EA043690B1

EA043690B1 - IMMUNOMODULATING FUSION PROTEINS

Info

Publication number: EA043690B1
Application number: EA202090838
Authority: EA
Inventors: Кристофер ЛАРСОН; Тони Р. Рид; Брайан Т. Оронски
Original assignee: Эписентарикс, Инк.
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2023-06-13

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications

Настоящая заявка испрашивает преимущества и приоритет предварительной заявки на патент СШАThis application claims the benefit and priority of a U.S. provisional patent application.

62/564,145, поданной 27 сентября 2017 года, которая настоящим полностью включена в настоящий документ посредством отсылки.62/564,145, filed September 27, 2017, which is hereby incorporated by reference in its entirety.

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности, иммунологии и слитых белков, например, слитых белков цитокиновых рецепторов.The invention relates to the field of molecular biology, in particular immunology and fusion proteins, for example, cytokine receptor fusion proteins.

Уровень техникиState of the art

Цитокины представляют собой небольшие секретируемые клеточные сигнальные белки, которые обладают разнообразными активностями, включающими регуляцию роста и дифференцировки клеток и модуляцию иммунной функции. Цитокины, цитокиновые рецепторы и некоторые другие иммуномодулирующие белки применяли в качестве терапевтических средств для лечения различных заболеваний. Однако введение таких белков, например, подкожным или внутрисосудистым путем, может приводить к неправильной клеточной и внеклеточной локализации, что ограничивает терапевтическую активность и/или повышает риск токсического действия.Cytokines are small secreted cell signaling proteins that have diverse activities including regulation of cell growth and differentiation and modulation of immune function. Cytokines, cytokine receptors, and several other immunomodulatory proteins have been used as therapeutic agents for the treatment of various diseases. However, administration of such proteins, for example by the subcutaneous or intravascular route, may result in improper cellular and extracellular localization, which limits therapeutic activity and/or increases the risk of toxicity.

IL-10 является гомодимерным цитокином с иммунорегуляторными свойствами, продуцируемым клетками, включая активированные Th2-клетки, В-клетки, кератиноциты, моноциты и макрофаги (Moore et al. (1993) ANNU. REV. IMMUNOL. 11:165). IL-10 ингибирует активацию и эффекторные функции множества клеток, включая Т-клетки, моноциты и макрофаги. В частности, IL-10 ингибирует синтез цитокинов, включая синтез IL-1, IFN-γ и ФНО, такими клетками, как Th1-клетки, NK-клетки, моноциты и макрофаги (Fiorentino et al. (1989) J. EXP. MED. 170:2081-2095; Fiorentino et al. (1991) J. IMMUNOL. 146:3444; Hsu et al. (1992) INT. IMMUNOL. 4:563; Hsu et al. (1992) INT. IMMUNOL. 4:563; D'Andrea et al. (1993) J. EXP. MED. 178:1041; de Waal Malefyt et al. (1991) J. EXP. MED. 174:915; Fiorentino et al. (1991) J. IMMUNOL. 147:3815). Множество патогенов, включая внутриклеточные патогены, вызывают продукцию IL-10, чтобы замедлить или приостановить эффективное удаление патогена иммунной системой (Moore et al. (1993), выше).IL-10 is a homodimeric cytokine with immunoregulatory properties produced by cells including activated Th2 cells, B cells, keratinocytes, monocytes and macrophages (Moore et al. (1993) ANNU. REV. IMMUNOL. 11:165). IL-10 inhibits the activation and effector functions of a variety of cells, including T cells, monocytes, and macrophages. In particular, IL-10 inhibits the synthesis of cytokines, including the synthesis of IL-1, IFN-γ and TNF, by cells such as Th1 cells, NK cells, monocytes and macrophages (Fiorentino et al. (1989) J. EXP. MED 170:2081-2095; Fiorentino et al. (1991) J. IMMUNOL. 146:3444; Hsu et al. (1992) INT. IMMUNOL. 4:563; Hsu et al. (1992) INT. IMMUNOL. 4: 563; D'Andrea et al. (1993) J. EXP. MED. 178:1041; de Waal Malefyt et al. (1991) J. EXP. MED. 174:915; Fiorentino et al. (1991) J. IMMUNOL 147:3815). A variety of pathogens, including intracellular pathogens, induce the production of IL-10 to slow or stop efficient clearance of the pathogen by the immune system (Moore et al. (1993), supra).

Несмотря на успехи, достигнутые в настоящее время в лечении опосредованных IL-10 нарушений, существует потребность в улучшенной терапии для лечения таких нарушений.Despite the progress made to date in the treatment of IL-10-mediated disorders, there is a need for improved therapies to treat such disorders.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Изобретение частично основано на открытии линкерных последовательностей, которые улучшают функцию слитых белков, например, слитых белков цитокиновых рецепторов, например, слитых белков рецептора IL-10 (IL-10R), например, слитых белков альфа-субъединицы рецептора IL-10 (IL-10RA), например, ловушек IL-10. Линкерные последовательности могут позволять лигандсвязывающей части слитого белка (например, цитокинового рецептора) оптимально связываться с лигандом (например, цитокином), обеспечивать временную и пространственную колокализацию двух или более компонентов слитого белка (например, двух субъединиц димерного цитокина), оптимизировать экспрессию с вектора экспрессии (например, вирусного вектора), уменьшать иммуногенность или обеспечивать сайт расщепления, который позволяет высвобождать компонент слитого белка. Например, линкерные последовательности могут обеспечивать достаточную гибкость, чтобы позволить лигандсвязывающему домену цитокинового рецептора принимать нативную конформацию в рамках слитого белка и минимизировать потенциальную иммуногенность слитого белка для применения в качестве терапевтического средства.The invention is based in part on the discovery of linker sequences that improve the function of fusion proteins, e.g., cytokine receptor fusion proteins, e.g., IL-10 receptor (IL-10R) fusion proteins, e.g., IL-10 receptor alpha (IL-10RA) fusion proteins ), such as IL-10 traps. Linker sequences may allow the ligand binding portion of a fusion protein (e.g., a cytokine receptor) to optimally bind to a ligand (e.g., a cytokine), provide temporal and spatial colocalization of two or more components of the fusion protein (e.g., two subunits of a dimeric cytokine), optimize expression from an expression vector ( for example, a viral vector), reduce immunogenicity or provide a cleavage site that allows the release of a component of the fusion protein. For example, linker sequences may provide sufficient flexibility to allow the ligand binding domain of a cytokine receptor to adopt a native conformation within the fusion protein and minimize the potential immunogenicity of the fusion protein for use as a therapeutic agent.

В одном аспекте изобретения предложен выделенный слитый белок, который включает, например, в ориентации от N- к С-концу: первую часть внеклеточного домена, трансмембранного домена или внутриклеточного домена цитокина, цитокинового рецептора или иммуномодулирующего белка; аминокислотный линкер; и по меньшей мере одно из второй части внеклеточного домена, трансмембранного домена или внутриклеточного домена цитокина, цитокинового рецептора или иммуномодулирующего белка; шарнирную область иммуноглобулина (Ig); и Fc-домен иммуноглобулина (Ig). В некоторых вариантах осуществления линкер включает от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает часть рецептора IL-10, например, человеческого рецептора IL-10, например, IL-10RA.In one aspect of the invention, an isolated fusion protein is provided that includes, for example, in N- to C-terminal orientation: the first portion of an extracellular domain, transmembrane domain, or intracellular domain of a cytokine, cytokine receptor, or immunomodulatory protein; amino acid linker; and at least one of a second portion of an extracellular domain, transmembrane domain, or intracellular domain of a cytokine, cytokine receptor, or immunomodulatory protein; immunoglobulin (Ig) hinge region; and the Fc domain of immunoglobulin (Ig). In some embodiments, the linker includes from about 5 to about 40 amino acid residues. In some embodiments, the fusion protein includes a portion of an IL-10 receptor, such as a human IL-10 receptor, such as IL-10RA.

В другом аспекте изобретения предложен выделенный слитый белок, который включает, в ориентации от N- к С-концу: растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора; аминокислотный линкер; шарнирную область иммуноглобулина (Ig); и Fc-домен иммуноглобулина (Ig); где линкер включает от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления цитокиновый рецептор является рецептором IL-10, например, человеческим рецептором IL-10, например, IL-10RA.In another aspect of the invention, there is provided an isolated fusion protein that includes, in N- to C-terminal orientation: a soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor; amino acid linker; immunoglobulin (Ig) hinge region; and Fc domain of immunoglobulin (Ig); wherein the linker comprises from about 5 to about 40 amino acid residues. In some embodiments, the cytokine receptor is an IL-10 receptor, such as a human IL-10 receptor, such as IL-10RA.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков аминокислотный линкер может включить, например, от приблизительно 5 до приблизительно 15, от приблизительно 5 до приблизительно 20, от приблизительно 5 до приблизительно 30, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 10 до приблизительно 20, от приблизительно 10 до приблизительно 30, от приблизительно 10 до приблизительно 40, от приблизительно 15 до приблизительно 20, от приблизительно 15 до приблизительно 30 или от приблизительно 15 до приблизительно 40 аминокислотных остатков.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the amino acid linker may include, for example, about 5 to about 15, about 5 to about 20, about 5 to about 30, about 10 to about 15, about 10 to about 20 , from about 10 to about 30, from about 10 to about 40, from about 15 to about 20, from about 15 to about 30, or from about 15 to about 40 amino acid residues.

- 1 043690- 1 043690

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков последовательность аминокислотного линкера получена из эндогенного белка человека, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, альбумина или казеина. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер включает С-концевую часть СН1 домена иммуноглобулина (Ig), например, СН1 домен IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер включает С-концевую часть СН1 домена IgG1, например, аминокислотный линкер включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 57, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the amino acid linker sequence is derived from an endogenous human protein, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, albumin, or casein. In some embodiments, the amino acid linker includes the C-terminal portion of the CH1 domain of an immunoglobulin (Ig), such as the CH1 domain of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM. In some embodiments, the amino acid linker comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, and SEQ ID NO: 57. In some embodiments the amino acid linker includes the C-terminal portion of the CH1 domain of IgG1, for example, the amino acid linker includes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 57, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков аминокислотный линкер включает последовательность, полученную из цитокина, сигнальной молекулы, иммуномодулирующего белка или пептида или биологически активного пептида.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the amino acid linker includes a sequence derived from a cytokine, signaling molecule, immunomodulatory protein or peptide, or biologically active peptide.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков аминокислотный линкер включает сайт расщепления, например, сайт протеолитического расщепления, например, сайт протеолитического расщепления, расщепляемый протеазой, присутствующей в эндоплазматическом ретикулуме или аппарате Гольджи эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления сайт протеолитического расщепления является сайтом расщепления фурином, например, сайтом расщепления фурином, включающим последовательность RX1X2R (SEQ ID NO: 50), где X1 является любой аминокислотой, а Х2 является Lys или Arg, например, сайтом расщепления фурином, включающим последовательность RAKR (SEQ ID NO: 51). В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков аминокислотный линкер протеолитически стабилен в организме млекопитающего или в растении.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the amino acid linker includes a cleavage site, such as a proteolytic cleavage site, such as a proteolytic cleavage site cleaved by a protease present in the endoplasmic reticulum or Golgi apparatus of a eukaryotic cell. In some embodiments, the proteolytic cleavage site is a furin cleavage site, for example, a furin cleavage site comprising the sequence RX1X2R (SEQ ID NO: 50), where X1 is any amino acid and X2 is a Lys or Arg, for example, a furin cleavage site comprising the sequence RAKR (SEQ ID NO: 51). In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the amino acid linker is proteolytically stable in a mammal or plant.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора является растворимой частью внеклеточного домена человеческого IL-10R, например, IL-10RA. Например, в некоторых вариантах осуществления растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или аминокислотные остатки 22-229 из SEQ ID NO: 12.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor is the soluble portion of the extracellular domain of human IL-10R, such as IL-10RA. For example, in some embodiments, the soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or amino acid residues 22-229 of SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков слитый белок включает одно или более из IL-10, TGF-β, рецептора TGFe, например, рецептора TGFe II типа (TeRII), CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL-23A/p19, IL27A/p28, IL27B/EBI3, IL-15, CD154, CD70, ФНО-альфа, CD86, CD137, CD137L, BORIS/CTCFL, FGF, ICAM, IL-24, ГМ-КСФ, MAGE, NY-ESO-1, ангиостатина, эндостатина, ацетилхолина, интерферона-гамма, DKK1/Wnt, p53, Ox40L, ГМ-КСФ, слитого белка рецептора IL-15, GITRL, CD40L, CD70, секретируемого флагеллина, IL-12, тимидинкиназы, тяжелой цепи или легкой цепи антитела против PD-1, тяжелой цепи или легкой цепи антитела против PD-L1, и тяжелой цепи или легкой цепи антитела против CTLA-4 или их функционального фрагмента.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the fusion protein includes one or more of IL-10, TGF-β, TGFe receptor, e.g., TGFe receptor type II (TeRII), CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-2 , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL-23A/p19, IL27A/p28, IL27B/EBI3, IL -15, CD154, CD70, TNF-alpha, CD86, CD137, CD137L, BORIS/CTCFL, FGF, ICAM, IL-24, GM-CSF, MAGE, NY-ESO-1, angiostatin, endostatin, acetylcholine, interferon-gamma , DKK1/Wnt, p53, Ox40L, GM-CSF, IL-15 receptor fusion protein, GITRL, CD40L, CD70, secreted flagellin, IL-12, thymidine kinase, anti-PD-1 antibody heavy chain or light chain, heavy chain or light chain an anti-PD-L1 antibody chain, and an anti-CTLA-4 antibody heavy chain or light chain or a functional fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков шарнирная область Ig выбрана из шарнирной области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM, и Fc-домен Ig выбран из Fc-домена IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область Ig и Fc-домен вместе включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления Fc Ig, шарнирная область Ig и CH1 домен Ig получены из одного иммуноглобулина.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the Ig hinge region is selected from the hinge region of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, and IgM, and the Ig Fc domain is selected from the Fc domain of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE and IgM. In some embodiments, the Ig hinge region and the Fc domain together comprise an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the Ig Fc, Ig hinge region, and Ig CH1 domain are derived from a single immunoglobulin.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков слитый белок включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:58.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the fusion protein includes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the fusion protein includes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, and SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the fusion protein includes amino acid sequence SEQ ID NO:58.

В некоторых вариантах осуществления любого из предыдущих слитых белков слитый белок включает аминокислотную последовательность, обладающую больше чем 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58.In some embodiments of any of the preceding fusion proteins, the fusion protein includes an amino acid sequence having greater than 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity to a sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58.

В другом аспекте изобретения предложен димерный цитокинсвязывающий белок, включающий два любых из предыдущих слитых белков, ковалентно связанных друг с другом, где каждый слитый белок включает внеклеточный домен цитокинового рецептора, и где два внеклеточных домена вместе определяют связывающий сайт для цитокина.In another aspect of the invention, there is provided a dimeric cytokine binding protein comprising any two of the preceding fusion proteins covalently linked to each other, wherein each fusion protein includes an extracellular domain of a cytokine receptor, and wherein the two extracellular domains together define a binding site for the cytokine.

В другом аспекте изобретения предложена нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную по- 2 043690 следовательность, кодирующую любой из предыдущих слитых белков.Another aspect of the invention provides a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding any of the preceding fusion proteins.

В другом аспекте изобретения предложен вектор экспрессии, включающий любую из предыдущих нуклеиновых кислот.In another aspect of the invention, an expression vector is provided comprising any of the preceding nucleic acids.

В другом аспекте изобретения предложена клетка-хозяина, включающая любой из предыдущих векторов экспрессии. В другом аспекте изобретения предложен способ получения слитого белка, включающий выращивание клетки-хозяина в условиях, позволяющих экспрессировать слитый белок, и очистку слитого белка. В другом аспекте изобретения предложен способ экспрессии слитого белка в клеткемишени, включающий контакт клетки с эффективным количеством любого из предыдущих векторов экспрессии. В некоторых вариантах осуществления слитый белок расщепляется посттрансляционно с образованием двух полипептидных цепей.In another aspect of the invention, a host cell is provided that includes any of the previous expression vectors. In another aspect of the invention, a method for producing a fusion protein is provided, comprising growing a host cell under conditions allowing expression of the fusion protein and purifying the fusion protein. In another aspect of the invention, a method of expressing a fusion protein in a target cell is provided, comprising contacting the cell with an effective amount of any of the preceding expression vectors. In some embodiments, the fusion protein is cleaved post-translationally to produce two polypeptide chains.

В другом аспекте любой из предыдущих слитых белков или векторов экспрессии может применяться, например, для снижения цитокиновой активности у субъекта, осуществляя, таким образом, лечение различных медицинских показаний, которые опосредованы цитокином, например, IL-10. В другом аспекте любой из предыдущих слитых белков или векторов экспрессии может применяться для ингибирования пролиферации опухолевых клеток in vitro и/или in vivo, ингибирования роста опухоли у нуждающегося в этом субъекта или лечения рака у нуждающегося в этом субъекта. Субъект может быть, например, животным, например, млекопитающим, например, человеком, например, пациентом педиатрического профиля. Например, при введении субъекту-человеку, имеющему рак, слитые белки или векторы экспрессии ингибируют или уменьшают рост опухоли, или уменьшают опухолевую нагрузку у субъекта.In another aspect, any of the previous fusion proteins or expression vectors can be used, for example, to reduce cytokine activity in a subject, thereby treating various medical conditions that are mediated by a cytokine, for example, IL-10. In another aspect, any of the preceding fusion proteins or expression vectors can be used to inhibit tumor cell proliferation in vitro and/or in vivo, inhibit tumor growth in a subject in need thereof, or treat cancer in a subject in need thereof. The subject may be, for example, an animal, such as a mammal, such as a human, such as a pediatric patient. For example, when administered to a human subject having cancer, the fusion proteins or expression vectors inhibit or reduce tumor growth or reduce tumor burden in the subject.

В некоторых вариантах осуществления рак может быть выбран из меланомы, плоскоклеточной карциномы кожи, базальноклеточной карциномы, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака анального канала, рака шейки матки, немелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы, мелкоклеточного рака легкого, почечно-клеточной карциномы, рака предстательной железы, гастроэзофагеального рака, рака толстой и прямой кишки, рака яичка, рака мочевого пузыря, рака яичника, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, холангиокарциномы, рака головного мозга и центральной нервной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы (например, карциномы паращитовидной железы), рака эндометрия, нейроэндокринного рака, лимфомы (например, лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы), лейкоза, карциномы из клеток Меркеля, желудочно-кишечных стромальных опухолей, множественной миеломы, рака матки, саркомы, рака почки, рака глаза, рака поджелудочной железы и герминогенного рака (например, герминогенного рака яичника). В некоторых вариантах осуществления рак может быть выбран из лейкоза, рака молочной железы, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака головного мозга, рака кожи, рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака головы и шеи и лейкоза.In some embodiments, the cancer may be selected from melanoma, squamous cell carcinoma of the skin, basal cell carcinoma, head and neck cancer, breast cancer, anal cancer, cervical cancer, non-small cell lung cancer, mesothelioma, small cell lung cancer, renal cell carcinoma, prostate cancer, gastroesophageal cancer, colorectal cancer, testicular cancer, bladder cancer, ovarian cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, brain and central nervous system cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer (eg, carcinoma parathyroid), endometrial cancer, neuroendocrine cancer, lymphoma (eg, Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma), leukemia, Merkel cell carcinoma, gastrointestinal stromal tumors, multiple myeloma, uterine cancer, sarcoma, kidney cancer, eye cancer, pancreatic cancer gland and germ cell cancer (eg germ cell ovarian cancer). In some embodiments, the cancer may be selected from leukemia, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, colon and rectal cancer, cancer stomach, head and neck cancer and leukemia.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок или вектор экспрессии применяют в комбинации с одной или более терапиями, выбранными из хирургии, лучевой терапии, химиотерапии, иммунотерапии, гормональной терапии и виротерапии. В некоторых вариантах осуществления слитый белок или вектор экспрессии применяют в комбинации с лимфоцитом, например, Т-клеткой, например, CAR Тклеткой.In some embodiments, the fusion protein or expression vector is used in combination with one or more therapies selected from surgery, radiation therapy, chemotherapy, immunotherapy, hormonal therapy, and virotherapy. In some embodiments, the fusion protein or expression vector is used in combination with a lymphocyte, such as a T cell, such as a CAR T cell.

Любой из предыдущих слитых белков или векторов экспрессии также может применяться для лечения воспалительного заболевания или инфекции у нуждающегося в этом субъекта.Any of the previous fusion proteins or expression vectors may also be used to treat an inflammatory disease or infection in a subject in need thereof.

Эти и другие аспекты и преимущества изобретения проиллюстрированы следующими фигурами, подробным описанием и формулой изобретения.These and other aspects and advantages of the invention are illustrated by the following figures, detailed description and claims.

Описание фигурDescription of the figures

Изобретение может быть в более полной мере понято при обращении к следующим чертежам.The invention can be more fully understood by reference to the following drawings.

На фиг. 1А показана схема димерного цитокинового рецептора на поверхности клетки (слева), антитела (в середине) и рецептор-Fc слитой конструкции, которая оптимально связывает цитокин-мишень (справа). На фиг. 1В показана рецептор-Fc слитая конструкция, например, цитокиновая ловушка, оптимальное связывание которой с цитокином-мишенью стерически затруднено (слева), или которая принимает оптимальную связывающую конфигурацию (справа).In fig. 1A shows a diagram of a dimeric cytokine receptor on the cell surface (left), an antibody (middle), and a receptor-Fc fusion construct that optimally binds the target cytokine (right). In fig. 1B shows a receptor-Fc fusion construct, such as a cytokine trap, that is sterically hindered from optimally binding to a target cytokine (left) or that adopts an optimal binding configuration (right).

На фиг. 2 показано выравнивание аминокислотных последовательностей доменов СН1 (сверху) и доменов СН2 (снизу) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM человека.In fig. Figure 2 shows the alignment of the amino acid sequences of the CH1 domains (top) and CH2 domains (bottom) of human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE and IgM.

На фиг. 3 показан Вестерн-блот фосфорилированного Stat3 после обработки репортерных клеток IL-10 и/или IL-10RA слитыми белками IL-10R-IgG и IL-10R-Fc, как указано. Общий Stat3 использовали в качестве контроля нанесения. Активность IL-10 была заметно снижена при воздействии IL-10R-IgG по сравнению с IL-10R-Fc.In fig. 3 shows a Western blot of phosphorylated Stat3 after treatment of IL-10 and/or IL-10RA reporter cells with IL-10R-IgG and IL-10R-Fc fusion proteins as indicated. Total Stat3 was used as an application control. IL-10 activity was markedly reduced by IL-10R-IgG compared with IL-10R-Fc.

Подробное описаниеDetailed description

В изобретении предложен рекомбинантный слитый белок для применения при лечении различных заболеваний, например, при ингибировании пролиферации опухолевой клетки, ингибировании роста опухоли, лечении рака, лечении воспалительного состояния или лечении инфекции у субъекта. Примерные слитые белки содержат: первую часть внеклеточного домена, трансмембранного домена или внутриклеточного домена цитокина, цитокинового рецептора или иммуномодулирующего белка; аминокислотный линкер; и по меньшей мере одно из второй части внеклеточного домена, трансмембранного доменаThe invention provides a recombinant fusion protein for use in the treatment of various diseases, for example, in inhibiting tumor cell proliferation, inhibiting tumor growth, treating cancer, treating an inflammatory condition, or treating an infection in a subject. Exemplary fusion proteins comprise: the first portion of an extracellular domain, transmembrane domain, or intracellular domain of a cytokine, cytokine receptor, or immunomodulatory protein; amino acid linker; and at least one of a second portion of the extracellular domain, a transmembrane domain

- 3 043690 или внутриклеточного домена цитокина, цитокинового рецептора или иммуномодулирующего белка; шарнирную область иммуноглобулина (Ig); или Fc-домен иммуноглобулина (Ig). Предполагается, что первая и вторая части могут быть частями одного и того же белка или частями разных белков, и, даже если они являются частями одного белка, первая и вторая части могут быть разными частями одного белка. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислотных остатков. Примерные слитые белки согласно изобретению включают цитокиновые ловушки.- 3 043690 or intracellular domain of a cytokine, cytokine receptor or immunomodulatory protein; immunoglobulin (Ig) hinge region; or Fc domain of immunoglobulin (Ig). It is contemplated that the first and second portions may be portions of the same protein or portions of different proteins, and even if they are portions of the same protein, the first and second portions may be different portions of the same protein. In some embodiments, the linker contains from about 5 to about 40 amino acid residues. Exemplary fusion proteins of the invention include cytokine decoys.

Цитокиновая ловушка, например, ловушка IL-10, является молекулой, содержащей растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора, например, рецептора IL-10 (IL-10R), например, альфа-субъединицу рецептора IL-10 (IL-10RA), предназначенной для связывания или иного блокирования цитокина-мишени. В цитокиновой ловушке внеклеточный домен цитокинового рецептора может быть слит с шарнирной областью иммуноглобулина (Ig) и Fc-доменом иммуноглобулина (Ig), что может обеспечивать, например, повышенную стабильность, Fc-эффекторные функции и/или мультимеризацию, например, димеризацию. Димеризация, которую обеспечивает слияние шарнирной области Ig и Fcдомена Ig, особенно выгодна для цитокиновых рецепторов, которые существуют в виде димерных рецепторных комплексов на клеточной поверхности, таких как, например, TpRII.A cytokine decoy, e.g., IL-10 decoy, is a molecule containing a soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor, e.g., IL-10 receptor (IL-10R), e.g., IL-10 receptor alpha subunit (IL-10RA), designed to binding or otherwise blocking a target cytokine. In a cytokine trap, the extracellular domain of a cytokine receptor may be fused to an immunoglobulin (Ig) hinge region and an immunoglobulin (Ig) Fc domain, which may provide, for example, increased stability, Fc effector functions, and/or multimerization, such as dimerization. The dimerization provided by the fusion of the Ig hinge region and the Ig Fc domain is particularly beneficial for cytokine receptors that exist as dimeric receptor complexes on the cell surface, such as TpRII.

Обычные цитокиновые ловушки, например, ловушки IL-10, содержат две полипептидных цепи, причем каждая полипептидная цепь включает растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора, слитую с шарнирной областью Ig и Fc-доменом Ig. Растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора, как правило, сливают непосредственно с шарнирной областью Ig без какойлибо промежуточной последовательности. Две полипептидных цепи ковалентно связаны дисульфидными связями между остатками цистеина в каждой шарнирной области Ig. Каждая полипептидная цепь обеспечивает растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора, например, IL-10R, например, IL-10RA, и две растворимых части внеклеточного домена цитокинового рецептора вместе определяют связывающий сайт для цитокина. Схематическое изображение димерного цитокинового рецептора, молекулы иммуноглобулина (антитела) и димерного белка, включающего два ковалентно связанных слитых белка, каждый из которых включает растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора, слитого с шарнирной областью Ig и Fc-доменом Ig, представлено на фиг. 1А.Conventional cytokine decoys, such as IL-10 decoys, contain two polypeptide chains, each polypeptide chain comprising a soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor fused to the Ig hinge region and the Ig Fc domain. The soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor is typically fused directly to the Ig hinge region without any intervening sequence. The two polypeptide chains are covalently linked by disulfide bonds between cysteine residues in each Ig hinge region. Each polypeptide chain provides a soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor, eg, IL-10R, eg, IL-10RA, and the two soluble portions of the extracellular domain of the cytokine receptor together define a binding site for the cytokine. A schematic representation of a dimeric cytokine receptor, an immunoglobulin (antibody) molecule, and a dimeric protein comprising two covalently linked fusion proteins, each comprising a soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor fused to an Ig hinge region and an Ig Fc domain, is shown in FIG. 1A.

Изобретение частично основано на открытии, что обычные цитокиновые ловушки, включающие слитый белок из растворимой части внеклеточного домена цитокинового рецептора, слитой с шарнирной областью Ig и Fc-доменом Ig, например, ловушки IL-10, не связываются оптимально со своим цитокином-мишенью. Например, обычная ловушка IL-10 не обеспечивает достаточной гибкости между двумя IL-10 лигандсвязывающими доменами, чтобы два IL-10 лигандсвязывающих домена могли объединяться в оптимальной конфигурации с определением IL-10-связывающего сайта.The invention is based in part on the discovery that conventional cytokine decoys comprising a fusion protein of the soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor fused to an Ig hinge region and an Ig Fc domain, such as IL-10 decoys, do not bind optimally to their target cytokine. For example, a conventional IL-10 decoy does not provide sufficient flexibility between the two IL-10 ligand binding domains so that the two IL-10 ligand binding domains can combine in an optimal configuration to define the IL-10 binding site.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложен выделенный слитый белок, включающий в ориентации от N- к С-концу: растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора; аминокислотный линкер; шарнирную область иммуноглобулина (Ig); и Fc-домен иммуноглобулина (Ig); где линкер включает от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислотных остатков. Линкерная последовательность позволяет, например, связывающему домену во внеклеточном домене цитокинового рецептора оптимально связываться со своим цитокином-мишенью. Это особенно важно, когда цитокинсвязывающий белок является димером, включающим два из предыдущих слитых белков, которые вместе определяют связывающий сайт для связывания цитокина-мишени. Без линкера образованием оптимального связывающего сайта двумя связывающими доменами может быть стерически затруднено (фиг. 1В). Различные признаки и аспекты изобретения более подробно обсуждаются ниже.Thus, in one aspect of the invention there is provided an isolated fusion protein comprising, in N- to C-terminus orientation: a soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor; amino acid linker; immunoglobulin (Ig) hinge region; and Fc domain of immunoglobulin (Ig); wherein the linker comprises from about 5 to about 40 amino acid residues. The linker sequence allows, for example, a binding domain in the extracellular domain of a cytokine receptor to optimally bind to its target cytokine. This is especially important when the cytokine binding protein is a dimer comprising two of the previous fusion proteins that together define a binding site for binding the target cytokine. Without a linker, formation of the optimal binding site by the two binding domains may be sterically hindered (Figure 1B). Various features and aspects of the invention are discussed in more detail below.

I. Слитые белки.I. Fusion proteins.

Примерные слитые белки могут включать: первую часть внеклеточного домена, трансмембранного домена или внутриклеточного домена цитокина, цитокинового рецептора или иммуномодулирующего белка; аминокислотный линкер; и по меньшей мере одно из второй части внеклеточного домена, трансмембранного домена или внутриклеточного домена цитокина, цитокинового рецептора или иммуномодулирующего белка; шарнирной области иммуноглобулина (Ig); и Fc-домена иммуноглобулина (Ig). Например, раскрытый слитый белок может включать, в ориентации от N- к С-концу: растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора; аминокислотный линкер; шарнирную область иммуноглобулина (Ig); и Fc-домен иммуноглобулина (Ig); где линкер включает от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислотных остатков.Exemplary fusion proteins may include: the first portion of an extracellular domain, transmembrane domain, or intracellular domain of a cytokine, cytokine receptor, or immunomodulatory protein; amino acid linker; and at least one of a second portion of an extracellular domain, transmembrane domain, or intracellular domain of a cytokine, cytokine receptor, or immunomodulatory protein; immunoglobulin (Ig) hinge region; and the Fc domain of immunoglobulin (Ig). For example, the disclosed fusion protein may include, in N- to C-terminal orientation: a soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor; amino acid linker; immunoglobulin (Ig) hinge region; and Fc domain of immunoglobulin (Ig); wherein the linker comprises from about 5 to about 40 amino acid residues.

Примерные цитокины включают IL-1a, IL-Щ, IL-18. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-3, IL-5, ГМ-КСФ, IL-6, IL-11, Г-КСФ, IL-12, LIF, OSM, IL-10, IL-20, IL-14, IL-16, IL-17, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CD154, LT-β, ФНО-α, ФНО-β, 4-1BBL APRIL, CD70, CD153, CD178, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGF-βΓ TGF-e2, TGF-e3, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, М-КСФ и MSP.Exemplary cytokines include IL-1a, IL-III, IL-18. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-3, IL-5, GM-CSF, IL-6, IL-11, G-CSF, IL- 12, LIF, OSM, IL-10, IL-20, IL-14, IL-16, IL-17, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CD154, LT-β, TNF-α, TNF- β, 4-1BBL APRIL, CD70, CD153, CD178, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGF-βΓ TGF-e2, TGF-e3, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, M-CSF and MSP.

При использовании в настоящем документе иммуномодулирующий белок относится к белку, модулирующему функцию иммунной системы субъекта. Иммуномодулирующие белки могут, например, модулировать функцию, например, В-клеток, Т-клеток, и/или продукцию антител. Примерные иммуно- 4 043690 модулирующие белки включают ингибиторы контрольных точек. Примерные иммуномодулирующие белки могут включать, например, CTLA-4, CD70, IL-2, CD40L, OX40L, IL-12, IL-7, PD-1 или PD-L1 или любой белок, модулирующий их активность. Другие примерные иммуномодулирующие белки могут включать антитело против PD-1 или антитело против PD-L1.As used herein, an immunomodulatory protein refers to a protein that modulates the function of a subject's immune system. Immunomodulatory proteins can, for example, modulate the function of, for example, B cells, T cells, and/or antibody production. Exemplary immunomodulatory proteins include checkpoint inhibitors. Exemplary immunomodulatory proteins may include, for example, CTLA-4, CD70, IL-2, CD40L, OX40L, IL-12, IL-7, PD-1 or PD-L1 or any protein that modulates their activity. Other exemplary immunomodulatory proteins may include an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

При использовании в настоящем документе растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора относится к любому внеклеточному домену цитокинового рецептора или фрагменту внеклеточного домена цитокинового рецептора, который способен связываться с цитокином-мишенью. Следует понимать, что растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора также предусматривает части внеклеточного домена, которые включают связывающий домен, который отдельно или в комбинации со вторым связывающим доменом (например, в случае димерных слитых белков) способен к связыванию с цитокином-мишенью.As used herein, a soluble portion of a cytokine receptor extracellular domain refers to any cytokine receptor extracellular domain or fragment of a cytokine receptor extracellular domain that is capable of binding to a target cytokine. It should be understood that the soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor also includes portions of the extracellular domain that include a binding domain that, alone or in combination with a second binding domain (eg, in the case of dimeric fusion proteins), is capable of binding to a target cytokine.

Примерные цитокиновые рецепторы включают цитокиновые рецепторы I типа (например, рецепторы ГМ-КСФ, рецепторы Г-КСФ, рецепторы IL I типа, рецепторы Еро, рецепторы LIF, рецепторы CNTF или рецепторы ТРО), цитокиновые рецепторы II типа (например, рецепторы IL-10, рецепторы IFN-альфа (например, IFNAR1 или IFNAR2), рецепторы IFN-бета, рецепторы IFN-гамма (например, IFNGR1 или IFNGR2), хемокиновые рецепторы (например, хемокиновые рецепторы СС, хемокиновые рецепторы СХС, хемокиновые рецепторы СХ3С или хемокиновые рецепторы ХС), рецепторы суперсемейства фактора некроза опухоли (TNFR; например, TNFRSF5/CD40, TNFRSF8/CD30, TNFRSF7/CD27, TNFRSF1A/TNFR1/CD120a, или TNFRSF1B/TN2/FRCD120b), рецепторы супесемейства TGFP (например, рецептор TGFe I типа или рецептор TGFe II типа) или рецепторы суперсемейства иммуноглобулина (Ig) (например, рецептор интерлейкина-1, CSF-1R, PDGFR (например, PDGFRA или PDGFRB) или SCFR). Предпочтительные цитокиновые рецепторы включают димерные цитокиновые рецепторы, например, рецепторы супесемейства TGFe, например, человеческий рецептор TGFe II типа (TeRII). В некоторых вариантах осуществления растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора является растворимой частью внеклеточного домена человеческого IL-10R, например, человеческого IL10RA, например, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, обладающую больше чем 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12, и/или их фрагмент, включающий связывающий домен, который связывается с IL-10.Exemplary cytokine receptors include type I cytokine receptors (e.g., GM-CSF receptors, G-CSF receptors, type I IL receptors, Epo receptors, LIF receptors, CNTF receptors, or TPO receptors), type II cytokine receptors (e.g., IL-10 receptors , IFN-alpha receptors (eg, IFNAR1 or IFNAR2), IFN-beta receptors, IFN-gamma receptors (eg, IFNGR1 or IFNGR2), chemokine receptors (eg, CC chemokine receptors, CXC chemokine receptors, CX3C chemokine receptors, or CS chemokine receptors ), tumor necrosis factor superfamily receptors (TNFR; e.g., TNFRSF5/CD40, TNFRSF8/CD30, TNFRSF7/CD27, TNFRSF1A/TNFR1/CD120a, or TNFRSF1B/TN2/FRCD120b), TGFP superfamily receptors (e.g., TGFe type I receptor or TGFe type II) or immunoglobulin (Ig) superfamily receptors (e.g., interleukin-1 receptor, CSF-1R, PDGFR (e.g., PDGFRA or PDGFRB), or SCFR). Preferred cytokine receptors include dimeric cytokine receptors, e.g., TGFe superfamily receptors, e.g. , human TGFe receptor type II (TeRII). In some embodiments, the soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor is a soluble portion of the extracellular domain of human IL-10R, e.g., human IL10RA, e.g., comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence having greater than 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity to SEQ ID NO: 12, and/or a fragment thereof including a binding domain that binds IL-10.

Растворимая часть внеклеточного домена цитокинового рецептора сохраняет свою способность связывать свой нативный лиганд. В некоторых вариантах осуществления растворимая часть внеклеточного домена сохраняет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% связывающей активности по отношению к своему нативному лиганду по сравнению с полноразмерным цитокиновым рецептором.The soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor retains its ability to bind its native ligand. In some embodiments, the soluble portion of the extracellular domain retains at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% of the binding activity for its native ligand compared to the full-length cytokine receptor.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок может включать, например, одно или более из TpRII, TGF-β, CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL23A/p19, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, IL-15, CD154, CD70, ФНО-альфа, CD86, CD137, CD137L, BORIS/CtCFL, FGF, ICAM, IL-24, ГМ-КСФ, MAGE, NY-ESO-1, ангиостатина, эндостатина, ацетилхолина, интерферона, DKK1/Wnt, р53, Ox40L, ГМ-КСФ, слитого белка рецептора IL-15, GITRL, CD40L, CD70, секретируемого флагеллина, IL-12, тимидинкиназы, тяжелой цепи или легкой цепи антитела против PD1, тяжелой цепи или легкой цепи антитела против PD-L1 и тяжелой цепи или легкой цепи против антитела CTLA-4, или их функционального фрагмента.In some embodiments, the fusion protein may include, for example, one or more of TpRII, TGF-β, CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-7, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL23A/p19, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, IL-15, CD154, CD70, TNF-alpha, CD86, CD137 , CD137L, BORIS/CtCFL, FGF, ICAM, IL-24, GM-CSF, MAGE, NY-ESO-1, angiostatin, endostatin, acetylcholine, interferon, DKK1/Wnt, p53, Ox40L, GM-CSF, receptor fusion protein IL-15, GITRL, CD40L, CD70, secreted flagellin, IL-12, thymidine kinase, anti-PD1 antibody heavy chain or light chain, anti-PD-L1 antibody heavy chain or light chain, and anti-CTLA-4 antibody heavy chain or light chain, or their functional fragment.

При использовании в настоящем документе термин шарнирная область иммуноглобулина (Ig) относится к аминокислотной последовательности, которая обычно связывает СН1 и СН2 домены константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Шарнирная область Ig может включать, например, один или более остатков цистеина, способных к образованию дисульфидных связей с остатками цистеина в другой белковой цепи. При использовании в настоящем документе термин Fc-домен иммуноглобулина (Ig) относится к фрагменту константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая способна связываться с Fc-рецептором. Fc-домен Ig может включать, например, СН2 и СН3 домен иммуноглобулина (Ig). Границы между CH1, CH2 и СН3 доменами Ig известны в данной области и могут быть найдены, например, в базе данных PROSITE (доступной в сети Интернет по адресу prosite.expasy.org). Для ясности, выравнивание аминокислотных последовательностей СН1 и СН2 доменов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM человека представлено на фиг. 2.As used herein, the term immunoglobulin (Ig) hinge region refers to the amino acid sequence that typically links the CH1 and CH2 domains of the immunoglobulin heavy chain constant region. The Ig hinge region may include, for example, one or more cysteine residues capable of forming disulfide bonds with cysteine residues in another protein chain. As used herein, the term immunoglobulin (Ig) Fc domain refers to a portion of the immunoglobulin heavy chain constant region that is capable of binding to the Fc receptor. The Fc domain of an Ig may include, for example, the CH2 and CH3 domain of an immunoglobulin (Ig). The boundaries between the CH1, CH2 and CH3 domains of Igs are known in the art and can be found, for example, in the PROSITE database (available on the Internet at prosite.expasy.org). For clarity, the amino acid sequence alignment of the CH1 and CH2 domains of human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE and IgM is presented in FIG. 2.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область Ig выбрана из шарнирной области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM, и Fc-домен Ig выбран из Fc-домена IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область Ig и Fc-домен вместе включают аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область Ig и Fc-домен вместе включают аминокислотную последовательность, обладающую больше чем 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.In some embodiments, the Ig hinge region is selected from the hinge region of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, and IgM, and the Ig Fc domain is selected from the Fc domain of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 , IgD, IgE and IgM. In some embodiments, the Ig hinge region and the Fc domain together comprise an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the Ig hinge region and the Fc domain together comprise an amino acid sequence having greater than 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to a sequence selected from SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.

- 5 043690- 5 043690

Аминокислотный линкер может позволить лигандсвязывающей части слитого белка (например, цитокинового рецептора) оптимально связываться с лигандом (например, цитокином), обеспечивать временную и пространственную колокализацию двух или более компонентов слитого белка (например, двух субъединиц димерного цитокина), оптимизировать экспрессию с вектора экспрессии (например, вирусного вектора), снизить иммуногенность или обеспечить сайт расщепления, обеспечивающий высвобождение компонента слитого белка.An amino acid linker may allow the ligand binding portion of a fusion protein (e.g., a cytokine receptor) to optimally bind to a ligand (e.g., a cytokine), provide temporal and spatial colocalization of two or more components of the fusion protein (e.g., two subunits of a dimeric cytokine), optimize expression from an expression vector ( for example, a viral vector), reduce immunogenicity or provide a cleavage site allowing release of a fusion protein component.

Аминокислотный линкер может включать, например, от приблизительно 5 до приблизительно 15, от приблизительно 5 до приблизительно 20, от приблизительно 5 до приблизительно 25, от приблизительно 5 до приблизительно 30, от приблизительно 5 до приблизительно 35, от приблизительно 5 до приблизительно 40, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 10 до приблизительно 20, от приблизительно 10 до приблизительно 25, от приблизительно 10 до приблизительно 30, от приблизительно 10 до приблизительно 35, от приблизительно 10 до приблизительно 40, от приблизительно 15 до приблизительно 20, от приблизительно 15 до приблизительно 25, от приблизительно 15 до приблизительно 30, от приблизительно 15 до приблизительно 35 или от приблизительно 15 до приблизительно 40 аминокислотных остатков. Аминокислоты в линкере могут быть природными аминокислотами или модифицированными аминокислотами.The amino acid linker may include, for example, from about 5 to about 15, from about 5 to about 20, from about 5 to about 25, from about 5 to about 30, from about 5 to about 35, from about 5 to about 40, from about 10 to about 15, about 10 to about 20, about 10 to about 25, about 10 to about 30, about 10 to about 35, about 10 to about 40, about 15 to about 20, about 15 to about 25, about 15 to about 30, about 15 to about 35, or about 15 to about 40 amino acid residues. The amino acids in the linker may be natural amino acids or modified amino acids.

В некоторых вариантах осуществления последовательность аминокислотного линкера получена из эндогенного человеческого белка, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, альбумина или казеина. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер включает С-концевую часть, например от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислот, СН1 домена иммуноглобулина (Ig), например, СН1 домена IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер включает последовательность, обладающую больше чем 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.In some embodiments, the amino acid linker sequence is derived from an endogenous human protein, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, albumin, or casein. In some embodiments, the amino acid linker includes the C-terminal portion, such as about 5 to about 40 amino acids, of an immunoglobulin (Ig) CH1 domain, such as the CH1 domain of an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM. In some embodiments, the amino acid linker comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, and SEQ ID NO: 64. In some embodiments, the amino acid linker includes a sequence having greater than 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64.

Белок или полипептид получены из референсного белка или полипептида, если он включает аминокислотную последовательность, которая по существу подобна всей или соответствующей части аминокислотной последовательности дикого типа референсного белка или полипептида. В некоторых вариантах осуществления белок или полипептид, полученный из белка или полипептида дикого типа, может иметь одну или более аминокислотных замен по сравнению с белком или полипептидом дикого типа. Например, предусмотрено, что белок или полипептид, полученный из белка или полипептида дикого типа, может обладать больше чем 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с белком или полипептидом дикого типа. Кроме того, предусмотрено, что белок или полипептид, полученный из белка или полипептида дикого типа, может содержать больше консервативных замен по сравнению с белком или полипептидом дикого типа. При использовании в настоящем документе термин консервативная замена относится к замене структурно подобной аминокислотой. Например, консервативные замены могут включать замены в рамках следующих групп: Ser и Cys; Leu, Ile и Val; Glu и Asp; Lys и Arg; Phe, Tyr и Trp; и Gln, Asn, Glu, Asp и His. Консервативные замены могут быть также определены с помощью алгоритма BLAST (от англ. Basic Local Alignment Search Tool - средство поиска основного локального выравнивания), матрицы замен BLOSUM (например, матрицы BLOSUM 62) или матрицы замен РАМ (например, матрицы РАМ 250).A protein or polypeptide is derived from a reference protein or polypeptide if it includes an amino acid sequence that is substantially similar to all or a corresponding portion of the wild-type amino acid sequence of the reference protein or polypeptide. In some embodiments, a protein or polypeptide derived from a wild-type protein or polypeptide may have one or more amino acid substitutions relative to the wild-type protein or polypeptide. For example, it is contemplated that a protein or polypeptide derived from a wild-type protein or polypeptide may have greater than 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity with a wild-type protein or polypeptide. It is further contemplated that a protein or polypeptide derived from a wild-type protein or polypeptide may contain more conservative substitutions compared to the wild-type protein or polypeptide. As used herein, the term conservative substitution refers to a substitution with a structurally similar amino acid. For example, conservative substitutions may include substitutions within the following groups: Ser and Cys; Leu, Ile and Val; Glu and Asp; Lys and Arg; Phe, Tyr and Trp; and Gln, Asn, Glu, Asp and His. Conservative substitutions can also be identified using the BLAST algorithm (Basic Local Alignment Search Tool), the BLOSUM substitution matrix (for example, the BLOSUM 62 matrix), or the PAM substitution matrix (for example, the PAM 250 matrix).

В некоторых вариантах осуществления последовательность аминокислотного линкера получена из цитокина, сигнальной молекулы, иммуномодулирующего белка или пептида, или биологически активного пептида.In some embodiments, the amino acid linker sequence is derived from a cytokine, signaling molecule, immunomodulatory protein or peptide, or biologically active peptide.

Другие предусмотренные линкерные последовательности включают линкеры, богатые глицином и серином, например, (G₄S)₃ (SEQ ID NO: 49). Дополнительные примеры линкерных последовательностей раскрыты, например, в George et al. (2003) PROTEIN ENGINEERING 15:871-879 и патентах США 5,482,858 и 5,525,491.Other provided linker sequences include glycine- and serine-rich linkers, for example, (G ₄ S) ₃ (SEQ ID NO: 49). Additional examples of linker sequences are disclosed, for example, in George et al. (2003) PROTEIN ENGINEERING 15:871-879 and US patents 5,482,858 and 5,525,491.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер может включать сайт расщепления, например, сайт протеолитического или непротеолитического расщепления. В некоторых вариантах осуществления сайт протеолитического расщепления расщепляет протеаза, присутствующая в определенной ткани, органелле или внутриклеточном компартементе. В некоторых вариантах осуществления линкер включает сайт протеолитического расщепления и два остатка цистеина, что приводит к образованию дисульфидной связи после протеолитического распада. В некоторых вариантах осуществления сайт протеолитического расщепления расщепляется протеазой, выбранной из матриксной металлопротеиназы (ММР), фурина, PC1, PC2, РС3, катепсина В, протеиназы 3 и каспазы 3. В некоторых вариантах осущестIn some embodiments, the amino acid linker may include a cleavage site, such as a proteolytic or non-proteolytic cleavage site. In some embodiments, the proteolytic cleavage site is cleaved by a protease present in a particular tissue, organelle, or intracellular compartment. In some embodiments, the linker includes a proteolytic cleavage site and two cysteine residues, resulting in the formation of a disulfide bond after proteolytic cleavage. In some embodiments, the proteolytic cleavage site is cleaved by a protease selected from matrix metalloproteinase (MMP), furin, PC1, PC2, PC3, cathepsin B, proteinase 3, and caspase 3. In some embodiments, the proteolytic cleavage site is cleaved by a protease selected from matrix metalloproteinase (MMP).

- 6 043690 вления сайт расщепления является сайтом протеолитического расщепления, расщепляемым протеазой, присутствующей в эндоплазматическом ретикулуме или аппарате Гольджи эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления сайт протеолитического расщепления является сайтом расщепления фурином. Фурин является протеазой, которая повсеместно экспрессируется и локализуется в аппарате Гольджи, где она распознает консенсусную последовательность RX1X₂R (SEQ ID NO: 50), где X1 является любой аминокислотой, а Х2 является Lys или Arg, и создает разрыв после последнего Arg. Фурин играет биологическую роль при расщеплении пропептидов белков, которые транспортируются через аппарат Гольджи. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления сайт протеолитического расщепления является сайтом расщепления фурином, включающим последовательность RX1X2R (SEQ ID NO: 50), где X1 является любой аминокислотой, а Х2 является Lys или Arg, например, сайтом расщепления фурином, включающим последовательность RAKR (SEQ ID NO: 51).- 6 043690 The cleavage site is a proteolytic cleavage site cleaved by a protease present in the endoplasmic reticulum or Golgi apparatus of a eukaryotic cell. In some embodiments, the proteolytic cleavage site is a furin cleavage site. Furin is a protease that is ubiquitously expressed and localized to the Golgi apparatus, where it recognizes the consensus sequence RX1X ₂ R (SEQ ID NO: 50), where X1 is any amino acid and X2 is a Lys or Arg, and creates a gap after the last Arg. Furin plays a biological role in the breakdown of propeptide proteins that are transported through the Golgi apparatus. Thus, in some embodiments, the proteolytic cleavage site is a furin cleavage site comprising the sequence RX1X2R (SEQ ID NO: 50), where X1 is any amino acid and X2 is a Lys or Arg, for example, a furin cleavage site comprising the sequence RAKR (SEQ ID NO: 51).

В некоторых вариантах осуществления Fc Ig, шарнирная область Ig и СН1 домен Ig получены из одного иммуноглобулина.In some embodiments, the Ig Fc, Ig hinge region, and Ig CH1 domain are derived from a single immunoglobulin.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления раскрытый слитый белок включает аминокислотную последовательность, обладающую больше чем 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58.In some embodiments, the fusion protein comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the disclosed fusion protein comprises an amino acid sequence having greater than 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity to a sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58.

Идентичность последовательностей может быть определена разными способами, которые известны в уровне техники, например, при использовании общедоступной компьютерной программы, такой как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Анализ BLAST (средство поиска основного локального выравнивания) при использовании алгоритма, используемого в программах blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402, включенные посредством отсылки), предназначен для поиска подобия последовательностей. По поводу обсуждения основных вопросов при поиске в базах данных последовательностей см. публикацию Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129, которая полностью включена посредством отсылки. Специалисты в данной области смогут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, требуемые для получения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Параметры поиска для гистограммы, описаний, выравниваний, ожидания (т.е. статистического порога значения для создания отчетов о совпадениях в базах данных последовательностей), предельное значение, матрица и фильтр имеют значение, установленное по умолчанию. По умолчанию в blastp, blastx, tblastn и tblastx используется оценочная матрица BLOSUM62 (Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919, полностью включена посредством отсылки). Четыре параметра blastn могут иметь следующие значения: Q=10 (штраф за создание пропуска); R=10 (штраф за продолжение пропуска); wink=1 (генерирует код совпадения в каждом wink.sup.th положении на протяжении запрашиваемой последовательности); и gapw=16 (устанавливает ширину окна, в котором генерируются выравнивания с пропусками). Эквивалентные параметры настройки значений Blastp могут быть следующими: Q=9; R=2; wink=1; и gapw=32. Поиски также можно проводить при использовании предоставляемых NCBI (Национальным центром биотехнологической информации США) Дополнительных параметров BLAST (например: -G, штраф за введение пропуска [целое число]: значение по умолчанию=5 для нуклеотидов/11 для белков; -Е, штраф за продолжение пропуска [целое число]: значение по умолчанию=2 для нуклеотидов/1 для белков; -q, штраф за несовпадающий нуклеотид [целое число]: значение по умолчанию = -3; -r, вознаграждение за совпадающий нуклеотид [целое число]: значение по умолчанию=1; -е, ожидаемое значение [фактическое]: значение по умолчанию=10; -W, длина слова [целое число]: значение по умолчанию=11 для нуклеотидов/28 для megablast/3 для белков; -у, значение сброса (X) для удлинений BLAST в битах: значение по умолчанию=20 для blastn/7 для остальных; -X, X значение сброса для выравнивания с пропусками (в битах): значение по умолчанию=15 для всех программ, не применимых к blastn; и -Z, финальное значение X сброса для выравнивания с пропусками (в битах): 50 для blastn, 25 для остальных). Также для парных выравниваний белковых последовательностей может использоваться ClustalW (параметры по умолчанию могут включать, например, матрицу Blosum62 и штраф за создание пропуска=10 и штраф за продолжение пропуска=0,1). В алгоритме Bestfit для сравнения последовательностей, доступном в версии 10.0 пакета GCG, используются параметры для ДНК GAP=50 (штраф за создание пропуска) и LEN=3 (штраф за продолжение пропуска), и эквивалентные параметры настройки при сравнениях белковых последовательностей, включают GAP=8 и LEN=2.Sequence identity can be determined by various methods that are known in the art, for example, using a publicly available computer program such as the BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) program. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analysis using the algorithm used in blastp, blastn, blastx, tblastn and tblastx (Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul , (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402, incorporated by reference), is intended for searching sequence similarity. For a discussion of basic issues in searching sequence databases, see Altschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129, which is incorporated by reference in its entirety. Those skilled in the art will be able to determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms required to obtain maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. The search options for histogram, descriptions, alignments, expectancy (ie, the statistical threshold value for reporting hits in sequence databases), cutoff, matrix, and filter are set to the default value. By default, blastp, blastx, tblastn and tblastx use the BLOSUM62 scoring matrix (Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919, incorporated by reference in its entirety). The four blastn parameters can have the following values: Q=10 (penalty for creating a pass); R=10 (fine for continuing to skip); wink=1 (generates a match code at every wink.sup.th position throughout the requested sequence); and gapw=16 (sets the width of the window in which gap alignments are generated). Equivalent Blastp value settings could be: Q=9; R=2; wink=1; and gapw=32. Searches can also be performed using the NCBI-provided Advanced BLAST Options (for example: -G, gap penalty [integer]: default=5 for nucleotides/11 for proteins; -E, penalty for skip continuation [integer]: default=2 for nucleotides/1 for proteins; -q, mismatched nucleotide penalty [integer]: default = -3; -r, matched nucleotide reward [integer]: default=1; -e, expected value [actual]: default=10; -W, word length [integer]: default=11 for nucleotides/28 for megablast/3 for proteins; -y, reset value (X) for BLAST extensions in bits: default=20 for blastn/7 for others -X, X reset value for gap alignment (in bits): default=15 for all programs not applicable to blastn; and -Z, final reset X value for skip alignment (in bits): 50 for blastn, 25 for others). ClustalW can also be used for pairwise protein sequence alignments (default parameters could include, for example, a Blosum62 matrix and gap creation penalty=10 and gap continuation penalty=0.1). The Bestfit sequence comparison algorithm, available in GCG version 10.0, uses parameters for DNA GAP=50 (gap penalty) and LEN=3 (gap penalty), and equivalent settings for protein sequence comparisons include GAP= 8 and LEN=2.

В одном аспекте изобретения предложен цитокинсвязывающий белок, включающий два слитых белка, где каждый слитый белок включает, в ориентации от N- к С-концу: растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора; аминокислотный линкер; шарнирную область иммуноглобулинаIn one aspect of the invention, there is provided a cytokine binding protein comprising two fusion proteins, wherein each fusion protein includes, in N- to C-terminus orientation: a soluble portion of the extracellular domain of a cytokine receptor; amino acid linker; immunoglobulin hinge region

- 7 043690 (Ig); и Fc-домен иммуноглобулина (Ig); где линкер включает от приблизительно 5 до приблизительно 40 аминокислотных остатков, где два слитых белка ковалентно соединены, и где два внеклеточных домена вместе определяют связывающий сайт для цитокина.- 7 043690 (Ig); and Fc domain of immunoglobulin (Ig); wherein the linker comprises from about 5 to about 40 amino acid residues, wherein the two fusion proteins are covalently linked, and wherein the two extracellular domains together define a binding site for the cytokine.

Цитокинсвязывающий белок может включать два из предыдущих слитых белков, ковалентно соединенных друг с другом, где каждый слитый белок включает внеклеточный домен цитокинового рецептора, и где два внеклеточных домена вместе определяют связывающий сайт для цитокина. Слитые белки могут быть ковалентно связаны, например, дисульфидными связями между остатками цистеина в шарнирной области Ig каждого слитого белка. В некоторых вариантах осуществления слитые белки, мономерные или мультимерные (например, димерные), сохраняют по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% связывающей активности целевого лиганда по сравнению с нативным, полноразмерным цитокиновым рецептором.The cytokine binding protein may comprise two of the preceding fusion proteins covalently linked to each other, wherein each fusion protein comprises an extracellular domain of a cytokine receptor, and wherein the two extracellular domains together define a binding site for the cytokine. Fusion proteins can be covalently linked, for example by disulfide bonds between cysteine residues in the Ig hinge region of each fusion protein. In some embodiments, the fusion proteins, monomeric or multimeric (eg, dimeric), retain at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% of the target ligand binding activity compared to the native, full-length cytokine receptor.

В некоторых вариантах осуществления цитокинсвязывающий белок согласно изобретению связывает цитокин с K_D 200 нМ, 100 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 50 пМ, 25 пМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления цитокинсвязывающий белок согласно изобретению связывает цитокин с K_D от 200 нМ до 100 нМ, от 200 нМ до 20 нМ, от 200 нМ до 10 нМ, от 200 нМ до 5 нМ, от 200 нМ до 1 нМ, от 200 нМ до 50 пМ, от 200 нМ до 25 пМ, от 100 нМ до 20 нМ, от 100 нМ до 10 нМ, от 100 нМ до 5 нМ, от 100 нМ до 1 нМ, от 100 нМ до 50 пМ, от 100 нМ до 25 пМ, от 20 нМ до 10 нМ, от 20 нМ до 5 нМ, от 20 нМ до 1 нМ, от 20 нМ до 50 пМ, от 20 нМ до 25 пМ, от 10 нМ до 5 нМ, от 10 нМ до 1 нМ, от 10 нМ до 50 пМ, от 10 нМ до 25 пМ, от 5 нМ до 1 нМ, от 5 нМ до 50 пМ, от 5 нМ до 25 пМ, от 1 нМ до 50 пМ, от 1 нМ до 25 пМ, или от 50 пМ до 25 рМ. В некоторых вариантах осуществления цитокинсвязывающий белок согласно изобретению связывает IL-10 с K_D 200 нМ, 100 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 50 пМ, 25 пМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления цитокинсвязывающий белок согласно изобретению связывает IL-10 с K_D от 200 нМ до 100 нМ, от 200 нМ до 20 нМ, от 200 нМ до 10 нМ, от 200 нМ до 5 нМ, от 200 нМ до 1 нМ, от 200 нМ до 50 пМ, от 200 нМ до 25 пМ, от 100 нМ до 20 нМ, от 100 нМ до 10 нМ, от 100 нМ до 5 нМ, от 100 нМ до 1 нМ, от 100 нМ до 50 пМ, от 100 нМ до 25 пМ, от 20 нМ до 10 нМ, от 20 нМ до 5 нМ, от 20 нМ до 1 нМ, от 20 нМ до 50 пМ, от 20 нМ до 25 пМ, от 10 нМ до 5 нМ, от 10 нМ до 1 нМ, от 10 нМ до 50 пМ, от 10 нМ до 25 пМ, от 5 нМ до 1 нМ, от 5 нМ до 50 пМ, от 5 нМ до 25 пМ, от 1 нМ до 50 пМ, от 1 нМ до 25 пМ, или от 50 пМ до 25 пМ. Значения K_D могут быть определены способами, известными в уровне техники, включая способы поверхностного плазмонного резонанса или интерферометрии биослоя.In some embodiments, the cytokine binding protein of the invention binds a cytokine with a K _D of 200 nM, 100 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 50 pM, 25 pM or lower. In some embodiments, the cytokine binding protein of the invention binds a cytokine with a K _D of 200 nM to 100 nM, 200 nM to 20 nM, 200 nM to 10 nM, 200 nM to 5 nM, 200 nM to 1 nM, 200 nM to 50 pM, from 200 nM to 25 pM, from 100 nM to 20 nM, from 100 nM to 10 nM, from 100 nM to 5 nM, from 100 nM to 1 nM, from 100 nM to 50 pM, from 100 nM up to 25 pM, from 20 nM to 10 nM, from 20 nM to 5 nM, from 20 nM to 1 nM, from 20 nM to 50 pM, from 20 nM to 25 pM, from 10 nM to 5 nM, from 10 nM to 1 nM, from 10 nM to 50 pM, from 10 nM to 25 pM, from 5 nM to 1 nM, from 5 nM to 50 pM, from 5 nM to 25 pM, from 1 nM to 50 pM, from 1 nM to 25 pM, or from 50 pM to 25 pM. In some embodiments, the cytokine binding protein of the invention binds IL-10 with a K _D of 200 nM, 100 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM , 2 nM, 1 nM, 50 pM, 25 pM or lower. In some embodiments, the cytokine binding protein of the invention binds IL-10 with a K _D of 200 nM to 100 nM, 200 nM to 20 nM, 200 nM to 10 nM, 200 nM to 5 nM, 200 nM to 1 nM, from 200 nM to 50 pM, from 200 nM to 25 pM, from 100 nM to 20 nM, from 100 nM to 10 nM, from 100 nM to 5 nM, from 100 nM to 1 nM, from 100 nM to 50 pM, from 100 nM to 25 pM, from 20 nM to 10 nM, from 20 nM to 5 nM, from 20 nM to 1 nM, from 20 nM to 50 pM, from 20 nM to 25 pM, from 10 nM to 5 nM, from 10 nM to 1 nM, from 10 nM to 50 pM, from 10 nM to 25 pM, from 5 nM to 1 nM, from 5 nM to 50 pM, from 5 nM to 25 pM, from 1 nM to 50 pM, from 1 nM up to 25 pM, or from 50 pM to 25 pM. K _D values can be determined by methods known in the art, including surface plasmon resonance or biolayer interferometry methods.

Примерные слитые белки согласно изобретению включают белки, включающие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58. Для ясности, последовательности отдельных элементов этих белков и белков, из которых были получены последовательности отдельных элементов, включая растворимую часть внеклеточного домена цитокинового рецептора, аминокислотный линкер, шарнирную область Ig и Fc-домен Ig, приведены в табл. 1.Exemplary fusion proteins of the invention include proteins comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58. For clarity, the sequences of the individual elements of these proteins and the proteins from which the sequences of the individual elements were derived, including the soluble portion of the extracellular domain of the cytokine receptor, the amino acid linker, the Ig hinge region, and the Ig Fc domain, are given in Table. 1.

- 8 043690- 8 043690

Таблица 1Table 1

Белок Protein Источник рецептора SEQ ID рецептора Source Receptor SEQ ID Receptor Источник линкера SEQ ID линкера Linker Source SEQ Linker ID Источник шарнира Ig/Fc Ig SEQ ID шарнира Ig/Fc Ig Source Ig/Fc Ig Hinge SEQ ID Ig/Fc Ig Hinge SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 22 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgGl SEQ ID NO: 1 CHI domain IgGl SEQ ID NO: 1 IgGl SEQ ID NO: 13 IgGl SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 55 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgGl SEQ ID NO: 53 CHI domain IgGl SEQ ID NO: 53 IgGl SEQ ID NO: 13 IgGl SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 56 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgGl SEQ ID NO: 54 CHI domain IgGl SEQ ID NO: 54 IgGl SEQ ID NO: 13 IgGl SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 58 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgGl SEQ ID NO: 57 CHI domain IgGl SEQ ID NO: 57 IgGl SEQ ID NO: 13 IgGl SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 23 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgG2 SEQ ID NO: 2 CHI domain IgG2 SEQ ID NO: 2 IgG2 SEQ ID NO: 14 IgG2 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 24 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgG3 SEQ ID NO: 3 CHI domain IgG3 SEQ ID NO: 3 IgG3 SEQ ID NO: 15 IgG3 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 25 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgG4 SEQ ID NO: 4 CHI domain IgG4 SEQ ID NO: 4 IgG4 SEQ ID NO: 16 IgG4 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 26 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgAl SEQ ID NO: 5 CHI domain IgAl SEQ ID NO: 5 IgAl SEQ ID NO: 17 IgAl SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 27 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgA2 SEQ ID NO: 6 CHI domain of IgA2 SEQ ID NO: 6 IgA2 SEQ ID NO: 18 IgA2 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 28 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgD SEQ ID NO: 7 CHI domain IgD SEQ ID NO: 7 IgD SEQ ID NO: 19 IgD SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 29 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgE SEQ ID NO: 8 CHI domain of IgE SEQ ID NO: 8 IgE SEQ ID NO: 20 IgE SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 30 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 CHI домен IgM SEQ ID NO: 9 CHI domain IgM SEQ ID NO: 9 IgM SEQ ID NO: 21 IgM SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 31 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 Альбумин SEQ ID NO: 10 Albumen SEQ ID NO: 10 IgGl SEQ ID NO: 13 IgGl SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 32 IL-10RA SEQ ID NO: 12 IL-10RA SEQ ID NO: 12 Казеин SEQ ID NO: 11 Casein SEQ ID NO: 11 IgGl SEQ ID NO: 13 IgGl SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 33 mlL-lORA SEQ ID NO: 34 mlL-lORA SEQ ID NO: 34 CHI домен mlgGl SEQ ID NO: 35 CHI domain mlgGl SEQ ID NO: 35 mlgGl SEQ ID NO: 36 mlgGl SEQ ID NO: 36

Таблица 2table 2

Белковая последовательность Protein sequence Последовательность нуклеиновой кислоты Nucleic acid sequence SEQ ID NO SEQ ID NO 22 22 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO SEQ ID NO 23 23 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO SEQ ID NO 24 24 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO SEQ ID NO 25 25 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO SEQ ID NO 26 26 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO SEQ ID NO 27 27 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO SEQ ID NO 28 28 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO SEQ ID NO 29 29 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO SEQ ID NO 30 thirty SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO SEQ ID NO 31 31 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO SEQ ID NO 32 32 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 47

II. Получение слитого белка.II. Preparation of the fusion protein.

Способы получения слитых белков изобретения известны в уровне техники. Например, молекулы ДНК, кодирующие раскрытый слитый белок, могут быть химически синтезированы при использовании представленной в настоящем документе информации о последовательности. Синтетические молекулы ДНК могут быть лигированы с другими подходящими нуклеотидными последовательностями, включающими, например, последовательности контроля экспрессии, с получением обычных конструкций экспрессии гена, кодирующих требуемый слитый белок. Получение определенных генетических конструкций общеизвестно в уровне техники. Примерные последовательностей нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 37-47, которые кодируют слитые белки SEQ ID NO: 22-32, можно найти в табл. 2.Methods for producing the fusion proteins of the invention are known in the art. For example, DNA molecules encoding a disclosed fusion protein can be chemically synthesized using the sequence information provided herein. Synthetic DNA molecules can be ligated to other suitable nucleotide sequences, including, for example, expression control sequences, to produce conventional gene expression constructs encoding the desired fusion protein. The production of certain genetic constructs is well known in the art. Exemplary nucleic acid sequences SEQ ID NOs: 37-47, which encode fusion proteins SEQ ID NOs: 22-32, can be found in table. 2.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие требуемые слитые белки, могут быть включены (лигированы) в векторы экспрессии, которые могут быть введены в клетки-хозяева с помощью стандартных методов трансфекции или трансформации. Примерами клеток-хозяев являются клетки Е. coli, клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детенышей хомяка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и клетки миеломы. Трансформированные клетки-хозяева могут выращивать в условиях, позволяющих клеткам-хозяевам экспрессировать гены, кодирующие требуемый слитый белок.Nucleic acids encoding the desired fusion proteins can be incorporated (ligated) into expression vectors, which can be introduced into host cells using standard transfection or transformation techniques. Examples of host cells include E. coli cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney (COS) cells, human hepatocellular carcinoma cells (eg, Hep G2) and myeloma cells. The transformed host cells can be grown under conditions that allow the host cells to express genes encoding the desired fusion protein.

- 9 043690- 9 043690

Специфические условия экспрессии и очистки будут изменяться в зависимости от используемой системы экспрессии. Например, если ген должен экспрессироваться в Е. coli, его сначала клонируют в вектор экспрессии, помещая сконструированный ген после подходящего бактериального промотора, например, Tip или Тас, и прокариотической сигнальной последовательности. Экспрессируемый секретируемый белок накапливается в преломляющих тельцах или тельцах включения, и может быть получен после разрушения клеток с помощью пресса Френча или обработки ультразвуком. Преломляющие тельца затем солюбилизируют, а белки подвергают рефолдингу и расщеплению способами, известными в данной области.Specific expression and purification conditions will vary depending on the expression system used. For example, if a gene is to be expressed in E. coli, it is first cloned into an expression vector by placing the constructed gene downstream of a suitable bacterial promoter, such as Tip or Tac, and a prokaryotic signal sequence. The expressed secreted protein accumulates in refractive or inclusion bodies and can be obtained after cell disruption using a French press or sonication. The refractive bodies are then solubilized and the proteins are refolded and digested by methods known in the art.

Если рекомбинантный ген должен экспрессироваться в эукариотических клетках-хозяевах, например, клетках СНО, его сначала встраивают в вектор экспрессии, содержащий подходящий эукариотический промотор, сигнал секреции, последовательность поли(А) и стоп-кодон, и, необязательно, он может содержать энхансеры и различные интроны. Генетическая конструкция может быть введена в эукариотические клетки-хозяева с помощью стандартных методов.If the recombinant gene is to be expressed in eukaryotic host cells, such as CHO cells, it is first inserted into an expression vector containing a suitable eukaryotic promoter, secretion signal, poly(A) sequence and stop codon, and optionally it may contain enhancers and various introns. The genetic construct can be introduced into eukaryotic host cells using standard methods.

Полипептид, включающий раскрытый слитый белок, может быть получен при выращивании (культивировании) клетки-хозяина, трансфицированной вектором экспрессии, кодирующим такой белок, при условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида. После экспрессии полипептид может быть собран и очищен или выделен с помощью способов, известных в уровне техники, например, при использовании аффинных меток, таких как Белок А, Белок G, глутатион-S-трансфераза (GST) и гистидиновые метки.A polypeptide comprising the disclosed fusion protein can be produced by culturing a host cell transfected with an expression vector encoding such protein under conditions that allow expression of the polypeptide. Once expressed, the polypeptide can be assembled and purified or isolated using methods known in the art, for example, using affinity tags such as Protein A, Protein G, glutathione S-transferase (GST) and histidine tags.

III. Векторы экспрессии.III. Expression vectors.

Слитые белки, представляющие интерес, могут быть экспрессированы в представляющей интерес клетке путем слияния гена, кодирующего представляющий интерес слитый белок, в подходящем векторе экспрессии. При использовании в настоящем документе вектор экспрессии относится к вектору, включающему рекомбинантный полинуклеотид, включающий последовательности контроля экспрессия, функционально связанные с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. Вектор экспрессии включает достаточные цис-действующие элементы для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть предоставлены клеткой-хозяином или в системе экспрессии in vitro. Векторы экспрессии включают все векторы, известные в уровне техники, такие как космиды, плазмиды (например, голые или содержащиеся в липосомах), ретротранспозоны (например, piggyback, sleeping beauty) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые включают рекомбинантный полинуклеотид, представляющий интерес.Fusion proteins of interest can be expressed in the cell of interest by fusing the gene encoding the fusion protein of interest into a suitable expression vector. As used herein, an expression vector refers to a vector comprising a recombinant polynucleotide comprising expression control sequences operably linked to the nucleotide sequence being expressed. The expression vector contains sufficient cis-acting elements for expression; other elements for expression may be provided by the host cell or in an in vitro expression system. Expression vectors include all vectors known in the art, such as cosmids, plasmids (eg, naked or contained in liposomes), retrotransposons (eg, piggyback, sleeping beauty) and viruses (eg, lentiviruses, retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses), which include the recombinant polynucleotide of interest.

В некоторых вариантах осуществления раскрытый вектор экспрессии является вирусным вектором. Термины вирусный вектор и вирус используются в настоящем документе попеременно для обозначения любых облигатных внутриклеточных паразитов, обладающих белоксинтезирующим или энергогенерирующим механизмом. Вирусный геном может представлять собой РНК или ДНК. Вирусы, применимые при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают рекомбинантно модифицированные оболочечные или безоболочечные ДНК и РНК вирусы, предпочтительно выбранные из бакуловирусов, парвовирусов, пикорнавирусов, герпесвирусов, поксвирусов или аденовирусов. Вирусы могут быть модифицированы с помощью методов рекомбинантных ДНК для включения экспрессии экзогенных трансгенов и могут быть сконструированы репликационно-дефицитными, условно реплицирующимися или репликационно-компетентными. Химерные вирусные векторы, в которых применяются предпочтительные элементы, обладающих свойствами каждого из исходных векторов (см., например, Fenget al. (1997) NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870), также могут применяться при практическом осуществлении настоящего изобретения. Хотя обычно предпочитают использовать вирус, специфичный для видов, подлежащих лечению, в некоторых случаях может быть предпочтительным использовать векторы, полученные из разных видов, которые обладают благоприятными патогенными свойствами. Например, векторы на основе вируса герпеса лошадей для генотерапии у человека описаны в публикации РСТ WO98/27216. Векторы описаны как полезные для лечения человека, поскольку вирус лошадей не является патогенным для человека. Аналогичным образом, овечьи аденовирусные векторы могут применяться в генотерапии у человека, поскольку, как утверждается, они избегают антител против векторов на основе аденовирусов человека. Такие векторы описаны в публикации РСТ WO 97/06826.In some embodiments, the disclosed expression vector is a viral vector. The terms viral vector and virus are used interchangeably herein to refer to any obligate intracellular parasite that has a protein-synthesizing or energy-generating mechanism. The viral genome may be RNA or DNA. Viruses useful in the practice of the present invention include recombinantly modified enveloped or non-enveloped DNA and RNA viruses, preferably selected from baculoviruses, parvoviruses, picornaviruses, herpesviruses, poxviruses or adenoviruses. Viruses can be modified by recombinant DNA techniques to enable expression of exogenous transgenes and can be engineered to be replication-deficient, conditionally replicating, or replication-competent. Chimeric viral vectors using preferred elements having properties of each of the original vectors (see, for example, Fenget al. (1997) NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870) can also be used in the practice of the present invention. Although it is generally preferred to use a virus specific to the species being treated, in some cases it may be preferable to use vectors derived from different species that have favorable pathogenic properties. For example, vectors based on equine herpes virus for gene therapy in humans are described in PCT publication WO98/27216. The vectors are described as useful for human treatment because the equine virus is not pathogenic to humans. Likewise, sheep adenovirus vectors may be used in human gene therapy because they are said to evade antibodies against human adenovirus vectors. Such vectors are described in PCT publication WO 97/06826.

В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор является аденовирусом. Аденовирусы представляют собой безоболочечные (голые) икосаэдрические вирусы среднего размера (90-100 нм), состоящие из нуклеокапсида и двухцепочечной линейной геномной ДНК. Аденовирусы реплицируются в ядре клеток млекопитающих, используя репликационный аппарат хозяина. Термин аденовирус относится к любому вирусу рода Adenoviridiae, включая, без ограничения, подрода аденовирусов человека, коров, овец, лошадей, псовых, свиней, мышей и обезьян. В частности, аденовирусы человека включает подрода A-F, а также их отдельные серотипы, отдельные серотипы и подрода A-F, включающие, без ограничения, типы аденовирусов человека 1, 2, 3, 4, 4а, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11a и Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19а, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34а, 35, 35р, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 91. Предпочтительные векторы получены из аденовирусов типа 2 и 5 человека. Если не указано иное, все номера нуклеотидов аденовируса типа 5 указаны относительно референснойIn some embodiments, the viral vector is an adenovirus. Adenoviruses are non-enveloped (naked) icosahedral viruses of medium size (90-100 nm), consisting of a nucleocapsid and double-stranded linear genomic DNA. Adenoviruses replicate in the nucleus of mammalian cells using the host replication apparatus. The term adenovirus refers to any virus of the genus Adenoviridiae, including, but not limited to, the adenovirus subgenus of human, bovine, ovine, equine, canine, porcine, mouse and monkey. In particular, human adenoviruses include subgenus A-F, as well as their individual serotypes, individual serotypes and subgenera A-F, including, without limitation, human adenovirus types 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11 (Ad11a and Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 and 91. Preferred vectors are derived from human adenoviruses types 2 and 5 . Unless otherwise noted, all adenovirus type 5 nucleotide numbers are relative to the reference

- 10 043690 последовательности NCBI AC000008.1, представленной в настоящем документе в SEQ ID NO: 52.- 10043690 sequence NCBI AC000008.1, presented herein at SEQ ID NO: 52.

Репликационный цикл аденовируса включает две фазы: раннюю фазу, во время которой экспрессируются 4 транскрипционных единицы (Е1, Е2, Е3 и Е4), и позднюю фазу, которая наступает после начала синтеза вирусной ДНК, и в течение которой экспрессируются поздние транскрипты, прежде всего, с главного позднего промотора (MLP). Поздние транскрипты кодируют большинство структурных белков вируса. Продукты генов Е1, Е2 и Е4 отвечают за транскрипционную активацию, трансформацию клеток, репликацию вирусной ДНК, а также другие вирусные функции, и необходимы для роста вирусной нагрузки.The adenovirus replication cycle includes two phases: an early phase, during which 4 transcription units (E1, E2, E3 and E4) are expressed, and a late phase, which occurs after the onset of viral DNA synthesis, and during which late transcripts, primarily, from the major late promoter (MLP). Late transcripts encode most of the structural proteins of the virus. The products of the E1, E2 and E4 genes are responsible for transcriptional activation, cell transformation, viral DNA replication, as well as other viral functions, and are necessary for the growth of the viral load.

Термин функционально связанный относится к связи элементов полинуклеотида в функциональном отношении. Последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана, если она помещена в функциональное отношение с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с геном, если он влияет на транскрипцию гена. Функционально связанные нуклеотидные последовательности обычно примыкают друг к другу. Однако, поскольку энхансеры обычно функционируют, когда они отделены от промотора несколькими килобазами, а интронные последовательности могут иметь различную длину, некоторые элементы полинуклеотида могут быть функционально связаны, но не фланкированы непосредственно, и могут даже функционировать в транс-конфигурации относительно другого аллеля или хромосомы.The term operably linked refers to the linkage of elements of a polynucleotide in a functional manner. A nucleic acid sequence is operably linked if it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a promoter or enhancer is operably linked to a gene if it influences transcription of the gene. Functionally related nucleotide sequences are usually adjacent to each other. However, since enhancers typically function when separated from the promoter by several kilobases, and intronic sequences can vary in length, some polynucleotide elements may be functionally linked but not directly flanked, and may even function in trans configuration relative to another allele or chromosome.

IV. Модификации слитых белков.IV. Modifications of fusion proteins.

В случае применения в качестве терапевтического средства слитый белок может быть оптимизирован (например, подвергнут созреванию аффинности) с целью улучшения биохимических свойств, включающих аффинность и/или специфичность, улучшения биофизических свойств, включающих агрегацию, стабильность, преципитацию и/или неспецифичные взаимодействия, и/или снижения иммуногенности. Методики созревания аффинности хорошо известны в данной области техники. Например, разнообразие может быть введено в раскрытый слитый белок путем перетасовки ДНК, перетасовки цепей, перетасовки CDR, случайного мутагенеза и/или сайт-специфического мутагенеза.When used as a therapeutic agent, the fusion protein can be optimized (eg, subjected to affinity maturation) to improve biochemical properties including affinity and/or specificity, improve biophysical properties including aggregation, stability, precipitation and/or non-specific interactions, and/ or decreased immunogenicity. Affinity maturation techniques are well known in the art. For example, diversity can be introduced into the disclosed fusion protein by DNA shuffling, strand shuffling, CDR shuffling, random mutagenesis, and/or site-directed mutagenesis.

Обычно оптимизированный слитый белок обладает, по меньшей мере, такой же или по существу такой же (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) аффинностью к лиганду, как и неоптимизированный (или исходный) слитый белок, из которого он был получен. Предпочтительно оптимизированный слитый белок обладает более высокой аффинностью к лиганду по сравнению с исходным слитым белком.Typically, the optimized fusion protein has at least the same or substantially the same (e.g., at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%) affinity for the ligand as the unoptimized (or original) fusion protein from which it was derived. Preferably, the optimized fusion protein has a higher affinity for the ligand compared to the original fusion protein.

Слитые белки (например, исходные и оптимизированные варианты) могут быть сконструированы так, чтобы они содержали некоторые константные (т.е. Fc) области с определенной эффекторной функцией (например, антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC)). Константные области человека известны в уровне техники.Fusion proteins (eg, original and optimized variants) can be designed to contain certain constant (ie, Fc) regions with a specific effector function (eg, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)). Human constant regions are known in the art.

Кроме того, если слитый белок предназначен для применения в качестве терапевтического средства, он может быть конъюгирован с эффекторным средством, таким как низкомолекулярный токсин или радионуклид, при использовании стандартных методов химической конъюгации in vitro. Если эффекторное средство является полипептидом, антитело может быть химически конъюгировано с эффектором или соединено с эффектором в виде слитого белка. Конструирование слитых белков хорошо известно в данной области техники.In addition, if the fusion protein is intended for use as a therapeutic agent, it can be conjugated to an effector agent, such as a small molecule toxin or radionuclide, using standard in vitro chemical conjugation techniques. If the effector agent is a polypeptide, the antibody may be chemically conjugated to the effector or linked to the effector as a fusion protein. The construction of fusion proteins is well known in the art.

V. Способы лечения.V. Methods of treatment.

Вышеуказанные слитые белки или векторы экспрессии могут применяться для лечения различных медицинских показаний. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные слитые белки или векторы экспрессии могут применяться для лечения различных медицинских показаний, которые опосредованы цитокином, например IL-10. Например, слитые белки и векторы экспрессии могут применяться для лечения различных онкологических или воспалительных заболеваний.The above fusion proteins or expression vectors can be used to treat various medical conditions. In some embodiments, the above fusion proteins or expression vectors can be used to treat various medical conditions that are mediated by a cytokine, such as IL-10. For example, fusion proteins and expression vectors can be used to treat various cancer or inflammatory diseases.

При использовании в настоящем документе лечить и лечение означают лечение заболевания у субъекта, например, у млекопитающего, например, у человека. Это включает: (а) подавление заболевания, т.е. прекращение его развития; и (b) облегчение заболевания, т.е. ослабление проявлений патологического состояния. При использовании в настоящем документе термины субъект и пациент относятся к организму, подлежащему лечению с применением способов и композиций, описанных в настоящем документе. Такие организмы предпочтительно включают, без ограничения, млекопитающих (например, мышей, обезьян, лошадей, коров, свиней, псовых, кошачьих и т.п.), и более предпочтительно включает людей.As used herein, treat and cure mean treating a disease in a subject, such as a mammal, such as a human. This includes: (a) disease suppression, e.g. cessation of its development; and (b) alleviation of the disease, i.e. weakening of the manifestations of the pathological condition. As used herein, the terms subject and patient refer to the organism to be treated using the methods and compositions described herein. Such organisms preferably include, but are not limited to, mammals (eg, mice, monkeys, horses, cows, pigs, canines, felines, etc.), and more preferably includes humans.

В некоторых вариантах осуществления слитые белки и векторы экспрессии, раскрытые в настоящем документе, могут применяться для лечения различных форм рака. Раковые клетки подвергают воздействию терапевтически эффективного количества слитого белка или вектора экспрессии с целью ингибировать или уменьшить пролиферацию раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления введение терапевтически эффективного количества слитого белка или вектора экспрессии в раковые клетки снижает активность IL-10 в клетках по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%. Активность IL-10 можно определять с помощью Вестерн- 11 043690 блоттинга, как описано в примере 2. В некоторых вариантах осуществления раскрытый слитый белок или вектор экспрессии может применяться для замедления роста опухоли у субъекта (например, пациента человека, также называемого субъектом человеком), которое может быть достигнуто путем введения эффективного количества слитого белка или вектора экспрессии субъекту. В некоторых вариантах осуществления введение эффективного количества слитого белка или вектора экспрессии субъекту уменьшает опухолевую нагрузку у этого субъекта по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%.In some embodiments, the fusion proteins and expression vectors disclosed herein can be used to treat various forms of cancer. Cancer cells are exposed to a therapeutically effective amount of a fusion protein or expression vector to inhibit or reduce cancer cell proliferation. In some embodiments, introduction of a therapeutically effective amount of the fusion protein or expression vector into cancer cells reduces IL-10 activity in the cells by at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60% , by at least 70%, by at least 80%, by at least 90%, or by at least 95%. IL-10 activity can be determined using Western blotting as described in Example 2. In some embodiments, the disclosed fusion protein or expression vector can be used to inhibit tumor growth in a subject (e.g., a human patient, also referred to as a human subject) which can be achieved by administering an effective amount of the fusion protein or expression vector to a subject. In some embodiments, administering an effective amount of the fusion protein or expression vector to a subject reduces the tumor burden in that subject by at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least by 70%, by at least 80%, or by at least 90%.

Примеры форм рака включают солидные опухоли, опухоли мягких тканей, гемопоэтические опухоли и метастатические поражения. Примеры гемопоэтических опухолей включают лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), В-клеточный, Т-клеточный или FAB ОЛЛ, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоцитарный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), например, трансформировавшийся ХЛЛ, диффузные В-крупноклеточные лимфомы (ДВККЛ), фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, миелодиспластический синдром (МДС), лимфому, болезнь Ходжкина, злокачественную лимфому, неходжкинскую лимфому, лимфому Беркитта, множественную миелому или синдром Рихтера (трансформацию Рихтера). Примеры солидных опухолей включают злокачественные новообразования, например саркомы, аденокарциномы и карциномы, различных органных систем, таких как опухоли, поражающие голову и шею (включая глотку), щитовидную железу, легкое (мелкоклеточную или немелкоклеточную карциному легкого (НМККЛ)), молочную железу, лимфоидную ткань, желудочно-кишечный тракт (например, ротовую полость, пищевод, желудок, печень, поджелудочную железу, тонкую кишку, толстую и прямую кишку, анальный канал), гениталии и мочеполовой тракт (например, почки, уротелий, мочевой пузырь, яичники, матку, шейку матки, эндометрий, предстательную железу, яички), центральную нервную систему (например, нервные или глиальные клетки, например, нейробластому или глиому) или кожу (например, меланому).Examples of cancer forms include solid tumors, soft tissue tumors, hematopoietic tumors, and metastatic lesions. Examples of hematopoietic tumors include leukemia, acute leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL), B-cell, T-cell or FAB ALL, acute myeloid leukemia (AML), chronic myelocytic leukemia (CML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), e.g. CLL, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), follicular lymphoma, hairy cell leukemia, myelodysplastic syndrome (MDS), lymphoma, Hodgkin's disease, malignant lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, multiple myeloma or Richter's syndrome (Richter's transformation). Examples of solid tumors include malignancies such as sarcomas, adenocarcinomas and carcinomas of various organ systems such as tumors affecting the head and neck (including the pharynx), thyroid, lung (small cell or non-small cell lung carcinoma (NSCLC)), breast, lymphoid tissue, gastrointestinal tract (eg, oral cavity, esophagus, stomach, liver, pancreas, small intestine, colon, rectum, anal canal), genitalia, and genitourinary tract (eg, kidneys, urothelium, bladder, ovaries, uterus , cervix, endometrium, prostate, testes), central nervous system (eg, nerve or glial cells, eg neuroblastoma or glioma) or skin (eg, melanoma).

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из меланомы, плоскоклеточной карциномы кожи, базальноклеточной карциномы, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака анального канала, рака шейки матки, немелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы, мелкоклеточного рака легкого, почечноклеточной карциномы, рака предстательной железы, гастроэзофагеального рака, рака толстой и прямой кишки, рака яичка, рака мочевого пузыря, рака яичника, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, холангиокарциномы, рака головного мозга и центральной нервной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы (например, карциномы паращитовидной железы), рака эндометрия, нейроэндокринного рака, лимфомы (например, Ходжкина и неходжкинской), лейкоза, карциномы из клеток Меркеля, желудочно-кишечных стромальных опухолей, множественной миеломы, рака матки, саркомы, рака почки, рака глаза, рака поджелудочной железы и герминогенного рака (например, герминогенного рака яичника). В некоторых вариантах осуществления рак может быть выбран из лейкоза, рака молочной железы, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака головного мозга, рака кожи, рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака головы и шеи и лейкоза. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из лейкоза, рака молочной железы, рака шейки матки, рака толстой и прямой кишки, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака желудка, рака головы и шеи, рака эндометрия и рака яичника.In some embodiments, the cancer is selected from melanoma, squamous cell carcinoma of the skin, basal cell carcinoma, head and neck cancer, breast cancer, anal cancer, cervical cancer, non-small cell lung cancer, mesothelioma, small cell lung cancer, renal cell carcinoma, prostate cancer, gastroesophageal cancer, colon and rectal cancer, testicular cancer, bladder cancer, ovarian cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, brain and central nervous system cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer (eg, parathyroid carcinoma), endometrial cancer, neuroendocrine cancer, lymphoma (eg, Hodgkin and non-Hodgkin), leukemia, Merkel cell carcinoma, gastrointestinal stromal tumors, multiple myeloma, uterine cancer, sarcoma, kidney cancer, eye cancer, pancreatic cancer, and germ cell cancer (eg , germ cell ovarian cancer). In some embodiments, the cancer may be selected from leukemia, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, colon and rectal cancer, cancer stomach, head and neck cancer and leukemia. In some embodiments, the cancer is selected from leukemia, breast cancer, cervical cancer, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer, head and neck cancer, endometrial cancer, and ovarian cancer.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок или вектор экспрессии согласно настоящему изобретению вводят для уменьшения уровней одного или более цитокинов у нуждающегося в этом субъекта (например, субъекта с воспалительным заболеванием). В некоторых вариантах осуществления раскрытый слитый белок или вектор экспрессии могут применяться для лечения воспалительного заболевания у субъекта (например, субъекта человека), которое может быть выполнено путем введения эффективного количества слитого белка или вектора экспрессии субъекту.In some embodiments, a fusion protein or expression vector of the present invention is administered to reduce the levels of one or more cytokines in a subject in need thereof (eg, a subject with an inflammatory disease). In some embodiments, the disclosed fusion protein or expression vector can be used to treat an inflammatory disease in a subject (eg, a human subject), which can be accomplished by administering an effective amount of the fusion protein or expression vector to the subject.

В настоящем описании воспалительное состояние представляет собой заболевание или состояние, характеризуемое, полностью или частично, воспалением или воспалительным ответом у пациента. Воспалительные состояния, которые можно лечить с применением слитых белков или векторов экспрессии согласно изобретению, можно охарактеризовать, например, на основе первичной поражаемой ткани, механизма действия, служащего первопричиной состояния, или части иммунной системы, активность которой нарушается или избыточно повышается. В некоторых вариантах осуществления примеры воспалительных состояний, которые можно лечить, включают воспаление легких (например, астму, респираторный дистресс-синдром взрослых, бронхит, легочное воспаление, легочный фиброз и муковисцидоз), суставов (например, ревматоидный артрит, ревматоидный спондилит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, подагрический артрит и другие артритические состояния), соединительной ткани, глаз (например, увеит (включая ирит), конъюнктивит, склерит и сухой кератоконъюнктивит), носа, кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительный колит, воспалительные заболевания кишечника, синдром воспаленного кишечника и дистальный проктит), почки (например, гломерулонефрит, интерстициальный нефрит, волчаночный нефрит, вторичный нефрит при болезни Вегенера, вторичная острую почечную недостаточность при остром нефрите, синдром Гудпасчера, постобструктивный синAs used herein, an inflammatory condition is a disease or condition characterized, in whole or in part, by inflammation or an inflammatory response in a patient. Inflammatory conditions that can be treated using fusion proteins or expression vectors according to the invention can be characterized, for example, based on the primary tissue affected, the mechanism of action that serves as the underlying cause of the condition, or the part of the immune system that is impaired or excessively increased in activity. In some embodiments, examples of inflammatory conditions that may be treated include inflammation of the lungs (e.g., asthma, adult respiratory distress syndrome, bronchitis, pulmonary inflammation, pulmonary fibrosis, and cystic fibrosis), joint inflammation (e.g., rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, juvenile rheumatoid arthritis , osteoarthritis, gouty arthritis and other arthritic conditions), connective tissue, eyes (eg, uveitis (including iritis), conjunctivitis, scleritis, and keratoconjunctivitis sicca), nose, bowel (eg, Crohn's disease, ulcerative colitis, inflammatory colitis, inflammatory bowel disease , inflammatory bowel syndrome and distal proctitis), kidney (eg, glomerulonephritis, interstitial nephritis, lupus nephritis, secondary nephritis in Wegener's disease, secondary acute renal failure in acute nephritis, Goodpasture's syndrome, post-obstructive syndrome

- 12 043690 дром и тубулярную ишемию), печени (например, гепатит (возникающий в результате вирусной инфекции, аутоиммунных ответов, лекарственной терапии, действия токсинов, факторов внешней среды или как вторичное последствие первичного нарушения), ожирение, билиарную атрезию, первичный билиарный цирроз и первичный склерозирующий холангит), кожи (например, псориаз, экзему и дерматит, например, экзематозные дерматиты, атопический и себорейный дерматит, аллергический или раздражающий контактный дерматит, экзему кракеле, фотоаллергический дерматит, фототоксический дерматит, фитофотодерматит, радиационный дерматит и стазисный дерматит), центральной нервной системы (например, рассеянный склероз и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона или деменцию, связанную с ВИЧ-инфекцией), сосудистой системы (например, повреждение при инфаркте вследствие ишемической болезни сердца, заболевание периферических сосудов, миокардит, васкулит, реваскуляризацию стеноза, атеросклероз и сосудистое заболевание, связанное с диабетом II типа), эндокринной системы (например, аутоиммунный тиреоидит (болезнь Хашимото), диабет I типа, воспаление печени и жировой ткани, ассоциированное с диабетом II типа, а также острое и хроническое воспаление коры надпочечников), сердца или жировой ткани. В настоящем изобретении предусмотрено, что некоторые воспалительные состояния включают воспаление во многих тканях. Кроме того, в настоящем описании предусмотрено, что некоторые воспалительные состояния могут быть подразделены на несколько категорий. В некоторых вариантах осуществления воспалительное состояние является аутоиммунным заболеванием. Типичные аутоиммунные заболевания включают, без ограничения перечисленными, ревматоидный артрит, псориаз (включая бляшковидный псориаз), псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит, рассеянный склероз, волчанку, алопецию, аутоиммунный панкреатит, целиакию, болезнь Бехчета, болезнь Кушинга, болезнь Грейвса. В некоторых вариантах осуществления воспалительное состояние является ревматоидным нарушением. Примеры ревматоидных нарушений включают, без ограничения перечисленными, ревматоидный артрит, ювенильный артрит, бурсит, спондилит, подагру, склеродермию, болезнь Стилла и васкулит. Следует отметить, что некоторые категории состояний перекрываются. Например, ревматоидный артрит является воспалительным ревматоидным нарушением, воспалительным заболеванием суставов и аутоиммунным нарушением.- 12 043690 droma and tubular ischemia), liver (for example, hepatitis (resulting from viral infection, autoimmune responses, drug therapy, toxins, environmental factors or as a secondary consequence of a primary disorder), obesity, biliary atresia, primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis), skin (eg, psoriasis, eczema and dermatitis, such as eczematous dermatitis, atopic and seborrheic dermatitis, allergic or irritant contact dermatitis, crackle eczema, photoallergic dermatitis, phototoxic dermatitis, phytophotodermatitis, radiation dermatitis and stasis dermatitis), central nervous system (eg, multiple sclerosis and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, or HIV-related dementia), vascular system (eg, infarction injury due to coronary artery disease, peripheral vascular disease, myocarditis, vasculitis, revascularization stenosis, atherosclerosis and vascular disease associated with type II diabetes), endocrine system (eg, autoimmune thyroiditis (Hashimoto's disease), type I diabetes, inflammation of the liver and adipose tissue associated with type II diabetes, and acute and chronic inflammation of the adrenal cortex ), heart or adipose tissue. The present invention provides that certain inflammatory conditions involve inflammation in multiple tissues. In addition, the present description provides that certain inflammatory conditions can be divided into several categories. In some embodiments, the inflammatory condition is an autoimmune disease. Typical autoimmune diseases include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, psoriasis (including plaque psoriasis), psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, ulcerative colitis, multiple sclerosis, lupus, alopecia, autoimmune pancreatitis, celiac disease, Behcet's disease, Cushing's disease, Graves' disease. In some embodiments, the inflammatory condition is a rheumatoid disorder. Examples of rheumatoid disorders include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, bursitis, spondylitis, gout, scleroderma, Still's disease and vasculitis. It should be noted that some condition categories overlap. For example, rheumatoid arthritis is an inflammatory rheumatoid disorder, an inflammatory joint disease, and an autoimmune disorder.

Термин эффективное количество при использовании в настоящем документе относится к количеству активного компонента (например, количеству слитого белка или вектора экспрессии настоящего изобретения), достаточному, чтобы произвести полезные или требуеиые результаты. Эффективное количество может быть введено в одном или более введениях, применениях или дозах и не должно быть ограничено конкретной композицией или путем введения.The term effective amount as used herein refers to an amount of active component (eg, an amount of a fusion protein or expression vector of the present invention) sufficient to produce the useful or desired results. An effective amount may be administered in one or more administrations, applications or dosages and should not be limited to a particular composition or route of administration.

В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество слитого белка находится в диапазоне от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, например, от 1 мг/кг до 100 мг/кг, от 1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 5 мг/кг, 10 мг/кг, 7,5 мг/кг, 5 мг/кг или 2,5 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество вектора экспрессии, например рекомбинантного вируса, находится в пределах 102-10¹⁵ бляшкообразующих единиц (БОЕ), например, 102-10¹⁰, 102-105, 105-10¹⁵, 105-10¹⁰ или 1010-10¹⁵ бляшкообразующих единиц. Вводимое количество будет зависеть от таких переменных, как тип и степень заболевания или показания, подлежащего лечению, общее состояние здоровья пациента, активность слитого белка или вектора экспрессии in vivo, фармацевтическая композия и путь введения. Начальная доза может быть увеличена до выличины выше верхнего уровня, чтобы быстро получить требуемую концентрацию в крови или в ткани. В альтернативе начальная доза может ниже оптимальной, при этом ежедневную дозу могут постепенно повышать в течение курса лечения. Доза для человека может быть оптимизирована, например, в обычном исследовании Фазы I с повышением дозы с 0,5 мг/кг до 20 мг/кг. Частота введения доз может изменяться в зависимости от таких факторов, как путь введения, величина дозы, полупериод существования антитела в сыворотке и подвергаемое лечению заболевание. Примеры частоты введения доз включают один раз в день, один раз в неделю и один раз в две недели. Предпочтительный путь введения является парентеральным, например, внутривенной инфузией. Изготовление композиций лекарственных средств на основе слитого белка или вектора экспрессии хорошо известно в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления слитый белок или вектор экспрессии лиофилизируют, а затем восстанавливают в забуференном растворе хлорида натрия во время введения.In some embodiments, the therapeutically effective amount of the fusion protein is in the range from 0.1 mg/kg to 100 mg/kg, for example, from 1 mg/kg to 100 mg/kg, from 1 mg/kg to 10 mg/kg, from 1 mg/kg to 5 mg/kg, 10 mg/kg, 7.5 mg/kg, 5 mg/kg or 2.5 mg/kg. In some embodiments, the therapeutically effective amount of an expression vector, such as a recombinant virus, is in the range of ^102-1015 plaque forming units (PFU), such as ^102-1010 , 102-105, ^105-1015 , ^105-1010 , or 1010- 10 ¹⁵ plaque-forming units. The amount administered will depend on variables such as the type and extent of the disease or indication being treated, the general health of the patient, the in vivo activity of the fusion protein or expression vector, the pharmaceutical composition, and the route of administration. The initial dose may be increased above the upper level to quickly achieve the desired blood or tissue concentration. Alternatively, the initial dose may be lower than optimal, with the daily dose gradually increased over the course of treatment. The human dose may be optimized, for example in a conventional Phase I study with a dose escalation from 0.5 mg/kg to 20 mg/kg. The frequency of dosing may vary depending on factors such as the route of administration, dose size, half-life of the antibody in the serum, and the disease being treated. Examples of dosing frequencies include once daily, once weekly, and once every two weeks. The preferred route of administration is parenteral, for example, intravenous infusion. The preparation of drug compositions based on a fusion protein or expression vector is well known in the art. In some embodiments, the fusion protein or expression vector is lyophilized and then reconstituted in a buffered sodium chloride solution at the time of administration.

Для терапевтического применения слитый белок или вектор экспрессии предпочтительно объединяют с фармацевтически приемлемым носителем. При использовании в настоящем документе термин фармацевтически приемлемый носитель означает буферы, носители и вспомогательные вещества, подходящие для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других нежелательных реакций или осложнений, соизмеримых с разумным отношением пользы/риска. Носитель(и) должен быть приемлемым в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами композиций и не является токсичным для реципиента. Фармацевтически приемлемые носители включают буферы, растворители, дисперсионные среды, покрытия, изотонические вещества и замедлители абсорбции и т.п., которые совместимы с фармацевтическим введением. Применение таких сред и добавок для фармацевтически активных веществ известно в уровне техники.For therapeutic use, the fusion protein or expression vector is preferably combined with a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier means buffers, carriers and excipients suitable for use in contact with tissues of humans and animals without undue toxicity, irritation, allergic response or other adverse reactions or complications commensurate with a reasonable benefit/risk ratio. The carrier(s) must be acceptable in the sense that it is compatible with the other ingredients of the compositions and is not toxic to the recipient. Pharmaceutically acceptable carriers include buffers, solvents, dispersion media, coatings, isotonic agents and absorption retarders, and the like, which are compatible with pharmaceutical administration. The use of such media and additives for pharmaceutically active substances is known in the art.

Фармацевтические композиции, содержащие слитые белки или векторы экспрессии, раскрытые вPharmaceutical compositions containing fusion proteins or expression vectors disclosed in

- 13 043690 настоящем документе, могут быть представлены в единичной лекарственной форме и могут быть изготовлены любым подходящим способом.- 13 043690 herein, may be presented in unit dosage form and may be manufactured by any suitable method.

Фармацевтическая композиция должна иметь состав, соответствующий ее предполагаемому пути введения. Примерами путей введения являются внутривенное (в/в), внутрикожное, ингаляционное, внутриглазное, интраназальное, трансдермальное, наружное, чресслизистое и ректальное введение.The pharmaceutical composition must have a composition appropriate for its intended route of administration. Examples of routes of administration include intravenous (IV), intradermal, inhalation, intraocular, intranasal, transdermal, topical, transmucosal, and rectal.

Предпочтительным путем введения слитых белков является в/в инфузия. Полезные композиции могут быть получены способами, известными в области фармацевтики. Например, см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990). Компоненты композиции, подходящие для парентерального введения, включают стерильный разбавитель, такой как воду для инъекций, раствор хлорида натрия, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновую кислоту или бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как ЭДТА; буферные вещества, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и регуляторы тоничности, такие как хлорид натрия или декстрозу.The preferred route of administration of the fusion proteins is intravenous infusion. Useful compositions can be prepared by methods known in the pharmaceutical field. For example, see Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990). Components of the composition suitable for parenteral administration include a sterile diluent such as water for injection, sodium chloride solution, fixed oils, polyethylene glycols, glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methylparabens; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as EDTA; buffering agents such as acetates, citrates or phosphates; and tonicity regulators such as sodium chloride or dextrose.

Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Носитель должен быть стабильным в условиях производства и хранения, и должен быть предохранен от воздействия микроорганизмов. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.For intravenous administration, suitable vehicles include saline, bacteriostatic water, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ), or phosphate-buffered saline (PBS). The carrier must be stable under the conditions of production and storage, and must be protected from exposure to microorganisms. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyhydric alcohol (eg, glycerin, propylene glycol and liquid polyethylene glycol) and suitable mixtures thereof.

Фармацевтические композиции предпочтительно являются стерильными. Стерилизация может быть выполнена любым подходящим способом, например, путем фильтрации через стерилизующие фильтрующие мембраны. Если композицию лиофилизируют, стерилизация фильтрованием может быть выполнена до или после лиофилизации и восстановления. В некоторых вариантах осуществления средство доставки (например, рекомбинантный вирус) и/или терапевтическое средство согласно изобретению вводят в комбинации с ингибитором контрольной точки, например, антителом против CTLA-4, антителом против PD-1 или антителом против PD-L1. Примеры антител против PD-1 включают, например, ниволумаб (Опдиво®, Bristol-Myers Squibb Co.), пембролизумаб (Китруда®, Merck Sharp & Dohme Corp.), PDR001 (Novartis Pharmaceuticals) и пидилизумаб (СТ-011, Cure Tech). Примеры антител против PD-L1 включают, например, атезолизумаб (Тецентрик®, Genentech), дувалумаб (AstraZeneca), MEDI4736, авелумаб (Бавенсио®, EMD Serono) и BMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.).The pharmaceutical compositions are preferably sterile. Sterilization can be accomplished by any suitable method, for example by filtration through sterilizing filter membranes. If the composition is lyophilized, filter sterilization may be performed before or after lyophilization and reconstitution. In some embodiments, the delivery vehicle (eg, a recombinant virus) and/or therapeutic agent of the invention is administered in combination with a checkpoint inhibitor, for example, an anti-CTLA-4 antibody, an anti-PD-1 antibody, or an anti-PD-L1 antibody. Examples of anti-PD-1 antibodies include, for example, nivolumab (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb Co.), pembrolizumab (Keytruda®, Merck Sharp & Dohme Corp.), PDR001 (Novartis Pharmaceuticals), and pidilizumab (CT-011, Cure Tech ). Examples of anti-PD-L1 antibodies include, for example, atezolizumab (Tecentriq®, Genentech), duvalumab (AstraZeneca), MEDI4736, avelumab (Bavencio®, EMD Serono) and BMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.).

Термин вводимый в комбинации при использовании в настоящем документе означает, что у субъекта в течение заболевания у субъекта применяют два (или более) разных лечения, при этом действие лечений у субъекта перекрываются в определенный момент времени. В некоторых вариантах осуществления доставка одного лечения все еще продолжается, когда начинают доставку второго, при этом в отношении введения присутствует перекрывание. Это в настоящем документе иногда называют одновременной или параллельной доставкой. В других вариантах осуществления доставку одного лечения заканчивают до начала доставки другого лечения. В некоторых вариантах осуществления в другом случае лечение является более эффективным из-за комбинированного введения. Например, второе лечение является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдается при меньшем количестве второго лечения, или второе лечение уменьшает симптомы в большей степени, чем можно было бы наблюдать, если бы второе лечение применяли в отсутствие первого лечения, или аналогичная ситуация наблюдается с первым лечением. В некоторых вариантах осуществления доставка является такой, что уменьшение симптома или другого параметра, связанного с нарушением, больше, чем наблюдаемое при одном лечении, доставляемым в отсутствие другого. Эффект двух лечений может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или больше аддитивного. Доставка может быть такой, что эффект первого доставленного лечения все еще может быть обнаружен при доставке второго лечения.The term administered in combination as used herein means that two (or more) different treatments are administered to a subject during the course of a disease in the subject, wherein the effects of the treatments overlap at a particular point in time in the subject. In some embodiments, delivery of one treatment is still ongoing when delivery of the second begins, and there is overlap with respect to administration. This is sometimes referred to herein as simultaneous or parallel delivery. In other embodiments, delivery of one treatment is completed before delivery of the other treatment begins. In some embodiments, the treatment is otherwise more effective due to combined administration. For example, the second treatment is more effective, for example, an equivalent effect is observed with less of the second treatment, or the second treatment reduces symptoms to a greater extent than would be observed if the second treatment were used in the absence of the first treatment, or a similar situation occurs with the first treatment. In some embodiments, delivery is such that the reduction in a symptom or other parameter associated with the disorder is greater than that observed with one treatment delivered in the absence of the other. The effect of the two treatments may be partially additive, fully additive, or more additive. Delivery may be such that the effect of the first treatment delivered can still be detected upon delivery of the second treatment.

По всему тексту описания, где композиции, устройства и системы описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные компоненты, или где процессы и способы описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные этапы, предполагается, что помимо этого существуют композиции устройства и системы согласно настоящему изобретению, которые по существу состоят или состоят из перечисленных компонентов, и что существуют процессы и способы согласно настоящему изобретению, которые состоят по существу или состоят из перечисленных этапов обработки.Throughout the specification, where compositions, devices and systems are described as having, including or containing specific components, or where processes and methods are described as having, including or containing specific steps, it is intended that there are also device and system compositions according to the present invention. which essentially consist of or consist of the listed components, and that there are processes and methods according to the present invention that consist essentially of or consist of the listed processing steps.

В изобретении, когда указано, что элемент или компонент включен и/или выбран из списка перечисленных элементов или компонентов, следует понимать, что элемент или компонент может быть любым из перечисленных элементов или компонентов, или элемент или компонент может быть выбран из группы, состоящей из двух или более перечисленных элементов или компонентов.In the invention, when an element or component is stated to be included and/or selected from a list of listed elements or components, it is understood that the element or component may be any of the listed elements or components, or the element or component may be selected from the group consisting of two or more of the listed elements or components.

Кроме того, следует понимать, что элементы и/или признаки композиции или способа, описанные в настоящем документе, могут комбинировать различными способами без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, в явной или неявной форме изложенных в данном документе. Например, если приведена ссылка на конкретный вирус, этот вирус может применяться в различных вариантахIn addition, it should be understood that elements and/or features of the composition or method described herein may be combined in various ways without departing from the spirit and scope of the present invention as expressly or impliedly set forth herein. For example, if a link is provided to a specific virus, that virus can be used in different ways

- 14 043690 осуществления композиций согласно настоящему изобретению и/или в способах согласно настоящему изобретению, если иное не следует из контекста. Другими словами, в рамках настоящего изобретения варианты осуществления были описаны и представлены таким образом, который позволяет написать и изобразить четкое и краткое применение, однако следует понимать, что варианты осуществления могут различными способами комбинировать или разделять без отступления от настоящих принципов и изобретения (изобретений). Например, следует понимать, что все признаки, описанные и изображенные в настоящем документе, могут применяться ко всем аспектам изобретения (изобретений), описанным и изображенным в настоящем документе.- 14 043690 implementation of the compositions according to the present invention and/or in the methods according to the present invention, unless otherwise clear from the context. In other words, while the embodiments of the present invention have been described and presented in a manner that allows clear and concise application to be written and depicted, it is to be understood that the embodiments may be combined or separated in various ways without departing from the present principles and invention(s). For example, it should be understood that all features described and depicted herein may apply to all aspects of the invention(s) described and depicted herein.

Следует понимать, что выражение по меньшей мере один из индивидуально включает в себя каждый из перечисленных после выражения объектов и различные комбинации двух или более перечисленных объектов, если иное не следует из контекста и применения. Выражение и/или в отношении трех или больше перечисленных объектов следует понимать как имеющее одинаковое значение, если из контекста не следует иное.It should be understood that the expression at least one of individually includes each of the objects listed after the expression and various combinations of two or more of the listed objects, unless the context and application otherwise require. The expression and/or in relation to three or more of the listed objects should be understood as having the same meaning unless the context otherwise requires.

Использование термина включать, включает, включающий, иметь, имеет, имеющий, содержать, содержит или содержащий, включая их грамматические эквиваленты, нужно понимать как открытое и неограничивающее, например, не исключающее дополнительные неуказанные элементы или этапы, если иное прямо не указано или не следует из контекста.The use of the term include, includes, includes, have, has, having, contains, contains or containing, including their grammatical equivalents, is to be understood as open-ended and non-limiting, for example, not excluding additional unspecified elements or steps, unless otherwise expressly stated or required from the context.

Если термин приблизительно используется перед количественным значением, настоящее изобретение также включает само определенное количественное значение, если прямо не указано иное. При использовании в настоящем документе термин приблизительно относится к отклонению на ччч10% от номинального значения, если не указано или не следует иное.When the term approximately is used before a quantitative value, the present invention also includes the quantitative value itself, unless expressly stated otherwise. As used herein, the term approximately refers to a deviation of hh10% from the nominal value unless otherwise stated or indicated.

Нужно понимать, что порядок этапов или порядок выполнения определенных действий являются несущественным при условии, что настоящее изобретение остается действующим. Кроме того, два или больше этапов или действий могут быть проведены одновременно.It should be understood that the order of steps or the order in which certain actions are performed is immaterial so long as the present invention remains operational. In addition, two or more steps or activities may be carried out simultaneously.

Использование любых возможных примеров или вводных слов перед перечислением примеров в настоящем документе, например такой как или включающий, предназначено просто для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем изобретения, если не указано иное. Ни одно выражение в описании не должно рассматриваться как указывающее на какой-либо незаявленный элемент как существенный для практического осуществления настоящего изобретения.The use of any possible examples or introductory words before listing examples herein, such as or including, is merely intended to better illustrate the present invention and does not limit the scope of the invention unless otherwise indicated. Nothing in the specification should be construed as indicating any unstated element as essential to the practice of the present invention.

ПримерыExamples

Следующие примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или содержания изобретения каким-либо образом.The following examples are illustrative only and are not intended to limit the scope or content of the invention in any way.

Пример 1. Конструирование плазмиды слитого белка IL-10RA.Example 1 Construction of an IL-10RA fusion protein plasmid.

В данном примере описано получение плазмид и вирусных векторов экспрессии, кодирующих слитые белки IL-10RA.This example describes the production of plasmids and viral expression vectors encoding IL-10RA fusion proteins.

Были созданы нуклеотидные последовательности, кодирующие серию слитых белков IL-10RA человека. Первый слитый белок, hIL-10R-IgG1 (SEQ ID NO: 58), включал остатки 1-229 IL-10RA человека (заканчивающиеся SLTRQ), после которых сразу следовали остатки 84-330 последовательности IgG1 человека (начинающиеся с NVNHK). Второй слитый белок, hIL-10R-Fc (SEQ ID NO: 48), включал остатки 1-235 IL-10RA человека (заканчивающиеся FTVTN), после которых сразу следовали остатки 104-324 IgG1 человека (начинающиеся с DKTHT). Подробное описание слитых белков показано в табл. 3.Nucleotide sequences encoding a series of human IL-10RA fusion proteins were generated. The first fusion protein, hIL-10R-IgG1 (SEQ ID NO: 58), included residues 1-229 of human IL-10RA (ending with SLTRQ), immediately followed by residues 84-330 of the human IgG1 sequence (starting with NVNHK). The second fusion protein, hIL-10R-Fc (SEQ ID NO: 48), included residues 1-235 of human IL-10RA (ending with FTVTN), immediately followed by residues 104-324 of human IgG1 (starting with DKTHT). A detailed description of the fusion proteins is shown in Table. 3.

Таблица 3Table 3

Соединение hIL-10RA-hIgGlCompound hIL-10RA-hIgGl

SLTRQNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTSLTRQNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT

SLTRQYFTVTN-DKTHTSLTRQYFTVTN-DKTHT

Нуклеотидные последовательности, кодирующие слитые белки, клонировали в плазмиды для последующих применений при необходимости. В частности, были созданы рекомбинантные аденовирусные векторы, которые не экспрессировали трансген, экспрессировали hIL-10R-IgG1 или hIL-10RA-Fc.The nucleotide sequences encoding the fusion proteins were cloned into plasmids for subsequent applications as needed. In particular, recombinant adenoviral vectors were created that did not express the transgene, expressed hIL-10R-IgG1 or hIL-10RA-Fc.

Пример 2. Активность слитого белка IL-10R.Example 2: Activity of IL-10R Fusion Protein.

Клетки А549 (клетки рака легкого человека) инфицировали вирусными векторами, не экспрессирующими трансген, экспрессирующими hIL-10R-IgG1 или hIL-10RA-Fc, как описано в Примере 1, в количестве 10 MOI и культивировали в течение четырех дней. Кондиционированную среду из культуры клеток собирали и суспендировали клетки ТНР-1 (человеческие лейкозные моноциты) в кондиционированной среде при плотности 5х10⁶ клеток/мл. Клетки обрабатывали либо человеческим IL-10 в концентрации 50 нг/мл при 37°С в течение 30 минут, либо хранили в качестве контролей. Для анализа активности IL-10, выделенный клеточный белок из клеток ТНР-1 исследовали с помощью Вестерн-блоттинга на фосфорилированный Stat3. Общий Stat3 использовали в качестве контроля нанесения.A549 cells (human lung cancer cells) were infected with non-transgene expressing viral vectors expressing hIL-10R-IgG1 or hIL-10RA-Fc as described in Example 1 at 10 MOI and cultured for four days. Conditioned medium from the cell culture was collected and THP-1 cells (human leukemia monocytes) were suspended in conditioned medium at a density of 5x10 ⁶ cells/ml. Cells were treated with either human IL-10 at a concentration of 50 ng/ml at 37°C for 30 minutes or stored as controls. To analyze IL-10 activity, isolated cellular protein from THP-1 cells was examined by Western blotting for phosphorylated Stat3. Total Stat3 was used as an application control.

IL-10 вызвал фосфорилирование Stat3 в клетках ТНР-1, культивируемых в кондиционированных средах зараженных вирусными векторами клеток, не экспрессирующих трансген или экспрессирующих hIL-10RA-Fc. Однако IL-10 не вызвал фосфорилирование Stat3 в клетках ТНР-1, культивируемых в конСлитый белокIL-10 induced Stat3 phosphorylation in THP-1 cells cultured in conditioned media of viral vector-infected cells not expressing the transgene or expressing hIL-10RA-Fc. However, IL-10 did not induce Stat3 phosphorylation in THP-1 cells cultured into the conFusion protein

Остатки hlL10RAResidues hlL10RA

Остатки hlgGl hIL-10R-IgGl hIL-10R-FcResidues hlgGl hIL-10R-IgGl hIL-10R-Fc

1-2291-229

1-2351-235

84-33084-330

104-324104-324

--

Claims

conditioned media of cells infected with a virus expressing hIL10R-IgG. These results demonstrate that the hIL-10R-IgG1 fusion protein blocked IL-10-induced activation of the Stat3 signaling cascade.

Incorporation by reference

The entire description of each of the patent documents and scientific articles referenced herein is incorporated by reference in all respects.

Equivalents

The invention may be embodied in other specific forms without departing from its essence or essential characteristics. Thus, the above embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not limiting of the invention described herein. Accordingly, the scope of the invention is indicated by the appended claims and not by the foregoing description, and all modifications that come within the meaning and scope of the claims are intended to be included therein.

CLAIM

1. An isolated fusion protein comprising, in N- to C-terminal orientation:

(i) a soluble portion of the extracellular domain of the IL-10 receptor alpha subunit, wherein the soluble portion of the extracellular domain of the IL-10 receptor has greater than 95% sequence identity to amino acid residues 22-229 of SEQ ID NO: 12;

(ii) an amino acid linker;

(iii) an immunoglobulin (Ig) hinge region; and (iv) an immunoglobulin (Ig) Fc domain, wherein the Ig hinge region and the Ig Fc domain together contain an amino acid sequence having greater than 95% identity with SEQ ID NO: 13-21;

where the linker consists of from 10 to 40 amino acid residues, and the linker contains a sequence derived from an endogenous human protein.

2. The isolated fusion protein of claim 1, wherein the linker consists of 10 to 30 amino acid residues, 10 to 20 amino acid residues, or 10 to 15 amino acid residues.

3. The isolated fusion protein of claim 1 or 2, wherein the linker includes a sequence derived from a cytokine, signaling molecule, immunomodulatory protein or peptide; sequence derived from human protein selected from albumin and casein; or the C-terminal portion of the CH1 domain of an immunoglobulin (Ig).

4. The isolated fusion protein of claim 1 or 2, wherein the linker comprises the C-terminal portion of an immunoglobulin (Ig) CH1 domain selected from the CH1 domain of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE and IgM.

5. The isolated fusion protein according to claim 1 or 2, where the linker contains an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 57.

6. The isolated fusion protein of any one of claims 1 to 5, wherein the linker comprises an amino acid sequence that is proteolytically stable in a mammal or plant, or includes a cleavage site.

7. An isolated fusion protein according to any one of claims 1 to 6, wherein the fusion protein comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55 , SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58; the fusion protein includes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58; or the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58.

8. A human IL-10 binding protein comprising two fusion proteins according to any one of claims 1 to 7, wherein each fusion protein comprises an extracellular domain of a human IL-10 receptor, wherein the two fusion proteins are covalently linked to each other, and wherein the two extracellular domains are together define a binding site for human IL-10 binding.

9. An isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a fusion protein according to any one of claims 1 to 7.

10. An expression vector comprising the nucleic acid according to claim 9.

11. A host cell comprising the expression vector of claim 10.

12. A method for producing a fusion protein, comprising:

(a) growing the host cell according to claim 11 under conditions for expressing the fusion protein;

(b) purifying the fusion protein.

13. A pharmaceutical composition comprising (i) a fusion protein according to any one of claims 1 to 7, a human IL-10 binding protein according to claim 8 or an expression vector according to claim 10; and (ii) at least one pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

14. A method of expressing a fusion protein in a target cell, comprising contacting the cell with an effective amount of the expression vector of claim 10 to express the fusion protein.

-