EA044423B1 - STABILIZATION AND CONTROLLED RELEASE SYSTEMS FOR DRUGS UNSTABLE BY STERILIZATION - Google Patents
STABILIZATION AND CONTROLLED RELEASE SYSTEMS FOR DRUGS UNSTABLE BY STERILIZATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA044423B1 EA044423B1 EA202192534 EA044423B1 EA 044423 B1 EA044423 B1 EA 044423B1 EA 202192534 EA202192534 EA 202192534 EA 044423 B1 EA044423 B1 EA 044423B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rapamycin
- amide
- range
- has1
- oleylamide
- Prior art date
Links
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 28
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 title claims description 7
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 title description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 title description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 title description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 title description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 67
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 62
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical class C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 62
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 59
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 59
- 229940113162 oleylamide Drugs 0.000 claims description 57
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 34
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 23
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 22
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- ZNLVYSJQUMALEO-UHFFFAOYSA-N 1-benzyl-4-(4-chloro-2-nitrophenyl)sulfonylpiperazine Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(Cl)=CC=C1S(=O)(=O)N1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 ZNLVYSJQUMALEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 14
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- FATBGEAMYMYZAF-KTKRTIGZSA-N oleamide Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(N)=O FATBGEAMYMYZAF-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 13
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 claims description 13
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N (z)-octadec-9-en-1-amine Chemical group CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCN QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 12
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims description 12
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims description 12
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims description 12
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 claims description 9
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 claims description 9
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 claims description 9
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 claims description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 8
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 8
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 claims description 7
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 7
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 6
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 6
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N benzododecinium Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 4
- JMPKRWPMDAFCGM-SNAWJCMRSA-N (e)-hex-2-en-1-amine Chemical compound CCC\C=C\CN JMPKRWPMDAFCGM-SNAWJCMRSA-N 0.000 claims description 3
- IAWXHEPLJXAMSG-ONEGZZNKSA-N (e)-pent-2-en-1-amine Chemical compound CC\C=C\CN IAWXHEPLJXAMSG-ONEGZZNKSA-N 0.000 claims description 3
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 3
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001716 benzalkonium Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- DGOSGFYDFDYMCW-MWRBZVGOSA-N phorbol dicaprate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(=O)CCCCCCCCC)C1(C)C DGOSGFYDFDYMCW-MWRBZVGOSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 83
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 102000003918 Hyaluronan Synthases Human genes 0.000 description 13
- 108090000320 Hyaluronan Synthases Proteins 0.000 description 13
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 12
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 12
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 10
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 10
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 9
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 9
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 8
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 7
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 7
- 229960003773 calcitonin (salmon synthetic) Drugs 0.000 description 7
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 7
- 108010068072 salmon calcitonin Proteins 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 6
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 6
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 6
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 5
- 102000003567 TRPV4 Human genes 0.000 description 5
- 101150098315 TRPV4 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide Chemical compound O=S(=O)=O AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 5
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 4
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 4
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- -1 sulfated hyaluronic acid alkenyl amides Chemical class 0.000 description 4
- 229960002117 triamcinolone acetonide Drugs 0.000 description 4
- YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N triamcinolone acetonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N 0.000 description 4
- 102100027400 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 Human genes 0.000 description 3
- 108091005664 ADAMTS4 Proteins 0.000 description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010003059 aggrecanase Proteins 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003349 osteoarthritic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 102000016284 Aggrecans Human genes 0.000 description 1
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229940124761 MMP inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008355 cartilage degradation Effects 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 150000001887 cortisones Chemical class 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к алкениламидам сульфатированной гиалуроновой кислоты и их применению для стабилизации и высвобождения лекарственных средств в форме мицеллярных суспензий, которые могут быть введены местным и/или местно-региональным образом, особенно внутрисуставно.The present invention relates to sulfated hyaluronic acid alkenyl amides and their use for stabilizing and releasing drugs in the form of micellar suspensions that can be administered in a local and/or local-regional manner, especially intra-articularly.
Уровень техникиState of the art
Местное или местно-региональное введение изучают все чаще для преодоления проблем, связанных с системной токсичностью или фармакокинетикой лекарственных средств; возможность сделать лекарство доступным на его сайте действия будет понижать водимые дозы, что еще больше уменьшит вероятность побочных эффектов. Это преимущество особенно важно при лечении хронических нарушений, требующих постоянного введения, или нарушений, которые являются этиологически и биохимически сложными. Одним из наиболее значимых примеров указанных нарушений является остеоартроз (OA), который возникает из-за сложной системы механических и биохимических взаимодействий, конечным результатом которых является разрушение суставной ткани. Хотя первоначальный механизм повреждения в значительной степени неизвестен, известны изменения, наносящие ущерб хрящу и в последствие субхондральной кости, такие как снижение содержания аггрекана и протеогликана в суставном хряще, увеличение количества коллагена типа I (субхондрального) по сравнению с типом II (присутствует в гиалиновом хряще), дисбаланс метаболической и катаболической активности хондроцитов и массивный дисбаланс внутрисуставной ферментативной активности с избыточной экспрессией (среди прочего) металлопротеиназ, цитокинов и воспалительных ферментов. Все это приводит к растрескиванию внутрисуставного хряща, вначале поверхностному и затем поражающему всю толщину хряща, пока в наиболее серьезных случаях не приводит к эрозии субхондральной кости и появлению хорошо известных клинических симптомов. Согласно последним открытиям, основной акцент для определения стратегий эффективного лечения следует искать в гуморальных взаимовлияниях между хрящом и субхондральной костью.Local or locoregional administration is increasingly being explored to overcome problems associated with systemic toxicity or drug pharmacokinetics; The ability to make a drug available at its site of action will lower the doses administered, further reducing the likelihood of side effects. This advantage is especially important in the treatment of chronic disorders that require constant administration, or disorders that are etiologically and biochemically complex. One of the most significant examples of these disorders is osteoarthritis (OA), which occurs due to a complex system of mechanical and biochemical interactions, the end result of which is the destruction of joint tissue. Although the initial mechanism of injury is largely unknown, changes are known to be detrimental to cartilage and subsequently to subchondral bone, such as decreased aggrecan and proteoglycan content in articular cartilage, increased amounts of type I (subchondral) collagen compared to type II (present in hyaline cartilage). ), an imbalance in chondrocyte metabolic and catabolic activity, and a massive imbalance in intra-articular enzymatic activity with overexpression of (among others) metalloproteinases, cytokines, and inflammatory enzymes. All this leads to cracking of the intra-articular cartilage, initially superficial and then affecting the entire thickness of the cartilage until, in the most severe cases, it leads to erosion of the subchondral bone and the appearance of the well-known clinical symptoms. According to recent discoveries, the main focus for determining effective treatment strategies should be sought in the humoral interactions between cartilage and subchondral bone.
Таким образом, очевидно, что новые рубежи в лечении остеоартроза должны основываться на многофакторном подходе, учитывающем сложность заболевания.Thus, it is clear that new frontiers in the treatment of osteoarthritis must be based on a multifactorial approach that takes into account the complexity of the disease.
Описаны многочисленные лекарственные средства, некоторые из которых также используют для лечения других нарушений, которые проявляют активность in vitro на различных моделях ОА и, следовательно, потенциально полезны для клинических целей. Однако их разработка в системных препаратах для использования человеком часто сильно ограничивается проблемами токсичности и фармакокинетики.Numerous drugs, some of which are also used to treat other disorders, have been described that are active in vitro in various models of OA and are therefore potentially useful for clinical purposes. However, their development into systemic formulations for human use is often severely limited by toxicity and pharmacokinetics issues.
Стратегия, связанная с этими аспектами, заключается в местном или местно-региональном, в частности внутрисуставном, введении, которое устраняет проблемы системных фармакокинетики и токсичности. Для внутрисуставного введения требуются рецептуры в водном растворителе, которые могут распределяться в синовиальной жидкости и интегрироваться в нее, не вызывая местных воспалительных явлений, которые часто возникают в случае неводных растворителей. Значение pH рецептуры должно быть таким же или очень схожим с физиологическим значением pH, чтобы гарантировать отсутствие дисбаланса в суставе, уже измененном текущим нарушением. Рецептура должна обеспечивать локализованное, продолжительное, постепенное высвобождение активного ингредиента, которое ограничено сайтом введения. И, наконец, переносимый активный ингредиент должен быть стабилен в условиях стерилизации стандартными способами.A strategy related to these aspects is local or locoregional, particularly intra-articular, administration, which overcomes the problems of systemic pharmacokinetics and toxicity. Intra-articular administration requires formulations in an aqueous solvent that can be distributed and integrated into the synovial fluid without causing the local inflammatory effects that often occur with non-aqueous solvents. The pH value of the formulation must be the same or very similar to the physiological pH value to ensure that there is no imbalance in a joint already affected by the current disorder. The formulation must provide a localized, sustained, gradual release of the active ingredient that is limited to the site of administration. Finally, the active ingredient to be transferred must be stable under standard sterilization conditions.
Эти требования также применимы к местно-региональным вариантам применения за пределами суставного отдела.These requirements also apply to locoregional applications outside the articular region.
Однако многие из лекарственных средств, представляющих наибольший интерес в описанной выше области, как правило, довольно чувствительны к изменениям pH, нестабильны при тепловой стерилизации и имеют преимущественно гидрофобную природу. Будучи гидрофильными, они склонны быстро выпадать в осадок в водном растворе, и, следовательно, после введения не обеспечивают достаточного времени пребывания для проявления фармакологического эффекта.However, many of the drugs of greatest interest in the field described above tend to be quite sensitive to changes in pH, unstable to heat sterilization, and predominantly hydrophobic in nature. Being hydrophilic, they tend to precipitate quickly in aqueous solution, and therefore, once administered, do not provide sufficient residence time for pharmacological effects to occur.
Примеры лекарственных средств, подходящих для местно-регионального введения включают рапамицин (сиролимус), статины, кальцитонин, эверолимус, паклитаксел и стероидные соединения.Examples of drugs suitable for local-regional administration include rapamycin (sirolimus), statins, calcitonin, everolimus, paclitaxel and steroid compounds.
Рапамицин представляет собой макролидный антибиотик, полностью нерастворимый в водных растворителях, который широко используют для предупреждения отторжения после трансплантации органов и в качестве покрытия для стентов, используемых для предотвращения рестеноза. Он также исследован на его влияния на суставы (Arthritis Res Ther, 2014, 16, 482) ввиду его способности активировать аутофагию в хондроцитах человека и его ингибирующего действия на mTOR, предотвращая таким образом развитие OA. mTOR (мишень рапамицина в клетках млекопитающих) представляет собой протеинкиназу, отвечающую за фосфорилирование серина и треонина, которая регулирует рост, пролиферацию, подвижность и выживаемость клеток; она также активно участвует в процессе перерождения хряща, которое имеет место у пациентов, страдающих от остеоартроза. Таким образом, ингибирование mTOR рапамицином в настоящее время может предоставлять заслуживающую внимание стратегию противодействия остеоартрозу суставов.Rapamycin is a macrolide antibiotic, completely insoluble in aqueous solvents, which is widely used to prevent rejection after organ transplantation and as a coating for stents used to prevent restenosis. It has also been studied for its effects on joints (Arthritis Res Ther, 2014, 16, 482) due to its ability to activate autophagy in human chondrocytes and its inhibitory effect on mTOR, thus preventing the development of OA. mTOR (mammalian target of rapamycin) is a serine and threonine phosphorylation protein kinase that regulates cell growth, proliferation, motility and survival; it is also actively involved in the process of cartilage degeneration that occurs in patients suffering from osteoarthritis. Thus, inhibition of mTOR by rapamycin may currently provide a noteworthy strategy to counteract joint osteoarthritis.
- 1 044423- 1 044423
Симвастатин и статины в целом, помимо их хорошо известных холестерин-снижающих эффектов, в течение некоторого времени исследовались на предмет их противовоспалительных эффектов (ингибирование ММП (MMP)) и их способности регулировать баланс остеобластов/остеокластов.Simvastatin and statins in general, in addition to their well-known cholesterol-lowering effects, have been investigated for some time for their anti-inflammatory effects (MMP inhibition) and their ability to regulate osteoblast/osteoclast balance.
Статины обычно нерастворимы в воде, нестабильны при кислом и щелочном pH и не могут быть стерилизованы нагреванием.Statins are generally insoluble in water, unstable at acidic and alkaline pH, and cannot be sterilized by heat.
Триамцинолон и кортизоны в целом широко используют для внутрисуставного лечения ОА, но они нерастворимы в воде.Triamcinolone and cortisones in general are widely used for intra-articular treatment of OA, but they are insoluble in water.
Кальцитонин используют из-за его воздействия на анаболизм хряща; он не полностью нерастворим в водном носителе, но имеет тенденцию очень быстро выпадать в осадок, что препятствует адекватному профилю высвобождения. Он также нестабилен при тепловой стерилизации.Calcitonin is used for its effects on cartilage anabolism; it is not completely insoluble in the aqueous vehicle, but tends to precipitate very quickly, preventing an adequate release profile. It is also unstable when heat sterilized.
Другими лекарствами, еще находящимися в стадии разработки, являются RN-1747, 4а-форбол12,13-дидеканоат (4aPDD) и арахидоновая кислота, которые действуют на определенные ионные каналы, такие как TRPV4. Этот канал представляет собой канал, экспрессирующий в широком спектре тканей, участвующих в генерации опосредуемых кальцием сигналов, способствуя таким важным функциям, как поддержание клеточного объема и гомеостаза. Также было показано, что TRPV4 играет решающую роль в развитии и поддержании костно-мышечной и хрящевой ткани; нарушение функции TRPV4 тесно связано с проявлением воспалительных и остеоартритических проблем сустава (McNaughty, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2015, 388, 437-450). Таким образом, способность также регулировать правильную активацию TRPV4 представляет собой важную мишень для лечения остеоартритических нарушений. Лекарственные средства, описанные выше, являются агонистами каналов TRPV4, способными регулировать их активацию и, следовательно, потенциально применимы для целей, описанных выше, но тот факт, что они плохо растворимы или даже нерастворимы в воде (как в случае RN-1747), исключает их клиническое применение.Other drugs still in development are RN-1747, 4a-phorbol 12,13-didecanoate (4aPDD), and arachidonic acid, which act on specific ion channels such as TRPV4. This channel is a channel expressed in a wide range of tissues involved in the generation of calcium-mediated signals, contributing to important functions such as the maintenance of cellular volume and homeostasis. TRPV4 has also been shown to play a critical role in the development and maintenance of musculoskeletal and cartilage tissue; Dysfunction of TRPV4 is closely associated with the manifestation of inflammatory and osteoarthritic joint problems (McNaughty, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2015, 388, 437-450). Thus, the ability to also regulate proper TRPV4 activation represents an important target for the treatment of osteoarthritic disorders. The drugs described above are TRPV4 channel agonists capable of regulating their activation and are therefore potentially useful for the purposes described above, but the fact that they are poorly soluble or even insoluble in water (as in the case of RN-1747) excludes their clinical application.
Следовательно, существует очевидная потребность в системах, которые позволяют стабилизировать описанные молекулы как на стадии приготовления рецептуры, так и на стадии стерилизации, и одновременно обеспечивать контролируемое высвобождение на месте введения.Therefore, there is a clear need for systems that allow the molecules described to be stabilized at both the formulation and sterilization stages, while simultaneously providing controlled release at the site of administration.
В документе US 2016/0279108 описана конъюгация рапамицина с низкомолекулярной гиалуроновой кислотой с помощью линкера, содержащего ароматические группы, с получением водорастворимого производного, способного проникать в лимфатическую систему и накапливаться в лимфатических узлах. В документе WO 2017044135 описаны рецептуры, содержащие рапамицин, капсулированный в фосфолипидные липосомы, которые, хотя и несут лекарственное средство, являются относительно большими (до 2 мкм) и могут создавать проблемы приготовления рецептур из-за их чувствительности к pH, ионной силе, градиенту носителя и др. Также описаны системы капсулирования для лекарственных средств, плохо растворимых в полимерных частицах (полимолочная кислота, полигликолевая кислота и др.). И, наконец, известные системы контролируемого высвобождения включают гидрогели на основе сильно гидратируемых полимеров (низкомолекулярная гиалуроновая кислота, коллаген, альгиновая кислота, альгинаты и др.), которые удерживают лекарство в сетке гидрогеля или высвобождает его постепенно по мере разрушения гидрогелевой структуры (WO 2013179258).US 2016/0279108 describes the conjugation of rapamycin with low molecular weight hyaluronic acid using a linker containing aromatic groups to obtain a water-soluble derivative that can penetrate the lymphatic system and accumulate in the lymph nodes. WO 2017044135 describes formulations containing rapamycin encapsulated in phospholipid liposomes, which, although carrying drug, are relatively large (up to 2 μm) and can pose formulation problems due to their sensitivity to pH, ionic strength, carrier gradient etc. Encapsulation systems for drugs that are poorly soluble in polymer particles (polylactic acid, polyglycolic acid, etc.) are also described. Finally, known controlled release systems include hydrogels based on highly hydrated polymers (low molecular weight hyaluronic acid, collagen, alginic acid, alginates, etc.), which retain the drug in the hydrogel network or release it gradually as the hydrogel structure is destroyed (WO 2013179258) .
Сульфатированная гиалуроновая кислота (HAS), описанная в документах EP 0702699 и WO 2017/085622, легко проникает через кожные барьеры, тем самым облегчая проход фармакологически активных веществ. Совсем недавно обнаружено, что HAS обладает противовоспалительными свойствами, опосредуемыми модуляцией активности множества цитокинов, как про- и противовоспалительных. Следовательно, HAS может быть использована при лечении нарушений, опосредуемых изменением уровней цитокинов (ревматоидный артрит, астма, системные и кожные аутоиммунные заболевания, вирусные инфекции, атопический дерматит, экзема, витилиго и лимфомы, как сообщается в документах WO 2010130468 и WO 2010130466).Sulfated hyaluronic acid (HAS), described in EP 0702699 and WO 2017/085622, easily penetrates skin barriers, thereby facilitating the passage of pharmacologically active substances. More recently, HAS has been found to have anti-inflammatory properties mediated by modulating the activity of multiple cytokines, both pro- and anti-inflammatory. Therefore, HAS can be used in the treatment of disorders mediated by changes in cytokine levels (rheumatoid arthritis, asthma, systemic and cutaneous autoimmune diseases, viral infections, atopic dermatitis, eczema, vitiligo and lymphomas, as reported in WO 2010130468 and WO 2010130466).
Описание изобретенияDescription of the invention
В настоящее время найдена система стабилизации и контролируемого высвобождения лекарственных средств, которые нестабильны при стерилизации стандартными способами и/или трудны для рецептурирования, которая включает смешение медикамента с алкениламидом сульфатированной гиалуроновой кислоты (HAS) и последующую обработку ультразвуком. Сульфатные группы делают гиалуроновую кислоту водорастворимой без образования гидрогеля и делают ее стерилизуемой фильтрованием, при этом амидирование C4-C20-алкениламином придает HAS частично гидрофобную природу, требуемую для ее смешения с соединениями, которые нерастворимы в воде.A system has now been found for the stabilization and controlled release of drugs that are unstable when sterilized by standard methods and/or are difficult to formulate, which involves mixing the drug with sulfated hyaluronic acid alkenylamide (HAS) and subsequent sonication. The sulfate groups make hyaluronic acid water soluble without forming a hydrogel and make it filter sterilizable, while amidation with a C4- C20 -alkenylamine gives HAS the partially hydrophobic nature required for its miscibility with compounds that are insoluble in water.
Обработка ультразвуком приводит к образованию мицеллярных структур, гомогенно суспендированных в водном носителе (HAS); указанные суспензии можно стерилизовать путем фильтрования или нагревания с использованием известных методов, таких как автоклавирование.Sonication results in the formation of micellar structures homogeneously suspended in an aqueous vehicle (HAS); these suspensions can be sterilized by filtration or heating using known methods such as autoclaving.
Полученные суспензии также можно лиофилизировать, хранить при комнатной температуре и восстанавливать во время использования стерильным водным носителем без потери титра активногоThe resulting suspensions can also be lyophilized, stored at room temperature and reconstituted during use with a sterile aqueous vehicle without loss of active titer
- 2 044423 ингредиента, и после введения на желаемый сайт прежде всего способны высвобождать активный ингредиент контролируемым образом.- 2 044423 ingredients, and after administration to the desired site, are primarily capable of releasing the active ingredient in a controlled manner.
Амиды сульфатированной гиалуроновой кислоты с C4-C20-алкениламинами являются новыми и составляют первый объект изобретения.Amides of sulfated hyaluronic acid with C 4 -C 20 -alkenylamines are new and constitute the first object of the invention.
Второй объект изобретения составляют водные мицеллярные суспензии амида сульфатированной гиалуроновой кислоты с C4-C2o-алкениламинами и гидрофобного или гидрофильного лекарственного средства.The second object of the invention is aqueous micellar suspensions of sulfated hyaluronic acid amide with C 4 -C 2 o-alkenylamines and a hydrophobic or hydrophilic drug.
Третьим объектом изобретения является способ приготовления мицеллярных суспензий, который включает:The third object of the invention is a method for preparing micellar suspensions, which includes:
взаимодействие C4-C2o-алкениламина с бензалкониевой или тетрабутиламмониевой солью сульфатированной гиалуроновой кислоты в апротонном неполярном растворителе в присутствии конденсирующих агентов;interaction of C 4 -C 2 o-alkenylamine with benzalkonium or tetrabutylammonium salt of sulfated hyaluronic acid in an aprotic non-polar solvent in the presence of condensing agents;
смешение амида сульфатированной гиалуроновой кислоты, полученной на предыдущей стадии, с водной суспензией или раствором лекарства;mixing sulfated hyaluronic acid amide obtained in the previous step with an aqueous suspension or solution of the drug;
обработка смеси ультразвуком и стерилизующее фильтрование.ultrasonic treatment of the mixture and sterilizing filtration.
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные мицеллярные суспензии и необязательные наполнители, и к их применению для местного, местнорегионального, внутрисуставного или внутрикостного инъекционного введения, в частности для внутрисуставной инъекции, для лечения остеоартроза.The invention also relates to pharmaceutical compositions containing said micellar suspensions and optional excipients, and to their use for local, local-regional, intra-articular or intraosseous injection administration, in particular for intra-articular injection, for the treatment of osteoarthritis.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Исходная гиалуроновая кислота, используемая в изобретении и предназначенная для сульфатированная и последующего амидирования, может быть получена и очищена известными методами, например, путем экстракции из петушиных гребней (EP 138572), ферментацией из Streptococcus (WO 2018/020458; WO 2019/016699), или биосинтезом из Bacillus (WO 2012/032154). Предпочтительная HA получена и очищена из Streptococcus со средневесовой молекулярной массой (MW) в интервале от 1000θ0 до 250000 Да, в частности от 180000 до 230000 Да, далее называемую MW 200 кДа, или HA со средневесовой MW в интервале от 500000 до 730000 Да. HA с MW 200 кДа особенно предпочтительна. Средняя молекулярная масса (MW) в данном случае средневесовую MW, рассчитанную методом характеристической вязкости (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).The source hyaluronic acid used in the invention and intended for sulfation and subsequent amidation can be obtained and purified by known methods, for example, by extraction from cockscombs (EP 138572), fermentation from Streptococcus (WO 2018/020458; WO 2019/016699), or biosynthesis from Bacillus (WO 2012/032154). A preferred HA is obtained and purified from Streptococcus with a weight average molecular weight (MW) in the range from 1000θ0 to 250,000 Da, in particular from 180,000 to 230,000 Da, hereinafter referred to as MW 200 kDa, or HA with a weight average MW in the range from 500,000 to 730,000 Da. HA with an MW of 200 kDa is particularly preferred. Average molecular weight (MW) in this case is the weight average MW calculated by the intrinsic viscosity method (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).
Фракции HA, описанные выше, сульфатируют по известным методикам, особенно способами, описанными в документах EP 702699 и WO 2017/085622.The HA fractions described above are sulfated using known methods, especially those described in EP 702699 and WO 2017/085622.
Число сульфатных групп на дисахаридное звено (степень сульфатирования) в амидах в соответствии с изобретением находится в интервале от 0,5 до 3,5. Обычно может быть использована степень сульфатирования, лежащая в интервале от 0,5 до 1,5 (HAS-1), 1,5 и 2,5 (HAS-2) или 2,5 и 3,5 (HAS-3). Предпочтительно используют HAS со степенью сульфатирования в интервале от 0,5 до 1,5 (HAS-1).The number of sulfate groups per disaccharide unit (degree of sulfation) in amides according to the invention is in the range from 0.5 to 3.5. Typically, a degree of sulfation ranging from 0.5 to 1.5 (HAS-1), 1.5 and 2.5 (HAS-2), or 2.5 and 3.5 (HAS-3) can be used. Preferably, HAS with a degree of sulfation in the range of 0.5 to 1.5 (HAS-1) is used.
В соответствии с изобретением карбоксильные группы HAS вводят в реакцию с C4-C20алкениламинами с образованием амидной связи. Обычно функциональные группы, не вовлеченные в дериватизацию, превращают в соль с помощью щелочного или щелочноземельного иона, предпочтительно Na+. Амидирование проводят по известным методикам, предпочтительно, как описано в документе EP 1095064, с соответствующими адаптациями.In accordance with the invention, the carboxyl groups of HAS are reacted with C4-C20 alkenylamines to form an amide bond. Typically, functional groups not involved in derivatization are converted to a salt using an alkali or alkaline earth ion, preferably Na + . The amidation is carried out according to known methods, preferably as described in document EP 1095064, with appropriate adaptations.
Степень дериватизации в мольных процентах (%) (амидирование) HAS, выраженная в виде отношения моли алкениламина/моли димера HAS, находится в интервале от 5 до 30%, предпочтительно от 10 до 25% и более предпочтительно от 10 до 17%.The degree of derivatization in mole percent (%) (amidation) of HAS, expressed as the ratio of moles of alkenylamine/moles of HAS dimer, is in the range of 5 to 30%, preferably 10 to 25%, and more preferably 10 to 17%.
Алкениламин предпочтительно содержит одну или две ненасыщенности, более предпочтительно одну ненасыщенность. Примерами предпочтительных аминов являются олеиламин, (2E)-гекс-2-ен-1амин и пент-2-ен-1-амин. Олеиламин особенно предпочтителен.Alkenylamine preferably contains one or two unsaturations, more preferably one unsaturation. Examples of preferred amines are oleylamine, (2E)-hex-2-en-1-amine and pent-2-en-1-amine. Oleylamine is particularly preferred.
Формула схематичного строения структурных подзвеньев олеиламида сульфатированной гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением показана ниже:The formula for the schematic structure of the structural subunits of sulfated hyaluronic acid oleylamide in accordance with the invention is shown below:
- 3 044423- 3 044423
Амиды в соответствии с изобретением устойчивы к тепловой обработке и, следовательно, могут быть стерилизованы в автоклаве, поскольку амидная связь является термоустойчивой. Они также могут быть стерилизованы фильтрованием при 0,2 мкм, могут быть смешаны как с гидрофобными, так и гидрофильными лекарствами, суспендированы или солюбилизированы в водном растворителе с образованием водной суспензии мицеллярных частиц, которые переносят лекарство и регулируют его высвобождение. Водную мицеллярную суспензию можно лиофилизировать, хранить при комнатной температуре и восстанавливать водным растворителем без потери титра активного ингредиента.The amides according to the invention are heat-resistant and can therefore be sterilized in an autoclave since the amide bond is heat-stable. They can also be sterilized by 0.2 micron filtration, mixed with either hydrophobic or hydrophilic drugs, suspended or solubilized in an aqueous solvent to form an aqueous suspension of micellar particles that transport the drug and regulate its release. The aqueous micellar suspension can be lyophilized, stored at room temperature, and reconstituted with an aqueous solvent without loss of active ingredient titer.
Размер мицелл находится в интервале от 5 до 200 нм, предпочтительно от 10 до 50 нм.The size of the micelles is in the range from 5 to 200 nm, preferably from 10 to 50 nm.
Концентрация амида в мицеллярных суспензиях находится в интервале от 4 до 20 мг/мл.The amide concentration in micellar suspensions ranges from 4 to 20 mg/ml.
Предпочтительная концентрация олеиламида равна 13 мг/мл.The preferred concentration of oleylamide is 13 mg/ml.
Примерами лекарственных средств, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, являются рапамицин, триамцинолон, статины (в частности, симвастатин), кальцитонин, RN-1747, 4а-форбол-12,13-дидеканоат (4aPDD), эверолимус, паклитаксел и арахидоновая кислота. Рапамицин особенно предпочтителен.Examples of drugs that can be used in accordance with the invention are rapamycin, triamcinolone, statins (particularly simvastatin), calcitonin, RN-1747, 4a-phorbol-12,13-didecanoate (4aPDD), everolimus, paclitaxel and arachidonic acid. acid. Rapamycin is particularly preferred.
Концентрация лекарства, которое может быть загружено в мицеллярные суспензии в соответствии с изобретением, зависит от гидрофобности самого лекарства и желаемой степени амидирования HAS, и, следовательно, может быть изменена за счет сбалансирования указанных характеристик.The concentration of drug that can be loaded into micellar suspensions according to the invention depends on the hydrophobicity of the drug itself and the desired degree of HAS amidation, and can therefore be varied by balancing these characteristics.
Мицеллярные суспензии в соответствии с изобретением, таким образом, состоят из амидов сульфатированной гиалуроновой кислоты (HAS) со степенью сульфатирования в интервале от 0,5 до 1,5 (HAS-1), от 1,5 до 2,5 (HAS-2) или от 2,5 до 3,5 (HAS-3), полученных из HA со средневесовой MW в интервале от 180000 до 230000 Да или со средневесовой MW в интервале от 500000 до 73000 Да; амидирование проводят C4-C20-алкениламинами, предпочтительно олеиламином, (2E)-гекс-2-ен-1амином и пент-2-ен-1-амианом; степень молярной дериватизации (амидирования) HAS, выраженная в виде отношение моли алкениламина/моли димера HAS, находится в интервале от 5 до 30%; концентрация амида в мицеллярных суспензиях находится в интервале от 4 до 20 мг/мл.The micellar suspensions according to the invention thus consist of sulfated hyaluronic acid amides (HAS) with a degree of sulfation in the range from 0.5 to 1.5 (HAS-1), from 1.5 to 2.5 (HAS-2 ) or from 2.5 to 3.5 (HAS-3), obtained from HA with a weight average MW in the range from 180,000 to 230,000 Da or from a weight average MW in the range from 500,000 to 73,000 Da; amidation is carried out with C4-C 20 -alkenylamines, preferably oleylamine, (2E)-hex-2-en-1amine and pent-2-en-1-amine; the degree of molar derivatization (amidation) of HAS, expressed as the ratio of moles of alkenylamine/moles of HAS dimer, is in the range from 5 to 30%; the amide concentration in micellar suspensions ranges from 4 to 20 mg/ml.
Предпочтительно мицеллярные суспензии в соответствии с изобретением состоят из амидов сульфатированной гиалуроновой кислоты (HAS) со степенью сульфатирования в интервале от 0,5 до 1,5 (HAS-1), полученных из HA со средневесовой MW в интервале от 180000 до 230000 Да; амидирование проводят олеиламином; степень молярной дериватизации (амидирования) HAS, выраженная в виде отношения моли алкениламина/моли димера HAS, находится в интервале от 10 до 17%; концентрация амида в мицеллярных суспензиях предпочтительно равна 13 мг/мл. Мицеллярные суспензии в соответствии с изобретением получают путем диспергирования гидрофобного лекарства в буферном растворе, содержащем амид, затем путем обработки ультразвуком в ультразвуковой ванне и затем фильтрованием через 0,2 мкм фильтр, что делает продукт стерильным. Буфер предпочтительно представляет собой фосфатный буфер PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) при pH 7, 2-Nморфолинометансульфоновую кислоту при pH в интервале от 5 до 8, 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтилсульфоновую кислоту при pH в интервале от 5 до 8, и более предпочтительно представляет собой PBS при pH 7. Если используемое лекарство растворимо в воде, его растворяют, а не диспергируют, в буферном растворе.Preferably, micellar suspensions according to the invention consist of sulfated hyaluronic acid amides (HAS) with a degree of sulfation in the range from 0.5 to 1.5 (HAS-1), derived from HA with a weight average MW in the range from 180,000 to 230,000 Da; amidation is carried out with oleylamine; the degree of molar derivatization (amidation) of HAS, expressed as the ratio of moles of alkenylamine/moles of HAS dimer, is in the range of 10 to 17%; the amide concentration in micellar suspensions is preferably 13 mg/ml. Micellar suspensions according to the invention are prepared by dispersing a hydrophobic drug in a buffer solution containing an amide, then sonicating in an ultrasonic bath and then filtering through a 0.2 μm filter, rendering the product sterile. The buffer is preferably phosphate buffer PBS (phosphate buffered saline) at pH 7, 2-Nmorpholinomethanesulfonic acid at pH ranging from 5 to 8, 4-(2-hydroxyethyl)-1piperazine ethyl sulfonic acid at pH ranging from 5 to 8, and is more preferably PBS at pH 7. If the drug used is water soluble, it is dissolved, rather than dispersed, in a buffer solution.
Таким образом, схематично получение системы стабилизации и контролируемого высвобождения в соответствии с изобретением включает:Thus, schematically, the preparation of the stabilization and controlled release system in accordance with the invention includes:
синтез желаемого сорта HAS в форме натриевой соли из HA-Na или из HA-TBA (тетрабутиламмониевая соль);synthesis of the desired grade of HAS in the form of sodium salt from HA-Na or from HA-TBA (tetrabutylammonium salt);
приготовление бензалкониевой соли (BA) или TBA-соли HAS из HAS-Na;preparing benzalkonium salt (BA) or TBA salt HAS from HAS-Na;
частичную дериватизацию карбоксильных групп HAS-BA или HAS-TBA C4-C20-алкениламином;partial derivatization of carboxyl groups of HAS-BA or HAS-TBA C4-C 20 -alkenylamine;
приготовление рецептуры HAS-алкениламид/лекарство в форме мицеллярной суспензии.preparation of the HAS-alkenylamide/drug formulation in the form of a micellar suspension.
- 4 044423- 4 044423
Мицеллярные суспензии могут быть введены как они есть после стерилизации или могут быть добавлены наполнители, такие как мальтоза, маннит или глюкоза, в концентрации, лежащей в интервале от 1 до 9 мас.%, предпочтительно мальтоза в концентрации 4,5% от массы рецептуры.Micellar suspensions can be administered as is after sterilization or excipients such as maltose, mannitol or glucose can be added at a concentration ranging from 1 to 9% by weight, preferably maltose at a concentration of 4.5% by weight of the formulation.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение более подробно.The following examples illustrate the invention in more detail.
Пример 1. Синтез HAS1.Example 1. Synthesis of HAS1.
1.1. Синтез HAS1-Na из натриевой соли HA.1.1. Synthesis of HAS1-Na from sodium salt HA.
Диспергируют 4,0 г (9,96x10’3 моль; 1 экв.) HA-Na (HA MW 200 кДа) в 220 мл ДМСО и добавляют 3,6 мл метансульфоновой кислоты (5 экв.), после чего смесь оставляют при перемешивании на 24 ч при комнатной температуре (КТ). По окончании растворения добавляют 12,8 г (8 экв.) комплекса пиридин(триоксид серы) (Pyr-SO3). После выдерживания в течение ночи при КТ продукт осаждают этанолом (EtOH); полученный осадок фильтруют через тигель Гуча, промывают дважды EtOH и снова растворяют в 150 мл деионизированной воды; добавляют 8 мл насыщенного раствора NaCl и 115 мл ДМСО и доводят рН до 3,4±0,1 с помощью 3M раствора NaOH. Продукт осаждают 440 мл EtOH; полученный осадок фильтруют через тигель Гуча, промывают смесью EtOH/H2O (80:20) и EtOH и окончательно сушат в вакууме при 37°C.Disperse 4.0 g (9.96 x 10'3 mol; 1 eq.) HA-Na (HA MW 200 kDa) in 220 ml DMSO and add 3.6 ml methanesulfonic acid (5 eq.), after which the mixture is left with stirring for 24 hours at room temperature (RT). After dissolution is complete, 12.8 g (8 eq.) of pyridine (sulfur trioxide) complex (Pyr-SO 3 ) is added. After standing overnight at RT, the product is precipitated with ethanol (EtOH); the resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible, washed twice with EtOH and dissolved again in 150 ml of deionized water; add 8 ml of saturated NaCl solution and 115 ml of DMSO and adjust the pH to 3.4 ± 0.1 with 3M NaOH solution. The product is precipitated with 440 ml EtOH; the resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible, washed with a mixture of EtOH/H 2 O (80:20) and EtOH and finally dried in vacuum at 37°C.
Получают 7,78 г HAS1-Na в виде желтовато-белого порошка. (Выход 97,6%).7.78 g of HAS1-Na are obtained in the form of a yellowish-white powder. (Yield 97.6%).
1.2. Синтез HAS1-Na из TBA-соли HA.1.2. Synthesis of HAS1-Na from the TBA salt of HA.
Растворяют 2,0 г (3,22x10’3 моль; 1 экв.) HA-TBA (HA MW 200 кДа) в 200 мл ДМСО. По окончании растворения добавляют 1,28 г (2,5 экв.) комплекса пиридин-(триоксид серы) (Pyr-SO3). После выдерживания в течение ночи при КТ продукт осаждают этанолом (EtOH); полученный осадок фильтруют через тигель Гуча, промывают дважды EtOH и снова растворяют в 150 мл деионизированной воды; добавляют 8 мл насыщенного раствора NaCl и 115 мл ДМСО и доводят рН до 3,4±0,1 с помощью 3M раствора NaOH. Продукт осаждают 430 мл EtOH; полученный осадок фильтруют через тигель Гуча, промывают смесью EtOH/H2O (80:20) и EtOH и окончательно сушат в вакууме при 37°C.Dissolve 2.0 g (3.22x10'3 mol; 1 eq.) HA-TBA (HA MW 200 kDa) in 200 ml DMSO. After dissolution is complete, 1.28 g (2.5 eq.) of pyridine-(sulfur trioxide) complex (Pyr-SO 3 ) is added. After standing overnight at RT, the product is precipitated with ethanol (EtOH); the resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible, washed twice with EtOH and dissolved again in 150 ml of deionized water; add 8 ml of saturated NaCl solution and 115 ml of DMSO and adjust the pH to 3.4 ± 0.1 with 3M NaOH solution. The product is precipitated with 430 ml EtOH; the resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible, washed with a mixture of EtOH/H 2 O (80:20) and EtOH and finally dried in vacuum at 37°C.
Получают 1,52 г HAS1-Na в виде желтовато-белого порошка. (Выход 93,8%).1.52 g of HAS1-Na are obtained in the form of a yellowish-white powder. (Yield 93.8%).
Пример 2. Синтез конъюгата HAS1-олеиламид [10%] из HAS1-BA (бензалконий).Example 2. Synthesis of HAS1-oleylamide [10%] conjugate from HAS1-BA (benzalkonium).
Растворяют 2,5 г (5,0x10’3 моль, 1 экв.) HAS1-Na в 100 мл деионизированной воды; отдельно растворяют 3,0 г хлорида бензалкония (BA+Cl’) в 100 мл деионизированной воды. По окончании солюбилизации добавляют раствор BA+Cl' к раствору HAS1, в результате получают осадок, который фильтруют через тигель Гуча, промывают в H2O, в этаноле и затем в ацетоне и сушат в роторном испарителе при высоком вакууме. Выделенный осадок HAS1-BA солюбилизируют в 160 мл ДМСО; затем добавляют 0,114 г (0,14 экв.) CDI (карбодиимид) и 0,10 мл метансульфоновой кислоты (0,3 экв.). После перемешивания в течение 30 мин при 40°C добавляют 1,32 мл (0,8 экв.) олеиламина и реакцию проводят в течение ночи при медленном перемешивании при 40°C. На следующий день добавляют 16 мл насыщенного раствора NaCl и продукт осаждают этанолом. Полученный осадок фильтруют через тигель Гуча и промывают 2 объемами смеси этанол/H2O (85:15), затем этанолом и, наконец, ацетоном. Полученный продукт растворяют в 50 мл в деионизированной H2O и подвергают диализу (диализная мембрана Spectra/Por® с отсечкой 12000-14000 Да) в течение 3 дней в буфере PBS (pH 7) и 1 день в H2O. И, наконец, диализированный продукт замораживают и лиофилизируют. Получают 1,9 г желтоватобелого порошка. (Выход 72,2%).Dissolve 2.5 g (5.0 x 10'3 mol, 1 eq.) HAS1-Na in 100 ml deionized water; Separately dissolve 3.0 g of benzalkonium chloride (BA + Cl') in 100 ml of deionized water. Upon completion of solubilization, add the BA+Cl' solution to the HAS1 solution to obtain a precipitate, which is filtered through a Gooch crucible, washed in H 2 O, ethanol and then acetone and dried in a rotary evaporator under high vacuum. The isolated HAS1-BA pellet was solubilized in 160 ml DMSO; then add 0.114 g (0.14 eq.) CDI (carbodiimide) and 0.10 ml methanesulfonic acid (0.3 eq.). After stirring for 30 minutes at 40°C, 1.32 ml (0.8 eq.) of oleylamine is added and the reaction is carried out overnight with slow stirring at 40°C. The next day, 16 ml of saturated NaCl solution is added and the product is precipitated with ethanol. The resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible and washed with 2 volumes of ethanol/H 2 O (85:15), then with ethanol and finally with acetone. The resulting product is dissolved in 50 ml in deionized H2O and dialyzed (Spectra/Por® dialysis membrane with cut-off 12000-14000 Da) for 3 days in PBS buffer (pH 7) and 1 day in H2O. Finally, the dialyzed product is frozen and lyophilized. 1.9 g of yellowish-white powder are obtained. (Yield 72.2%).
Описание. Степень дериватизации рассчитывают с помощью анализа 1H-ЯМР: 20 мг HAS1олеиламид растворяют в 1 мл D2O и анализируют с помощью спектрометра Bruker Advance (300 МГц). Для определения степени дериватизации используют следующие сигналы: δ 0,6-0,9 (т, 3H, HAS1-CONH(CH2)8-CH=CH-(CH2)7-CH3), δ 1,9-1,7 (с, 3H, HAS1-NHCO-CH3) (моли олеиламида относительно молей повторяющегося звена HAS1).Description. The degree of derivatization is calculated using 1 H-NMR analysis: 20 mg HAS1oleylamide is dissolved in 1 ml D2O and analyzed using a Bruker Advance spectrometer (300 MHz). To determine the degree of derivatization, the following signals are used: δ 0.6-0.9 (t, 3H, HAS1-CONH(CH 2 ) 8 -CH=CH-(CH 2 ) 7 -CH 3 ), δ 1.9-1 .7 (s, 3H, HAS1-NHCO-CH3) (moles of oleyl amide relative to moles of HAS1 repeat unit).
Пример 3. Синтез конъюгата HAS1-олеиламид [10%] из HAS1-TBA.Example 3. Synthesis of HAS1-oleylamide [10%] conjugate from HAS1-TBA.
а) Приблизительно 10 г сульфоновой смолы Amberlyst промывают 5 раз водой сорта MilliQ в колонке с рубашкой (смола занимает приблизительно половину объема колонки). Добавляют 20 мл 55%ного раствора TBA-OH, встряхивают и оставляют в контакте со смолой на 2 ч при КТ. Смолу промывают приблизительно 0,5 л MilliQ H2O, пока рН элюата не упадет ниже 10,5 (pH 10,48).a) Approximately 10 g of Amberlyst sulfone resin is washed 5 times with MilliQ grade water in a jacketed column (the resin occupies approximately half the column volume). Add 20 ml of 55% TBA-OH solution, shake and leave in contact with the resin for 2 hours at RT. The resin is washed with approximately 0.5 L of MilliQ H2O until the pH of the eluate drops below 10.5 (pH 10.48).
Загружают 2,5 г (5,0x10’3 моль, 1 экв.) соли HAS1-Na, растворенной в 30 мл H2O, процеживают при скорости 5 мл/мин и промывают дополнительно 60 мл. Элюат собирают, замораживают и лиофилизируют; получают 3,9 г соли HAS1-TBA в форме светло-желтого лиофилизата.Load 2.5 g (5.0 x 10’3 mol, 1 eq.) of HAS1-Na salt dissolved in 30 ml of H2O, filter at a speed of 5 ml/min and wash with an additional 60 ml. The eluate is collected, frozen and lyophilized; 3.9 g of HAS1-TBA salt are obtained in the form of a light yellow lyophilisate.
b) Выделенное производное HAS1-TBA солюбилизируют в 160 мл ДМСО; затем добавляют 0,114 г (0,14 экв.) CDI (карбодиимид) и 0,10 мл метансульфоновой кислоты (0,3 экв.). После перемешивания в течение 30 мин при 40°C добавляют 1,32 мл (0,8 экв.) олеиламина и реакцию проводят в течение ночи при медленном перемешивании при 40°C. На следующий день добавляют 16 мл насыщенного раствора NaCl и продукт осаждают этанолом. Полученный осадок фильтруют через тигель Гуча и промывают 2 объемами смеси этанол/H2O (85:15), затем этанолом и, наконец, ацетоном.b) The isolated HAS1-TBA derivative is solubilized in 160 ml DMSO; then add 0.114 g (0.14 eq.) CDI (carbodiimide) and 0.10 ml methanesulfonic acid (0.3 eq.). After stirring for 30 minutes at 40°C, 1.32 ml (0.8 eq.) of oleylamine is added and the reaction is carried out overnight with slow stirring at 40°C. The next day, 16 ml of saturated NaCl solution is added and the product is precipitated with ethanol. The resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible and washed with 2 volumes of ethanol/H 2 O (85:15), then with ethanol and finally with acetone.
Получают 2,5 г желтовато-белого порошка. (Выход 94,1%).2.5 g of yellowish-white powder are obtained. (Yield 94.1%).
- 5 044423- 5 044423
После описания с использованием анализа 1Н-ЯМР, как описано в примере 2, определяют степень дериватизации 10,6±0,8% моль/моль (молей олеиламида относительно молей повторяющегося звенаAfter characterization using 1H-NMR analysis as described in Example 2, the degree of derivatization was determined to be 10.6 ± 0.8% mol/mol (moles of oleylamide relative to moles of repeat unit
HAS1).HAS1).
Пример 4. Синтез HAS1-олеиламид [17%] из HAS1-TBA.Example 4. Synthesis of HAS1-oleylamide [17%] from HAS1-TBA.
После получения производного HAS1-TBA, как описано в примере 3, пункт a), синтез проводят следующим образом.After obtaining the HAS1-TBA derivative as described in example 3, point a), the synthesis is carried out as follows.
Солюбилизируют 2,5 г (5,0x10’3 моль, 1 экв.) выделенного производного HAS1-TBA в 160 мл ДМСО; затем добавляют 0,163 г (0,2 экв.) CDI (карбодиимид) и 0,10 мл метансульфоновой кислоты (0,3 экв.). После перемешивания в течение 30 мин при 40°C добавляют 1,32 мл (0,8 экв.) олеиламина и реакцию проводят в течение ночи при медленном перемешивании при 40°C. На следующий день добавляют 16 мл насыщенного раствора NaCl и продукт осаждают этанолом. Полученный осадок фильтруют через тигель Гуча и промывают 2 объемами смеси этанол/Н2О (85:15), затем этанолом и, наконец, ацетоном. Получают 2,6 г рыхлого белого продукта. (Выход 96,1%).Solubilize 2.5 g (5.0x10'3 mol, 1 eq.) of the isolated HAS1-TBA derivative in 160 ml of DMSO; then add 0.163 g (0.2 eq.) CDI (carbodiimide) and 0.10 ml methanesulfonic acid (0.3 eq.). After stirring for 30 minutes at 40°C, 1.32 ml (0.8 eq.) of oleylamine is added and the reaction is carried out overnight with slow stirring at 40°C. The next day, 16 ml of saturated NaCl solution is added and the product is precipitated with ethanol. The resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible and washed with 2 volumes of ethanol/H 2 O (85:15), then with ethanol and finally with acetone. 2.6 g of a fluffy white product are obtained. (Yield 96.1%).
После описания с использованием анализа 1Н-ЯМР, как описано в примере 2, определяют степень дериватизации 17,3±1,2% моль/моль (молей олеиламида относительно молей повторяющегося звена HAS1).After characterization using 1H-NMR analysis as described in Example 2, the degree of derivatization was determined to be 17.3 ± 1.2% mol/mol (moles of oleylamide relative to moles of HAS1 repeat unit).
Пример 5. Синтез HAS1’Oлеиламид [25%] из HAS1-TBA.Example 5. Synthesis of HAS1'Oleylamide [25%] from HAS1-TBA.
После получения производного HAS1-TBA, как описано в примере 3, пункт а), синтез проводят следующим образом.After obtaining the HAS1-TBA derivative as described in example 3, point a), the synthesis is carried out as follows.
Солюбилизируют 2,5 г (5,0x10’3 моль, 1 экв.) выделенного производного HAS1-TBA в 160 мл ДМСО; затем добавляют 0,285 г (0,35 экв.) CDI (карбодиимид) и 0,15 мл метансульфоновой кислоты (0,45 экв.). После перемешивания в течение 30 мин при 40°C добавляют 1,32 мл (0,8 экв.) олеиламина и реакцию проводят в течение ночи при медленном перемешивании при 40°C. На следующий день добавляют 16 мл насыщенного раствора NaCl и продукт осаждают этанолом. Полученный осадок фильтруют через тигель Гуча и промывают 2 объемами смеси этанол/Н2О (85:15), затем этанолом и, наконец, ацетоном. Получают 2,6 г рыхлого белого продукта. (Выход 94,5%).Solubilize 2.5 g (5.0x10'3 mol, 1 eq.) of the isolated HAS1-TBA derivative in 160 ml of DMSO; then add 0.285 g (0.35 eq.) CDI (carbodiimide) and 0.15 ml methanesulfonic acid (0.45 eq.). After stirring for 30 minutes at 40°C, 1.32 ml (0.8 eq.) of oleylamine is added and the reaction is carried out overnight with slow stirring at 40°C. The next day, 16 ml of saturated NaCl solution is added and the product is precipitated with ethanol. The resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible and washed with 2 volumes of ethanol/H 2 O (85:15), then with ethanol and finally with acetone. 2.6 g of a fluffy white product are obtained. (Yield 94.5%).
После описания с помощью анализа 1Н-ЯМР, как описано в примере 2, определяют степень дериватизации 24,5±1,5% моль/моль (молей олеиламида относительно молей повторяющегося звена HAS1).After characterization by 1H-NMR analysis as described in Example 2, the degree of derivatization was determined to be 24.5 ± 1.5% mol/mol (moles of oleyl amide relative to moles of HAS1 repeat unit).
Пример 6. Синтез HAS2’Oлеиламид [10%] из HAS2-TBA.Example 6. Synthesis of HAS2'Oleylamide [10%] from HAS2-TBA.
Получают HAS2 по методике, описанной в примере 1.1, только меняют количество используемого комплекса пиридин-(триоксид серы) (Pyr^SO3) (16 г).HAS2 is obtained according to the method described in example 1.1, only the amount of pyridine-(sulfur trioxide) complex (Pyr^SO 3 ) (16 g) used is changed.
После получения производного HAS2-TBA, как описано в примере 3, пункт а), синтез проводят следующим образом.After obtaining the HAS2-TBA derivative as described in example 3, point a), the synthesis is carried out as follows.
Солюбилизируют 2 г (3,3x10’3 моль, 1 экв.) соли HAS2-TBA в 160 мл ДМСО; затем добавляют 0,074 г (0,14 экв.) CDI (карбодиимид) и 0,06 мл метансульфоновой кислоты (0,3 экв.). После перемешивания в течение 30 мин при 40°C добавляют 1,08 мл (0,8 экв.) олеиламина и реакцию проводят в течение ночи при медленном перемешивании при 40°C. На следующий день добавляют 16 мл насыщенного раствора NaCl и продукт осаждают этанолом. Полученный осадок фильтруют через тигель Гуча и промывают 2 объемами смеси этанол/Н2О (85:15), затем этанолом и, наконец, ацетоном.Solubilize 2 g (3.3x10'3 mol, 1 eq.) HAS2-TBA salt in 160 ml DMSO; then add 0.074 g (0.14 eq.) CDI (carbodiimide) and 0.06 ml methanesulfonic acid (0.3 eq.). After stirring for 30 minutes at 40°C, 1.08 ml (0.8 eq.) of oleylamine is added and the reaction is carried out overnight with slow stirring at 40°C. The next day, 16 ml of saturated NaCl solution is added and the product is precipitated with ethanol. The resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible and washed with 2 volumes of ethanol/H 2 O (85:15), then with ethanol and finally with acetone.
Получают 2,0 г рыхлого светло-желтого-белого продукта. (Выход 94,5%).2.0 g of a fluffy light yellow-white product are obtained. (Yield 94.5%).
После описания с использованием анализа 1Н-ЯМР, как описано в примере 2, определяют степень дериватизации 9,8±0,6% моль/моль (молей олеиламида относительно молей повторяющегося звена HAS2).After characterization using 1H-NMR analysis as described in Example 2, the degree of derivatization was determined to be 9.8 ± 0.6% mol/mol (moles of oleylamide relative to moles of HAS2 repeat unit).
Пример 7. Синтез HAS3-олеиламид [11%] из HAS3-TBA.Example 7 Synthesis of HAS3-oleylamide [11%] from HAS3-TBA.
Получают HAS3 по методике, описанной в примере 1.1, только меняют количество используемого комплекса пиридин-(триоксид серы) (Pyr-SO3) (20,8 г).HAS3 is obtained according to the method described in example 1.1, only the amount of pyridine-(sulfur trioxide) complex (Pyr-SO 3 ) used (20.8 g) is changed.
После получения производного HAS3-TBA, как описано в примере 3, пункт а), синтез проводят следующим образом.After obtaining the HAS3-TBA derivative as described in example 3, point a), the synthesis is carried out as follows.
Солюбилизируют 2 г (2,8x10’3 моль, 1 экв.) соли HAS3-TBA в 160 мл ДМСО; затем добавляют 0,063 г (0,14 экв.) CDI (карбодиимид) и 0,05 мл метансульфоновой кислоты (0,3 экв.). После перемешивания в течение 30 мин при 40°C добавляют 0,73 мл (0,8 экв.) олеиламина и реакцию проводят в течение ночи при медленном перемешивании при 40°C. На следующий день добавляют 16 мл насыщенного раствора NaCl и продукт осаждают этанолом. Полученный осадок фильтруют через тигель Гуча и промывают 2 объемами смеси этанол/Н2О (85:15), затем этанолом и, наконец, ацетоном.Solubilize 2 g (2.8x10'3 mol, 1 eq.) HAS3-TBA salt in 160 ml DMSO; then add 0.063 g (0.14 eq.) CDI (carbodiimide) and 0.05 ml methanesulfonic acid (0.3 eq.). After stirring for 30 minutes at 40°C, 0.73 ml (0.8 eq.) of oleylamine is added and the reaction is carried out overnight with slow stirring at 40°C. The next day, 16 ml of saturated NaCl solution is added and the product is precipitated with ethanol. The resulting precipitate is filtered through a Gooch crucible and washed with 2 volumes of ethanol/H 2 O (85:15), then with ethanol and finally with acetone.
Получают 1,7 г рыхлого светло-желто-белого продукта. (Выход 93,9%).1.7 g of a fluffy light yellow-white product are obtained. (Yield 93.9%).
После описания с использованием анализа 1Н-ЯМР, как описано в примере 2, определяют степень дериватизации 11,1±0,6% моль/моль (молей олеиламида относительно молей повторяющегося звена HAS3).After characterization using 1H-NMR analysis as described in Example 2, the degree of derivatization was determined to be 11.1 ± 0.6% mol/mol (moles of oleylamide relative to moles of HAS3 repeat unit).
Пример 8. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/рапамицин.Example 8 Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/rapamycin formulation.
Взвешивают 65 мг конъюгата HAS1-олеиламид, полученного в примере 3 (дериватизация 10% моль), в пробирке на 50 мл и добавляют 20 мг рапамицина (1CHEM LP) и 5,0 мл PBS (pH 7). СуспензиюWeigh 65 mg of the HAS1-oleylamide conjugate prepared in Example 3 (10 mol% derivatization) into a 50 ml tube and add 20 mg of rapamycin (1CHEM LP) and 5.0 ml of PBS (pH 7). Suspension
- 6 044423 оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.- 6 044423 leave with stirring for 2 hours at room temperature and sonicate for 10 minutes (Sonifer 250 ultrasonicator), then filter at 0.2 μm with a Sartorius cellulose acetate filter.
Анализ содержания рапамицина в рецептуре.Analysis of rapamycin content in the formulation.
Система ВЭЖХ-МС (HPLC-MS) Agilent 1260: колонка Kinetex C8; расход: 0,35 мл/мин; УФ детектор при 216 нм; подвижная фаза (ПФ (MP)): ацетат аммония (2 г/л) (A); ацетонитрил (B); градиент: 40% подвижной фазы (B) в течение 3 мин, затем градиент от 40 до 97% (B) за 4 мин.HPLC-MS system Agilent 1260: Kinetex C8 column; flow rate: 0.35 ml/min; UV detector at 216 nm; mobile phase (MP): ammonium acetate (2 g/l) (A); acetonitrile (B); gradient: 40% mobile phase (B) over 3 min, then gradient from 40 to 97% (B) over 4 min.
Система калибрована путем впрыскивания стандарта рапамицина при 0,14 мг/мл (рапамицин растворяют до 1,4 мг/мл в ацетонитриле (ACN) и разбавляют 1:10 с помощью ПФ (40% (B)/60% (A)). Время удерживания составляет 7,6 мин.The system is calibrated by injecting a rapamycin standard at 0.14 mg/mL (rapamycin is dissolved to 1.4 mg/mL in acetonitrile (ACN) and diluted 1:10 with PF (40% (B)/60% (A)). The retention time is 7.6 minutes.
Рецептуру HAS1-олеиламид/рапамицин разбавляют 1:3 в ПФ (40% (B)/60% (A) и вводят напрямую в ВЭЖХ. Время удерживания рапамицина 7,6 мин. Количественный анализ проводят с учетом площади стандарта рапамицина. МС анализ подтверждает структуру рапамицина и отсутствие продуктов разложения (теоретический МС 914,2; измеренный 914,3+Na+). Содержание рапамицина, определенное в рецептуре, составляет 0,16 мг/мл.The HAS1-oleylamide/rapamycin formulation is diluted 1:3 in PF (40% (B)/60% (A) and injected directly into HPLC. Rapamycin retention time is 7.6 min. Quantitative analysis is carried out taking into account the area of the rapamycin standard. MS analysis confirms structure of rapamycin and the absence of degradation products (theoretical MS 914.2; measured 914.3+Na+) The rapamycin content determined in the formulation is 0.16 mg/ml.
Пример 9. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (9 мг/мл)/рапамицин.Example 9 Preparation of HAS1-oleylamide (9 mg/ml)/rapamycin formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 3 (дериватизация 10% моль), в пробирке объемом 50 мл и добавляют 20 мг рапамицина (1CHEM LP) и 5,0 мл PBS (pH 7). Суспензию оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide prepared as in Example 3 (10 mol% derivatization) in a 50 ml tube and add 20 mg of rapamycin (1CHEM LP) and 5.0 ml of PBS (pH 7). The suspension is left stirring for 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 sonicator), then filtered at 0.2 μm with a Sartorius cellulose acetate filter.
Содержание рапамицина в рецептуре, проанализированное как в примере 8, равно 0,15 мг/мл.The rapamycin content of the formulation, analyzed as in Example 8, is 0.15 mg/ml.
Пример 10. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/рапамицин.Example 10 Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/rapamycin formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 4 (дериватизация 17% мол.), в пробирке объемом 50 мл и добавляют 20 мг рапамицина (1CHEM LP) и 5,0 мл PBS (pH 7). Суспензию оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide prepared as in Example 4 (17 mol% derivatization) in a 50 ml tube and add 20 mg of rapamycin (1CHEM LP) and 5.0 ml of PBS (pH 7). The suspension is left stirring for 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 sonicator), then filtered at 0.2 μm with a Sartorius cellulose acetate filter.
Содержание рапамицина в рецептуре, проанализированное как в примере 8, равно 0,21 мг/мл.The rapamycin content of the formulation, analyzed as in Example 8, is 0.21 mg/ml.
Пример 11 (сравнительный). Приготовление рецептуры рапамицина в PBS.Example 11 (comparative). Preparation of rapamycin formulation in PBS.
Взвешивают 20 мг рапамицина в пробирке объемом 50 мл и добавляют 5,0 мл PBS (pH 7); суспензию оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы. Содержание рапамицина в рецептуре, проанализированное как в примере 8, составляет 0,00 мг/мл.Weigh 20 mg rapamycin into a 50 ml tube and add 5.0 ml PBS (pH 7); the suspension is left stirring for 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 ultrasonicator), then filtered at 0.2 μm with a Sartorius cellulose acetate filter. The rapamycin content of the formulation, analyzed as in Example 8, is 0.00 mg/ml.
Пример 12. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/RN-1747.Example 12. Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/RN-1747 formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 3 (дериватизация 10% мол.), в пробирке объемом 50 мл и добавляют 21,5 мг RN-1747 (Key Organics), 4,0 мл PBS (pH 7) и 0,5 мл 1M HCl; суспензию оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), доводят до pH 7 с помощью 0,5 мл 1M раствора NaOH, а затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide prepared as in Example 3 (10 mol% derivatization) in a 50 ml tube and add 21.5 mg RN-1747 (Key Organics), 4.0 ml PBS (pH 7) and 0 .5 ml 1M HCl; the suspension is left stirring for 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 ultrasonicator), adjusted to pH 7 with 0.5 ml of 1 M NaOH solution, and then filtered at 0.2 µm with a Sartorius filter from cellulose acetate.
Анализ содержания RN-1747 в рецептуре.Analysis of RN-1747 content in the formulation.
Система ВЭЖХ-МС Agilent 1260 (ВЭЖХ-МС): колонка Kinetex C8; расход: 0,35 мл/мин; УФ детектор при 216 нм; подвижная фаза (ПФ (MP)): ацетат аммония (2 г/л) (A); ацетонитрил (B); градиент: 20% подвижной фазы (B) в течение 3 мин, затем градиент от 20 до 97% (B) за 4 мин.Agilent 1260 HPLC-MS system (HPLC-MS): Kinetex C8 column; flow rate: 0.35 ml/min; UV detector at 216 nm; mobile phase (MP): ammonium acetate (2 g/l) (A); acetonitrile (B); gradient: 20% mobile phase (B) over 3 min, then gradient from 20 to 97% (B) over 4 min.
Система калибрована путем впрыскивания стандарта RN-1747 при 0,15 мг/мл (RN-1747 растворяют до 1,5 мг/мл в ACN и разбавляют 1:10 с помощью ПФ ((20% (B)/80% (A)). Время удерживания: 8,4 мин.The system is calibrated by injecting the RN-1747 standard at 0.15 mg/ml (RN-1747 is dissolved to 1.5 mg/ml in ACN and diluted 1:10 with PF ((20% (B)/80% (A) Retention time: 8.4 min.
Рецептуру HAS1-олеиламид/RN-1747 разбавляют 1:3 в ПФ (20% (B)/80% (A)) и вводят напрямую в ВЭЖХ. Время удерживания RN-1747 составляет 8,4 мин. Количественный анализ проводят с учетом площади стандарта RN-1747. МС анализ подтверждает структуру RN-1747 и отсутствие продуктов разложения (теоретический МС 395,9; измеренный 395,5+Na+). Содержание RN-1747, найденное в рецептуре, составляет 0,44 мг/мл.The HAS1-oleylamide/RN-1747 formulation is diluted 1:3 in PF (20% (B)/80% (A)) and injected directly into the HPLC. The retention time of RN-1747 is 8.4 minutes. Quantitative analysis is carried out taking into account the area of the RN-1747 standard. MS analysis confirms the structure of RN-1747 and the absence of degradation products (theoretical MS 395.9; measured 395.5+Na+). The content of RN-1747 found in the formulation is 0.44 mg/ml.
Пример 13. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/симвастатин.Example 13 Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/simvastatin formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 3 (дериватизация 10% мол.), в пробирке объемом 50 мл и добавляют 20,5 мг симвастатина (Fluorochem) и 5,0 мл PBS (pH 7); суспензию оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), доводят до pH 7 с помощью 0,5 мл 1M раствора NaOH и затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide prepared as in Example 3 (10 mol% derivatization) in a 50 ml tube and add 20.5 mg of simvastatin (Fluorochem) and 5.0 ml of PBS (pH 7); the suspension is left stirred for 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 sonicator), adjusted to pH 7 with 0.5 ml of 1 M NaOH and then filtered at 0.2 µm with a Sartorius acetate filter cellulose.
Анализ содержания симвастатина в рецептуре.Analysis of simvastatin content in the formulation.
Система ВЭЖХ-МС Agilent 1260: колонка Kinetex C8; расход: 0,35 мл/мин; УФ детектор при 216 нм; подвижная фаза: ацетат аммония (2 г/л) (A); ацетонитрил (B); градиент: 40% подвижной фазы (B) в течение 3 мин, затем градиент от 40 до 97% (B) за 4 мин.Agilent 1260 HPLC-MS system: Kinetex C8 column; flow rate: 0.35 ml/min; UV detector at 216 nm; mobile phase: ammonium acetate (2 g/l) (A); acetonitrile (B); gradient: 40% mobile phase (B) over 3 min, then gradient from 40 to 97% (B) over 4 min.
- 7 044423- 7 044423
Система калибрована путем впрыскивания стандарта симвастатина при 0,3 мг/мл (симвастатин растворяют до 3,0 мг/мл в ACN и разбавляют 1:10 с помощью ПФ ((40% (B)/60% (A)). Время удерживания: 7,1 мин.The system is calibrated by injecting a simvastatin standard at 0.3 mg/mL (simvastatin is dissolved to 3.0 mg/mL in ACN and diluted 1:10 with PF ((40% (B)/60% (A)). Retention time : 7.1 min.
Рецептуру HAS1-олеиламид/симвастатин разбавляют 1:3 в ПФ (40% (B)/60% (A) и вводят напрямую в ВЭЖХ. Время удерживания симвастатина равно 7,1 мин. Количественный анализ проводят с учетом площади стандарта симвастатина. МС анализ подтверждает структуру симвастатина и отсутствие продуктов разложения (теоретический МС 418,3; измеренный 418,6+Na+). Содержание симвастатина, найденное в рецептуре, составляет 0,20 мг/мл.The HAS1-oleylamide/simvastatin formulation is diluted 1:3 in PF (40% (B)/60% (A) and injected directly into the HPLC. Simvastatin retention time is 7.1 min. Quantitative analysis is carried out taking into account the area of the simvastatin standard. MS analysis confirms the structure of simvastatin and the absence of degradation products (theoretical MS 418.3; measured 418.6+Na+) The content of simvastatin found in the formulation is 0.20 mg/ml.
Пример 14. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/ацетонид триамцинолона.Example 14 Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/triamcinolone acetonide formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 3 (дериватизация 10% мол.), в пробирке объемом 50 мл и добавляют 20,5 мг ацетонида триамцинолона (Spectrum) и 5,0 мл PBS (pH 7); суспензию оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), доводят до pH 7 с помощью 0,5 мл 1M раствора NaOH и затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide prepared as in Example 3 (10 mol% derivatization) in a 50 ml tube and add 20.5 mg of triamcinolone acetonide (Spectrum) and 5.0 ml of PBS (pH 7); the suspension is left stirred for 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 sonicator), adjusted to pH 7 with 0.5 ml of 1 M NaOH and then filtered at 0.2 µm with a Sartorius acetate filter cellulose.
Анализ содержания ацетонида триамцинолона в рецептуре.Analysis of the content of triamcinolone acetonide in the formulation.
Система ВЭЖХ-МС Agilent 1260: колонка Kinetex C8; расход: 0,35 мл/мин; УФ детектор при 216 нм; подвижная фаза (ПФ (MP)): ацетат аммония (2 г/л) (A); ацетонитрил (B); градиент: 20% подвижной фазы (B) в течение 3 мин, затем градиент от 20 до 97% (B) за 4 мин.Agilent 1260 HPLC-MS system: Kinetex C8 column; flow rate: 0.35 ml/min; UV detector at 216 nm; mobile phase (MP): ammonium acetate (2 g/l) (A); acetonitrile (B); gradient: 20% mobile phase (B) over 3 min, then gradient from 20 to 97% (B) over 4 min.
Система калибрована путем впрыскивания стандарта ацетонида триамцинолона при 0,3 мг/мл (триамцинолон растворяют до 3,0 мг/мл в ACN и разбавляют 1:10 с помощью ПФ ((20% (B)/80% (A)). Время удерживания: 8,6 мин.The system is calibrated by injecting a triamcinolone acetonide standard at 0.3 mg/ml (triamcinolone is dissolved to 3.0 mg/ml in ACN and diluted 1:10 with PF ((20% (B)/80% (A)). Time retention: 8.6 min.
Рецептуру HAS1-олеиламид/триамцинолон разбавляют 1:3 в ПФ (20% (B)/80% (A)) и вводят напрямую в ВЭЖХ. Время удерживания триамцинолона равно 8,6 мин. Количественный анализ проводят с учетом площади стандарта триамцинолона. МС анализ подтверждает структуру гексаацетонида триамцинолона и отсутствие продуктов разложения (теоретический МС 532,6; измеренный 532,3+Na+).The HAS1-oleylamide/triamcinolone formulation is diluted 1:3 in PF (20% (B)/80% (A)) and injected directly into the HPLC. The retention time of triamcinolone is 8.6 minutes. Quantitative analysis is carried out taking into account the area of the triamcinolone standard. MS analysis confirms the structure of triamcinolone hexaacetonide and the absence of degradation products (theoretical MS 532.6; measured 532.3+Na + ).
Содержание гексаацетонида триамцинолона, найденное в рецептуре, составляет 0,02 мг/мл.The content of triamcinolone hexaacetonide found in the formulation is 0.02 mg/ml.
Пример 15. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/кальцитонин лососевых рыб.Example 15. Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/salmon calcitonin formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 3 (дериватизация 10% мол.), в пробирке объемом 10 мл; добавляют 16,0 мг кальцитонина лососевых рыб (Bachem) и 5,0 мл 0,2M раствора CH3COONH4 (pH 5,2), раствор оставляют при перемешивании на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), затем фильтруют при 0,2 мкм через фильтр Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide, obtained as in example 3 (derivatization 10 mol.%), in a 10 ml test tube; add 16.0 mg of salmon calcitonin (Bachem) and 5.0 ml of a 0.2 M solution of CH 3 COONH 4 (pH 5.2), the solution is left with stirring for 2 hours at room temperature and treated with ultrasound for 10 minutes (ultrasonic Sonifer 250 apparatus), then filtered at 0.2 µm through a Sartorius cellulose acetate filter.
Анализ содержания кальцитонина в рецептуре.Analysis of calcitonin content in the recipe.
Система ВЭЖХ-МС Agilent 1260: колонка Kinetex C8; расход: 0,35 мл/мин; УФ детектор при 254 нм; подвижная фаза (ПФ (MP)): ацетат аммония (2 г/л) (A); ацетонитрил (B); градиент: 15% подвижной фазы (B) в течение 3 мин, затем градиент от 15 до 97% (B) за 4 мин.Agilent 1260 HPLC-MS system: Kinetex C8 column; flow rate: 0.35 ml/min; UV detector at 254 nm; mobile phase (MP): ammonium acetate (2 g/l) (A); acetonitrile (B); gradient: 15% mobile phase (B) over 3 min, then gradient from 15 to 97% (B) over 4 min.
Система калибрована путем впрыскивания стандарта кальцитонина лососевых рыб при 0,8 мг/мл (кальцитонин растворяют до 8,0 мг/мл в ACN и разбавляют 1:10 с помощью ПФ ((15% (B)/85% (A)). Время удерживания: 7,4 мин.The system is calibrated by injecting a salmon calcitonin standard at 0.8 mg/ml (calcitonin is dissolved to 8.0 mg/ml in ACN and diluted 1:10 with PF ((15% (B)/85% (A)). Retention time: 7.4 min.
Рецептуру HAS1-олеиламид/кальцитонин лососевых рыб разбавляют 1:3 в ПФ (15% (B)/85% (A)) и вводят напрямую в ВЭЖХ. Время удерживания кальцитонина равно 7,4 мин. Количественный анализ проводят с учетом площади стандарта кальцитонина лососевых рыб. МС анализ подтверждает структуру кальцитонина лососевых рыб и отсутствие продуктов разложения (теоретический МС 3431,9; измеренный: (1144,4=3430,2+3H+)/3).The HAS1-oleylamide/salmon calcitonin formulation is diluted 1:3 in PF (15% (B)/85% (A)) and injected directly into the HPLC. The retention time of calcitonin is 7.4 minutes. Quantitative analysis is carried out taking into account the area of the salmon calcitonin standard. MS analysis confirms the structure of salmon calcitonin and the absence of degradation products (theoretical MS 3431.9; measured: (1144.4=3430.2+3H + )/3).
Содержание кальцитонина лососевых рыб, найденное в рецептуре, составляет 3,2 мг/мл.The salmon calcitonin content found in the formulation is 3.2 mg/ml.
Когда рецептуры, описанные в примерах 9-17, должны быть лиофилизированы, рекомендуется добавлять наполнитель, выбранный из мальтозы, маннита и глюкозы, предпочтительно мальтозу, в количестве 4,5% мас./мас. Добавление следует проводить после обработки ультразвуком и перед фильтрованием через 0,2 мкм фильтр.When the formulations described in Examples 9-17 are to be lyophilized, it is recommended to add a filler selected from maltose, mannitol and glucose, preferably maltose, in an amount of 4.5% w/w. Addition should be carried out after sonication and before filtration through a 0.2 µm filter.
Пример 16. Приготовление рецептуры HAS1-олеиламид (13 мг/мл)/паклитаксел.Example 16 Preparation of HAS1-oleylamide (13 mg/ml)/paclitaxel formulation.
Взвешивают 65 мг HAS1-олеиламида, полученного как в примере 4 (дериватизация 17% мол.), в пробирке объемом 50 мл и добавляют 20 мг паклитаксела и 5,0 мл PBS (pH 7). Суспензию оставляют при перемешивании приблизительно на 2 ч при комнатной температуре и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин (ультразвуковой аппарат Sonifer 250), затем фильтруют при 0,2 мкм с фильтром Sartorius из ацетата целлюлозы.Weigh 65 mg of HAS1-oleylamide prepared as in Example 4 (17 mol% derivatization) in a 50 ml tube and add 20 mg of paclitaxel and 5.0 ml of PBS (pH 7). The suspension is left stirring for approximately 2 hours at room temperature and sonicated for 10 minutes (Sonifer 250 sonicator), then filtered at 0.2 μm with a Sartorius cellulose acetate filter.
Анализ содержания паклитаксела в рецептуре.Analysis of paclitaxel content in the formulation.
Система ВЭЖХ-МС Agilent 1260: колонка Kinetex C18; расход: 1,0 мл/мин; УФ детектор при 220 нм; подвижная фаза (ПФ (MP)): ацетат аммония (2 г/л) (A); ацетонитрил (B); градиент: 1% подвижной фазы (B) в течение 3 мин, затем градиент от 5 до 95% (B) за 10 мин.Agilent 1260 HPLC-MS system: Kinetex C18 column; flow rate: 1.0 ml/min; UV detector at 220 nm; mobile phase (MP): ammonium acetate (2 g/l) (A); acetonitrile (B); gradient: 1% mobile phase (B) over 3 min, then gradient from 5 to 95% (B) over 10 min.
Система калибрована путем впрыскивания стандарта паклитаксела (растворенного в ацетонитриле) при 0,46 мг/мл.The system is calibrated by injecting a paclitaxel standard (dissolved in acetonitrile) at 0.46 mg/ml.
- 8 044423- 8 044423
Рецептуру HASl-олеиламид/паклитаксел разбавляют 1:3 в ацетонитриле и вводят напрямую вThe HASl-oleylamide/paclitaxel formulation is diluted 1:3 in acetonitrile and injected directly into
ВЭЖХ. Время удерживания паклитаксела равно 11,3 мин. Количественный анализ проводят с учетом площади стандарта паклитаксела. МС анализ подтверждает структуру паклитаксела и отсутствие продуктов разложения (теоретический МС; измеренный 853,9+Na+). Содержание паклитаксела, найденное в рецептуре, составляет 0,23 мг/мл.HPLC. The retention time of paclitaxel is 11.3 minutes. Quantitative analysis is carried out taking into account the area of the paclitaxel standard. MS analysis confirms the structure of paclitaxel and the absence of degradation products (theoretical MS; measured 853.9+Na+). The content of paclitaxel found in the formulation is 0.23 mg/ml.
Пример 17. Тест на образование мицелл.Example 17 Micelle formation test.
Образование мицелл, способных нести гидрофобные активные ингредиенты, продемонстрировано с помощью электронной просвечивающей микроскопии (ПЭМ (TEM)).The formation of micelles capable of carrying hydrophobic active ingredients was demonstrated using transmission electron microscopy (TEM).
Помещают 25 мкл рецептуры примера 8, разбавленной до 0,2 мг/мл, на сетку 400 меш; после окрашивания 1%-ным уранилацетатом образец изучают в просвечивающем электронном микроскопе TecnaiGA2(FEI), работающем при 100 кВ. Изображения получают с помощью цифровой камеры Veleta (Olympus Soft Imaging System). Обнаружено образование совместимых с мицеллярной системой везикул, имеющих средний диаметр в интервале от 10 до 50 нм (фиг. 1).Place 25 μl of the formulation of Example 8, diluted to 0.2 mg/ml, on a 400 mesh grid; After staining with 1% uranyl acetate, the sample is examined in a TecnaiG A 2(FEI) transmission electron microscope operating at 100 kV. Images are acquired using a Veleta digital camera (Olympus Soft Imaging System). The formation of vesicles compatible with the micellar system, having an average diameter in the range from 10 to 50 nm, was detected (Fig. 1).
Пример 18. Оценка стабильности стерилизованных рецептур при хранении и лиофилизации.Example 18. Evaluation of the stability of sterilized formulations during storage and lyophilization.
Проведены экспериментальные тесты, чтобы оценить влияние лиофилизации рецептур по изобретению на содержание активного ингредиента. В частности, испытывают рецептуру примера 8 с добавлением 0,23 г мальтозы (4,5 мас./мас.%) перед фильтрованием через 0,2 мкм фильтр.Experimental tests were carried out to evaluate the effect of lyophilization of the formulations according to the invention on the content of the active ingredient. In particular, the formulation of Example 8 was tested with the addition of 0.23 g maltose (4.5 w/w%) before filtering through a 0.2 μm filter.
Полученный профильтрованный раствор делят в стерильных условиях между флаконами на 1 мл (9x1 мл) (по 0,5 мл на флакон). Флаконы помещают в лиофилизатор (Epsilon 2-6DLS plus); зонд лиофилизатора помещают на один из них (начальная температура замораживания: при 40°C; замораживание образца: -17°C; температура лиофилизации: -29°C). Вакуум на стадии лиофилизации устанавливают на 0,08 бар; лиофилизированные образцы имеют внешний вид несплющенного светложелто-белого осадка.The resulting filtered solution is divided under sterile conditions between 1 ml bottles (9x1 ml) (0.5 ml per bottle). The vials are placed in a lyophilizer (Epsilon 2-6DLS plus); the lyophilizer probe is placed on one of them (initial freezing temperature: at 40°C; sample freezing: -17°C; lyophilization temperature: -29°C). The vacuum at the lyophilization stage is set to 0.08 bar; lyophilized samples have the appearance of a non-flattened, light yellow-white precipitate.
Один образец растворяют в 0,58 мл H2O сразу же после лиофилизации и анализируют титр рапамицина уже описанным методом ВЭЖХ-МС. Другие образцы хранят при 40°C в течение 6 месяцев и титрование рапамицина проводят через 3 и 6 месяцев.One sample is dissolved in 0.58 ml H2O immediately after lyophilization and the rapamycin titer is analyzed by the HPLC-MS method already described. Other samples were stored at 40°C for 6 months and rapamycin titrations were performed at 3 and 6 months.
Установленный титр рапамицина составляет 95% как сразу после лиофилизации, так и через 3 или 6 месяцев хранения при 40°C, показывая эффективность системы стабилизации и контролируемого высвобождения, описанной в изобретении.The titer of rapamycin was found to be 95% both immediately after lyophilization and after 3 or 6 months of storage at 40°C, demonstrating the effectiveness of the stabilization and controlled release system described in the invention.
Пример 19. Испытания in vitro ингибирования протеазы синовиальной жидкости, индуцированного производным HAS 1 -олеиламид/рапамицин.Example 19 In vitro test for synovial fluid protease inhibition induced by HAS 1 -oleylamide/rapamycin derivative.
Рецептуру HAS1-олеиламид/рапамицин, полученную как в примере 10, то есть, содержащую 13 мг/мл HAS1-олеиламид и 0,21 мг/мл рапамицина, испытывают in vitro с целью оценки ее ингибирующего действия на протеазы синовиальной жидкости, более конкретно на:The HAS1-oleylamide/rapamycin formulation prepared as in Example 10, i.e., containing 13 mg/ml HAS1-oleylamide and 0.21 mg/ml rapamycin, was tested in vitro to evaluate its inhibitory effect on synovial fluid proteases, more specifically on :
различных металлопротеиназ человека (ММП (MMP));various human metalloproteinases (MMPs);
эластазу;elastase;
аггреканазу 1 (ADAMTS4);aggrecanase 1 (ADAMTS4);
используя глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу в качестве контроля (как известно специалисту, GAPDH представляет собой конститутивный фермент, физиологически экспрессируемый в каждой клетке, ингибирование которого предупреждает клеточную активность, приводящую к гибели клетки; оценка его ингибирования испытываемыми образцами определяет специфичность действия и токсичность образцов) и путем оценки начальной скорости гидролиза различных протеаз (RFU/s) в присутствии разных концентраций рецептуры. Значение IC50, то есть, концентрацию ингибитора, способную ингибировать 50% ферментативной активности стандартизованных ММП, рассчитывают путем интерполяции активности ММП относительно концентрации рецептуры, и значения представлены на фиг. 2.using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as a control (as one skilled in the art knows, GAPDH is a constitutive enzyme physiologically expressed in every cell, the inhibition of which prevents cellular activity leading to cell death; assessment of its inhibition by test samples determines the specificity of action and toxicity of the samples) and by assessing the initial rate of hydrolysis of different proteases (RFU/s) in the presence of different concentrations of the formulation. The IC 50 value, that is, the inhibitor concentration capable of inhibiting 50% of the enzymatic activity of the standardized MMPs, is calculated by interpolating the MMP activity relative to the formulation concentration, and the values are presented in FIG. 2.
Материалы и методы.Materials and methods.
Для ММП: используют флуориметрический набор определения профиля ингибитора ММП (Fluorimetric MMP Inhibitor Profiling Kit (BML-AK016)); испытывают рецептуру, описанную в примере 10, при концентрации HAS1-олеиламид 0,8, 0,4 и 0,1 мг/мл, соответствующей 0,013, 0,006 и 0,0016 мг/мл рапамицина, соответственно, и с использованием такой же концентрации субстрата (4,0 мкМ);For MMP: use a fluorimetric MMP Inhibitor Profiling Kit (BML-AK016)); test the formulation described in Example 10 at HAS1-oleyl amide concentrations of 0.8, 0.4 and 0.1 mg/ml, corresponding to 0.013, 0.006 and 0.0016 mg/ml rapamycin, respectively, and using the same substrate concentration (4.0 µM);
Для эластазы: используют флуориметрический набор для эластазы (Fluorimetric Sensolyte Rh110 Elastase kit (AS-72178)); испытывают рецептуру, упомянутую в примере 10, при концентрации HAS1олеиламид 0,7 мг/мл, 0,35 мг/мл и 0,1 мг/мл, соответствующей 0,0112, 0,0056 и 0,0016 мг/мл рапамицина, соответственно, и с использованием такой же концентрации субстрата (25 мкМ).For elastase: use a fluorimetric elastase kit (Fluorimetric Sensolyte Rh110 Elastase kit (AS-72178)); test the formulation mentioned in Example 10 at HAS1 oleyl amide concentrations of 0.7 mg/ml, 0.35 mg/ml and 0.1 mg/ml, corresponding to 0.0112, 0.0056 and 0.0016 mg/ml rapamycin, respectively , and using the same substrate concentration (25 μM).
Для ADAMTS4: используют набор для оценки активности аггреканазы (Aggrecanase Activity Assay Kit (KA-1497)); испытывают рецептуру, упомянутую в примере 10, при концентрации HAS1-олеиламид 0,6 мг/мл, 0,3 мг/мл и 0,1 мг/мл, соответствующей 0,0096, 0,0048 и 0,0016 мг/мл рапамицина, соответственно, и с использованием такой же концентрации субстрата (1 мкМ).For ADAMTS4: use a kit to assess the activity of aggrecanase (Aggrecanase Activity Assay Kit (KA-1497)); test the formulation mentioned in Example 10 at HAS1-oleyl amide concentrations of 0.6 mg/ml, 0.3 mg/ml and 0.1 mg/ml, corresponding to 0.0096, 0.0048 and 0.0016 mg/ml rapamycin , respectively, and using the same substrate concentration (1 μM).
Для GAPDH: используют калориметрический набор для оценки активности GAPDH (Colorimetric GAPDH Activity Assay Kit) (K680-100)); испытывают рецептуру, описанную в примере 10, приFor GAPDH: use a calorimetric GAPDH Activity Assay Kit (K680-100)); test the recipe described in example 10 at
- 9 044423 концентрации HASl-олеиламид 0,6, 0,3 и 0,1 мг/мл, соответствующей 0,0096, 0,0048 и 0,0016 мг/мл рапамицина, соответственно, и с использованием такой же концентрации субстрата (1 мкМ).- 9 044423 HASl-oleyl amide concentrations of 0.6, 0.3 and 0.1 mg/ml, corresponding to 0.0096, 0.0048 and 0.0016 mg/ml rapamycin, respectively, and using the same substrate concentration (1 µM).
Результаты представлены на фиг. 2.The results are presented in Fig. 2.
Очевидно, что рецептура HAS1-олеиламид/рапамицин селективно ингибирует ММП, показывая превосходную активность на всех металлопротеиназах, за исключением MMP2 и MMP9; и, напротив, она не влияет на другие протестированные протеазы синовиальной жидкости или на контрольный фермент (GAPDH).It appears that the HAS1-oleylamide/rapamycin formulation selectively inhibits MMPs, showing superior activity on all metalloproteinases except MMP2 and MMP9; in contrast, it does not affect other synovial fluid proteases tested or the control enzyme (GAPDH).
Это означает, что рецептура HAS1-олеиламид/рапамицин действует специфически и селективно на ММП, и особенно на ММП, которые избыточно экспрессированы в синовиальной жидкости пациентов с OA и ответственны за деградацию коллагена.This means that the HAS1-oleylamide/rapamycin formulation acts specifically and selectively on MMPs, and especially on MMPs that are overexpressed in the synovial fluid of OA patients and are responsible for collagen degradation.
Пример 20. Испытания ex vivo на высвобождение коллагена из хрящевых эксплантатов, индуцированное производным HAS1-олеиламид/рапамицин.Example 20 Ex vivo tests on collagen release from cartilage explants induced by HAS1-oleylamide/rapamycin derivative.
Эффективность рецептуры HAS1-олеиламид/рапамицин при высвобождении коллагена оценивают в модели ex vivo воспаления хряща, описанной в литературе (Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20: 2131-2140). Испытываемая рецептура HAS1-олеиламид/рапамицин представляет собой рецептуру, полученную в примере 10, в разных концентрациях.The effectiveness of the HAS1-oleylamide/rapamycin formulation in releasing collagen was assessed in an ex vivo model of cartilage inflammation described in the literature (Arns, S. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20: 2131-2140). The HAS1-oleylamide/rapamycin formulation tested is the formulation prepared in Example 10 at different concentrations.
Хрящ собирают из пателлофеморальной борозды и мыщелка бедренной кости, взятых из бедренной кости взрослого животного крупного рогатого скота, и биопсию хряща (0=3 мм) берут с помощью стального пробойника. Биопсии культивируют в 48-луночном многолуночном планшете (BD Falcon, номер по каталогу 353078, Италия) при 37°C с 5% CO2 в течение 24 ч в среде DMEM/F-12 (1:1) (Life Technologies, номер по каталогу 11320074, Италия), содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies, номер по каталогу 10270106, Италия). После инкубации биопсии промывают PBS и делят на следующие группы:Cartilage is collected from the patellofemoral groove and femoral condyle taken from the femur of an adult bovine animal, and a cartilage biopsy (0=3 mm) is taken using a steel punch. Biopsies are cultured in a 48-well multiwell plate (BD Falcon, catalog number 353078, Italy) at 37°C with 5% CO 2 for 24 hours in DMEM/F-12 medium (1:1) (Life Technologies, catalog number catalog 11320074, Italy) containing 2% fetal bovine serum (Life Technologies, catalog number 10270106, Italy). After incubation, biopsies are washed with PBS and divided into the following groups:
1) контрольная группа, где клетки не обработаны и не стимулированы;1) control group, where the cells were not treated or stimulated;
2) одна группа, обработанная провоспалительными цитокинами OSM (онкостатин M) и IL-1e (по 10 нг/мл каждого);2) one group treated with pro-inflammatory cytokines OSM (Oncostatin M) and IL-1e (10 ng/ml each);
3) одна группа, подвергнутая воздействию OSM и IL-1e и обработанная HAS1-олеиламид (1,3 мг/мл)/рапамицин (0,021 мг/мл);3) one group exposed to OSM and IL-1e and treated with HAS1-oleylamide (1.3 mg/ml)/rapamycin (0.021 mg/ml);
4) одна группа, подвергнутая воздействию OSM и IL-1e и обработанная HAS1-олеиламид (0,3 мг/мл)/рапамицин (0,005 мг/мл);4) one group exposed to OSM and IL-1e and treated with HAS1-oleylamide (0.3 mg/ml)/rapamycin (0.005 mg/ml);
5) одна группа, подвергнутая воздействию OSM и IL-1e и обработанная HAS1-олеиламид (0,1 мг/мл)/рапамицин (0,002 мг/мл).5) one group exposed to OSM and IL-1e and treated with HAS1-oleylamide (0.1 mg/ml)/rapamycin (0.002 mg/ml).
Через 0, 7, 14 и 21 день культуральную среду биопсии аспирируют и заменяют свежей средой, содержащей воспалительные цитокины и тестируемую рецептуру HAS1-олеиламид/рапамицин. После 21-дневной инкубации среду для биопсии собирают и определяют растворимый коллаген с помощью набора для оценки коллагена Sircol collagen assay kit (Biocolor, номер по каталогу S1000, UK) в соответствии с инструкциями производителя. Как видно на фиг. 3, биопсии группы, обработанной IL1/OSM высвобождают, как и ожидалось, существенно более высокое количество растворимого коллагена в культуральную среду, чем контроль, указывая на очень сильное воспалительное повреждение. Рецептура HAS1-олеиламид/рапамицин значительно снижает высвобождение коллагена, индуцированное воспалительным стимулом, на практике снижая его до контрольных уровней даже в наиболее низкой испытанной концентрации и практически устраняя его при концентрации 1,3/0,021 мг/мл. Этот эффект подтверждает способность рецептуры ингибировать высвобождение коллагена и указывает на выраженный противовоспалительный эффект рецептуры HAS1-олеиламид/рапамицин.After 0, 7, 14, and 21 days, the biopsy culture medium was aspirated and replaced with fresh medium containing inflammatory cytokines and the test formulation HAS1-oleylamide/rapamycin. After a 21-day incubation, the biopsy medium is collected and soluble collagen is determined using the Sircol collagen assay kit (Biocolor, cat. no. S1000, UK) according to the manufacturer's instructions. As can be seen in FIG. 3, biopsies from the IL1/OSM treated group released, as expected, significantly higher amounts of soluble collagen into the culture medium than controls, indicating very severe inflammatory damage. The HAS1-oleylamide/rapamycin formulation significantly reduced inflammatory stimulus-induced collagen release, effectively reducing it to control levels even at the lowest concentration tested and virtually eliminating it at 1.3/0.021 mg/mL. This effect confirms the ability of the formulation to inhibit collagen release and indicates a significant anti-inflammatory effect of the HAS1-oleylamide/rapamycin formulation.
Пример 21. Влияние на экспрессию ММП-13, индуцированное производным HAS1олеиламид/рапамицин.Example 21. Effect on MMP-13 expression induced by HAS1oleylamide/rapamycin derivative.
Определяют концентрацию ММП-13 в надосадочных жидкостях из тестов на эффективность высвобождения коллагена (предыдущий пример), чтобы количественно оценить присутствие в образцах основного фермента, ответственного за разрушение хряща. Для этой цели используют метод анализа ELISA (Mybiosource, номер по каталогу MBS2880297, США) в соответствии с инструкциями производителя.The concentration of MMP-13 in the supernatants from the collagen release efficiency tests (previous example) was determined to quantify the presence of the main enzyme responsible for cartilage degradation in the samples. For this purpose, the ELISA assay method (Mybiosource, catalog number MBS2880297, USA) is used in accordance with the manufacturer's instructions.
Результаты, представленные на фиг. 4, показывают, что обработка образцов воспалительными цитокинами OSM и IL-1e значительно повышает концентрацию ММП-13 в надосадочной жидкости, как и ожидалось. Напротив, надосадочные жидкости образцов, обработанных рецептурой HAS1олеиламид/рапамицин в концентрациях 0,3 и 0,1 мг/мл, соответствующих 0,0048 и 0,0016 мг/мл рапамицина, соответственно, имеют значительно более низкие уровни ММП-13, чем контрольные образцы, даже при самой низкой проверенной концентрации. Это однозначно подтверждает эффективность испытанной рецептуры при снижении экспрессии воспалительных факторов, лежащих в основе деградации суставного хряща.The results presented in Fig. 4 show that treatment of samples with the inflammatory cytokines OSM and IL-1e significantly increases the concentration of MMP-13 in the supernatant, as expected. In contrast, supernatants of samples treated with the HAS1oleylamide/rapamycin formulation at concentrations of 0.3 and 0.1 mg/ml, corresponding to 0.0048 and 0.0016 mg/ml rapamycin, respectively, had significantly lower levels of MMP-13 than controls. samples, even at the lowest concentration tested. This clearly confirms the effectiveness of the tested formulation in reducing the expression of inflammatory factors underlying the degradation of articular cartilage.
--
Claims (21)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102019000003887 | 2019-03-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044423B1 true EA044423B1 (en) | 2023-08-25 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ziadlou et al. | Optimization of hyaluronic acid-tyramine/silk-fibroin composite hydrogels for cartilage tissue engineering and delivery of anti-inflammatory and anabolic drugs | |
| Gentile et al. | Localised controlled release of simvastatin from porous chitosan–gelatin scaffolds engrafted with simvastatin loaded PLGA-microparticles for bone tissue engineering application | |
| JP5047814B2 (en) | Amide derivatives of hyaluronic acid in osteoarthritis | |
| Mero et al. | A hyaluronic acid–salmon calcitonin conjugate for the local treatment of osteoarthritis: Chondro-protective effect in a rabbit model of early OA | |
| He et al. | Chondroitin sulfate microspheres anchored with drug-loaded liposomes play a dual antioxidant role in the treatment of osteoarthritis | |
| Li et al. | Injectable amphipathic artesunate prodrug‐hydrogel microsphere as gene/drug nano‐microplex for rheumatoid arthritis therapy | |
| Babazada et al. | Self-assembling lipid modified glycol-split heparin nanoparticles suppress lipopolysaccharide-induced inflammation through TLR4–NF-κB signaling | |
| EP3579897A1 (en) | Short-acting heparin-based anticoagulant compounds and methods | |
| EP4049653A1 (en) | Injectable intraocular microgel as drug delivery system, and hydrogel comprising same | |
| US10966955B2 (en) | Ocular drug delivery system and uses thereof | |
| Hong et al. | Combination therapy using kartogenin-based chondrogenesis and complex polymer scaffold for cartilage defect regeneration | |
| Wang et al. | A biopolymer-based and inflammation-responsive nanodrug for rheumatoid arthritis treatment via inhibiting JAK-STAT and JNK signalling pathways | |
| EP3941948B1 (en) | Stabilisation and controlled-release systems for medicaments unstable on sterilisation | |
| Jones et al. | Hyaluronan derived nanoparticle for simvastatin delivery: evaluation of simvastatin induced myotoxicity in tissue engineered skeletal muscle | |
| Balasso et al. | Screening of chemical linkers for development of pullulan bioconjugates for intravitreal ocular applications | |
| Wang et al. | Suppressing phosphoinositide-specific phospholipases Cγ1 promotes mineralization of osteoarthritic subchondral bone osteoblasts via increasing autophagy, thereby ameliorating articular cartilage degeneration | |
| Song et al. | Thermosensitive injectable hydrogel loaded with hypoxia-induced exosomes maintains chondrocyte phenotype through NDRG3-mediated hypoxic response | |
| Chen et al. | The amelioration of cartilage degeneration by photo-crosslinked GelHA hydrogel and crizotinib encapsulated chitosan microspheres | |
| Montanari et al. | Halting hyaluronidase activity with hyaluronan-based nanohydrogels: Development of versatile injectable formulations | |
| EA044423B1 (en) | STABILIZATION AND CONTROLLED RELEASE SYSTEMS FOR DRUGS UNSTABLE BY STERILIZATION | |
| Guarise et al. | Hydrophobic derivatives of sulfated hyaluronic acid as drug delivery Systems for Multi-Target Intra-Articular Treatment of post-traumatic osteoarthritis | |
| US6562371B1 (en) | Liposomes | |
| Kaderli et al. | A novel oxido-viscosifying Hyaluronic Acid-antioxidant conjugate for osteoarthritis therapy: Biocompatibility assessments | |
| EP3691691B1 (en) | Pharmaceutical compositions containing a conjugate of hyaluronic acid and carnosine and relative use | |
| Sun et al. | Bioactive composite hydrogel with effects of robust promoting osteogenesis and immunomodulation for osteoporotic bone regeneration |