EA044644B1 - COMBINED CANCER THERAPY USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT ACTIVATE NATURAL KILLER CELLS - Google Patents

COMBINED CANCER THERAPY USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT ACTIVATE NATURAL KILLER CELLS Download PDF

Info

Publication number
EA044644B1
EA044644B1 EA202091887 EA044644B1 EA 044644 B1 EA044644 B1 EA 044644B1 EA 202091887 EA202091887 EA 202091887 EA 044644 B1 EA044644 B1 EA 044644B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
cells
chain variable
Prior art date
Application number
EA202091887
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Грегори П. Чан
Энн Ф. Чэунг
Ася ГРИНБЕРГ
Ева Гутьеррес
Уилльям Хани
Николай ВАГТМАНН
Бредли М. Ланд
Бьянка ПРИНЦ
Original Assignee
Драгонфлай Терапьютикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Драгонфлай Терапьютикс, Инк. filed Critical Драгонфлай Терапьютикс, Инк.
Publication of EA044644B1 publication Critical patent/EA044644B1/en

Links

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross references to related applications

Настоящая заявка испрашивает преимущество и приоритет предварительной заявки на патент США № 62/628178, поданной 8 февраля 2018 г., раскрытие которой включено в настоящий документ в качестве ссылки во всей ее полноте для всех целей.This application claims the benefit and priority of U.S. Provisional Patent Application No. 62/628,178, filed February 8, 2018, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.

Область изобретенияField of invention

В настоящем изобретении описана комбинированная терапия рака с помощью мультиспецифического связывающего белка, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном, рецептором NKG2D и CD16 в комбинации со вторым противораковым агентом. Также описаны фармацевтические композиции мультиспецифического связывающего белка и терапевтические способы, применимые для лечения рака в комбинации со вторым противораковым агентом.The present invention describes combination therapy for cancer using a multispecific binding protein that binds to tumor-associated antigen, NKG2D receptor and CD16 in combination with a second anticancer agent. Also described are pharmaceutical compositions of multispecific binding protein and therapeutic methods useful for treating cancer in combination with a second anticancer agent.

Уровень техникиState of the art

Рак продолжает оставаться серьезной проблемой для здоровья, несмотря на значительные исследовательские усилия и научные достижения, сообщаемые в литературе по лечению этого заболевания. Некоторые из наиболее часто диагностируемых видов рака включают рак простаты, рак молочной железы и рак легкого. Рак простаты является наиболее распространенной формой рака у мужчин. Рак молочной железы остается основной причиной смерти у женщин. Текущие варианты лечения этих видов рака не эффективны для всех пациентов и/или могут иметь существенные побочные эффекты. Другие виды рака также остаются сложными для лечения с использованием существующих вариантов лечения.Cancer continues to be a major health problem despite significant research efforts and scientific advances reported in the treatment literature for this disease. Some of the most commonly diagnosed cancers include prostate cancer, breast cancer, and lung cancer. Prostate cancer is the most common form of cancer in men. Breast cancer remains the leading cause of death in women. Current treatment options for these cancers are not effective for all patients and/or may have significant side effects. Other types of cancer also remain difficult to treat with current treatment options.

Противораковые иммунотерапические препараты являются желательными по причине их высокой специфичности и возможности способствовать разрушению раковых клеток с использованием собственной иммунной системы пациента. Слитые белки, такие как биспецифические Т-клеточные рекрутеры, представляют собой противораковые иммунотерапевтические препараты рака, описанные в литературе, которые связываются с опухолевыми клетками и Т-клетками для облегчения разрушения опухолевых клеток. Антитела, которые связываются с определенными опухоль-ассоциированными антигенами и с определенными иммунными клетками, описаны в литературе. См., например, WO 2016/134371 и WO 2015/095412.Anticancer immunotherapy drugs are desirable because of their high specificity and ability to promote the destruction of cancer cells using the patient's own immune system. Fusion proteins such as bispecific T cell recruiters are anticancer cancer immunotherapies described in the literature that bind to tumor cells and T cells to facilitate tumor cell destruction. Antibodies that bind to certain tumor-associated antigens and to certain immune cells are described in the literature. See, for example, WO 2016/134371 and WO 2015/095412.

Естественные клетки-киллеры (NK) являются компонентом врожденной иммунной системы и составляют примерно 15% циркулирующих лимфоцитов. NK-клетки проникают практически во все ткани и первоначально характеризовались своей способностью эффективно убивать опухолевые клетки без необходимости предварительной сенсибилизации. Активированные NK-клетки убивают клетки-мишени посредством аналогичных цитотоксических Т-клеток, то есть через цитолитические гранулы, которые содержат перфорин и гранзимы, а также через пути рецепторов смерти. Активированные NK-клетки также секретируют воспалительные цитокины, такие как IFN-гамма и хемокины, которые способствуют привлечению других лейкоцитов в ткани-мишени.Natural killer (NK) cells are a component of the innate immune system and make up approximately 15% of circulating lymphocytes. NK cells infiltrate virtually all tissues and were initially characterized by their ability to effectively kill tumor cells without the need for prior sensitization. Activated NK cells kill target cells through similar cytotoxic T cell pathways, that is, through cytolytic granules that contain perforin and granzymes, as well as through death receptor pathways. Activated NK cells also secrete inflammatory cytokines, such as IFN-gamma and chemokines, which promote the recruitment of other leukocytes to target tissues.

NK-клетки реагируют на сигналы через различные активирующие и ингибирующие рецепторы на своей поверхности. Например, когда NK-клетки встречают здоровые аутоклетки, их активность ингибируется активацией иммуноглобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров (KIR). Альтернативно, когда NK-клетки встречают чужеродные или раковые клетки, они активируются через свои активирующие рецепторы (например, NKG2D, NCR, DNAM1). NK-клетки также активируются константной областью некоторых иммуноглобулинов через рецепторы CD16 на их поверхности. Общая чувствительность NKклеток к активации зависит от суммы стимулирующих и ингибирующих сигналов.NK cells respond to signals through various activating and inhibitory receptors on their surface. For example, when NK cells encounter healthy self-cells, their activity is inhibited by activation of killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). Alternatively, when NK cells encounter foreign or cancer cells, they are activated through their activating receptors (eg, NKG2D, NCR, DNAM1). NK cells are also activated by the constant region of some immunoglobulins through CD16 receptors on their surface. The overall sensitivity of NK cells to activation depends on the sum of stimulatory and inhibitory signals.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу усиления гибели опухолевых клеток прямо или опосредованно, причем способ включает воздействие на опухоль и естественные клеткикиллеры белка, содержащего: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из: блокатора контрольных точек; цитокина; агониста TLR; агониста STING; химиотерапевтического агента; агента, нацеленного на рак, который взаимодействует со специфическими молекулами в раковых клетках, которые участвуют в росте или выживании раковых клеток, включая, например, ингибиторы киназы, такие как ибрутиниб, вемурафениб или гливек; онколитического вируса; вакцины; радиации; адоптивной терапии NK, которая включает инфузию размноженных ex vivo NK-клеток, адоптивной терапии Т-клетками, которая включает инфузию ex vivo размноженных Т-клеток, включая клетки, которые были модифицированы in vitro для экспрессии химерного антигенного рецептора (например, CAR-T клетки); терапии трансплантации стволовых клеток (SCT) и агента, вызывающего клеточное старение.In one aspect, the present invention provides a method of enhancing the death of tumor cells directly or indirectly, the method comprising exposing the tumor and natural killer cells to a protein comprising: (a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; in combination with a second therapeutic agent selected from: a checkpoint blocker; cytokine; TLR agonist; STING agonist; chemotherapeutic agent; a cancer-targeting agent that interacts with specific molecules in cancer cells that are involved in the growth or survival of cancer cells, including, for example, kinase inhibitors such as ibrutinib, vemurafenib or Gleevec; oncolytic virus; vaccines; radiation; adoptive NK therapy, which involves infusion of ex vivo expanded NK cells, adoptive T cell therapy, which involves infusion of ex vivo expanded T cells, including cells that have been modified in vitro to express a chimeric antigen receptor (eg, CAR-T cells ); stem cell transplant therapy (SCT) and an inducing cellular senescence agent.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16; или состав, содержащий белок; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек,In one aspect, the invention provides a method for treating cancer in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein comprising: (a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; or a composition containing protein; in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker,

- 1 044644 цитокина, агониста TLR, агониста STING, химиотерапевтического агента, агента, нацеленного на рак, онколитического вируса, вакцины, радиации, адоптивной терапии NK, которая включает инфузию размноженных ex vivo NK-клеток, адоптивной терапии Т-клетками, которая включает инфузию ex vivo размноженных Т-клеток, включая клетки, которые были модифицированы in vitro для экспрессии химерного антигенного рецептора (например, CAR-T клетки), терапии трансплантации стволовых клеток (SCT) и агента, вызывающего клеточное старение.- 1 044644 cytokine, TLR agonist, STING agonist, chemotherapeutic agent, cancer-targeting agent, oncolytic virus, vaccine, radiation, adoptive NK therapy, which includes infusion of ex vivo expanded NK cells, adoptive T cell therapy, which includes infusion ex vivo expanded T cells, including cells that have been modified in vitro to express a chimeric antigen receptor (eg, CAR-T cells), stem cell transplant therapy (SCT), and an inducing cellular senescence agent.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с блокатором контрольных точек, выбранным из: антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к KIR, антитела к NKG2A, антитела к LAG3 и антитела к TIM3.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a checkpoint blocker selected from: anti-PD1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-KIR antibodies, anti-NKG2A antibodies, anti-LAG3 antibodies and anti-TIM3 antibodies.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с цитокином, включая интерфероны и интерлейкины, такие как IL-2, IL-15, IL-12, INFa, IL-21, PEG-IL-2 (модифицированный полиэтиленгликолем интерлейкин-2) и гетеродимеры IL15/IL15R.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a cytokine, including interferons and interleukins, such as IL-2, IL-15, IL-12, INFa, IL-21, PEG-IL-2 (polyethylene glycol-modified interleukin-2) and IL15/IL15R heterodimers.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агонистом TLR, выбранным из агониста TLR7, агониста TLR8, агониста TLR7/8, агониста TLR9, агониста TLR4 и агониста TLR3.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a TLR agonist selected from a TLR7 agonist, a TLR8 agonist, a TLR7/8 agonist, a TLR9 agonist, a TLR4 agonist. and a TLR3 agonist.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агонистом STING ADU-S100.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with the STING agonist ADU-S100.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с химиотерапевтическим агентом, включающим алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид, мехлорэтамин, хлорамбуцил, мелфалан, дакарбазин (DTIC), нитрозомочевины, темозоломид (пероральный дакарбазин); антрациклины, такие как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон и валрубицин; разрушители цитоскелета, такие как паклитаксел, наб-паклитаксел, доцетаксел, абраксан и таксотер; эпотилоны; ингибиторы гистондеацетилазы, такие как вориностат и ромидепсин; ингибиторы топоизомеразы I, такие как иринотекан и топотекан; ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид, тенипозид и тафлупозид; ингибиторы киназы, такие как бортезомиб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, вемурафениб и висмодегиб; аналоги нуклеотидов и аналоги-предшественники, такие как азацитидин, азатиоприн, капецитабин; пептидные антибиотики, такие как блеомицин и актиномицин; агенты на основе платины, такие как карбоплатин, цисплатин и оксалиплатин; ретиноиды, такие как третиноин и алитретиноин; и алкалоиды барвинка и их производные, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a chemotherapeutic agent including alkylating agents such as cyclophosphamide, mechlorethamine, chlorambucil, melphalan, dacarbazine (DTIC) , nitrosoureas, temozolomide (oral dacarbazine); anthracyclines such as daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone and valrubicin; cytoskeletal disruptors such as paclitaxel, nab-paclitaxel, docetaxel, abraxane and taxotere; epothilones; histone deacetylase inhibitors such as vorinostat and romidepsin; topoisomerase I inhibitors such as irinotecan and topotecan; topoisomerase II inhibitors such as etoposide, teniposide and tafluposide; kinase inhibitors such as bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib and vismodegib; nucleotide analogs and precursor analogs such as azacitidine, azathioprine, capecitabine; peptide antibiotics such as bleomycin and actinomycin; platinum-based agents such as carboplatin, cisplatin and oxaliplatin; retinoids such as tretinoin and alitretinoin; and vinca alkaloids and their derivatives such as vinblastine, vincristine, vindesine and vinorelbine.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с блокатором контрольных точек, выбранным из ниволумаба, пембролизумаба, атезолизумаба, дурвалумаба, авелумаба, ипилимумаба, тремелимумаба, лирилумаба и монализумаба.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a checkpoint blocker selected from nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, lirilumab and monalizumab.

В настоящем изобретении предлагается способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агони- 2 044644 стом TLR, выбранным из: R848/pe3UKBUMoga, VTX-2337, имиквимода и CpG-олигодезоксинуклеотида.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing tumor cell death and/or a method for treating cancer with a protein comprising: (a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a TLR agonist selected from: R848/pe3UKBUMoga, VTX-2337, imiquimod, and CpG -oligodeoxynucleotide.

В настоящем изобретении предлагается мультиспецифические связывающие белки, которые связываются с опухоль-ассоциированным антигеном на раковой клетке и рецептором NKG2D, и рецептором CD16 на естественных клетках-киллерах для активации естественных клеток-киллеров, фармацевтические композиции, содержащие такие мультиспецифические связывающие белки, и терапевтические способы с применением таких мультиспецифических белков и фармацевтических композиций, в том числе для лечения рака. Такие белки могут взаимодействовать с более чем одним типом рецептора, активирующего NK, и могут блокировать связывание природных лигандов с NKG2D. В определенных вариантах осуществления белок может агонизировать NK-клетки у людей и у других видов, таких как грызуны и/или яванские макаки. Различные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения описаны более подробно ниже.The present invention provides multispecific binding proteins that bind to tumor-associated antigen on a cancer cell and the NKG2D receptor and CD16 receptor on natural killer cells to activate natural killer cells, pharmaceutical compositions containing such multispecific binding proteins, and therapeutic methods with the use of such multispecific proteins and pharmaceutical compositions, including for the treatment of cancer. Such proteins may interact with more than one type of NK-activating receptor and may block the binding of natural ligands to NKG2D. In certain embodiments, the protein can agonize NK cells in humans and in other species, such as rodents and/or cynomolgus monkeys. Various aspects and embodiments of the present invention are described in more detail below.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок может включать первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и Fc-домен антитела, его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16.In some embodiments, the multispecific binding protein may include a first antigen binding site that binds NKG2D; a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and the Fc domain of the antibody, a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen-binding region that binds CD16.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок является трехвалентным, включающим первый и второй антигенсвязывающий участок, оба связывающие один и тот же опухоль-ассоциированный антиген; третий антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; и Fc-домен антитела, часть которого достаточна для связывания CD16.In some embodiments, the multispecific binding protein is trivalent, comprising a first and a second antigen-binding site, both binding the same tumor-associated antigen; a third antigen binding site that binds NKG2D; and the Fc domain of the antibody, part of which is sufficient to bind CD16.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок является четырехвалентным, включающим первый и второй антигенсвязывающий участок, оба связывающие один и тот же опухоль-ассоциированный антиген; третий и четвертый антигенсвязывающий участок, оба связывающие NKG2D; и Fc-домен антитела, часть которого достаточна для связывания CD16.In some embodiments, the multispecific binding protein is tetravalent, comprising a first and a second antigen-binding site, both binding the same tumor-associated antigen; third and fourth antigen binding sites, both binding NKG2D; and the Fc domain of the antibody, part of which is sufficient to bind CD16.

Каждый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи антитела и вариабельный домен легкой цепи антитела (например, расположенный как в антителе или слитый вместе с scFv), или один или более антигенсвязывающих участков могут быть однодоменным антителом, таким как VHH-антитело, такое как антитело верблюдовых, или VNAR-антитело, подобное тем, которые обнаружены у хрящевых рыб. В некоторых случаях опухоль-ассоциированный антиген может быть выбран из группы, состоящей из HER2, CD20, CD33, антигена созревания В-клеток (ВСМА), ЕрСАМ, CD2, CD19, CD25, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, CLL1/CLEC12A, FLT3, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, сМЕТ, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGEА3, В7.1, В7.2, CTLA4, HLA-E и PD-L1.Each antigen binding region may include an antibody heavy chain variable domain and an antibody light chain variable domain (eg, located as in an antibody or fused together with a scFv), or one or more antigen binding regions may be a single domain antibody, such as a VHH antibody, such as an antibody camelids, or a VNAR antibody similar to those found in cartilaginous fish. In some cases, the tumor-associated antigen may be selected from the group consisting of HER2, CD20, CD33, B-cell maturation antigen (BCMA), EpCAM, CD2, CD19, CD25, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, CLL1/ CLEC12A, FLT3, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGEA3, B7.1, B7.2, CTLA4, HLA-E and PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем каждый из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотным последовательностям вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающего участка, раскрытого в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи включает последовательности определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (CDR1), определяющей комплементарность области 2 (CDR2) и определяющей комплементарность области 3 (CDR3) и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, как описано в табл. 1 антигенсвязывающего участка.In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein each of the heavy chain variable domain and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%) identical to the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the antigen binding region disclosed in table. 1. In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises heavy chain complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2), and complementarity determining region 3 (CDR3) sequences and light chain CDR1, CDR2, and CDR3 sequences, as described in table 1 antigen binding site.

Например, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 48). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 92), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 58), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 113); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 60), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 61), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.For example, in some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 47, and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 48). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises the sequence A CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 92), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 58), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 113); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence , represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 60), the CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 61), and the CDR3 sequence, represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 47, and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%

- 3 044644 или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 48). В некоторых вариантах осуществления, вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 92), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 58), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 93); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 61), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 62). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 57), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 58), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 59); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 60), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 61), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.- 3 044644 or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 48). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 92), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 58), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 93); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 61), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 62). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 57), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 58), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 59 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 60), a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 61), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 47), и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 48). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 92), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 58), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 104); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 60), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 61), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 62). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 57), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 58), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 103); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 60), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 61), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 47), and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 48). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 92), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 58), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 104 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 60), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 61), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 62). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 57), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 58), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 103 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 60), a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 61), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 45) и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 46). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 90), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 52), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 91); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 54), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 55), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 56). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 51), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 52), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 53); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 54), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 55), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56.In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 45) and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 46). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 90), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 52), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 91 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 54), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 55), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 56). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 51), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 52), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 53 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 54), a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 55), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем ваIn some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein both

- 4 044644 риабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 49 и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 50). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 94), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 64), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 95; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 66), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 67), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 68). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 63), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 64), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 65); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 66), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 67), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68.- 4 044644 the heavy chain riable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% (for example, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 49 and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 50). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 94), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 64), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 66), a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 67), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 68). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 63), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 64), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 65 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 66), a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 67), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 114 и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 115. В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 122), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 117), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 123); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 119), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 120), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 121). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 116), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 117), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 118); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 119), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 120), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 121).In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 114 and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 115. In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 122), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 117), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 123); and the light chain variable domain contains a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 119), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 120), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 121). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 116), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 117), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 118 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 119), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 120), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 121).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 124) и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 125). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 122), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 117), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 130); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 127), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 128), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 129). В некоторых вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 116), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 117), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 126); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 127), последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательно- 5 044644 стью (SEQ ID NO: 128), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 129).In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 124) and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 125). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 122), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 117), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 130 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 127), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 128), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 129). In some embodiments, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 116), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 117), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 126 ); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 127), a CDR2 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 128), and a CDR3 sequence represented by an amino acid sequence (SEQ ID NO: 129).

В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1).In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain containing at least 90% amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or 100%) identical to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 42).In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 42).

В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 43) и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 44).In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 43) and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 44).

В некоторых вариантах осуществления, антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 69) и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 70).In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 69) and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical amino acid sequence (SEQ ID NO: 70).

В некоторых вариантах осуществления+ антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71 и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72.In some embodiments, the antigen binding region that binds NKG2D comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises at least 90% of the amino acid sequence (e.g., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 and the light chain variable domain contains at least 90% amino acid sequence (e.g., 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения рака у пациента. Способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества описанного в настоящем документе мультиспецифического связывающего белка для лечения рака. Типовые виды рака для лечения с использованием мультиспецифических связывающих белков включают, например, карциному, экспрессирующую HER2.In another aspect of the present invention, there is provided a method for treating cancer in a patient. The method includes administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a multispecific binding protein described herein for the treatment of cancer. Exemplary cancers for treatment using multispecific binding proteins include, for example, HER2-expressing carcinoma.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На фиг. 1 представлен мультиспецифический связывающий белок, содержащий NKG2Dсвязывающий домен (правое плечо), опухоль-ассоциированный антигенсвязывающий домен (левое плечо) и Fc-домен или его часть, которая связывается c CD16.In fig. 1 shows a multispecific binding protein containing an NKG2D binding domain (right arm), a tumor-associated antigen binding domain (left arm), and an Fc domain or part thereof that binds CD16.

На фиг. 2 представлен мультиспецифический связывающий белок, содержащий NKG2Dсвязывающий домен в формате scFv (правое плечо), опухоль-ассоциированный антигенсвязывающий домен (левое плечо) и Fc-домен или его часть, которые связываются с CD16.In fig. 2 shows a multispecific binding protein containing an NKG2D binding domain in scFv format (right arm), a tumor-associated antigen binding domain (left arm), and an Fc domain or part thereof that binds CD16.

На фиг. 3 представлен TriNKET в форме триомаба, который представляет собой трифункциональное биспецифическое антитело, которое имеет IgG-подобную форму. Эта химера состоит из двух полуантител, каждое с одной легкой и одной тяжелой цепью, которые происходят от двух родительских антител. Форма триомаба представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 1/2 антитела крысы и V2 антитела мыши.In fig. 3 presents TriNKET in the form of triomab, which is a trifunctional bispecific antibody that has an IgG-like form. This chimera consists of two half-antibodies, each with one light and one heavy chain, which are derived from two parent antibodies. The triomab form is a heterodimeric construct containing 1/2 rat antibodies and mouse V 2 antibodies.

На фиг. 4 представлен TriNKET в форме общей легкой цепи (LC), в которой используется технология выступы-во-впадины (KIH). KiH представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, и FC, стабилизированный мутациями гетеродимеризации. TriNKET в формате KiH может быть гетеродимерной конструкцией с 2 fab, связывающимися с мишенью 1 и мишенью 2, содержащей 2 разных тяжелых цепи и общую легкую цепь, которая спаривается с обоими HC.In fig. 4 shows TriNKET in a common light chain (LC) form that uses knob-in-jaw (KIH) technology. KiH is a heterodimer containing 2 Fabs binding to target 1 and target 2, and an F C stabilized by heterodimerization mutations. TriNKET in KiH format can be a heterodimeric construct with 2 fabs binding to target 1 and target 2 containing 2 different heavy chains and a common light chain that pairs with both HCs.

На фиг. 5 представлен TriNKET в форме иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig™), который объединяет домены связывания мишеней двух моноклональных антител через гибкие природные линкеры и приводит к четырехвалентной IgG-подобной молекуле. DVD-Ig™ представляет собой гомодимерную конструкцию, в которой вариабельный домен, нацеленный на антиген 2, слит с N-концом вариабельного домена Fab, нацеленного на антиген 1. Конструкция содержит нормальный Fc.In fig. 5 presents TriNKET in the form of dual variable domain immunoglobulin (DVD-Ig™), which combines the target binding domains of two monoclonal antibodies through flexible natural linkers and results in a tetravalent IgG-like molecule. DVD-Ig™ is a homodimeric construct in which the antigen 2-targeting variable domain is fused to the N-terminus of the antigen 1-targeting Fab variable domain. The construct contains normal Fc.

- 6 044644- 6 044644

На фиг. 6 представлен TriNKET в форме ортогональной поверхности Fab (Ortho-Fab), который представляет собой гетеродимерную конструкцию, которая содержит 2 Fab-фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Спаривание LC-HC обеспечивается ортогональной поверхностью.In fig. 6 shows TriNKET in the form of an orthogonal surface Fab (Ortho-Fab), which is a heterodimeric construct that contains 2 Fab fragments binding to target 1 and target 2 fused to an Fc. LC-HC pairing is mediated by an orthogonal surface.

Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в Fc.Heterodimerization is mediated by mutations in Fc.

На фиг. 7 представлен TrinKET в формате 2 в 1Ig.In fig. 7 shows TrinKET in 2 in 1Ig format.

На фиг. 8 представлен TriNKET в формате ES, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 разных Fab-фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с FC. Гетеродимеризация обеспечивается электростатической мутацией в Fc.In fig. 8 shows TriNKET in ES format, which is a heterodimeric construct containing 2 different Fab fragments binding to target 1 and target 2 fused to F C . Heterodimerization is mediated by electrostatic mutation in Fc.

На фиг. 9 представлен TriNKET в форме обмена Fab-фрагментами: антитела, которые обмениваются Fab-фрагментами путем замены тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полумолекулы) на пару тяжелых-легких цепей из другой молекулы, что приводит к образованию биспецифических антител. Форма обмена Fab-фрагментами (cFae) представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и FC, стабилизированными мутациями гетеродимеризации.In fig. 9 represents TriNKET in the form of Fab exchange: antibodies that exchange Fab fragments by replacing the heavy chain and attached light chain (half-molecule) with a heavy-light chain pair from another molecule, resulting in the formation of bispecific antibodies. The Fab fragment exchange form (cFae) is a heterodimer containing 2 target-binding Fabs 1 and 2, and F C stabilized by heterodimerization mutations.

На фиг. 10 представлен TriNKET в форме тела SEED, который представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и FC, стабилизированные мутациями гетеродимеризации.In fig. 10 shows TriNKET in the form of a SEED body, which is a heterodimer containing 2 target-binding Fabs 1 and 2, and F C stabilized by heterodimerization mutations.

На фиг. 11 представлен TriNKET в форме LuZ-Y, в которой лейциновая молния используется для индуцирования гетеродимеризации двух разных НС. Форма LuZ-Y представляет собой гетеродимер, содержащий 2 различных scFab, связывающихся с мишенью 1 и 2, слитых с FC. Гетеродимеризация обеспечивается с помощью мотивов лейциновой молнии, слитых с С-концом FC.In fig. 11 presents TriNKET in the form of LuZ-Y, in which a leucine zipper is used to induce heterodimerization of two different NSs. The LuZ-Y form is a heterodimer containing 2 different target-binding scFabs 1 and 2 fused to F C . Heterodimerization is mediated by leucine zipper motifs fused to the C-terminus of the F C .

На фиг. 12 представлен TriNKET в форме Cov-X-тела.In fig. 12 shows TriNKET in the form of a Cov-X body.

На фиг. 13А-13В представлен TriNKET в формах кλ-тела, которые представляют собой гетеродимерные конструкции с 2 различными Fab, слитыми с Fc, стабилизированными мутациями гетеродимеризации: Fab1, нацелеленный на антиген 1, содержит каппа-LC, тогда как второй Fab, нацеленный на антиген 2, содержит лямбда LC. На фиг. 13А представлено типовое представление одной формы кλ-тела; на фиг. 13В представлено типовое представление другого кλ-тела.In fig. 13A-13B show TriNKET in kλ-body forms, which are heterodimeric constructs with 2 different Fc-fused Fabs stabilized by heterodimerization mutations: Fab1 targeting antigen 1 contains kappa-LC, while the second Fab targeting antigen 2 , contains lambda LC. In fig. 13A is a typical representation of one kλ-body shape; in fig. 13B is a typical representation of another kλ-body.

На фиг. 14 представлен график, демонстрирующий аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D человека в ИФА анализе.In fig. 14 is a graph showing the binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant human NKG2D in an ELISA assay.

На фиг. 15 представлен график, демонстрирующий аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D яванского макака в ИФА анализе.In fig. 15 is a graph showing the binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant cynomolgus NKG2D in an ELISA assay.

На фиг. 16 представлен график, демонстрирующий аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D мыши в ИФА анализе.In fig. 16 is a graph showing the binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant mouse NKG2D in an ELISA assay.

На фиг. 17 представлен график, демонстрирующий связывание NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека, с помощью проточной цитометрии, демонстрирующей среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), кратную по сравнению с фоном.In fig. 17 is a graph showing the binding of NKG2D binding domains (listed as clones) to EL4 cells expressing human NKG2D by flow cytometry showing mean fluorescence intensity (MFI) multiple of background.

На фиг. 18 представлен график, демонстрирующий связывание NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D мыши, с помощью проточной цитометрии, демонстрирующей среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), кратную по сравнению с фоном.In fig. 18 is a graph showing the binding of NKG2D binding domains (listed as clones) to EL4 cells expressing mouse NKG2D by flow cytometry demonstrating mean fluorescence intensity (MFI) multiple of background.

На фиг. 19 представлен график, демонстрирующий специфическую аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D-Fc человека путем конкуренции с природным лигандом ULBP-6.In fig. 19 is a graph showing the specific binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant human NKG2D-Fc by competition with the natural ligand ULBP-6.

На фиг. 20 представлен график, демонстрирующий специфическую аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D-Fc человека путем конкуренции с природным лигандом MICA.In fig. 20 is a graph showing the specific binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant human NKG2D-Fc by competition with the natural MICA ligand.

На фиг. 21 представлен график, демонстрирующий специфическую аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D-Fc человека путем конкуренции с природным лигандом Rae-1 дельта.In fig. 21 is a graph showing the specific binding affinity of NKG2D binding domains (listed as clones) to recombinant human NKG2D-Fc by competition with the natural ligand Rae-1 delta.

На фиг. 22 представлен график, демонстрирующий активацию NKG2D человека посредством NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) путем количественного определения процента TNF-альфа-положительных клеток, которые экспрессируют NKG2D-CD3-дзета слитые белки человека.In fig. 22 is a graph showing activation of human NKG2D by NKG2D binding domains (listed as clones) by quantifying the percentage of TNF-alpha positive cells that express human NKG2D-CD3-zeta fusion proteins.

На фиг. 23 представлен график, демонстрирующий активацию NKG2D мыши посредством NKG2Dсвязывающих доменов (перечисленных в виде клонов) путем количественного определения процента TNF-альфа-положительных клеток, которые экспрессируют NKG2D-CD3-дзета слитые белки мыши.In fig. 23 is a graph showing activation of mouse NKG2D by NKG2D binding domains (listed as clones) by quantifying the percentage of TNF-alpha positive cells that express mouse NKG2D-CD3-zeta fusion proteins.

На фиг. 24 представлен график, демонстрирующий активацию NK-клеток человека NKG2Dсвязывающими доменами (перечисленных в виде клонов).In fig. 24 is a graph showing activation of human NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

На фиг. 25 представлен график, демонстрирующий активацию NK-клеток человека NKG2Dсвязывающими доменами (перечисленных в виде клонов).In fig. 25 is a graph showing activation of human NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

На фиг. 26 представлен график, демонстрирующий активацию NK-клеток мыши NKG2D- 7 044644 связывающими доменами (перечисленных в виде клонов).In fig. 26 is a graph showing activation of mouse NK cells by NKG2D-7044644 binding domains (listed as clones).

На фиг. 27 представлен график, демонстрирующий активацию NK-клеток мыши NKG2Dсвязывающими доменами (перечисленных в виде клонов).In fig. 27 is a graph showing activation of mouse NK cells by NKG2D binding domains (listed as clones).

На фиг. 28 представлен график, демонстрирующий цитотоксический эффект NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) на опухолевые клетки.In fig. 28 is a graph showing the cytotoxic effect of NKG2D binding domains (listed as clones) on tumor cells.

На фиг. 29 представлен график, демонстрирующий температуру плавления NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов), измеренную с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии.In fig. 29 is a graph showing the melting temperature of NKG2D binding domains (listed as clones) measured by differential scanning fluorimetry.

На фиг. 30 представлен график, демонстрирующий усиленную активацию NK-клеток человека мультиспецифическими связывающими белками.In fig. 30 is a graph showing enhanced activation of human NK cells by multispecific binding proteins.

На фиг. 31 представлен график, демонстрирующий, что мультиспецифические связывающие белки индуцируют более высокие уровни цитотоксичности NK-клеток человека в отношении опухолевых клеток-мишеней.In fig. 31 is a graph demonstrating that multispecific binding proteins induce higher levels of cytotoxicity of human NK cells towards target tumor cells.

На фиг. 32 представлен график, демонстрирующий, что мультиспецифические связывающие белки индуцируют более высокие уровни цитотоксичности NK-клеток человека в отношении опухолевых клеток-мишеней.In fig. 32 is a graph demonstrating that multispecific binding proteins induce higher levels of human NK cell cytotoxicity toward target tumor cells.

На фиг. 33 представлен график, демонстрирующий, что мультиспецифические связывающие белки индуцируют более высокие уровни цитотоксичности NK-клеток человека в отношении опухолевых клеток-мишеней.In fig. 33 is a graph demonstrating that multispecific binding proteins induce higher levels of human NK cell cytotoxicity toward target tumor cells.

На фиг. 34 представлен график, демонстрирующий, что мультиспецифические связывающие белки индуцируют более высокие уровни цитотоксичности NK-клеток человека в отношении опухолевых клеток-мишеней.In fig. 34 is a graph demonstrating that multispecific binding proteins induce higher levels of human NK cell cytotoxicity towards target tumor cells.

На фиг. 35 представлен график, демонстрирующий, что мультиспецифические связывающие белки индуцируют более высокие уровни цитотоксичности NK-клеток мыши в отношении опухолевых клетокмишеней.In fig. 35 is a graph demonstrating that multispecific binding proteins induce higher levels of cytotoxicity of mouse NK cells towards target tumor cells.

На фиг. 36 представлен график, демонстрирующий, что мультиспецифические связывающие белки индуцируют более высокие уровни цитотоксичности NK-клеток мыши в отношении опухолевых клетокмишеней.In fig. 36 is a graph demonstrating that multispecific binding proteins induce higher levels of cytotoxicity of mouse NK cells towards target tumor cells.

На фиг. 37 представлен профиль связывания нацеленных на CD33 TriNKET с NKG2D, экспрессируемым на клетках EL4. На фиг. 37 продемонстрировано связывание двух TriNKET, когда CD33связывающий домен используется в качестве второго нацеливающего плеча.In fig. 37 shows the binding profile of CD33-targeted TriNKET to NKG2D expressed on EL4 cells. In fig. 37 demonstrates the binding of two TriNKETs when the CD33 binding domain is used as the second targeting arm.

На фиг. 38 представлен профиль связывания нацеленных на HER2 TriNKET с NKG2D, экспрессируемым на клетках EL4. На фиг. 38 продемонстрированы те же два NKG2D-связывающих домена, которые в таких условиях соединены со вторым нацеливающим плечом HER2.In fig. 38 shows the binding profile of HER2-targeted TriNKET to NKG2D expressed on EL4 cells. In fig. 38 demonstrates the same two NKG2D-binding domains that are coupled to the second targeting arm of HER2 under these conditions.

На фиг. 39 представлен профиль связывания нацеленных на ВСМА TriNKET с NKG2D, экспрессируемым на клетках EL4.In fig. 39 shows the binding profile of BCMA-targeted TriNKET to NKG2D expressed on EL4 cells.

На фиг. 40 представлена гистограмма нацеленных на CD20 TriNKET, которые связываются с NKG2D, экспрессируемым на клетках EL4. Неокрашенные клетки EL4 использовали в качестве отрицательного контроля для сигнала флуоресценции. Неокрашенный: заполненный; CD20-TriNKET-F04: сплошная линия; CD20-TriNKET-C26: пунктирная линия.In fig. 40 is a histogram of CD20-targeting TriNKETs that bind to NKG2D expressed on EL4 cells. Unstained EL4 cells were used as a negative control for the fluorescence signal. Unpainted: filled; CD20-TriNKET-F04: solid line; CD20-TriNKET-C26: dotted line.

На фиг. 41 представлен профиль связывания нацеленных на CD33 TriNKET с CD33, экспрессируемым на клетках ОМЛ MV4-11 человека.In fig. 41 shows the binding profile of CD33-targeted TriNKETs to CD33 expressed on human AML MV4-11 cells.

На фиг. 42 представлен профиль связывания нацеленных на HER2 TriNKET с HER2, экспрессируемым на клетках 786-O рака почек человека.In fig. 42 shows the binding profile of HER2-targeted TriNKET to HER2 expressed on 786-O human kidney cancer cells.

На фиг. 43 представлен профиль связывания нацеленных на ВСМА TriNKETc ВСМА, экспрессируемым на клетках миеломы ММ. 1S человека.In fig. 43 shows the binding profile of BCMA-targeted TriNKETc BCMA expressed on MM myeloma cells. 1S person.

На фиг. 44 представлена гистограмма нацеленных на CD20 TriNKET, которые связываются с CD20, экспрессируемым на поверхности клеток лимфомы EL4 человека. Неокрашенные клетки использовали в качестве отрицательного контроля для сигнала флуоресценции. Неокрашенный: заполненный; CD20TriNKET-F04: сплошная линия; CD20-TriNKET-C26: пунктирная линия.In fig. 44 is a histogram of CD20-targeting TriNKETs that bind to CD20 expressed on the surface of human EL4 lymphoma cells. Unstained cells were used as a negative control for the fluorescence signal. Unpainted: filled; CD20TriNKET-F04: solid line; CD20-TriNKET-C26: dotted line.

На фиг. 45А-45В представлена гистограммы синергетической активации NK-клеток с использованием CD16 и NKG2D. На фиг. 45А продемонстрированы уровни CD107а; на фиг. 45В продемонстрированы уровни IFNy; на фиг. 45С продемонстрированы уровни CD107а. Графики демонстрируют среднее значение (n=2) ±SD. Данные представляют собой пять независимых экспериментов с использованием пяти различных здоровых доноров.In fig. 45A-45B are histograms of synergistic NK cell activation using CD16 and NKG2D. In fig. 45A demonstrates CD107a levels; in fig. 45B demonstrated IFNy levels; in fig. 45C demonstrated CD107a levels. Graphs show mean (n=2) ±SD. Data are representative of five independent experiments using five different healthy donors.

На фиг. 46 представлена гистограмма, демонстрирующая активацию NK-клеток с использованием TriNKET, нацеленных на NKG2D и CD16. Во всех случаях испытанные антитела имели изотип IgG1 человека. Графики демонстрируют среднее значение (n=2) ±SD.In fig. 46 is a histogram showing NK cell activation using TriNKET targeting NKG2D and CD16. In all cases, the antibodies tested were of the human IgG1 isotype. Graphs show mean (n=2) ±SD.

На фиг. 47А-47С представлена гистограмма, демонстрирующая, что TriNKET и трастузумаб способны активировать первичные NK-клетки человека в совместной культуре с HER2-положительными опухолевыми клетками человека, на что указывает увеличение дегрануляции CD107а и выработки цито- 8 044644 кинов IFNy. По сравнению с моноклональным антителом трастузумабом оба TriNKET продемонстрировали превосходную активацию NK-клеток человека с различными клетками HER2 рака человека. На фиг. 47А продемонстрировано, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с клетками SkBr-3. На фиг. 47В продемонстрировано, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с клетками Со1о201. На фиг. 47С продемонстрировано, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с клетками НСС1954.In fig. 47A-47C are histograms demonstrating that TriNKET and trastuzumab are able to activate primary human NK cells in co-culture with HER2-positive human tumor cells, as indicated by increased CD107a degranulation and production of IFNy cytokines. Compared to the monoclonal antibody trastuzumab, both TriNKETs demonstrated superior activation of human NK cells with a variety of HER2 human cancer cells. In fig. 47A demonstrated that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with SkBr-3 cells. In fig. 47B demonstrated that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with Co10201 cells. In fig. 47C demonstrated that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with HCC1954 cells.

На фиг. 48А-48В представлена гистограмма, демонстрирующая TriNKET-опосредованную активацию покоящихся или IL-2-активированных NK-клеток человека в совместной культуре с CD33экспрессирующей линией клеток ОМЛ человека MV4-11. Фиг. 48А показывает TriNKETопосредованную активацию покоящихся NK-клеток человека. На фиг. 48В продемонстрирована TriNKET-опосредованная активация IL-2-активированных NK-клеток человека от того же донора.In fig. 48A-48B are histograms showing TriNKET-mediated activation of quiescent or IL-2-activated human NK cells in coculture with the CD33-expressing human AML cell line MV4-11. Fig. 48A shows TriNKET-mediated activation of resting human NK cells. In fig. 48B demonstrates TriNKET-mediated activation of IL-2-activated human NK cells from the same donor.

На фиг. 49А-49В представлена гистограмма, демонстрирующая усиление TriNKET цитотоксической активности с использованием активированных IL-2 и покоящихся NK-клеток человека. На фиг. 49А продемонстрирован процент специфического лизиса опухолевых клеток SkBr-3 покоящимися NKклетками человека. На фиг. 49В продемонстрирован процент специфического лизиса опухолевых клеток SkBr-3 активированными IL-2 NK-клетками человека.In fig. 49A-49B are histograms demonstrating TriNKET enhancement of cytotoxic activity using activated IL-2 and resting human NK cells. In fig. 49A demonstrates the percentage of specific lysis of SkBr-3 tumor cells by resting human NK cells. In fig. 49B demonstrates the percentage of specific lysis of SkBr-3 tumor cells by IL-2 activated human NK cells.

На фиг. 50А-50В представлены гистограммы, демонстрирующие, что TriNKET обеспечивают наибольшее преимущество против рака со средним и низким уровнем HER2 по сравнению с трастузумабом. На фиг. 50А продемонстрировано уничтожение активированными NK-клетками человека опухолевых клеток SkBr-3 с высоким уровнем HER2. На фиг. 50В продемонстрировано уничтожение активированными NK-клетками человека опухолевых клеток 786-O с низким уровнем HER2. TriNKET обеспечивают большее преимущество по сравнению с трастузумабом против клеток рака с низким уровнем экспрессией HER2.In fig. 50A-50B are histograms demonstrating that TriNKETs provide the greatest benefit against intermediate and low HER2 cancers compared to trastuzumab. In fig. 50A demonstrates the destruction of SkBr-3 tumor cells with high levels of HER2 by activated human NK cells. In fig. 50B demonstrated the killing of 786-O tumor cells with low HER2 levels by activated human NK cells. TriNKETs provide greater benefit compared with trastuzumab against cancer cells with low HER2 expression.

На фиг. 51А-51С представлены гистограммы, демонстрирующие экспрессию высокоаффинного FcRyI (CD64) на поверхности трех линий клеток ОМЛ человека, клеточной линии Molm-13 (фиг. 51А), клеточной линии Mv4-11 (фиг. 51В) и клеточной линии ТНР-1 (фиг. 51С).In fig. 51A-51C are histograms showing the expression of high affinity FcRyI (CD64) on the surface of three human AML cell lines, the Molm-13 cell line (FIG. 51A), the Mv4-11 cell line (FIG. 51B), and the THP-1 cell line (FIG. 51C).

На фиг. 52А-52В представлены линейные графики опосредованной моноклональным антителом или TriNKET активации NK-клеток человека в совместной культуре с клетками либо Molm-13 (фиг. 52В), либо ТНР-1 (фиг. 52А).In fig. 52A-52B are line graphs of monoclonal antibody or TriNKET-mediated activation of human NK cells in coculture with either Molm-13 (FIG. 52B) or THP-1 (FIG. 52A) cells.

На фиг. 53А-53С представлены линейные графики анализов цитотоксичности NK-клеток человека с использованием трех линий клеток ОМЛ человека в качестве мишеней. На фиг. 53А продемонстрировано, что клетки Mv4-11, которые экспрессируют CD64, но на более низком уровне, чем ТНР-1, показали пониженную эффективность в случае с моноклональным анти-CD33. На фиг. 53В продемонстрировано, что моноклональное антитело к CD33 показывает хорошую эффективность против клеток Molm-13, которые не экспрессируют CD64. На фиг. 53С продемонстрировано, что клетки ТНР-1 не проявляли эффекта в случае только с моноклональным анти-CD33. Идентичность линейных графиков, отмеченных на фиг. 53С, также применима к линейным графикам на фиг. 53А-53В.In fig. 53A-53C are line graphs of human NK cell cytotoxicity assays using three human AML cell lines as targets. In fig. 53A demonstrated that Mv4-11 cells, which express CD64, but at a lower level than THP-1, showed reduced efficacy with monoclonal anti-CD33. In fig. 53B demonstrated that an anti-CD33 monoclonal antibody shows good activity against Molm-13 cells that do not express CD64. In fig. 53C demonstrated that THP-1 cells had no effect when treated with monoclonal anti-CD33 alone. The identity of the line graphs marked in Fig. 53C also applies to the line graphs in FIG. 53A-53B.

На фиг. 54А и 54В представлены гистограммы, демонстрирующие, что В-клетки здорового донора чувствительны к лизису, опосредованному TriNKET.In fig. 54A and 54B are histograms demonstrating that healthy donor B cells are sensitive to TriNKET-mediated lysis.

На фиг. 54С и 54D представлены гистограммы, демонстрирующие, что миелоидные клетки устойчивы к опосредованному TriNKET лизису.In fig. 54C and 54D are histograms demonstrating that myeloid cells are resistant to TriNKET-mediated lysis.

На фиг. 55 представлены линейные графики TriNKET-опосредованного hPBMC уничтожения опухолевых клеток SkBr-3 в длительных совместных культурах.In fig. 55 shows line graphs of TriNKET-mediated hPBMC killing of SkBr-3 tumor cells in long-term co-cultures.

На фиг. 56 представлена блок-схема схемы исследования эффективности подкожной SC2.2 для RMA/S-HER2.In fig. 56 is a flow diagram of the subcutaneous SC2.2 efficacy study design for RMA/S-HER2.

На фиг. 57 представлены линейные графики, показывающие, что SC2.2 не влияет на рост подкожной опухоли RMA/S-HER2.In fig. 57 shows line graphs showing that SC2.2 does not affect RMA/S-HER2 subcutaneous tumor growth.

На фиг. 58А-58В представлены графики, демонстрирующие связывание in vitro с помощью mcFAEC26.99 TriNKET. 60 мкг/мл указанных антител с четырехкратными разведениями добавляли к 2x105 опухолевым клеткам B16F10 (фиг. 58А) или клеткам EL4-mNKG2D (фиг. 58В). Связывание оценивали с использованием вторичного конъюгированного с РЕ антитела козы против мышиного Ig с последующим проточным цитометрическим анализом.In fig. 58A-58B are graphs demonstrating in vitro binding by mcFAEC26.99 TriNKET. 60 μg/ml of the indicated antibodies with fourfold dilutions were added to 2x105 B16F10 tumor cells (Fig. 58A) or EL4-mNKG2D cells (Fig. 58B). Binding was assessed using a secondary PE-conjugated goat anti-mouse Ig antibody followed by flow cytometric analysis.

На фиг. 59 представлен график, демонстрирующий повышенную цитотоксичность NK, опосредованную mCFAE-C26.99 TriNKET.In fig. 59 is a graph demonstrating increased NK cytotoxicity mediated by mCFAE-C26.99 TriNKET.

На фиг. 60А-60В представлена противоопухолевая эффективность mcFAE-С26.99 TriNKET в п/к моделях B16F10. Мышам вводили внутрибрюшинно (фиг. 60А) контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 и моноклональное антитело к Tyrp-1 мыши или (фиг. 60В) контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 и mcFAE-C26.99 TriNKET, в дозе 150 мкг (6, 8, 10, 12, 14, 16 и 21 дни). Рост опухоли оценивали в течение 28 дней. Графики демонстрируют кривые роста опухоли у отдельных мышей.In fig. 60A-60B show the antitumor efficacy of mcFAE-C26.99 TriNKET in subcutaneous B16F10 models. Mice were administered intraperitoneally (Fig. 60A) isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 and mouse monoclonal antibody Tyrp-1 or (Fig. 60B) isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 and mcFAE-C26.99 TriNKET, at a dose of 150 mcg (6, 8, 10, 12, 14, 16 and 21 days). Tumor growth was assessed over 28 days. The graphs show tumor growth curves in individual mice.

На фиг. 61А-61В представлена противоопухолевая эффективность mcFAE-С26.99 TriNKET в в/вIn fig. 61A-61B presents the antitumor efficacy of mcFAE-C26.99 TriNKET in i.v.

- 9 044644 моделях B16F10. На фиг. 61А продемонстрирована опухолевая нагрузка, когда антитела вводили в дозе- 9 044644 models B16F10. In fig. 61A demonstrated tumor burden when antibodies were administered at a dose

150 мкг (4, 6, 8, 11, 13, 15 дни). На фиг. 61В продемонстрирована опухолевая нагрузка, когда антитела вводили в дозе 150 мкг (7, 9, 11, 13, 15 дни). Через 18 дней после опухолевой нагрузки, мышей умерщвляли и оценивали количество метастаз на поверхности легких.150 mcg (4, 6, 8, 11, 13, 15 days). In fig. 61B demonstrated tumor burden when antibodies were administered at a dose of 150 μg (days 7, 9, 11, 13, 15). 18 days after tumor challenge, mice were sacrificed and the number of metastases on the surface of the lungs was assessed.

На фиг. 62 представлена гистограмма, показывающая, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с CD20+ клетками Раджи.In fig. 62 is a bar graph showing that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with CD20+ Raji cells.

На фиг. 63 представлена гистограмма, показывающая активацию NK-клеток человека в культуре с ВСМА-положительными миеломными клетками человека MM.1S.In fig. 63 is a histogram showing the activation of human NK cells in culture with BCMA-positive human myeloma cells MM.1S.

На фиг. 64 представлен график, демонстрирующий, что TriNKET усиливают лизис NK-клетками человека клеток миеломы KMS12-PE.In fig. 64 is a graph showing that TriNKETs enhance human NK cell lysis of KMS12-PE myeloma cells.

На фиг. 65 представлен график, демонстрирующий, что нацеленные на ВСМА TriNKET с различными NKG2D-связывающими доменами усиливают лизис NK-клетками человека клеток миеломы KMS12-PE.In fig. 65 is a graph showing that BCMA-targeting TriNKETs with different NKG2D binding domains enhance human NK cell lysis of KMS12-PE myeloma cells.

На фиг. 66А-66С представлены линейные графики, демонстрирующие эффекты комбинированной терапии с использованием mNFAE-C26.99 TriNKET и антител к PD-1 в п/к моделях B16F10. На фиг. 66А представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 с моноклональным антителом к IgG2a 2A3 крысы или mcFAE-C26.99. На фиг. 66В представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип или моноклональное антитело к PD-1, клон RPM1-14. На фиг. 66С представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили комбинацию mcFAEC26.99 и моноклонального антитела к PD-1. Рост опухоли оценивали в течение 30 дней. Графики демонстрируют кривые роста опухоли у отдельных мышей.In fig. 66A-66C are line graphs demonstrating the effects of combination therapy using mNFAE-C26.99 TriNKET and anti-PD-1 antibodies in SC B16F10 models. In fig. 66A is a line graph showing tumor size (mm 3 ) in mice treated intraperitoneally with isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 with rat anti-IgG2a monoclonal antibody 2A3 or mcFAE-C26.99. In fig. 66B is a line graph showing tumor size (mm 3 ) in mice treated intraperitoneally with isotype control or anti-PD-1 monoclonal antibody, clone RPM1-14. In fig. 66C shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice intraperitoneally injected with the combination of mcFAEC26.99 and anti-PD-1 monoclonal antibody. Tumor growth was assessed over 30 days. The graphs show tumor growth curves in individual mice.

На фиг. 67А-67С представлены линейные графики, демонстрирующие эффекты комбинированной терапии с использованием mNFAE-C26.99 TriNKET и рекомбинантного IL-2 человека в п/к моделях B16F10. На фиг. 67А представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 или mcFAE-C26.99. На фиг. 67В представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип или IL-2. На фиг. 67С представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили комбинацию mcFAE-C26.99 и IL-2. Рост опухоли оценивали в течение 40 дней у 3 мышей из комбинированной группы, оставшихся без опухолей. Графики демонстрируют кривые роста опухоли у отдельных мышей.In fig. 67A-67C are line graphs demonstrating the effects of combination therapy using mNFAE-C26.99 TriNKET and recombinant human IL-2 in SC B16F10 models. In fig. 67A shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice intraperitoneally injected with isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 or mcFAE-C26.99. In fig. 67B shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice treated intraperitoneally with isotype control or IL-2. In fig. 67C shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice intraperitoneally injected with the combination of mcFAE-C26.99 and IL-2. Tumor growth was assessed over 40 days in 3 mice from the combination group that remained tumor-free. The graphs show tumor growth curves in individual mice.

На фиг. 68 представлен линейный график, демонстрирующий, что триспецифическое связывание в одной молекуле важно для максимальной активности NK-клеток.In fig. 68 is a line graph demonstrating that trispecific binding in a single molecule is important for maximal NK cell activity.

На фиг. 69 представлена гетеродимерная конструкция Oasc-Fab, которая включает связывание Fab с мишенью 1 и связывание scFab с мишенью 2, слитые с FC. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в FC.In fig. 69 shows a heterodimeric Oasc-Fab construct that includes Fab binding to target 1 and scFab binding to target 2 fused to FC. Heterodimerization is achieved by mutations in F C .

На фиг. 70 представлена DuetMab, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 разных Fab, связывающихся с антигеном 1 и 2, и Fc стабилизированные мутациями гетеродимеризации. Fab 1 и 2 содержат дифференциальные S-S мостики, которые обеспечивают правильное сопряжение LC и НС.In fig. 70 shows DuetMab, which is a heterodimeric construct containing 2 different Fabs binding to antigen 1 and 2, and F c stabilized by heterodimerization mutations. Fabs 1 and 2 contain differential SS bridges that ensure proper coupling of LC and NS.

На фиг. 71 представлена CrossmAb, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию с 2 различными Fab, связывающими с мишенью 1 и 2, слитыми с Fc, стабилизированными гетеродимеризацией. Домены CL и СН1 и домены VH и VL поменяны местами, например, СН1 соединен с VL, в то время как CL соединен с VH.In fig. 71 shows CrossmAb, which is a heterodimeric construct with 2 different target binding Fabs 1 and 2 fused to an Fc stabilized by heterodimerization. The CL and CH1 domains and the VH and VL domains are swapped, eg, CH1 is connected to VL while CL is connected to VH.

На фиг. 72 представлена Fit-Ig, которая представляет собой гомодимерные конструкции, где связывание Fab с антигеном 2 слито с N-концом НС Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит Fc дикого типа.In fig. 72 shows Fit-Ig, which is a homodimeric construct where the Fab binding to antigen 2 is fused to the N-terminus of the HC Fab that binds to antigen 1. The construct contains wild type Fc.

На фиг. 73A-73D представлены линейные графики, показывающие процент лизиса клеток-мишеней 786-O покоящимися NK-клетками (фиг. 73А) или NK-клетками, активированными IL-2 (фиг. 73В), IL-12 (фиг. 73С) или IL-15 (фиг. 73D) в присутствии трастузумаба или HER2-TriNKET.In fig. 73A-73D are line graphs showing the percentage of 786-O target cell lysis by resting NK cells (FIG. 73A) or NK cells activated by IL-2 (FIG. 73B), IL-12 (FIG. 73C), or IL -15 (Fig. 73D) in the presence of trastuzumab or HER2-TriNKET.

На фиг. 74A-74D представлены линейные графики, показывающие процент лизиса клеток-мишеней Molm-13 покоящимися NK-клетками (фиг. 74А) или NK-клетками, активированными IL-2 (фиг. 74В), IL12 (фиг. 74С) или IL-15 (фиг. 74D) в присутствии линтузумаба, запатентованного моноклонального антитела против CD33 или CD33-TriNKET.In fig. 74A-74D are line graphs showing the percentage of Molm-13 target cell lysis by resting NK cells (FIG. 74A) or NK cells activated by IL-2 (FIG. 74B), IL12 (FIG. 74C), or IL-15 (Fig. 74D) in the presence of lintuzumab, a proprietary monoclonal antibody against CD33 or CD33-TriNKET.

На фиг. 75A-75D представлены линейные графики, показывающие процент лизиса клеток-мишеней KMS12-PE покоящимися NK-клетками (фиг. 75А) или NK-клетками, активированными IL-2 (фиг. 75В), IL-12 (фиг. 75С) или IL-15 (фиг. 75D) в присутствии моноклонального антитела ВСМА ЕМ-901 или ВСМА-TriNKET.In fig. 75A-75D are line graphs showing the percentage of KMS12-PE target cell lysis by resting NK cells (FIG. 75A) or NK cells activated by IL-2 (FIG. 75B), IL-12 (FIG. 75C), or IL -15 (Fig. 75D) in the presence of monoclonal antibody BCMA EM-901 or BCMA-TriNKET.

На фиг. 76A-76D представлены линейные графики, показывающие процент лизиса клеток-мишеней KMS12-PE покоящимися NK-клетками (фиг. 76А) или NK-клетками, активированными помалидомидомIn fig. 76A-76D are line graphs showing the percentage of lysis of KMS12-PE target cells by resting NK cells (Fig. 76A) or NK cells activated by pomalidomide

- 10 044644 (фиг. 76В), IL-2 (фиг. 76С) или комбинацией IL-2 и помалидомидом (фиг. 76D) в присутствии моноклонального антитела ВСМА ЕМ-901 или BCMA-TriNKET.- 10 044644 (Fig. 76B), IL-2 (Fig. 76C) or a combination of IL-2 and pomalidomide (Fig. 76D) in the presence of monoclonal antibody BCMA EM-901 or BCMA-TriNKET.

На фиг. 77А-77В представлены графики, показывающие анализ проточной цитометрии очищенныхIn fig. 77A-77B are graphs showing flow cytometry analysis of purified

CD8+ Т-клеток и клеток-мишеней НСС1954.CD8+ T cells and HCC1954 target cells.

На фиг. 78А-78В представлены линейные графики, показывающие рост клеток-мишеней НСС1954 в присутствии CD8+ Т-клеток и HER2-TriNKET, пембролизумаба (Keytruda) или их комбинации. CD8+ Т-клетки, используемые на фиг. 78А и 78В были выделены от разных доноров.In fig. 78A-78B are line graphs showing the growth of HCC1954 target cells in the presence of CD8+ T cells and HER2-TriNKET, pembrolizumab (Keytruda), or a combination thereof. CD8+ T cells used in FIG. 78A and 78B were isolated from different donors.

На фиг. 79 представлен линейный график, демонстрирующий рост клеток-мишеней Skbr-3 в присутствии РВМС и HER2-TriNKET, агониста TLR или их комбинации.In fig. 79 is a line graph showing the growth of Skbr-3 target cells in the presence of PBMC and HER2-TriNKET, a TLR agonist, or a combination thereof.

На фиг. 80А-80С представлены линейные графики, показывающие кривые роста опухоли у отдельных мышей, инокулированных опухолевыми клетками B16F10 и обработанных 7,5 мг/кг mcFAE-C26.99 TriNKET или 7,5 мг/кг контрольного изотипа моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 (фиг. 80А), 1 мкг рекомбинантного IL-12 мыши (rmIL-12) или 7,5 мг/кг контрольного изотипа моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 (фиг. 80В) или комбинацию 7,5 мкг/кг mcFAE-C26.99 TriNKET и 1 мкг rmIL-12. (фиг. 80С). На фиг. 80В и 80С, нижние панели представляют графики в небольшом масштабе по оси Y.In fig. 80A-80C are line graphs showing tumor growth curves of individual mice inoculated with B16F10 tumor cells and treated with 7.5 mg/kg mcFAE-C26.99 TriNKET or 7.5 mg/kg isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 (FIG. 80A), 1 μg recombinant mouse IL-12 (rmIL-12) or 7.5 mg/kg isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 (FIG. 80B) or a combination of 7.5 μg/kg mcFAE- C26.99 TriNKET and 1 µg rmIL-12. (Fig. 80C). In fig. 80B and 80C, the bottom panels represent plots at a small scale along the Y axis.

На фиг. 81 представлена кривая Каплана-Мейера, показывающая процент животных, выживших после инокуляции опухолевых клеток B16F10 и обработок 7,5 мг/кг контрольным изотипом моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4, 7,5 мг/кг mcFAE-C26.99 TriNKET, 1 мкг rmIL-12 или комбинации 7,5 мг/кг mcFAE-C26.99 TriNKET и 1 мкг rmIL-12.In fig. 81 shows a Kaplan-Meier curve showing the percentage of animals surviving after inoculation of B16F10 tumor cells and treatments with 7.5 mg/kg isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4, 7.5 mg/kg mcFAE-C26.99 TriNKET, 1 µg rmIL-12 or a combination of 7.5 mg/kg mcFAE-C26.99 TriNKET and 1 µg rmIL-12.

Подробное описание сущности изобретенияDetailed description of the invention

В настоящем изобретении предлагаются мультиспецифические связывающие белки, которые связываются с опухоль-ассоциированным антигеном на поверхности раковой клетки и рецептором NKG2D, и рецептором CD16 на естественных клетках-киллерах для активации естественной клетки-киллера, фармацевтические композиции, содержащие такие мультиспецифические связывающие белки, и терапевтические способы с использованием таких мультиспецифических белков и фармацевтических композиций, в том числе для лечения рака. Различные аспекты настоящего изобретения изложены ниже в разделах; однако аспекты настоящего изобретения, описанные в одном конкретном разделе, не должны быть ограничены каким-либо конкретным разделом.The present invention provides multispecific binding proteins that bind to tumor-associated antigen on the surface of a cancer cell and the NKG2D receptor and CD16 receptor on natural killer cells to activate the natural killer cell, pharmaceutical compositions containing such multispecific binding proteins, and therapeutic methods using such multispecific proteins and pharmaceutical compositions, including for the treatment of cancer. Various aspects of the present invention are set forth below in the sections; however, the aspects of the present invention described in one specific section are not intended to be limited to any particular section.

Для облегчения понимания настоящего изобретения, ряд терминов и фраз определены ниже.To facilitate understanding of the present invention, a number of terms and phrases are defined below.

Термины в единственном числе, используемые в данном документе, означают один или более и включают множественное число, если это не противоречит контексту.Terms in the singular as used herein mean one or more and include the plural unless inconsistent with the context.

Термин антигенсвязывающий участок, в контексте данного документа, относится к части молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании антигена. В антителах человека антигенсвязывающий участок образован аминокислотными остатками N-концевых вариабельных (V) областей тяжелой (Н) и легкой (L) цепей. Три сильно расходящихся участка в V-областях тяжелой и легкой цепей называются гипервариабельными областями, которые расположены между более консервативными фланкирующими участками, известными как каркасные области или FR. Таким образом, термин FR относится к аминокислотным последовательностям, которые естественным образом находятся между и рядом с гипервариабельными областями в иммуноглобулинах. В молекуле антитела человека три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи располагаются относительно друг друга в трехмерном пространстве для образования антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность является комплементарной трехмерной поверхности связанного антигена, и три гипервариабельные области каждой из тяжелых и легких цепей называются определяющими комплементарность областями или CDR. У некоторых животных, таких как верблюдовые и хрящевые рыбы, антигенсвязывающий участок образован одноцепочечным антителом, образующим однодоменное антитело. Антигенсвязывающие участки могут существовать в интактном антителе, в антигенсвязывающем фрагменте антитела, которое сохраняет антигенсвязывающую поверхность, или в рекомбинантном полипептиде, таком как scFv, с использованием пептидного линкера для соединения вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи в одном полипептиде.The term antigen-binding site, as used herein, refers to the part of the immunoglobulin molecule that is involved in the binding of antigen. In human antibodies, the antigen-binding region is formed by amino acid residues of the N-terminal variable (V) regions of the heavy (H) and light (L) chains. The three highly divergent regions in the V regions of the heavy and light chains are called hypervariable regions, which are located between more conserved flanking regions known as framework regions or FRs. Thus, the term FR refers to amino acid sequences that naturally occur between and adjacent to hypervariable regions in immunoglobulins. In a human antibody molecule, three light chain hypervariable regions and three heavy chain hypervariable regions are positioned relative to each other in three-dimensional space to form an antigen-binding surface. The antigen-binding surface is complementary to the three-dimensional surface of the bound antigen, and the three hypervariable regions of each of the heavy and light chains are called complementarity determining regions or CDRs. In some animals, such as camelids and cartilaginous fishes, the antigen-binding site is formed by a single-chain antibody forming a single-domain antibody. Antigen binding sites may exist in an intact antibody, in an antigen binding fragment of an antibody that retains an antigen binding surface, or in a recombinant polypeptide, such as a scFv, using a peptide linker to join a heavy chain variable domain to a light chain variable domain in a single polypeptide.

Термин опухоль-ассоциированный антиген, в контексте настоящего изобретения, означает любой антиген, включая, но не ограничиваясь этим, белок, гликопротеин, ганглиозид, углевод, липид, ассоциированный с раком. Такой антиген может экспрессироваться в злокачественных клетках или в микроокружении опухоли, например в опухоль-ассоциированных кровеносных сосудах, внеклеточном матриксе, мезенхимальной строме или иммунных инфильтратах.The term tumor-associated antigen, in the context of the present invention, means any antigen, including, but not limited to, protein, glycoprotein, ganglioside, carbohydrate, lipid, associated with cancer. Such an antigen may be expressed in malignant cells or in the tumor microenvironment, such as tumor-associated blood vessels, extracellular matrix, mesenchymal stroma or immune infiltrates.

Термины субъект и пациент, в контексте настоящего изобретения, относятся к организму, подлежащему лечению с помощью способов и композиций, описанных в настоящем документе. Такие организмы предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих (например, мышей, обезьян, лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кошек и тому подобное) и более предпочтительно включают людей.The terms subject and patient, as used herein, refer to the organism to be treated by the methods and compositions described herein. Such organisms preferably include, but are not limited to, mammals (eg, mice, monkeys, horses, cattle, pigs, dogs, cats, and the like) and more preferably include humans.

Термин эффективное количество в контексте настоящего изобретения относится к количеству соединения (например, соединения по настоящему изобретению), достаточному для достижения полезныхThe term effective amount in the context of the present invention refers to an amount of a compound (for example, a compound of the present invention) sufficient to achieve beneficial

- 11 044644 или желаемых результатов. Эффективное количество может быть введено за одно или более введений, применений или дозировок, и не предназначено для ограничения конкретным составом или путем введения. Термин лечение, в контексте настоящего изобретения, включает любой эффект, например, ослабление, уменьшение, модулирование, улучшение или устранение, которое приводит к улучшению патологического состояния, заболевания, расстройства и т.п., или ослабление его симптома.- 11 044644 or desired results. An effective amount may be administered in one or more administrations, applications or dosages, and is not intended to be limited to a particular formulation or route of administration. The term treatment, in the context of the present invention, includes any effect, such as attenuation, reduction, modulation, improvement or elimination, which results in the improvement of a pathological condition, disease, disorder, etc., or the alleviation of a symptom thereof.

Термин фармацевтическая композиция, в контексте настоящего изобретения, относится к комбинации активного агента с носителем, инертным или активным, что делает композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo.The term pharmaceutical composition, in the context of the present invention, refers to the combination of an active agent with a carrier, inert or active, which makes the composition particularly suitable for diagnostic or therapeutic use in vivo or ex vivo.

Термин фармацевтически приемлемый носитель, в контексте настоящего изобретения, относится к любому из стандартных фармацевтических носителей, таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии (например, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло) и различные типы смачивающих агентов. Композиции также могут включать стабилизаторы и консерванты. Например, носители, стабилизаторы и адъюванты, см. например, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].The term pharmaceutically acceptable carrier, as used herein, refers to any of the standard pharmaceutical carriers such as phosphate buffered saline, water, emulsions (eg, such as oil/water or water/oil emulsions) and various types of wetting agents. The compositions may also include stabilizers and preservatives. For example, carriers, stabilizers and adjuvants, see, for example, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].

Термин фармацевтически приемлемая соль, в контексте настоящего изобретения, относится к любой фармацевтически приемлемой соли (например, кислоте или основанию) соединения по настоящему изобретению, которая при введении субъекту способна предоставить соединение по настоящему изобретению или активный метаболит, или его остаток. Как известно специалистам в данной области техники, соли соединений по настоящему изобретению могут быть получены из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, но не ограничиваются ими, соляную, бромистоводородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-п-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиная, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую, бензолсульфоновую кислоту и тому подобное. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, хотя сами по себе они не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы при получении солей, полезных в качестве промежуточных соединений при получении соединений по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей.The term pharmaceutically acceptable salt, as used herein, refers to any pharmaceutically acceptable salt (eg, acid or base) of a compound of the present invention that, when administered to a subject, is capable of providing the compound of the present invention or an active metabolite or residue thereof. As is known to those skilled in the art, salts of the compounds of the present invention can be prepared from inorganic or organic acids and bases. Examples of acids include, but are not limited to, hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, nitric, perchloric, fumaric, maleic, phosphoric, glycolic, lactic, salicylic, succinic, toluene-p-sulfonic, tartaric, acetic, citric, methanesulfonic, ethanesulfonic, formic , benzoic, malonic, naphthalene-2-sulfonic, benzenesulfonic acid and the like. Other acids, such as oxalic acid, although not pharmaceutically acceptable in themselves, can be used in the preparation of salts useful as intermediates in the preparation of the compounds of the present invention and their pharmaceutically acceptable acid addition salts.

Типовые основания включают, но не ограничиваются ими, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочно-земельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы NW4 +, где W представляет собой C1-4 алкил и тому подобное.Typical bases include, but are not limited to, alkali metal hydroxides (eg sodium), alkaline earth metal hydroxides (eg magnesium), ammonia and compounds of the formula NW 4 + where W is C 1-4 alkyl and the like.

Примеры солей включают, но не ограничиваются ими: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, флукогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и тому подобное. Другие примеры солей включают анионы соединений по настоящему изобретению, соединенные с подходящим катионом, таким как Na+, NH4+ и NW4+ (где W представляет собой C1-4 алкильную группу) и тому подобное.Examples of salts include, but are not limited to: acetate, adipate, alginate, aspartate, benzoate, benzenesulfonate, bisulfate, butyrate, citrate, camphorate, camphorsulfonate, cyclopentane propionate, digluconate, dodecyl sulfate, ethanesulfonate, fumarate, flucoheptanoate, glycerophosphate, hemisulfate, heptanoate, hexano at , hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, 2-hydroxyethanesulfonate, lactate, maleate, methanesulfonate, 2-naphthalene sulfonate, nicotinate, oxalate, palmoate, pectinate, persulfate, phenylpropionate, picrate, pivalate, propionate, succinate, tartrate, thiocyanate, tosylate, undecanoate, etc. similar. Other examples of salts include the anions of the compounds of the present invention coupled with a suitable cation such as Na + , NH4 + and NW4 + (where W represents a C 1-4 alkyl group) and the like.

Для терапевтического применения соли соединений по настоящему изобретению рассматриваются как фармацевтически приемлемые. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут найти применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения.For therapeutic use, salts of the compounds of the present invention are considered pharmaceutically acceptable. However, salts of acids and bases that are not pharmaceutically acceptable may also find use, for example, in the preparation or purification of a pharmaceutically acceptable compound.

Во всем описании, где композиции описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные компоненты, или где процессы и способы описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные стадии, предполагается, что, кроме того, существуют композиции по настоящему изобретению, которые состоят в основном из перечисленных компонентов или состоят из них, и что существуют процессы и способы в соответствии с настоящим изобретением, которые состоят по существу или состоят из перечисленных стадий обработки.Throughout the specification, where compositions are described as having, including, or containing specific components, or where processes and methods are described as having, including, or containing specific steps, it is intended that, in addition, there are compositions of the present invention that consist substantially of the following components or consist of them, and that there are processes and methods in accordance with the present invention that consist essentially of or consist of the listed processing steps.

Как правило, композиции, в которых указан процент, процент представляет собой массовый процент, если не указано иное. Кроме того, если переменная не сопровождается определением, то учитывают предыдущее определение переменной.Generally, for compositions where a percentage is indicated, the percentage is a percentage by weight unless otherwise stated. In addition, if a variable is not accompanied by a definition, then the previous definition of the variable is taken into account.

I. БелкиI. Proteins

В настоящем изобретении предлагаются мультиспецифические связывающие белки, которые связываются с опухоль-ассоциированным антигеном на раковой клетке и рецептором NKG2D, и рецептором CD16 на естественных клетках-киллерах для активации естественной клетки-киллера. Мультиспецифические связывающие белки полезны в фармацевтических композициях и терапевтических способах, описанных в настоящем документе. Связывание мультиспецифического связывающего белка с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на поверхности естественной клетки-киллера усиливает активность естественной клетки-киллера в отношении разрушения раковой клетки. Связывание мультиспецифического связывающего белка с опухоль-ассоциированным антигеном на раковой клетке приводит к тому, что раковая клетка приближается к естественной клетке-киллеру, что облегчает прямое и опосредованное раз- 12 044644 рушение раковой клетки естественной клеткой-киллером. Дополнительное описание примеров мультиспецифических связывающих белков приведено ниже.The present invention provides multispecific binding proteins that bind to tumor-associated antigen on a cancer cell and the NKG2D receptor and CD16 receptor on natural killer cells to activate the natural killer cell. Multispecific binding proteins are useful in the pharmaceutical compositions and therapeutic methods described herein. The binding of multispecific binding protein to the NKG2D receptor and CD16 receptor on the surface of natural killer cells enhances the activity of natural killer cells to destroy the cancer cell. The binding of the multispecific binding protein to a tumor-associated antigen on a cancer cell brings the cancer cell closer to the natural killer cell, facilitating direct and indirect destruction of the cancer cell by the natural killer cell. Additional descriptions of examples of multispecific binding proteins are provided below.

Первый компонент мультиспецифических связывающих белков связывается с экспрессирующими рецептор NKG2D клетками, которые могут включать, но не ограничиваются ими, NK-клетки, γδ Т клетки и CD8+ αβ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления после NKG2D-связывания мультиспецифические связывающие белки могут блокировать природные лиганды, такие как ULBP6 и MICA, от связывания с NKG2D.The first component of the multispecific binding proteins binds to NKG2D receptor-expressing cells, which may include, but are not limited to, NK cells, γδ T cells and CD8+ αβ T cells. In some embodiments, following NKG2D binding, multispecific binding proteins can block natural ligands such as ULBP6 and MICA from binding to NKG2D.

Второй компонент мультиспецифических связывающих белков связывается с одним или более опухоль-ассоциированными антигенами, которые могут включать, но не ограничиваются ими HER2, CD20, CD33, ВСМА, ЕрСАМ, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, сМЕТ, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGEА3, В7.1, В7.2, CTLA4 и PD-L1.The second component of multispecific binding proteins binds to one or more tumor-associated antigens, which may include, but are not limited to, HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1 , IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGEA3, B7.1, B7.2, CTLA4 and PD-L1.

Третий компонент для мультиспецифических связывающих белков связывается с клетками, экспрессирующими CD16, Fc-рецептор на поверхности лейкоцитов, включая естественные клетки-киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, тучные клетки и фолликулярные дендритные клетки.The third component for multispecific binding proteins binds to cells expressing CD16, an Fc receptor on the surface of leukocytes, including natural killer cells, macrophages, neutrophils, eosinophils, mast cells and follicular dendritic cells.

Мультиспецифические связывающие белки могут принимать несколько форматов, как показано в, но не ограничиваясь этим, приведенных ниже примерах. Один формат представляет собой гетеродимерное мультиспецифическое антитело, которое включает первую тяжелую цепь иммуноглобулина, вторую тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина. Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc (шарнир-СН2-СН3) домен, первый вариабельный домен тяжелой цепи и необязательный первый домен тяжелой цепи СН1. Легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи; вместе с первой тяжелой цепью иммуноглобулина легкая цепь иммуноглобулина образует антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит второй Fc (шарнир-СН2-СН3) домен, второй вариабельный домен тяжелой цепи и необязательно второй домен тяжелой цепи CH1, который может соединиться с легкой цепью иммуноглобулина, идентичной той, которая соединиться с первой тяжелой цепью иммуноглобулина, за исключением того, что когда легкая цепь иммуноглобулина соединяется со второй тяжелой цепью иммуноглобулина, полученный антигенсвязывающий участок связывается с опухолевым антигеном. Первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе могут связываться с CD16 (фиг. 1).Multispecific binding proteins can take several formats, as shown in, but not limited to, the examples below. One format is a heterodimeric multispecific antibody that includes a first immunoglobulin heavy chain, a second immunoglobulin heavy chain, and an immunoglobulin light chain. The first immunoglobulin heavy chain includes a first Fc (hinge-CH2-CH3) domain, a first heavy chain variable domain, and an optional first heavy chain domain CH1. The light chain of an immunoglobulin includes a light chain variable domain and a light chain constant domain; Together with the first immunoglobulin heavy chain, the immunoglobulin light chain forms an antigen-binding site that binds to NKG2D. The second immunoglobulin heavy chain contains a second Fc (hinge-CH2-CH3) domain, a second heavy chain variable domain, and optionally a second CH1 heavy chain domain that can couple to an immunoglobulin light chain identical to that which binds to the first immunoglobulin heavy chain, except that when an immunoglobulin light chain combines with a second immunoglobulin heavy chain, the resulting antigen-binding region binds to a tumor antigen. The first Fc domain and the second Fc domain together can bind CD16 (Fig. 1).

Другой типовой формат включает гетеродимерное мультиспецифическое антитело, которое включает первую тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь иммуноглобулина и вторую тяжелую цепь иммуноглобулина. Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc (шарнир-СН2-СН3) домен, слитый либо с помощью линкера, либо с помощью шарнирной области антитела с одноцепочечным Fv (scFv), который связывается с NKG2D. Разнообразные линкеры могут быть использованы для связывания scFv с первым Fc-доменом или внутри самого scFv. Кроме того, scFv может включать мутации, которые делают возможным образование дисульфидной связи для стабилизации общей структуры scFv. ScFv также может включать мутации для модификации изоэлектрической точки всей первой тяжелой цепи иммуноглобулина и/или для обеспечения более легкой последующей очистки. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина включает второй Fc (шарнир-СН2-СН3) домен и второй вариабельный домен тяжелой цепи, и необязательно второй домен тяжелой цепи CH1. Легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина соединяется с легкой цепью иммуноглобулина и связывается с опухолевым антигеном. Первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе могут связываться с CD16 (фиг. 2).Another exemplary format includes a heterodimeric multispecific antibody that includes a first immunoglobulin heavy chain, an immunoglobulin light chain, and a second immunoglobulin heavy chain. The first immunoglobulin heavy chain includes a first Fc (hinge-CH2-CH3) domain fused by either a linker or an antibody hinge region to a single chain Fv (scFv) that binds NKG2D. A variety of linkers can be used to link the scFv to the first Fc domain or within the scFv itself. In addition, the scFv may include mutations that allow the formation of a disulfide bond to stabilize the overall structure of the scFv. ScFv may also include mutations to modify the isoelectric point of the entire first immunoglobulin heavy chain and/or to allow for easier subsequent purification. The second immunoglobulin heavy chain includes a second Fc (hinge-CH2-CH3) domain and a second heavy chain variable domain, and optionally a second heavy chain domain CH1. The light chain of an immunoglobulin includes a light chain variable domain and a light chain constant domain. The second immunoglobulin heavy chain combines with the immunoglobulin light chain and binds to the tumor antigen. The first Fc domain and the second Fc domain together can bind CD16 (Fig. 2).

Альтернативный формат гетеродимерных мультиспецифических белков включает первую тяжелую цепь иммуноглобулина, вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, первую легкую цепь иммуноглобулина и вторую легкую цепь иммуноглобулина. Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc (шарнир-СН2-СН3) домен, первый вариабельный домен тяжелой цепи и необязательный первый домен тяжелой цепи CH1. Первая легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вместе с первой тяжелой цепью иммуноглобулина первая легкая цепь иммуноглобулина образует антигенсвязывающий участок, связывающий опухолевый антиген. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина включает второй Fc (шарнир-СН2-СН3) домен, второй вариабельный домен тяжелой цепи и необязательно второй домен тяжелой цепи CH1. Вторая легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вместе со второй тяжелой цепью иммуноглобулина легкая цепь иммуноглобулина образует антигенсвязывающий участок, связывающийся с тем же опухолевым антигеном. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина может соединиться с легкой цепью иммуноглобулина, которая может быть идентична легкой цепи иммуноглобулина, которая соединяется с первой тяжелой цепью иммуноглобулина, за исключением того, что когда легкая цепь иммуноглобулина соединяется со второй тяжелой цепью иммуноглобулина, причем полученный антигенсвязывающий участок является вторым антигенсвязывающим участком, который связывается с опухолевым антигеном. В некоторых вариантах осуществления первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе могут связываться с CD16 (фиг. 1).An alternative format of heterodimeric multispecific proteins includes a first immunoglobulin heavy chain, a second immunoglobulin heavy chain, a first immunoglobulin light chain, and a second immunoglobulin light chain. The first immunoglobulin heavy chain includes a first Fc (hinge-CH2-CH3) domain, a first heavy chain variable domain, and an optional first heavy chain CH1 domain. The first light chain of an immunoglobulin includes a light chain variable domain and a light chain constant domain. Together with the first immunoglobulin heavy chain, the first immunoglobulin light chain forms an antigen-binding site that binds tumor antigen. The second immunoglobulin heavy chain includes a second Fc (hinge-CH2-CH3) domain, a second heavy chain variable domain, and optionally a second CH1 heavy chain domain. The second immunoglobulin light chain includes a light chain variable domain and a light chain constant domain. Together with the second immunoglobulin heavy chain, the immunoglobulin light chain forms an antigen-binding site that binds to the same tumor antigen. The second immunoglobulin heavy chain may couple to an immunoglobulin light chain, which may be identical to the immunoglobulin light chain that couples to the first immunoglobulin heavy chain, except that when the immunoglobulin light chain is coupled to a second immunoglobulin heavy chain, the resulting antigen binding site is the second antigen binding site site that binds to tumor antigen. In some embodiments, the first Fc domain and the second Fc domain together may bind CD16 (FIG. 1).

- 13 044644- 13 044644

Один или более дополнительных мотивов связывания могут быть слиты с С-концом домена СН3 константной области, необязательно через линкерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок может представлять собой одноцепочечный или стабилизированный дисульфидными связями вариабельный участок (ScFv) или может образовывать четырехвалентную или трехвалентную молекулу.One or more additional binding motifs may be fused to the C-terminus of the CH3 constant region domain, optionally via a linker sequence. In some embodiments, the antigen binding region may be a single chain or disulfide stabilized variable region (ScFv) or may form a tetravalent or trivalent molecule.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме триомаба, который представляет собой трифункциональное биспецифическое антитело, которое поддерживает IgG-подобную форму. Эта химера состоит из двух полуантител, каждое с одной легкой и одной тяжелой цепью, которые происходят от двух родительских антител.In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of triomab, which is a trifunctional bispecific antibody that maintains an IgG-like form. This chimera consists of two half-antibodies, each with one light and one heavy chain, which are derived from two parent antibodies.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок представляет собой форму общей легкой цепи (LC), в которой используется технология выступы-во-впадины (KIH). KIH включает конструирование доменов CH3 для создания выступа или впадины в каждой тяжелой цепи для содействия гетеродимеризации. Концепция технологии Fc выступы-во-впадины (KiH) заключалась в том, чтобы ввести выступ в одном домене СН3 (СН3А) путем замены небольшого остатка на объемный (то есть, T366WCH3A в нумерации ЕС). Чтобы приспособить выступ, на другом домене СН3 (СН3В) была создана дополнительная впадина поверхности путем замены ближайших соседних остатков к выступу более мелкими (т.е., T366S/L368A/Y407VCH3B). Мутация впадина была оптимизирована путем скрининга структурно-управляемой фаговой библиотеки (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library.J Mol Biol (1997) 270(1):26-35). Рентгеновские кристаллические структуры KiH Fc вариантов (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated halfantibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.J Mol Biol (2014) 426(9): 1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs.Mol Immunol (2014) 58(1): 132-8) продемонстрировали, что гетеродимеризация термодинамически поддерживается гидрофобными взаимодействиями, обусловленными стерической комплементарностью на границе между ядром домена СН3 и внутренней поверхностью, тогда как поверхности выступ-выступ и впадина-впадина не благоприятствуют гомодимеризации вследствие стерического утруднения и нарушения благоприятных взаимодействий, соответственно.In some embodiments, the multispecific binding protein is a common light chain (LC) form that uses knob-in-knot (KIH) technology. KIH involves the design of C H 3 domains to create a knob or trench in each heavy chain to promote heterodimerization. The concept of Fc knobs-in-hollows (KiH) technology was to introduce a knob in one CH3 domain (CH3A) by replacing a small residue with a bulky one (i.e., T366W CH3A in EU numbering). To accommodate the knob, an additional surface depression was created on another CH3 domain (CH3B) by replacing the nearest adjacent residues to the knob with smaller ones (i.e., T366S/L368A/Y407V CH3B ). The cavity mutation was optimized by screening a structure-driven phage library (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library.J Mol Biol (1997) 270(1) :26-35). X-ray crystal structures of KiH Fc variants (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated halfantibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.J Mol Biol (2014) 426(9): 1947–57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs.Mol Immunol (2014 ) 58(1): 132-8) demonstrated that heterodimerization is thermodynamically supported by hydrophobic interactions driven by steric complementarity at the interface between the CH3 domain core and the inner surface, whereas the ridge-ridge and valley-groove surfaces do not favor homodimerization due to steric hindrance and disruption favorable interactions, respectively.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig™), которые объединяют домены связывания мишеней двух моноклональных антител через гибкие природные линкеры и дает четырехвалентную IgG-подобную молекулу.In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a dual variable domain immunoglobulin (DVD-Ig™), which combines the target binding domains of two monoclonal antibodies through flexible natural linkers to produce a tetravalent IgG-like molecule.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме ортогональной поверхности Fab (орто-Fab). В подходе к орто-Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface.Nat. Biotechnol. (2014) 32(2): 191-8), региональный дизайн на основе структуры вводит комплементарные мутации в поверхность LC и HCVH.cH1 только в одном Fab, без каких-либо изменений в другом Fab.In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of an orthogonal surface of the Fab (ortho-Fab). In the approach to ortho-Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. ( 2014) 32(2): 191-8), structure-based regional design introduces complementary mutations into the LC and HC surface of VH .c H1 in only one Fab, without any changes in the other Fab.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок имеет формат 2 в 1 Ig. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме ES, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 разных Fabфрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечивается электростатической мутацией в Fc. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме кλ-тела, которая представляет собой гетеродимерные конструкции с 2 различными Fab, слитыми с Fc, стабилизированными мутациями гетеродимеризации: Fab1, нацеленный на антиген 1, содержит каппа-LC, тогда как второй Fab, нацеленный на антиген 2, содержит лямбда LC. На фиг. 13А представлено типовое представление одной формы кλ-тела. На фиг. 13В представлено типовое представление другого кλ-тела.In some embodiments, the multispecific binding protein is in a 2 in 1 Ig format. In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of an ES, which is a heterodimeric construct containing 2 different Fab fragments binding to target 1 and target 2 fused to an Fc. Heterodimerization is mediated by electrostatic mutation in Fc. In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a kλ body, which are heterodimeric constructs with 2 different Fc-fused Fabs stabilized by heterodimerization mutations: Fab1 targeting antigen 1 contains kappa-LC, while the second Fab targeting for antigen 2, contains lambda LC. In fig. 13A is a typical representation of one kλ-body shape. In fig. 13B is a typical representation of another kλ-body.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме обмена Fab-фрагментами (антитела, которые обмениваются Fab-фрагментами путем замены тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полумолекулы) на пару тяжелых-легких цепей из другой молекулы, что приводит к биспецифическим антителам). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме тела SEED (домен, сконструированный путем обмена между цепями (SEED) была разработана для генерирования асимметричных и биспецифических антителоподобных молекул, что позволяет расширять терапевтические применения естественных антител. Данная платформа, полученная с помощью белковой инженерии, основана на обмене структурно родственных последовательностей иммуноглобулина в консервативных доменах СН3. Конструкция SEED позволяет эффективно генерировать гетеродимеры AG/GA, в то же время препятствуя гомодимеризации доменов AG и GA SEED CH3.(Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме LuZ-Y, в кото- 14 044644 рой лейциновая молния используется для индуцирования гетеродимеризации двух разных НС. (Wranik,In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a Fab exchange (antibodies that exchange Fab fragments by exchanging the heavy chain and attached light chain (half-molecule) with a heavy-light chain pair from another molecule, resulting in bispecific antibodies). In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a SEED body (a chain-exchange engineered domain (SEED) has been designed to generate asymmetric and bispecific antibody-like molecules, allowing for expanded therapeutic applications of natural antibodies. This protein engineered platform is based on the exchange of structurally related immunoglobulin sequences in conserved CH3 domains.The SEED design allows efficient generation of AG/GA heterodimers while preventing homodimerization of the AG and GA domains of SEED CH3.(Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54). In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of LuZ-Y, in which a leucine zipper is used to induce heterodimerization of two different HCs (Wranik,

BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).B.J. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме Cov-X-Body (В биспецифических CovX-антителах два разных пептида соединяются вместе с использованием разветвленного азетидинонового линкера и сливаются с каркасным антителом в мягких условиях сайт-специфическим образом. В то время как фармакофоры отвечают за функциональную активность, каркас антител обеспечивает длительный период полураспада и Ig-подобное распределение. Фармакофоры могут быть химически оптимизированы или заменены другими фармакофорами для получения оптимизированных или уникальных биспецифических антител. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616).In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of Cov-X-Body (In bispecific CovX antibodies, two different peptides are linked together using a branched azetidinone linker and fused to the scaffold antibody under mild conditions in a site-specific manner. While the pharmacophores respond for functional activity, the antibody scaffold provides a long half-life and Ig-like distribution. Pharmacophores can be chemically optimized or replaced with other pharmacophores to produce optimized or unique bispecific antibodies (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52); 22611-22616).

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в гетеродимерной форме Oasc-Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, слитые с FC. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в FC.In some embodiments, the multispecific binding protein is in an Oasc-Fab heterodimeric form that includes a target-binding Fab 1 and a target-binding scFab 2 fused to an FC. Heterodimerization is mediated by mutations in FC.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме DuetMab, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 разных Fab, связывающихся с антигеном 1 и 2, и FC, стабилизированные мутациями гетеродимеризации. Fab 1 и 2 содержат дифференциальные S-S мостики, которые обеспечивают правильное сопряжение LC и НС.In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a DuetMab, which is a heterodimeric construct containing 2 different Fabs binding to antigen 1 and 2, and FCs stabilized by heterodimerization mutations. Fabs 1 and 2 contain differential S-S bridges that ensure proper pairing of LC and NS.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме CrossmAb, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию с 2 различными Fab, связывающими с мишенью 1 и 2, слитыми с Fc, стабилизированными гетеродимеризацией. Домены CL и СН1 и домены VH и VL поменяны местами, например, СН1 соединен с VL, в то время как CL соединен с VH.In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of a CrossmAb, which is a heterodimeric construct with 2 different target binding Fabs 1 and 2 fused to an Fc stabilized by heterodimerization. The CL and CH1 domains and the VH and VL domains are swapped, eg, CH1 is connected to VL while CL is connected to VH.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифический связывающий белок находится в форме Fit-Ig, которая представляет собой гомодимерные конструкции, где Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N-концом НС Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит Fc дикого типа.In some embodiments, the multispecific binding protein is in the form of Fit-Ig, which are homodimeric constructs wherein a Fab that binds to antigen 2 is fused to the N-terminus of an HC Fab that binds to antigen 1. The construct contains a wild-type Fc.

В табл. 1 перечислены пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с NKG2D. Если не указано иное, последовательности CDR, представленные в табл. 1, определяют по Кабат.In table 1 lists the peptide sequences of heavy chain variable domains and light chain variable domains that, in combination, can bind to NKG2D. Unless otherwise indicated, the CDR sequences presented in Table. 1, determined according to Kabat.

- 15 044644- 15 044644

Таблица 1Table 1

Клоны Clones Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Amino acid sequence of the heavy chain variable region Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи Amino acid sequence of the light chain variable region ADI-27705 ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQIDNO:1) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQIDNO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYN SYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:2) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYN SYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:2) ADI-27724 ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR ASQSVSSS YLA W YQQKPGQ APR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYG SSPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:4) EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCR ASQSVSSS YLA W YQQKPGQ APR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYG SSPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:4) ADI-27740 (A40) ADI-27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YHSFYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:6) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YHSFYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:6) ADI-27741 ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ SNSYYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:8) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ SNSYYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:8) ADI-27743 ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYN DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITTC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYN

- 16 044644- 16 044644

GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) ADI-28153 ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWGFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWGFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RTSQSISSYLNWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDSATYYCQQS YDIPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RTSQSISSYLNWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDSATYYCQQS YDIPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) ADI-28226 (C26) ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYG SFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYG SFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14) ADI-28154 ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTIS SLQPDDFAT YYCQQS К EVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT DFTLTIS SLQPDDFAT YYCQQS TO EVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16) ADI-29399 ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTIS S LQPDDF AT Y YC QQ YN SFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 18) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTIS S LQPDDF AT Y YC QQ YN SFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 18) ADI-29401 ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YDIYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:20) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YDIYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:20) ADI-29403 ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITTC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT

- 17 044644- 17 044644

NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYD SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:22) EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYD SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:22) ADI-29405 ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYG SFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:24) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYG SFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:24) ADI-29407 ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:25) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:25) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQ SFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:26) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQ SFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:26) ADI-29419 ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:27) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:27) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYS SFSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:28) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYS SFSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:28) ADI-29421 ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:29) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:29) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYE SYSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:30) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYE SYSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:30) ADI-29424 ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQIDNO:31) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQIDNO:31) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKAS SLESG VPSRFS GS GS GT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYD SFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:32) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKAS SLESG VPSRFS GS GS GT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYD SFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:32) ADI-29425 ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITTC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK

- 18 044644- 18 044644

EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33) EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33) LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQ SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:34) LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQ SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:34) ADI-29426 ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:35) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:35) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YHSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:36) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YHSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:36) ADI-29429 ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:37) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:37) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YELYSYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:38) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSIGSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGS GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQ YELYSYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:38) ADI-29447 (F47) ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:39) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:39) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RAS QSIS S WLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYD TFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:40) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RAS QSIS S WLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYD TFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:40) ADI-27727 ADI-27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGD SSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVS S (SEQIDNO:41) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGD SSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVS S (SEQIDNO:41) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQ KPGQPPKLLIYWASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEI К (SEQ ID NO:42) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQ KPGQPPKLLIYWASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEI TO (SEQ ID NO:42) ADI-29443 (F43) ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG GSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGS IYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDR FHPYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG GSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGS IYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDR FHPYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:43) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASQSVSRYLAWYQQKPGQAPR LLIYDASNRATGIPARFSGSGSG TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQF DTWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:44) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASQSVSRYLAWYQQKPGQAPR LLIYDASNRATGIPARFSGSGSG TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQF DTWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:44)

- 19 044644- 19 044644

ADI-27744 (A44) ADI-27744 (A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKD GGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:51) FTFSSYAMS или CDR1 (SEQ ID NO:90) - SYAMS CDR2 (SEQ ID NO:52) AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO:53) AKDGGYYDSGAGDY или CDR3 (SEQ ID NO:91) - DGGYYDSGAGDY EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKD GGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO:51) FTFSSYAMS or CDR1 (SEQ ID NO:90) - SYAMS CDR2 (SEQ ID NO:52) AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO:53) AKDGGYYDSGAGDY or CDR3 (SEQ ID NO:91) - DGGYYDSGAGDY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGIDSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:46) CDR1 (SEQ ID NO:54) RASQGIDSWLA CDR2 (SEQ ID NO:55) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:56) QQGVSYPRT DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGIDSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:46) CDR1 (SEQ ID NO:54) RASQGIDSWLA CDR2 (SEQ ID NO:55) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:56) QQGVSYPRT ADI-27749 (A49) ADI-27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:47) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO:59) ARGAPMGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO:93) GAPMGAAAGWFDP EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:47) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO:59) ARGAPMGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO:93) GAPMGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT ADI-29463 (F63) ADI-29463 (F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEW MGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMT RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC ARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTT VTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEW MGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMT RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC ARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTT VTVSS EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR ASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRL LIYGASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDD YWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:50) EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCR ASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRL LIYGASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDD YWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:50)

- 20 044644- 20 044644

(SEQ ID NO:49) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:63) - YTFTGYYMH или CDR1 (SEQ ID NO:94) - GYYMH CDR2 (SEQ ID NO:64) - WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO:65) - ARDTGEYYDTDDHGMDV или CDR3 (SEQ ID NO:95) - DTGEYYDTDDHGMDV (SEQ ID NO:49) CDR1 not according to Kabat (SEQ ID NO:63) - YTFTGYYMH or CDR1 (SEQ ID NO:94) - GYYMH CDR2 (SEQ ID NO:64) - WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 not according to Kabat (SEQ ID NO:65) - ARDTGEYYDTDDHGMDV or CDR3 (SEQ ID NO:95) - DTGEYYDTDDHGMDV CDR1 (SEQ ID NO:66) RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:67) GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:68) QQDDYWPPT CDR1 (SEQ ID NO:66) RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:67) GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:68) QQDDYWPPT ADI-29404 (F04) ADI-29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:78) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIG EIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAR GPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:78) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCEQYD SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:79) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLAWYQQKPGKAPK LLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCEQYD SYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:79) ADI-28200 ADI-28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRG RKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:80) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRG RKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:80) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC ESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQ KPGQPPKPLIYWASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEI К (SEQIDNO:81) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC ESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQ KPGQPPKPLIYWASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEI K (SEQIDNO:81) A49MQ A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PQGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO :97) - EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PQGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not according to Kabat (SEQ ID NO :97) - DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT

- 21 044644- 21 044644

ARGAPQGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO:98) GAPQGAAAGWFDP ARGAPQGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO:98) GAPQGAAAGWFDP A49ML A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PLGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:99) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO :100) ARGAPLGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO: 101)- GAPLGAAAGWFDP EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PLGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:99) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO:100) ARGAPLGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO: 101)- GAPLGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT A49MI A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 102) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO: 103) ARGAPIGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO: 104)- GAPIGAAAGWFDP EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 102) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO: 103) ARGAPIGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO: 104)- GAPIGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT A49MF A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITTC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP

- 22 044644- 22 044644

SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PFGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 105) CDR1 не по Кабат (SEQ Ш NO:57) - FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) - SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO: 106) - ARGAPFGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO: 107)- GAPFGAAAGWFDP SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PFGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 105) CDR1 not according to Kabat (SEQ Ш NO:57) - FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) - SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO: 106) - ARGAPFGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO: 107)- GAPFGAAAGWFDP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT A49MV A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PVGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 108) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO: 109) ARGAPVGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO: 110)- GAPVGAAAGWFDP EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PVGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 108) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO:57) FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO: 109) ARGAPVGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO: 110)- GAPVGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT A49консенсус ная A49consensus EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PXGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS, где X представляет собой M, L, I, V, Q или F EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGA PXGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS where X represents M, L, I, V, Q or F DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RAS QGIS S WLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) - DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RAS QGIS S WLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ GVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:48) CDR1 (SEQ ID NO:60) -

- 23 044644- 23 044644

(SEQIDNO: 111) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO:57) - FTFSSYSMN или CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO: 112) - ARGAPXGAAAGWFDP или CDR3 (SEQ ID NO: 113)GAPXGAAAGWFDP, где X представляет собой M, L, I, V, Q или F (SEQIDNO: 111) CDR1 not according to Kabat (SEQ ID NO:57) - FTFSSYSMN or CDR1 (SEQ ID NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO: 112) - ARGAPXGAAAGWFDP or CDR3 (SEQ ID NO: 113)GAPXGAAAGWFDP where X represents M, L, I, V, Q or F RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:61) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:62) QQGVSFPRT ADI-29378 (Е78) ADI-29378 (E78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA REGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTT VTVSS (SEQ ID NO: 114) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO: 116) YTFTSYYMH или CDR1 (SEQ ID NO: 122) - SYYMH CDR2 (SEQ ID NO: 117)IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO: 118) AREGAGFAYGMDYYYMDV или CDR3 (SEQ ID NO: 123)EGAGFAYGMDYYYMDV QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA REGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTT VTVSS (SEQ ID NO: 114) CDR1 not by Kabat (SEQ ID NO: 116) YTFTSYYMH or CDR1 (SEQ ID NO: 122) - SYYMH CDR2 (SEQ ID NO: 117)IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO: 118) AREGAGFAYGMDYYYMDV or CDR3 (SEQ ID NO: 123)EGAGFAYGMDYYYMDV EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRL LIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSD NWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 115) CDR1 (SEQ ID NO: 119) RASQSVSSYLA CDR2 (SEQ ID NO: 120) DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO: 121) QQSDNWPFT EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRL LIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSD NWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 115) CDR1 (SEQ ID NO: 119) RASQSVSSYLA CDR2 (SEQ ID NO: 120) DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO: 121) QQSDNWPFT ADI-29379 (Е79) ADI-29379 (E79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA RGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGT TVTVSS (SEQ ID NO: 124) CDR1 не по Кабат (SEQ ID NO: 116) - QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA RGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGT TVTVSS (SEQ ID NO: 124) CDR1 not according to Kabat (SEQ ID NO: 116) - EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSSNLAWYQQKPGQAP RLLIYGASTRATGIPARFSGSGS GTEFTLTIS SLQSEDFAVYYCQQ YDDWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 125) CDR1 (SEQ ID NO: 127) RASQSVSSNLA EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSSNLAWYQQKPGQAP RLLIYGASTRATGIPARFSGSGS GTEFTLTIS SLQSEDFAVYYCQQ YDDWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 125) CDR1 (SEQ ID NO: 127) RASQSVSSNLA YTFTSYYMH или CDR1 (SEQ ID NO: 122) - SYYMH CDR2 (SEQ ID NO:117) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 не по Кабат (SEQ ID NO: 126) ARGAPNYGDTTHDYYYMDV или CDR3 (SEQ ID NO: 130) GAPNYGDTTHDYYYMDV YTFTSYYMH or CDR1 (SEQ ID NO: 122) - SYYMH CDR2 (SEQ ID NO:117) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 not by Kabat (SEQ ID NO: 126) ARGAPNYGDTTHDYYYMDV or CDR3 (SEQ ID NO: 130) GAPNYGDTTHDYYYMDV CDR2 (SEQ ID NO:128) GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO: 129) QQYDDWPFT CDR2 (SEQ ID NO:128) GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO: 129) QQYDDWPFT

Альтернативно, вариабельный домен тяжелой цепи, определенный (SEQ ID NO: 69, может быть соединен с вариабельным доменом легкой цепи, определенным (SEQ ID NO: 70, с образованием антигенсвязывающего участка, который может связываться с NKG2D, как проиллюстрировано в патенте США 9273136.Alternatively, the heavy chain variable domain defined by (SEQ ID NO: 69) may be coupled to the light chain variable domain defined by (SEQ ID NO: 70) to form an antigen binding region that can bind NKG2D, as illustrated in US Pat. No. 9,273,136.

SEQ ID NO: 69SEQ ID NO: 69

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 70SEQ ID NO: 70

QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL

Альтернативно, вариабельный домен тяжелой цепи, определенный (SEQ ID NO: 71, может быть соединен с вариабельным доменом легкой цепи, определенным (SEQ ID NO: 72, с образованием антигенсвязывающего участка, который может связываться с NKG2D, как проиллюстрировано в патенте США 7879985.Alternatively, the heavy chain variable domain defined by (SEQ ID NO: 71) may be coupled to the light chain variable domain defined by (SEQ ID NO: 72) to form an antigen binding region that can bind NKG2D, as illustrated in US Pat. No. 7,879,985.

SEQ ID NO:71SEQ ID NO:71

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGS ANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSSQVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGS ANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO: 72SEQ ID NO: 72

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP- 24 044644EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP- 24 044644

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK

В Fc-домене связывание CD16 опосредуется шарнирной областью и доменом СН2. Например, в IgG1 человека взаимодействие с CD16 главным образом сосредоточено на аминокислотных остатках Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 и углеводном остатке N-ацетил-Dглюкозамина в домене СН2 (см., Sondermann et al, Nature, 406(6793):267-273). На основе известных доменов мутации могут быть выбраны для усиления или уменьшения аффинности связывания с CD16, например, с использованием библиотек фагового дисплея или кДНК библиотек поверхностного дисплея дрожжей, или могут быть сконструированы на основе известной трехмерной структуры взаимодействия.In the Fc domain, CD16 binding is mediated by the hinge region and the CH2 domain. For example, in human IgG1, the interaction with CD16 is mainly concentrated on the amino acid residues Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 and the carbohydrate residue N-acetyl-Dglucosamine in the CH2 domain (see ., Sondermann et al, Nature, 406(6793):267-273). Based on known domains, mutations can be selected to enhance or decrease CD16 binding affinity, for example using phage display libraries or yeast surface display cDNA libraries, or can be designed based on a known three-dimensional interaction structure.

Сборка тяжелых цепей гетеродимерных антител может быть осуществлена путем экспрессии двух разных последовательностей тяжелых цепей антител в одной и той же клетке, что может привести к сборке гомодимеров каждой тяжелой цепи антитела, а также сборке гетеродимеров. Содействие преимущественной сборке гетеродимеров может быть достигнуто путем включения различных мутаций в домен СН3 каждой константной области тяжелой цепи антитела, как показано в US 13/494870, US 16/028850, US 11/533709, US 12/875015, US 13/289934, US 14/773418, US 12/811207, US 13/866756, US 14/647480, US 14/830336. Например, мутации могут быть проведены в домене СН3 на основе IgG1 человека и включают различные пары аминокислотных замен в первом полипептиде и втором полипептиде, которые позволяют этим двум цепям селективно гетеродимеризоваться друг с другом. Все положения аминокислотных замен, показанные ниже, пронумерованы в соответствии с индексом EU, как в Кабат.Assembly of heterodimeric antibody heavy chains can be accomplished by expressing two different antibody heavy chain sequences in the same cell, which can result in the assembly of homodimers of each antibody heavy chain as well as the assembly of heterodimers. Promotion of preferential heterodimer assembly can be achieved by introducing various mutations into the CH3 domain of each antibody heavy chain constant region, as shown in US 13/494870, US 16/028850, US 11/533709, US 12/875015, US 13/289934, US 14/773418, US 12/811207, US 13/866756, US 14/647480, US 14/830336. For example, mutations can be made in the CH3 domain of human IgG1 and involve different pairs of amino acid substitutions in the first polypeptide and the second polypeptide that allow the two chains to selectively heterodimerize with each other. All amino acid substitution positions shown below are numbered according to the EU index, as in Kabat.

В одном сценарии аминокислотная замена в первом полипептиде заменяет исходную аминокислоту более крупной аминокислотой, выбранной из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) или триптофана (W) и по меньшей мере одной аминокислотная замена во втором полипептиде заменяет исходную аминокислоту (аминокислоты) меньшей аминокислотой(ами), выбранной из аланина (А), серина (S), треонина (Т) или валина (V), таким образом, что большая аминокислотная замена (выступ) вписывается в поверхность более мелких аминокислотных замен (полость). Например, один полипептид может включать замену T366W, а другой может включать три замены, включая T366S, L368A и Y407V.In one scenario, an amino acid substitution in the first polypeptide replaces the parent amino acid with a larger amino acid selected from arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y), or tryptophan (W) and at least one amino acid substitution in the second polypeptide replaces the parent amino acid ( amino acids) by smaller amino acid(s) selected from alanine (A), serine (S), threonine (T) or valine (V), such that the larger amino acid substitution (protrusion) fits into the surface of the smaller amino acid substitutions (cavity) . For example, one polypeptide may include the T366W substitution, and another may include three substitutions, including T366S, L368A, and Y407V.

Вариабельный домен тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению может необязательно сочетаться с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90% идентичной константной области антитела, такой как константная область IgG, включая шарнирные, домены СН2 и СН3 с или без домена СН1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области по меньшей мере на 90% идентична константной области антитела человека, такой как константная область IgG1 человека, константная область IgG2 человека, константная область IgG3 человека или константная область IgG4 человека. В некоторых других вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области по меньшей мере на 90% идентична константной области антитела другого млекопитающего, такого как кролик, собака, кошка, мышь или лошадь. Одна или более мутаций могут быть включены в константную область по сравнению с константной областью IgG1 человека, например, в Q347, Y349, L351, S354, Е356, Е357, K360, Q362, S364, Т366, L368, K370, N390, K392, Т394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, Т411 и/или K439. Типовые замены включают, например, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C,The heavy chain variable domain of an antibody of the present invention may optionally be combined with an amino acid sequence at least 90% identical to the antibody constant region, such as the IgG constant region, including the hinge, CH2 and CH3 domains with or without the CH1 domain. In some embodiments, the amino acid sequence of the constant region is at least 90% identical to a human antibody constant region, such as a human IgG1 constant region, a human IgG2 constant region, a human IgG3 constant region, or a human IgG4 constant region. In some other embodiments, the amino acid sequence of the constant region is at least 90% identical to the constant region of an antibody from another mammal, such as a rabbit, dog, cat, mouse, or horse. One or more mutations may be included in the constant region compared to the human IgG1 constant region, for example in Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394 , D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 and/or K439. Typical replacements include, for example, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C,

Е356К, E357Q, E357L, E357W, К36ОЕ, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I,E356K, E357Q, E357L, E357W, K36OE, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I,

T366L, Т366М, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, К392М,T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M,

K392V, K392F, K392D, К392Е, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A,K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A,

F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D и К439Е.F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D and K439E.

В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть включены в СН1 константной области IgG1 человека, могут находиться в положении аминокислот V125, F126, Р127, Т135, Т139, А140, F170, Р171 и/или V173. В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть включены в Са константной области IgG1 человека, могут находиться в положении аминокислот Е123, F116, S176, V163, S174 и/или Т164.In some embodiments, mutations that may be included in the CH1 constant region of human IgG1 may be at amino acid positions V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171, and/or V173. In some embodiments, mutations that may be included in the Ca constant region of human IgG1 may be at amino acid positions E123, F116, S176, V163, S174, and/or T164.

Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, приведенных в табл. 2.Alternatively, amino acid substitutions can be selected from the following sets of substitutions shown in table. 2.

- 25 044644- 25 044644

Таблица 2table 2

Первый полипептид First polypeptide Второй полипептид Second polypeptide Набор 1 Set 1 S364E/F405A S364E/F405A Y349K/T394F Y349K/T394F Набор 2 Set 2 S364H/D401K S364H/D401K Y349T/T411E Y349T/T411E Набор 3 Set 3 S364H/T394F S364H/T394F Y349T/F405A Y349T/F405A Набор 4 Set 4 S364E/T394F S364E/T394F Y349K/F405A Y349K/F405A Набор 5 Set 5 S364E/T411E S364E/T411E Y349K/D401K Y349K/D401K Набор 6 Set 6 S364D/T394F S364D/T394F Y349K/F405A Y349K/F405A Набор 7 Set 7 S364H/F405A S364H/F405A Y349T/T394F Y349T/T394F Набор 8 Set 8 S364K/E357Q S364K/E357Q L368D/K370S L368D/K370S Набор 9 Set 9 L368D/K370S L368D/K370S S364K S364K Набор 10 Set 10 L368E/K370S L368E/K370S S364K S364K Набор И Set I K360E/Q362E K360E/Q362E D401K D401K Набор 12 Set 12 L368D/K370S L368D/K370S S364K/E357L S364K/E357L Набор 13 Set 13 K370S K370S S364K/E357Q S364K/E357Q Набор 14 Set 14 F405L F405L K409R K409R Набор 15 Set 15 K409R K409R F405L F405L

Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, приведенных в табл.3.Alternatively, amino acid substitutions may be selected from the following substitution sets shown in Table 3.

Таблица 3Table 3

Первый полипептид First polypeptide Второй полипептид Second polypeptide Набор 1 Set 1 K409W K409W D399V/F405T D399V/F405T Набор 2 Set 2 Y349S Y349S E357W E357W Набор 3 Set 3 К360Е K360E Q347R Q347R Набор 4 Set 4 K360E/K409W K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Q347R/D399V/F405T Набор 5 Set 5 Q347E/K360E/K409W Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Q347R/D399V/F405T Набор 6 Set 6 Y349S/K409W Y349S/K409W E357W/D399V/F405T E357W/D399V/F405T

Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующего набора замен, показанных в табл. 4.Alternatively, amino acid substitutions can be selected from the following set of substitutions shown in table. 4.

Таблица 4Table 4

Первый полипептид First polypeptide Второй полипептид Second polypeptide Набор 1 Set 1 T366K/L351K T366K/L351K L351D/L368E L351D/L368E Набор 2 Set 2 T366K/L351K T366K/L351K L351D/Y349E L351D/Y349E Набор 3 Set 3 T366K/L351K T366K/L351K L351D/Y349D L351D/Y349D Набор 4 Set 4 T366K/L351K T366K/L351K L351D/Y349E/L368E L351D/Y349E/L368E Набор 5 Set 5 T366K/L351K T366K/L351K L351D/Y349D/L368E L351D/Y349D/L368E Набор 6 Set 6 E356K/D399K E356K/D399K K392D/K409D K392D/K409D

Альтернативно, по меньшей мере одна аминокислотная замена в каждой полипептидной цепи может быть выбрана из табл. 5.Alternatively, at least one amino acid substitution in each polypeptide chain can be selected from table. 5.

Таблица 5Table 5

Первый полипептид First polypeptide Второй полипептид Second polypeptide L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V T366V, T366I, T366L, Т366М, N390D, N390E, K392L, К392М, K392V, K392F K392D, К392Е, K409F, K409W, T411D и Т411Е T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D and T411E

Альтернативно, по меньшей мере одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора замен в табл. 6, где аминокислота в положении(ях), указанном в столбце Первый полипептид, заменена любой известной отрицательно заряженной аминокислотой, и аминокислота в положении(ях), указанном в столбце Второй полипептид, заменена любой известной положительно заряженной аминокислотой.Alternatively, the at least one amino acid substitution may be selected from the following set of substitutions in table. 6, wherein the amino acid at the position(s) indicated in the First Polypeptide column is replaced by any known negatively charged amino acid, and the amino acid at the position(s) indicated in the Second Polypeptide column is replaced by any known positively charged amino acid.

Таблица 6Table 6

Первый полипептид First polypeptide Второй полипептид Second polypeptide К392, К370, К409 или К439 K392, K370, K409 or K439 D399, Е356 или Е357 D399, E356 or E357

Альтернативно, по меньшей мере одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора в табл. 7, где аминокислота в положении(ях), указанном в столбце Первый полипептид, заменена любой известной положительно заряженной аминокислотой, и аминокислота в указанном положе- 26 044644 нии(ях) в столбце Второй полипептид, заменена любой известной отрицательно заряженной аминокислотой.Alternatively, the at least one amino acid substitution may be selected from the following set in table. 7, wherein the amino acid at the position(s) indicated in the First Polypeptide column is replaced by any known positively charged amino acid, and the amino acid at the indicated position(s) in the Second Polypeptide column is replaced by any known negatively charged amino acid.

Таблица 7Table 7

Первый полипептид First polypeptide Второй полипептид Second polypeptide D399, Е356 или Е357 D399, E356 or E357 К409, К439, КЗ 70 или КЗ 92 K409, K439, KZ 70 or KZ 92

Альтернативно или в дополнение, структурная стабильность гетеромультимерного белка может быть повышена путем введения S354C на первой или второй полипептидной цепи и Y349C на противоположной полипептидной цепи, которая образует искусственный дисульфидный мостик на границе раздела двух полипептидов.Alternatively or in addition, the structural stability of the heteromultimeric protein can be increased by introducing S354C on the first or second polypeptide chain and Y349C on the opposite polypeptide chain, which forms an artificial disulfide bridge at the interface of the two polypeptides.

Мультиспецифические белки, описанные выше, могут быть получены с использованием технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известной специалисту в данной области техники. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована в первый вектор экспрессии; вторая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована во второй вектор экспрессии; третья последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована в третий вектор экспрессии; первый, второй и третий векторы экспрессии могут быть вместо стабильно трансфицированы в клетки-хозяева для получения мультимерных белков.The multispecific proteins described above can be produced using recombinant DNA technology well known to one skilled in the art. For example, a first nucleic acid sequence encoding a first immunoglobulin heavy chain may be cloned into a first expression vector; a second nucleic acid sequence encoding a second immunoglobulin heavy chain may be cloned into a second expression vector; a third nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin light chain may be cloned into a third expression vector; the first, second and third expression vectors may instead be stably transfected into host cells to produce multimeric proteins.

Для достижения наибольшего выхода мультиспецифического белка можно изучить различные соотношения первого, второго и третьего вектора экспрессии, чтобы определить оптимальное соотношение для трансфекции в клетки-хозяева. После трансфекции отдельные клоны могут быть выделены для генерации банка клеток с использованием способов, известных в данной области техники, таких как ограниченное разведение, ИФА, FACS, микроскопия или Clonepix.To achieve the highest yield of multispecific protein, different ratios of the first, second and third expression vector can be studied to determine the optimal ratio for transfection into host cells. After transfection, individual clones can be isolated to generate a cell bank using methods known in the art, such as limited dilution, ELISA, FACS, microscopy or Clonepix.

Клоны могут быть культивированы в условиях, подходящих для масштабирования в биореакторе и поддержания экспрессии мультиспецифического белка. Мультиспецифические белки могут быть выделены и очищены с использованием способов, известных в данной области техники, включая центрифугирование, глубинную фильтрацию, лизис клеток, гомогенизацию, замораживание-оттаивание, аффинную очистку, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, обменную хроматографию гидрофобного взаимодействия и хроматографию со смешанным режимом.Clones can be cultured under conditions suitable for bioreactor scale-up and maintenance of multispecific protein expression. Multispecific proteins can be isolated and purified using methods known in the art, including centrifugation, depth filtration, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, affinity purification, gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction exchange chromatography and mixed chromatography. regime.

II. Характеристики TriNKETII. Characteristics of TriNKET

В определенных вариантах осуществления описанные в настоящем документе TriNKET, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена, связываются с клетками, экспрессирующими NKG2D человека. В некоторых вариантах осуществления TriNKET, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен для опухольассоциированного антигена, связываются с опухоль-ассоциированным антигеном на уровне, сопоставимом с моноклональным антителом, имеющим тот же опухоль-ассоциированный антигенсвязывающий домен. Например, TriNKET, которые включаютIn certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D-binding domain and a tumor-associated antigen binding domain, bind to cells expressing human NKG2D. In some embodiments, TriNKETs that include an NKG2D binding domain and a tumor-associated antigen binding domain bind to a tumor-associated antigen at a level comparable to a monoclonal antibody having the same tumor-associated antigen binding domain. For example, TriNKET, which include

NKG2D-связывающий домен и HER2-связывающий домен из трастузумаба, могут связываться с HER2, экспрессируемым на клетках, на уровне, сопоставимом с таковым у трастузумаба.The NKG2D-binding domain and HER2-binding domain from trastuzumab can bind to HER2 expressed on cells at levels comparable to those of trastuzumab.

Однако описанные в данном документе TriNKET более эффективны в снижении роста опухоли и уничтожении раковых клеток. Например, TriNKET по настоящему изобретению, который нацелен на HER2-экспрессирующий опухолевые/раковые клетки, более эффективен, чем SC2.2 - одноцепочечная биспецифическая молекула, построенная из scFv, полученного из трастузумаба, связанного с ULBP-6, лигандом для NKG2D. SC2.2 связывает раковые клетки HER2+ и NKG2D+ NK-клетки одновременно. Поэтому была исследована эффективность SC2.2 в снижении количества раковых клеток HER2+. Анализы активации и цитотоксичности in vitro показали, что SC2.2 эффективен в активации и уничтожении NK-клеток. Однако SC2.2 не смог продемонстрировать эффективность в модели подкожной опухоли RMA/S-HER2. Эффективность SC2.2 также тестировали in vivo с использованием модели сингенной мыши со сверхэкспрессирующей RMA/S-HER2. В этой мышиной модели SC2.2 не смог продемонстрировать контроль роста опухоли по сравнению с контролем носителя. Таким образом, хотя SC2.2 был способен активировать и убивать NK-клетки, и связываться с раковыми клетками HER2+, эти свойства были недостаточны для эффективного контроля роста опухоли HER2+.However, the TriNKETs described herein are more effective in reducing tumor growth and killing cancer cells. For example, the TriNKET of the present invention, which targets HER2-expressing tumor/cancer cells, is more effective than SC2.2, a single-chain bispecific molecule constructed from a trastuzumab-derived scFv bound to ULBP-6, a ligand for NKG2D. SC2.2 binds HER2+ cancer cells and NKG2D+ NK cells simultaneously. Therefore, the effectiveness of SC2.2 in reducing the number of HER2+ cancer cells was investigated. In vitro activation and cytotoxicity assays showed that SC2.2 was effective in activating and killing NK cells. However, SC2.2 failed to demonstrate efficacy in the RMA/S-HER2 subcutaneous tumor model. The efficacy of SC2.2 was also tested in vivo using a syngeneic mouse model overexpressing RMA/S-HER2. In this mouse model, SC2.2 failed to demonstrate tumor growth control compared to vehicle controls. Thus, although SC2.2 was able to activate and kill NK cells and bind to HER2+ cancer cells, these properties were not sufficient to effectively control HER2+ tumor growth.

В определенных вариантах осуществления описанные в настоящем документе TriNKET, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена активируют первичные NK-клетки человека при культивировании с опухолевыми клетками, экспрессирующими антиген. Активация NK-клеток отмечена увеличением дегрануляции CD107а и продуцировании цитокинов IFNy. Кроме того, по сравнению с моноклональным антителом, которое включает опухоль-ассоциированный антигенсвязывающий домен, TriNKET демонстрируют превосходную активацию NK-клеток человека в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих антиген. Например, по сравнению с моноклональным антителом трастузумабом, TriNKET по настоящему изобретению, имеющие HER2-связывающий домен, обладают превосходной активацией NK-клеток человека в присутствии HER2-экспрессирующих раковых клеток.In certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D-binding domain and a tumor-associated antigen binding domain, activate primary human NK cells when cultured with tumor cells expressing the antigen. Activation of NK cells is marked by an increase in CD107a degranulation and the production of IFNy cytokines. Additionally, compared to a monoclonal antibody that includes a tumor-associated antigen-binding domain, TriNKETs demonstrate superior activation of human NK cells in the presence of antigen-expressing tumor cells. For example, compared to the monoclonal antibody trastuzumab, the TriNKETs of the present invention having a HER2-binding domain have superior activation of human NK cells in the presence of HER2-expressing cancer cells.

- 27 044644- 27 044644

В определенных вариантах осуществления описанные в настоящем документе TriNKET, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена, усиливают активность покоящихся и активированных IL-2 NK-клеток человека в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих антиген. NK-клетки в покое показали меньшее фоновое продуцирование IFNy и дегрануляцию CD107а, чем NK-клетки, активированные IL-2. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки, активированные IL-2, показывают больший процент клеток, становящихся IFNy+; CD107a+ после стимуляции TriNKET.In certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D-binding domain and a tumor-associated antigen binding domain, enhance the activity of resting and IL-2-activated human NK cells in the presence of tumor cells expressing the antigen. Resting NK cells showed less background IFNy production and CD107a degranulation than IL-2-activated NK cells. In some embodiments, NK cells activated by IL-2 show a higher percentage of cells becoming IFNy+; CD107a+ after TriNKET stimulation.

В определенных вариантах осуществления описанные в настоящем документе TriNKET, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2), усиливают цитотоксическую активность покоящихся и IL-2-активированных NK-клеток человека в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих антиген. Кроме того, TriNKET (например, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2), более эффективно направляют ответы активированных и покоящихся NK-клеток против опухолевых клеток по сравнению с моноклональным антителом, которое включает тот же участок связывания опухоль-ассоциированного антигена. В некоторых вариантах осуществления TriNKET обладают преимуществом в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих средние и низкие опухолевые антигены, по сравнению с моноклональными антителами, которые включают один и тот же участок связывания опухоль-ассоциированного антигена. Следовательно, терапия, включающая TriNKET, может быть лучше терапии моноклональными антителами. Во всех этих условиях TriNKET индуцировали большую активацию NK-клеток и большее уничтожение опухолевых клеток, когда NK-клетки инкубировали с IL-2 по сравнению с NK-клетками без IL-2, демонстрируя синергизм между TriNKET и IL-2.In certain embodiments, the TriNKETs described herein, which include an NKG2D-binding domain and a tumor-associated antigen binding domain (non-limiting examples of tumor-associated antigens including CD20, BCMA, and HER2), enhance the cytotoxic activity of resting and IL-2-activated Human NK cells in the presence of antigen-expressing tumor cells. In addition, TriNKETs (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET), which include a binding domain for tumor-associated antigen ( non-limiting examples of tumor-associated antigens including CD20, BCMA, and HER2) more effectively direct activated and resting NK cell responses against tumor cells compared to a monoclonal antibody that includes the same tumor-associated antigen binding site. In some embodiments, TriNKETs are advantageous against tumor cells expressing intermediate and low tumor antigens over monoclonal antibodies that include the same tumor-associated antigen binding site. Therefore, therapy including TriNKET may be superior to monoclonal antibody therapy. In all of these conditions, TriNKET induced greater NK cell activation and greater tumor cell killing when NK cells were incubated with IL-2 compared to NK cells without IL-2, demonstrating synergy between TriNKET and IL-2.

В определенных вариантах осуществления, по сравнению с моноклональными антителами, TriNKET, описанные в данном документе (например, А40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2), полезны при лечении рака с высокой экспрессией Fcрецептора (FcR) или рака, находящегося в микроокружении опухоли с высокими уровнями FcR. Моноклональные антитела оказывают свое влияние на рост опухоли посредством множества механизмов, включая АЗКЦ (ADCC), CDC (комплементзависимую цитотоксичность), фагоцитоз и сигнальную блокаду среди прочих. Среди FcyR CD16 имеет самое низкое сродство к Fc IgG; FcyRI (CD64) представляет собой высокоаффинный FcR, который примерно в 1000 раз сильнее связывается с Fc IgG, чем CD16. CD64 обычно экспрессируется на многих гематопоэтических линиях, таких как миелоидная линия, и может экспрессироваться на опухолях, происходящих из этих типов клеток, таких как острая миелоидная лейкемия (ОМЛ). Иммунные клетки, проникающие в опухоль, такие как MDSC и моноциты, также экспрессируют CD64 и, как известно, проникают в микроокружение опухоли. Экспрессия CD64 опухолью или в микроокружении опухоли может оказывать негативное воздействие на терапию моноклональными антителами. Экспрессия CD64 в микроокружении опухоли затрудняет взаимодействие этих антител с CD16 на поверхности NK-клеток, поскольку антитела предпочитают связывать высокоаффинный рецептор. TriNKET, воздействуя на два активирующих рецептора на поверхности NK-клеток, могут преодолеть пагубное влияние экспрессии CD64 (либо на опухоль, либо на микроокружение опухоли) на терапию моноклональными антителами. Независимо от экспрессии CD64 на опухолевых клетках, TriNKET способны опосредовать ответы NK-клеток человека против всех опухолевых клеток, поскольку двойное нацеливание двух активирующих рецепторов на NK-клетки обеспечивает более сильное специфическое связывание с NK-клетками.In certain embodiments, compared to monoclonal antibodies, TriNKETs described herein (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET) , which include a binding domain for a tumor-associated antigen (non-limiting examples of tumor-associated antigens including CD20, BCMA and HER2) are useful in treating cancers with high FcR receptor (FcR) expression or cancers located in the tumor microenvironment with high levels of FcR. Monoclonal antibodies exert their effects on tumor growth through multiple mechanisms, including ADCC, CDC (complement dependent cytotoxicity), phagocytosis and signal blockade, among others. Among the FcyRs, CD16 has the lowest affinity for IgG Fc; FcyRI (CD64) is a high-affinity FcR that binds approximately 1000 times more strongly to IgG Fc than CD16. CD64 is commonly expressed on many hematopoietic lineages, such as the myeloid lineage, and can be expressed on tumors derived from these cell types, such as acute myeloid leukemia (AML). Tumor-infiltrating immune cells, such as MDSCs and monocytes, also express CD64 and are known to infiltrate the tumor microenvironment. Expression of CD64 by the tumor or in the tumor microenvironment may have a negative impact on monoclonal antibody therapy. Expression of CD64 in the tumor microenvironment makes it difficult for these antibodies to interact with CD16 on the surface of NK cells, as the antibodies prefer to bind the high-affinity receptor. TriNKETs, by targeting two activating receptors on the surface of NK cells, may overcome the deleterious effects of CD64 expression (either on the tumor or the tumor microenvironment) on monoclonal antibody therapy. Regardless of CD64 expression on tumor cells, TriNKETs are capable of mediating human NK cell responses against all tumor cells because dual targeting of two activating receptors to NK cells allows for stronger NK cell specific binding.

В некоторых вариантах осуществления TriNKET, описанные в настоящем документе (например, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают домен связывания для опухоль-ассоциированных антигенов (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2) обеспечивают лучший профиль безопасности посредством уменьшения побочных эффектов, вызванных связыванием с мишенью вне опухоли. Естественные клетки-киллеры и CD8 Т-клетки способны непосредственно лизировать опухолевые клетки, хотя механизмы, посредством которых NK-клетки и CD8 Т-клетки распознают нормальные клетки от опухолевых клеток, отличаются. Активность NK-клеток регулируется балансом сигналов от активирующих (NCR, NKG2D, CD16 и т.д.) и ингибирующих (KIR, NKG2A и т.д.) рецепторов. Баланс этих активирующих и ингибирующих сигналов позволяет NK-клеткам определять здоровые аутоклетки из стрессированных, инфицированных вирусом или трансформированных аутоклеток. Этот врожденный механизм аутотолерантности поможет защитить нормальную здоровую ткань от ответов NK-клеток. Чтобы расширить этот принцип, аутотолерантность NK-клеток позволит TriNKET нацеливать на антигены, экспрессируемые как на поверхности аутоклеток, так и на поверхности опухоIn some embodiments, TriNKETs described herein (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET) that include a binding domain for tumor-associated antigens (non-limiting examples of tumor-associated antigens including CD20, BCMA and HER2) provide a better safety profile by reducing side effects caused by binding to a target outside the tumor. Natural killer cells and CD8 T cells are able to directly lyse tumor cells, although the mechanisms by which NK cells and CD8 T cells recognize normal cells from tumor cells differ. The activity of NK cells is regulated by the balance of signals from activating (NCR, NKG2D, CD16, etc.) and inhibitory (KIR, NKG2A, etc.) receptors. The balance of these activating and inhibitory signals allows NK cells to identify healthy autocells from stressed, virus-infected, or transformed autocells. This innate self-tolerance mechanism will help protect normal healthy tissue from NK cell responses. To extend this principle, NK cell self-tolerance would allow TriNKET to target antigens expressed on both the autocell and tumor surfaces.

- 28 044644 ли, без побочных эффектов или с увеличенным терапевтическим окном. В отличие от естественных клеток-киллеров, Т-клеткам требуется распознавание специфического пептида, представленного молекулами МНС для активации и эффекторных функций. Т-клетки были основной целью иммунотерапии, и было разработано много стратегий для перенаправления Т-клеточных ответов против опухоли. Биспецифические Т-клетки, ингибиторы контрольных точек и CAR-T-клетки были одобрены FDA, но часто оказывают дозолимитирующее токсическое действие. Биспецифические Т-клетки и CAR-Т клетки работают вокруг системы распознавания TCR-MHC, используя связывающие домены для нацеливания антигенов на поверхность опухолевых клеток и используя сконструированные сигнальные домены для передачи сигналов активации в эффекторную клетку. Несмотря на то, что эти способы лечения эффективны для выявления противоопухолевого иммунного ответа, они часто сочетаются с синдромом высвобождения цитокинов (CRS) и побочными эффектами, вызванными связыванием с мишенью вне опухоли. TriNKET уникальны в этом контексте, поскольку они не будут перекрывать естественные системы активации и ингибирования NK-клеток. Вместо этого TriNKET предназначены для изменения баланса и обеспечения дополнительных сигналов активации для NK-клеток, сохраняя при этом толерантность NK к здоровым аутоклеткам.- 28 044644 whether, without side effects or with an increased therapeutic window. Unlike natural killer cells, T cells require recognition of a specific peptide presented by MHC molecules for activation and effector functions. T cells have been a major target of immunotherapy, and many strategies have been developed to redirect T cell responses against the tumor. Bispecific T cells, checkpoint inhibitors, and CAR T cells have been approved by the FDA but often have dose-limiting toxicities. Bispecific T cells and CAR-T cells operate around the TCR-MHC recognition system, using binding domains to target antigens to the surface of tumor cells and using engineered signaling domains to transmit activation signals to the effector cell. Although these treatments are effective in eliciting an antitumor immune response, they are often associated with cytokine release syndrome (CRS) and side effects caused by binding to nontumor targets. TriNKETs are unique in this context because they will not override natural NK cell activation and inhibition systems. Instead, TriNKETs are designed to alter the balance and provide additional activation signals to NK cells while maintaining NK tolerance to healthy autocells.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе TriNKET, включающие NKG2D-связывающий домен (например, A40-TriNKET, А44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают связывающий домен опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2), более эффективно задерживают прогрессирование опухоли, чем моноклональные антитела, которые включают тот же самый опухолевый антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления TriNKET, содержащие NKG2D-связывающий домен и опухолевый антигенсвязывающий домен, более эффективны против метастазов рака, чем моноклональные антитела, которые включают один и тот же опухолевый антигенсвязывающий домен.In some embodiments, TriNKETs described herein comprising an NKG2D-binding domain (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET) that include a tumor-associated antigen binding domain (non-limiting examples of tumor-associated antigens include CD20, BCMA, and HER2) are more effective at delaying tumor progression than monoclonal antibodies that include the same tumor antigen-binding domain. In some embodiments, TriNKETs comprising an NKG2D binding domain and a tumor antigen binding domain are more effective against cancer metastases than monoclonal antibodies that include the same tumor antigen binding domain.

Вышеприведенное описание описывает множество аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения. В заявке на патент конкретно рассматриваются все комбинации и варианты аспектов, и вариантов осуществления.The above description describes many aspects and embodiments of the present invention. The patent application specifically addresses all combinations and variations of aspects and embodiments.

III. Применения в терапевтических целяхIII. Therapeutic uses

В настоящем изобретении приводятся способы лечения рака с использованием описанного в настоящем документе мультиспецифического связывающего белка (например, A40-TriNKET, A44TriNKET, A49-TriNKET, С26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), который включает связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2), и/или фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе. Способы могут быть использованы для лечения различных видов рака, включая солидную опухоль, лимфому и лейкоз. Тип рака, подлежащий лечению, желательно соответствует типу раковой клетки, с которой связывается мультиспецифический связывающий белок. Например, лечение рака, экспрессирующего адгезивную молекулу эпителиальных клеток (ЕрСАМ), такого как рак толстой кишки, экспрессирующий ЕрСАМ, желательно лечить с использованием описанного в настоящем документе мультиспецифического связывающего белка, который связывается с NKG2D, CD16 и ЕрСАМ. Дополнительные аспекты и варианты осуществления терапевтических способов описаны ниже.The present invention provides methods for treating cancer using the multispecific binding protein described herein (for example, A40-TriNKET, A44TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET and F63-TriNKET), which includes a binding domain for a tumor-associated antigen (non-limiting examples of tumor-associated antigens including CD20, BCMA and HER2), and/or a pharmaceutical composition described herein. The methods can be used to treat various types of cancer, including solid tumor, lymphoma and leukemia. The type of cancer to be treated desirably matches the type of cancer cell to which the multispecific binding protein binds. For example, treatment of cancers expressing epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), such as colon cancer expressing EpCAM, is desirably treated using a multispecific binding protein described herein that binds NKG2D, CD16 and EpCAM. Additional aspects and embodiments of the therapeutic methods are described below.

Соответственно, один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ лечения рака у пациента, причем способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества мультиспецифического связывающего белка, описанного в настоящем документе (например, A40-TriNKET, А44- TriNKET, А49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов, включая CD20, ВСМА и HER2), для лечения рака. Примеры рака для лечения включают солидную опухоль, лейкоз и лимфому.Accordingly, one aspect of the present invention provides a method of treating cancer in a patient, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a multispecific binding protein described herein (e.g., A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26 -TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET and F63-TriNKET), which include a binding domain for a tumor-associated antigen (non-limiting examples of tumor-associated antigens including CD20, BCMA and HER2), for the treatment of cancer. Examples of cancers to treat include solid tumor, leukemia and lymphoma.

Терапевтический способ может быть охарактеризован в зависимости от рака, подлежащего лечению. Например, в определенных вариантах осуществления рак представляет собой солидную опухоль. В некоторых других вариантах осуществления рак представляет собой рак мозга, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия, рак пищевода, лейкоз, рак легкого, рак печени, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак прямой кишки, рак почки, рак желудка, рак яичка или рак матки. В других вариантах осуществления рак представляет собой васкуляризированную опухоль, плоскоклеточный рак, аденокарциному, мелкоклеточный рак, меланому, глиому, нейробластому, саркому (например, ангиосаркому или хондросаркому), рак гортани, рак околоушной железы, рак желчных путей, рак щитовидной железы, акральную лентигинозную меланому, актинический кератоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, аденоидно-кистозную карциному, аденомы, аденосаркому, аденосквамозную карциному, рак анальной части прямой кишки, рак анального канала, рак прямой кишки, астроцитарной опухоли, карциному бартолиновой железы, базальноклеточную карциному, рак желчных протоков, рак костей, рак костного мозга, рак бронхов, карциному бронхиальной железы, нейроэндокринныеThe therapeutic method may be characterized depending on the cancer to be treated. For example, in certain embodiments, the cancer is a solid tumor. In some other embodiments, the cancer is brain cancer, head and neck cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, leukemia, lung cancer, liver cancer, melanoma , ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, colorectal cancer, kidney cancer, stomach cancer, testicular cancer or uterine cancer. In other embodiments, the cancer is a vascularized tumor, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, small cell carcinoma, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma (e.g., angiosarcoma or chondrosarcoma), laryngeal cancer, parotid cancer, biliary tract cancer, thyroid cancer, acral lentiginosis melanoma, actinic keratosis, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, adenoid cystic carcinoma, adenomas, adenosarcoma, adenosquamous carcinoma, anal rectal cancer, anal canal cancer, rectal cancer, astrocytic tumor, Bartholin gland carcinoma, basal cell carcinoma, cancer bile ducts, bone cancer, bone marrow cancer, bronchial cancer, bronchial gland carcinoma, neuroendocrine

- 29 044644 опухоли, холангиокарциному, хондросаркому, папиллому/карциному сосудистой оболочки, хронический лимфолейкоз, хронический миелоидный лейкоз, светлоклеточную карциному, рак соединительной ткани, цистаденому, рак пищеварительной системы, рак двенадцатиперстной кишки, рак эндокринной системы, эндодермальную опухоль, гиперплазию эндометрия, стромальную саркому матки, эндометриоидную аденокарциному, рак эндотелиоцитов, эпендимальный рак, рак эпителиальных клеток, саркому Юинга, рак глаз и глазницы, рак женских половых органов, фокальную нодулярную гиперплазию, рак желчного пузыря, рак антрального отдела желудка, рак свода желудка, гастриному, глиобластому, глюкагоному, рак сердца, гемангиобластому, гемангиоэндотелиому, гемангиому, аденому печени, печеночный аденоматоз, гепатобилиарный рак, гепатоцеллюлярную карциному, болезнь Ходжкина, рак подвздошной кишки, инсулиному, интраэпителиальную неоплазию, интраэпителиальную плоскоклеточную неоплазию, рак внутрипеченочного желчного протока, инвазивную плоскоклеточную карциному, рак тонкой кишки, рак сустава, саркому Капоши, рак таза, крупноклеточный рак, рак толстой кишки, лейомиосаркому, меланому лентиго, лимфому, рак половых органов у мужчин, злокачественную меланому, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластому, медуллоэпителиому, менингеальный рак, мезотелиальный рак, метастатическую карциному, рак ротовой полости, мукоэпидермоидную карциному, множественную миелому, рак мышц, рак носового тракта, ра к нервной системы, нейроэпителиальную аденокарциному узелковую меланому, неэпителиальный рак кожи, неходжкинскую лимфому, мелкоклеточный рак, олигодендроглиальный рак, рак полости рта, остеосаркома, папиллярная серозная аденокарцинома, рак полового члена, рак глотки, опухоли гипофиза, плазмоцитому, псевдосаркому, бластому легкого, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак дыхательной системы, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, серозный рак, рак пазухи, рак кожи, мелкоклеточный рак, рак тонкой кишки, рак гладких мышц, рак мягких тканей, соматостатин-секретирующую опухоль, рак позвоночника, плоскоклеточный рак, поперечно-полосатый рак мышц, субмезотелиальный рак, поверхностную распространяющуюся меланому, Т-клеточный лейкоз, рак языка, недифференцированную карциному, рак мочеточника, рак мочеиспускательного канала, рак мочевого пузыря, рак мочевой системы, рак шейки матки, рак тела матки, увеальную меланому, рак влагалища, веррукозную карциному, ВИПому, ВИПому, рак вульвы, высокодифференцированную карциному или опухоль Вильмса.- 29 044644 tumors, cholangiocarcinoma, chondrosarcoma, papilloma/carcinoma of the choroid, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, clear cell carcinoma, connective tissue cancer, cystadenoma, digestive system cancer, duodenal cancer, endocrine system cancer, endodermal tumor, endometrial hyperplasia, stromal uterine sarcoma, endometrioid adenocarcinoma, endothelial cell cancer, ependymal cancer, epithelial cell cancer, Ewing's sarcoma, eye and orbital cancer, cancer of the female genital organs, focal nodular hyperplasia, gallbladder cancer, gastric antrum cancer, gastric vault cancer, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, heart cancer, hemangioblastoma, hemangioendothelioma, hemangioma, liver adenoma, hepatic adenomatosis, hepatobiliary cancer, hepatocellular carcinoma, Hodgkin's disease, ileal cancer, insulinoma, intraepithelial neoplasia, intraepithelial squamous neoplasia, intrahepatic bile duct cancer, invasive squamous cell carcinoma, cancer of the thin colon, joint cancer, Kaposi's sarcoma, pelvic cancer, large cell cancer, colon cancer, leiomyosarcoma, lentigo melanoma, lymphoma, male genital cancer, malignant melanoma, malignant mesothelial tumors, medulloblastoma, medulloepithelioma, meningeal cancer, mesothelial cancer, metastatic carcinoma , oral cavity cancer, mucoepidermoid carcinoma, multiple myeloma, muscle cancer, nasal tract cancer, nervous system cancer, neuroepithelial adenocarcinoma, nodular melanoma, nonepithelial skin cancer, non-Hodgkin's lymphoma, small cell cancer, oligodendroglial cancer, oral cancer, osteosarcoma, papillary serous adenocarcinoma , penile cancer, pharyngeal cancer, pituitary tumors, plasmacytoma, pseudosarcoma, lung blastoma, rectal cancer, renal cell cancer, respiratory system cancer, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, sarcoma, serous cancer, sinus cancer, skin cancer, small cell cancer, cancer small bowel, smooth muscle cancer, soft tissue cancer, somatostatin-secreting tumor, spine cancer, squamous cell carcinoma, striated muscle cancer, submesothelial cancer, superficial spreading melanoma, T-cell leukemia, tongue cancer, undifferentiated carcinoma, ureteral cancer, cancer urethra, bladder cancer, urinary system cancer, cervical cancer, uterine corpus cancer, uveal melanoma, vaginal cancer, verrucous carcinoma, VIPoma, VIPoma, vulvar cancer, well-differentiated carcinoma or Wilms tumor.

В некоторых других вариантах осуществления рак представляет собой неходжкинскую лимфому, такую как В-клеточная лимфома или Т-клеточная лимфома. В некоторых вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой В-клеточную лимфому, такую как диффузная Вкрупноклеточная лимфома, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома, фолликулярная лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, мантийноклеточная лимфома, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, экстранодальная В-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, узловая В-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, В-клеточная лимфома маргинальной зоны селезенки, лимфома Беркитта, лимфоплазмоцитарная лимфома, волосатоклеточный лейкоз или первичная лимфома центральной нервной системы (ЦНС). В некоторых других вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой Т-клеточную лимфому, такую как предшественник Т-лимфобластной лимфомы, периферическую Т-клеточную лимфому, кожную Т-клеточную лимфому, ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, внеузловую Т-клеточную лимфому из натуральных киллеров, Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, Т-клеточную лимфому типа подкожного панникулита, анапластическую крупноклеточную лимфому или периферическую Т-клеточную лимфому.In some other embodiments, the cancer is non-Hodgkin's lymphoma, such as B-cell lymphoma or T-cell lymphoma. In some embodiments, the non-Hodgkin's lymphoma is a B-cell lymphoma, such as diffuse large B-cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma, follicular lymphoma, small cell lymphocytic lymphoma, mantle cell lymphoma, marginal zone B-cell lymphoma, extranodal B-cell lymphoma marginal zone, nodal marginal zone B-cell lymphoma, splenic marginal zone B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, lymphoplasmacytic lymphoma, hairy cell leukemia, or primary central nervous system (CNS) lymphoma. In some other embodiments, the non-Hodgkin's lymphoma is a T-cell lymphoma, such as precursor T-lymphoblastic lymphoma, peripheral T-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, angioimmunoblastic T-cell lymphoma, extranodal natural killer T-cell lymphoma, T - enteropathic cell lymphoma, subcutaneous panniculitis type T-cell lymphoma, anaplastic large cell lymphoma or peripheral T-cell lymphoma.

Рак, подлежащий лечению, может быть охарактеризован в соответствии с наличием определенного антигена, экспрессируемого на поверхности раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления раковая клетка экспрессирует одно или более из следующего: HER2, CD20, CD33, ВСМА, ЕрСАМ, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, сМЕТ, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, Mage-Аз, В7.1, В7.2, CTLA4 и PD-L1.The cancer to be treated can be characterized according to the presence of a specific antigen expressed on the surface of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell expresses one or more of the following: HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4 , MUC1, sMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, Mage-Az, V7.1, V7.2, CTLA4 and PD-L1.

В определенных вариантах осуществления белок по настоящему изобретению используется в способе усиления гибели опухолевых клеток (синонимично с лизисом, уничтожением, абляцией, уменьшением выживаемости или пролиферации клеток, и т.п.) прямо или опосредованно, или для производства лекарственного средства для использования в способе усиления гибели опухолевых клеток (синонимичном с лизисом, уничтожением, абляцией, снижением выживаемости или пролиферации клеток и т.п.) прямо или опосредованно, путем воздействия на опухолевые или раковые клетки и естественные клеткикиллеры белка по настоящему изобретению (например, А40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов включают CD20, ВСМА и HER2). Опухолевая клетка, которая реагирует на белок, как описано выше, экспрессирует опухоль-ассоциированный антиген, с которым связывается второй антигенсвязывающий участок белка. Например, в типовом варианте осуществления C26-TriNKET-CD20 используется для нацеливания на экспрессирующую CD20 опухолевую или раковую клетку (либо покоющуюся, либо активированную); в другом типичном варианте осуществления C26-TriNKET-BMCA используется для нацеливания на ВМСА-экспрессирующую опухоль или раковую клетку (либо покоющуюся, либо активированную).In certain embodiments, a protein of the present invention is used in a method of enhancing the death of tumor cells (synonymous with lysis, killing, ablation, reducing cell survival or proliferation, etc.) directly or indirectly, or for the production of a drug for use in the method of enhancing death of tumor cells (synonymous with lysis, destruction, ablation, decreased survival or proliferation of cells, etc.) directly or indirectly, by affecting tumor or cancer cells and natural killer cells of the protein of the present invention (for example, A40-TriNKET, A44- TriNKET, A49-TriNKET, C26TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET), which include a binding domain for a tumor-associated antigen (non-limiting examples of tumor-associated antigens include CD20, BCMA, and HER2). A tumor cell that responds to the protein as described above expresses a tumor-associated antigen to which a second antigen-binding site of the protein binds. For example, in an exemplary embodiment, C26-TriNKET-CD20 is used to target a CD20-expressing tumor or cancer cell (either quiescent or activated); in another exemplary embodiment, C26-TriNKET-BMCA is used to target a BMCA-expressing tumor or cancer cell (either quiescent or activated).

- 30 044644- 30 044644

В некоторых вариантах осуществления белок по настоящему изобретению используется в способе лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, или в производстве лекарственного средства для применения в способе лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, который включает введение субъекту белок или состав, содержащий белок по настоящему изобретению (например, A40-TriNKET, A44TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63-TriNKET), которые включают домен связывания для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов включают CD20, ВСМА и HER2). Раковая клетка, реагирующая на белок, как описано выше, экспрессирует опухоль-ассоциированный антиген, с которым связывается второй антигенсвязывающий участок белка. Например, в типовом варианте осуществления C26TriNKET-CD20 используется для нацеливания на экспрессирующую CD20 раковую клетку (либо покоющуюся, либо активированную); в другом типичном варианте осуществления С26-TriNKET-BMCA используется для нацеливания на ВМСА-экспрессирующую раковую клетку (либо покоющуюся, либо активированную).In some embodiments, a protein of the present invention is used in a method of treating cancer in a subject in need thereof, or in the manufacture of a medicament for use in a method of treating cancer in a subject in need thereof, which includes administering to the subject a protein or composition comprising a protein of the present invention. invention (e.g., A40-TriNKET, A44TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, and F63-TriNKET) that include a binding domain for a tumor-associated antigen (non-limiting examples of tumor-associated antigens include CD20, BCMA and HER2). A cancer cell that responds to the protein as described above expresses a tumor-associated antigen to which a second antigen-binding site of the protein binds. For example, in an exemplary embodiment, C26TriNKET-CD20 is used to target a CD20-expressing cancer cell (either quiescent or activated); in another exemplary embodiment, C26-TriNKET-BMCA is used to target a BMCA-expressing cancer cell (either quiescent or activated).

IV. Комбинированная терапияIV. Combination therapy

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается комбинированная терапия. Мультиспецифические связывающие белки, описанные в настоящем документе, используются в комбинации с дополнительными терапевтическими агентами для лечения рака.In another aspect of the present invention, combination therapy is provided. The multispecific binding proteins described herein are used in combination with additional therapeutic agents for the treatment of cancer.

В одном аспекте изобретение относится к способу усиления гибели опухолевых клеток прямо или опосредованно, причем способ включает воздействие на опухоль и естественные клетки-киллеры белка, содержащего: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из: блокатора контрольных точек; цитокина; агониста TLR; агониста STING; химиотерапевтического агента; агент, нацеленный на рак, который взаимодействует со специфическими молекулами в раковых клетках, которые участвуют в росте или выживании раковых клеток, включая, например, ингибиторы киназы, такие как ибрутиниб, вемурафениб или гливек; онколитического вируса; вакцины; радиации; адоптивной терапии NK, которая включает инфузию размноженных ex vivo NK-клеток или Т-клеток, включая клетки, которые были модифицированы in vitro для экспрессии химерного антигенного рецептора (например, CAR-T клетки); и трансплантации стволовых клеток (SCT).In one aspect, the invention relates to a method of enhancing the death of tumor cells directly or indirectly, the method comprising exposing the tumor and natural killer cells to a protein comprising: (a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; in combination with a second therapeutic agent selected from: a checkpoint blocker; cytokine; TLR agonist; STING agonist; chemotherapeutic agent; a cancer-targeting agent that interacts with specific molecules in cancer cells that are involved in the growth or survival of cancer cells, including, for example, kinase inhibitors such as ibrutinib, vemurafenib or Gleevec; oncolytic virus; vaccines; radiation; adoptive NK therapy, which involves infusion of ex vivo expanded NK cells or T cells, including cells that have been modified in vitro to express a chimeric antigen receptor (eg, CAR-T cells); and stem cell transplantation (SCT).

В определенных вариантах осуществления второй терапевтический агент содержит CAR-T клетку. Технология CAR-T известна в данной области техники и описана в патенте США № 10174095, публикации заявки на патент США № 2015/0283178 и рассмотрена в Guedan et al., Mol Ther Methods Clin Dev. (2018) 12:145-156. CAR могут нацеливается на множество антигенов. Например, в определенных вариантах осуществления CAR-T-клетка экспрессирует или способна экспрессировать CAR, который специфически связывается с опухоль-ассоциированным антигеном, например, CD19, CD22, ВСМА, PSMA, мезотелином (MSLN), ROR1, WT1, L1CAM, MUC16 или LeY. В некоторых вариантах осуществления опухоль-ассоциированный антиген, связанный CAR, представляет собой тот же самый антиген, связанный вторым антигенсвязывающим участком мультиспецифического связывающего белка. В определенных вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающий участок, который является таким же или по существу таким же, как второй антигенсвязывающий участок мультиспецифического связывающего белка.In certain embodiments, the second therapeutic agent comprises a CAR-T cell. CAR-T technology is known in the art and is described in US Patent No. 10174095, US Patent Application Publication No. 2015/0283178 and discussed in Guedan et al., Mol Ther Methods Clin Dev. (2018) 12:145–156. CARs can target multiple antigens. For example, in certain embodiments, the CAR-T cell expresses or is capable of expressing a CAR that specifically binds to a tumor-associated antigen, e.g., CD19, CD22, BCMA, PSMA, mesothelin (MSLN), ROR1, WT1, L1CAM, MUC16, or LeY . In some embodiments, the tumor-associated antigen bound by the CAR is the same antigen bound by a second antigen-binding site of a multispecific binding protein. In certain embodiments, the CAR comprises an antigen binding region that is the same or substantially the same as a second antigen binding region of the multispecific binding protein.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16; или состав, содержащий белок; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек; цитокина; агониста TLR; агониста STING; химиотерапевтического агента; агента, нацеленного на рак, который взаимодействует со специфическими молекулами в раковых клетках, которые участвуют в росте или выживании раковых клеток, включая, например, ингибиторы киназы, такие как ибрутиниб, вемурафениб или гливек; онколитического вируса; вакцины; радиации; адоптивной терапии NK, которая включает инфузию размноженных ex vivo NK-клеток или Т-клеток, включая клетки, которые были модифицированы in vitro для экспрессии химерного антигенного рецептора (например, CAR-Tклетки); и трансплантации стволовых клеток (SCT).In one aspect, the present invention provides a method of treating cancer in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein comprising: (a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; or a composition containing protein; in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker; cytokine; TLR agonist; STING agonist; chemotherapeutic agent; a cancer-targeting agent that interacts with specific molecules in cancer cells that are involved in the growth or survival of cancer cells, including, for example, kinase inhibitors such as ibrutinib, vemurafenib or Gleevec; oncolytic virus; vaccines; radiation; adoptive NK therapy, which involves infusion of ex vivo expanded NK cells or T cells, including cells that have been modified in vitro to express a chimeric antigen receptor (eg, CAR T cells); and stem cell transplantation (SCT).

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с блокатором контрольных точек, выбранным из: антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к KIR, антитела к NKG2A, антитела к LAG3 и антитела к TIM3.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a checkpoint blocker selected from: anti-PD1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-KIR antibodies, anti-NKG2A antibodies, anti-LAG3 antibodies and anti-TIM3 antibodies.

- 31 044644- 31 044644

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с цитокином, включая интерфероны и интерлейкины, такие как IL-2, IL-15, IL-12, INFa, IL-21, PEG-IL-2 (модифицированный полиэтиленгликолем интерлейкин-2) и гетеродимеры IL15/IL15R.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a cytokine, including interferons and interleukins, such as IL-2, IL-15, IL-12, INFa, IL-21, PEG-IL-2 (polyethylene glycol-modified interleukin-2) and IL15/IL15R heterodimers.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агонистом TLR, выбранным из агониста TLR7, агониста TLR8, агониста TLR7/8, агониста TLR9, агониста TLR4 и агониста TLR3.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a TLR agonist selected from a TLR7 agonist, a TLR8 agonist, a TLR7/8 agonist, a TLR9 agonist, a TLR4 agonist. and a TLR3 agonist.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агонистом STING ADU-S100.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with the STING agonist ADU-S100.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с химиотерапевтическим агентом, включающим алкилирующие агенты, такие как циклофосфамид, мехлорэтамин, хлорамбуцил, мелфалан, дакарбазин (DTIC), нитрозомочевины, темозоломид (пероральный дакарбазин); антрациклины, такие как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон и валрубицин; разрушители цитоскелета, такие как паклитаксел, наб-паклитаксел, доцетаксел, абраксан и таксотер; эпотилоны; ингибиторы гистондеацетилазы, такие как вориностат и ромидепсин; ингибиторы топоизомеразы I, такие как иринотекан и топотекан; ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид, тенипозид и тафлупозид; ингибиторы киназы, такие как бортезомиб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, вемурафениб и висмодегиб; аналоги нуклеотидов и аналоги-предшественники, такие как азацитидин, азатиоприн, капецитабин; пептидные антибиотики, такие как блеомицин и актиномицин; агенты на основе платины, такие как карбоплатин, цисплатин и оксалиплатин; ретиноиды, такие как третиноин и алитретиноин; и алкалоиды барвинка и их производные, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a chemotherapeutic agent including alkylating agents such as cyclophosphamide, mechlorethamine, chlorambucil, melphalan, dacarbazine (DTIC) , nitrosoureas, temozolomide (oral dacarbazine); anthracyclines such as daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone and valrubicin; cytoskeletal disruptors such as paclitaxel, nab-paclitaxel, docetaxel, abraxane and taxotere; epothilones; histone deacetylase inhibitors such as vorinostat and romidepsin; topoisomerase I inhibitors such as irinotecan and topotecan; topoisomerase II inhibitors such as etoposide, teniposide and tafluposide; kinase inhibitors such as bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib and vismodegib; nucleotide analogs and precursor analogs such as azacitidine, azathioprine, capecitabine; peptide antibiotics such as bleomycin and actinomycin; platinum-based agents such as carboplatin, cisplatin and oxaliplatin; retinoids such as tretinoin and alitretinoin; and vinca alkaloids and their derivatives such as vinblastine, vincristine, vindesine and vinorelbine.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с блокатором контрольных точек, выбранным из: ниволумаба, пембролизумаба, атезолизумаба, дурвалумаба, авелумаба, ипилимумаба, тремелимумаба, лирилумаба и монализумаба.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a checkpoint blocker selected from: nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, lirilumab and monalizumab.

В настоящем изобретении предлагается способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агонистом TLR, выбранным из: R848/резиквимода, VTX-2337, имиквимода и CpG-олигодезоксинуклеотида.The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing tumor cell death and/or a method for treating cancer with a protein comprising: (a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with a TLR agonist selected from: R848/resiquimod, VTX-2337, imiquimod, and a CpG oligodeoxynucleotide.

В настоящем изобретении предложен способ прямого или опосредованного усиления гибели опухолевых клеток и/или способ лечения рака белком, содержащим: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16, в комбинации с агентом, который индуцирует клеточное старение. Агент, индуцирующий старение раковых клеток, тем самым повышая чувствительность клеток к уничтожению и/или клиренсу иммунными клетками (например, NKклетками). Клеточное старение может быть индуцировано рядом клеточных событий, таких как остановка клеточного цикла, повреждение ДНК и ингибирование каскада митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Агенты, которые вызывают клеточное старение, известны в данной области техники и описаны, например, в Ruscetti et al., Science (2018) 362, 1416-22; and Herranz et al., J. Clin. Invest. (2018) 128(4): 1238-1246. В некоторых вариантах осуществления агент, который индуцирует клеточное старение,The present invention provides a method for directly or indirectly enhancing the death of tumor cells and/or a method for treating cancer with a protein containing: (a) a first antigen-binding site that binds NKG2D; (b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an antibody Fc domain or portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16, in combination with an agent that induces cellular senescence. An agent that induces senescence in cancer cells, thereby sensitizing the cells to killing and/or clearance by immune cells (eg, NK cells). Cellular senescence can be induced by a number of cellular events, such as cell cycle arrest, DNA damage, and inhibition of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade. Agents that induce cellular senescence are known in the art and are described, for example, in Ruscetti et al., Science (2018) 362, 1416-22; and Herranz et al., J. Clin. Invest. (2018) 128(4): 1238-1246. In some embodiments, an agent that induces cellular senescence is

- 32 044644 включает комбинацию агента, который индуцирует терминацию клеточного цикла, такого как ингибитор циклинзависимой киназы (CDK), и ингибитор MAPK-киназы (MEK). В некоторых вариантах осуществления агент, который индуцирует клеточное старение, содержит комбинацию ингибитора CDK4/6 (например, пальбоциклиба, абемакиклиба или рибоциклиба) и ингибитора MEK1/2 (например, траметиниба, кобиметиниба, рефаметиниба или селуметиниба).- 32 044644 includes a combination of an agent that induces cell cycle termination, such as a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor and a MAPK kinase (MEK) inhibitor. In some embodiments, the agent that induces cellular senescence comprises a combination of a CDK4/6 inhibitor (eg, palbociclib, abemaciclib, or ribociclib) and a MEK1/2 inhibitor (eg, trametinib, cobimetinib, refametinib, or selumetinib).

Белки по настоящему изобретению также можно использовать в качестве дополнения к хирургическому удалению первичного опухолевого очага.The proteins of the present invention can also be used as an adjunct to surgical removal of the primary tumor site.

Количество мультиспецифического связывающего белка и дополнительного терапевтического агента, и относительные сроки введения могут быть выбраны для достижения желаемого комбинированного терапевтического эффекта. Например, при назначении комбинированной терапии пациенту, нуждающемуся в таком введении, терапевтические агенты в комбинации или фармацевтическую композицию, или композиции, содержащие терапевтические агенты, можно вводить в любом порядке, таком как, например, последовательно, одновременно, вместе, одновременно и тому подобное. Кроме того, например, мультиспецифический связывающий белок можно вводить в то время, когда дополнительный терапевтический агент(ы) оказывает свое профилактическое или терапевтическое действие, или наоборот.The amount of multispecific binding protein and additional therapeutic agent, and the relative timing of administration, can be selected to achieve the desired combined therapeutic effect. For example, when administering combination therapy to a patient in need of such administration, the therapeutic agents in combination or the pharmaceutical composition or compositions containing the therapeutic agents may be administered in any order, such as, for example, sequentially, simultaneously, together, simultaneously, and the like. In addition, for example, the multispecific binding protein may be administered while the additional therapeutic agent(s) are exerting their prophylactic or therapeutic effects, or vice versa.

V. Фармацевтические композицииV. Pharmaceutical compositions

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат терапевтически эффективное количество белка, описанного в настоящем документе (например, A40TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, С26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET и F63TriNKET), который включает связывающий домен для опухоль-ассоциированного антигена (неограничивающие примеры опухоль-ассоциированных антигенов включают CD20, ВСМА и HER2). Композиция может быть составлена для использования в различных системах доставки лекарственного средства. Один или более физиологически приемлемых вспомогательных веществ или носителей также могут быть включены в композицию для надлежащего приготовления. Подходящие составы для использования в настоящем раскрытии найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Для краткого обзора способов доставки лекарственных средств см., например, Langer (Science 249: 1527-1533, 1990).The present invention also provides pharmaceutical compositions that contain a therapeutically effective amount of a protein described herein (for example, A40TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET and F63TriNKET) , which includes a binding domain for a tumor-associated antigen (non-limiting examples of tumor-associated antigens include CD20, BCMA and HER2). The composition can be formulated for use in various drug delivery systems. One or more physiologically acceptable excipients or carriers may also be included in the composition for proper preparation. Suitable formulations for use in the present disclosure are found in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. For a brief review of drug delivery methods, see, for example, Langer (Science 249: 1527-1533, 1990 ).

Состав для внутривенной доставки лекарственного средства по настоящему изобретению может содержаться в пакете, ручке или шприце. В определенных вариантах осуществления пакет может быть соединен с каналом, содержащим трубку и/или иглу. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой лиофилизированный состав или жидкий состав. В определенных вариантах осуществления состав может быть высушен вымораживанием (лиофилизирован) и содержаться в около 12-60 флаконах. В некоторых вариантах состав может быть лиофилизирован, и 45 мг лиофилизированного состава может содержаться в одном флаконе. В определенных вариантах осуществления около 40-100 мг лиофилизированного состава может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав из 12, 27 или 45 флаконов объединяют для получения терапевтической дозы белка во внутривенном лекарственном препарате. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой жидкий состав и храниться в количестве от около 250 мг/флакон до около 1000 мг/флакон. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой жидкий состав и храниться в количестве около 600 мг/флакон. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой жидкий состав и храниться в количестве около 250 мг/флакон.The intravenous drug delivery composition of the present invention may be contained in a pouch, pen or syringe. In certain embodiments, the package may be connected to a channel containing a tube and/or a needle. In certain embodiments, the formulation may be a lyophilized formulation or a liquid formulation. In certain embodiments, the formulation may be freeze-dried (lyophilized) and contained in about 12-60 vials. In some embodiments, the formulation may be lyophilized, and 45 mg of the lyophilized formulation may be contained in one vial. In certain embodiments, about 40-100 mg of the lyophilized formulation may be contained in one vial. In some embodiments, a lyophilized formulation of 12, 27, or 45 vials is combined to produce a therapeutic dose of protein in an intravenous drug product. In certain embodiments, the formulation may be a liquid formulation and be stored in an amount of from about 250 mg/vial to about 1000 mg/vial. In certain embodiments, the formulation may be a liquid formulation and stored in an amount of about 600 mg/vial. In certain embodiments, the formulation may be a liquid formulation and stored in an amount of about 250 mg/vial.

Данное настоящее изобретение может существовать в жидком водном фармацевтическом составе, включающем терапевтически эффективное количество белка в забуференном растворе, образующем состав.The present invention may exist in a liquid aqueous pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of protein in a buffered solution forming the composition.

Данные композиции могут быть стерилизованы с помощью обычных способов стерилизации или могут быть стерильно отфильтрованы. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования как есть или лиофилизированы, причем лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным носителем перед введением. рН препаратов обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 или от 6 до 8 и наиболее предпочтительно от 7 до 8, например от 7 до 7,5. Полученные композиции в твердой форме могут быть упакованы в несколько однодозовых емкостей, каждая из которых содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов. Композиция в твердой форме также может быть упакована в контейнер для изменяемого количества.These compositions can be sterilized using conventional sterilization methods or can be sterile filtered. The resulting aqueous solutions may be packaged for use as is or lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous vehicle prior to administration. The pH of the preparations is usually from 3 to 11, more preferably from 5 to 9 or from 6 to 8, and most preferably from 7 to 8, for example from 7 to 7.5. The resulting compositions in solid form can be packaged in multiple single-dose containers, each containing a fixed amount of the above agent or agents. The composition in solid form may also be packaged in a variable quantity container.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается состав с увеличенным сроком хранения, включающая белок по настоящему изобретению, в комбинации с маннитом, моногидратом лимонной кислоты, цитратом натрия, дигидратом динатрийфосфата, дигидратом дигидрофосфата натрия, хлоридом натрия, полисорбатом 80, водой и гидроксидом натрия.In some embodiments, the present invention provides an extended shelf life formulation comprising a protein of the present invention in combination with mannitol, citric acid monohydrate, sodium citrate, disodium phosphate dihydrate, sodium dihydrogen phosphate dihydrate, sodium chloride, polysorbate 80, water and sodium hydroxide.

В определенных вариантах осуществления готовят водный состав, включающий белок по настоящему изобретению в рН-буферном растворе. Буфер по данному изобретению может иметь рН в диапазоне от около 4 до около 8, например от около 4,5 до около 6,0 или от около 4,8 до около 5,5 или может иметь рН от около 5,0 до около 5,2. Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше значениям рН, также должны быть частью этого раскрытия. Например, диапазоны значений, использующие комбинацию любого из приведенных выше значений в качестве верхнего и/или нижнего пределов, пред- 33 044644 назначены для включения. Примеры буферов, которые будут регулировать рН в этом диапазоне, включают ацетатные (например, ацетат натрия), сукцинатные (такие как сукцинат натрия), глюконатные, гистидиновые, цитратные и другие буферы органических кислот.In certain embodiments, an aqueous formulation is prepared comprising the protein of the present invention in a pH buffer solution. The buffer of this invention may have a pH in the range of about 4 to about 8, such as from about 4.5 to about 6.0 or from about 4.8 to about 5.5, or may have a pH from about 5.0 to about 5 ,2. Ranges intermediate to the above pH values should also be part of this disclosure. For example, value ranges that use a combination of any of the above values as upper and/or lower limits are intended to be included. Examples of buffers that will adjust the pH in this range include acetate (such as sodium acetate), succinate (such as sodium succinate), gluconate, histidine, citrate and other organic acid buffers.

В определенных вариантах осуществления состав включает буферную систему, которая содержит цитрат и фосфат для поддержания рН в диапазоне от около 4 до около 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон рН может составлять от около 4,5 до около 6,0 или от около 4,8 до около 5,5, или диапазон рН от около 5,0 до около 5,2. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, фосфат динатрия дигидрат и/или дигидрофосфат натрия дигидрат. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает около 1,3 мг/мл лимонной кислоты (например, 1,305 мг/мл), около 0,3 мг/мл цитрата натрия (например, 0,305 мг/мл), около 1,5 мг/мл фосфата динатрий дигидрата (например, 1,53 мг/мл), около 0,9 мг/мл дигидрофосфата натрия дигидрата (например, 0,86) и около 6,2 мг/мл хлорида натрия (например, 6,165 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления буферная система включает 1-1,5 мг/мл лимонной кислоты, от 0,25 до 0,5 мг/мл цитрата натрия, от 1,25 до 1,75 мг/мл динатрия фосфата дигидрата, от 0,7 до 1,1 мг/мл натрия дигидрофосфата дигидрата и от 6,0 до 6,4 мг/мл хлорида натрия. В определенных вариантах осуществления рН состав корректируют с помощью гидроксида натрия.In certain embodiments, the formulation includes a buffer system that contains citrate and phosphate to maintain the pH in the range of about 4 to about 8. In some embodiments, the pH range can be from about 4.5 to about 6.0 or from about 4.8 to about 5.5, or a pH range from about 5.0 to about 5.2. In some embodiments, the buffer system includes citric acid monohydrate, sodium citrate, disodium phosphate dihydrate, and/or sodium dihydrogen phosphate dihydrate. In some embodiments, the buffer system includes about 1.3 mg/mL citric acid (e.g., 1.305 mg/mL), about 0.3 mg/mL sodium citrate (e.g., 0.305 mg/mL), about 1.5 mg/mL disodium phosphate dihydrate (eg, 1.53 mg/ml), about 0.9 mg/ml sodium dihydrogen phosphate dihydrate (eg, 0.86), and about 6.2 mg/ml sodium chloride (eg, 6.165 mg/ml). In some embodiments, the buffer system includes 1 to 1.5 mg/mL citric acid, 0.25 to 0.5 mg/mL sodium citrate, 1.25 to 1.75 mg/mL disodium phosphate dihydrate, 0. 7 to 1.1 mg/ml sodium dihydrogen phosphate dihydrate and 6.0 to 6.4 mg/ml sodium chloride. In certain embodiments, the pH of the composition is adjusted using sodium hydroxide.

Полиол, который действует как тонизирующий агент и может стабилизировать антитело, также может быть включен в состав. Полиол добавляют к композиции в количестве, которое может варьироваться в зависимости от желаемой изотоничности состава. В определенных вариантах осуществления водный состав может быть изотоническим. Количество добавляемого полиола также может быть изменено по отношению к молекулярной массе полиола. Например, может быть добавлено меньшее количество моносахарида (например, маннита) по сравнению с дисахаридом (таким, как трегалоза). В некоторых вариантах осуществления полиол, который может быть использован в составе в качестве средства, регулирующего тоничность, представляет собой маннит. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять от около 5 до около 20 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять около 7,5-15 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять около 10-14 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять около 12 мг/мл. В определенных вариантах осуществления полиол сорбит может быть включен в состав.A polyol that acts as a tonic and can stabilize the antibody may also be included. The polyol is added to the composition in an amount that may vary depending on the desired isotonicity of the composition. In certain embodiments, the aqueous composition may be isotonic. The amount of polyol added can also be varied relative to the molecular weight of the polyol. For example, a smaller amount of a monosaccharide (such as mannitol) may be added compared to a disaccharide (such as trehalose). In some embodiments, the polyol that can be used in the composition as a tonicity control agent is mannitol. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be from about 5 to about 20 mg/ml. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be about 7.5-15 mg/ml. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be about 10-14 mg/ml. In certain embodiments, the concentration of mannitol may be about 12 mg/ml. In certain embodiments, a sorbitol polyol may be included in the composition.

Также могут быть добавлены в состав детергент или поверхностно-активное вещество. Типовые детергенты включают неионогенные детергенты, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавляемого детергента таково, что оно уменьшает агрегацию составленного антитела и/или сводит к минимуму образование частиц в составе, и/или уменьшает адсорбцию. В определенных вариантах осуществления состав может включать поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат. В некоторых вариантах осуществления состав может содержать детергент полисорбат 80 или Твин 80. Твин 80 представляет собой термин, используемый для описания полиоксиэтилена (20) сорбитанмоноолеата (см., Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996). В некоторых вариантах осуществления состав может содержать от около 0,1 до около 10 мг/мл полисорбата 80 или от около 0,5 до около 5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления около 0,1% полисорбата 80 может быть добавлено в состав.A detergent or surfactant may also be added to the formulation. Exemplary detergents include nonionic detergents such as polysorbates (eg, polysorbates 20, 80, etc.) or poloxamers (eg, poloxamer 188). The amount of detergent added is such that it reduces aggregation of the formulated antibody and/or minimizes the formation of particles in the composition and/or reduces adsorption. In certain embodiments, the composition may include a surfactant that is a polysorbate. In some embodiments, the composition may contain the detergent polysorbate 80 or Tween 80. Tween 80 is the term used to describe polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (see, Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996). In some embodiments, the formulation may contain from about 0.1 to about 10 mg/ml polysorbate 80 or from about 0.5 to about 5 mg/ml. In some embodiments, about 0.1% polysorbate 80 may be added to the formulation.

В вариантах осуществления белковый продукт по настоящему изобретению составлен в виде жидком составе. Жидкий состав может быть представлен в концентрации 10 мг/мл во флаконе согласно фармокопее США/Ерв. Фарм. тип I 50R, закрытом резиновой пробкой и запечатанном алюминиевым обжимным колпачком. Пробка может быть изготовлена из эластомера, соответствующего фармокопее США и Ерв. Фарм. В некоторых вариантах осуществления флаконы могут быть заполнены 61,2 мл раствора белкового продукта, чтобы обеспечить экстрагируемый объем 60 мл. В определенных вариантах осуществления жидкий состав может быть разбавлен 0,9% солевым раствором.In embodiments, the protein product of the present invention is formulated as a liquid formulation. The liquid formulation can be presented at a concentration of 10 mg/ml in a vial according to USP/Erv. Pharm. type I 50R, closed with a rubber stopper and sealed with an aluminum crimp cap. The stopper can be made of elastomer that complies with USP and ERV. Pharm. In some embodiments, the vials may be filled with 61.2 mL of protein product solution to provide an extractable volume of 60 mL. In certain embodiments, the liquid formulation may be diluted with a 0.9% saline solution.

В определенных вариантах осуществления жидкий состав по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде раствора с концентрацией 10 мг/мл в комбинации с сахаром при стабилизирующих уровнях. В определенных вариантах осуществления жидкий состав может быть приготовлен на водном носителе. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор может быть добавлен в количестве, не превышающем того, которое может привести к вязкости, нежелательной или непригодной для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления сахар может быть дисахаридами, например, сахарозой. В определенных вариантах осуществления жидкий состав также может включать один или более из буферного агента, поверхностно-активного вещества и консерванта.In certain embodiments, the liquid composition of the present invention can be formulated as a solution at a concentration of 10 mg/ml in combination with sugar at stabilizing levels. In certain embodiments, the liquid composition may be formulated in an aqueous carrier. In some embodiments, the stabilizer may be added in an amount no greater than that which would result in a viscosity undesirable or unsuitable for intravenous administration. In some embodiments, the sugar may be a disaccharide, such as sucrose. In certain embodiments, the liquid formulation may also include one or more of a buffering agent, a surfactant, and a preservative.

В некоторых вариантах осуществления рН жидкого состава может быть установлен путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может представлять собой соляную кислоту. В определенных вариантах осуществления основание может представлять собой гидроксид натрия.In some embodiments, the pH of the liquid formulation may be adjusted by adding a pharmaceutically acceptable acid and/or base. In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable acid may be hydrochloric acid. In certain embodiments, the base may be sodium hydroxide.

В дополнение к агрегации, дезамидирование представляет собой распространенный вариант продукта пептидов и белков, который может происходить во время ферментации, сбора/осветления клеток, очистки, хранения действующего вещества/лекарственного продукта и во время анализа образца. Деза- 34 044644 мидирование представляет собой потерю группы NH3 из белка, образующего промежуточный сукцинимид, который может подвергаться гидролизу. Промежуточный сукцинимид приводит к снижению массы исходного пептида на 17 дальтон. Последующий гидролиз приводит к увеличению массы на 18 дальтон. Выделение промежуточного сукцинимида затруднено из-за нестабильности в водных условиях. Таким образом, дезамидирование обычно определяется как увеличение массы на 1 дальтон. Дезамидирование аспарагина приводит к аспарагиновой или изоаспарагиновой кислоте. Параметры, влияющие на скорость дезамидирования, включают рН, температуру, диэлектрическую проницаемость растворителя, ионную силу, первичную последовательность, локальную конформацию полипептида и третичную структуру. Аминокислотные остатки, находящиеся вблизи с Asn в пептидной цепи, влияют на скорости дезамидирования. Gly и Ser, следующие за Asn в белковых последовательностях, приводят к более высокой восприимчивости к дезамидированию.In addition to aggregation, deamidation is a common product variant of peptides and proteins that can occur during fermentation, cell collection/clarification, purification, active ingredient/drug product storage, and during sample analysis. Deamidation is the loss of an NH3 group from a protein, forming a succinimide intermediate that can undergo hydrolysis. The succinimide intermediate reduces the mass of the parent peptide by 17 daltons. Subsequent hydrolysis results in an increase in mass of 18 daltons. Isolation of the succinimide intermediate is difficult due to instability under aqueous conditions. Thus, deamidation is usually defined as an increase in mass of 1 Dalton. Deamidation of asparagine results in aspartic or isoaspartic acid. Parameters affecting the rate of deamidation include pH, temperature, solvent dielectric constant, ionic strength, primary sequence, local polypeptide conformation, and tertiary structure. Amino acid residues located close to Asn in the peptide chain affect the rate of deamidation. Gly and Ser following Asn in protein sequences result in higher susceptibility to deamidation.

В определенных вариантах осуществления жидкий состав по настоящему изобретению может быть сохранен в условиях рН и влажности для предотвращения дезаминирования белкового продукта.In certain embodiments, the liquid composition of the present invention may be maintained under pH and humidity conditions to prevent deamination of the protein product.

Представляющий интерес водный носитель в настоящем документе является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкого состава. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI - англ. sterile water for injection), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI - bacteriostatic water for injection), pHбуферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.The aqueous carrier of interest herein is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic for administration to humans) and useful for the preparation of a liquid formulation. Exemplary vehicles include sterile water for injection (SWFI), bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffer solution (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution.

В составы необязательно может быть добавлен консервант для уменьшения бактериального действия. Добавление консерванта может, например, облегчать производство многоразового (многократного) состава.A preservative may optionally be added to the formulations to reduce bacterial action. The addition of a preservative may, for example, facilitate the production of a reusable (reusable) formulation.

Составы для внутривенного введения (ВВ) могут быть предпочтительным путем введения в конкретных случаях, например, когда пациент находится в больнице после трансплантации, получая все лекарственные средства посредством ВВ введения. В некоторых вариантах осуществления перед введением жидкий состав разбавляют 0,9% раствором хлорида натрия. В определенных вариантах осуществления разбавленный лекарственное средство для инъекций является изотоническим и подходит для введения посредством внутривенной инфузии.Intravenous (IV) formulations may be the preferred route of administration in specific cases, for example, when a patient is in the hospital after a transplant receiving all medications via IV administration. In some embodiments, the liquid formulation is diluted with a 0.9% sodium chloride solution prior to administration. In certain embodiments, the diluted injectable drug is isotonic and suitable for administration by intravenous infusion.

В некоторых вариантах осуществления соли или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и получены из различных известных кислот (неорганических и органических) с металлами или аминами, образующими основание. В определенных вариантах осуществления буфер может представлять собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой глицинатный, карбонатный, цитратный буферы, и в этом случае ионы натрия, калия или аммония могут служить в качестве противоиона.In some embodiments, salts or buffer components may be added in an amount of 10-200 mM. Salts and/or buffers are pharmaceutically acceptable and are derived from various known acids (inorganic and organic) with metals or amines forming the base. In certain embodiments, the buffer may be a phosphate buffer. In some embodiments, the buffer may be a glycinate, carbonate, citrate buffer, in which case sodium, potassium, or ammonium ions may serve as a counterion.

В составы необязательно может быть добавлен консервант для уменьшения бактериального действия. Добавление консерванта может, например, облегчать производство многоразового (многократного) состава.A preservative may optionally be added to the formulations to reduce bacterial action. The addition of a preservative may, for example, facilitate the production of a reusable (reusable) formulation.

Представляющий интерес водный носитель в настоящем документе является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкого состава. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.The aqueous carrier of interest herein is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic for administration to humans) and useful for the preparation of a liquid formulation. Exemplary vehicles include sterile water for injection (SWFI), bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffered solution (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution.

Данное настоящее изобретение может существовать в лиофилизированном составе, включающем белки и лиопротектор. Лиопротектор может быть сахаром, например дисахаридами. В определенных вариантах осуществления ликопротектор может представлять собой сахарозу или мальтозу. Лиофилизированный состав может также включать один или более из буферного агента, поверхностно-активного вещества, наполнителя и/или консерванта.This present invention may exist in a lyophilized formulation comprising proteins and a lyoprotectant. The lyoprotectant may be a sugar, such as a disaccharide. In certain embodiments, the lycoprotectant may be sucrose or maltose. The lyophilized formulation may also include one or more of a buffering agent, a surfactant, an excipient and/or a preservative.

Количество сахарозы или мальтозы, пригодное для стабилизации лиофилизированного лекарственного средства, может быть в массовом соотношении по меньшей мере 1:2 белка к сахарозе или мальтозе. В некоторых вариантах осуществления массовое соотношение белок/сахароза или мальтоза может составлять от 1:2 до 1:5.The amount of sucrose or maltose suitable for stabilizing the lyophilized drug may be in a weight ratio of at least 1:2 protein to sucrose or maltose. In some embodiments, the protein/sucrose or maltose weight ratio may be from 1:2 to 1:5.

В некоторых вариантах осуществления рН состава перед лиофилизацией может быть установлен путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может представлять собой хлористоводородную кислоту. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемым основанием может быть гидроксид натрия.In some embodiments, the pH of the formulation may be adjusted prior to lyophilization by adding a pharmaceutically acceptable acid and/or base. In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable acid may be hydrochloric acid. In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable base may be sodium hydroxide.

Перед лиофилизацией рН раствора, содержащего белок по настоящему изобретению, может быть отрегулировано в диапазоне от 6 до 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон рН для лиофилизированного лекарственного средства может составлять от 7 до 8.Before lyophilization, the pH of the solution containing the protein of the present invention may be adjusted to a range of 6 to 8. In some embodiments, the pH range for the lyophilized drug may be 7 to 8.

В некоторых вариантах осуществления соли или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и получены из раз- 35 044644 личных известных кислот (неорганических и органических) с металлами или аминами, образующими основание. В определенных вариантах осуществления буфер может представлять собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой глицинатный, карбонатный, цитратный буферы, и в этом случае ионы натрия, калия или аммония могут служить в качестве противоиона.In some embodiments, salts or buffer components may be added in an amount of 10-200 mM. Salts and/or buffers are pharmaceutically acceptable and are derived from various known acids (inorganic and organic) with metals or amines forming the base. In certain embodiments, the buffer may be a phosphate buffer. In some embodiments, the buffer may be a glycinate, carbonate, citrate buffer, in which case sodium, potassium, or ammonium ions may serve as a counterion.

В определенных вариантах осуществления может быть добавлен наполнитель. Наполнитель представляет собой соединение, которое добавляет массу к лиофилизированной смеси и вносит вклад в физическую структуру лиофилизированной массы (например, облегчает производство по существу однородной лиофилизированной массы, которая поддерживает открытопористую структуру). Иллюстративные наполнители включают маннит, глицин, полиэтиленгликоль и сорбит. Лиофилизированные составы по настоящему изобретению могут содержать такие наполнители.In certain embodiments, filler may be added. An excipient is a compound that adds bulk to the lyophilized mixture and contributes to the physical structure of the lyophilized mass (eg, facilitates the production of a substantially uniform lyophilized mass that maintains an open-cell structure). Exemplary excipients include mannitol, glycine, polyethylene glycol, and sorbitol. The lyophilized compositions of the present invention may contain such excipients.

В составы необязательно может быть добавлен консервант для уменьшения бактериального действия. Добавление консерванта может, например, облегчать производство многоразового (многократного) состава.A preservative may optionally be added to the formulations to reduce bacterial action. The addition of a preservative may, for example, facilitate the production of a reusable (reusable) formulation.

В определенных вариантах осуществления лиофилизированное лекарственное средство может быть составлено с водным носителем. Представляющий интерес водный носитель в настоящем документе является фармацевтически приемлемым (например, безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкого состава после лиофилизации. Иллюстративные разбавители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рНбуферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.In certain embodiments, the lyophilized drug may be formulated with an aqueous carrier. The aqueous carrier of interest herein is pharmaceutically acceptable (eg, safe and non-toxic for administration to humans) and useful for preparing a liquid formulation after lyophilization. Exemplary diluents include sterile water for injection (SWFI), bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffer solution (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution.

В определенных вариантах осуществления лиофилизированное лекарственное средство по настоящему изобретению восстанавливают либо стерильной водой для инъекций, фармакопея США (USP) (SWFI), либо 0,9% инъекцией хлорида натрия, фармакопея США. Во время восстановления лиофилизированный порошок растворяют в растворе.In certain embodiments, the lyophilized drug of the present invention is reconstituted with either Sterile Water for Injection, USP (SWFI) or 0.9% Sodium Chloride Injection, USP. During reconstitution, the lyophilized powder is dissolved in the solution.

В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный белковый продукт по настоящему изобретению восстанавливают до около 4,5 мл водой для инъекций и разбавляют 0,9% солевым раствором (раствор хлорида натрия).In some embodiments, the lyophilized protein product of the present invention is reconstituted to about 4.5 ml with water for injection and diluted with 0.9% saline (sodium chloride solution).

Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут быть изменены таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, не будучи токсичным для пациента.The actual dosage levels of the active ingredients in the pharmaceutical compositions of the present invention may be adjusted to provide an amount of the active ingredient that is effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition, and route of administration without being toxic to the patient.

Конкретная доза может представлять собой унифицированную дозу для каждого пациента, например, 50-5000 мг белка. Альтернативно, доза пациента может быть адаптирована к приблизительной массе тела или площади поверхности пациента. Другие факторы при определении подходящей дозировки могут включать заболевание или патологическое состояние, которое нужно лечить или предупреждать, тяжесть заболевания, способ введения, а также возраст, пол и состояние здоровья пациента. Специалисты в данной области техники обычно проводят дальнейшее уточнение расчетов, необходимых для определения подходящей дозировки для лечения, особенно в свете информации о дозировке и тестов, раскрытых в настоящем документе. Дозировка также может быть определена путем использования известных анализов для определения доз, используемых вместе с соответствующими данными доза-ответ. Дозировка индивидуального пациента может быть скорректирована по мере наблюдения за развитием заболевания. Уровни в крови целевой конструкции или комплекса у пациента могут быть измерены, чтобы увидеть, нужно ли корректировать дозировку для достижения или поддержания эффективной концентрации. Фармакогеномика может быть использована для определения того, какие целевые конструкции и/или комплексы, и их дозировки, наиболее вероятно, будут эффективными для данного индивидуума (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).The specific dose may be a uniform dose for each patient, for example, 50-5000 mg of protein. Alternatively, the patient's dose may be tailored to the patient's approximate body weight or surface area. Other factors in determining the appropriate dosage may include the disease or condition being treated or prevented, the severity of the disease, the route of administration, and the age, sex, and medical condition of the patient. Those skilled in the art will routinely refine the calculations necessary to determine the appropriate dosage for treatment, especially in light of the dosage information and tests disclosed herein. Dosage can also be determined by using known dose determination assays used in conjunction with appropriate dose-response data. An individual patient's dosage may be adjusted as disease progression is monitored. Blood levels of the target construct or complex in a patient can be measured to see if dosage adjustments need to be made to achieve or maintain an effective concentration. Pharmacogenomics can be used to determine which target constructs and/or complexes, and their dosages, are most likely to be effective for a given individual (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).

В общем, дозировки, основанные на массе тела, находятся в пределах от около 0,01 мкг до около 100 мг/кг массы тела, например, от около 0,01 мкг до около 100 мг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 50 мг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 10 мг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 1 мг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 100 мкг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 50 мкг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 10 мкг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 1 мкг/кг массы тела, от около 0,01 мкг до около 0,1 мкг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 100 мг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 50 мг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 10 мг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 1 мг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 100 мкг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 10 мкг/кг массы тела, от около 0,1 мкг до около 1 мкг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 100 мг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 50 мг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 10 мг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 1 мг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 100 мкг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 50 мкг/кг массы тела, от около 1 мкг до около 10 мкг/кг массы тела, от около 10 мкг до около 100 мг/кг массы тела, от около 10 мкг до около 50 мг/кг массы тела, от около 10 мкг до около 10 мг/кг массы тела, от около 10 мкг до около 1 мг/кг массы тела, от около 10 мкг до около 100 мкг/кг массы тела, от около 10 мкг до около 50 мкг/кг массы тела, от около 50 мкг до около 100 мг/кг массы тела, отIn general, dosages based on body weight range from about 0.01 μg to about 100 mg/kg body weight, for example, from about 0.01 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 0.01 µg to about 50 mg/kg body weight, from about 0.01 µg to about 10 mg/kg body weight, from about 0.01 µg to about 1 mg/kg body weight, from about 0.01 µg to about 100 µg /kg body weight, from about 0.01 μg to about 50 μg/kg body weight, from about 0.01 μg to about 10 μg/kg body weight, from about 0.01 μg to about 1 μg/kg body weight, from about 0.01 μg to about 0.1 μg/kg body weight, from about 0.1 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 0.1 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 0 .1 µg to about 10 mg/kg body weight, from about 0.1 µg to about 1 mg/kg body weight, from about 0.1 µg to about 100 µg/kg body weight, from about 0.1 µg to about 10 µg/kg body weight, from about 0.1 µg to about 1 µg/kg body weight, from about 1 µg to about 100 mg/kg body weight, from about 1 µg to about 50 mg/kg body weight, from about 1 µg to about 10 mg/kg body weight, from about 1 µg to about 1 mg/kg body weight, from about 1 µg to about 100 µg/kg body weight, from about 1 µg to about 50 µg/kg body weight, from about 1 μg to about 10 μg/kg body weight, from about 10 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 10 mg/kg body weight body, from about 10 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 10 μg to about 100 μg/kg body weight, from about 10 μg to about 50 μg/kg body weight, from about 50 μg to about 100 mg/ kg body weight, from

- 36 044644 около 50 мкг до около 50 мг/кг массы тела, от около 50 мкг до около 10 мг/кг массы тела, от около 50 мкг до около 1 мг/кг массы тела, от около 50 мкг до около 100 мкг/кг массы тела, от около 100 мкг до около 100 мг/кг массы тела, от около 100 мкг до около 50 мг/кг массы тела, от около 100 мкг до около 10 мг/кг массы тела, от около 100 мкг до около 1 мг/кг массы тела, от около 1 мг до около 100 мг/кг массы тела, от около 1 мг до около 50 мг/кг массы тела, от около 1 мг до около 10 мг/кг массы тела, от около 10 мг до около 100 мг/кг массы тела, от около 10 мг до около 50 мг/кг массы тела, от около 50 мг до около 100 мг/кг массы тела.- 36 044644 about 50 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 10 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 50 μg to about 100 μg/ kg body weight, from about 100 μg to about 100 mg/kg body weight, from about 100 μg to about 50 mg/kg body weight, from about 100 μg to about 10 mg/kg body weight, from about 100 μg to about 1 mg/kg body weight, from about 1 mg to about 100 mg/kg body weight, from about 1 mg to about 50 mg/kg body weight, from about 1 mg to about 10 mg/kg body weight, from about 10 mg to about 100 mg/kg body weight, from about 10 mg to about 50 mg/kg body weight, from about 50 mg to about 100 mg/kg body weight.

Дозы могут вводиться один или более раз в день, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже один раз каждые 2-20 лет. Специалисты в данной области техники могут легко оценить частоту повторения для дозирования на основании измеренных времен пребывания и концентраций целевой конструкции или комплекса в жидкостях или тканях организма. Введение по настоящему изобретению может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, внутриполостным, с помощью перфузий через катетер или с помощью прямой инъекции в очаг поражения. Это может осуществляться один или более раз в день, один или более раз в неделю, один или более раз в месяц и один или более раз в год.Doses may be administered one or more times daily, weekly, monthly or annually, or even once every 2 to 20 years. Those skilled in the art can readily estimate the repetition frequency for dosing based on the measured residence times and concentrations of the target construct or complex in body fluids or tissues. Administration of the present invention may be intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intrapleural, intrathecal, intracavitary, by perfusion through a catheter, or by direct injection into the lesion. This may occur one or more times per day, one or more times per week, one or more times per month, and one or more times per year.

Вышеприведенное описание описывает множество аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения. В заявке на патент конкретно рассматриваются все комбинации и варианты аспектов, и вариантов осуществления.The above description describes many aspects and embodiments of the present invention. The patent application specifically addresses all combinations and variations of aspects and embodiments.

ПримерыExamples

Теперь настоящее изобретение, в целом описанное ранее, будет более легко понято со ссылкой на следующие примеры, которые включены только в целях иллюстрации определенных аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретения.The present invention, as generally described above, will now be more readily understood with reference to the following examples, which are included only for the purpose of illustrating certain aspects and embodiments of the present invention and are not intended to limit the invention.

Пример 1 - NKG2D-связывающие домены связываются с NKG2DExample 1 - NKG2D-binding domains bind to NKG2D

NKG2D-связывающие домены связываются с очищенным рекомбинантным NKG2DNKG2D-binding domains bind to purified recombinant NKG2D

Последовательности нуклеиновых кислот эктодоменов NKG2D человека, мыши или яванского макака были слиты с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими Fc-домены IgG1 человека, и введены в клетки млекопитающих для экспрессии. После очистки белки слияния NKG2D-Fc адсорбировали в лунках микропланшетов. После блокирования лунок бычьим сывороточным альбумином для предотвращения неспецифического связывания NKG2D-связывающие домены титровали и добавляли в лунки, с предварительно адсорбированными белками слияния NKG2D-Fc. Связывание первичного антитела определяли с использованием вторичного антитела, которое конъюгировали с пероксидазой хрена и специфически распознавали легкую цепь каппа человека, чтобы избежать перекрестной реактивности с Fc. 3,3,5,5'-Тетраметилбензидин (ТМВ), субстрат для пероксидазы хрена, добавляли в лунки для визуализации сигнала связывания, у которого измеряли оптическую плотность при 450 нм и корректировали при 540 нМ. Клон NKG2D-связывающего домена, контрольный изотип или положительный контроль (выбранный из (SEQ ID NO: 45-48 или клоны к мышиному NKG2D MI-6 и СХ-5, доступные от eBioscience) добавляли в каждую лунку.Nucleic acid sequences from human, mouse, or cynomolgus NKG2D ectodomains were fused to nucleic acid sequences encoding human IgG1 Fc domains and introduced into mammalian cells for expression. After purification, the NKG2D-Fc fusion proteins were adsorbed into the wells of microplates. After blocking the wells with bovine serum albumin to prevent nonspecific binding, NKG2D-binding domains were titrated and added to wells preadsorbed with NKG2D-Fc fusion proteins. Primary antibody binding was determined using a secondary antibody that was conjugated to horseradish peroxidase and specifically recognized human kappa light chain to avoid cross-reactivity with Fc. 3,3,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB), a substrate for horseradish peroxidase, was added to the wells to visualize the binding signal, whose absorbance was measured at 450 nm and corrected at 540 nM. An NKG2D binding domain clone, isotype control, or positive control (selected from (SEQ ID NOs: 45-48 or murine NKG2D clones MI-6 and CX-5, available from eBioscience) was added to each well.

Контрольный изотип показал минимальное связывание с рекомбинантными белками NKG2D-Fc, в то время как положительный контроль наиболее сильно связывался с рекомбинантными антигенами. NKG2D-связывающие домены, вырабатываемые всеми клонами, демонстрировали связывание с рекомбинантными белками NKG2D-Fc человека, мыши и яванского макака, хотя с разным сродством от клона к клону. Как правило, каждый клон к NKG2D, связывается с рекомбинантным NKG2D-Fc человека (фиг. 14) и яванского макака (фиг. 15), со сходным сродством, но с более низким сродством с рекомбинантным NKG2D-Fc мыши (фиг. 16).The isotype control showed minimal binding to recombinant NKG2D-Fc proteins, while the positive control bound most strongly to recombinant antigens. The NKG2D-binding domains produced by all clones showed binding to recombinant human, mouse, and cynomolgus NKG2D-Fc proteins, although with varying affinities from clone to clone. Typically, each clone to NKG2D binds to recombinant human (FIG. 14) and cynomolgus (FIG. 15) NKG2D-Fc with similar affinity but lower affinity to recombinant mouse NKG2D-Fc (FIG. 16).

NKG2D-связывающие домены связываются с клетками, экспрессирующими NKG2DNKG2D-binding domains bind to cells expressing NKG2D

Линии клеток EL4 лимфомы мыши были сконструированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов сигнального домена NKG2D-CD3-дзета человека или мыши. NKG2D-связывающий клон, контрольный изотип или положительный контроль использовали в концентрации 100 нМ для окрашивания внеклеточного NKG2D, экспрессированного на поверхности клеток EL4. Связывание антител определяли с использованием конъюгированных с флуорофором вторичных антител к IgG человека. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали соотношение сигнала по сравнению с фоном (FOB - fold-over-background) с использованием среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) NKG2D-экспрессирующих клеток по сравнению с исходными клетками EL4.Mouse lymphoma EL4 cell lines were engineered to express chimeric antigen receptors of the human or mouse NKG2D-CD3-zeta signaling domain. NKG2D-binding clone, isotype control, or positive control was used at a concentration of 100 nM to stain extracellular NKG2D expressed on the surface of EL4 cells. Antibody binding was determined using fluorophore-conjugated secondary anti-human IgG antibodies. Cells were analyzed by flow cytometry and fold-over-background (FOB) ratio was calculated using the mean fluorescence intensity (MFI) of NKG2D-expressing cells compared to parental EL4 cells.

NKG2D-связывающие домены, вырабатываемые всеми клонами, связывались с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека и мыши. Антитела положительного контроля (выбранные из (SEQ ID NO: 45-48 или клоны к мышиному NKG2D MI-6 и СХ-5, доступные от eBioscience) давали лучший сигнал связывания FOB. Аффинность связывания NKG2D для каждого клона была сходной между клетками, экспрессирующими NKG2D человека (фиг. 17) и мыши (фиг. 18).NKG2D-binding domains produced by all clones bound to EL4 cells expressing human and mouse NKG2D. Positive control antibodies (selected from (SEQ ID NO: 45-48 or anti-mouse NKG2D clones MI-6 and CX-5, available from eBioscience) gave the best FOB binding signal. NKG2D binding affinity for each clone was similar between cells expressing NKG2D human (Fig. 17) and mouse (Fig. 18).

Пример 2 -NKG2D-связывающие домены блокируют связывание природного лиганда с NKG2DExample 2 -NKG2D-binding domains block natural ligand binding to NKG2D

Конкуренция с ULBP-6Competition with ULBP-6

Рекомбинантные белки NKG2D-Fc человека адсорбировали в лунках микропланшета и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для снижения неспецифического связывания. НасыщаюRecombinant human NKG2D-Fc proteins were adsorbed into microplate wells and the wells were blocked with bovine serum albumin to reduce nonspecific binding. Saturating

- 37 044644 щую концентрацию ULBP-6-His-6uoTUHa добавляли в лунки с последующим добавлением клонов NKG2D-связывающих доменов. После 2-часовой инкубации лунки промывали и ULBP-6-His-биотин, который оставался связанным с лунками, покрытыми NKG2D-Fc, определяли стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена, и субстратом ТМВ. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc рассчитывали по проценту ULBP-6-His-биотина, который блокировался от связывания с белками NKG2D-Fc в лунках. Антитело положительного контроля (выбранное из (SEQ ID NO: 45-48) и различные NKG2D-связывающие домены блокировали связывание ULBP-6 с NKG2D, в то время как контрольный изотип показал небольшую конкуренцию с ULBP-6 (фиг. 19).- 37 044644 A full concentration of ULBP-6-His-6uoTUHa was added to the wells, followed by the addition of NKG2D-binding domain clones. After a 2-hour incubation, the wells were washed and the ULBP-6-His-biotin that remained bound to the NKG2D-Fc-coated wells was detected with horseradish peroxidase-conjugated streptavidin and the substrate TMB. Absorbance was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. After background subtraction, specific binding of NKG2D-binding domains to NKG2D-Fc proteins was calculated from the percentage of ULBP-6-His-biotin that was blocked from binding to NKG2D-Fc proteins in the wells. A positive control antibody (selected from (SEQ ID NO: 45-48) and various NKG2D binding domains blocked ULBP-6 binding to NKG2D, while the isotype control showed little competition with ULBP-6 (FIG. 19).

Конкуренция с MICACompetition with MICA

Рекомбинантные белки MICA-Fc человека адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для снижения неспецифического связывания. NKG2D-Fcбиотин добавляли в лунки, после чего добавляли NKG2D-связывающие домены. После инкубации и промывания NKG2D-Fc-6uotuh, который оставался связанным с лунками, покрытыми MICA-Fc, детектировали с использованием стрептавидин-HRP и субстрата ТМВ. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc рассчитывали по проценту NKG2D-Fc-биотина, который блокировался от связывания с белками MICA-Fc в лунках. Антитело положительного контроля (выбранное из SEQ ID NO: 45-48) и различные NKG2D-связывающие домены блокировали связывание MICA с NKG2D, в то время как контрольный изотип показал небольшую конкуренцию с MICA (фиг. 20).Recombinant human MICA-Fc proteins were adsorbed into microplate wells, and the wells were blocked with bovine serum albumin to reduce nonspecific binding. NKG2D-Fcbiotin was added to the wells, followed by the addition of NKG2D binding domains. After incubation and washing, NKG2D-Fc-6uotuh that remained bound to MICA-Fc-coated wells was detected using streptavidin-HRP and TMB substrate. Absorbance was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. After background subtraction, specific binding of NKG2D-binding domains to NKG2D-Fc proteins was calculated from the percentage of NKG2D-Fc-biotin that was blocked from binding to MICA-Fc proteins in the wells. A positive control antibody (selected from SEQ ID NOs: 45-48) and various NKG2D binding domains blocked MICA binding to NKG2D, while the isotype control showed little competition with MICA (FIG. 20).

Конкуренция с Rae-1 дельтаCompetition with Rae-1 delta

Рекомбинантный Rae-1дельта-Fc мыши (приобретенный у R & D Systems) адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифического связывания. NKG2D-Fc-6uotuh мыши добавляли в лунки, после чего добавляли NKG2Dсвязывающие домены. После инкубации и промывания NKG2D-Fc-6uotuh, который оставался связанным с лунками, покрытыми Rae-1дельта-Fc, детектировали с использованием стрептавидин-HRP и субстрата ТМВ. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc рассчитывали по проценту NKG2D-Fc-биотина, который блокировался от связывания с белками Rae-1дельта-Fc в лунках. Положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO: 45-48 или клонов к мышиному NKG2D MI-6 и СХ-5, доступных от eBioscience) и различные клоны NKG2D-связывающего домена блокировали связывание Rae-1дельта с NKG2D мыши, в то время как контрольный изотип антитела демонстрировал небольшую конкуренцию с Rae-1дельта (фиг. 21).Recombinant mouse Rae-1delta-Fc (purchased from R&D Systems) was adsorbed to microplate wells, and the wells were blocked with bovine serum albumin to reduce nonspecific binding. Mouse NKG2D-Fc-6uotuh was added to the wells, followed by the addition of NKG2D binding domains. After incubation and washing, NKG2D-Fc-6uotuh that remained bound to Rae-1delta-Fc-coated wells was detected using streptavidin-HRP and TMB substrate. Absorbance was measured at 450 nM and corrected at 540 nM. After background subtraction, specific binding of NKG2D-binding domains to NKG2D-Fc proteins was calculated from the percentage of NKG2D-Fc-biotin that was blocked from binding to Rae-1delta-Fc proteins in the wells. Positive control (selected from SEQ ID NO: 45-48 or the mouse NKG2D clones MI-6 and CX-5 available from eBioscience) and various NKG2D-binding domain clones blocked Rae-1delta binding to mouse NKG2D, while the control the antibody isotype showed little competition with Rae-1delta (Fig. 21).

Пример 3 - клоны NKG2D-связывающего домена активируют NKG2DExample 3 - NKG2D-binding domain clones activate NKG2D

Последовательности нуклеиновых кислот NKG2D человека и мыши были слиты с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими сигнальный домен CD3-дзета, для получения конструкций химерного антигенного рецептора (CAR). Конструкции NKG2D-CAR затем клонировали в ретровирусный вектор с использованием сборки Гибсона и трансфицировали в клетки expi293 для получения ретровируса. Клетки EL4 инфицировали вирусами, содержащими NKG2D-CAR вместе с 8 мкг/мл полибрена. Через 24 ч после заражения уровни экспрессии NKG2D-CAR в клетках EL4 анализировали проточной цитометрией и отбирали клоны, которые экспрессируют высокие уровни NKG2D-CAR на клеточной поверхности.Human and mouse NKG2D nucleic acid sequences were fused to nucleic acid sequences encoding the CD3-zeta signaling domain to generate chimeric antigen receptor (CAR) constructs. The NKG2D-CAR constructs were then cloned into a retroviral vector using Gibson assembly and transfected into expi293 cells to produce retrovirus. EL4 cells were infected with viruses containing NKG2D-CAR along with 8 μg/ml polybrene. At 24 h postinfection, NKG2D-CAR expression levels in EL4 cells were analyzed by flow cytometry, and clones that expressed high levels of NKG2D-CAR on the cell surface were selected.

Чтобы определить, активируют ли NKG2D-связывающие домены NKG2D, их адсорбировали в лунках микропланшета, и NKG2D-CAR EL4 клетки культивировали в лунках, покрытых фрагментом антитела, в течение 4 ч в присутствии брефельдина-А и монензина. Внутриклеточную выработку TNF-альфа, индикатора активации NKG2D, анализировали с помощью проточной цитометрии. Процент TNF-альфаположительных клеток был нормализован по отношению к клеткам, обработанным положительным контролем. Все NKG2D-связывающие домены активировали NKG2D человека (фиг. 22) и мыши (фиг. 23).To determine whether NKG2D binding domains activate NKG2D, they were adsorbed to microplate wells, and NKG2D-CAR EL4 cells were cultured in antibody fragment-coated wells for 4 h in the presence of brefeldin-A and monensin. Intracellular production of TNF-alpha, an indicator of NKG2D activation, was analyzed by flow cytometry. The percentage of TNF-alpha-positive cells was normalized to that of positive control-treated cells. All NKG2D-binding domains activated human (FIG. 22) and mouse (FIG. 23) NKG2D.

Пример 4 - NKG2D-связывающие домены активируют NK-клеткиExample 4 - NKG2D-binding domains activate NK cells

Первичные NK-клетки человекаPrimary human NK cells

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС - Peripheral blood mononuclear cells) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3- CD56+) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных бус из РВМС, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 95%. Затем выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, в течение 24-48 ч, после чего их переносили в лунки микропланшета, на которых были адсорбированы NKG2D-связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором антитело к CD107а, брефельдинА и монензин. После культивирования NK-клетки анализировали проточной цитометрией с использованием конъюгированных с флуорофором антител к CD3, CD56 и IFN-гамма. CD107а и IFN-гамма окрашивания были проанализированы в CD3- CD56+ клетках для оценки NK-клеточной активации. Увеличение числа CD107a/IFN-гамма дважды положительных клеток свидетельствует о лучшей активации NKклеток за счет вовлечения двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора. NKG2D-связывающиеPeripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the buffy platelet layer of peripheral blood using density gradient centrifugation. NK cells (CD3 - CD56+) were isolated using negative selection using magnetic beads from PBMCs, and the purity of the isolated NK cells was typically >95%. Then the isolated NK cells were cultured in a medium containing 100 ng/ml IL-2 for 24-48 hours, after which they were transferred into microplate wells on which NKG2D-binding domains were adsorbed and cultured in a medium containing conjugated fluorophore antibody to CD107a, brefeldinA and monensin. After culture, NK cells were analyzed by flow cytometry using fluorophore-conjugated antibodies to CD3, CD56, and IFN-gamma. CD107a and IFN-gamma staining were analyzed in CD3 - CD56+ cells to assess NK cell activation. The increase in the number of CD107a/IFN-gamma double positive cells indicates better activation of NK cells due to the involvement of two activating receptors rather than a single receptor. NKG2D-binders

- 38 044644 домены и положительный контроль (выбранный из (SEQ ID NO: 45-48) показали, что более высокий процент NK-клеток становится CD107a+b IFN-гамма +, по сравнению с контрольным изотипом (фиг. 24 и фиг. 25 представляют два независимых эксперимента, каждый с использованием РВМС другого донора для получения NK-клеток).- 38 044644 domains and positive control (selected from (SEQ ID NO: 45-48) showed that a higher percentage of NK cells become CD107a+b IFN-gamma + compared to the isotype control (Fig. 24 and Fig. 25 present two independent experiments, each using PBMC from a different donor to obtain NK cells).

Первичные NK-клетки мышиPrimary mouse NK cells

Селезенки получали от мышей С57В1/6 и измельчали через сито для клеток с размером пор 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток. Клетки осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса ACK (приобретенном у Thermo Fisher Scientific #А1049201; 155 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбоната калия, 0,01 мМ ЭДТА) для удаления эритроцитов. Оставшиеся клетки культивировали с 100 нг/мл hIL-2 в течение 72 ч, а затем собирали и готовили для выделения NK-клеток. Затем NK-клетки (CD3 NK1.1 +) выделяли из клеток селезенки, с использованием метода отрицательного истощения с использованием магнитных бус, с чистотой > 90%. Очищенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл mIL-15, в течение 48 ч, после чего их переносили в лунки микропланшета, на которых были адсорбированы NKG2D-связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором антитело к CD107а, брефельдин-А и монензин. После культивирования в лунках, покрытых NKG2D-связывающим доменом, NK-клетки анализировали проточной цитометрией с использованием конъюгированных с флуорофором антител к CD3, NK1.1 и IFN-гамма. CD107a и IFN-гамма окрашивания были проанализированы в CD3- NK1.1+ клетках для оценки NK-клеточной активации. Увеличение числа CD107a/IFN-гамма дважды положительных клеток свидетельствует о лучшей активации NKклеток за счет вовлечения двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора. NKG2D-связывающие домены и положительный контроль (выбранный из антимышиных NKG2D клонов MI-6 и СХ-5 доступных от eBioscience) показали, что более высокий процент NK-клеток становится CD107a+n IFN-гамма+, по сравнению с контрольным изотипом (на фиг. 26 и 27 показаны два независимых эксперимента, в каждом из которых использовалась другая мышь для получения NK-клеток).Spleens were obtained from C57B1/6 mice and ground through a 70-μm cell sieve to obtain a single-cell suspension. Cells were pelleted and resuspended in ACK lysis buffer (purchased from Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate, 0.01 mM EDTA) to remove red blood cells. The remaining cells were cultured with 100 ng/ml hIL-2 for 72 h and then harvested and prepared for NK cell isolation. Then NK cells (CD3 NK1.1+) was isolated from spleen cells using a negative depletion method using magnetic beads, with a purity of >90%. Purified NK cells were cultured in a medium containing 100 ng/ml mIL-15 for 48 hours, after which they were transferred to microplate wells on which NKG2D-binding domains were adsorbed and cultured in a medium containing a fluorophore-conjugated antibody to CD107a, brefeldin-A and monensin. After culture in NKG2D-binding domain-coated wells, NK cells were analyzed by flow cytometry using fluorophore-conjugated antibodies to CD3, NK1.1, and IFN-gamma. CD107a and IFN-gamma staining were analyzed in CD3- NK1.1+ cells to assess NK cell activation. The increase in the number of CD107a/IFN-gamma double positive cells indicates better activation of NK cells due to the involvement of two activating receptors rather than a single receptor. NKG2D-binding domains and positive controls (selected from the anti-mouse NKG2D clones MI-6 and CX-5 available from eBioscience) showed that a higher percentage of NK cells become CD107a+n IFN-gamma+, compared to the isotype control (FIGS. 26 and 27 show two independent experiments, each using a different mouse to obtain NK cells).

Пример 5 - NKG2D-связывающие домены приводят к гибели опухолевых клеток-мишенейExample 5 - NKG2D-binding domains lead to the death of target tumor cells

Анализы активации первичных NK-клеток человека и мыши продемонстрировали повышенные уровни маркеров цитотоксичности на поверхности NK-клеток после инкубации с NKG2Dсвязывающими доменами. Чтобы определить, приводит ли это к усилению лизиса опухолевых клеток, был использован клеточный анализ, в котором каждый NKG2D-связывающий домен превращался в моноспецифическое антитело. Fc-область была использована в качестве одной области нацеливания, в то время как Fab-область (NKG2D-связывающий домен) действовала как другая область нацеливания, для активации NK-клеток. Клетки ТНР-1, которые имеют человеческое происхождение и экспрессируют высокие уровни Fc-рецепторов, использовали в качестве мишени для опухоли и использовали набор для цитотоксичности Perkin Elmer DELFIA. Клетки ТНР-1 метили реагентом BATDA, и ресуспендировали при 105 клеток/мл в культуральной среде. Меченые клетки ТНР-1, затем были объединены с антителами к NKG2D и выделенными NK клетками мыши в лунках планшета для микротитрования при 37°С в течение 3 ч. После инкубации 20 мкл супернатанта культуры удаляли, смешивали с 200 мкл раствора европия и инкубировали при встряхивании в течение 15 минут в темноте. Флуоресценцию измеряли во времени с помощью планшет-ридера PheraStar, оборудованного модулем флуоресценции с разрешением по времени (возбуждение 337 нм, излучение 620 нм), и удельный лизис рассчитывали в соответствии с инструкциями набора.Activation assays of primary human and mouse NK cells demonstrated increased levels of cytotoxicity markers on the surface of NK cells after incubation with NKG2D binding domains. To determine whether this results in increased tumor cell lysis, a cell-based assay was used in which each NKG2D-binding domain was converted into a monospecific antibody. The Fc region was used as one targeting region, while the Fab region (NKG2D binding domain) acted as the other targeting region to activate NK cells. THP-1 cells, which are of human origin and express high levels of Fc receptors, were used as a tumor target and a Perkin Elmer DELFIA cytotoxicity kit was used. THP-1 cells were labeled with BATDA reagent and resuspended at 105 cells/ml in culture medium. Labeled THP-1 cells were then combined with anti-NKG2D antibodies and isolated mouse NK cells in microtiter plate wells at 37°C for 3 hours. After incubation, 20 μl of culture supernatant was removed, mixed with 200 μl of europium solution and incubated with shaking for 15 minutes in the dark. Fluorescence was measured over time using a PheraStar plate reader equipped with a time-resolved fluorescence module (337 nm excitation, 620 nm emission), and specific lysis was calculated according to the kit instructions.

Положительный контроль, ULBP-6-естественный лиганд для NKG2D, показал повышенный специфический лизис клеток-мишеней ТНР-1 NK-клетками мыши. Антитела к NKG2D также увеличивали специфический лизис клеток-мишеней ТНР-1, в то время как антитело к контрольному изотипу показало снижение специфического лизиса. Пунктирная линия указывает на специфический лизис клеток ТНР-1 NK-клетками мыши без добавления антител (фиг. 28).The positive control, ULBP-6, a natural ligand for NKG2D, showed increased specific lysis of THP-1 target cells by mouse NK cells. Antibodies to NKG2D also increased specific lysis of THP-1 target cells, while antibody to the isotype control showed decreased specific lysis. The dotted line indicates specific lysis of THP-1 cells by mouse NK cells without the addition of antibodies (FIG. 28).

Пример 6. Антитела к NKG2D имеют высокую термостабильностьExample 6. Antibodies to NKG2D have high thermal stability

Температуру плавления NKG2D-связывающих доменов анализировали с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии. Экстраполированные кажущиеся температуры плавления являются высокими по сравнению с типичными антителами IgG1 (фиг. 29).The melting temperature of NKG2D-binding domains was analyzed using differential scanning fluorimetry. The extrapolated apparent melting points are high compared to typical IgG1 antibodies (FIG. 29).

Пример 7. Дисплей мультиспецифически связывающих белков усиливает способность активировать NK-клеткиExample 7: Display of Multispecific Binding Proteins Enhances the Ability to Activate NK Cells

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3 CD56+) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных бус из РВМС, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 95%. Выделенные NK-клетки затем культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, в течение 24-48 ч, после чего их переносили в лунки микропланшета, на которых были адсорбированы мультиспецифические и биспецифические связывающие белки, соответственно, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором антитело к CD107а, брефельдин-А и монензин. После культивирования NK-клетки анализировали проточной цитометрией с использованием конъюгированных с флуорофором антител к CD3, CD56 и IFN-гамма. CD107аPeripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. NK cells (CD3 CD56+) were isolated using negative selection using magnetic beads from PBMCs, and the purity of the isolated NK cells was typically >95%. Isolated NK cells were then cultured in medium containing 100 ng/ml IL-2 for 24-48 hours, after which they were transferred to microplate wells on which multispecific and bispecific binding proteins, respectively, were adsorbed and cultured in medium containing a fluorophore-conjugated antibody to CD107a, brefeldin-A and monensin. After culture, NK cells were analyzed by flow cytometry using fluorophore-conjugated antibodies to CD3, CD56, and IFN-gamma. CD107a

- 39 044644 и IFN-гамма окрашивания были проанализированы в CD3- CD56+ клетках для оценки NK-клеточной активации. Увеличение числа CD107a/IFN-гамма дважды положительных клеток свидетельствует о лучшей активации NK-клеток. AL2.2 является мультиспецифическим связывающим белком, содержащим HER2связывающий домен (трастузумаб), NKG2D-связывающий домен (ULBP-6) и Fc-домен IgG1 человека. Это было проведено посредством контролируемой реакции обмена Fab-плечами (cFAE), начиная с гомодимера трастузумаба и гомодимера ULBP-6-Fc (см. Labrijn et al. Nature Protocols 9, 2450-2463). SC2.2 представляет собой одноцепочечный белок, содержащий scFv, полученный из трастузумаба, и ULBP-6 (SEQ ID NO: 73).- 39 044644 and IFN-gamma staining were analyzed in CD3 - CD56+ cells to assess NK cell activation. An increase in the number of CD107a/IFN-gamma double positive cells indicates better activation of NK cells. AL2.2 is a multispecific binding protein containing a HER2-binding domain (trastuzumab), an NKG2D-binding domain (ULBP-6), and a human IgG1 Fc domain. This was done through a controlled Fab arm exchange (cFAE) reaction starting with a trastuzumab homodimer and a ULBP-6-Fc homodimer (see Labrijn et al. Nature Protocols 9, 2450-2463). SC2.2 is a single chain protein containing a trastuzumab-derived scFv and ULBP-6 (SEQ ID NO: 73).

SEQ ID NO: 73SEQ ID NO: 73

MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDIQLENY TPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTL ILCCLLIILPCFILPGIMAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDIQLENY TPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMD STLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTL ILCCLLIILPCFILPGI

Анализ CD107a и IFN-гамма окрашивание показали, что контрольный изотип IgG, не вызывает активацию NK-клеток, в то время как более высокий процент NK-клеток становится CD107a+ и IFN-гамма+ после стимуляции с мультиспецифическим связывающим белком по сравнению с биспецифическим белком, демонстрирующим более сильную активацию NK-клеток за счет вовлечения двух активирующих рецепторов (NKG2D и CD16), а не только одного (NKG2D) (фиг. 30). Ожидается, что это увеличение активации NK-клеток приведет к более сильному уничтожению опухолевых клеток.Analysis of CD107a and IFN-gamma staining showed that the IgG isotype control did not induce NK cell activation, while a higher percentage of NK cells became CD107a + and IFN-gamma + after stimulation with multispecific binding protein compared to bispecific protein. , demonstrating stronger activation of NK cells due to the involvement of two activating receptors (NKG2D and CD16), rather than just one (NKG2D) (Fig. 30). This increase in NK cell activation is expected to result in greater tumor cell killing.

Пример 8 - Дисплей мультиспецифически связывающих белков усиливает цитотоксичность по отношению к целевым опухолевым клеткамExample 8 - Display of Multispecific Binding Proteins Enhances Cytotoxicity to Target Tumor Cells

Анализ первичной цитотоксичности NK-клеток человекаHuman NK Cell Primary Cytotoxicity Assay

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3 CD56+) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных бус из РВМС, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 95%. NK-клетки затем культивировали в течение ночи в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, перед использованием в анализах цитотоксичности. На следующий день NK-клетки ресуспендировали при 5x105 клеток/мл в свежей культуральной среде. Клетки рака молочной железы SKBR-3 человека метили реагентом BATDA согласно набору для измерения цитотоксичности Perkin Elmer DELFIA и ресуспендировали при 5x104 клеток/мл в культуральной среде. Различные разбавления мультиспецифических связывающих белков были внесены в питательные среды. NKклетки, меченые клетки SKBR-3 и мультиспецифически связывающие белки, затем были объединены в лунки микротитрационного планшета и инкубировали при 37° С в течение 3 ч. После инкубации 20 мкл супернатанта культуры удаляли, смешивали с 200 мкл раствора европия и инкубировали при встряхивании в течение 15 мин в темноте. Флуоресценцию измеряли во времени с помощью планшет-ридера PheraStar, оборудованного модулем флуоресценции с разрешением по времени (возбуждение 337 нм, излучение 620 нм), и удельный лизис рассчитывали в соответствии с инструкциями набора. AL0.2 является мультиспецифическим связывающим белком, содержащим HER2-связывающий домен (трастузумаб), NKG2D-связывающий домен (выбранный из (SEQ ID NO: 1-44)) и Fc-домен IgG1 человека. Это было проведено посредством контролируемой реакции обмена Fab-плечами (cFAE), начиная с гомодимера трастузумаба и гомодимера анти-NKG2D. AL0.2si основан на AL0.2 и содержит дополнительную мутацию D265A в Fc-домене, которая нивелирует связывание с CD16. Трастузумаб-si основан на трастузумабе и содержит дополнительную мутацию D265A в Fc-домене, которая нивелирует связывание CD16. AL2.2 является мультиспецифическим связывающим белком, содержащим HER2-связывающий домен (трастузумаб), NKG2D-связывающий домен (ULBP-6) и Fc-домен IgG1 человека. SC2.2 представляет собой одноцепочечный белок, содержащий scFv, полученный из трастузумаба, и ULBP-6.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. NK cells (CD3 CD56+) were isolated using negative selection using magnetic beads from PBMCs, and the purity of the isolated NK cells was typically >95%. NK cells were then cultured overnight in medium containing 100 ng/ml IL-2 before use in cytotoxicity assays. The next day, NK cells were resuspended at 5x105 cells/ml in fresh culture medium. Human SKBR-3 breast cancer cells were labeled with BATDA reagent according to the Perkin Elmer DELFIA cytotoxicity kit and resuspended at 5x104 cells/ml in culture medium. Various dilutions of multispecific binding proteins were added to the culture media. NK cells, labeled SKBR-3 cells and multispecific binding proteins were then pooled into the wells of a microtiter plate and incubated at 37°C for 3 hours. After incubation, 20 μl of the culture supernatant was removed, mixed with 200 μl of europium solution and incubated with shaking for 15 minutes in the dark. Fluorescence was measured over time using a PheraStar plate reader equipped with a time-resolved fluorescence module (337 nm excitation, 620 nm emission), and specific lysis was calculated according to the kit instructions. AL0.2 is a multispecific binding protein containing a HER2 binding domain (trastuzumab), an NKG2D binding domain (selected from (SEQ ID NO: 1-44)) and a human IgG1 Fc domain. This was carried out through a controlled Fab arm exchange (cFAE) reaction, starting with a trastuzumab homodimer and an anti-NKG2D homodimer. AL0.2si is based on AL0.2 and contains an additional mutation D265A in the Fc domain, which abolishes binding to CD16. Trastuzumab-si is based on trastuzumab and contains an additional mutation D265A in the Fc domain, which abolishes CD16 binding. AL2.2 is a multispecific binding protein containing a HER2-binding domain (trastuzumab), an NKG2D-binding domain (ULBP-6), and a human IgG1 Fc domain. SC2.2 is a single-chain protein containing a trastuzumab-derived scFv and ULBP-6.

AL0.2 показал усиленный лизис клеток-мишеней SkBr-3 NK-клетками человека по сравнению с трастузумабом дозозависимым образом со значением р 0,0311 в ЕС50 (фиг. 31). AL0.2si (фиг. 32) и трастузумаб-si (фиг. 33) показали снижение как в активности, так и в максимальном специфическом лизисе клеток SkBr-3 по сравнению с AL0.2, со значением р 0,0002 и 0,0001 в ЕС50, соответственно. (фиг. 3233). Кроме того, AL0.2 показал усиленный лизис клеток SkBr-3, по сравнению с AL2.2, дозозависимым образом (фиг. 34). Контрольный изотип IgG не показал увеличения специфического лизиса при любой из протестированных концентраций. Вместе, данные продемонстрировали, что мультиспецифические связывающие белки, включающие 2 активирующих рецептора на NK-клетках и один опухолевый антиген, вызывают более сильное уничтожение опухолевых клеток NK-клетками человека по сравнению с биспецифическими белками, задействующими один активирующий рецептор на NK-клетках и один опухолевый антиген.AL0.2 showed enhanced lysis of SkBr-3 target cells by human NK cells compared to trastuzumab in a dose-dependent manner with a p value of 0.0311 in EC50 (Fig. 31). AL0.2si (Fig. 32) and trastuzumab-si (Fig. 33) showed a decrease in both activity and maximum specific lysis of SkBr-3 cells compared to AL0.2, with a p value of 0.0002 and 0.0001 in the EU50, respectively. (Fig. 3233). In addition, AL0.2 showed enhanced lysis of SkBr-3 cells, compared to AL2.2, in a dose-dependent manner (Fig. 34). The IgG isotype control showed no increase in specific lysis at any of the concentrations tested. Together, the data demonstrated that multispecific binding proteins, involving 2 activating receptors on NK cells and one tumor antigen, caused greater killing of tumor cells by human NK cells compared with bispecific proteins, involving one activating receptor on NK cells and one tumor antigen. antigen.

Анализ цитотоксичности первичных NK-клеток мышиCytotoxicity Analysis of Primary Mouse NK Cells

Селезенки получали от мышей С57В1/6 и измельчали через сито для клеток с размером пор 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток. Клетки осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса ACK (приобретенном у Thermo Fisher Scientific #А1049201; 155 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбонаSpleens were obtained from C57B1/6 mice and ground through a 70-μm cell sieve to obtain a single-cell suspension. Cells were pelleted and resuspended in ACK lysis buffer (purchased from Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM ammonium chloride, 10 mM bicarbonate

- 40 044644 та калия, 0,01 мМ ЭДТА) для удаления эритроцитов. Оставшиеся клетки культивировали с 100 нг/мл hIL-2 в течение 72 ч, а затем собирали и готовили для выделения NK-клеток. Затем NK-клетки (CD3 NK1.1 +) выделяли из клеток селезенки, с использованием метода отрицательного истощения с использованием магнитных бус, с чистотой > 90%. Очищенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл mIL-15 в течение 48 ч, прежде чем повторно суспендировали в культуральной среде при 10 клеток/мл для цитотоксических анализов. RMA-HER2-dTomato, линия опухолевых клеток мыши, сконструированная для экспрессии HER2 и dTomato, и ее контрольный аналог, клетки RMA, экспрессирующие zsGreen, использовали в качестве мишеней. Клетки ресуспендировали при 2х105 клеток/мл в культуральной среде и высевали в лунки микропланшет при соотношении 1:1. Разведения мультиспецифического белка вносили в культуральную среду и добавляли к клеткам RMA вместе с клетками NK. После инкубации в течение ночи при 37°С с 5% СО2, процент RMA-HER2-dTomato и клеток RMA-zsGreen определяли с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентного репортера, чтобы идентифицировать эти два типа клеток. Удельная гибель клеток-мишеней = (1-((% RMA-Ca2T-dTomato клеток в группе лечения *% RMA-zsGreen клеток в контрольной группе)/(% RMA-Ca2T-dTomato клеток в контрольной группе * % RMA-zsGreen клеток в группе лечения))) * 100%.- 40 044644 potassium, 0.01 mM EDTA) to remove red blood cells. The remaining cells were cultured with 100 ng/ml hIL-2 for 72 h and then harvested and prepared for NK cell isolation. Then NK cells (CD3 NK1.1+) was isolated from spleen cells using a negative depletion method using magnetic beads, with a purity of >90%. Purified NK cells were cultured in medium containing 100 ng/ml mIL-15 for 48 h before being resuspended in culture medium at 10 cells/ml for cytotoxic assays. RMA-HER2-dTomato, a mouse tumor cell line engineered to express HER2 and dTomato, and its control counterpart, RMA cells expressing zsGreen, were used as targets. Cells were resuspended at 2x105 cells/ml in culture medium and seeded into microplate wells at a ratio of 1:1. Dilutions of the multispecific protein were added to the culture medium and added to RMA cells along with NK cells. After incubation overnight at 37°C with 5% CO2, the percentage of RMA-HER2-dTomato and RMA-zsGreen cells was determined by flow cytometry using a fluorescent reporter to identify these two cell types. Specific target cell death = (1-((% RMA-Ca2T-dTomato cells in the treatment group *% RMA-zsGreen cells in the control group)/(% RMA-Ca2T-dTomato cells in the control group * % RMA-zsGreen cells in treatment group))) * 100%.

AL2.2 более эффективен в перенаправлении ответов NK-клеток на опухолевые мишени, чем SC2.2 (фиг. 36) и трастузумаб (фиг. 35). Контрольный белок показал небольшое влияние на специфическую гибель мишени. Эти данные демонстрируют, что мультиспецифические связывающие белки, включающие 2 активирующих рецептора на NK-клетках и один опухолевый антиген, вызывают более сильное уничтожение опухолевых клеток NK-клетками мыши по сравнению с биспецифическими белками, задействующими один активирующий рецептор на NK-клетках и один опухолевый антиген.AL2.2 is more effective in redirecting NK cell responses to tumor targets than SC2.2 (Figure 36) and trastuzumab (Figure 35). The control protein showed little effect on target specific killing. These data demonstrate that multispecific binding proteins involving 2 activating receptors on NK cells and one tumor antigen cause greater tumor cell killing by mouse NK cells compared with bispecific proteins involving one activating receptor on NK cells and one tumor antigen .

Пример 9 - Мультиспецифические связывающие белки связываются с NKG2DExample 9 - Multispecific binding proteins bind to NKG2D

Линии клеток EL4 лимфомы мыши были сконструированы для экспрессии NKG2D человека. Триспецифические связывающие белки (TriNKET), каждый из которых содержит NKG2D-связывающий домен, ассоциированный с опухолью антигенсвязывающий домен (такой как CD33-, HER2-, CD20- или ВСМА-связывающий домен) и Fc-домен, который связывается с CD16, как показано на фиг. 1, анализировали на их сродство к внеклеточному NKG2D, экспрессированному на клетках EL4. Связывание мультиспецифических связывающих белков с NKG2D определяли с использованием конъюгированных с флуорофором вторичных антител к IgG человека. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали соотношение сигнала по сравнению с фоном (FOB) с использованием среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) NKG2D-экспрессирующих клеток по сравнению с исходными клетками EL4.Mouse lymphoma EL4 cell lines were engineered to express human NKG2D. Trispecific binding proteins (TriNKET), each containing an NKG2D-binding domain, a tumor-associated antigen-binding domain (such as a CD33-, HER2-, CD20-, or BCMA-binding domain), and an Fc domain that binds to CD16, as shown in fig. 1 were analyzed for their affinity for extracellular NKG2D expressed on EL4 cells. Binding of multispecific binding proteins to NKG2D was determined using fluorophore-conjugated secondary anti-human IgG antibodies. Cells were analyzed by flow cytometry and the ratio of signal over background (FOB) was calculated using the mean fluorescence intensity (MFI) of NKG2D-expressing cells compared to parental EL4 cells.

Анализируемые TriNKET включали CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 и CD33-связывающий домен), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 и CD33-связывающий домен), HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 и HER2связывающий домен), HER2-TriNKET-F04 (ADI-29404 и HER2-связывающий домен), CD20-TriNKETC26 (ADI-28226 и CD20-связывающий домен), CD20-TriNKET-F04 (ADI-29404 и CD20 -связывающий домен), BCMA-TriNKET-C26 (ADI-28226 и ВСМА-связывающий домен), BCMA-TriNKET-F04 (ADI29404 и ВСМА-связывающий домен), BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 и ВСМА-связывающий домен) и BCMA-TriNKET-F47 (ADI-29447 и ВСМА-связывающий домен). HER2-связывающий домен, используемый в тестируемых молекулах, состоял из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи трастузумаба. CD33-связывающий домен состоял из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, перечисленных ниже.TriNKETs analyzed included CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 and CD33 binding domain), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 and CD33 binding domain), HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 and HER2 binding domain), HER2 -TriNKET-F04 (ADI-29404 and HER2-binding domain), CD20-TriNKETC26 (ADI-28226 and CD20-binding domain), CD20-TriNKET-F04 (ADI-29404 and CD20-binding domain), BCMA-TriNKET-C26 (ADI-28226 and BCMA-binding domain), BCMA-TriNKET-F04 (ADI29404 and BCMA-binding domain), BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 and BCMA-binding domain) and BCMA-TriNKET-F47 (ADI-29447 and BCMA-binding domain). The HER2-binding domain used in the tested molecules consisted of a heavy chain variable domain and a trastuzumab light chain variable domain. The CD33 binding domain consisted of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, listed below.

SEQ ID NO: 74:SEQ ID NO: 74:

OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYVVHWVROAPGOGLEWMGYINPYNDOVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYVVHWVROAPGOGLEWMGYINPYND

CDR1CDR1

GTKYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQGTKYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQ

CDR2 CDR3CDR2 CDR3

GTLVTVSSGTLVTVSS

SEQ ID NO: 75:SEQ ID NO: 75:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCTASSSVNYIHWYQQKPGQPPKLLIYDTSKVASGVPARDIVLTQSPASLAVSPGQRATICTTASSSVNYIHWYQQKPGQPPKLLIYDTSKVASGVPAR

CDR1 CDR1CDR1 CDR1

FSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCOQWRSYPLTFGQGTKLEIKFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCOQWRSYPLTFGQGTKLEIK

CDR3CDR3

CD20-связывающий домен, используемый в тестируемых молекулах, состоял из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи. ВСМА-связывающий домен, используемый в тестируемых молекулах, состоял из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, перечисленных ниже.The CD20 binding domain used in the tested molecules consisted of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain. The BCMA binding domain used in the test molecules consisted of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain as listed below.

- 41 044644- 41 044644

Вариабельный домен тяжелой цепи EM-801 (SEQ ID NO: 82):EM-801 Heavy Chain Variable Domain (SEQ ID NO: 82):

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSAISGSGGEVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSAISGSGG

CDR1CDR2CDR1CDR2

STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGOGTLVTSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGOGTLVT

VSSCDR3VSSCDR3

Вариабельный домен легкой цепи EM-801 (SEQ ID NO: 83):EM-801 Light Chain Variable Domain (SEQ ID NO: 83):

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASOSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASOSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI

CDR1CDR2CDR1CDR2

PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOQYGYPPDFTFGQGTKVEIKPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOQYGYPPDFTFGQGTKVEIK

CDR3CDR3

Вариабельный домен тяжелой цепи EM-901 (SEQ ID NO: 76)EM-901 Heavy Chain Variable Domain (SEQ ID NO: 76)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSSTEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSST

CDR1CDR2CDR1CDR2

YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGOGTLVTVSYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGOGTLVTVS

SCDR3SCDR3

Вариабельный домен легкой цепи EM-901 (SEQ ID NO: 77)EM-901 Light Chain Variable Domain (SEQ ID NO: 77)

EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYOOKPGOAPRLLIHSASTRATGIPDEIVLTOSPGTLLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYOOKPGOAPRLLIHSASTRATGIPD

CDR1CDR2CDR1CDR2

RFS GSGS GTDFTLAIS RLEPEDF A V Y YCQOYGYPPDFTFGOGTKVEIKRFS GSGS GTDFTLAIS RLEPEDF A V Y YCQOYGYPPDFTFGOGTKVEIK

CDR3CDR3

Данные показывают, что TriNKET по настоящему изобретению связывается с NKG2D, когда белок включает опухолевый антигенсвязывающий домен, такой как CD33, HER2, CD20 и ВСМА.Data show that the TriNKET of the present invention binds to NKG2D when the protein includes a tumor antigen binding domain such as CD33, HER2, CD20 and BCMA.

Пример 10 - Мультиспецифические связывающие белки связываются с опухолевыми антигенами человека.Example 10 - Multispecific binding proteins bind to human tumor antigens.

Триспецифические связывающие белки связываются с CD33, HER2, CD20 и ВСМАTrispecific binding proteins bind to CD33, HER2, CD20 and BCMA

Клеточную линию ОМЛ человека MV4-11, экспрессирующую CD33, использовали для анализа связывания TriNKET с опухоль-ассоциированным антигеном. TriNKET и родительское моноклональное антитело к CD33 инкубировали с клетками, и связывание детектировали с использованием конъюгированных с флуорофором вторичных антител к IgG человека. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали соотношение сигнала по сравнению с фоном (FOB) с использованием среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) от TriNKET и родительского моноклонального антитела к CD33, нормализованного к контрольным вторичным антителам. CD33-TriNKET-C26 и CD33TriNKET-F04 показывают сопоставимые уровни связывания с CD33 по сравнению с родительским антителом к CD33 (фиг. 41).The human AML cell line MV4-11, expressing CD33, was used to analyze TriNKET binding to tumor-associated antigen. TriNKET and the parental anti-CD33 monoclonal antibody were incubated with cells, and binding was detected using fluorophore-conjugated anti-human IgG secondary antibodies. Cells were analyzed by flow cytometry and the ratio of signal over background (FOB) was calculated using the mean fluorescence intensity (MFI) from TriNKET and the parental anti-CD33 monoclonal antibody normalized to control secondary antibodies. CD33-TriNKET-C26 and CD33TriNKET-F04 show comparable levels of binding to CD33 compared to the parental CD33 antibody (FIG. 41).

Клеточные линии рака человека, экспрессирующие HER2, использовали для анализа связывания TriNKET с опухоль-ассоциированным антигеном. Клеточная линия 786-O рака почек экспрессирует низкие уровни HER2. TriNKET и, необязательно, родительское моноклональное антитело к HER2 (трастузумаб) инкубировали с клетками, и связывание определяли, используя конъюгированные с флуорофором вторичные антитела к IgG человека. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали соотношение сигнала по сравнению с фоном (FOB) с использованием среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) от TriNKET и трастузумаба, нормализованного к контрольным вторичным антителам. HER2-TriNKET-C26 и HER2-TriNKET-F04 показывают сопоставимые уровни связывания с HER2, экспрессируемым на клетках 786-O, по сравнению с трастузумабом (фиг. 42).Human cancer cell lines expressing HER2 were used to analyze the binding of TriNKET to tumor-associated antigen. The 786-O kidney cancer cell line expresses low levels of HER2. TriNKET and optionally the parent anti-HER2 monoclonal antibody (trastuzumab) were incubated with cells and binding was determined using fluorophore-conjugated secondary anti-human IgG antibodies. Cells were analyzed by flow cytometry and the ratio of signal over background (FOB) was calculated using mean fluorescence intensity (MFI) from TriNKET and trastuzumab normalized to control secondary antibodies. HER2-TriNKET-C26 and HER2-TriNKET-F04 show comparable levels of binding to HER2 expressed on 786-O cells compared to trastuzumab (Figure 42).

Клетки миеломы человека MM.1S, экспрессирующие ВСМА, использовали для анализа связывания TriNKET с опухоль-ассоциированным антигеном ВСМА. TriNKET и, необязательно, родительское моноклональное антитело к ВСМА (ЕМ-801) инкубировали с клетками, и связывание детектировали с использованием конъюгированных с флуорофором вторичных антител к IgG человека. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали соотношение сигнала по сравнению с фоном (FOB) с использованием среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) от TriNKET и ЕМ-801, нормализованного к контрольным вторичным антителам. C26-TriNKET-BCMA, F04-TriNKET-BCMA, F43TriNKET-BCMA и F47-TriNKET-BCMA показывают сопоставимые уровни связывания с ВСМА, экспрессируемым на клетках MM.1S, по сравнению с ЕМ-801 (фиг. 43).Human myeloma cells MM.1S expressing BCMA were used to analyze the binding of TriNKET to the tumor-associated antigen BCMA. TriNKET and optionally the parental anti-BCMA monoclonal antibody (EM-801) were incubated with cells, and binding was detected using a fluorophore-conjugated secondary anti-human IgG antibody. Cells were analyzed by flow cytometry and the ratio of signal over background (FOB) was calculated using the mean fluorescence intensity (MFI) from TriNKET and EM-801 normalized to control secondary antibodies. C26-TriNKET-BCMA, F04-TriNKET-BCMA, F43TriNKET-BCMA and F47-TriNKET-BCMA show comparable levels of binding to BCMA expressed on MM.1S cells compared to EM-801 (Figure 43).

Клетки лимфомы человека Раджи, экспрессирующие CD20, использовали для анализа связывания TriNKET с опухоль-ассоциированным антигеном CD20. TriNKET инкубировали с клетками, и связывание детектировали с использованием конъюгированных с флуорофором вторичных антител к IgG чело- 42 044644 века. Клетки анализировали проточной цитометрией и гистограмму преобразовывали в график. Как показано на фиг. 44, CD20-TriNKET-C26 и CD20-TriNKET-F04 одинаково хорошо связываются с CD20.Human Raji lymphoma cells expressing CD20 were used to assay the binding of TriNKET to the tumor-associated antigen CD20. TriNKET was incubated with cells and binding was detected using fluorophore-conjugated secondary anti-human IgG antibodies. Cells were analyzed by flow cytometry and the histogram was converted into a graph. As shown in FIG. 44, CD20-TriNKET-C26 and CD20-TriNKET-F04 bind equally well to CD20.

Пример 11 - Мультиспецифические связывающие белки активируют NK-клеткиExample 11 - Multispecific binding proteins activate NK cells

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3CD56+) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных бус из РВМС, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 90%. Выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2 для активации, или оставляли на ночь без цитокина. IL-2-активированные NK-клетки использовали в течение 24-48 ч после активации.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. NK cells (CD3CD56+) were isolated using negative selection using magnetic beads from PBMCs, and the purity of the isolated NK cells was typically >90%. Isolated NK cells were cultured in medium containing 100 ng/ml IL-2 for activation or left overnight without the cytokine. IL-2-activated NK cells were used within 24–48 h of activation.

Клетки рака человека, экспрессирующие антиген опухоли собирали и ресуспендировали в культуральной среде при 2х106 клеток/мл. Моноклональные антитела или TriNKET, нацеленные на опухолевый антиген, разводили в культуральной среде. Активированные NK-клетки собирали, промывали и ресуспендировали при 2х106 клеток/мл в культуральной среде. Затем раковые клетки смешивали с моноклональными антителами/TriNKET и активировали NK-клетки в присутствии IL-2. Брефельдин-А и монензин также добавляли в смешанную культуру для блокирования транспорта белка из клетки для внутриклеточного окрашивания цитокинов. Конъюгированное с флуорофором антитело к CD107а добавляли к смешанной культуре и культуру инкубировали в течение 4 ч перед тем, как образцы были подготовлены для анализа FACS с использованием конъюгированных с флуорофором антител к CD3, CD56 и IFNгамма. CD107a и IFN-гамма-окрашивание было проанализировано в CD3- CD56+ клетках для оценки активации NK-клеток. Увеличение числа CD107a/IFN-гамма дважды положительных клеток свидетельствует о лучшей активации NK-клеток за счет вовлечения двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора.Human cancer cells expressing tumor antigen were collected and resuspended in culture medium at 2x10 6 cells/ml. Monoclonal antibodies or TriNKETs targeting tumor antigen were diluted in culture medium. Activated NK cells were collected, washed and resuspended at 2x10 6 cells/ml in culture medium. Cancer cells were then mixed with monoclonal antibodies/TriNKET and NK cells were activated in the presence of IL-2. Brefeldin-A and monensin were also added to the mixed culture to block protein transport out of the cell for intracellular cytokine staining. Fluorophore-conjugated anti-CD107a antibody was added to the mixed culture and the culture was incubated for 4 hours before samples were prepared for FACS analysis using fluorophore-conjugated anti-CD3, CD56, and IFNgamma antibodies. CD107a and IFN-gamma staining was analyzed in CD3- CD56+ cells to assess NK cell activation. The increase in the number of CD107a/IFN-gamma double positive cells indicates better activation of NK cells due to the involvement of two activating receptors rather than a single receptor.

TriNKET опосредуют активацию NK-клеток человека, совместно культивируемых с HER2экспрессирующими клетками SkBr-3 (фиг. 47А), клетками Со1о201 (фиг. 47В) и клетками НСС1954 (фиг. 47С), соответственно, как показано увеличением дегрануляции CD107а и IFN-гамма выработки. Клетки SkBr-3 и клетки НСС1954 имеют высокий уровень поверхностной экспрессии HER2, а Со1о201 имеет средний уровень экспрессии HER2. По сравнению с моноклональным антителом трастузумабом, TriNKET демонстрируют превосходную активацию NK-клеток человека в присутствии клеток рака человека. Только NK-клетки, NK-клетки плюс клетки SkBr-3 использовали в качестве отрицательных контролей.TriNKETs mediate activation of human NK cells co-cultured with HER2-expressing SkBr-3 cells (Figure 47A), Co1o201 cells (Figure 47B) and HCC1954 cells (Figure 47C), respectively, as shown by increased CD107a degranulation and IFN-gamma production . SkBr-3 cells and HCC1954 cells have a high level of surface expression of HER2, and Co1o201 has a medium level of HER2 expression. Compared to the monoclonal antibody trastuzumab, TriNKETs demonstrate superior activation of human NK cells in the presence of human cancer cells. NK cells alone, NK cells plus SkBr-3 cells were used as negative controls.

TriNKET (C26-TriNKET-HER2 и F04-TriNKET-HER2) опосредуют активацию NK-клеток человека, совместно культивированных с CD33-экспрессирующими клетками человека ОМЛ Mv4-11, и показали увеличение дегрануляции CD107а и выработки IFN-гамма. По сравнению с моноклональным антителом к CD33 TriNKET (C26-TriNKET-HER2 и F04-TriNKET-HER2) показали превосходную активацию NKклеток человека в присутствии клеток рака человека, экспрессирующих HER2 (фиг. 47А-47С).TriNKET (C26-TriNKET-HER2 and F04-TriNKET-HER2) mediate activation of human NK cells co-cultured with CD33-expressing human AML Mv4-11 cells and showed increased CD107a degranulation and IFN-gamma production. Compared to anti-CD33 monoclonal antibody, TriNKET (C26-TriNKET-HER2 and F04-TriNKET-HER2) showed superior activation of human NK cells in the presence of human cancer cells expressing HER2 (FIGS. 47A-47C).

Первичные NK-клетки человека активируются TriNKET в совместной культуре с мишенью, экспрессирующей линии клеток рака человека.Primary human NK cells are activated by TriNKET in coculture with target expressing human cancer cell lines.

Совместное культивирование первичных NK-клеток человека с CD20-положительными клетками рака человека приводило к TriNKET-опосредованной активации первичных NK-клеток человека (фиг. 62). TriNKET направленные на CD20 (например, C26-TriNKET-CD20 и F04-TriNKET-CD20), опосредовали активацию NK-клеток человека, при культивировании совместно с CD20-положительными клетками Раджи, о чем свидетельствует увеличение CD107а дегрануляции и выработки цитокинов IFNy (фиг. 62). По сравнению с моноклональным антителом ритуксимабом, оба TriNKET (например, C26-TriNKETCD20 и F04-TriNKET-CD20), показали превосходную активацию NK-клеток человека (фиг. 62).Co-culture of primary human NK cells with CD20-positive human cancer cells resulted in TriNKET-mediated activation of primary human NK cells (FIG. 62). CD20-targeted TriNKETs (e.g., C26-TriNKET-CD20 and F04-TriNKET-CD20) mediated human NK cell activation when co-cultured with CD20-positive Raji cells, as evidenced by increased CD107a degranulation and IFNy cytokine production (Fig. 62). Compared to the monoclonal antibody rituximab, both TriNKETs (eg, C26-TriNKETCD20 and F04-TriNKET-CD20) showed superior activation of human NK cells (FIG. 62).

РитуксимабуНRituximabuN

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGN

CDR1CDR2CDR1CDR2

GDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWG AGTTVTVSA (SEQ ID NO:84)CDR3GDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWG AGTTVTVSA (SEQ ID NO:84)CDR3

Ритуксимаб_\ЕRituximab_\E

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVP

CDR1CDR2CDR1CDR2

VRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCOQWTSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:85)VRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCOQWTSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:85)

CDR3CDR3

Совместное культивирование первичных NK-клеток человека с ВСМА-положительными клетками миеломы MM.1S приводило к TriNKET-опосредованной активации первичных NK-клеток человека. TriNKET направленные на ВСМА (например, C26-TriNKET-BMCA и F04-TriNKET-BMCA) опосредовали активацию NK-клеток человека, при культивировании совместно с клетками миеломы MM.1S, о чем свидетельствует увеличение CD107α дегрануляции и выработки цитокинов IFNy (фиг. 63). По сравнениюCo-culture of primary human NK cells with BCMA-positive MM.1S myeloma cells resulted in TriNKET-mediated activation of primary human NK cells. BCMA-targeted TriNKETs (eg, C26-TriNKET-BMCA and F04-TriNKET-BMCA) mediated human NK cell activation when co-cultured with MM.1S myeloma cells, as evidenced by increased CD107α degranulation and IFNy cytokine production (Figure 63 ). Compared

- 43 044644 с изотипом TriNKET, TriNKET направленные на ВСМА (например, A44-TriNKET-BMCA, A49-TriNKETBMCA, C26-TriNKET-BMCA, F04-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F47TriNKET-BMCA и F63-TriNKET-BMCA) показали повышенную активность по отношению к NKклеткам (фиг. 63).- 43 044644 with the TriNKET isotype, TriNKET directed to BCMA (for example, A44-TriNKET-BMCA, A49-TriNKETBMCA, C26-TriNKET-BMCA, F04-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F47TriNKET- BMCA and F63-TriNKET-BMCA) showed increased activity towards NK cells (Fig. 63).

Пример 12 - Триспецифические связывающие белки приводят к цитотоксичности по отношению к клеткам-мишеням ракаExample 12 - Trispecific Binding Proteins Lead to Cytotoxicity to Cancer Target Cells

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3 CD56+) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных бус из РВМС, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 90%. Выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2 для активации, или оставляли на ночь без цитокина. Активированные IL-2 или покоящиеся NK-клетки использовали на следующий день в анализах цитотоксичности.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. NK cells (CD3 CD56+) were isolated using negative selection using magnetic beads from PBMCs, and the purity of the isolated NK cells was typically >90%. Isolated NK cells were cultured in medium containing 100 ng/ml IL-2 for activation or left overnight without the cytokine. IL-2-activated or resting NK cells were used the next day in cytotoxicity assays.

Чтобы проверить способность NK-клеток человека лизировать раковые клетки в присутствии TriNKET, использовали анализ нерадиоактивной цитотоксичности cyto Tox 96 от Promega (G1780) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки рака человека, экспрессирующие антиген опухоли собирали, промывали и ресуспендировали в культуральной среде при 1-2х105/мл. Покоящиеся и/или активированные NK-клетки собирали, промывали и ресуспендировали при 105-2.0x106 клеток/мл в тех же культуральных средах, как и для клеток рака. В каждой лунке 96-луночного планшета 50 мкл суспензии клеток рака смешивали с 50 мкл суспензии NK-клеток с или без TriNKET, нацеленных на опухолевый антиген, экспрессируемый на раковых клетках. После инкубации при 37°С с 5% СО2 в течение 3 ч и 15 мин, 10х кратный буфер для лизиса добавляли в лунки, содержащие только раковые клетки, и в лунки, содержащие только среды для максимального лизиса и отрицательного контроля реагентов, соответственно. Затем планшет помещали обратно в инкубатор на дополнительные 45 мин для достижения общей 4-часовой инкубации. Затем клетки осаждали, и культуральный супернатант переносили в новый 96луночный планшет и смешивали с субстратом для развития реакции. Новый планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, и оптическую плотность считывали при 492 нм на SpectraMax i3x. Процент специфического лизиса клеток рака рассчитывали следующим образом: % Специфический лизис = ((экспериментальный лизис - самопроизвольный лизис только из NK-клеток - самопроизвольный лизис только из клеток рака)/(Максимальный лизис - отрицательный контроль реагентов))х100%.To test the ability of human NK cells to lyse cancer cells in the presence of TriNKET, the cyto Tox 96 non-radioactive cytotoxicity assay from Promega (G1780) was used according to the manufacturer's instructions. Briefly, human cancer cells expressing tumor antigen were collected, washed and resuspended in culture medium at 1-2x10 5 /ml. Resting and/or activated NK cells were collected, washed and resuspended at 105-2.0x106 cells/ml in the same culture media as for cancer cells. In each well of a 96-well plate, 50 μl of a cancer cell suspension was mixed with 50 μl of an NK cell suspension with or without TriNKET targeting a tumor antigen expressed on cancer cells. After incubation at 37°C with 5% CO 2 for 3 hours and 15 minutes, 10x lysis buffer was added to wells containing only cancer cells and to wells containing only maximum lysis and negative control reagent media, respectively. The plate was then placed back into the incubator for an additional 45 min to achieve a total incubation of 4 h. The cells were then pelleted, and the culture supernatant was transferred to a new 96-well plate and mixed with the substrate to develop the reaction. The new plate was incubated for 30 min at room temperature and the absorbance was read at 492 nm on a SpectraMax i3x. The percentage of specific lysis of cancer cells was calculated as follows: % Specific lysis = ((experimental lysis - spontaneous lysis from NK cells only - spontaneous lysis from cancer cells only)/(Maximum lysis - negative control reagents))x100%.

TriNKET опосредуют цитотоксичность NK-клеток человека против CD33-положительной линии клеток ОМЛ человека Molm-13. Как показано на фиг. 53В, покоящиеся NK-клетки человека были смешаны с Molm-13 клетками рака, и TriNKET (например, C26-TriNKET-CD33 и F04-TriNKET-CD33) способны повысить цитотоксическую активность покоящихся NK-клеток человека дозозависимым образом против клеток рака. Пунктирная линия указывает на цитотоксическую активность покоящихся NKклеток без TriNKET. Активированные NK-клетки человека смешивали с раковыми клетками Molm-13, и TriNKET дополнительно усиливают цитотоксическую активность активированных NK-клеток человека, по сравнению с антителом к CD33, дозозависимым образом против клеток рака (фиг. 53В).TriNKETs mediate human NK cell cytotoxicity against the CD33-positive human AML cell line Molm-13. As shown in FIG. 53B, resting human NK cells were mixed with Molm-13 cancer cells, and TriNKETs (eg, C26-TriNKET-CD33 and F04-TriNKET-CD33) were able to enhance the cytotoxic activity of resting human NK cells in a dose-dependent manner against cancer cells. The dotted line indicates the cytotoxic activity of resting NK cells without TriNKET. Activated human NK cells were mixed with Molm-13 cancer cells, and TriNKET further enhanced the cytotoxic activity of activated human NK cells compared to anti-CD33 antibody in a dose-dependent manner against cancer cells (Figure 53B).

TriNKET усиливают цитотоксичность NK-клеток против мишеней с низким уровнем поверхностной экспрессией по сравнению с цитотоксической активностью трастузумаба, моноклонального антитела к HER2. Покоящиеся NK-клетки человека смешивали с опухолевыми клетками SkBr, экспрессирующими HER2 на высоком уровне, и раковыми клетками 786-0, экспрессирующими HER2 на низком уровне, и способностью TriNKET усиливать цитотоксическую активность покоящихся NK-клеток человека против клеток рака, экспрессирующих HER2 на высоком и низком уровне, была проанализирована в дозозависимой манере. Пунктирные линии на фиг. 50А и фиг. 50В указывают на цитотоксическую активность покоящихся NK-клеток против клеток рака в отсутствие TriNKET. Как показано на фиг. 50В, при смешивании активированных NK-клеток человека с клетками 786-0, экспрессирующими HER2 на низком уровне и TriNKET (например, CD26-TriNKET-HER2 и F04-TriNKET-HER2) наблюдали дозозависимую цитотоксическую активность активированных NK-клеток человека против клеток рака.TriNKETs enhance NK cell cytotoxicity against low surface expressed targets compared with the cytotoxic activity of trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody. Resting human NK cells were mixed with SkBr tumor cells expressing high levels of HER2 and 786-0 cancer cells expressing low levels of HER2, and the ability of TriNKET to enhance the cytotoxic activity of resting human NK cells against cancer cells expressing high and low levels of HER2 low level was analyzed in a dose-dependent manner. The dotted lines in Fig. 50A and FIG. 50B indicate the cytotoxic activity of resting NK cells against cancer cells in the absence of TriNKET. As shown in FIG. 50B, by mixing activated human NK cells with 786-0 cells expressing low levels of HER2 and TriNKET (eg, CD26-TriNKET-HER2 and F04-TriNKET-HER2), dose-dependent cytotoxic activity of activated human NK cells against cancer cells was observed.

Определяли TriNKET-опосредованный лизис ВСМА-положительных клеток миеломы. Фиг. 64 показывает TriNKET-опосредованный лизис ВСМА-положительных клеток миеломы KMS12-PE покоящимися эффекторными NK-клетками человека. Два Trinket (cFAE-A49.801 и cFAE-A49.901), использующие тот же NKG2D-связывающий домен (А49), но различные нацеленные на ВСМА домены, испытывали на эффективность in vitro. Оба TriNKET в одинаковой степени усиливали лизис NK-клетками клеток KMS12-PE, но TriNKET с использованием нацеливающего домена ЕМ-901 обеспечивали повышенную активность.TriNKET-mediated lysis of BCMA-positive myeloma cells was determined. Fig. 64 shows TriNKET-mediated lysis of BCMA-positive KMS12-PE myeloma cells by resting human effector NK cells. Two Trinkets (cFAE-A49.801 and cFAE-A49.901), using the same NKG2D-binding domain (A49) but different BCMA-targeting domains, were tested for in vitro efficacy. Both TriNKETs enhanced NK cell lysis of KMS12-PE cells to the same extent, but TriNKETs using the EM-901 targeting domain provided increased activity.

Фиг. 65 показывает цитотоксическую активность нескольких TriNKET с использованием различных NKG2D-связывающих доменов (А40, А44, А49, С26 и F47), но одного и того же домена, нацеленного на ВСМА. Изменение NKG2D-связывающего домена TriMAKET, нацеленного на ВСМА, приводило к изменениям максимального уничтожения, а также эффективности TriNKET. Все TriNKET продемонстрировали повышенное уничтожение клеток-мишеней KMS12-PE по сравнению с моноклональным антите- 44 044644 лом ЕМ-901 (фиг. 65).Fig. 65 shows the cytotoxic activity of several TriNKETs using different NKG2D binding domains (A40, A44, A49, C26 and F47) but the same BCMA targeting domain. Altering the BCMA-targeting NKG2D-binding domain of TriMAKET resulted in changes in maximum killing as well as TriNKET efficiency. All TriNKETs demonstrated increased killing of KMS12-PE target cells compared to monoclonal antibody EM-901 (FIG. 65).

Пример 13.Example 13.

Была исследована синергическая активация NK-клеток человека путем сшивания NKG2D и CD16.Synergistic activation of human NK cells by cross-linking NKG2D and CD16 was investigated.

Первичный анализ активации NK-клеток человекаPrimary analysis of human NK cell activation

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки очищали от РВМС с использованием отрицательных магнитных бус (StemCell # 17955). NK-клетки были > 90% CD3-CD56+, как определено с помощью проточной цитометрии. Затем клетки размножали 48 ч в среде, содержащей 100 нг/мл hIL-2 (Peprotech # 200-02), перед использованием в анализах активации. Антитела наносили на 96-луночный планшет с плоским дном в концентрации 2 мкг/мл (анти-CD16, Biolegend # 302013) и 5 мкг/мл (анти-NKG2D, R&D # МАВ139) в 100 мкл стерильного PBS в течение ночи при 4°С с последующим тщательным промыванием лунок для удаления избытка антител. Для оценки дегрануляции IL-2-активированные NK-клетки ресуспендировали в 5x105 клеток/мл в культуральной среде с добавлением 100 нг/мл hIL2 и 1 мкг/мл АРС-конъюгированного анти-CD107а mAb (BioLegend # 328619). 1x105 клеток/лунку затем были добавлены в планшеты покрытые антителами. Ингибиторы транспорта белка брефельдин A (BFA, Biolegend # 420601) и монензин (Biolegend # 420701) добавляли в конечном разведении 1:1000 и 1:270, соответственно. Клетки в планшетах инкубировали в течение 4 ч при 37°С в 5% СО2. Для внутриклеточного окрашивания IFN-γ NK-клетки метили анти-CD3 (Biolegend # 300452) и анти-CD56 mAb (Biolegend # 318328), а затем фиксировали и пермеабилизировали и метили анти-IFN-γ mAb (Biolegend # 506507). NK-клетки анализировали на экспрессию CD107а и IFN-γ с помощью проточной цитометрии после гейтирования на живые клетки CD56+CD3-.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. NK cells were purified from PBMCs using negative magnetic beads (StemCell #17955). NK cells were >90% CD3 CD56 + as determined by flow cytometry. Cells were then propagated for 48 h in medium containing 100 ng/ml hIL-2 (Peprotech #200-02) before use in activation assays. Antibodies were applied to a 96-well flat-bottom plate at a concentration of 2 μg/ml (anti-CD16, Biolegend # 302013) and 5 μg/ml (anti-NKG2D, R&D # MAB139) in 100 μl of sterile PBS overnight at 4°C C, followed by thorough washing of the wells to remove excess antibodies. To assess degranulation, IL-2-activated NK cells were resuspended at 5x105 cells/ml in culture medium supplemented with 100 ng/ml hIL2 and 1 μg/ml APC-conjugated anti-CD107a mAb (BioLegend #328619). 1x105 cells/well were then added to antibody-coated plates. The protein transport inhibitors brefeldin A (BFA, Biolegend #420601) and monensin (Biolegend #420701) were added at final dilutions of 1:1000 and 1:270, respectively. Cells in plates were incubated for 4 hours at 37°C in 5% CO 2 . For intracellular IFN-γ staining, NK cells were labeled with anti-CD3 (Biolegend #300452) and anti-CD56 mAb (Biolegend #318328) and then fixed and permeabilized and labeled with anti-IFN-γ mAb (Biolegend #506507). NK cells were analyzed for CD107a and IFN-γ expression by flow cytometry after gating on live CD56+CD3 - cells.

Чтобы исследовать относительную эффективность комбинации рецепторов, проводили сшивание NKG2D или CD16 и совместное сшивание обоих рецепторов посредством планшетсвязанной стимуляции. Как показано на фиг. 45 (фиг. 45А-45С), комбинированная стимуляция CD16 и NKG2D приводила к сильно повышенным уровням CD107а (дегрануляция) (фиг. 45А) и/или выработке IFN-γ (фиг. 45В). Пунктирные линии представляют аддитивный эффект отдельных стимуляций каждого рецептора.To investigate the relative potency of the receptor combination, cross-linking of NKG2D or CD16 and co-linking of both receptors via plate-linked stimulation were performed. As shown in FIG. 45 (FIGS. 45A-45C), combined stimulation of CD16 and NKG2D resulted in highly elevated CD107a levels (degranulation) (FIG. 45A) and/or IFN-γ production (FIG. 45B). The dotted lines represent the additive effect of individual stimulations of each receptor.

Уровни CD107а и внутриклеточную выработку IFN-γ в активированных IL-2 NK-клетках анализировали после 4 ч планшетсвязанной стимуляции, анти-CD16, анти-NKG2D или комбинацией обоих моноклональных антител. Графики показывают среднее значение (n=2) ±SD. Фиг. 45А демонстрирует уровни CD107а; фиг. 45В демонстрирует уровни IFNy; фиг. 45С демонстрирует уровни CD107а и IFN-γ. Данные, показанные на фиг. 45А-45С представляют собой пять независимых экспериментов с использованием пяти различных здоровых доноров.CD107a levels and intracellular IFN-γ production in IL-2-activated NK cells were analyzed after 4 h of plate-linked stimulation, anti-CD16, anti-NKG2D, or a combination of both monoclonal antibodies. Graphs show mean (n=2) ±SD. Fig. 45A shows CD107a levels; fig. 45B demonstrates IFNy levels; fig. 45C demonstrates CD107a and IFN-γ levels. The data shown in FIG. 45A-45C represent five independent experiments using five different healthy donors.

Дегрануляцию CD107а и внутриклеточную выработку IFN-γ в NK-клетках, активированных IL-2, анализировали после 4 ч планшетсвязанной стимуляции трастузумабом, анти-NKG2D или TriNKET, полученным из доменов связывания трастузумаба и антитела к NKG2D (фиг. 46). Во всех случаях испытанные антитела имели изотип IgG1 человека. Графики показывают среднее значение (n=2) ±SD.CD107a degranulation and intracellular IFN-γ production in IL-2-activated NK cells were analyzed after 4 hours of plate-bound stimulation with trastuzumab, anti-NKG2D, or TriNKET derived from the binding domains of trastuzumab and anti-NKG2D antibody (FIG. 46). In all cases, the antibodies tested were of the human IgG1 isotype. Graphs show mean (n=2) ±SD.

Пример 14. Оценка связывания TriNKET с экспрессируемым в клетках NKG2D человекаExample 14: Evaluation of TriNKET binding to human NKG2D expressed in cells

Клетки EL4, трансдуцированные NKG2D человека, использовали для тестирования связывания с экспрессируемым в клетках NKG2D человека. TriNKET были разбавлены до 20 мкг/мл, а затем разбавлены серийно. Разведения mAb или TriNKET использовали для окрашивания клеток, а связывание TriNKET или mAb определяли с использованием конъюгированного с флуорофором вторичного антитела к IgG человека. Клетки анализировали проточной цитометрией, связывание MFT было нормализовано к вторичным контрольным антителам для получения кратности по сравнению с фоновыми значениями.EL4 cells transduced with human NKG2D were used to test binding to cell-expressed human NKG2D. TriNKETs were diluted to 20 μg/ml and then serially diluted. Dilutions of mAb or TriNKET were used to stain cells, and TriNKET or mAb binding was detected using a fluorophore-conjugated anti-human IgG secondary antibody. Cells were analyzed by flow cytometry, and MFT binding was normalized to secondary control antibodies to obtain fold over background values.

Оценка связывания TriNKET с клеточно-экспрессированными антигенами рака человекаEvaluation of TriNKET binding to cell-expressed human cancer antigens

Линии клеток рака человека, экспрессирующие CD33 или HER2, использовали для оценки связывания опухолевого антигена с TriNKET, полученными из различных клонов, нацеленных на NKG2D. Клеточную линию ОМЛ человека MV4-11 использовали для оценки связывания TriNKET с экспрессируемым в клетке CD33. Клеточная линия 786-0 рака почек человека экспрессирует низкие уровни HER2 и была использована для оценки связывания TriNKET с клеточно-экспрессированным HER2. TriNKET разбавляли до 20 мкг/мл и инкубировали с соответствующими клетками. Связывание TriNKET детектировали с использованием конъюгированного с флуорофором вторичного антитела к IgG человека. Клетки анализировали проточной цитометрией, MFT связывания с сэкспрессированными в клетке CD33 и HER2 нормализовали к вторичным контрольным антителам для получения кратности по сравнению с фоновыми значениями.Human cancer cell lines expressing CD33 or HER2 were used to assess tumor antigen binding to TriNKETs derived from different NKG2D-targeting clones. The human AML cell line MV4-11 was used to evaluate the binding of TriNKET to cell-expressed CD33. The human kidney cancer cell line 786-0 expresses low levels of HER2 and was used to evaluate the binding of TriNKET to cell-expressed HER2. TriNKET was diluted to 20 μg/ml and incubated with the appropriate cells. TriNKET binding was detected using a fluorophore-conjugated anti-human IgG secondary antibody. Cells were analyzed by flow cytometry, and MFT binding to cell-expressed CD33 and HER2 was normalized to secondary control antibodies to obtain fold over background values.

Определение способности к связыванию антител с линиями HER2-положительных клеток рака человекаDetermination of antibody binding ability to HER2-positive human cancer cell lines

Была измерена способность связывания антител (ABC) с линиями HER2-положительных клеток рака человека. Использовался набор Quantum Simply Cellular от Bangs Lab (# 815), и для получения бус, меченных антителами, следовали инструкциям производителя. Вкратце, каждую из четырех популяций бус окрашивали насыщающим количеством антитела к HER2, а популяции клеток также окрашивали насыщающим количеством того же антитела. Данные выборки были получены для каждой популяцииAntibody binding capacity (ABC) to HER2-positive human cancer cell lines was measured. The Quantum Simply Cellular kit from Bangs Lab (#815) was used and the manufacturer's instructions were followed to prepare antibody-labeled beads. Briefly, each of the four bead populations was stained with a saturating amount of anti-HER2 antibody, and the cell populations were also stained with a saturating amount of the same antibody. Sample data were obtained for each population

- 45 044644 бус, а также для популяций клеток. Рабочий лист QuickCal, поставляемый с набором, использовался для генерации стандартной кривой и экстраполяции значений ABC для каждой из клеточных линий.- 45 044644 beads, as well as for cell populations. The QuickCal worksheet provided with the kit was used to generate a standard curve and extrapolate ABC values for each of the cell lines.

Активация первичных NK-клеток с помощью TriNKETActivation of Primary NK Cells by TriNKET

РВМС выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Изолированные РВМС были промыты и подготовлены для выделения NK-клеток. NK-клетки выделяли, используя метод отрицательного отбора с магнитными бусами; чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 90% CD3-CD56+. Выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2 для активации, или оставляли на ночь без цитокина. IL-2активированные NK-клетки использовали через 24-48 ч; покоящиеся NK-клетки всегда использовали на следующий день после очистки.PBMC were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. Isolated PBMCs were washed and prepared for NK cell isolation. NK cells were isolated using a negative selection method with magnetic beads; the purity of isolated NK cells was typically >90% CD3-CD56+. Isolated NK cells were cultured in medium containing 100 ng/ml IL-2 for activation or left overnight without the cytokine. IL-2 activated NK cells were used after 24–48 h; resting NK cells were always used the day after purification.

Линии клеток рака человека, экспрессирующие целевую раковую мишень собирали из культуры, и клетки доводили до 2x106 клеток/мл. Моноклональные антитела или TriNKET, нацеленные на целевую раковую мишень, разводили в культуральной среде. Покоящиеся и/или активированные NK-клетки собирали из культуры, клетки промывали и ресуспендировали при 2x106 клеток/мл в культуральной среде. IL-2 и конъюгированный с флуорофором анти-CD107a добавляли к NK-клеткам для активации культуры. Брефельдин-А и монензин разводили в культуральной среде для блокирования транспорта белка из клетки для внутриклеточного окрашивания цитокинов. В 96-луночный планшет добавляли 50 мкл опухолевых мишеней, mAb/TriNKET, BFA/монензин и NK-клетки для общего объема культуры 200 мкл. Планшет культивировали в течение 4 ч, прежде чем образцы были подготовлены для анализа FACS.Human cancer cell lines expressing the desired cancer target were harvested from culture and the cells were adjusted to 2x106 cells/ml. Monoclonal antibodies or TriNKETs targeting the target cancer target were diluted in culture media. Resting and/or activated NK cells were collected from culture, cells were washed and resuspended at 2x106 cells/ml in culture medium. IL-2 and fluorophore-conjugated anti-CD107a were added to NK cells to activate the culture. Brefeldin-A and monensin were diluted in culture medium to block protein transport out of the cell for intracellular cytokine staining. 50 μL of tumor targets, mAb/TriNKET, BFA/monensin, and NK cells were added to a 96-well plate for a total culture volume of 200 μL. The plate was cultured for 4 h before samples were prepared for FACS analysis.

После 4-часовой активации культуры клеток готовили для анализа методом проточной цитометрии с использованием конъюгированных с флуорофором антител к CD3, CD56 и IFNy. Окрашивание CD107a и IFNy анализировали в популяциях CD3-CD56+ для оценки активации NK-клеток.After 4-hour activation, cell cultures were prepared for flow cytometry analysis using fluorophore-conjugated antibodies to CD3, CD56, and IFNy. CD107a and IFNy staining were analyzed in CD3-CD56+ populations to assess NK cell activation.

Анализ первичной цитотоксичности NK-клеток человекаHuman NK Cell Primary Cytotoxicity Assay

РВМС выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Изолированные РВМС были промыты и подготовлены для выделения NK-клеток. NK-клетки выделяли, используя метод отрицательного отбора с магнитными бусами, чистота выделенных NK-клеток обычно составляла >90% CD3-CD56+. Выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, или оставляли на ночь без цитокина. Активированные IL-2 или покоящиеся NK-клетки использовали на следующий день в анализах цитотоксичности.PBMC were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. Isolated PBMCs were washed and prepared for NK cell isolation. NK cells were isolated using a negative selection method with magnetic beads, and the purity of isolated NK cells was typically >90% CD3-CD56+. Isolated NK cells were cultured in medium containing 100 ng/ml IL-2 or left overnight without the cytokine. IL-2-activated or resting NK cells were used the next day in cytotoxicity assays.

Анализ высвобождения Cyto Tox 96 LHDCyto Tox 96 LHD Release Assay

Способность NK-клеток человека лизировать опухолевые клетки измеряли с добавлением или без добавления TriNKET с использованием анализа нерадиоактивной цитотоксичности cyto Tox 96 от Promega (G1780). Линии клеток рака человека, экспрессирующие целевую раковую мишень собирали из культуры, клетки промывали PBS и ресуспендировали в среде роста при 1-2x105 клеток/мл для использования в качестве клеток-мишеней. 50 мкл суспензии клеток-мишеней добавляли в каждую лунку.The ability of human NK cells to lyse tumor cells was measured with or without the addition of TriNKET using the cyto Tox 96 non-radioactive cytotoxicity assay from Promega (G1780). Human cancer cell lines expressing the desired cancer target were collected from culture, the cells were washed with PBS and resuspended in growth medium at 1-2x105 cells/ml for use as target cells. 50 μl of target cell suspension was added to each well.

Моноклональные антитела или TriNKET, нацеленные на представляющий интерес раковый антиген, разводили в культуральной среде, в каждую лунку добавляли 50 мкл разведенного mAb или TriNKET. Покоящиеся и/или активированные NK-клетки собирали из культуры, клетки промывали и ресуспендировали при 105-2,0x106 клеток/мл в культуральной среде в зависимости от желаемого Е:Т соотношения. 50 мкл NK-клеток добавляли в каждую лунку планшета, чтобы получить общий объем культуры 150 мкл. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 3 ч и 15 мин. После инкубации 10x буфер для лизиса добавляли в лунки только с клетками-мишенями и в лунки, содержащие только среду, для максимального лизиса и контроля объема. Затем планшет помещали обратно в инкубатор на дополнительные 45 мин, чтобы довести общее время инкубации до развития реакции в течение 4 ч.Monoclonal antibodies or TriNKETs targeting the cancer antigen of interest were diluted in culture medium, and 50 μl of the diluted mAb or TriNKET was added to each well. Resting and/or activated NK cells were collected from culture, cells were washed and resuspended at 105-2.0x106 cells/ml in culture medium depending on the desired E:T ratio. 50 μl of NK cells was added to each well of the plate to obtain a total culture volume of 150 μl. The plate was incubated at 37°C with 5% CO 2 for 3 hours and 15 minutes. After incubation, 10x lysis buffer was added to wells containing only target cells and to wells containing only media for maximum lysis and volume control. The plate was then placed back into the incubator for an additional 45 min to bring the total incubation time to a reaction of 4 h.

После инкубации планшет извлекали из инкубатора и клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. 50 мкл культурального супернатанта переносили в чистый микропланшет и 50 мкл раствора субстрата добавляли в каждую лунку. Планшет защищали от света и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 50 мкл стоп-раствора и измеряли оптическую плотность при 492 нм на SpectraMax i3x. % Удельного лизиса рассчитывали следующим образом: % Удельного лизиса = ((Экспериментальное высвобождение-Самопроизвольное высвобождение из эффектора-Самопроизвольное высвобождение из мишени)/(Максимальное высвобождениеСамопроизвольное высвобождение))*100%.After incubation, the plate was removed from the incubator and the cells were pelleted by centrifugation at 200 g for 5 min. 50 μl of culture supernatant was transferred to a clean microplate and 50 μl of substrate solution was added to each well. The plate was protected from light and incubated for 30 min at room temperature. 50 μL of stop solution was added to each well and absorbance was measured at 492 nm on a SpectraMax i3x. % Specific lysis was calculated as follows: % Specific lysis = ((Experimental release-Spontaneous release from effector-Spontaneous release from target)/(Maximum releaseSpontaneous release))*100%.

Анализ цитотоксичности DELFIADELFIA Cytotoxicity Assay

Линии клеток рака человека, экспрессирующие целевую раковую мишень собирали из культуры, клетки промывали PBS и ресуспендировали в средах для роста при 106 клеток/мл для мечения BATDA реагентом (Perkin Elmer ADO116). Следовали инструкциям производителя по мечению клеток-мишеней. После мечения клетки промывали 3 раза PBS и ресуспендировали в 0,5-1,0x105 клеток/мл в культуральной среде. Для приготовления фоновых лунок аликвоту меченых клеток отбирали, и клетки извлекали из среды. 100 мкл среды осторожно добавляли в лунки в трех повторениях, чтобы не повредить гранулированные клетки. 100 мкл BATDA-меченных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Лунки были сохранены для спонтанного высвобождения из клеток-мишеней, и лунки были подготовле- 46 044644 ны для максимального лизиса клеток-мишеней путем добавления 1% Тритон-Х. Моноклональные антитела или TriNKET против интересующей опухоли-мишени разводили в культуральной среде и в каждую лунку добавляли 50 мкл разведенного mAb или TriNKET. Покоящиеся и/или активированные NK-клетки собирали из культуры, клетки промывали и ресуспендировали при 105-2,0х106 клеток/мл в культуральной среде в зависимости от желаемого Е:Т соотношения. 50 мкл NK-клеток добавляли в каждую лунку планшета, чтобы получить общий объем культуры 200 мкл. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО2 за 2-3 ч до проявления теста.Human cancer cell lines expressing the desired cancer target were collected from culture, cells were washed with PBS and resuspended in growth media at 106 cells/ml for labeling with BATDA reagent (Perkin Elmer ADO116). The manufacturer's instructions for labeling target cells were followed. After labeling, cells were washed 3 times with PBS and resuspended at 0.5-1.0x105 cells/ml in culture medium. To prepare background wells, an aliquot of labeled cells was removed and the cells were removed from the medium. 100 μL of medium was carefully added to the wells in triplicate to avoid damaging the granulated cells. 100 μl of BATDA-labeled cells was added to each well of a 96-well plate. Wells were maintained for spontaneous release from target cells, and wells were prepared for maximum target cell lysis by adding 1% Triton-X. Monoclonal antibodies or TriNKET against the target tumor of interest were diluted in culture medium, and 50 μl of the diluted mAb or TriNKET was added to each well. Resting and/or activated NK cells were collected from the culture, the cells were washed and resuspended at 105-2.0x106 cells/ml in culture medium depending on the desired E:T ratio. 50 μl of NK cells was added to each well of the plate to obtain a total culture volume of 200 μl. The plate was incubated at 37°C with 5% CO 2 2-3 hours before the test was developed.

После культивирования в течение 2-3 ч планшет извлекали из инкубатора и клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. 20 мкл супернатанта культуры переносили в чистый микропланшет, предоставленный производителем, в каждую лунку добавляли 200 мкл раствора европия комнатной температуры. Планшет защищали от света и инкубировали на шейкере при 250 об/мин в течение 15 мин. Планшет считывали с использованием инструментов Victor 3 или SpectraMax i3X. % Удельного лизиса рассчитывали следующим образом: % Удельного лизиса = ((Экспериментальное высвобождениеспонтанное высвобождение)/(Максимальное высвобождение-Спонтанное высвобождение))*100%.After culturing for 2-3 hours, the plate was removed from the incubator and the cells were pelleted by centrifugation at 200 g for 5 minutes. 20 μl of the culture supernatant was transferred into a clean microplate provided by the manufacturer, and 200 μl of europium solution at room temperature was added to each well. The plate was protected from light and incubated on a shaker at 250 rpm for 15 min. The plate was read using Victor 3 or SpectraMax i3X instruments. % Specific lysis was calculated as follows: % Specific lysis = ((Experimental release-spontaneous release)/(Maximum release-Spontaneous release))*100%.

Долгосрочный анализ цитотоксичности РВМС человекаLong-term cytotoxicity assay of human PBMCs

Клетки-мишени SkBr-3 были помечены BacMam 3.0 NucLight Green (# 4622) для отслеживания клеток-мишеней. Для мечения клеток-мишеней SkBr-3 следовали протоколу производителя. Аннексин V Красный (Essen Bioscience # 4641) разбавляли и готовили в соответствии с инструкциями производителя. Моноклональные антитела или TriNKET разводили в культуральной среде. 50 мкл mAb или TriNKET, аннексина V и оставшихся NK-клеток добавляли в лунки 96-луночного планшета, уже содержащего меченые клетки SkBr-3; Добавляли 50 мкл полной культуральной среды для общего объема культуры 200 мкл.SkBr-3 target cells were labeled with BacMam 3.0 NucLight Green (#4622) for target cell tracking. The manufacturer's protocol was followed to label target cells with SkBr-3. Annexin V Red (Essen Bioscience #4641) was diluted and prepared according to the manufacturer's instructions. Monoclonal antibodies or TriNKET were diluted in culture medium. 50 μl of mAb or TriNKET, annexin V and the remaining NK cells were added to the wells of a 96-well plate already containing labeled SkBr-3 cells; 50 μl of complete culture medium was added for a total culture volume of 200 μl.

Сбор изображений была настроен на IncuCyte S3. Изображения для фазового, зеленого и красного каналов собирали каждый час, по 2 изображения на лунку. Анализ изображений проводился с использованием программного обеспечения IncuCyte S3. Маски для зеленого и красного каналов были созданы для подсчета количества опухолевых клеток и аннексин V-положительных клеток, соответственно. Для расчета % аннексин V положительных клеток-мишеней Mv4-11 использовали следующую формулу. % Аннексин V положительных клеток SkBr-3 = ((количество перекрывающихся объектов)/(количество зеленых объектов))*100%.Image acquisition was set up on an IncuCyte S3. Images for the phase, green, and red channels were collected every hour, 2 images per well. Image analysis was performed using IncuCyte S3 software. Masks for the green and red channels were created to count the number of tumor cells and annexin V-positive cells, respectively. The following formula was used to calculate % Annexin V positive Mv4-11 target cells. % Annexin V positive SkBr-3 cells = ((number of overlapping objects)/(number of green objects))*100%.

Сравнение TriNKET, нацеленного на раковые клетки HER+c SC2.2Comparison of TriNKET targeting HER+c SC2.2 cancer cells

TriNKET, нацеленный на HER2, более эффективен, чем трастузумаб, для уменьшения количества клеток SkBr-3, и только 60% клеток с нулевого времени оставалось после 60 часов. TriNKET настоящего изобретения, нацеленный на HER2 экспрессирующие опухолевые/раковые клетки, был более эффективен, чем SC2.2 -одноцепочечная биспецифическая молекула, построенная из scFv, полученного из трастузумаба, связанного с ULBP-6, лигандом для NKG2D. SC2.2 связывает раковые клетки HER2+ и NKG2D+ NK-клетки одновременно. Поэтому была исследована эффективность SC2.2 в снижении количества раковых клеток HER2+. Анализы активации и цитотоксичности in vitro показали, что SC2.2 эффективен в активации и уничтожении NK-клеток. Однако SC2.2 не смог продемонстрировать эффективность в модели подкожной опухоли RMA/S-HER2. Эффективность SC2.2 также тестировали in vivo с использованием модели сингенной мыши со сверхэкспрессирующей RMA/S-HER2. В этой мышиной модели SC2.2 не смог продемонстрировать контроль роста опухоли по сравнению с контролем носителя. Таким образом, хотя SC2.2 был способен активировать и убивать NK-клетки, и связываться с раковыми клетками HER2+, эти свойства были недостаточны для эффективного контроля роста опухоли HER2+.TriNKET targeting HER2 was more effective than trastuzumab at reducing SkBr-3 cells, with only 60% of cells from time zero remaining after 60 hours. The TriNKET of the present invention, targeting HER2-expressing tumor/cancer cells, was more effective than SC2.2, a single-chain bispecific molecule constructed from a trastuzumab-derived scFv bound to ULBP-6, a ligand for NKG2D. SC2.2 binds HER2+ cancer cells and NKG2D+ NK cells simultaneously. Therefore, the effectiveness of SC2.2 in reducing the number of HER2+ cancer cells was investigated. In vitro activation and cytotoxicity assays showed that SC2.2 was effective in activating and killing NK cells. However, SC2.2 failed to demonstrate efficacy in the RMA/S-HER2 subcutaneous tumor model. The efficacy of SC2.2 was also tested in vivo using a syngeneic mouse model overexpressing RMA/S-HER2. In this mouse model, SC2.2 failed to demonstrate tumor growth control compared to vehicle controls. Thus, although SC2.2 was able to activate and kill NK cells and bind to HER2+ cancer cells, these properties were not sufficient to effectively control HER2+ tumor growth.

Оценка периода полувыведения SC2.2 из сыворотки у мышей С57В1/6 Для определения периода полувыведения SC2.2 из сыворотки у мышей С57В1/6, SC2.2 метили флуоресцентной меткой для отслеживания его концентрации in vivo. SC2.2 метили с помощью IRDye 800CW (Licor # 929-70020). Меченый белок вводили внутривенно 3 мышам С57В1/6, кровь отбирали у каждой мыши в указанные моменты времени. После сбора кровь центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин и из каждого образца отбирали сыворотку и хранили при 4°С до тех пор, пока не были собраны все временные точки.Estimation of the serum half-life of SC2.2 in C57B1/6 mice To determine the serum half-life of SC2.2 in C57B1/6 mice, SC2.2 was fluorescently labeled to monitor its concentration in vivo. SC2.2 was labeled using IRDye 800CW (Licor #929-70020). The labeled protein was injected intravenously into 3 C57B1/6 mice, and blood was collected from each mouse at the indicated time points. After collection, blood was centrifuged at 1000 g for 15 min and serum was collected from each sample and stored at 4°C until all time points were collected.

Сыворотку визуализировали с использованием инфракрасной системы визуализации Odyssey CLx, флуоресцентный сигнал с 800 канала количественно определяли с использованием программного обеспечения Image J. Интенсивности изображения были нормализованы к первому моменту времени, и данные соответствовали двухфазному уравнению затухания. В этой экспериментальной системе бета-период полувыведения SC2.2 составлял около 7 ч.Serum was imaged using an Odyssey CLx infrared imaging system, and the fluorescence signal from the 800 channel was quantified using Image J software. Image intensities were normalized to the first time point, and the data were fit to a two-phase decay equation. In this experimental system, the beta half-life of SC2.2 was approximately 7 h.

In vivo тестирование SC2.2 против подкожных опухолей RMA/S-HER2In vivo testing of SC2.2 against RMA/S-HER2 subcutaneous tumors

Исследование in vivo было разработано в соответствии с фиг. 56 для проверки эффективности SC2.2 против подкожных опухолей RMA/S-HER2. 106 клеток RMA/S, трансдуцированных человеческим HER2, подкожно инъецировали в бок 20 мышей С57В1/6. Начиная со 2-го дня после инокуляции опухоли, SC2.2 ежедневно вводили внутрибрюшинно. SC2.2 был дозирован в высоких и низких концентрациях наряду с контролем носителем. Начиная с 4-го дня после инокуляции опухоли, опухоли измеряли в понедельник, среду и пятницу на протяжении всего исследования. Объем опухоли рассчитывали по слеThe in vivo study was designed according to FIG. 56 to test the efficacy of SC2.2 against RMA/S-HER2 subcutaneous tumors. 10 6 RMA/S cells transduced with human HER2 were injected subcutaneously into the flank of 20 C57B1/6 mice. Starting on day 2 after tumor inoculation, SC2.2 was administered daily intraperitoneally. SC2.2 was dosed at high and low concentrations along with a vehicle control. Beginning on day 4 after tumor inoculation, tumors were measured on Monday, Wednesday, and Friday throughout the study. Tumor volume was calculated after

- 47 044644 дующей формуле: объем опухоли=длина х ширина х высота TriNKET связываются с клетками, экспрессирующими NKG2D человека Была определена способность TriNKET связывать клетки, экспрессирующие NKG2D человека. Фиг. 37 и 38 показывают дозозависимое связывание двух TriNKET, содержащих разные NKG2D-связывающие домены. На фиг. 37 продемонстрировано связывание двух TriNKET, когда CD33-связывающий домен используется в качестве второго нацеливающего плеча. На фиг. 38 продемонстрированы те же два NKG2D-связывающих домена, которые в таких условиях соединены со вторым нацеливающим плечом HER2. Шесть NKG2D-связывающих доменов сохраняют один и тот же профиль связывания с обоими нацеливающими на опухоль доменами.- 47 044644 following formula: tumor volume = length x width x height TriNKET binds to cells expressing human NKG2D The ability of TriNKET to bind to cells expressing human NKG2D was determined. Fig. 37 and 38 show dose-dependent binding of two TriNKETs containing different NKG2D-binding domains. In fig. 37 demonstrates the binding of two TriNKETs when the CD33‐binding domain is used as the second targeting arm. In fig. 38 demonstrates the same two NKG2D-binding domains that are coupled to the second targeting arm of HER2 under these conditions. The six NKG2D-binding domains retain the same binding profile with both tumor-targeting domains.

TriNKET связываются с клетками, экспрессирующими антигены рака человека.TriNKETs bind to cells expressing human cancer antigens.

Была определена способность TriNKET связывать клетки, экспрессирующие антигены рака человека. Фиг. 41 и фиг. 42 показывают связывание TriNKET с экспрессирующими CD33 (фиг. 41) и HER2 (фиг. 42) клетками. Связывание TriNKET с клеточно-экспрессируемым антигеном было согласованным между NKG2D-связывающими доменами. TriNKET связывались с сопоставимыми родительскому моноклональному антителу уровнями.The ability of TriNKET to bind cells expressing human cancer antigens was determined. Fig. 41 and fig. 42 show binding of TriNKET to CD33 (FIG. 41) and HER2 (FIG. 42) expressing cells. Binding of TriNKET to cell-expressed antigen was consistent across NKG2D-binding domains. TriNKET bound at levels comparable to the parent monoclonal antibody.

Способность антител связывать линии HER2-положительных клеток рака человекаAbility of antibodies to bind HER2-positive human cancer cell lines

В табл. 8 приведены результаты количественного определения уровня поверхностного HER2. Было установлено, что клетки SkBr-3 и НСС1954 имеют высокие (+++) уровни поверхностного HER2. ZR-75-1 и Со1о201 показали средние уровни (++) поверхностного HER2, а 786-O показала самый низкий уровень поверхностного HER2 (+).In table Figure 8 shows the results of quantitative determination of the level of surface HER2. SkBr-3 and HCC1954 cells were found to have high (+++) levels of surface HER2. ZR-75-1 and Co1o201 showed moderate levels (++) of surface HER2, and 786-O showed the lowest level of surface HER2 (+).

Таблица 8. ABC HER2-положительных клеточных линий ракаTable 8. ABC of HER2-positive cancer cell lines

Клеточная линия Cell line Экспрессия HER2 HER2 expression АВС ABC 786-0 786-0 Низкая Low 28162 28162 Со1о201 Co1o201 Средняя Average 273 568 273 568 ZR-75-1 ZR-75-1 Средняя Average 281 026 281 026 SKBR-3 SKBR-3 Высокая High 6 820 532 6 820 532 НСС1954 NSS1954 Высокая High 10 569 869 10 569 869

Первичные NK-клетки человека активируются TriNKET в совместной культуре с линиями рака человека, экспрессирующими различные уровни HER2.Primary human NK cells are activated by TriNKET in coculture with human cancer lines expressing varying levels of HER2.

Фиг. 47А-47С показывают, что TriNKET и трастузумаб способны активировать первичные NKклетки человека в совместной культуре с HER2-положительными опухолевыми клетками человека, на что указывает увеличение дегрануляции CD107а и выработки цитокинов IFNg. По сравнению с моноклональным антителом трастузумабом оба TriNKET продемонстрировали превосходную активацию NKклеток человека с различными клетками HER2 рака человека.Fig. 47A-47C show that TriNKET and trastuzumab are able to activate primary human NK cells in co-culture with HER2-positive human tumor cells, as indicated by increased CD107a degranulation and IFNg cytokine production. Compared to the monoclonal antibody trastuzumab, both TriNKETs demonstrated superior activation of human NK cells with a variety of human HER2 cancer cells.

На фиг. 47А продемонстрировано, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с клетками SkBr-3. На фиг. 47В продемонстрировано, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с клетками Со1о201. Фиг. 47С показывает, что NK-клетки человека активируются TriNKET при культивировании с клетками НСС1954.In fig. 47A demonstrated that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with SkBr-3 cells. In fig. 47B demonstrated that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with Co10201 cells. Fig. 47C shows that human NK cells are activated by TriNKET when cultured with HCC1954 cells.

TriNKET усиливают активность покоящихся и активированных IL-2 NK-клеток человекаTriNKETs enhance the activity of resting and IL-2-activated human NK cells

Фиг. 48А-48В показывают TriNKET-опосредованную активацию покоящихся или IL-2активированных NK-клеток человека в совместной культуре с CD33-экспрессирующей линией клеток ОМЛ человека MV4-11. Фиг. 48А показывает TriNKET-опосредованную активацию покоящихся NKклеток человека. На фиг. 48В продемонстрирована TriNKET-опосредованная активация NK-клеток человека от того же донора. Покоящиеся NK-клетки показали меньшую фоновую выработку IFNy и дегрануляцию CD107а, чем NK-клетки, активированные IL-2. Покоящиеся NK-клетки показали большее изменение в выработке IFNy и дегрануляции CD107а по сравнению с NK-клетками, активированными IL-2. NK-клетки, активированные IL-2, показали больший процент клеток, становящихся IFNy +; CD107a+ после стимуляции TriNKET.Fig. 48A-48B show TriNKET-mediated activation of quiescent or IL-2-activated human NK cells in coculture with the CD33-expressing human AML cell line MV4-11. Fig. 48A shows TriNKET-mediated activation of resting human NK cells. In fig. 48B demonstrates TriNKET-mediated activation of human NK cells from the same donor. Resting NK cells showed less background IFNy production and CD107a degranulation than IL-2-activated NK cells. Resting NK cells showed a greater change in IFNy production and CD107a degranulation compared to IL-2-activated NK cells. NK cells activated by IL-2 showed a higher percentage of cells becoming IFNy+; CD107a+ after TriNKET stimulation.

TriNKET усиливают цитотоксичность покоящихся и активированных IL-2 NK-клеток человекаTriNKETs enhance the cytotoxicity of resting and IL-2-activated human NK cells

Фиг. 49А-49В показывают усиление TriNKET цитотоксической активности с использованием активированных IL-2 и покоящихся NK-клеток человека. На фиг. 49А продемонстрирован процент специфического лизиса опухолевых клеток SkBr-3 покоящимися NK-клетками человека. На фиг. 49В продемонстрирован процент специфического лизиса опухолевых клеток SkBr-3 активированными IL-2 NKклетками человека. Активированные IL-2 и покоящиеся популяции NK-клеток происходили от одного и того же донора. По сравнению с трастузумабом, TriNKET более эффективно направляют ответы против клеток SkBr-3 либо активированными, либо покоящимся популяциями NK-клеток.Fig. 49A-49B show TriNKET enhancement of cytotoxic activity using activated IL-2 and resting human NK cells. In fig. 49A demonstrates the percentage of specific lysis of SkBr-3 tumor cells by resting human NK cells. In fig. 49B demonstrates the percentage of specific lysis of SkBr-3 tumor cells by IL-2 activated human NK cells. IL-2-activated and quiescent NK cell populations were derived from the same donor. Compared with trastuzumab, TriNKET is more effective in directing responses against SkBr-3 cells by either activated or quiescent NK cell populations.

- 48 044644- 48 044644

TriNKET усиливают цитотоксичность NK-клеток в отношении мишеней с низкой поверхностной экспрессиейTriNKETs enhance NK cell cytotoxicity towards low surface expression targets

Фиг. 50А-50В показывают, что TriNKET обеспечивают большее преимущество против рака с средним и низким уровнем HER2 по сравнению с трастузумабом. Фиг. 50А показывает уничтожение активированными NK-клетками человека опухолевых клеток SkBr-3 с высоким уровнем HER2. Фиг. 50В показывает уничтожение NK-клетками человека опухолевых клеток 786-O с низким уровнем HER2. TriNKET обеспечивают большее преимущество по сравнению с трастузумабом против клеток рака с низким уровнем экспрессией HER2. TriNKET обеспечивают наибольшее преимущество по отношению к целям с низким уровнем поверхностной экспрессии.Fig. 50A-50B show that TriNKET provides greater benefit against intermediate and low HER2 cancers compared to trastuzumab. Fig. 50A shows activated human NK cells killing SkBr-3 tumor cells with high levels of HER2. Fig. 50B shows human NK cells killing 786-O tumor cells with low levels of HER2. TriNKETs provide greater benefit compared with trastuzumab against cancer cells with low HER2 expression. TriNKETs provide the greatest benefit against low surface expression targets.

Преимущество TriNKET в лечении рака с высоким уровнем экспрессии FcR или в микроокружении опухоли с высоким уровнем FcRAdvantage of TriNKET in treating cancers with high FcR expression or in tumor microenvironments with high FcR levels

Терапия моноклональными антителами была одобрена для лечения многих типов рака, включая как гематологические, так и солидные опухоли. Хотя использование моноклональных антител в лечении рака улучшило результаты лечения пациентов, все еще существуют ограничения. Механистические исследования показали, что моноклональные антитела оказывают свое влияние на рост опухоли посредством множества механизмов, включая ADCC, CDC, фагоцитоз и сигнальную блокаду среди других.Monoclonal antibody therapy has been approved for the treatment of many types of cancer, including both hematologic and solid tumors. Although the use of monoclonal antibodies in cancer treatment has improved patient outcomes, limitations still exist. Mechanistic studies have shown that monoclonal antibodies exert their effects on tumor growth through multiple mechanisms, including ADCC, CDC, phagocytosis, and signal blockade among others.

В частности, считается, что ADCC является основным механизмом, посредством которого моноклональные антитела оказывают свое влияние. ADCC основывается на взаимодействии Fc антител с низким сродством FcyRIII (CD16) на поверхности естественных клеток-киллеров, которые обеспечивают прямой лизис опухолевой клетки. Среди FcyR CD16 обладает наименьшим сродством к IgG Fc, FcyRI (CD64) является FcR с высоким сродством и связывается около в 1000 раз сильнее с IgG Fc, чем CD16.In particular, ADCC is thought to be the primary mechanism by which monoclonal antibodies exert their effects. ADCC is based on the interaction of low-affinity Fc antibodies FcyRIII (CD16) on the surface of natural killer cells, which provide direct lysis of the tumor cell. Among the FcyRs, CD16 has the lowest affinity for IgG Fc, FcyRI (CD64) is a high affinity FcR and binds about 1000 times more strongly to IgG Fc than CD16.

CD64 обычно экспрессируется на многих гематопоэтических линиях, таких как миелоидная линия, и может экспрессироваться на опухолях, происходящих из этих типов клеток, таких как острая миелоидная лейкемия (ОМЛ). Иммунные клетки, проникающие в опухоль, такие как MDSC и моноциты, также экспрессируют CD64 и, как известно, проникают в микроокружение опухоли. Экспрессия CD64 опухолью или в микроокружении опухоли может оказывать негативное воздействие на терапию моноклональными антителами. Экспрессия CD64 в микроокружении опухоли затрудняет взаимодействие этих антител с CD16 на поверхности NK-клеток, поскольку антитела предпочитают связывать высокоаффинный рецептор. Посредством нацеливания на два активирующих рецептора на поверхности NK-клеток TriNKET могут быть способны преодолеть пагубное влияние экспрессии CD64 на терапию моноклональными антителами.CD64 is commonly expressed on many hematopoietic lineages, such as the myeloid lineage, and can be expressed on tumors derived from these cell types, such as acute myeloid leukemia (AML). Tumor-infiltrating immune cells, such as MDSCs and monocytes, also express CD64 and are known to infiltrate the tumor microenvironment. Expression of CD64 by the tumor or in the tumor microenvironment may have a negative impact on monoclonal antibody therapy. Expression of CD64 in the tumor microenvironment makes it difficult for these antibodies to interact with CD16 on the surface of NK cells, as the antibodies prefer to bind the high-affinity receptor. By targeting two activating receptors on the surface of NK cells, TriNKETs may be able to overcome the detrimental effects of CD64 expression on monoclonal antibody therapy.

Экспрессия FcRyI(CD64) на поверхности клеток трех клеточных линий ОМЛExpression of FcRyI(CD64) on the cell surface of three AML cell lines

Была разработана in vitro культуральная система, чтобы проверить активность TriNKET и моноклональных антител против опухолей с высокими и низкими уровнями поверхностной экспрессии CD64. Molm-13 и ТНР-1 представляют собой две клеточные линии ОМЛ человека, которые имеют сходный уровень экспрессии поверхностного CD33, но клетки Molm-13 не экспрессируют CD64, тогда как клетки ТНР-1 экспрессируют CD64 на своей поверхности (фиг. 51А-51С). Используя моноклональные антитела или TriNKET, направленные на мишень CD33, тестировали влияние экспрессии CD64 опухолью на моноклональные антитела или терапию TriNKET. Фиг. 51А-51С показывают уровни экспрессии высокоаффинного FcRyI (CD64) в трех линиях клеток ОМЛ человека, клеточной линии Molm-13 (фиг. 51А), клеточной линии Mv4-11 (фиг. 51В) и клеточной линии ТНР-1. (фиг. 51С). Клетки Molm-13 не экспрессируют CD64, в то время как клетки Mv4-11 имеют низкий уровень экспрессии, а ТНР-1 имеют высокий уровень экспрессии CD64 на клеточной поверхности.An in vitro culture system was developed to test the activity of TriNKET and monoclonal antibodies against tumors with high and low levels of CD64 surface expression. Molm-13 and THP-1 are two human AML cell lines that have similar levels of surface CD33 expression, but Molm-13 cells do not express CD64, whereas THP-1 cells express CD64 on their surface (Figures 51A-51C) . Using monoclonal antibodies or TriNKET targeting CD33, the effect of tumor CD64 expression on monoclonal antibodies or TriNKET therapy was tested. Fig. 51A-51C show the expression levels of high affinity FcRyI (CD64) in three human AML cell lines, the Molm-13 cell line (Fig. 51A), the Mv4-11 cell line (Fig. 51B) and the THP-1 cell line. (Fig. 51C). Molm-13 cells do not express CD64, while Mv4-11 cells have low levels of expression and THP-1 cells have high levels of CD64 expression on the cell surface.

TriNKET имеют преимущество в нацеливании на опухолевые клетки с высоким уровнем поверхностной экспрессии FcRTriNKETs have an advantage in targeting tumor cells with high levels of FcR surface expression

Фиг. 52А-52В показывают опосредованную моноклональными антителами или TriNKET активацию NK-клеток человека в совместной культуре с клетками либо Molm-13 (фиг. 52В), либо ТНР-1 (фиг. 52А). Моноклональное антитело к CD33 человека продемонстрировало хорошую активацию NK-клеток человека в системе совместной культуры Molm-13, о чем свидетельствует повышенная дегрануляция CD107а и выработка IFNy. Моноклональное антитело не действует в системе совместной культуры ТНР-1, где высокие уровни CD64 присутствуют в опухоли. Интересно, что TriNKET были эффективны против клеток Molm-13 (фиг. 52В) и ТНР-1 (фиг. 52А), в то время как моноклональные антитела не способны активировать NK-клетки в культуре с клетками FcR-Hi ТНР-1, указывая на то, что TriNKET способны преодолеть связывание с CD64 на поверхности опухоли и эффективно нацелить NK-клетки для активации. Двойное нацеливание двух активирующих рецепторов на NK-клетки обеспечивало более сильное специфическое связывание с NK-клетками. Моноклональные антитела, которые нацелены только на CD16 на NK-клетках, могут связываться с другими высокоаффинными FcR и предотвращать вхаимодействие с CD 16 на NK-клетках.Fig. 52A-52B show monoclonal antibody or TriNKET-mediated activation of human NK cells in coculture with either Molm-13 (FIG. 52B) or THP-1 (FIG. 52A) cells. Anti-human CD33 monoclonal antibody demonstrated good activation of human NK cells in the Molm-13 co-culture system, as evidenced by increased CD107a degranulation and IFNy production. The monoclonal antibody does not work in the THP-1 co-culture system, where high levels of CD64 are present in the tumor. Interestingly, TriNKETs were effective against Molm-13 (Figure 52B) and THP-1 (Figure 52A) cells, while monoclonal antibodies failed to activate NK cells in culture with FcR-Hi THP-1 cells, indicating that TriNKETs are able to overcome binding to CD64 on the tumor surface and effectively target NK cells for activation. Dual targeting of two activating receptors to NK cells provided stronger specific binding to NK cells. Monoclonal antibodies that target only CD16 on NK cells can bind to other high-affinity FcRs and prevent interaction with CD16 on NK cells.

Анализы цитотоксичности NK-клеток человека с использованием систем совместной культуры Molm-13 и ТНР-1 предоставляют дополнительные доказательства, подтверждающие эффективность TriNKET в присутствии высоких уровней CD64. В этих анализах цитотоксичности была использованаHuman NK cell cytotoxicity assays using Molm-13 and THP-1 coculture systems provide further evidence supporting the efficacy of TriNKET in the presence of high levels of CD64. These cytotoxicity assays used

- 49 044644 третья линия клеток ОМЛ человека, Mv4-11. Клетки Mv4-11 экспрессируют низкие уровни CD64 и попадают между клетками ТНР-1 и Molm-13 относительно уровней CD64 на их поверхности (фиг. 51А51С).- 49 044644 third human AML cell line, Mv4-11. Mv4-11 cells express low levels of CD64 and fall between THP-1 and Molm-13 cells relative to their surface CD64 levels (FIG. 51A51C).

TriNKET демонстрируют эффективность в клеточных линиях ОМЛ независимо от уровня экспрессии FcyRITriNKETs demonstrate efficacy in AML cell lines regardless of FcyRI expression level

Фиг. 53А-53С показывают анализы цитотоксичности NK-клеток человека с использованием трех линий клеток ОМЛ человека в качестве мишеней. Моноклональное антитело к CD33 показывает хорошую эффективность против клеток Molm-13 (фиг. 53В), которые не экспрессируют CD64. Клетки Mv411 (фиг. 53А), которые экспрессируют CD64, но на более низком уровне, чем ТНР-1, показали пониженную эффективность в случае с моноклональным анти-CD33. Клетки ТНР-1 (фиг. 53С) не проявляли эффекта в случае только с моноклональным анти-CD33. Независимо от уровня экспрессии CD64 на поверхности опухолевых клеток, TriNKET были способны опосредовать ответы NK-клеток человека против всех опухолевых клеток, протестированных в настоящем документе.Fig. 53A-53C show human NK cell cytotoxicity assays using three human AML cell lines as targets. The anti-CD33 monoclonal antibody shows good activity against Molm-13 cells (FIG. 53B), which do not express CD64. Mv411 cells (FIG. 53A), which express CD64, but at a lower level than THP-1, showed reduced efficacy with monoclonal anti-CD33. THP-1 cells (FIG. 53C) showed no effect when treated with monoclonal anti-CD33 alone. Regardless of the level of CD64 expression on the surface of tumor cells, TriNKETs were able to mediate human NK cell responses against all tumor cells tested herein.

Фиг. 53А-53С показывают, что клетки ТНР-1 были защищены от терапии моноклональными антителами из-за высокого уровня экспрессии высокоаффинного FcR на их поверхности. TriNKET обошли эту защиту, воздействуя на два активирующих рецептора на поверхности NK-клеток. Данные по цитотоксичности напрямую коррелировали с тем, что было замечено в экспериментах по активации в совместной культуре. TriNKET были способны обойти защиту от mAb-терапии, наблюдаемой с клетками ТНР1, и индуцировать лизис, опосредованный NK-клетками, несмотря на высокий уровень FcR.Fig. 53A-53C show that THP-1 cells were protected from monoclonal antibody therapy due to high levels of high-affinity FcR expression on their surface. TriNKETs bypassed this defense by targeting two activating receptors on the surface of NK cells. The cytotoxicity data directly correlated with what was seen in the co-culture activation experiments. TriNKETs were able to bypass the protection from mAb therapy observed with THP1 cells and induce NK cell-mediated lysis despite high FcR levels.

Уничтожение нормальных миелоидных и нормальных В-клеток в культурах РВМС: TriNKET обеспечивает лучший профиль безопасности благодаря меньшему количеству побочных эффектов, вызванных связыванием с мишенью вне опухоли.Depletion of normal myeloid and normal B cells in cultured PBMCs: TriNKET provides a better safety profile due to fewer side effects caused by binding to non-tumor targets.

Естественные клетки-киллеры и CD8 Т-клетки способны непосредственно лизировать опухолевые клетки, хотя механизмы, посредством которых NK-клетки и CD8 Т-клетки распознают нормальные клетки от опухолевых клеток, отличаются. Активность NK-клеток регулируется балансом сигналов от активирующих (NCR, NKG2D, CD16 и т.д.) и ингибирующих (KIR, NKG2A и т.д.) рецепторов. Баланс этих активирующих и ингибирующих сигналов позволяет NK-клеткам определять здоровые аутоклетки из стрессированных, инфицированных вирусом или трансформированных аутоклеток. Этот встроенный механизм аутотолерантности поможет защитить нормальную здоровую ткань от ответов NK-клеток. Чтобы расширить этот принцип, аутотолерантность NK-клеток позволит TriNKET нацеливать на антигены, экспрессируемые как на поверхности аутоклеток, так и на поверхности опухоли, без побочных эффектов или с увеличенным терапевтическим окном.Natural killer cells and CD8 T cells are able to directly lyse tumor cells, although the mechanisms by which NK cells and CD8 T cells recognize normal cells from tumor cells differ. The activity of NK cells is regulated by the balance of signals from activating (NCR, NKG2D, CD16, etc.) and inhibitory (KIR, NKG2A, etc.) receptors. The balance of these activating and inhibitory signals allows NK cells to identify healthy autocells from stressed, virus-infected, or transformed autocells. This built-in self-tolerance mechanism will help protect normal healthy tissue from NK cell responses. To extend this principle, NK cell self-tolerance would allow TriNKET to target antigens expressed on both the autocell and tumor surfaces without side effects or with an extended therapeutic window.

В отличие от естественных клеток-киллеров Т-клеткам требуется распознавание специфического пептида, представленного молекулами МНС для активации и эффекторных функций. Т-клетки были основной целью иммунотерапии, и было разработано много стратегий для перенаправления Т-клеточных ответов против опухоли. Биспецифические Т-клетки, ингибиторы контрольных точек и CAR-T-клетки были одобрены FDA, но часто оказывают дозолимитирующее токсическое действие. Биспецифические Т-клетки и CAR-T клетки работают вокруг системы распознавания TCR-MHC, используя связывающие домены для нацеливания антигенов на поверхность опухолевых клеток и используя сконструированные сигнальные домены для передачи сигналов активации в эффекторную клетку. Несмотря на то, что эти способы лечения эффективны для выявления противоопухолевого иммунного ответа, они часто сочетаются с синдромом высвобождения цитокинов (CRS) и побочными эффектами, вызванными связыванием с мишенью вне опухоли. TriNKET уникальны в этом контексте, поскольку они не будут перекрывать естественные системы активации и ингибирования NK-клеток. Вместо этого TriNKET предназначены для изменения баланса и обеспечения дополнительных сигналов активации для NK-клеток, сохраняя при этом толерантность NK к здоровым аутоклеткам.Unlike natural killer cells, T cells require recognition of a specific peptide presented by MHC molecules for activation and effector functions. T cells have been a major target of immunotherapy, and many strategies have been developed to redirect T cell responses against the tumor. Bispecific T cells, checkpoint inhibitors, and CAR T cells have been approved by the FDA but often have dose-limiting toxicities. Bispecific T cells and CAR-T cells operate around the TCR-MHC recognition system, using binding domains to target antigens to the surface of tumor cells and using engineered signaling domains to transmit activation signals to the effector cell. Although these treatments are effective in eliciting an antitumor immune response, they are often associated with cytokine release syndrome (CRS) and side effects caused by binding to nontumor targets. TriNKETs are unique in this context because they will not override natural NK cell activation and inhibition systems. Instead, TriNKETs are designed to alter the balance and provide additional activation signals to NK cells while maintaining NK tolerance to healthy autocells.

РВМС выделяли из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности. Любые загрязняющие эритроциты лизировали путем инкубации в буфере для лизиса АСК. РВМС промывали 3 раза в PBS, и подсчитывали общее количество РВМС. Концентрацию РВМС доводили до 10 клеток/мл в первичной среде для культивирования клеток. 1 мл РВМС высевали в лунки 24-луночного планшета, указанные TriNKET или mAb добавляли в культуры РВМС в концентрации 10 мкг/мл. Клетки культивировали в течение ночи при 37°С с 5% СО2. На следующий день (спустя 24 ч) РВМС собирали из культуры и готовили для анализа FACS. Процент CD45 +; CD19+ В-клеток и CD45 +; CD33 +; CD11b+ миелоидных клеток анализировали в разных группах лечения.PBMCs were isolated from whole blood by density gradient centrifugation. Any contaminating erythrocytes were lysed by incubation in ASA lysis buffer. PBMCs were washed 3 times in PBS, and the total number of PBMCs was counted. The concentration of PBMCs was adjusted to 10 cells/ml in primary cell culture medium. 1 mL of PBMC was seeded into wells of a 24-well plate, and the indicated TriNKET or mAb was added to the PBMC cultures at a concentration of 10 μg/mL. Cells were cultured overnight at 37°C with 5% CO2. The next day (24 h later), PBMCs were harvested from culture and prepared for FACS analysis. CD45+ percentage; CD19+ B cells and CD45+; CD33+; CD11b+ myeloid cells were analyzed in different treatment groups.

Фиг. 54В и 54D показывают, что аутологичные миелоидные клетки защищены от TriNKETопосредованных ответов NK-клеток. Фиг. 54А и 54В показывают, что В-клетки от здорового донора чувствительны к лизису, опосредованному TriNKET, в то время как миелоидные клетки устойчивы к лизису TriNKET. РВМС, обработанные TriNKET, нацеленные на CD20, показали пониженную частоту CD19+ В-клеток с популяцией CD45+лимфоцитов (фиг. 54А), но не влияли на популяцию CD45+, CDD3-, CD56лимфоцитов (фиг. 54С). В этих культурах частота CD45+, CD19+ миелоидных клеток (фиг. 54В) или частота CD33+, CD33+, CD11b+ миелоидных клеток (фиг. 54D) не изменялась.Fig. 54B and 54D show that autologous myeloid cells are protected from TriNKET-mediated NK cell responses. Fig. 54A and 54B show that B cells from a healthy donor are sensitive to TriNKET-mediated lysis, while myeloid cells are resistant to TriNKET lysis. PBMCs treated with TriNKET targeting CD20 showed a reduced frequency of CD19+ B cells with a population of CD45+ lymphocytes (Fig. 54A), but had no effect on the population of CD45+, CDD3-, CD56 lymphocytes (Fig. 54C). In these cultures, the frequency of CD45+, CD19+ myeloid cells (Fig. 54B) or the frequency of CD33+, CD33+, CD11b+ myeloid cells (Fig. 54D) did not change.

TriNKET опосредуют hPBMC уничтожение опухолевых клеток SkBr-3 в длительных совместныхTriNKETs mediate hPBMC killing of SkBr-3 tumor cells in long-term cooperative

- 50 044644 культурах- 50 044644 cultures

Анализ цитотоксичности первичных РВМС человекаCytotoxicity assay of primary human PBMCs

Фиг. 55 показывает длительное уничтожение клеток SkBr-3 в культуре с РВМС человека. При культивировании отдельно клетки SkBr-3 пролиферируют и их количество почти удваивается за 60 ч. Когда РВМС человека добавляют к клеткам SkBr-3 в культуре, скорость пролиферации замедляется, а когда добавляется изотипный TriNKET, нацеленный на CD33, пролиферация также замедляется, но в меньшей степени. При обработке культур трастузумабом SkBr-3 больше не размножается, и через 60 ч остается только 80% клеток по сравнению с моментом нулевого времени. Поскольку клетки SkBr-3 чувствительны к блокадам сигнала HER2, влияние на рост клеток SkBr-3 может быть опосредовано блокадой сигнала HER2 или с помощью эффекторных функций Fc, таких как ADCC.Fig. 55 shows long-term killing of SkBr-3 cells in culture with human PBMC. When cultured alone, SkBr-3 cells proliferate and nearly double in number within 60 hours. When human PBMCs are added to SkBr-3 cells in culture, the rate of proliferation slows, and when isotype TriNKET targeting CD33 is added, proliferation also slows, but to a lesser extent. degrees. When cultures are treated with trastuzumab, SkBr-3 no longer proliferates, and after 60 h only 80% of the cells remain compared to time zero. Because SkBr-3 cells are sensitive to HER2 signal blockades, the effect on SkBr-3 cell growth may be mediated by HER2 signal blockade or through Fc effector functions such as ADCC.

Пример 15. Противоопухолевая эффективность mCFAE-C26.99 TriNKET in vitroExample 15 Antitumor efficacy of mCFAE-C26.99 TriNKET in vitro

Для проверки активности связывания cFAE-C26.99 TriNKET мыши, прямое связывание измеряли по сравнению с его моноклональными антителами с помощью анализов с помощью проточной цитометрии относительно Tyrp-1-положительных клеток меланомы B16F10 (фиг. 58А) и линии EL4, сверхэкспрессирующей NKG2D мыши (EL4-mNKG2D, фиг. 58В).To test the binding activity of mouse TriNKET cFAE-C26.99, direct binding was measured in comparison to its monoclonal antibodies using flow cytometry assays against Tyrp-1-positive B16F10 melanoma cells (Fig. 58A) and the EL4 cell line overexpressing mouse NKG2D (FIG. 58A). EL4-mNKG2D, Fig. 58B).

Чтобы проверить, сохраняют ли mcFAE-C26.99 TriNKET способность опосредовать цитотоксичность, измеряли уничтожение Tyrp-1-положительных опухолевых мишеней B16F10 IL-2активированными NK-клетками мыши. Как показано на фиг. 59, NK-клетки мыши увеличивали свою цитотоксическую активность в присутствии mcFAE-C26.99. Важно отметить, что моноклональное антитело к Tyrp-1 ТА99 проявляло только незначительные эффекты.To test whether mcFAE-C26.99 TriNKETs retain the ability to mediate cytotoxicity, killing of Tyrp-1-positive tumor targets B16F10 by IL-2 activated mouse NK cells was measured. As shown in FIG. 59, mouse NK cells increased their cytotoxic activity in the presence of mcFAE-C26.99. It is important to note that the anti-Tyrp-1 monoclonal antibody TA99 showed only minor effects.

Повышенная цитотоксичность NK, опосредованная mcFAE-C26.99 TriNKETIncreased NK cytotoxicity mediated by mcFAE-C26.99 TriNKET

Приблизительно 5х103 клеток меланомы B16F10 на лунку высевали за два дня до анализа. В день эксперимента 5х104 IL-2-активированных NK-клеток мыши добавляли в присутствии ТА99 моноклонального антитела или mcFAE-C26.99 TriNKET (mcFAE-C26.99 является гетеродимером mC26 и ТА99 с IgG2c мыши в качестве Fc. Мутации Gm относятся к мутациям гетеродимеризации, используемым для получения гетеродимера). Использовали 20 мкг/мл антител с четырехкратными разведениями. Через 4 ч совместного культивирования процент цитотоксичности оценивали с использованием набора CytoTox96 для высвобождения LDH. Пунктирная линия представляет базовую цитотоксичность в отсутствие антител.Approximately 5 x 10 3 B16F10 melanoma cells per well were seeded two days before analysis. On the day of the experiment, 5x10 4 IL-2-activated mouse NK cells were added in the presence of TA99 monoclonal antibody or mcFAE-C26.99 TriNKET (mcFAE-C26.99 is a heterodimer of mC26 and TA99 with mouse IgG2c as the Fc. Gm mutations refer to mutations heterodimerization used to obtain a heterodimer). 20 μg/ml antibodies with fourfold dilutions were used. After 4 h of co-culture, the percentage of cytotoxicity was assessed using the CytoTox96 LDH release kit. The dotted line represents baseline cytotoxicity in the absence of antibodies.

mC26_hvL_ mCL (жирный шрифт) (выделенные курсивом подчеркнутые аминокислоты являются мутациями гетеродимеризации, используемыми для получения гетеродимера):mC26_hvL_ mCL (bold) (italicized and underlined amino acids are heterodimerization mutations used to produce the heterodimer):

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLES GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIKRADAAPTVSI FPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTY SMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:86) mC26 hvH IgG2CGmB QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHS GSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHT FPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPP LKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFV NNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEK TISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMIKGFLPAEIAVDWTSNGRTEQN YKNTATVLDSDGSYFMYSRLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLG К (SEQ ID NO:87)DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLES GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIKRADAAPTVSI FPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTY SMSSTLTLTKDEYERHNSYTC EATHKTSSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:86) mC26 hvH IgG2CGmB QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHS GSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGS TLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHT FPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPP LKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFV NNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSP IEK TISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMIKGFLPAEIAVDWTSNGRTEQN YKNTATVLDSDGSYFMYSRLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLG K (SEQ ID NO:87)

TA99_mvL_mCLTA99_mvL_mCL

DIQMSQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTL ADGVPSRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIKRADAAPT VSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:88)DIQMSQSPASLSSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTL ADGVPSRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIKRADAAPT VSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTLTKDEYERHNS YTCEATHKTSSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:88)

TA99 mvH IgG2CGmATA99 mvH IgG2CGmA

EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKTSGFNIKDYFLHWVRQRPDQGLEWIGWINPD NGNTVYDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAALDYWG QGASVIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSS GVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQN PCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPS PIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRT EQNYKNTATVLDSDGSYLMYSKLTVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTIS RSLGK (SEQ ID NO:89)EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKTSGFNIKDYFLHWVRQRPDQGLEWIGWINPD NGNTVYDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAALDYWG QGASVIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSS GVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTW PSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQN PCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPS PIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEI AVDWTSNGRT EQNYKNTATVLDSDGSYLMYSKLTVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTIS RSLGK (SEQ ID NO:89)

Пример 16. Противоопухолевая эффективность mcFAE-C26.99 TriNKET in vivoExample 16 Antitumor efficacy of mcFAE-C26.99 TriNKET in vivo

Для того, чтобы проверить, вызывает ли mcFAE-C26.99 противоопухолевые функции in vivo, C57BL/6 мышам вводили подкожно 2х105 B16F10 опухолевых клеток. Мышам вводили либо контрольTo test whether mcFAE-C26.99 induces antitumor functions in vivo, C57BL/6 mice were injected subcutaneously with 2x105 B16F10 tumor cells. Mice received either control

- 51 044644 ный изотип, моноклональное антитело ТА99, либо TriNKET mcFAE-C26.99. Обработка моноклональным антителом ТА99 показала такое же прогрессирование опухоли, что и в контрольной группе, получавшей лечение изотипом. Однако введение mcFAE-C26.99 TriNKET приводило к задержке прогрессирования опухоли по сравнению с группой, получавшей изотип. Около 2x105 B16F10 клеток меланомы инъецировали подкожно в бок мышей C57BL/6. На 6 день после инокуляции мышей рандомизировали (n=10 на группу). Мышам вводили внутрибрюшинно (фиг. 60А) контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 и моноклональное антитело к Tyrp-1 мыши или (фиг. 60В) контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 и mcFAE-C26.99 TriNKET, в дозе 150 мкг (6, 8, 10, 12, 14, 16 и 21 дни). Рост опухоли оценивали в течение 28 дней. Графики демонстрируют кривые роста опухоли у отдельных мышей.- 51 044644 isotype, monoclonal antibody TA99, or TriNKET mcFAE-C26.99. Treatment with the monoclonal antibody TA99 showed similar tumor progression as the isotype-treated control group. However, administration of mcFAE-C26.99 TriNKET resulted in a delay in tumor progression compared with the isotype group. About 2x105 B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously into the flank of C57BL/6 mice. On day 6 after inoculation, mice were randomized (n=10 per group). Mice were administered intraperitoneally (Fig. 60A) isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 and mouse monoclonal antibody Tyrp-1 or (Fig. 60B) isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 and mcFAE-C26.99 TriNKET, at a dose of 150 mcg (6, 8, 10, 12, 14, 16 and 21 days). Tumor growth was assessed over 28 days. The graphs show tumor growth curves in individual mice.

В дополнение к модели подкожной опухоли B16F10, mcFAE-C26.99 TriNKET был также протестирован на его эффективность опухоли в условиях диссеминированной опухоли. 1x105 клеток B16F10 вводили мышам внутривенно. Лечение начинали либо на 4, либо на 7 день с низкой (300 мкг/инъекция) и высокой (600 мкг/инъекция) дозы антитела. На 18 день после инокуляции были подсчитаны метастазы в легких. Лечение, начатое на 4 и 7 день после инокуляции опухоли, привело к уменьшению количества метастаз в легких, когда моноклональное антитело ТА99 или mcFAE-C26.99 TriNKET использовалось в высокой концентрации по сравнению с контрольной группой, получавшей изотип. При низких концентрациях только mcFAE-C26.99 TriNKET уменьшал опухолевую нагрузку (фиг. 61А). Подобные эффекты наблюдались, когда антитела вводили, начиная с 7-го дня после инокуляции опухоли. В целом, терапия mcFAE-C26.99 TriNKET привела к снижению количества метастаз в легких по сравнению с моноклональным антителом ТА99 во всех тестируемых условиях. Около 1x105 клеток меланомы B16F10 вводили внутривенно в хвостовую вену мышам C57BL/6 (n=8 на группу). Мышей либо оставляли необработанными, либо внутрибрюшинно вводили контрольное моноклональное антитело (изотип, клон С1.18.4), моноклональное антитело ТА99 или TriNKET TA99 (mcFAE-С26.99). На фиг. 61А продемонстрирована опухолевая нагрузка, когда антитела вводили в дозе 150 мкг (4, 6, 8, 11, 13, 15 дни). Фиг. 61В показывает опухолевую нагрузку, когда антитела вводили в дозе 150 мкг (7, 9, 11, 13, 15 дни). Через 18 дней после введения опухоли мышей умерщвляли и оценивали количество метастаз на поверхности легких (фиг. 61В).In addition to the B16F10 subcutaneous tumor model, mcFAE-C26.99 TriNKET was also tested for its tumor efficacy in the disseminated tumor setting. 1x10 5 B16F10 cells were injected intravenously into mice. Treatment began on either day 4 or 7 with low (300 μg/injection) and high (600 μg/injection) doses of antibody. On day 18 after inoculation, lung metastases were counted. Treatment initiated on days 4 and 7 after tumor inoculation resulted in a reduction in the number of lung metastases when monoclonal antibody TA99 or mcFAE-C26.99 TriNKET was used at high concentrations compared with the isotype control group. At low concentrations, only mcFAE-C26.99 TriNKET reduced tumor burden (Figure 61A). Similar effects were observed when antibodies were administered starting at day 7 after tumor inoculation. Overall, mcFAE-C26.99 TriNKET therapy resulted in a reduction in lung metastases compared with monoclonal antibody TA99 in all conditions tested. About 1x10 5 B16F10 melanoma cells were injected intravenously into the tail vein of C57BL/6 mice (n=8 per group). Mice were either left untreated or injected intraperitoneally with a control monoclonal antibody (isotype, clone C1.18.4), monoclonal antibody TA99, or TriNKET TA99 (mcFAE-C26.99). In fig. 61A demonstrated tumor burden when antibodies were administered at a dose of 150 μg (days 4, 6, 8, 11, 13, 15). Fig. 61B shows the tumor burden when antibodies were administered at a dose of 150 μg (days 7, 9, 11, 13, 15). 18 days after tumor injection, mice were sacrificed and the number of metastases on the surface of the lungs was assessed (Fig. 61B).

Пример 17. Комбинированная терапия с mcFAE-C26.99 TriNKET in vivoExample 17 Combination therapy with mcFAE-C26.99 TriNKET in vivo

Определяли уровни противоопухолевого ответа мультиспецифических белков по настоящему изобретению при объединении с другим противоопухолевым агентом. Чтобы определить, могут ли быть усилены противоопухолевые иммунные ответы, опосредованные mcFAE-C26.99, были проведены комбинированные исследования с использованием антител к PD-1 или цитокинов IL-2. Мышам C57BL/6 вводили подкожно 2x105 клеток опухоли B16F10. Мышам вводили контрольный изотип, mCFAE-С26.99 TriNKET, моноклональное антитело к PD-1 или комбинацию mcFAE-C26.99 и моноклонального антитела к PD-1. Монотерапия mcFAE-C26.99 или антителом к PD-1 привела к 10% респондеров. Однако комбинированная терапия mcFAE-C26.99 и моноклональным антителом к PD-1 задержала прогрессирование опухоли и привела к 40% мышей-респондеров по сравнению с группой, получавшей изотип.The levels of antitumor response of the multispecific proteins of the present invention when combined with another antitumor agent were determined. To determine whether antitumor immune responses mediated by mcFAE-C26.99 could be enhanced, combination studies using anti-PD-1 antibodies or IL-2 cytokines were performed. C57BL/6 mice were injected subcutaneously with 2x105 B16F10 tumor cells. Mice were treated with isotype control, mCFAE-C26.99 TriNKET, anti-PD-1 monoclonal antibody, or a combination of mcFAE-C26.99 and anti-PD-1 monoclonal antibody. Monotherapy with mcFAE-C26.99 or anti-PD-1 antibody resulted in 10% responders. However, combination therapy with mcFAE-C26.99 and an anti-PD-1 monoclonal antibody delayed tumor progression and resulted in 40% responder mice compared with the isotype group.

Комбинированная терапия с моноклональным антителом к PD-1Combination therapy with anti-PD-1 monoclonal antibody

2x105 B16F10 клеток меланомы вводили подкожно в бок мышей C57BL/6. На 6 день после инокулирования опухоли мышей рандомизировали (n=10 на группу). Мышам вводили внутрибрюшинно контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 с моноклональным антителом к IgG2a 2A3 крысы и mcFAE-C26.99; контрольный изотип и клон моноклонального антитела к PD-1 RPM1-14; или комбинацию mcFAE-С26.99 и моноклональное антитело к PD-1. Животным вводили, как указано выше, однократные дозы 150 мкг (mcFAE-C26.99 и С1.18.4) и 200 мкг (моноклональное антитело к PD-1 и 2А3). Рост опухоли оценивали в течение 30 дней. Графики на фиг. 66А-66С показывают кривые роста опухоли у отдельных мышей. На фиг. 66А представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышеи, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 с моноклональным антителом к IgG2a 2A3 крысы или mcFAEC26.99. На фиг. 66В представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип или моноклональное антитело к PD-1, клон RPM1-14. На фиг. 66С представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили комбинацию mcFAE-С26.99 и моноклонального антитела к PD-1.2x10 5 B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously into the flank of C57BL/6 mice. On day 6 after tumor inoculation, mice were randomized (n=10 per group). Mice were injected intraperitoneally with isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 with rat anti-IgG2a monoclonal antibody 2A3 and mcFAE-C26.99; anti-PD-1 monoclonal antibody isotype control and clone RPM1-14; or a combination of mcFAE-C26.99 and an anti-PD-1 monoclonal antibody. Animals were administered, as above, single doses of 150 μg (mcFAE-C26.99 and C1.18.4) and 200 μg (monoclonal antibody to PD-1 and 2A3). Tumor growth was assessed over 30 days. Graphs in Fig. 66A-66C show tumor growth curves in individual mice. In fig. 66A is a line graph showing tumor size (mm 3 ) in mice treated intraperitoneally with isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 with rat anti-IgG2a monoclonal antibody 2A3 or mcFAEC26.99. In fig. 66B is a line graph showing tumor size (mm 3 ) in mice treated intraperitoneally with isotype control or anti-PD-1 monoclonal antibody, clone RPM1-14. In fig. 66C shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice intraperitoneally injected with the combination of mcFAE-C26.99 and anti-PD-1 monoclonal antibody.

Комбинированная терапия с IL-2Combination therapy with IL-2

Также оценивали влияние на размер опухоли при введении комбинации mcFAE-C26.99 и рекомбинантного IL-2 человека. Мышам C57BL/6 вводили подкожно 2x105 клеток опухоли B16F10. Мышам вводили контрольный изотип, mcFAE-C26.99 TriNKET или IL-2 по отдельности, или обрабатывали комбинацией mcFAE-C26.99 и IL-2. Монотерапия mcFAE-C26.99 (фиг. 67А) или IL-2 (фиг. 67В) привела к 10% мышей-респондеров. Однако комбинированная терапия (фиг. 67С) задержала прогрессирование опухоли и привела к 70-90% мышей-респондеров по сравнению с группой, получавшей изотип.The effect on tumor size when administered with a combination of mcFAE-C26.99 and recombinant human IL-2 was also assessed. C57BL/6 mice were injected subcutaneously with 2x105 B16F10 tumor cells. Mice were treated with isotype control, mcFAE-C26.99 TriNKET, or IL-2 alone, or treated with a combination of mcFAE-C26.99 and IL-2. Monotherapy with mcFAE-C26.99 (FIG. 67A) or IL-2 (FIG. 67B) resulted in 10% responder mice. However, combination therapy (Fig. 67C) delayed tumor progression and resulted in 70-90% responder mice compared to the isotype group.

Для этого эксперимента 2x105 клеток меланомы B16F10 инъецировали подкожно в бок мышейFor this experiment, 2x105 B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously into the flank of mice.

- 52 044644- 52 044644

C57BL/6. На 6 день после инокулирования опухоли мышей рандомизировали (n=10 на группу). Мышам внутрибрюшинно вводили контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 или mcFAE-C26.99; контрольный изотип или IL-2; или комбинацию mcFAE-C26.99 и IL-2. Животным вводили, как указано выше, однократные дозы 150 мкг (mcFAE-C26.99 и С1.18.4) и 100000 ЕД (IL-2, два раза в день). Рост опухоли оценивали в течение 40 дней у 3 мышей из комбинированной группы, оставшихся без опухолей. Графики демонстрируют кривые роста опухоли у отдельных мышей.C57BL/6. On day 6 after tumor inoculation, mice were randomized (n=10 per group). Mice were injected intraperitoneally with isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 or mcFAE-C26.99; isotype control or IL-2; or a combination of mcFAE-C26.99 and IL-2. Animals were administered, as above, single doses of 150 μg (mcFAE-C26.99 and C1.18.4) and 100,000 units (IL-2, twice daily). Tumor growth was assessed over 40 days in 3 mice from the combination group that remained tumor-free. The graphs show tumor growth curves in individual mice.

На фиг. 67А представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 или mcFAE-C26.99. На фиг. 67В представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили контрольный изотип или IL-2. На фиг. 67С представлены линейные графики, показывающие размер опухоли (мм3) у мышей, которым внутрибрюшинно вводили комбинацию mcFAE-C26.99 и IL-2.In fig. 67A shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice intraperitoneally injected with isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 or mcFAE-C26.99. In fig. 67B shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice treated intraperitoneally with isotype control or IL-2. In fig. 67C shows line graphs showing tumor size (mm 3 ) in mice intraperitoneally injected with the combination of mcFAE-C26.99 and IL-2.

Пример 18. Цитотоксическая активность покоящихся NK-клеток человека, опосредованную TriNKET, моноклональными антителами или биспецифическими антителами к HER2-положительным клеткамExample 18. Cytotoxic activity of resting human NK cells mediated by TriNKET, monoclonal antibodies or bispecific antibodies to HER2-positive cells

РВМС выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Изолированные РВМС были промыты и подготовлены для выделения NK-клеток. NK-клетки выделяли, используя метод отрицательного отбора с магнитными бусами; чистота выделенных NK-клеток обычно составляла > 90% CD3-CD56+. Выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, или оставляли на ночь без цитокина. Активированные IL-2 или покоящиеся NK-клетки использовали на следующий день в анализах цитотоксичности.PBMC were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. Isolated PBMCs were washed and prepared for NK cell isolation. NK cells were isolated using a negative selection method with magnetic beads; the purity of isolated NK cells was typically >90% CD3-CD56+. Isolated NK cells were cultured in medium containing 100 ng/ml IL-2 or left overnight without the cytokine. IL-2-activated or resting NK cells were used the next day in cytotoxicity assays.

Анализ цитотоксичности DELFIADELFIA Cytotoxicity Assay

Линии клеток рака человека, экспрессирующие представляющую интерес мишень, собирали из культуры, клетки промывали HBS и ресуспендировали в среде роста при 106 клеток/мл для мечения BATDA реагентом (Perkin Elmer AD0116). Следовали инструкциям производителя по мечению клетокмишеней. После мечения клетки промывали 3 раза HBS и ресуспендировали в 0,5-1,0x105 клеток/мл в культуральной среде. Для приготовления фоновых лунок аликвоту меченых клеток отбирали, и клетки извлекали из среды. 100 мкл среды осторожно добавляли в лунки в трех повторениях, чтобы не повредить гранулированные клетки. 100 мкл BATDA-меченных клеток добавляли в каждую лунку 96луночного планшета. Лунки были сохранены для спонтанного высвобождения из клеток-мишеней, и лунки были подготовлены для максимального лизиса клеток-мишеней путем добавления 1% Тритон-Х. Моноклональные антитела или TriNKET против интересующей опухоли-мишени разводили в культуральной среде и в каждую лунку добавляли 50 мкл разведенного mAb или TriNKET. Покоящиеся и/или активированные NK-клетки собирали из культуры, клетки промывали и ресуспендировали при 10 2,0x106 клеток/мл в культуральной среде в зависимости от желаемого Е:Т соотношения. 50 мкл NKклеток добавляли в каждую лунку планшета, чтобы получить общий объем культуры 200 мкл. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО2 за 2-3 ч до проявления теста.Human cancer cell lines expressing the target of interest were harvested from culture, cells were washed with HBS and resuspended in growth medium at 106 cells/ml for labeling with BATDA reagent (Perkin Elmer AD0116). The manufacturer's instructions for labeling target cells were followed. After labeling, cells were washed 3 times with HBS and resuspended in 0.5-1.0x105 cells/ml in culture medium. To prepare background wells, an aliquot of labeled cells was removed and the cells were removed from the medium. 100 μL of medium was carefully added to the wells in triplicate to avoid damaging the granulated cells. 100 μl of BATDA-labeled cells was added to each well of a 96-well plate. Wells were maintained for spontaneous release from target cells, and wells were prepared to maximize target cell lysis by adding 1% Triton-X. Monoclonal antibodies or TriNKET against the target tumor of interest were diluted in culture medium, and 50 μl of the diluted mAb or TriNKET was added to each well. Resting and/or activated NK cells were collected from the culture, the cells were washed and resuspended at 10 2.0 x 106 cells/ml in culture medium depending on the desired E:T ratio. 50 μl of NK cells was added to each well of the plate to obtain a total culture volume of 200 μl. The plate was incubated at 37°C with 5% CO2 2-3 hours before the test was developed.

После культивирования в течение 2-3 ч планшет извлекали из инкубатора и клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. 20 мкл супернатанта культуры переносили в чистый микропланшет, предоставленный производителем, и в каждую лунку добавляли 200 мкл раствора европия комнатной температуры. Планшет защищали от света и инкубировали на шейкере при 250 об/мин в течение 15 мин. Планшет считывали с использованием инструментов Victor 3 или SpectraMax i3X. %After culturing for 2-3 hours, the plate was removed from the incubator and the cells were pelleted by centrifugation at 200 g for 5 minutes. 20 μL of culture supernatant was transferred to a clean microplate provided by the manufacturer, and 200 μL of room temperature europium solution was added to each well. The plate was protected from light and incubated on a shaker at 250 rpm for 15 min. The plate was read using Victor 3 or SpectraMax i3X instruments. %

Удельного лизиса рассчитывали следующим образом: % Удельного лизиса = ((Экспериментальное высвобождение-спонтанное высвобождение)/(Максимальное высвобождение-Спонтанное высвобождение))*100%.Specific lysis was calculated as follows: % Specific lysis = ((Experimental release-spontaneous release)/(Maximum release-Spontaneous release))*100%.

Комбинация моноклонального антитела и биспецифического NK-клеточного рекрутера не повторяет активность TriNKETCombination of monoclonal antibody and bispecific NK cell recruiter does not recapitulate the activity of TriNKET

Фиг. 68 показывает цитотоксическую активность покоящихся NK-клеток человека, опосредованную TriNKET, моноклональными антителами или биспецифическими антителами к HER2положительной линии клеток Colo-201. TriNKET (ADI-29404 (F04)), нацеленный на HER2, индуцировал максимальный лизис клеток Colo-201 покоящимися NK-клетками человека. Мутация D265A была введена в домен CH2TriNKET для нивелирования связывания с FcR. HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A не способен опосредовать лизис клеток Colo-201, демонстрируя важность двойного нацеливания CD16 и NKG2D на NK-клетки. Чтобы дополнительно продемонстрировать важность двойного нацеливания на NK-клетки, моноклональное антитело трастузумаб использовали для нацеливания на HER2 и опосредования ADCC с помощью NK-клеток. Один трастузумаб был способен увеличивать лизис NK-клетками клеток Colo-201, но максимальный лизис, достигнутый одним только трастузумабом, был около в 4 раза ниже по сравнению с таковым в присутствии TriNKET. Чтобы понять важность нацеливания CD16 и NKG2D на одну и ту же молекулу, активность TriNKET (ADI-29404 (F04)) сравнивали с активностью биспецифического антитела, направленного на HER2 и NKG2D, в комбинации с трастузумабом. При использовании в эквимолярных концентрациях комбинация биспецифической молекулы и трастузумабаFig. 68 shows the cytotoxic activity of resting human NK cells mediated by TriNKET, monoclonal antibodies or bispecific antibodies to the HER2 positive cell line Colo-201. TriNKET (ADI-29404 (F04)), targeting HER2, induced maximal lysis of Colo-201 cells by resting human NK cells. The D265A mutation was introduced into the CH2TriNKET domain to eliminate binding to FcR. HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A fails to mediate lysis of Colo-201 cells, demonstrating the importance of dual targeting of CD16 and NKG2D on NK cells. To further demonstrate the importance of dual targeting of NK cells, the monoclonal antibody trastuzumab was used to target HER2 and mediate ADCC by NK cells. Trastuzumab alone was able to increase NK cell lysis of Colo-201 cells, but the maximum lysis achieved by trastuzumab alone was about 4-fold lower compared to that in the presence of TriNKET. To understand the importance of targeting CD16 and NKG2D to the same molecule, the activity of TriNKET (ADI-29404 (F04)) was compared with that of a bispecific antibody targeting HER2 and NKG2D in combination with trastuzumab. When used in equimolar concentrations, the combination of a bispecific molecule and trastuzumab

- 53 044644 не способна обеспечить максимальный лизис клеток Colo-201 покоящимися NK-клетками человека. Недостаток комбинации трастузумаб+биспецифическая молекула демонстрирует важность содержания триспецифического связывания TriNKET в одной молекуле.- 53 044644 is not able to provide maximum lysis of Colo-201 cells by resting human NK cells. The disadvantage of the trastuzumab+bispecific molecule combination demonstrates the importance of containing the trispecific binding TriNKET in a single molecule.

Пример 19.Example 19.

Пример 14 демонстрирует, что HER2-, CD33- и ВСМА-TriNKET усиливают цитотоксичность покоящихся и активированных IL-2 NK-клеток человека. Этот пример дополнительно характеризует влияние TriNKET на IL-12- и IL-15-активированные NK-клетки человека. Цитотоксичность измеряли в контексте трех различных опухоль-ассоциированных антигенов, HER2, CD33 и ВСМА, с NK-клетками, выделенными из РВМС человека, с использованием анализа цитотоксичности DELFIA, как описано в примере 14.Example 14 demonstrates that HER2-, CD33-, and BCMA-TriNKETs enhance the cytotoxicity of resting and IL-2-activated human NK cells. This example further characterizes the effect of TriNKET on IL-12- and IL-15-activated human NK cells. Cytotoxicity was measured in the context of three different tumor-associated antigens, HER2, CD33 and BCMA, with NK cells isolated from human PBMCs using the DELFIA cytotoxicity assay as described in Example 14.

Чтобы измерить цитотоксичность в отношении HER2-экспрессирующих клеток, NK-клетки человека культивировали с IL-2, IL-12 или IL-15 или оставляли на ночь без цитокинов. Покоящиеся или активированные цитокинами NK-клетки совместно культивировали с опухолевыми клетками 786-O с низким уровнем экспрессии HER2 в присутствии серийно разведенного трастузумаба или полученного из трастузумаба HER2-TriNKET. Как показано на фиг. 73А, покоящиеся NK-клетки человека не показали уничтожения клеток-мишеней 786-O, и трастузумаб не смог увеличить лизис клеток-мишеней 786-O. HER2TriNKET был способен увеличивать лизис покоящимися NK-клетками клеток-мишеней 786-O, но лизис достигал только около 20%. Как показано на фиг. 73B-D, цитокин-активированные NK-клетки показали около 20% специфического лизиса при совместном культивировании с клетками-мишенями 786-O. В отличие от покоящихся NK-клеток трастузумаб способен увеличивать активность NK-клеток, активированных цитокинами, около до 40% специфического лизиса. HER2-TriNKET более мощно усиливает цитокин-активированный лизис NK-клетками клеток-мишеней 786-O. Специфический лизис также достигал более высокого максимального значения с HER2-TriNKET по сравнению с трастузумабом с активированными цитокинами NK-эффекторными клетками.To measure cytotoxicity toward HER2-expressing cells, human NK cells were cultured with IL-2, IL-12, or IL-15 or left overnight without cytokines. Quiescent or cytokine-activated NK cells were cocultured with low-HER2 expressing 786-O tumor cells in the presence of serially diluted trastuzumab or trastuzumab-derived HER2-TriNKET. As shown in FIG. 73A, resting human NK cells did not show killing of 786-O target cells, and trastuzumab failed to increase lysis of 786-O target cells. HER2TriNKET was able to increase quiescent NK cell lysis of 786-O target cells, but lysis only reached about 20%. As shown in FIG. 73B-D, cytokine-activated NK cells showed about 20% specific lysis when co-cultured with 786-O target cells. In contrast to resting NK cells, trastuzumab is able to increase the activity of cytokine-activated NK cells to approximately 40% specific lysis. HER2-TriNKET more potently enhances cytokine-activated NK cell lysis of 786-O target cells. Specific lysis also reached a higher maximum value with HER2-TriNKET compared to trastuzumab with cytokine-activated NK effector cells.

Чтобы измерить цитотоксичность в отношении CD33-экспрессирующих клеток, NK-клетки человека культивировали с IL-2, IL-12 или IL-15 или оставляли на ночь без цитокинов. Покоящиеся или активированные цитокинами NK-клетки совместно культивировали с CD33-положительными Molm-13 клетками опухоли в присутствии серийно разведенных линтузумаба, запатентованного моноклонального антитела к CD33 или CD33-TriNKET, полученного из запатентованного антитела к CD33. Как показано на фиг. 74А, покоящиеся NK-клетки человека не показали уничтожения клеток-мишеней Molm-13, и оба моноклональных антитела привели только к небольшому увеличению лизиса NK-клетками клетокмишеней Molm-13. Как показано на фиг. 74B-D, CD33-TriNKET был способен увеличивать лизис покоящимися NK-клетками клеток-мишеней Molm-13 до около 30% специфического лизиса. Активированные цитокинами NK-клетки показали около 35-55% лизиса при совместном культивировании с клеткамимишенями Molm-13. В отличие от покоящихся NK-клеток, оба моноклональных антитела были способны повышать активность NK-клеток, активированных цитокинами, до около 60-70% специфического лизиса. CD33-TriNKET более эффективно усиливает цитокин-активированный лизис NK-клетками клетокмишеней Molm-13. Специфический лизис также достигал более высокого максимального значения с CD33-TriNKET по сравнению с любым моноклональным антителом с активированными цитокинами NKэффекторными клетками.To measure cytotoxicity toward CD33-expressing cells, human NK cells were cultured with IL-2, IL-12, or IL-15 or left overnight without cytokines. Quiescent or cytokine-activated NK cells were cocultured with CD33-positive Molm-13 tumor cells in the presence of serially diluted lintuzumab, a proprietary anti-CD33 monoclonal antibody, or CD33-TriNKET derived from a proprietary anti-CD33 antibody. As shown in FIG. 74A, resting human NK cells did not show killing of Molm-13 target cells, and both monoclonal antibodies resulted in only a slight increase in NK cell killing of Molm-13 target cells. As shown in FIG. 74B-D, CD33-TriNKET was able to increase resting NK cell lysis of Molm-13 target cells to approximately 30% specific lysis. Cytokine-activated NK cells showed approximately 35-55% lysis when co-cultured with Molm-13 target cells. In contrast to resting NK cells, both monoclonal antibodies were able to increase the activity of cytokine-activated NK cells to about 60-70% specific lysis. CD33-TriNKET more effectively enhances cytokine-activated NK cell lysis of Molm-13 target cells. Specific lysis also achieved a higher maximum value with CD33-TriNKET compared to any monoclonal antibody with cytokine-activated NK effector cells.

Для измерения цитотоксичности в отношении клеток, экспрессирующих ВСМА, NK-клетки человека культивировали с IL-2, IL-12 или IL-15 или оставляли на ночь без цитокинов. Покоящиеся или активированные цитокинами NK-клетки совместно культивировали с ВСМА-положительными KMS12-PE клетками опухоли в присутствии серийно разведенных антител к ВСМА ЕМ-901 или BCMA-TriNKET, полученных из ЕМ-901. Как показано на фиг. 75А, покоящиеся NK-клетки человека не показали уничтожения клеток-мишеней KMS12-PE, а ЕМ-901 и BCMA-TriNKET показали лишь небольшое увеличение лизиса NK-клетками клеток-мишеней KMS12-PE. Как показано на фиг. 75B-D, NK-клетки, активированные цитокинами, показали около 10-40% лизиса при совместном культивировании с клетками-мишенями KMS12-PE, причем степень лизиса варьируется для NK-клеток, обработанных различными цитокинами. В отличие от покоящихся NK-клеток, ЕМ-901 был способен увеличивать активность NK-клеток, активированных цитокинами, до около 40-80% специфического лизиса в зависимости от используемого цитокина. BCMA-TriNKET более эффективно усиливает цитокин-активированный лизис NK-клетками клеток-мишеней KMS12-PE. Специфический лизис также достигал более высокого максимального значения с BCMA-TriNKET по сравнению с родительским моноклональным антителом с активированными цитокинами NK-эффекторными клетками.To measure cytotoxicity toward cells expressing BCMA, human NK cells were cultured with IL-2, IL-12, or IL-15 or left overnight without cytokines. Quiescent or cytokine-activated NK cells were cocultured with BCMA-positive KMS12-PE tumor cells in the presence of serially diluted anti-BCMA EM-901 or BCMA-TriNKET derived from EM-901. As shown in FIG. 75A, resting human NK cells showed no killing of KMS12-PE target cells, and EM-901 and BCMA-TriNKET showed only a slight increase in NK cell killing of KMS12-PE target cells. As shown in FIG. 75B-D, NK cells activated by cytokines showed about 10-40% lysis when co-cultured with KMS12-PE target cells, with the extent of lysis varying for NK cells treated with different cytokines. In contrast to resting NK cells, EM-901 was able to increase the activity of cytokine-activated NK cells to about 40-80% specific lysis depending on the cytokine used. BCMA-TriNKET more effectively enhances cytokine-activated NK cell lysis of KMS12-PE target cells. Specific lysis also achieved a higher maximum value with BCMA-TriNKET compared to the parental monoclonal antibody with cytokine-activated NK effector cells.

Помалидомид представляет собою соединение, обладающее иммуномодулирующей активностью. Чтобы оценить влияние помалидомида и/или IL-2 на цитотоксичность NK-клеток в отношении клеток, экспрессирующих ВСМА, NK-клетки человека отделяли или культивировали с IL-2, помалидомидом или комбинацией IL-2 и помалидомида в течение ночи. Покоящиеся или активированные NK-клетки совместно культивировали с клетками-мишенями KMS12-PE в присутствии серийно разведенных ЕМ-901 или BCMA-TriNKET, полученных из ЕМ-901. Как показано на фиг. 76А, покоящиеся NK-клетки человека не показали уничтожения клеток-мишеней KMS12-PE. ЕМ-901 показало только небольшое увеличение лизиса NK-клетками клеток-мишеней KMS12-PE, тогда как BCMA-TriNKET продемонстрировал болееPomalidomide is a compound that has immunomodulatory activity. To evaluate the effect of pomalidomide and/or IL-2 on NK cell cytotoxicity toward BCMA-expressing cells, human NK cells were isolated or cultured with IL-2, pomalidomide, or a combination of IL-2 and pomalidomide overnight. Quiescent or activated NK cells were cocultured with KMS12-PE target cells in the presence of serially diluted EM-901 or EM-901-derived BCMA-TriNKET. As shown in FIG. 76A, resting human NK cells did not show killing of KMS12-PE target cells. EM-901 showed only a small increase in NK cell lysis of KMS12-PE target cells, whereas BCMA-TriNKET showed more

- 54 044644 высокий и более сильный специфический лизис. Как показано на фиг. 76В, активированные помалидомидом NK-клетки показали лизис клеток-мишеней KMS12-PE, сходный с покоящимися NK-клетками. BCMA-TriNKET увеличивал лизис клеток-мишеней NK-клетками, активированными помалидомидом, в большей степени, чем увеличение лизиса покоящимися NK-клетками. Как показано на фиг. 76С, IL-2активированные NK-клетки лизировали около 20% клеток-мишеней в совместной культуре. ЕМ-901 увеличило лизис NK-клетками клеток-мишеней KMS12-PE до около 40%, тогда как BCMA-TriNKET увеличил специфический лизис до около 60%. Следовательно, NK-клетки были более активными после обработки IL-2 по сравнению с обработкой помалидомидом. Когда IL-2 и помалидомид объединяются для активации NK-клеток, NK-клетки демонстрируют еще более высокую активность-около 30% специфического лизиса. ЕМ-901 увеличивало лизис с помощью NK-клеток, активированных IL-2/помалидомидом, до около 60%, a BCMA-TriNKET увеличивал лизис до около 80%. Этот результат продемонстрировал большую эффективность TriNKET по сравнению с его родительским антителом и согласуется с другими условиями, протестированными в настоящем примере.- 54 044644 higher and stronger specific lysis. As shown in FIG. 76B, pomalidomide-activated NK cells showed lysis of KMS12-PE target cells similar to resting NK cells. BCMA-TriNKET increased target cell lysis by pomalidomide-activated NK cells to a greater extent than the increase in lysis by resting NK cells. As shown in FIG. 76C, IL-2 activated NK cells lysed about 20% of target cells in co-culture. EM-901 increased NK cell lysis of KMS12-PE target cells to about 40%, whereas BCMA-TriNKET increased specific lysis to about 60%. Consequently, NK cells were more active after IL-2 treatment compared to pomalidomide treatment. When IL-2 and pomalidomide combine to activate NK cells, NK cells show even higher activity—about 30% specific lysis. EM-901 increased lysis by IL-2/pomalidomide-activated NK cells to about 60%, and BCMA-TriNKET increased lysis to about 80%. This result demonstrated greater potency of TriNKET compared to its parent antibody and is consistent with other conditions tested in the present example.

Пример 20.Example 20.

Этот пример показывает цитотоксичность CD8+ Т-клеток человека против HER2-экспрессирующих клеток-мишеней в присутствии HER2-TriNKET и антитела к PD-1 пембролизумаба.This example demonstrates the cytotoxicity of human CD8+ T cells against HER2-expressing target cells in the presence of HER2-TriNKET and the anti-PD-1 antibody pembrolizumab.

Вкратце, РВМС человека выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Изолированные РВМС стимулировали с помощью 1 мкг/мл конканавалина А (ConA) при 37°С в течение 18 ч. Затем ConA удаляли и РВМС культивировали с 25 ед./мл IL-2 при 37°С в течение 4 дней. CD8+ Т-клетки очищали с использованием отрицательного метода отбора с магнитными бусами. Очищенные CD8+ Т-клетки культивировали в среде, содержащей 10 нг/мл IL-15 при 37°С в течение 3-14 дней.Briefly, human PBMCs were isolated from the buffy coat of peripheral blood using density gradient centrifugation. Isolated PBMCs were stimulated with 1 μg/ml concanavalin A (ConA) at 37°C for 18 hours. ConA was then removed and PBMCs were cultured with 25 U/ml IL-2 at 37°C for 4 days. CD8+ T cells were purified using a negative selection method with magnetic beads. Purified CD8+ T cells were cultured in medium containing 10 ng/ml IL-15 at 37°C for 3-14 days.

Была оценена чистота клеточной популяции, а также экспрессия NKG2D, CD16 и PD-1. Вкратце, клетки окрашивали конъюгированными с флуорофором антителами к CD3, CD8, CD56, CD4, NKG2D и CD16 и анализировали проточной цитометрией. Как показано на фиг. 77А, CD8+ Т-клетки были высокой степени чистоты. CD3+CD8+ Т-клетки были равномерно положительными на NKG2D и отрицательными на CD16. Около 20% CD3+CD8+ Т-клеток экспрессировали PD-1.The purity of the cell population was assessed, as well as the expression of NKG2D, CD16 and PD-1. Briefly, cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies to CD3, CD8, CD56, CD4, NKG2D, and CD16 and analyzed by flow cytometry. As shown in FIG. 77A, CD8+ T cells were of high purity. CD3+CD8+ T cells were uniformly positive for NKG2D and negative for CD16. About 20% of CD3+CD8+ T cells expressed PD-1.

В качестве клеток-мишеней использовали линию НСС1954 клеток рака человека, которая экспрессировала HER2, трансдуцированную BacMam 3.0 NucLight Green (# 4622) для отслеживания клеток. Клетки окрашивали конъюгированными с флуорофором антителами к HER2 и PD-L1, и уровень экспрессии HER2 и PD-L1 анализировали проточной цитометрией. Как показано на фиг. 77В, экспрессия HER2 и PD-L1 была обнаружена на поверхности клеток НСС1954.The target cells used were the human cancer cell line HCC1954, which expressed HER2 transduced with BacMam 3.0 NucLight Green (#4622) for cell tracking. Cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies to HER2 and PD-L1, and the expression levels of HER2 and PD-L1 were analyzed by flow cytometry. As shown in FIG. 77B, expression of HER2 and PD-L1 was detected on the surface of HCC1954 cells.

Эффект HER2-TriNKET, пембролизумаба, и их комбинации на цитотоксичность Т-клеток оценивали с использованием долгосрочного анализа цитотоксичности CD8+ Т-клеток. Вкратце, клетки-мишени НСС1954 собирали из культуры, промывали, ресуспендировали в питательной среде и вводили в планшет при 5000 клеток на лунку в 96-луночный планшет. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение ночи. HER2-TriNKET, пембролизумаб и соответствующие им контрольные изотипы разводили в культуральных средах. 50 мкл антител и TriNKET вместе добавляли в каждую лунку. CD8+ эффекторные Т-клетки собирали из культуры, промывали и ресуспендировали при 1х106клеток/мл (для Е: Т соотношения 10:1) или 2,5x106 клеток/мл (для Е:Т соотношения 25:1) в питательных средах. 50 мкл CD8+ Тклеток добавляли в каждую лунку планшета, до общего объема культуры 200 мкл в каждой лунке. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО2 до 7 дней. Изображения в фазовом и зеленом каналах собирали каждый час, по 2 изображения на лунку, используя инструмент IncuCyte S3. Изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения IncuCyte S3. Количество живых опухолевых клеток в лунках было представлено количеством зеленых объектов.The effect of HER2-TriNKET, pembrolizumab, and their combination on T cell cytotoxicity was assessed using a long-term CD8+ T cell cytotoxicity assay. Briefly, HCC1954 target cells were harvested from culture, washed, resuspended in growth medium, and plated at 5,000 cells per well in a 96-well plate. The plate was incubated at 37°C with 5% CO2 overnight. HER2-TriNKET, pembrolizumab, and their corresponding isotype controls were diluted in culture media. 50 μl of antibodies and TriNKET were added together to each well. CD8+ effector T cells were collected from culture, washed and resuspended at 1x106 cells/ml (for E:T ratio 10:1) or 2.5x106 cells/ml (for E:T ratio 25:1) in culture media. 50 μl of CD8+ T cells was added to each well of the plate, up to a total culture volume of 200 μl in each well. The plate was incubated at 37°C with 5% CO 2 for up to 7 days. Phase and green channel images were collected every hour, 2 images per well, using the IncuCyte S3 instrument. Images were analyzed using IncuCyte S3 software. The number of live tumor cells in the wells was represented by the number of green objects.

Как показано на фиг. 78А, комбинация 20 нМ HER2-TriNKET и 6,7 нМ, 20 нМ или 67 нМ пембролизумаба показала более сильный эффект уничтожения опухоли, чем HER2-TriNKET или только пембролизумаб. Комбинированный эффект был более значительным при более высоком соотношении Е:Т и увеличенной концентрации пембролизумаба. Подобный комбинированный эффект наблюдался с CD8+ эффекторными Т-клетками, выделенными от другого донора, когда HER2-TriNKET был использован при низкой дозе 0,04 нМ и пембролизумаб использовали при 67 нМ (фиг. 78В).As shown in FIG. 78A, the combination of 20 nM HER2-TriNKET and 6.7 nM, 20 nM, or 67 nM pembrolizumab showed greater tumor killing effect than HER2-TriNKET or pembrolizumab alone. The combined effect was greater with higher E:T ratios and increased pembrolizumab concentrations. A similar combined effect was observed with CD8+ effector T cells isolated from a different donor when HER2-TriNKET was used at a low dose of 0.04 nM and pembrolizumab was used at 67 nM (Figure 78B).

Пример 21.Example 21.

В этом примере показана цитотоксичность РВМС человека в отношении экспрессирующей HER2 линии клеток рака молочной железы человека Skbr-3 в присутствии HER2-TriNKET и агониста TLR (Invivogen TL8-506).This example demonstrates the cytotoxicity of human PBMCs to the HER2-expressing human breast cancer cell line Skbr-3 in the presence of HER2-TriNKET and a TLR agonist (Invivogen TL8-506).

Вкратце, клетки Skbr-3 трансдуцировали для стабильной экспрессии NucLight Green (Essen BioScience 4475). После отбора пуромицином клетки собирали из культуры и ресуспендировали в культуральной среде. 3x103 клеток- мишеней добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном в 100 мкл среды. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 20 ч.Briefly, Skbr-3 cells were transduced to stably express NucLight Green (Essen BioScience 4475). After puromycin selection, cells were harvested from culture and resuspended in culture medium. 3 x 103 target cells were added to each well of a 96-well flat bottom plate in 100 µl of medium. The plate was incubated at 37°C with 5% CO2 for 20 hours.

мкл HER2-TriNKET и/или агониста TLR, разведенного в культуральной среде, добавляли в конечных концентрациях для анализа 10 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно. Свежеобработанные РВМСμL of HER2-TriNKET and/or TLR agonist diluted in culture medium were added at final assay concentrations of 10 μg/mL and 50 μg/mL, respectively. Freshly processed PBMCs

--

Claims (38)

человека ресуспендировали при 1,2х106 клеток/мл в культуральной среде, и 50 мкл РВМС добавляли во все лунки за исключением контрольной группы только клетки-мишени (которая получала 50 мкл культуральной среды). Планшет помещали в прибор Incucyte (Essen BioScience) на время анализа, причем фазовые и зеленые флуоресцентные изображения получали ежечасно в течение четырех дней. Количество клеток было получено с использованием масок зеленых событий с минимальными ограничениями площади для исключения дебриса. Количество клеток в каждый момент времени было нормализовано к количеству начальных зеленых клеток SKBR-3 для получения процента роста.The human was resuspended at 1.2 x 10 6 cells/ml in culture medium, and 50 μl of PBMC was added to all wells except for the target cell only control group (which received 50 μl of culture medium). The plate was placed in an Incucyte instrument (Essen BioScience) for the duration of the analysis, with phase and green fluorescence images acquired hourly for four days. Cell counts were obtained using green event masks with minimal area restrictions to exclude debris. The number of cells at each time point was normalized to the number of initial green SKBR-3 cells to obtain the percentage of growth. Как показано на фиг. 79, добавление только РВМС человека не оказывало влияния на пролиферацию клеток-мишеней SKBR-3, но одновременное включение HER2-TriNKET в культуру позволило РВМС существенно ингибировать рост опухолевых клеток. В тестируемой дозе агонист TLR стимулировал РВМС медленно уменьшать популяцию клеток SKBR-3 по сравнению с первоначальным количеством. Комбинация HER2-TriNKET и агониста TLR была наиболее сильной, способствуя уничтожению почти всех клеток-мишеней в течение 4 дней.As shown in FIG. 79, addition of human PBMCs alone had no effect on the proliferation of SKBR-3 target cells, but simultaneous inclusion of HER2-TriNKET in culture allowed PBMCs to significantly inhibit tumor cell growth. At the dose tested, the TLR agonist stimulated PBMCs to slowly reduce the SKBR-3 cell population from the initial number. The combination of HER2-TriNKET and a TLR agonist was most potent, killing almost all target cells within 4 days. Пример 22.Example 22. Пример 17 демонстрирует, что mcFAE-C26.99 TriNKET подавлял рост опухоли отдельно или в комбинации с IL-2 или с моноклональным антителом к PD-1 в ксенотрансплантантной модели мыши с опухолевыми клетками B16F10. Этот пример дополнительно характеризует комбинацию mcFAE-C26.99 TriNKET с IL-12.Example 17 demonstrates that mcFAE-C26.99 TriNKET suppressed tumor growth alone or in combination with IL-2 or an anti-PD-1 monoclonal antibody in a xenograft mouse model with B16F10 tumor cells. This example further characterizes the combination of mcFAE-C26.99 TriNKET with IL-12. Вкратце, 2x105 клеток меланомы B16F10 инъецировали подкожно в бок мышей C57BL/6. На 5 день после инокулирования опухоли мышей рандомизировали (n=10 на группу). Мышам внутрибрюшинно вводили (А) 7,5 мг/кг mcFAE-C26.99 TriNKET или 7,5 мг/кг контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4, (В) 1 мкг рекомбинантного IL-12 мыши (rmIL-12) или 7,5 мг/кг контрольный изотип моноклонального антитела к IgG2a мыши С1.18.4 или (С) комбинацию 7,5 мкг/кг mcFAE-C26.99 TriNKET и 1 мкг rmIL-12. Рост опухоли оценивали в течение 61 дня, а выживаемость мышей контролировали.Briefly, 2x105 B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously into the flank of C57BL/6 mice. On day 5 after tumor inoculation, mice were randomized (n=10 per group). Mice were intraperitoneally injected with (A) 7.5 mg/kg mcFAE-C26.99 TriNKET or 7.5 mg/kg isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4, (B) 1 μg recombinant mouse IL-12 (rmIL-12 ) or 7.5 mg/kg isotype control anti-mouse IgG2a monoclonal antibody C1.18.4 or (C) a combination of 7.5 μg/kg mcFAE-C26.99 TriNKET and 1 μg rmIL-12. Tumor growth was assessed over 61 days, and mouse survival was monitored. Как показано на фиг. 80А-С, монотерапия mcFAE-C26.99 TriNKET (фиг. 80А) или IL-12 мыши (фиг. 80В) сама по себе была эффективной в подавлении роста опухоли B16F10, но комбинированная терапия mcFAE-C26.99 TriNKET и IL -12 (фиг. 80С) оказывала более существенный эффект, приводя к полной регрессии опухоли у 40% обработанных мышей. Как показано на фиг. 81, общая выживаемость была значительно увеличена с помощью комбинированной терапии: 70% мышей, получавших комбинированную терапию, были еще живы на 61 день, тогда как среднее время выживания составляло только 20 дней в контрольной группе и группе, получавшей TriNKET, и 37 дней в группе лечения одним агентом IL-12.As shown in FIG. 80A-C, mcFAE-C26.99 TriNKET (FIG. 80A) or mouse IL-12 (FIG. 80B) monotherapy alone was effective in suppressing B16F10 tumor growth, but combination therapy of mcFAE-C26.99 TriNKET and IL-12 (FIG. 80C) had a more significant effect, resulting in complete tumor regression in 40% of treated mice. As shown in FIG. 81, overall survival was significantly increased by combination therapy: 70% of mice treated with combination therapy were still alive at 61 days, while the median survival time was only 20 days in the control and TriNKET groups and 37 days in the treatment with a single IL-12 agent. Включение путем ссылкиIncorporation by reference Полное раскрытие каждого из патентных документов и научных статей, упомянутых в настоящем документе, включено в качестве ссылки для всех целей.The entire disclosure of each of the patent documents and scientific articles mentioned herein is incorporated by reference for all purposes. ЭквивалентыEquivalents Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от сущности или его существенных характеристик. Таким образом, вышеприведенные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а неограничивающие изобретение, описанное в данном документе. Таким образом, объем настоящего изобретения обозначен прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые входят в значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в нее.The invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. Thus, the above embodiments should be considered in all respects as illustrative and not limiting of the invention described herein. Accordingly, the scope of the present invention is indicated by the appended claims and not by the preceding description, and all modifications that come within the meaning and scope of the claims are intended to be included therein. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способ прямого или опосредованного усиления клеточной гибели опухолевых клеток, экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген, включающий воздействие на опухолевую клетку и естественную клетку-киллера белка, содержащего:1. A method of directly or indirectly enhancing cell death of tumor cells expressing a tumor-associated antigen, including exposing the tumor cell and natural killer cell to a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO : 47 and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48. 2. Способ лечения рака, экспрессирующего опухоль-ассоциированный антиген, у субъекта, нуж-2. A method of treating cancer expressing a tumor-associated antigen in a subject requiring - 56 044644 дающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего:- 56 044644 given herein, the method comprising administering to a subject a protein containing: (а) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; или состава, содержащего белок;or a composition containing protein; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность определяющей комплементарность области 1 (CDR1), представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, последовательность определяющей комплементарность области 2 (CDR2), представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58, и последовательность определяющей комплементарность области 3 (CDR3), представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 113; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the heavy chain variable domain contains a complementarity determining region 1 (CDR1) sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 92, a complementarity determining region 2 (CDR2) sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 58, and the complementarity determining region 3 (CDR3) sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 113; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.4. The method of claim 3, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 92, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 58, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 93; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 59; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.5. The method of claim 3, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 57, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 58, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 59; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. 6. Способ по п.3, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 104; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.6. The method of claim 3, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 92, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 58, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 104; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. 7. Способ по п.3, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 103; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 60, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.7. The method of claim 3, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 57, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 58, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 103; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. 8. Способ прямого или опосредованного усиления клеточной гибели опухолевых клеток, экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген, включающий воздействие на опухолевую клетку и естественную клетку-киллера белка, содержащего:8. A method of directly or indirectly enhancing cell death of tumor cells expressing a tumor-associated antigen, including exposing the tumor cell and natural killer cell to a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязы-(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen-binding - 57 044644 вающий участок, который связывается с CD16;- 57 044644 region that binds to CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46. 9. Способ лечения рака, экспрессирующего опухоль-ассоциированный антиген, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего:9. A method of treating a cancer expressing a tumor-associated antigen in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein comprising: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; или состава, содержащего белок;or a composition containing protein; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46. 10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 52, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56.10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 90, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 52, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 91; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56. 11. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 51, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 52), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 53); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 55), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56.11. The method according to claim 8 or 9, characterized in that the heavy chain variable domain contains a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 51, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 52), and a CDR3 sequence represented by amino acid sequence (SEQ ID NO: 53); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 55), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56. 12. Способ прямого или опосредованного усиления клеточной гибели опухолевых клеток, экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген, включающий воздействие на опухолевую клетку и естественную клетку-киллера белка, содержащего:12. A method of directly or indirectly enhancing cell death of tumor cells expressing a tumor-associated antigen, including exposing the tumor cell and natural killer cell to a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. 13. Способ лечения рака, экспрессирующего опухоль-ассоциированный антиген, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего:13. A method of treating a cancer expressing a tumor-associated antigen in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; или состава, содержащего белок;or a composition containing protein; - 58 044644 в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50.- 58 044644 in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to that of sequence of SEQ ID NO: 49, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. 14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 64), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 95); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 66, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 67), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68.14. The method according to claim 12 or 13, characterized in that the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 94, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 64), and a CDR3 sequence represented by amino acid sequence (SEQ ID NO: 95); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 67), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68. 15. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 63, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 64), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 65); и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 66, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 67), и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68.15. The method according to claim 12 or 13, characterized in that the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 63, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 64), and a CDR3 sequence represented by amino acid sequence (SEQ ID NO: 65); and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 67), and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68. 16. Способ прямого или опосредованного усиления клеточной гибели опухолевых клеток, экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген, включающий воздействие на опухолевую клетку и естественную клетку-киллера белка, содержащего:16. A method of directly or indirectly enhancing cell death of tumor cells expressing a tumor-associated antigen, including exposing the tumor cell and natural killer cell to a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 114, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 115.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115. 17. Способ лечения рака, экспрессирующего опухоль-ассоциированный антиген, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего:17. A method of treating a cancer expressing a tumor-associated antigen in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein comprising: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; или состава, содержащего белок;or a composition containing protein; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 114, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 115.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115. 18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 122, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 117, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 123; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 119, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 120, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 121.18. The method according to claim 16 or 17, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 122, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 117, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 123; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 120, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121. 19. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит по-19. The method according to claim 16 or 17, characterized in that the heavy chain variable domain contains - 59 044644 следовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 116, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 117, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 118; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 119, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 120, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 121.- 59 044644 the CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 116, the CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 117, and the CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 118; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 120, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121. 20. Способ прямого или опосредованного усиления клеточной гибели опухолевых клеток, экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген, включающий воздействие на опухолевую клетку и естественную клетку-киллера белка, содержащего:20. A method of directly or indirectly enhancing cell death of tumor cells expressing a tumor-associated antigen, including exposing the tumor cell and natural killer cell to a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (с) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) an Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 124, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 124, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125. 21. Способ лечения рака, экспрессирующего опухоль-ассоциированный антиген, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего:21. A method of treating a cancer expressing a tumor-associated antigen in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; или состава, содержащего белок;or a composition containing protein; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из блокатора контрольных точек и цитокина, причем первый антигенсвязывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 124, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125.in combination with a second therapeutic agent selected from a checkpoint blocker and a cytokine, wherein the first antigen binding region comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein the heavy chain variable domain comprises an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 124, and the light chain variable domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125. 22. Способ по п.20 или 21, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 122, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 117, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 130; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 127, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 128, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 129.22. The method according to claim 20 or 21, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 122, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 117, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 130; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 127, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129. 23. Способ по п.20 или 21, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 116, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 117, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 126; и вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 127, последовательность CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 128, и последовательность CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 129.23. The method according to claim 20 or 21, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 116, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 117, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 126; and the light chain variable domain comprises a CDR1 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 127, a CDR2 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, and a CDR3 sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129. 24. Способ прямого или опосредованного усиления клеточной гибели опухолевых клеток, экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген, включающий воздействие на опухолевую клетку и естественную клетку-киллера белка, содержащего:24. A method of directly or indirectly enhancing cell death of tumor cells expressing a tumor-associated antigen, including exposing the tumor cell and natural killer cell to a protein containing: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из:in combination with a second therapeutic agent selected from: - 60 044644 (i) блокатора контрольных точек, выбранного из антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к- 60 044644 (i) a checkpoint blocker selected from an anti-PD1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD1 antibody, CTLA4, антитела к KIR, антитела к NKG2A, антитела к LAG3 и антитела к TIM3; и (ii) цитокина, выбранного из IL-2, INFa, IL-21, PEG-IL-2 и гетеродимера IL15/IL15R.CTLA4, anti-KIR, anti-NKG2A, anti-LAG3, and anti-TIM3; and (ii) a cytokine selected from IL-2, INFa, IL-21, PEG-IL-2 and IL15/IL15R heterodimer. 25. Способ лечения рака, экспрессирующего опухоль-ассоциированный антиген, у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту белка, содержащего:25. A method of treating a cancer expressing a tumor-associated antigen in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a protein comprising: (a) первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D;(a) a first antigen binding site that binds NKG2D; (b) второй антигенсвязывающий участок, который связывается с опухоль-ассоциированным антигеном; и (c) Fc-домен антитела или его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывается с CD16;(b) a second antigen-binding site that binds to a tumor-associated antigen; and (c) the Fc domain of the antibody, or a portion thereof sufficient to bind CD16, or a third antigen binding region that binds CD16; или состава, содержащего белок;or a composition containing protein; в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из:in combination with a second therapeutic agent selected from: (i) блокатора контрольных точек, выбранного из антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к KIR, антитела к NKG2A, антитела к LAG3 и антитела к TIM3; и (ii) цитокина, выбранного из IL-2, INFa, IL-21, PEG-IL-2 и гетеродимера IL15/IL15R.(i) a checkpoint blocker selected from an anti-PD1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-CTLA4 antibody, an anti-KIR antibody, an anti-NKG2A antibody, an anti-LAG3 antibody, and an anti-TIM3 antibody; and (ii) a cytokine selected from IL-2, INFa, IL-21, PEG-IL-2 and IL15/IL15R heterodimer. 26. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что второй терапевтический агент включает блокатор контрольных точек, выбранный из антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA4, антитела к KIR, антитела к NKG2A, антитела к LAG3 и антитела к TIM3.26. The method according to any one of claims 1 to 23, characterized in that the second therapeutic agent includes a checkpoint blocker selected from an anti-PD1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-CTLA4 antibody, an anti-KIR antibody, an anti-NKG2A antibody, an anti- LAG3 and anti-TIM3 antibodies. 27. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что второй терапевтический агент включает цитокин, выбранный из L-2, IL-15, IL-12, INFa, IL-21, PEG-IL-2 и гетеродимеров IL15/IL15R.27. The method according to any one of claims 1 to 23, characterized in that the second therapeutic agent includes a cytokine selected from L-2, IL-15, IL-12, INFa, IL-21, PEG-IL-2 and IL15 heterodimers /IL15R. 28. Способ по любому из пп.2-7, 9-11, 13-15, 17-19 и 21-27, отличающийся тем, что рак выбран из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза, острого миеломоноцитарного лейкоза, В-клеточной лимфомы, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, рака пищевода, саркомы Юинга, фолликулярной лимфомы, рака желудка, рака желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечных стромальных опухолей, глиобластомы, рака головы и шеи, меланомы, мезотелиомы, множественной миеломы, миелодиспластичного синдрома, почечно-клеточной карциномы, нейробластомы, немелкоклеточного рака легкого, нейроэндокринных опухолей, рака яичников и рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, саркомы, мелкоклеточного рака легкого, Т-клеточной лимфомы, рака яичка, рака тимуса, рака щитовидной железы, рака уротелия, видов рака, инфильтруемых миелоидными супрессорными клетками, видов рака с отложением внеклеточного матрикса, видов рака с высоким уровнем реактивной стромы и видов рака с неоангиогенезом.28. The method according to any one of claims 2-7, 9-11, 13-15, 17-19 and 21-27, characterized in that the cancer is selected from the group consisting of acute myeloid leukemia, acute myelomonocytic leukemia, B-cell lymphoma, bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, diffuse large B-cell lymphoma, esophageal cancer, Ewing's sarcoma, follicular lymphoma, gastric cancer, gastrointestinal cancer, gastrointestinal stromal tumors, glioblastoma, head and neck cancer , melanoma, mesothelioma, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, renal cell carcinoma, neuroblastoma, non-small cell lung cancer, neuroendocrine tumors, ovarian and pancreatic cancer, prostate cancer, sarcoma, small cell lung cancer, T-cell lymphoma, testicular cancer, thymic cancer, thyroid cancer, urothelial cancer, cancers infiltrated by myeloid suppressor cells, cancers with extracellular matrix deposition, cancers with high levels of reactive stroma and cancers with neoangiogenesis. 29. Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что первый антигенсвязывающий участок белка связывается с NKG2D у людей, приматов, не являющихся человеком, и грызунов.29. The method according to any one of claims 1 to 28, characterized in that the first antigen binding region of the protein binds to NKG2D in humans, non-human primates and rodents. 30. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи присутствуют в одном и том же полипептиде.30. The method according to any one of claims 1 to 23, characterized in that the heavy chain variable domain and the light chain variable domain are present in the same polypeptide. 31. Способ по любому из пп.24-29, отличающийся тем, что первый антигенсвязывающий участок представляет собой однодоменное антитело.31. The method according to any one of claims 24-29, characterized in that the first antigen-binding site is a single-domain antibody. 32. Способ по п.31, отличающийся тем, что однодоменное антитело представляет собой антитело VHH или антитело VNAR.32. The method according to claim 31, characterized in that the single domain antibody is a VHH antibody or a V NAR antibody. 33. Способ по любому из пп.1-30, отличающийся тем, что второй антигенсвязывающий участок представляет собой однодоменное антитело.33. The method according to any one of claims 1 to 30, characterized in that the second antigen-binding site is a single-domain antibody. 34. Способ по п.33, отличающийся тем, что второй антигенсвязывающий участок представляет собой антитело VHH или антитело VNAR.34. The method of claim 33, wherein the second antigen binding site is a VHH antibody or a V NAR antibody. 35. Способ по любому из пп.1-34, отличающийся тем, что опухоль-ассоциированный антиген выбран из группы, состоящей из HER2, ЕрСАМ, CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, сМЕТ, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, В7.1, В7.2, CTLA4 и PD-L1.35. The method according to any one of claims 1 to 34, characterized in that the tumor-associated antigen is selected from the group consisting of HER2, EpCAM, CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 and PD-L1. 36. Способ по любому из пп.1-35, отличающийся тем, что белок содержит часть Fc-домена антитела, достаточную для связывания CD16, причем Fc-домен антитела содержит шарнирный домен и домен СН2.36. The method according to any one of claims 1 to 35, characterized in that the protein contains a part of the Fc domain of the antibody sufficient to bind CD16, and the Fc domain of the antibody contains a hinge domain and a CH2 domain. 37. Способ по любому из пп.1-35, отличающийся тем, что белок содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 234-332 антитела IgG1 человека.37. The method according to any one of claims 1 to 35, characterized in that the protein contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to amino acids 234-332 of the human IgG1 antibody. 38. Способ по любому из пп.2-7, 9-11, 13-15, 17-19 и 21-37, отличающийся тем, что состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.38. The method according to any of claims 2-7, 9-11, 13-15, 17-19 and 21-37, characterized in that the composition additionally contains a pharmaceutically acceptable carrier. --
EA202091887 2018-02-08 2019-02-08 COMBINED CANCER THERAPY USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT ACTIVATE NATURAL KILLER CELLS EA044644B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/628,178 2018-02-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA044644B1 true EA044644B1 (en) 2023-09-19

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240166753A1 (en) Multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16, and a tumor-associated antigen for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US20230303702A1 (en) Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16, and a tumor-associated antigen
US20240228625A1 (en) Proteins binding her2, nkg2d and cd16
US20200095327A1 (en) Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
KR20240078657A (en) Proteins binding bcma, nkg2d and cd16
US20210130471A1 (en) Proteins binding cd33, nkg2d and cd16
US20200231700A1 (en) Proteins binding gd2, nkg2d and cd16
KR20190120770A (en) Proteins That Bind PSMA, NKG2D, and CD16
RU2809125C2 (en) Polyvalent binding proteins for activation of natural killer cells and their therapeutic application for treatment of malignant neoplasm
EA044644B1 (en) COMBINED CANCER THERAPY USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT ACTIVATE NATURAL KILLER CELLS
RU2788531C2 (en) Protein binding with nkg2d, cd16 and with tumor-specific antigen
AU2018220736B2 (en) Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
RU2826991C2 (en) Protein binding with nkg2d, cd16 and with tumor-specific antigen