44) индуцировали значительно более высокие титры Авспецифических антител по сравнению с ACI-24 через 1 неделю после третьей иммунизации (табл. 3). Каждая из вакцин ACI-24.043 (с инкапсулированным SAT47) и ACI-24.046 (с инкапсулированным SAT44) имеет высокие показатели по Epivax (142,89 и 57,2 соответственно).
- 16 044699
Таблица 3
Кратность увеличения титра Αβ-специфического антитела по сравнению с ACI-24 (1 неделя после третьей иммунизации, день 64)
| Вакцина | ACI-24.046 (инкапсулированный SAT44) | ACI-24.043 (инкапсулированный SAT47) | ACI-24.045 (инкапсулированный SAT43) | ACI-24.044 (инкапсулированный SAT42) |
| кратное увел ичен не титра Αβ- специфичес- кою IgG по сравнению с ACI-24 | 40 р-0,0027 (**) | 144 р-0,0003 (***) | 17 р-0,1408 (ns) | 7 р-0,6003 (ns) |
Статистический критерий: критерий Крускала-Уоллиса с множественными сравнениями Данна. *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001; ns: статистически незначимый.
Согласно результатам, полученным in vivo (фин. 1) с вакцинами ACI-24.046 (инкапсулированный SAT44) и ACI-24.043 (инкапсулированный SAT47), полученными согласно методике тонкой липидной пленки, протестировали иммуногенность in vivo тех же вакцин, полученных согласно методу впрыска поперечного потока. Мышам C57BL/6 дикого типа вводили в общем три подкожные (s.c.) иммунизации на дни 0, 14 и 28 вакцин ACI-24, ACI-24.046 (с инкапсулированным SAT44) или ACI-24.043 (с инкапсулированным SAT47). Образцы крови брали на день -7, 7, 21 и 35 для измерения тиров Αβ1-42специфического IgG посредством ELISA.
Результаты на фиг. 6 показывают, что иммунизация вакцинами ACI-24, содержащими инкапсулированные Т-клеточные эпитопы, вызвала значительное увеличение титров Αβ-специфических антител по сравнению с ACI-24.
Пример 4. Качество индуцированных Αβ-специфических антител.
4.1 . In vitro ингибирование самоассоциации человеческого Αβ1-42.
Качество индуцированных Αβ-специфических антител тестировали in vitro путем измерения ингибирования самоассоциации/агрегации Αβ1-42. Этот анализ основан на способности плазмы мышей до и после иммунизации нарушать естественную предрасположенность человеческого Αβ1-42 к самоассоциации.
Стандартные планшеты для ELISA покрывали 1 мкг/мл Αβ1-42 на всю ночь при 4°С. Планшеты промывали 4 раза с 300 мкл 0,05% Tween 20/PBS. Насыщение достигали добавлением 0,5% BSA/PBS и инкубацией в течение 1 часа при 37°С. После промывки на планшеты добавляли четыре 2-кратных серийных разведения плазмы на 20 мин при комнатной температуре при встряхивании. Биотинилированный Αβ1-42 добавляли в каждую лунку до конечной концентрации 0,1 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. Биотинилированный Αβ1-42 без плазмы использовали в качестве положительного контроля самоассоциации Αβ1-42 (рассматривают как 100% самоассоциации, 0% ингибирования). После стадии промывки планшеты инкубировали с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированной со стрептавидином (R&D Systems, Канада, Ref. 890803), при разведении 1/200 в 0,5% BSA/0,05% Tween 20/PBS в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. После промывания планшеты инкубировали с субстратом Sure Blue Reserve ТМВ (Seracare, кат.№ 5120-0081) в течение 10 мин. Реакцию останавливали стоп-раствором Bethyl (Bethyl Laboratories, Inc, кат.№ El 15), и планшеты считывали при 450 нм с использованием планшетного ридера для ELISA. Процент ингибирования самоассоциации рассчитывали с использованием в качестве эталона биотинилированного Αβ1-42 без плазмы в качестве положительного контроля (0% ингибирования).
Результаты показали, что Αβ-специфические антитела, полученные после 2 иммунизации всеми вакцинами, содержащими Т-клеточный эпитоп, нарушали самоассоциацию Αβ1-42 более эффективно, чем антитела, индуцированные ACI-24 (фиг. 2А). Поскольку плазма перед иммунизацией вызывает базовое ингибирование самоассоциации, процент на 21 день нормализовывали путем вычитания базового значения для плазмы перед иммунизацией. Специфические антитела к Αβ1-42, полученные иммунизацией всеми вакцинами ACI-24, содержащими Т-клеточный эпитоп, показали более высокое ингибирование самоассоциации Αβ1-42 по сравнению с ACI-24, это ингибирование достигло статистической значимости в группе, иммунизированной ACI-24.046 (с инкапсулированным SAT44) (фиг. 2В).
4.2 Образование антител, распознающих Αβ-олигомеры.
- 17044699
Для того чтобы оценить специфичность индуцированных антител у мышей C57BL/6 к связыванию патологического Άβ, ответы IgG, специфического для Aβ 1-42-олигомеров, определяли с помощью ELISA. Планшеты покрывали 10 мкг/мл олигомеров, полученных, как описано ранее (Adolfsson, 2012), на всю ночь при 4°C. После промывания с 0,05% Tween 20/PBS и блокирования с 1% BSA/0,05% Tween 20/PBS на планшеты добавляли серийные разведения плазмы и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После промывки планшеты инкубировали с конъюгированным с щелочной фосфатазой (ΆΡ) антителом против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch, Cat: 115-055-164, PA, USA) в течение 2 часов при 37°C. После окончательной промывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом ΆΡ (pNPP) и считывали при 405 нм, используя планшетный ридер для ELISA. Результаты выражены относительно серийных разведений коммерчески доступного антитела.
Каждый образец тестировали в восьми или четырех двукратных серийных разведениях, начиная с разведения 1/100, 1/400, 1/800 или 1/1600, на основании титров антитела к Ae1-42. Результаты на фиг. 3 показывают, что иммунизация всеми вакцинами ACI-24, содержащими Т-клеточный эпитоп, вызывала увеличение титров антител, специфических для олигомера Άβ1-42, по сравнению с ACI-24, что достигло статистической значимости для группы, иммунизированной вакциной ACI-24.043 (с инкапсулированным SAT47).
Индекс авидности индуцированных антител у мышей C57BL/6 через 7 и 21 день после иммунизации определяли с помощью анализа ELISA. Одну половину стандартного планшета для ELISA покрывали 10 мкг/мл пептидной пленки Άβ1-42, а другую половину покрывали 1 мкг/мл пептидной пленки Άβ142 на всю ночь при 4°C. После промывания с 0,05% Tween 20/PBS и блокирования с 1% BSA/0,05% Tween 20/PBS к обоим покрытиям добавляли восемь 2-кратных серийных разведений плазмы и инкубировали при 37°C в течение двух часов. После стадии промывки планшеты инкубировали с конъюгированным с щелочной фосфатазой (ΆΡ) антителом против мышиного IgG (Jackson ImmunoResearch, Cat: 115-055-164, PA, USA) в течение 2 ч при 37°C. После окончательной промывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом АР (pNPP) и считывали при 405 нм, используя планшетный ридер для ELISA. Результаты выражены относительно серийных разведений коммерчески доступного антитела (6Е10, Biolegend, UK, Cat. 803002).
Для определения индекса авидности рассчитывали AU/мл для каждого образца на обоих покрытиях, используя стандартную кривую, полученную для 10 мкг/мл пептида Ae1-42. Значения оптической плотности от 0,6 до 2,8 использовали для обратного расчета концентрации. Индекс авидности рассчитывали как соотношение между концентрацией антител более низкой покрывающей концентрации (1 мкг/мл пептида Άβ1-42) и насыщенного покрытия (10 мкг/мл пептида Άβ1-42).
Результаты, приведенные на фиг. 4, показывают, что иммунизация всеми вакцинами ACI-24, содержащими Т-клеточный эпитоп, вызывала созревание авидности Άβ 1-42-специфического антитела между 1ой и 2ой иммунизацией (день 7 и день 21, соответственно), что достигло статистической значимости в группах, иммунизированных ACI-24.044 (с инкапсулированным SAT42) и ACI-24.043 (с инкапсулированным SAT47).
Для того чтобы оценить специфичность индуцированных антител у яванских макак к связыванию патологического Άβ, титры Άβ1-42 олигомер-специфического IgG измеряли с помощью технологии Meso Scale Discovery (MSD) на день 64 (1 неделя после третьей иммунизации) в сыворотке яванских макак, иммунизированных вакциной ACI-24.046 (с инкапсулированным SAT44 - 2 группы, всего 8 макак), вакциной ACI-24.045 (инкапсулированный SAT 43-4 макаки) или вакциной ACI-24.043 (инкапсулированный SAT 47-4 макаки). Планшеты MSD со стрептавидином насыщали в течение ночи с 5% блокатора A (MSD, Ref. R93BA-4) при 4°C. На следующий день планшеты промывали 4 раза 0,05% Tween 20/PBS и покрывали 25 мкл захватывающего антитела биотинилированного 6Е10 (Biolegend, Ref. 803008) в PBS при концентрации 0,5 мкг/мл в течение 1 часа при 37°C на шейкере. После промывки планшеты инкубировали с 25 мкл олигомеров Άβ1-42 (Adolfsson, 2012) при 10 мкг/мл в PBS в течение 1 ч при 37°C на шейкере. Планшеты промывали и инкубировали с восемью 2-кратными разведениями сыворотки макак (начальное разведение 1/50 в 1% обезжиренном молоке/0,05% Tween/PBS). Образцы инкубировали 2 часа при 37°C на шейкере. Планшеты промывали 4 раза и добавляли антитело против человеческого IgG, меченное SULFO-TAG (Jackson, Ref. 109-005-098), разведенное 1% обезжиренным молоком/0,05% Tween 20/PBS, в течение 1 ч при 37°C на шейкере. После 4 промывок добавляли буфер для считывания MSD T 2X (MSD, Ref. R92TC-2), и планшеты считывали в течение 5 мин. Результаты выражены относительно серийных разведений пула макак, используемого в качестве стандарта.
Результаты показали, что все протестированные вакцины ACI-24.046 (инкапсулированный SAT44), ACI-24.043 (инкапсулированный SAT47) и ACI-24.045 (инкапсулированный SAT43) вызывали увеличение антител, способных распознавать олигомеры Άβ, на день 64 (1 неделя после иммунизации) по сравнению с днем 1 (перед первой иммунизацией), см. фиг 5.
- 18 044699
Ссылочные источники
Adolfsson О., Pihlgren М., Toni Ν., Varisco Υ., Buccareilo A.L.. Antoniello К., Lohmann S._ Piorkowska K., Gafner V., Atwal J K., Maloney J , Chen M., Gogineni A., Weimer R M., .Mortensen D.L., Friesenhahn M , Ho C , Paul R , Pfeifer A., Muhs A., Watts R J., An effectorreduced anti-p-amyloid (Αβ) antibody with unique ap binding properties promotes neuroprotection and glial enguifment of Αβ. J Neurosci. Jul 11 :32(28):9677-89 (2012).
Agacljanyan M.G., Ghochikyan A., Petrushina I, Vasilevko V., Movsesyan N., Mkrtichyan M., Saing T. and Cribbs DIL, Prototype Alzheimer’s Disease Vaccine Using the Immunodominant В Cell Epitope from β-Amyloid and Promiscuous T Cell Epitope Pan HLA DRBinding Peptide. J Immunol 174 (3) 1580-1586 (2005).
Arai H, Suzuki H, Yoshiyama T. Vanutide cridificar and the QS-21 adjuvant in Japanese subjects with mild to moderate Alzheimer's disease: results from two phase 2 studies. Curr Alzheimer Res. 12(3):242-54 (2015).
Ghochikyan A,, Mkrtichyan M., Petrushina I., Movsesyan N., Karapetyan A., Cribbs D.H., Agadjanyan M.G., Prototype Alzheimer's disease epitope vaccine induced strong Th2-type antiAbeta antibody response with Alum to Quil A adjuvant switch. Vaccine. 20,24(13):2275-82 (2006).
Gilman S , Koller M., Black RS, Jenkins L., Griffith S.G., Fox N.C., Eisner L , Kirby L., Boada Rovira M., Forette F., Orgogozo J.M., Clinical effect of Αβ immunization (AN 1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology 64, 1553-1562 (2005).
Liu B., Frost J.L., Sun J., Fu H., Grimes S., Blackburn P., Lemere C. A., MER5101, a novel Apl-I5:DT conjugate vaccine, generates a robust anti-Αβ antibody response and attenuates Αβ pathology and cognitive deficits in APPswe/PSI AE9 transgenic mice.
J Neurosci. 33(16):7027-37 (2013).
Lutzner N., Kalbacher H., Quantifying Cathepsin S Activity in Antigen Presenting Cells Using a Novel Specific Substrate. J. Biol Chern. Vol. 283 No. 52 p. 36185 (2008).
Maier M., Seabrook T J, Lazo ND., Jiang L., Das P , Janus C, Lemere C A , Short amyloid-beta (Abeta) immunogens reduce cerebral Abeta load and learning deficits in an Alzheimer's disease mouse model in the absence of an Abeta-specific cellular immune response. J Neurosci. 3;26(1 8):4717-28 (2006).
Martineau P, chapter 41: Affinity Measurements by Competition ELISA, Pages 657-665, from book: Antibody engineering, Vol.l; R. Kontermann and S. Diibel (2010)
Monsonego A., Weiner H.L, Immunotherapeutic approaches to Alzheimer's disease. Science 31:302(5646):834-8 (2003).
- 19 044699
Muhs A., Hickman D.T., Pihlgren M., Chuard N., Giriens V., Meerschman C., van der
Auwera 1., van Leuven F., Sugawara M., Weingertner M.-C , Bechinger B., Greferath R., Kolonko
N,, Nagel-Steger L , Riesner D , Brady RO, Pfeifer A., Nicolau C., Liposomal vaccines with conformation-specific amyioid peptide antigens define immune response and efficacy in APP transgenic mice. PNAS, 104 23:9810-9815 (2007).
Orgogozo J.M., Gilman S., Dartigues J.F., Laurent B., Puel M., Kirby L.C., Jouanny P.,
Dubois B., Eisner L., Flitman S., Michel В F., Boada M., Frank A., Hock C., Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abet42 immunization. Neurology 61: 46-54 ¢2003).
Pihlgren M., Silva A B , Madani R, Giriens V , Waeckerie-Men Y., Fettdschoss A.,
Hickman D T , Lopez-Deber MP , NdaoD M , Vukicevic M , Buccareilo A L., Gather V., Chuard
N , Reis P , Piorkowska K., Pfeifer A., Kiindig T.M., Muhs A., Johansen P., TLR4- and TR1Fdependent stimulation of В lymphocytes by peptide liposomes enables T cell-independent isotype switch in mice. Blood. Jan 3; 121 (1):85-94 (2013).
Sailusto F., Lanzavecchia A., Araki K., Ahmed R , From vaccines to memory and back.
Immunity. Oct 29;33(4):451-63 (2010).
Schneeberger A., Mandler M., Mattner F, Schmidt W , AFFITOME® technology in neurodegenerative diseases: the doubling advantage. Hum Vaccin 11.948-52 (2010)
Seabrook T.J., Thomas K., Jiang L., Bloom J , Spooner E., Maier M , Bitan G , Lemere
C.A , Dendrimeric Abetal-15 is an effective immunogen in wiidtype and APP-tg mice. Neurobioi
Aging. 28(6):813-23 (2006).
Siegrist CA, Chapter 2: Vaccine Immunology, Pages 14-32 from book: Vaccine (6th
Edition, 2013).n, Walter A. Orenstein and Paul)
Soto C., Plaque busters: strategies to inhibit amyloid formation in Alzheimer’s disease.
Molecular Medicine Today (vol 5), August 1999.
Winblad В , Graf A., Riviere M E, Andreasen N., Ryan J.M., Active immunotherapy options for Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2014 Jan 30,6( 1):7.
Winblad В , Andreasen N., Minthon L„ Fioesser A., fmbert G., Dumortier T , Maguire
R.P , Blennow К , Lundmark J., Staufenbiel M., Orgogozo J.M , Graf A, Safety, tolerability, and antibody response of active Αβ immunotherapy with CADI06 in patients with Alzheimer's disease: randomised, double-blind, placebo-controlled, first-in-human study. Lancet Neurol. 11(7):597-604(2012).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в области техники настоящего изобретения. Все публикации и патенты, специально упомянутые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки для всех целей, связанных с изобретением.
Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. На самом деле, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и приложенных чертежей. Предполагается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Более того, все аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе, считаются широко применимыми и совместимыми с любыми и всеми другими согласованными вариантами осуществления, включая те, которые взяты из других аспектов изобретения (в том числе по отдельности), подходящим образом.
-
Claims (16)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Липосомальная вакцинная композиция, содержащая:а) β-амилоид (Ав)-производный пептидный антиген, представленный на поверхности липосомы;b) пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, инкапсулированный внутри липосомы, который способен стимулировать ответ хелперных Т-клеток, что усиливает продукцию антител Вклетками;c) адъювант.
- 2. Липосомальная вакцинная композиция по п.1, где пептид, содержащий универсальный Тклеточный эпитоп, содержит по меньшей мере 30% гидрофобных аминокислот.
- 3. Липосомальная вакцинная композиция по п.1 или 2, причем вакцинная композиция содержит по меньшей мере два разных универсальных Т-клеточных эпитопа, которые инкапсулированы внутри липосомы.
- 4. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-3, где каждый универсальный Тклеточный эпитоп имеет длину не более 30 аминокислот, не более 20 аминокислот или не более 10-20 аминокислот.
- 5. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-4, причем вакцинная композиция содержит два, три или четыре разных универсальных Т-клеточных эпитопа, которые инкапсулированы внутри липосомы.
- 6. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-5, где пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, содержит по меньшей мере два разных универсальных Т-клеточных эпитопа.
- 7. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-6, где пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, содержит два, три или четыре универсальных Т-клеточных эпитопа.
- 8. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.3-7, где по меньшей мере два универсальных Т-клеточных эпитопа соединены линкером.
- 9. Липосомальная вакцинная композиция по п.8, где линкер содержит по меньшей мере две аминокислоты, где линкер необязательно содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислот VVR или PMGAP.
- 10. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-9, где универсальные Т-клеточные эпитопы выбраны из:a) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа дифтерийного токсина и столбнячного токсина;b) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа вируса Эпштейна-Барр и столбнячного токсина;c) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа вируса Эпштейна-Барр, столбнячного токсина и гемоцианина лимфы улитки; илиd) комбинации универсального Т-клеточного эпитопа гемагглютинина вируса гриппа, дифтерийного токсина, столбнячного токсина и вируса Эпштейна-Барр.
- 11. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-10, где пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 (SAT42), SEQ ID NO: 2 (SAT43), SEQ ID NO: 3 (SAT44), SEQ ID NO: 4 (SAT47).
- 12. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-10, где универсальный Т-клеточный эпитоп содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5 (SAT6), SEQ ID NO: 6 (SAT13), SEQ ID NO: 7 (SAT15), SEQ ID NO: 8 (SAT17).
- 13. Липосомальная вакцинная композиция, содержащая:a) тетрапальмитоилированный β-амилоид (Ав)-производный пептидный антиген, представленный на поверхности липосомы, который содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислот 1-15 бета-амилоида;b) пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, инкапсулированный внутри липосомы, где пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3 (SAT44) и SEQ ID NO: 4 (SAT47).c) адъювант.
- 14. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-13, где адъювант образует часть липосомы.
- 15. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-14, где адъювант представлен по меньшей мере частично на поверхности липосомы.
- 16. Липосомальная вакцинная композиция по любому из пп.1-15, где адъювант содержит монофосфорил-липид A (MPLA).-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18166659.5 | 2018-04-10 | ||
| EP18202366.3 | 2018-10-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044699B1 true EA044699B1 (ru) | 2023-09-25 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7807175B2 (en) | Therapeutic vaccine | |
| US11124552B2 (en) | Compositions of phosphorylated tau peptides and uses thereof | |
| AU2010224824B2 (en) | Method for therapeutic use | |
| US20150093432A1 (en) | Composition | |
| JP2022529529A (ja) | タウワクチンの異種投与 | |
| US10828351B2 (en) | Anti-abeta therapeutic vaccines | |
| US12005102B2 (en) | Anti-abeta therapeutic vaccines | |
| EA044699B1 (ru) | Терапевтические вакцины против бета-амилоида | |
| CN112165956A (zh) | 抗Aβ治疗性疫苗 | |
| EA044254B1 (ru) | Композиции фосфорилированных тау-пептидов и их применения |