EA043681B1 - ANTI-TIGIT ANTIBODIES AND THEIR USE AS THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC AGENTS - Google Patents
ANTI-TIGIT ANTIBODIES AND THEIR USE AS THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC AGENTS Download PDFInfo
- Publication number
- EA043681B1 EA043681B1 EA202091587 EA043681B1 EA 043681 B1 EA043681 B1 EA 043681B1 EA 202091587 EA202091587 EA 202091587 EA 043681 B1 EA043681 B1 EA 043681B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- tigit
- chain variable
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 7
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 title description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 title description 3
- 101100369641 Mus musculus Tigit gene Proteins 0.000 claims description 85
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 30
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 14
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 102000049823 human TIGIT Human genes 0.000 claims description 9
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 claims 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims 1
- 101100226902 Mus musculus Fcrlb gene Proteins 0.000 claims 1
- 241001614181 Phera Species 0.000 claims 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 claims 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims 1
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 claims 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 claims 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 102100029740 Poliovirus receptor Human genes 0.000 description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 20
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 13
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 230000005883 trogocytosis Effects 0.000 description 10
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 9
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 9
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 102100035488 Nectin-2 Human genes 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 108010048507 poliovirus receptor Proteins 0.000 description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 4
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 102200056122 rs11570605 Human genes 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000012739 FreeStyle 293 Expression medium Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000596234 Homo sapiens T-cell surface protein tactile Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 101100495513 Mus musculus Cflar gene Proteins 0.000 description 1
- 101150065403 NECTIN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060005251 Nectin Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102100021797 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710174326 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100035268 T-cell surface protein tactile Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 102000007379 beta-Arrestin 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010032967 beta-Arrestin 2 Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 102220430030 c.109A>G Human genes 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940126546 immune checkpoint molecule Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000008299 semisolid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- -1 that is Proteins 0.000 description 1
- 208000013076 thyroid tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Description
Родственная заявкаRelated Application
Данная заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент № PCT/CN 2017/120392, поданной 30 декабря 2017 г. Полное содержание вышеупомянутой заявки включено в данное описание посредством ссылки для всех целей.This application claims priority to Patent Application No. PCT/CN 2017/120392, filed December 30, 2017. The entire contents of the above application are incorporated herein by reference for all purposes.
Область техникиField of technology
Настоящая заявка относится к антителам, которые специфически связываются с TIGIT (Тклеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM), и их применению.The present application relates to antibodies that specifically bind to TIGIT (Tissue Immunoreceptor with Ig and ITIM domains) and their use.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Tigit (Т-клеточный иммуноглобулин и домен ITIM) является трансмембранным белком типа I, членом семейства белков CD28, который играет важную роль в ингибировании опосредованных Т-клетками и NK-клетками функциональных активностей в противоопухолевом иммунитете [Boles KS, et al, 2009 Eur J Immunol, 39: 695-703; Stanietsky N. et al., 2009 PNAS 106: 17858-63; Yu X et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57].Tigit (T cell immunoglobulin and ITIM domain) is a type I transmembrane protein, a member of the CD28 family of proteins, which plays an important role in inhibiting T cell and NK cell mediated functional activities in antitumor immunity [Boles KS, et al, 2009 Eur J Immunol 39: 695–703; Stanietsky N. et al., 2009 PNAS 106: 17858-63; Yu X et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57].
Гены и кДНК кодирующие TIGIT, были клонированы и охарактеризованы у мышей и людей. Полноразмерный TIGIT человека имеет последовательность длиной 244 аминокислоты (SEQ ID NO: 1), в которой первые 21 аминокислота составляют сигнальный пептид. Аминокислотная последовательность зрелого TIGIT человека содержит 223 аминокислотных (аа) остатка (учетный номер NCBI: NM_173799). Внеклеточный домен (ECD) зрелого TIGIT человека состоит из 120 аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 2, соответствующих аминокислотам 22-141 SEQ ID NO: 1) с Ig-подобным доменом V-типа (соответствует аминокислотам 39-127 SEQ ID NO: 1), за которыми следуют трансмембранная последовательность из 21 аминокислоты (аа) и цитоплазматический домен из 82 аминокислот (аа) с иммунорецепторным ингибиторным мотивом на основе тирозина (ITIM) [Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57; Stengel KF, et al. 2012 PNAS 109: 5399-04]. В пределах ECD TIGIT человека имеет только 59 и 87% идентичности аминокислотных (аа) последовательностей с мышами и яванскими макаками соответственно.The genes and cDNAs encoding TIGIT have been cloned and characterized in mice and humans. Full-length human TIGIT has a sequence length of 244 amino acids (SEQ ID NO: 1), in which the first 21 amino acids constitute the signal peptide. The amino acid sequence of mature human TIGIT contains 223 amino acid (aa) residues (NCBI accession number: NM_173799). The extracellular domain (ECD) of mature human TIGIT consists of 120 amino acid residues (SEQ ID NO: 2, corresponding to amino acids 22-141 SEQ ID NO: 1) with a V-type Ig-like domain (corresponding to amino acids 39-127 SEQ ID NO: 1 ), followed by a 21 amino acid (aa) transmembrane sequence and an 82 amino acid (aa) cytoplasmic domain with an immunoreceptor tyrosine inhibitory motif (ITIM) [Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol 10: 48–57; Stengel KF, et al. 2012 PNAS 109: 5399-04]. Within the ECD, human TIGIT shares only 59 and 87% amino acid (aa) sequence identity with mice and cynomolgus monkeys, respectively.
TIGIT экспрессируется на Т-клетках (включая активированные Т-клетки, Т-клетки памяти, регуляторные Т-клетки (Treg) и фолликулярные Т-хелперные клетки (Tfh)) и NK-клетках [Boles KS, et al, 2009 Eur J Immunol, 39: 695-703; Joller N, et al, 2014 Immunity 40: 569-81; Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41: 902-15; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106: 17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57].TIGIT is expressed on T cells (including activated T cells, memory T cells, regulatory T cells (Treg) and follicular T helper cells (Tfh)) and NK cells [Boles KS, et al, 2009 Eur J Immunol , 39: 695-703; Joller N, et al, 2014 Immunity 40: 569-81; Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41: 902-15; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106: 17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57].
До настоящего времени были идентифицированы два лиганда Tigit: CD155 (также известный как рецептор полиовируса или PVR) и CD112 (также известный как связанный с рецептором полиовируса 2, PVRL2, нектин-2). Эти лиганды в основном экспрессируются на АРС (антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки и макрофаги) и опухолевых клетках [Casado JG, et al., 2009 Cancer Immunol Immunother 58: 1517-26; Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41: 902-15; Mendelsohn CL et al., 1989, 56: 855-65; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106: 17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57]. Как молекула иммунной контрольной точки, Tigit инициирует ингибирующую передачу сигналов в иммунных клетках при взаимодействии со своими лигандами, CD155 и CD112. Аффинность связывания Tigit с CD155 (Kd: около 1 нМ) намного выше, чем с CD112, и является ли взаимодействие TIGIT и CD112 функционально значимым в опосредовании ингибирующих сигналов еще предстоит определить. Костимулирующий рецептор CD226 (DNAM-1) связывается с теми же лигандами с более низкой аффинностью (Kd: около 100 нМ), но дает положительный сигнал [Bottino С, et al., 2003 J Exp Med 198: 557- 67]. Кроме того, CD96 (Tactile), Tigit-подобный рецептор, также играет аналогично ингибирующую роль в том же пути [Chan CJ, et al., 2014 Nat. Immunol 15:431-8].So far, two Tigit ligands have been identified: CD155 (also known as poliovirus receptor or PVR) and CD112 (also known as poliovirus receptor-related 2, PVRL2, nectin-2). These ligands are mainly expressed on APCs (antigen presenting cells such as dendritic cells and macrophages) and tumor cells [Casado JG, et al., 2009 Cancer Immunol Immunother 58: 1517-26; Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41: 902-15; Mendelsohn CL et al., 1989, 56: 855-65; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106: 17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10: 48-57]. As an immune checkpoint molecule, Tigit initiates inhibitory signaling in immune cells when interacting with its ligands, CD155 and CD112. The binding affinity of Tigit for CD155 (Kd: about 1 nM) is much higher than for CD112, and whether the interaction of TIGIT and CD112 is functionally significant in mediating inhibitory signals remains to be determined. The costimulatory receptor CD226 (DNAM-1) binds to the same ligands with lower affinity (Kd: about 100 nM), but gives a positive signal [Bottino C, et al., 2003 J Exp Med 198: 557-67]. In addition, CD96 (Tactile), a Tigit-like receptor, also plays a similarly inhibitory role in the same pathway [Chan CJ, et al., 2014 Nat. Immunol 15:431-8].
Tigit может ингибировать иммунные ответы через различные механизмы. Во-первых, взаимодействие между TIGIT и PVR на дендритных клетках (DC) может давать обратную сигнализацию в DC, приводя к положительной регуляции IL-10 и снижению секреции IL-12, тем самым ингибируя активацию Тклеток [Yu X, et al. Nat Immunol.2009 10: 48-57]. Во-вторых, TIGIT связывается с CD155 с более высокой аффинностью, тем самым конкурируя со взаимодействием DNAM-1-CD155. В-третьих, прямое лигирование TIGIT на Т-клетках может отрицательно регулировать TCR-опосредованную активацию, и последующая пролиферация и привлечение TIGIT на NK-клетки блокируют цитотоксичность NK-клеток [Joller N., et al. 2011, 186: 1338-42; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106: 17858-63]. В-четвертых, экспрессия Tigit на Tregs ассоциирована с высокоактивированным и супрессивным фенотипом в опухолевой ткани, и передача сигналов TIGIT в Tregs может способствовать стабильности Treg [Joller N., et al. Immunity 2014 40:569-81; Kurtulus S., et al. J Clin Invest. 2015 125: 4053-4062].Tigit can inhibit immune responses through various mechanisms. First, the interaction between TIGIT and PVR on dendritic cells (DCs) may provide feedback signaling to DCs, leading to up-regulation of IL-10 and decreased secretion of IL-12, thereby inhibiting T cell activation [Yu X, et al. Nat Immunol.2009 10: 48-57]. Second, TIGIT binds to CD155 with higher affinity, thereby competing with the DNAM-1-CD155 interaction. Third, direct ligation of TIGIT on T cells can negatively regulate TCR-mediated activation, and subsequent proliferation and recruitment of TIGIT on NK cells blocks NK cell cytotoxicity [Joller N., et al. 2011, 186: 1338-42; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106: 17858-63]. Fourth, Tigit expression on Tregs is associated with a highly activated and suppressive phenotype in tumor tissue, and TIGIT signaling in Tregs may contribute to Tregs stability [Joller N., et al. Immunity 2014 40:569-81; Kurtulus S., et al. J Clin Invest. 2015 125: 4053-4062].
TIGIT имеет мотив, подобный тирозиновому хвосту иммуноглобулина (ITT), за которым следует иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в его цитоплазматическом хвосте [Yu X, et al. Nat Immunol. 2009 10:48-57; Engels N, et al. Curr Opin Immunol 2011 23: 324-329]. Эти мотивы могут опосредовать рекрутирование фосфатазы SHIP-1 и β-аррестина 2 [Li М, et al. J Biol Chem.2014 289:17647-17657; Liu S, et al. Cell death and differentiation 2013 20: 456-464], обеспечивая таким образом механизм, с помощью которого TIGIT может сам по себе давать ингибирующие сигналы для ослабления активирующих сигналов.TIGIT has an immunoglobulin tyrosine tail (ITT)-like motif followed by an immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM) in its cytoplasmic tail [Yu X, et al. Nat Immunol. 2009 10:48-57; Engels N, et al. Curr Opin Immunol 2011 23: 324-329]. These motifs may mediate the recruitment of phosphatase SHIP-1 and β-arrestin 2 [Li M, et al. J Biol Chem.2014 289:17647-17657; Liu S, et al. Cell death and differentiation 2013 20: 456-464], thus providing a mechanism by which TIGIT itself can provide inhibitory signals to attenuate activating signals.
Положительная регуляция экспрессии Tigit в опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах (TIL) и мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) была зарегистрирована при многих типах рака,Positive regulation of Tigit expression in tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) has been reported in many types of cancer,
- 1 043681 таких как рак легкого [Tassi, et al., Cancer Res. 2017 77: 851-861], рак пищевода [Xie J, et al., Oncotarget 2016 7: 63669-63678], рак молочной железы [Gil Del Alcazar CR, et al. Рак Discov. 2017], острый миелоцитарный лейкоз (AML) [Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22: 3057-66] и меланома [Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125: 2046-2058]. Повышенная экспрессия Tigit в AML ассоциирована с плохим прогнозом выживаемости пациентов [Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22: 3057-66]. Положительная регуляция передачи сигналов Tigit играет важную роль не только в иммунной толерантности к раку, но также хронической вирусной инфекции. Во время ВИЧ-инфекции экспрессия Tigit на Т-клетках была значительно более высокой и положительно коррелировала с вирусной нагрузкой и прогрессированием заболевания [Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12: e1005349]. Кроме того, блокада рецептора Tigit в отдельности или в сочетании с другой блокадой может восстановить функционально истощенные Т-клетки как in vitro, так и in vivo [Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125:2046-2058; Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349; Johnston RJ, et al. Cancer Cell 2014 26: 923-937]. В случаях рака и вирусных инфекций активация передачи сигналов Tigit способствует дисфункции иммунных клеток, что приводит к разрастанию рака или распространению вирусной инфекции. Ингибирование Tigit-опосредованной ингибирующей передачи сигналов с помощью терапевтических агентов может восстанавливать функциональную активность иммунных клеток, включая Т-клетки, NK-клетки и дендритные клетки (DC), следовательно, повышая иммунитет против рака или хронической вирусной инфекции.- 1 043681 such as lung cancer [Tassi, et al., Cancer Res. 2017 77: 851-861], esophageal cancer [Xie J, et al., Oncotarget 2016 7: 63669-63678], breast cancer [Gil Del Alcazar CR, et al. Cancer Discov. 2017], acute myelocytic leukemia (AML) [Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22: 3057-66] and melanoma [Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125: 2046-2058]. Increased Tigit expression in AML is associated with poor patient survival prognosis [Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22: 3057-66]. Positive regulation of Tigit signaling plays an important role not only in immune tolerance to cancer but also to chronic viral infection. During HIV infection, Tigit expression on T cells was significantly higher and positively correlated with viral load and disease progression [Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12: e1005349]. In addition, blockade of the Tigit receptor alone or in combination with another blockade can restore functionally exhausted T cells both in vitro and in vivo [Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125:2046-2058; Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349; Johnston RJ, et al. Cancer Cell 2014 26: 923-937]. In cases of cancer and viral infections, activation of Tigit signaling contributes to immune cell dysfunction, leading to the proliferation of cancer or the spread of viral infection. Inhibition of Tigit-mediated inhibitory signaling with therapeutic agents can restore the functional activity of immune cells, including T cells, NK cells, and dendritic cells (DCs), hence enhancing immunity against cancer or chronic viral infection.
Следовательно, модуляция передачи сигналов Tigit с помощью антагонистических молекул может избавить иммунные клетки от толерантности, вызывая эффективные иммунные ответы для уничтожения опухолей или хронических вирусных инфекций.Therefore, modulation of Tigit signaling by antagonistic molecules can break immune cells from tolerance, inducing effective immune responses to clear tumors or chronic viral infections.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на обнаружении набора моноклональных антител (mAb), которые ингибируют Tigit-опосредованную клеточную передачу сигналов в иммунных клетках, повторно активируют иммунные клетки и повышают иммунитет путем специфического связывания с Tigit. Соответственно, в первом аспекте настоящая заявка относится к анти-Tigit антителу и его антигенсвязывающему фрагменту, которое способно связываться с Tigit человека (SEQ ID NO: 1). Настоящее изобретение также относится к гуманизированной версии анти-Tigit mAb по первому аспекту.The present invention is based at least in part on the discovery of a set of monoclonal antibodies (mAbs) that inhibit Tigit-mediated cell signaling in immune cells, reactivate immune cells and enhance immunity by specifically binding to Tigit. Accordingly, in a first aspect, the present application provides an anti-Tigit antibody and an antigen binding fragment thereof that is capable of binding to human Tigit (SEQ ID NO: 1). The present invention also relates to a humanized version of the anti-Tigit mAb according to the first aspect.
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно настоящей заявке содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую одну, две или три CDR (область, определяющая комплементарность), имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 13, или их варианты, содержащие одну или более консервативных замен, например, одну или две консервативные замены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 13; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащая одну, две или три CDR, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, 7 или 8, или их варианты, содержащие одну или более консервативных замен, например одну или две консервативные замены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 6, 7 или 8.In specific embodiments, an antibody of the present application comprises a heavy chain variable region (VH) comprising one, two or three CDRs (complementarity determining region) having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 13, or variants thereof containing one or more conservative substitutions, for example, one or two conservative substitutions in the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 13; and/or a light chain variable region (VL) comprising one, two or three CDRs having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 6, 7 or 8, or variants thereof containing one or more conservative substitutions, for example one or two conservative substitutions in amino acid sequences SEQ ID NO: 6, 7 or 8.
В более конкретном варианте осуществления антитело согласно настоящей заявке содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или ее вариант, содержащий одну или более консервативных замен, например одну или две консервативные замены, VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 13 или их вариант, содержащий одну или более консервативных замен, например одну или две консервативные замены, и VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или ее вариант, содержащий одну или более консервативных замен, например одну или две консервативные замены; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или ее вариант, содержащий одну или более консервативных замен, например одну или две консервативные замены, VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или ее вариант, содержащий одну или более консервативных замен, например, одну или две консервативные замены, и VL-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или ее вариант, содержащий одну или более консервативные замены, например одну или две консервативные замены.In a more specific embodiment, the antibody of the present application comprises a heavy chain variable region (VH) containing VH-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a variant thereof containing one or more conservative substitutions, such as one or two conservative substitutions, VH -CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 13 or a variant thereof containing one or more conservative substitutions, such as one or two conservative substitutions, and VH-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or thereof a variant containing one or more conservative substitutions, for example one or two conservative substitutions; and/or a light chain variable region (VL) comprising VL-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a variant thereof containing one or more conservative substitutions, for example one or two conservative substitutions, VL-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or a variant thereof containing one or more conservative substitutions, such as one or two conservative substitutions, and VL-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or a variant thereof containing one or more conservative substitutions, such as one or two conservative substitutions.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей заявке способно связываться с Tigit человека и содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 14, 19, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85 %, по меньшей мере 90 %, по меньшей мере 95 %, по меньшей мере 96 %, по меньшей мере 97 %, по меньшей мере 98 %, по меньшей мере 99 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 9, 14, 19. В одном варианте осуществления различие в последовательности находится в каркасной области. В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 10, 15 или 20, или ее вариантом.The antibody or antigen binding fragment thereof according to the present application is capable of binding to human Tigit and contains a heavy chain variable region having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 9, 14, 19, or a sequence having at least 85%, at least 90 %, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% sequence identity to SEQ ID NO: 9, 14, 19. In one embodiment, the difference in sequence is in the framework region. In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region encoded by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 10, 15 or 20, or a variant thereof.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей заявке способно связываться с Tigit человека и содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11, 16, 21 или 24, или последовательность, имеющую по меньшейThe antibody or antigen binding fragment thereof of the present application is capable of binding to human Tigit and comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 11, 16, 21 or 24, or a sequence having at least
- 2 043681 мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96 %, по меньшей мере 97 %, по меньшей мере 98 %, по меньшей мере 99 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 11, 16, 21 или 24. В одном варианте осуществления различие в последовательности находится в каркасной области. В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 12, 17 или 22, или ее вариантом.- 2 043681 at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% sequence identity with SEQ ID NO: 11 , 16, 21, or 24. In one embodiment, the sequence difference is in the framework region. In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region encoded by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 12, 17 or 22, or a variant thereof.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с Tigit человека со значением Kd от около 1х10-9 М до около 1х10-12 М. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с Tigit человека со значением Kd меньше около 1х10-9 М, меньше около 1x10’1° М, меньше около 1x10’11 М или меньше около 1х10’12 М.In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof is capable of binding to human Tigit with a Kd value of from about 1x10 -9 M to about 1x10 -12 M. For example, the antibody or antigen binding fragment thereof is capable of binding to human Tigit with a Kd value less than about 1x10 -9 M, less than about 1x10'1° M, less than about 1x10'11 M or less than about 1x10' 12 M.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или их варианта и константную область легкой цепи типа каппа или лямбда или их варианта. В более конкретном варианте осуществления область Fc антитела представляет собой Fc человеческого IgG1 или его вариант, например область Fc с SEQ ID NO: 18.In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain constant region of the subclass IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 or a variant thereof and a light chain constant region of the kappa or lambda type or a variant thereof. In a more specific embodiment, the Fc region of the antibody is a human IgG1 Fc or a variant thereof, such as the Fc region of SEQ ID NO: 18.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способствует образованию IFN-γ антигенспецифическими Т-клетками. В более конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способствует образованию IFN-γ антигенспецифическими Т-клетками дозозависимым образом.In one embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof promotes the production of IFN-γ by antigen-specific T cells. In a more specific embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof promotes the production of IFN-γ by antigen-specific T cells in a dose-dependent manner.
В более конкретном варианте осуществления антитело согласно настоящей заявке снижает поверхностную экспрессию Tigit рецептора через FcγR-опосредованный трогоцитоз, в частности FcyRIIBопосредованный трогоцитоз.In a more specific embodiment, the antibody of the present application reduces the surface expression of the Tigit receptor through FcγR-mediated trogocytosis, in particular FcyRIIB-mediated trogocytosis.
В одном варианте осуществления антитело согласно настоящей заявке демонстрирует рНзависимое связывание с антигеном, такое что антитело проявляет более сильное связывание с TIGIT человека при слабом кислотном рН в микроокружении опухоли (например, рН 6,0) по сравнению со связыванием с TIGIT человека при физиологическом показателе рН (например, рН 7,4). В более конкретном варианте осуществления антитело согласно настоящей заявке имеет (1) соотношение KD при рН 7,4/рН 6,0 более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более, и/или (2) значение Rmax (RU) при рН 6,0, которое составляет по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз выше Rmax при рН 7,4, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) или аналогичного метода.In one embodiment, the antibody of the present application exhibits pH-dependent antigen binding such that the antibody exhibits stronger binding to human TIGIT at the weakly acidic pH of the tumor microenvironment (eg, pH 6.0) compared to binding to human TIGIT at physiological pH. (eg pH 7.4). In a more specific embodiment, the antibody of the present application has (1) a K D ratio at pH 7.4/pH 6.0 greater than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 , 50, 60, 70, 80, 90, 100 or more, and/or (2) an Rmax (RU) value at pH 6.0 that is at least 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times Rmax at pH 7.4 as measured by surface plasmon resonance (Biacore) or similar method.
Анти-Tigit mAb, раскрытые в настоящем документе, имеют потенциальное терапевтическое применение для лечения рака, борьбы с вирусными инфекциями и другими заболеваниями человека, которые механически связаны с иммунной толерантностью или истощением. Соответственно, в дополнительных вариантах осуществления анти-Tigit антитело согласно настоящей заявке предназначено для применения для лечения рака. В другом конкретном варианте осуществления анти-Tigit антитело согласно настоящей заявке предназначено для применения для лечения инфекции, лечения инфекционного заболевания и/или борьбы с вирусными инфекциями. В другом конкретном варианте осуществления анти-Tigit антитело согласно настоящей заявке предназначено для применения для лечения других заболеваний человека, связанных с или вызванных иммунной толерантностью, или для лечения заболевания, которое можно корректировать путем увеличения активации иммунных клеток.The anti-Tigit mAbs disclosed herein have potential therapeutic applications in the treatment of cancer, viral infections, and other human diseases that are mechanistically related to immune tolerance or exhaustion. Accordingly, in additional embodiments, the anti-Tigit antibody of the present application is for use in the treatment of cancer. In another specific embodiment, the anti-Tigit antibody of this application is for use in treating an infection, treating an infectious disease, and/or combating viral infections. In another specific embodiment, the anti-Tigit antibody of this application is intended for use in the treatment of other human diseases associated with or caused by immune tolerance, or for the treatment of a disease that can be corrected by increasing activation of immune cells.
В дополнительном аспекте настоящая заявка относится к композиции, содержащей анти-Tigit антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и терапевтически приемлемый эксципиентIn an additional aspect, the present application relates to a composition comprising an anti-Tigit antibody or an antigen-binding fragment thereof and a therapeutically acceptable excipient
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Фиг. 1 - схематическая диаграмма Tigit-mIgG2a (верхняя) и Tigit-huIgG1 (нижняя). Tigit ECD: внеклеточный домен tigit. N: N-конец. С: С-конец;Fig. 1 - schematic diagram of Tigit-mIgG2a (top) and Tigit-huIgG1 (bottom). Tigit ECD: extracellular domain of tigit. N: N-terminal. C: C-terminus;
фиг. 2 - филогенетические деревья областей Vh (А) и Vk (В) анти-Tigit антитела. Последовательности Vh и Vk варианта анти-Tigit антитела сопоставляли с использованием программного обеспечения DNASTAR Megalign. Гомология последовательности показана в филогенетических деревьях;fig. 2 - phylogenetic trees of the Vh (A) and Vk (B) regions of anti-Tigit antibodies. The Vh and Vk sequences of the anti-Tigit antibody variant were aligned using DNASTAR Megalign software. Sequence homology is shown in phylogenetic trees;
фиг. 3 - определение аффинности очищенных мышиных анти-Tigit антител с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR);fig. 3 - determination of the affinity of purified mouse anti-Tigit antibodies using surface plasmon resonance (SPR);
фиг. 4 - определение связывания Tigit с помощью проточной цитометрии;fig. 4 - determination of Tigit binding using flow cytometry;
фиг. 5 (А) - схематическая диаграмма, показывающая ингибирование взаимодействий Tigit-лиганд с помощью анти-Tigit mAb. (В) Связывание растворимого Tigit (слитого белка Tigit-huIgG1) с экспрессирующими лиганд Tigit клетками HEK293 (HEK293/PVR или HEK293/PVR-L2) определяли с помощью проточной цитометрии. Блокаду взаимодействия Tigit-лиганд количественно измеряли путем добавления последовательно разбавленных анти-Tigit антител. Результаты показаны с помощью среднего ± SD для двух повторных измерений;fig. 5(A) is a schematic diagram showing inhibition of Tigit-ligand interactions by anti-Tigit mAb. (B) Binding of soluble Tigit (Tigit-huIgG1 fusion protein) to Tigit ligand-expressing HEK293 cells (HEK293/PVR or HEK293/PVR-L2) was determined by flow cytometry. Blockade of Tigit-ligand interaction was quantified by adding serially diluted anti-Tigit antibodies. Results are shown using the mean ± SD of two replicate measurements;
фиг. 6 - активация ЦМВ (цитомегаловирус)-специфичных человеческих Т-клеток с помощью антиTigit mAbs. Пептид человеческого ЦМВ (NLVPMVATV, 495-503), сенсибилизированный HLA-A2.1+ PBMC (4х04), стимулировали клетками-мишенями, активированными пептидом ЦМВ, клетками НСТ116fig. 6 - activation of CMV (cytomegalovirus)-specific human T cells using anti-Tigit mAbs. Human CMV peptide (NLVPMVATV, 495-503) sensitized HLA-A2.1+ PBMC ( 4x04 ) was stimulated with CMV peptide-activated target cells, HCT116 cells
- 3 043681 (104) в течение ночи в присутствии анти-Tigit антител. IFN-γ в культуральном супернатанте определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Все условия осуществляли в трех повторных измерениях. Результаты показаны как среднее ± SD;- 3 043681 (104) overnight in the presence of anti-Tigit antibodies. IFN-γ in the culture supernatant was determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). All conditions were carried out in triplicate measurements. Results are shown as mean ± SD;
фиг. 7 - анти-Tigit mAb способствуют цитотоксичности, опосредованной NK-клетками. (А) Экспрессия Tigit и DNAM-1 на сконструированной стабильной клеточной линии NK92MI/Tigit-DNAM-1. (В) Уничтожение клеток NK92MI/Tigit-DNAM-1 относительно клеток SK-MES-1/PVR в присутствии hu1217-2-2/IgG1mf (0,007-30 мкг/мл) определяли с помощью анализа высвобождения LDH (лактатдегидрогеназы), как описано в примере 8. Результаты показаны как среднее ± SD для трех повторных измерений;fig. 7 - Anti-Tigit mAbs promote NK cell-mediated cytotoxicity. (A) Expression of Tigit and DNAM-1 in the engineered stable cell line NK92MI/Tigit-DNAM-1. (B) Killing of NK92MI/Tigit-DNAM-1 cells relative to SK-MES-1/PVR cells in the presence of hu1217-2-2/IgG1mf (0.007-30 μg/ml) was determined using an LDH (lactate dehydrogenase) release assay as described in Example 8. Results are shown as mean ± SD of triplicate measurements;
фиг. 8 - анти-Tigit mAb hu1217-2-2/IgG1wt снижает поверхностную экспрессию рецептора Tigit через FcγR-оπосредованный трогоцитоз. Клетки Jurkat/Tigit инкубировали с FcγR-экспрессирующими клетками HEK293 в присутствии анти-Tigit mAb, меченных биотином, в полной среде в течение ночи. В некоторых случаях добавляли 10% человеческую сыворотку АВ (human АВ), чтобы определить влияние большого количества человеческого IgG на трогоцитоз. Поверхностную экспрессию рецептора Tigit определяли окрашиванием с помощью SA-APC (Biolegend). MFI (средняя интенсивность флуоресценции) определяли методом проточной цитометрии. Все точки данных представлены для двух повторных измерений. Результаты показаны как среднее ± SD;fig. 8 - anti-Tigit mAb hu1217-2-2/IgG1wt reduces the surface expression of the Tigit receptor through FcγR-mediated trogocytosis. Jurkat/Tigit cells were incubated with FcγR-expressing HEK293 cells in the presence of biotin-labeled anti-Tigit mAb in complete medium overnight. In some cases, 10% human AB serum was added to determine the effect of large amounts of human IgG on trogocytosis. Surface expression of the Tigit receptor was determined by staining with SA-APC (Biolegend). MFI (mean fluorescence intensity) was determined by flow cytometry. All data points are presented for two repeated measurements. Results are shown as mean ± SD;
фиг. 9 - ADCC-эффекты (ADCC - антителозависимая клеточная цитотоксичность) анти-Tigit mAb на мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС). (А) Экспрессию Tigit на РНАстимулированных РВМС от здоровых доноров определяли с помощью проточной цитометрии. CD4 (CD4 Foxp3-), CD8+ Т-эффекторы и регуляторные Т-клетки (Tregs, CD4+ Foxp3+) все экспрессировали значительные уровни Tigit (18 ~41%). Показанные данные являются показательными результатами от 3 здоровых доноров. (В) Анализ ADCC проводили с использованием CD16+ человеческой линии NK-клеток NK92MI/CD16V в качестве эффекторных клеток и РНА-стимулированных РВМС в качестве клетокмишеней в присутствии mAb к Tigit (30 мкг/мл) или контрольных антител (ОКТ3 при 5 мкг/мл в качестве положительного контроля и huIgG при 30 мкг/мл в качестве отрицательного контроля) в течение 42 ч. Процент CD3+, CD8+ Т-клеток и Tregs определяли с помощью проточной цитометрии;fig. 9 - ADCC effects (ADCC - antibody-dependent cellular cytotoxicity) of anti-Tigit mAb on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). (A) Tigit expression on RNA-stimulated PBMCs from healthy donors was determined by flow cytometry. CD4 (CD4 Foxp3 - ), CD8 + T effector and regulatory T cells (Tregs, CD4 + Foxp3 + ) all expressed significant levels of Tigit (18 ~41%). Data shown are representative results from 3 healthy donors. (B) ADCC assay was performed using the CD16+ human NK cell line NK92MI/CD16V as effector cells and RNA-stimulated PBMCs as target cells in the presence of anti-Tigit mAb (30 μg/ml) or control antibodies (OCT3 at 5 μg/ml as a positive control and huIgG at 30 μg/ml as a negative control) for 42 h. The percentage of CD3 + , CD8 + T cells and Tregs was determined by flow cytometry;
фиг. 10 - CDC-эффекты (CDC - комплемент-зависимая цитотоксичность) анти-Tigit mAb на РВМС человека. Анализ CDC проводили с использованием РНА-стимулированных РВМС в качестве клетокмишеней и аутологичных сывороток в качестве источника комплементов. Через 3 дня совместного культивирования предварительно активированных РВМС с анти-Tigit mAb (0,01-100 мкг/мл) в конечной концентрации 15% аутологичных сывороток процент CDC (ось Y) измеряли с помощью анализа свечения титра клеток и рассчитывали, как описано в примере 11. Показаны данные от доноров А и В. HuIgG использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как анти-МНС-А, В, С использовали в качестве положительного контроля.fig. 10 - CDC effects (CDC - complement-dependent cytotoxicity) of anti-Tigit mAb on human PBMC. The CDC assay was performed using RNA-stimulated PBMCs as target cells and autologous sera as a complement source. After 3 days of coculture of preactivated PBMCs with anti-Tigit mAb (0.01-100 μg/ml) at a final concentration of 15% autologous sera, the percentage of CDC (Y-axis) was measured using a fluorescent cell titer assay and calculated as described in the example 11. Shown are data from donors A and B. HuIgG was used as a negative control, while anti-MHC-A, B, C were used as positive controls.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
ОпределенияDefinitions
Консервативные аминокислотные замены аминокислот общеизвестны в данной области техники и приведены в качестве примера в таблице ниже. В общем смысле, консервативная аминокислотная замена означает, что аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь.Conservative amino acid substitutions of amino acids are well known in the art and are exemplified in the table below. In general terms, a conservative amino acid substitution means that an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a similar side chain.
- 4 043681- 4 043681
Если специально не определено где-либо еще в этом документе, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, общепринятое для специалиста в области техники, к которой относится это изобретение.Unless specifically defined elsewhere in this document, all other technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one skilled in the art to which this invention relates.
Используемые в данном документе, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа слов включают их соответствующие отсылки на формы множественного числа, если контекст явно не предписывает иное.As used herein, including the appended claims, the singular forms of words include their respective references to the plural forms unless the context clearly requires otherwise.
Термин или используется в значении и используется взаимозаменяемо с термином и/или, если контекст явно не предписывает иное.The term or is used to mean and is used interchangeably with the term and/or unless the context clearly dictates otherwise.
В данном описании и в последующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово содержат и такие варианты, как содержит и содержащий, следует понимать как подразумевающее включение указанной аминокислотной последовательности, последовательности ДНК, стадии или их группы, но не исключение какой-либо другой аминокислотной последовательности, последовательности ДНК, стадии. При использовании в данном документе термин содержащий может быть заменен термином содержащий в себе, включающий или иногда имеющий.In this specification and in the following claims, unless the context otherwise requires, the word contain and variants such as contains and containing are to be understood to mean the inclusion of the specified amino acid sequence, DNA sequence, step or group thereof, but not the exclusion of any other amino acid sequence, DNA sequence, stage. When used herein, the term containing may be replaced by the term containing, including, or sometimes having.
Термин Tigit включает различные изоформы млекопитающих, например, Tigit человека, ортологи Tigit человека и аналоги, содержащие по меньшей мере один эпитоп в пределах Tigit. Аминокислотная последовательность Tigit, например Tigit человека, и нуклеотидная последовательность, кодирующая ее, известны в данной области.The term Tigit includes various mammalian isoforms, for example, human Tigit, orthologs of human Tigit, and analogues containing at least one epitope within Tigit. The amino acid sequence of Tigit, for example human Tigit, and the nucleotide sequence encoding it are known in the art.
Термины введение, лечение и обработка, используемые в данном документе, применительно к животному, человеку, субъекту экспериментального исследования, клетке, ткани, органу или биологической жидкости означают контакт экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического агента или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Обработка клетки включает контакт реагента с клеткой, а также контакт реагента с жидкостью, где жидкость контактирует с клеткой. Термин введение или обработка также включает обработку in vitro и ex vivo, например клетки, с помощью реагента, диагностического агента, связывающего соединения или другой клетки. Термин субъект в данном документе относится к любому организму, предпочтительно животному, более предпочтительно млекопитающему (например, крысе, мыши, собаке, кошке, кролику) и наиболее предпочтительно человеку.The terms administration, treatment and treatment as used herein, when applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ or biological fluid, mean contact of an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic agent or composition with the animal, human, subject, cell, tissue, organ or biological fluid. Treatment of a cell involves contact of the reagent with the cell, as well as contact of the reagent with the liquid, where the liquid contacts the cell. The term administration or treatment also includes in vitro and ex vivo treatment of, for example, a cell with a reagent, diagnostic agent, binding compound, or other cell. The term subject as used herein refers to any organism, preferably an animal, more preferably a mammal (eg, rat, mouse, dog, cat, rabbit), and most preferably human.
Антитело или молекула антителаAntibody or antibody molecule
В данном документе раскрыты молекулы антител, которые связываются с Tigit с высокой аффинностью и специфичностью.Disclosed herein are antibody molecules that bind to Tigit with high affinity and specificity.
В некоторых вариантах осуществления анти-Tigit антитело связывается с Tigit человека и включает по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть областей, определяющих комплементарность (CDR), содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13 или SEQ ID NO: 6, 7, 8.In some embodiments, the anti-Tigit antibody binds to human Tigit and includes at least one, two, three, four, five, or six complementarity determining regions (CDRs) containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13 or SEQ ID NO: 6, 7, 8.
- 5 043681- 5 043681
В конкретных вариантах осуществления антитело согласно настоящей заявке содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую одну, две или три CDR, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 13, или ее вариант, содержащий одну или более консервативных замен; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую одну, две или три CDR, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, 7 или 8, или ее вариант, содержащий одну или более консервативных замен.In specific embodiments, an antibody of the present application comprises a heavy chain variable region (VH) comprising one, two or three CDRs having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 13, or a variant thereof comprising one or more conservative substitutions; and/or a light chain variable region (VL) comprising one, two or three CDRs having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 6, 7 or 8, or a variant thereof containing one or more conservative substitutions.
В некоторых вариантах осуществления анти-Tigit антитело представляет собой выделенное антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело или рекомбинантное антитело.In some embodiments, the anti-Tigit antibody is an isolated antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, or a recombinant antibody.
В некоторых вариантах осуществления анти-Tigit антитело содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт или по меньшей мере вариабельную область. В некоторых вариантах осуществления анти-Tigit антитело содержит антигенсвязывающий фрагмент, полученный из антитела, описанного в данном документе.In some embodiments, the anti-Tigit antibody comprises at least one antigen binding site or at least a variable region. In some embodiments, the anti-Tigit antibody comprises an antigen binding fragment derived from an antibody described herein.
Термин антитело в данном документе используется в самом широком смысле и конкретно охватывает антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они распознают антиген, например Tigit. Антитело обычно является моноспецифичным, но также может быть описано как идиоспецифичное, гетероспецифичное или полиспецифичное. Молекулы антител связываются посредством специфических сайтов связывания со специфическими антигенными детерминантами или эпитопами на антигенах.The term antibody is used herein in its broadest sense and specifically covers antibodies (including full-length monoclonal antibodies) and antibody fragments, provided they recognize an antigen, such as Tigit. The antibody is usually monospecific, but may also be described as idiospecific, heterospecific, or polyspecific. Antibody molecules bind through specific binding sites to specific antigenic determinants or epitopes on antigens.
Термин моноклональное антитело, или mAb, или Mab в данном документе означает популяцию по существу гомогенных антител, то есть молекулы антитела, содержащиеся в этой популяции, идентичны по аминокислотной последовательности, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Напротив, традиционные (поликлональные) препараты антител обычно включают множество различных антител, имеющих разные аминокислотные последовательности в их вариабельных доменах, особенно их областях, определяющих комплементарность (CDR), которые часто специфичны для разных эпитопов. Определение моноклональное указывает на то, что антитело получено из по существу гомогенной популяции антител; его не следует интерпретировать как требующее получения антитела посредством какого-либо конкретного способа. Моноклональные антитела (mAb) могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler G et al, Nature, 1975, 256: 495-497; U.S. Pat. No. 4376110; Ausubel FM et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow E et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988; и Colligan JE et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993. Раскрываемые в данном документе mAb могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgD, IgE, IgA, и любому их подклассу. Гибридому, продуцирующую mAb, можно культивировать in vitro или in vivo. Высокие титры mAb могут быть получены производством in vivo, когда клетки из отдельных гибридом вводят внутрибрюшинно мышам, таким как мыши Balb/c, которым предварительно вводили пристан, для получения асцитической жидкости, содержащей высокие концентрации желаемых mAb. MAb изотипа IgM или IgG могут быть очищены от таких асцитических жидкостей или от культуральных супернатантов с помощью методов колоночной хроматографии, хорошо известных специалистам в данной области.The term monoclonal antibody, or mAb, or Mab as used herein means a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the antibody molecules contained in the population are identical in amino acid sequence, except for possible naturally occurring mutations that may be present in minute quantities. In contrast, traditional (polyclonal) antibody preparations typically include many different antibodies having different amino acid sequences in their variable domains, especially their complementarity determining regions (CDRs), which are often specific for different epitopes. The definition of monoclonal indicates that the antibody is derived from an essentially homogeneous population of antibodies; it should not be interpreted as requiring the antibody to be produced by any particular method. Monoclonal antibodies (mAbs) can be produced by methods known to those skilled in the art. See, for example, Kohler G et al, Nature, 1975, 256: 495-497; U.S. Pat. No. 4376110; Ausubel FM et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow E et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988; and Colligan JE et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993. The mAbs disclosed herein can be of any class of immunoglobulins, including IgG, IgM, IgD, IgE, IgA, and any subclass thereof. The mAb-producing hybridoma can be cultured in vitro or in vivo. High titers of mAbs can be produced by in vivo production where cells from individual hybridomas are injected intraperitoneally into mice, such as pristane-pretreated Balb/c mice, to produce ascitic fluid containing high concentrations of the desired mAbs. MAbs of the IgM or IgG isotype can be purified from such ascitic fluids or from culture supernatants using column chromatography techniques well known to those skilled in the art.
Как правило, структурная единица основного антитела включает тетрамер. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, каждая из которых имеет одну легкую цепь (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область из от около 100 до 110 или более аминокислот, главным образом ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть тяжелой цепи может определять константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию. Обычно легкие цепи человека классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Кроме того, человеческие тяжелые цепи обычно классифицируют как α, δ, ε, γ или μ и определяют изотипы антитела как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. Внутри легкой и тяжелой цепей вариабельные и константные области соединены областью J из около 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область D из еще около 10 аминокислот.Typically, the structural unit of a primary antibody includes a tetramer. Each tetramer contains two identical pairs of polypeptide chains, each having one light chain (about 25 kDa) and one heavy chain (about 50-70 kDa). The amino terminal portion of each chain includes a variable region of about 100 to 110 or more amino acids primarily responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal portion of the heavy chain may define a constant region primarily responsible for effector function. Human light chains are generally classified as kappa and lambda light chains. In addition, human heavy chains are generally classified as α, δ, ε, γ, or μ, and antibody isotypes are defined as IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively. Within the light and heavy chains, the variable and constant regions are connected by a J region of about 12 or more amino acids, with the heavy chain also including a D region of about 10 more amino acids.
Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь (VL/VH) образуют сайт связывания антитела. Таким образом, в общем, интактное антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два сайта связывания, обычно, являются одинаковыми.The variable regions of each light/heavy chain (VL/VH) pair form the antibody binding site. Thus, in general, an intact antibody has two binding sites. With the exception of bifunctional or bispecific antibodies, the two binding sites are usually the same.
Как правило, вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей содержат три гипервариабельные области, также называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые расположены между относительно консервативными каркасными областями (FR). CDR обычно выровнены по каркасным областям, что позволяет связываться с конкретным эпитопом. Как правило, от N-конца к С-концу вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи последовательно включают FR-1 (или FR1), CDR-1 (или CDR1), FR-2 (FR2), CDR-2 (CDR2), FR-3 (или FR3), CDR-3 (CDR3) и FR-4 (или FR4). Присваивание аминокислот каждому домену, в общем, соответствует определениям в Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al, National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5 ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al, (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917 или Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883.Typically, the variable domains of both the heavy and light chains contain three hypervariable regions, also called complementarity determining regions (CDRs), which are located between relatively conserved framework regions (FRs). CDRs are typically aligned to framework regions to allow binding to a specific epitope. Typically, from N-terminus to C-terminus, the variable domains of both the light and heavy chains sequentially include FR-1 (or FR1), CDR-1 (or CDR1), FR-2 (FR2), CDR-2 (CDR2 ), FR-3 (or FR3), CDR-3 (CDR3) and FR-4 (or FR4). The amino acid assignment to each domain generally follows the definitions in Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al, National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5 ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al, (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917 or Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883.
- 6 043681- 6 043681
Термин гипервариабельная область означает аминокислотные остатки антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из CDR (т.е. VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 в вариабельном домене легкой цепи и VH-CDR1, VH-CDR2 и VHCDR3 в вариабельном домене тяжелой цепи). См. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (определение областей CDR антитела по последовательности); см. также Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (определение областей CDR антитела по структуре). Термин каркасные или FR остатки означает такие остатки вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области, определенных в данном документе как остатки CDR.The term hypervariable region refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for binding to an antigen. The hypervariable region contains amino acid residues from the CDRs (ie, VL-CDR1, VL-CDR2 and VL-CDR3 in the light chain variable domain and VH-CDR1, VH-CDR2 and VHCDR3 in the heavy chain variable domain). See Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (determination of antibody CDR regions by sequence); see also Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (identification of antibody CDR regions by structure). The term framework or FR residues means those variable domain residues that differ from the hypervariable region residues defined herein as CDR residues.
Если не указано иное, фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент означает антигенсвязывающие фрагменты антител, то есть фрагменты антител, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, связанным полноразмерным антителом, например фрагменты, которые сохраняют один или более областей CDR. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают, но не ограничиваются, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител, например одноцепочечные Fv (ScFv); нанотела и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.Unless otherwise indicated, an antibody fragment or antigen-binding fragment means antigen-binding antibody fragments, that is, antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen bound by a full-length antibody, such as fragments that retain one or more CDR regions. Examples of antigen binding fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab') 2 and Fv fragments; diabodies; linear antibodies; single chain antibody molecules, for example single chain Fv (ScFv); nanobodies and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
Антитело, которое специфично связывается с определенным белком-мишенью, также описывается как специфически связывающееся с определенным белком-мишенью. Это означает, что антитело проявляет преимущественное связывание с этой мишенью по сравнению с другими белками, но эта специфичность не требует абсолютной специфичности связывания. Антитело считается специфичным в отношении его предполагаемой мишени, если его связывание позволяет определить присутствие белка-мишени в образце, например, без получения нежелательных результатов, таких как ложноположительные результаты. Антитела или их связывающие фрагменты, используемые в настоящем изобретении, будут связываться с белком-мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза выше, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз выше и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100 раз выше, чем аффинность к нецелевым белкам. Антитело в данном документе заявлено как специфически связывающееся с полипептидом, содержащим данную аминокислотную последовательность, например аминокислотную последовательность зрелой молекулы Tigit человека, если оно связывается с полипептидами, содержащими эту последовательность, но не связывается с белками, в которых эта последовательность отсутствует.An antibody that specifically binds to a particular target protein is also described as specifically binding to a particular target protein. This means that the antibody exhibits preferential binding to that target over other proteins, but this specificity does not require absolute binding specificity. An antibody is considered specific for its intended target if its binding allows detection of the presence of the target protein in a sample, for example, without producing undesirable results such as false positives. Antibodies or binding fragments thereof used in the present invention will bind to the target protein with an affinity that is at least two times higher, preferably at least 10 times higher, more preferably at least 20 times higher, and most preferably at least 100 times higher than the affinity for non-target proteins. An antibody herein is claimed to specifically bind to a polypeptide containing a given amino acid sequence, for example the amino acid sequence of a mature human Tigit molecule, if it binds to polypeptides containing that sequence, but does not bind to proteins lacking that sequence.
Выражения рН-зависимое связывание, рН-зависимое связывание с мишенью и рН-зависимое связывание с антигеном являются взаимозаменяемыми в настоящем раскрытии, и указывают, что антитело согласно настоящей заявке связывается с его мишенью/антигеном, а именно TIGIT человека, зависимым от рН образом. В частности, антитело согласно настоящей заявке проявляет более высокую аффинность связывания и/или сигнал связывания со своим антигеном при слабо кислотном рН, например рН 6,0, которое обычно наблюдается в микроокружении опухоли, по сравнению с аффинностью связывания и/или сигналом связывания при физиологическом значении рН, например рН 7,4. Способы определения аффинности связывания и/или интенсивности сигнала связывания антитела согласно настоящей заявке хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются, поверхностный плазмонный резонанс (Biacore) или аналогичную технологию. Более конкретно, антитело согласно настоящей заявке имеет соотношение KD при рН 7,4/рН 6,0 более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) или подобной технологией. Альтернативно или дополнительно, антитело согласно настоящей заявке имеет значение Rmax (RU) при рН 6,0, которое по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз выше, чем Rmax при рН 7,4, как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) или аналогичной технологии. Аффинность связывания антитела можно измерить при 25 или 37°С. Было обнаружено, что микроокружение опухоли имеет относительно более кислое значение рН, чем физиологическое состояние или нормальные ткани (Zhang et al. Focus on molecular Imaging 2010; Tannock and Rotin et al. Cancer Res 1989). Следовательно, антитело согласно настоящей заявке, имеющее вышеупомянутое рН-зависимое связывание, является эффективным в качестве анти-TIGIT терапевтического агента для нацеливания на TIGIT-положительные лимфоциты в микроокружении опухоли с селективностью и меньшей токсичностью, связанной с активацией периферических лимфоцитов.The expressions pH-dependent binding, pH-dependent target binding, and pH-dependent antigen binding are used interchangeably in the present disclosure and indicate that the antibody of the present application binds to its target/antigen, namely human TIGIT, in a pH-dependent manner. In particular, the antibody of the present application exhibits a higher binding affinity and/or binding signal to its antigen at a weakly acidic pH, such as pH 6.0, which is typically observed in the tumor microenvironment, compared to the binding affinity and/or binding signal at physiological conditions. pH value, for example pH 7.4. Methods for determining the binding affinity and/or binding signal intensity of an antibody according to the present application are well known in the art and include, but are not limited to, surface plasmon resonance (Biacore) or similar technology. More specifically, the antibody of the present application has a K D ratio at pH 7.4/pH 6.0 greater than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or more, as measured by surface plasmon resonance (Biacore) or similar technology. Alternatively or additionally, the antibody of the present application has an Rmax (RU) value at pH 6.0 that is at least 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times higher than Rmax at pH 7.4 as measured by surface plasmon resonance (Biacore) or similar technology. Antibody binding affinity can be measured at 25 or 37°C. The tumor microenvironment has been found to have a relatively more acidic pH value than the physiological state or normal tissues (Zhang et al. Focus on molecular imaging 2010; Tannock and Rotin et al. Cancer Res 1989). Therefore, the antibody of the present application having the above pH-dependent binding is effective as an anti-TIGIT therapeutic agent for targeting TIGIT-positive lymphocytes in the tumor microenvironment with selectivity and less toxicity associated with activation of peripheral lymphocytes.
Термин человеческое антитело в данном документе означает антитело, которое содержит только последовательности белка иммуноглобулина человека. Человеческое антитело может содержать мышиные углеводные цепи, если продуцируется в мыши, в клетке мыши или в гибридоме, полученной из клетки мыши. Аналогично, мышиное антитело или крысиное антитело означает антитело, которое содержит только последовательности белка иммуноглобулина мыши или крысы соответственно.The term human antibody as used herein means an antibody that contains only human immunoglobulin protein sequences. A human antibody may contain murine carbohydrate chains if produced in a mouse, in a mouse cell, or in a hybridoma derived from a mouse cell. Likewise, mouse antibody or rat antibody means an antibody that contains only mouse or rat immunoglobulin protein sequences, respectively.
Термин гуманизированное антитело означает формы антител, которые содержат последовательности нечеловеческих антител (например, мышиных), а также человеческих антител. Такие антитела содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, и обычно двухThe term humanized antibody refers to antibody forms that contain sequences from non-human antibodies (eg, murine) as well as human antibodies. Such antibodies contain a minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. In general, a humanized antibody will contain substantially all of at least one, and typically two
- 7 043681 вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все FR области соответствуют таким областям последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека. Префикс hum, hu, Hu или h добавляют к обозначениям клонов антител, когда это необходимо, чтобы отличать гуманизированные антитела от исходных антител грызунов. Гуманизированные формы антител грызунов обычно содержат те же последовательности CDR исходных антител грызунов, хотя некоторые аминокислотные замены могут быть включены для увеличения аффинности, увеличения стабильности гуманизированного антитела или по другим причинам.- 7 043681 variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of a non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the FR regions correspond to such regions of the human immunoglobulin sequence. The humanized antibody optionally also contains at least a portion of the constant region (Fc) of an immunoglobulin, typically human immunoglobulin. The prefix hum, hu, Hu, or h is added to antibody clone designations when necessary to distinguish humanized antibodies from the original rodent antibodies. Humanized forms of rodent antibodies generally contain the same CDR sequences of the parent rodent antibodies, although some amino acid substitutions may be included to increase affinity, increase stability of the humanized antibody, or for other reasons.
Антитело согласно настоящей заявке имеет потенциальные терапевтические применения при лечении рака. Термин рак или опухоль в данном документе означает или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого), рак надпочечника, рак печени, рак желудка, рак шейки матки, меланому рак почки, рак молочной железы, колоректальный рак, лейкоз, рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак эндометрия, рак головы и шеи, лимфому рак яичников, рак кожи, опухоль щитовидной железы или метастатическое поражение раком.The antibody of the present application has potential therapeutic applications in the treatment of cancer. The term cancer or tumor as used herein means or describes a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, lung cancer (including small cell lung cancer or non-small cell lung cancer), adrenal cancer, liver cancer, stomach cancer, cervical cancer, melanoma, kidney cancer, breast cancer, colorectal cancer, leukemia, bladder cancer , bone cancer, brain cancer, endometrial cancer, head and neck cancer, lymphoma, ovarian cancer, skin cancer, thyroid tumor or metastatic cancer.
Кроме того, антитело согласно настоящей заявке имеет потенциальные терапевтические применения для борьбы с вирусными инфекциями и другими заболеваниями человека, которые механически связаны с иммунной толерантностью или истощением. В контексте настоящей заявки термин истощение относится к процессу, который приводит к истощению способности иммунных клеток реагировать на инфицирующий вирус во время длительного периода хронической вирусной инфекции.In addition, the antibody of the present application has potential therapeutic applications against viral infections and other human diseases that are mechanistically related to immune tolerance or exhaustion. As used herein, the term exhaustion refers to the process that results in the depletion of the ability of immune cells to respond to an infecting virus during a prolonged period of chronic viral infection.
Фармацевтические композиции и наборыPharmaceutical compositions and kits
В некоторых аспектах это раскрытие относится к композициям, например фармацевтически приемлемым композициям, которые включают анти-Tigit-3 антитело, описанное в настоящем документе, составленное вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. Используемый в настоящем документе термин фармацевтически приемлемый эксципиент включает любые и все растворители, дисперсионные среды, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Эксципиент может быть подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, ректального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии).In some aspects, this disclosure relates to compositions, such as pharmaceutically acceptable compositions, that include an anti-Tigit-3 antibody described herein formulated together with at least one pharmaceutically acceptable excipient. As used herein, the term pharmaceutically acceptable excipient includes any and all solvents, dispersion media, isotonic and absorption delaying agents and the like that are physiologically compatible. The excipient may be suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, rectal, spinal or epidermal administration (eg, by injection or infusion).
Композиции согласно настоящему изобретению могут находиться в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузии), дисперсии или суспензии, липосомы и суппозитории. Подходящая форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные подходящие композиции находятся в форме растворов для инъекции или инфузии. Одним подходящим способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В некоторых вариантах осуществления антитело вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.The compositions of the present invention may be in various forms. These include, for example, liquid, semi-solid and solid dosage forms such as liquid solutions (eg injections and infusions), dispersions or suspensions, liposomes and suppositories. The appropriate form depends on the intended route of administration and therapeutic use. Typical suitable compositions are in the form of solutions for injection or infusion. One suitable route of administration is parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular). In some embodiments, the antibody is administered by intravenous infusion or injection. In some embodiments, the antibody is administered by intramuscular or subcutaneous injection.
Термин терапевтически эффективное количество, используемый в настоящем документе, относится к количеству антитела, которое при введении субъекту для лечения заболевания или расстройства или по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания или расстройства является достаточным для осуществления такого лечения заболевания, расстройства или симптома. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от антитела, заболевания, расстройства и/или симптомов заболевания или расстройства, степени тяжести заболевания, расстройства и/или симптомов заболевания или расстройства, возраста субъекта, подлежащего лечению, и/или веса субъекта, подлежащего лечению. Подходящее количество в любом указанном случае может быть очевидным для специалистов в данной области или может быть определено путем проведения рутинных экспериментов. В случае комбинированной терапии терапевтически эффективное количество относится к общему количеству активных агентов, содержащихся в комбинации для эффективного лечения заболевания, расстройства или состояния.The term therapeutically effective amount as used herein refers to an amount of antibody that, when administered to a subject to treat a disease or disorder or at least one of the clinical symptoms of the disease or disorder, is sufficient to effect such treatment of the disease, disorder or symptom. The therapeutically effective amount may vary depending on the antibody, the disease, disorder and/or symptoms of the disease or disorder, the severity of the disease, disorder and/or symptoms of the disease or disorder, the age of the subject being treated, and/or the weight of the subject being treated. The appropriate amount in any given case may be obvious to those skilled in the art or can be determined by routine experimentation. In the case of combination therapy, a therapeutically effective amount refers to the total amount of active agents contained in the combination to effectively treat a disease, disorder or condition.
Субъект, используемый в настоящем документе, представляет собой млекопитающее, например грызуна или примата, предпочтительно высшего примата, например человека (например, пациента, имеющего или подверженного риску заболевания, описанного в настоящем документе).The subject used herein is a mammal, such as a rodent or a primate, preferably a great ape, such as a human (eg, a patient with or at risk of a disease described herein).
ПримерыExamples
Пример 1. Получение анти-Tigit моноклонального антителаExample 1: Preparation of anti-Tigit monoclonal antibody
Анти-Tigit моноклональные антитела (mAb) получали на основе традиционной технологии слияния гибридом [de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35: 1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378: 1] с небольшими модификациями. Для дальнейшей характеристики отбирали mAb с высокой активностью связывания, полученной в результате иммуноферментного анализа (ELISA) и анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).Anti-Tigit monoclonal antibodies (mAbs) were prepared based on traditional hybridoma fusion technology [de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378: 1] with minor modifications. mAbs with high binding activity obtained from enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and fluorescence-activated cell sorting (FACS) assay were selected for further characterization.
- 8 043681- 8 043681
Рекомбинантный белок Tigit для анализа иммунизации и связывания кДНК, кодирующую полноразмерный Tigit человека (SEQ ID NO: 1), синтезировали и приобретали у Sino Biological (Beijing, China) на основе её последовательности GenBank (номер доступа: NM_173799). Кодирующую область внеклеточного домена (ECD) полноразмерного Tigit человека, соответствующую аминокислоте (АА) 1-141 SEQ ID NO: 1, амплифицировали с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) и клонировали в вектор экспрессии на основе pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с С-концом, слитым либо с Fc-доменом мышиного IgG2a, либо с Fc-доменом тяжелой цепи IgG1 человека, что приводит к получению двух плазмид для экспрессии рекомбинантного слитого белка, Tigit-mIgG2a и TigithuIgG1, соответственно. Схематическое изображение слитых белков Tigit показано на фиг. 1. Для получения рекомбинантного слитого белка плазмиды Tigit-mIgG2a и Tigit-huIgG1 временно трансфицировали в клетки 293G (разработанные собственными силами) и культивировали в течение 7 дней в СО2инкубаторе, оборудованном вращающимся шейкером. Супернатант, содержащий рекомбинантный белок, собирали и очищали центрифугированием. Tigit-mIgG2a и Tigit-huIgG1 очищали с использованием колонки с белком A (Cat.: 17127901, GE Life Sciences). Оба белка Tigit-mIgG2a и Tigit-huIgG1 подвергали диализу против забуференного фосфатом солевого раствора (DPBS) и хранили в морозильной камере при -80°С в небольших аликвотах.Recombinant Tigit protein for immunization and binding assay cDNA encoding full-length human Tigit (SEQ ID NO: 1) was synthesized and purchased from Sino Biological (Beijing, China) based on its GenBank sequence (accession number: NM_173799). The extracellular domain (ECD) coding region of full-length human Tigit corresponding to amino acid (AA) 1-141 SEQ ID NO: 1 was amplified by PCR (polymerase chain reaction) and cloned into the pcDNA3.1-based expression vector (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) with the C-terminus fused to either the mouse IgG2a Fc domain or the human IgG1 heavy chain Fc domain, resulting in two recombinant fusion protein expression plasmids, Tigit-mIgG2a and TigithuIgG1, respectively. A schematic representation of Tigit fusion proteins is shown in FIG. 1. To obtain the recombinant fusion protein, Tigit-mIgG2a and Tigit-huIgG1 plasmids were transiently transfected into 293G cells (developed in-house) and cultured for 7 days in a CO 2 incubator equipped with a rotating shaker. The supernatant containing the recombinant protein was collected and purified by centrifugation. Tigit-mIgG2a and Tigit-huIgG1 were purified using a protein A column (Cat.: 17127901, GE Life Sciences). Both Tigit-mIgG2a and Tigit-huIgG1 proteins were dialyzed against phosphate buffered saline (DPBS) and stored in a -80°C freezer in small aliquots.
Клеточные линии со стабильной экспрессиейCell lines with stable expression
Для создания стабильных клеточных линий, которые экспрессируют полноразмерный Tigit человека (huTigit) или Tigit обезьяны (mkTigit, учетный №: ХМ_005548101.2), гены Tigit (синтезированные Genescript, Nanjing, China) клонировали в ретровирусный вектор pFB-Neo (Cat.: 217561, Agilent, USA). Двухтропные ретровирусные векторы получали в соответствии с предыдущим протоколом [Zhang T, et al. 2005, Blood]. Векторы, содержащие huTigit и mkTigit, трансдуцировали в клетки Jurkat и NK92MI (АТСС, Manassas, VA, USA), соответственно, для генерации клеточных линий Jurkat/huTigit и NK92MI/mkTigit. Клеточные линии с высокой экспрессией отбирали путем культивирования в среде с G418 и анализом связывания FACS.To create stable cell lines that express full-length human Tigit (huTigit) or monkey Tigit (mkTigit, accession no.: ХМ_005548101.2), Tigit genes (synthesized by Genescript, Nanjing, China) were cloned into the retroviral vector pFB-Neo (Cat.: 217561 , Agilent, USA). Ditropic retroviral vectors were prepared according to the previous protocol [Zhang T, et al. 2005, Blood]. Vectors containing huTigit and mkTigit were transduced into Jurkat and NK92MI cells (ATCC, Manassas, VA, USA), respectively, to generate the Jurkat/huTigit and NK92MI/mkTigit cell lines. Highly expressing cell lines were selected by culture in G418 medium and FACS binding assay.
Иммунизация, гибридомное слияние и клонированиеImmunization, hybridoma fusion and cloning
Мышей Balb/c возрастом от восьми до двенадцати недель (от HFK BIOSCIENCE CO., LTD, Beijing, China) иммунизировали внутрибрюшинно (i.p.) 100 мкл антигенной смеси, содержащей 10 мкг TigitmIgG2a и водорастворимый адъювант (Cat.: КХ0210041, KangBiQuan, Beijing, China). Процедуру повторяли через три недели. Через две недели после 2-й иммунизации сыворотки мыши оценивали на связывание с Tigit с помощью ELISA и FACS. Через десять дней после скрининга сыворотки мышей с наивысшими титрами сыворотки анти-Tigit антител стимулировали путем внутрибрюшинной инъекции 50 мкг Tigit-mIgG2a. Через три дня после стимулирования спленоциты выделяли и сливали с клеточной линией мышиной миеломы, клетками SP2/0 (АТСС), используя стандартные методики [1977, Somat Cell Genet, 3: 231].Eight to twelve week old Balb/c mice (from HFK BIOSCIENCE CO., LTD, Beijing, China) were immunized intraperitoneally (i.p.) with 100 μl of an antigen mixture containing 10 μg of TigitmIgG2a and a water-soluble adjuvant (Cat.: KX0210041, KangBiQuan, Beijing, China). The procedure was repeated after three weeks. Two weeks after the 2nd immunization, mouse sera were assessed for Tigit binding by ELISA and FACS. Ten days after serum screening, mice with the highest serum titers of anti-Tigit antibodies were stimulated by intraperitoneal injection of 50 μg of Tigit-mIgG2a. Three days after stimulation, splenocytes were isolated and fused with a murine myeloma cell line, SP2/0 cells (ATCC), using standard techniques [1977, Somat Cell Genet, 3: 231].
Оценка активности связывания с Tigit антител с помощью ELISA и FACSEvaluation of binding activity of Tigit antibodies using ELISA and FACS
Супернатанты гибридомных клонов первоначально исследовали с помощью ELISA, как описано в Methods in Molecular Biology (2007) 378: 33-52 с некоторыми модификациями. Вкратце, белок TigithuIgG1 наносили в 96-луночные планшеты. Антимышиное IgG-антитело, связанное с FIRP (пероксидаза хрена, Cat.: 7076S, Cell Signaling Technology, USA), и субстрат (Cat.: 00-4201-56, eBioscience, USA) использовали для получения сигнала поглощения цвета на длине волны 450 нм, который измеряли с помощью планшет-ридера (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, USA). ELISA-положительные клоны дополнительно проверяли с помощью FACS с использованием клеток NK92MI/huTigit или NK92mi/mkTigit, описанных выше. Tigit-экспрессирующие клетки (10 клеток/лунку) инкубировали с ELISA-положительными супернатантами гибридом с последующим связыванием с козьим антимышиным IgG-антителом, меченным Alexa Fluro-647 (Cat.: A0473, Beyotime Biotechnology, China). Флуоресценцию клеток определяли количественно с использованием проточного цитометра (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, USA).Supernatants of hybridoma clones were initially examined by ELISA as described in Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52 with some modifications. Briefly, TigithuIgG1 protein was loaded into 96-well plates. Anti-mouse IgG antibody coupled to FIRP (horseradish peroxidase, Cat.: 7076S, Cell Signaling Technology, USA) and substrate (Cat.: 00-4201-56, eBioscience, USA) were used to obtain a color absorption signal at wavelength 450 nm, which was measured using a plate reader (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, USA). ELISA-positive clones were further verified by FACS using NK92MI/huTigit or NK92mi/mkTigit cells described above. Tigit-expressing cells (10 cells/well) were incubated with ELISA-positive hybridoma supernatants, followed by coupling with goat anti-mouse IgG antibody labeled Alexa Fluro-647 (Cat.: A0473, Beyotime Biotechnology, China). Cell fluorescence was quantified using a flow cytometer (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, USA).
Кондиционированные среды из гибридом, которые показали положительные сигналы при скрининге как с помощью ELISA, так и с помощью FACS, подвергали функциональным анализам для выявления антител с хорошей функциональной активностью, показанной в анализах на основе иммунных клеток человека (см. следующие разделы). Антитела с желаемой функциональной активностью дополнительно субклонировали и охарактеризовывали.Conditioned media from hybridomas that showed positive signals when screened by both ELISA and FACS were subjected to functional assays to identify antibodies with good functional activity shown in human immune cell-based assays (see following sections). Antibodies with the desired functional activity were further subcloned and characterized.
Субклонирование и адаптация гибридом к бессывороточной среде или среде с низким содержанием сывороткиSubcloning and adaptation of hybridomas to serum-free or low-serum media
После первичного скрининга с помощью ELISA, FACS и функциональных анализов, как описано выше, положительные клоны гибридомы субклонировали путем предельного разведения. Три положительных субклона на основе скрининга ELISA и FACS из каждого планшета отбирали и охарактеризовывали с помощью функциональных анализов. Лучшие субклоны антител, подтвержденные с помощью функциональных анализов, адаптировали для роста в среде CDM4MAb (Cat.: SH30801.02, Hyclone, USA) с 3% FBS.After initial screening by ELISA, FACS and functional assays as described above, positive hybridoma clones were subcloned by limiting dilution. Three positive subclones based on ELISA and FACS screening from each plate were selected and characterized using functional assays. The best antibody subclones confirmed by functional assays were adapted for growth in CDM4MAb medium (Cat.: SH30801.02, Hyclone, USA) with 3% FBS.
- 9 043681- 9 043681
Экспрессия и очистка моноклональных антителExpression and purification of monoclonal antibodies
Клетки гибридомы или клетки 293G, временно трансфицированные плазмидой для экспрессии антител (Cat. No. R79007, Invitrogen), культивировали либо в среде CDM4MAb (Cat.: SH30801.02, Hyclone), либо в экспрессионной среде Freestyle 293 (Cat.: 12338018, Invitrogen) и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5-7 дней при 37°С. Кондиционированную среду собирали центрифугированием и фильтровали пропусканием через 0,22 мкм мембрану перед очисткой. Мышиные или рекомбинантные антитела, содержащие супернатанты, наносили и связывали с колонкой с белком A (Cat.: 17127901, GE Life Sciences) в соответствии с руководством производителя. Процедура обычно давала антитела с чистотой выше 90%. Аффинно очищенные антитела к белку А либо подвергали диализу против PBS (фосфатно-солевой буфер), либо дополнительно очищали с использованием колонки HiLoad 16/60 Superdex200 (Cat.: 17531801, GE Life Sciences) для удаления агрегатов. Концентрации белков определяли путем измерения поглощения при 280 нм. Конечные препараты антител хранили в аликвотах в морозильной камере при -80°С.Hybridoma cells or 293G cells transiently transfected with an antibody expression plasmid (Cat. No. R79007, Invitrogen) were cultured in either CDM4MAb medium (Cat.: SH30801.02, Hyclone) or Freestyle 293 expression medium (Cat.: 12338018, Invitrogen) and incubated in a CO 2 incubator for 5-7 days at 37°C. The conditioned medium was collected by centrifugation and filtered through a 0.22 μm membrane before purification. Mouse or recombinant antibody containing supernatants were applied and coupled to a protein A column (Cat.: 17127901, GE Life Sciences) according to the manufacturer's manual. The procedure typically produced antibodies with a purity greater than 90%. Affinity-purified Protein A antibodies were either dialyzed against PBS or further purified using a HiLoad 16/60 Superdex200 column (Cat.: 17531801, GE Life Sciences) to remove aggregates. Protein concentrations were determined by measuring absorbance at 280 nm. The final antibody preparations were stored in aliquots in a freezer at -80°C.
Пример 2. Клонирование и анализ последовательности антител к TigitExample 2: Cloning and sequence analysis of Tigit antibodies
Клоны мышиной гибридомы собирали для получения всей содержащейся в клетках РНК с использованием набора Ultrapure RNA (Cat.: 74104, QIAGEN, Germany) на основании протокола производителя. Первую нить кДНК синтезировали с использованием набора для синтеза кДНК от Invitrogen (Cat.: 18080051) и проводили ПЦР-амплификацию нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи (Vh) и вариабельную область цепи каппа (Vk) мышиных mAb, с использованием набора для ПЦР (Cat.: CW0686, CWBio, Beijing, China). Олигопраймеры, используемые для клонирования кДНК Vh и Vk антитела, синтезировали Invitrogen (Beijing, China) на основе последовательностей, описанных ранее (Brocks et al. 2001 Mol Med 7: 461). ПЦР-продукты затем субклонировали в вектор клонирования pEASY-Blunt (Cat.: С В101-02, TransGen, China) и секвенировали в Genewiz (Beijing, China). Аминокислотные последовательности областей Vh и Vk выводили из результатов секвенирования ДНК.Mouse hybridoma clones were collected to obtain total cellular RNA using the Ultrapure RNA kit (Cat.: 74104, QIAGEN, Germany) based on the manufacturer's protocol. First-strand cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit from Invitrogen (Cat.: 18080051) and PCR amplification of nucleotide sequences encoding the heavy chain variable region (Vh) and kappa variable region (Vk) of mouse mAbs was performed using a PCR kit. (Cat.: CW0686, CWBio, Beijing, China). Oligoprimers used for cloning Vh and Vk antibody cDNAs were synthesized by Invitrogen (Beijing, China) based on sequences described previously (Brocks et al. 2001 Mol Med 7: 461). The PCR products were then subcloned into the pEASY-Blunt cloning vector (Cat.: C B101-02, TransGen, China) and sequenced at Genewiz (Beijing, China). The amino acid sequences of the Vh and Vk regions were deduced from DNA sequencing results.
Мышиные mAb анализировали путем сравнения гомологии последовательностей и группировали на основании сходства последовательностей (фиг. 2). Области, определяющие комплементарность (CDR), определяли согласно системе Кабата [Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132: 211-250] и базе данных IMGT [Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27: 209-212] с помощью аннотации последовательности и анализа последовательности через Интернет (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.HTML). Аминокислотные последовательности типичного лучшего клона mu1217 (Vh и Vk) перечислены в табл.1 (SEQ ID NO: 9 и 11). Последовательности CDR mu1217 перечислены в табл. 2 (SEQ ID NO: 3-8).Murine mAbs were analyzed by comparing sequence homology and grouped based on sequence similarity (Fig. 2). Complementarity determining regions (CDRs) were determined according to Kabat's system [Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132: 211-250] and the IMGT database [Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27: 209-212] using sequence annotation and sequence analysis via the Internet (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index. HTML). The amino acid sequences of the exemplary best mu1217 clone (Vh and Vk) are listed in Table 1 (SEQ ID NO: 9 and 11). The CDR sequences of mu1217 are listed in Table. 2 (SEQ ID NO: 3-8).
Таблица 1. Аминокислотные последовательности Vh и Vk областей mu1217Table 1. Amino acid sequences of the Vh and Vk regions of mu1217
Таблица 2. CDR последовательности (аминокислотные) Vh и Vk областей mu1217Table 2. CDR sequences (amino acids) of the Vh and Vk regions of mu1217
Пример 3. Определение аффинности очищенных мышиных анти-Tigit антител с помощью SPRExample 3 Affinity Determination of Purified Mouse Anti-Tigit Antibodies by SPR
Антитела к Tigit с высокой активностью связывания по данным ELISA и FACS, а также с высокими функциональными активностями, полученными с помощью клеточных анализов (описанных в примерах 1 и 2), охарактеризовывали по их кинетике связывания с помощью анализов SPR с использованием BIAcore™ T-200 (GE Life Sciences). Вкратце, антитело против человеческого IgG иммобилизовали на активированном биосенсорном чипе СМ5 (Cat. №: BR100530, GE Life Sciences). Fc-меченый Tigit человека заливался по поверхности чипа и захватывался антителом против человеческого IgG. Затем последовательно разбавленные (0,12 до 10 нМ) очищенные мышиные антитела заливали по поверхности чипа и анализировали изменения сигналов поверхностного плазмонного резонанса для расчета скоростей ассоциации (kon) и скоростей диссоциации (kof) с помощью модели связывания Ленгмюра один к одному (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). Равновесную константу диссоциации (KD) рассчитывали как отношение kof/kon. Профили аффинности связывания лучших mAb, включая mu1217, mu1257, mu1226 и mu242, показаны на фиг. 3 и в табл. 3.Anti-Tigit antibodies with high binding activity by ELISA and FACS, as well as high functional activity by cell-based assays (described in Examples 1 and 2), were characterized by their binding kinetics using SPR assays using BIAcore™ T-200 (GE Life Sciences). Briefly, anti-human IgG antibody was immobilized on an activated CM5 biosensor chip (Cat. No: BR100530, GE Life Sciences). Fc-labeled human Tigit was cast onto the chip surface and captured by anti-human IgG antibody. Serially diluted (0.12 to 10 nM) purified mouse antibodies were then cast onto the chip surface and changes in surface plasmon resonance signals were analyzed to calculate association rates (ko n ) and dissociation rates (kof) using the one-to-one Langmuir binding model (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). The equilibrium dissociation constant ( KD ) was calculated as the ratio kof/kon. The binding affinity profiles of the best mAbs, including mu1217, mu1257, mu1226, and mu242, are shown in FIG. 3 and in table. 3.
- 10 043681- 10 043681
Таблица 3. Аффинность связывания гибридомных антител, определяемые с помощью SPRTable 3. Binding affinities of hybridoma antibodies determined by SPR
Пример 4. Гуманизация мышиного анти-Tigit человека mAb mu1217Example 4: Humanization of Mouse Anti-Human Tigit mAb mu1217
Гуманизация и инженерия mAbHumanization and engineering of mAbs
Для гуманизации mu1217 в генах зародышевой линии человеческого IgG проводили поиск последовательностей, которые обладают высокой степенью гомологии с последовательностями кДНК вариабельных областей mu1217, путем бластинга (англ. blasting - поиск при помощи BLAST) базы данных генов человеческого иммуноглобулина на сайтах IMGT (http:// www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html) и NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Гены IGVH и IGVK человека, которые присутствуют в спектре антител человека с высокой частотой (Glanville2009 PNAS 106: 20216-20221) и которые высоко гомологичны с mu1217, выбирали в качестве матриц для гуманизации.To humanize mu1217 in human IgG germline genes, sequences that have a high degree of homology to mu1217 variable region cDNA sequences were searched for by blasting the human immunoglobulin gene database at the IMGT sites (http:// www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html) and NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). The human IGVH and IGVK genes, which are present in the human antibody spectrum at high frequency (Glanville2009 PNAS 106: 20216-20221) and which are highly homologous to mu1217, were chosen as templates for humanization.
Гуманизацию осуществляли посредством CDR-прививки (Methods in Molecular Biology, Vol. 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press), и гуманизированные антитела (hu1217s) конструировали в виде человеческого IgG1mf с использованием разработанного собственными силами вектора экспрессии. На начальном этапе гуманизации мутации от мышиных до человеческих аминокислотных остатков в каркасных областях основывались на моделированной трехмерной структуре, и мышиные каркасные остатки, имеющие структурное значение для поддержания канонических структур CDR, сохраняли в 1-й версии гуманизированного антитела 1217 (hu1217-1-1 с шестью CDR, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3, 13, 5 (CDR тяжелой цепи) и SEQ ID NO: 6, 7, 8 (CDR легкой цепи), вариабельной областью тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15, и вариабельной областью легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 и кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17). В частности, CDR Vk mu1217 (SEQ ID NO: 6-8) привили в каркас вариабельного гена человеческой зародышевой линии IGVk3-15 с сохранением одного остатка мышиной каркасной области (V58), что привело к получению гуманизированной последовательности Vk Hu1217-1-1 (SEQ ID NO: 16 для аминокислотной последовательности и SEQ ID NO: 17 для нуклеотидной последовательности). N-конец H-CDR2 (SEQ ID NO: 4), H-CDR1 и H-CDR3 (SEQ ID NO: 3 и 5) Vh mu1217 привили в каркас вариабельного гена человеческой зародышевой линии IGVH3-7 с сохранением двух остатков мышиного каркаса (Т24 и I37 SEQ ID NO: 10). В гуманизированных вариантах hu1217 привили только N-концевую половину H-CDR2 по Кабату, так как только N-концевую половину предсказывали в качестве важной для связывания антигена в соответствии с моделируемой трехмерной структурой. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность полученной гуманизированной последовательности Vh Hu1217-1-1 показаны в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 соответственно.Humanization was accomplished by CDR grafting (Methods in Molecular Biology, Vol. 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press), and humanized antibodies (hu1217s) were constructed as human IgG1mf using an in-house developed expression vector. At the initial stage of humanization, mutations from mouse to human amino acid residues in the framework regions were based on the modeled three-dimensional structure, and mouse framework residues having structural significance for maintaining canonical CDR structures were retained in the 1st version of the humanized antibody 1217 (hu1217-1-1 with six CDRs having the amino acid sequences SEQ ID NO: 3, 13, 5 (heavy chain CDR) and SEQ ID NO: 6, 7, 8 (light chain CDR), a heavy chain variable region having the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 and the encoded nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and the encoded nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17). Specifically, the Vk mu1217 CDR (SEQ ID NO: 6-8) was grafted into the human germline variable gene framework IGVk3-15, retaining one residue of the mouse framework region ( V58 ), resulting in the humanized Vk sequence Hu1217-1-1 (SEQ ID NO: 16 for amino acid sequence and SEQ ID NO: 17 for nucleotide sequence). The N terminus of H-CDR2 (SEQ ID NO: 4), H-CDR1 and H-CDR3 (SEQ ID NO: 3 and 5) of Vh mu1217 was grafted into the human germline variable gene backbone IGVH3-7, retaining two residues of the mouse backbone ( T 24 and I 37 SEQ ID NO: 10). In the humanized variants, hu1217 was grafted with only the N-terminal half of Kabat's H-CDR2, since only the N-terminal half was predicted to be important for antigen binding according to the modeled 3D structure. The amino acid sequence and nucleotide sequence of the resulting humanized Vh sequence Hu1217-1-1 are shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, respectively.
Hu1217-1-1 конструировали в виде полноразмерного антитела человека с использованием разработанных своими силами экспрессирующих векторов, которые содержат константные области варианта человеческого IgG1, обозначенного как IgG1mf (SEQ ID NO: 18), и цепи каппа, соответственно, с легко адаптирующимися сайтами для субклонирования. Экспрессию и получение антитела hu1217-1-1 осуществляли путем котрансфекции двух указанных выше конструкций в клетки 293G и очистки с использованием колонки с белком A (Cat.: 17543802, GE Life Sciences). Очищенные антитела концентрировали до 0,5-5 мг/мл в PBS и хранили аликвотами в морозильной камере при -80°С.Hu1217-1-1 was constructed as a full-length human antibody using in-house developed expression vectors that contain the constant regions of the human IgG1 variant designated IgG1mf (SEQ ID NO: 18) and kappa chain, respectively, with easily adaptable subcloning sites . Expression and production of hu1217-1-1 antibody was accomplished by cotransfecting the above two constructs into 293G cells and purifying using a protein A column (Cat.: 17543802, GE Life Sciences). Purified antibodies were concentrated to 0.5-5 mg/ml in PBS and stored in aliquots in a freezer at -80°C.
На основании матрицы hu1217-1-1, авторы изобретения сделали несколько одиночных мутаций, превращающих оставшиеся мышиные остатки в каркасной области Vk в соответствующие остатки человеческой зародышевой линии, которые включают V58I в Vk и в Т24А и 137V Vh. Все полученные hu1217-2A-1 (T24A), hu1217-2B-1 (I37V) и hu1217-l-2a (V58I) имели схожее связывание и функциональные активности с hu1217-1-1. Все мутации, направленные на гуманизацию, осуществляли с использованием праймеров, содержащих мутации в определенных положениях, и набора для сайт-направленного мутагенеза (Cat. No. FM111-02, TransGen, Beijing, China). Желаемые мутации подтверждали с помощью анализа секвенирования. Эти варианты антител, полученные из hu1217, анализировали с помощью анализов связывания и функциональности, как описано ранее.Based on the hu1217-1-1 template, we made several single mutations converting the remaining mouse residues in the Vk framework region into the corresponding human germline residues, which include V58I in Vk and in T24A and 137V Vh. The resulting hu1217-2A-1 (T24A), hu1217-2B-1 (I37V), and hu1217-l-2a (V58I) all had similar binding and functional activities to hu1217-1-1. All humanization mutations were performed using primers containing mutations at specific positions and a site-directed mutagenesis kit (Cat. No. FM111-02, TransGen, Beijing, China). The desired mutations were confirmed by sequencing analysis. These hu1217-derived antibody variants were analyzed using binding and functionality assays as previously described.
Антитела Hu1217 дополнительно подвергали инжинирингу путем введения мутаций в CDR и каркасные области для улучшения молекулярных и биофизических свойств для терапевтического применения для человека. Факторы, которые нужно учитывать, включают аминокислотные составы, термостабильность (Tm), поверхностную гидрофобность и изоэлектронные точки (pIs) при сохранении функциоHu1217 antibodies were further engineered by introducing mutations in the CDR and framework regions to improve molecular and biophysical properties for human therapeutic applications. Factors to consider include amino acid compositions, thermal stability ( Tm ), surface hydrophobicity, and isoelectronic points (pIs) while maintaining function.
- 11 043681 нальной активности.- 11 043681 cash activity.
В совокупности, хорошо сконструированную версию гуманизированного моноклонального антитела hu1217-2-2 (SEQ ID NO: 3, 5-8, 13 и 19-21) получали с помощью мутационного процесса, описанного выше, и охарактеризовывали более подробно. Результаты показали, что и hu1217-2-2, и hu1217-1-1 были очень схожи в отношении аффинности связывания и функциональных активностей, таких как ингибирование Tigit-опосредованной передачи сигналов вниз по течению.Collectively, a well-designed version of the humanized monoclonal antibody hu1217-2-2 (SEQ ID NOs: 3, 5-8, 13 and 19-21) was generated using the mutation process described above and characterized in more detail. The results showed that both hu1217-2-2 and hu1217-1-1 were very similar in terms of binding affinity and functional activities, such as inhibition of Tigit-mediated downstream signaling.
Для определения аффинности антитела улавливали на поверхности, захватывающей человеческий Fc, и использовали при анализе аффинности на основе технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Результаты SPR-определенных профилей связывания анти-Tigit антител суммированы в табл. 4. Hu1217-2-2 и hu1217-1-1 показали очень схожие профили связывания со средней константой диссоциации при 0,415 нМ и 0,266 нМ, соответственно, которые близки к таковой у ch1217.To determine affinity, antibodies were captured on the human Fc capture surface and used in an affinity assay based on surface plasmon resonance (SPR) technology. The results of SPR-determined anti-Tigit antibody binding profiles are summarized in Table 1. 4. Hu1217-2-2 and hu1217-1-1 showed very similar binding profiles with average dissociation constants of 0.415 nM and 0.266 nM, respectively, which are close to that of ch1217.
Таблица 4. Аффинности связывания антител hu1217, определяемые с помощью SPRTable 4. Binding affinities of hu1217 antibodies determined by SPR
* ch1217 состоит из вариабельных доменов mu1217, слитых с константными областями человеческого IgG1mf/каппа ** NA: данные отсутствуют.*ch1217 consists of mu1217 variable domains fused to human IgG1mf/kappa constant regions **NA: No data available.
Таблица 5. CDR антител hu1217Table 5. CDR of hu1217 antibodies
Все гуманизированные антитела, показанные выше, также исследовали в отношении функциональных активностей на первичных иммунных клетках человека, выделенных у здоровых доноров (описано в примере 7).All humanized antibodies shown above were also tested for functional activities on primary human immune cells isolated from healthy donors (described in Example 7).
Пример 5. Активности связывания разных версий 1217 с нативным TigitExample 5. Binding activities of different versions of 1217 with native Tigit
Чтобы оценить активность связывания анти-Tigit антител с нативным Tigit на живых клетках, клетки NK92mi подвергали инжинирингу таким образом, чтобы обеспечить сверхэкспрессию Tigit человека. Живые клетки NK92mi/Tigit высевали в 96-луночный планшет и инкубировали с серией разведений анти-Tigit антител. Козий античеловеческий IgG использовали в качестве вторичного антитела для выявления связывания антитела с клеточной поверхностью. Значения EC50 для дозозависимого связывания с нативным Tigit человека определяли путем подгонки данных доза-ответ к четырехпараметрической логистической модели с помощью GraphPad Prism. Как показано на фиг. 4 и в табл. 6 оба гуманизированных антитела 1217, hu1217-1-1 и hu1217-2-2, показали хорошую аффинность связывания с нативным Tigit на живых клетках.To evaluate the binding activity of anti-Tigit antibodies to native Tigit in living cells, NK92mi cells were engineered to overexpress human Tigit. Live NK92mi/Tigit cells were seeded in a 96-well plate and incubated with a dilution series of anti-Tigit antibodies. Goat anti-human IgG was used as a secondary antibody to detect antibody binding to the cell surface. EC 50 values for dose-dependent binding to native human Tigit were determined by fitting dose-response data to a four-parameter logistic model using GraphPad Prism. As shown in FIG. 4 and in table. 6, both humanized 1217 antibodies, hu1217-1-1 and hu1217-2-2, showed good binding affinity to native Tigit on living cells.
Таблица 6. ЕС50 дозозависимого связывания гуманизированных вариантов 1217 с нативным TigitTable 6. EC 50 dose-dependent binding of humanized 1217 variants to native Tigit
Пример 6. Анти-Tigit антитела блокируют взаимодействия Tigit с его лигандами PVR и PVR-L2Example 6 Anti-Tigit antibodies block interactions of Tigit with its ligands PVR and PVR-L2
Tigit связывается с PVR с высокой аффинностью (Kd: около 1 нМ), что может конкурировать с взаимодействием CD266-PVR [Yu et al, 2009].Tigit binds to PVR with high affinity (Kd: about 1 nM), which may compete with the CD266-PVR interaction [Yu et al, 2009].
Чтобы определить, могут ли анти-Tigit антитела блокировать взаимодействия Tigit-PVR и TigitPVR-L2, клетки HEK293 подвергали инжинирингу таким образом, чтобы обеспечить экспрессию высоких уровней PVR или PVR-L2. Полученные клеточные линии назвали HEK293/PVR и HEK293/PVR-L2, соответственно. Связывание растворимого Tigit (слитого белка Tigit-mIgG2a) с PVR или PVR-L2 определяли с помощью проточной цитометрии (фиг. 5А). Блокаду взаимодействия Tigit-лиганд количественно измеряли путем добавления последовательно разбавленных анти-Tigit антител. Как показано на фиг. 5В,To determine whether anti-Tigit antibodies could block Tigit-PVR and TigitPVR-L2 interactions, HEK293 cells were engineered to express high levels of PVR or PVR-L2. The resulting cell lines were named HEK293/PVR and HEK293/PVR-L2, respectively. The binding of soluble Tigit (Tigit-mIgG2a fusion protein) to PVR or PVR-L2 was determined by flow cytometry (Fig. 5A). Blockade of Tigit-ligand interaction was quantified by adding serially diluted anti-Tigit antibodies. As shown in FIG. 5V,
- 12 043681 hu1217-2-2/IgG1 (гуманизированная версия, содержащая Fc-область IgG1 дикого типа и имеющая те же последовательности VH и VL, что и hu1217-2-2/IgG1mf) и hu1217-2-2/IgG1mf могут блокировать связывание Tigit с PVR дозозависимым образом с IC50 при 0,64 и 0,55 мкг/мл, соответственно. Аналогично,- 12 043681 hu1217-2-2/IgG1 (a humanized version containing the wild-type IgG1 Fc region and having the same VH and VL sequences as hu1217-2-2/IgG1mf) and hu1217-2-2/IgG1mf can block binding of Tigit to PVR in a dose-dependent manner with IC 50 at 0.64 and 0.55 μg/ml, respectively. Likewise,
IC50 hu1217-2-2/IgG1 и hu1217-2-2/IgG1mf при блокировании взаимодействия Tigit-PVR-L2 составляетThe IC 50 of hu1217-2-2/IgG1 and hu1217-2-2/IgG1mf when blocking the Tigit-PVR-L2 interaction is
0,25 и 0,18 мкг/мл, соответственно.0.25 and 0.18 μg/ml, respectively.
Пример 7. Активация ЦМВ-специфичных Т-клеток человека анти-Tigit антителамиExample 7: Activation of CMV-specific human T cells by anti-Tigit antibodies
Функциональную активность антител к Tigit дополнительно оценивали с использованием Т-клеток естественного происхождения, которые распознают пептид человеческого ЦМВ РР65 (NLVPMVATV, 495-503, HLA-А2.1-рестриктированный) [Boeckh М, Boeckh M and Geballe АР, 2011 J Clin Invest. 121: 1673-80]. Вкратце, РВМС от HLA-A2.1+ здоровых доноров моделировали пептидом РР65 (> 98% чистоты, синтезированный GL Biochem, Shanghai) в полном RPMI с 10% FBS в течение недели. РВМС, примированный рр65, использовали в качестве эффекторных клеток. Перед анализом в клетки-мишени, клетки НСТ116 (HLA2A-.1+, 104), вводили пептид рр65 (5 мкг/мл) в течение 30 мин и совместно культивировали с равным количеством РВМС, сенсибилизированных рр65, в 96-луночном планшете в течение ночи в присутствии или в отсутствие анти-Tigit антител или холостого контроля (только среда). Как показано на фиг. 6, hu1217-2-2/IgG1 стимулировал рр65-специфические Т-клетки на секрецию IFN-γ в супернатанте клеточной культуры дозозависимым образом для обоих доноров.The functional activity of antibodies to Tigit was further assessed using naturally occurring T cells that recognize the human CMV PP65 peptide (NLVPMVATV, 495-503, HLA-A2.1-restricted) [Boeckh M, Boeckh M and Geballe AR, 2011 J Clin Invest . 121: 1673-80]. Briefly, PBMCs from HLA-A2.1+ healthy donors were modeled with PP65 peptide (>98% purity, synthesized by GL Biochem, Shanghai) in complete RPMI with 10% FBS for a week. PBMC primed with pp65 were used as effector cells. Before analysis, target cells were injected with pp65 peptide (5 μg/ml) for 30 min and co-cultured with an equal number of pp65-sensitized PBMCs in a 96-well plate. overnight in the presence or absence of anti-Tigit antibodies or blank control (medium only). As shown in FIG. 6, hu1217-2-2/IgG1 stimulated pp65-specific T cells to secrete IFN-γ in the cell culture supernatant in a dose-dependent manner for both donors.
Пример 8. Анти-Tigit антитела усиливали цитотоксичность, опосредованную NK-клеткамиExample 8 Anti-Tigit Antibodies Enhanced NK Cell-Mediated Cytotoxicity
Известно, что Tigit конститутивно экспрессируется в клетках естественных киллерах (NK) с относительно более высокими уровнями, и взаимодействие между Tigit и его лигандами ингибирует цитотоксичность, опосредованную NK-клетками [Wang F, et al. 2015 Eur. J. Immunology 45: 2886-97; Stanietsky N et al, 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106: 17858-63].Tigit is known to be constitutively expressed in natural killer (NK) cells at relatively higher levels, and the interaction between Tigit and its ligands inhibits NK cell-mediated cytotoxicity [Wang F, et al. 2015 Eur. J Immunology 45: 2886-97; Stanietsky N et al, 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106: 17858-63].
Чтобы подтвердить, могут ли гуманизированные анти-Tigit антитела стимулировать NKопосредованную цитотоксичность, была разработана линия NK-клеток NK92MI, осуществляющая коэкспрессию как рецепторов Tigit, так и DNAM-1 (NK92MI/Tigit-DNAM-1) в качестве эффекторной клетки посредством ретровирусной трансдукции в соответствии с протоколами, описанными ранее [Zhang et al., 2006 Cancer Res. 66: 5927-5933]. PVR-экспрессирующую клеточную линию рака легкого SK-MES1/PVR определяли аналогично в качестве мишени.To confirm whether humanized anti-Tigit antibodies could stimulate NK-mediated cytotoxicity, the NK cell line NK92MI was developed to co-express both Tigit receptors and DNAM-1 (NK92MI/Tigit-DNAM-1) as an effector cell via retroviral transduction into according to protocols described previously [Zhang et al., 2006 Cancer Res. 66: 5927-5933]. The PVR-expressing lung cancer cell line SK-MES1/PVR was similarly identified as a target.
Цитотоксичность клеток NK92MI/Tigit-DNAM-1 в отношении клеток SK-MES-1/PVR определяли с помощью анализа высвобождения LDH с использованием набора для анализа нерадиоактивной цитотоксичности CytoTox 96 (Promega, Madison, WI). Вкратце, клетки NK92MI/Tigit-DNAM-1 (8x105) совместно культивировали с клетками SK-MES-1/PVR (2x104) в присутствии анти-Tigit Abs (0,007-30 мкг/мл) в течение 5 часов в 96-луночных V-образных планшетах. Специфический лизис с помощью анализа высвобождения LDH определяли с использованием следующего уравнения: процент специфического лизиса = [(экспериментальный - спонтанный для эффекторных клеток - спонтанный для клетокмишеней)/(максимальный для клеток-мишеней - спонтанный для клеток-мишеней)] x 100. Результаты показали, что анти-Tigit антитела hu1217-2-2/IgG1mf усиливают уничтожение NK-клеток дозозависимым образом (ЕС50: 0,185 мкг/мл) (фиг. 7).Cytotoxicity of NK92MI/Tigit-DNAM-1 cells to SK-MES-1/PVR cells was determined by LDH release assay using the CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega, Madison, WI). Briefly, NK92MI/Tigit-DNAM-1 cells (8x10 5 ) were co-cultured with SK-MES-1/PVR cells (2x10 4 ) in the presence of anti-Tigit Abs (0.007-30 μg/ml) for 5 hours at 96- well V-shaped plates. Specific lysis by LDH release assay was determined using the following equation: percentage of specific lysis = [(experimental - spontaneous for effector cells - spontaneous for target cells)/(maximum for target cells - spontaneous for target cells)] x 100. The results showed that anti-Tigit antibodies hu1217-2-2/IgG1mf enhanced NK cell killing in a dose-dependent manner ( EC50 : 0.185 μg/ml) (Fig. 7).
Пример 9. Анти-Tigit антитела могут снижать поверхностную экспрессию рецептора Tigit через FcγR-опосредованный трогоцитоз.Example 9 Anti-Tigit antibodies can reduce surface expression of the Tigit receptor through FcγR-mediated trogocytosis.
Трогоцитоз представляет собой явление, при котором молекулы клеточной поверхности переносятся из донорных клеток в акцепторные клетки [Joly E, et al. 2003 Nat. Immunol; Machlenkin A, et al. 2008 Cancer Res.; Beum PV et al. 2008 J. Immunol; Rossi EA, et al. 2013 Blood]. Трогоцитоз, вызванный антителом, через Fcy-рецепторы (FcyRs) приводит к подавлению рецепторов на поверхности клетки [Carlsten M, et al. 2016 Clin Cancer Res; Beum PV, et al. 2011 J. Immunology]. Следовательно, подавление рецептора-мишени с помощью трогоцитоза может вызывать ослабленную передачу сигналов. Принимая во внимание эти наблюдения, существует возможность, что hu1217-2-2/IgG1 может индуцировать трогоцитоз рецептора Tigit в присутствии FcyR+ клеток, что приводит к снижению поверхностной экспрессии. Чтобы учесть эту возможность, клетки Jurkat/Tigit инкубировали с клетками HEK, экспрессирующими различные FcyRs (включая FcyRIIAH131, FcyRIIB, FcyRIIIv158), с меченым биотином hu1217-2-2/IgG1wt (гуманизированное антитело, содержащее те же последовательности VL и VH, что и hu1217-2-2/IgG1mf, и Fc область IgG1 дикого типа) или hu1217-2-2/IgG1mf в течение ночи. Поверхностную экспрессию рецептора Tigit определяли с помощью SA-APC (Biolegend). Как показано на фиг. 8, hu1217-2-2/IgG1, но не hu12172-2/IgG1mf, вызывал значительное снижение поверхностной экспрессии Tigit по сравнению с клетками, обработанными отрицательным контролем человеческим IgG, что указывает на то, что снижение поверхностного Tigit на клетках Jurkat/Tigit зависит от связывания FcyR. Кроме того, присутствие 10% сыворотки человека (содержащей высокий уровень эндогенного IgG) может частично снижать FcyRIIAH131или FcyRIIIAv158., но не FcγRIIB-опосредованный трогоцитоз рецептора Tigit, предполагая, что FcyRIIB может играть критическую роль в снижении поверхностной экспрессии Tigit анти-Tigit mAb (например, hu1217-2-2/IgG1wt) in vivo. Эти наблюдения также согласуются с предыдущими результатами [Ganesan LP, et al. 2012 J Immunol 189:4981-8; Taylor RP, et al. 2015 Blood 125: 762-6].Trogocytosis is a phenomenon in which cell surface molecules are transferred from donor cells to acceptor cells [Joly E, et al. 2003 Nat. Immunol; Machlenkin A, et al. 2008 Cancer Res.; Beum PV et al. 2008 J Immunol; Rossi E. A., et al. 2013 Blood]. Antibody-induced trogocytosis via Fcy receptors (FcyRs) leads to downregulation of cell surface receptors [Carlsten M, et al. 2016 Clin Cancer Res; Beum PV, et al. 2011 J. Immunology]. Therefore, inhibition of the target receptor by trogocytosis may cause attenuated signaling. Taking these observations into account, there is a possibility that hu1217-2-2/IgG1 may induce Tigit receptor trogocytosis in the presence of FcyR + cells, resulting in decreased surface expression. To address this possibility, Jurkat/Tigit cells were incubated with HEK cells expressing various FcyRs (including FcyRIIAH 131 , FcyRIIB, FcyRIII v158 ), with biotin-labeled hu1217-2-2/IgG1wt (a humanized antibody containing the same VL and VH sequences that both hu1217-2-2/IgG1mf and the Fc region of wild-type IgG1) or hu1217-2-2/IgG1mf overnight. Surface expression of the Tigit receptor was determined using SA-APC (Biolegend). As shown in FIG. 8, hu1217-2-2/IgG1, but not hu12172-2/IgG1mf, caused a significant reduction in surface Tigit expression compared to cells treated with the human IgG negative control, indicating that the reduction in surface Tigit on Jurkat/Tigit cells is dependent from FcyR binding. Additionally, the presence of 10% human serum (containing high levels of endogenous IgG) can partially reduce FcyRIIA H131 or FcyRIIIA v158 , but not FcγRIIB-mediated Tigit receptor trogocytosis, suggesting that FcyRIIB may play a critical role in reducing Tigit surface expression by anti-Tigit mAb (eg hu1217-2-2/IgG1wt) in vivo. These observations are also consistent with previous results [Ganesan LP, et al. 2012 J Immunol 189:4981-8; Taylor RP, et al. 2015 Blood 125: 762-6].
--
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNPCT/CN2017/120392 | 2017-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043681B1 true EA043681B1 (en) | 2023-06-13 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7287963B2 (en) | Anti-TIGIT antibodies and their use as therapeutic and diagnostic agents | |
| JP6968872B2 (en) | Anti-Tim-3 antibody | |
| KR20180100238A (en) | Anti-ROR1 antibody, ROR1 x CD3 bispecific antibody, and method of using same | |
| EA034666B1 (en) | Anti-pd1 antibody and use thereof for treating cancer or viral infection, and antibody fragment | |
| KR20210143192A (en) | Modified Fc fragments, antibodies comprising same, and applications thereof | |
| ES2737307T3 (en) | Non-antagonistic antibodies directed against the alpha chain of the extracellular domain of the IL7 receptor and use thereof in the treatment of cancer | |
| CN112566935A (en) | anti-OX 40 antibodies and methods of use | |
| CA3010223A1 (en) | Therapeutic binding compounds | |
| TWI764291B (en) | Anti-tigit antibodies and methods of use | |
| JP2022553927A (en) | Treatment of cancer with ILT-2 inhibitors | |
| EA043681B1 (en) | ANTI-TIGIT ANTIBODIES AND THEIR USE AS THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC AGENTS | |
| EA042181B1 (en) | ANTI-TIM-3 ANTIBODIES AND THEIR USE | |
| KR20230158464A (en) | Methods for treating cancer using an anti-TIGIT antibody in combination with an anti-PD1 antibody | |
| CN114641500A (en) | Methods of treating cancer using anti-OX 40 antibodies in combination with anti-TIM 3 antibodies |