EA043649B1 - METHOD FOR OBTAINING HEMOPHILI TYPE VACCINE IN CONJUGATE - Google Patents
METHOD FOR OBTAINING HEMOPHILI TYPE VACCINE IN CONJUGATE Download PDFInfo
- Publication number
- EA043649B1 EA043649B1 EA202190638 EA043649B1 EA 043649 B1 EA043649 B1 EA 043649B1 EA 202190638 EA202190638 EA 202190638 EA 043649 B1 EA043649 B1 EA 043649B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- prf
- haemophilus influenzae
- solution
- influenzae type
- conjugate
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 22
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229940029584 haemophilus influenzae type b conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 7
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- -1 ethyl dimethylaminoproline carbodiimide Chemical compound 0.000 claims description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 3
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 claims description 3
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- AIHDUTVBOYDXOW-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)pyridin-1-ium-1-carbonitrile Chemical compound CN(C)C1=CC=[N+](C#N)C=C1 AIHDUTVBOYDXOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 18
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 18
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061190 Haemophilus infection Diseases 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124962 ActHIB Drugs 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 206010046861 Vaccination complication Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения конъюгированной вакцины для профилактики гемофильной инфекции из штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМОболенск В-7884.The invention relates to the field of biotechnology and concerns a method for producing a conjugate vaccine for the prevention of Haemophilus influenzae infection from the Haemophilus influenzae type b strain GKPMObolensk B-7884.
Уровень техникиState of the art
Описан способ получения капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib), заключающийся в культивировании штамма в культуральной среде, сборе и обработке супернатанта культуры для экстрагирования капсулярного полисахарида с последующим его конъюгированием с белкомносителем (патент RU 2644246). Недостатком данного способа является использование для культивирования продуцента питательной среды сложного состава, состоящей из 33 компонентов, многие из которых требуют отдельной предварительной подготовки. Кроме того, инактивацию биомассы проводят раствором формалина в конечной концентрации 0,35-0,37% (об./об.), отсутствие остатков которого необходимо подтверждать в готовой вакцине.A method for obtaining capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b (Hib) is described, which consists in cultivating the strain in a culture medium, collecting and processing the culture supernatant to extract the capsular polysaccharide, followed by its conjugation with a protein carrier (patent RU 2644246). The disadvantage of this method is the use of a complex nutrient medium for cultivating the producer, consisting of 33 components, many of which require separate preliminary preparation. In addition, biomass inactivation is carried out with a formaldehyde solution in a final concentration of 0.35-0.37% (v/v), the absence of residues of which must be confirmed in the finished vaccine.
В патенте (RU 2542393) раскрывается способ получения конъюгата капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b с антигенами, который включает получение смеси столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси или фосфата алюминия, ее очистку, связывание карбодиимидным способом через дигидразид адипиновой кислоты с капсульным полисахаридом Hib и отмывку центрифугированием. Недостатком данного способа является использование анатоксинов адсорбированных на геле гидроокиси или фосфата алюминия. Присутствие гидроокиси или фосфата алюминия в составе вакцины потенциально увеличивает ее реактогенность и поствакцинальные осложнения, а также может приводить к формированию иммунного ответа в том числе и на анатоксины.The patent (RU 2542393) discloses a method for producing a conjugate of the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b with antigens, which includes obtaining a mixture of tetanus and diphtheria toxoids adsorbed on an aluminum hydroxide or phosphate gel, its purification, binding by the carbodiimide method through adipic acid dihydrazide with the Hib capsular polysaccharide and washing by centrifugation. The disadvantage of this method is the use of toxoids adsorbed on aluminum hydroxide or phosphate gel. The presence of aluminum hydroxide or phosphate in the vaccine composition potentially increases its reactogenicity and post-vaccination complications, and can also lead to the formation of an immune response, including to toxoids.
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ получения антигенного вакцинного препарата Haemophilus influenzae типа В путем выращивания бактерий на жидких питательных средах с последующим отделением биомассы методом ультрафильтрации на молекулярных волоконных фильтрах для извлечения экзогенного полисахарида. Далее концентрат клеток обрабатывают 2,5%-ным раствором натрия хлорида с натриевой солью ЭДТА и из полученного экстракта ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах выделяют капсульный полисахарид Hib в комплексе с белком, который соединяют с экзогенным полисахаридом Hib в соотношении 1:1 (патент RU 2185191).The closest analogue of the claimed invention is a method for producing an antigenic vaccine preparation of Haemophilus influenzae type B by growing bacteria in liquid nutrient media, followed by separation of biomass by ultrafiltration on molecular fiber filters to extract exogenous polysaccharide. Next, the cell concentrate is treated with a 2.5% solution of sodium chloride with sodium salt EDTA and from the resulting extract by ultrafiltration on molecular fiber filters, the capsular polysaccharide Hib is isolated in complex with protein, which is combined with exogenous polysaccharide Hib in a 1:1 ratio (patent RU 2185191 ).
Недостатком данного способа является долгая подготовка посевного материала (10 ч) с использованием твердой питательной среды, что приводит к необходимости смыва клеток с поверхности физиологическим раствором, сопровождающегося высоким риском контаминации и дополнительными трудозатратами по подготовке матрацев со стерильной средой. Инактивацию биомассы проводят раствором формалина, что приводит к необходимости последующего подтверждения его отсутствия в готовой вакцине и, следовательно, проведения дополнительного контроля. Использование ультрафильтрации для отделения биомассы из культуральной жидкости приводит к потерям по капсульному полисахариду ввиду использования молекулярных волокон с малым размером пор (20 кДа), на которых в процессе фильтрации скапливается слой бактериальных клеток, задерживающих целевой продукт полисахарид ПРФ. Экзогенный полисахарид Hib после отделения биомассы концентрируется только на молекулярных волокнах без дальнейшей очистки, а капсульный полисахарид в комплексе с белком Hib также подвергается дополнительно только диализу, что может усиливать реактогенность готовой вакцины. Раскрытие сущности изобретения.The disadvantage of this method is the long preparation of seed material (10 hours) using a solid nutrient medium, which leads to the need to wash off cells from the surface with physiological solution, accompanied by a high risk of contamination and additional labor costs for preparing mattresses with a sterile environment. Inactivation of biomass is carried out with a formaldehyde solution, which leads to the need for subsequent confirmation of its absence in the finished vaccine and, therefore, additional control. The use of ultrafiltration to separate biomass from the culture liquid leads to losses in capsular polysaccharide due to the use of molecular fibers with a small pore size (20 kDa), on which, during the filtration process, a layer of bacterial cells accumulates, retaining the target product, PRF polysaccharide. Exogenous Hib polysaccharide, after separation of the biomass, is concentrated only on molecular fibers without further purification, and the capsular polysaccharide in complex with the Hib protein is also subject to additional dialysis only, which can enhance the reactogenicity of the finished vaccine. Disclosure of the invention.
Нами разработан способ получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной, получаемой путем культивирования оригинального штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884 (штамм защищен патентом RU 2624014) в жидкой питательной среде простого состава с последующим выделением, концентрированием и очисткой субстанции полирибозилрибитолфосфата (ПРФ), которую активируют, конъюгируют с модифицированным белком-носителем и подвергают дополнительной постадийной очистке. Полученный конъюгат стерилизуют фильтрацией, добавляют необходимые растворители в рассчитанном количестве, разливают по флаконам и лиофильно высушивают.We have developed a method for producing Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine, obtained by cultivating the original strain of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk B-7884 (the strain is protected by patent RU 2624014) in a liquid nutrient medium of simple composition, followed by isolation, concentration and purification of the substance polyribosyl ribitol phosphate (PRP) , which is activated, conjugated to a modified carrier protein and subjected to additional step-by-step purification. The resulting conjugate is sterilized by filtration, the necessary solvents are added in calculated quantities, poured into vials and freeze-dried.
Техническими результатами, достигаемыми при осуществлении изобретения, являются следующие.The technical results achieved by implementing the invention are as follows.
По сравнению с используемыми способами получения конъюгированных вакцин для профилактики гемофильной инфекции субстанцию ПРФ получают из высокопродуктивного штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884, культивируемого в жидкой питательной среде простого состава, в которую в одном из вариантов дополнительно внесен раствор рибозы. При этом концентрация полисахарида в культуральной жидкости выше, описанной в патенте RU 2644246 (до 300 мкг/мл), и составляет 528-594 мкг/мл в случае с добавлением рибозы и 400-450 мкг/мл без добавления рибозы.In comparison with the methods used for producing conjugate vaccines for the prevention of Haemophilus influenzae infection, the PRF substance is obtained from the highly productive strain of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk B-7884, cultivated in a liquid nutrient medium of simple composition, into which, in one of the variants, a ribose solution is additionally added. In this case, the concentration of the polysaccharide in the culture liquid is higher than that described in patent RU 2644246 (up to 300 μg/ml), and is 528-594 μg/ml in the case of the addition of ribose and 400-450 μg/ml without the addition of ribose.
В предлагаемой технологии исключена стадия подготовки посевного материала путем культивирования продуцента на твердой питательной среде, что сокращает время и затраты на получение вакцины. Инактивация культуральной жидкости проводится путем нагревания, а не добавлением формалина, что исключает необходимость контроля его содержания в готовой вакцине. Инактивированная культуральная жидкость подвергается очистке через каскад глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,30,1 мкм, что позволяет отделить бактериальную массу и при этом минимизировать потери по полисахариду. При очистке и выделении субстанции нативный раствор ПРФ предварительно подвергается конThe proposed technology eliminates the stage of preparing seed material by cultivating the producer on a solid nutrient medium, which reduces the time and costs of obtaining the vaccine. Inactivation of the culture liquid is carried out by heating, and not by adding formalin, which eliminates the need to control its content in the finished vaccine. The inactivated culture liquid is purified through a cascade of depth filters with a pore diameter from 3.0-0.8 to 0.30.1 microns, which makes it possible to separate the bacterial mass and at the same time minimize polysaccharide losses. When purifying and isolating the substance, the native PRF solution is first subjected to con
- 1 043649 центрированию (в одном из вариантов), что значительно снижает объемы продукта, а значит позволяет уменьшить затраты на реагенты и упрощает процесс. В качестве белка-носителя используется столбнячный анатоксин не сорбированный на геле гидроокиси или фосфата алюминия, что делает полученную вакцину не реактогенной и при этом высоко иммуногенной. Очистка полисахарида ПРФ и конъюгата с белком-носителем проводится с использованием ультрафильтрационных кассет из современных материалов - полиэфирсульфон, гель-хроматографии, в одном из вариантов осветлением путем фильтрации через угольные картонные фильтры с диаметром пор 0,5-1,0 мкм, что позволяет снизить содержание эндотоксинов, нуклеиновых кислот, белка, удалить остаточные реагенты, используемые для конъюгации.- 1 043649 centering (in one of the options), which significantly reduces the volume of the product, which means it reduces the cost of reagents and simplifies the process. Tetanus toxoid not sorbed on aluminum hydroxide or phosphate gel is used as a carrier protein, which makes the resulting vaccine non-reactogenic and at the same time highly immunogenic. Purification of the PRP polysaccharide and the conjugate with the carrier protein is carried out using ultrafiltration cassettes made of modern materials - polyethersulfone, gel chromatography, in one of the options, clarification by filtration through carbon cardboard filters with a pore diameter of 0.5-1.0 microns, which allows to reduce content of endotoxins, nucleic acids, proteins, remove residual reagents used for conjugation.
Таким образом, изобретение представляет собой способ получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной, включающий следующие этапы: культивирование штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884 на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: глюкоза - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,0; пептон - 15,0; NH4Cl - 0,7; Na2HPO4 - 2,5; KCl - 0,5; NaCl - 3,3; L-глутаминовая кислота - 1,2; L-цистеин - 0,015; НАД - 0,02; гемин - 0,04, инактивацию культуры при помощи нагревания до (55±5)°С и выдерживания (15±3) мин, центрифугирование для отделения биомассы с последующей фильтрацией через каскад глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм, выделение полирибозилрибитолфосфата (ПРФ) путем осаждения 10%-ным раствором цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ), концентрирование и очистку, активацию полученной субстанции растворами 1-циано-4диметил-аминопиридиния тетрафторобората (ЦДАФ) и триэтиламина и смешивание со столбнячным анатоксином, модифицированным раствором этилдиметиламинопролинкарбодиимида (ЭДАК), не сорбированным на геле гидроокиси или фосфата алюминия, очистку, стерилизацию, добавление фармацевтически приемлемых носителей, розлив и лиофильную сушку.Thus, the invention is a method for producing Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine, which includes the following steps: cultivation of the Haemophilus influenzae type b strain GKPM-Obolensk B-7884 on a liquid nutrient medium of the following composition, g/l: glucose - 5.0; yeast extract - 2.0; peptone - 15.0; NH 4 Cl - 0.7; Na 2 HPO 4 - 2.5; KCl - 0.5; NaCl - 3.3; L-glutamic acid - 1.2; L-cysteine - 0.015; NAD - 0.02; hemin - 0.04, inactivation of the culture by heating to (55±5)°C and holding for (15±3) minutes, centrifugation to separate the biomass, followed by filtration through a cascade of depth filters with a pore diameter of 3.0-0.8 up to 0.3-0.1 microns, isolation of polyribosylribitol phosphate (PRP) by precipitation with a 10% solution of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), concentration and purification, activation of the resulting substance with solutions of 1-cyano-4dimethyl-aminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) and triethylamine and mixing with tetanus toxoid, a modified solution of ethyl dimethylaminoproline carbodiimide (EDAC), not sorbed on an aluminum hydroxide or phosphate gel, purification, sterilization, addition of pharmaceutically acceptable carriers, bottling and freeze-drying.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Пример получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной из оригинального штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884.An example of obtaining a Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine from the original strain of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk B-7884.
Пример 1. Первый технологический этап получения субстанции ПРФ заключается в создании Главного банка культуры (ГБК) и Рабочего банка культуры (РБК). Для этого оригинальный штамм Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884 культивируют в жидкой питательной среде в колбах на протяжении 4-6 часов, при температуре (35±2)°С и (150±10) об/мин до достижения середины экспоненциальной фазы роста. К культуральной жидкости Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884 добавляют стерильный 80%-ный раствор глицерина в объеме, соответствующем 25% объема культуральной жидкости (или соотношение 1:4). Розлив культуральной жидкости с криопротектором осуществляют в криопробирки вместимостью 5,0 мл по 1,0 мл. Каждую криопробирку маркируют. Полученные пробирки ГБК хранят в низкотемпературном холодильнике при температуре минус (80±3)°С на протяжении не более 10 лет. Пробирки ГБК используют для получения РБК по описанной выше схеме.Example 1. The first technological stage of obtaining the PRF substance is the creation of the Main Cultural Bank (GBK) and the Working Cultural Bank (RBC). For this, the original strain of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk V-7884 is cultivated in a liquid nutrient medium in flasks for 4-6 hours, at a temperature of (35±2)°C and (150±10) rpm until the mid-exponential growth phases. To the culture liquid of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk V-7884 add a sterile 80% glycerol solution in a volume corresponding to 25% of the volume of the culture liquid (or a ratio of 1:4). The culture liquid with cryoprotector is poured into 1.0 ml cryotubes with a capacity of 5.0 ml. Each cryovial is labeled. The resulting GBK tubes are stored in a low-temperature refrigerator at minus (80±3)°C for no more than 10 years. GBK tubes are used to obtain RBC according to the scheme described above.
В табл. 1 представлены результаты контроля Рабочего банка культуры Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884 о соответствии по всем показателям нормативным значениям.In table 1 presents the results of control of the Working Culture Bank Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk V-7884 on compliance of all indicators with standard values.
- 2 043649- 2 043649
Таблица 1Table 1
Результаты контроля Рабочего банка культуры Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884Results of control of the Working Culture Bank Haemophilus influenzae type b GCPM-Obolensk V-7884
РБК используют для получения рабочего посевного материла (РПМ). Для этого в асептических условиях восстановленную культуру из РБК переносят в жидкую питательную среду, разлитую в конические колбы. Культуру выращивают на протяжении 4-6 часов, при температуре (35±2)°С и (150±10) об/мин до достижения середины экспоненциальной фазы роста.RBC is used to obtain working seed material (WSM). To do this, under aseptic conditions, the reconstituted culture from the RBC is transferred into a liquid nutrient medium poured into conical flasks. The culture is grown for 4-6 hours, at a temperature of (35±2)°C and (150±10) rpm until the mid-exponential growth phase is reached.
Полученную культуральную жидкость объединяют в колбе и контролируют по показателям Чистота культуры, Окраска по Граму. Рабочий посевной материал получают в количестве 10% от количества питательной среды, используемой в ферментере.The resulting culture liquid is combined in a flask and monitored according to the indicators Culture purity and Gram stain. Working seed is obtained in an amount of 10% of the amount of nutrient medium used in the fermenter.
Далее проводят культивирование в ферментере Biostat® А МО UniVessel® Glass 2L 230V (Sartorius). Состав питательной среды для получения максимального количества ПРФ Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884, г/л: глюкоза - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,0; пептон - 15,0; NH4Cl - 0,7; Na2HPO4 - 2,5; KCl - 0,5; NaCl - 3,3; L-глутаминовая кислота - 1,2; L-цистеин - 0,015; НАД - 0,02; гемин - 0,04. Дополнительно добавляют питательные вещества к культуре, после достижения ею оптической плотности 1,0, в виде 20%-ного раствора глюкозы и 10% дрожжевого экстракта (соотношение 1:1).Next, cultivation is carried out in a Biostat® A MO UniVessel® Glass 2L 230V fermenter (Sartorius). Composition of the nutrient medium for obtaining the maximum amount of PRF Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk V-7884, g/l: glucose - 5.0; yeast extract - 2.0; peptone - 15.0; NH4Cl - 0.7; Na 2 HPO 4 - 2.5; KCl - 0.5; NaCl - 3.3; L-glutamic acid - 1.2; L-cysteine - 0.015; NAD - 0.02; hemin - 0.04. Additionally, nutrients are added to the culture after it reaches an optical density of 1.0, in the form of a 20% glucose solution and 10% yeast extract (ratio 1:1).
Рабочий посевной материал при помощи перистальтического насоса (через сифон) перекачивают в ферментер. Проводят культивирование при следующих условиях:The working seed is pumped into the fermenter using a peristaltic pump (via a siphon). Cultivation is carried out under the following conditions:
Количество оборотов мешалки: 100-300 об/мин; температура: (35±2)°С;Mixer speed: 100-300 rpm; temperature: (35±2)°C;
количество растворенного кислорода: 30% (регулируется карскадом); рН: (7,2±0,2);amount of dissolved oxygen: 30% (regulated by carcade); pH: (7.2±0.2);
Полученную производственную культуру контролируют по показателям Окраска по Граму, Чистота культуры. Количество синтезированного полисахарида ПРФ составляет 400-450 мкг/мл.The resulting production culture is controlled according to the following indicators: Gram stain and culture purity. The amount of synthesized polysaccharide PRF is 400-450 μg/ml.
По завершении процесса культивирования проводят инактивацию культуры при помощи нагревания до (55+5)°С и выдерживания (15+3) мин без перемешивания. Инактивацию культуры подтверждают путем высева культуральной жидкости на шоколадный агар (отсутствие роста культуры).Upon completion of the cultivation process, the culture is inactivated by heating to (55+5)°C and holding for (15+3) minutes without stirring. Inactivation of the culture is confirmed by plating the culture liquid on chocolate agar (no growth of the culture).
Полученную инактивированную культуру центрифугируют (центрифуга Beckman coulter AvantiJ-E) для отделения биомассы с последующей фильтрацией через каскад глубинных фильтров с диаметром пор 0,3-0,6 мкм и 0,1-0,3 мкм.The resulting inactivated culture is centrifuged (Beckman coulter AvantiJ-E centrifuge) to separate the biomass, followed by filtration through a cascade of depth filters with pore diameters of 0.3-0.6 μm and 0.1-0.3 μm.
Полисахарид из фильтрата выделяют путем осаждения 10%-ным раствором цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ). Смесь оставляют при температуре (5±3)°С до выпадения осадка. Полученный осадок ПРФ центрифугируют и гомогенизируют при помощи гомогенизатора RW 16 basic (производительThe polysaccharide from the filtrate is isolated by precipitation with a 10% solution of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). The mixture is left at a temperature of (5±3)°C until a precipitate forms. The resulting PRF sediment is centrifuged and homogenized using an RW 16 basic homogenizer (manufacturer:
- 3 043649- 3 043649
IKA) при скорости вращения (6000±500) об/мин до полного его растворения. Экстракцию ПРФ проводят спиртом этиловым в количестве 40% по объему. После окончания экстракции приступают к отделению осадка центрифугированием. К полученному супернатанту добавляют 1,0% (по объему) 4,0 М раствора натрия хлорида, содержимое бутыли встряхивают вручную и оставляют при температуре (5±3)°С на (13±1) ч в холодной комнате. Осадок отделяют центрифугированием, собирают и высушивают при уровне вакуума от 0,04 мбар в течение (24±4) ч. Полученную субстанцию ПРФ контролируют по показателям Описание, Вода, Подлинность, Распределение молекул ПРФ по размеру, Рибоза, ПРФ, Фосфор, Белок, Нуклеиновые кислоты, Бактериальные эндотоксины.IKA) at a rotation speed of (6000±500) rpm until it is completely dissolved. Extraction of PRF is carried out with ethyl alcohol in an amount of 40% by volume. After the extraction is completed, the sediment is separated by centrifugation. 1.0% (by volume) 4.0 M sodium chloride solution is added to the resulting supernatant, the contents of the bottle are shaken manually and left at a temperature of (5±3)°C for (13±1) hours in a cold room. The precipitate is separated by centrifugation, collected and dried at a vacuum level of 0.04 mbar for (24±4) hours. The resulting PRF substance is controlled according to the indicators Description, Water, Identity, Size distribution of PRF molecules, Ribose, PRF, Phosphorus, Protein, Nucleic acids, Bacterial endotoxins.
При помощи реакции латекс-агглютинации подтверждают подлинность полученного продукта (фигура). Образование хлопьевидного осадка свидетельствует о наличии ПРФ в субстанции.Using the latex agglutination reaction, the authenticity of the resulting product is confirmed (figure). The formation of a flocculent sediment indicates the presence of PRF in the substance.
В табл. 2 представлены результаты контроля полученной субстанции ПРФ о соответствии по всем показателям нормативным значениям.In table Table 2 shows the results of monitoring the obtained PRF substance for compliance with standard values for all indicators.
Таблица 2table 2
Результаты контроля субстанции ПРФ, полученной из оригинального штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884Results of control of the PRF substance obtained from the original strain of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk V-7884
Полученную субстанцию ПРФ используют для получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной. Для этого готовят раствор субстанции, ПРФ активируют растворами 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторобората (ЦДАФ) и триэтиламина и смешивают со столбнячным анатоксином, модифицированным раствором этилдиметиламинопролинкарбодиимида (ЭДАК). Полученный конъюгат концентрируют и проводят его диафильтрацию на ультрафильтрационной установке с кассетой 100 кДа. Далее предварительно фильтруют через мембрану 0,45 мкм и очищают на хроматографической колонке с сорбентом Сефадекс G-25. Собранный элюат подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану 0,22 мкм и контролируют.The resulting PRF substance is used to produce Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine. To do this, a solution of the substance is prepared, the PRF is activated with solutions of 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAF) and triethylamine and mixed with tetanus toxoid, a modified solution of ethyldimethylaminoprolinecarbodiimide (EDAC). The resulting conjugate is concentrated and diafiltrated using an ultrafiltration unit with a 100 kDa cassette. Next, it is pre-filtered through a 0.45 µm membrane and purified on a chromatographic column with Sephadex G-25 sorbent. The collected eluate is subjected to sterilizing filtration through a 0.22 μm membrane and monitored.
Полученный конъюгат ПРФ со столбнячным анатоксином контролируют по показателям Описание, Подлинность, рН, Белок, Соотношение ПРФ к белку, Концентрация ПРФ, Свободный ПРФ, Свободный белок, Распределение молекул ПРФ по размеру, Стерильность, ЭДАК, ЦДАФ, Бактериальные эндотоксины.The resulting conjugate of PRF with tetanus toxoid is controlled according to the indicators Description, Identity, pH, Protein, Ratio of PRF to protein, Concentration of PRF, Free PRF, Free protein, Size distribution of PRF molecules, Sterility, EDAC, CDAP, Bacterial endotoxins.
Результаты контроля полученного конъюгата ПРФ со столбнячным анатоксином соответствует по всем показателям нормативным значениям.The results of control of the resulting PRF conjugate with tetanus toxoid correspond to standard values in all respects.
Полученный промежуточный продукт используют на стадии сведения вакцины: используют рассчитанное количество промежуточного продукта (конъюгата), стерильного 0,5 М раствора сахарозы, стерильного 0,1 М раствора трис-HCl и стерильной воды для инъекций. Розлив сведенной вакцины (доза розлива - 0,6 мл) осуществляют в предварительно подготовленные флаконы 2R. Вакцину лиофильно высушивают при заданных параметрах и передают на стадию упаковки и маркировки. Контроль готовой продукции проводят согласно НД по следующим показателям: Описание, Подлинность, Растворимость, Механические включения, рН, Вода, Точность розлива, Фосфор, Капсульный полиса- 4 043649 харид, Стерильность, Аномальная токсичность, Пирогенность, Сахароза. По всем показателям полученная вакцина гемофильная тип b конъюгированная соответствует требования нормативной документации.The resulting intermediate product is used at the vaccine mixing stage: a calculated amount of the intermediate product (conjugate), a sterile 0.5 M sucrose solution, a sterile 0.1 M Tris-HCl solution and sterile water for injection are used. The mixed vaccine is filled (filling dose is 0.6 ml) into pre-prepared 2R vials. The vaccine is freeze-dried under specified parameters and transferred to the packaging and labeling stage. Control of finished products is carried out in accordance with ND according to the following indicators: Description, Authenticity, Solubility, Mechanical inclusions, pH, Water, Filling accuracy, Phosphorus, Capsular polysaccharide, Sterility, Abnormal toxicity, Pyrogenicity, Sucrose. In all respects, the resulting hemophilus influenzae type b conjugate vaccine complies with the requirements of regulatory documentation.
Пример 2. Получение вакцины гемофильной тип b конъюгированной из штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884 осуществляют как описано в примере 1.Example 2. Preparation of the Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine from the Haemophilus influenzae type b strain GKPM-Obolensk B-7884 is carried out as described in example 1.
Интенсифицируют образование полисахарида ПРФ добавлением в питательную среду 0,5%-ного раствора рибозы, что приводит к увеличению еще на 32% концентрации образуемого ПРФ (до 528-594 мкг/мл).The formation of the PRF polysaccharide is intensified by adding a 0.5% ribose solution to the nutrient medium, which leads to an increase in the concentration of the formed PRF by another 32% (up to 528-594 μg/ml).
Фильтрат после отделения биомассы концентрируют (в 10 раз) и подвергают диафильтрации на ультрафильтрационной установке с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа.After separating the biomass, the filtrate is concentrated (10 times) and subjected to diafiltration in an ultrafiltration unit with a nominal molecular weight cutoff of 30 kDa.
Супернатант после экстракции этиловым спиртом и отделения осадка фильтруют через угольные глубинные фильтры с диаметром пор 0,5-1,0 мкм, после чего определяют оптическую плотность полученного фильтрата (при длине волны 275 нм).The supernatant, after extraction with ethyl alcohol and separation of the precipitate, is filtered through carbon depth filters with a pore diameter of 0.5-1.0 μm, after which the optical density of the resulting filtrate is determined (at a wavelength of 275 nm).
Приведенные дополнительные технологические этапы позволяют увеличить содержание ПРФ в субстанции с 0,74 до 0,95 мг/мг субстанции, а также снизить количество нуклеиновых кислот и белка с 0,8 до 0,1%, количество эндотоксинов - со значения менее 25 ЕЭ в 1 мкг ПРФ до менее 5 ЕЭ в 1 мкг ПРФ.The above additional technological steps make it possible to increase the content of PRP in the substance from 0.74 to 0.95 mg/mg of substance, as well as reduce the amount of nucleic acids and protein from 0.8 to 0.1%, the amount of endotoxins - from a value of less than 25 EU per 1 µg PRF to less than 5 EU in 1 µg PRF.
Вакцина гемофильная тип b конъюгированная из штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМОболенск В-7884 успешно прошла доклинические исследования на половозрелых и неполовозрелых животных, в ходе которых была доказана ее безопасность и иммуногенность в сравнении с препаратом сравнения Акт-ХИБ® (производства Sanofi Pasteur, Франция) и Вакцина гемофильная тип b конъюгированная, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения 0,5 мл/доза (производства ФБУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии).The hemophilus influenzae type b vaccine conjugated from the Haemophilus influenzae type b strain GKPMObolensk B-7884 has successfully passed preclinical studies on mature and immature animals, during which its safety and immunogenicity was proven in comparison with the reference drug Act-HIB® (manufactured by Sanofi Pasteur, France) and Hemophilus influenzae type b conjugate vaccine, lyophilisate for preparing a solution for intramuscular administration 0.5 ml/dose (produced by the Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology).
Способ позволяет получить вакцину гемофильную тип b конъюгированную из оригинального штамма Haemophilus influenzae тип b ГКПМ-Оболенск В-7884, обладающую протективной активностью, не уступающую существующим конъюгированным вакцинам и сохраняющую стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности (1,5 года).The method makes it possible to obtain a Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine from the original strain of Haemophilus influenzae type b GKPM-Obolensk B-7884, which has protective activity that is not inferior to existing conjugate vaccines and maintains the stability of all quality indicators during the established shelf life (1.5 years).
Claims (2)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019112197 | 2019-04-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043649B1 true EA043649B1 (en) | 2023-06-08 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9512159B2 (en) | Methods for the production of 3-O-deactivated-4′-monophosphoryl lipid A (3D-MLA) | |
| JP5465676B2 (en) | Fermentation process for culturing Streptococcus and purification process for obtaining capsular polysaccharide (cp) from Streptococcus | |
| US4197290A (en) | Vaccine | |
| US8093034B2 (en) | Fed batch culture methods for streptococci | |
| CA2538691C (en) | Process for producing polysaccharide for conjugate vaccine | |
| PT983342E (en) | Culture medium with soy bean extract as aminoacid source and no protein complexes of animal origin | |
| JPS61186328A (en) | Improved composite bodies, manufacture and drug containing them | |
| JP2538224B2 (en) | Purification of pertussis antigen | |
| US4123520A (en) | Method for preparing high molecular weight meningococcal Group C vaccine | |
| RU2704452C1 (en) | Method of producing a hemophilic b type conjugated vaccine | |
| EA043649B1 (en) | METHOD FOR OBTAINING HEMOPHILI TYPE VACCINE IN CONJUGATE | |
| US4235994A (en) | High molecular weight meningococcal group C vaccine and method for preparation thereof | |
| CN114106210A (en) | Production process of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine | |
| RU2770877C1 (en) | Method of producing antigenic conjugated substance of haemophilic type b microbe for creating vaccine preparations | |
| RU2089215C1 (en) | Method of preparing meningococcus lipopolysaccharide of serogroup b | |
| RU2283135C1 (en) | Method for releasing cleaned meningococcal polysaccharides of a and c serological group | |
| RU2096042C1 (en) | Method of preparing multipartial vaccine for leptospirosis control in animals | |
| RU2687973C1 (en) | Method of producing drug preparation of collalisin®, lyophilizate for preparing solution for local and parenteral application for treating fibroproliferative diseases | |
| SU1750689A1 (en) | Method for preparation of polysaccharido-protein vaccine against neisseria meningitis serogroup b | |
| Bronzino et al. | Vaccine Production | |
| RU2535122C1 (en) | Method for preparing choleragen anatoxin | |
| CA1155056A (en) | Vaccine for the prevention and treatment of bovine mastitis | |
| SU1085040A1 (en) | Method for producing soluble choleraic o-antigen for immunization of choleraic agglutinating serum producers | |
| RU2088244C1 (en) | Method of vi-antigen preparing | |
| SU784878A1 (en) | Method of obtaining protecting somatic antigen of diphtheria corinebacteria |