EA043101B1 - MEANS FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN LIQUID FORM (VERSIONS) - Google Patents

MEANS FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN LIQUID FORM (VERSIONS) Download PDF

Info

Publication number
EA043101B1
EA043101B1 EA202290467 EA043101B1 EA 043101 B1 EA043101 B1 EA 043101B1 EA 202290467 EA202290467 EA 202290467 EA 043101 B1 EA043101 B1 EA 043101B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
cov2
agent
dose
cov
Prior art date
Application number
EA202290467
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ольга Вадимовна Зубкова
Татьяна Андреевна Ожаровская
Инна Вадимовна Должикова
Ольга Попова
Дмитрий Викторович Щебляков
Дарья Михайловна Гроусова
Алина Шахмировна Джаруллаева
Амир Ильдарович Тухватулин
Наталья Михайловна Тухватулина
Дмитрий Николаевич Щербинин
Ильяс Булатович Есмагамбетов
Елизавета Александровна Токарская
Андрей Геннадьевич Ботиков
Алина Сергеевна Ерохова
Фатима Магомедовна Ижаева
Наталья Анатольевна Никитенко
Надежда Леонидовна Лубенец
Александр Сергеевич Семихин
Сергей Владимирович Борисевич
Борис Савельевич Народицкий
Денис Юрьевич Логунов
Александр Леонидович Гинцбург
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Publication of EA043101B1 publication Critical patent/EA043101B1/en

Links

Description

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.The invention relates to biotechnology, immunology and virology. The proposed agent can be used to prevent diseases caused by the SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome virus.

Уровень техникиState of the art

Эпидемия коронавирусной инфекции COVID-19, которая началась в конце 2019 г.в Китайской Народной Республике, за несколько месяцев распространилась по всему миру и бросила беспрецедентный вызов современной системе здравоохранения. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 106 млн человек, а число погибших более 2,3 млн человек.The COVID-19 epidemic, which began in late 2019 in the People's Republic of China, spread around the world in a few months and posed an unprecedented challenge to the modern healthcare system. Currently, the number of cases of COVID-19 is more than 106 million people, and the death toll is more than 2.3 million people.

Возбудителем заболевания является одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.The causative agent of the disease is a single-stranded RNA virus SARS-CoV-2 belonging to the Coronaviridae family to the Beta-CoV lineage.

Коронавирус передается от человека к человеку воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Инкубационный период составляет в среднем 5-6 дней, после чего развиваются первые симптомы заболевания. Для COVID-19 характерными симптомами являются повышение температуры тела, сухой кашель, отдышка, утомляемость. Реже встречаются боль в горле, в суставах, насморк, головная боль. При этом тяжесть заболевания может варьироваться, от бессимптомной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома и смерти.Coronavirus is transmitted from person to person by airborne droplets, airborne dust and contact routes. The incubation period averages 5-6 days, after which the first symptoms of the disease develop. For COVID-19, the characteristic symptoms are fever, dry cough, shortness of breath, fatigue. Less common are sore throat, joint pain, runny nose, headache. The severity of illness can range from asymptomatic infection to severe acute respiratory syndrome and death.

Быстрое распространение SARS-CoV-2 и высокий процент смертности создали острую необходимость в разработке эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом. Разработка безопасной и эффективной вакцины против SARS-CoV-2 в настоящее время является важнейшим глобальным приоритетом.The rapid spread of SARS-CoV-2 and the high mortality rate have created an urgent need to develop effective means of preventing diseases caused by this virus. The development of a safe and effective SARS-CoV-2 vaccine is now a top global priority.

В течение года после начала пандемии различные фармацевтические компаний предложили свои варианты кандидатной вакцины против COVID-19.Within a year of the start of the pandemic, various pharmaceutical companies offered their own versions of a COVID-19 vaccine candidate.

Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована модифицированная мРНК, кодирующая мутантную форму S белка SARS-CoV-2. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 21 день (F.P. Polack et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med 2020; 383: 26032615).Pharmaceutical company Pfizer has partnered with biotech company BioNTech to develop the BNT162b2 (tozinameran) vaccine. This vaccine is a lipid nanoparticle encapsulated with a modified mRNA encoding a mutant S form of the SARS-CoV-2 protein. The vaccination schedule involves two immunizations 21 days apart (F.P. Polack et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med 2020; 383: 26032615).

Фармацевтическая компания Modema в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК, кодирующая S белок SARS-CoV-2, которая окружена липидной оболочкой. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (L.A. Jackson et al. An mRNA Vaccine against SARSCoV-2 -Preliminary Report. N Engl J Med 2020; 383:1920-1931).The pharmaceutical company Modema, in collaboration with the National Institutes of Health (USA), has developed the mRNA-1273 vaccine. The active component of this vaccine is mRNA encoding the S protein of SARS-CoV-2, which is surrounded by a lipid membrane. The vaccination schedule involves two immunizations with an interval of 28 days (L.A. Jackson et al. An mRNA Vaccine against SARSCoV-2 - Preliminary Report. N Engl J Med 2020; 383:1920-1931).

Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (М. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. The Lancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021).The University of Oxford, in collaboration with the pharmaceutical company AstraZeneca, has developed a ChAdOx1 nCoV-19 vector vaccine (AZD1222). The active component of this vaccine is the chimpanzee adenovirus ChAdOx1 containing a codon-optimized coding sequence of the full-length S protein of the SARS-CoV-2 virus (GenBank MN908947) with a tissue plasminogen activator leader sequence. The vaccination schedule involves two immunizations with an interval of 28 days (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomized controlled trials in Brazil, South Africa , and the UK, The Lancet, Vol 397, Issue 10269, P99-111, 2021).

Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. Схема вакцинации предусматривает однократную иммунизацию. (GenBank YP009724390) (Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. The Lancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).CanSino has developed a vector vaccine against COVID-19 based on a replication-defective human adenovirus serotype 5 (Ad5) that expresses the full-length SARS-CoV-2 S glycoprotein. The vaccination schedule provides for a single immunization. (GenBank YP009724390) (Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial, The Lancet, Vol 369, Issue 10249, P479-488, 2020).

Исследовательские группы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical в сотрудничестве с Медицинским центром Beth Israel Deaconess, с помощью технологии Janssen AdVac® создали несколько кандидатных вакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумя пролин-стабилизирующими мутациями. В настоящий момент исследуются две схемы вакцинации: однократная и двукратная с интервалом 8 недель (J. Sadoff et al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 2021 Jan 13. DOI: 10.1056/NEJMoa2034201).The Johnson and Johnson and Janssen Pharmaceutical research teams, in collaboration with the Beth Israel Deaconess Medical Center, have developed several candidate vaccines using Janssen AdVac® technology. Following safety and efficacy studies, the candidate vaccine Ad26.COV2.S (Ad26COVS1) was selected. The active component of this vaccine is a recombinant serotype 26 adenovirus vector with a deletion of the E1 and E3 regions, containing the S gene of the SARS-CoV-2 protein, with a furin cleavage site mutation and two proline-stabilizing mutations. Two vaccination regimens are currently being investigated: single and double with an interval of 8 weeks (J. Sadoff et al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 2021 Jan 13 DOI: 10.1056/NEJMoa2034201).

Таким образом, можно отметить, что большая часть вакцин против COVID-19 предполагают двукратную вакцинацию.Thus, it can be noted that most of the vaccines against COVID-19 involve a double vaccination.

Каждая из представленных вакцин имеет свои сильные стороны и недостатки. Так вакцины на основе РНК обладают менее выраженными побочными эффектами, но по сравнению с векторными вакцинами обладают меньшей иммуногенностью. Кроме того, РНК более хрупкая, чувствительная к условиямEach of the presented vaccines has its own strengths and weaknesses. Thus, RNA-based vaccines have less pronounced side effects, but compared to vector vaccines, they have less immunogenicity. In addition, RNA is more fragile, sensitive to conditions

- 1 043101 хранения.- 1 043101 storage.

Вакцины, основанные на рекомбинантных вирусных векторах, обладают высокой иммуногенностью. Однако недостатком данного типа вакцин является возможность формирования иммунного ответа на векторную часть, что затрудняет ревакцинацию. Также за счет того, что аденовирусы циркулируют в популяции человека, часть населения может иметь предсуществующий иммунитет против данных вирусов. Экспрессионные векторы, основанные на аденовирусах других млекопитающих, позволяют решить проблему с предсуществующим иммунитетом, однако такие векторы хуже проникают в клетки человека, а за счет этого снижается эффективность вакцин.Vaccines based on recombinant viral vectors are highly immunogenic. However, the disadvantage of this type of vaccine is the possibility of forming an immune response to the vector part, which makes revaccination difficult. Also, due to the fact that adenoviruses circulate in the human population, a part of the population may have a pre-existing immunity against these viruses. Expression vectors based on adenoviruses from other mammals can solve the problem of pre-existing immunity, but such vectors are less able to penetrate into human cells, and this reduces the effectiveness of vaccines.

Техническое решение согласно патенту РФ № 2731342 (опубликован 01.09.2020) выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты фармацевтического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2:The technical solution according to the patent of the Russian Federation No. 2731342 (published on 09/01/2020) was chosen by the authors of the claimed invention as a prototype. Variants of a pharmaceutical agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 are known from this patent:

содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;containing component 1, which is an agent in the form of an expression vector based on the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and the ORF6-Ad26 region is replaced by ORF6-Ad5, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and also containing component 2, which is an agent in the form of an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, with built-in expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;

содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делегированы E1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;containing component 1, which is an agent in the form of an expression vector based on the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are delegated, and the ORF6-Ad26 region is replaced by ORF6-Ad5, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3; with built-in expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;

содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.containing component 1, which is an agent in the form of an expression vector based on the genome of a recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and also containing component 2, which is an agent in the form of an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

Кроме того, в данном патенте раскрыто применение указанных вариантов средств для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающее использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.In addition, this patent discloses the use of these options for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2, including the use of component 1 and 2 in an effective amount sequentially with an interval of at least 1 week.

Нужно отметить, что такой способ применения имеет ряд недостатков. Так, например, каждый из компонентов фармацевтического средства может вызывать побочные эффекты и аллергические реакции, следовательно при двукратной схеме вакцинации количество таких явлений будет возрастать. Также такая схема иммунизации имеет ряд практических трудностей, заключающихся в том, что необходимо обеспечить явку пациентов с определенным интервалом времени. Кроме того, имеется ряд логистических трудностей, связанных со своевременной доставкой нужных компонентов средства.It should be noted that this method of application has several disadvantages. So, for example, each of the components of a pharmaceutical agent can cause side effects and allergic reactions, therefore, with a double vaccination schedule, the number of such events will increase. Also, such an immunization scheme has a number of practical difficulties, consisting in the fact that it is necessary to ensure the appearance of patients with a certain time interval. In addition, there are a number of logistical difficulties associated with the timely delivery of the necessary components of the tool.

Таким образом, в области техники существует потребность в расширении арсенала фармацевтических средств, способных индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 у широких слоев населения.Thus, there is a need in the art to expand the arsenal of pharmaceutical agents capable of inducing an immune response against the SARS-CoV-2 virus in the general population.

Технической задачей изобретения является создание средств, содержащих один активный компонент, и при этом обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV2 у широких слоев населения.The technical objective of the invention is the creation of products containing one active ingredient, and at the same time providing an effective induction of an immune response against the SARS-CoV2 virus in the general population.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

Решением технической задачи является вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.The solution to the technical problem is a variant of the agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 26th serotype, in which E1 and E3 region, and the ORF6-Ad26 region is replaced with ORF6-Ad5, with an inserted expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

Также создан вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.A variant of an agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form has also been created, containing as the only active component an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted. , with an inserted expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

Кроме того, заявлен вариант средства для индукции специфического иммунитета против вирусаIn addition, a variant of the agent for inducing specific immunity against the virus is claimed.

- 2 043101 тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.- 2 043101 severe acute respiratory syndrome SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated expression cassette, selected of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

При этом, частном случае его выполнения буферный раствор средства для жидкой формы содержит, мас.%:At the same time, in a particular case of its implementation, the buffer solution of the agent for the liquid form contains, wt%:

трис tris от 0,1831 до 0,3432 from 0.1831 to 0.3432 хлорид натрия sodium chloride от 0,3313 до 0,6212 from 0.3313 to 0.6212 сахароза sucrose от 3,7821 до 7,0915 from 3.7821 to 7.0915 магния хлоридагексагидрат magnesium chloride hexahydrate от 0,0154 до 0,0289 from 0.0154 to 0.0289 ЭДТА EDTA от 0,0029 до 0,0054 from 0.0029 to 0.0054 полисорбат-80 polysorbate-80 от 0,0378 до 0,0709 from 0.0378 to 0.0709 этанол 95% ethanol 95% от 0,0004 до 0,0007 from 0.0004 to 0.0007 вода water остальное. rest.

Каждый вариант средства применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.Each variant of the agent is used to induce specific immunity against the SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome virus.

При этом средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно.In this case, the agent is intended for use intranasally or intramuscularly. Also, the agent can be administered jointly and simultaneously intranasally and intramuscularly.

Причем в частном случае выполнения средство интраназально вводят в дозе от 5x10 10 до 5x1011 вирусных частиц или внутримышечно в дозе от 5x1010 до 5x1011 вирусных частиц. А совместное введение интраназально и внутримышечно осуществляют в дозе от 5x1010 до 5x1011 вирусных частиц внутримышечно, в дозе от 5x1010 до 5x1011 вирусных частиц интраназально.Moreover, in a particular case of execution, the agent is administered intranasally at a dose of 5x10 10 to 5x1011 viral particles or intramuscularly at a dose of 5x10 10 to 5x1011 viral particles. And joint administration intranasally and intramuscularly is carried out at a dose of 5x10 10 to 5x1011 viral particles intramuscularly, at a dose of 5x10 10 to 5x1011 viral particles intranasally.

Совместное введение предусматривает интраназальное и внутримышечное введение в рамках одной процедуры вакцинации.Co-administration involves intranasal and intramuscular administration within the same vaccination procedure.

Технический результат заключается в разработке средства, обеспечивающего развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоев населения.The technical result consists in the development of a tool that ensures the development of humoral and cellular immune responses against the SARS-CoV-2 virus in the general population.

Основная цель вакцинации - обеспечить эффективную и долгосрочную защиту от патогена. Одним из вариантов достижения этой цели является многократная вакцинация. Когда организм человека впервые встречает вакцинный антиген, это приводит к активации двух основных компонентов адаптивного иммунного ответа: В-лимфоцитов и эффекторных Т-лимфоцитов. Активированные В-лимфоциты трансформируются в плазматические клетки, способные к продукции антител, а также превращаются в Вклетки памяти. Эффекторные Т-лимфоциты делятся на два основных типа: Т-хелперы (CD4+) и Ткиллеры (CD8+). Главной функцией Т-хелперов является поддержка в развитии гуморального или клеточного иммунного ответа. Основной функцией Т-киллеров является уничтожение повреждённых клеток собственного организма. Т-киллеры являются одним из главных компонентов антивирусного иммунитета. Однако через некоторое время после вакцинации количество антиген-специфичных иммунных клеток в организме начинает уменьшаться, тогда вводят бустерную дозу вакцины, которая позволяет поддерживать количество антиген-специфичных Т- и В-клеток на должном уровне (обеспечивающем протекцию организма от патогена).The main goal of vaccination is to provide effective and long-term protection against a pathogen. One way to achieve this goal is multiple vaccinations. When the human body first encounters a vaccine antigen, it leads to the activation of two main components of the adaptive immune response: B-lymphocytes and effector T-lymphocytes. Activated B-lymphocytes transform into plasma cells capable of producing antibodies, and also turn into memory B cells. Effector T-lymphocytes are divided into two main types: T-helpers (CD4+) and T-killers (CD8+). The main function of T-helpers is to support the development of a humoral or cellular immune response. The main function of T-killers is the destruction of damaged cells of their own body. T-killers are one of the main components of antiviral immunity. However, some time after vaccination, the number of antigen-specific immune cells in the body begins to decrease, then a booster dose of the vaccine is administered, which allows you to maintain the number of antigen-specific T- and B-cells at the proper level (providing protection of the body from the pathogen).

Разработка однокомпонентного средства, которое будет вызывать стойкий иммунный ответ после однократной иммунизации является сложной научно-практической задачей. При этом значимость такой разработки сложно переоценить. Однократное введение способно обеспечить более быстрые темпы массовой вакцинации, что в условиях пандемии имеет критическое значение. Также данное средство может быть полезно для экстренной вакцинации, для иммунизации мобильных групп граждан (кочевые народы и пр.) и др. Кроме того, можно отметить, что при однократном введении снижается неблагоприятное воздействие на человека: травматичность, количество побочных эффектов и аллергических реакций.The development of a single-component agent that will cause a stable immune response after a single immunization is a complex scientific and practical task. At the same time, the significance of such a development is difficult to overestimate. A single injection can provide faster rates of mass vaccination, which is critical in a pandemic. Also, this tool can be useful for emergency vaccination, for immunization of mobile groups of citizens (nomadic peoples, etc.), etc. In addition, it can be noted that a single administration reduces the adverse effects on humans: trauma, the number of side effects and allergic reactions.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

На фиг. 1 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного средства по варианту 1.In FIG. Figure 1 shows the results of assessing the humoral immune response to the antigen of the SARS-CoV2 virus in volunteers immunized with the liquid form of the developed agent according to option 1.

Ось ординат - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2. Ось абсцисс - дни.Y-axis - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 virus. The abscissa axis is days.

О - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день.O - IgG titer to the RBD domain of SARS-CoV-2 glycoprotein S in each volunteer participating in the study, on day 14.

□ - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день.□ - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 virus in each volunteer participating in the study, on day 21.

А - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день.A - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 virus in each volunteer participating in the study, on day 28.

Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждойThe geometric mean of the antibody titer is shown as a black line for each

- 3 043101 группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.- 3 043101 data groups. A statistically significant difference between the values of 14, 21 and 28 days is indicated by a bracket above which is the p value according to the Wilcoxon T-test.

На фиг. 2 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вирусаIn FIG. 2 shows the results of assessing the humoral immune response to the antigen of the virus

SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного средства по вариантуSARS-CoV2 in volunteers immunized with the liquid form of the developed agent according to the variant

2.2.

Ось ординат - титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2. Ось абсцисс - дни.Y-axis - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 virus. The abscissa axis is days.

О - титр IgG к RBD домену гликопротеина вующего в исследовании, на 14 день.O - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein present in the study, on day 14.

□ - титр IgG к RBD домену гликопротеина вующего в исследовании, на 21 день.□ - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein in the study, on day 21.

△ - титр IgG к RBD домену гликопротеина вующего в исследовании, на 28 день.△ - IgG titer to the RBD domain of the glycoprotein in the study, on day 28.

вируса вируса вирусаvirus virus virus

SARS-CoV-2SARS-CoV-2

SARS-CoV-2SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 каждого каждого каждого добровольца участдобровольца участдобровольца участСреднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.SARS-CoV-2 Each Each Each Volunteer Site Volunteer Site Geometric mean antibody titer is represented as a black bar for each data group. A statistically significant difference between the values of 14, 21 and 28 days is indicated by a bracket above which is the p value according to the Wilcoxon T-test.

На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.In FIG. Figure 3 shows the results of evaluating the effectiveness of immunization of volunteers with a liquid form of the developed agent according to option 1 in assessing the proportion of proliferating CD8+ (A) and CD4+ (B) lymphocytes restimulated by SARS-CoV-2 S antigen.

Ось ординат - количество пролиферирующих клеток,%. Ось абсцисс - дни.The y-axis is the number of proliferating cells,%. The abscissa axis is days.

• - обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.• - indicates the proportion of proliferating CD8+ in each volunteer on day 0.

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день- the proportion of proliferating CD8+ in each volunteer on day 14 is indicated

А - обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.A - indicates the proportion of proliferating CD8+ in each volunteer on day 28.

• - обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.• - indicates the proportion of proliferating CD4+ in each volunteer on day 0.

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день- the proportion of proliferating CD4+ in each volunteer on day 14 is indicated

А - обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.A - indicates the proportion of proliferating CD4+ in each volunteer on day 28.

Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами * р<0,05; ** р<0,01; **** р<0,001 по критерию Манна-Уитни.The median of the values is represented as a black line for each data group. Statistically significant difference between the values of 0, 14 and 28 days is indicated by brackets and symbols * p<0.05; ** p<0.01; **** p<0.001 according to the Mann-Whitney test.

На фиг. 4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного средства по варианту 2 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.In FIG. Figure 4 shows the results of evaluating the effectiveness of immunization of volunteers with a liquid form of the developed agent according to option 2 in assessing the proportion of proliferating CD8+ (A) and CD4+ (B) lymphocytes restimulated by SARS-CoV-2 S antigen.

Ось ординат - количество пролиферирующих клеток,%. Ось абсцисс - дни.The y-axis is the number of proliferating cells,%. The abscissa axis is days.

• - обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.• - indicates the proportion of proliferating CD8+ in each volunteer on day 0.

- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день- the proportion of proliferating CD8+ in each volunteer on day 14 is indicated

А - обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.A - indicates the proportion of proliferating CD8+ in each volunteer on day 28.

• - обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.• - indicates the proportion of proliferating CD4+ in each volunteer on day 0.

- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день- the proportion of proliferating CD4+ in each volunteer on day 14 is indicated

А - обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.A - indicates the proportion of proliferating CD4+ in each volunteer on day 28.

Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами * р<0,05; ** р<0,01; **** р<0,001 по критерию Манна-Уитни.The median of the values is represented as a black line for each data group. Statistically significant difference between the values of 0, 14 and 28 days is indicated by brackets and symbols * p<0.05; ** p<0.01; **** p<0.001 according to the Mann-Whitney test.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Активным компонентом разработанного средства является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма аденовируса, со встроенной экспрессионной кассетой, содержащей ген антигена вируса SARS-CoV-2.The active component of the developed agent is an expression vector based on the genome of a recombinant adenovirus strain with an integrated expression cassette containing the SARS-CoV-2 virus antigen gene.

Аденовирусные векторы способны проникать в различные типы клеток человека, обеспечивают высокие уровни экспрессии целевого антигена, приводят к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. В ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Минздрава России было разработано 3 варианта экспрессионных векторов на основе аденовирусов млекопитающих:Adenovirus vectors are able to penetrate various types of human cells, provide high levels of expression of the target antigen, and lead to the induction of both cellular and humoral immune responses. FGBU NITsEM them. N.F.Gamalei of the Ministry of Health of Russia developed 3 variants of expression vectors based on mammalian adenoviruses:

экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5;an expression vector based on the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and the ORF6-Ad26 region is replaced by ORF6-Ad5;

экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области;an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted;

экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.an expression vector based on the genome of a recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

В качестве антигена был выбран S белок SARS-CoV-2, который находится на поверхности вирусной частицы. Это один из наиболее перспективных антигенов, позволяющих индуцировать мощный и длительный иммунный ответ. Также было показано, что антитела к S белку SARS-CoV-2 являются вирус-нейтрализующими.The S protein of SARS-CoV-2, which is located on the surface of the viral particle, was chosen as the antigen. This is one of the most promising antigens for inducing a strong and long-lasting immune response. Antibodies to the SARS-CoV-2 S protein have also been shown to be virus-neutralizing.

Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы разработали раз- 4 043101 личные варианты экспрессионных кассет, содержащих ген S белка.To achieve the most efficient induction of immune responses, the authors developed various variants of expression cassettes containing the S gene of the protein.

Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор - это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК (Wang W., Jia YL., Li YC, Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao СР., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports - 2017. - Vol. 8. - P. 10416).The expression cassette of SEQ ID NO: 1 consists of the CMV promoter, the S gene of the SARS-CoV2 virus protein, and a polyadenylation signal. The CMV promoter is a cytomegalovirus early gene promoter that provides for constitutive expression in a variety of cell types. However, the strength of target gene expression driven by the CMV promoter varies across cell types. In addition, it was shown that the level of transgene expression under the control of the CMV promoter decreases with increasing time of cell cultivation due to suppression of gene expression, which is associated with DNA methylation (Wang W., Jia YL., Li YC, Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao SR., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells // Scientific Reports - 2017. - Vol. 8. - P. 10416) .

Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор - синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор bbb-актина курицы и химерный интрон (bbb-актина курицы и bbbглобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора CAG выше, чем у промотора CMV (Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. - 2014. - Vol. 13. -P. 1270-1277).The expression cassette of SEQ ID NO: 2 consists of the CAG promoter, the S gene of the SARS-CoV2 virus protein, and a polyadenylation signal. The CAG promoter is a synthetic promoter that includes an early enhancer of the CMV promoter, a chicken bbb actin promoter, and a chimeric intron (chicken bbb actin and rabbit bbb globin). It has been experimentally shown that the transcriptional activity of the CAG promoter is higher than that of the CMV promoter (Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation // Genet Mol Res. - 2014. - Vol. 13. - P. 1270-1277).

Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 - промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1α (EF-1a). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток (Wang X, Xu Z, Tian Z, Zhang X, Xu D, Li Q, Zhang J, Wang T. The EF-1a promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. J Cell Mol Med. 2017 Nov;21(11):3044-3054. doi: 10.1111/jcmm.l3216. Epub 2017 May 30. PMID: 28557288; PMCID: PMC5661254). Ген EF-1a кодирует фактор элонгации-1а, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1a часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.The expression cassette of SEQ ID NO: 3 consists of the EF1 promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal. The EF1 promoter is the human eukaryotic translation elongation factor 1α (EF-1a) promoter. The promoter is constitutively active in a wide range of cell types (Wang X, Xu Z, Tian Z, Zhang X, Xu D, Li Q, Zhang J, Wang T. The EF-1a promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells J Cell Mol Med 2017 Nov;21(11):3044-3054 doi: 10.1111/jcmm.l3216 Epub 2017 May 30 PMID: 28557288; PMCID: PMC5661254 The EF-1a gene encodes elongation factor-1a, which is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells and is expressed in almost all mammalian cell types. This EF-1a promoter is often active in cells in which the viral promoters are unable to express controlled genes and in cells in which the viral promoters are gradually silenced.

Экспрессионная кассета SEQ ID NO: 4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV2 и сигнала полиаденилирования.The expression cassette of SEQ ID NO: 4 consists of the CMV promoter, the S gene of the SARS-CoV2 virus protein, and a polyadenylation signal.

Таким образом, в результате проведенной работы было разработано 3 варианта средства.Thus, as a result of the work carried out, 3 variants of the tool were developed.

1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.1) An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and the ORF6-Ad26 region is replaced with ORF6-Ad5, with an inserted expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

2) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.2) an agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an embedded expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

3) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.3) an agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an embedded expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.The implementation of the invention is confirmed by the following examples.

Пример 1. Получение активного компонента средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2Ha основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа.Example 1. Obtaining the active component of the agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2Ha based on the genome of the recombinant human adenovirus strain of the 26th serotype.

На первом этапе работы был разработан дизайн 3 вариантов экспрессионных кассет:At the first stage of work, the design of 3 variants of expression cassettes was developed:

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;the expression cassette of SEQ ID NO: 1 consists of the CMV promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal;

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;the expression cassette of SEQ ID NO: 2 consists of the CAG promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal;

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.the expression cassette of SEQ ID NO: 3 consists of the EF1 promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal.

Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2 осуществлялся компанией ЗАО Евроген (Москва).Synthesis of the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein was carried out by ZAO Evrogen (Moscow).

Для получения рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи Минздрава России: плазмида pAd26-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа, и плазмида pAd26-too, несущая геном ре- 5 043101 комбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией Е1 и E3-областей.To obtain a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, we used two plasmids obtained at the N.F. 5 043101 genome of combinant human adenovirus serotype 26 with an open reading frame ORF6 of human adenovirus serotype 5 and with a deletion of E1 and E3 regions.

На первом этапе работы с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd26-Ends были получены плазмиды pAd26-Ends-CMV-S-CoV2, pAd26-Ends-CAG-S-CoV2, pAd26-Ends-EF1-SCoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-tooCMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EFl-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания 0RF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией Е1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно.At the first stage of the work, plasmids pAd26-Ends-CMV-S-CoV2, pAd26-Ends-CAG-S-CoV2, pAd26-Ends-EF1-SCoV2 containing expression cassettes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, respectively, as well as bearing arms of the homology of the genome of adenovirus serotype 26. Next, the resulting plasmids were linearized according to a unique hydrolysis site, and each plasmid was mixed with the pAd26-too recombinant vector. As a result of homologous recombination, plasmids pAd26-tooCMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EFl-S-CoV2 were obtained, carrying the genome of recombinant human adenovirus 26 serotype with an open reading frame 0RF6 human adenovirus 5 -th serotype and with a deletion of E1 and E3 regions, with an expression cassette of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, respectively.

На следующем этапе плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры HEK293.At the next stage, plasmids pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1S-CoV2 were digested with specific restriction endonucleases to remove the vector part. The resulting DNA preparations were transfected into HEK293 culture cells.

В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы human adenovirus 26-го серотипа: Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм human adenovirus 26-го серотипа: Ad26-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.As a result of the work, recombinant strains of human adenovirus serotype 26 were obtained: Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-EF1-S-CoV2. A control strain of human adenovirus serotype 26 was obtained using a similar scheme: Ad26-too, which does not contain the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, который является активным компонентом разработанного средства.Thus, an expression vector was obtained containing the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions were deleted, and the ORF6-Ad26 region was replaced with an ORF6-Ad5 with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, which is the active component of the developed agent.

Пример 2. Получение активного компонента средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа.Example 2. Obtaining the active component of an agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype.

В данной работе также использовали 3 варианта экспрессионных кассет:In this work, we also used 3 variants of expression cassettes:

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;the expression cassette of SEQ ID NO: 1 consists of the CMV promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal;

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;the expression cassette of SEQ ID NO: 2 consists of the CAG promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal;

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.the expression cassette of SEQ ID NO: 3 consists of the EF1 promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal.

Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2 осуществлялся компанией ЗАО Евроген (Москва).Synthesis of the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein was carried out by ZAO Evrogen (Moscow).

Для получения рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи Минздрава России:To obtain a recombinant strain of human adenovirus serotype 5, we used two plasmids obtained at the N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology:

плазмида pAd5-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа (одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок; второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома);plasmid pAd5-Ends carrying homology arms of the genome of adenovirus serotype 5 (one arm of homology represents the beginning of the genome of human adenovirus serotype 5 (from the left inverted terminal repeat to the E1 region) and the sequence of the viral genome, including the pIX protein; the second arm homology contains the nucleotide sequence after the E4 ORF3 region to the end of the genome);

плазмида pAd5-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией Е1 и Е3-областей.plasmid pAd5-too carrying the genome of recombinant human adenovirus serotype 5 with deletion of E1 and E3 regions.

На первом этапе работы с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd5-Ends были получены плазмиды pAd5-Ends-CMV-S-CoV2, pAd5-Ends-CAG-S-CoV2, pAd5-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5го с делецией Е1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно.At the first stage of the work, plasmids pAd5-Ends-CMV-S-CoV2, pAd5-Ends-CAG-S-CoV2, pAd5-Ends-EF1-S-CoV2 containing expression cassettes of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, respectively, as well as carrying arms of the genome homology of adenovirus serotype 5. Next, the resulting plasmids were linearized according to a unique hydrolysis site, and each plasmid was mixed with the pAd5-too recombinant vector. As a result of homologous recombination, plasmids pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2 were obtained, carrying the genome of recombinant human adenovirus 5 with the deletion of E1 and E3 regions , with an expression cassette of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, respectively.

На следующем этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-SCoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры HEK293.At the next stage, plasmids pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-SCoV2 were digested with specific restriction endonucleases to remove the vector part. The resulting DNA preparations were transfected into HEK293 culture cells.

В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы human adenovirus 5-го серотипа: Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм human adenovirus 5-го серотипа: Ad5-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.As a result of this work, recombinant strains of human adenovirus serotype 5 were obtained: Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-EF1-S-CoV2. According to a similar scheme, a control strain of human adenovirus serotype 5 was obtained: Ad5-too, which does not contain the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, который является активным компо- 6 043101 нентом разработанного средства.Thus, an expression vector was obtained containing the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 5, in which the E1 and E3 regions were deleted with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , which is the active component of the developed agent.

Пример 3. Получение активного компонента средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа.Example 3. Obtaining the active component of the agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 based on the genome of the recombinant strain of simian adenovirus serotype 25.

В данной работе использовали 3 варианта экспрессионных кассет:In this work, 3 variants of expression cassettes were used:

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;the expression cassette of SEQ ID NO: 4 consists of the CMV promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal;

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;the expression cassette of SEQ ID NO: 2 consists of the CAG promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal;

экспрессионная кассета SEQ ID NO: 3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.the expression cassette of SEQ ID NO: 3 consists of the EF1 promoter, the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, and a polyadenylation signal.

Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2 осуществлялся компанией ЗАО Евроген (Москва).Synthesis of the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein was carried out by ZAO Evrogen (Moscow).

Для получения рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи Минздрава России:To obtain a recombinant strain of simian adenovirus of the 25th serotype, two plasmids were used, obtained at the N.F.

плазмида pSim25-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса обезьян 25-го серотипа;plasmid pSim25-Ends carrying the homology arms of the simian adenovirus genome serotype 25;

плазмида pSim25-null, несущая геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа с делецией Е1 и Е3-областей.plasmid pSim25-null carrying the genome of recombinant simian adenovirus serotype 25 with deletion of E1 and E3 regions.

На первом этапе работы с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pSim25-Ends, были получены плазмиды p-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2, p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2, p-Sim25-Ends-EF1-SCoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса обезьян 25-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25-го с делецией Е1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно.At the first stage of work, using genetic engineering methods based on the pSim25-Ends plasmid, plasmids p-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2, p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2, p-Sim25-Ends-EF1 were obtained -SCoV2 containing expression cassettes of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, respectively, as well as bearing homology arms of the simian adenovirus genome serotype 25. Next, the obtained plasmids were linearized according to a unique hydrolysis site, and each plasmid was mixed with the pSim25-too recombinant vector. As a result of homologous recombination, plasmids pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2 were obtained, carrying the genome of recombinant simian adenovirus 25 with the deletion of E1 and E3 -regions, with an expression cassette of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, respectively.

На следующем этапе плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-tooEF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры HEK293.At the next stage, plasmids pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-tooEF1-S-CoV2 were digested with specific restriction endonucleases to remove the vector part. The resulting DNA preparations were transfected into HEK293 culture cells.

В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы simian adenovirus 25-го серотипа: simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм simian adenovirus25-го серотипа: simAd25-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.As a result of the work, recombinant strains of simian adenovirus serotype 25 were obtained: simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-EF1-S-CoV2. A control strain of simian adenovirus 25 serotype simAd25-too, which does not contain the S gene of the SARS-CoV-2 virus protein, was obtained according to a similar scheme.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делегированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, который является активным компонентом разработанного средства.Thus, an expression vector was obtained containing the genome of a recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which E1 and E3 regions are delegated with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , which is the active component of the developed tool.

Пример 4. Разработка буферного раствораExample 4 Buffer Development

Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Для поддержания рН раствора в буфер добавили трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободнорадикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.The authors of the invention have chosen a water-based buffer solution that ensures the stability of recombinant adenovirus particles. Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) was added to the buffer to maintain the pH of the solution. Sodium chloride was added to achieve the required ionic strength and osmolarity. For cryoprotection, sucrose was added to the buffer. Magnesium chloride hexahydrate was added as a source of divalent cations, EDTA as a free radical oxidation inhibitor, polysorbate-80 as a surfactant, ethanol 95% as a free radical oxidation inhibitor.

Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (табл. 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из активных компонентов средства:To determine the concentration of the substances that make up the buffer solution for the liquid form of the agent, several variants of the experimental groups were obtained (Table 1). One of the active components of the agent was added to each of the resulting buffer solutions:

1) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1 (Ad26-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц);1) an expression vector based on the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and the ORF6-Ad26 region is replaced by ORF6-Ad5, with an integrated expression cassette SEQ ID NO: 1 (Ad26-CMV-S -CoV2, 1*1011 virus particles);

2) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1 (Ad5-CMV-S-CoV2, l*10n вирусных частиц);2) an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated expression cassette of SEQ ID NO: 1 (Ad5-CMV-S-CoV2, l*10 n viral particles);

3) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 4 (simAd25-CMV-S-CoV2, 1x1011 вирусных частиц).3) an expression vector based on the genome of a recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated expression cassette SEQ ID NO: 4 (simAd25-CMV-S-CoV2, 1x1011 viral particles).

Полученные средства хранили при температуре -18°С и -70°С в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.The obtained funds were stored at -18°C and -70°C for 3 months, then thawed and the change in the titer of recombinant adenoviruses was assessed.

- 7 043101- 7 043101

Таблица 1. Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы средстваTable 1. Composition of experimental buffer solutions for the liquid form of the agent

№ группы group number Состав буферного раствора Buffer composition о К OK Хлорид натрия (мг) Sodium chloride (mg) Сахароза (мг) Sucrose (mg) Магния хлорида гексагидрат (мг) Magnesium chloride hexahydrate (mg) ЭДТА (мг) EDTA (mg) Полисорбат-80 (мг) Polysorbate-80 (mg) Этанол 95% (мг) Ethanol 95% (mg) Вода Water 1 1 0,968 0.968 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 2 2 1,815 1.815 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 3 3 1,21 1.21 1,752 1.752 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 4 4 1,21 1.21 3,285 3.285 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 5 5 1,21 1.21 2,19 2.19 20 20 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 6 6 1,21 1.21 2,19 2.19 37,5 37.5 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 7 7 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,0816 0.0816 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 8 8 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,153 0.153 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 9 9 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,0152 0.0152 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 10 10 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,0285 0.0285 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml И AND 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,2 0.2 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 12 12 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,375 0.375 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml 13 13 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,002 0.002 до 0,5 мл up to 0.5 ml 14 14 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,00375 0.00375 до 0,5 мл up to 0.5 ml 15 15 1,21 1.21 2,19 2.19 25 25 0,102 0.102 0,019 0.019 0,25 0.25 0,0025 0.0025 до 0,5 мл up to 0.5 ml

Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы средства при температурах -18°С и -70°С в течение 3 месяцев не изменялся.The results of the experiment showed that the titer of recombinant adenoviruses after their storage in a buffer solution for the liquid form of the agent at temperatures of -18°C and -70°C did not change for 3 months.

Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ (мас.%):Thus, the developed buffer solution for the liquid form of the agent ensures the stability of all components of the developed agent in the following range of active ingredients (wt.%):

Трис: от 0,1831 до 0,3432 мас.%;Tris: 0.1831 to 0.3432% by weight;

Хлорид натрия: от 0,3313 до 0,6212 мас.%;Sodium chloride: 0.3313 to 0.6212% by weight;

Сахароза: от 3,7821 до 7,0915 мас.%;Sucrose: 3.7821 to 7.0915% by weight;

Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 до 0,0289 мас.%;Magnesium chloride hexahydrate: 0.0154 to 0.0289% by weight;

ЭДТА: от 0,0029 до 0,0054 мас.%;EDTA: 0.0029 to 0.0054% by weight;

Полисорбат-80: от 0,0378 до 0,0709 мас.%;Polysorbate-80: 0.0378 to 0.0709% by weight;

Этанол 95%: от 0,0004 до 0,0007 мас.%;Ethanol 95%: 0.0004 to 0.0007% by weight;

Растворитель: остальное.Solvent: rest.

Пример 5. Получение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формеExample 5. Obtaining an agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form

Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 1 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 в буферном растворе.The developed agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form according to option 1 contains an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 26th serotype, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 in buffer solution.

Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 2 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 в буферном растворе.The developed agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form according to option 2 contains an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 in buffer solution.

Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 3 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 в буферном растворе.The developed agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form according to option 3 contains an expression vector based on the genome of a recombinant strain of simian adenovirus of the 25th serotype, with an integrated expression cassette selected from SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 in buffer solution.

Активный компонент смешивается с компонентами буферного раствора во время технологического процесса. Фармацевтическое средство разливается в стерильные флаконы. Хранение производят в защищенном от света месте, при температуре не выше минус 18°С. Перед использованием необходимо дос- 8 043101 тать из холодильной камеры и выдержать при комнатной температуре до полного размораживания не более 30 мин; перед применением перемешать, осторожно покачивая флакон (ампулу). Не допускается резко встряхивать препарат. Не допускается повторная заморозка.The active component is mixed with the components of the buffer solution during the technological process. The pharmaceutical product is poured into sterile vials. Storage is carried out in a place protected from light, at a temperature not exceeding minus 18°C. Before use, it is necessary to take 8 043101 out of the refrigerator and keep at room temperature until completely defrosted for no more than 30 minutes; mix before use by gently shaking the vial (ampoule). It is not allowed to shake the drug sharply. Re-freezing is not allowed.

Пример 6. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при внутривенном и внутримышечном введенииExample 6. Toxicity of the developed agent with a single injection (acute toxicity) in mice with intravenous and intramuscular administration

В данном исследовании оценивали острую токсичность средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;In this study, the acute toxicity of an agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form was evaluated, containing as the only active component an expression vector based on the genome of a recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which E1 and E3 region, and the ORF6-Ad26 region is replaced by ORF6-Ad5, with an embedded expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;

средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;means for induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an integrated an expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;

средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делегированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.means for induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain simian adenovirus of the 25th serotype, in which the E1 and E3 regions are delegated, with an integrated an expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

В исследовании были использованы аутбредные мыши обоих полов, массой 18-20 г, возрастом 6-8 недель.The study used outbred mice of both sexes, weighing 18-20 g, aged 6-8 weeks.

Расчет дозы средства проводили, исходя из иммунизирующей дозы (108 в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных - сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили, исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 108 в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.The calculation of the dose of funds was carried out on the basis of the immunizing dose (10 8 w.h.), obtained in a preliminary experiment on a sensitive species of animals - Syrian hamsters. Doses for mice were calculated based on body weight. The minimum dose for toxicological experiments was chosen dose for mice 10 8 vp, as the closest to therapeutic. No cross-species conversion factor was used for dose conversion, doses were obtained by direct conversion to body weight according to the WHO recommendation for vaccine preparations.

В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:As a result, the following doses of the drug were chosen for administration to mice in this experiment:

108 в.ч. - близкая к эффективной дозе (ЭД) для мышей;10 8 w.h. - close to the effective dose (ED) for mice;

109 в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;10 9 w.h. - increased ED for mice by 20 times;

1010 в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;10 10 w.h. - increased ED for mice by 200 times;

1011 в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;10 11 w.h. - increased ED for mice by 2000 times;

Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:Thus, the following experimental groups of animals were obtained:

1) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1х108 в.ч., 20 мышей;1) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1x10 8 v.h., 20 mice;

2) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1х109 в.ч., 20 мышей;2) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1x10 9 v.h., 20 mice;

3) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1х1010 в.ч., 20 мышей;3) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1x10 10 v.h., 20 mice;

4) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1х 1011 в.ч., 20 мышей;4) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1x 10 11 v.h., 20 mice;

5) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1х108 в.ч., 20 мышей;5) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1x10 8 v.h., 20 mice;

6) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1х109 в.ч., 20 мышей;6) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1x10 9 v.h., 20 mice;

7) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1х1010 в.ч., 20 мышей;7) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1x10 10 v.h., 20 mice;

8) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1х 1011 в.ч., 20 мышей;8) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1x 10 11 v.h., 20 mice;

9) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1х108 в.ч., 20 мышей;9) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1x10 8 v.h., 20 mice;

10) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1х109 в.ч., 20 мышей;10) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1x10 9 v.h., 20 mice;

11) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1х1010 в.ч., 20 мышей;11) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1x10 10 v.h., 20 mice;

12) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1х 1011 в.ч., 20 мышей;12) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1x 10 11 v.h., 20 mice;

13) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.13) placebo (buffer solution), 20 mice.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.Clinical examination of each animal was carried out daily for 14 days, recording signs of intoxication and the number of dead animals.

Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалосьThe following parameters of the functional state of laboratory animals were recorded: activity, movement, appearance, condition of wool, eyes, ears, teeth, limbs. Physiological functions: respiration, salivation, saliva, urine, excretion. All animals remained alive throughout the experiment. In all groups, the animals looked healthy, actively ate food, responded adequately to stimuli, and showed research interest. The coat is thick, even and shiny, tightly adhering to the surface of the body; no hair loss or brittleness was detected. Muscle tone was not characterized by increased excitability. The auricles are without crusts, not inflamed, no twitching is noticed. Teeth of normal color, without breakage. The mice were of average fatness, did not suffer from exhaustion. The abdominal region was not enlarged in volume. Breathing is even, uncomplicated. Salivation is normal. Urination frequency, urine color, gastrointestinal parameters, muscle tone, reflexes corresponded to the physiological norm. The behavior of the experimental animals did not differ

- 9 043101 от контрольных.- 9 043101 from control.

На 14 сутки от начала эксперимента осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.On the 14th day from the start of the experiment, mice were euthanized by the method of dislocation of the cervical vertebrae. During the study, animals in serious condition with signs of imminent death were not observed, there was no death of animals.

Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.Conducted a complete necropsy of the bodies of all animals. During necropsy, the external state of the body, internal surfaces and passages, the cranial cavity, the chest, abdominal and pelvic cavities with organs and tissues located in them, the neck with organs and tissues, and the musculoskeletal system were examined.

При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.In a macroscopic study, no effect of the agent on the state of the internal organs of mice was found, no differences were found between the control and experimental groups. There were no statistically significant differences in organ mass between the experimental and control groups. The weight gain of animals in the experimental and control groups did not differ.

Пример 7. Определение эффективности иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответаExample 7. Determination of the effectiveness of immunization with the developed tool for evaluating the humoral immune response

Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против SARS-CoV-2 через 21 день после введения средства лабораторным животным.One of the main characteristics of the effectiveness of immunization is the antibody titer. The example presents data regarding the change in antibody titer against SARS-CoV-2 21 days after administration of the agent to laboratory animals.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г. Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 5x101° вирусных частиц/200 мкл.Mammals were used in the experiment - mice of the BALB/c line, females 18 g. All animals were divided into 13 groups of 5 animals, which were intramuscularly injected with variants of the developed agent in liquid form at a dose of 5x101° viral particles/200 μl.

Были получены следующие группы животных:The following groups of animals were obtained:

1) Ad26-too-CMV-S-CoV2,1) Ad26-too-CMV-S-CoV2,

2) Ad26-too-CAG-S-CoV2,2) Ad26-too-CAG-S-CoV2,

3) Ad26-too-EF1-S-CoV2,3) Ad26-too-EF1-S-CoV2,

4) Ad26-too,4) Ad26-too,

5) Ad5-too-CMV-S-CoV2,5) Ad5-too-CMV-S-CoV2,

6) Ad5-too-CAG-S-CoV2,6) Ad5-too-CAG-S-CoV2,

7) Ad5-too-EF1-S-CoV2,7) Ad5-too-EF1-S-CoV2,

8) Ad5-too,8) Ad5-too,

9) simAd25-too-CMV-S-CoV2,9) simAd25-too-CMV-S-CoV2,

1°) simAd25-too-CAG-S-CoV2,1°) simAd25-too-CAG-S-CoV2,

11) simAd25-too-EF1-S-CoV2,11) simAd25-too-EF1-S-CoV2,

12) simAd25-too,12) simAd25-too,

13) плацебо (буфер).13) placebo (buffer).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:Three weeks later, the animals were bled from the tail vein and the blood serum was isolated. The antibody titer was determined by enzyme immunoassay (ELISA) according to the following protocol:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 ч при температуре +4°С.1) The antigen was adsorbed on the wells of a 96-well ELISA plate for 16 hours at +4°C.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась забивка планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 10° мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.2) Further, to get rid of non-specific binding, the plate was plugged with 5% milk dissolved in a buffer to block a non-specific signal in a volume of 10 μl per well. Incubated on a shaker at 37°C for an hour.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 10° раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.3) Serum samples from immunized mice were first diluted 10°-fold and then a series of two-fold dilutions was made. A total of 12 dilutions of each sample were prepared.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.4) Add 50 µl of each diluted serum sample to the wells of the plate.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.5) Further incubation was carried out for 1 hour at 37°C.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.6) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.7) Secondary antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase were then added.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.8) Further incubation was carried out for 1 hour at 37°C.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.9) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.10) Then a solution of tetramethylbenzidine (TMB) was added, which is a substrate for horseradish peroxidase and, as a result of the reaction, turns into a colored compound. The reaction was stopped after 15 minutes by adding sulfuric acid. Next, using a spectrophotometer measured the optical density of the solution (OD) in each well at a wavelength of 450 nm.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в табл. 2.The antibody titer was determined as the last dilution in which the optical density of the solution was significantly higher than in the negative control group. The results obtained (geometric mean) are presented in table. 2.

- 10 043101- 10 043101

Таблица 2. Титр антител к S белку SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)Table 2. Titer of antibodies to the S protein of SARS-CoV-2 in the blood serum of mice (geometric mean of the antibody titer)

No. Название группы животных Animal group name Титр антител Antibody titer 1 1 Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 2425 2425 2 2 Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, 2111 2111 3 3 Ad26-too-EFl-S-CoV2 Ad26-too-EFl-S-CoV2 2786 2786 4 4 Ad26-too Ad26-too 0 0 5 5 Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 38802 38802 6 6 Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, 29407 29407 7 7 Ad5-too-EFl-S-CoV2 Ad5-too-EFl-S-CoV2 33779 33779 8 8 Ad5-too Ad5-too 0 0 9 9 simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 14703 14703 10 10 simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, 16890 16890 И AND si m Ad2 5 -too-EF 1 - S -С о V2 si m Ad2 5 -too-EF 1 - S -C o V2 12800 12800 12 12 simAd25-too simAd25-too 0 0 13 13 плацебо (буфер) placebo (buffer) 0 0

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2.Thus, the results of the experiment show that all the developed agents induce a humoral immune response against SARS-CoV-2.

Пример 8. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинацииExample 8. Study of the immunogenicity of the developed agent by assessing the humoral immune response to the antigen of the SARS-CoV-2 virus in the blood of volunteers at various times after vaccination

Цель данного эксперимента заключалась в определении напряженности иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев в различные сроки после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.The purpose of this experiment was to determine the intensity of the immune response to the SARS-CoV-2 virus in volunteers at various times after their immunization with various variants of the developed agent.

В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.The study included healthy volunteers aged 18 to 60 years. All study participants were divided into several groups.

1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.1) An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and the ORF6-Ad26 region is changed to ORF6-Ad5, with an embedded expression cassette of SEQ ID NO: 1, 10 11 virus particles/dose, 9 people.

2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.2) An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form containing, as the only active component, an expression vector based on the genome of the recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, and ORF6-Ad26 region changed to ORF6-Ad5, with built-in expression cassette SEQ ID NO: 1, 10 11 virus particles/dose, 9 people.

Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14, 21, 28 и 42 дней, у пациентов отбирали образцы крови. Из полученных образцов выделяли сыворотку крови, которую в дальнейшем использовали для определения титра антител к S антигену вируса SARS-CoV-2.Volunteers were once intramuscularly immunized with the appropriate agent. Before immunization, as well as after 14, 21, 28 and 42 days, blood samples were taken from patients. From the obtained samples, blood serum was isolated, which was subsequently used to determine the titer of antibodies to the S antigen of the SARS-CoV-2 virus.

Титр антител определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа, разработанной в ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Минздрава России (РЗН 2020/10393 2020-05-18), которая позволяет определять титр IgG к RBD домену S антигена вируса SARS-CoV-2.The antibody titer was determined using a test system for enzyme immunoassay developed at the Federal State Budgetary Institution National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after N.N. N.F.Gamalei of the Ministry of Health of Russia (RZN 2020/10393 2020-05-18), which allows you to determine the IgG titer to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus antigen.

Планшеты с предварительно адсорбированным RBD (100 нг/лунку) промывали 5 раз промывочным буфером. Далее в лунки планшета вносили в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля. В остальные лунки планшета добавляли серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец). Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/мин. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37°С при перемешивании со скоростьюPlates with pre-adsorbed RBD (100 ng/well) were washed 5 times with wash buffer. Then, 100 µl of the positive control was added to the wells of the plate in 2 repetitions, as well as in 2 repetitions of 100 µl of the negative control. A series of two-fold dilutions of the studied samples was added to the remaining wells of the tablet (two repetitions for each sample). The plate was sealed with a film and incubated for 1 h at a temperature of +37°C with stirring at a speed of 300 rpm. Then the wells were washed 5 times with the working solution of the buffer for washing. Then, 100 µl of the working solution of the conjugate of monoclonal antibodies was added to each well, the plate was covered with a sticky film and incubated for 1 hour at a temperature of +37°C with stirring at a speed

- 11 043101- 11 043101

300 об/мин. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 мин в темном месте при температуре от +20°С. После этого останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результат учитывали в течение 10 мин после остановки реакции путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны 450 нм.300 rpm Then the wells were washed 5 times with the working solution of the buffer for washing. Then, 100 μl of chromogen-substrate solution was added to each well and incubated for 15 min in a dark place at a temperature of +20°C. After that, the reaction was stopped by adding µl of stop reagent (1M sulfuric acid solution) to each well. The result was taken into account within 10 min after stopping the reaction by measuring the optical density on a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.

Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором значение OD450 сыворотки иммунизированного участника превышает значение контрольной сыворотки (сыворотка участника до иммунизации) более чем в 2 раза.The IgG titer was defined as the maximum serum dilution at which the OD450 value of the immunized participant's serum exceeds the value of the control serum (participant's pre-immunization serum) by more than 2 times.

Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев после введения различных вариантов разработанного средства представлены на фиг. 1, 2.The results of the analysis of the antibody titer to the antigen of the SARS-CoV-2 virus in the blood serum of volunteers after the introduction of various variants of the developed agent are shown in Fig. 12.

Как видно из представленных данных, иммунизация добровольцев обоими вариантами разработанного средства позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы добровольцев) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. При этом рост напряженности гуморального иммунного ответа отмечается с увеличением дней после иммунизации.As can be seen from the presented data, the immunization of volunteers with both variants of the developed agent makes it possible to form a pronounced (statistically significantly different from the parameters of the control unimmunized group of volunteers) humoral immunity, characterized by an increase in the titer of antibodies to the S protein of the SARS-CoV-2 virus. At the same time, an increase in the intensity of the humoral immune response is noted with an increase in days after immunization.

Пример 9. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки клеточного иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинацииExample 9. Study of the immunogenicity of the developed agent by assessing the cellular immune response to the antigen of the SARS-CoV-2 virus in the blood of volunteers at various times after vaccination

Цель данного эксперимента заключалась определении напряженности клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.The purpose of this experiment was to determine the intensity of cellular immunity to the SARS-CoV-2 virus in volunteers after their immunization with various variants of the developed agent.

В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.The study included healthy volunteers aged 18 to 60 years. All study participants were divided into several groups.

1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.1) An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form containing, as the only active component, an expression vector based on the genome of the recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and ORF6-Ad26 region changed to ORF6-Ad5, with built-in expression cassette SEQ ID NO: 1, 10 11 virus particles/dose, 9 people.

2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO: 1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.2) An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form containing, as the only active component, an expression vector based on the genome of the recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, and ORF6-Ad26 region changed to ORF6-Ad5, with built-in expression cassette SEQ ID NO: 1, 10 11 virus particles/dose, 9 people.

Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14 и 28 дней у пациентов отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,077 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96 л планшета (2x105 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 ч после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.Volunteers were once intramuscularly immunized with the appropriate agent. Before immunization, as well as after 14 and 28 days, blood samples were taken from patients, from which mononuclear cells were isolated by centrifugation in a density gradient solution of ficoll (1.077 g/mL; PanEco). Next, the isolated cells were stained with fluorescent dye CFSE (Invivogen, USA) and seeded into wells of a 96 L plate (2x105 cells/well). Then, lymphocytes were re-stimulated under in vitro conditions by adding coronavirus S protein to the culture medium (final protein concentration 1 μg/ml). Intact cells, to which no antigen was added, were used as a negative control. 72 hours after the addition of the antigen, the % proliferating cells were measured, and the culture medium was taken to measure the amount of interferon gamma.

Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 АРС (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Су5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса. Полученные результаты представлены на фиг. 3, 4.To determine the percentage of proliferating cells, they were stained with antibodies against marker molecules of T lymphocytes CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, clone SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, clone SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5 .5 (BDBiosciences, clone SK1)). Proliferating (with less CFSE cell dye) CD4+ and CD8+ T lymphocytes were determined in the cell mixture using a BD FACS AriaIII flow cytometer (BDBiosciences, USA). The resulting percentage of proliferating cells in each sample was determined by subtracting the result obtained from the analysis of intact cells from the result obtained from the analysis of cells restimulated with coronavirus S antigen. The results obtained are presented in Fig. 3, 4.

Результаты проведенного исследования показали, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного иммунизацией добровольцев различными вариантами средства, согласно медиане значений пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, отмечается с увеличением дней после иммунизации. Во всех группах максимальные значения, пролиферирующих как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов наблюдаются на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днем исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях, пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов -р<0,001.The results of the study showed that an increase in the intensity of cellular immunity caused by immunization of volunteers with various variants of the agent, according to the median values of proliferating CD4+ and CD8+ T-lymphocytes, is observed with an increase in days after immunization. In all groups, the maximum values of proliferating both CD4+ and CD8+ T-lymphocytes are observed on the 28th day after immunization. Between 0 and 28 days of the study, there is a maximum statistically significant difference in the values of proliferating CD4+ and CD8+ T-lymphocytes - p<0.001.

Таким образом, исходя из приведенных данных, можно заключить, что иммунизация разработанным средством способна вызвать формирование напряженного антиген-специфического клеточного звена противоинфекционного иммунитета, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности в измеряемых параметрах до и после иммунизации.Thus, based on the above data, it can be concluded that immunization with the developed agent can cause the formation of a tense antigen-specific cellular link of anti-infective immunity, which is confirmed by a high degree of statistical significance in the measured parameters before and after immunization.

Пример 10. Оценка нежелательных явлений у добровольцев после однократной и двукратной иммунизации вариантами разработанного средстваExample 10. Evaluation of adverse events in volunteers after single and double immunization with variants of the developed agent

- 12 043101- 12 043101

Цель данного эксперимента заключалась определении побочных эффектов у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.The purpose of this experiment was to determine the side effects in volunteers after they were immunized with various variants of the developed agent.

В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.The study included healthy volunteers aged 18 to 60 years. All study participants were divided into several groups.

1) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.1) Single intramuscular injection of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 10 11 viral particles/dose, 9 people.

2) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.2) Single intramuscular injection of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 10 11 viral particles/dose, 9 people.

3) Двукратная схема иммунизации, при которой вначале вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, а через 21 день вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, 20 человек.3) Two-time immunization regimen in which the agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) is first administered in liquid form 10 11 viral particles / dose, and after 21 days the agent based on recombinant human adenovirus is administered 5 serotypes (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form 10 11 virus particles/dose, 20 people.

В табл. 3 включены данные об основных нежелательных явлениях, зарегистрированных с момента начала исследования и вплоть до визита (телефонного контакта) 180-го дня в рамках исследования.In table. 3 includes data on the main adverse events recorded from the start of the study and up to the visit (telephone contact) of the 180th day of the study.

Таблица 3. Основные нежелательные явления, наблюдаемые после однократного введения разработанного препарата по сравнению с двукратным введениемTable 3. The main adverse events observed after a single injection of the developed drug compared with a double injection

Кол-во субъектов (%) Кол-во событий Number of subjects (%) Number of events Группа 1 (Ad26-tooCMV-SCoV2) Group 1 (Ad26-tooCMV-SCoV2) Группа 2 (Ad5-tooCMV-SCoV2) Group 2 (Ad5-tooCMV-SCoV2) Группа 3 (Ad26-tooCMV-SCoV2+ Ad5-tooCMV-SCoV2) Group 3 (Ad26-tooCMV-SCoV2+ Ad5-tooCMV-SCoV2) Лабораторные и инструментальные данные Laboratory and instrumental data Повышение числа Т-лимфоцитов Increase in the number of T-lymphocytes 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 6 (66.67%) 6 6 (66.67%) 6 7 (35.00%) 7 7 (35.00%) 7 Снижение числа естественных клеток-киллеров Reducing the number of natural killer cells 5 (55.56%) 5 5 (55.56%) 5 4 (44.44%) 4 4 (44.44%) 4 7 (35.00%) 8 7 (35.00%) 8 Повышение числа В-лимфоцитов Increase in the number of B-lymphocytes 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 5 (55.56%) 5 5 (55.56%) 5 5 (25.00%) 5 5 (25.00%) 5 Повышение числа моноцитов Increase in the number of monocytes 5 (55.56%) 5 5 (55.56%) 5 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Увеличение количества CD4лимфоцитов Increase in the number of CD4 lymphocytes 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 6 (30.00%) 6 6 (30.00%) 6 Уменьшение процентного содержания лимфоцитов CD8 Reducing the percentage of CD8 lymphocytes 4 (44.44%) 4 4 (44.44%) 4 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 5 (25.00%) 5 5 (25.00%) 5 Повышение количества CD8лимфоцитов Increase in the number of CD8 lymphocytes 1 (И.11%) 1 1 (I.11%) 1 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 4 (20.00%) 4 4 (20.00%) 4 Повышение уровня иммуноглобулина Е (IgE) в крови Increased levels of immunoglobulin E (IgE) in the blood 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 3 (15.00%) 3 3 (15.00%) 3 Повышение скорости оседания эритроцитов Increased erythrocyte sedimentation rate 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 2 (10.00%) 2 2 (10.00%) 2 Повышение числа естественных клеток-киллеров Increasing the number of natural killer cells 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 4 (20.00%) 4 4 (20.00%) 4 Уменьшение соотношения CD4/CD8 Decreased CD4/CD8 ratio 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 4 (20.00%) 4 4 (20.00%) 4 Повышение числа лейкоцитов Increase in the number of leukocytes 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Повышение числа тромбоцитов Increase in the number of platelets 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1

- 13 043101- 13 043101

Снижение количества CD4лимфоцитов Decrease in the number of CD4 lymphocytes 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 2(10.00%) 2 2(10.00%) 2 Увеличение процентного содержания лимфоцитов Increase in the percentage of lymphocytes 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 7(35.00%) 7 7(35.00%) 7 Увеличение соотношения CD4/CD8 Increased CD4/CD8 ratio 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 2 (10.0%) 2 2 (10.0%) 2 Общие нарушения и реакции в месте введения General disorders and reactions at the injection site Боль в месте вакцинации Pain at the injection site 7 (77.78%) 7 7 (77.78%) 7 5 (55.56%) 5 5 (55.56%) 5 8 (40.00%) 10 8 (40.00%) 10 Г ипертермия Hyperthermia 8 (88.89%) 9 8 (88.89%) 9 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 19 (55.00%) 35 19 (55.00%) 35 Астения Asthenia 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 И (55.00%) 13 AND (55.00%) 13 Боль Pain 3 (33.33%) 4 3 (33.33%) 4 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 4 (20.00%) 7 4 (20.00%) 7 Снижение аппетита Decreased appetite 2 (22.22%) 2 2 (22.22%) 2 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Пирексия pyrexia 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Нарушения со стороны нервной системы Nervous System Disorders Головная боль Headache 6 (66.67%) 6 6 (66.67%) 6 3 (33.33%) 3 3 (33.33%) 3 И (55.00%) 15 AND (55.00%) 15 Нарушения со стороны дыхательной системы, органов грудной клетки и средосте ния Respiratory, thoracic and mediastinal disorders Боль в ротоглотке (орофарингеальная) Pain in the oropharynx (oropharyngeal) 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Ринорея Rhinorrhea 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 4 (20.00%) 4 4 (20.00%) 4 Першение в горле Sore throat 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 2(10.00%) 2 2(10.00%) 2 Заложенность носа Nasal congestion 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Чихание sneezing 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 1 (5.00%) 1 1 (5.00%) 1 Вирусная инфекция верхних дыхательных путей Viral infection of the upper respiratory tract 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 Желудочно-кишечные нарушения Gastrointestinal disorders Диарея Diarrhea 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 3 (15.00)3 3 (15.00)3 Нарушения со стороны иммунной системы Immune System Disorders Крапивница Hives 1 (11.11%) 1 1 (11.11%) 1 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0 0 (0.00%) 0

Как видно из представленных данных однократная схема иммунизации разработанным средством для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме вызывает существенно меньше побочных эффектов, по сравнению с двукратной схемой иммунизации.As can be seen from the presented data, a single immunization scheme with the developed agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form causes significantly fewer side effects compared to a two-fold immunization scheme.

Пример 11. Определение эффективности интраназальной иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответаExample 11. Determination of the effectiveness of intranasal immunization with the developed tool for evaluating the humoral immune response

Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при интраназальном введении.The purpose of this study is to test the effectiveness of the developed agent when administered intranasally.

В эксперименте использованы мыши линии С57/В16, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:The experiment used mice of the C57/B16 line, females 18-20 years old, 5 animals/group. The following groups of animals were formed:

1) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.1) Single intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

2) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.2) Single intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

3) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян3) Single intranasal administration of an agent based on recombinant simian adenovirus

- 14 043101 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.- 14 043101 serotypes (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 virus particles/dose.

4) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5x1011 вирусных частиц/дозу.4) Single intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x1011 viral particles/dose.

5) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5x1011 вирусных частиц/дозу.5) Single intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x1011 viral particles/dose.

6) Однократное интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5x1011 вирусных частиц/дозу.6) Single intranasal administration of a recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) agent in liquid form, 5x1011 viral particles/dose.

7) Однократное интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).7) Single intranasal administration of a buffer solution (negative control).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:Three weeks later, the animals were bled from the tail vein and the blood serum was isolated. The antibody titer was determined by enzyme immunoassay (ELISA) according to the following protocol:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 ч при температуре +4°С.1) The antigen was adsorbed on the wells of a 96-well ELISA plate for 16 hours at +4°C.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5% молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.2) Next, to get rid of non-specific binding, 5% milk in TPBS 100 μl/well was added to the wells of the tablet. Incubated on a shaker at 37°C for an hour.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.3) Serum samples from immunized mice were first diluted 100-fold and then a series of two-fold dilutions was made.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.4) Add 50 µl of each diluted serum sample to the wells of the plate.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.5) Further incubation was carried out for 1 hour at 37°C.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.6) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.7) Secondary antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase were then added.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.8) Further incubation was carried out for 1 hour at 37°C.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.9) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 мин добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.10) Then a solution of tetramethylbenzidine (TMB) was added, which is a substrate for horseradish peroxidase and, as a result of the reaction, turns into a colored compound. The reaction was stopped after 15 min by adding sulfuric acid. Next, using a spectrophotometer measured the optical density of the solution (OD) in each well at a wavelength of 450 nm.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в табл. 4.The antibody titer was determined as the last dilution in which the optical density of the solution was significantly higher than in the negative control group. The results obtained (geometric mean) are presented in table. 4.

Таблица 4. Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)Table 4. Titer of antibodies to protein S in the blood serum of mice (geometric mean of antibody titer)

Группа животных group of animals Титр антител Antibody titer Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозуAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose 919 919 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозуAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose 8445 8445 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозуsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose 6400 6400 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозуAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pv /dose 1838 1838 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозуAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pv /dose 19401 19401 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозуsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pv /dose 12800 12800 Буферный раствор buffer solution 0 0

Как видно из полученных результатов интраназальная иммунизация животных разработанным средством приводила к повышению титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARSCoV-2 в жидкой форме путем его интраназального введения.As can be seen from the results obtained, intranasal immunization of animals with the developed agent led to an increase in the titer of antibodies to the S protein of the SARS-CoV-2 virus. Thus, the results of this experiment confirm the possibility of using the developed agent for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARSCoV-2 in liquid form by intranasal administration.

Пример 12. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизацииExample 12. Evaluation of the immunogenicity of the developed agent during joint intramuscular and intranasal immunization

Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при совместном интраназальном введении и внутримышечном введении.The purpose of this study is to test the effectiveness of the developed agent for combined intranasal and intramuscular administration.

В эксперименте использованы мыши линии С57/В16, самки 18-20 г, 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:The experiment used mice of the C57/B16 line, females 18-20 g, 5 animals/group. The following groups of animals were formed:

1) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5x1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-1) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles / dose and simultaneously intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-

- 15 043101- 15 043101

CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 virus particles/dose.

2) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.2) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

3) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.3) Intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

4) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.4) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles / dose and at the same time intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too- CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 virus particles/dose.

5) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.5) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

6) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.6) Intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

7) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-tooCMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.7) Intranasal administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles / dose and simultaneously intramuscular administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-tooCMV- S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 virus particles/dose.

8) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.8) Intranasal administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

9) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1010 вирусных частиц/дозу.9) Intramuscular administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x10 10 viral particles/dose.

10) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-tooCMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х10п вирусных частиц/дозу.10) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x1011 viral particles / dose and simultaneously intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-tooCMV-S -CoV2) in liquid form, 5x10 viral particles/dose.

11) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.11) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x 10 11 viral particles/dose.

12) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.12) Intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 26 (Ad26-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x 10 11 viral particles/dose.

13) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMVS-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.13) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x1011 viral particles / dose and simultaneously intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMVS) -CoV2) in liquid form, 5x 10 11 virus particles/dose.

14) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.14) Intranasal administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x 10 11 viral particles/dose.

15) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.15) Intramuscular administration of an agent based on recombinant human adenovirus serotype 5 (Ad5-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x 10 11 viral particles/dose.

16) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-tooCMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х1011 вирусных частиц/дозу.16) Intranasal administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x1011 viral particles / dose and simultaneously intramuscular administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-tooCMV-S -CoV2) in liquid form, 5x1011 virus particles/dose.

17) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.17) Intranasal administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5 x 10 11 viral particles/dose.

18) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5х 1011 вирусных частиц/дозу.18) Intramuscular administration of an agent based on recombinant simian adenovirus serotype 25 (simAd25-too-CMV-S-CoV2) in liquid form, 5x 10 11 viral particles/dose.

19) Интраназальное введение буферного раствора и одновременно внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).19) Intranasal administration of a buffer solution and simultaneously intramuscular administration of a buffer solution (negative control).

20) Интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).20) Intranasal administration of a buffer solution (negative control).

21) Внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).21) Intramuscular administration of a buffer solution (negative control).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:Three weeks later, the animals were bled from the tail vein and the blood serum was isolated. The antibody titer was determined by enzyme immunoassay (ELISA) according to the following protocol:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 ч при температуре +4°С.1) The antigen was adsorbed on the wells of a 96-well ELISA plate for 16 hours at +4°C.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5% молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.2) Next, to get rid of non-specific binding, 5% milk in TPBS 100 μl/well was added to the wells of the tablet. Incubated on a shaker at 37°C for an hour.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.3) Serum samples from immunized mice were first diluted 100-fold and then a series of two-fold dilutions was made.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.4) Add 50 µl of each diluted serum sample to the wells of the plate.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.5) Further incubation was carried out for 1 hour at 37°C.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.6) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

- 16 043101- 16 043101

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.7) Secondary antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase were then added.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.8) Further incubation was carried out for 1 hour at 37°C.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.9) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 мин добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.10) Then a solution of tetramethylbenzidine (TMB) was added, which is a substrate of horseradish peroxidase and, as a result of the reaction, turns into a colored compound. The reaction was stopped after 15 min by adding sulfuric acid. Next, using a spectrophotometer measured the optical density of the solution (OD) in each well at a wavelength of 450 nm.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в табл. 5.The antibody titer was determined as the last dilution in which the optical density of the solution was significantly higher than in the negative control group. The results obtained (geometric mean) are presented in table. 5.

Таблица 5. Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)Table 5. Titer of antibodies to protein S in the blood serum of mice (geometric mean of antibody titer)

Группа животных group of animals Титр антител Antibody titer 1 1 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу и/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/n, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/m 3200 3200 2 2 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу и/нAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose i/n 1056 1056 3 3 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1О10 вч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 vh/dose IM 2111 2111 4 4 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу и/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/n, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/m, 38802 38802 5 5 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу и/нAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose i/n 8445 8445 6 6 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose IM 33779 33779 7 7 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/n, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/m 22286 22286 8 8 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу и/нsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 h/dose i/n 6400 6400 9 9 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 vh/dose IM 16890 16890 10 10 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу и/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/n, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/m 44572 44572 И AND Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу и/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/n, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/m 44572 44572 12 12 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1О10 вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/n, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/m 51200 51200 13 13 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу и/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5* 1010 вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/n, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/m 51200 51200

- 17 043101- 17 043101

14 14 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1О10 вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/n, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 10 hs/dose i/m 19401 19401 15 15 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*Ю10вч/дозу и/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5* 1010 вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/n, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 10 hs/dose i/m 22286 22286 16 16 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 n hs/dose i/n, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p hs/dose i/m 3676 3676 17 17 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p hv/dose i/n, 1213 1213 18 18 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 vh /dose i/m 2425 2425 19 19 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p iv/dose i/n, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p iv/dose i/m 44572 44572 20 20 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/нAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p iv/dose i/n 9701 9701 21 21 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 vh /dose i/m 33779 33779 22 22 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pv /dose i/n, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pvv /dose i/m 25600 25600 23 23 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/нsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p.p./dose i/n 7352 7352 24 24 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p hs/dose i/m 19401 19401 25 25 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу и/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 n iv/dose i/n, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 n iv/dose i/m 51200 51200 26 26 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу и/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 n hs/dose i/n, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 p hs/dose i/m 51200 51200 27 27 Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу в/мAd5-too-CMV-S-CoV2, 5*10 n sv/dose i/n, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 n sv/dose i/m 51200 51200 28 28 simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу и/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5* 1011 вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 sv /dose i/n, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 11 iv/dose i/m 58813 58813 29 29 Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10п вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу в/мAd26-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pv /dose i/n, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 pv /dose i/m 22286 22286 30 thirty simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10пвч/дозу и/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5* 1011 вч/дозу в/мsimAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10 sv /dose i/n, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5* 10 11 iv/dose i/m 25600 25600 31 31 Буферный раствор и/н Буферный раствор в/м Buffer solution i/n Buffer solution i/m 0 0 32 32 Буферный раствор и/н Buffer solution i/n 0 0 33 33 Буферный раствор в/м Buffer solution i/m 0 0

Как видно из полученных результатов, совместная интраназальная и внутримышечная иммунизация животных разработанным средством приводила к более мощному гуморальному иммунному ответу, по сравнению с иммунизацией только одним способом. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназального введения.As can be seen from the results obtained, joint intranasal and intramuscular immunization of animals with the developed agent led to a more powerful humoral immune response, compared with immunization by only one method. Thus, the results of this experiment confirm the possibility of using the developed agent to induce specific immunity to the SARS-CoV-2 virus by joint and simultaneous intramuscular and intranasal administration.

- 18 043101- 18 043101

Промышленная применимостьIndustrial Applicability

Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.All of the above examples confirm the effectiveness of pharmaceutical agents that provide effective induction of an immune response against the SARS-CoV-2 virus and industrial applicability.

Claims (8)

1. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.1. An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain of human adenovirus serotype 26, in which the E1 and E3 regions are deleted, and the ORF6-Ad26 region is replaced with ORF6-Ad5, with an inserted expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. 2. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.2. An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of a recombinant human adenovirus strain of the 5th serotype, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an embedded expression cassette selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. 3. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.3. An agent for the induction of specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 in liquid form, containing as the only active component an expression vector based on the genome of the recombinant strain of simian adenovirus serotype 25, in which the E1 and E3 regions are deleted, with an embedded expression cassette selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. 4. Средство по пп.1-3 отличающееся тем, что дополнительно содержит буферный раствор, содержащий, мас.%: трис 0,1831-0,3432, хлорид натрия 0,3313-0,6212, сахароза 3,7821-7,0915, магния хлорида гексагидрат 0,0154-0,0289, ЭДТА 0,0029-0,0054, полисорбат-80 0,0378-0,0709, этанол 95% 0,0004-0,0007, вода - остальное.4. The agent according to claims 1-3, characterized in that it additionally contains a buffer solution containing, wt.%: tris 0.1831-0.3432, sodium chloride 0.3313-0.6212, sucrose 3.7821-7, 0915, magnesium chloride hexahydrate 0.0154-0.0289, EDTA 0.0029-0.0054, polysorbate-80 0.0378-0.0709, ethanol 95% 0.0004-0.0007, water - the rest. 5. Применение средства по пп.1-3 для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, где указанное средство предназначено для интраназального или внутримышечного введения или совместного интраназального и внутримышечного введения.5. The use of an agent according to claims 1 to 3 for inducing an immune response against the SARS-CoV-2 virus, where said agent is intended for intranasal or intramuscular administration or combined intranasal and intramuscular administration. 6. Применение по п.5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для интраназального введения в дозе 5х1010-5х1011 вирусных частиц.6. Use according to claim 5, characterized in that said agent is intended for intranasal administration at a dose of 5x10 10 -5x10 11 viral particles. 7. Применение по п.5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для внутримышечного введения в дозе 5х1010-5х1011 вирусных частиц.7. Use according to claim 5, characterized in that said agent is intended for intramuscular administration at a dose of 5x10 10 -5x10 11 viral particles. 8. Применение по п.5, отличающееся тем, что при совместном введении интраназально и внутримышечно, указанное средство внутримышечно вводят в дозе 5х1010-5х1011 вирусных частиц, а интраназально в дозе 5х1010-5х1011 вирусных частиц.8. The use according to claim 5, characterized in that when administered intranasally and intramuscularly, the indicated agent is administered intramuscularly at a dose of 5x10 10 -5x10 11 viral particles, and intranasally at a dose of 5x10 10 -5x10 11 viral particles.
EA202290467 2021-02-09 2021-02-09 MEANS FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN LIQUID FORM (VERSIONS) EA043101B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021103099 2021-02-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043101B1 true EA043101B1 (en) 2023-04-25

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2743963C1 (en) Agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in liquid form (versions)
US20230075979A1 (en) Coronavirus vaccine
WO2021076010A1 (en) Pharmaceutical agent for inducing specific immunity against sars-cov-2
EA026620B1 (en) Vaccine against rsv
CN115058452A (en) CMV vaccines
US20220249655A1 (en) Agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in lyophilized form (variants)
EA043101B1 (en) MEANS FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN LIQUID FORM (VERSIONS)
EA042634B1 (en) MEANS FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-CoV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN LYOPHILIZED FORM (VERSIONS)
RU2779634C1 (en) Immunobiological agent and method for its use for induction of specific immunity against viruses sars-cov-2 variant b.1.617.2 (delta) and sars-cov-2 variant b.1.1.529 (omicron) (variants)
RU2811791C1 (en) Expression vector based on human adenovirus 19 serotype and method of its application
JP7360544B2 (en) Pharmaceutical products for inducing specific immunity against SARS-COV-2
RU2761904C1 (en) Drug application for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in children
US20220265816A1 (en) Use of the agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 for revaccination of population (variants)
EA043182B1 (en) APPLICATION OF A DRUG FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN CHILDREN
KR102243295B1 (en) Recombinant vaccine composition comprising envelope protein of Zika virus
EA043163B1 (en) APPLICATION OF MEANS FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS FOR POPULATION REVACCINATION (VERSIONS)
CA3156264A1 (en) Utilization of an agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in children
EA042672B1 (en) APPLICATION OF A DRUG FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNE AGAINST THE SARS-CoV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN PERSONS OVER 60 AND/OR HAVING CHRONIC DISEASES (OPTIONS)
WO2023128799A1 (en) Immunobiological agent for inducing an immune response to sars-cov-2 and method for using same (variants)
JP2023507543A (en) Use of Agents (Variations) to Induce Specific Immunity Against Severe Acute Respiratory Syndrome Virus SARS-CoV-2 in Subjects Over 60 Years of Age and/or with Chronic Diseases
WO2022177466A1 (en) The use of the agent for inducing immunity to sars-cov-2
PL244794B1 (en) Amino acid sequence of recombinant tick-borne encephalitis virus-like particles and their use as a vaccine antigen for prevention of tick-borne encephalitis virus infections