EA043759B1 - ANTIBODIES WITH INCREASED AFFINITY FOR THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR AND FRAGMENTS DERIVED FROM THEM - Google Patents
ANTIBODIES WITH INCREASED AFFINITY FOR THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR AND FRAGMENTS DERIVED FROM THEM Download PDFInfo
- Publication number
- EA043759B1 EA043759B1 EA202091328 EA043759B1 EA 043759 B1 EA043759 B1 EA 043759B1 EA 202091328 EA202091328 EA 202091328 EA 043759 B1 EA043759 B1 EA 043759B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- mabs
- mab
- nimotuzumab
- cdr2
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 41
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 title description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 title description 2
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 27
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 23
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 23
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 claims description 21
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 52
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 43
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- 102100038778 Amphiregulin Human genes 0.000 description 1
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 101800001382 Betacellulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010061534 Oesophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100039467 P3 protein Human genes 0.000 description 1
- 101710117080 P3 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100029837 Probetacellulin Human genes 0.000 description 1
- 102100025498 Proepiregulin Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100032350 Protransforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000025402 neoplasm of esophagus Diseases 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к вариантам моноклонального антитела (mAb) нимотузумаба и происходящим из них антигенсвязывающим фрагментам, которые имеют мутации в CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи и распознают внеклеточную область рецептора эпидермального фактора роста человека (hEGFR) с большей аффинностью, а также их диагностическое и терапевтическое применение.The invention relates to the fields of biotechnology and medicine, in particular to variants of the monoclonal antibody (mAb) nimotuzumab and antigen-binding fragments derived from them, which have mutations in CDR1 and CDR2 of the variable region of the heavy chain and recognize the extracellular region of the human epidermal growth factor receptor (hEGFR) with greater affinity, as well as their diagnostic and therapeutic applications.
Уровень техникиState of the art
EGFR представляет собой трансмембранный гликопротеин, который имеет внеклеточную лигандсвязывающую область и внутриклеточную область, имеющую тирозинкиназную активность. Указанные лиганды включают: эпидермальный фактор роста (EGF), амфирегулин, трансформирующий фактор роста а, бетацеллюлин, эпирегулин и гепаринсвязывающий EGF (Olayioye, M.y et al., The EMBO Journal, 19: 3159-3167, 2000; Yarden, Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews, 2: 127-137, 2001). Связывание лигандов с рецептором вызывает конформационные изменения и изменения расположения во внеклеточной области, которые вызывают димеризацию и активацию рецептора (Ogiso, H. et al., Cell 110: 775-787, 2002). Данный рецептор участвует в различных клеточных процессах, которые способствуют поддержанию и выживанию эпителиальных клеток. Однако нарушение регуляции пути EGFR/EGF вследствие избыточной экспрессии или конститутивной активации способствует пролиферации опухолевых клеток, инвазии, и связана с плохим прогнозом при многих злокачественных новообразованиях (Yarden Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews. 2: 127-137, 2001). По этой причине EGFR считают ассоциированным с опухолью антигеном (АГ), который очень важен для разработки противоопухолевой терапии.EGFR is a transmembrane glycoprotein that has an extracellular ligand-binding region and an intracellular region having tyrosine kinase activity. These ligands include: epidermal growth factor (EGF), amphiregulin, transforming growth factor α, betacellulin, epiregulin and heparin-binding EGF (Olayioye, M.y et al., The EMBO Journal, 19: 3159-3167, 2000; Yarden, Y. and Sliwkowski , M., Nature Reviews, 2: 127-137, 2001). Binding of ligands to the receptor causes conformational changes and changes in location in the extracellular region, which cause dimerization and activation of the receptor (Ogiso, H. et al., Cell 110: 775-787, 2002). This receptor is involved in various cellular processes that contribute to the maintenance and survival of epithelial cells. However, dysregulation of the EGFR/EGF pathway due to overexpression or constitutive activation promotes tumor cell proliferation, invasion, and is associated with poor prognosis in many malignancies (Yarden Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews. 2: 127-137, 2001) . For this reason, EGFR is considered a tumor-associated antigen (AG), which is very important for the development of antitumor therapy.
В настоящее время на рынке присутствуют три mAb против EGFR: цетуксимаб (Erbitux), панитумумаб (Vectibix) и нимотузумаб (TheraCIM) (Reichert, J., MAbs.4: 413-415, 2012), и еще семь находятся в фазах I-III клинических испытаний (Reichert, J. and Dhimolea, Е., Drug Discovery Today, 17: 954-963, 2012). Они были специально разработаны для распознавания внеклеточной области EGFR, конкурентного ингибирования связывания лигандов и димеризации рецептора и, таким образом, ингибирования аутофосфорилирования рецептора и сигнального каскада, который приводит к его активации (Burgess, А. и др., Molecular Cell, 12: 541 -552, 2003).There are currently three anti-EGFR mAbs on the market: cetuximab (Erbitux), panitumumab (Vectibix), and nimotuzumab (TheraCIM) (Reichert, J., MAbs.4: 413-415, 2012), and seven more are in phase I- III clinical trials (Reichert, J. and Dhimolea, E., Drug Discovery Today, 17: 954-963, 2012). They were specifically designed to recognize the extracellular region of EGFR, competitively inhibit ligand binding and receptor dimerization, and thereby inhibit autophosphorylation of the receptor and the signaling cascade that leads to its activation (Burgess, A. et al., Molecular Cell, 12: 541 - 552, 2003).
Нимотузумаб (mAb R3) представляет собой гуманизированное mAb изотипа IgG1, которое распознает hEGFR, полученное путем клонирования ДНК гипервариабельных областей мышиных mAb ior egf/r3 и каркасов вариабельных и константных областей тяжелых и легких цепей человека (REI и NEWN соответственно) (Mateo, С. et al., Immunotechnology 3: 71-8, 1997). MAb R3 распознает EGFR с аналогичной аффинностью и обладает такой же способностью ингибировать связывание EGF с рецептором, что и его мышиный предшественник. Данный вариант является менее иммуногенным, чем химерный вариант mAb ior egf/r3 (Mateo, С. et al., Immunotechnology 3: 71-8, 1997). Нимотузумаб распознает эпитоп в домене III внеклеточной области EGFR, который перекрывается с сайтом связывания лигандов в этом домене, что объясняет его способность блокировать связывание лиганда и последующую активацию рецептора (Tundidor, Y. et al., MAbs 6: 1013-1025, 2014). Эффективность нимотузумаба была продемонстрирована в клинических испытаниях на пациентах с опухолью головы и шеи (Crombet, Т. et al., J Clin Oncol 22: 16461654, 2004), глиомой (Ramos, Т. et al., Cancer Biol. Ther.5: 375-379, 2006; MacDonald, T. et al., Neuro Oncol., 13: 1049-1058, 2011) и опухолью пищевода (Ramos-Suzarte, M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012). Данное антитело (AT) находится в фазе III клинических испытаний при раке носоглотки, локально прогрессирующем раке пищевода и плоскоклеточной карциноме пищевода (Galluzzi, L. et al., Oncolmmunology, 1: 28-37, 2012).Nimotuzumab (mAb R3) is a humanized mAb of the IgG1 isotype that recognizes hEGFR, obtained by cloning the hypervariable region DNA of murine mAb ior egf/r3 and the human heavy and light chain variable and constant region frameworks (REI and NEWN, respectively) (Mateo, S. et al., Immunotechnology 3: 71-8, 1997). MAb R3 recognizes EGFR with similar affinity and has the same ability to inhibit EGF receptor binding as its murine predecessor. This variant is less immunogenic than the chimeric mAb ior egf/r3 variant (Mateo, C. et al., Immunotechnology 3: 71-8, 1997). Nimotuzumab recognizes an epitope in domain III of the extracellular region of EGFR that overlaps with the ligand binding site in this domain, which explains its ability to block ligand binding and subsequent receptor activation (Tundidor, Y. et al., MAbs 6: 1013-1025, 2014). The effectiveness of nimotuzumab has been demonstrated in clinical trials in patients with head and neck tumors (Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 16461654, 2004), glioma (Ramos, T. et al., Cancer Biol. Ther. 5: 375-379, 2006; MacDonald, T. et al., Neuro Oncol., 13: 1049-1058, 2011) and esophageal tumor (Ramos-Suzarte, M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012). This antibody (AT) is in phase III clinical trials for nasopharyngeal cancer, locally advanced esophageal cancer, and esophageal squamous cell carcinoma (Galluzzi, L. et al., Oncolmmunology, 1: 28-37, 2012).
В отличие от других AT, направленных против EGFR, как в доклинических испытаниях на зеленых обезьянах Cercopithecus aethiops sabaeus (Arteaga, M. и др., Cancer Biology & Therapy. 6: 1390-1395, 2007), так и в клинических испытаниях (Crombet, Т. et al. J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004; Ramos T. et al., Cancer Biol Ther 5: 375-379, 2006; Ramos-Suzarte M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012; Strumberg, D. et al., Invest New Drugs, 30: 1138-1143, 2010) нимотузумаба не было обнаружено никаких признаков тяжелой токсичности, обычно связанных с препаратами, направленными против этого АГ. Эти данные свидетельствуют о том, что нимотузумаб является единственным анти-EGFR агентом, который можно применять на постоянной основе (Allan, D., The Oncologist, 10: 760-761, 2005). Профиль низкой токсичности, но с противоопухолевым эффектом, данного mAb может быть обусловлен его средней аффинностью (10-8) (Crombet, Т. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). Авторы предполагают, что mAb с промежуточной аффинностью должны обладать высоким противоопухолевым эффектом и низкой токсичностью, поскольку усвоение в опухоли (высокая экспрессия EGFR) преобладает над усвоением в нормальной кани (низкая экспрессия EGFR). С другой стороны, высокоаффинные mAb (такие как цетуксимаб) будут захвачены как опухолевыми, так и нормальными клетками; и низкая аффинность mAb будет иметь небольшой эффект из-за низкого включения в опухоли (Crombet, Т. et al., J Clin Oncol 22: 16461654, 2004). Однако было описано, что противоопухолевый эффект нимотузумаба зависит от экспрессии EGFR, поскольку его эффективность снижается в опухолях со средней или низкой экспрессией этого рецептора (Akashi, Y. et al., British Journal of Cancer, 98: 749-755, 2008). Следовательно, получение варианта нимотузумаба с умерено увеличенной аффинностью к рецептору может обеспечить получение ан- 1 043759 титела (AT) с более сильным противоопухолевым эффектом, но в то же время сохраненной низкой токсичностью. Получение этого варианта нимотузумаба со средней аффинностью и сохранение его точной специфичности к эпитопу (которая является уникальной среди терапевтических AT против EGFR) (Tundidor, Y. et al., MAbs 6: 1013-1025, 2014) будет способствовать сохранению ценных свойств исходного антитела.Unlike other ATs directed against EGFR, both in preclinical trials in green monkeys Cercopithecus aethiops sabaeus (Arteaga, M. et al., Cancer Biology & Therapy. 6: 1390-1395, 2007) and in clinical trials (Crombet , T. et al. J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004; Ramos T. et al., Cancer Biol Ther 5: 375-379, 2006; Ramos-Suzarte M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600–605, 2012; Strumberg, D. et al., Invest New Drugs, 30: 1138–1143, 2010), nimotuzumab showed no evidence of severe toxicity typically associated with drugs targeting this antigen. These data suggest that nimotuzumab is the only anti-EGFR agent that can be used chronically (Allan, D., The Oncologist, 10: 760-761, 2005). The low toxicity but antitumor effect profile of this mAb may be due to its moderate affinity (10-8) (Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). The authors hypothesize that intermediate-affinity mAbs should have high antitumor effect and low toxicity because tumor uptake (high EGFR expression) predominates over normal uptake (low EGFR expression). On the other hand, high-affinity mAbs (such as cetuximab) will be taken up by both tumor and normal cells; and a low affinity mAb will have little effect due to low uptake into tumors (Crombet, T. et al., J Clin Oncol 22: 16461654, 2004). However, the antitumor effect of nimotuzumab has been described to be dependent on EGFR expression, as its effectiveness is reduced in tumors with intermediate or low expression of this receptor (Akashi, Y. et al., British Journal of Cancer, 98: 749-755, 2008). Therefore, producing a variant of nimotuzumab with moderately increased receptor affinity may provide an antibody (AT) with stronger antitumor effect while maintaining low toxicity. Producing this intermediate affinity variant of nimotuzumab and maintaining its precise epitope specificity (which is unique among anti-EGFR AT therapeutics) (Tundidor, Y. et al., MAbs 6: 1013-1025, 2014) will help preserve the valuable properties of the parent antibody.
Аффинное созревание AT представляет собой процесс, который происходит естественным образом; однако с развитием комбинаторной биологии это явление было воспроизведено в лаборатории. Такие технологии направленной эволюции требуют разных этапов: мутации, отображения (дисплея), селекции и амплификации (Wark, K. and Hudson, P., Advanced Drug Delivery Reviews, 58: 657-670, 2006). Технология фагового дисплея обеспечивает мощную платформу для создания новых AT человека, а также для улучшения их аффинности in vitro (Hoogenboom, H., Nat Biotechnol, 23: 1105-1116, 2005).Affinity maturation of AT is a process that occurs naturally; however, with the development of combinatorial biology, this phenomenon has been reproduced in the laboratory. Such directed evolution technologies require different steps: mutation, display, selection and amplification (Wark, K. and Hudson, P., Advanced Drug Delivery Reviews, 58: 657-670, 2006). Phage display technology provides a powerful platform for the generation of new human ATs, as well as for improving their affinity in vitro (Hoogenboom, H., Nat Biotechnol, 23: 1105-1116, 2005).
Авторы настоящего изобретения обнаружили отображенные на фагах мутантные варианты нимотузумаба с повышенной способностью связываться с внеклеточной областью hEGFR. Набор мутаций, которыми обладают эти варианты, ранее не был описан и не может быть предсказан, исходя из анализа кристаллической структуры антигенсвязывающего фрагмента (Fab) нимотузумаба. Следовательно, новизна настоящего изобретения заключается в обеспечении новых фрагментов и mAb, которые распознают hEGFR с более высокой аффинностью (в 3-4 раза выше), таким образом, указанные фрагменты и mAb могут распознавать линии со средней экспрессией EGFR более эффективно, чем нимотузумаб. Аналогично, данные mAb показали большую способность ингибировать лиганд-опосредованное фосфорилирование EGFR по сравнению с нимотузумабом, что указывает на то, что они обладают более сильным противоопухолевым эффектом, чем нимотузумаб. Все вышеперечисленное подтверждает возможность применения этих фрагментов и mAb в диагностике или лечении опухолей со средней экспрессией EGFR.The present inventors have discovered phage-displayed mutant variants of nimotuzumab with increased ability to bind to the extracellular region of hEGFR. The set of mutations that these variants possess has not been previously described and cannot be predicted from analysis of the crystal structure of the antigen-binding fragment (Fab) of nimotuzumab. Therefore, the novelty of the present invention is to provide new fragments and mAbs that recognize hEGFR with higher affinity (3-4 times higher), such that these fragments and mAbs can recognize intermediate EGFR expression lines more effectively than nimotuzumab. Likewise, these mAbs showed greater ability to inhibit ligand-mediated EGFR phosphorylation compared to nimotuzumab, indicating that they have a stronger antitumor effect than nimotuzumab. All of the above confirms the possibility of using these fragments and mAbs in the diagnosis or treatment of tumors with intermediate EGFR expression.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным mAb, которые распознают внеклеточную область hEGFR Her1 и обладают более, чем 95% идентичностью по отношению к антителу нимотузумаб.The present invention provides recombinant mAbs that recognize the extracellular region of hEGFR Her1 and have greater than 95% identity to the antibody nimotuzumab.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к mAb, где последовательности области, определяющей комплементарность (CDR), CDR2 вариабельной области тяжелых цепей, выбраны из группы, включающей:In one embodiment, the present invention provides an mAb wherein the heavy chain variable region CDR2 complementarity determining region (CDR) sequences are selected from the group consisting of:
SEQ ID NO. 20 иSEQ ID NO. 20 and
SEQ ID NO. 21, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелых цепей представляют собой SEQ ID NO. 9 и SEQ ID NO. 3 соответственно, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:SEQ ID NO. 21, the heavy chain CDR1 and CDR3 sequences are SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO. 3, respectively, and the light chain variable region CDR sequences are:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.CDR 3 SEQ ID NO. 24.
В другом варианте реализации рекомбинантные mAb согласно настоящему изобретению характеризуются тем, что последовательность CDR2 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, включающей:In another embodiment, the recombinant mAbs of the present invention are characterized in that the heavy chain variable region CDR2 sequence is selected from the group consisting of:
SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 10,
SEQ ID NO. 11,SEQ ID NO. eleven,
SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 12,
SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 17,
SEQ ID NO. 18 иSEQ ID NO. 18 and
SEQ ID NO. 29, последовательность CDR1 представляет собой SEQ ID NO. 9, и последовательность CDR3 представляет собой SEQ ID NO.3 в указанных тяжелых цепях, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:SEQ ID NO. 29, the CDR1 sequence is SEQ ID NO. 9, and the CDR3 sequence is SEQ ID NO.3 in said heavy chains, and the light chain variable region CDR sequences are:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.CDR 3 SEQ ID NO. 24.
Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к mAb, где последовательность CDR2 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, включающей:Another embodiment of the present invention provides an mAb wherein the heavy chain variable region CDR2 sequence is selected from the group consisting of:
SEQ ID NO. 2 иSEQ ID NO. 2 and
SEQ ID NO. 8, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелых цепей представляют собой SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 3, соответственно, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:SEQ ID NO. 8, the heavy chain CDR1 and CDR3 sequences are SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 3, respectively, and the CDR sequences of the light chain variable region are:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.CDR 3 SEQ ID NO. 24.
В дополнительном варианте реализации mAb согласно настоящему изобретению характеризуются тем, что последовательность CDR1 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, включающей:In a further embodiment, the mAbs of the present invention are characterized in that the heavy chain variable region CDR1 sequence is selected from the group consisting of:
- 2 043759- 2 043759
SEQ ID NO. 13 иSEQ ID NO. 13 and
SEQ ID NO. 19, последовательности CDR2 и CDR3 тяжелых цепей представляют собой SEQ ID NO. 14 и SEQ IDSEQ ID NO. 19, the heavy chain CDR2 and CDR3 sequences are SEQ ID NO. 14 and SEQ ID
NO. 3, соответственно, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:NO. 3, respectively, and the CDR sequences of the light chain variable region are:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.CDR 3 SEQ ID NO. 24.
В частности, настоящее изобретение относится к mAb, характеризующемуся наличием следующей последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей:In particular, the present invention relates to an mAb characterized by the presence of the following heavy and light chain variable region sequence:
Тяжелая цепьHeavy chain
CDR1 SEQ ID NO. 15,CDR1 SEQ ID NO. 15,
CDR2 SEQ ID NO. 16,CDR2 SEQ ID NO. 16,
CDR3 SEQ ID NO. 3,CDR3 SEQ ID NO. 3,
Легкая цепьLight chain
CDR 1 SEQ ID NO. 22,CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.CDR 3 SEQ ID NO. 24.
Настоящее изобретение включает все вышеуказанные mAb, в которых при этом каркасные области (FW) вариабельной области тяжелой и легкой цепей имеют следующие последовательности:The present invention includes all of the above mAbs, wherein the heavy and light chain variable region FW regions have the following sequences:
Тяжелая цепьHeavy chain
FW 1 SEQ ID NO. 4,FW 1 SEQ ID NO. 4,
FW 2 SEQ ID NO. 5,FW 2 SEQ ID NO. 5,
FW 3 SEQ ID NO. 6,FW 3 SEQ ID NO. 6,
FW 4 SEQ ID NO. 7,FW 4 SEQ ID NO. 7,
Легкая цепьLight chain
FW 1 SEQ ID NO. 25,FW 1 SEQ ID NO. 25,
FW 2 SEQ ID NO. 26,FW 2 SEQ ID NO. 26,
FW 3 SEQ ID NO. 27,FW 3 SEQ ID NO. 27,
FW 4 SEQ ID NO. 28.FW 4 SEQ ID NO. 28.
Кроме того, раскрытые AT включают константные области тяжелой цепи IgG1 человека и области легкой цепи каппа человека.In addition, the disclosed ATs include human IgG1 heavy chain constant regions and human kappa light chain constant regions.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к фрагментам, полученным из вышеуказанных AT, где указанные фрагменты могут быть Fab-типа, (Fab)2 и одноцепочечными фрагментами вариабельной области.In a specific embodiment, the present invention relates to fragments derived from the above AT, wherein said fragments may be Fab-type, (Fab)2 and single chain variable region fragments.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которую можно применять при лечении рака, которая в качестве активного начала имеет раскрытые в настоящей заявке mAb или их фрагменты в диапазоне от 50 до 400 мг, и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которую можно применять в диагностике опухолей, активным началом которой являются раскрытые в настоящей заявке mAb или их фрагменты в диапазоне от 1 до 9 мг, и фармацевтически приемлемый носитель.In another embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition that can be used in the treatment of cancer, which has as the active principle a mAb or fragments thereof disclosed herein in the range of 50 to 400 mg, and a pharmaceutically acceptable carrier. In addition, the present invention relates to a pharmaceutical composition that can be used in the diagnosis of tumors, the active principle of which is the mAb or fragments thereof disclosed herein in the range of 1 to 9 mg, and a pharmaceutically acceptable carrier.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к применению раскрытых в настоящей заявке mAb и их фрагментов для лечения опухолей, которые экспрессируют EGFR; а также при диагностике опухолей, несущих EGFR, при этом указанные mAb и фрагменты конъюгированы с соответствующим маркером. Настоящее изобретение также относится к применению указанных mAb и их фрагментов для направления иммунного ответа против EGFR-положительных опухолей, при этом указанные mAb и фрагменты конъюгированы с белками или белковыми доменами, представляющими иммунологический интерес.In another embodiment, the present invention relates to the use of mAbs and fragments thereof disclosed herein for the treatment of tumors that express EGFR; as well as in the diagnosis of tumors carrying EGFR, wherein said mAbs and fragments are conjugated to the corresponding marker. The present invention also relates to the use of said mAbs and fragments thereof to direct an immune response against EGFR-positive tumors, wherein said mAbs and fragments are conjugated to proteins or protein domains of immunological interest.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Получение фрагментов с повышенной способностью связываться с внеклеточной областью EGFR человека, происходящих из нимотузумаба.Generation of fragments with increased ability to bind to the extracellular region of human EGFR, derived from nimotuzumab.
Настоящее изобретение относится к 13 фрагментам, происходящим из нимотузумаба, которые имеют более 97% идентичности с его аминокислотной последовательностью и обладают повышенной способностью связываться с внеклеточной областью hEGFR. Мутации в вариантах, описанные в настоящем изобретении, приводят к получению вариантов нимотузумаба со способностью распознавать большее количество клеток человека со средней экспрессией EGFR по сравнению с исходным Fab нимотузумаба.The present invention provides 13 fragments derived from nimotuzumab that have greater than 97% amino acid sequence identity and have increased ability to bind to the extracellular region of hEGFR. Mutations in the variants described in the present invention result in nimotuzumab variants with the ability to recognize more human cells with average EGFR expression compared to the parent nimotuzumab Fab.
Фрагменты, описанные в настоящем изобретении, благодаря их способности связываться с внеклеточной областью hEGFR, могут быть получены путем отбора мутантных вариантов Fab нимотузумаба из библиотек, содержащих более 107 молекул, отображенных на нитчатых фагах. Соответствующие этим вариантам гены могут быть встроены в векторы экспрессии фагмидного типа (слиты с одним из генов, кодирующих белки капсида нитчатого фага) и применены для получения вирусных частиц, которые экс- 3 043759 понируют на своей поверхности варианты белков. Исходные библиотеки могут включать различную степень многообразия в наборе позиций областей, определяющих комплементарность (CDR), что может позволить тщательно изучить эту область, которая функционально важна для взаимодействия АГ-АТ. Каждый из исходных остатков в этих положениях может быть заменен комбинацией из 20 аминокислот, заранее определенным набором остатков, которые обладают некоторым(и) общими физикохимическим(и) свойством(ами), таким(и) как гидрофобность, ароматический характер, суммарный заряд и/или размер, или подвергаться небольшой случайной рандомизации путем введения незначительной доли случайной комбинации нуклеотидов в каждой соответствующей позиции кодона (что будет поддерживать преобладание исходной последовательности). Выбранные позиции могут быть варьировать одновременно в одной библиотеке или в нескольких отдельных библиотеках. Эти библиотеки могут содержать различные пропорции молекул с одной или несколькими мутациями, консервативными или нет, по отношению к исходному Fab нимотузумаба.The fragments described in the present invention, due to their ability to bind to the extracellular region of hEGFR, can be obtained by selecting nimotuzumab Fab mutants from libraries containing more than 10 7 molecules displayed on filamentous phages. The genes corresponding to these variants can be inserted into phagemid-type expression vectors (fused with one of the genes encoding filamentous phage capsid proteins) and used to produce viral particles that display protein variants on their surface. Source libraries may include varying degrees of diversity in the set of complementarity determining region (CDR) positions, which may allow careful study of this region, which is functionally important for Ag-Ab interaction. Each of the original residues at these positions can be replaced by a combination of 20 amino acids, a predetermined set of residues that share some common physicochemical property(s), such as hydrophobicity, aromatic character, net charge, and/or or size, or be subject to a small randomization by introducing a small fraction of a random combination of nucleotides at each corresponding codon position (which will maintain the predominance of the original sequence). The selected positions can be varied simultaneously in one library or in several separate libraries. These libraries may contain varying proportions of molecules with one or more mutations, conserved or not, with respect to the parent nimotuzumab Fab.
Отбор аналогичных фрагментов и mAb нимотузумаба с повышенной способностью связывания с внеклеточной областью hEGFR.Selection of similar fragments and mAbs of nimotuzumab with increased binding ability to the extracellular region of hEGFR.
Отбор фагов, имеющих варианты с повышенной способностью связываться с внеклеточной областью hEGFR, может быть основан на инкубации смесей фагов из библиотек в контакте с иммобилизованным на твердой поверхности АГ hEGFR, удалении не связавшихся фагов путем промывания и элюировании связанных фагов в условиях, которые мешают взаимодействию белков. Несколько последовательных циклов селекции можно выполнять в одинаковых условиях. Анализ последовательностей ДНК, встроенных в выбранные фагмиды, может выявить закономерности, приводящие к выявлению наиболее распространенной замены, которая может быть связана с увеличенной способностью к связыванию с EGFR. Обнаруженные повторяющиеся мутации, будь то индивидуальные модификации или комбинации изменений, выбранные непосредственно из библиотек, могут быть объединены между собой для формирования новых вариантов и обеспечения дополнительного увеличения способности к связыванию с EGFR.The selection of phages that have variants with an increased ability to bind to the extracellular region of hEGFR can be based on incubating mixtures of phages from libraries in contact with hEGFR Ag immobilized on a solid surface, removing unbound phages by washing, and eluting bound phages under conditions that interfere with protein interaction . Several successive selection cycles can be performed under the same conditions. Analysis of the DNA sequences incorporated into selected phagemids may reveal patterns leading to the identification of the most common substitution, which may be associated with increased EGFR binding capacity. Discovered recurrent mutations, whether individual modifications or combinations of changes selected directly from libraries, can be combined to form new variants and provide further increases in EGFR binding capacity.
Способность к связыванию с hEGFR каждого из вариантов, выбранных непосредственно из библиотек или спроектированных и сконструированных позже, может быть оценена иммунохимическими методами с использованием преимуществ формата фагового дисплея, который позволяет одновременно характеризовать несколько вариантов.The hEGFR-binding ability of each variant, selected directly from libraries or designed and constructed later, can be assessed by immunochemical methods taking advantage of the phage display format, which allows for the simultaneous characterization of multiple variants.
В качестве альтернативы, фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть получены путем использования других платформ комбинаторной биологии, таких как рибосомы или дрожжевые дисплеи.Alternatively, fragments according to the present invention can be obtained by using other combinatorial biology platforms, such as ribosomes or yeast displays.
Кроме того, гены, которые кодируют новые вариабельные области, могут быть клонированы в векторы экспрессии клеток млекопитающих и могут производить рекомбинантные mAb, содержащие новые мутации. Также можно подтвердить, что при использовании данного формата полученные mAb по сравнению с нимотузумабом сохраняют способность преимущественно распознавать внеклеточную область hEGFR посредством измерений аффинности на основе поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore).In addition, genes that encode new variable regions can be cloned into mammalian cell expression vectors and can produce recombinant mAbs containing the new mutations. It can also be confirmed that using this format, the resulting mAbs, compared to nimotuzumab, retain the ability to preferentially recognize the extracellular region of hEGFR through surface plasmon resonance-based affinity (BIAcore) measurements.
Демонстрация функционального превосходства новых mAb и их фрагментов, происходящих из нимотузумаба.Demonstration of the functional superiority of novel mAbs and their fragments derived from nimotuzumab.
Функциональное превосходство каждого из вариантов фрагментов, выбранных непосредственно из библиотек или впоследствии сконструированных в виде фрагментов или в формате полных AT, может быть продемонстрировано в анализах in vitro или in vivo. Для каждого варианта распознавание клеточных линий с различной экспрессией EGFR можно оценить с помощью проточной цитометрии, удостоверившись, что новые варианты распознают более высокий процент положительных клеток и с более высокой средней интенсивностью флуоресценции; и этот эффект более выражен в линиях со средней или низкой экспрессией EGFR. Для этой цели будут применять клетки со следующими характеристиками:The functional superiority of each of the fragment variants, selected directly from libraries or subsequently constructed as fragments or in full AT format, can be demonstrated in in vitro or in vivo assays. For each variant, recognition of cell lines with different EGFR expression can be assessed using flow cytometry, ensuring that new variants recognize a higher percentage of positive cells and with a higher average fluorescence intensity; and this effect is more pronounced in lines with intermediate or low EGFR expression. For this purpose, cells with the following characteristics will be used:
высокая экспрессия EGFR: такая как плоскоклеточная карцинома А431 человеческого происхождения, аденокарцинома молочной железы MDA-MB-468 с метастазами в плевральную жидкость человеческого происхождения, не ограничиваясь указанными;high expression of EGFR: such as squamous cell carcinoma A431 of human origin, breast adenocarcinoma MDA-MB-468 with metastasis to pleural fluid of human origin, but not limited to;
средняя экспрессия EGFR: аденокарцинома легкого Н125 и Н292 человеческого происхождения, не ограничиваясь указанными;average EGFR expression: but not limited to H125 and H292 lung adenocarcinoma of human origin;
низкая экспрессия EGFR: мелкоклеточный рак легкого U1906 человеческого происхождения, аденокарцинома молочной железы MDA-MB-231 человеческого происхождения, карцинома яичника SKOV3, рак молочной железы SKBR3, не ограничиваясь указанными.low EGFR expression: small cell lung cancer U1906 of human origin, breast adenocarcinoma MDA-MB-231 of human origin, ovarian carcinoma SKOV3, breast cancer SKBR3, but not limited to those.
Способность каждого mAb или его фрагмента ингибировать фосфорилирование EGFR, опосредованное его лигандом (EGF), также можно оценивать при различных концентрациях и в клеточных линиях с различной экспрессией EGFR. Анализы ингибирования пролиферации с помощью Alamar blue также можно проводить на линиях с различной экспрессией рецептора. Кроме того, способность каждого mAb индуцировать АТ-зависимую клеточную цитотоксичность может быть определена в линиях с различной экспрессией рецептора. Во всех случаях можно ожидать, что варианты с более высокой аффинностью демонстрируют больший эффект и что он будет более выражен в линиях со средней или низкой экспрессией EGFR.The ability of each mAb or fragment thereof to inhibit its ligand (EGF)-mediated phosphorylation of EGFR can also be assessed at different concentrations and in cell lines with different EGFR expression. Alamar blue proliferation inhibition assays can also be performed on lines with different receptor expression. In addition, the ability of each mAb to induce AT-dependent cellular cytotoxicity can be determined in lines with different receptor expression. In all cases, one would expect that higher affinity variants would show greater effect and that it would be more pronounced in lines with intermediate or low EGFR expression.
- 4 043759- 4 043759
С другой стороны, может быть измерен противоопухолевый эффект mAb или их фрагментов у бестимусных мышей, несущих человеческие опухоли, с различной экспрессией EGFR, где будет измеряться задержка роста опухоли.Alternatively, the antitumor effect of mAbs or fragments thereof could be measured in nude mice bearing human tumors with varying EGFR expression, where tumor growth inhibition would be measured.
Кроме того, фрагменты или mAb с радиоактивными изотопами или флуорофорами могут быть помечены и инокулированы в бестимусных мышей, несущих человеческие опухоли, с различной экспрессией EGFR. Это позволяет оценить способность фрагментов распознавать опухоли in vivo, что подтверждает их применение в качестве инструментов для диагностики рака путем получения изображений.In addition, fragments or mAbs with radioactive isotopes or fluorophores can be labeled and inoculated into nude mice bearing human tumors with varying expression of EGFR. This allows evaluation of the fragments' ability to recognize tumors in vivo, supporting their use as imaging tools for cancer diagnosis.
Терапевтическое применение и способы лечения новыми mAb и происходящими из них фрагментами.Therapeutic applications and methods of treatment of new mAbs and fragments derived from them.
Новые mAb и их фрагменты, полученные в настоящем изобретении, имеют более высокую аффинность, чем нимотузумаб, что позволяет применять их в сценариях, где у нимотузумаба есть ограничения, например, в клетках с низкой или средней экспрессией EGFR. Указанные mAb могут быть применены при лечении пациентов с опухолями головы и шеи, глиомой, раком пищевода, легких и поджелудочной железы.The novel mAbs and fragments thereof produced in the present invention have higher affinity than nimotuzumab, allowing their use in scenarios where nimotuzumab has limitations, such as in cells with low or intermediate EGFR expression. These mAbs can be used in the treatment of patients with head and neck tumors, glioma, esophageal, lung and pancreatic cancer.
Для терапевтического применения mAb и их фрагменты должны быть введены субъекту, имеющему заболевание, либо независимо, либо в сочетании с традиционными способами лечения рака, такими как лучевая терапия или химиотерапия, для усиления их терапевтического действия. Путь введения может быть любым из описанных в уровне техники для парентерального введения лекарств, предпочтительно внутривенным или подкожным путем.For therapeutic use, mAbs and fragments thereof must be administered to a subject having a disease, either alone or in combination with conventional cancer treatments, such as radiation therapy or chemotherapy, to enhance their therapeutic effect. The route of administration may be any of those described in the prior art for parenteral administration of drugs, preferably intravenous or subcutaneous.
Чтобы получить желаемый терапевтический эффект, mAb и их фрагменты согласно настоящему изобретению следует вводить в дозах, которые находятся в диапазоне концентраций, в которых они оказывают противоопухолевое действие без токсических проявлений. Диапазон исследуемых доз может варьировать от 50 до 400 мг на пациента в течение 6 недельных циклов лечения. Лечение новыми вариантами с более высокой аффинностью может быть скорректировано для введения более низких доз и поддержания эффекта, подобного действию нимотузумаба, или можно применять рекомендованную дозу для нимотузумаба (200 мг), показав больший противоопухолевый эффект, который будет зависеть от профиля токсичности новых mAb и их фрагментов.To obtain the desired therapeutic effect, the mAbs and fragments thereof of the present invention should be administered in doses that are within the concentration range in which they exhibit antitumor effects without toxicity. The dose range studied may vary from 50 to 400 mg per patient over 6 weekly treatment cycles. Treatment with newer higher affinity variants can be adjusted to administer lower doses and maintain nimotuzumab-like effects, or the recommended dose for nimotuzumab (200 mg) can be used to show greater antitumor effect, which will depend on the toxicity profile of the new mAbs and their fragments.
MAb и их фрагменты согласно настоящему изобретению могут найти применение в диагностике EGFR-положительных опухолей путем их конъюгирования с радиоизотопами или флуорофорами; поскольку они обладают большей аффинностью и способностью распознавать клетки со средней или низкой экспрессией EGFR, что является преимуществом по сравнению с нимотузумабом в диагностике опухолей с этой особенностью.The MAbs and fragments thereof of the present invention may find use in the diagnosis of EGFR-positive tumors by conjugating them with radioisotopes or fluorophores; as they have greater affinity and ability to recognize cells with intermediate or low EGFR expression, which is an advantage over nimotuzumab in diagnosing tumors with this feature.
Чтобы применять их в качестве инструментов для детекции, указанные mAb и их фрагменты должны быть введены пациентам с опухолями для идентификации их путем визуализации местоположения опухоли или возможных метастазов, положительных по EGFR. mAb и их фрагменты, конъюгированные с радиоизотопами или флуорофорами, следует вводить в дозах в диапазоне концентраций, для которых кинетика распределения в тканях и их выведение позволяют быстро получать изображения высокого качества. Этот диапазон может составлять от 0,5 до 9 мг на пациента, предпочтительно 3 мг.To be used as detection tools, these mAbs and fragments thereof must be administered to patients with tumors to identify them by imaging the location of the tumor or possible EGFR-positive metastases. mAbs and their fragments conjugated to radioisotopes or fluorophores should be administered in doses in a concentration range for which the kinetics of tissue distribution and clearance allow rapid acquisition of high-quality images. This range may be from 0.5 to 9 mg per patient, preferably 3 mg.
Кроме того, фрагменты, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть слиты с белками или белковыми доменами, представляющими иммунологический интерес, с целью направления иммунного ответа на EGFR-положительные опухолевые клетки. Данное применение имеет преимущество, так как комбинирует потенциальные возможности обеих терапевтических средств по отдельности, концентрируя ответ в области опухоли; Fab-фрагменты обеспечивают специфичность в отношении опухолевых клеток, которые экспрессируют АГ, в то время как белки или слитые белковые домены играют свою иммунологическую роль, что может иметь превосходящий эффект по сравнению с монотерапией.In addition, the fragments disclosed in the present invention can be fused to proteins or protein domains of immunological interest to direct an immune response to EGFR-positive tumor cells. This application has the advantage of combining the potential of both therapeutic agents separately, concentrating the response in the tumor area; Fab fragments provide specificity for tumor cells that express Ag, while proteins or protein fusion domains play their immunological role, which may have a superior effect compared to monotherapy.
Фармацевтические композиции.Pharmaceutical compositions.
Описанные в настоящем изобретении mAb и их фрагменты вводят как часть фармацевтической композиции, которую можно применять для лечения рака. Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются перечисленным: солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор и тому подобное. Другие буферные агенты, диспергирующие агенты и нетоксичные инертные вещества, подходящие для введения пациенту, могут быть включены в композиции согласно настоящему изобретению. Композиции обычно стерильны и не содержат нежелательных частиц.The mAbs and fragments thereof described herein are administered as part of a pharmaceutical composition that can be used to treat cancer. Preferably, the present invention covers pharmaceutical compositions containing a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, saline, phosphate-buffered saline, and the like. Other buffering agents, dispersing agents and non-toxic inert substances suitable for administration to a patient may be included in the compositions of the present invention. The compositions are typically sterile and free of unwanted particles.
Настоящее изобретение дополнительно поясняется следующими примерами и чертежами. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.The present invention is further illustrated by the following examples and drawings. However, these examples should not be construed as limiting the scope of the present invention.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1. Оценка методом ELISA распознавания нитчатых фагов, отображающих FabR3. Различные препараты очищенных фагов доводили до концентрации, эквивалентной 1012 вирусных частиц/мл. Поглощение измеряли при 490 нм.Fig. 1. Evaluation by ELISA of recognition of filamentous phages displaying FabR3. Various preparations of purified phages were adjusted to a concentration equivalent to 10 12 viral particles/ml. Absorbance was measured at 490 nm.
Фиг. 2. Оценка методом ELISA реакционной способности смеси фагов, несущих библиотеку FabR3, после трех раундов селекции против внеклеточной области EGFR человека. Различные очищенные пре- 5 043759 параты фага доводили до концентрации, эквивалентной 1011 вирусных частиц/мл. Поглощение измеряли при 490 нм.Fig. 2. Evaluation by ELISA of the reactivity of a mixture of phages carrying the FabR3 library after three rounds of selection against the extracellular region of human EGFR. Various purified phage preparations were adjusted to a concentration equivalent to 1011 viral particles/ml. Absorbance was measured at 490 nm.
Фиг. 3. Выравнивание аминокислотной последовательности трех CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) нимотузумаба и 11 вариантов FabR3 с уникальными последовательностями после трех раундов селекции библиотеки против внеклеточной области EGFR человека. Черточки показывают, что исходная аминокислота сохранялась в этой позиции. Количество раз, когда последовательность повторялась, указано в скобках.Fig. 3. Amino acid sequence alignment of three CDRs of the nimotuzumab variable heavy chain (VH) region and 11 FabR3 variants with unique sequences after three rounds of library selection against the extracellular region of human EGFR. The dashes indicate that the original amino acid was retained at that position. The number of times the sequence was repeated is indicated in parentheses.
Фиг. 4. Оценка методом ELISA распознавания отображенных на фагах вариантов FabR3 с уникальными последовательностями, полученными из библиотеки путем небольшой рандомизации после трех раундов селекции против внеклеточной области EGFR человека. Препараты фагов предварительно нормализовали в соответствии с отображаемым количеством белка. (А) Варианты, включенные в группу 1, имеют мутации только в CDR2 VH. (Б) Варианты группы 2, присутствуют мутации в CDR1 и CDR2 VH. Поглощение измеряли при 490 нм.Fig. 4. Evaluation by ELISA of recognition of phage-displayed FabR3 variants with unique sequences obtained from the library by slight randomization after three rounds of selection against the extracellular region of human EGFR. Phage preparations were previously normalized according to the amount of protein displayed. (A) Variants included in group 1 have mutations only in CDR2 VH. (B) Group 2 variants, mutations in CDR1 and CDR2 VH are present. Absorbance was measured at 490 nm.
Фиг. 5. Варианты FabR3 на фагах, сконструированные из комбинации наиболее повторяющейся мутации CDR1 и мутаций CDR2 лучших вариантов FabR3 группы 1. (А) Выравнивание аминокислотной последовательности трех CDR VH исходного нимотузумаба и двух сконструированных вариантов. (Б) Оценка методом ELISA распознавания сконструированных вариантов. Поглощение измеряли при 490 нм.Fig. 5. FabR3 variants on phages constructed from a combination of the most recurrent CDR1 mutation and the CDR2 mutations of the best group 1 FabR3 variants. (A) Amino acid sequence alignment of the three VH CDRs of the parent nimotuzumab and the two engineered variants. (B) ELISA assessment of engineered variant recognition. Absorbance was measured at 490 nm.
Фиг. 6. Распознавание клеток линии Н125 с помощью Fab mAb K4 и K5, происходящих из нимотузумаба. (А) Точечная диаграмма, показывающая процент распознанных EGFR-положительных клеток. (Б) Гистограммы средней интенсивности флуоресценции (EGFR-положительные клетки).Fig. 6. Recognition of H125 cells by Fab mAbs K4 and K5 derived from nimotuzumab. (A) Scatter plot showing the percentage of EGFR-positive cells recognized. (B) Histograms of mean fluorescence intensity (EGFR-positive cells).
Фиг. 7. Ингибирование фосфорилирования EGFR, опосредованного EGF и индуцированного нимотузумабом и mAb K4 и K5. (А) Линия H125, которая имеет среднюю экспрессию EGFR. (Б) линия MDAMB-468 с высокой экспрессией EGFR.Fig. 7. Inhibition of EGF-mediated EGFR phosphorylation induced by nimotuzumab and mAbs K4 and K5. (A) Line H125, which has moderate EGFR expression. (B) MDAMB-468 line with high EGFR expression.
ПримерыExamples
Пример 1: Успешное отображение на нитчатом фаге М13 антигенсвязывающего фрагмента нимотузумаба (FabR3).Example 1: Successful display of the antigen-binding fragment of nimotuzumab (FabR3) on filamentous phage M13.
Гены, кодирующие вариабельные области легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей нимотузумаба, фланкированные сайтами рестрикции ApaLI/XhoI и SfiI/BstEII, соответственно, амплифицировали с помощью ПЦР. Фрагменты обоих генов VL и VH клонировали в вектор pCES1 (Haard, H., Methods in Molecular Biology. 178: 87-100, 2002), после чего следовали гены, кодирующие константную область легкой цепи каппа (CK) и константную область тяжелой цепи (CH1), соответственно. Ген, кодирующий область CH1, связан с геном, кодирующим пептидную метку с-тус, и следует за геном III. Эта генетическая конструкция кодировала АГ-связывающий фрагмент, происходящий из нимотузумаба (FabR3). Компетентные бактерии штамма TG1 вида Escherichia coli трансформировали полученными генетическими конструкциями и применяли для получения и очистки отображенного на фаге FabR3, слитого с белком Р3 вирусного капсида, в объеме 50 мл (Marks, J. et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). Специфическое распознавание очищенных отображенных на фагах молекул оценивали с помощью ELISA (фиг. 1). С этой целью полистироловые планшеты (MaxiSorp, США) покрывали АГ нимотузумаба, внеклеточной областью EGFR человека (Her1) (Ramirez, В. et al., Int. J. Cancer, 119: 2190-2199, 2006), антителом к метке c-myc mAb 9E10 (Центр генной инженерии и биотехнологии Sancti Spiritus, Куба) и BSA в качестве несвязанной молекулы. Связанные фаги обнаруживали с помощью mAb против М13, конъюгированного с пероксидазой хрена (GE Healthcare, США), и соответствующего субстрата фермента. Как показано на фиг. 1, отображенный на фагах FabR3 имел правильный фолдинг, что измерили распознаванием mAb 9E10, которые показывают уровни отображения, и потому сохранил способность нимотузумаба к специфическому распознаванию Her1.The genes encoding the variable regions of the light (VL) and heavy (VH) chains of nimotuzumab, flanked by the ApaLI/XhoI and SfiI/BstEII restriction sites, respectively, were amplified by PCR. Fragments of both VL and VH genes were cloned into the pCES1 vector (Haard, H., Methods in Molecular Biology. 178: 87-100, 2002), followed by the genes encoding the kappa light chain constant region (CK) and the heavy chain constant region ( CH1), respectively. The gene encoding the CH1 region is related to the gene encoding the c-myc peptide tag and follows gene III. This genetic construct encoded an Ag-binding fragment derived from nimotuzumab (FabR3). Competent bacteria strain TG1 of the Escherichia coli species were transformed with the resulting genetic constructs and used to obtain and purify the viral capsid displayed on the FabR3 phage, fused with the P3 protein, in a volume of 50 ml (Marks, J. et al. J. Mol. Biol. 222: 581 -597, 1991). Specific recognition of purified phage-displayed molecules was assessed by ELISA (Fig. 1). For this purpose, polystyrene plates (MaxiSorp, USA) were coated with nimotuzumab Ag, the extracellular region of human EGFR (Her1) (Ramirez, B. et al., Int. J. Cancer, 119: 2190-2199, 2006), an antibody to the c- tag myc mAb 9E10 (Center for Genetic Engineering and Biotechnology Sancti Spiritus, Cuba) and BSA as an unrelated molecule. Bound phages were detected using anti-M13 mAb conjugated to horseradish peroxidase (GE Healthcare, USA) and the appropriate enzyme substrate. As shown in FIG. 1, displayed on FabR3 phages was correctly folded, as measured by recognition of mAb 9E10, which shows display levels, and therefore retained the ability of nimotuzumab to specifically recognize Her1.
Пример 2. Отбор и характеристика отображенных на нитчатых фагах фрагментов вариантов FabR3 с большей реакционной способностью по отношению к внеклеточной области EGFR человека.Example 2. Selection and characterization of FabR3 variant fragments displayed on filamentous phages with greater reactivity towards the extracellular region of human EGFR.
Разработали стратегию небольшой рандомизации из 25 остатков, расположенных в выступающих сегментах трех CDR (согласно определению AbM) тяжелой цепи нимотузумаба. Большинство из них (24/25) заменили комбинацией, которая потенциально содержала все 20 аминокислот, но сохраняла первоначальный остаток в большинстве молекул библиотеки. С этой целью вводили вырожденные кодоны, которые сохранили исходный нуклеотид в 90% в каждой позиции, в то время как оставшиеся 10% соответствовали эквимолярной смеси трех других нуклеотидов. Другой остаток (F29) заменяли только другими гидрофобными остатками (I, L, М, V), хотя исходный остаток преобладал в большинстве молекул библиотеки. Чтобы сделать это, применяли вырожденный кодон, в положениях 1 и 3 триплета в 90% случаев содержался исходный нуклеотид (Т и С соответственно), в то время как оставшиеся 10% случаев соответствовали эквимолярной смеси трех других нуклеотидов, вторую позицию триплета (Т) не модифицировали. Разработанную библиотеку конструировали в формате Fab путем клонирования вариабельных областей в вектор pCES-1. Таким образом, создавали библиотеку вариантов Fab нимотузумаба, состоящую из 1,5х107 членов.A small randomization strategy of 25 residues located in the overhangs of three CDRs (as defined by AbM) of the nimotuzumab heavy chain was developed. Most of these (24/25) were replaced with a combination that potentially contained all 20 amino acids but retained the original residue in most of the library molecules. For this purpose, degenerate codons were introduced that retained 90% of the original nucleotide at each position, while the remaining 10% corresponded to an equimolar mixture of the other three nucleotides. Another residue (F29) was replaced only by other hydrophobic residues (I, L, M, V), although the original residue predominated in most of the library molecules. To do this, a degenerate codon was used, in positions 1 and 3 of the triplet, 90% of the cases contained the original nucleotide (T and C, respectively), while the remaining 10% of cases corresponded to an equimolar mixture of the other three nucleotides, the second position of the triplet (T) not modified. The developed library was constructed in Fab format by cloning the variable regions into the pCES-1 vector. Thus, a library of nimotuzumab Fab variants consisting of 1.5 x 10 7 members was created.
Фаги, полученные из библиотеки, очищали осаждением с полиэтиленгликолем в соответствии с раPhages obtained from the library were purified by polyethylene glycol precipitation according to
- 6 043759 нее установленными процедурами (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). Для выделения функциональных отображенных на фаге мутированных вариантов FabR3, обладающих большей способностью связываться с их антигеном, вирусные частицы инкубировали на иммунотрубках (Nunc, Дания), покрытых Her1. После удаления не связавшихся фагов с помощью промывки, связавшиеся фаги элюировали инкубацией с основным раствором триэтиламина. Бактерий штамма TG1 инфицировали отобранными фагами, которые амплифицировали фагом-помощником M13KO7, и применяли в качестве исходного материала для нового раунда селекции. Проводили три раунда селекции фагов и наблюдали увеличение реакционной способности смеси фагов в отношении Her1 по мере увеличения числа циклов (фиг. 2). Секвенирование генов, встроенных в отобранную фагмиду, полученную в третьем цикле селекции, выявило 11 уникальных последовательностей, разделенных на две группы (фиг. 3). Первая группа состояла из вариантов, в которых рандомизировали только CDR2, и вторая группа включала молекулы, в которых появились мутации в CDR1 и CDR2.- 6 043759 not established procedures (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). To isolate functional phage-displayed mutated FabR3 variants that have a greater ability to bind to their antigen, viral particles were incubated on immunotubes (Nunc, Denmark) coated with Her1. After removing unbound phages by washing, bound phages were eluted by incubation with a basic triethylamine solution. Bacteria of strain TG1 were infected with selected phages, which were amplified with helper phage M13KO7, and used as starting material for a new round of selection. Three rounds of phage selection were performed and an increase in the reactivity of the phage mixture towards Her1 was observed as the number of cycles increased (Fig. 2). Sequencing of genes embedded in the selected phagemid obtained in the third round of selection revealed 11 unique sequences divided into two groups (Fig. 3). The first group consisted of variants in which only CDR2 was randomized, and the second group included molecules in which mutations in CDR1 and CDR2 appeared.
Пример 3: Демонстрация повышения реактивности новых отображенных на нитевидных фагах вариантов FabR3 по отношению к внеклеточной области hEGFR.Example 3: Demonstration of increased reactivity of novel filament phage-displayed variants of FabR3 towards the extracellular region of hEGFR.
Компетентных бактерий штамма E.coli TG1 трансформировали выявленными после трех раундов селекции генетическими конструкциями, которые содержали уникальные последовательности, отличные от последовательности исходного нимотузумаба. На основании этих последовательностей получали и очищали фаги, отображающие варианты FabR3. Для определения реакционной способности этих новых вариантов в отношении Her1 определяли распознавание препаратов фагов препаратов при различных концентрациях вирусных частиц с помощью ELISA. Все оцененные варианты, 6 с мутациями исключительно в CDR2 (фиг. 4А) и 5 с мутациями в CDR1 и CDR2 (фиг. 4Б), показали более высокую реактивность по отношению к Her1, чем исходный FabR3 при различных протестированных концентрациях. Кроме того, с помощью мутагенеза по Кункелю сконструировали два новых варианта, сочетавшие мутации CDR2, которые больше всего повышали реактивность, и наиболее часто повторявшуюся мутацию CDR1 (фиг. 5А). Распознавание этих новых вариантов оценивали с помощью ELISA. Комбинация мутаций была совместима, потому что оба варианта показали более высокую реактивность к Her1, чем исходный FabR3, отображенный на фаге (фиг. 5Б).Competent bacteria of the E. coli TG1 strain were transformed with genetic constructs identified after three rounds of selection that contained unique sequences different from the sequence of the original nimotuzumab. Based on these sequences, phages displaying FabR3 variants were prepared and purified. To determine the reactivity of these new variants toward Her1, drug recognition of phage drugs was determined at various concentrations of viral particles using ELISA. All variants evaluated, 6 with mutations exclusively in CDR2 (Fig. 4A) and 5 with mutations in CDR1 and CDR2 (Fig. 4B), showed higher reactivity toward Her1 than the parent FabR3 at the various concentrations tested. In addition, two new variants were constructed using Kunkel mutagenesis, combining the mutations in CDR2 that most increased reactivity and the most frequently repeated mutation in CDR1 ( Fig. 5A ). Recognition of these new variants was assessed using ELISA. The combination of mutations was compatible because both variants showed higher reactivity to Her1 than the original FabR3 displayed on the phage (Fig. 5B).
Пример 4. Демонстрация повышенной аффинности новых вариантов нимотузумаба, продуцируемых в виде растворимого белка в клетках млекопитающих.Example 4 Demonstration of increased affinity of new variants of nimotuzumab produced as a soluble protein in mammalian cells.
Гены, кодирующие исходный VH нимотузумаба (R3 mAb) и VH двух сконструированных вариантов нимотузумаба с мутациями в CDR1 и CDR2, как описано в примере 3 (фиг. 5А), которые были названы K4 и K5, а также исходную вариабельную область легкой цепи каппа (VK) нимотузумаба клонировали в векторы экспрессии клеток млекопитающих pSV-gpt и pSV-hyg соответственно (Orlandi, R. et al., PNAS: 3833-3837, 1989). Векторы с представляющими интерес генами линеаризировали ферментом Pvu I и осаждали в присутствии этанола. ДНК, восстановленную в фосфатно-солевом буферном растворе, применяли для электропорации клеток NS0. Для получения клонов, продуцирующих mAb R3, K4 и K5, ко-трансфицировали 4 мкг вектора pSV-gpt с соответствующим VH (табл. 1) и 8 мкг вектора pSV-hyg-VK исходного нимотузумаба. Процедуру получения стабильных клонов проводили с использованием ксантина, гипоксантина и микофеноловой кислоты в качестве агентов для селекции. Эта методология позволила получить три представляющие интерес молекулы, такие как AT изотипа IgG1 и с легкой цепью каппа. Полученные AT очищали от супернатанта с помощью аффинной хроматографии с белком А.The genes encoding the original VH of nimotuzumab (R3 mAb) and the VH of two engineered variants of nimotuzumab with mutations in CDR1 and CDR2 as described in Example 3 (Fig. 5A), which were named K4 and K5, as well as the original kappa light chain variable region ( VK) nimotuzumab was cloned into the mammalian cell expression vectors pSV-gpt and pSV-hyg, respectively (Orlandi, R. et al., PNAS: 3833-3837, 1989). Vectors containing genes of interest were linearized with the enzyme Pvu I and precipitated in the presence of ethanol. DNA reconstituted in phosphate-buffered saline was used to electroporate NS0 cells. To obtain clones producing mAbs R3, K4, and K5, 4 μg of the pSV-gpt vector with the corresponding VH (Table 1) and 8 μg of the pSV-hyg-VK vector of the original nimotuzumab were co-transfected. The procedure for obtaining stable clones was carried out using xanthine, hypoxanthine and mycophenolic acid as selection agents. This methodology yielded three molecules of interest, such as AT isotype IgG1 and kappa light chain. The resulting AT was purified from the supernatant using protein A affinity chromatography.
Таблица 1Table 1
Описание генов VH и VL,примененных в ко-трансфекции клеток NS0 с целью получения mAb R3, K4 и K5Description of the VH and VL genes used in co-transfection of NS0 cells to obtain mAbs R3, K4 and K5
Чтобы продемонстрировать, что мутации, полученные на фагах, которые в этом формате проявляли большую реактивность по отношению к Her1, вызывали тот же эффект в полноразмерных AT, было принято решение измерить аффинность по Biacore. Во-первых, Fab, полученные из mAb R3, K4 и K5, получали ферментативным расщеплением папаином и последующим разделением белком А. Как показано в табл. 2, новые mAb K4 и K5 показали увеличение аффинности в 3 и 3,6 раз, соответственно, по отношению к mAb R3.To demonstrate that mutations generated in phages that were more reactive to Her1 in this format had the same effect in full-length AT, we decided to measure Biacore affinity. First, Fabs derived from mAbs R3, K4 and K5 were obtained by enzymatic digestion with papain and subsequent separation with protein A. As shown in Table. 2, the new mAbs K4 and K5 showed a 3- and 3.6-fold increase in affinity, respectively, relative to mAb R3.
- 7 043759- 7 043759
Таблица 2table 2
Увеличение аффинности mAb K4 и K5 по отношению к нимотузумабуIncreased affinity of mAbs K4 and K5 for nimotuzumab
Пример 5. Fab, полученный из mAb K4 и K5, продуцируемых в клетках млекопитающих, показал большее распознавание линии клеток аденокарциномы легкого Н125 человека, чем Fab, полученный из нимотузумаба.Example 5 Fab derived from mAbs K4 and K5 produced in mammalian cells showed greater recognition of the human lung adenocarcinoma H125 cell line than Fab derived from nimotuzumab.
Определили способность Fab, происходящих из mAb K4 и K5, распознавать молекулу Her1. В этом случае распознавание Her1 оценивали с помощью проточной цитометрии в клеточной линии, в естественном контексте этой молекулы. С этой целью Fab, происходящие из mAb R3, K4 и K5, инкубировали в концентрации 1,25 мкг/мл с клеточной линией аденокарциномы легкого Н125 человека, которая имеет среднюю экспрессию рецептора. Fab, связанные с Her1 на мембране клеток, детектировали с помощью мышиных mAb против легкой цепи каппа человека, конъюгированных с фикоэритрином. Как показано на фиг. 6А, Fab, происходящий из mAb K4 и K5, распознавали более высокий процент Her1положительных клеток и с более высокой средней интенсивностью флуоресценции (FMI) (фиг. 6Б) по сравнению с Fab, происходящим из mAb R3.The ability of Fabs derived from mAbs K4 and K5 to recognize the Her1 molecule was determined. In this case, Her1 recognition was assessed by flow cytometry in a cell line, in the natural context of this molecule. For this purpose, Fabs derived from mAbs R3, K4 and K5 were incubated at a concentration of 1.25 μg/ml with the human lung adenocarcinoma cell line H125, which has intermediate receptor expression. Fabs bound to Her1 on the cell membrane were detected using mouse anti-human kappa light chain mAb conjugated to phycoerythrin. As shown in FIG. 6A, Fab derived from mAbs K4 and K5 recognized a higher percentage of Her1-positive cells and with a higher mean fluorescence intensity (FMI) (Fig. 6B) compared to Fab derived from mAb R3.
Пример 6: Увеличение аффинности mAb K4 и K5 приводило к большей способности этих AT ингибировать EGF-опосредованное фосфорилирование EGFR.Example 6: Increasing the affinity of mAbs K4 and K5 resulted in a greater ability of these ATs to inhibit EGF-mediated phosphorylation of EGFR.
Чтобы определить способность новых mAb ингибировать EGF-опосредованное фосфорилирование, проводили анализ методом вестерн-блоттинга. Применяли две клеточные линии:To determine the ability of the new mAbs to inhibit EGF-mediated phosphorylation, Western blot analysis was performed. Two cell lines were used:
линия клеток аденокарциномы легкого человека Н125 (средняя экспрессия EGFR);human lung adenocarcinoma cell line H125 (medium EGFR expression);
аденокарцинома молочной железы с метастазами в плевральную жидкость человеческого происхождения MDA-MB-468 (высокая экспрессия EGFR).breast adenocarcinoma with metastases to pleural fluid of human origin MDA-MB-468 (high expression of EGFR).
Клетки обрабатывали в течение 2 часов mAb R3, K4 и K5 в концентрациях 10 мкг/мл, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл. Затем среду удаляли для элиминации не связавшихся с клетками mAb, добавляли свежую среду с EGF человека в течение 10 минут, чтобы вызвать фосфорилирование рецептора. Затем в буфере RIPA данные клетки, подвергнутые различным видам обработки, подвергали лизису. Концентрацию белка определяли количественно в соответствии с инструкциями набора реагентов для бицинхониновой кислоты (Pierce). 25 мкг белка из лизата наносили в 9% SDS-PAGE гель и белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Первичные AT против pEGFR (Y1068) полученные в кролике, применяли для обнаружения фосфорилированного EGFR (Phospho-EGFR). Содержание белка визуализировали с помощью вторичных антител против антител кролика, связанных с флуорофором HRP, с последующим добавлением хемилюминесцентного субстрата (Pierce). На графиках показан сигнал, полученный с помощью PhosphoEGFR, который показывает количество данного белка в клеточном лизате. Как показано на фиг. 7, при всех оцененных концентрациях mAb K4 и K5 показали большую способность ингибировать EGFопосредованное фосфорилирование EGFR в обеих клеточных линиях по сравнению с нимотузумабом. Кроме того, оба mAb при самой низкой протестированной концентрации имеют больший или тот же эффект, что и нимотузумаб при самой высокой оцененной концентрации (в 4 раза более концентрированной). Хотя для всех mAb ингибирование больше в линии MDA-MB-468 с более высокой экспрессией рецептора (фиг. 7Б), важно подчеркнуть, что ингибирующий эффект mAb K4 и K5 не теряется в клеточной линии с более низкой экспрессией рецептора (фиг. 7А), как это происходит с нимотузумабом. Вышеуказанное обеспечивает преимущество применения таких новых mAb, полученных путем включения мутаций в вариабельную область нимотузумаба, которые приводят к большей аффинности к его лиганду и более высокой биологической активности.Cells were treated for 2 hours with mAbs R3, K4, and K5 at concentrations of 10 μg/ml, 5 μg/ml, and 2.5 μg/ml. The medium was then removed to eliminate unbound mAbs, and fresh human EGF medium was added for 10 minutes to induce receptor phosphorylation. These treated cells were then lysed in RIPA buffer. Protein concentration was quantified according to the instructions of the bicinchoninic acid reagent kit (Pierce). 25 μg of protein from the lysate was loaded on a 9% SDS-PAGE gel and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. Primary Ab against pEGFR (Y1068) obtained in rabbit was used to detect phosphorylated EGFR (Phospho-EGFR). Protein content was visualized using a secondary anti-rabbit antibody coupled to an HRP fluorophore, followed by the addition of a chemiluminescent substrate (Pierce). The graphs show the signal obtained using PhosphoEGFR, which indicates the amount of a given protein in the cell lysate. As shown in FIG. 7, at all concentrations assessed, mAbs K4 and K5 showed greater ability to inhibit EGF-mediated EGFR phosphorylation in both cell lines compared to nimotuzumab. In addition, both mAbs at the lowest concentration tested have greater or the same effect as nimotuzumab at the highest concentration tested (4 times more concentrated). Although for all mAbs the inhibition is greater in the MDA-MB-468 line with higher receptor expression (Figure 7B), it is important to emphasize that the inhibitory effect of mAbs K4 and K5 is not lost in the cell line with lower receptor expression (Figure 7A). as is the case with nimotuzumab. The above provides the advantage of using such new mAbs obtained by introducing mutations in the variable region of nimotuzumab, which lead to greater affinity for its ligand and higher biological activity.
--
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2017-0148 | 2017-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043759B1 true EA043759B1 (en) | 2023-06-21 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110305213B (en) | anti-B7-H3 antibody, preparation method thereof, conjugate thereof and application thereof | |
| JP6359372B2 (en) | Bispecific chimeric protein containing DARPin | |
| JP6967853B2 (en) | Antibodies that bind to ErbB-2 and ErbB-3 | |
| US9505843B2 (en) | Anti-Her3 scFV fragment and bispecific anti-c-Met/anti-Her3 antibodies comprising the same | |
| TWI426083B (en) | Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions | |
| CN111094351B (en) | Antibodies that bind EGFR and cMET | |
| US9808507B2 (en) | Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody | |
| US10000569B2 (en) | Anti-cMet/anti-EGFR/anti-HER3 multispecific antibodies and use thereof | |
| CA3013584C (en) | Antibody against egfrviii and use thereof | |
| KR20150097304A (en) | Anti-EGFR/Anti-HER2 Bispecific Antibodies With Anti-EGFR DARPins | |
| Lee et al. | Multi-paratopic VEGF decoy receptor have superior anti-tumor effects through anti-EGFRs and targeted anti-angiogenic activities | |
| US11718676B2 (en) | Antibodies with increased affinity for the epidermal growth factor receptor and fragments derived therefrom | |
| EA043759B1 (en) | ANTIBODIES WITH INCREASED AFFINITY FOR THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR AND FRAGMENTS DERIVED FROM THEM | |
| JP6502619B2 (en) | Target-specific composition for removing cell membrane proteins | |
| CN110637032B (en) | anti-DR 5 antibodies and uses thereof | |
| WO2024173565A2 (en) | Human synthetic antibodies targeting human epidermal growth factor receptor 2 (her2) mutants | |
| WO2023086998A2 (en) | Compositions and methods for rare heparan sulfate glycan-targeted cancer treatment | |
| KR20230161759A (en) | Antibodies regulating functions of a CC chemokine receptor 7 |