EA043748B1 - Ацилазы пенициллина g - Google Patents

Ацилазы пенициллина g Download PDF

Info

Publication number
EA043748B1
EA043748B1 EA201991637 EA043748B1 EA 043748 B1 EA043748 B1 EA 043748B1 EA 201991637 EA201991637 EA 201991637 EA 043748 B1 EA043748 B1 EA 043748B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
pga
seq
acylase
polypeptide
Prior art date
Application number
EA201991637
Other languages
English (en)
Inventor
Оскар Алвизо
Дэвид Элгарт
Роберт Кевин Орр
Джеймс Николас Риггинс
Анна ФРИСЗКОВСКА
Катрина В. Лекса
Сян И
Да Дуан
Кортни Дайанн Моффетт
Никки Деллас
Весна Митчелл
Original Assignee
Кодексис, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кодексис, Инк. filed Critical Кодексис, Инк.
Publication of EA043748B1 publication Critical patent/EA043748B1/ru

Links

Description

По настоящей заявке испрашивают приоритет патентных заявок США с серийными №№ 62/442810 и 62/472055, поданных 5 января 2017 г. и 16 марта 2017 г. соответственно, обе они включены, таким образом, посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.
Область изобретения
Настоящее изобретение предусматривает сконструированные ферменты ацилазы пенициллина G (PGA), полинуклеотиды, кодирующие ферменты, композиции, содержащие ферменты, и способы использования сконструированных ферментов PGA.
Ссылка на список последовательностей, таблицу или компьютерную программу
Официальная копия списка последовательностей подана одновременно с описанием в виде текстового файла в формате ASCII через EFS-Web с названием файла Списки последовательностей^, датой создания 5 июня 2019 г. и размером 967 КБ. Список последовательностей, поданный через EFS-Web, является частью описания и включен в полном объеме по ссылке в настоящее описание.
Предпосылки изобретения
Ацилаза пенициллина G (PGA) (пенициллинамидаза, ЕС 3.5.1.11) катализирует расщепление амидной связи боковой цепи пенициллина G (бензилпенициллина). Фермент используют коммерчески при получении 6-амино-пенициллановой кислоты (6-АРА) и фенилуксусной кислоты (РАА). 6-АРА является ключевым соединением при промышленном получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков, таких как амоксициллин, ампициллин и цефалексин. Встречаемый в природе фермент PGA демонстрирует нестабильность в коммерческих процессах, что требует иммобилизации на твердых подложках для коммерческого применения. PGA ковалентно связывают с различными основами, и системы с иммобилизованной PGA описывают как эффективные инструменты для синтеза чистых оптических изомеров. Однако прикрепление к твердым поверхностям ведет к нарушению свойств фермента, таким как сниженная активность и/или избирательность, и ограничение доступом растворенных веществ. Кроме того, несмотря на то, что прикрепление к твердым подложкам делает возможным захват ферментов и повторное использование в дополнительных циклах обработки, стабильность фермента является такой, что такие применения могут быть ограничены. Ферментативный катализ пенициллина G с помощью PGA до 6АРА является региоспецифическим (не происходит расщепление лактам-амидной связи) и стереоспецифическим. Получение 6-АРА составляет, возможно, наибольшую пользу от ферментативного катализа при получении фармацевтических средств. Ферментативная активность PGA, ассоциированная с фенацетильным фрагментом, допускает стереоспецифический гидролиз большого спектра фенацетильных производных первичных аминов, а также спиртов.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предусматривает сконструированные ферменты ацилазы пенициллина G (PGA), полинуклеотиды, кодирующие ферменты, композиции, содержащие ферменты, и способы использования сконструированных ферментов PGA. Настоящее изобретение предусматривает сконструированные ацилазы пенициллина G, способные к ацилированию инсулина, где полипептидная последовательность указанной ацилазы пенициллина G по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична SEQ ID № 2, 4, 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 142, 154 и 160. В некоторых вариантах осуществления ацилаза пенициллина G содержит SEQ ID № 4, 12, 24, 40, 56, 70, 82, 108, 110, 116, 136, 142, 154 или 160. В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированная ацилаза пенициллина G содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична по меньшей мере одной последовательности, приведенной в табл. 5.1, 5.1, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 7.1, 8.1, 9.1, 11.1, 12.1, 13.1, 14.1, 15.1, 16.1, 17.1, 18.1, 19.1 и/или табл. 20.1. В некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированная ацилаза пенициллина G содержит последовательность содержит последовательность, приведенную в табл. 5.1, 5.1, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 7.1, 8.1, 9.1, 11.1, 12.1, 13.1, 14.1, 15.1, 16.1, 17.1, 18.1, 19.1 и/или табл. 20.1. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления сконструированная ацилаза пенициллина G содержит гистидиновую метку. В некоторых вариантах осуществления гистидиновая метка присутствует на С-конце сконструированной ацилазы пенициллина G. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, сконструированная ацилаза пенициллина G содержит полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID № 110 и SEQ ID № 142.
Настоящее изобретение также относится к сконструированным полинуклеотидным последовательностям, кодирующим сконструированные ацилазы пенициллина G, предусмотренные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления сконструированная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична SEQ ID №№ 1, 11, 23, 39, 55, 69, 81, 99, 107, 109, 115, 135, 141, 153 и/или 159.
Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим сконструированные полинуклеотидные последовательности, предусмотренные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления векторы содержат по меньшей мере одну сконструированную полинуклеотидную последовательность, содержащую полинуклеотидную последовательность(и), по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичную SEQ ID №№ 2, 11, 23, 39, 55, 69, 81, 99,
- 1 043748
107, 109, 115, 135, 141, 153 и/или 159. В некоторых дополнительных вариантах осуществления векторы содержат по меньшей мере одну управляющую последовательность.
Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим по меньшей мере один вектор, предусмотренный в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления векторы в клетках-хозяевах содержат по меньшей мере одну сконструированную полинуклеотидную последовательность, содержащую полинуклеотидную последовательность(и), по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичную SEQ ID №№ 1, 11, 23, 39, 55, 69, 81, 99, 107, 109, 115, 135, 141, 153 и/или 159. В некоторых дополнительных вариантах осуществления векторы содержат по меньшей мере одну управляющую последовательность.
Настоящее изобретение также относится к способам получения ацилированного инсулина, которые включают предоставление: по меньшей мере одной сконструированной ацилазы пенициллина G по любому из пп.1-7 и инсулина; и экспонирование сконструированной ацилазы пенициллина G и инсулина в таких условиях, что сконструированная ацилаза пенициллина G ацилирует инсулин, тем самым получая ацилированный инсулин. В некоторых вариантах осуществления ацилирование проводят в присутствии метилфенилацетата. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, ацилирование происходит в любом из положений А1, В1 и/или В29 указанного инсулина. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, ацилирование происходит в положении А1 указанного инсулина, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления ацилирование происходит в положении В1 указанного инсулина, и в других вариантах осуществления ацилирование происходит в положении В29 указанного инсулина. В некоторых вариантах осуществления ацилирование происходит в положениях A1, B1 и/или В29 указанного инсулина. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, ацилирование происходит в положениях A1, B1 и В29 инсулина. В некоторых дополнительных вариантах осуществления способов, сконструированная ацилаза пенициллина G продуцирует более чем 90% более ацилированного инсулина по сравнению с получением ацилированного инсулина с помощью полипептида из SEQ ID № 2, 4, 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 142, 154 и/или 160.
Настоящее изобретение также относится к композициям ацилированного инсулина, получаемым с использованием по меньшей мере одной сконструированной ацилазы пенициллина G, предусмотренной в настоящем описании. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие ацилированный инсулин, получаемый с использованием по меньшей мере одного способа, предусмотренного в настоящем описании.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 приведена хроматограмма для аналитического способа, описанного в табл. 21.5, которую используют для того, чтобы количественно определять инсулин и порядок элюирования ацилированных продуктов.
На фиг. 2 приведены результаты экспериментов, описанных в примере 10.
На фиг. 3 приведены результаты экспериментов, описанных в примере 16.
Описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает сконструированные ацилазы пенициллина G (PGA), которые способны расщеплять пенициллин до фенилуксусной кислоты и 6-аминопенициллановой кислоты (6-АРА), которая является ключевым промежуточным соединением в синтезе большого спектра βлактамных антибиотиков. В частности, настоящее изобретение предусматривает сконструированные PGA, которые способны продуцировать монозащищенный или дизащищенный фенилацетатом инсулин посредством добавления защитной группы в положения A1, B1 или В29 свободного инсулина или удаления защитных групп из А1/В1/В29 тризащищенного инсулина или удаления А1/В1/В29 трифенилацетатных защитных групп для того, чтобы высвобождать свободный инсулин.
В целом, встречаемые в природе PGA представляют собой гетеродимерные ферменты, состоящие из альфа-субъединицы и бета-субъединицы. В природе PGA дикого типа синтезируется в виде полипептида препро-PGA, содержащего N-концевой сигнальный пептид, который опосредует транслокацию в периплазму, и линкерную область, соединяющую С-конец альфа-субъединицы с N-концом бетасубъединицы. Протеолитическая обработка ведет к зрелому гетеродимерному ферменту. Межмолекулярная линкерная область также может выполнять функцию содействия надлежащей укладке фермента. PGA, предусмотренные в настоящем описании, основаны PGA из Kluyvera citrophila, в которую вводили различные модификации для того, чтобы создавать усовершенствованные ферментативные свойства, как описано подробно далее.
Для описаний, предусмотренных в настоящем описании, использование формы единственного числа включает множественное число (и наоборот), пока конкретно не указано иное. Например, формы единственного числа включают множественное число до тех пор, пока контекст явно не указывает на иное. Аналогичным образом, содержать, содержит, содержащий, включать, включает и включающий являются взаимозаменяющими и не предназначены для ограничения. Кроме того, следует понимать, что когда в описаниях различных вариантов осуществления используют термин содержащий, специалисты в данной области поймут, что в некоторых конкретных случаях вариант осуществления можно альтернативно описывать с использованием формулировки состоящий по существу из или со- 2 043748 стоящий из.
Как приведенное выше общее описание, включая чертежи, так и последующее подробное описание являются лишь образцовыми и разъясняющими и не являются ограничением этого раскрытия. Кроме того, заголовки разделов, используемые в настоящем описании, служат только цели организации и их не следует толковать в качестве ограничения описываемого объекта изобретения.
Определения
Как используют в настоящем описании, следующие термины приведены в следующих значениях.
По отношению к настоящему раскрытию, технические и научные термины, используемые в описаниях в настоящем описании, должны иметь значения, в которых их обычно понимает специалист в данной области, пока конкретно не определено иное. Соответственно, следующие термины приведены в следующих значениях. Все патенты и публикации, в том числе все последовательности, раскрытые в таких патентах и публикациях, упоминаемых в настоящем описании, в явной форме включены по ссылке. Если не указано иное, практическая реализация настоящего изобретения включает общепринятые способы, широко используемые в молекулярной биологии, ферментации, микробиологии и связанных областях, которые известны специалистам в данной области. Пока в настоящем описании не определенное иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, как их обычно понимает специалист в области, к которой это изобретение относится. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем описании, можно использовать при практической реализации или тестировании настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. В действительности, подразумевают, что настоящее изобретение не ограничено конкретными способами, протоколами и реактивами, описанными в настоящем описании, поскольку они могут варьировать, в зависимости от контекста, в котором их используют. Заголовки, предусмотренные в настоящем описании, не являются ограничениями для различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения.
Тем не менее, чтобы облегчать понимание настоящего изобретения, многие термины определены далее. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Таким образом, предусмотрено, что каждый числовой диапазон, раскрытый в настоящем описании, охватывает каждый более узкий числовой диапазон, который попадает в такой более узкий числовой диапазон, как если бы все такие более узкие числовые диапазоны были в явной форме изложены в настоящем описании. Также предусмотрено, что каждое максимальное (или минимальное) числовое ограничение, раскрытое в настоящем описании, включает каждое меньшее (или большее) числовое ограничение, как если бы такие меньшие (или большие) числовые ограничения были в явной форме изложены в настоящем описании.
Как используют в настоящем описании, термин содержащий и его производные используют в их инклюзивном значении (т.е. эквиваленты термину включающий и соответствующим ему производным).
Как используют в настоящем описании и в приложенной формуле изобретения, форма единственного числа включает множественное число, пока контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, упоминание о клетке-хозяине включает множество таких клеток-хозяев.
Если не указано иное, нуклеиновые кислоты пишут слева направо в ориентации от 5' к 3' и аминокислотные последовательности пишут слева направо в ориентации от амино к карбокси соответственно.
Заголовки, предусмотренные в настоящем описании, не являются ограничениями для различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые можно получить, обратившись к описанию в целом. Соответственно, термины, которые определены далее, более полно определены путем обращения к описанию в целом.
Как используют в настоящем описании, термины белок, полипептид и пептид используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения полимера по меньшей мере двух аминокислот, ковалентно связанных амидной связью, независимо от длины или посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования, фосфорилирования, липидизация, миристилирования, убиквитинилирования и т.д.). В это определение включены D- и L-аминокислоты и смеси D- и L-аминокислот.
Как используют в настоящем описании, полинуклеотид и нуклеиновая кислота относятся к двум или больше нуклеозидам, которые ковалентно связаны вместе. Полинуклеотид может полностью состоять из рибонуклеозидов (т.е. РНК), полностью состоять из 2'-дезоксирибонуклеотидов (т.е. ДНК) или смесей рибо- и 2'-дезоксирибонуклеозидов. Хотя нуклеозиды обычно связывают вместе через стандартные фосфодиэфирные связи, полинуклеотиды могут содержать одну или несколько нестандартных связей. Полинуклеотид может быть одноцепочечным или двухцепочечным или может содержать как одноцепочечные области, так и двухцепочечные области. Кроме того, хотя полинуклеотид обычно состоит из встречаемых в природе кодирующих нуклеиновых оснований (т.е. аденина, гуанина, урацила, тимина и цитозина), он может содержать одно или несколько модифицированных и/или синтетических нуклеиновых оснований (например, инозин, ксантин, гипоксантин и т.д.). Предпочтительно такие модифицированные или синтетические нуклеиновые основания будут кодирующими нуклеиновыми основаниями.
Как используют в настоящем описании, степень строгости гибридизации относится к условиям гибридизации, таким как условия промывания, при гибридизации нуклеиновых кислот. В целом, реакции
- 3 043748 гибридизации осуществляют в условиях более низкой степени строгости, после чего следуют промывания переменной, но более высокой степени строгости. Термин умеренно строгая гибридизация относится к условиям, которые допускают связывание целевой ДНК с комплементарной нуклеиновой кислотой, которая обладает приблизительно 60% идентичностью, предпочтительно приблизительно 75% идентичностью, приблизительно 85% идентичностью с целевой ДНК; с более чем приблизительно 90% идентичностью с целевым полинуклеотидом. Образцовые умеренно строгие условия представляют собой условия, эквивалентные гибридизации в 50% формамиде, 5х растворе Денхарта, 5х SSPE, 0,2% SDS при 42°С, после чего следует промывание в 0,2х SSPE, 0,2% SDS при 42°С. Гибридизация высокой степени строгости в целом относится к условиям, которые составляют приблизительно 10°С или меньше от температуры теплового плавления Tm, как определяют в условиях раствора для определенной полинуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления условия высокой степени строгости относятся к условиям, которые допускают гибридизацию только тех последовательностей нуклеиновой кислоты, которые образуют стабильные гибриды в 0,018 М NaCl при 65°С (т.е. если гибрид не стабилен в 0,018 М NaCl при 65°С, он не будет стабилен в условиях с высокой строгостью, как предусмотрено в настоящем описании). Условия с высокой строгостью можно обеспечивать, например, посредством гибридизации в условиях, эквивалентных 50% формамиду, 5х раствору Денхарта, 5х SSPE, 0,2% SDS при 42°С, после чего следует промывание в 0,1х SSPE и 0,1% SDS при 65°С. Другие условия высокой степени строгости представляют собой гибридизацию в условиях, эквивалентных гибридизации в 5х SSC, содержащем 0,1% (мас.:об.) SDS при 65°С и промыванию в 0,1х SSC, содержащем 0,1% SDS, при 65°С. Другие условия гибридизации высокой степени строгости, а также умеренно строгие условия, известны специалистам в данной области.
Как используют в настоящем описании, кодирующая последовательность относится к той части нуклеиновой кислоты (например, гену), которая кодирует аминокислотную последовательность белка.
Как используют в настоящем описании, с оптимизацией кодонов относится к изменениям в кодонах полинуклеотида, кодирующего белок, на те, которые предпочтительно использует конкретный организм, так что кодируемый белок эффективно экспрессируют в организме, представляющем интерес. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие ферменты PGA, могут быть с оптимизацией кодонов для оптимального получения из организма-хозяина, выбранного для экспрессии. Несмотря на то, что генетический код является вырожденным в том отношении, что большинство аминокислоты представлены несколькими кодонами, называемыми синонимами или синонимическими кодонами, хорошо известно, что использование кодонов конкретными организмами является неслучайным и смещенным в направлении конкретных кодонных триплетов. Это предпочтение кодонов может быть выше в отношении заданного гена, генов с общей функцией или происхождением от общего предка, сильно экспрессируемых белков в сравнении с белками с низким числом копий и агрегатных кодирующих белки областей в геноме организма. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие ферменты PGA, могут быть с оптимизацией кодонов для оптимального получения из организма-хозяина, выбранного для экспрессии.
Как используют в настоящем описании, кодоны с предпочтительным, оптимальным, высоким предпочтением кодонов относятся взаимозаменяемо к кодонам, которые используют с более высокой частотой в кодирующих белок областях, чем другие кодоны, которые кодируют ту же аминокислоту. Предпочтительные кодоны можно определять по отношению к использованию кодонов в одном гене, наборе генов с общей функцией или происхождением, высоко экспрессируемых генах, частоте кодонов в агрегатных кодирующих белок областях всего организма, частоте кодонов в агрегатных кодирующих белок областях родственных организмов или их сочетаний. Кодоны, частота которых возрастает вместе с уровнем экспрессии гена, обычно представляют собой оптимальные кодоны для экспрессии. Известны различные способы для определения частоты кодонов (например, использование кодонов, относительное использование синонимических кодонов) и кодонных предпочтений у конкретных организмов, включая многопараметрический анализ, например, с использованием кластерного анализа или анализа соответствий, и эффективное число кодонов, используемых в гене (см., например, GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham; McInerney, Bioinform., 14:372-73 [1998]; Stenico et al., Nucleic Acids Res., 222:437-46 [1994]; and Wright, Ген 87:23-29 [1990]). Таблицы использования кодонов доступны для растущего списка организмов (см., например, Wada et al., Nucleic Acids Res., 20:2111-2118 [1992]; Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000]; Duret, et al., выше; Henaut and Danchin, Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, et al. (ред.), ASM Press, Washington D.C., [1996], стр. 2047-2066. Источник данных для получения использования кодонов может полагаться на любую доступную нуклеотидную последовательность, способную кодировать белок. Эти наборы данных включают последовательности нуклеиновой кислоты, о которых известно, что они фактически кодируют экспрессируемые белки (например, полные кодирующие белок последовательности - CDS), метки экспрессируемой последовательности (ESTS) или предсказанные кодирующие области геномных последовательностей (см., например, Uberbacher, Meth. Enzymol., 266:259-281 [1996]; Tiwari et al., Comput. Appl. Biosci., 13:263-270 [1997]).
- 4 043748
Как используют в настоящем описании, управляющую последовательность определяют в настоящем описании как включающую все компоненты, которые необходимы или благоприятны для экспрессии полинуклеотида и/или полипептида по настоящему изобретению, каждая управляющая последовательность может быть нативной или чужеродной для полинуклеотида, представляющего интерес. Такие управляющие последовательности включают, но не ограничиваясь этим, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции.
Как используют в настоящем описании, функционально связанную определяют в настоящем описании как конфигурацию, в которой управляющую последовательность надлежащим образом размещают (т.е. в функциональной связи) в положении относительно полинуклеотида, представляющего интерес, так что управляющая последовательность управляет или регулирует экспрессию полинуклеотида и/или полипептида, представляющего интерес.
Как используют в настоящем описании, промоторная последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которую распознает клетка-хозяин для экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес, такого как кодирующая последовательность. Управляющая последовательность может содержать подходящую промоторную последовательность. Промоторная последовательность содержит транскрипционные управляющие последовательности, которые опосредуют экспрессию полинуклеотида, представляющего интерес. Промотор может представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, которая демонстрирует транскрипционную активность в клетке-хозяине, предпочтительно включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и которую можно получать из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные для клетки-хозяина.
Как используют в настоящем описании, встречаемая в природе или дикого типа относится к форме, которую находят в природе. Например, встречаемые в природе или дикого типа полипептид или полинуклеотидная последовательность представляет собой последовательность, присутствующую в организме, которую можно из источника в природе и которую человек не модифицировал целенаправленно с помощью манипуляций.
Как используют в настоящем описании, не встречаемый в природе, сконструированный и рекомбинантный, когда используют в настоящем раскрытии со ссылкой на (например, клетку, нуклеиновую кислоту или полипептид), относится к материалу, или материалу, соответствующему природной или нативной форме материала, который модифицирован таким образом, который иначе не существовал бы в природе. В некоторых вариантах осуществления материал является идентичным встречаемому в природе материалу, но его получают или создают из синтетических материалов и/или посредством манипуляции с использованием рекомбинантных способов. Неограничивающие примеры включают, среди прочих, рекомбинантные клетки, экспрессирующие гены, которые не встречаются в нативной (не рекомбинантной) форме клетки, или экспрессирующие нативные гены, которые иначе экспрессируются на другом уровне.
Как используют в настоящем описании, процентная доля идентичности последовательностей, процент идентичности и процент идентичных относятся к сравнению между полинуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями, и их определяют посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентную долю вычисляют посредством определения числа положений, в которых встречаются идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, или основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток выравнивают с пропуском, чтобы получать число совпадающих положений, и делят число совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножают результат на 100, чтобы получать процентную долю идентичности последовательностей. Определение оптимального выравнивания и процента идентичности последовательностей осуществляют с использованием алгоритмов BLAST и BLAST 2.0 (см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; и Altschul et al., Nucl. Acids Res. 3389-3402 [1977]). Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST общедоступно через веб-сайт National Center for Biotechnology Information.
В кратком изложении, анализ BLAST включает сначала идентификацию пар последовательностей с высокими оценками (HSP) посредством идентификации коротких слов длины W в запросной последовательности, которые или совпадают или отвечают определенному порогу оценки с положительным значением Т, когда выравнивают со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т обозначают как порог оценки соседних слов (Altschul et al., выше). Эти начальные совпадения соседних слов действуют в качестве затравок для инициации поиска для того, чтобы находить более длинные HSP, содержащие их. Затем совпадения слов расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока можно увеличивать кумулятивную оценку выравнивания. Кумулятивные оценки вычисляют с использованием, для нуклеотидных последовательностей, параметров М (награда за пару совпа
- 5 043748 дающих остатков; всегда >0) и N (штраф за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей матрицу замен используют для того, чтобы вычислять кумулятивную оценку. Расширение совпадений слов в каждом направлении останавливают, когда: кумулятивная оценка выравнивания снижается на количество X от ее максимального достигнутого значения; кумулятивная оценка снижается до нуля или ниже, из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными оценками; или достигают конца любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используют по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=4 и сравнение обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей, в программе BLASTP используют по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и матрицу замен BLOSUM62 (см., например, Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]).
В данной области доступны и известны многие другие алгоритмы, которые функционируют аналогично BLAST, предоставляя процент идентичности для двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с использованием любого подходящего известного в данной области способа (например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith и Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; с помощью алгоритма выравнивания по гомологии Needleman и Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970]; с помощью способа поиска сходства Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; и/или с помощью компьютерных реализаций этих алгоритмов [GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в GCG Wisconsin Software Package]), или путем визуального просмотра, используя способы, общеизвестные в данной области. Дополнительно, при определении выравнивания последовательностей и процента идентичности последовательностей можно использовать программы BESTFIT или GAP в GCG Wisconsin Software Package (Accelrys, Madison WI), используя предусмотренные параметры по умолчанию.
Как используют в настоящем описании, существенная идентичность относится к полинуклеотидной или полипептидной последовательности, которая обладает по меньшей мере 80% идентичности последовательностей, по меньшей мере 85% идентичности и 89-95% идентичности последовательностей, более обычно по меньшей мере 99% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью в окне сравнения по меньшей мере в 20 положений остатков, часто в окне по меньшей мере 30-50 остатков, где процентную долю идентичности последовательностей вычисляют посредством сравнения эталонной последовательности с последовательностью, которая содержит делеции или добавления, которые составляют 20% или меньше от эталонной последовательности в окне сравнения. В конкретных вариантах осуществления, применяемых к полипептидам, термин существенная идентичность обозначает, что две полипептидные последовательности, когда выровнены оптимально, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием весов пропусков по умолчанию, имеют по меньшей мере 80% идентичности последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 89% идентичности последовательностей, по меньшей мере 95% идентичности последовательностей или больше (например, 99% идентичности последовательностей). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами.
Как используют в настоящем описании, эталонная последовательность относится к определенной последовательности, с которой сравнивают другую последовательность. Эталонная последовательность может представлять собой подмножество более крупной последовательности, например, сегмент полноразмерной последовательности гена или полипептида. В целом, эталонная последовательность составляет по меньшей мере 20 нуклеотидных или аминокислотных остатков в длину, по меньшей мере 25 остатков в длину, по меньшей мере 50 остатков в длину или полную длину нуклеиновой кислоты или полипептида. Поскольку каждый из двух полинуклеотидов или полипептидов может (1) содержать последовательность (т.е. часть полной последовательности), которая схожа между двумя последовательностями, и (2) дополнительно содержать последовательность, которая расходится между двумя последовательностями, сравнение последовательностей между двумя (или больше) полинуклеотидами или полипептидами обычно осуществляют посредством сравнения последовательностей двух полинуклеотидов в окне сравнения для того, чтобы идентифицировать и сравнивать локальные области сходства последовательностей. Термин эталонная последовательность не предназначен для ограничения последовательностями дикого типа, и может включать сконструированные или измененные последовательности. Например, в некоторых вариантах осуществления эталонная последовательность может представлять собой предварительно сконструированную или измененную аминокислотную последовательность.
Как используют в настоящем описании, окно сравнения относится к умозрительному сегменту из по меньшей мере приблизительно 20 непрерывных нуклеотидных положений или аминокислотных остатков, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью из по меньшей мере 20 непрерывных нуклеотидов или аминокислот и где часть последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) в 20% или меньше по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Окно сравнения может быть длиннее 20 непрерывных остатков и необя
- 6 043748 зательно включает 30, 40, 50, 100 или более длинные окна.
Как используют в настоящем описании, соответствующий, в отношении и относительно, когда используют в контексте нумерации данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности, относится к нумерации остатков конкретной эталонной последовательности, когда данную аминокислотную или полинуклеотидную последовательность сравнивают с эталонной последовательностью. Другими словами, номер остатка или положение остатка в данном полимере обозначают относительно эталонной последовательности, а не по фактическому нумерационному положению остатка в данной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности. Например, заданную аминокислотную последовательность, такую как ту, что у сконструированной PGA, можно выравнивать с эталонной последовательностью посредством введения пропусков для того, чтобы оптимизировать совпадения остатков между двумя последовательностями. В этих случаях, несмотря на то, что присутствуют пропуски, нумерацию остатка в заданной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности выполняют относительно эталонной последовательности, с которой ее выровняли. Как используют в настоящем описании, упоминание о положении остатка, таком как Xn, как дополнительно описано далее, следует толковать как указание на соответствующий остаток, пока конкретно не указано иное. Таким образом, например, Х94 относится к любой аминокислоте в положении 94 в полипептидной последовательности.
Как используют в настоящем описании, усовершенствованное свойство фермента относится к PGA, которая проявляет усовершенствование любого свойства фермента по сравнению с эталонной PGA. Для сконструированных полипептидов PGA, описанных в настоящем описании, сравнение в целом выполняют с ферментом PGA дикого типа, несмотря на то, что в некоторых вариантах осуществления эталонной PGA может быть другая усовершенствованная сконструированная PGA. Свойства фермента, для которых усовершенствование желательно, включают, но не ограничиваясь этим, ферментативную активность (которую можно выражать в единицах процентов превращения субстрата за конкретное время реакции с использованием конкретного количества PGA), хемоселективность, тепловую стабильность, стабильность в растворителе, рН профиль активности, требования к кофакторам, стойкость к ингибиторам (например, ингибирование продуктом), стереоспецифичность и стереоселективность (включая энантиоселективность).
Как используют в настоящем описании, увеличенная ферментативная активность относится к усовершенствованному свойству сконструированных полипептидов PGA, которую может представлять увеличение удельной активности (например, получаемый продукт/время/масса белка) или увеличение процента превращения субстрата в продукт (например, процент превращения начального количества субстрата в продукт за конкретный период времени с использованием конкретного количества PGA) по сравнению с эталонным ферментом PGA. Образцовые способы определения активности фермента приведены в примерах. Можно влиять на любое свойство, относящееся к активности фермента, включая классические свойства фермента Km, Vmax или kcat, изменения которых могут вести к увеличенной ферментативной активности. Усовершенствование активности фермента может составлять приблизительно от 1,5 крат ферментативной активности соответствующего фермента PGA дикого типа, до 2 крат, 5 крат, 10 крат, 20 крат, 25 крат, 50 крат, 75 крат, 100 крат или больше ферментативной активности относительно встречаемой в природе PGA или другой сконструированной PGA, из которой получали полипептиды PGA. В конкретных вариантах осуществления, сконструированный фермент PGA проявляет усовершенствованную ферментативную активность в диапазоне от 1,5 до 50 раз, от 1,5 до 100 раз более чем та, что у родительского фермента PGA. Специалист в данной области поймет, что активность любого фермента ограничена диффузией так, что скорость каталитического оборота не может превышать скорости диффузии субстрата, включая любые необходимые кофакторы. Теоретический максимум предела диффузии, или kcat/Km, в целом составляет приблизительно от 108 до 109 (М-1 с-1). Таким образом, любые усовершенствования активности фермента PGA будут иметь верхний предел, связанный со скоростью диффузии субстратов, на которые действует фермент PGA. Активность PGA можно измерять с помощью любого одного из стандартных анализов, используемых для измерения высвобождения фенилуксусной кислоты при расщеплении пенициллина G, например, посредством титрования (см., например, Simons and Gibson, Biotechnol. Tech.,13:365-367 [1999]). В некоторых вариантах осуществления активность PGA можно измерять с использованием 6-нитрофенилацетамидобензойной кислоты (NIPAB), продукт расщепления которой 5-амино-2-нитробензойная кислота поддается обнаружению спектрофотометрически (λmax=405 нм). Сравнение активностей ферментов выполняют с использованием определенного препарата фермента, определенного анализа при определенных условиях и одного или нескольких определенных субстратов, как дополнительно описано подробно в настоящем описании. В целом, когда сравнивают лизаты, определяют число клеток и количество анализируемого белка, а также использование идентичных экспрессирующих систем и идентичных клеток-хозяев для того, чтобы минимизировать вариации в количестве фермента, продуцируемого клетками-хозяевами и присутствующего в лизатах.
Как используют в настоящем описании, увеличенная ферментативная активность и увеличенная активность относятся к усовершенствованному свойству сконструированного фермента, которое может быть представлено увеличением удельной активности (например, получаемый продукт/время/масса бел
- 7 043748 ка) или увеличением процента превращения субстрата в продукт (например, процент превращения начального количества субстрата в продукт за конкретный период времени с использованием конкретного количества PGA) по сравнению с эталонным ферментом, как раскрыто в настоящем описании. Можно влиять на любое свойство, относящееся к активности фермента, включая классические свойства фермента Km, Vmax или kcat, изменения которых могут вести к увеличенной ферментативной активности. В некоторых вариантах осуществления ферменты PGA, предусмотренные в настоящем описании, высвобождают инсулин посредством удаления трифенилацетатных защитных групп с конкретных остатков в инсулине. Сравнение активностей ферментов выполняют с использованием определенного препарата фермента, определенного анализа при определенных условиях и одного или нескольких определенных субстратов, как дополнительно описано подробно в настоящем описании. В целом, когда сравнивают ферменты в клеточных лизатах, определяют число клеток и количество анализируемого белка, а также использование идентичных экспрессирующих систем и идентичных клеток-хозяев для того, чтобы минимизировать вариации в количестве фермента, продуцируемого клетками-хозяевами и присутствующего в лизатах.
Как используют в настоящем описании, превращение относится к ферментативному превращению субстрата в соответствующий продукт.
Как используют в настоящем описании, процент превращения относится к проценту субстрата, который превращают в продукт за определенный период времени в конкретных условиях. Таким образом, например, ферментативную активность или активность полипептида PGA можно выражать в виде процента превращения субстрата в продукт.
Как используют в настоящем описании, хемоселективность относится к предпочтительному образованию в химической или ферментативной реакции одного продукта относительно других.
Как используют в настоящем описании, термостабильный используют, чтобы отослать к полипептиду, который устойчив к инактивации под воздействием набора температурных условий (например, 40-80°С) в течение определенного периода времени (например, 0,5-24 ч), по сравнению с необработанным ферментом, таким образом сохраняя определенный уровень остаточной активности (например, более чем 60-80%) после воздействия повышенных температур.
Как используют в настоящем описании, стабильный в растворителе относится к способности полипептида поддерживать схожую активность (например, более чем, например, 60-80%) после воздействия различных концентраций (например, 5-99%) растворителя (например, изопропилового спирта, тетрагидрофурана, 2-метилтетрагидрофурана, ацетона, толуола, бутилацетата, трет-бутилметилового эфира и т.д.) в течение определенного периода времени (например, 0,5-24 ч) по сравнению с необработанным ферментом.
Как используют в настоящем описании, рН стабильный относится к полипептиду PGA, который сохраняет схожую активность (например, более чем 60-80%) после воздействия высокого или низкого рН (например, 4,5-6 или 8-12) в течение определенного периода времени (например, 0,5-24 ч) по сравнению с необработанным ферментом.
Как используют в настоящем описании, термостабильный и стабильный в растворителе относится к полипептиду PGA, который и термостабилен и стабилен в растворителе.
Как используют в настоящем описании, гидрофильная аминокислота или остаток относится к аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, проявляющую гидрофобность меньше нуля в соответствии с нормализованной консенсусной шкалой гидрофобности по Eisenberg et al., (Eisenberg et al., J. Mol. Biol., 179:125-142 [1984]). Генетически кодируемые гидрофильные аминокислоты включают L-Thr (T), L-Ser (S), L-His (H), L-Glu (E), L-Asn (N), L-Gln (Q), L-Asp (D), L-Lys (K) и L-Arg (R).
Как используют в настоящем описании, кислая аминокислота или остаток относится к гидрофильной аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, проявляющую значение рК меньше приблизительно 6, когда аминокислота входит в пептид или полипептид. Кислые аминокислоты обычно имеют отрицательно заряженные боковые цепи при физиологическом рН из-за утраты иона водорода. Генетически кодируемые кислые аминокислоты включают L-Glu (E) и L-Asp (D).
Как используют в настоящем описании, основная аминокислота или остаток относится к гидрофильным аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, проявляющую значение рК более приблизительно 6, когда аминокислота входит в пептид или полипептид. Основные аминокислоты обычно имеют положительно заряженные боковые цепи при физиологическом рН из-за ассоциации с ионом гидрония. Генетически кодируемые основные аминокислоты включают L-Arg (R) и L-Lys (K).
Как используют в настоящем описании, полярная аминокислота или остаток относится к гидрофильным аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, которая не заряжена при физиологическом рН, но которая имеет по меньшей мере одну связь, в которой пара электронов, общая для двух атомов, удерживается более близко одним из атомов. Генетически кодируемые полярные аминокислоты включают L-Asn (N), L-Gln (Q), L-Ser (S) и L-Thr (T).
Как используют в настоящем описании, гидрофобная аминокислота или остаток относится к аминокислоте или остатку, имеющим боковая цепь, проявляющую гидрофобность более нуля в соответствии с нормализованной консенсусной шкалой гидрофобности по Eisenberg et al., (Eisenberg et al., J. Mol. Biol.,
- 8 043748
179:125-142 [1984]). Генетически кодируемые гидрофобные аминокислоты включают L-Pro (P), L-Ile (I),
L-Phe (F), L-Val (V), L-Leu (L), L-Trp (W), L-Met (M), L-Ala (А) и L-Tyr (Y).
Как используют в настоящем описании, ароматическая аминокислота или остаток относится к гидрофильной или гидрофобной аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, которая содержит по меньшей мере одно ароматическое или гетероароматическое кольцо. Генетически кодируемые ароматические аминокислоты включают L-Phe (F), L-Tyr (Y) и L-Trp (W). Несмотря на то, что вследствие рКа его гетероароматического атома азота, L-His (H) иногда классифицируют как основный остаток, или как ароматический остаток, поскольку его боковая цепь содержит гетероароматическое кольцо, в настоящем описании гистидин классифицируют как гидрофильный остаток или как конформационно затрудненный остаток (см. далее).
Как используют в настоящем описании, конформационно затрудненная аминокислота или остаток относится к аминокислоте или остатку, которые имеют конформационно затрудненную геометрию. в настоящем описании конформационно затрудненные остатки включают L-Pro (P) и L-His (H). Гистидин имеет конформационно затрудненную геометрию, поскольку он имеет относительно небольшое имидазольное кольцо. Пролин имеет конформационно затрудненную геометрию, поскольку он также имеет пятичленное кольцо.
Как используют в настоящем описании, неполярная аминокислота или остаток относится к гидрофобной аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, которая не заряжена при физиологическом рН и которая имеет связи, в которых пара электронов, обычно общих для двух атомов, в целом удерживается в равной мере каждым из двух атомов (т.е. боковая цепь не является полярной). Генетически кодируемые неполярные аминокислоты включают L-Gly (G), L-Leu (L), L-Val (V), L-Ile (I), L-Met (M) и L-Ala (A).
Как используют в настоящем описании, алифатическая аминокислота или остаток относится к гидрофобной аминокислоте или остатку, имеющему алифатическую углеводородную боковую цепь.
Генетически кодируемые алифатические аминокислоты включают L-Ala (A), L-Val (V), L-Leu (L) и L-Ile (I).
Следует отметить, что цистеин (или L-Cys или [С]) необычен в том отношении, что он может образовывать дисульфидные мостики с другими аминокислотами L-Cys (С) или другим сульфанил- или сульфгидрил-содержащими аминокислотами. Цистеинподобные остатки включают цистеин и другие аминокислоты, которые содержат сульфгидрильные фрагменты, которые доступны для формирования дисульфидных мостиков. Способность L-Cys (С) (и других аминокислот с SH-содержащими боковыми цепями) существовать в пептиде или в восстановленной форме со свободным SH или окисленной форме с дисульфидным мостиком, влияет на то, привносит ли L-Cys (С) суммарный гидрофобный или гидрофильный характер в пептид. Хотя L-Cys (С) проявляет гидрофобность 0,29 в соответствии с нормализованной консенсусной шкалой по Eisenberg (Eisenberg et al., 1984, выше), следует понимать, что для целей настоящего раскрытия L-Cys (С) относят к его собственной уникальной группе.
Как используют в настоящем описании, небольшая аминокислота или остаток относится к аминокислоте или остатку, имеющим боковую цепь, которая состоит из всего трех или меньше атомов углерода и/или гетероатомов (не включая α-углерод и водороды). Малые аминокислоты или остатки дополнительно можно относить к алифатическим, неполярным, полярным или кислым небольшим аминокислотам или остатками, в соответствии с вышеприведенными определениями. Генетически кодируемые небольшие аминокислоты включают L-Ala (A), L-Val (V), L-Cys (С), L-Asn (N), L-Ser (S), L-Thr (T) и L-Asp (D).
Как используют в настоящем описании, гидроксилсодержащая аминокислота или остаток относится к аминокислоте, содержащей гидроксильный (-ОН) фрагмент.
Генетически кодируемые гидроксилсодержащие аминокислоты включают L-Ser (S) L-Thr (T) и LTyr (Y).
Как используют в настоящем описании, различие аминокислот и различие остатков относится к различию аминокислотного остатка в определенном положении полипептидной последовательности относительно аминокислотного остатка в соответствующем положении в эталонной последовательности. Положения различных аминокислот в целом обозначают в настоящем описании как Хп, где п относится к соответствующему положению в эталонной последовательности, на которой основано отличие остатков. Например, различие остатков в положении Х40 по сравнению с SEQ ID № 2 относится к отличию аминокислотного остатка в положении полипептида, соответствующем положению 40 в SEQ ID № 2. Таким образом, если эталонный полипептид из SEQ ID № 2 имеет гистидин в положении 40, то различие остатков в положении Х40 по сравнению с SEQ ID № 2 относится к замене аминокислоты любым остатком, отличным от гистидина, в положении полипептида, соответствующем положению 40 в SEQ ID № 2. В большинстве случаев в настоящем описании, конкретное различие аминокислотных остатков в определенном положении указывают как XnY, где Xn представляет собой конкретное соответствующее положение, как описано выше, и Y представляет собой однобуквенный идентификатор аминокислоты, встречающейся в сконструированном полипептиде (т.е. другой остаток, нежели в эталонном полипептиде). В некоторых случаях, настоящее раскрытие также предусматривает конкретные различия
- 9 043748 аминокислот, обозначаемые стандартной записью AnB, где А представляет собой однобуквенный идентификатор остатка в эталонной последовательности, n представляет собой номер положения остатка в эталонной последовательности и В представляет собой однобуквенный идентификатор замены остатка в последовательности сконструированного полипептида. В некоторых случаях, полипептид по настоящему раскрытию может содержать одно или несколько различий аминокислотных остатков относительно эталонной последовательности, которые показывает список конкретных положений, где присутствуют различия остатков относительно эталонной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, где можно использовать более чем одну аминокислоту в конкретном положении остатка полипептида, различные аминокислотные остатки, которые можно использовать, разделяют с помощью / (например, X192A/G). Настоящее раскрытие включает сконструированные полипептидные последовательности, содержащие одно или несколько различий аминокислот, которые включают консервативные и/или неконсервативные аминокислотные замены. Аминокислотные последовательности конкретных рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, включенные в список последовательностей по настоящему раскрытию, содержат начальный остаток метионина (М) (т.е. М представляет положение остатка 1). Однако специалист в данной области поймет, что этот начальный остаток метионина можно удалять с помощью биологических механизмов процессинга, например, в системе трансляции в клеткехозяине или in vitro, чтобы создавать зрелый белок, не содержащий начальный остаток метионина, но в остальном сохраняющий свойства фермента. Следовательно, термин различие аминокислотных остатков относительно SEQ ID № 2 в положении Xn, как используют в настоящем описании, может относиться к положению Xn или соответствующему положению (например, положению (Х-1)п) в эталонной последовательности, которая обработана с тем, чтобы начальный метионин отсутствовал.
Как используют в настоящем описании, фраза консервативные аминокислотные замены относится к взаимозаменяемости остатков, имеющих схожие боковые цепи, и, таким образом, обычно включает замену аминокислоты в полипептиде на аминокислоты в том же или сходно определяемом классе аминокислот. В качестве примера и не ограничения, в некоторых вариантах осуществления аминокислоту с алифатической боковой цепью заменяют на другую алифатическую аминокислоту (например, аланин, валин, лейцин и изолейцин); аминокислоту с гидроксильной боковой цепью заменяют на другую аминокислоту с гидроксильной боковой цепью (например, серин и треонин); аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи, заменяют на другую аминокислоту, имеющую ароматическую боковую цепь (например, фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин); аминокислоту с основной боковой цепью заменяют на другую аминокислоту с основной боковой цепью (например, лизин и аргинин); аминокислоту с кислой боковой цепью заменяют на другую аминокислоту с кислой боковой цепью (например, аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота); и/или гидрофобную или гидрофильную аминокислоту заменяют на другую гидрофобную или гидрофильную аминокислоту, соответственно. Образцовые консервативные замены приведены в табл. 1.
Таблица 1. Образцовые консервативные аминокислотные замены
Остаток Возможные консервативные замены
A, L, V, I Другая алифатическая (A, L, V, I) Другая неполярная (A, L, V, I, G, М)
G, М Другая неполярная (A, L, V, I, G, М)
D, Е Другая кислая (D, Е)
К, R Другая основная (К, R)
N, Q, S, Т Другая полярная
Η, Y, W, F Другая ароматическая (Η, Y, W, F)
С, Р Неполярная
Как используют в настоящем описании, фраза неконсервативная замена относится к замене аминокислоты в полипептиде на аминокислоту со значительно отличающимися свойствами боковой цепи. Неконсервативные замены позволяют использовать аминокислоты между определенными группами, а не внутри них, и влияют на (а) структуру пептидного остова в области замены (например, пролин вместо глицина) (b) заряд или гидрофобность или (с) объем боковой цепи. В качестве примера и не ограничения, образцовая неконсервативная замена может представлять собой кислую аминокислоту, заменяемую на основную или алифатическую аминокислоту; ароматическую аминокислоту, заменяемую на маленькую аминокислоту; и гидрофильную аминокислоту, заменяемую на гидрофобную аминокислоту.
Как используют в настоящем описании, делеция относится к модификации полипептида посредством удаления одной или нескольких аминокислот из эталонного полипептида. Делеции могут включать удаление 1 или больше аминокислот, 2 или больше аминокислот, 5 или больше аминокислот, 10 или больше аминокислот, 15 или больше аминокислот или 20 или больше аминокислот, вплоть до 10% от общего числа аминокислот или вплоть до 20% от общего числа аминокислот, образующих полипептид, при сохранении ферментативной активности и/или сохранении усовершенствованных свойств сконст- 10 043748 руированного фермента. Делеции могут быть направлены на внутренние части и/или концевые части полипептида. В различных вариантах осуществления делеция может содержать непрерывный сегмент или может быть прерывающейся.
Как используют в настоящем описании, инсерция относится к модификации полипептида посредством добавления одной или нескольких аминокислот в эталонный полипептид. В некоторых вариантах осуществления усовершенствованные сконструированные ферменты PGA содержат инсерции одной или нескольких аминокислот во встречаемом в природе полипептиде PGA, а также инсерции одной или нескольких аминокислот в сконструированных полипептидах PGA. Инсерции могут находиться во внутренних частях полипептида или на карбокси- или аминоконце. Инсерции, как используют в настоящем описании, включают слитые белки как они известны в данной области. Инсерция может представлять собой непрерывный сегмент аминокислот или может быть разделена одной или несколькими аминокислотами во встречаемом в природе полипептиде.
Термин набор замен аминокислот или набор замен относится к группе замен аминокислот в полипептидной последовательности, по сравнению с эталонной последовательностью. Набор замен может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше замен аминокислот. В некоторых вариантах осуществления набор замен относится к набору замен аминокислот, который присутствует в любом из вариантов PGA, перечисленных в таблицах, приведенных в примерах.
Как используют в настоящем описании, фрагмент относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию, но где остальная аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в последовательности. Фрагменты обычно имеют приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или приблизительно 99% полноразмерного полипептида PGA, например, полипептида из SEQ ID № 2. В некоторых вариантах осуществления фрагмент является биологически активным (т.е. он проявляет ту же ферментативную активность, что и полноразмерная последовательность).
Как используют в настоящем описании, выделенный полипептид относится к полипептиду, который по существу отделяют от других контаминантов, которые в природе сопутствуют ему, например, белок, липиды и полинуклеотиды. Термин охватывает полипептиды, которые удалены из или очищены от встречаемого в природе окружения или экспрессирующей системы (например, клетка-хозяин или синтез in vitro). Усовершенствованные ферменты PGA могут присутствовать в клетке, присутствовать в клеточной среде или могут быть получены в различных формах, таких как лизаты или выделенные препараты. По существу, в некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды PGA по настоящему раскрытию могут представлять собой выделенный полипептид.
Как используют в настоящем описании, по существу чистый полипептид относится к композиции, в которой частицы полипептида представляют собой преобладающие присутствующие частицы (т.е. на молярной или массовой основе, он является более многочисленным, чем любые другие индивидуальные макромолекулярные частицы в композиции), и в целом представляет собой в значительной степени очищенную композицию, когда рассматриваемые частицы составляют по меньшей мере приблизительно 50% присутствующих макромолекулярных частиц по молям или % массы. В целом, композиция по существу чистого сконструированного полипептида PGA содержит приблизительно 60% или больше, приблизительно 70% или больше, приблизительно 80% или больше, приблизительно 90% или больше, приблизительно 91% или больше, приблизительно 92% или больше, приблизительно 93% или больше, приблизительно 94% или больше, приблизительно 95% или больше, приблизительно 96% или больше, приблизительно 97% или больше, приблизительно 98% или больше или приблизительно 99% от всех макромолекулярных частиц по молям или % массы, присутствующих в композиции. Частицы растворителя, низкомолекулярные соединения (<500 Да) и частицы элементарных ионов не считают макромолекулярными частицами. В некоторых вариантах осуществления выделенный усовершенствованный полипептид PGA представляет собой композицию по существу чистого полипептида.
Как используют в настоящем описании, когда используют по отношению к нуклеиновой кислоте или полипептиду, термин гетерологичный относится к последовательности, которую обычно организм (например, организм дикого типа) не экспрессирует и не секретирует. В некоторых вариантах осуществления термин охватывает последовательность, которая содержит две или больше подпоследовательностей, которые не встречаются в той же связи друг с другом, как их обычно находят в природе, или является рекомбинантно сконструированной так, что ее уровень экспрессии или физическую связь с другими нуклеиновыми кислотами или другими молекулами в клетке или структуру обычно не встречают в природе. Например, гетерологичную нуклеиновую кислоту обычно получают рекомбинантно, имея две или больше последовательностей из несвязанных генов, которые устроены таким образом, который не находят в природе (например, открытая рамка считывания (ORF) нуклеиновой кислоты по изобретению функционально связана с промоторной последовательностью, вставленной в экспрессирующую кассету, такую как вектор). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полинуклеотид относится к любому полинуклеотиду, который вводят в клетку-хозяина с помощью лабораторных приемов и который включает полинуклеотиды, которые удаляют из клетки-хозяина, подвергаемой лабораторной манипуляции, и затем повторно вводят в клетку-хозяина.
- 11 043748
Как используют в настоящем описании, подходящие условия реакции относятся к тем условиям в растворе биокаталитической реакции (например, диапазонам загрузки фермента, загрузки субстрата, загрузки кофакторов, температуре, рН, буферам, сорастворителям и т. д.), при которых полипептид PGA по настоящему раскрытию способен высвобождать свободный инсулин посредством удаления трифенилацетатных защитных групп. Образцовые подходящие условия реакции предусмотрены в настоящем раскрытии и проиллюстрированы примерами.
Как используют в настоящем описании, загрузка, например, в загрузке соединения, загрузке фермента или загрузке кофактора относится к концентрации или количеству компонента в реакционной смеси в начале реакции.
Как используют в настоящем описании, субстрат в контексте опосредованного биокатализатором процесса относится к соединению или молекуле, на которые действует биокатализатор.
Как используют в настоящем описании, продукт в контексте опосредованного биокатализатором процесса относится к соединению или молекуле, являющимся результатом действия биокатализатора.
Как используют в настоящем описании, уравновешивание, как используют в настоящем описании, относится к процессу, ведущему к равновесной концентрации химических частиц в химической или ферментативной реакции (например, взаимопревращение двух частиц А и В), включая взаимопревращение стереоизомеров, как определяют с помощью прямой константы скорости и обратной константы скорости химической или ферментативной реакции.
Как используют в настоящем описании, ацилаза и ацилтрансферазы, используют взаимозаменяемо, чтобы отослать к ферментам, которые способны к переносу ацильной группы с донора на акцептор, чтобы формировать сложные эфиры или амиды. Опосредованная ацилазой обратная реакция ведет к гидролизу сложного эфира или амида.
Как используют в настоящем описании, пенициллин G и бензилпенициллин относятся к антибиотику, также известному как (2S,5R,6R)-3,3-диметил-7-оксо-6-(2-фенилацетамидо)-4-тиа-1-азабициkло [3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота (C16H18N2O4S). В первую очередь, он эффективен против грамположительных организмов, хотя некоторые грамотрицательные организмы также восприимчивы к нему.
Как используют в настоящем описании, ацилазу пенициллина G и PGA используют взаимозаменяемо, чтобы отослать к ферменту, обладающему способностью опосредовать расщепление пенициллина G (бензилпенициллина) до фенилуксусной кислоты (РНА) и 6-аминопенициллановой кислоты (6АРА). В некоторых вариантах осуществления активность PGA может быть основана на расщеплении модельных субстратов, например, на расщеплении 6-нитро-3-(фенилацетамид)бензойной кислоты до фенилуксусной кислоты и 5-амино-2-нитробензойной кислоты. PGA также способны осуществлять обратную реакцию переноса ацильной группы с донора ацила на акцептор ацила. PGA, как обозначают в настоящем описании, включают встречаемые в природе PGA (дикого типа), а также не встречаемые в природе ферменты PGA, включающие один или несколько сконструированных полипептидов, создаваемых путем манипуляции человека. Ген PGA дикого типа представляет собой гетеродимер, состоящий из альфа-субъединицы (23,8 кДа) и бета-субъединицы (62,2 кДа), связанных спейсерной областью в 54 аминокислоты. Из-за присутствия спейсерной области, необходима стадия аутопроцессинга для того, чтобы формировать активный белок.
Как используют в настоящем описании, донор ацила относится к той части субстрата ацилазы, которая дает ацильную группу акцептору ацила для того, чтобы формировать сложные эфиры или амиды.
Как используют в настоящем описании, акцептор ацила относится к той части субстрата ацилазы, которая принимает ацильную группу от донора ацила для того, чтобы формировать сложные эфиры или амиды.
Как используют в настоящем описании, последовательность α-цепи относится к аминокислотной последовательности, которая соответствует (например, обладает по меньшей мере 85% идентичностью) остаткам в положениях с 27 до 235 в SEQ ID № 2. Как используют в настоящем описании, одноцепочечный полипептид может содержать последовательность отцепи и дополнительную последовательность(и).
Как используют в настоящем описании, последовательность β-цепи относится к аминокислотной последовательности, которая соответствует (например, обладает по меньшей мере 85% идентичностью) остаткам в положениях с 290 до 846 в SEQ ID № 2. Как используют в настоящем описании, одноцепочечный полипептид может содержать последовательность β-цепи и дополнительную последовательность(и).
Как используют в настоящем описании, получен из, когда используют в контексте сконструированных ферментов PGA, идентифицирует исходный фермент PGA и/или ген, кодирующий такой фермент PGA, на котором основано конструирование. Например, одноцепочечный сконструированный фермент PGA из SEQ ID № 60 получали посредством искусственного развития, на протяжении нескольких поколений, гена, кодирующего PGA из К. citrophila. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления сконструированные ферменты PGA получают из встречаемого в природе или PGA дикого типа с
- 12 043748
SEQ ID № 2, хотя в некоторых дополнительных вариантах осуществления сконструированные ферменты PGA получают из других развитых ферментов PGA. В некоторых вариантах осуществления сконструированная PGA содержит последовательность α-цепи и последовательность β-цепи, которые могут присутствовать в виде отдельных полипептидов в зрелом ферменте или могут присутствовать в качестве части одноцепочечного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, когда присутствует в виде одноцепочечной формы, сконструированный полипептид PGA может содержать, от амино- к карбоксиконцу, структуру B-L-A в которой В представляет собой последовательность β-цепи (или единицу В); А представляет собой последовательность α-цепи (или единицу А); и L представляет собой линкер, соединяющий последовательности α-цепи и β-цепи. В некоторых вариантах осуществления спейсер или линкер L содержит спейсер или линкер достаточной длины и гибкости, чтобы допускать надлежащую укладку и взаимодействие единиц А и В для того, чтобы формировать функциональный фермент PGA. Образцовый линкер/спейсер содержит аминокислотную последовательность Gln-Leu-Asp-Gln.
Будь в форме отдельных полипептидов или в виде одноцепочечного полипептида, последовательности α- и β-цепей могут иметь одну или несколько различий остатков по сравнению со встречаемыми в природе последовательностями α- и β-цепей из PGA K. citrophila.
Как используют в настоящем описании, инсулин относится к полипептидному гормону, продуцируемому бета-клетками поджелудочной железы у нормальных индивидуумов. Инсулин необходим для регуляции метаболизма углеводов, посредством снижения уровней глюкозы крови. Систематический недостаток инсулина ведет к диабету. Инсулин состоит из 51 аминокислоты и имеет молекулярную массу приблизительно 5800 Да. Инсулин состоит из двух пептидных цепей (обозначаемых А и В), содержащих одну внутрисубъединичную и две межсубъедининых дисульфидных связи. Цепь А состоит из 21 аминокислоты и цепь В состоит из 30 аминокислот. Две цепи образуют высоко упорядоченную структуру, с несколькими альфа-спиральными областями в обеих цепях А и В. Изолированные цепи неактивны. В растворе инсулин представляет собой мономер, димер или гексамер. Он является гексамером в высоко концентрированных препаратах, используемых для подкожной инъекции, но становится мономером по мере его разведения текучими веществами организма. Предусмотрено, что определение охватывает проинсулин и любой очищенный выделенный полипептид, имеющий частично или полностью первичную структурную конформацию и по меньшей мере одно из биологических свойств инсулина, встречаемого в природе. Кроме того, предусмотрено, что оно охватывает природный и получаемый синтетически инсулин, в том числе гликоформы, а также аналоги (например, полипептиды, имеющие делеции, инсерции и/или замены).
Инсулин содержит три нуклеофильных амина, которые потенциально могут вступать в реакцию с донором фенилацетата и быть защищенными с помощью PGA. Эти остатки включают Lys в В-цепи в положении 29 (В29) и два N-концевых свободных амина, Gly на А-цепи в положении 1 (А1) и Phe на Вцепи в положении 1 (В1). Тризащищенный инсулин (фенилацетат, химически прикрепленный к остаткам A1, B1, B29 в инсулине человека) предусмотрен в настоящем описании. Ранее сообщалось, что PGA катализирует гидролиз N-фенилацетат-защищенных пептидов и инсулина с исключительной избирательностью к фенилацетатной амидной связи, оставляя остальные пептидные связи белка интактными (Brtnik et al., Coll. Czech. Chem. Commun., 46 (8), 1983-1989 [1981] и Wang et al. Biopolym. 25 (Suppl.), S109-S114 [1986]).
Как используют в настоящем описании, трифенилацетатная защитная группа относится к молекуле инсулина, которая имеет три первичных амина в положениях B1, B29 и А1, которые защищают фенилацильной группой.
Как используют в настоящем описании, дифенилацетатная защитная группа относится к молекуле инсулина, которая имеет два первичных амина в положениях B1, B29 и/или А1, которые защищены фенилацильной группой.
Как используют в настоящем описании, дифенилацетатная защитная группа относится к молекуле инсулина, которая имеет один первичный амин в положениях B1, B29 или А1, которые защищены фенилацильной группой.
Ацилазы пенициллина G
Впервые была описана ацилаза пенициллина из Penicillium chrysogenum Wise. Q176 авторами Sakaguchi и Murao (Sakaguchi and Murao, J. Agr.Chem. Soc. Jpn., 23:411 [1950]). Ацилаза пенициллина G представляет собой гидролитический фермент, который действует на боковые цепи пенициллина G, цефалоспорина G и родственных антибиотиков с образованием промежуточных соединений β-лактамных антибиотиков 6-аминопенициллановой кислоты и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты с фенилуксусной кислотой в качестве общего побочного продукта. Эти промежуточные соединения антибиотиков входят в потенциальные строительные блоки для полусинтетических антибиотиков, таких как ампициллин, амоксициллин, клоксациллин, цефалексин и цефатоксим.
Как указано выше, ацилазы пенициллина G (PGA) отличаются способностью катализировать гидролитическое расщепление пенициллина G, с сопряженным основанием структурной формулы (I), до 6аминопенициллановой кислоты, с сопряженным основанием структурной формулы (II), и фенилуксусной
- 13 043748 кислоты структурной формулы (III), как показано в схеме 1:
Схема 1
W (П) (тп)
Без ограничения теорией, субстратная специфичность выглядит ассоциированной с распознаванием гидрофобной фенильной группы, тогда как нуклеофил, которым в некоторых PGA является остаток серина на N-конце бета-цепи, выполняет функцию акцептора бета-лактама и различных других групп, таких как бета-аминокислоты. PGA также могут отличаться способностью расщеплять модельные субстраты, аналогичные пенициллину G, например, расщепление 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты (NIPAB) структурной формулы (IV), как показано в схеме 2:
Схема 2
(TV) (V) (HI) до фенилуксусной кислоты структурной формулы (III) и 5-амино-2-нитробензойной кислоты структурной формулы (V) (см., например, Alkema et al., Anal. Biochem., 275:47-53 [1999]). Поскольку 5-амино2-нитробензойная кислота является хромогенной, субстрат формулы (IV) предоставляет удобный способ измерения активности PGA. В дополнение к вышеуказанным реакциям, PGA также можно использовать при кинетическом разрешении DL-трет-лейцина для получения оптически чистого трет-лейцина (см., например, Liu et al., Prep. Biochem. Biotechnol., 36:235-41 [2006]).
PGA по настоящему изобретению основаны на ферменте, полученном из организма Kluyvera citrophila (K. citrophila). Как и в случае PGA от других организмов, PGA от K. citrophila представляет собой гетеродимерный фермент, состоящий из альфа-субъединицы и бета-субъединицы, которые возникают посредством протеолитического процессинга препрополипептида PGA. Удалением сигнального пептида и спейсерного пептид получают зрелый гетеродимер (см., например, Barbero et al., Ген 49:69-80 [1986]). Аминокислотная последовательность встречаемого в природе препрополипептида PGA из K. citrophila общедоступна (см., например, номер доступа GenBank P07941, [gi:129551]) и предоставлена в настоящем описании как SEQ ID № 2. Последовательность альфа-цепи встречаемой в природе PGA K. citrophila соответствует остаткам с 27 до 235 из SEQ ID № 2. Последовательность бета-цепи встречаемой в природе PGA K. citrophila соответствует остаткам с 290 до 846 из SEQ ID № 2.
Остатки с 1 до 26 из SEQ ID № 2 соответствуют сигнальному пептиду и остатки 236-289 из SEQ ID № 2 соответствуют связывающему пропептиду, оба их удаляют для того, чтобы создавать встречаемый в природе зрелый фермент PGA, который представляет собой гетеродимер, содержащий субъединицу αцепи и субъединицу β-цепи. В некоторых вариантах осуществления сконструированная PGA содержит последовательность α-цепи и последовательность β-цепи, которые могут присутствовать в виде отдельных полипептидов в зрелом ферменте или могут присутствовать в качестве части одноцепочечного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, которая присутствует в виде одноцепочечной формы, сконструированный полипептид PGA может содержать, от амино- к карбоксиконцу, структуру B-L-A в которой В представляет собой последовательность β-цепи (или единицу В); А представляет собой последовательность α-цепи (или единицу А); и L представляет собой линкер, соединяющий последовательности α-цепи и β-цепи. В некоторых вариантах осуществления спейсер или линкер L содержит спейсер или линкер достаточной длины и гибкости, чтобы допускать надлежащую укладку и взаимодействие единиц А и В для того, чтобы формировать функциональный фермент PGA. Образцовый линкер/спейсер содержит аминокислотную последовательность Gln-Leu-Asp-Gln.
Будь в форме отдельных полипептидов или в виде одноцепочечного полипептида, последовательности α- и β-цепей могут иметь одно или несколько различий остатков по сравнению со встречаемыми в природе последовательностями α- и β-цепей из PGA K. citrophila.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает сконструированные полипептиды PGA с аминокислотными последовательностями, которые обладают по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или больше идентичностью последовательностей с SEQ ID №№ 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160.
Настоящее изобретение предусматривает инсулинспецифические биокатализаторы ацилирования, подходящие для использования в коммерческом масштабе. Направленную эволюцию использовали для разработки эффективных вариантов ацилаз, которые способны добавлять фенилацетатную защитную группу к инсулину в положениях A1, B1 и/или В29. Варианты PGA, предусмотренные в настоящем описании, способны принимать широкий диапазон ацильных групп, проявлять увеличенную стабильность в
- 14 043748 растворителе и усовершенствованную термостабильность по сравнению с PGA дикого типа. Варианты PGA, предусмотренные в настоящем описании, не содержат спейсерную область. Таким образом, стадия аутопроцессинга не требуется для того, чтобы получать активные ферменты. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим сконструированные полипептиды PGA. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды функционально связаны с одной или несколькими гетерологичными регуляторными последовательностями, которые управляют экспрессией гена, чтобы создавать рекомбинантный полинуклеотид, способный экспрессировать полипептид.
Экспрессионные конструкции, содержащие гетерологичный полинуклеотид, кодирующий сконструированные полипептиды PGA, можно вводить в подходящие клетки-хозяева для того, чтобы экспрессировать соответствующий полипептид PGA. По причине известности кодонов, соответствующих различным аминокислотам, доступность белковой последовательности предоставляет описание всех полинуклеотидов, способных кодировать рассматриваемое. Вырожденность генетического кода, где одни и те же аминокислоты кодируют посредством альтернативные или синонимические кодоны, допускает создание чрезвычайно большого числа нуклеиновых кислот, все из которых кодируют усовершенствованные ферменты PGA, раскрытые в настоящем описании. Таким образом, имея идентифицированную конкретную аминокислотную последовательность, специалисты в данной области могут создавать любое число различных нуклеиновых кислот путем простой модификации последовательности одного или нескольких кодонов таким образом, который не меняет аминокислотную последовательность белка. В связи с этим, настоящее раскрытие, в частности, предусматривает каждую и всякую возможную вариацию полинуклеотидов, которые можно получать, выбирая комбинации на основе выбора возможных кодонов, и все такие вариации следует рассматривать как конкретно раскрытые для любого полипептида, раскрытого в настоящем описании, включая аминокислотные последовательности, представленные в таблицах в примерах.
В различных вариантах осуществления, кодоны предпочтительно отбирают так, чтобы они подходил к клетке-хозяину, в которой получают белок. Например, предпочтительные кодоны, используемые в бактериях, используют для того, чтобы экспрессировать ген в бактериях; предпочтительные кодоны, используемые в дрожжах используют для экспрессии в дрожжа; и предпочтительные кодоны, используемые у млекопитающих, используют для экспрессии в клетках млекопитающих.
В определенных вариантах осуществления все кодоны не нужно заменять для того, чтобы оптимизировать использование кодонов для полипептидов PGA, поскольку природная последовательность содержит предпочтительные кодоны, а также поскольку использование предпочтительных кодонов может не требоваться для всех аминокислотных остатков. Следовательно, полинуклеотиды с оптимизацией кодонов, кодирующие ферменты PGA, могут содержать предпочтительные кодоны в приблизительно 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более чем 90% положений кодонов полноразмерной кодирующей области.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PGA с аминокислотной последовательностью, которая обладает по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или большей идентичностью последовательностей с любой альфа-цепью и/или бета-цепью эталонных сконструированных полипептидов PGA, описанных в настоящем описании. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична эталонным последовательностям альфа- и бета-цепей на основе SEQ ID № 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует аминокислотную последовательность альфа- и/или бета-цепи из SEQ ID № 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид PGA с аминокислотной последовательностью, которая обладает по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или большей идентичностью последовательностей с SEQ ID № 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична SEQ ID № 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160.
В некоторых вариантах осуществления выделенным полинуклеотидом, кодирующим усовершенствованный полипептид PGA, манипулировали различными способами для обеспечения усовершенствованной активности и/или экспрессии полипептида. Манипуляции с выделенным полинуклеотидом перед его встраиванием в вектор могут быть желательны или необходимы, в зависимости от экспрессирующего вектора. Приемы модификаций полинуклеотидов и последовательностей нуклеиновой кислоты с использованием способов рекомбинантных ДНК хорошо известны в данной области.
Например, способы мутагенеза и направленной эволюции можно легко применять к полинуклеотидам для того, чтобы создавать варианты библиотек, которые можно экспрессировать, осуществлять их скрининг и анализ. Способы мутагенеза и направленной эволюции хорошо известны в данной области
- 15 043748 (см., например, патенты США №№ 5605793, 5830721, 6132970, 6420175, 6277638, 6365408, 6602986,
7288375, 6287861, 6297053, 6576467, 6444468, 5811238, 6117679, 6165793, 6180406, 6291242, 6995017,
6395547, 6506602, 6519065, 6506603, 6413774, 6573098, 6323030, 6344356, 6372497, 7868138, 5834252,
5928905, 6489146, 6096548, 6387702, 6391552, 6358742, 6482647, 6335160, 6653072, 6355484, 603344,
6319713, 6613514, 6455253, 6579678, 6586182, 6406855, 6946296, 7534564, 7776598, 5837458, 6391640,
6309883, 7105297, 7795030, 6326204, 6251674, 6716631, 6528311, 6287862, 6335198, 6352859, 6379964,
7148054, 7629170, 7620500, 6365377, 6358740, 6406910, 6413745, 6436675, 6961664, 7430477, 7873499,
7702464, 7783428, 7747391, 7747393, 7751986, 6376246, 6426224, 6423542, 6479652, 6319714, 6521453,
6368861, 7421347, 7058515, 7024312, 7620502, 7853410, 7957912, 7904249 и все связанные эквиваленты не для США; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Ген, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 и WO 2009/152336, все они включены в настоящее описание посредством ссылки).
В некоторых вариантах осуществления варианты ацилаз PGA по настоящему изобретению дополнительно содержат дополнительные последовательности, которые не изменяют кодируемую активность фермента. Например, в некоторых вариантах осуществления варианты ацилаз PGA связывают с эпитопной меткой или другой последовательностью, которую можно использовать при очистке.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды вариантов ацилаз PGA по настоящему изобретению секретирует клетка-хозяин, в которой их экспрессируют (например, клетка-хозяин дрожжей или нитчатых грибов) и экспрессируют в виде препротеина, содержащего сигнальный пептид (т.е. аминокислотную последовательность, которая связана с аминоконцом полипептида и которая направляет кодируемый полипептид по клеточному секреторному пути).
В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид представляет собой эндогенный сигнальный пептид ацилазы PGA К. citrophila. В некоторых других вариантах осуществления используют сигнальные пептиды из других секретируемых белков K. citrophila.
В некоторых вариантах осуществления другие сигнальные пептиды находят использование, в зависимости от клетки-хозяина и других факторов. Области, кодирующие эффективные сигнальные пептиды, для клеток-хозяев нитчатых грибов включают, но не ограничиваясь этим, кодирующие сигнальные пептиды области, получаемые из ТАКА амилазы Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens, липазы Humicola lanuginosa и целлобиогидролазы II Т. reesei. Кодирующие сигнальные пептиды области для бактериальных клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, кодирующие сигнальные пептиды области, получаемые из генов мальтогенной амилазы Bacillus NClB 11837, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, β-лактамазы Bacillus licheniformis, нейтральной протеазы (nprT, nprS, nprM) Bacillus stearothermophilus и prsA Bacillus subtilis. В некоторых дополнительных вариантах осуществления другие сигнальные пептиды находят использование в настоящем изобретении (см., например, Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57: 109-137 [1993], включено в настоящее описание посредством ссылки). Дополнительные эффективные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев включают таковые из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae, инвертазы SUC2Saccharomyces cerevisiae (см., например, Taussig and Carlson, Nucl. Acids Res., 11:1943-54 [1983]; № доступа SwissProt P00724; и Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]). В некоторых вариантах осуществления находят применение варианты этих сигнальных пептидов и других сигнальных пептидов. В действительности, не предусмотрено, что настоящее изобретение ограничено каким-либо конкретным сигнальным пептидом, поскольку любой подходящий сигнальный пептид, известный в данной области, находит использование в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает полинуклеотиды, кодирующие полипептиды вариантов ацилаз PGA и/или их биологически активные фрагменты, как раскрыто в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид функционально связан с одной или несколькими гетерологичными регуляторными или управляющими последовательностями, которые управляют экспрессией гена для того, чтобы создавать рекомбинантный полинуклеотид, способный экспрессировать полипептид. В некоторых вариантах осуществления экспрессионные конструкции, содержащие гетерологичный полинуклеотид, кодирующий вариант ацилазы PGA, вводят в подходящие клетки-хозяева для того, чтобы экспрессировать вариант ацилазы PGA.
Средние специалисты в данной области поймут, что из-за вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды вариантов ацилаз PGA по настоящему изобретению. Например, все кодоны AGA, AGG, CGA, CGC, CGG и CGU кодируют аминокислоту аргинин. Таким образом, в каждом положении в нуклеиновых кислотах по изобретению,
- 16 043748 где аргинин определен кодоном, кодон можно изменять на любой из соответствующих кодонов, описанных выше, без изменения кодируемого полипептида. Понятно, что U в последовательности РНК соответствует Т в последовательности ДНК. Изобретение относится к и предусматривает каждую и всякую возможную вариацию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, которую можно выполнять, выбирая комбинации на основе возможных альтернатив кодонов.
Как указано выше, также можно разрабатывать последовательность ДНК, кодирующую PGA, с кодонами с высоким предпочтением кодонов (кодонов, которые используют с более высокой частотой в кодирующих белок областях, чем другие кодоны, которые кодируют ту же аминокислоту). Предпочтительные кодоны можно определять по отношению к использованию кодонов в одном гене, наборе генов с общей функцией или происхождением, высоко экспрессируемых генах, частоте кодонов в агрегатных кодирующих белок областях целого организма, частоте кодонов в агрегатных кодирующих белок областях родственных организмов или их сочетаний. Кодон, частота которого возрастает вместе с уровнем экспрессии гена, обычно является оптимальным кодоном для экспрессии. В частности, последовательность ДНК можно оптимизировать для экспрессии в конкретном организме-хозяине. Различные способы хорошо известны в данной области для определения частоты кодонов (например, использование кодонов, относительное использование синонимических кодонов) и кодонные предпочтения в конкретных организмах, включая многопараметрический анализ (например, с использованием кластерного анализа или анализа соответствий) и эффективное число кодонов, используемых в гене. Источник данных для получения использования кодонов может полагаться на любую доступную нуклеотидную последовательность, способную кодировать белок.
Эти наборы данных включают последовательности нуклеиновой кислоты, которые доподлинно кодируют экспрессируемые белки (например, полные кодирующие белок последовательности -CDS), метки экспрессируемой последовательности (EST) или предсказанные кодирующие области геномных последовательностей, как хорошо известно в данной области. Полинуклеотиды, кодирующие варианты PGA, можно получать с использованием любых подходящих известные в данной области способов. Обычно олигонуклеотиды синтезируют индивидуально, затем соединяют (например, способами ферментативного или химического лигирования или опосредованными полимеразой способами) для того, чтобы формировать по существу любую желаемую непрерывную последовательность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды по настоящему изобретению получают посредством химического синтеза с использованием любых подходящих известных в данной области способов, включая в качестве неограничивающих примеров автоматизированные способы синтеза. Например, в фосфорамидитном способе олигонуклеотиды синтезируют (например, в автоматическом синтезаторе ДНК), очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящие векторы. В некоторых вариантах осуществления после этого получают фрагменты двухцепочечной ДНК или посредством синтеза комплементарной нити и отжига нитей вместе при подходящих условиях или посредством добавления комплементарной нити с использованием ДНК-полимеразы и подходящей последовательности праймера. Существует множество общих и стандартных текстов, в которых предоставлены способы, которые можно использовать в настоящем изобретении и которые хорошо известны специалистам в данной области.
Сконструированные PGA можно получать, подвергая полинуклеотид, кодирующий встречаемую в природе PGA, способам мутагенеза и/или направленной эволюции, как рассмотрено выше. Мутагенез можно осуществлять в соответствии с любыми из приемов, известных в данной области, включая случайный и сайт-специфический мутагенез. Направленную эволюцию можно осуществлять с использованием любых из приемов, известных в данной области для скрининга усовершенствованных вариантов, включая перетасовку. Другие процедуры направленной эволюции, которые находят применение, включают, но не ограничиваясь этим, процесс (стадию) ступенчатой достройки, рекомбинацию in vitro, мутагенную ПЦР, кассетный мутагенез, сплайсинг посредством достраивания перекрытий (SOE), способы направленной эволюции ProSAR™ и т.д., а также любые другие подходящие способы.
Осуществляют скрининг клонов, получаемых после мутагенетической обработки, по сконструированным PGA, имеющим желаемое усовершенствованное свойство фермента. Измерение активности фермента из экспрессионных библиотек можно осуществлять с использованием стандартных биохимических приемов мониторинга скорости образования продукта. Когда желаемым усовершенствованным свойством фермента является тепловая стабильность, активность фермента можно измерять после воздействия на препараты фермента определенными температурами и измерения количества активности фермента, остающейся после тепловой обработки. Затем клоны, содержащие полинуклеотид, кодирующий PGA, выделяют, секвенируют для того, чтобы идентифицировать изменения в нуклеотидной последовательности (если уместно), и используют для того, чтобы экспрессировать фермент в клетке-хозяине.
Когда последовательность сконструированного полипептида известна, полинуклеотиды, кодирующие фермент, можно получать стандартными твердофазными способами, в соответствии с известными способами синтеза. В некоторых вариантах осуществления фрагменты приблизительно до 100 оснований можно синтезировать индивидуально, затем соединять (например, способами ферментативного или химического лигирования или опосредованными полимеразой способами) для того, чтобы формировать любую желаемую непрерывную последовательность. Например, полинуклеотиды и олигонуклеотиды по
- 17 043748 изобретению можно получать посредством химического синтеза (например, с использованием классического фосфорамидитного способа, описанного в Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981], или способа, описанного в Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984], как его обычно практикуют в автоматизированных способах синтеза). В соответствии с фосфорамидитным способом олигонуклеотиды синтезируют (например, в автоматическом синтезаторе ДНК), очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящие векторы. Кроме того, по существу любую нуклеиновую кислоту можно получать из любого из различных коммерческих источников (например, Midland Certified Reagent Company, Midland, TX, The Great American Ген Company, Ramona, CA, ExpressGen Inc. Chicago, IL, Operon Technologies Inc., Alameda, CA и многие другие).
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным конструкциям, содержащим последовательность, кодирующую по меньшей мере один вариант PGA, как предусмотрено в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид варианта PGA, функционально связанный с гетерологичным промотором. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы по настоящему изобретению используют для того, чтобы трансформировать подходящие клетки-хозяева, чтобы позволять клеткамхозяевам экспрессировать белок варианта PGA. Способы рекомбинантной экспрессии белков в грибах и других организмах хорошо известны в данной области, и множество экспрессирующих векторов доступно или можно сконструировать с использованием стандартных способов. В некоторых вариантах осуществления конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержат вектор, такой как, плазмида, космида, фаг, вирус, бактериальная искусственная хромосома (ВАС), искусственная хромосома дрожжей (YAC) и т.п., в который встроена последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды по настоящему изобретению встраивают в любой один из различных экспрессирующих векторов, подходящих для экспрессии полипептида(ов) варианта PGA. Подходящие векторы включают, но не ограничиваясь этим хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК (например, производные SV40), а также бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирусные, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговой ДНК, вирусную ДНК, например, вируса осповакцины, аденовируса, вируса оспы птиц, псевдобешенства, аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровирусов и многих других. Любой подходящий вектор, который трансдуцирует генетический материал в клетку и, если репликация желательна, который является реплицируемым и жизнеспособным в релевантном хозяине, находит использование в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления конструкция дополнительно содержит регуляторные последовательности, включая в качестве неограничивающих примеров промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью белка. Большое число подходящих векторов и промоторов известно специалистам в данной области. В действительности, в некоторых вариантах осуществления, чтобы достигать высоких уровней экспрессии у конкретного хозяина, часто полезно экспрессировать варианты PGA по настоящему изобретению под управлением гетерологичного промотора. В некоторых вариантах осуществления промоторную последовательность функционально связывают с 5'-областью кодирующей вариант PGA последовательности с использованием любого подходящего известного в данной области способа. Примеры эффективных промоторов для экспрессии вариантов PGA включают, но не ограничиваясь этим, промоторы грибов. В некоторых вариантах осуществления находит применение промоторная последовательность, которая управляет экспрессией гена, отличного от гена PGA, в штамме грибов. В качестве неограничивающего примера, можно использовать промотор грибов из гена, кодирующего эндоглюканазу. В некоторых вариантах осуществления находит применение промоторная последовательность, которая управляет экспрессией гена PGA в штамме грибов, отличном от штамма грибов, у которого получали PGA. Примеры других подходящих промоторов, которые можно использовать для того, чтобы управлять транскрипцией нуклеотидных конструкций по настоящему изобретению в клеткаххозяевах нитчатых грибов, включают, но не ограничиваясь этим, промоторы, получаемые из генов ТАКА амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислой стабильной альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), липазы Rhizomucor miehei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (см., например, WO 96/00787, включенную в настоящее описание посредством ссылки), а также промотор NA2-tpi (гибрид промоторов из генов нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae), промоторы, такие как cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1, amy и glaA (см., например, Nunberg et al., Mol. Cell Biol., 4:2306-2315 [1984]; Boel et al., EMBO J., 3:1581-85 [1984]; и европейскую патентную заявку 137280, все они включены в настоящее описание посредством ссылки), и их мутантные, усеченные и гибридные промоторы.
В дрожжевых клетках-хозяевах эффективные промоторы включают, но не ограничиваясь этим, те, что из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (eno-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (gal1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) и 3фосфоглицераткиназы S. cerevisiae. Дополнительные эффективные промоторы, которые можно исполь- 18 043748 зовать для дрожжевых клеток-хозяев, известны в данной области (см., например, Romanos et al., Yeast
8:423-488 [1992], включенную в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, промоторы, ассоциированные с получением хитиназы в грибах, находят применение в настоящем изобретении (см., например, Blaiseau and Lafay, Gene 120243-248 [1992]; и Limon et al., Curr. Genet., 28:478-83 [1995], обе они включены в настоящее описание посредством ссылки).
Для бактериальных клеток-хозяев подходящие промоторы для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию включают, но не ограничиваясь этим, промоторы, получаемые из lac-оперона Е.coli, trp-оперона Е. coli, бактериофага А, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), генов xylA и xylB Bacillus subtilis и прокариотического гена бета-лактамазы (см., например, Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]), а также промотора tac (см., например, DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]).
В некоторых вариантах осуществления клонированные варианты PGA по настоящему изобретению также имеют подходящую последовательность терминатора транскрипции, последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином для того, чтобы терминировать транскрипцию. Последовательность терминатора функционально связывают с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который функционален в клетке-хозяине, предпочтительно находит применение в настоящем изобретении. Образцовые терминаторы транскрипции для клеток-хозяев нитчатых грибов включают, но не ограничиваясь этим, те, которые получают из генов ТАКА амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (также см. патент США № 7399627, включенный в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления образцовые терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев включают те, которые получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома С Saccharomyces cerevisiae (CYCl) и глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие эффективные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев общеизвестны специалистам в данной области (см., например, Romanos et al., Yeast 8:423-88 [1992]).
В некоторых вариантах осуществления подходящая лидерная последовательность, являющаяся частью клонируемой последовательности варианта PGA, представляет собой нетранслируемую область мРНК, которая важна для трансляции в клетке-хозяине. Лидерную последовательность функционально связывают с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любая лидерная последовательность, которая функциональна в клетке-хозяине, предпочтительно находит применение в настоящем изобретении. Образцовые лидеры для клеток-хозяев нитчатых грибов включают, но не ограничиваясь этим, те, которые получают из генов ТАКА амилазы Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans. Подходящие лидеры для дрожжевых клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, те, которые получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
В некоторых вариантах осуществления последовательности по настоящему изобретению также содержат последовательность полиаденилирования, которая представляет собой последовательность, функционально связанную с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты и которую, при транскрипции, распознает клетка-хозяин в качестве сигнала для добавления остатков полиаденозина к транскрибируемой мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая функциональна в клеткехозяине, предпочтительно находит применение в настоящем изобретении. Образцовые последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев нитчатых грибов включают, но не ограничиваясь этим, те, которые получают из генов ТАКА амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum и альфа-глюкозидазы Aspergillus niger. Эффективные последовательности полиаденилирования для дрожжевых клеток-хозяев известны в данной области (см., например, Guo and Sherman, Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995]).
В некоторых вариантах осуществления управляющая последовательность содержит кодирующую сигнальный пептид область, кодирующую аминокислотную последовательность, связываемую с аминоконцом полипептида и направляющую кодируемый полипептид по секреторному пути клетки. 5'-конец кодирующей последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты может неотъемлемо содержать кодирующую сигнальный пептид область, в природе связанную с сохранением трансляционной рамки считывания с сегментом кодирующей области, который кодирует секретируемый полипептид. Альтернативно, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать кодирующую сигнальный пептид область, которая чужеродна для кодирующей последовательности. Когда кодирующая последовательность в природе не содержит кодирующую сигнальный пептид область, может потребоваться чужеродная кодирующая сигнальный пептид область.
Альтернативно, чужеродной кодирующей сигнальный пептид областью можно просто замещать ес- 19 043748 тественную кодирующую сигнальный пептид область для того, чтобы усиливать секрецию полипептида.
Однако любую кодирующую сигнальный пептид область, которая направляет экспрессируемый полипептид по секреторному пути клетки-хозяина, предпочтительно можно использовать в настоящем изобретении.
Эффективные кодирующие сигнальные пептиды области для бактериальных клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, кодирующие сигнальные пептиды области, получаемые из генов мальтогенной амилазы Bacillus NC1B 11837, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, нейтральной протеазы Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis.
Дополнительные сигнальные пептиды известны в данной области (см., например, Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57: 109-137 [1993]).
Эффективные кодирующие сигнальные пептиды области для клеток-хозяев нитчатых грибов включают, но не ограничиваясь этим, кодирующие сигнальные пептиды области, получаемые из генов ТАКА амилазы Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa.
Эффективные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, гены альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие эффективные кодирующие сигнальные пептиды области известны в данной области (см., например, Romanos et al., [1992], выше).
В некоторых вариантах осуществления управляющая последовательность содержит кодирующую пропептид область, которая кодирует аминокислотную последовательность, расположенную на аминоконце полипептида. Получаемый полипептид известен как профермент или прополипептид (или зимоген, в некоторых случаях). Прополипептид в целом неактивен и может быть превращен в зрелый активный полипептид PGA посредством каталитического или аутокаталитического отщепления пропептида от прополипептид. Кодирующую пропептид область можно получать из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лактазы Myceliophthora thermophila (см., например, WO 95/33836).
Когда обе области сигнального пептида и пропептида присутствуют на аминоконце полипептида, область пропептида располагают рядом с аминоконцом полипептида, а область сигнального пептида располагают рядом с аминоконцом области пропептида.
В некоторых вариантах осуществления регуляторные последовательности также используют для того, чтобы сделать возможной регуляцию экспрессии полипептида относительно роста клетки-хозяина. Примеры регуляторных систем представляют собой те, которые обеспечивают экспрессию гена, подлежащего включению или выключению в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. В прокариотических клетках-хозяевах подходящие регуляторные последовательности включают, но не ограничиваясь этим, системы операторов lac, tac и trp. В дрожжевых клетках-хозяевах подходящие регуляторные системы включают, например, систему ADH2 или систему GAL1. У нитчатых грибов подходящие регуляторные последовательности включают промотор ТАКА альфа-амилазы, промотор глюкоамилазы Aspergillus niger и промотор глюкоамилазы Aspergillus oryzae.
Другими примерами регуляторных последовательностей являются те, которые допускают амплификацию гена. В эукариотических системах они включают ген дигидрофолатредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются в присутствии тяжелых металлов. В этих случаях последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PGA по настоящему изобретению, следует функционально связывать с регуляторной последовательностью.
Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотид, кодирующий сконструированный полипептид PGA или его вариант, и одну или несколько регулирующих экспрессию областей, таких как промотор и терминатор, сайт начала репликации и т.д., в зависимости от типа хозяев, в которые их следует вводить. В некоторых вариантах осуществления различные последовательности нуклеиновой кислоты и управляющие последовательности, описанные выше, соединяют вместе для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, который может содержать один или несколько удобных участков рестрикции для того, чтобы сделать возможной инсерцию или замену последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в таких участках. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты экспрессируют посредством встраивания последовательности нуклеиновой кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, в подходящий вектор для экспрессии. При создании экспрессирующего вектора, кодирующую последовательность располагают в векторе с тем, чтобы функционально связывать кодирующую последовательность с подходящими управляющими последовательностями для экспрессии.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор включает любой подходящий вектор (например, плазмиду или вирус), который можно в целях удобства подвергать процедурам с рекомбинантной ДНК и мо- 20 043748 жет обеспечивать экспрессию полинуклеотидной последовательности. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую вектор следует вводить. В некоторых вариантах осуществления векторы представляют собой линейные или замкнутые кольцевые плазмиды.
В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор представляет собой автономно реплицирующийся вектор (т. е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, такого как плазмида, внехромосомный элемент, минихромосома или искусственная хромосома). В некоторых вариантах осуществления вектор содержит любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно, в некоторых других вариантах осуществления, при введении в клетку-хозяина, вектор встраивают в геном и реплицируют вместе с хромосомой(ами), в которую он встроен. Кроме того, в дополнительных вариантах осуществления находят применение один вектор или плазмида или два или больше вектора или плазмид, которые вместе содержат полную ДНК, подлежащую введению в геном клетки-хозяина, или транспозон.
В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор по настоящему изобретению содержит один или несколько селективных маркеров, которые допускают простой отбор трансформированных клеток. Селективный маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоциду или вирусу, устойчивость к противомикробным средствам или тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т.п. Любые подходящие селективные маркеры для использования в клетках-хозяевах нитчатых грибов находят использование в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь этим, amdS (ацетамидаза), argB (орнитинкарбамоилтрансфераза), bar (фосфинотрицинацетилтрансфераза), hph (гигромицинфосфотрансфераза), niaD (нитратредуктаза), pyrG (оротидин-5'фосфатдекарбоксилаза), sC (сульфатаденилтрансфераза) и trpC (антранилатсинтаза), а также их эквиваленты. Дополнительные маркеры, которые можно использовать в клетках-хозяевах, таких как Aspergillus, включают, но не ограничиваясь этим, гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae, и ген bar Streptomyces hygroscopicus. Подходящие маркеры для дрожжевых клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, МЕТ3, TRP1 и URA3. Примеры бактериальных селективных маркеров включают, но не ограничиваясь этим, гены dal из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу и/или тетрациклину.
В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы по настоящему изобретению содержат элемент(ы), который допускает встраивание вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома. В некоторых вариантах осуществления, включающих встраивание в геном клетки-хозяина, векторы основаны на последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или любой другой элемент вектора для встраивания вектора в геном посредством гомологичной или негомологичной рекомбинации.
В некоторых альтернативных вариантах осуществления, экспрессирующие векторы содержат дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты для того, чтобы направлять встраивание посредством гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина. Дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты делают возможным встраивание вектора в геном клетки-хозяина в точном местоположении(ях) в хромосоме(ах). Чтобы увеличивать вероятность встраивания в точном местоположении, интеграционные элементы предпочтительно содержат достаточное число нуклеотидов, такое как от 100 до 10000 пар оснований, предпочтительно от 400 до 10000 пар оснований и наиболее предпочтительно от 800 до 10000 пар оснований, которые высоко гомологичны с соответствующей целевой последовательностью, чтобы увеличивать вероятность гомологичной рекомбинации. Интеграционные элементы могут представлять собой любую последовательность, которая гомологична с целевой последовательностью в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интеграционные элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие последовательности нуклеиновой кислоты. С другой стороны, вектор можно встраивать в геном клетки-хозяина посредством негомологичной рекомбинации.
Для автономной репликации вектор дополнительно может содержать участок начала репликации, который делает возможной автономную репликацию вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Примеры бактериальных участков начала репликации представляют собой ori P15A или участки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 (эта плазмида имеет ori P15A) или pACYC184, которые допускают репликацию в Е. coli, и pUB110, pE194, рТА1060 или pAMe1, которые допускают репликацию в Bacillus. Примеры участков начала репликации для использования в дрожжевых клетках-хозяевах представляет собой 2 мкм участок начала репликации, ARS1, ARS4, комбинацию ARS1 и CEN3 и комбинацию ARS4 и CEN6. Участком начала репликации может быть тот, который имеет мутацию, которая делает его функционирование чувствительным к температуре в клетке-хозяине (см., например, Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433 [1978]).
В некоторых вариантах осуществления более чем одну копию последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению вставляют в клетку-хозяина для увеличения продуцирования продукта гена. Увеличение числа копий последовательности нуклеиновой кислоты можно получать посредством встраивания по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клеткихозяина или посредством включения амплифицируемого гена селективного маркера с последовательно- 21 043748 стью нуклеиновой кислоты, где клетки, содержащие амплифицированные копии гена селективного маркера и, тем самым, дополнительные копии последовательности нуклеиновой кислоты, можно выбирать посредством культивирования клеток в присутствии подходящего средства для отбора.
Многие экспрессирующие векторы для использования в настоящем изобретении коммерчески доступны. Подходящие коммерческие экспрессирующие векторы включают, но не ограничиваясь этим, экспрессирующие векторы p3xFLAGTMTM (Sigma-Aldrich Chemicals), которые содержат промотор CMV и сайт полиаденилирования hGH для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих и участок начала репликации pBR322 и маркеры устойчивости к ампициллину для амплификации в Е.coli. Другие подходящие экспрессирующие векторы включают, но не ограничиваясь этим, pBluescriptII SK(-) и pBK-CMV (Stratagene), и плазмиды, полученные из pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) или pPoly (см., например, Lathe et al., Gene 57:193-201 [1987]).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий последовательность, кодирующую по меньшей мере один вариант PGA, трансформируют в клетку-хозяина для того, чтобы делать возможным размножение вектора и экспрессию варианта(ов) PGA. В некоторых вариантах осуществления варианты PGA являются посттрансляционно модифицированными для того, чтобы удалять сигнальный пептид, и в некоторых случаях могут расщепляться после секреции. В некоторых вариантах осуществления описанную выше трансформированную клетку-хозяина культивируют в подходящей питательной среде в условиях, допускающих экспрессию варианта(ов) PGA. Любая подходящая среда, которую можно использовать для культивирования клеток-хозяев, находит применение в настоящем изобретении, включая в качестве неограничивающих примеров минимальные или комплексные среды, содержащие подходящие добавки. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева растят в средах НТР. Подходящие среды доступны у различных коммерческих поставщиков, или их можно получать в соответствии с опубликованными прописями (например, в каталогах American Type Culture Collection).
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий усовершенствованный полипептид PGA, предусмотренный в настоящем описании, полинуклеотид функционально связывают с одной или несколькими управляющими последовательностями для экспрессии фермента PGA в клетке-хозяине. Клетки-хозяева для использования в экспрессии полипептидов PGA, кодируемых экспрессирующими векторами по настоящему изобретению, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваясь этим, бактериальные клетки, такие как клетки Е.coli, Bacillus megaterium, Lactobacillus kefir, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, такие как дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris (№ доступа АТСС 201178)); клетки насекомого, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животного, такие как клетки СНО, COS, BHK, 293 и меланомы Боуэса; и клетки растения. Подходящие среды для культивирования и условия роста для описанных выше клеток-хозяев хорошо известны в данной области.
Полинуклеотиды для экспрессии PGA можно вводить в клетки с помощью различных известных в данной области способов. Приемы включают, среди прочих, электропорацию, бомбардировку биолистическими частицами, опосредованную липосомами трансфекцию, трансфекцию с хлоридом кальция и слияние протопластов. Различные способы введения полинуклеотидов в клетки известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. Подходящие эукариотические клетки-хозяева включают, но не ограничиваясь этим, клетки грибов, клетки водорослей, клетки насекомого и клетки растения. Подходящие клетки-хозяева грибов включают, но не ограничиваясь этим, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota, Zygomycota, Fungi imperfecti. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева грибов представляют собой клетки дрожжей и клетки нитчатых грибов. Клетки-хозяева нитчатых грибов по настоящему изобретению включают все нитчатые формы подотдела Eumycotina и Oomycota. Нитчатые грибы отличаются вегетативным мицелием с клеточной стенкой, состоящей из хитина, целлюлозы и других сложных полисахаридов. Клетки-хозяева нитчатых грибов по настоящему изобретению морфологически отличны от дрожжей.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева нитчатых грибов относятся к любому подходящему роду и виду, включая в качестве неограничивающих примеров Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium и/или Volvariella и/или телеоморфы или анаморфы, а также их синонимы, базионимы или таксономические эквиваленты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей, включая в качестве неограничивающих примеров клетки видов Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces или Yarrowia. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетка дрожжей представляет собой Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces
- 22 043748 kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae,
Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans или Yarrowia lipolytica.
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку водоросли, например, Chlamydomonas (например, С. reinhardtii) и Phormidium (P. sp. АТСС29409).
В некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. Подходящие прокариотические клетки включают, но не ограничиваясь этим, грамположительные, грамотрицательные и грамвариабельные бактериальные клетки. Любой подходящий бактериальный организм находит применение в настоящем изобретении, включая в качестве неограничивающих примеров Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter, Acidothermus, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Micrococcus, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmus, Streptomyces, Streptococcus, Synecoccus, Saccharomonospora, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Tularensis, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia и Zymomonas. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой вид Agrobacterium, Acinetobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Buchnera, Geobacillus, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, Streptomyces или Zymomonas. В некоторых вариантах осуществления бактериальный штамм-хозяин не патогенен для человека. В некоторых вариантах осуществления бактериальный штамм-хозяин представляет собой промышленный штамм. Многие бактериальные промышленные штаммы известны и подходят для настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, бактериальная клеткахозяин относится к виду Agrobacterium (например, A. radiobacter, A. rhizogenes и А. rubi). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, бактериальная клетка-хозяин относится к виду Arthrobacter (например, A. aurescens, A. citreus, A. globiformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparqffinus, A. sulfureus и A. ureafaciens). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бактериальная клетка-хозяин относится к виду Bacillus (например, В. thuringensis, В. anthracis, В. megaterium, В. subtilis, В. lentus, В. circulans, В. pumilus, В. lautus, B.coagulans, В. brevis, В. firmus, В. alkaophius, В. licheniformis, В. clausii, B. stearothermophilus, В. halodurans и В. amyloliquefaciens). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой промышленный штамм Bacillus, включая в качестве неограничивающих примеров В. subtilis, В. pumilus, В. licheniformis, В. megaterium, В. clausii, В. stearothermophilus или В. amyloliquefaciens. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева Bacillus представляют собой В. subtilis, В. licheniformis, В. megaterium, В. stearothermophilus и/или В. amyloliquefaciens. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Clostridium (например, С. acetobutylicum, С. tetani E88, С. lituseburense, C. saccharobutylicum, С. perfringens и С. beijerinckii). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Corynebacterium (например, С. glutamicum и С. acetoacidophilum). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Escherichia (например, Е. coli). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Erwinia (например, Е. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata и Е. terreus). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Pantoea (например, P. Citrea и P. agglomerans). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Pseudomonas (например, P. putida, P. aeruginosa, P. Mevalonii и P. sp. D-01 10). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Streptococcus (например, S. equisimiles, S. Pyogenes и S. uberis). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Streptomyces (например, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. Griseus и S. lividans). В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин относится к виду Zymomonas (например, Z. mobilis и Z. lipolytica).
Образцовой клеткой-хозяином является Escherichia coli W3110. Экспрессирующий вектор создавали, функционально связывая полинуклеотид, кодирующий усовершенствованную PGA, в плазмиду pCK110900, функционально связанную с промотор lac под управлением репрессора lad. Экспрессирующий вектор также содержал участок начала репликации Р15а и ген устойчивости к хлорамфениколу. Клетки, содержащие рассматриваемый полинуклеотид в Escherichia coli W3110, выделяли через отбор клеток с использованием хлорамфеникола.
Многие прокариотические и эукариотические штаммы, которые находят использование в настоящем изобретении, легко доступны для публики во многих коллекциях культур, таких как American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Cen- 23 043748 traalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern
Regional Research Center (NRRL).
В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева генетически модифицируют, чтобы они имели характеристики, которые усовершенствуют секрецию белка, стабильность белка и/или другие свойства, желательные для экспрессии и/или секреции белка. Генетическую модификацию можно осуществлять с помощью приемов генетической инженерии и/или классических микробиологических приемов (например, химический или УФ мутагенез и последующий отбор). В действительности, в некоторых вариантах осуществления комбинации приемов рекомбинантной модификации и классического отбора используют для получения клеток-хозяев. Используя рекомбинантную технологию, молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить, удалять, ингибировать или модифицировать таким образом, который ведет к увеличенному выходу варианта(ов) PGA в клетке-хозяине и/или в среде для культивирования. Например, нокаут функции Alp1 ведет к клетке с протеазной недостаточностью, а нокаут функции pyr5 ведет к клетке с фенотипом дефицита пиримидина. В одном подходе генетической инженерии гомологичную рекомбинацию используют для того, чтобы индуцировать модификации целевого гена посредством конкретного направленного воздействия на ген in vivo, чтобы подавлять экспрессию кодируемого белка. В альтернативных подходах находят использование миРНК, антисмысловая и/или рибозимная технология при ингибировании экспрессии гена. В данной области известны различные способы для снижения экспрессии белка в клетках, включая в качестве неограничивающих примеров делецию целиком или частично гена, кодирующего белок, и сайт-специфический мутагенез для нарушения экспрессии или активности продукта гена. (см., например, Chaveroche et al., Nucl. Acids Res., 28:22 e97 [2000]; Cho et al., Molec. Plant Microbe Interact., 19:7-15 [2006]; Maruyama and Kitamoto, Biotechnol Lett., 30:1811-1817 [2008]; Takahashi et al., Mol. Gen. Genom., 272: 344-352 [2004]; и You et al., Arch. Micriobiol.,191:615-622 [2009], все они включены по ссылке в настоящее описание). Также находит применение случайный мутагенез, за которым следует скрининг желаемых мутаций (см., например, Combier et al., FEMS Microbiol. Lett., 220:141-8 [2003]; и Firon et al., Eukary. Cell 2:247-55 [2003], обе включены по ссылке).
Введение вектора или конструкции ДНК в клетку-хозяина можно выполнять с использованием любого подходящего известного в данной области способа, включая в качестве неограничивающих примеров трансфекцию с фосфатом кальция, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, PEGопосредованную трансформацию, электропорацию или другие обычные приемы, известные в данной области.
В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки-хозяева (т.е. рекомбинантные клетки-хозяева) по настоящему изобретению культивируют в стандартных питательных средах модифицированных по ситуации для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации полинуклеотида PGA. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой то, что использовали ранее для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и они общеизвестны специалистам в данной области. Как отмечено, многие стандартные источники и тексты доступны для культивирования и получения многих клеток, включая клетки, происходящие от бактерий, растений, животных (в частности, млекопитающих) и архебактерий.
В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие полипептиды вариантов PGA по изобретению, растят в условиях порционной или непрерывной ферментации. Классическая порционная ферментация представляет собой закрытую систему, в которой композиции среды задают в начале ферментации и не подвергают искусственным изменениям в ходе ферментации. Вариацией порционной системы является порционная ферментация с подпиткой, которая также находит применение в настоящем изобретении. В этой вариации субстрат добавляют частями по мере протекания ферментации. Порционные системы с подпиткой можно использовать, когда катаболитная репрессия вероятно ингибирует метаболизм клеток и когда желательно иметь ограниченные количества субстрата в среде. Порционная ферментация и порционная ферментация с подпиткой являются обычными и хорошо известными в данной области. Непрерывная ферментация представляет собой открытую систему, где определенную среду для ферментации непрерывно добавляют в биореактор и одновременно равное количество кондиционированной среды удаляют для обработки. Непрерывная ферментация в целом поддерживает культуры при постоянной высокой плотности, где клетки прежде всего находятся в логарифмической фазе роста. Системы непрерывной ферментации стремятся поддерживать условия устойчивого роста. Способы с модулирующими питательными веществами и факторами роста для непрерывного процесса ферментации, а также приемы максимизации скорости образования продукта, хорошо известны в области промышленной микробиологии.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, бесклеточные системы транскрипции/трансляции находят использование при получении варианта(ов) PGA. Несколько систем коммерчески доступны, и способы общеизвестны специалистам в данной области.
Настоящее изобретение предусматривает способы получения полипептидов вариантов PGA или их биологически активных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления способ включает: предоставление клетки-хозяина, трансформированной полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере приблизительно 70% (или по меньшей мере прибли- 24 043748 зительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%) идентичностью последовательностей с SEQ ID № 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160, и содержит по меньшей мере одну мутацию, как предусмотрено в настоящем описании; культивирование трансформированной клетки-хозяина в среде для культивирования в условиях, в которых клетка-хозяин экспрессирует кодируемый полипептид варианта PGA; и необязательно извлечение или выделение экспрессируемого полипептида варианта PGA и/или извлечение или выделение среды для культивирования, содержащей экспрессируемый полипептид варианта PGA. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно предусматривают необязательный лизис трансформированных клеток-хозяев после экспрессии кодируемого полипептида PGA и необязательно извлечение и/или выделение экспрессируемого полипептида варианта PGA из клеточного лизата. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способы получения полипептида варианта PGA, включающие культивирование клетки-хозяина, трансформированной полипептидом варианта PGA, в условиях, подходящих для продуцирования полипептида варианта PGA, и извлечение полипептида варианта PGA. Обычно, извлечение или выделение полипептида PGA происходит из культуральной среды клетки-хозяина, клетки-хозяина или обеих с использованием приемов извлечения белка, которые хорошо известны в данной области, включая те, что описаны в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева собирают посредством центрифугирования, разрушают физическими или химическими средствами и получаемый неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые при экспрессии белков, можно разрушать любым удобным способом, включая в качестве неограничивающих примеров циклическое замораживание-оттаивание, обработку звуком, механическое разрушение и/или использование средств для лизиса клеток, а также многими другими подходящими способами, хорошо известными специалистам в данной области.
Сконструированные ферменты PGA, экспрессируемые в клетке-хозяине, можно извлекать из клеток и/или среда для культивирования с использованием любого одного или нескольких общеизвестных приемов для очистки белка, включая, среди прочего, обработку лизоцимом, обработку звуком, фильтрование, высаливание, ультрацентрифугирование и хроматографию. Подходящие растворы для лизирования и высокоэффективного экстрагирования белков из бактерий, таких как Е. coli, коммерчески доступны под торговым названием CelLytic В™ (Sigma-Aldrich).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления получаемый полипептид извлекают/выделяют и необязательно очищают любыми из многих известных в данной области способов. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид выделяют из питательной среды с помощью стандартных процедур, включая в качестве неограничивающих примеров центрифугирование, фильтрование, экстрагирование, распылительную сушку, испарение, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобного взаимодействия, хроматофокусирование и эксклюзионную) или преципитацию. В некоторых вариантах осуществления стадии повторной укладки белка используют, по желанию, по заврешении конфигурация зрелого белка. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) используют на конечных стадиях очистки. Например, в некоторых вариантах осуществления известные в данной области способы находят использование в настоящем изобретении (см., например, Parry et al., Biochem. J., 353:117 [2001]; и Hong et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 73:1331 [2007], обе включены в настоящее описание посредством ссылки). В действительности, любые подходящие способы очистки, известные в данной области, находят использование в настоящем изобретении.
Хроматографические приемы для выделения полипептида PGA включают, но не ограничиваясь этим, хроматографию с обращенной фазой высокоэффективную жидкостную хроматографию, ионообменную хроматографию, электрофорез в геле и аффинную хроматографию. Условия для очистки конкретного фермента зависят отчасти от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность, молекулярная масса, молекулярная форма и т.д., которые известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления аффинные приемы находят использование при выделении усовершенствованных ферментов PGA. Для очистки аффинной хроматографией можно использовать любое антитело, которое специфически связывает полипептид PGA. Для получения антител различных животных-хозяев, включая в качестве неограничивающих примеров кроликов, мышей, крыс и т.д., можно иммунизировать посредством инъекции PGA. Полипептид PGA можно прикреплять к подходящему носителю, такому как BSA, через функциональную группу боковой цепи или линкеры, прикрепленные к функциональной группе боковой цепи. Различные адъюванты можно использовать для увеличения иммунологического ответа, в зависимости от биологического вида хозяина, в том числе, в качестве неограничивающих примеров, Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы Pluronic, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин морского блюдца, динитрофенол и потенциально эффективные адъюванты человека, такие как BCG (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum.
- 25 043748
В некоторых вариантах осуществления варианты PGA получают и используют в форме клеток, экспрессирующих ферменты, в виде неочищенных экстрактов или в виде выделенных или очищенных препаратов. В некоторых вариантах осуществления варианты PGA получают в виде лиофилизатов, в порошкообразной форме (например, ацетоновые порошки) или получают в виде растворов фермента. В некоторых вариантах осуществления варианты PGA находятся в форме по существу чистых препаратов.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды PGA прикрепляют к любой подходящей твердой подложке. Твердые подложки включают, но не ограничиваясь этим, твердую фазу, поверхность и/или мембрану. Твердые носители включают, но не ограничиваясь этим, органические полимеры, такие как полистирол, полиэтилен, полипропилен, полифторэтилен, полиэтиленокси и полиакриламид, а также их сополимеры и привитые полимеры. Твердый носитель также может быть неорганическим, например, стеклом, диоксидом кремния, стеклом с контролируемым размером пор (CPG), диоксидом кремния обращенной фазы или металлом, таким как золото или платина. Конфигурация субстрата может быть в форме бусин, сфер, частиц, гранул, геля, мембраны или поверхности. Поверхности могут быть плоскими, по существу плоскими или не плоскими. Твердые носители могут быть пористыми или не пористыми и могут иметь набухающие или не набухающие характеристики. Твердый носитель можно выполнять в форме лунки, впадины или другого контейнера, сосуда, признака или местоположения. Множество опор можно выполнять в массиве в различных местоположениях, с возможностью обращения для роботизированной доставки реактивов или с помощью способов и/или инструментов обнаружения.
В некоторых вариантах осуществления иммунологические способы используют для того, чтобы очищать варианты PGA. В одном подходе антитело, образованное против полипептида варианта PGA (например, против полипептида, содержащего любую из SEQ ID №№ 2, 4, 12, 24, 40, 56, 70, 82, 100, 108, 110, 116, 136, 154 и/или 160, и/или его иммуногенного фрагмента), с использованием стандартных способов иммобилизуют на бусах, смешивают с клеточными культуральными средами в условиях, в которых связывают вариант PGA, и осаждают. В связанном подходе применение находит иммунохроматография.
В некоторых вариантах осуществления варианты PGA экспрессируют в виде слитого белка, содержащего неферментативную часть. В некоторых вариантах осуществления последовательность варианта PGA сливают с облегчающим очистку доменом. Как используют в настоящем описании, термин облегчающий очистку домен относится к домену, который опосредует очистку полипептида, с которым его сливают. Подходящие домены для очистки включают, но не ограничиваясь этим, металл-хелатирующие пептиды, гистидин-триптофановые модули, которые допускают очистку на иммобилизованных металлах, последовательность, которая связывает глутатион (например, GST), гемагглютининовую метку (НА) (соответствующую эпитопу, получаемому из белка гемагглютинина гриппа; см., например, Wilson et al., Cell 37:767 [1984]), последовательности мальтозусвязывающего белка, эпитоп FLAG, используемый в системе удлинения/аффинной очистки FLAGS (например, системе, доступной в Immunex Corp), и т.п. Один экспрессирующий вектор, рассматриваемый для использования в композициях и способах, описанных в настоящем описании, обеспечивает экспрессию слитого белка, содержащего полипептид по изобретению, слитый с полигистидиновой областью, отделенной сайтом расщепления энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают очистку на IMIAC (аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла; см., например, Porath et al., Prot. Exp. Purif., 3:263-281 [1992]) тогда как сайт расщепления энтерокиназы предоставляет средство для отделения полипептида варианта PGA от слитого белка. Векторы pGEX (Promega) также можно использовать для того, чтобы экспрессировать чужеродные полипептиды в виде слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST). В целом, такие слитые белки растворимы и могут быть легко очищены от лизированных клеток посредством адсорбции на лиганд-агарозгных бусах (например, глутатион-агарозных в случае слияния с GST), после чего следует элюирование в присутствии свободного лиганда.
Экспериментальная часть
Различные признаки и варианты осуществления раскрытия проиллюстрированы в следующих репрезентативных примерах, которые предусмотрены в качестве иллюстрации и не ограничения.
Далее в раскрытии экспериментов применяют следующие сокращения: м.д. (миллионная доля); М (молярный); мМ (миллимолярный), мкМ (микромолярный); нМ (наномолярный); моль (моли); г (грамм); мг (миллиграмм); мкг (микрограмм); л (литр); мл (миллилитр); см (сантиметр); мм (миллиметр); мкм (микрометр); с (секунда); мин (минута); ч (час); Ед (единица); MW (молекулярная масса); об./мин (обороты в минуту); °С (градус Цельсия); RT (комнатная температура); CDS (кодирующая последовательность); ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота); РНК (рибонуклеиновая кислота); а.к. (аминокислота); ТВ (среда ТВ; 12 г/л бактотриптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 мл/л глицерина, 65 мМ фосфат калия, рН 7,0, 1 мМ MgSO4); САМ (хлорамфеникол); PMBS (сульфат полимиксина В); IPTG (изопропилтиогалактозид); TFA (трифторуксусная кислота); CHES (2-циклогексиламино)этансульфоновая кислота; HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография); FIOPC (кратность усовершенствования относительно положительного контроля); НТР (высокая пропускная способность); LB (бульон Лурия); Codexis (Codexis, Inc., Redwood City, CA); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Daicel (Daicel, West
- 26 043748
Chester, PA); Genetix (Genetix USA, Inc., Beaverton, OR); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC,
Sunnyvale, CA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, часть Life Technologies, Corp., Grand Island, NY),
Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (часть Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); (Infors; Infors-HT, Bottmingen/Basel, Switzerland); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); и BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Microfluidics (Microfluidics Corp., Newton, MA).
Пример 1. Экспрессионные хозяева Е.coli, содержащие гены рекомбинантных PGA.
Исходные ферменты PGA, используемые для полученяи вариантов по настоящему изобретению, получали или из панели ацилаз Codex® (планшет панели PGA; Codexis) или вариантов, раскрытых в публикации заявки на патент США совместного владения № 2016/0326508. Планшет панели PGA содержит совокупность сконструированных полипептидов PGA, которые имеют усовершенствованные свойства, по сравнению с PGA дикого типа Kluyvera citrophila. Ген PGA дикого типа представляет собой гетеродимер, состоящий из альфа-субъединицы (23,8 кДа) и бета-субъединицы (62,2 кДа), которые связаны с помощью спейсерной области из 54 а.к. Из-за присутствия спейсерной области, стадия аутопроцессинга необходима для того, чтобы формировать активный белок. В ходе разработки настоящего изобретения, ген дикого типа модифицировали для устранения спейсерной области, таким образом устраняя стадию аутопроцессинга. Планшет панели PGA (Codexis) содержит варианты PGA, которые не содержат спейсерную область (см., например, публикацию заявки на патент США 2010/0143968 А1). Кодирующие PGA гены клонировали в экспрессирующий вектор pCK110900 (см. фиг. 3 в публикации заявки на патент США № 2006/0195947), функционально связанный с промотором lac под управлением репрессора lacl. Экспрессирующий вектор также содержит участок начала репликации Р15а и ген устойчивости к хлорамфениколу. Получаемые плазмиды трансформировали в Е.coli W3110 с использованием стандартных известных в данной области способов. Трансформанты выделяли, подвергая клетки отбору с хлорамфениколом, как известно в данной области (см., например, патент США № 8383346 и WO2010/144103).
Пример 2. Получение НТР PGA-содержащих влажных клеточных осадков
Клетки Е.coli, содержащие кодирующие рекомбинантную PGA гены из моноклональных колоний, инокулировали в 180 мкл LB, содержащего 1% глюкозу и 30 мкг/мл хлорамфеникола в лунках 96луночных микротитровальных планшетов с мелкими лунками. Планшеты закупоривали О2проницаемыми уплотнениями и культуры выращивали в течение ночи при 30°С, 200 об./мин и 85% влажности. Затем 10 мкл каждой клеточной культуры переносили в лунки 96-луночных планшетов с глубокими лунками, содержащих 390 мл ТВ и 30 мкг/мл САМ. Планшеты с глубокими лунками закупоривали О2-проницаемыми уплотнениями и инкубировали при 30°С, 250 об./мин и 85% влажности, пока не достигали OD6000,6-0,8. Затем клеточные культуры индуцировали с использованием IPTG до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение ночи при тех же условиях как исходно использовали. Затем клетки осаждали с использованием центрифугирования на 4000 об./мин в течение 10 мин. Супернатанты выбрасывали, а осадки замораживали при -80°С перед лизисом.
Пример 3. Получение НТР PGA-содержащих клеточных лизатов
Сначала 200 мкл лизирующего буфера, содержащего 10 мМ буфера Tris-HCl, рН 7,5, 1 мг/мл лизоцима и 0,5 мг/мл PMBS, добавляли к клеточной массе в каждой лунке, полученной, как описано в примере 2. Клетки лизировали при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании на настольном встряхивателе. Затем планшет центрифугировали в течение 15 мин на 4000 об./мин и при 4°С. Затем прозрачные супернатанты использовали в биокаталитических реакциях для того, чтобы определять уровни их активности.
Пример 4. Получение лиофилизированных лизатов из культур во встряхиваемых колбах (SF).
Выбранные НТР культуры, которые растили как описано выше, высевали на планшеты с LB агаром с 1% глюкозы и 30 мкг/мл САМ и растили в течение ночи при 37°С. Одну колонию из каждой культуры переносили в 6 мл LB с 1% глюкозы и 30 мкг/мл САМ.
Культуры выращивали в течение 18 ч при 30°С, 250 об./мин и пересевали приблизительно 1:50 в 250 мл ТВ, содержащей 30 мкг/мл САМ, до конечной OD600 0,05. Культуры выращивали в течение приблизительно 195 минут при 30°С, 250 об./мин, до OD600 0,6-0,8 и индуцировали с использованием 1 мМ IPTG. Затем культуры выращивали в течение 20 ч при 30°С, 250 об./мин. Культуры центрифугировали 4000 об./минх20 мин. Супернатант выбрасывали и осадки ресуспендировали в 30 мл 20 мМ TRIS-HCl, рН 7,5. Клетки осаждали (4000 об./минх20 мин) и замораживали при -80°С на 120 мин. Замороженные осадки ресуспендировали в 30 мл 20 мМ TRIS-HCl, рН 7,5 и лизировали с использованием обрабатывающей системы Microfluidizer® (Microfluidics) при 18000 фунтов/дюйм2. Лизаты осаждали (10000 об./минх60 мин) и супернатанты замораживали и лиофилизировали для того, чтобы создавать ферменты встряхиваемых колб (SF).
Пример 5. Усовершенствования в ацилировании инсулина в положениях А1, В1 и В29 относительно SEQ ID № 4
SEQ ID № 4 выбирали в качестве родительского фермента на основе результатов скрининга вариантов, раскрытых в публикации заявки на патент США совместного владения № 2016/0326508, для получения В29-деацилированного продукта. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием
- 27 043748 луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций).
Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,1 М CHES, рН 10, 10 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 20 мкл НТР супернатанта. НТР планшеты инкубировали во встряхивателе Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 300 об./мин, в течение 20 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 минут с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Активность относительно SEQ ID № 4 (активность FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 4. Результаты показаны в табл. 5.1. Процент превращения вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта как наблюдали по HPLC анализу. В табл. 5.2 приведены результаты, показывающие избирательность вариантов относительно SEQ ID № 4.
Таблица 5.1. Активность вариантов относительно SEQ ID № 4
№ вариан та SEQ ID № (н. /а . к.) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 4) Процент превращения ацилированием FIOP1 в обозначенных участках (относительно SEQ ID № 4)
Al В29 Bl А1/В2 9 Al/B 1 B1/B2 9
4 11/12 F71G;G74D +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++
5 17/18 F2 4Y;V2 8A;F71C;F7 01W + ++++
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 4 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,5 раза увеличенная активность; ++ > чем в 2,5 раза, но меньше чем в 5 раз увеличенная активность; +++ > чем в 5 раз увеличенная активность, но меньше чем в 10 раз; ++++ > чем в 10 раз.
Таблица 5.2. Избирательность вариантов относительно SEQ ID № 4
№ вариа нта SEQ ID № (н. /а . к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 4) Процент избирательности ацилирования (FIOP)1 в обозначенных участках (относительно SEQ ID № 4)
Al В29 Bl Al/B 29 Al/B 1 Bl/B 29
3 85/86 F71R +
4 11/12 F71G;G74D + +++ + + + + + + + + + + + + +
5 17/18 F24Y;V28A;F71C;F 701W + + + +
1 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 4 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,5 раза увеличенная избирательность; + + > чем в 2,5 раза, но меньше чем в 5 раз увеличенная избирательность; +++ > чем в 5 раз увеличенная избирательность, но меньше чем в 10 раз; ++++ > чем в 10 раз.
Пример 6. Усовершенствование ацилирования инсулина в положениях А1, В1 и В29 по сравнению с SEQ ID № 12 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 12 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 5, (т.е., наилучший фермент, идентифицированный при ацилировании инсулина в положении В29). Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций).
Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
Скрининг каждого варианта осуществляли в 200 мкл реакции, состоящей из 10 г/л инсулина, 0,1 М TRIS буфера рН 9,25, 20% ацетонитрила, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл осветленного лизата, в течение 5 ч при 30°С. 96-луночные планшеты закупоривали теплом и инкубировали во встряхивателе
- 28 043748
Thermotron® на 100 об./мин. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 12 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 12. Эти результаты представлены в табл. 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 и 6.7. Процент превращения вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта как наблюдали по HPLC анализу.
Процент избирательности относительно SEQ ID № 12 (процент избирательности FIOP) вычисляли как процент избирательности продукта, образуемого вариантом, относительно процента избирательности, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 12. Результаты представлены в табл. 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 и 6.7. Процент избирательности вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 6.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку А1, относительно SEQ ID № 12
№ вариа нта SEQ ID № (н. /а . к.) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращени я ацилирован ием (FIOP)1 по участку А1 (относител ьно SEQ ID № 12) Процент избиратель ности ацилирован ия (FIOP)1 ДЛЯ участка А1 (относител ьно SEQ ID № 12)
6 Y27Т;А255G;W3701; + + +
7 D623N; +
8 T384R; + + +
9 L253S; + +
10 T705S; +
11 A373Y; + +
12 Y27T;F254W;A470V; + +
13 Y27T;L253V;A255G;N348R; +
14 Y27T;D74S;F254W;A255G;N34 8R;КЗ69C;ТЗ84P; + +
15 Y27Т;D74N;L253V;F254W;N34 + + +
8R;КЗ69C;ТЗ84P;
16 L253M; + +
17 N457T; + +
18 R317S;Q380P; + +
19 69/70 K128W; + +
1 Уровни увеличенной активности или избирательности определяли относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 1,0 раза, но меньше чем в 1,5 раза увеличены; ++ > чем в 1,5 раза, но меньше чем в 2,0 раза; +++ > чем в 2,0 раза.
- 29 043748
Таблица 6.2. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 12
№ вариа нта SEQ ID № (н./а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращения ацилировани ем (FIOP)1 по участку В2 9 (относитель но SEQ ID № 12) Процент избирательн ости ацилировани я (FIOP)2 для участка В2 9 (относитель но SEQ ID № 12)
20 Y27Т;N348R;D381К; + +
21 Y27Т;D74S;А255G;N348R; K369C;D381K; +
22 15/16 Y271;D74S;А255G;N348R; D381K;T384P; + +
23 Y2 7Т;N34 8R;КЗ 6 9С;W37 01; D381K;T384P; +
24 Y27T;D74G;F254W;A255G; N348R;К369С;W370I; D381K; +
25 Y27T;F254W;A255G;N348R; W370I;D381K; +
26 13/14 Y27T;A255G;N348R;W3701; D381K;T384P; +
27 D381F; + +
28 Q134M; + +
- 30 043748
29 D623W; ++ +
30 L253R; + +
31 N627M; + +
32 N627R; + +
33 D623N; ++ +
34 K615V; + +
35 D381L; + +
36 D381R; + ++
37 A132G; + +
38 A467S; + +
39 F256Y; + +
40 D623V; + +
41 К615Н; +
42 D623A; + +
43 D381Q; + +
44 К615С; +
45 T384R; + +
46 F256H; + +
47 Т453С; +
48 D381V; +
49 D381K; + +
50 D381F;Q672K; +
51 D623Y; + +
53 D623R; +++ ++
54 D623F; + +
55 D623K; +++ ++
56 D381I; +
57 АЗ73К; +++ ++
58 S706K; + ++
59 N348K;A467T; + +
60 D709G; + +
61 D709A; + +
62 F620R; + +
63 D709N; + ++
64 D709H; + +
65 Е377А; +
66 F620K; + +
67 S706R; +
68 21/22 D709R; + ++++
69 N20S;D709Q; +
70 D709S; + +
71 V618C; + +
72 А6 9М; +
73 F2 5 4K; + +
74 A8 4V; +
75 F701H; +
76 Р383К; +
77 Аб 9L; ++
78 I708V; +
79 А255К; ++ ++
80 A255R; ++ ++
81 A6 9V; +
82 P383R; ++++
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза увеличены; ++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 6,0 раза; +++ > чем в 6,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличе-
- 31 043748 ны; ++ > чем в 5,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза; +++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 15 раз;
++++ > чем в 15 раз.
Таблица 6.3. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участкам А1 и В29, относительно SEQ ID № 12
№ вариант а SEQ ID № (н. /а . к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращен ИЯ ацилирова нием (FIOP)1 по участкам А1 и В29 (относите льно SEQ ID № 12) Процент избиратель ности ацилирован ия (FIOP)2 ДЛЯ участков А1 и В29 (относител ьно SEQ ID № 12)
198 Y271; D74S; F254W; N348R; D381W; + +
199 Y27T;A255G;N348R;W370I; +
200 Y27T;N348R;T384P; + +
201 Y27T;D74G;F254W;А255G;N348R; D381W; + +
202 Y27T;D74S;N348R; +
203 Y27T;A255G;N348R; + +
204 Y27T;L253V;N348R;D38IF;T384P r + +
205 Y27T;L253V;F254W;N348R;1384P r +
206 Y27I;D74P;F254W;A255G;N348R; D381K;T384P; + +
207 Y27T;N348R; + +
208 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I ;D381W;1384P; +
22 15/16 Y27T;D74S;A255G;N348R;D381K; 1384P; + +
209 Y27T;D74G;F254W;N348R;D381W; 1384P; + +
210 Y27T;F254W;A255G;D38IK;T384P r + +
211 Y2 7T;D7 4 S;F2 5 4W;N3 4 8R;D3 81F; + +
212 Y27T;A255G;N348R;D381W;T384P + +
213 Y27T;F254W;N348R;D381W;T384P r + +
214 Y27T;D74G;N348R; + +
181 Y27T;F254W;A255G;T384P; ++ +
182 Y27T;F254W;A255G; ++ +
215 Y27T;D74S;L253V;N348R; +++ ++
183 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348R ;D381F;T384P; + +
184 Y27T;F254W;A255G;N348R; + +
185 Y27T;D74N;F254W;T384P; +++ +
- 32 043748
186 Y27Т;L253V;N348R; +
187 Y27Т;D74G;А255G;N348R; ++ ++
12 Y27T;F254W;A470V; +
13 Y27Т;L253V;А255G;N348R; + +
189 Y27Т;D74G;L253 V;А255G;N348R; D381F; ++ +
6 Y27Т;А255G;W3701; ++ +
190 Y27T;D74S;F254W;А255G;N348R; +++ ++
216 Y27T;D74N;L253V;F254W; +
191 9/10 Y27T;D74S;L253V;F254W;N348R; D381W;T384P; ++ ++
192 Y27T;D74N;F254W;A255G;N348R; +++ ++
217 5/6 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; N348R; +++ +
194 Y27T;L253V;N348R;W3701;D38IF ;T384P; + +
26 13/14 Y27T;A255G;N348R;W3701;D38IK ;T384P; + +
195 Y2 7T;D7 4 S;A2 55G;W37 01; ++ +
29 D623W; + +
30 L253R; + +
42 D623A; + +
218 D623N; + +
46 F256H; + +
219 A616R; +
220 D623L; + +
51 D623Y; + +
54 D623F; + +
55 D623K; + +
221 D381Q; + +
222 T384R; ++ ++
223 19/20 D623R; ++ +++
57 A373K; + +
224 H472R; +
225 F620R; + +
197 A255P; +
73 F2 5 4K; + +
80 A255R; + +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличены; ++ > чем в 5,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза; +++ > чем в 10,0 раза.
Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличены; ++ > чем в 5,0 раза, но меньше чем в 7,0 раза; +++ > чем в 7,0 раза.
- 33 043748
Таблица 6.4. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участкам А1 и В1, относительно SEQ ID № 12
№ вариан та SEQ ID № (н./ а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращения ацилирование м (FIOP)1 по участкам Al и Bl (относительн о SEQ ID № 12) Процент избирательно сти ацилирования (FIOP)2 для участков А1 и В1 (относительн о SEQ ID № 12)
226 Y2 7T;L253V;A255G;N348R ;Т384Р; + +
83 Y27T;L253V; + +
84 Y27T;D74G;L253V;F254W; + +
85 Y27Т;D74G;L253V;А255G; N348R;W370I;ТЗ84Р; + +
86 Y27T;D74N;L253V;F254W; N348R;W3701;D38 IK;ТЗ84 P; + +
87 Y27T;D74N;L253V;F254W; A255G;N348R;W370I; + +
199 Y27T;A255G;N348R;W370I + +
- 34 043748
227 Y27T;D74P;L253V;F254W; A255G;N348R;K369C;W370 I; + +
88 Y27T;D74G;L253V;N348R; КЗ 6 9C;W3 7 01;D3 81F;T3 8 4 P; + +
89 Y27T;L253V;F254W;N348R + +
90 Y27T;D74P;L253V;F254W; A255G;N348R; + +
228 Y27T; +
229 Y27T;D74G;L253V;N348R; K369C;W370I; + +
91 Y27T;D74G;L253V;F254W; A255G;W370I; + + +
92 Y27T;L253V;F254W;A255G + +
93 Y27T;D74G;L253V;F254W; T384P; + +
94 Y27T;D74N;F254W;N348R; W370I; + +
95 Y27T;D74S;L253V;N348R; W3701;D38 IK;T384P; + +
96 Y27T;L253V;A255G;W370I + +
97 Y27T;D74G;F254W;A255G; D381F; + +
98 Y27T;L253V;КЗ69C;W370I + +
230 Y27T;D74P;F254W;A255G; N348R; + +
99 Y27T;L253V;F254W;N348R ;D381F; + +
101 Y27T;D74S;L253V;A255G; T384P; + +
- 35 043748
231 Y27T;D74G;A255G;W370I; + +
232 Y27T;D74S;N348R; +
102 Y27T;D74N;L253V;N348R; W370I;D381W;T384P; + +
233 Y27T;D74G;L253V;F254W; N348R; + +
103 Y27T;D7 4P;L253V;N348R; + +
234 Y27T;L253V;F254W;A255G ;N348R; + +
235 Y27T;D74S;L253V;F254W; A255G;N348R; + +
104 Y27T;D74G;F254W;A255G; N348R;КЗ69C;W3701;D381 F; + +
105 Y27T;D74P;F254W;A255G; N348R;КЗ69C;W3701; + +
106 65/6 6 Y27T;D74N;L253V;F254W; W370I;D381K; + + +
236 Y27T;D74G;F254W;КЗ69C; W370I; + +
237 Y27T;D74G;L253V;N348R; W370I; + +
107 Y27T;D74G;L253V;T384P; + +
108 Y27T;D74S;N348R;W370I; + +
109 Y27T;D74S;L253V;F254W; A255G;КЗ69C;W3701; + +
238 Y27T;D74G;F254W;A255G; N348R; + +
239 Y27T;L253V;N348R;W370I ;T384P; + +
111 Y27T;D74N;L253V;F254W; A255G; + +
240 Y27T;L253V;F254W; + +
241 Y27T;D74G;КЗ69C;W370I; + +
242 Y27T;F254W;A449V; + +
- 36 043748
114 Y27T;D74G;L253V;A255G; N348R;D381W; + +
115 Υ27Τ;D74Ρ;L253V;W370I; + +
117 Υ27Τ;D74G;L253V;F254W; Α2 55G;W3701;D38 IK;Τ384 Ρ; +
118 Y27T;D74N;F254W;A255G; Ν348R;W3701;D38 IK; + +
119 Y27T;D74S;L253V;N348R; КЗ 69C;W3701;ТЗ84P; + +
243 Y2 7 T;D7 4N;L2 5 3V;N3 4 8R; + +
120 Y27Τ;D74Ν;L253V;F254W; Ν348R;W370I;D381F; + +
121 Y27T;D74S;F254W;A255G; N348R;W370I;D381F;T384 P; + +
122 Y27T;D74G;L253V;F254W; A255G;D381K; + +
123 Y27T;D74S;F254W;K369L; W370I; + +
124 Y27T;L253V;F254W;D381F ;T384P; + +
125 Y27T;D74G;L253V;F254W; A255G;КЗ69C;W370I; + +
126 Y27T;D74G;F254W;A255G; N348R;W370I; + +
127 Y27T;D74G;L253V;F254W; A2 55G;N348R;W3701;T384 P; + +
128 L253V;N348R;W370I; + +
244 Y27T;F254W;N348R;W370I r + +
129 Y27T;D74N;L253V;F254W; K369C; + +
131 Y27T;D74S;L253V;N348R; + +
- 37 043748
D381W;
245 Y27T;D74S;A255G; + +
134 Y27T;D74S;L253V;A255G; N348R;W3701;D38 IK; + +
136 Y27T;D74N;L253V;F254W; A2 55G;N348R;W3701;T384 P; + +
137 Y27T;D74S;F254W;A255G; W370I; + + +
138 Y27T;F254W;A255G;КЗ69C ;W3701;D381F;T384P; + +
139 Y27T;L253V;F254W;D381F r + +
140 Y27T;D74N;F254W;N348R; + +
141 67/6 8 Y27T;F254W;A255G;W370I r + + +
142 Y27T;D74N;A107V;A255G; N348R;КЗ69C;W370I; + +
143 Y27T;F254W;A255G;N348R ;W370I; + +
144 Y27T;D74N;F254W; + +
246 Y27T;D74S;F254W;K369C; T384P; + +
145 Y27T;D74G;L253V;D381F; T384P; + +
146 Y27T;D7 4P;L253V;A255G; + +
247 Y27T;D74G;A255G;N348R; K369C;W370I; + +
148 Y27T;D74S;F254W;A255G; N348R;КЗ69C;W370I; + +
248 Y27T;F254W;A255G;N348R ;КЗ69C;W3701; + +
149 Y27T;D74P;W3701; + +
249 Y27T;D74P;L253V;F254W; N348R;КЗ69C;W370I; + +
- 38 043748
150 Y27T;L253V;F254W;T384P + +
205 Y27T;L253V;F254W;N348R ;T384P; + +
151 Y27T;D74N;L253V;F254W; A255G;W370I; + +
250 Y27T;F254W;A255G;N348R f + +
251 Y27T;D74S;F254W;N348R; + +
153 Y27T;F254W;A255G;N348R ;W370I;T384P; + +
252 D74N;L253V;F254W;K369C ;W370I; + +
253 Y27T;D74S;КЗ69C;W3701; D381K;T384P; + +
155 Y27T;L253V;A255G;W370I ;D381F;T384P; + + +
157 Y27T;L253V;F254W;N348R ;W370I;T384P; + +
158 Y27T;D74N;F254W;N348R; W370I;D381K; + +
159 Y27T;D74N;L253V;A255G; N348R;КЗ69C;W370I; + +
160 Y27T;L253V;F254W;N348R ;D381W;T384P; + +
161 Y27T;L253V;F254W;A255G ;G260C;N348R;D38IF;T38 4P; +
162 Y27T;D74P;L253V;F254W; N348R;D381F;T384P; + +
165 Y27T;D74G;L253V;A255G; N348R;T384P; + +
166 Y27T;D74N;L253V;A255G; W370I; + +
167 Y27T;D74N;A255G;N348R; + +
- 39 043748
W370I;
208 Y27T;F254W;A255G;N348R ;W3701;D381W;ТЗ84P; + +
254 Y2 7T;L253V;A255G;N348R ;КЗ69C;W3701; + +
169 Y2 7T;L253V;D381F;T384P r + +
170 Y27T;D74P;L253V;F254W; N348R;W370I;D381W;T384 P; + +
171 Y27T;L253V;F254W;A255G ;N348R;W3701;T384P; + +
255 A255G;N348R;W370I; + +
209 Y27T;D74G;F254W;N348R; D381W;T384P; +
210 Y27T;F254W;A255G;D381K ;T384P; + +
256 Y27T;D74N;F254W;A255G; K369C; + +
257 Y27T;D74P;L253V;F254W; N348R; + +
173 Y27T;L253V;F254W;N348R ;W370I;D381F; + +
174 Y2 7T;D74G;L253V;A255G; + +
175 Y27T;D74N;L253V;F254W; N348R;W370I; + +
177 Y27T;D74G;L253V;F254W; A255G;N348R;КЗ69C;W370 I;D381F; + +
178 Y27T;D74G;L253V;F254W; N348R;КЗ69C;W370I; + +
258 Y27T;L253V;F254W;A255G ;N348R;W370I; + + +
179 Y27T;D74N;L253V; + +
181 Y27T;F254W;A255G;T384P + + + +
- 40 043748
Г
182 Y27T;F254W;A255G; + + ++
215 Y27T;D74S;L253V;N348R; + + + +
183 Y27T;L253V;F254W;A255G ;N348R;D381F;T384P; + +
185 Y27T;D74N;F254W;T384P; + + + + +
186 Y27T;L253V;N348R; + +
187 Y27T;D74G;A255G;N348R; + +
12 Y27T;F254W;A470V; + +
13 Y27T;L253V;A255G;N348R r + +
189 Y27T;D74G;L253V;A255G; N348R;D381F; + +
6 Y27T;A255G;W3701; + + + +
190 Y27T;D74S;F254W;A255G; N348R; + + +
216 Y27T;D74N;L253V;F254W; ++++ + +
191 9/10 Y27T;D74S;L253V;F254W; N348R;D381W;T384P; + + + +
192 Y27T;D74N;F254W;A255G; N348R; + + +
193 Y27T;D74P;L253V;F254W; A255G; + + + + +
217 5/6 Y27T;D74G;L253V;F254W; A255G;N348R; + + + +
14 Y27T;D74S;F254W;A255G; N348R;КЗ69C;T384P; +
15 Y27T;D74N;L253V;F254W; N348R;КЗ69C;T384P; + +
194 Y27T;L253V;N348R;W370I ;D381F;T384P; + +
195 Y27T;D74S;A255G;W3701; +++ ++
27 D381F; + +
259 A132S; + +
28 Q134M; + +
29 D623W; + +
260 T131L; + +
35 D381L; + +
37 A132G; + +
262 W370V; + +
263 D381R; + +
264 T384R; + +
265 D623Y; + +
7 D623N; + +
266 D623R; + +
267 S619I; +
268 L253V; + +
269 T133K; +
197 A255P; + +
270 I708M; +
271 F254T; + +
272 T705S; +
- 41 043748 1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза увеличены; ++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза; +++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100 раз; ++++ >
чем 100.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза увеличены; ++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза; +++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100 раз; ++++ > чем 100.
Таблица 6.5. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участкам А1 и В29, относительно SEQ ID № 12
№ вариа нта SEQ ID № (н./ а. Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращени я ацилирован Процент избирател ьности ацилирова
к. ) ием (FIOP)1 no участкам Al и B29 (относител ьно SEQ ID № 12) НИЯ (FIOP)2 ДЛЯ участков Al и B29 (относите льно SEQ ID № 12)
85 Y27Т;D74G;L253V;А255G;N348R ;W3701;ТЗ84Р; + +
86 Y27Т;D74N;L253V;F254W;N348R ;W370I;D381К;ТЗ84Р; + +
87 Y27Т;D74N;L253V;F254W;A255G ;N348R;W370I; + +
91 Y27Т;D74G;L253V;F254W;A255G ;W370I; +
93 Y27T;D74G;L253V;F254W;T384P +
95 Y27T;D74S;L253V;N348R;W370I ;D381K;T384P; + +
102 Y27T;D74N;L253V;N348R;W370I ;D381W;T384P; + + +
233 Y27T;D74G;L253V;F254W;N348R +
273 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348 R;КЗ69C;W3701;D381W;T384P; + +
235 Y27T;D74S;L253V;F254W;A255G ;N348R; + +
106 65/6 6 Y27T;D74N;L253V;F254W;W370I ;D381K; + +
108 Y27T;D74S;N348R;W370I; + +
111 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G r +
113 Y27T;D74G;A255G;W370I; + +
114 Y27T;D74G;L253V;A255G;N348R + +
- 42 043748
;D381W;
115 Y27T;D74P;L253V;W370I; + +
117 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G ;W3701;D38IK;T384P; + + +
274 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348 R;K369C;T384P; + +
118 Y27T;D74N;F254W;A255G;N348R ;W370I;D38IK; + +
120 Y27T;D74N;L253V;F254W;N348R ;W370I;D381F; + +
121 Y27T;D74S;F254W;A255G;N348R ;W3701;D381F;T384P; + +
122 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G ;D381K; + +
126 Y27T;D74G;F254W;A255G;N348R ;W370I; + +
127 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G ;N348R;W370I;T384P; + +
131 Y27T;D74S;L253V;N348R;D381W r + +
245 Y27T;D74S;A255G; +
134 Y27T;D74S;L253V;A255G;N348R ;W370I;D38IK; + +
136 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G ;N348R;W370I;T384P; + +
137 Y27T;D74S;F254W;A255G;W370I r + +
140 Y27T;D74N;F254W;N348R; +
141 67/6 8 Y27T;F254W;A255G;W370I; +
143 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370 i; +
145 Y27T;D74G;L253V;D381F;T384P + +
149 Y27T;D74P;W370I; +
- 43 043748
151 Y27Τ;D74Ν;L253V;F254W;A255G ;W370I; + +
152 Y27T;D74G;L253V;Ν348R;W370I Г + +
157 Y27T;L253V;F254W;N348R;W370 I;T384P; + +
160 Y27T;L253V;F254W;N348R;D381 W;T384P; + +
161 Y27T;L253V;F254W;A255G;G260 C;N348R;D381F;T384P; + +
162 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R ;D381F;T384P; + +
275 Y27T;D74G;L253V;F254W; + +
164 Y27T;D74N;L253V;N348R; + +
165 Y27T;D74G;L253V;A255G;N348R ;T384P; + +
166 Y27T;D74N;L253V;A255G;W370I r + +
167 Y27T;D74N;A255G;N348R;W370I r + +
276 Y27T;D74P;F254W;A255G;N348R ;D381K;T384P; + +
208 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370 I;D381W;T384P; + +
254 Y27T;L253V;A255G;N348R;КЗ 69 C;W370I; +
22 15/1 6 Y27T;D74S;A255G;N348R;D38 IK ;T384P; + +
170 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R ;W3 7 01;D3 81W;T 3 8 4 P; + +
171 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348 R;W3701;T384P; + +
209 Y27T;D74G;F254W;N348R;D381W ;T384P; + +
277 Y27T;D74N;F254W;N348R;W370I + +
- 44 043748
278 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R ;К369С; + +
257 Y27Т;D74Р;L253V;F254W;N348R +
279 Y27T;F254W;КЗ69С;D381F;ТЗ84 Р; + +
173 Y27T;L253V;F254W;N348R;W370 I;D381F; + +
175 Y27Т;D74N;L253V;F254W;N348R ;W370I; + +
280 Y27T;F254W;N348R;КЗ69C;W370 I;D381N;T384P; + +
180 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G ;N348R; +
281 D623N; + +
264 T384R; + +
220 D623L; + +
62 F620R; ++ + + +
63 D709N; ++ + +++
19 69/7 0 K128W; + + ++
282 T705E; ++ ++
283 A255E; ++ + +
284 F254T; ++ ++
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза увеличены; ++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза; +++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100 раз; ++++ > чем 100.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза увеличены; ++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза; +++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100 раз; ++++ > Чем 100.
- 45 043748
Таблица 6.6. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участкам А1, В1 и В29, относительно SEQ ID № 12
№ вариа нта SEQ ID № (н./ а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превраще ния ацилиров анием (FIOP)1 по участкам Al, В1 и В29 (относит ельно SEQ ID № 12) Процент избиратель ности ацилирован ия (FIOP)2 ДЛЯ участков Al, В1 и В29 (относител ьно SEQ ID № 12)
226 Y2 7T;L253V;A255G;N348R;Т384Р + +
83 Y27T;L253V; + +
84 Y27T;D74G;L253V;F254W; + +
198 Y27T;D74S;F254W;N348R;D381W; + +
285 Y27T;D74G;A255G;N348R;КЗ69C; D381F;T384P; + +
85 Y27T;D74G;L253V;A255G;N348R; W370I;T384P; + +
86 Y27T;D74N;L253V;F254W;N348R; W3701;D38 IK;T384P; + + + +
87 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G; N348R;W370I; + +
199 Y27T;A255G;N348R;W370I; + + +
200 Y27T;N348R;T384P; + +
88 Y27T;D74G;L253V;N348R;КЗ69C; W370I;D381F;T384P; + +
- 46 043748
90 Y27T;D7 4P;L253V;F254W;A255G; N348R; + +
228 Y27T; + +
91 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; W370I; + +
92 Y27T;L253V;F254W;A255G; + +
93 Y27T;D74G;L253V;F254W;T384P; + +
94 Y27T;D74N;F254W;N348R;W370I; + +
95 Y27T;D74S;L253V;N348R;W370I; D381K;T384P; + + + +
286 Y27T;L253V;N348R; + +
96 Y27T;L253V;A255G;W370I; + +
97 Y27T;D74G;F254W;A255G;D381F; + +
287 Y27T;F254W;N348R;T384P; +
201 Y27T;D74G;F254W;A255G;N348R; D381W; + +
288 D74N;F254W;A255G;N348R;T384P + +
289 Y27T;F254W;A255G; + +
202 Y27T;D74S;N348R; + +
230 Y27T;D74P;F254W;A255G;N348R; + +
99 Y27T;L253V;F254W;N348R;D381F r + +
101 Y27T;D74S;L253V;A255G;T384P; + +
231 Y27T;D74G;A255G;W370I; + + +
102 Y27T;D74N;L253V;N348R;W370I; D381W;T384P; + + + +
233 Y27T;D74G;L253V;F254W;N348R; + + +
103 Y27T;D74P;L253V;N348R; + +
234 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348R r + +
235 Y27T;D74S;L253V;F254W;A255G; N348R; + +
104 Y27T;D74G;F254W;A255G;N348R; КЗ69C;W370I;D381F; + +
- 47 043748
105 Y27T;D74P;F254W;A255G;N348R; K369C;W370I; + +
106 65/6 6 Y27T;D74N;L253V;F254W;W370I; D381K; + + + +
236 Y27T;D74G;F254W;КЗ69C;W370I; + +
237 Y27T;D74G;L253V;N348R;W370I; + + +
107 Y27T;D74G;L253V;T384P; + +
108 Y27T;D74S;N348R;W370I; + + +
290 Y27T;D74G;A255G;N348R; + +
238 Y27T;D74G;F254W;A255G;N348R; + +
239 Y27T;L253V;N348R;W370I;T384P + + +
111 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G; + +
242 Y27T;F254W;A449V; + +
114 Y27T;D74G;L253V;A255G;N348R; D381W; + +
115 Y27T; D74P;L253V;W3701; + +
117 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; W3701;D38 IK;T384P; + + + +
118 Y27T;D74N;F254W;A255G;N348R; W370I;D381K; + +
120 Y27T;D74N;L253V;F254W;N348R; W370I;D381F; + + + +
121 Y2 7 T;D7 4 S;F2 5 4W;A2 5 5G;N3 4 8R; W370I;D381F;T384P; + + + +
122 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; D381K; + + +
123 Y27T;D74S;F254W;КЗ69L;W370I; + +
291 Y27T;D74N;F254W;A255G;N348R; K369C;D381F; + +
124 Y27T;L253V;F254W;D381F;T384P + + +
126 Y27T;D74G;F254W;A255G;N348R; W370I; + + + +
127 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; + +
- 48 043748
N348R;W3701;ТЗ84P;
128 L253V;N348R;W3701; + +
244 Y27T;F254W;N348R;W370I; + +
131 Y27T;D74S;L253V;N348R;D381W; + + + +
132 Y27T;D74S;L253V;N348R; + +
245 Y27T;D74S;A255G; + +
292 Y27T;L253V;A255G;N348R; + +
134 Y27T;D74S;L253V;A255G;N348R; W370I;D381K; + +
136 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G; N348R;W370I;T384P; + +
137 Y27T;D74S;F254W;A255G;W370I; + + +
138 Y27T;F254W;A255G;КЗ69C;W370I ;D381F;T384P; + +
203 Y27T;A255G;N348R; + +
139 Y27T;L253V;F254W;D381F; + +
140 Y27T;D74N;F254W;N348R; + +
141 67/6 8 Y27T;F254W;A255G;W370I; + + + +
204 Y27T;L253V;N348R;D381F;T384P Λ + +
143 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I + + + +
293 Y27T;L253V;F254W;N348R; + +
144 Y27T;D74N;F254W; + +
294 Y27T;D74N;F254W;N348R;КЗ69C; D381F;T384P; + +
145 Y27T;D74G;L253V;D381F;T384P; + + + +
146 Y27T;D7 4P;L253V;A255G; + +
148 Y2 7 T;D7 4 S;F2 5 4W;A2 5 5G;N3 4 8R; K369C;W370I; + +
149 Y27T;D74P;W370I; + + +
150 Y27T;L253V;F254W;T384P; + +
295 Y27T;D74N;N348R; + +
205 Y27T;L253V;F254W;N348R;T384P + +
- 49 043748
Г
151 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G; W370I; + +
250 Y27T;F254W;A255G;N348R; + +
251 Y27T;D74S;F254W;N348R; + +
206 Y27T;D74P;F254W;A255G;N348R; D381K;T384P; + +
153 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I ;T384P; + + + +
296 7/8 Y27T;D74N;N348R;T384P; + +
253 Y27T;D74S;КЗ69C;W3701;D38IK; T384P; + +
155 Y27T;L253V;A255G;W370I;D381F ;T384P; + + + +
157 Y27T;L253V;F254W;N348R;W370I ;T384P; + + +
158 Y27T;D74N;F254W;N348R;W370I; D381K; + +
160 Y2 7T;L2 53V;F2 54W;N34 8R; D3 81W ;T384P; + + +
297 Y27T;L253V;F254W; + +
161 Y27T;L253V;F254W;A255G;G260C ;N348R;D381F;T384P; + +
162 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R; D381F;T384P; + + + +
164 Y2 7 T;D7 4N;L2 5 3V;N3 4 8R; + +
165 Y27T;D74G;L253V;A255G;N348R; T384P; + +
166 Y27T;D74N;L253V;A255G;W370I; + +
167 Y27T;D74N;A255G;N348R;W370I; + +
207 Y27T;N348R; + +
208 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I ;D381W;T384P; + + + +
169 Y2 7T;L2 53V;D3 81F;T3 8 4P; + +
22 15/1 Y27T;D74S;A255G;N348R;D38 IK; + +
- 50 043748
6 Т384Р;
170 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R; W370I;D381W;ТЗ84Р; + + + +
171 Y27T;L253V;F254W;А255G;N348R ;W370I;ТЗ84Р; + + +
255 A255G;N348R;W370I; + +
209 Y27T;D74G;F254W;N348R;D381W; Т384Р; + + + +
210 Y27T;F254W;A255G;D381K;T384P Λ + + + +
211 Y27T;D74S;F254W;N348R;D381F; + +
257 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R; + +
173 Y27T;L253V;F254W;N348R;W3701 ;D381F; + +
174 Y27T;D74G;L253V;A255G; + +
175 Y27T;D74N;L253V;F254W;N348R; W370I; + +
177 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; N348R;КЗ69C;W3701;D38IF; + +
178 Y27T;D74G;L253V;F254W;N348R; K369C;W370I; + +
212 Y27T;A255G;N348R;D381W;T384P r + +
258 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348R ;W370I; + + +
213 Y27T;F254W;N348R;D381W;T384P r + +
214 Y27T;D74G;N348R; + +
179 Y27T;D74N;L253V; + +
180 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; N348R; + +
29 D623W; + +
40 D623V; + +
42 D623A; + +
43 D381Q; + +
220 D623L; + +
298 D623N; + +
8 T384R; + + +
57 A373K; + +
299 F620R; + +
300 F254T; + +
197 A255P; + +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза увеличены; ++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза; +++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100 раз; ++++ > чем 100.
Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза увеличены; ++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза; +++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100 раз; ++++ > чем 100.
- 51 043748
Таблица 6.7. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В1, относительно SEQ ID № 12
№ вариа нта SEQ ID № (н./ а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращени я ацилирован ием (FIOP)1 по участку В1 (относител ьно SEQ ID № 12) Процент избирательн ости ацилировани я (FIOP)2 для участка В1 (относитель но SEQ ID № 12)
83 Y27T;L253V; +
84 Y27Т;D74G;L253V;F254W; + + +
85 Y27Т;D74G;L253V;A255G;N34 8R;W370I;ТЗ84Ρ; + + +
86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Υ27Τ;D74Ν;L253V;F254W;N34 8R;W37 01;D3 81Κ;ТЗ 8 4Ρ; Υ27Τ;D74Ν;L253V;F254W;A25 5G;Ν348R;W370I; Υ27Τ;D74G;L253V;Ν348R;КЗ 6 9С;W3 7 01;D3 81F;ТЗ 8 4 Ρ; Y27T;L253V;F254W;N348R; Y27T;D74P;L253V;F254W;A25 5G;N348R; Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 5G;W370I; Y27T;L253V;F254W;A255G; Y27T;D74G;L253V;F254W;T38 4P; Y27T;D74N;F254W;N348R;W37 01; Y27T;D74S;L253V;N348R;W37 01;D381K;T384P; Y27T;L253V;A255G;W370I; Y27T;D74G;F254W;A255G;D38 IF; Y27T;L253V;КЗ69C;W370I; Y27T;L253V;F254W;N348R;D3 8 IF; Y27T;L253V;F254W;A255G;N3 48R;W370I; Y27T;D74S;L253V;A255G;T38 4P; Y27T;D74N;L253V;N348R;W37 01;D381W;T384P; + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
103 Y27T;D74P;L253V;N348R; + +
104 Y27T;D74G;F254W;A255G;N34 8R;КЗ69C;W370I;D381F; + +
105 Y27T;D74P;F254W;A255G;N34 8R;КЗ69C;W3701; + +
- 52 043748
106 65/6 6 Y27T;D74Ν;L253V;F254W;W37 0I;D381K; + + + +
107 Y27T;D7 4G;L253V;T384P; + +
108 Y27T;D74S;N348R;W370I; + +
109 Y27T;D74S;L253V;F254W;A25 5G;КЗ69C;W3701; + +
110 Y27T;D74G;L253V;N348R;КЗ 6 9C;W370I; +
111 Y27T;D74N;L253V;F254W;A25 5G; + + +
112 Y27T;D74P;L253V;F254W;N34 8R; + +
113 Y27T;D74G;A255G;W3701; + +
114 Y27T;D74G;L253V;A255G;N34 8R;D381W; + +
115 Y27T;D74P;L253V;W370I; + + +
116 Y27T;L253V;N348R;W3701; T3 84P; +
117 Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 5G;W3701;D38 IK;T384P; + + +
118 Y27T;D74N;F254W;A255G;N34 8R;W3701;D38 IK; + +
119 Y27T;D74S;L253V;N348R;КЗ 6 9C;W370I;T384P; + +
120 Y27T;D74N;L253V;F254W;N34 8R;W370I;D381F; + + + +
121 Y27T;D74S;F254W;A255G;N34 8R;W37 01;D3 81F;T3 8 4P; + +
122 Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 5G;D381K; + + + +
123 Y27T;D74S;F254W;КЗ69L;W37 01; + +
124 Y27T;L253V;F254W;D381F;T3 84P; + +
125 Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 +
- 53 043748
5G;КЗ69C;W3701;
126 Y27T;D74G;F254W;A255G;N34 8R;W37OI; + + +
127 Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 5G;N348R;W370I;T384P; + + + +
128 L253V;N348R;W370I; +
129 Y27T;D74N;L253V;F254W;K36 9C; + +
130 Y27T;D74G;F254W;A255G;N34 8R; +
131 Y27T;D74S;L253V;N348R;D38 1W; + +
132 Y27T;D74S;L253V;N348R; + +
133 Y27T;L253V;F254W;A255G;N3 4 8R; +
134 Y27T;D74S;L253V;A255G;N34 8R;W3701;D38 IK; + + + +
135 Y27T;F254W;A255G;N348R;КЗ 69C;W370I; + +
136 Y27T;D74N;L253V;F254W;A25 5G;N348R;W370I;T384P; + + + + +
137 Y27T;D74S;F254W;A255G;W37 01; + + + +
138 Y27T;F254W;A255G;КЗ69C;W3 701;D38IF;T384P; +
139 Y27T;L253V;F254W;D381F; + + +
140 Y27T;D74N;F254W;N348R; +
141 67/6 8 Y27T;F254W;A255G;W370I; +
142 Y27T;D74N;A107V;A255G;N34 8R;КЗ69C;W3701; +
143 Y27T;F254W;A255G;N348R;W3 701; +
144 Y27T;D74N;F254W; + +
145 Y27T;D74G;L253V;D381F;T38 + +
- 54 043748
4P;
146 Y27T;D74P;L253V;A255G; + +
147 Y27T;D74S;L253V;F254W;A25 5G;N348R; + +
148 Y27T;D74S;F254W;A255G;N34 8R;КЗ69C;W3701; +
149 Y27T;D74P;W370I; +
150 Y27T;L253V;F254W;T384P; + +
151 Y27T;D74N;L253V;F254W;A25 5G;W370I; + + + + + +
152 Y27T;D74G;L253V;N348R;W37 01; + + +
153 Y27T;F254W;A255G;N348R;W3 70I;T384P; +
154 Y27T;D74G;L253V;F254W;N34 8R; + +
155 Y27T;L253V;A255G;W370I;D3 81F;T384P; +
156 Y27T;L253V;A255G;N348R;D3 8 IK; + +
157 Y27T;L253V;F254W;N348R;W3 70I;T384P; + +
158 Y27T;D74N;F254W;N348R;W37 0I;D381K; + +
159 Y27T;D74N;L253V;A255G;N34 8R;КЗ69C;W3701; + +
160 Y27T;L253V;F254W;N348R;D3 81W;T384P; + +
161 Y27T;L253V;F254W;A255G;G2 60C;N348R;D381F;T384P; + +
162 Y27T;D74P;L253V;F254W;N34 8R;D381F;T384P; + +
163 Y2 7T;D7 4G;L2 53V;N348R;КЗ 6 9C;W370I;D381F; + +
164 Y27T;D74N;L253V;N348R; + +
- 55 043748
165 Y27Τ;D74G;L253V;Α255G;Ν34 8R;T384P; + +
166 Υ27Τ;D74N;L253V;A255G;W37 01; + + + +
167 Y27T;D74Ν;Α255G;Ν348R;W37 01; + +
168 Υ2 7Τ;L2 53V;N34 8R;D3 81F; ТЗ 84Р; +
169 Y2 7Т;L2 53V;D3 81F;ТЗ 8 4Р; +
170 Y27T;D74P;L253V;F254W;N34 8R;W370I;D381W;ТЗ84P; + + +
171 Y27T;L253V;F254W;A255G;N3 48R;W370I;T384P; +
172 Y27T;L253V;F254W; + +
173 Y27T;L253V;F254W;N348R;W3 70I;D381F; + + + +
174 Y27T;D74G;L253V;A255G; + +
175 Y27T;D74N;L253V;F254W;N34 8R;W370I; + + + + + +
176 Y27T;D74N;L253V;F254W;N34 8R;КЗ69C;W3701;D38 IK; + +
177 Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 5G;N348R;КЗ69C;W370I;D381 F; + +
178 Y27T;D74G;L253V;F254W;N34 8R;КЗ69C;W3701; + +
179 Y27T;D74N;L253V; + +
180 Y27T;D74G;L253V;F254W;A25 5G;N348R; + +
181 Y27T;F254W;A255G;T384P; +
182 Y27T;F254W;A255G; + + +
183 Y27T;L253V;F254W;A255G;N3 48R;D381F;T384P; + +
184 Y27T;F254W;A255G;N348R; + +
185 Y27T;D74N;F254W;T384P; +
- 56 043748
186 Y27T;L253V;N348R; + +
187 Y27Т;D74G;А255G;N348R; +
12 Y27T;F254W;A470V; +
13 Y27T;L253V;A255G;N348R; +
188 Y27Т;D74N;L253V;КЗ69С;D38 1К;Т384Р; + +
189 Y27T;D74G;L253V;A255G;N34 8R;D381F; + + +
6 Y27Τ;Α255G;W370I; +
190 Y27T;D74S;F254W;A255G;N34 8R; +
191 9/10 Υ27Τ;D74S;L253V;F254W;N34 8R;D381W;T384P; + + + + +
192 Y27T;D74N;F254W;A255G;N34 8R; +
193 Y27T;D74P;L253V;F254W;A25 5G; + + +
194 Y27T;L253V;N348R;W370I;D3 81F;T384P; + + + +
195 Y27T;D74S;A255G;W370I; +
196 N388E; + + +
197 A255P; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличены; ++ > чем в 5,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза; +++ > чем в 10,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличены; ++ > чем в 5,0 раза, но меньше чем в 7,0 раза; +++ > чем в 7,0 раза.
Пример 7. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 12
Ацилирование по В29 четырьмя вариантами, перечисленными в табл. 7.1, тестировали в масштабе встряхиваемой колбы. Порошки встряхиваемых колб получали, как описано в примере 4. Реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, каждая содержит 200 мкл 0,2 М TRIS, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 10 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 0,9 г/л лиофилизированного порошка фермента, восстановленного в 10 мМ TRIS, рН 7,5. НТР планшеты закупоривали теплом и инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 5 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 12 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 12. Результаты представлены в табл. 7.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Процент избирательности относительно SEQ ID № 12 (процент избирательности FIOP) вычисляли как процент избирательности продукта, образуемого вариантом, относительно процента избирательности, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 12. Процент избирательности вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
- 57 043748
Таблица 7.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 12
Y27Т;V28А;G71Н;D74G;К103
Е;W119Y;L253Y;F256R;N348
Н;T352K;A373R;S374T;S390
К;G444N;A451K;N494D;Q547
К; А616Y;S646D;
Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12)
D709R;
D709K;
Процент превращени ацилирован
Процент избирательн ости ацилировани
ием я (FIOP)2
(FIOP)1 по для участка
участку В29
В29 (относитель
(относител но SEQ ID №
ьно SEQ ID 12)
№ 12)
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза увеличены; ++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100,0 раза; +++ > чем в 100,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: + > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 50,0 раза увеличены; ++ > чем в 50,0 раза, но меньше чем в 100,0 раза; +++ > чем в 100,0 раза.
Пример 8. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 108 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 108 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 7. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,1 М TRIS, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 25 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 3 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 108 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 108. Результаты представлены в табл. 8.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
- 58 043748
Таблица 8.1. Активность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 108
№ варианта SEQ ID № (н./а. к.) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 108) Процент превращения ацилированием (FIOP)1 по участку Al (относительно SEQ ID № 108)
301 25/26 R256V; + + + +
302 23/24 Н71М; + + + +
303 27/28 К390А; + + + +
304 33/34 H71L; + + + +
305 31/32 R256L; + + +
306 35/36 R256K; + + +
307 29/30 КЗ9OR; + + +
308 K390L; + + +
309 К390Р; + +
310 КЗ 9ОС; + +
311 H71Q; + +
312 H71D; + +
313 КЗ 9ОН; + +
314 Е707К; + +
315 D623W; +
316 F50V;S619W; +
317 D252C; +
318 Т705Р; +
319 K369S; +
320 K369R;S619M; +
321 N185D;G415Н;N444L;К723D Г +
322 N185D;N444L;К723D;R748G +
323 N9D;G415H;N444L;N457Q;К 723D;R748E; +
324 N185D;K723D;R748E; +
325 K128H;K369R; +
326 N9D;T443D;N444K;K723D;R 748G;A764E; +
327 S619F; +
328 N9D;N185D;G415H;K723D;R 748E; +
329 S619M; +
330 N185D;R256H;T560G;R748E r +
331 N9D;K723D;R748S; +
- 59 043748
332 K436G; +
333 N185D;N444K;N457Q;Кб68Е ;К723D;R748G; +
334 К128Н; +
335 K723D; +
336 N185D;G415H;T443D;N444R ;К723D;R748S; +
337 N444S;K723D;R748D; +
338 N185D;T560G;K723D; +
339 K128Q; +
340 N185D;R748D; +
341 N9D;N185D; +
342 T129W;N185D;N444L;K723D ;R748E; +
343 N185D;N444K;R748S; +
344 N185D;G415H;N444S;R748E r +
345 A467V; +
346 F620L; +
347 N185D;T443D;N444S;K723D ;R748E; +
348 N9D;G415H;T443D;N444L;К 723D;R748E; +
349 Q626E; +
350 K723D;R748E; +
351 Q626M; +
352 N9D;T443D;N444S;K723D;R 748E; +
353 D709E; +
354 K369W; +
355 G415H;N444S;T560G;K723D ;R748S; +
356 G415H;K723D; +
357 T384E; +
358 N185D;N444K;K723D; +
- 60 043748
359 N444L;K723D; +
360 K369R;T384Y;S619M; +
361 N9D;N185D;N444L;К723D;R 748D; +
362 N457Q;K723D;R748D; +
363 K369R;H546P; +
364 N9D;N185D;G415H;N444L;R 748E; +
365 K369Q; +
366 D623H; +
367 N9D;G415H;T443D;N444L;К 723D; +
368 F254W; +
369 K369R; +
370 N185D;G415H;T443D;N444S ;N457Q;R748E; +
371 N185D;G415H;N444S;K723D ;R748S; +
372 N9D;N185D;N444S;K723D;R 748E; +
373 N9D;N185D;T560G;K723D;R 748E; +
374 K723D;R748D; +
375 T379N; +
376 N18 5D;G415H;N444L; T560G ;K723D; +
377 N444K;K723D;R748E; +
378 N18 5D;T4 4 3D;N4 57Q; T5 60G ;R748S; +
379 N185D;N457Q;R748S; +
380 N9D;N185D;K723D;R748S; +
381 N9D;G415H;T443D;N444L;R 748S; +
382 N9D;N185D;G415H;T443D; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 108 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 8,0 раза; ++++ > чем в 8,0 раза.
Пример 9. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 24 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 24 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 8. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,2 М TRIS, 20% ацетонитрила, 25 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта (начальный рН перед добавлением лизата составлял 9,4). НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 3 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 минут и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 24 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 24. Результаты представлены в табл. 9.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и
- 61 043748 примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 9.1. Активность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 24
№ варианта SEQ ID № (н./а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 24) Процент превращения ацилировани ем (FIOP)1 по участку А1 (относитель но SEQ ID № 24)
383 71/72 S67А;М7IQ;N185D;R256L;T443D;Q 62 6М; + + +
384 S67А;Nl85D;КЗ90А;N444S; + + +
385 81/82 S67А;М7IQ;R256L;Т443D;S619W; +++
386 S67А;Nl85D;К390А;T443D;Q626Е; +++
387 83/84 S67А;М7IQ;Nl85D;R256L;S619W; + + +
388 75/76 S67А;М7IQ;Nl85D;R256L;Т443D;Е 707K;K723D; +++
389 73/74 S67А;М7IQ;R256L;К436G;Т443D;S 619W;Q626M; + + +
390 79/80 S67А; КЗ90А;К436G;Т443D;S619W; Q626E; +++
391 77/78 M71Q;N185D;R256L;T443D; +++
392 S67А;М7IQ;Nl85D;R256L; +++
393 S67А;М71F;КЗ90А;S619W; + +
394 S67А;КЗ90А;N444S;S619F; + +
395 S67A;K390A; ++
396 М7IQ;Nl85D;R256L;Т443D;Q626Е; K723D; + +
397 S67А;М71F;Nl85D;КЗ90А;S619W; + +
398 Nl85D;КЗ90А;Т443D; ++
399 S67А;М7IQ;Nl85D;R256К; + +
400 M71Q;R256L;T443D; + +
- 62 043748
401 M7IQ;N185D;R256L;T443D;Q626M; Е707К; + +
402 S67А;М71F;КЗ90А;Т443D;S619F;Q 62 6М; + +
403 S67А;М7IQ;N185D;R256L;Q626М;К 723D; + +
404 S67А; КЗ90А;Т443D;S619W;Q626Е; + +
405 М7IQ;N185D;R256L;Т443D;Q626Е; E707K; ++
406 M7IL;VI84Q;D252C;КЗ69S;КЗ90P; G415H;R748E; + +
407 S67А;КЗ90А;S619W; + +
408 M71F;КЗ90A;S619W; + +
409 M71Q;R256L;K436G;E707K; + +
410 S67A;K390A;K723D; ++
411 S67A;M7IQ;N185D;R256K;T384E;N 444S;S619W; + +
412 M7IQ;N185D;R256K;S619F; ++
413 S67A;M7IQ; R256L;K436G;Q626M; ++
414 K3 90A; ++
415 N185D; КЗ90A;K436G;Q626M; + +
416 КЗ90A;N444S;K723D; + +
417 N185D;КЗ90A;S619F; + +
418 K369S;G415H;F620L;T705P; + +
419 N185D;КЗ90A;Q626M; ++
420 M7IQ; R256L;T443D;S619W;Q626E; ++
421 M7IQ;R256L;S619W;E707K; + +
422 VI84Q;D252C;КЗ69S;КЗ90P;R748E Г ++
423 M7IQ;N185D;R256L;T384E; + +
424 M71L;F254W;A638Q;D709E;R748S; + +
425 S67A;M7IL;D252C;КЗ69S;КЗ90P; ++
426 K390A;T443D;S619W; + +
427 M7IQ;R256K;T443D;Q626M; ++
428 КЗ90A;N444S;S619W; + +
- 63 043748
429 S67A;M7IQ;Nl85D;КЗ90A;N444S;S 619W; + +
430 Nl85D;КЗ90A;S619W; + +
431 S67A;M7IQ;Nl85D;КЗ90A;S619W;E 707K; + +
432 Nl85D;КЗ90A;Q626M;K723D; + +
433 K128Q;КЗ69S;T705P;R748E; + +
434 M7IQ;R256L;Q626M;E707K; ++
435 КЗ90А;К436G;S619W;К723D; + +
436 K390A;K723D; ++
437 К128Q;D252С;КЗ69S;КЗ90Р; + +
438 М7IQ;N185D;R256L;ТЗ84Е;S619W; ++
439 М71Q;N18 5D;R2 5 6К;КЗ 9 0А;К4 3 6G; Е707К; ++
440 S67А;М71F;N185D;N444S;S619W;К 723D; ++
441 Nl85D;К436G;Т443D;S619W;Q626М ;Е707К;K723D; + +
442 M71Q;R256K; ++
443 М7IQ;R256L;КЗ90L;Т443D; + +
444 S67А;М7IF;K390L;T443D;Q626М; +
445 М7IQ;R256L;КЗ90L;Т443D;Q626М; +
446 М7IQ;Nl85D;КЗ90А;Т443D;S619W; Q626E; +
447 К128Q;КЗ69S;G415Н; +
448 К128Н;F620L;Т705Р;R748Е; +
449 М7IL;Т379N;D709Е;R748G; +
450 ТЗ84Е;Р418G;N444S;А638Q;D709Е ;R748S; +
451 М71Q; Nl8 5D;КЗ 9 ОА;N4 4 4 S; +
452 М71F; Nl85D;КЗ90L;N444S;S619W; K723D; +
453 M71L;D709E; +
454 N185D;R256K;S619W;E707K; +
455 K369S;K390P;F620L; +
- 64 043748
456 М7IQ;R256L;Q626Е;Е707К; +
457 S67А;М71F;N185D;N444S;S619W; +
458 К128Q;VI84Q;D252C;КЗ69S;G415Н +
459 F254W;ТЗ84Е;А638Q;D709Е;R748S Г +
460 S67А;М7IQ;Q134H;R256L;K390L;Т 443D;Q626М;Е707К; +
461 K128Q;T705P; +
462 М7IQ;N185D;R256L;КЗ90L; +
463 S67A;T443D;S619R; +
464 М7IQ;R256К;КЗ90А;Е707К; +
465 S67А;М71Q;ТЗ84Е;КЗ90А;N444S;S 619W; +
466 M71L;F254W;N309T;N444S; +
467 M71L;P418G;R748S; +
468 М7IQ;N185D;R256L;КЗ90L;Q626М; +
469 M71L; +
470 S67А;М7IQ;N185D;R256К;КЗ90L;S 619W; +
471 S67А;М71F;Nl85D;КЗ90L;S619W; +
472 M71Q;N185D;K390A;K436G;T443D; Q626M; +
473 G415H;F620L; +
474 М7IL;VI84Q;КЗ69S;G415Н;Т705Р; +
Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 24 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза.
Пример 10. Эффект добавления гистидиновой метки в SEQ ID № 82
Ацилирование по В29 для SEQ ID № 82, как описано в примере 9, и SEQ ID № 110, которая содержит метку из шести гистидинов на С-конце, сравнивали в масштабе встряхиваемой колбы. Порошки встряхиваемых колб получали, как описано в примере 4. Реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, каждая содержала 200 мкл, состоящих из 0,2 М TRIS, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 25 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 0,3-10 г/л лиофилизированного порошка фермента, восстановленного в 10 мМ TRIS, рН 7,5. НТР планшеты закупоривали теплом и инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 3 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа. На фиг. 2 приведен график, показывающий результаты. Как показано, добавление гистидиновой метки оказывало минимальный эффект на фермент относительно версии без гистидиновой метки.
Пример 11. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 110 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 110 выбирали в качестве родительского фермента после того, как было показано, что гистидиновая метка оказывает минимальное влияние на активность SEQ ID № 82. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций).
Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но с использованием 400 мкл лизирующего буфера вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,2 М TRIS, 20% ацетонитрила, 25 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта (начальный рН перед добавлением лизата составлял 9,4). НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 2 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с
- 65 043748 использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 110 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 110. Результаты представлены в табл. 9.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 11.1. Активность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 110
№ варианта SEQ ID № (н./а. к.) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 110) Процент превращения ацилированием (FIOP)1 по участку А1 (относительно SEQ ID № 110)
475 E482Q; + +
476 Е482М; + +
477 E482Y; + +
478 37/38 E482I; + +
479 Е482Т; + +
480 G54A; +
481 39/40 S386G; +
482 D484T; +
483 E482L; +
484 T32V; +
485 N444S;D709Е;R748S; +
- 66 043748
486 G54S; +
487 G415H;D709E; +
488 Q556G; +
489 Y616D; +
490 K128Q;D252C;G415H;N444S ;D709E;R748S; +
491 N185D;D709E; +
492 Y616N; +
493 Y616G; +
494 L557P; +
495 S704T; +
496 Y616A; +
497 47/48 L557S; +
498 43/44 P496A; +
499 P496T; +
500 45/46 L557Q; +
501 L557R; +
502 S639G; +
503 49/50 S704A; +
504 Q233A; +
505 D334P; +
506 Q233D; +
507 P496R; +
508 S639A; +
509 T131D; +
510 T131E; +
511 Q112D; +
512 S639E; +
513 L557V; +
514 S639D; +
515 P496N; +
516 S740A; +
517 L225T; +
518 T131N; +
519 L557M; +
520 D484L; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 110 и определяли следующим образом: + > чем в 1,0 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 8,0 раза; ++++ > чем в 8,0 раза.
Пример ^.Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 40 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 40 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 11. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но с использованием 400 мкл лизирующего буфера, вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,2 М TRIS, 20% ацетонитрила, 25 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 80 мкл НТР супернатанта (начальный рН перед добавлением лизата составлял 9,4). НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 2 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с
- 67 043748 использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 40 (процент превращения (FIOP)) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 40. Результаты представлены в табл. 12.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Процент избирательности относительно SEQ ID № 40 (процент избирательности FIOP) вычисляли как процент избирательности продукта, образуемого вариантом, относительно процента избирательности, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 40. Процент избирательности вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 12.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 40
№ вариа нта SEQ ID № (н. /а . к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 40) Процент превращен ИЯ ацилирова нием (FIOP)1 по участку В29 (относите льно SEQ ID № 40) Процент избиратель ности ацилирован ия (FIOP)2 ДЛЯ участка В29 (относител ьно SEQ ID № 40)
524 53/54 W370K; + +
525 57/58 D623V; + +
526 51/52 A2 8V;Y52L;L55I;Т131Е;L175H ;Q233R;G415Н;N444G;Р513S; + +
527 55/56 D623L; + +
528 59/60 P366G; + +
529 A28V;G74D;T374S;S704A; + +
530 А28V;L175Н;Р513S;W619S; + +
531 P366S; + +
532 LI75Н;G415Н;К723D; + +
533 Н472А; + +
534 Н348N;N444G;S704А; + +
535 T374S;Y616А;S704А; + +
536 T27Y;A28V;G74D;N185D; T374S ;N444G;S704А; + +
537 A2 8R; + +
538 N185D;T374S; + +
539 Y52L;L55I;QI12D;ТЗ74S;N444 G; +
540 H348N; +
541 Q380F; +
542 S150A; +
543 A362R; +
544 T374S;G415H;K547Q; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 40 и определяли следующим образом: + > чем в 1,0 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 8,0 раза; ++++ > чем в 8,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 40 и определяли следующим образом: + > чем в 1,0 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличе- 68 043748 ны; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 8,0 раза;
++++ > чем в 8,0 раза.
Пример ^.Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 56 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 56 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 12. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но с использованием 400 мкл лизирующего буфера, вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,2 М TRIS, 10% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта (начальный рН перед добавлением лизата составлял 9,4). НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 3 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и разводили еще 2 раза в воде перед загрузкой в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 56 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 56, и представлен далее в таблице. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Процент избирательности относительно SEQ ID № 56 (процент избирательности FIOP) вычисляли как процент избирательности продукта, образуемого вариантом, относительно процента избирательности, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 56. Результаты представлены в табл. 13.1. Процент избирательности вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
- 69 043748
Таблица 13.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 56
№ вариан та SEQ ID № (н. /а . к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 56) Процент превраще НИЯ ацилиров анием (FIOP)1 по участку В29 (относит ельно SEQ ID № 56) Процент избиратель ности ацилирован ия (FIOP)2 ДЛЯ участка В29 (относител ьно SEQ ID № 56)
561 Q112D;W619S; +
562 87/88 РЗ66S;D484Т;W619S;1708V; +
563 РЗ66Q;D484Т;К547Н;W619S; +
564 W619S; +
565 РЗ66G;D484Т;W619S;F620L; +
566 95/96 K390Q; +
567 К390А; +
568 K390S; +
569 W619S;S740A; +
570 Е103К;Q112D;A361G;P366G;D48 4T;W619S; +
571 Q157S;K723D; +
572 E103K;W619S; +
573 A361G;РЗ66Q;D484T;W619S;F62 0L; +
574 QI57S;K436G;L623V;K723D; +
575 P366G;W619S;S740A; +
576 D484T;K547H;W619S;F620L;S74 0A; +
577 D484T;I708V; +
578 P366Q;Q556H;W619S;S740A; +
579 P366S;D484T;W619S;F620L;170 +
- 70 043748
8V;
580 ElОЗК;QI12L;РЗ66Q;D484Т;W61 9S;I708V;S740A; +
581 D130Е;QI57S;L62ЗТ;Q626М; +
582 Т131Е;S704А;K723D; +
583 D130E;R317А;L623T;K723D; +
584 Е561Р; +
585 W37OK;D484Т;W619S; +
586 K436G;L623T; +
587 РЗ66S;D484Т;S740А; +
588 Т13ID;L557V;S639Т;К723D; +
589 K369D; +
590 R317А;L62ЗТ;Q626М;К723D; +
591 D130E;QI57S;К436G;K723D; +
592 Y616T; +
593 К128D;D130Е;QI57S;К436G;L62 ЗТ;Q626М;К723D; +
594 L557P; +
595 91/92 A255G; +
596 P366S;D484T; +
597 QI12L;РЗ66G;D484Т;К547Н;W61 9S;I708V; +
598 T131D;Т491S;L557V;D709Е;К72 3D; +
599 Q71G; +
600 D484T;I708V;S740A; +
601 S675E; +
602 РЗ66S;W37OK;D484Т;Q556H;W61 9S; +
603 D130E;L623T; +
604 A255D; +
605 T131D;L557V; +
606 L225Т;L557V;S704А;D709Е;К72 3D; +
607 Е1ОЗК;W37OK;D484Т;W619S;170 8V; +
608 D484T; +
609 QI12D;РЗ66S;D484Т; +
610 Q112L;D484T;I708V;
611 97/98 F57H; +
612 99/10 0 F57C; +
614 89/90 A67S; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 56 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 8,0 раза; ++++ > чем в 8,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 56 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 4,0 раза; +++ > чем в 4,0 раза, но меньше чем в 8,0 раза; ++++ > чем в 8,0 раза.
- 71 043748
Пример 14. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении А1 по сравнению с SEQ ID № 70 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 70 выбирали в качестве дополнительного родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 7. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но используя 400 мкл лизирующего буфера вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, содержащими 200 мкл 0,1 М Tris-HCl, pH 9,25, 20% ацетонитрила, 20 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР лизата. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 5 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин, разводили 2 раза в воде и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 70 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 70. Результаты представлены в табл. 14.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 14.1. Активность вариантов, ацилирующих по участку А1, относительно SEQ ID № 70
№ вариан та SEQ ID № (н. /а . к.) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 70) Процент превращения ацилированием (FIOP)1 по участку Al (относительно SEQ ID № 70)
642 121/1 22 R317S;Q380Р;G415Н;Т443D;А517 К;T560G;F701W; + + +
643 119/1 20 А255Р;Q380P;G444K;N457T;A517 K;T560G; +++
644 123/1 24 А2 55Р;R317S;Q3 8 OP;G415Н;Т4 4 3 D;G4 4 4 S;А517К;Т5 6 0G;F7 01W; + + +
645 113/1 14 A2 55P;R317S;Q3 8 OP;G415H;T4 4 3 D;G444S;F454W;N457T;A517K;T5 60G;F701W;
646 115/1 16 L55I;A255P;R317S;Q38 OP;T443D ;G444S;F454W;H472P;A517K;T56 + + +
- 72 043748
0G;F701W;
647 111/1 12 A2 55P; R317S ; Q3 8 OP; G415H; G4 4 4 S;N457T;A517K;T560G;F701W; + + +
648 117/1 18 A2 55P;R317S;Q3 8 OP;G415H;T4 4 3 D;F454W;N457T;A517K;T560G;F7 01W;
649 A2 55P;R317S;Q3 8 OP;T4 4 3D;G4 4 4 S;F454W;A517K;T560G;F701W; + +
650 A2 55P;R317S;Q3 8 OP;T4 4 3D;G4 4 4 S;N457T;T560G;F701W; + +
651 A255P;R317S;Q38 OP;G444K;F4 54 W;A517K;T560G; + +
652 L253S; + +
653 A255P;R317S;G415H;T443D;G444 S;F454W;N457T;A517K;F701W; + +
654 A2 55P;R317S;Q3 8 OP;G415H;T4 4 3 D;F454W;N457T;A517K;F701W; + +
655 A255P;R317S;Q38 OP;G444K;A517 K;T560G;F701W; + +
656 R317S;Q38 OP;T443D;G444K;F4 54 W;A517K;T560G;F701W; + +
657 Q556G; + +
658 A255P;R317S;A373K;G415H;T443 D;F454W;N457T;A517K;T560G;F7 01W; + +
659 N185E; + +
660 W370L; + +
661 A2 55P;R317S;Q3 8 OP;G4 4 4S; N4 57 T;A517K;T560G;F701W; + +
662 A2 55P; R317S ; A37 3K; G415H; G4 4 4 K;N457T;A517K;T560G;F701W; + +
663 A2 55P;R317S;Q38 OP;G444K;F4 54 W;N457T;A517K;T560G;F701W; + +
664 N348D; +
665 N348H; +
- 73 043748
666 А255Р;R317S;А37ЗК;G415Н;G444 S;F454W;N457T;A517K;T560G;F7 01W; +
667 А255Р;А37ЗК;G415Н;G444S;N457 Т;А517К;T560G;F701W; +
668 L557P; +
669 A362V; +
670 А255Р;R317S;Q380Р;Т443D;F454 W;T560G;F701W; +
671 Е707А; +
672 А255Р;R317S;Q380Р;G444S;А517 К;T560G;F701W; +
673 А255Р;R317S;Q380Р;G444К;N457 Т;А517К;T560G;F701W; +
674 T560G; +
675 А255Р;R317S;G415Н;G444S;F454 W;А517К;T560G;F701W; +
676 R317S;А37ЗК;G415Н;Т443D;F454 W;А517К;T560G;F701W; +
677 А255Р;R317S;КЗ69Т;G415Н;Т443 D;N457T;A517K;F701W; +
678 А255Р;R317S;А37ЗК;G415Н;G444 K;N457T;A517K;S530D;F701W; +
679 L557G; +
680 А255Р;R317S;G415Н;F454W;N457 Т;А517К;T560G;F701W; +
681 А255Р;R317S;А37ЗК;G415Н;G444 К;F454W;A517K;T560G;F701W; +
682 А255Р;R317S;Q380Р;G444Q;F454 W;А517К;T560G;F701W; +
683 L253R; +
684 А2 55Р;R317S;Q3 8 0Р;G4 4 4S;F4 54 W;А517К;S530D;T560G;F701W; +
685 R317S;А37ЗК;G415Н;G444К;F454 W;А517К;T560G;F701W; +
686 А255Р; +
687 L557S; +
688 А255Р;R317S;Q38OP;G444K;F454 W;N457T;A517K;F701W; +
689 S386G; +
690 L557E; +
691 F254G; +
692 А451К; +
693 А2 55Р;R317S;Q3 8 0Р;G4 4 4S;F4 54 W;А517К;T560G; F701W; +
694 А255Р;R317S;Q380Р;G444К; F4 54 W;T560G;F701W; +
695 F756P; +
696 R317S;Q380Р;Т443D;N457Т;А517 К;F701W; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 70 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 1,5 раза увеличены; ++ > чем в 1,5 раза, но меньше чем в 2,0 раза; +++ > чем в 2,0 раза.
- 74 043748
Пример 15. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении А1 по сравнению с SEQ ID № 116 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 116 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 14. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но используя 400 мкл лизирующего буфера вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, содержащим 200 мкл 0,25 М Tris-HCl, pH 9,25, 20% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР лизата. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин в течение 4 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин, разводили 24х в воде и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 116 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 116. Результаты представлены в табл. 15.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 15.1. Активность вариантов, ацилирующих по участку А1, относительно SEQ ID № 116
№ вариант а SEQ ID № (н./а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 116) Процент превращен ия ацилирова нием (FIOP)1 по участку А1 (относите льно SEQ ID № 116)
697 125/12 6 L253S;N348D;G415Н;N457Т;Q556G;L557P Г + + + +
698 131/13 2 N185Е;L253S;N348Н;G415Н;N457Т;Q556G ;L557G;К72ЗЕ; ++++
699 L2 53S;S317R;N348Н;АЗ 62V;G415Н;N4 57T ;Q556G;L557G;К723Е; + + + +
700 133/13 N185Е;L253S;S317R;N348D;АЗ62V; + + + +
- 75 043748
4
701 N185E;L253S;S317R;N348H;A3 62V;Q556G ;L557G; + + + +
702 L253S;N348D;W370L;N457T;Q556G;L557G r ++++
703 N185D;L253S;S317R;N348H;A3 62V;G415H ;N457T; ++++
704 N185E;L253S;S317R;G415H;N457T;L557P ;K723E; + + + +
705 129/13 0 N185D;L253S;N348H;A3 62V; ++++
706 L253S;S317R;N348D;A3 62V;G415H;N457T ++++
707 L253S;N348D;A3 62V;L557G;K723E; + + + +
708 L253S;N348D;A3 62V;N457T;L557G;K723E ++++
709 L253S;A3 62V;N457T;L557G; + + + +
710 L253S;N348D;A3 62V;G415H;L557G; ++++
711 L253S;S317R;A3 62V;G415H;L557G; ++++
712 L253S;S317R;N348H;A3 62V;W37OL;Q556G ;L557P; + + + +
713 L253S;S317R;N348D;A3 62V;G415H;Q556G ;L557G;K723E; ++++
714 L253S;N348D;L557P; + + + +
715 L253S;N348D;A3 62V;W37OL;N457T;Q556G ;L557G;K723E; ++++
716 N185D;L253S;N348H;G415H;L557G; ++++
717 N185E;L253S;N348H;A3 62V;K723E; + + + +
718 N185D;L253Q;G415H;N457T;L557G; ++++
719 L253S;S317R;N348D;W37OL;N457T;K723E r + + + +
720 L253S;S317R;N348D;G415H;L557G; ++++
721 N185D;L253S;S317R;W37OL;G415H;Q556G ;L557G; + + + +
722 N185E;L253S;S317R;N348H;A3 62V;L557G ++++
- 76 043748
;K723E;
723 N185D;L253S;S317R;N348H;L557G;R602C + + + +
724 N185E;L253S;N348D;A3 62V;N457T;Q556G ;L557P; ++++
725 N185D;L253S;S317R;A3 62V; ++++
726 L253S;S317R;N348D;A3 62V;N457T;Q556G ;L557G;K723E; + + + +
727 N185D;L253S;N348H;A3 62V;G415H; ++++
728 N185E;L253S;N348H;A3 62V;W370L;G415H ;Q556G;L557G; ++++
729 L253S;S317R;N348D;A362V;Q556G;L557P + + + +
730 L253S;S317R;A362V;N457T;Q556G;L557G ;K723E; + + + +
731 N185E;L253S;S317R;N348D;A3 62V;G415H ;L557G;K723E; ++++
732 L253S;S317R;N348D;L557P; ++++
733 N18 5E;L2 53S;S317R;N348H;A3 62V;G415H ;N457T;K723E; + + + +
734 137/13 8 N18 5D;L2 53S;S317R;N348H;A3 62V;G415H ++++
735 N18 5D;L2 53S;A3 62V;L557G; ++++
736 N185D;L253Q;S317R;N348D;A362V;G415H ;N457T;K723E; + + +
737 N185E;L253S;S317R;A3 62V;W37OL;L557G ;K723E; + + +
738 N185E;L253S;G415H;L557G; +++
739 L253Q;N348D;N457T;Q556G;L557P; +++
740 N185E;L253S;N348H;A3 62V;N457T;L557G + + +
741 N185D;L253S;S317R;A3 62V;G415H;N457T +++
742 N185D;L253Q;S317R;N348D;W37OL;N457T + + +
- 77 043748
743 N185D;L253Q;S317R;A3 62V;G415H;K72ЗЕ + + +
744 N185D;L253S;S317R;G415Н;L557G; + + +
745 L253S;N348D;АЗ 62V;Q556G;L557G; + + +
746 L253S;S317R;A362V; + + +
747 L253S;S317R;G415Н;N457Т; + + +
748 L253S;S317R;N348D;АЗ 62V;N457Т;Q556G + + +
749 N185Е;L253S;N348Н;АЗ 62V;L557G; +++
750 L253S;N348Н;АЗ 62V;К72ЗЕ; +++
751 L253Q;N348D;A362V;N457T;L557P; +++
752 L253S;S317R;N348D;АЗ 62V; +++
753 N185Е;L253S;N457Т;L557P; +++
754 N185E;L253Q;N348D;Q556G;L557G; +++
755 L253S;N348D;АЗ 62V;W370L;L557P;К72ЗЕ + + +
756 L253Q;S317R;N348D;L557G; +++
757 L253Q;АЗ 62V;W37OL;N457T;Q556G;L557G + + +
758 L253S;N348D;L557G;K72ЗЕ; +++
759 L253S;N348D;L557G; +++
760 N185E;L253S;L557G;K72ЗЕ; +++
761 N185D;L253Q;S317R;Q556G;L557G; +++
762 L2 53Q;S317R;A3 62V;N4 57T;Q55 6G; L557P + + +
763 L253S;A3 62V;L557G; +++
764 N185D;L253S;N348D;A3 62V;G415H;Q556G ;K723E; +++
765 L253S;S317R;N348H;N457T;Q556G;K72ЗЕ + + +
766 L253S;S317R;A3 62V;L557G;K72ЗЕ; +++
767 N185D;L253S;N457T;L557G; +++
768 127/12 8 L253S;N348H;G415H; +++
769 N185Е;S317R;N348Н;АЗ 62V;N457Т;L557G +++
- 78 043748
Г
770 N185E;L253Q;N348H;A362V;N457T; + + +
771 L253S;S317R;N348D;К72ЗЕ; +++
772 L253S;АЗ 62V;G415Н; + + +
773 N348D;АЗ 62V;N457Т;Q556G;L557G;К72ЗЕ Г +++
774 N185Е;L253S;S317R;N348Н;АЗ 62V;К72ЗЕ Г + + +
775 N185Е;L253S;АЗ 62V;Q556G;К72ЗЕ; + + +
776 L253S;S317R;АЗ 62V;Q556G;L557G; + + +
777 L253Q;N348D;A362V;Q556G;L557G; +++
778 N185E;S317R;N348D;A362V;Q556G;L557P Г + + +
779 N185E;L253S;S317R;N457T; +++
780 N185E;L253S;S317R;N348H;G415H;L557G ;K723E; + + +
781 T105N;N185D;L253Q;S317R;N348D;L557G + + +
782 N185D;S317R;N348D;A362V;N457T; +++
783 L253S;G415H;L557G; + + +
784 N18 5E;N348D;A3 62V;G415H;K72 3E; +++
785 N185D;L253Q;N348D;G415H;N457T;L557G ;K723E; + + +
786 N185E;L253Q;W370L;G415H;Q556G;L557G r + + +
787 N185D;A3 62V;G415H;Q556G;L557G;K723E r +++
788 N185D;L253Q;S317R;N348D;N457T; +++
789 L253Q;N348D;A362V;L557G; + + +
790 N185D;L253S;N348D;N457T;Q556G;L557G ;K723E; + + +
791 N185E;S317R;N348H;N457T;Q556G;L557G r +++
792 L253S;N348D;A3 62V;G415H;Q556G;L557P r +++
- 79 043748
793 N348D;A362V;G415H;L557G; + + +
794 N18 5D;L2 53S;A3 62V; + + +
795 N185D;A3 62V;W37OL;Q556G;L557G;W701F ;K723E; + + +
796 L253S;G415H;N457T;L557G; + + +
797 N185E;S317R;G415H;N457T;L557G; + + +
798 L253Q;S317R;N348D;A362V;G415H; + + +
799 N18 5E;L2 53S;A3 62V; + + +
800 L253S;L557P; + + +
801 L253Q;S317R;N348H;A362V;G415H;L557G r + + +
802 N185E;L253Q;S317R;N348D; + + +
803 L253S;S317R;N348H;W37OL;G415D;N457T ;K723E; + + +
804 L253Q;S317R;N348D;A362V;N457T;Q556G ;K723E; +++
805 N185D;S317R;N348D;G415H;L557G; + + +
806 L253Q;S317R;N348D;N457T;Q556G;L557G ;K723E; + + +
807 N185D;L253S;N348H; +++
808 N185E;S317R;N348H;W701F;K723E; +++
809 N185E;N348D;A3 62V;W37OL;G415H;K723E r +++
810 S317R;A3 62V;N457T;L557G;K723E; +++
811 N185D;N348H;A3 62V;Q556G;L557G;K723E + + +
812 L253S;S317R;A3 62V;K723E; +++
813 N185E;N348D;N457T;Q556G;K723E; + + +
814 L253S;N348H;A3 62V; + + +
815 L253S;N348D; + + +
816 S317R;N348D;A362V;G415H; +++
817 L253Q;N348D;A3 62V;L557G;K723E; +++
818 L253Q;N348D;G415H;L557G;K723E; + + +
819 L253Q;N348D;A362V;G415H;L557P; +++
820 135/13 L253S;S317R;N348D; +++
- 80 043748
6
821 N185D;L253Q;S317R;N348D;L557G;K72ЗЕ + + +
822 L253S;S317R;L557G;K72ЗЕ; + + +
823 N185E;S317R;N348D;A362V;G415H;L557P + + +
824 L253S;Q556G;L557G;К723Е; + + +
825 N185Е;L253S;S317R; + + +
826 N185E;L253Q;S317R;N348D;A3 62V;K72ЗЕ f + + +
827 L2 53Q;S317R;N348D;A3 62V;Q55 6G;K72 3E f + + +
828 N185E;L253S;N457T;L557P;R602C; + + +
829 L253Q;A3 62V;Q556G;L557G;K72ЗЕ; + + +
830 N185D;N348D;A362V; + + +
831 N185E;L253S;S317R;A3 62V; + + +
832 L253Q;S317R;A362V;L557G; + + +
833 N185D;N348D;L557G; + + +
834 N185D;L253Q;S317R;N457T; + + +
835 S317R;N348D;A362V;N457T;L557G; + + +
836 L253Q;S317R;G415H;L557P;K723E; + + +
837 N185D;N348D;W370L;G415H;Q556G;L557P ;K723E; + + +
838 КЗ04E;S317R;N348H;A3 62V;L557G;W701F f + + +
839 N185D;L253S; + + +
840 N185E;G415H;N457T;Q556G;K723E; + + +
841 G415H;Q556G; + + +
842 L253S;N457T;L557P; + + +
843 S317R;N348D;G415H;N457T; + + +
844 L253Q;G415H;L557G; + + +
845 L253Q;S317R;N348D; + + +
846 N185D;N348H;A362V;L557P; + + +
847 N185D;L253S;N348D;A3 62V;W37OL;G415H ;D428G;Q556G;K723E; + + +
- 81 043748
848 N348D;Q556G;L557G; + + +
849 N185D;N348D;N457T;K72ЗЕ; + + +
850 N185E;L253Q;N348D;L557G; + + +
851 N185D;A362V;G415H;L557P; + + +
852 N185E;S317R;A3 62V;N457T;L557G;K723E r + + +
853 L253Q;S317R;G415H;Q556G;L557G;K723E r +++
854 L253Q;N348H;A362V;L557G; +++
855 N185E;N348D;A362V;L557P; +++
856 L253Q;A3 62V;W701F;K723E; + + +
857 S317R;N348D;A3 62 V;Q556G;L557P;K723E r + + +
858 N185E;L253S;K723E; + + +
859 N185D;S317R;N348D; +++
860 N185D;S317R;N348H;A362V; +++
861 N185E;S317R;N457T;Q556G;L557G; +++
862 N185E;N348D;A362V; +++
863 S317R;A362V;L557G; +++
864 N185E;A362V;N457T; +++
865 N185D;L253Q;S317R;N348H;K723E; +++
866 N348H;A3 62V;N457T;W701F;K723E; + + +
867 N348D;A362V;N457T; +++
868 N185D;S317R;N348H;N457T; +++
869 N185E;N457T;Q556G; + + +
870 N185E;S317R;N348D;G415H;L557P;W701F r +++
871 L253S;N348H;N457T; + + +
872 N18 5E;L2 5 3Q;N3 4 8 D;G415H;K7 2 3E; + + +
873 L253S;Q556G;L557G; +++
874 N18 5E;L2 53Q;W7 01F;K7 2 3E; +++
875 N185D;S317R;A362V;Q556G; + + +
876 L253S;N348H;K723E; +++
877 N185E;L253Q;S317R;N457T; +++
- 82 043748
878 Nl85D;G415H;N457T;K72ЗЕ; + + +
879 N185E;N348D;G415H; + + +
880 L253Q;N348Н;АЗ 62V;W37OL;L557P; + + +
881 N185D;G415H;Q556G; + + +
882 Nl85E;N348D;A3 62V;N457T;K72ЗЕ; + + +
883 N185D;S317R;L557P; + + +
884 L253S;N348H;L557G; + + +
885 Nl85D;S317R;W37OL;N457T;L557G; + + +
886 N185D;S317R;N348D;A362V;K723E; + + +
887 S317R;A3 62V;W37OL;L557G; + + +
888 Nl 85D;S317R;W701F; + + +
889 L253Q;G415H;N457T; + + +
890 L253S;A362V; + + +
891 N348H;G415H;Q556G;L557P; + + +
892 N185D;N348D;A362V;K723E; + + +
893 N185D;N348H;A362V; + + +
894 N185E;L253Q;S317R;A362V; + + +
895 N185E;L253Q;N348H;L557G; + + +
896 N185D;W701F; + + +
897 L253Q;S317R;A362V;G415H; + + +
898 L253Q;S317R;W37OL;N457T;L557G;K723E r + + +
899 N185E;S317R;A362V; + + +
900 L253S;S317R; + + +
901 L253Q;N348H;L557G; + + +
902 Nl85D;L557G;K723E; + + +
903 N185E;G415H;L557G; + + +
904 N185E;W701F; + + +
905 S317R;N348D;L557G; + + +
906 L253S;N348H;N457T;Q556G;L557G;Y580N ;K723E; + + +
907 N185E;A362V;N457T;K723E; + + +
908 N348D;A3 62V;L557G;K72 3E; + + +
909 L253Q;S317R;A3 62V;G415H;K723E; + + +
- 83 043748
910 L253Q;N457T;Q556G;L557G; + + +
911 G415H;N457T;Q556G;L557G; + + +
912 L253Q;S317R;L557G;K72ЗЕ; + + +
913 S317R;N457T;Q556G;L557G; + + +
914 N348H;G415H;N457T; + + +
915 N185D;L253Q;N348H;L557P;K723E; + + +
916 L253Q;A3 62V;N457T;K723E; + + +
917 N185D;L253Q;Q556G;L557P;K723E; + + +
918 N185D;G415H;K723E; + + +
919 S317R;A362V;N457T; + + +
920 L253Q;N348D;Q556G;K723E; + + +
921 S317R;L557G;K723E; + + +
922 N185E;Q556G;L557G;K723E; + + +
923 N185D;A362V;L557G; + + +
924 N185E;N348D;K723E; + + +
925 L253Q;A362V;N457T; + + +
926 L253S;Q556G; + + +
927 N185D;N348D; + + +
928 L253Q;S317R;N457T; + + +
929 N185E;L253Q; + + +
930 L253S;L557G; + + +
931 N185E;N348D; + + +
932 L253Q;N348D;A3 62V;K723E; + + +
933 N185D;A3 62 V;G415H;K723E; + + +
934 N185E;A362V;Q556G; + + +
935 L253Q;L557G;K723E; + + +
936 S317R;N348H;L557G; + + +
937 S317R;A362V;G415H; + + +
938 N185E;L253Q;S317R; + + +
939 N185D;L253Q;L557G; + + +
940 G415H;L557G; + + +
941 S317R;N457T;L557G; + + +
942 A3 62V;L557G;K723E; + + +
943 L253Q;S317R;Q556G; + + +
- 84 043748
944 N348D;G415H; + + +
945 N18 5D;L2 53Q;N348H;A3 62V;K72 3E; + + +
946 N348H;Q556G; + + +
947 A362V;N457T;L557G; + + +
948 L253Q;S317R;N348H; + + +
949 L253Q;N348D;W370L;Q556G;L557G;K723E r + + +
950 N185E;Q556G;L557P; +++
951 A3 62V;W37OL;L557G;K723E; +++
952 L253Q;Q556G;L557G; + + +
953 L253S;N457T; + + +
954 N185E;S317R;N457T;K723E; + + +
955 S317R;A362V;Q556G;L557G; +++
956 N185D;N348H;N457T; +++
957 A362V;N457T;Q556G;L557P; +++
958 G415H;L557P; +++
959 L253S; + + +
960 N185E;L253Q;N457T; + + +
961 L253S;A642V; +++
962 N348D;A362V; +++
963 N185E;S317R;W37OL;Q556G; + + +
964 L253Q;A362V; +++
965 L253Q;N348H;A362V; +++
966 N457T;Q556G;L557P; +++
967 Al 60S;N18 5E;S317R;A3 62V;L557G; +++
968 S317R;W37OL;L557G; + + +
969 S317R;W37OL;N457T; +++
970 N457T;L557P; +++
971 S317R;Q556G; + + +
972 A362V;N457T; + + +
973 S317R;A362V; + + +
974 S317R;Q556G;L557G;K723E; +++
975 S317R;G415H; + + +
976 N185D;L253S;V360I;G415H;L557G; + + +
- 85 043748
977 N348D; + + +
978 N348D;АЗ 62V;К72ЗЕ; + + +
979 N185E;N348H; + + +
980 АЗ 62V;Q556G;L557P; + + +
981 N185D;N457T; + + +
982 N185D;A362V; + + +
983 L253Q;S317R; + + +
984 N348H;A362V; + + +
985 A362V;Q556G;K723E; + + +
986 N185E;A362V; + + +
987 A362V;L557G; + + +
988 S317R;Q556G;L557G; + +
989 L253Q;K723E; + +
990 N185D;S317R; + +
991 S317R;N457T; + +
992 S317R;L557G; + +
993 G415H; + +
994 A3 62V;N457T;K723E; + +
995 N185D;K723E; + +
996 Q556G;L557G; + +
997 A3 62 V; + +
998 N185D; + +
999 L253Q;S317R; + +
1000 S317R;K723E; + +
1001 Q556G;K723E; + +
1002 L253Q; + +
1003 L557G; + +
1004 N185E; + +
1005 S317R; + +
1006 Al40E;N185E;L253Q;G415H;N457T;L557G r + +
1007 N457T; +
1008 L2 53S;S317R;A3 62V;N457T;K723E;S750R r +
1009 N185D;A362V;E707A; +
1010 L557P; +
1011 L253Q;F277L;L557P; +
1012 N185D;A3 62V;L557G;E707A; +
1013 N348H; +
1014 K723E; +
1015 N185D;S317R;A362V;E707A; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 116 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 1,5 раза увеличены; ++ > чем в 1,5 раза, но меньше чем в 2,0 раза; +++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза; ++++ > чем в 5,0 раза.
Пример 16. Эффект добавления гистидиновой метки, оказываемый на SEQ ID № 136
Ацилирование по А1 для SEQ ID № 136 (описано в примере 15) и SEQ ID № 142, которая содержит метку из шести гистидинов на С-конце SEQ ID № 136, сравнивали в масштабе встряхиваемой колбы. Порошки встряхиваемых колб получали, как описано в примере 4. Реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, содержащими 200 мкл 0,25 М Tris-HCl, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 0,05-0,5 г/л лиофилизированного порошка фермента. Планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 4 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в
- 86 043748 течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин, разводили 20х в воде и загружали в HPLC для анализа. Результаты представлены на фиг. 3. Как показано на этой фиг. , добавление гистидиновой метки оказывало минимальный эффект на фермент относительно версии без гистидиновой метки.
Пример 17. Усовершенствование ацилирования инсулина в положениях А1 и В29 по сравнению с SEQ ID № 40 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 40 выбирали в качестве дополнительного родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 11. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, каждая содержала 200 мкл, содержащих 0,2 М TRIS, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин в течение 2 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 40 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 40. Результаты представлены в табл. 17.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Процент избирательности относительно SEQ ID № 40 (процент избирательности FIOP) вычисляли как процент избирательности продукта, образуемого вариантом, относительно процента избирательности, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 40. Результаты представлены в табл. 17.1. Процент избирательности вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
- 87 043748
Таблица 17.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, ________________относительно SEQ ID № 40________________
№ вариа нта SEQ ID № (н. /а . к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 40) Процент превращени я ацилирован ием (FIOP)1 по участкам А1 и В29 (относител ьно SEQ ID № 40) Процент избиратель ности ацилирован ия (FIOP)2 ДЛЯ участков А1 и В2 9 (относител ьно SEQ ID № 40)
1018 143/1 44 L55I;Q71G;А255Р;N444S ; Т56 0G; + + + + + + +
1030 L55I;Q7IG;К128W;Y253S;T56 0G; + + + + + + + +
1020 147/1 48 L55I;Q7IG;G74D;N444S; + + + + + + +
1031 L256Y;N457M;G461R; ++++ ++++
1032 L55I;Y253S;H348D; ++++ ++++
1019 145/1 46 L55I;Q7IG;K128W;N4 4 4S; ++++ +++
1033 L55I;Q7IG;G74D; ++++ +++
1034 L55I;Q71G; ++++ +++
1035 H348N;K352T;T384P; ++++ ++++
1036 L55I;H348D; ++++ ++++
1037 H348N;K352T;T384P; Q559H; ++++ ++++
1038 L55I;Q7IG;Y253S;A255P; ++++ +++
1039 L55I;G74D;H348D;Q38 OP;N44 4S;T560G; + + + + + + +
1040 H348N;K352T;P364L;Y616R; ++++ ++++
1041 L55I;Q7IG;G74D;Y253S;A255 P; + + + + + + +
1042 L55I;Q7IG;G74D;A255P;H348 ++++ +++
- 88 043748
D;
1043 L55I;Q7IG;G74D;А517К; + + + + +++
1044 L55I;Q7IG;G74D;N444S;F454 W;A517K; + + + + + + + +
1023 153/1 54 L55I;Q7IF;G74D;K390L; + + + ++
1045 H348N;K352T;T384R;N457M;Y 61 6R; + + + +++
1046 L55I;Q7IG;G74D;H348D;N444 S;T560G; + + + +++
1047 Q7IM;G74S;N185D;КЗ90A;Q62 6M; + + + + +
1048 L55I;Y253S;Q38OP;T560G; +++ ++
1022 151/1 52 L55I;Q7IM;G74S;Q38 OP; + + + + +
1021 149/1 50 L55I;Q7IM;Q38 OP;K436G;W61 9F; +++ ++
1049 H348N;K352T; +++ +++
1050 K128W;Y253S;F254W;A362V;N 457T;Q556G;L557G; +++ +++
1051 L55I;Q71F;W619F; +++ ++
1052 L55I;Q71G;H348D;F701W; +++ +++
1053 L55I;Q7IM;G74D;N185D; +++ +
1054 L55I;Q7IM;N185D;K436G;W61 9F; + + + +
1055 L55I;Y253S;N444S; +++ ++
1056 H348N;K352T;T384R; +++ +++
1057 L55I;Q71F; +++ ++
552 L55I;H348D;Q38OP; +++ +
1058 T12 9W;H34 8N;КЗ52T; +++ +++
1059 L55I;Q71M;Q380P; +++ +
1060 T129W;G202A;F254K;K352T;R 373K;T384R;N457M; +++ +++
1061 N185E;КЗ69C;N457T;Q556G;L 557G;D709E;K723E; + + + + +
1062 L55I;N444S; +++ +
1063 N185E;G415H;N457T;K723E; +++ +
1064 A67S;Q71F;A255P;L256K;T38 4E; +++ ++++
1065 Q71F;L256K;N444S;T560G; +++ ++
1066 L256Y;H348N;T384R; +++ +++
1067 Q71F;N444K;Y616E; +++ ++
1068 H546L; + +++
1069 N440L; + +
1070 D518R; + +++
1071 A279P; + +
1072 A349E; + +
1073 N440Y; + +
1074 K682A; + +
1075 N333S; + +
1076 K682G; + +
1077 N333A; + +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 40 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличены; ++ >
- 89 043748 чем в 5,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза; +++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 20,0 раза; ++++ >
чем в 20,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 40 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 5,0 раза увеличены; ++ > чем в 5,0 раза, но меньше чем в 10,0 раза; +++ > чем в 10,0 раза, но меньше чем в 20,0 раза; ++++ > чем в 20,0 раза.
Пример 18. Усовершенствование ацилирования инсулина в положениях А1 и В29 по сравнению с SEQ ID № 154 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 154 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 17. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, каждая содержала 200 мкл, содержащих 0,2 М TRIS, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 2 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 154 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 154. Результаты представлены в табл. 18.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Процент избирательности относительно SEQ ID № 154 (процент избирательности FIOP) вычисляли как процент избирательности продукта, образуемого вариантом, относительно процента избирательности, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 154. Результаты представлены в табл. 18.1. Процент избирательности вычисляли посредством деления площади пика продукта на сумму площадей пиков продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
- 90 043748
Таблица 18.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 154
№ вариа SEQ ID № Различия аминокислот (относительно SEQ ID № Процент превращени Процент избиратель
нта (н./а. к. ) 154) я ацилирован ием (FIOP)1 по участкам А1 и В29 (относител ьно SEQ ID № 154) ности ацилирован ия (FIOP)2 ДЛЯ участков А1 и В2 9 (относител ьно SEQ ID № 154)
1026 159/16 0 N185Е;Н348D;К352Т;L390А; N444S; + + + + +
1027 163/16 4 F71G;F254W;Н348D;ТЗ84Р;L 390A;N444S; + + + + +
1078 Y253S;Н348D;ТЗ84Р;L390А; N444S;N457T; +++ + +
1079 F71G;N185E;Y253S;F254W;H 348D;К352Т;ТЗ84Р;L390А;N 444S;
1028 161/16 2 N185E;Y253S;F254W;H348N; К352Т;L390A;T560G; + + + + +
1029 165/16 6 F71G;Y253S;H348D;K352T;Т 384P;L390A;T560G; + + + +
1080 H348D;K352T;L390A;N444S; +++ +
1081 F254W;H348N;ТЗ84P;L390A; + + + + +
1082 K352T;L390A;N444S; + + + +
1083 H348D;K352T;L390A; + + +
1084 N185E;F254W;H348N;K352T; T384P;L390A;N444S; + + +
1085 Y253S;F254W;K352T;T384P; L390A; + + +
1086 F254W;T384P;L390A; ++ +
1087 F71G;E165G;N185E;Y253S;F 254W;H348D;K352T;L390A;N 444S; +
1088 F71G;K352T;L390A; + + +
- 91 043748
1089 F71G;ТЗ84P;L390A;N444S;T 560G; + + +
1090 F71G;N185E;F254W;H348D;К 352T;L390A;N444S; + + +
1091 F71G;F254W;H348N;K352T;T 384P;L390A;N444S; + + +
1092 G202A;F254W;H348D;T384P; L390A;N444S; + + +
1093 Y253S;H348D;T384P;L390A; N444S; + + +
1094 F71G;A466M; ++ +
1095 F7IG;Y253S;K352T;T384P;L 390A;T560G; + + +
1096 H348D;L390A;N444S; ++ +
1097 F7IG;H348N;T384P;L390A;T 560G; + + +
1098 F254W;K352T;L390A; ++ +
1099 Y253S;F254W;T384P;L390A; + + +
1100 L390A;N444S; + + +
1024 155/15 6 D7 4S;A3 62V;Q55 6G; ++ +
1101 F71G;Y253S;F254W;H348N;K 352T;L390A; + + +
1102 D74S;A362V; + + +
1103 D74S;A3 62V;T384R;L557G; + + +
1104 F7IM;S251C;A279P;N333A;N 444S; + + +
1105 H348D;K352T;A3 62V;N444S; K723E; + + +
1106 F71G;F254W;H348D;K352T;T 384P;L390A;N444S; + + +
1107 A279P;N44 OY;N444S; ++ +
1108 F7IG;A250S;A279P;N44OL;N 444S;A466M;A642E; ++ +
1109 F254W;H348N;L390A; + + +
- 92 043748
1110 D74S;АЗ 62V;N444К; + + +
1025 157/15 8 D74G;N185Е;К352Т;Q380Р;К 436G;Y616R; + + +
1111 D74S; + + +
1112 D7 4S;АЗ 62V;N4 4 4S;Q55 6G; + + +
1113 К352Т;Т384Р;L390A;T560G; + + +
1114 F7IM;D74S;АЗ 62V;L390А;G4 15H;N444K; + + +
1115 F71G;Н348D;ТЗ84Р;L390А; + +
1116 D74G;Н348D;Q380Р;К436G;К 723Е; + +
1117 F71G;P164S;Y253S;H348D;Т 384Р;L390А;N444S;I637М; + +
1118 F71G;D74S;L390A;G415Н;W6 19F; + +
1119 N185Е;ТЗ84Р;L390А;Н472Р; + +
1120 F254W;К352Т;АЗ 62V;К723D; + +
1121 D74G;Н348D;Т560G;К72ЗЕ; + +
1122 A67S;Y253S;F254W;H348D;K 352Т;G415Н;К723D; + +
1123 F71G;Н348D;К352Т;ТЗ84Р;L 390A;N444S; + +
1124 F71G;H348D;L390A; + +
1125 F71G;N185Е;Н348N;L390А; + +
1126 N185D;H348D;K352T;K436G; T560G;K723D; + +
1127 F71G;F254W;T384P;L390A;N 444S;T560G; + +
1128 D74S;A3 62V;T384P; + +
1129 A279P;N333A;A466M; + +
ИЗО F71G;Y253S;K352T;L390A; + +
1131 D74S;L557G; + +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 40 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 3,0 раза; +++ > чем в 3,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза; ++++ > чем в 5,0 раза.
Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 40 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 3,0 раза; +++ > чем в 3,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза; ++++ > чем в 5,0 раза.
Пример 19. Усовершенствование ацилирования инсулина в положениях А1 и В1 по сравнению с SEQ ID № 12 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 12 выбирали в качестве дополнительного родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 7. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, содержащими 200 мкл 0,1 М TRIS, рН 9,25, 20% ацетонитрила, 10 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 10 мкл НТР супернатанта. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин в течение 5 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила или диметилацетамид и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 12 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспе- 93 043748 чиваемого с помощью SEQ ID № 12. Результаты представлены в табл. 19.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 19.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 12
№ вариа нта SEQ ID № (н./ а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 12) Процент превращен ИЯ ацилирова нием (FIOP)1 по участкам А1 и В1 (относите льно SEQ ID № 12) Процент избирател ьности ацилирова ния (FIOP)1 ДЛЯ участков А1 и В1 (относите льно SEQ ID № 12)
106 65/6 6 Y27T;D7 4N;L253V;F254W;W370I; D381K; + + + + + + +
141 67/6 8 Y27T;F254W;А255G;W370I; + + + + + + +
117 Y27T;D7 4G;L253V;F254W;A255G; W3701;D38 IK;ТЗ84P; ++++ +++
120 Y27T;D7 4N;L253V;F254W;N348R; W370I;D381F; + + + + + + +
1132 Y27T;L253V;F254W;N348R;W370I +++ + +
157 Y27T;L253V;F254W;N348R;W370I ;T384P; + + + + +
1133 Y27T;D7 4N;L253V;F254W;A255G; N348R;W370I;D381W;T384P; +++ + +
86 Y27T;D7 4N;L253V;F254W;N348R; W3701;D38IK;T384P; + + + + +
137 Y27T;D74S;F254W;A255G;W370I; +++ ++
170 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R; W370I;D381W;T384P; +++ ++
- 94 043748
91 Y27Т;D74G;L253V;F254W;A255G; W370I; + + + + +
155 Y27Т;L253V;А255G;W370I;D381F ;Т384Р; + + + + +
1134 Y27T;L253V;F254S;А255G;N348R ;W370I; +++ + +
258 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348R ;W370I; + + + + +
1135 Y27T;L253V;F254W;A255G;N348R ;W370I; +++ + +
126 Y27T;D74G;F254W;A255G;N348R; W370I; + + + + +
143 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I +++ + +
124 Y27T;L253V;F254W;D381F;T384P +++ + +
240 Y27T;L253V;F254W; +++ ++
171 Y27T;L253V;F254L;A255G;N348R ;W370I;T384P; +++ + +
275 Y27T;D74G;L253V;F254W; +++ ++
84 Y27T;D74G;L253V;F254W; +++ ++
96 Y27T;L253V;A255G;W370I; ++ ++
115 Y27T;D74P;L253V;W370I; + + ++
136 Y27T;D74N;L253V;F254W;A255G; N348R;W370I;T384P; + + + +
153 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I ;T384P; + + + +
102 Y27T;D74N;L253V;N348R;W370I; D381R;T384P; ++ + +
95 Y27T;D74S;L253V;N348R;W370I; D381K; + + + +
1136 Y27T;D74G;F254W;W370I; ++ ++
122 Y27T;D74G;L253V;F254W;A255G; D381K; ++ + +
145 Y27T;D74G;L253V;D381F;T384P; + + ++
116 Y27T;L253V;N348R;W370I;T384P + + + +
154 Y27T;D74G;L253V;F254W;N348R; ++ ++
1137 Y27T;L253V;N348R;W370I;T384P + + + +
152 Y27T;D74G;L253V;N348R;W370I; ++ ++
162 Y27T;D74P;L253V;F254W;N348R; D381F;T384P; + + + +
237 Y27T;D74G;L253V;N348R;W370I; ++ ++
113 Y27T;D74G;A255G;W370I; ++ ++
1138 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I ;D381F;T384P; + + +
208 Y27T;F254W;A255G;N348R;W370I ;D381F;T384P; + + +
643 119/ 120 K128W;A255P;Q380P;G444K;N457 T;A517K;T560G; + +
1 Уровни увеличенной активности или избирательности определяли относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 12 и определяли следующим образом: ”+” > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 5 раз увеличены; ++ > чем в 5 раз, но меньше чем в 10 раз; +++ > чем в 10 раз, но меньше чем в 15 раз: ”++++” > чем в 15 раз.
-95043748
Пример 20. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 в присутствии фенилуксусной кислоты по сравнению с SEQ ID № 56 с высокой пропускной способностью
SEQ ID № 56 выбирали в качестве дополнительного родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 12. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но с использованием 400 мкл лизирующего буфера вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,2 М TRIS, 10% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата, 12,5 или 15 г/л фенилуксусной кислоты и 10 мкл НТР супернатанта (начальный рН перед добавлением лизата составлял 9,4). НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин в течение 3 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем добавляли 400 мкл воды и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об. /мин в течение 5 мин и разводили еще в 2 раза в воде перед загрузкой в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 56 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 56. Результаты представлены в табл. 20.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 20.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, __________________относительно SEQ ID № 56__________________
№ вариант а SEQ ID № (н./а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 56) Процент превращения ацилированием (FIOP)1 по участку В29 (относительно SEQ ID № 56)
615 T27S; + +
611 97/98 F57H; +
614 89/90 A67S; +
616 Al 6ОС; +
612 99/100 F57C; +
617 F57V; +
618 S704A; +
619 R373I; +
620 T379S; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 56 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза.
Пример 21. Аналитическое обнаружение инсулина и его ацилированных продуктов.
Данные, описанные в примерах 5-18, собирали с использованием аналитических способов в табл. 21.1, 21.2, 21.3, 21.4 и 21.5. Все способы, предусмотренные в настоящем описании, находят использование при анализе вариантов, получаемых с использованием настоящего изобретения. Однако не предусмотрено, что способы, описанные в настоящем описании, являются исключительными способами в применении к анализу вариантов, предусмотренных в настоящем описании и/или получаемых с использованием способов, предусмотренных в настоящем описании. Результаты, предстаывленные на фиг. 1, соответствуют порядку элюирования соединений для этих способов.
- 96 043748
Таблица. 21.1. Аналитический способ
Прибор Agilent HPLC серии 1200
Колонка Ascentis Express С18, 4,6 χ 100 или 150 мм, 2,7 мкМ
Подвижная фаза Градиент I (А: 0,05% TEA в воде; В: 0,05% TEA в MeCN)
Время мин) %А
0, 0 95
0, 1 70
8, 8,5 или 9 50
8,1, 8, 6 или 9,1 5
8,2, 8, 7, или 9,2 95
9, 9, 2 или 9,5 95
Время ( 0 7 или 8 7, 1 иль 9 или 1 Скорость потока Время прохождения Порядок элюирования продуктов Температура колонки Градиент II ((А: 0,05% TEA в воде; В: 0,05% TEA в MeCN) мин) %А 70 50 8,1 70 0 70 1,0 мл/мин ~10 мин Инсулин; Al-ацилированный инсулин; В2 9- ацилированный инсулин; Bl-ацилированный инсулин; ди—Al,В29—ацилированный инсулин; ди-А1,Bl- ацилированный инсулин; ди-В1,В29-ацилированный инсулин; три-А1, Bl,В29-ацилированный инсулин 40°С
Объем впрыска 5 мкл
Обнаружение УФ 218 нм и 280 нм Детектор: MWD (Agilent серии 1200) Щель=4 нм
Таблица 21.2. Аналитический способ
Прибор Agilent HPLC серии 1290
Колонка Waters Cortecs UPLC C18 2,1 χ 50 мм, 1,6 мкМ
Подвижная фаза Градиент MeCN) для (А: 0,05% образцов TEA в воде; В: 0, 05 % TEA в
Время ( мин) %А
0, 0 72
2,5 50
2,51-2, 7 10
2,71 72
3 72
Градиент MeCN) для (А: 0,05% TEA промывания в воде; В: 0, 05 % TEA в
Время ( мин) Isa
- 97 043748
0, 0 72
1,7 0
1,71-2 72
Скорость потока 0,9 мл/мин
Время прохождения 3 мин
Порядок элюирования продуктов Инсулин; А1-ацилированный инсулин; В2 9ацилированный инсулин; В1-ацилированный инсулин; ди—Al,В29—ацилированный инсулин; ди-А1,Blацилированный инсулин; ди-В1,В29-ацилированный инсулин; три-А1, Bl,В29-ацилированный инсулин
Температура колонки 40°С
Объем впрыска 0,5 мкл
Обнаружение УФ 218 нм и 280 нм Детектор: MWD (Agilent серии 1290); щель=4 нм; ширина пика > 0,1 мин; Эталон=360; BW=8
Таблица 21.3. Аналитический способ
Прибор Agilent HPLC серии 1200
Колонка Ascentis Express С18, 4,6 χ 100 или 150 мм, 2,7 мкМ
Подвижная фаза
Скорость потока 1,0 мл/мин
Время прохождения ~10 мин
Порядок элюирования продуктов Инсулин; Al-ацилированный инсулин; В2 9ацилированный инсулин; Bl-ацилированный инсулин; ди-А1,В29-ацилированный инсулин; ди-А1,Blацилированный инсулин; ди-В1,В29-ацилированный инсулин; три-А1,Bl,В29-ацилированный инсулин
Температура 40°С
колонки
Объем впрыска 5 мкл
Обнаружение УФ 218 нм и 280 нм Детектор: MWD (Agilent серии 1200); щель=4 нм; ширина пика > 0,1 мин; Эталон=360; BW=8
Таблица 21.4. Аналитический способ
Прибор Agilent HPLC серии 1290
Колонка Waters Cortecs UPLC С18 2,1 χ 50 мм, 1,6 мкМ
Подвижная фаза
Скорость потока 0,9 мл/мин
Время прохождения 3 мин
Порядок элюирования продуктов Инсулин; Al-ацилированный инсулин; В2 9ацилированный инсулин; Bl-ацилированный инсулин; ди—А1,В29-ацилированный инсулин; ди-А1,Blацилированный инсулин; ди-В1,В29-ацилированный инсулин; три-А1, Bl,В29-ацилированный инсулин
Температура колонки 40°С
Объем впрыска 0,5 мкл
Обнаружение УФ 218 нм и 280 Детектор: MWD ширина пика > 0 нм (Agilent ,1 мин; серии 1290); щель=4 нм; эталон=360; BW=8
- 98 043748
Таблица 21.5. Аналитический способ
Прибор Система Agilent UPLC 1290, оборудованная четырехкомпонентным насосом и DAD UV детектором, или система Thermo Vanquish UPLC, оборудованная DAD UV детектором.
Колонка Колонка Waters Cortecs UPLC C18 (50 χ 2,1 мм, 1, 6μ)
Подвижная фаза
Скорость потока 1,0 мл/мин
Время прохождения 3,25 мин
Порядок элюирования продуктов Фенилуксусная кислота, 0,32 минуты; инсулин, 0,78 минуты; А1-моноацилинсулин, 0,91 минуты; В29-моноацилинсулин, 0,95 минуты; Blмоно ацилинсулин, 1,02 минуты; А1,В29диацилинсулин, 1,09 минуты; А1, В1-диацилинсулин, 1,14 минуты; Bl,В29-диацилинсулин, 1,21 минуты; Al, Bl, В29-триацилинсулин, 1,3 8 минуты
Температура колонки 40°С
Объем впрыска 1,0 мкл
Обнаружение УФ обнаружение (λ=218 нм, щель=4 нм, ширина пика >0,1 мин, эталон=360 нм)
Пример 22. Усовершенствование ацилирования инсулина в положениях А1 и В2 9 по сравнению с SEQ ID № 160 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 160 выбирали в качестве дополнительного родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 18. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками, каждая содержала 200 мкл, состоящих из 0,5 М TRIS, рН 10,0, 20% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 5-10 мкл НТР супернатанта. НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 2 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 мин и загружали в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 160 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 160. Результаты представлены в табл. 22.1. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
- 99 043748
Таблица 22.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участкам А1 и В29, относительно SEQ ID № 160
№ вариан та SEQ ID № (н./а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 160) Процент превращения ацилированием (FIOP)1 по участкам А1 и В2 9 (относительно SEQ ID № 160) Процент избирательности ацилирования (FIOP)2 для участков А1 и В29 (относительно SEQ ID № 160)
1139 S251G; +
1140 N44S; + +
1141 N44R; +
1142 N4 4M; + +
1143 F254H; +
1144 N44Q; + +
1145 S251A; + +
1146 R317A; + +
1147 D348H; + +
1148 F254V; + +
1149 F254L; + +
115 S444A; + +
1151 I55V; +
1152 S444K; +
1153 S444R; + +
1154 N44D; + +
1155 N4 4E; + +
1156 R317W; + +
1157 N44T; + +
1158 F254C; + +
1159 S444L; + +
116 N4 4H; + +
1161 N44I; + +
1162 А3 9Т; + +
1163 F254T; + +
1164 F254G; + +
1165 167/16 8 K172R; D484T + +
1166 F254Y; + +
1167 S444T; + +
1168 F254S; ++ +
1169 169/17 S251T; ++ +
117 171/17 2 А466М;А47Т;К723 Е; + + +
1171 173/17 4 El 85D;А279Р;Q38 Р;А466М; + + +
1172 175/17 6 F254W; + + + + +
1173 177/17 8 F2 54A; + + + + +
1174 179/18 A3 9S; +++ ++
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 160 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 3,0 раза; +++ > чем в 3,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза; ++++ > чем в 5,0 раза.
2 Уровни увеличенной избирательности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 160 и определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем в 2,0 раза, но меньше чем в 3,0 раза; +++ > чем в 3,0 раза, но меньше чем в 5,0 раза; ++++ > чем в 5,0 раза.
- 100 043748
Пример 23. Усовершенствование ацилирования инсулина в положении В29 по сравнению с SEQ ID № 100 в высокопропускном скрининге
SEQ ID № 100 выбирали в качестве следующего родительского фермента на основе результатов, описанных в примере 13. Библиотеки сконструированных генов получали с использованием луночных приемов (например, насыщающий мутагенез и рекомбинация предварительно идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в НТР, как описано в примере 2, а растворимые лизаты создавали, как описано в примере 3, но с использованием 400 мкл лизирующего буфера, вместо 200 мкл.
НТР реакции осуществляли в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Каждая реакционная лунка содержала 200 мкл 0,5 М TRIS, 20% ацетонитрила, 50 г/л инсулина, 17 г/л метилфенилацетата и 40 мкл НТР супернатанта (начальный рН перед добавлением лизата=10). НТР планшеты инкубировали во встряхивателях Thermotron® (амплитуда 3 мм, модель № AJ185, Infors) при 30°С, 100 об./мин, в течение 5 ч. Реакции гасили с использованием 200 мкл ацетонитрила и перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Добавляли 400 мкл воды и планшеты снова перемешивали в течение 5 мин с использованием настольного встряхивателя. Затем планшеты центрифугировали на 4000 об./мин в течение 5 минут и разбавляли еще в 2 раза в воде перед загрузкой в HPLC для анализа.
Процент превращения относительно SEQ ID № 100 (процент превращения FIOP) вычисляли как процент превращения продукта, образуемого вариантом, относительно процента превращения, обеспечиваемого с помощью SEQ ID № 100, и он показан далее в таблице. Процент превращения количественно определяли делением площади пика продукта на сумму площадей пиков субстрата, продукта и примесей/побочного продукта, как наблюдали по HPLC анализу.
Таблица 23.1. Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, _____________ относительно SEQ ID № 100________________
№ вариан та SEQ ID № (н./а. к. ) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 100) Процент превращения ацилированием (FIOP)1 по участку В29 (относительно SEQ ID № 100)
1175 195/196 N444S;N457Т;А466М;D709Е; + +
1176 201/202 N333A;АЗ 62V;N457Т;Y616Т; + +
1177 193/194 A255G;K390Q;Y616T;S675E; + +
1178 199/200 N333A;N444S;N457T;Y616T;D 709E; + +
1179 A255G;L557G;Y616T; + +
1180 181/182 A255G;L557G;E561P;Y616T;S 67 5E; + +
1181 F254H;A255G;L557G;Y616T; + +
1182 A255G;R373N;Y616T; + +
1183 R373N;L557G;E561P;Y616T;S 67 5E; + +
1184 Al60T;A255G;L557G;Y616T; + +
1185 L557G;Y616T;S675E; + +
1186 Al60T;A255G;КЗ90Q;L557G;S 67 5E; + +
1187 K390Q;Y616T; + +
1188 C57H;A255G;КЗ69D;КЗ90Q; + +
1189 N444S;N457T;D709E; + +
1190 L557G;Y616T; +
1191 K390Q;L557G; +
1192 N333A;A362V;T384E;Y616T; +
1193 F254H;A255G;L557G;S675E; +
1194 C57H;A255G;L557G;S675E; +
1195 QI57S;R316H;A3 62V;КЗ90A; N 444S;T560G; +
1196 A2 8 V;P2 4 9A;T5 6 0G;D7 0 9E; +
1197 K390Q; +
- 101 043748
1198 С57Н;А255G;L557G;Е561Р;S6 7 5Е; +
1199 Al 60Т;L557G;Y616Т; +
1200 L256Y;N333A;N444S;N457Т;Т 560G; +
1201 A255G;R373N; +
1202 Y616T; +
1203 R373N;E561P; +
1204 КЗ69D;L557G;Е561Р; +
1205 L557G;S675E; +
1206 С57Н;A255G;L557G; +
1207 А160Т;F254H;K390Q;L557G;Y 61 6Т; +
1208 А255G;КЗ69D;R373Ν;S675Е; +
1209 V56L;A255G;Y616T; +
1210 N333A;N444S;Т560G; +
1211 C57H;Y616T; +
1212 F254H;A255G;КЗ69D;КЗ90Q; +
1213 L557G; +
1214 КЗ69D;Е561Р;S675Е; +
1215 C57H;A255G; +
1216 N333A;N444S;Т560G;D709Е; +
1217 V56L;L557G;Y616Т; +
1218 V5 6L;С57Н;A255G;L557G;Е56 1Р; +
1219 L256Y;N333A;Y616T;D709E; +
1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 100, который демонстрировал превращение 33,9±1,4%. Усовершенствования эффективности определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем 2.
- 102 043748
Таблица 23.2
Активность и избирательность вариантов, ацилирующих по участку В29, относительно SEQ ID № 100
№ варианта SEQ ID № (н./а. к.) Различия аминокислот (относительно SEQ ID № 100) Процент превращения
ацилирование м (FIOP) 1 по участку В29 (относительн о SEQ ID № 100)
1220 189/190 А28Т;L557V;К723D; +
1221 187/188 С57Н;A255G;L557G;Y616T;S675 Е; +
1222 197/198 АЗ 62V;N444S;N457Т; +
1223 185/186 C57H;A255G;Y616T;S675E; +
1224 183/184 С57Н;F254H;A255G;L557G;Y616 Т; +
1225 191/192 A28T;C57V;K723D; +
1226 Е561Р;Y616T; +
1227 A255G;S675E; +
1228 N333A;Н348N;АЗ 62V;N444S;T56 0G;Y616T; +
1229 V56L;C57H;F254H;A255G;R373N ;Y616T;S675E; +
1230 F254H;A255G;L557G;S675E; +
1231 Y616T;S675E; +
1232 V56L;C57H;E561P;Y616T;S675E +
1233 N333A;A3 62 V;N444S;D709E; +
1234 A28T;Q112D; +
1235 L557V;W619S;K723D; +
1236 L557G;Y616T; +
1237 C57H;F254H;A255G;S675E; +
1238 C57V;QI12D;QI57S;Al 60C;L557 V;L623T;K723D; +
1239 C57H;L557G;Y616T; +
1240 A2 8T;C57V;L557V; +
1241 A362V;N444S;D709E; +
1242 Y616T; +
- 103 -

Claims (6)

1243 L557V;W619S;L62ЗТ; +
1244 Q112D;A160C;W619S; +
1245 A255G; +
1246 Р249А;АЗ 62V;N444S;А466М;D70 9Е; +
1247 D484T;S704A; +
1248 F254Н;КЗ90Q;Y616Т; +
1249 QI12D;QI57S;L557V;W619S;L62 ЗТ; +
1250 D484Т;L557V;L62ЗТ; +
1251 QI12D;QI57S;L62ЗТ; +
1252 С57Н;Al60Т;А255G;Y616T;S675 Е; +
1253 L557V;L62ЗТ;К723D; +
1254 С57Н;A255G;L557G; +
1255 L623T; +
1256 D484T;L623T; +
1257 QI12D;Al60С;D484Т;L557V;W61 9S;L623T;K723D; +
1258 АЗ 62 V; +
1259 С57Н;F254H;A255G; +
1260 С57Н;R373N;D484Т;L557G;S675 Е; +
1261 С57Н;R373N;L557G;S675Е; +
1262 C57H;A255G;R373N; +
1263 P249A;R316H;A362V;N444S;A46 6М;Y616T; +
1264 L557V;K723D; + 1 Уровни увеличенной активности устанавливали относительно эталонного полипептида из SEQ ID № 100, который демонстрировал превращение 52,1 ±2,2%. Усовершенствования эффективности определяли следующим образом: + > чем в 1,2 раза, но меньше чем в 2,0 раза увеличены; ++ > чем 2.
Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, цитируемые в этой заявке, включены, таким образом, посредством ссылки во всей совей полноте для всех целей в той же степени, как если бы каждую отдельную публикацию, патент, патентную заявку или другой документ индивидуально указывали для включения по ссылке для всех целей.
Хотя проиллюстрированы и описаны конкретные варианты осуществления, следует принимать во внимание, что можно выполнять различные изменения, не отступая от сущности и объема изобретения (й).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Сконструированная ацилаза пенициллина G, способная к ацилированию инсулина в положении В29, где полипептидная последовательность указанной ацилазы пенициллина G по меньшей мере на 97, 98, 99% или больше идентична SEQ ID № 100 и где сконструированная ацилаза пенициллина G имеет ферментативную активность, составляющую по меньшей мере 1,5 крат ферментативной активности сконструированной ацилазы пенициллина G с последовательностью SEQ ID № 4.
2. Сконструированная ацилаза пенициллина G по п.1, где указанная ацилаза пенициллина G содержит SEQ ID № 100, 24, 40, 56, 82, 108, 110, 154 или 160.
3. Сконструированная ацилаза пенициллина G по п.1 или 2, где указанная ацилаза пенициллина G имеет ферментативную активность, составляющую 2, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100 или более крат ферментативной активности сконструированной ацилазы пенициллина G с последовательностью SEQ ID № 4.
4. Сконструированная ацилаза пенициллина G по любому из пп.1-3, где указанная сконструированная ацилаза пенициллина G содержит гистидиновую метку.
5. Сконструированная ацилаза пенициллина G по п.4, где указанная гистидиновая метка присутствует на С-конце указанной сконструированной ацилазы пенициллина G, необязательно, где указанная ацилаза пенициллина G содержит полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID № 100 и SEQ ID № 110.
6. Сконструированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая сконструированную ацилазу пенициллина G по любому из пп.1-5.
- 104 -
EA201991637 2017-01-05 2018-01-04 Ацилазы пенициллина g EA043748B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/442,810 2017-01-05
US62/472,055 2017-03-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043748B1 true EA043748B1 (ru) 2023-06-19

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11180747B2 (en) Variant penicillin-G acylases
US11965192B2 (en) Penicillin-G acylases
US12084697B2 (en) Penicillin-G acylases
US20230272363A1 (en) Penicillin-g acylases
EA043748B1 (ru) Ацилазы пенициллина g