EA043757B1 - METHOD FOR INCREASING SECRETION LEVELS OF INTERLEUKIN-2 AND PROTEINS OBTAINED FROM IT - Google Patents
METHOD FOR INCREASING SECRETION LEVELS OF INTERLEUKIN-2 AND PROTEINS OBTAINED FROM IT Download PDFInfo
- Publication number
- EA043757B1 EA043757B1 EA201991093 EA043757B1 EA 043757 B1 EA043757 B1 EA 043757B1 EA 201991093 EA201991093 EA 201991093 EA 043757 B1 EA043757 B1 EA 043757B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- human
- muteins
- ability
- receptor
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 24
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims description 16
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 title description 86
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 title description 85
- 102220511387 Proteasome subunit beta type-10_K35E_mutation Human genes 0.000 claims description 49
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102220345545 c.103A>C Human genes 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 17
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 15
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 102220520422 DNA polymerase beta_K35R_mutation Human genes 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102220500923 Telomerase reverse transcriptase_K35D_mutation Human genes 0.000 description 5
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 4
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 102220500914 Telomerase reverse transcriptase_K35R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108700004922 F42A Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102220596838 Non-structural maintenance of chromosomes element 1 homolog_R38A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102220505697 Palmitoyl-protein thioesterase 1_Y45F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102220495631 Putative uncharacterized protein LOC645739_F42A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 102220427331 c.274A>T Human genes 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102200142011 rs121909050 Human genes 0.000 description 1
- 102200131576 rs121912452 Human genes 0.000 description 1
- 102200041867 rs121918148 Human genes 0.000 description 1
- 102200158049 rs387906619 Human genes 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу введения мутаций в ген интерлейкина-2 (IL-2), которые приводят к увеличению уровней секреции указанной молекулы и полученного из нее семейства иммуномодулирующих мутеинов, не затрагивая их биологические функции.The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for introducing mutations in the interleukin-2 (IL-2) gene, which lead to increased secretion levels of the specified molecule and the family of immunomodulatory muteins derived from it, without affecting their biological functions.
Уровень техникиState of the art
IL-2, изначально описанный как фактор роста Т-клеток (Smith, KA Immunol. Rev. 51:337-357, 1980), впоследствии оказался регулятором с двойными функциями в иммунном ответе (Malek, TR Annu. Rev. Immunol. 26:453-479, 2008; Hoyer KK et al., Immunol. Rev. 226:19-28, 2008), который может стимулировать или осуществлять негативную модуляцию эффекторных функций иммунной системы. В настоящее время считается, что его основная роль связана с поддержанием иммунологической толерантности (Malek, TR & Bayer, AL Nat. Rev. Immunol. 4:665-674, 2004) путем стимуляции регуляторных Т-клеток, которые конститутивно экспрессируют высокие уровни альфа-цепи рецептора IL-2. Хотя бета- и гаммасубъединицы образуют димерный рецептор, обладающий промежуточным сродством, конститутивно присутствующий в эффекторных клетках иммунной системы, постоянное наличие высоких уровней альфа-цепи обеспечивает регуляторные Т-клетки высокоаффинным тримерным рецептором, который позволяет этой клеточной популяции преимущественно использовать цитокин (Malek, T.R. & Castro, I. Immunity. 33: 153-165, 2010).IL-2, originally described as a T cell growth factor (Smith, KA Immunol. Rev. 51:337-357, 1980), subsequently emerged as a regulator with dual functions in the immune response (Malek, TR Annu. Rev. Immunol. 26: 453-479, 2008; Hoyer KK et al., Immunol. Rev. 226:19-28, 2008), which can stimulate or negatively modulate effector functions of the immune system. Its primary role is now thought to be in the maintenance of immunological tolerance (Malek, TR & Bayer, AL Nat. Rev. Immunol. 4:665-674, 2004) by stimulating regulatory T cells that constitutively express high levels of alpha IL-2 receptor chains. Although the beta and gamma subunits form an intermediate-affinity dimeric receptor present constitutively on effector cells of the immune system, the persistent presence of high levels of the alpha chain provides regulatory T cells with a high-affinity trimeric receptor that allows this cell population to preferentially utilize the cytokine (Malek, T.R. & Castro, I. Immunity. 33: 153-165, 2010).
Функциональную дихотомию IL-2 использовали для получения противоположных терапевтических эффектов на иммунную систему и модулирования нужного иммунного ответа в различных ситуациях. Его иммунопотенцирующую способность использовали для стимуляции противоопухолевых реакций (Klapper, J.A. et al., Cancer. 113:293-301, 2008). С другой стороны, способность IL-2 стимулировать преимущественно Т-регуляторные клетки использовали путем применения низких доз, недостаточных для стимуляции эффекторных Т-клеток или получения токсических эффектов, для контроля аутоиммунных нарушений (Hartemann A. et. al, Lancet Diabetes Endocrinol. 1:295-305, 2013) и воспалительных заболеваний (Saadoun D. et al., N. Engl. J. Med. 365:2067-2077, 2011), а также заболеваний трансплантат против хозяина (Koreth, A. et al., N. Engl. J. Med. 365:2055-2066, 2011).The functional dichotomy of IL-2 has been used to produce opposing therapeutic effects on the immune system and modulate the desired immune response in different situations. Its immunopotentiating ability has been used to stimulate antitumor responses (Klapper, J.A. et al., Cancer. 113:293-301, 2008). On the other hand, the ability of IL-2 to stimulate predominantly T regulatory cells has been exploited by using low doses, insufficient to stimulate effector T cells or produce toxic effects, to control autoimmune disorders (Hartemann A. et. al, Lancet Diabetes Endocrinol. 1: 295-305, 2013) and inflammatory diseases (Saadoun D. et al., N. Engl. J. Med. 365:2067-2077, 2011), as well as graft-versus-host diseases (Koreth, A. et al., N Engl J Med 365:2055-2066, 2011).
В качестве способа получения мутеинов с разными иммуномодулирующими свойствами была предложена сегрегация взаимодействий IL-2 путем введения мутаций в различные участки связывания с субъединицами рецептора. Избирательное нарушение участка связывания альфа-цепи посредством направленного мутагенеза позволило получить молекулу, называемую не-альфа, которая имеет пониженную способность стимулировать регуляторные Т-клетки, но при этом сохраняет свое агонистическое действие на эффекторные клетки, несущие бета/гамма-димерный рецептор (Carmenate Т. et al., J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9206243 B2). Эта молекула демонстрирует сильный противоопухолевый эффект у мышей. С другой стороны, нарушение посредством мутагенеза участков связывания IL-2 с бета- и/или гамма-субъединицами может генерировать антагонисты рецептора IL-2, которые селективно модулируют стимуляцию различных популяций клеток (Shanafelt, AB et al., Nat. Biotechnol. 18:11971202, 2000; WO 2011/063770). Примерами молекул этого типа являются мутеины M1 и М2, описанные в патенте США 8759486 В2.Segregation of IL-2 interactions by introducing mutations into different binding sites of the receptor subunits has been proposed as a way to obtain muteins with different immunomodulatory properties. Selective disruption of the alpha chain binding site through site-directed mutagenesis produced a molecule called non-alpha, which has a reduced ability to stimulate regulatory T cells but retains its agonist effect on beta/gamma dimer receptor-bearing effector cells (Carmenate T et al., J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9206243 B2). This molecule demonstrates strong antitumor effects in mice. Alternatively, disruption by mutagenesis of the IL-2 beta and/or gamma subunit binding sites can generate IL-2 receptor antagonists that selectively modulate the stimulation of different cell populations (Shanafelt, AB et al., Nat. Biotechnol. 18: 11971202, 2000; WO 2011/063770). Examples of molecules of this type are the M1 and M2 muteins described in US Pat. No. 8,759,486 B2.
В дополнение к мутеинам, потерявшим свою способность к взаимодействию, были описаны мутированные варианты IL-2, обладающие свойствами суперагониста, обусловленными увеличением их способности связываться с той или иной субъединицей рецептора. Увеличение сродства к бета-субъединице приводит к продуцированию молекул, обеспечивающих мощную стимуляцию эффекторных клеток и обладающих сильным противоопухолевым эффектом (Levin, AM et al., Nature. 484:529-533, 2012). С другой стороны, повышенное сродство IL-2 к альфа-субъединице рецептора привело к появлению других вариантов суперагонистов с превосходной способностью стимулировать пролиферативный ответ Тклеток in vitro (WO 2005/007121).In addition to muteins that have lost their ability to interact, mutated variants of IL-2 have been described that have superagonist properties due to an increase in their ability to bind to one or another subunit of the receptor. Increased affinity for the beta subunit leads to the production of molecules that provide potent stimulation of effector cells and have a strong antitumor effect (Levin, AM et al., Nature. 484:529-533, 2012). On the other hand, the increased affinity of IL-2 for the alpha subunit of the receptor has led to the emergence of other superagonist variants with superior ability to stimulate T cell proliferative responses in vitro (WO 2005/007121).
Описанные выше полученные из IL-2 мутеины получали путем рационального конструирования, скрининга in silico и направленной эволюции IL-2, отображаемой на поверхности дрожжевых клеток. Хотя и было получено отображение биологически активного IL-2 на нитевидных фагах (Buchli, PJ и др., Arch. Biochem. Biophys. 339:79-84, 1997; Vispo, NS и др., Immunotechnology 3: 185-193, 1997), эта технологическая платформа еще не использовалась для отбора новых вариантов цитокинов с модифицированными свойствами.The IL-2-derived muteins described above were obtained through rational design, in silico screening, and directed evolution of IL-2 displayed on the surface of yeast cells. Although biologically active IL-2 has been shown to display on filamentous phages (Buchli, PJ et al., Arch. Biochem. Biophys. 339:79-84, 1997; Vispo, NS et al., Immunotechnology 3: 185-193, 1997 ), this technology platform has not yet been used to select new cytokine variants with modified properties.
Помимо иммуномодулирующих свойств IL-2 и полученных из него мутеинов, важным элементом для их терапевтического использования является разработка систем, обеспечивающих их получение в достаточных количествах, в частности в масштабе лаборатории и в промышленном масштабе, или путем трансфекции или трансдукции нормальных и/или опухолевых клеток или тканей.In addition to the immunomodulatory properties of IL-2 and its derived muteins, an important element for their therapeutic use is the development of systems that ensure their production in sufficient quantities, in particular on a laboratory scale and on an industrial scale, or by transfection or transduction of normal and/or tumor cells or fabrics.
Основным способом рекомбинантного продуцирования IL-2 и других родственных молекул является экспрессия в цитоплазме E.coli, в которой образуются тельца включения, с последующими процедурами ренатурации in vitro (Devos R. et al., Nucl. Acids Res. 11:4307-4323, 1983; Weir, MP & Sparks, J., Biochem. J. 245: 85-91, 1987). Несмотря на уже продемонстрированную полезность этой стратегии продолжается изучение других систем экспрессии, которые сразу приводят к получению правильно свернутыхThe main method for recombinant production of IL-2 and other related molecules is expression in the cytoplasm of E. coli, in which inclusion bodies are formed, followed by in vitro renaturation procedures (Devos R. et al., Nucl. Acids Res. 11:4307-4323, 1983; Weir, MP & Sparks, J., Biochem J. 245: 85-91, 1987). Despite the already demonstrated utility of this strategy, other expression systems that immediately result in correctly folded proteins continue to be explored.
- 1 043757 молекул, очень похожих на природный IL-2. Секреция IL-2 в некоторых из этих систем экспрессии ограничена тенденцией IL-2 к агрегации (Halfmann G. et al., J. Gen. Microbiol. 139:2465-2473, 1993; Cha, HJ et al., Biochem. Eng. J. 24: 225-233, 2005).- 1,043,757 molecules very similar to natural IL-2. Secretion of IL-2 in some of these expression systems is limited by the tendency of IL-2 to aggregate (Halfmann G. et al., J. Gen. Microbiol. 139:2465-2473, 1993; Cha, H. J. et al., Biochem. Eng. J. 24: 225-233, 2005).
Авторами настоящего изобретения неожиданно было найдено несколько мутаций, которые не были описаны ранее или получение которых невозможно предсказать, исходя из анализа кристаллической структуры человеческого IL-2, но введение которых увеличивает способность различных типов клеток секретировать рекомбинантный человеческий IL-2 и многочисленные мутеины, полученные из IL-2, обладающие специфическими иммуномодулирующими свойствами. Это открытие дает основу для использования этих мутаций в промышленном масштабе.The present inventors have unexpectedly discovered several mutations that have not been previously described or the production of which cannot be predicted based on analysis of the crystal structure of human IL-2, but the introduction of which increases the ability of various cell types to secrete recombinant human IL-2 and numerous muteins derived from IL-2, which has specific immunomodulatory properties. This discovery provides the basis for exploiting these mutations on an industrial scale.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу, который обеспечивает увеличение уровней секреции рекомбинантного человеческого IL-2 у разных хозяев, не оказывая влияния на их биологические функции. Указанный способ основан на введении уникальных мутаций в гены, кодирующие человеческий IL-2 и другие полученные из него полипептиды, которые включают, без ограничения, полученные из человеческого IL-2 мутеины, сконструированные таким образом, чтобы они действовали в качестве антагонистов, суперагонистов или селективных агонистов. Уровни секреции указанных белков, получаемых способами по настоящему изобретению, превышают по меньшей мере в три раза уровни секреции немутантных аналогов. В настоящем изобретении производные мутеины относятся к мутеинам, которые имеют более 90% идентичности с человеческим IL-2.In one embodiment, the present invention provides a method that increases secretion levels of recombinant human IL-2 in different hosts without affecting their biological functions. This method is based on the introduction of unique mutations in the genes encoding human IL-2 and other polypeptides derived from it, which include, without limitation, muteins derived from human IL-2, designed to act as antagonists, superagonists or selective agonists. The secretion levels of these proteins produced by the methods of the present invention are at least three times higher than the secretion levels of their non-mutant counterparts. In the present invention, derived muteins refer to muteins that have more than 90% identity with human IL-2.
Способ по настоящему изобретению относится к мутациям, которые приводят к неконсервативной замене аминокислоты в положении 35 первичной последовательности белка (Lys в исходной последовательности), предпочтительно заменам К35Е, K35D и K35Q.The method of the present invention relates to mutations that result in a non-conservative amino acid substitution at position 35 of the primary protein sequence (Lys in the original sequence), preferably the K35E, K35D and K35Q substitutions.
В частности, настоящее изобретение относится к белкам, полученным описанным в настоящей заявке способом, выбранным из группы, содержащей SEQ ID NO: 1-18.In particular, the present invention relates to proteins obtained by the method described herein, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-18.
Объектом настоящего изобретения также являются генетические конструкции, которые включают описанные выше мутированные гены, слитые с другими нуклеотидными последовательностями, кодирующими синтез слитых белков, которые образованы IL-2 или другими полученными из него иммуномодулирующими полипептидами и дополнительными последовательностями белков. Дополнительные последовательности белков включают, без ограничения, капсидные белки нитевидных фагов, альбумин, Fc-область антител, цельные антитела или фрагменты антител, которые включают вариабельные домены.The present invention also provides genetic constructs that include the above-described mutated genes fused to other nucleotide sequences encoding the synthesis of fusion proteins that are formed by IL-2 or other immunomodulatory polypeptides derived therefrom and additional protein sequences. Additional protein sequences include, but are not limited to, filamentous phage capsid proteins, albumin, the Fc region of antibodies, whole antibodies, or antibody fragments that include variable domains.
В конкретном варианте осуществления хозяева, которые используются для получения описанных выше молекул, включают, без ограничения, клетки E.coli, дрожжей и млекопитающих, такие как, помимо прочего, HEK-293, СНО, NSO. Способ по настоящему изобретению можно использовать для повышения эффективности продуцирования IL-2 и других полученных из IL-2 полипептидов как в масштабе лаборатории, так и в промышленном масштабе. Белки, полученные способом по настоящему изобретению, можно использовать в терапевтических целях.In a specific embodiment, the hosts that are used to produce the molecules described above include, but are not limited to, E. coli, yeast and mammalian cells, such as, but not limited to, HEK-293, CHO, NSO. The method of the present invention can be used to increase the efficiency of production of IL-2 and other IL-2-derived polypeptides both on a laboratory scale and on an industrial scale. Proteins obtained by the method of the present invention can be used for therapeutic purposes.
В другом варианте осуществления задачей настоящего изобретения является как in vitro, так и in vivo модификация физиологии нормальных и опухолевых клеток и/или тканей через экспрессию человеческого IL-2 и/или семейства иммуномодулирующих мутеинов, полученных из него (отдельно или слитых с другими белками). Примером является трансдукция Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов или NK-клеток для терапии адоптивного переноса; или прямая трансдукция/трансфекция опухолевой ткани. В этих случаях, способ по настоящему изобретению можно использовать для увеличения секреции представляющих интерес молекул.In another embodiment, the object of the present invention is to modify, both in vitro and in vivo, the physiology of normal and tumor cells and/or tissues through the expression of human IL-2 and/or a family of immunomodulatory muteins derived therefrom (alone or fused to other proteins) . An example is the transduction of T lymphocytes, B lymphocytes or NK cells for adoptive transfer therapy; or direct transduction/transfection of tumor tissue. In these cases, the method of the present invention can be used to increase the secretion of molecules of interest.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Настоящее изобретение относится к способу, который обеспечивает повышенные уровни секреции рекомбинантного человеческого IL-2 у разных хозяев, не оказывая влияние на их биологические функции. Указанный способ основан на введении уникальных мутаций в гены, кодирующие человеческий IL2 и другие полученные из него полипептиды, которые включают, без ограничения, полученные из человеческого IL-2 мутеины, сконструированные таким образом, чтобы они действовали в качестве антагонистов, суперагонистов или селективных агонистов.The present invention relates to a method that provides increased levels of secretion of recombinant human IL-2 in different hosts without affecting their biological functions. This method is based on the introduction of unique mutations in the genes encoding human IL2 and other polypeptides derived from it, which include, without limitation, muteins derived from human IL-2, designed to act as antagonists, superagonists or selective agonists.
Идентификация мутаций, увеличивающих способность белков, получаемых из человеческого IL-2, отображаться на нитевидных фагах.Identification of mutations that increase the ability of human IL-2-derived proteins to display on filamentous phages.
Полипептиды, полученные из человеческого IL-2, с уникальными мутациями, которые приводят к увеличению их уровней отображения на нитевидных фагах, могут быть выбраны из библиотек, состоящих из более чем 108 молекул, презентированных на нитевидных фагах. Гены, соответствующие указанным полипептидам, могут быть вставлены в векторы экспрессии фагемидного типа (слитые с одним из генов, кодирующих капсидные белки нитевидного фага) и использованы для получения вирусных частиц, которые отображают на своей поверхности варианты белка. Исходные библиотеки могут включать разные степени диверсификации всей последовательности или в наборе заранее определенных положений. Каждый из первичных остатков в этих положениях может быть заменен смесью из 20 аминокислот или подмножеством выбранных остатков. Диверсификация может быть достигнута путем случайного или сайт-направленного мутагенеза.Polypeptides derived from human IL-2 with unique mutations that result in increased levels of their display on filamentous phages can be selected from libraries consisting of more than 10 8 molecules presented on filamentous phages. The genes corresponding to these polypeptides can be inserted into phagemid-type expression vectors (fused with one of the genes encoding the capsid proteins of the filamentous phage) and used to produce viral particles that display protein variants on their surface. Source libraries may include varying degrees of diversification throughout the sequence or at a set of predefined positions. Each of the primary residues at these positions may be replaced by a mixture of 20 amino acids or a subset of selected residues. Diversification can be achieved by random or site-directed mutagenesis.
- 2 043757- 2 043757
Отбор фагов с повышенными уровнями экспрессии человеческого IL-2 может быть осуществлен путем инкубации смеси фагов из библиотек вместе с молекулой-селектором, иммобилизованной на твердой поверхности, удалении несвязанных фагов путем промывки и элюции связанных фагов в условиях, которые предотвращают взаимодействия между белками. В качестве молекулы-селектора можно использовать одну из субъединиц рецептора рекомбинантного IL-2 или моноклональное антитело, направленное против IL-2 или пептида, генетически слитого с ним. В аналогичных условиях может быть выполнено несколько последовательных циклов отбора. Анализ последовательностей ДНК, встроенных в выбранные фагемиды, может выявить закономерности, позволяющие идентифицировать более распространенные замены, потенциально связанные с увеличением способности отображаться на фагах.Selection of phages with elevated levels of human IL-2 expression can be accomplished by incubating a mixture of phages from libraries together with a selector molecule immobilized on a solid surface, removing unbound phages by washing, and eluting bound phages under conditions that prevent protein-protein interactions. The selector molecule can be one of the subunits of the recombinant IL-2 receptor or a monoclonal antibody directed against IL-2 or a peptide genetically fused to it. Under similar conditions, several successive selection cycles can be performed. Analysis of DNA sequences integrated into selected phagemids may reveal patterns that allow the identification of more common substitutions potentially associated with increased ability to be displayed on phages.
Уровни отображения мутированных вариантов IL-2 можно оценить с помощью анализов связывания, таких как ELISA, на иммобилизованной молекуле захвата, не селективно распознающей различные мутантные варианты IL-2 и нативный эталон. В качестве молекулы захвата для этого типа анализов предпочтительным является антитело против маркерной пептидной последовательности, генетически слитой с вариантами IL-2, такой как пептид с-тус, слитой со всеми чужеродными белками в системе экспрессии на основе фагемидного вектора pCSM. Общность эффектов мутаций, выявленных при скрининге, описанном выше, в семействе полученных из IL-2 мутеинов можно продемонстрировать путем введения указанных замен в последовательности разных мутированных вариантов, описанных для человеческого IL-2, которые включают разное количество замен различной природы, с целью селективного воздействия на взаимодействия с различными субъединицами рецептора IL-2 с последующей модификацией их иммуномодулирующих функций. Все эти модифицированные мутеины отображают на нитевидных фагах путем вставки кодирующих их генов в фагемидные векторы. Оценка уровней отображения каждого мутеина на нитевидных фагах может быть выполнена методом ELISA, как описано для IL-2. В качестве эталона для расчета степени увеличения отображения на фаге, ассоциированной с введением замен, идентифицированных как часть настоящего изобретения, используются исходные мутеины без какихлибо дополнительных замен и их отображение на фагах. Альтернативно, способ по настоящему изобретению может быть осуществлен путем использования других платформ комбинаторной биологии, таких как отображение на клетках дрожжей или млекопитающих, для выбора вариантов IL-2 и/или полученных из него мутеинов с повышенными уровнями презентации на клеточной мембране.Display levels of mutated IL-2 variants can be assessed using binding assays, such as ELISA, on an immobilized capture molecule that does not selectively recognize different IL-2 mutant variants and the native reference. The preferred capture molecule for this type of assay is an antibody against a marker peptide sequence genetically fused to IL-2 variants, such as the c-myc peptide, fused to all foreign proteins in the pCSM phagemid vector-based expression system. The generality of the effects of the mutations identified in the screening described above in the family of IL-2-derived muteins can be demonstrated by introducing these substitutions into the sequence of the different mutated variants described for human IL-2, which include different numbers of substitutions of varying nature, for the purpose of selective effect on interactions with various subunits of the IL-2 receptor with subsequent modification of their immunomodulatory functions. All of these modified muteins are displayed on filamentous phages by inserting the genes encoding them into phagemid vectors. Assessment of the display levels of each mutein on filamentous phages can be performed by ELISA as described for IL-2. As a reference for calculating the degree of increase in phage display associated with the introduction of substitutions identified as part of the present invention, the original muteins without any additional substitutions and their phage display are used. Alternatively, the method of the present invention can be carried out by using other combinatorial biology platforms, such as display on yeast or mammalian cells, to select variants of IL-2 and/or muteins derived therefrom with increased levels of presentation on the cell membrane.
В ходе описанного выше процесса отбора в положении 35 могут возникать повторяющиеся неконсервативные мутации (в частности, К35Е, K35D и K35Q).During the selection process described above, recurrent non-conservative mutations may arise at position 35 (particularly K35E, K35D and K35Q).
Использование идентифицированных мутаций для увеличения уровней секреции человеческого IL2 и полученных из него мутеинов в виде растворимых белков и их ренатурация из телец включений.Use of identified mutations to increase secretion levels of human IL2 and its derived muteins as soluble proteins and their renaturation from inclusion bodies.
После идентификации группы мутаций, которые приводят к увеличенному отображению на нитевидных фагах человеческого IL-2 и полученных из него мутеинов можно продемонстрировать влияние этих же замен на секрецию растворимых белков путем введения их в соответствующие кодирующие гены, клонированные в растворимые векторы экспрессии для клеток дрожжей или млекопитающих. Оценка концентраций белков, секретируемых в супернатант клетками-хозяевами, содержащими указанные векторы экспрессии, позволяет продемонстрировать увеличение уровня секреции IL-2 и полученных из него мутеинов, ассоциированное с введением мутаций, которые используются в способе по настоящему изобретению, по сравнению с оригинальными аналогами, которые не включают указанные замены.Having identified a group of mutations that result in increased display on filament phages of human IL-2 and its derived muteins, the effect of these same substitutions on the secretion of soluble proteins can be demonstrated by introducing them into the corresponding coding genes cloned into soluble expression vectors for yeast or mammalian cells . Evaluation of the concentrations of proteins secreted into the supernatant by host cells containing these expression vectors allows us to demonstrate an increase in the level of secretion of IL-2 and muteins derived from it associated with the introduction of mutations that are used in the method of the present invention, compared with the original analogues, which do not include specified substitutions.
Альтернативно, увеличение продуцирования человеческого IL-2 и полученных из него мутеинов следует оценивать по трансфекции и/или трансдукции нормальных и/или опухолевых клеток и/или тканей in vivo или in vitro.Alternatively, increased production of human IL-2 and its muteins should be assessed by transfection and/or transduction of normal and/or tumor cells and/or tissues in vivo or in vitro.
Описанные выше исследования, в которых используется способ по настоящему изобретению, можно проводить, используя IL-2 и полученные из него мутеины в виде отдельных молекул или слитых с дополнительными полипептидными последовательностями, такими как альбумин, Fc-область иммуноглобулинов человека, цельные антитела или фрагменты антитела, полученные на основе его вариабельных областей.The studies described above using the method of the present invention can be carried out using IL-2 and muteins derived therefrom as single molecules or fused to additional polypeptide sequences such as albumin, human immunoglobulin Fc region, whole antibodies or antibody fragments , derived from its variable regions.
Мутации, описанные в настоящем изобретении, также могут быть использованы для улучшения процессов ренатурации in vitro человеческого IL-2 и полученных из него мутеинов, сформированных в виде телец включения в цитоплазме E.coli. Увеличение эффективности ренатурации можно оценить путем вычисления удельной биологической активности на массу белка относительно немутированного варианта.The mutations described in the present invention can also be used to improve the in vitro renaturation of human IL-2 and muteins derived from it, formed as inclusion bodies in the cytoplasm of E. coli. The increase in renaturation efficiency can be assessed by calculating the specific biological activity per protein mass relative to the unmutated variant.
Демонстрация совместимости используемых мутаций с биологическими функциями IL-2 и селективной модуляцией его взаимодействий с субъединицами рецептора.Demonstration of the compatibility of the mutations used with the biological functions of IL-2 and the selective modulation of its interactions with receptor subunits.
Оценка биологической активности вариантов IL-2, модифицированных способом по настоящему изобретению, может включать методы in vitro и in vivo с целью подтверждения сохранения их способности индуцировать пролиферацию, дифференцировку и активацию различных типов клеток, таких как субпопуляции Т-лимфоцитов, NK-клетки и клеточные линии лимфоидного происхождения, рост которых зависит от IL-2. Влияние нативного IL-2 на пролиферацию Т-лимфоцитов, экспрессирующих тримерный рецептор, можно определить с помощью анализа пролиферации клеточной линии CTLL-2 in vitro, используя колориметрический метод восстановления красителя аламарский голубой или метод про- 3 043757 точной цитометрии. Влияние in vitro нативного IL-2 на дифференцировку Т CD4+ лимфоцитов в Т регуляторные лимфоциты и способность этих молекул размножаться и активировать NK-клетки in vitro определяют методом проточной цитометрии.Evaluation of the biological activity of IL-2 variants modified by the method of the present invention may include in vitro and in vivo methods to confirm their continued ability to induce proliferation, differentiation, and activation of various cell types, such as T-lymphocyte subsets, NK cells, and lineages of lymphoid origin whose growth is dependent on IL-2. The effect of native IL-2 on the proliferation of T lymphocytes expressing the trimeric receptor can be determined using an in vitro proliferation assay of the CTLL-2 cell line using the Alamara Blue dye reconstitution colorimetric method or flow cytometry method. The in vitro effect of native IL-2 on the differentiation of T CD4+ lymphocytes into T regulatory lymphocytes and the ability of these molecules to proliferate and activate NK cells in vitro was determined by flow cytometry.
Совместимость мутаций, используемых в способе по настоящему изобретению, с селективной модуляцией взаимодействия IL-2 с его рецептором может быть подтверждена путем введения указанных замен в структуру мутеинов, ранее созданных и/или выбранных для увеличения или уменьшения их способности связываться с любой из субъединиц рецептора IL-2. Наличие требуемых изменений в свойствах связывания можно продемонстрировать путем непосредственного определения таких замен в экспериментах ELISA на микротитрационных планшетах, покрытых каждой из субъединиц рецептора. Ранее описанные анализы, используемые для характеристики иммуномодулирующей и/или противоопухолевой активности различных мутеинов in vitro и in vivo, можно использовать в качестве дополнительных инструментов проверки. В случае не-альфа мутеина (Carmenate, Т. у otros, J. Immunol. 190: 6230-6238, 2013) можно подтвердить, что он сохраняет способность стимулировать пролиферацию in vitro T CD8+ лимфоцитов на том же уровне, что и нативный IL-2. В случае мутеина с повышенной способностью связываться с бета-субъединицей рецептора, обладающего суперагонистической активностью (супер-бетамутеин), можно подтвердить, что он поддерживает более высокую способность стимулировать пролиферацию NK-клеток in vitro, чем нативный IL-2. В обоих случаях пролиферация может быть определена методом проточной цитометрии. Дифференциальное влияние на пролиферацию популяций in vivo можно определить в экспериментах по включению бромдезоксиуридина. Можно продемонстрировать, что в экспериментальной модели метастазирования, в которой используется линия меланомы MB16F0, оба мутеина вызывают более сильный противоопухолевый эффект in vivo, чем нативный IL-2.The compatibility of the mutations used in the method of the present invention with selective modulation of the interaction of IL-2 with its receptor can be confirmed by introducing the specified substitutions into the structure of muteins previously created and/or selected to increase or decrease their ability to bind to any of the IL receptor subunits -2. The presence of the desired changes in binding properties can be demonstrated by directly detecting such substitutions in ELISA experiments on microtiter plates coated with each of the receptor subunits. Previously described assays used to characterize the immunomodulatory and/or antitumor activities of various muteins in vitro and in vivo can be used as additional screening tools. In the case of non-alpha mutein (Carmenate, T. y otros, J. Immunol. 190: 6230-6238, 2013), it can be confirmed that it retains the ability to stimulate in vitro proliferation of T CD8+ lymphocytes at the same level as native IL- 2. In the case of a mutein with an increased ability to bind to the beta subunit of the receptor with superagonist activity (super-betamutein), it can be confirmed that it maintains a higher ability to stimulate NK cell proliferation in vitro than native IL-2. In both cases, proliferation can be determined by flow cytometry. Differential effects on the proliferation of populations in vivo can be determined by bromodeoxyuridine incorporation experiments. It can be demonstrated that in an experimental model of metastasis using the MB16F0 melanoma line, both muteins produce a stronger antitumor effect in vivo than native IL-2.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фиг. 1. Оценка уровней отображения на фаге мутированного IL-2 методом ELISA. Все препараты фага доводили до эквивалентной концентрации 1013 вирусных частиц/мл.Fig. 1. Assessment of phage display levels of mutated IL-2 by ELISA. All phage preparations were adjusted to an equivalent concentration of 10 13 viral particles/ml.
Фиг. 2. Оценка методом ELISA уровней секреции слитых белков, образованных либо IL-2, либо полученными из него мутеинами и Fc-областью человеческого IgG1. Клетки трансфицировали полиэтиленимином и генетическими конструкциями, кодирующими слитые белки, которые содержали:Fig. 2. Evaluation by ELISA of the secretion levels of fusion proteins formed either by IL-2 or muteins derived from it and the Fc region of human IgG1. Cells were transfected with polyethylenimine and genetic constructs encoding fusion proteins that contained:
a) IL-2 с мутацией К35Е и без нее;a) IL-2 with and without the K35E mutation;
b) не-альфа IL-2 (NA) с и без дополнительной мутации К35Е;b) non-alpha IL-2 (NA) with and without additional K35E mutation;
с) супер-бета IL-2 (SB) с и без К35Е;c) super-beta IL-2 (SB) with and without K35E;
d) не-гамма Ml IL-2 (NG M1) с и без К35Е;d) non-gamma Ml IL-2 (NG M1) with and without K35E;
e) не-гамма М2 IL-2 (NG M2) си без К35Е.e) non-gamma M2 IL-2 (NG M2) without K35E.
Фиг. 3. Сохранение молекулярных взаимодействий нативного IL-2 в варианте К35Е (ELISA).Fig. 3. Preservation of molecular interactions of native IL-2 in the K35E variant (ELISA).
Фиг. 4. Сохранение биологической активности IL-2 с заменой К35Е в анализе пролиферации CTLL-2.Fig. 4. Preservation of IL-2 biological activity with K35E substitution in the CTLL-2 proliferation assay.
Фиг. 5. Способность IL-2 с К35Е увеличивать IL-2-зависимые клеточные популяции in vivo;Fig. 5. The ability of IL-2 with K35E to increase IL-2-dependent cell populations in vivo;
5а - фотография селезенки мышей, которым инъецировали вариант IL-2 с К35Е и PBS;5a is a photograph of the spleen of mice injected with the IL-2 variant with K35E and PBS;
5b - гистограммы проточной цитометрии популяции клеток памяти с фенотипом CD3+CD8+ (CD44hi) в селезенке.5b - Flow cytometry histograms of a population of memory cells with the CD3+CD8+ phenotype (CD44hi) in the spleen.
Фиг. 6. Совместимость замены К35Е с потерей способности связываться с альфа-субъединицей рецептора IL-2, уже описанной для мутеина, полученного из IL-2 (ELISA). Микротитрационные планшеты покрывали альфа-субъединицей человека (а) и мыши (b).Fig. 6. Compatibility of the K35E substitution with the loss of the ability to bind to the alpha subunit of the IL-2 receptor, already described for the IL-2-derived mutein (ELISA). Microtiter plates were coated with human (a) and mouse (b) alpha subunit.
Фиг. 7. Совместимость замены К35Е с улучшенной способностью связываться с бета-субъединицей рецептора IL-2, уже описанной для мутеина, полученного из IL-2 (ELISA).Fig. 7. Compatibility of the K35E substitution with improved ability to bind to the beta subunit of the IL-2 receptor, already described for IL-2-derived mutein (ELISA).
ПримерыExamples
Пример 1. Отбор и характеристика нитевидных фагов, отображающих функциональный мутированный человеческий IL-2.Example 1: Selection and characterization of filamentous phages displaying functional mutated human IL-2.
Создавали библиотеку с мягкой рандомизацией, нацеленную на несколько положений в человеческом IL-2. Выбранные положения включали положения, имеющие остатки с боковыми цепями, задействованными в участке связывания альфа-субъединицы рецептора (K35, R38, Т41, F42, K43, F44, Y45, Е61, Е62, K64, Р65, Е68, V69, N71, L72, Q74 и Y107). Диверсификацию человеческого IL-2 выполняли, используя мутагенез по Кункелю с мутагенными олигонуклеотидами, содержащими смесь оснований в каждом положении-мишени (spiked), с 85% сохранением исходного нуклеотида в каждом положениимишени плюс 15% эквимолярной смеси оставшихся трех нуклеотидов для достижения общей умеренной степени разнообразия в выбранной области. Таким образом, полученная библиотека, состоящая из 109 клонов, содержала в целом 20 аминокислот в каждом положении участка связывания, при этом каждая молекула в библиотеке имела только несколько замен, что ограничивало поиск новых полипептидов до пространства функциональных последовательностей, более близких к исходной молекуле. Библиотечные фаги очищали осаждением полиэтиленгликолем, используя хорошо известные процедуры (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Очищенные вирусные частицы инкубировали в иммунотрубках (Nunc, Denmark), покрытых рекомбинантной альфа субъединицей рецептора IL-2 (R&D), что позволило выделить функциональные мутированные варианты IL-2 благодаря их способности отображаться на фагах. Две независимые процедуры пэннинга выполняли на субъединицах рецептора IL-2 человека и мыши.A soft randomization library was created targeting multiple positions in human IL-2. The selected positions included those having residues with side chains involved in the receptor alpha subunit binding site (K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, Q74 and Y107). Diversification of human IL-2 was performed using Kunkel mutagenesis with mutagenic oligonucleotides containing a mixture of bases at each target position (spiked), with 85% conservation of the original nucleotide at each target position plus a 15% equimolar mixture of the remaining three nucleotides to achieve an overall moderate degree of diversity in the selected area. Thus, the resulting library of 109 clones contained a total of 20 amino acids at each binding site position, with each molecule in the library having only a few substitutions, limiting the search for new polypeptides to the space of functional sequences closer to the original molecule. Library phages were purified by polyethylene glycol precipitation using well known procedures (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Purified virus particles were incubated in immunotubes (Nunc, Denmark) coated with recombinant IL-2 receptor alpha subunit (R&D), allowing the isolation of functional mutated IL-2 variants due to their ability to display on phages. Two independent panning procedures were performed on human and mouse IL-2 receptor subunits.
- 4 043757- 4 043757
После вымывания несвязанных фагов связанные фаги элюировали путем добавления щелочного раствора триэтиламина. Бактерии TG1 инфицировали выбранными фагами, которые амплифицировали, используя хелперный фаг M13KO7, и которые использовали в качестве исходного материала для нового цикла отбора. Выполняли четыре цикла отбора фагов. Секвенирование вставок в выбранных фагемидах (из третьего и четвертого циклов отбора) выявило сходство в полученных мутированных вариантах. Несмотря на преобладание исходного не мутированного гена IL-2 (широко представленного в исходной библиотеке), присутствовала небольшая доля вариантов, имеющих замены К35Е, K35D и K35Q, что свидетельствует о влиянии неконсервативных замен в положении 35 на отображение функционального IL-2 на нитевидных фагах. К35Е была самой частой заменой. Это открытие оказалось неожиданным, так как анализ кристаллической структуры комплекса IL-2/рецептор (коды PDB 2B5I и 2ERJ) указывает на участие оригинального остатка K35 в ионных взаимодействиях в полярной периферической области участка связывания альфа-субъединицы. Таким образом, способность неконсервативных замен (инверсия заряда в двух случаях) сохранять взаимодействие с молекулой-селектором оказалось неожиданной.After washing out unbound phages, bound phages were eluted by adding an alkaline triethylamine solution. TG1 bacteria were infected with selected phages, which were amplified using helper phage M13KO7, and which were used as starting material for a new round of selection. Four cycles of phage selection were performed. Sequencing of inserts in selected phagemids (from the third and fourth rounds of selection) revealed similarities in the resulting mutated variants. Despite the predominance of the original non-mutated IL-2 gene (widely represented in the original library), a small proportion of variants having the K35E, K35D, and K35Q substitutions were present, indicating the influence of non-conservative substitutions at position 35 on the display of functional IL-2 on filamentous phages. K35E was the most common replacement. This finding was unexpected, since analysis of the crystal structure of the IL-2/receptor complex (PDB codes 2B5I and 2ERJ) indicates the involvement of the original K35 residue in ionic interactions in the polar peripheral region of the alpha subunit binding site. Thus, the ability of nonconservative substitutions (charge inversion in two cases) to preserve interaction with the selector molecule was unexpected.
Пример 2. Увеличение секреции и отображения на фагах человеческого IL-2 с неконсервативными заменами в положении 35Example 2: Enhanced secretion and display of human IL-2 on phages with non-conservative substitutions at position 35
Сравнивали способность разных вариантов IL-2, выбранных из библиотеки, секретироваться в периплазму Е.coli и отображаться на фагах. Нативный IL-2 использовали в качестве эталонной молекулы. Мутагенезом по Кункелю также был сконструирован K35R-содержащий вариант (консервативная замена в положении 35), который использовали в качестве дополнительного контроля. Все белки получали путем вставки кодирующих их генов в фагемидный вектор pCSM (слитый с геном 3 М13) и последующего продуцирования фага из бактерий TG1, трансформированных полученными генетическими конструкциями (Rojas, G. et al., Immunobiology. 218:105-113, 2013). Уровни отображения каждого варианта на фагах оценивали методом ELISA на микротитрационных планшетах, покрытых моноклональным антителом 9Е10. Связанные фаги детектировали, используя анти-М13 антитело, связанное с пероксидазой хрена. Было показано, что замены К35Е, K35D и K35Q приводят к увеличению уровня отображения человеческого IL-2 по сравнению с исходной молекулой (фиг. 1). Это увеличение было 10-кратным в случае замен К35Е и K35D с инверсией заряда и 7-кратным в случае замены K35Q. С другой стороны, консервативная замена K35R не оказывала влияния на способность IL-2 отображаться (фиг. 1). Для дальнейших исследований была выбрана замена К35Е.The ability of different IL-2 variants selected from the library to be secreted into the periplasm of E. coli and displayed on phages was compared. Native IL-2 was used as the reference molecule. A K35R-containing variant (conservative substitution at position 35) was also constructed by Kunkel mutagenesis, which was used as an additional control. All proteins were obtained by inserting the genes encoding them into the phagemid vector pCSM (fused with gene 3 M13) and subsequent production of phage from TG1 bacteria transformed with the resulting genetic constructs (Rojas, G. et al., Immunobiology. 218:105-113, 2013) . The levels of display of each variant on phages were assessed by ELISA on microtiter plates coated with the monoclonal antibody 9E10. Bound phages were detected using anti-M13 antibody coupled to horseradish peroxidase. The K35E, K35D, and K35Q substitutions were shown to result in increased levels of human IL-2 display compared to the parent molecule (Fig. 1). This increase was 10-fold in the case of the K35E and K35D charge inversion replacements and 7-fold in the case of the K35Q replacement. On the other hand, the conservative K35R substitution had no effect on the ability of IL-2 to be displayed (Fig. 1). For further studies, the K35E replacement was chosen.
Пример 3. Изучение влияния замены К35Е на секрецию и отображение на фагах на панели мутированных вариантов IL-2Example 3. Study of the effect of the K35E substitution on secretion and display on phages in a panel of mutated IL-2 variants
К35Е вводили в гены нескольких мутированных вариантов человеческого IL-2 (в формате отображения на фагах) мутагенезом по Кункелю. Панель включала четыре уже описанных мутеина для осуществления различных иммуномодулирующих функций: один неальфа мутеин с селективной агонистической функцией в отношении эффекторных Т-клеток (Carmenate, Т. et al., J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9,206,243 B2), один антагонистичный мутеин, который теряет способность связываться с гамма субъединицей рецептора IL-2 (не-гамма) (US 8,759,486 В2), и два суперагонистичных мутеина с повышенной способностью связываться либо с бета (супер-бета), либо с альфа (супер-альфа) субъединицей рецептора IL-2 (Levin AM и др., Nature. 484:529-533, 2012; WO 2005/007121). Фаги, отображающие каждый из этих белков, получали и очищали (вместе с исходными молекулами без К35Е), и уровни отображения чужеродных белков оценивали методом ELISA на микротитрационных планшетах, покрытых моноклональным антителом 9Е10. Препарат фага, отображающего нативный IL-2, использовали в качестве эталона (при условии наличия в нем 100 произвольных единиц/мл) для построения стандартной кривой для расчета относительных уровней отображения для каждого варианта. В табл. 1 показано увеличение уровня отображения для каждого мутеина, ассоциированного с введением К35Е.K35E was introduced into the genes of several mutated variants of human IL-2 (in phage display format) by Kunkel mutagenesis. The panel included four already described muteins for various immunomodulatory functions: one non-alpha mutein with selective agonist function against effector T cells (Carmenate, T. et al., J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9,206,243 B2) , one antagonistic mutein that loses the ability to bind to the gamma subunit of the IL-2 receptor (non-gamma) (US 8,759,486 B2), and two superagonistic muteins with increased ability to bind to either beta (super-beta) or alpha (super-beta). alpha) subunit of the IL-2 receptor (Levin AM et al., Nature. 484:529-533, 2012; WO 2005/007121). Phages displaying each of these proteins were prepared and purified (along with the parent molecules without K35E), and levels of foreign protein display were assessed by ELISA on microtiter plates coated with monoclonal antibody 9E10. A native IL-2 display phage preparation was used as a standard (assuming 100 random units/ml) to construct a standard curve to calculate relative display levels for each variant. In table Figure 1 shows the increase in display level for each mutein associated with K35E administration.
Таблица 1. Увеличение уровней отображения тестируемых мутеинов, ассоциированных с введением замены К35ЕTable 1. Increase in display levels of tested muteins associated with the introduction of the K35E substitution
Пример 4. Замена K35 усиливает секрецию клетками-хозяевами человека слитых белков на основе IL-2 и полученных из него мутеиновExample 4: K35 Substitution Enhances Secretion of IL-2-Based Fusion Proteins and IL-2-derived Muteins by Human Host Cells
Создавали генетические конструкции для слияния генов человеческого IL-2 и полученных из него мутеинов с геном Fc-области человеческого IgG1 в контексте вектора экспрессии рСМХ. Также готовили дополнительную панель эквивалентных конструкций, имеющих мутацию К35Е. HEK 293 Т-клетки (адаптированные для выращивания в суспензии) трансфицировали каждой из вышеописанных генетиче- 5 043757 ских конструкций, смешанных соответствующим образом с полиэтиленимином. Объем трансфекции составлял 50 мл.Genetic constructs were created to fuse the genes of human IL-2 and its muteins with the Fc region gene of human IgG1 in the context of the pCMX expression vector. An additional panel of equivalent constructs containing the K35E mutation was also prepared. HEK 293 T cells (adapted for suspension growth) were transfected with each of the above genetic constructs mixed appropriately with polyethylenimine. The transfection volume was 50 ml.
Супернатанты из трансфицированных клеток собирали через шесть дней культивирования. Присутствие IL-2-производных рекомбинантных белков оценивали методом ELISA на микротитрационных планшетах, покрытых моноклональным антителом к IL-2.2 (направленным против линейного эпитопа, присутствующего на всех мутеинах). Захваченные слитые белки детектировали с помощью антитела против человеческого Fc, связанного с пероксидазой хрена. Уровни слитых белков в супернатантах были выше для тех молекул, которые содержали замену К35Е, по сравнению с их исходными аналогами (фиг. 2а-е). Такие рекомбинантные белки очищали методом аффинной хроматографии с белком А. В табл. 2 показаны выходы после очистки.Supernatants from transfected cells were collected after six days of culture. The presence of IL-2-derived recombinant proteins was assessed by ELISA on microtiter plates coated with a monoclonal antibody to IL-2.2 (directed against a linear epitope present on all muteins). The captured fusion proteins were detected using an anti-human Fc antibody coupled to horseradish peroxidase. The levels of fusion proteins in the supernatants were higher for those molecules that contained the K35E substitution compared to their parent counterparts (Fig. 2a-e). Such recombinant proteins were purified by affinity chromatography with protein A. Table. Figure 2 shows the outputs after cleaning.
Таблица 2. Выходы после очистки IL-2 и полученных из него мутеинов, слитых с Fc-областью иммуноглобулинов человека, из HEK 293 Т-клеток, трансфицированных в суспензииTable 2. Yields after purification of IL-2 and its derived muteins fused to the Fc region of human immunoglobulins from HEK 293 T cells transfected in suspension
Пример 5. Замена K35E является совместимой с молекулярными взаимодействиями нативного IL-2Example 5: The K35E Substitution is Compatible with Molecular Interactions of Native IL-2
Связывающую способность рекомбинантного мутированного IL-2 (K35E) в формате гомодимера, слитого с Fc-областью человека, оценивали методом ELISA на микротитрационных планшетах, покрытых разными молекулами, о которых известно, что они взаимодействуют с нативным IL-2. Панель молекул покрытия включала четыре моноклональных антитела, распознающих разные эпитопы на IL-2, a также альфа-субъединицу рецептора IL-2 (человеческого или мышиного происхождения). Захваченный слитый белок детектировали с помощью антитела против человеческого Fc, связанного с пероксидазой хрена. Аналогичный слитый гомодимер, включающий немутированный IL-2, продуцируемый в той же системе экспрессии, использовали в качестве контроля. Присутствие К35Е не влияло на связывание мутированного гомодимера как с антителами, так и с рецепторами, напротив, оно вызывало противоположный эффект. Реакционная способность мутированного варианта по отношению ко всем молекулам покрытия была выше, чем у его немутированного рекомбинантного аналога (фиг. 3), что указывает на то, что антигенность и функциональность варианта К35Е являются более близкой к таковым нативного IL-2, чем немутированного рекомбинантного белка, полученного в аналогичных условиях.The binding capacity of recombinant mutated IL-2 (K35E) in homodimer format fused to the human Fc region was assessed by ELISA on microtiter plates coated with various molecules known to interact with native IL-2. The panel of coating molecules included four monoclonal antibodies recognizing different epitopes on IL-2, as well as the alpha subunit of the IL-2 receptor (human or murine origin). The captured fusion protein was detected using an anti-human Fc antibody coupled to horseradish peroxidase. A similar homodimer fusion comprising unmutated IL-2 produced in the same expression system was used as a control. The presence of K35E did not affect the binding of the mutated homodimer to either antibodies or receptors; on the contrary, it caused the opposite effect. The reactivity of the mutated variant to all coating molecules was higher than that of its unmutated recombinant counterpart (Fig. 3), indicating that the antigenicity and functionality of the K35E variant are closer to those of native IL-2 than to the unmutated recombinant protein. , obtained under similar conditions.
Пример 6. К35Е в Fc-слитых IL-2 сохраняет способность стимулировать пролиферацию клеток CTLL-2Example 6: K35E in IL-2 Fc Fusion Retains the Ability to Stimulate CTLL-2 Cell Proliferation
Оценивали способность мутированного IL-2 (K35E) в формате Fc-слитого гомодимера (очищенного из HEK 293 Т-клеток, трансфицированных в суспензии) индуцировать пролиферацию CTLL-2. Рекомбинантный человеческий IL-2 использовали в качестве контроля. Клетки выращивали в присутствии разных концентраций обоих белков и пролиферацию измеряли, используя колориметрический анализ восстановления красителя аламарский голубой (фиг. 4). Удельную активность рассчитывали в каждом случае по дозе молекул, которая вызывала половину максимальной пролиферации, с использованием программного обеспечения GraphPad. Удельная активность Fc-слитого мутированного IL-2 (включающего K35E) составляла 4х106 МЕ/мг и находилась в том же диапазоне, что и у эталонного рекомбинантного IL-2 (2,3x106 МЕ/мг). Этот результат указывает на сохранение биологической активности IL-2 в присутствии К35Е.The ability of mutated IL-2 (K35E) in Fc-fusion homodimer format (purified from HEK 293 T cells transfected in suspension) to induce CTLL-2 proliferation was assessed. Recombinant human IL-2 was used as a control. Cells were grown in the presence of different concentrations of both proteins and proliferation was measured using a colorimetric Alamara Blue dye reduction assay (Fig. 4). Specific activity was calculated in each case from the dose of molecules that caused half the maximum proliferation using GraphPad software. The specific activity of the Fc-fusion mutated IL-2 (including K35E) was 4 x 10 6 IU/mg and was in the same range as the reference recombinant IL-2 (2.3 x 10 6 IU/mg). This result indicates that the biological activity of IL-2 is preserved in the presence of K35E.
Пример 7. K35E Fc-слитого IL-2 обладает способностью стимулировать размножение in vivo Тклеток памяти с фенотипом CD8Example 7 K35E IL-2 Fc-fusion has the ability to stimulate in vivo expansion of memory T cells with the CD8 phenotype
Мыши C57BL/6 получали пять ежедневных доз 4x104 ME Fc-слитого мутированного IL-2 (K35E) в течение 5 последовательных дней с целью изучения способности этого белка стимулировать in vivo пролиферацию популяций IL-2-зависимых клеток. После обработки животных умерщвляли, и их селезенки анализировали. Кроме того, определяли размер популяции клеток памяти с фенотипом CD3+CD8+ (CD44hi) методом проточной цитометрии.C57BL/6 mice received five daily doses of 4x104 IU Fc-fusion mutated IL-2 (K35E) for 5 consecutive days to study the ability of this protein to stimulate in vivo proliferation of IL-2-dependent cell populations. After treatment, animals were sacrificed and their spleens were analyzed. In addition, the population size of memory cells with the CD3+CD8+ phenotype (CD44hi) was determined by flow cytometry.
Контролем в эксперименте служила группа мышей, которым вводили забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).The control group in the experiment was a group of mice that were injected with phosphate buffered saline (PBS).
Рекомбинантный Fc-слитый IL-2 (K35E) оказывал ожидаемое влияние на популяцию CD8 Т-клеток памяти, судя по увеличению селезенки (фиг. 5а) и удвоению в ней относительного количества Т-клеток памяти с фенотипом CD8 (фиг. 5b).Recombinant Fc-fusion IL-2 (K35E) had the expected effect on the memory CD8 T cell population, as judged by the enlargement of the spleen (Fig. 5a) and the doubling of the relative number of memory T cells with the CD8 phenotype therein (Fig. 5b).
- 6 043757- 6 043757
Пример 8. Замена К35Е является совместимой с потерей способности связываться с альфасубъединицей рецептора IL-2, которая определяет свойства селективного агониста.Example 8 The K35E substitution is consistent with loss of the ability to bind to the alpha subunit of the IL-2 receptor, which determines the properties of the selective agonist.
Сравнивали связывающие свойства как человеческого IL-2, так и не-альфа мутеина, описанного ранее (Carmenate Т. et al., J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9,206,243), который содержит замены R38A, F42A, Y45A и Е62А, приводящие к потере способности связывать альфа-субъединицу рецептора IL-2, для снижения его стимулирующего воздействия на Т-регуляторные клетки, не оказывая при этом влияния на эффекторные клетки, имеющие гетеродимерный бета/гамма-рецептор. Оба рекомбинантных белка имели дополнительную мутацию К35Е и были получены в виде слитых белков, содержащих Fc-область иммуноглобулина человека. Микротитрационные планшеты покрывали рекомбинантной альфасубъединицей рецептора IL-2 человеческого (а) и мышиного (b) происхождения. Захваченные слитые белки детектировали с помощью антитела против человеческого Fc, связанного с пероксидазой хрена. Введение К35Е привело к появлению новой не-альфа молекулы с более высоким уровнем экспрессии по сравнению с исходным аналогом (фиг. 2b) и значительно более низкой способностью связывать альфацепь человека и мыши по сравнению с немутированным IL-2, также имеющим замену К35Е (фиг. 6). Эти результаты являются первым доказательством совместимости К35Е с селективной модуляцией взаимодействий и иммуномодулирующих функций IL-2.The binding properties of both human IL-2 and non-alpha mutein, described previously (Carmenate T. et al., J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9,206,243), which contains the substitutions R38A, F42A, Y45A, were compared and E62A, leading to loss of the ability to bind the alpha subunit of the IL-2 receptor, to reduce its stimulatory effect on T-regulatory cells, without affecting effector cells having a heterodimeric beta/gamma receptor. Both recombinant proteins had an additional K35E mutation and were produced as fusion proteins containing the Fc region of human immunoglobulin. Microtiter plates were coated with recombinant IL-2 receptor alpha subunit of human (a) and murine (b) origin. The captured fusion proteins were detected using an anti-human Fc antibody coupled to horseradish peroxidase. Introduction of K35E resulted in the emergence of a new non-alpha molecule with a higher expression level compared to the parent analogue (Fig. 2b) and significantly lower ability to bind the human and mouse alpha chain compared to unmutated IL-2, also having the K35E substitution (Fig. 6). These results provide the first evidence that K35E is compatible with the selective modulation of IL-2 interactions and immunomodulatory functions.
Пример 9. Замена К35Е является совместимой с увеличением способности связывать бетасубъединицу рецептора IL-2, уже описанной для суперагонистического вариантаExample 9 The K35E substitution is consistent with the increase in IL-2 receptor beta-subunit binding ability already described for the superagonist variant
Связывающую способность IL-2 и супер-бета-мутеина, содержащего мутации L80F, R81D, L85V, I86V и I92F (имеющего дополнительную мутацию К35Е и слитого с Fc-областью человеческого IgG1), оценивали методом ELISA на планшетах, покрытых бета-субъединицей рецептора IL-2. Захваченные слитые белки детектировали с помощью антитела против человеческого Fc, связанного с пероксидазой хрена. Введение К35Е привело к появлению новой молекулы с более высокими уровнями экспрессии по сравнению с исходным супер-бета-мутеином (фиг. 2с) и с улучшенной способностью связывать бетасубъединицу, что является основой его суперагонистческой функции (фиг. 7). Этот результат расширил доказательства совместимости замены К35Е с конструкцией новых полученных из IL-2 молекул с модификациями в их взаимодействиях с рецепторными субъединицами и иммуномодулирующих функциях.The binding capacity of IL-2 and super-beta mutein containing mutations L80F, R81D, L85V, I86V and I92F (having an additional K35E mutation and fused to the Fc region of human IgG1) was assessed by ELISA on plates coated with the beta subunit of the IL receptor -2. The captured fusion proteins were detected using an anti-human Fc antibody coupled to horseradish peroxidase. The introduction of K35E resulted in a new molecule with higher expression levels compared to the original super-beta-mutein (Fig. 2c) and with an improved ability to bind the beta subunit, which is the basis of its superagonist function (Fig. 7). This result expands the evidence for the compatibility of the K35E substitution with the design of new IL-2-derived molecules with modifications in their interactions with receptor subunits and immunomodulatory functions.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2016-0171 | 2016-11-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043757B1 true EA043757B1 (en) | 2023-06-20 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3543252B1 (en) | In vitro method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it | |
| CN100488984C (en) | Reducing immunogenicity of fusion proteins | |
| US6313272B1 (en) | DNA encoding high affinity interleukin-4 muteins | |
| Ju et al. | Conversion of the interleukin 1 receptor antagonist into an agonist by site-specific mutagenesis. | |
| NO329976B1 (en) | Receptor-based antagonists as well as the method of preparation and use thereof | |
| JPH09502460A (en) | Method for selecting superagonist, antagonist and superantagonist of human interleukin-6 based on three-dimensional modeling of receptor complex | |
| Kuziel et al. | Interleukin-2 and the IL-2 Receptor: New Insight Into Structure and Function. | |
| CN108640991B (en) | Antihuman interleukin 17A monoclonal antibody and its application | |
| KR20080042070A (en) | Il-6 binding proteins | |
| CA2821646A1 (en) | Alphabodies specifically binding to cytokines or growth factors and/or cytokine or growth factor receptors | |
| Devos et al. | Interleukin‐5 and its receptor: a drug target for eosinophilia associated with chronic allergic disease | |
| CN113943374B (en) | Interleukin 15 and polypeptide complex of receptor thereof | |
| CA2259940C (en) | High-affinity interleukin-4 muteins | |
| Labriola-Tompkins et al. | Structure–function analysis of human IL-1α: identification of residues required for binding to the human type I IL-1 receptor | |
| EA043757B1 (en) | METHOD FOR INCREASING SECRETION LEVELS OF INTERLEUKIN-2 AND PROTEINS OBTAINED FROM IT | |
| NZ753820B2 (en) | Method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it | |
| EP0769055A1 (en) | Variants of leukemia inhibitory factor | |
| CN101027079A (en) | Chimeric protein | |
| Ninomiya et al. | In vitro and in vivo Evaluation of Chemically Synthesized, Receptor-Biased Interleukin-4 and Photocaged Variants | |
| CA2418913A1 (en) | Peptide mimetics | |
| Dionyssopoulou et al. | Synthetic peptides as putative therapeutic agents in transplantation medicine: application of PEPSCAN to the identification of functional sequences in the extracellular domain of the interleukin-2 receptor beta chain (IL-2Rβ) | |
| Lin et al. | The construction and characterization of a biologically active recombinant IL-2 containing a lysine-rich C-terminal extension. | |
| AU742384B2 (en) | High affinity interleukin-4 muteins | |
| Buchli | Biological and receptor binding properties of interleukin-2 analogs employing site-directed mutagenesis and filamentous phage display | |
| Czabotar et al. | Identification of regions within the third FnIII-like domain of the IL-5Rα involved in IL-5 interaction |