EA042971B1 - ANTIBODIES THAT SPECIFICLY BIND TO TL1A - Google Patents
ANTIBODIES THAT SPECIFICLY BIND TO TL1A Download PDFInfo
- Publication number
- EA042971B1 EA042971B1 EA201890756 EA042971B1 EA 042971 B1 EA042971 B1 EA 042971B1 EA 201890756 EA201890756 EA 201890756 EA 042971 B1 EA042971 B1 EA 042971B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- acid sequence
- amino acid
- chain variable
- variable region
- Prior art date
Links
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross-reference to related applications
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 62/220442, поданной сентября 2015 г., содержание которой включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме и для всех целей.This application claims priority over U.S. Provisional Application No. 62/220442, filed September 2015, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety and for all purposes.
Перечень последовательностейSequence listing
Данная заявка включает перечень последовательностей, представленный в электронном виде в виде текстового файла с именем TL1A_ST25, созданного 18 сентября 2015 г. и размером 89000 байт. Перечень последовательностей включен в данный документ посредством ссылки.This application includes a sequence listing submitted electronically as a text file named TL1A_ST25 created on September 18, 2015 and 89,000 bytes in size. The sequence listing is incorporated herein by reference.
Область техникиTechnical field
Данное раскрытие относится в целом к области конструирования антител. Более конкретно, данное раскрытие относится к вариантам антител, которые специфически связываются с TL1A и которые ингибируют взаимодействие между TL1A и рецептором смерти 3 (DR3). В некоторых аспектах антитела также ингибируют взаимодействие между TL1A и рецептором-приманкой 3 (DcR3). Антитела обладают улучшенной активностью по сравнению с исходным антителом, из которого были получены варианты.This disclosure relates generally to the field of antibody engineering. More specifically, this disclosure relates to antibody variants that specifically bind to TL1A and that inhibit the interaction between TL1A and death receptor 3 (DR3). In some aspects, the antibodies also inhibit the interaction between TL1A and decoy receptor 3 (DcR3). The antibodies have improved activity compared to the parent antibody from which the variants were derived.
Уровень техникиState of the art
Различные публикации, включая патенты, опубликованные заявки, номера доступа, технические статьи и научные статьи приводятся в описании. Каждая из этих цитируемых публикаций включена в качестве ссылки в полном объеме и для всех целей в этом документе.Various publications, including patents, published applications, access numbers, technical articles and scientific articles are cited in the description. Each of these cited publications is incorporated by reference in its entirety and for all purposes in this document.
ФНО-подобный лиганд 1А (TL1A, син. 15 член суперсемейства ФНО (TNFSF15); TL1 и VEGI) является членом надсемейства фактора некроза опухолей, который экспрессируется антигенпрезентирующими клетками (включая дендритные клетки, В-клетки и макрофаги), CD4+ и CD8+ Т-клетками и эндотелиальными клетками. TL1A может быть экспрессирован на поверхности клетки или секретирован как растворимый цитокин. Рецептор для TL1A, рецептор смерти 3 (DR3) экспрессируется различными клетками, включая CD4+ и CD8+ Т-клетки, NK-клетки, NKT-клетки и FOXP3+ регуляторные Т-клетки (Treg) и врожденные лимфоидные клетки 2 типа и 3 типа (ILC2 и ILC3).TNF-like ligand 1A (TL1A, syn. 15 member of the TNF superfamily (TNFSF15); TL1 and VEGI) is a member of the tumor necrosis factor superfamily that is expressed by antigen presenting cells (including dendritic cells, B cells, and macrophages), CD4+ and CD8+ T- cells and endothelial cells. TL1A can be expressed on the cell surface or secreted as a soluble cytokine. The receptor for TL1A, death receptor 3 (DR3), is expressed by a variety of cells, including CD4+ and CD8+ T cells, NK cells, NKT cells, and FOXP3+ regulatory T cells (Treg) and type 2 and type 3 innate lymphoid cells (ILC2 and ILC3).
TL1A также может связывать рецептор-приманку (DcR3), который является конкурентным ингибитором DR3. DcR3 также действует как рецептор-приманка для Fas-лиганда (Fas-L) и лимфотоксинподобного индуцибельного белка, который конкурирует с гликопротеином D за связывание медиатора проникновения вируса герпеса на Т-клетках (LIGHT - лимфотоксинподобный индуцибельный белок). Соответственно DcR3 является важным регулятором нескольких путей сигналинга.TL1A can also bind a decoy receptor (DcR3), which is a competitive inhibitor of DR3. DcR3 also acts as a decoy receptor for Fas ligand (Fas-L) and a lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for binding of the herpes virus entry mediator on T cells (LIGHT - lymphotoxin-like inducible protein). Accordingly, DcR3 is an important regulator of several signaling pathways.
Путь сигналинга TL1A/DR3 был вовлечен в несколько биологических систем, которые связаны с заболеваниями человека. Например, было показано, что TL1A играет роль в иммунитете, ангиогенезе и гомеостазе барьерных тканей. Было показано, что ингибирование взаимодействия TL1A с DR3 способствует терапевтическому эффекту в нескольких иммуноопосредованных патологических состояниях, таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ, модель рассеянного склероза), колит, язвенный колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, заболевание кожи, астма и артрит.The TL1A/DR3 signaling pathway has been implicated in several biological systems that are associated with human disease. For example, TL1A has been shown to play a role in immunity, angiogenesis, and barrier tissue homeostasis. Inhibition of the interaction of TL1A with DR3 has been shown to contribute to a therapeutic effect in several immune-mediated pathological conditions, such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, a multiple sclerosis model), colitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, skin disease, asthma, and arthritis.
Соответственно соединения, которые ингибируют активность TL1A, пригодны, например, для их терапевтического, профилактического, диагностического и прогностического применения.Accordingly, compounds which inhibit TL1A activity are suitable, for example, for their therapeutic, prophylactic, diagnostic and prognostic uses.
Краткое описание сущности изобретенияBrief description of the essence of the invention
В данном описании предложено рекомбинантное антитело, содержащее CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, при условии, что если вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.Provided herein is a recombinant antibody comprising a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, with provided that if the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the light chain variable region does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащуюIn some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 21, and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a light chain variable region CDR1 comprising amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a light chain variable region CDR3 containing
- 1 042971 аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах антитело содержит CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27.- 1 042971 amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and a variable region CDR3 light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and a variable region CDR3 light chain region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. B In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21 and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27.
Также в данном описании предложено рекомбинантное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, при условии, что, если вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых аспектах антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.Also provided herein is a recombinant antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, provided that if the variable the heavy chain region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the light chain variable region does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some aspects, the antibody contains a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region , containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some aspects, the antibody contains a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some aspects, the antibody contains a variable region a heavy chain region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. In some aspects, an antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the variable region light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some aspects, aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 , and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
В некоторых аспектах антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60. В некоторых аспектах антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61. В некоторых аспектах антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и легкую цепь, содержащую аминоIn some aspects, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60. In some aspects, the antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61. In some aspects, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 , and a light chain containing amino
- 2 042971 кислотную последовательность SEQ ID NO: 61.- 2 042971 acid sequence SEQ ID NO: 61.
Такие рекомбинантные антитела предпочтительно являются полноразмерными и предпочтительно являются моноклональными. Такие рекомбинантные антитела связываются с TL1A с повышенной аффинностью относительно антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Такие рекомбинантные антитела обладают повышенной активностью по сравнению с антителом, имеющим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 10 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 12 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 13 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 15 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 20 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 25 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 27 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 40 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Кратность повышения активности можно определять в соответствии с анализом TL1A-индуцированной каспазной активности в клетках TF-1.Such recombinant antibodies are preferably full length and are preferably monoclonal. Such recombinant antibodies bind to TL1A with increased affinity for an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Such recombinant antibodies have increased activity compared to with an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 10-fold higher than that of an antibody having a variable a heavy chain region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 12-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Increased activity can be at least about 13-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 1, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Increased activity can be at least about 15-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and variable light chain region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 20-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 25-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 2. Increased activity can be at least about 27-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Increased activity may be at least about 40-fold higher than the activity of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The fold increase in activity can be determined according to with analysis of TL1A-induced caspase activity in TF-1 cells.
Такие рекомбинантные антитела могут содержать константную область тяжелой цепи IgG1 человека, константную область тяжелой цепи IgG2 человека или константную область тяжелой цепи IgG4 человека или любые их аллотипы. Константная область тяжелой цепи IgG1 человека может содержать SEQ ID NO: 42, или SEQ ID NO: 43 (AK IgG1 человека), или SEQ ID NO: 44 (IgG1 человека с YTE), или SEQ ID NO: 64 (IgG1 человека с YTE и AK), или SEQ ID NO: 63 (IgG1 человека с L234A, L235A, G237A), или SEQ ID NO: 62 (IgG1 человека с L234A, L235A, G237A и AK), или SEQ ID NO: 65 (IgG1 человека с L235A и G237A), или SEQ ID NO: 66 (IgG1 человека с L235A, G237A и AK). Константная область тяжелой цепи IgG2 человека может содержать SEQ ID NO: 67, или SEQ ID NO: 70 (AK IgG2 человека), или SEQ ID NO: 71 (IgG2 человека с A330S, P331S), или SEQ ID NO: 68 (IgG2 человека с A330S, P331S и ΔΚ). Константная область IgG4 тяжелой цепи IgG4 человека может содержать SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 46 (IgG4 человека с S228P и ΔΚ), или SEQ ID NO: 47 (IgG4 человека с S228P и YTE), или SEQ ID NO: 69 (IgG4 человека с S228P, YTE и ΔΚ). Понятно, что тяжелую цепь IgG4 можно использовать без стабилизирующей замены S228P (например, IgG4 только с YTE или IgG4 с YTE и ΔΚ или IgG4 только с ΔΚ).Such recombinant antibodies may comprise a human IgG1 heavy chain constant region, a human IgG2 heavy chain constant region, or a human IgG4 heavy chain constant region, or any allotypes thereof. The human IgG1 heavy chain constant region may comprise SEQ ID NO: 42, or SEQ ID NO: 43 (human AK IgG1), or SEQ ID NO: 44 (human IgG1 with YTE), or SEQ ID NO: 64 (human IgG1 with YTE and AK), or SEQ ID NO: 63 (human IgG1 with L234A, L235A, G237A), or SEQ ID NO: 62 (human IgG1 with L234A, L235A, G237A and AK), or SEQ ID NO: 65 (human IgG1 with L235A and G237A), or SEQ ID NO: 66 (human IgG1 with L235A, G237A and AK). The human IgG2 heavy chain constant region may comprise SEQ ID NO: 67, or SEQ ID NO: 70 (human IgG2 AK), or SEQ ID NO: 71 (human IgG2 with A330S, P331S), or SEQ ID NO: 68 (human IgG2 with A330S, P331S and ΔΚ). The heavy chain IgG4 constant region of human IgG4 may comprise SEQ ID NO: 45 or SEQ ID NO: 46 (human IgG4 with S228P and ΔΚ) or SEQ ID NO: 47 (human IgG4 with S228P and YTE) or SEQ ID NO: 69 (Human IgG4 with S228P, YTE and ΔΚ). It is understood that an IgG4 heavy chain can be used without a stabilizing S228P substitution (eg, IgG4 with YTE only, or IgG4 with YTE and ΔΚ, or IgG4 with ΔΚ only).
Рекомбинантные антитела могут содержать константную область легкой цепи лямбда человека или ее аллотип. Константная область легкой цепи лямбда человека может содержать SEQ ID NO: 48.Recombinant antibodies may contain a human lambda light chain constant region or an allotype thereof. The human lambda light chain constant region may comprise SEQ ID NO: 48.
Такие рекомбинантные антитела связываются с TL1A человека и могут связываться с TL1A приматов, отличных от человека, или TL1A млекопитающего, отличного от человека, такого как мышь, крыса, морская свинка, кошка, собака, кролик или свинья.Such recombinant antibodies bind to human TL1A and can bind to TL1A of a non-human primate or TL1A of a non-human mammal such as a mouse, rat, guinea pig, cat, dog, rabbit or pig.
Такие рекомбинантные антитела могут быть использованы в способе лечения заболевания дыхательных путей, способе лечения заболевания желудочно-кишечного тракта, способе лечения заболевания кожи или способе лечения артрита, или могут быть использованы для лечения заболевания дыхательных путей, заболевания желудочно-кишечного тракта, заболевания кожи или артрита, или могут быть использованы для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания дыхательных путей, заболевания желудочно-кишечного тракта, заболевания кожи или артрита. Заболевание дыхательных путей может включать одно или более из астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), леSuch recombinant antibodies can be used in a method of treating a respiratory disease, a method of treating a gastrointestinal disease, a method of treating a skin disease, or a method of treating arthritis, or can be used to treat a respiratory disease, a gastrointestinal disease, a skin disease, or arthritis. , or may be used to make a medicament for the treatment of a respiratory disease, a gastrointestinal disease, a skin disease, or arthritis. Respiratory disease may include one or more of asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD),
- 3 042971 гочного фиброза, саркоидоза легких, аллергического ринита или кистозного фиброза. Заболевание желудочно-кишечного тракта может включать одно или более из воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, колита, язвенного колита, эозинофильного эзофагита или синдрома раздраженного кишечника, или заболевания, или патологического состояния желудочно-кишечного тракта, связанного с кистозным фиброзом. Артрит может включать ревматоидный артрит. Заболевание кожи может включать одно или более из атопического дерматита, экземы и склеродермии.- 3 042971 pulmonary fibrosis, pulmonary sarcoidosis, allergic rhinitis or cystic fibrosis. The gastrointestinal disease may include one or more of inflammatory bowel disease, Crohn's disease, colitis, ulcerative colitis, eosinophilic esophagitis, or irritable bowel syndrome, or a disease or condition of the gastrointestinal tract associated with cystic fibrosis. Arthritis may include rheumatoid arthritis. The skin disease may include one or more of atopic dermatitis, eczema, and scleroderma.
Людей, приматов, отличных от человека, или млекопитающих, отличных от человека, нуждающихся в таких методах лечения, можно лечить с помощью антител или композиции, содержащей антитела, например, путем введения антител или их композиции субъекту. Введение может быть парентеральным, например подкожным и/или внутривенным.Humans, non-human primates, or non-human mammals in need of such therapies can be treated with antibodies or compositions containing antibodies, for example, by administering the antibodies or composition to a subject. Administration may be parenteral, eg subcutaneous and/or intravenous.
Такие рекомбинантные антитела могут быть использованы в способе выявления TL1A на поверхности мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Способы включают приведение в контакт антитела, которое связывается с TL1A, как описано или приведено в данном документе в качестве примера, с МКПК, полученными от субъекта, и выявлением антитела, связанного с TL1A, на поверхности МКПК. Способы могут дополнительно включать количественное определение уровня TL1A на МКПК. Способы могут дополнительно включать получение МКПК от субъекта.Such recombinant antibodies can be used in a method for detecting TL1A on the surface of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The methods include contacting an antibody that binds to TL1A, as described or exemplified herein, with PBMCs obtained from a subject and detecting the TL1A-bound antibody on the surface of the PBMC. The methods may further include quantifying the level of TL1A in PBMCs. The methods may further include obtaining a PBMC from a subject.
Такие рекомбинантные антитела могут быть использованы в способе выявления TL1A в сыворотке крови. Способы включают приведение в контакт антитела, которое связывается с TL1A, как описано или приведено в данном документе в качестве примера, с сывороткой крови, полученной от субъекта, и выявлением антитела, связанного с TL1A, в сыворотке. Способы могут дополнительно включать количественное определение уровня TL1A в сыворотке крови. Способы могут дополнительно включать получение сыворотки из крови, полученной от субъекта. Способы могут дополнительно включать получение крови от субъекта.Such recombinant antibodies can be used in a method for detecting TL1A in serum. The methods include contacting an antibody that binds to TL1A, as described or exemplified herein, with sera obtained from a subject and detecting an antibody bound to TL1A in the serum. The methods may further include quantifying the level of TL1A in serum. The methods may further include obtaining serum from blood obtained from the subject. The methods may further include obtaining blood from a subject.
Предложены полинуклеотиды, кодирующие одну или более вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи таких антител. Полинуклеотиды могут дополнительно кодировать константную область тяжелой цепи и/или константную область легкой цепи.Provided are polynucleotides encoding one or more heavy chain variable regions and light chain variable regions of such antibodies. The polynucleotides may further encode a heavy chain constant region and/or a light chain constant region.
В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 58. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 50. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 52 или SEQ ID NO: 59. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 54. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 55. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 56. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 57.In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, such as a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 51 or SEQ ID NO: 58. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence an acid encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 50. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, such as a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 59. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, such as the sequence a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 54. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, such as a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 55. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, e.g., a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 56. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region, containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, for example, a nucleic acid sequence containing SEQ ID NO: 57.
В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 49. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 52. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 53. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 54. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательностьIn some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, such as a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 49. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding a light variable region. an antibody chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, e.g., a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 52. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, e.g. a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 53. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, such as a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 54. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence
- 4 042971- 4 042971
SEQ ID NO: 7, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 55. В некоторых аспектах полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 7, e.g., a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 55. In some aspects, the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence
SEQ ID NO: 8, например последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 56.SEQ ID NO: 8, e.g. a nucleic acid sequence containing SEQ ID NO: 56.
Предложены векторы, содержащие один или более таких полинуклеотидов. Предложены клетки, трансформированные одним или более такими полинуклеотидами или такими векторами. Трансформированные клетки могут принадлежать млекопитающим и предпочтительно являются клетками-хозяевами экспрессии млекопитающих, такими как клетки СНО, клетки NSO или клетки HEK293.Vectors containing one or more of these polynucleotides are provided. Cells transformed with one or more such polynucleotides or such vectors are provided. The transformed cells may be mammalian and are preferably mammalian expression host cells such as CHO cells, NSO cells, or HEK293 cells.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
На фиг. 1 показаны положения и идентичности каждой из одиночных аминокислотных замен, сделанных в областях CDR1 или CDR2, или к выбранным аминокислотным остаткам, смежным с CDR2 вариабельной области тяжелой цепи исходного антитела (320-179). Заключенные в рамки области представляют собой CDR в соответствии с системой нумерации AbM.In FIG. 1 shows the positions and identities of each of the single amino acid substitutions made in the CDR1 or CDR2 regions, or to selected amino acid residues adjacent to the parent antibody heavy chain variable region CDR2 (320-179). The boxed regions are CDRs according to the AbM numbering system.
На фиг. 2 показаны положения и идентичности каждой из отдельных аминокислотных замен, сделанных в областях CDR1 или CDR3 вариабельной области легкой цепи исходного антитела (320-179). Заключенные в рамки области представляют собой CDR в соответствии с системой нумерации AbM.In FIG. 2 shows the positions and identities of each of the individual amino acid substitutions made in the CDR1 or CDR3 regions of the light chain variable region of the parent antibody (320-179). The boxed regions are CDRs according to the AbM numbering system.
На фиг. 3 показано выравнивание тяжелых цепей вариантов антитела против TL1A.In FIG. 3 shows the heavy chain alignment of anti-TL1A antibody variants.
На фиг. 4 показано выравнивание легких цепей вариантов анти-TL1A-связывающего антитела.In FIG. 4 shows the light chain alignment of anti-TL1A binding antibody variants.
На фиг. 5 показано сравнение фазы диссоциации TL1A вариантов антител против TL1A, измеренных с помощью SPR (поверхностный плазмонный резонанс).In FIG. 5 shows a comparison of the dissociation phase of TL1A anti-TL1A antibody variants measured by SPR (surface plasmon resonance).
На фиг. 6 показаны результаты анализа активности каспазы клеток TF-1 с вариантами антител против TL1A.In FIG. 6 shows the results of the analysis of caspase activity of TF-1 cells with anti-TL1A antibody variants.
На фиг. 7 показаны результаты анализов активности каспазы клеток TF-1 с использованием различных антител против TL1A по сравнению с исходным антителом 320-179.In FIG. 7 shows the results of assays of caspase activity of TF-1 cells using various anti-TL1A antibodies compared to the parent antibody 320-179.
На фиг. 8 показано, что антитело 320-587 обладает превосходной активностью TL1A в анализе активности каспазы TF-1 по сравнению с другими известными антителами против TL1A в нескольких разных экспериментах.In FIG. 8 shows that antibody 320-587 has superior TL1A activity in the TF-1 caspase activity assay compared to other known anti-TL1A antibodies in several different experiments.
На фиг. 9 показаны различные антитела против TL1A, которые ингибируют связывание TL1A с DR3 по сравнению с изотипическим контролем, как измерено в формате ИФА.In FIG. 9 shows various anti-TL1A antibodies that inhibit TL1A binding to DR3 compared to an isotype control as measured by ELISA format.
На фиг. 10 показано, что исходное антитело 320-179 не ингибирует связывание TL1A с DcR3, тогда как варианты антител против TL1A ингибируют взаимодействие TL1A-DcR3.In FIG. 10 shows that the parent antibody 320-179 does not inhibit TL1A binding to DcR3, while anti-TL1A antibody variants inhibit TL1A-DcR3 interaction.
На фиг. 11 показано, что антитело 320-587 перекрестно реагирует и связывается с TL1A разных видов; указанное антитело связывается с TL1A всех испытуемых видов.In FIG. 11 shows that antibody 320-587 cross-reacts and binds to different species of TL1A; said antibody binds to TL1A of all species tested.
На фиг. 12A-12D показаны результаты введения антитела 320-587 в TNBS-индуцированной модели колита (TNBS - тринитробензолсульфоновая кислота) крыс, демонстрирующей, что антитело значительно облегчает симптомы колита.In FIG. 12A-12D show the results of administration of antibody 320-587 in a TNBS-induced colitis (TNBS-trinitrobenzenesulfonic acid) rat model, demonstrating that the antibody significantly alleviates the symptoms of colitis.
На фиг. 13 показано, что антитело 320-587 выявляет TL1A человека, выделяющееся из человеческих МКПК, стимулированных иммунными комплексами, в ИФА.In FIG. 13 shows that antibody 320-587 detects human TL1A isolated from immune complex stimulated human PBMCs in ELISA.
На фиг. 14 показано, что антитело 320-587 выявляет популяцию человеческих МКПК, которые экспрессируют мембранные TL1A на их поверхности, в анализе методом проточной цитометрии.In FIG. 14 shows that antibody 320-587 detects a population of human PBMCs that express membrane TL1A on their surface in flow cytometric analysis.
На фиг. 15 показано, что у крыс, имеющих острую OVA-индуцированную астму (OVA-овальбумин), получавших лечение антителом 320-587, значительно снижался уровень эозинофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ).In FIG. 15 shows that in rats with acute OVA-induced asthma (OVA-ovalbumin) treated with antibody 320-587, the level of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was significantly reduced.
На фиг. 16A-16D показано, что у морских свинок с острой OVA-индуцированной астмой, которую лечили при помощи антитела 320-587, имелись улучшения по эозинофилам в ЖБАЛ (фиг. 16А), макрофагам в ЖБАЛ (фиг. 16В), гиперреактивности верхних дыхательных путей после ранней астматической реакции (фиг. 16С), и выраженности ранней астматической реакции (фиг. 16D).In FIG. 16A-16D show that guinea pigs with acute OVA-induced asthma treated with the 320-587 antibody had improvements in eosinophils in the BAL (Fig. 16A), macrophages in the BAL (Fig. 16B), and upper airway hyperresponsiveness. after the early asthmatic reaction (FIG. 16C), and the severity of the early asthmatic response (FIG. 16D).
На фиг. 17А-17Е показано, что у крыс с хронической OVA-индуцированной астмой, которую лечили при помощи антитела 320-587, имелись улучшения по эозинофилам в ЖБАЛ (фиг. 17А), макрофагам в ЖБАЛ (фиг. 17В), ИЛ-13 в ЖБАЛ (фиг. 17С), гиперплазии бокаловидных клеток, оцениваемой при помощи ШИК-реакции (фиг. 17D), и утолщению слизистой оболочки, оцениваемому на срезах, окрашенных Н&Е (гематоксилин и эозин) (фиг. 17Е).In FIG. 17A-17E show that rats with chronic OVA-induced asthma treated with antibody 320-587 had improvements in eosinophils in BAL (Fig. 17A), macrophages in BAL (Fig. 17B), IL-13 in BAL (FIG. 17C), goblet cell hyperplasia as assessed by PAS (FIG. 17D), and mucosal thickening as assessed on sections stained with H&E (hematoxylin and eosin) (FIG. 17E).
На фиг. 18 показана доза овальбумина, необходимая для удвоения обструкции дыхательных путей.In FIG. 18 shows the dose of ovalbumin required to double the airway obstruction.
На фиг. 19 показано, что у крыс с TNBS-индуцированным колитом, который лечили при помощи антитела 320-587, имелось положительное влияние на фиброз в области изъязвлений.In FIG. 19 shows that rats with TNBS-induced colitis treated with antibody 320-587 had a positive effect on fibrosis in the area of ulceration.
На фиг. 20А-20Е показано сравнение крыс с TNBS-индуцированным колитом с DNBS-индуцированным колитом (DNBS - динитробензолсульфоновая кислота), которых лечили при помощи антитела 320-587, и проявления эффекта на 7 и 14 сутки на отношение масса/длина толстой кишки (фиг. 20А), фиброз толстой кишки (фиг. 20В), инфильтрат толстой кишки (фиг. 20С) и повреждение толстой кишки (фиг. 20D). На фиг. 20Е показаны репрезентативные срезы области изъязвлений на 7 и 14 сутки.In FIG. 20A-20E show a comparison of TNBS-induced colitis rats with DNBS-induced colitis (DNBS - dinitrobenzene sulfonic acid) treated with antibody 320-587 and the effect observed at days 7 and 14 on the colonic mass/length ratio (Fig. 20A), colonic fibrosis (FIG. 20B), colonic infiltrate (FIG. 20C) and colonic injury (FIG. 20D). In FIG. 20E shows representative sections of the area of ulceration on days 7 and 14.
На фиг. 21А-21С показано, что у крыс с DSS-индуцированным колитом, который лечили при помощи антитела 320-587, имелись улучшения по изменению массы во время введения DSS (фиг. 21А),In FIG. 21A-21C show that rats with DSS-induced colitis treated with antibody 320-587 had improvements in weight change during DSS administration (FIG. 21A),
- 5 042971 клиническим показателям во время введения DSS (фиг. 21В) и отношению масса/длина толстой кишки (фиг. 21С).- 5 042971 clinical indicators during the introduction of DSS (Fig. 21B) and the mass/length ratio of the colon (Fig. 21C).
На фиг. 22 показаны изменения уровня TL1A-индуцированных внутрибрюшинных цитокинов в ответ на лечение 320-587.In FIG. 22 shows changes in TL1A-induced intraperitoneal cytokines in response to treatment 320-587.
Подробное описание сущности изобретенияDetailed Description of the Invention
Различные термины, относящиеся к аспектам раскрытия, используются в описании и формуле изобретения. Такие термины должны иметь свое обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Другие конкретно определенные термины должны толковаться в соответствии с определением, представленным в данном документе.Various terms relating to aspects of the disclosure are used throughout the specification and claims. Such terms shall have their ordinary meaning in the art, unless otherwise indicated. Other specifically defined terms should be interpreted in accordance with the definition provided in this document.
В некоторых случаях термины субъект и пациент используются в данном документе взаимозаменяемо и включают любое животное. Предпочтительными являются млекопитающие, в том числе компаньоны (например, кошка, собака) и сельскохозяйственные виды млекопитающих (например, свиньи, лошади, коровы), а также грызуны, включая мышей, кроликов и крыс, морских свинок и других грызунов. Приматы, отличные от человека, такие как яванские макаки, более предпочтительны и люди наиболее предпочтительны.In some instances, the terms subject and patient are used interchangeably herein and include any animal. Preferred are mammals, including companion animals (eg, cat, dog) and agricultural mammals (eg, pigs, horses, cows), as well as rodents, including mice, rabbits and rats, guinea pigs, and other rodents. Non-human primates such as cynomolgus macaques are preferred and humans are most preferred.
Молекула, такая как антитело, была выделена, если она была изменена и/или удалена из ее естественной среды рукой человека.A molecule, such as an antibody, has been isolated if it has been altered and/or removed from its natural environment by human hand.
Как используется в данном документе, формы единственного числа включают формы множественного числа, если прямо не указано иное.As used herein, singular forms include plural forms unless expressly stated otherwise.
Специфичность в контексте взаимодействий антитело-антиген необязательно является абсолютным определением, но может представлять собой относительный термин, означающий степень селективности антитела к антиген-положительной клетке по сравнению с антиген-отрицательной клеткой. Специфичность антитела для антиген-положительной клетки опосредуется вариабельными областями антитела и обычно определяющими комплементарность областями (CDR) антитела. Конструкция может иметь от 100 до 1000-кратной специфичности для антиген-положительных клеток по сравнению с антиген-отрицательными клетками.Specificity in the context of antibody-antigen interactions is not necessarily an absolute definition, but may be a relative term indicating the degree of selectivity of an antibody for an antigen-positive cell versus an antigen-negative cell. The specificity of an antibody for an antigen positive cell is mediated by the variable regions of the antibody and usually by the complementarity determining regions (CDRs) of the antibody. The construct may have 100 to 1000 fold specificity for antigen positive cells compared to antigen negative cells.
Используемый в данном документе термин рекомбинантный включает экспрессию генов, полученных при помощи генной инженерии или иным образом путем лабораторных манипуляций.As used herein, the term recombinant includes the expression of genes obtained through genetic engineering or otherwise through laboratory manipulation.
В раскрытии представлены варианты антител против TL1A, содержащие рекомбинантно измененную вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи антитела 320-179, таким образом, что варианты антител специфически связываются с TL1A. Эти варианты антител 320-179 ингибируют способность TL1A взаимодействовать с DR3 и в некоторых аспектах также с DcR3 и, кроме того, ингибируют сигналинг, вызванный взаимодействием TL1A с DR3. Эти антитела обладают повышенной эффективностью по сравнению с антителом 320-179. Эти антитела обладают повышенной аффинностью к TL1A по сравнению с антителом 320-179.The disclosure provides anti-TL1A antibody variants comprising a recombinantly altered heavy and/or light chain variable region of antibody 320-179 such that the antibody variants specifically bind to TL1A. These 320-179 antibody variants inhibit the ability of TL1A to interact with DR3 and in some aspects also with DcR3 and furthermore inhibit signaling induced by TL1A interaction with DR3. These antibodies are more effective than antibody 320-179. These antibodies have increased affinity for TL1A compared to antibody 320-179.
Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 10 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 12 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 13 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 15 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 20 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 25 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 27 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Повышенная активность может быть по меньшей мере примерно в 40 раз выше активности антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Кратность повышения активности можно определить, например, путем измерения высвобождения каспазы в TL1A-индуцированном апоптозе в анализе клеток TF-1.The increased activity may be at least about 10-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity may be at least about 12 times the activity of an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity may be at least about 13 times higher than the activity of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 15 times higher than the activity of an antibody, having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Increased activity can be at least about 20-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region , containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Increased activity can be at least about 25 times higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 27-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The increased activity can be at least about 40-fold higher than that of an antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The fold increase in activity can be determined, for example, by measuring the release of caspase in TL1A-induced apoptosis in the analysis of TF-1 cells.
- 6 042971- 6 042971
Варианты антитела 320-179 рекомбинантно экспрессируются и специфически связываются с TL1A. Исходное антитело 320-179 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах вариант антитела 320-179 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, при условии, что если вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Вариант антитела 320-179 способен ингибировать взаимодействие TL1A с DR3. Вариант антитела 320-179 имеет повышенную активность по сравнению с антителом 320-179 и/или имеет повышенную аффинность к TL1A относительно антитела 320-179.Antibody variants 320-179 are expressed recombinantly and specifically bind to TL1A. The parent antibody 320-179 comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some aspects, the 320-179 antibody variant comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 3, and the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, provided that if the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the variable region the light chain does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Antibody variant 320-179 is able to inhibit the interaction of TL1A with DR3. The 320-179 antibody variant has increased activity compared to the 320-179 antibody and/or has an increased affinity for TL1A relative to the 320-179 antibody.
В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых наиболее предпочтительных аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 1 and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some aspects, the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In some aspects, the variable region the heavy chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some most preferred aspects, the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some aspects, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
В наиболее предпочтительных аспектах вариант антитела 320-179 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и специфически связывается с TL1A. В некоторых аспектах вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 присоединена к константной области тяжелой цепи IgG1 (AK) человека (например, SEQ ID NO: 43), так что тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 60. В некоторых аспектах вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 4 присоединена к константной области легкой цепи лямбда человека (например, SEQ ID NO: 48), так что легкая цепь содержит SEQ ID NO: 61. Вариант антитела 320-179 способен ингибировать взаимодействие TL1A с DR3. Вариант антитела имеет повышенную активность по сравнению с антителом 320-179 и/или имеет повышенную аффинность к TL1A относительно антитела 320-179.In most preferred aspects, the 320-179 antibody variant comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and specifically binds to TL1A. In some aspects, the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 3 is fused to a human IgG1 (AK) heavy chain constant region (e.g., SEQ ID NO: 43) such that the heavy chain comprises SEQ ID NO: 60. In some aspects, the light chain variable region chain of SEQ ID NO: 4 is fused to a human lambda light chain constant region (eg, SEQ ID NO: 48) such that the light chain contains SEQ ID NO: 61. Antibody variant 320-179 is able to inhibit the interaction of TL1A with DR3. The antibody variant has increased activity compared to antibody 320-179 and/or has increased affinity for TL1A relative to antibody 320-179.
В некоторых аспектах варианты антител 320-179 рекомбинантно экспрессируются и специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. Антитела могут содержать вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В аспектах, в которых вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи предпочтительно не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Эти варианты антител 320-179 способны ингибировать взаимодействие TL1A с DR3. Эти варианты антител 320-179 имеют повышенную активность по сравнению с антителом 320-179 и/или имеют повышенную аффинность к TL1A по сравнению с антителом 320-179.In some aspects, antibody variants 320-179 are recombinantly expressed and specifically associated with TL1A and contain a heavy chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and a variable heavy chain CDR3 a heavy chain region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. Antibodies may comprise a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a variable region CDR3 light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30. In aspects in which the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the light chain variable region preferably does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. These antibody variants are 320- 179 are able to inhibit the interaction of TL1A with DR3. These variants of antibodies 320-179 have increased activity compared to antibody 320-179 and/or have increased affinity for TL1A compared to antibody 320-179.
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16,In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16,
- 7 042971- 7 042971
CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьCDR3 of the heavy chain variable region containing the amino acid sequence
SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a light chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельнойIn some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain the CDR1 variable
- 8 042971 области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.- 8 042971 heavy chain region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, heavy chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, heavy chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, light chain variable region CDR1 a chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and comprise a heavy chain variable region CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a heavy chain variable region CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a heavy chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a light chain variable region CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a light chain variable region CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 .
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи при условии, что вариабельная область легкой цепи не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи или легкую цепь. Вариабельная область легкой цепи может дополнительно содержать константную область лямбда.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region, provided that the light chain variable region does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some aspects, antibodies specifically bind to TL1A and contain a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region or light chain. The light chain variable region may further comprise a lambda constant region.
В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариабельную область тяжелой цепи при условии, что вариабельная область тяжелой цепи не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых аспектах антитела специфически связываются с TL1A и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и вариабельную область тяжелой цепи при условии, что, если вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, вариабельная область тяжелой цепи не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Вариабельная область тяжелой цепи может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, включая любую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4, описанную или проиллюстрированную в данном документе.In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a heavy chain variable region, provided that the heavy chain variable region does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some aspects, antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a heavy chain variable region. In some aspects, the antibodies specifically bind to TL1A and contain a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and a heavy chain variable region. In some aspects, antibodies specifically bind to TL1A and comprise a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and a heavy chain variable region, provided that if the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the variable region heavy chain does not contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The heavy chain variable region may further comprise a heavy chain constant region, including any IgG1, IgG2, or IgG4 heavy chain constant region amino acid sequence described or illustrated herein.
- 9 042971- 9 042971
Варианты антител 320-179 специфически связываются с TL1A. Антитела связываются с TL1A человека и могут связываться с одной или более из TL1A яванского макака, TL1A мыши, TL1A крысы, TL1A морской свинки, TL1A кошки, TL1A собаки, TL1A свиньи или TL1A кролика. В некоторых аспектах антитела могут связываться с TL1A нескольких разных видов, например, если эпитоп является общим. В некоторых аспектах TL1A человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, или SEQ ID NO. 33. В некоторых аспектах TL1A яванского макака содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34. В некоторых аспектах TL1A мыши содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых аспектах TL1A крысы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36. В некоторых аспектах TL1A морской свинки содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. В некоторых аспектах TL1A кошки содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38. В некоторых аспектах TL1A свиньи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39. В некоторых аспектах TL1A кролика содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40. В некоторых аспектах TL1A собаки содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41.Antibody variants 320-179 bind specifically to TL1A. The antibodies bind to human TL1A and can bind to one or more of cynomolgus monkey TL1A, mouse TL1A, rat TL1A, guinea pig TL1A, cat TL1A, dog TL1A, pig TL1A, or rabbit TL1A. In some aspects, antibodies can bind to TL1A of several different species, for example, if the epitope is shared. In some aspects, human TL1A comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, or SEQ ID NO. 33. In some aspects, cynomolgus TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34. In some aspects, murine TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35. In some aspects, rat TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36. In some aspects, marine TL1A mumps contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37. In some aspects, feline TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38. In some aspects, porcine TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39. In some aspects, rabbit TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. In some aspects, dog TL1A contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.
Варианты антител 320-179 имеют аффинность связывания для эпитопа на TL1A, которая включает равновесную константу диссоциации (KD), которая может быть измерена при помощи анализа кинетического исключения, такого как анализ KINEXA® (Sapidyne Instruments Inc., Бойсе, Айдахо).Antibody variants 320-179 have a binding affinity for an epitope on TL1A that includes an equilibrium dissociation constant (KD) that can be measured using a kinetic exclusion assay such as the KINEXA® assay (Sapidyne Instruments Inc., Boise, Idaho).
KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, предпочтительно составляет менее чем около 1000 пМ. В некоторых аспектах KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, составляет менее чем около 500 пМ, или менее чем около 400 пМ, или менее чем около 300 пМ, или менее чем около 200 пМ. В некоторых предпочтительных аспектах KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, составляет менее чем около 100 пМ.The K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, is preferably less than about 1000 pM. In some aspects, the K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, is less than about 500 pM, or less than about 400 pM, or less than about 300 pM, or less than about 200 pM. In some preferred aspects, the KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, is less than about 100 pM.
KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 10 пМ до около 100 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 25 пМ до около 75 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 30 пМ до около 60 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 30 пМ до около 50 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 35 пМ до около 50 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 36 пМ до около 46 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 38 пМ до около 44 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 39 пМ до около 43 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 40 пМ до около 45 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять от около 35 пМ до около 42 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять около 40 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять около 41 пМ. KD для связывания TL1A, определенная при помощи анализа кинетического исключения, может составлять около 42 пМ. Анализ кинетического исключения может использовать молекулу антитела или молекулу TL1A в качестве константного партнера по связыванию, а другую молекулу в качестве титранта.The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, can be from about 10 pM to about 100 pM. The K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, may be from about 25 pM to about 75 pM. The K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, may be from about 30 pM to about 60 pM. The K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, may be from about 30 pM to about 50 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, can be from about 35 pM to about 50 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, can be from about 36 pM to about 46 pM. The K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, may be from about 38 pM to about 44 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, can be from about 39 pM to about 43 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, can be from about 40 pM to about 45 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, can be from about 35 pM to about 42 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, may be about 40 pM. The KD for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion assay, may be about 41 pM. The K D for TL1A binding, as determined by kinetic exclusion analysis, may be about 42 pM. A kinetic exclusion assay can use an antibody molecule or a TL1A molecule as a constant binding partner and another molecule as a titrant.
Варианты антител против TL1A 320-179 предпочтительно способны связываться с TL1A-положительными клетками. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 100 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 75 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 50 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 30 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 25 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 20 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 18 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 15 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 13 нМ. Антитело может связываться с TL1A-положительной клеткой со значением ЭК50 менее чем около 10 нМ.Anti-TL1A antibody variants 320-179 are preferably capable of binding to TL1A positive cells. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 100 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 75 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 50 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 30 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 25 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 20 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 18 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 15 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 13 nM. The antibody can bind to a TL1A positive cell with an EC 50 value of less than about 10 nM.
Варианты антитела 320-179 предпочтительно являются моноклональными и более предпочтительно представляют собой полноразмерные антитела, содержащие две тяжелые цепи и две легкие цепи. В некоторых аспектах антитела содержат производные, или фрагменты, или части антител, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность, а также предпочтительно сохраняют в большей степени или всю аффинность молекулы исходного антитела 320-179 (например, для TL1A). Например, производные могут содержать по меньшей мере одну вариабельную область (вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи). Другие примеры подходящих производных и фрагментов антител включают без ограничеAntibody variants 320-179 are preferably monoclonal and more preferably full length antibodies containing two heavy chains and two light chains. In some aspects, the antibodies contain derivatives or fragments or portions of antibodies that retain antigen-binding specificity and also preferably retain more or all of the affinity of the parent antibody molecule 320-179 (eg, for TL1A). For example, derivatives may contain at least one variable region (heavy chain or light chain variable region). Other examples of suitable antibody derivatives and fragments include, but are not limited to
- 10 042971 ния антитела с полиэпитопной специфичностью, биспецифические антитела, мультиспецифические антитела, диатела, одноцепочечные молекулы, а также молекулы FAb, F(Ab')2, Fd, Fabc и Fv, одноцепочечные (Sc) антитела, одноцепочечные Fv-антитела (scFv), отдельные легкие цепи антител, отдельные тяжелые цепи антител, слития между цепями антител и другими молекулами, мономеры или димеры тяжелой цепи, мономеры или димеры легкой цепи, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и других мультимеров. Одноцепочечные Fv-антитела могут быть мультивалентными. Все изотипы антител могут быть использованы для получения производных, фрагментов и частей антител. Производные, фрагменты и/или части антитела могут быть рекомбинантно продуцированы и экспрессированы любым типом клеток, прокариотическим или эукариотическим.- 10 042971 polyepitope specific antibodies, bispecific antibodies, multispecific antibodies, diabodies, single chain molecules, and FAb, F(Ab')2, Fd, Fabc and Fv molecules, single chain (Sc) antibodies, single chain Fv antibodies (scFv ), individual antibody light chains, individual antibody heavy chains, fusions between antibody chains and other molecules, heavy chain monomers or dimers, light chain monomers or dimers, single heavy and single light chain dimers, and other multimers. Single chain Fv antibodies may be multivalent. All isotypes of antibodies can be used to obtain derivatives, fragments and parts of antibodies. Derivatives, fragments and/or parts of an antibody can be recombinantly produced and expressed by any cell type, prokaryotic or eukaryotic.
В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL можно далее подразделить на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца до С-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Как правило, антигенсвязывающие свойства антитела с меньшей вероятностью могут нарушаться изменениями в последовательностях FR, а не изменениями последовательностей CDR. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.In a full-length antibody, each heavy chain consists of a heavy chain variable region (abbreviated herein as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region consists of three domains: CH1, CH2, and CH3. Each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region consists of a single domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs) that alternate with more conserved regions called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from N-terminus to C-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. In general, the antigen-binding properties of an antibody are less likely to be affected by changes in FR sequences than by changes in CDR sequences. Immunoglobulin molecules can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), or subclass.
Варианты антител 320-179 являются полностью человеческими. Полностью человеческие антитела представляют собой те, в которых вся молекула является человеческой или иначе имеет человеческое происхождение, или содержит аминокислотную последовательность, идентичную человеческой форме антитела. Полностью человеческие антитела включают антитела, полученные из библиотеки V-генов человека, например, где рекомбинантно экспрессируются человеческие гены, кодирующие вариабельные области антител. Полностью человеческие антитела могут экспрессироваться в других организмах (например, мышах и технологии XenoMouse) или клетках других организмов, трансформированных генами, кодирующими человеческие антитела. Полностью человеческие антитела могут тем не менее содержать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями, например мутации, введенные при помощи случайных или сайт-направленных мутаций.Antibody variants 320-179 are fully human. Fully human antibodies are those in which the entire molecule is human or otherwise of human origin, or contains an amino acid sequence identical to the human form of the antibody. Fully human antibodies include antibodies derived from a human V gene library, for example, where human genes encoding antibody variable regions are recombinantly expressed. Fully human antibodies can be expressed in other organisms (eg mice and XenoMouse technology) or cells of other organisms transformed with genes encoding human antibodies. Fully human antibodies may, however, contain amino acid residues not encoded by human sequences, such as mutations introduced by random or site-directed mutations.
В некоторых аспектах варианты антител 320-179 могут содержать белковые каркасы, происходящие не из иммуноглобулина. Например, можно сделать ссылку на (Ku & Schutz, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:6552-6556), который описывает белок в виде четырехспирального пучка цитохрома b562, имеющего две петли, расположенные в случайном порядке для создания CDR, которые были выбраны для связывания антигена.In some aspects, antibody variants 320-179 may contain protein scaffolds that are not derived from immunoglobulin. For example, reference can be made to (Ku & Schutz, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:6552-6556), which describes the protein as a four helix bundle of cytochrome b562 having two loops randomly arranged for generating CDRs that have been selected for antigen binding.
Варианты антител 320-179 могут содержать посттрансляционные модификации или фрагменты, которые могут влиять на активность или стабильность антител. Эти модификации или фрагменты включают без ограничения метилированные, ацетилированные, гликозилированные, сульфатированные, фосфорилированные, карбоксилированные и амидированные фрагменты и другие фрагменты, которые хорошо известны в данной области техники. Фрагменты включают любую химическую группу или комбинации групп, обычно встречающихся в молекулах иммуноглобулина в природе или иным образом добавленных к антителам при помощи рекомбинантных систем экспрессии, включая прокариотические и эукариотические системы экспрессии.Antibody variants 320-179 may contain post-translational modifications or fragments that may affect antibody activity or stability. These modifications or moieties include, without limitation, methylated, acetylated, glycosylated, sulfated, phosphorylated, carboxylated, and amidated moieties, and other moieties that are well known in the art. Fragments include any chemical group or combinations of groups normally found naturally in immunoglobulin molecules or otherwise added to antibodies using recombinant expression systems, including prokaryotic and eukaryotic expression systems.
Примеры модификаций боковой цепи, рассматриваемых в описании, включают модификации аминогрупп, таких как восстановительное алкилирование реакцией с альдегидом с последующим восстановлением с помощью NaBH4; амидирование метилацетимидатом; ацилирование ангидридом уксусной кислоты; карбамоилирование аминогрупп цианатом; тринитробензилирование аминогрупп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS); ацилирование аминогрупп янтарным ангидридом и тетрагидрофталевым ангидридом; и пиридоксилирование лизина пиридоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением с помощью NaBH4.Examples of side chain modifications discussed herein include amino modifications such as reductive alkylation with an aldehyde followed by reduction with NaBH 4 ; amidation with methylacetimidate; acylation with acetic anhydride; carbamoylation of amino groups with cyanate; trinitrobenzylation of amino groups with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS); acylation of amino groups with succinic anhydride and tetrahydrophthalic anhydride; and pyridoxylation of lysine with pyridoxal-5-phosphate followed by reduction with NaBH 4 .
Гуанидиновая группа остатков аргинина может быть модифицирована путем образования продуктов гетероциклической конденсации с реагентами, такими как 2,3-бутандион, фенилглиоксаль и глиоксаль. Карбоксильная группа может быть модифицирована активированием карбодиимидом посредством образования О-ацилизомочевины с последующим образованием производного, например, соответствующего амида. Сульфидрильные группы могут быть модифицированы такими способами, как карбоксиметилирование с помощью иодуксусной кислоты или иодацетамида; окисление надмуравьиной кислоты до цистеиновой кислоты; образование смешанных дисульфидов с другими тиольными соединениями; реакция с малеимидом, малеиновым ангидридом или другим замещенным малеимидом; образование производных соединения ртути с использованием 4-хлорртутьбензоата, 4-хлорртутьфенилсульфоновой кислоты, хлорида фенилртути, 2-хлорртуть-4-нитрофенола и других соединений ртути; карбамоилирование сThe guanidine group of arginine residues can be modified by forming heterocyclic condensation products with reagents such as 2,3-butanedione, phenylglyoxal and glyoxal. The carboxyl group can be modified by activation with a carbodiimide through the formation of an O-acylisourea followed by the formation of a derivative, for example the corresponding amide. Sulfidryl groups can be modified by methods such as carboxymethylation with iodoacetic acid or iodoacetamide; oxidation of performic acid to cysteic acid; formation of mixed disulfides with other thiol compounds; reaction with maleimide, maleic anhydride or other substituted maleimide; the formation of mercury compound derivatives using 4-chloromercury benzoate, 4-chloromercuryphenylsulfonic acid, phenylmercuric chloride, 2-chloromercury-4-nitrophenol, and other mercury compounds; carbamoylation with
- 11 042971 цианатом при щелочном рН. Остатки триптофана могут быть модифицированы, например, окислением N-бромсукцинимидом или алкилированием индольного кольца 2-гидрокси-5-нитробензилбромидом или сульфенилгалогенидами. С другой стороны, остатки тирозина могут быть изменены путем нитрования тетранитрометаном с образованием производного 3-нитротирозина. Модификацию имидазольного кольца гистидинового остатка можно осуществить путем алкилирования производными иодуксусной кислоты или N-карбэтоксилированием диэтилпирокарбонатом.- 11 042971 cyanate at alkaline pH. Tryptophan residues can be modified, for example, by oxidation with N-bromosuccinimide or by alkylation of the indole ring with 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide or sulfenyl halides. On the other hand, tyrosine residues can be altered by nitration with tetranitromethane to form a 3-nitrotyrosine derivative. The modification of the imidazole ring of the histidine residue can be carried out by alkylation with iodoacetic acid derivatives or by N-carbethoxylation with diethylpyrocarbonate.
Варианты антител 320-179 могут включать модификации, которые модулируют время полужизни и биораспределение в сыворотке крови, включая без ограничения модификации, которые модулируют взаимодействие антитела с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), рецептором, который играет ключевую роль в защите IgG от катаболизма и поддержании высокой концентрации антител в сыворотке. Модификации, модулирующие время полужизни в сыворотке крови, могут происходить в Fc-области IgG1, IgG2 или IgG4, включая тройную замену M252Y/S254T/T256E (замены YTE с нумерацией в соответствии с системой нумерации ЕС (Edelman, G.M. et al. (1969), Proc. Natl. Acad., USA, 63, 78-85)), как описано в патенте США № 7083784. Другие замены могут происходить в положениях 250 и 428, см., например, патент США № 1211191, а также в положениях 307, 380 и 434, см., например, публикацию РСТ № WO 00/042072. Примеры аминокислотных замен константной области, которые модулируют связывание с Fc-рецепторами и последующей функцией, опосредованной этими рецепторами, включая связывание FcRn и время полужизни в сыворотке крови, описаны в публикации США № 2009/0142340, 2009/0068175 и 2009/0092599. Антитела любого класса могут иметь С-концевой лизин тяжелой цепи, опущенный или удаленный для уменьшения гетерогенности (AK). Замена S228P (нумерация ЕС) в IgG4 человека может стабилизировать обмен Fab-фрагментами антитела in vivo (Labrin et al. (2009), Nature Biotechnology, 27:8, 767-773), и эта замена может присутствовать одновременно с модификациями YTE и/или AK.Antibody variants 320-179 may include modifications that modulate serum half-life and biodistribution, including, without limitation, modifications that modulate the antibody's interaction with the neonatal Fc receptor (FcRn), a receptor that plays a key role in protecting IgG from catabolism and maintaining high concentration of antibodies in serum. Modifications that modulate serum half-life can occur in the Fc region of IgG1, IgG2, or IgG4, including the M252Y/S254T/T256E triple substitution (YTE substitutions numbered according to the EU numbering system (Edelman, G.M. et al. (1969) , Proc. Natl. Acad., USA, 63, 78-85)) as described in US Pat. No. 7,083,784. Other substitutions may occur at positions 250 and 428, see for example US Pat. 307, 380 and 434, see, for example, PCT Publication No. WO 00/042072. Examples of constant region amino acid substitutions that modulate binding to Fc receptors and subsequent function mediated by these receptors, including FcRn binding and serum half-life, are described in US Publication No. 2009/0142340, 2009/0068175 and 2009/0092599. Antibodies of any class may have the heavy chain C-terminal lysine omitted or removed to reduce heterogeneity (AK). The substitution S228P (EC numbering) in human IgG4 can stabilize the exchange of antibody Fab fragments in vivo (Labrin et al. (2009), Nature Biotechnology, 27:8, 767-773), and this substitution may be present concurrently with modifications to YTE and/ or AK.
Варианты антител 320-179 содержат константные домены человека. Константные домены тяжелой цепи предпочтительно представляют собой константные домены IgG1, IgG2 или IgG4 человека. Константные домены легкой цепи предпочтительно представляют собой константные домены лямбда человека. Подходящий домен лямбда человека содержит SEQ ID NO: 48.Antibody variants 320-179 contain human constant domains. The heavy chain constant domains are preferably human IgG1, IgG2 or IgG4 constant domains. The light chain constant domains are preferably human lambda constant domains. A suitable human lambda domain comprises SEQ ID NO: 48.
Константные области тяжелой цепи IgG1 человека, которые могут использоваться с вариантами антител 320-179, могут быть выбраны из IgG1 человека (SEQ ID NO: 42), IgG1 человека (AK) (SEQ ID NO: 43), IgG1 человека 252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 44), IgG1 человека 252Y/254T/256E (AK) (SEQ ID NO: 64), IgG1 человека L234A/L235A/G237A (SEQ ID NO: 63), IgG1 человека L234A/L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 62), IgG1 человека L235A/G237A (SEQ ID NO: 65) и IgG1 человека L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 66). Константные области тяжелой цепи IgG2 человека, которые могут быть использованы с вариантами антител 320-119, могут быть выбраны из IgG2 человека с или без AK (SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 70) и IgG2 человека A330S/P331S с или без (ΔΚ) (SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 68). Константные области тяжелой цепи IgG4 человека, которые могут быть использованы с вариантами антител 320-179, могут быть выбраны из IgG4 человека S228P (SEQ ID NO: 45), IgG4 человека S228P (AK) (SEQ ID NO: 46), IgG4 человека 228P/252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 47) и IgG4 человека 228P/252Y/254T/256E (ΔΚ) (SEQ ID NO: 69).Heavy chain constant regions of human IgG1 that can be used with antibody variants 320-179 can be selected from human IgG1 (SEQ ID NO: 42), human IgG1 (AK) (SEQ ID NO: 43), human IgG1 252Y/254T/ 256E (SEQ ID NO: 44), Human IgG1 252Y/254T/256E (AK) (SEQ ID NO: 64), Human IgG1 L234A/L235A/G237A (SEQ ID NO: 63), Human IgG1 L234A/L235A/G237A ( AK) (SEQ ID NO: 62), human IgG1 L235A/G237A (SEQ ID NO: 65) and human IgG1 L235A/G237A (AK) (SEQ ID NO: 66). Human IgG2 heavy chain constant regions that can be used with antibody variants 320-119 can be selected from human IgG2 with or without AK (SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 70) and human IgG2 A330S/P331S with or without (ΔΚ) (SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 68). Human IgG4 heavy chain constant regions that can be used with antibody variants 320-179 can be selected from human IgG4 S228P (SEQ ID NO: 45), human IgG4 S228P (AK) (SEQ ID NO: 46), human IgG4 228P /252Y/254T/256E (SEQ ID NO: 47) and human IgG4 228P/252Y/254T/256E (ΔΚ) (SEQ ID NO: 69).
Варианты антител 320-179 могут быть помечены, связаны или конъюгированы с любыми химическими или биомолекулярными фрагментами. Меченые антитела могут найти применение в терапевтических, диагностических или фундаментальных исследованиях. Такие метки/конъюгаты могут быть обнаруживаемыми, например флуорохромы, электрохемилюминесцентные зонды, квантовые точки, радиоактивные метки, ферменты, флуоресцентные белки, люминесцентные белки и биотин. Метки/конъюгаты могут быть химиотерапевтическими агентами, токсинами, изотопами и другими агентами, используемыми для лечения таких патологических состояний, например уничтожения раковых клеток. Химиотерапевтические агенты могут быть любыми, которые пригодны для целей, для которых используется антитело.Antibody variants 320-179 may be labeled, linked or conjugated to any chemical or biomolecular moieties. Labeled antibodies can be used in therapeutic, diagnostic or basic research. Such labels/conjugates can be detectable, such as fluorochromes, electrochemiluminescent probes, quantum dots, radioactive labels, enzymes, fluorescent proteins, luminescent proteins, and biotin. Labels/conjugates can be chemotherapeutic agents, toxins, isotopes, and other agents used to treat such pathological conditions, such as killing cancer cells. Chemotherapeutic agents can be any that are suitable for the purposes for which the antibody is used.
Антитела могут быть дериватизированы известными защищающими/блокирующими группами для предотвращения протеолитического расщепления или повышения активности или стабильности.Antibodies can be derivatized with known protecting/blocking groups to prevent proteolytic cleavage or increase activity or stability.
Полинуклеотидные последовательности, которые кодируют антитела и их субдомены (например, FR и CDR), представлены в описании. Полинуклеотиды включают, но не ограничиваются ими, РНК, ДНК, кДНК, гибриды РНК и ДНК и одно-, двух- или трехцепочечные цепи РНК, ДНК или их гибридов. Полинуклеотиды могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, и/или вариабельную область легкой цепи варианта антитела 320-179, как описано или приведено в данном документе в качестве примера. Комплементарные цепи полинуклеотидных последовательностей также входят в объем раскрытия.Polynucleotide sequences that encode antibodies and their subdomains (eg, FR and CDR) are presented in the description. Polynucleotides include, but are not limited to, RNA, DNA, cDNA, RNA/DNA hybrids, and single, double or triple stranded RNA, DNA, or hybrids thereof. The polynucleotides may contain a nucleic acid sequence encoding a heavy chain variable region and/or a light chain variable region of the 320-179 antibody variant as described or exemplified herein. Complementary strands of polynucleotide sequences are also within the scope of the disclosure.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51.
- 12 042971- 12 042971
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 49.The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 49.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 50.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 50.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 52.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 52.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 53.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 53.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 54.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 54.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 55.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 55.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 56.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 56.
Полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 57.The polynucleotide may comprise a nucleic acid sequence encoding the antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. The polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 57.
В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела. Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 50.In some aspects, the polynucleotide comprises a first nucleic acid sequence encoding an antibody heavy chain variable region and a second nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region. The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 50.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 52.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 52.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 54.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 54.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 55.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 55.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Полинуклеотид,The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. A polynucleotide,
- 13 042971 кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 56.- 13 042971 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 56.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 51, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 57.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 57.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 49, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 52.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 52.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 49, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 53.The first nucleic acid sequence may encode a heavy chain variable region of an antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may comprise a nucleic acid sequence acids of SEQ ID NO: 49, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 53.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 49, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 54.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 54.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 49, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 55.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 55.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 49, и полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 56.The first nucleic acid sequence may encode an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may comprise the sequence nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 may contain the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 56.
В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область тяжелой цепи. В предпочтительных аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область тяжелой цепи IgG1 (AK) SEQ ID NO: 43, например полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 58.In some aspects, the polynucleotide comprises a first nucleic acid sequence encoding an antibody heavy chain variable region and a second nucleic acid sequence encoding a heavy chain constant region. In preferred aspects, the polynucleotide comprises a first nucleic acid sequence encoding an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a second nucleic acid sequence encoding an IgG1 heavy chain constant region (AK) of SEQ ID NO: 43, e.g., a polynucleotide, containing the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 58.
В некоторых аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область легкой цепи. В предпочтительных аспектах полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область легкой цепи лямбда SEQ ID NO: 48, например полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 59.In some aspects, the polynucleotide comprises a first nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region and a second nucleic acid sequence encoding a light chain constant region. In preferred aspects, the polynucleotide comprises a first nucleic acid sequence encoding an antibody light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a second nucleic acid sequence encoding a lambda light chain constant region of SEQ ID NO: 48, e.g. acids SEQ ID NO: 59.
Любой из полинуклеотидов, описанных или проиллюстрированных примерами в данном документе, может быть помещен в вектор. Таким образом, векторы, содержащие полинуклеотиды, представлены как часть раскрытия. Векторы могут быть векторами экспрессии. Таким образом, предложены рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид. Вектор экспрессии может содержать одну или более дополнительных последовательностей, таких как без ограничения регуляторные последовательности, селективный маркер, метку очистки или сигнал полиаденилирования. Такие регуляторные элементы могут содержать транскрипционный промотор, энхансеры, мРНК-сайты связывания рибосомы или последовательности, которые контролируютAny of the polynucleotides described or exemplified herein may be placed into a vector. Thus, vectors containing polynucleotides are provided as part of the disclosure. The vectors may be expression vectors. Thus, recombinant expression vectors containing a sequence encoding a polypeptide of interest are provided. The expression vector may contain one or more additional sequences such as, but not limited to, regulatory sequences, a selectable marker, a purification tag, or a polyadenylation signal. Such regulatory elements may contain a transcriptional promoter, enhancers, mRNA ribosome binding sites, or sequences that control
- 14 042971 прекращение транскрипции и трансляции.- 14 042971 termination of transcription and translation.
Векторы экспрессии, особенно векторы экспрессии для млекопитающих, могут содержать один или более нетранскрибируемых элементов, таких как точка начала репликации, подходящий промотор и энхансер, связанный с экспрессируемым геном, другие 5'- или 3'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности (такие как необходимые сайты связывания рибосом), сайт полиаденилирования, участок донора и акцептора сплайсинга или последовательности терминации транскрипции. Также может быть включена точка начала репликации, которая дает возможность реплицировать в конкретном хозяине.Expression vectors, especially mammalian expression vectors, may contain one or more non-transcribed elements such as an origin of replication, an appropriate promoter and enhancer associated with the gene to be expressed, other 5' or 3' flanking non-transcribed sequences, 5' or 3 '-untranslated sequences (such as essential ribosome binding sites), polyadenylation site, splicing donor and acceptor site, or transcription termination sequences. An origin of replication may also be included, which allows replication in a particular host.
Векторы могут быть использованы для трансформации любого из широкого набора клеток-хозяев, хорошо известных специалистам в данной области техники, и предпочтительно клеток-хозяев, способных экспрессировать антитела. Векторы включают без ограничения плазмиды, фагемиды, космиды, бакмиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) и бакуловирус, а также другие бактериальные, эукариотические, дрожжевые и вирусные векторы. Подходящие клетки-хозяева включают без ограничения клетки СНО, клетки NS0, клетки HEK293 или любую известную или продуцируемую эукариотическую клеточную линию, а также включают бактерии, дрожжи и клетки насекомых.Vectors can be used to transform any of a wide variety of host cells well known to those skilled in the art, and preferably host cells capable of expressing antibodies. Vectors include, but are not limited to, plasmids, phagemids, cosmids, bacmids, bacterial artificial chromosomes (BACs), yeast artificial chromosomes (YACs), and baculovirus, as well as other bacterial, eukaryotic, yeast, and viral vectors. Suitable host cells include, but are not limited to, CHO cells, NS0 cells, HEK293 cells, or any eukaryotic cell line known or produced, and include bacteria, yeast, and insect cells.
Антитела также могут быть получены клетками гибридомы; способы получения гибридом хорошо известны и разработаны в данной области техники.Antibodies can also be produced by hybridoma cells; methods for producing hybridomas are well known and developed in the art.
В раскрытии также представлены композиции, содержащие варианты антител 320-179. Композиции могут содержать любое из антител, описанное и/или проиллюстрированное в данном документе примерами, и приемлемого носителя, такого как фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители включают любые среды, которые не влияют на биологическую активность антитела и предпочтительно не токсичны для хозяина, которому он вводится. Композиции могут быть составлены для введения субъекту в любой подходящей лекарственной форме.The disclosure also provides compositions containing antibody variants 320-179. The compositions may contain any of the antibodies described and/or exemplified herein, and an acceptable carrier, such as a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers include any media that do not interfere with the biological activity of the antibody and preferably are not toxic to the host to which it is administered. The compositions may be formulated for administration to a subject in any suitable dosage form.
Варианты антител 320-179 могут быть использованы для лечения заболеваний дыхательных путей, заболевания желудочно-кишечного тракта, артрита или заболевания кожи у субъекта. Таким образом, раскрытие включает методы лечения. В общем способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания дыхательных путей, заболевания желудочно-кишечного тракта, артрита или заболевания кожи, так что заболевание респираторных путей, заболевание желудочно-кишечного тракта, артрит или заболевание кожи лечится. Вариант антитела 320-179 может содержать любое антитело, описанное или приведенное в данном документе в качестве примера. Введение может включать подкожное введение антитела. Введение может включать внутривенное введение антитела. Субъект предпочтительно является человеком. Субъект может быть приматом, отличным от человека, таким как яванский макак, или может быть млекопитающим, таким как мышь, крыса, морская свинка, кошка, свинья, кролик или собака.Antibody variants 320-179 can be used to treat respiratory disease, gastrointestinal disease, arthritis, or skin disease in a subject. Thus, the disclosure includes treatments. In general, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment for a respiratory disease, gastrointestinal disease, arthritis, or skin disease, such that the respiratory disease, gastrointestinal disease, arthritis, or skin disease is treated. . Antibody variant 320-179 may contain any antibody described or exemplified herein. Administration may include subcutaneous administration of the antibody. Administration may include intravenous administration of the antibody. The subject is preferably a human. The subject may be a non-human primate, such as a cynomolgus monkey, or may be a mammal, such as a mouse, rat, guinea pig, cat, pig, rabbit, or dog.
В тех аспектах, при которых необходимо лечить заболевание дыхательных путей, способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания дыхательных путей. Заболевание дыхательных путей может включать одно или более из астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), легочного фиброза, саркоидоза легких, аллергического ринита или кистозного фиброза. Так, например, в некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении астмы, таким образом, что астма лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении ХОБЛ, таким образом, что ХОБЛ лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении легочного фиброза, таким образом, что легочный фиброз лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении саркоидоза легких, таким образом, что саркоидоз легких лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении аллергическом рините, таким образом, что аллергический ринит лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении кистозного фиброза, таким образом, что кистозный фиброз лечится у субъекта.In those aspects in which the respiratory disease is to be treated, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition thereof to a subject in need of treatment of the respiratory disease. The respiratory disease may include one or more of asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), pulmonary fibrosis, pulmonary sarcoidosis, allergic rhinitis, or cystic fibrosis. Thus, for example, in some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of asthma treatment such that the subject's asthma is treated. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment for COPD such that the subject is treated for COPD. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of treatment for pulmonary fibrosis such that the subject is treated for pulmonary fibrosis. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition thereof to a subject in need of treatment for pulmonary sarcoidosis such that the subject is treated for pulmonary sarcoidosis. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment for allergic rhinitis such that the subject is treated for allergic rhinitis. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment for cystic fibrosis such that the cystic fibrosis is treated in the subject.
В тех аспектах, при которых необходимо лечить заболевание желудочно-кишечного тракта, способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания желудочно-кишечного тракта. Заболевание желудочно-кишечного тракта может включать одно или более из следующего списка: воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона, колит, язвенный колит, синдром раздраженного кишечника (IBS), эозинофильный эзофагит, или заболевание, или патологическое состояние желудочно-кишечного тракта, связанное с кистозным фиброзом. Так, например, в некоторых аспектах способы включают введение варианту антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении IBD, таким образом, что IBD лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении болезни Крона, таким образом, что болезнь Крона лечится у субъекта. ВIn those aspects in which a disease of the gastrointestinal tract is to be treated, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition thereof to a subject in need of treatment of the disease of the gastrointestinal tract. The gastrointestinal disease may include one or more of the following: inflammatory bowel disease (IBD), Crohn's disease, colitis, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome (IBS), eosinophilic esophagitis, or a disease or condition of the gastrointestinal tract, associated with cystic fibrosis. Thus, for example, in some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of IBD treatment such that the subject is treated for IBD. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of treatment for Crohn's disease such that the subject's Crohn's disease is treated. IN
- 15 042971 некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении колита, таким образом, что колит лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении язвенного колита, таким образом, что язвенный колит лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении IBS, таким образом, что IBS лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении эозинофильного эзофагита, таким образом, что эозинофильный эзофагит лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания или патологического состояния желудочно-кишечного тракта, связанного с кистозным фиброзом, таким образом, что заболевание или патологическое состояние желудочно-кишечного тракта, связанное с кистозным фиброзом, лечится у субъекта.- 15 042971 In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment for colitis such that the subject's colitis is treated. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of treatment for ulcerative colitis such that the subject is treated for ulcerative colitis. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of IBS treatment such that the subject is treated for IBS. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of treatment for eosinophilic esophagitis such that the subject is treated for eosinophilic esophagitis. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment of a gastrointestinal disease or condition associated with cystic fibrosis such that the gastrointestinal disease or condition associated with cystic fibrosis , is treated in the subject.
В тех аспектах, при которых необходимо лечить артрит, способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении артрита. Артрит может включать ревматоидный артрит. Так, например, в некоторых аспектах способы включают введение варианту антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении ревматоидного артрита, таким образом, что ревматоидный артрит лечится у субъекта.In those aspects in which arthritis is to be treated, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of arthritis treatment. Arthritis may include rheumatoid arthritis. Thus, for example, in some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition thereof to a subject in need of treatment for rheumatoid arthritis such that the subject is treated for rheumatoid arthritis.
В тех аспектах, при которых необходимо лечить заболевание кожи, способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания кожи. Заболевание кожи может включать одно или более из атопического дерматита, экземы или склеродермии. Так, например, в некоторых аспектах способы включают введение варианту антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении атопического дерматита, таким образом, что атопический дерматит лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении экземы, таким образом, что экзема лечится у субъекта. В некоторых аспектах способы включают введение варианта антитела 320-179 или его композиции субъекту, нуждающемуся в лечении склеродермии, таким образом, что склеродермия лечится у субъекта.In those aspects in which a skin disease is to be treated, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of treatment for the skin disease. The skin disease may include one or more of atopic dermatitis, eczema, or scleroderma. Thus, for example, in some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant, or composition thereof, to a subject in need of atopic dermatitis treatment such that the subject is treated for atopic dermatitis. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of treatment for eczema such that the subject's eczema is treated. In some aspects, the methods include administering the 320-179 antibody variant or composition to a subject in need of treatment for scleroderma such that the subject is treated for scleroderma.
Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы при получении лекарственного средства для использования при лечении заболевания респираторных путей. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы при получении лекарственного средства для использования при лечении заболевания желудочно-кишечного тракта. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы при получении лекарственного средства для использования при лечении артрита. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы при получении лекарственного средства для использования при лечении заболевания кожи. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примеров в данном документе, могут быть использованы при получении лекарственного средства для применения при лечении любого заболевания из астмы, ХОБЛ, легочного фиброза, саркоидоза легких, аллергического ринита, кистозного фиброза, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, колита, язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, эозинофильного эзофагита, заболевания или патологического состояния желудочно-кишечного тракта, связанного с кистозным фиброзом, артрита, ревматоидного артрита, атопического дерматита, экземы или склеродермии.Antibody variants 320-179 described or exemplified herein may be used in the preparation of a medicament for use in the treatment of respiratory disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein may be used in the preparation of a medicament for use in the treatment of gastrointestinal disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used in the preparation of a medicament for use in the treatment of arthritis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein may be used in the preparation of a medicament for use in the treatment of skin disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used in the preparation of a medicament for use in the treatment of any disease from asthma, COPD, pulmonary fibrosis, pulmonary sarcoidosis, allergic rhinitis, cystic fibrosis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, colitis, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, eosinophilic esophagitis, gastrointestinal disease or condition associated with cystic fibrosis, arthritis, rheumatoid arthritis, atopic dermatitis, eczema, or scleroderma.
Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения заболевания дыхательных путей. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения заболевания желудочно-кишечного тракта. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения астмы. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения заболевания кожи. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения ХОБЛ. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения легочного фиброза. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения саркоидоза легких. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения аллергического ринита. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения кистозного фиброза. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания кишечника. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения болезни Крона. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения колита. Варианты антител 320-179, описанные илиAntibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat respiratory disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat disease of the gastrointestinal tract. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat asthma. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat skin disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat COPD. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat pulmonary fibrosis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat lung sarcoidosis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat allergic rhinitis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat cystic fibrosis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat inflammatory bowel disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat Crohn's disease. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat colitis. Antibody Options 320-179 as described or
- 16 042971 приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения язвенного колита. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для эозинофильного эзофагита. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения заболевания или патологического состояния желудочно-кишечного тракта, связанного с кистозным фиброзом. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения синдрома раздраженного кишечника. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения ревматоидного артрита. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения атопического дерматита. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения экземы. Варианты антител 320-179, описанные или приведенные в качестве примера в данном документе, могут быть использованы для лечения склеродермии.- 16 042971 given as an example in this document, can be used to treat ulcerative colitis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used for eosinophilic esophagitis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat a disease or condition of the gastrointestinal tract associated with cystic fibrosis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat irritable bowel syndrome. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat rheumatoid arthritis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat atopic dermatitis. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat eczema. Antibody variants 320-179 described or exemplified herein can be used to treat scleroderma.
Также предложен способ in vitro для выявления TL1A в образце ткани, выделенном от субъекта, включающий приведение в контакт антитела по любому из пп.1-19 с образцом ткани, выделенным от субъекта, с образованием комплекса антитело-TL1A, и выявления комплекса в образце ткани.Also provided is an in vitro method for detecting TL1A in a tissue sample isolated from a subject, comprising contacting an antibody according to any one of claims 1 to 19 with a tissue sample isolated from a subject to form an antibody-TL1A complex, and detecting the complex in the tissue sample. .
Вариант антитела 320-179 можно использовать для выявления TL1A-положительных клеток, например, в образце ткани, полученном от субъекта. Антитела могут использоваться для выявления TL1Aположительных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), например МКПК, полученных от субъекта. Антитела могут использоваться для выявления TL1A в сыворотке крови. Такие способы могут быть осуществлены in vivo, ex vivo, in vitro или in situ. В общем способы включают приведение в контакт любого из вариантов антител 320-179, описанных или проиллюстрированных в данном документе, с тканью или клетками, например МКПК, выделенными от субъекта, с образованием комплекса антитело-TL1A и выявления комплекса в ткани или на клетках. Антитело может быть помечено детектируемой меткой. Антитело может быть обнаружено вторичным антителом, которое помечено детектируемой меткой. Ткань может содержать или может быть биологической жидкостью, такой как кровь или сыворотка крови. Ткань может содержать или может быть тканями дыхательного тракта, таким как ткань легкого, мокрота, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, желудочно-кишечная ткань или желудочнокишечная промывная жидкость. Ткань может содержать или может быть кожей или тканью кожи. Ткань может содержать или может быть тканью любого сустава в организме. Способ может дополнительно включать выделение ткани от субъекта. Такие методы могут быть количественными, например количественное определение уровня TL1A в ткани, количественное определение уровня TL1A-положительных клеток или количественное определение уровня TL1A на клетках или количественное определение уровня TL1A в сыворотке.The 320-179 antibody variant can be used to detect TL1A positive cells, for example, in a tissue sample obtained from a subject. The antibodies can be used to detect TL1A positive peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), such as PBMCs, obtained from a subject. Antibodies can be used to detect TL1A in serum. Such methods can be carried out in vivo, ex vivo, in vitro or in situ. In general, the methods include contacting any of the antibody variants 320-179 described or illustrated herein with tissue or cells, such as PBMCs, isolated from a subject to form an antibody-TL1A complex and detecting the complex in the tissue or on the cells. The antibody may be labeled with a detectable label. The antibody can be detected by a secondary antibody that is labeled with a detectable label. The tissue may contain or be a biological fluid such as blood or blood serum. The tissue may or may be respiratory tract tissues such as lung tissue, sputum, bronchoalveolar lavage fluid, gastrointestinal tissue, or gastrointestinal lavage fluid. The fabric may or may be leather or skin tissue. The tissue may comprise or be tissue from any joint in the body. The method may further include isolating tissue from the subject. Such methods can be quantitative, such as quantifying the level of TL1A in tissue, quantifying the level of TL1A positive cells, or quantifying the level of TL1A on cells, or quantifying the level of TL1A in serum.
В раскрытии также предложены наборы, содержащие любой из вариантов антител 320-179, описанных и приведенных в качестве примеров в данном документе. Наборы могут использоваться для обеспечения антител и других агентов для применения в диагностике, фундаментальных исследованиях или терапевтических методах, наряду с другими. В некоторых аспектах наборы содержат любые одно или более из вариантов антител 320-179, описанных или приведенных в качестве примера в данном документе, и инструкции для использования одного или более антител в способе лечения заболевания дыхательных путей, в способе лечения заболевания желудочно-кишечного тракта, или в способе лечения артрита.The disclosure also provides kits containing any of the antibody variants 320-179 described and exemplified herein. The kits can be used to provide antibodies and other agents for use in diagnostics, basic research, or therapeutic methods, among others. In some aspects, kits contain any one or more of the antibody variants 320-179 described or exemplified herein and instructions for using one or more antibodies in a method of treating a respiratory disease, in a method of treating a gastrointestinal disease, or in a method of treating arthritis.
Следующие примеры приведены для более подробного описания раскрытия. Они предназначены для иллюстрации, а не для ограничения раскрытия.The following examples are provided to describe the disclosure in more detail. They are intended to be illustrative and not to limit disclosure.
Пример 1. Материалы и методы.Example 1. Materials and methods.
Положения аминокислот в этих примерах нумеруются в соответствии с системой нумерации Kabat. CDR определяют в соответствии с методом AbM системы определения CDR в этом документе.The amino acid positions in these examples are numbered according to the Kabat numbering system. CDRs are determined according to the AbM method of the CDR determination system in this document.
1.1. Генерация вариантов пучков.1.1. Generation of variants of beams.
Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей антитела 320-179 (SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно) использовали в качестве матриц для разработки указанных вариантов. 320-179 был ранее описан в публикации США № 2014/0255302 (VH представляет собой SEQ ID NO: 186, a VL представляет собой SEQ ID NO: 199 в этой публикации) как 320-179 (также описано как С320-179). Это антитело обладало благоприятными биофизическими свойствами, являлось мощным ингибитором TL1A и имело низкий прогнозируемый профиль иммуногенности.Amino acid sequences of the variable region of the heavy and light chains of antibodies 320-179 (SEQ ID NO: 1 and 2, respectively) were used as templates for the development of these variants. 320-179 was previously described in US Publication No. 2014/0255302 (VH is SEQ ID NO: 186 and VL is SEQ ID NO: 199 in this publication) as 320-179 (also described as C320-179). This antibody had favorable biophysical properties, was a potent inhibitor of TL1A, and had a low predictive immunogenicity profile.
Варианты антител 320-179 были сделаны путем замены одной из группы из девяти типичных аминокислот - A, S, Q, D, Н, K, L, W, Y - по одной в каждом аминокислотном положении CDR (как определено при помощи номенклатуры AbM) в CDR1 легкой цепи (CDR-L1), CDR3 легкой цепи (CDR-L3), CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1) и CDR2 тяжелой цепи (CDR-H2). Варианты антител, включающие A, S, Q, D, Н, K, L, W, Y, также были сделаны в положениях 59 и 60 в вариабельной области тяжелой цепи и в положении 79 в вариабельной области легкой цепи. Полный список всех сгенерированных однозамещенных вариантов антител показан на фиг. 1 (вариабельная область тяжелой цепи) и фиг. 2 (вариабельная область легкой цепи) соответственно.Antibody variants 320-179 were made by substituting one of a group of nine typical amino acids - A, S, Q, D, H, K, L, W, Y - one at each amino acid position of the CDR (as defined using AbM nomenclature) in light chain CDR1 (CDR-L1), light chain CDR3 (CDR-L3), heavy chain CDR1 (CDR-H1) and heavy chain CDR2 (CDR-H2). Antibody variants including A, S, Q, D, H, K, L, W, Y were also made at positions 59 and 60 in the heavy chain variable region and at position 79 in the light chain variable region. A complete listing of all single substituted antibody variants generated is shown in FIG. 1 (heavy chain variable region) and FIG. 2 (light chain variable region), respectively.
- 17 042971- 17 042971
1.2. Конструирование векторов, экспрессирующих антитела.1.2. Construction of vectors expressing antibodies.
Варианты вариабельных областей были получены путем обратной транскрипции аминокислотных последовательностей в последовательности ДНК, которые впоследствии были синтезированы de novo путем сборки синтетических олигонуклеотидов. Варианты VH субклонировали в вектор экспрессии млекопитающих, содержащий константную область человека для получения полноразмерных тяжелых цепей антител (CH1 тяжелой цепи IgG1 человека, шарнирный участок, домены CH2 и CH3) (например, UniProt № P01857). Аналогично варианты VL субклонировали в вектор экспрессии млекопитающих, содержащий константную область легкой цепи лямбда человека для получения лямбда-цепей полноразмерных антител (SwissProt № P0CG05.1). В некоторых случаях полноразмерная тяжелая цепь и в отдельности легкая цепь были обратно переведены в последовательности ДНК и впоследствии синтезированы de novo путем сборки синтетических олигонуклеотидов.Variable region variants were generated by reverse transcription of amino acid sequences into DNA sequences, which were subsequently synthesized de novo by assembling synthetic oligonucleotides. The VH variants were subcloned into a mammalian expression vector containing a human constant region to generate full-length antibody heavy chains (human IgG1 heavy chain CH1, hinge, CH2 and CH3 domains) (eg, UniProt # P01857). Similarly, V L variants were subcloned into a mammalian expression vector containing a human lambda light chain constant region to generate full length antibody lambda chains (SwissProt # P0CG05.1). In some cases, the full-length heavy chain and the light chain alone were retranslated into DNA sequences and subsequently synthesized de novo by assembling synthetic oligonucleotides.
1.3. Экспрессия вариантов антител.1.3. Expression of antibody variants.
Антитела были получены путем совместной трансфекции тяжелых и легких цепей антител в клетки EXPI293® (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). За сутки до трансфекции было определено количество клеток, необходимых для эксперимента. Для каждой 20 мл трансфекции требовалось 3,6x107 клеток в 20 мл среды EXPI293® Expression Medium. В день до трансфекции клетки высевали с плотностью 0,9x106 жизнеспособных клеток/мл и инкубировали в течение ночи при 37°С в увлажненной атмосфере с 8% CO2 в воздухе на орбитальном шейкере, вращающемся со скоростью 200 об/мин. В день трансфекции количество клеток и их жизнеспособность определяли с использованием автоматизированного счетчика клеток. Использовали культуры с более чем 98% жизнеспособными клетками. Для каждой 20 мл трансфекции комплексы липид-ДНК получали путем разбавления 10 мкг ДНК тяжелой цепи и 10 мкг ДНК легкой цепи в среде OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) (№ 31985)-062) до общего объема 1,0 мл. 54 мкл EXPIFECTAMINE® 293 Reagent (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) разбавляли в среде OPTI-MEM® I до общего объема 1,0 мл. Оба флакона осторожно перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации разбавленную ДНК смешивали с разбавленным EXPIFECTAMINE® 293 Reagent и реакционной смесью ДНК-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent и инкубировали еще 20 мин при комнатной температуре, чтобы образовать комплексы ДНК-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent. После инкубации к каждой 50 мл биореакторной трубке (ТРР Techno Plastic Products AG) добавляли 2 мл комплекса ДНК-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent. В отрицательную контрольную пробирку вместо комплекса ДНК-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent добавляли 2 мл среды OPTI-MEM® I (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния).Antibodies were generated by co-transfection of antibody heavy and light chains into EXPI293® cells (Life Technologies, Carlsbad, CA). One day before transfection, the number of cells required for the experiment was determined. For each 20 ml transfection, 3.6x10 7 cells were required in 20 ml of EXPI293® Expression Medium. The day before transfection, cells were seeded at a density of 0.9x106 viable cells/ml and incubated overnight at 37° C. in a humidified atmosphere with 8% CO 2 in air on an orbital shaker rotating at 200 rpm. On the day of transfection, the number of cells and their viability was determined using an automated cell counter. Cultures with more than 98% viable cells were used. For each 20 ml transfection, lipid-DNA complexes were prepared by diluting 10 μg heavy chain DNA and 10 μg light chain DNA in OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) (#31985-062) to total volume 1.0 ml. 54 µl of EXPIFECTAMINE® 293 Reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA) was diluted in OPTI-MEM® I medium to a total volume of 1.0 ml. Both vials were gently mixed and incubated for 5 min at room temperature. After incubation, diluted DNA was mixed with diluted EXPIFECTAMINE® 293 Reagent and DNA-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent reaction mix and incubated for an additional 20 min at room temperature to form DNA-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent complexes. After incubation, 2 ml of DNA-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent complex was added to each 50 ml bioreactor tube (TPP Techno Plastic Products AG). In the negative control tube, 2 ml of OPTI-MEM® I medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) was added instead of the DNA-EXPIFECTAMINE® 293 Reagent complex.
Клетки инкубировали в инкубаторе при температуре 37°С с увлажненной атмосферой 8% CO2 в воздухе на орбитальном шейкере, вращающемся со скоростью 200 об/мин. Примерно через 16-18 ч после трансфекции к каждому биореактору добавляли 100 мкл EXPIFECTAMINE® 293 Transfection Enhancer 1 и 1,0 мл EXPIFECTAMINE® 293 Transfection Enhancer 2. Антитела собирали примерно через 72 ч после трансфекции.Cells were incubated in an incubator at 37°C with a humidified atmosphere of 8% CO2 in air on an orbital shaker rotating at 200 rpm. Approximately 16-18 hours after transfection, 100 μl EXPIFECTAMINE® 293 Transfection Enhancer 1 and 1.0 ml EXPIFECTAMINE® 293 Transfection Enhancer 2 were added to each bioreactor. Antibodies were collected approximately 72 hours after transfection.
1.4. Очистка вариантов антител.1.4. Purification of antibody variants.
Каждый вариант антител экспрессировали в клетках EXPI293® в 20 мл клеточной культуры. Культуры центрифугировали в 50 мл пробирках фирмы Falcon при 3000xg в течение 20 мин и супернатанты фильтровали с использованием 0,22 мкм фильтра (Corning). Супернатанты очищали с использованием робота Gilson ASPEC GX274. Вкратце картриджи SPE (твердофазная экстракция) (Agilent, 12131014), заполненные 1,2 мл смолы с протеином A MABSELECT SURE® (GE Healthcare Bio-Sciences АВ, Уппсала, Швеция) были предварительно уравновешены 3 объемами колонки 1X PBS. 18 мл супернатанта пропускали через колонки, а затем промывали 4 мл 1X PBS. Каждую колонку предварительно элюировали 0,9 мл 0,1 М лимонной кислоты при рН 2,9. Очищенные антитела элюировали 2 мл 0,1 М лимонной кислоты, при рН 2,9. Антитела обессоливали в PBS S0rensens (59,5 мМ KH2PO4, 7,3 мМ Na2HPO4-2H2O, 145,4 мМ NaCl (рН ~5.8)) с использованием колонок PD-10 (GE Healthcare).Each antibody variant was expressed in EXPI293® cells in 20 ml of cell culture. The cultures were centrifuged in 50 ml Falcon tubes at 3000xg for 20 min and the supernatants were filtered using a 0.22 µm filter (Corning). Supernatants were purified using a Gilson ASPEC GX274 robot. Briefly, SPE (solid phase extraction) cartridges (Agilent, 12131014) filled with 1.2 ml of MABSELECT SURE® protein A resin (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) were pre-equilibrated with 3 column volumes of 1X PBS. 18 ml of the supernatant was passed through the columns and then washed with 4 ml of 1X PBS. Each column was pre-eluted with 0.9 ml of 0.1 M citric acid at pH 2.9. Purified antibodies were eluted with 2 ml of 0.1 M citric acid, pH 2.9. Antibodies were desalted in PBS S0rensens (59.5 mM KH2PO4, 7.3 mM Na 2 HPO 4 -2H 2 O, 145.4 mM NaCl (pH ~5.8)) using PD-10 columns (GE Healthcare).
1.5. Экспрессия антитела и связывание антигена, как определено при помощи SPR (поверхностный плазмонный резонанс).1.5. Antibody expression and antigen binding as determined by SPR (Surface Plasmon Resonance).
Используя сенсорные чипы СМ5 (GE Healthcare), протеин A (Pierce) был соединен с поверхностью чипа с использованием набора для аминного сопряжения (GE Healthcare). Протеин А был соединен с проточной кюветой 1 и 2 (или альтернативно 3 и 4) с использованием BIACORE® T200. Супернатанты из клеток EXPI-293®, содержащие антитело или альтернативно очищенные антитела (как описано в 1.4), пропускали через поверхность проточной кюветы 2, тогда как буфер (HBS-EP) пропускали через проточную кювету 1. Количество супернатанта или очищенного белка (а также концентрация), вводимое во время стадии захвата, варьировалось между прогонами и указано в заголовке табл. 3-11. В конце введения супернатанта или очищенного антитела измеряли изменение в единицах ответа. Это значение было указано как уровень захвата в табл. 3-11. Чтобы определить, является ли TL1A связанным с антителом, TL1A затем пропускали через проточные кюветы 1 и 2, а единицы ответа измеряли до конца введения TL1A (фаза ассоциации). Это значение обозначается как уровень связывания TL1A (раннего) в табл. 3-11.Using CM5 sensor chips (GE Healthcare), protein A (Pierce) was coupled to the surface of the chip using an amine coupling kit (GE Healthcare). Protein A was coupled to flow cell 1 and 2 (or alternatively 3 and 4) using BIACORE® T200. Supernatants from EXPI-293® cells containing antibody or alternatively purified antibodies (as described in 1.4) were passed over the surface of flow cell 2, while buffer (HBS-EP) was passed through flow cell 1. Amount of supernatant or purified protein (as well as concentration) administered during the capture step varied between runs and is indicated in the header of the table. 3-11. At the end of administration of the supernatant or purified antibody, the change in response units was measured. This value was indicated as the level of capture in the table. 3-11. To determine if TL1A is antibody bound, TL1A is then passed through flow cells 1 and 2 and response units are measured until the end of TL1A administration (association phase). This value is referred to as the level of binding TL1A (early) in table. 3-11.
- 18 042971- 18 042971
Единицы ответа измеряли до окончания фазы диссоциации. Это значение помечено как уровень связывания TL1A (позднего) в табл. 3-11 и является мерой количества антитела, которое было потеряно с поверхности чипа в результате диссоциации комплекса TL1A-антитела. Сенсограммы были дважды стандартизированы (проточная кювета 2 вычитается из проточной кюветы 1 и контрольного буфера). Поскольку для скрининга имелось большое количество вариантов антител, их проверяли в разных прогонах (табл. 3-11). В каждом случае (кроме прогона 3) для сравнения было включено исходное антитело 320-179. Ниже приводится краткое описание условий, используемых в каждом прогоне.Response units were measured until the end of the dissociation phase. This value is labeled as the level of binding TL1A (late) in table. 3-11 and is a measure of the amount of antibody that has been lost from the surface of the chip as a result of dissociation of the TL1A-antibody complex. Sensorgrams were double standardized (flow cell 2 subtracted from flow cell 1 and control buffer). Since a large number of antibody variants were available for screening, they were tested in different runs (Tables 3-11). In each case (except run 3), the parent antibody 320-179 was included for comparison. Below is a brief description of the conditions used in each run.
Таблица 1Table 1
* Этот прогон был выполнен на Biacore® A100.* This run was performed on Biacore® A100.
Связывание антитела против TL1A с различными видами TL1A также определяли с использованием SPR. Антитело против TL1A захватывали на поверхности протеина А. TL1A от человека, крысы, мыши, кролика, морской свинки, обезьяны свиньи, собаки, кошки или яванского макака пропускали по поверхности и измеряли единицы ответа.Binding of anti-TL1A antibody to various TL1A species was also determined using SPR. Anti-TL1A antibody was captured on the surface of protein A. TL1A from human, rat, mouse, rabbit, guinea pig, monkey, pig, dog, cat, or cynomolgus monkey was passed over the surface and response units were measured.
1.6. Получение TL1A.1.6. Getting TL1A.
TL1A человека получали в системе экспрессии для млекопитающего EXPI293®, используя конструкцию экспрессии ДНК, кодирующую внеклеточный домен (ECD) TL1A человека с N-концевым HIS иHuman TL1A was generated in the EXPI293® mammalian expression system using a DNA expression construct encoding the extracellular domain (ECD) of human TL1A with an N-terminal HIS and
- 19 042971 меткой FLAG. Другие виды форм TL1A были созданы на основе перечня последовательностей из общедоступных баз данных. Они приведены ниже.- 19 042971 labeled FLAG. Other types of TL1A forms have been created based on sequence listings from public databases. They are listed below.
Таблица 2table 2
Супернатант культуры, содержащий секретируемый белок TL1A, собирали центрифугированием при 2000xg в течение 10 мин для удаления клеток. Белок TL1A очищали из супернатанта с использованием колонки HP HISTRAP® (GE Healthcare). Элюированный белок подвергали буферному обмену в PBS с использованием колонки HILOAD® 16/60 Superdex 200 для препаративной степени чистоты (GE Healthcare) и фракции ~70 кДа, разделяли гель-фильтрацией на колонке HILOAD® 26/60 SUPERDEX® 200 для препаративной степени чистоты (GE Healthcare).The culture supernatant containing secreted TL1A protein was collected by centrifugation at 2000xg for 10 min to remove cells. The TL1A protein was purified from the supernatant using an HP HISTRAP® column (GE Healthcare). The eluted protein was buffer exchanged in PBS using a HILOAD® 16/60 Superdex 200 column for prep grade (GE Healthcare) and a ~70 kDa fraction, separated by gel filtration on a HILOAD® 26/60 SUPERDEX® 200 column for prep grade ( GE Healthcare).
1.7. Анализ активности клеточной линии TF-1.1.7. Analysis of the activity of the TF-1 cell line.
Чтобы определить, какие антитела против TL1A функционально нейтрализуют биологическую активность TL1A, антитела тестировали на их способность нейтрализовать апоптоз, индуцированный TL1A, в линии клеток TF-1. Клеточная линия эритролейкоза человека TF-1 (ATCC: CRL-2003) поддерживали в культуре в стандартных условиях. Клетки TF-1 (7,5х104/лунку) инкубировали в непрозрачных 96-луночных планшетах (Greiner) с 100 нг/мл человеческого TL1A и 10 мкг/мл циклогексимида для индуцирования апоптоза. Тестируемые антитела в концентрации 10 мкг/мл (66,7 нМ) или менее добавляли к планшетам и инкубировали в течение 4-5 ч. Затем индукцию апоптоза оценивали с использованием набора Homogeneous Caspases Kit (Roche) в соответствии с инструкциями производителя.To determine which anti-TL1A antibodies functionally neutralize the biological activity of TL1A, the antibodies were tested for their ability to neutralize TL1A-induced apoptosis in the TF-1 cell line. The human erythroleukemia cell line TF-1 (ATCC: CRL-2003) was maintained in culture under standard conditions. TF-1 cells (7.5x10 4 /well) were incubated in opaque 96-well plates (Greiner) with 100 ng/ml human TL1A and 10 μg/ml cycloheximide to induce apoptosis. Test antibodies at a concentration of 10 μg/ml (66.7 nM) or less were added to the plates and incubated for 4-5 hours. Apoptosis induction was then assessed using the Homogeneous Caspases Kit (Roche) according to the manufacturer's instructions.
Данные были нормализованы по экспрессии в процентах от максимального апоптоза (уровни апоптоза, достигаемые TL1A человека плюс циклогексимид в отсутствии антитела против TL1A).The data were normalized for expression as a percentage of maximum apoptosis (levels of apoptosis achieved by human TL1A plus cycloheximide in the absence of anti-TL1A antibody).
1.8. Селективность к рецепторам у наиболее активных антител.1.8. Receptor selectivity for the most active antibodies.
TL1A связывается как с его родственным сигнальным рецептором DR3, так и с рецепторомприманкой DcR3, который также служит рецептором-приманкой для членов семейства ФНО Fas-L и LIGHT. Антитела оценивали на их способность ингибировать связывание TL1A с его рецепторами в конкурентном ИФА. Химеру DR3/Fc (R&D Systems) или химеру DcR3/Fc (R&D Systems) наносили на 96-луночный планшет (Maxisorp, Nunc) в концентрации 2 мкг/мл. Серийно разведенные тестовые антитела предварительно инкубировали с 1 мкг/мл биотинилированным в одном сайте TL1A человека в течение 30 мин, затем добавляли к лункам, покрытым DR3/Fc или DcR3/Fc. Связанный TL1A был выявлен с использованием стрептавидин-пероксидазы хрена 1:2000 (BD Pharmingen). Данные были нормализованы по экспрессии в виде процента от максимального связывания TL1A с рецептором при отсутствии антитела против TL1A.TL1A binds to both its cognate signaling receptor DR3 and the decoy receptor DcR3, which also serves as a decoy receptor for TNF family members Fas-L and LIGHT. Antibodies were evaluated for their ability to inhibit the binding of TL1A to its receptors in a competitive ELISA. DR3/Fc chimera (R&D Systems) or DcR3/Fc chimera (R&D Systems) were applied to a 96-well plate (Maxisorp, Nunc) at a concentration of 2 μg/ml. Serially diluted test antibodies were pre-incubated with 1 μg/ml biotinylated at one site human TL1A for 30 min, then added to wells coated with DR3/Fc or DcR3/Fc. Bound TL1A was detected using streptavidin-horseradish peroxidase 1:2000 (BD Pharmingen). Data were normalized for expression as a percentage of maximum TL1A receptor binding in the absence of anti-TL1A antibody.
1.9. Анализ кинетического исключения.1.9. Kinetic exclusion analysis.
Этим анализом измеряют свободную концентрацию одного из партнеров по связыванию без нарушения равновесия. Растворы могут быть приготовлены в автономном режиме с использованием немодифицированных белков в растворе, а значения измерения аффинности можно считать через несколько суток после смешивания, чтобы обеспечить достижение равновесия. В анализе кинетического исключения один интерактант (называемый постоянным связывающим партнером, или СВР) удерживается в постоянной концентрации, а другой (называемый титрантом) разводится последовательно. Анализы кинетического исключения могут быть использованы для определения константы диссоциации (KD) и аффинности взаимодействия антитело-антиген. В типичном анализе кинетического исключения титрант иммобилизуют на шарики (например, шарики сефарозы или ПММА (полиметилметакрилат)) и используют для захвата свободного СВР в растворе. Затем вторичный меченый зонд используется для количе- 20 042971 ственной оценки количества захваченного СВР. Анализ кинетического исключения описан в Darling,This assay measures the free concentration of one of the binding partners without disturbing the equilibrium. Solutions can be prepared offline using unmodified proteins in solution, and affinity measurements can be read several days after mixing to ensure equilibrium is reached. In a kinetic exclusion assay, one interactant (called a constant binding partner, or CBP) is held at a constant concentration and the other (called a titrant) is diluted sequentially. Kinetic exclusion assays can be used to determine the dissociation constant (K D ) and affinity of the antibody-antigen interaction. In a typical kinetic exclusion assay, a titrant is immobilized onto beads (eg Sepharose or PMMA (polymethyl methacrylate) beads) and used to capture free CBP in solution. A secondary labeled probe is then used to quantify the amount of captured CBP. Kinetic exclusion analysis is described in Darling,
RK et al. (2004), ASSAY and Drug Development Technol., 2(6):647-57.RK et al. (2004), ASSAY and Drug Development Technol., 2(6):647-57.
Компоненты объединяли и позволяли им достичь равновесия. Затем для количественной оценки свободной фракции СВР использовали кинетический анализ исключения. Кривые равновесия с несколькими концентрациями СВР анализировали с использованием метода анализа n-кривой в программном обеспечении KinExA® Pro (версия 4.1.11, Sapidyne) для получения надежных значений KD. Взаимодействие 320-587 для TL1A человека исследовали с использованием двух направлений:The components were combined and allowed to reach equilibrium. Exclusion kinetic analysis was then used to quantify the free fraction of CBP. Equilibrium curves with several concentrations of CBP were analyzed using the n-curve analysis method in the KinExA® Pro software (version 4.1.11, Sapidyne) to obtain reliable K D values. Interaction 320-587 for human TL1A was investigated using two directions:
(1) СВР представляет собой 320-587, титрант представляет собой TL1A;(1) CBP is 320-587, titrant is TL1A;
(2) СВР представляет собой TL1A, титрант представляет собой 320-587.(2) CBP is TL1A, titrant is 320-587.
Пример 2. Результаты эксперимента.Example 2. Results of the experiment.
2.1. Выбор TL1A-связывающих вариантов с эквивалентной или улучшенной скоростью диссоциации по сравнению С320-179.2.1. Selection of TL1A-binding variants with equivalent or improved dissociation rate compared to C320-179.
Варианты антител 320-179 были сконструированы и экспрессированы, как описано выше. Супернатанты EXPI293® (Life Technologies Corp.) каждого варианта оценивали при помощи BIACORE® (GE Healthcare) и полученные данные сравнивали с данными исходного антитела 320-179. В отдельном эксперименте антитела очищали с использованием хроматографии на протеине А (см. 1.4) и в экспериментах BIACORE® (GE Healthcare) использовали очищенные антитела. В табл. 3-11 показан уровень экспрессии каждого варианта, а также их связывание с TL1A в ранний и поздний момент времени. В более поздних сериях (табл. 10 и 11) тестировали варианты антител, содержащие более одной аминокислотной замены.Antibody variants 320-179 were constructed and expressed as described above. The EXPI293® (Life Technologies Corp.) supernatants of each variant were evaluated by BIACORE® (GE Healthcare) and compared with the parent antibody 320-179. In a separate experiment, antibodies were purified using protein A chromatography (see 1.4) and purified antibodies were used in the BIACORE® experiments (GE Healthcare). In table. 3-11 shows the level of expression of each variant, as well as their binding to TL1A at an early and late time point. In later series (Tables 10 and 11), antibody variants containing more than one amino acid substitution were tested.
Таблица 3Table 3
Эксперимент SPR - прогон 1 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 1 anti-TL1A antibody binding to TL1A
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
- 21 042971- 21 042971
Таблица 4Table 4
Эксперимент SPR - прогон 2 - антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 2 - anti-TL1A antibodies binding to TL1A
- 22 042971- 22 042971
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
Таблица 5Table 5
Эксперимент SPR - прогон 3 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 3 anti-TL1A antibodies binding to TL1A
- 23 042971- 23 042971
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
Таблица 6Table 6
Эксперимент SPR - прогон 4 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 4 anti-TL1A antibodies binding to TL1A
- 24 042971- 24 042971
- 25 042971- 25 042971
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
Таблица 7Table 7
Эксперимент SPR - прогон 5 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 5 anti-TL1A antibodies binding to TL1A
- 26 042971- 26 042971
- 27 042971- 27 042971
Таблица 8Table 8
Эксперимент SPR - прогон 6 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 6 anti-TL1A antibodies binding to TL1A
- 28 042971- 28 042971
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
Таблица 9Table 9
Эксперимент SPR - прогон 7 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 7 anti-TL1A antibodies binding to TL1A
- 29 042971- 29 042971
- 30 042971- 30 042971
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
Таблица 10Table 10
Эксперимент SPR - прогон 8 - антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 8 - anti-TL1A antibodies binding to TL1A
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
- 31 042971- 31 042971
Таблица 11Table 11
Эксперимент SPR - прогон 9 антитела против TL1A, связывающиеся с TL1ASPR experiment - run 9 anti-TL1A antibodies binding to TL1A
* указывает на антитела, которые были выбраны для анализа активности.* indicates the antibodies that were selected for the activity assay.
Антитела, которые имели уровни захвата, сходные или лучше, чем у 320-179, а также значения уровня связывания TL1A (раннего) и уровня связывания TL1A (позднего), которые были в подобном диапазоне, были взяты для анализа активности. Эти варианты указаны штриховкой в табл. 3-11. Сравнение скорости диссоциации, измеренной при помощи SPR для нескольких антител, показано на фиг. 5. Некоторые из антител диссоциировали с меньшей скоростью, чем исходное антитело 320-179.Antibodies that had capture levels similar to or better than 320-179, as well as TL1A binding level (early) and TL1A binding level (late) values that were in a similar range, were taken for activity analysis. These options are indicated by shading in Table. 3-11. A comparison of dissociation rates measured by SPR for several antibodies is shown in FIG. 5. Some of the antibodies dissociated at a slower rate than the parent antibody 320-179.
2.2. Антитела против TL1A с улучшенной активностью в клеточном анализе.2.2. Anti-TL1A antibodies with improved activity in cell assay.
Для определения того, коррелируют ли улучшенная скорость диссоциации с усиленной активностью очищенного антитела, варианты исследовали в анализе TL1A-индуцированной активности каспазы в клетках TF-1. Эффективные антитела действуют путем связывания с TL1A и ингибируют активацию TL1A рецептора DR3. Этот рецептор запускает путь апоптоза, в котором каспазы активируются и могут быть обнаружены с использованием коммерческих реагентов. В каждом эксперименте вариант антитела сравнивали с 320-179 по кратности улучшения активности. Результаты приведены в табл. 12.To determine if the improved dissociation rate correlates with increased activity of the purified antibody, the variants were examined in a TL1A-induced caspase activity assay in TF-1 cells. Effective antibodies act by binding to TL1A and inhibit TL1A activation of the DR3 receptor. This receptor triggers an apoptotic pathway in which caspases are activated and can be detected using commercial reagents. In each experiment, the antibody variant was compared with 320-179 fold improvement in activity. The results are shown in table. 12.
Таблица 12Table 12
Анализ TL1A-индуцированной каспазной активности в клетках TF-1. Ингибирование антителами против TL1AAnalysis of TL1A-induced caspase activity in TF-1 cells. Inhibition by anti-TL1A antibodies
- 32 042971- 32 042971
** Для нескольких антител с кратностью улучшения, превышающей 10-кратное повышение в активности, проводили до n=7 анализов. Результаты соответствовали данным, приведенным в этой таблице. На фиг. 7 показаны n=4 повторов нескольких антител с улучшенной активностью по сравнению с 320-179.** For several antibodies with a fold improvement greater than a 10-fold increase in activity, up to n=7 analyzes were performed. The results were consistent with the data given in this table. In FIG. 7 shows n=4 repeats of several antibodies with improved activity compared to 320-179.
Как показано в табл. 12 и на фиг. 6, некоторые из тестируемых антител с одной заменой обладают превосходной активностью по сравнению с 320-179. Из всех тестируемых вариантов антитела с одной заменой два имели более чем 10-кратное повышение активности по сравнению с 320-179. Этими вариантами являлись 320-331 (который содержал замену Y91W в вариабельной области легкой цепи) и 320-547 (который содержал замену N56Y в вариабельной области тяжелой цепи) (фиг. 6). Этот результат является неожиданным, поскольку, как правило, CDR3 VH антитела преимущественно участвует в связывании антител, тогда как наоборот замена N56Y оказывает существенное влияние на связывание в CDR2 VH антитела. Когда были сделаны варианты с Y91W из VL или отдельно N56Y в VH с другими заменами, которые улучшали активность, были получены высокоактивные антитела. Когда замена Y91W в VL была объединена с заменой N56Y в VH в одном антителе, 320-587, кратность увеличения активности по сравнению с 320-179 составляла 40. На фиг. 7 показаны четыре разных повторных эксперимента, демонстри- 33 042971 рующих увеличение активности четырех антител 320-587, 320-591, 320-592 и 320-601 по сравнению сAs shown in Table. 12 and in FIG. 6, some of the single substitution antibodies tested have superior activity compared to 320-179. Of all single substitution antibody variants tested, two had more than a 10-fold increase in potency compared to 320-179. These variants were 320-331 (which contained the Y91W substitution in the light chain variable region) and 320-547 (which contained the N56Y substitution in the heavy chain variable region) (FIG. 6). This result is unexpected because, as a rule, the VH CDR3 of the antibody is predominantly involved in antibody binding, while, conversely, the N56Y substitution has a significant effect on binding to the VH CDR2 of the antibody. When variants were made with Y91W from VL or N56Y alone in VH with other substitutions that improved activity, highly active antibodies were obtained. When the Y91W change in VL was combined with the N56Y change in VH in one antibody, 320-587, the fold increase in activity compared to 320-179 was 40. FIG. 7 shows four different replicate experiments demonstrating an increase in the activity of four antibodies 320-587, 320-591, 320-592 and 320-601 compared to
320-179. Последовательности этих антител с повышенной активностью по сравнению с 320-179 показаны на фиг. 3 (вариабельная область тяжелой цепи) и на фиг. 4 (вариабельная область легкой цепи).320-179. The sequences of these antibodies with increased activity compared to 320-179 are shown in FIG. 3 (heavy chain variable region) and FIG. 4 (light chain variable region).
Проведено сравнение активности 320-587 по сравнению с другими ранее описанными антителами против TL1A. Эти ранее описанные антитела включают антитело 1681N, описанное в патенте США № 8642741 (VH представляет собой SEQ ID NO: 18, VL представляет собой SEQ ID NO: 26), антитело VH5/VL1 из публикации США № 2014/0308271 (VH представляет собой SEQ ID NO: 24, VL представляет собой SEQ ID NO: 17), гуманизированное 1В4, как описано в патенте США № 8263743 (VH представляет собой SEQ ID NO: 74, VL представляет собой SEQ ID NO: 75) и 320-168 (также называемое С320-168), как описано в публикации США № 2014/0255302А1 (VH представляет собой SEQ ID NO: 181, VL представляет собой SEQ ID NO: 194). На фиг. 8 показано, что 320.587 обладает превосходной эффективностью в анализе на основе клеток по сравнению с этими ранее описанными антителами, что делает его наиболее эффективным антителом против TL1A.The activity of 320-587 was compared with other previously described antibodies against TL1A. These previously described antibodies include the 1681N antibody described in US Pat. ID NO: 24, VL is SEQ ID NO: 17), humanized 1B4 as described in US Pat. No. 8,263,743 (VH is SEQ ID NO: 74, VL is SEQ ID NO: 75) and referred to as C320-168) as described in US Publication No. 2014/0255302A1 (VH is SEQ ID NO: 181, VL is SEQ ID NO: 194). In FIG. 8 shows that 320.587 has superior cell-based assay performance over these previously described antibodies, making it the most effective anti-TL1A antibody.
2.3. Анализ конкурентного связывания с рецепторами DR3 и DcR3.2.3. Analysis of competitive binding to DR3 and DcR3 receptors.
Антитела, которые проявляли повышенную активность по сравнению с 320-179, подвергали скринингу на их способность ингибировать связывание TL1A с его сигнальным рецептором DR3 или рецептором-приманкой DcR3. Все тестируемые антитела против TL1A показали ингибирование связывания TL1A с DR3 по сравнению с изотипическим контролем (фиг. 9). Это подтверждает, что антитела ингибируют активность TL1A, блокируя взаимодействие TL1A-DR3.Antibodies that showed increased activity compared to 320-179 were screened for their ability to inhibit TL1A binding to its DR3 signaling receptor or DcR3 decoy receptor. All anti-TL1A antibodies tested showed inhibition of TL1A binding to DR3 compared to the isotype control (FIG. 9). This confirms that the antibodies inhibit TL1A activity by blocking the TL1A-DR3 interaction.
В предыдущих экспериментах, описанных в публикации США № 2014/0255302А1 (пример 4), антитело 320-179 (320-179) тестировали в анализе конкурентного связывания с рецепторами и показали, что оно селективно ингибируют связывание TL1A с DR3, но не с DcR3 (фиг. 10). В экспериментах, представленных в данном документе на фиг. 10, снова показано, что 320-179 не ингибирует взаимодействие TL1A-DcR3. Это контрастирует с протестированными улучшенными антителами против TL1A. Антитела с улучшенной активностью в анализе клеток TF-1 (как описано в разделе 2.2), включая антитело 320-587, закономерно ингибировали взаимодействие TL1A-DcR3.In previous experiments described in US Publication No. 2014/0255302A1 (Example 4), antibody 320-179 (320-179) was tested in a competitive receptor binding assay and shown to selectively inhibit TL1A binding to DR3 but not DcR3 ( Fig. 10). In the experiments presented herein in FIG. 10 again shows that 320-179 does not inhibit TL1A-DcR3 interaction. This is in contrast to the improved anti-TL1A antibodies tested. Antibodies with improved activity in the TF-1 cell assay (as described in section 2.2), including antibody 320-587, consistently inhibited TL1A-DcR3 interaction.
Таким образом, исходное антитело 320-179 способно ингибировать взаимодействие TL1A-DR3, но не взаимодействие TL1A-DcR3. Несколько антител с повышенной эффективностью, таких как 320-267 (VH представляет собой SEQ ID NO: 1, VL представляет собой SEQ ID NO: 11), 320-277 (VH представляет собой SEQ ID NO: 1, VL представляет собой SEQ ID NO: 12), 320-278 (VH представляет собой SEQ ID NO 1, VL представляет собой SEQ ID NO: 13) и 320-591 (VH представляет собой SEQ ID NO: 3, VL представляет собой SEQ ID NO: 9) ингибирует взаимодействие TL1a-DR3, но не взаимодействие TL1A-DcR3. Несколько антител с повышенной активностью, таких как 320-331, 320-547, 320-583, 320-584, 320-585, 320-586, 320-587 и варианты этих антител, способны ингибировать взаимодействия как TL1A-DR3, так и TL1A-DcR3.Thus, the parent antibody 320-179 was able to inhibit the TL1A-DR3 interaction but not the TL1A-DcR3 interaction. Several antibodies with improved potency such as 320-267 (VH is SEQ ID NO: 1, VL is SEQ ID NO: 11), 320-277 (VH is SEQ ID NO: 1, VL is SEQ ID NO: 1 : 12), 320-278 (VH is SEQ ID NO: 1, VL is SEQ ID NO: 13) and 320-591 (VH is SEQ ID NO: 3, VL is SEQ ID NO: 9) inhibits interaction TL1a-DR3 but not TL1A-DcR3 interaction. Several antibodies with enhanced activity such as 320-331, 320-547, 320-583, 320-584, 320-585, 320-586, 320-587 and variants of these antibodies are able to inhibit both TL1A-DR3 and TL1A-DcR3.
2.4. Видовая перекрестная реактивность 320-587 была проверена на их способность связываться с рекомбинантно продуцируемым TL1A от разных видов. Антитело связывало TL1A всех испытуемых видов (фиг. 11). Связывание 320-587 с TL1A человека, крысы, морской свинки, собаки, кошки, яванского макака имело медленную скорость диссоциации, что указывало на высокое аффинное взаимодействие. Антитело связывало TL1A мыши и кролика и обладало быстрой скоростью диссоциации.2.4. The species cross-reactivity of 320-587 was tested for their ability to bind to recombinantly produced TL1A from different species. The antibody bound TL1A of all tested species (Fig. 11). Binding of 320-587 to human, rat, guinea pig, dog, cat, cynomolgus monkey TL1A had a slow dissociation rate, indicating a high affinity interaction. The antibody bound mouse and rabbit TL1A and had a fast dissociation rate.
2.5. Доклинические модели эффективности для тестирования антител против TL1A на следующих животных моделях заболевания.2.5. Preclinical performance models for testing anti-TL1A antibodies in the following animal models of the disease.
Астма - аллерген-индуцированная астма. Грызуна (мышь, крысу или морскую свинку) сенсибилизировали внутрикожной инъекцией овальбумина (OVA), особенно OVA, полученного из куриных яиц, с добавлением квасцов, а затем стимулировали по меньшей мере через 2 недели путем опрыскивания распыленным OVA, вызывая симптомы астмы, включая гиперреактивность дыхательных путей, приток эозинофилов и увеличение производства цитокинов (например, Hylkema et al., 2002, Clin. Exp. Immunol., 129:390-96). Такая модель может быть изменена путем повторной стимуляции, чтобы обеспечить профиль более хронической болезни с увеличением ремоделирования дыхательных путей и индукции фиброза (например, Bos et al., 2007, Eur. Respir. J., 30:653-661). Альтернативные аллергены, такие как пылевой клещ, также могут быть использованы (например, Lambert et al., 1998, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157:1991-9). Альтернативно примат, отличный от человека (например, яванский макак), может быть сенсибилизирован и подвергнут стимуляции экзогенным антигеном, таким как Ascaris suum, что приводит к гиперреактивности дыхательных путей, притоку эозинофилов и увеличению продуцирования цитокинов (например, Wegner et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol., 87:835-41).Asthma - allergen-induced asthma. A rodent (mouse, rat, or guinea pig) was sensitized with an intradermal injection of ovalbumin (OVA), especially egg-derived OVA supplemented with alum, and then stimulated at least 2 weeks later by spraying with nebulized OVA, causing asthma symptoms, including respiratory hyperreactivity. pathways, eosinophil influx and increased cytokine production (eg, Hylkema et al., 2002, Clin. Exp. Immunol., 129:390-96). Such a pattern can be modified by restimulation to provide a more chronic disease profile with increased airway remodeling and fibrosis induction (eg, Bos et al., 2007, Eur. Respir. J., 30:653-661). Alternative allergens such as dust mites can also be used (eg, Lambert et al., 1998, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157:1991-9). Alternatively, a non-human primate (e.g., cynomolgus monkey) can be sensitized and challenged with an exogenous antigen such as Ascaris suum, resulting in airway hyperreactivity, eosinophil influx, and increased cytokine production (e.g., Wegner et al., 1991, J. Allergy Clinic Immunol., 87:835-41).
ХОБЛ - воспаление дыхательных путей, вызванных дымом. Грызун (мышь, крыса или морская свинка) будет подвергаться воздействию сигаретного дыма 3-7 раз в неделю в течение как минимум 4 недель, что приводит к легочному заболеванию, сходному с ХОБЛ, которое характеризуется скоплением в легких нейтрофилов, увеличением продукции воспалительных цитокинов, фиброзом легких и легочной гипертензией (например, Davis et al. (2012), PLoS One, 7:e33304). Более тяжелая форма заболевания может быть вызвана внесением повторной бактериальной или вирусной инфекции в легкие во время воздействия дыма (например, Li et al. (2012), Biol. Pharm. Bull., 35:1752-60). Грызуны с ХОБЛ, индуциро- 34 042971 ванным дымом, будут получать лечение антителами против TL1A и проверены на эффективность лечения.COPD is an inflammation of the airways caused by smoke. A rodent (mouse, rat, or guinea pig) will be exposed to cigarette smoke 3-7 times a week for at least 4 weeks, resulting in a pulmonary disease similar to COPD, characterized by accumulation of neutrophils in the lungs, increased production of inflammatory cytokines, fibrosis lungs and pulmonary hypertension (eg, Davis et al. (2012), PLoS One, 7:e33304). A more severe form of the disease may be caused by re-introduction of a bacterial or viral infection into the lungs during smoke exposure (eg, Li et al. (2012), Biol. Pharm. Bull., 35:1752-60). Rodents with smoke-induced COPD will be treated with anti-TL1A antibodies and tested for treatment efficacy.
Легочный фиброз - блеомицин-индуцированный легочный фиброз. Грызун (мышь, крыса или морская свинка) будет получать лечение блеомицином или путем интратрахеальной/интраназальной инстилляции или путем внутривенной инъекции один или два раза в неделю в течение по меньшей мере 3 недель. Эта методика индуцирует значительный и стабильный легочный фиброз (например, Pinart et al. (2009), Resp. Physiol., Neurobiol., 166:41-46). Грызуны с блеомицин-индуцированным легочным фиброзом будут получать лечение антителами против TL1A и будут проверены на эффективность лечения.Pulmonary fibrosis - bleomycin-induced pulmonary fibrosis. The rodent (mouse, rat or guinea pig) will be treated with bleomycin either by intratracheal/nasal instillation or by intravenous injection once or twice a week for at least 3 weeks. This technique induces significant and stable pulmonary fibrosis (eg, Pinart et al. (2009), Resp. Physiol., Neurobiol., 166:41-46). Rodents with bleomycin-induced pulmonary fibrosis will be treated with anti-TL1A antibodies and will be tested for treatment efficacy.
Кистозный фиброз - хорьковая модель с нокаутом CFTR (трансмембранный регулятор кистозного фиброза). У хорьков, гомозиготных по нокаутному гену или с известными мутациями, связанными с болезнью, CFTR (ген, являющийся причиной кистозного фиброза) спонтанно развивается заболевание подобное кистозному фиброзу, характеризующееся обструкцией слизистых оболочек дыхательных путей, ателектазом, интерстициальной пневмонией и повторными легочными инфекциями с прогрессирующей бактериальной колонизацией легких (например, Sun et al. (2014), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 50:502-12). CFTR’/’ хорьки будут получать лечение антителами против TL1a и будут проверены на эффективность лечения.Cystic fibrosis is a CFTR (transmembrane regulator of cystic fibrosis) knockout ferret model. Ferrets homozygous for a knockout gene or with known mutations associated with the disease, CFTR (the gene that causes cystic fibrosis), spontaneously develop a cystic fibrosis-like disease characterized by airway mucosal obstruction, atelectasis, interstitial pneumonia, and recurrent lung infections with progressive bacterial infection. lung colonization (e.g., Sun et al. (2014), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 50:502-12). CFTR’/’ ferrets will be treated with anti-TL1a antibodies and will be tested for effectiveness of the treatment.
Синдром раздраженного кишечника - стресс-индуцированная висцеральная гиперчувствительность. Стресс будут индуцировать у крыс или разлучением новорожденного с матерью (например, Coutinho et al. (2002), Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 282:G307-16), или ограничение двигательных функций взрослых (например, Shen et al. (2010), J. Neurogastroenterol. Motil., 16:281-90). Ожидается, что это приведет к измененной перистальтики толстой кишки и висцеральной гиперчувствительности, подобной той, которая наблюдается у пациентов с IBS. Крысы, подвергнутые стрессу, будут получать лечение антителами против TL1A и будут проверены на эффективность лечения.Irritable bowel syndrome - stress-induced visceral hypersensitivity. Stress will be induced in rats by either separation of the neonate from the mother (eg, Coutinho et al. (2002), Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 282:G307-16), or limitation of adult motor functions (eg, Shen et al. al (2010) J Neurogastroenterol Motil 16:281-90). This is expected to result in altered colonic motility and visceral hypersensitivity similar to that seen in IBS patients. Stressed rats will receive anti-TL1A antibody treatment and will be tested for effectiveness of the treatment.
Ревматоидный артрит - коллаген-индуцированный артрит. Грызун (мышь, крыса или морская свинка) будет иммунизирован и стимулирован коллагеном в адъюванте. У животных развивается двусторонний отек ног и эритема, воспалительный инфильтрат в области суставов и повреждение суставов (например, Bendele et al. (1999), Toxicol. Pathol., 27:134-42). Грызуны с коллагеном-индуцированным артритом будут получать лечение антителами против TL1A и будут проверены на эффективность лечения.Rheumatoid arthritis - collagen-induced arthritis. The rodent (mouse, rat or guinea pig) will be immunized and stimulated with collagen in the adjuvant. Animals develop bilateral leg edema and erythema, joint inflammatory infiltrate, and joint damage (eg, Bendele et al. (1999) Toxicol. Pathol., 27:134-42). Rodents with collagen-induced arthritis will be treated with anti-TL1A antibodies and will be tested for the effectiveness of the treatment.
Эозинофильный эзофагит - интраназальный эозинофильный эзофагит, индуцированный Aspergillus fumigatus. У мышей, подвергшихся повторной интраназальной инстилляции A. fumigatis, развивается выраженная эозинофилия пищевода, эпителиальная дисплазия и гиперплазия и свободные эозинофильные гранулы (например, Mishra et al. (2001), J. Clin. Invest., 107:83-90). Аналогичным образом повторное воздействие аэрозоля с овальбумином в течение двух недель у сенсибилизированных морских свинок вызывает эозинофилию пищевода с инфильтрацией как эозинофилов, так и тучных клеток в эпителиальный слой (например, Liu et al. (2015), Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 308:G482-488). Мышей или морских свинок с эозинофильным эзофагитом будут лечить антителами против TL1A и проверять на эффективность лечения.Eosinophilic esophagitis is intranasal eosinophilic esophagitis induced by Aspergillus fumigatus. Mice subjected to repeated intranasal instillation of A. fumigatis develop marked esophageal eosinophilia, epithelial dysplasia and hyperplasia, and free eosinophilic granules (eg, Mishra et al. (2001), J. Clin. Invest., 107:83-90). Similarly, repeated exposure to ovalbumin aerosol for two weeks in sensitized guinea pigs causes esophageal eosinophilia with infiltration of both eosinophils and mast cells into the epithelial layer (e.g., Liu et al. (2015), Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 308:G482-488). Mice or guinea pigs with eosinophilic esophagitis will be treated with anti-TL1A antibodies and tested for efficacy.
2.6. Использование антител против TL1A при выявлении образцов, содержащих TL1A, антитела согласно раскрытию могут быть использованы для выявления TL1A в образцах человека. 320-587 использовали для выявления TL1A человека, секретируемого из человеческих МКПК, стимулированных иммунными комплексами (фиг. 13) в формате ИФА. 320-587 также использовали для обнаружения популяции человеческих МКПК, которые экспрессируют мембранный TL1A на их поверхности в экспериментах по проточной цитометрии (фиг. 14).2.6. Use of anti-TL1A antibodies in detecting samples containing TL1A, the antibodies of the disclosure can be used to detect TL1A in human samples. 320-587 were used to detect human TL1A secreted from immune complex stimulated human PBMCs (FIG. 13) by ELISA. 320-587 were also used to detect populations of human PBMCs that express membrane TL1A on their surface in flow cytometry experiments (FIG. 14).
2.7. Определение аффинности связывания антитела против TL1A с TL1A человека при помощи анализа кинетического исключения.2.7. Determination of the binding affinity of an anti-TL1A antibody to human TL1A using a kinetic exclusion assay.
Время достижения равновесия с 320-587 как СВР. Сначала измеряли скорость Kon для взаимодействия 320-587/TL1A. Вкратце раствор получали путем смешивания 320-587 и TL1A, а аликвоты удаляли в различные моменты времени в течение 3 ч. Свободный 320-587 был захвачен путем пропускания раствора через колонку, заполненную шариками сефарозы, покрытыми 20 мкг/мл TL1A. Захваченный 320-587 был выявлен с использованием Alexa Fluor® 647-конъюгированного антитела против иммуноглобулина человека (0,5 мкг/мл). Этот анализ повторяли два раза, получая скорости Kon 8,35x105 и 7,45x105 Ms’1 со средней скоростью Kon 7,90x105 Ms’1. Затем скорость Kon использовали для оценки времени, необходимого для достижения равновесия при различных концентрациях 320-587, используя инструмент для получения теоретической кривой связывания, представленный на веб-сайте Sapidyne (www. Sapidyne.com).Time to reach equilibrium from 320-587 as SVR. First, the K on rate for the 320-587/TL1A interaction was measured. Briefly, a solution was prepared by mixing 320-587 and TL1A and aliquots removed at various times over 3 hours. Free 320-587 was captured by passing the solution through a column packed with Sepharose beads coated with 20 μg/ml TL1A. Captured 320-587 was detected using Alexa Fluor® 647-conjugated anti-human immunoglobulin antibody (0.5 μg/ml). This analysis was repeated twice, yielding K on rates of 8.35x105 and 7.45x105 Ms' 1 with an average Kon rate of 7.90x105 Ms' 1 . The Kon rate was then used to estimate the time required to reach equilibrium at various concentrations of 320-587 using the Theoretical Binding Curve tool provided on the Sapidyne website (www. Sapidyne.com).
Определение KD с использованием 320-587 как СВР. СВР, 320-587, разводили в аналитическом буфере (DPBS (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко), дополненном 1 мг/мл BSA (бычий сывороточный альбумин)) до конечных концентраций 15, 50 и 150 пМ. Титрант TL1A человека разбавляли в аналитическом буфере для создания серии концентраций 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 пМ. Используя время достижения равновесия, определенное выше, кривым, которые содержали или 50, или 150 пМ 320-587, позволили прийти к равновесию в инкубаторе при 25°С в течение 2 суток. Кривым, которыеDetermination of K D using 320-587 as CBP. CBP, 320-587, were diluted in assay buffer (DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) supplemented with 1 mg/ml BSA (bovine serum albumin)) to final concentrations of 15, 50 and 150 pM. Human TL1A titrant was diluted in assay buffer to create a series of concentrations of 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 and 3000 pM. Using the equilibration time defined above, curves that contained either 50 or 150 pM 320-587 were allowed to equilibrate in an incubator at 25° C. for 2 days. Curves that
- 35 042971 содержали 15 пМ 320-587, позволили прийти к равновесию в инкубаторе при 25°С в течение 3 суток.- 35 042971 contained 15 pM 320-587, allowed to equilibrate in an incubator at 25°C for 3 days.
После периода уравновешивания свободную фракцию 320-587 в каждой реакции количественно определяли, как описано выше. Значения KD определяли с использованием анализа n-кривой кривых равновесия, генерируемых с 15, 50 и 150 пМ 320-587.After an equilibration period, the free fraction 320-587 in each reaction was quantified as described above. KD values were determined using n-curve analysis of equilibrium curves generated with 15, 50 and 150 pM 320-587.
Время достижения равновесия с TL1A как СВР. Время достижения равновесия в этой ориентации оценивали с использованием Kon для взаимодействия 320-587/TL1A, определенного как описано выше в 2.8. В этом формате свободную фракцию TL1A захватывали путем пропускания раствора через колонку, заполненной шариками ПММА, покрытыми 30 мкг/мл 320-587. Захваченный TL1A был выявлен с использованием антитела против 6x-his DyLight 650 (0,75 мкг/мл). Этот анализ повторяли два раза, получая скорости Kon 6,11x105 и 5,74x105 Ms-1 со средней скоростью Kon 5,93x105 Ms-1.Time to reach equilibrium with TL1A as CVR. The time to equilibrate in this orientation was estimated using K on for the 320-587/TL1A interaction determined as described in 2.8 above. In this format, the free fraction of TL1A was captured by passing the solution through a column packed with PMMA beads coated with 30 μg/ml 320-587. Captured TL1A was detected using anti-6x-his DyLight 650 antibody (0.75 μg/ml). This analysis was repeated two times, obtaining speeds K o n 6.11x105 and 5.74x105 Ms -1 with an average speed K on 5.93x105 Ms -1 .
Определение KD с использованием TL1A как СВР. СВР, человеческий TL1A, разводили в буфере для анализа до конечных концентраций 30, 100 и 300 пМ. Титрант 320-587 разбавляли в аналитическом буфере для создания серии концентраций 0,05, 0,15, 0,5, 1,5, 5, 15, 50, 150, 500, 1500 и 5000 пМ.Determination of K D using TL1A as CVR. CBP, human TL1A, was diluted in assay buffer to final concentrations of 30, 100 and 300 pM. Titrant 320-587 was diluted in assay buffer to create a series of concentrations of 0.05, 0.15, 0.5, 1.5, 5, 15, 50, 150, 500, 1500 and 5000 pM.
Используя время достижения равновесия, определенное выше, всем кривым позволили прийти к равновесию в инкубаторе при 25°C в течение 3 суток. После периода уравновешивания свободную фракцию TL1A в каждой реакции количественно определяли, как описано выше. Значения KD определяли с использованием анализа n-кривой кривых равновесия, генерируемых с 30, 100 и 300 пМ TL1A.Using the equilibration time defined above, all curves were allowed to equilibrate in an incubator at 25° C. for 3 days. After an equilibration period, the free fraction of TL1A in each reaction was quantified as described above. K D values were determined using n-curve analysis of equilibrium curves generated with 30, 100 and 300 pM TL1A.
Хорошее соответствие наблюдали для двух методов KinExA, а также относительно низкой % ошибкой. Значение KD для взаимодействия TL1A с 320-587, определяемое с использованием 320-587 в качестве СВР, составляло 40,97±8,33 пМ (табл. 13), тогда как KD, полученный с использованием TL1A в качестве СВР, составляла 41,52±13,5 пМ (табл. 14).Good agreement was observed for the two KinExA methods, as well as a relatively low % error. The K D value for the interaction of TL1A with 320-587, determined using 320-587 as the CBP, was 40.97 ± 8.33 pM (Table 13), while the K D obtained using TL1A as the CBP was 41.52±13.5 pM (Table 14).
Таблица 13Table 13
Аффинность. Шарики сефарозы, покрытые TL1A; 320-587 как СВРAffinity. Sepharose beads coated with TL1A; 320-587 as SVR
Таблица 14Table 14
Аффинность. Шарики ПММА, покрытые 320-587; TL1A как СВРAffinity. PMMA balls coated 320-587; TL1A as SVR
.0. Доклинические модели эффективности для тестирования антител против TL1a..0. Preclinical performance models for testing antibodies against TL1a.
.0.1. Астма..0.1. Asthma.
Острая овальбумин-индуцированная астма у крыс. Серых крыс сенсибилизировали OVA при помощи и/п инъекции на 0 сутки, а затем стимулировали аэрозолем OVA ежесуточно на 35-42 сутки. Крыс лечили антителом 320-587 или носителем при помощи в/в инъекции на 14, 21, 28 и 35 сутки. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) оценивали на общие и дифференцированные клетки на 43-е сутки. Было обнаружено, что лечение значительно снижает количество эозинофилов в ЖБАЛ (фиг. 15).Acute ovalbumin-induced asthma in rats. Gray rats were sensitized with OVA by i/p injection on day 0 and then stimulated with OVA aerosol daily on days 35-42. Rats were treated with antibody 320-587 or vehicle by iv injection on days 14, 21, 28 and 35. Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was assessed for total and differentiated cells on the 43rd day. Treatment was found to significantly reduce the number of eosinophils in the BAL (FIG. 15).
Хроническая овальбумин-индуцированная астма у крыс. Крыс сенсибилизировали с использованием OVA с добавлением квасцов при помощи и/п инъекции на 0 и 7 сутки, а затем стимулировали аэрозолем с OVA два раза в неделю в течение 3 недель, начиная с 14 и до 31 суток, и 5 суток подряд с 37 по 42 сутки. Животных лечили антителом 320-587 или носителем при помощи в/в инъекций на 24, 29, 34 и 39 сутки. ЖБАЛ оценивали на общие и дифференцированные клетки и панель цитокинов на 43-е сутки. Срезы легких окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и шифф-йодной кислотой (ШИК) и оценивали по ряду патологий. Лечение 320-587 значительно уменьшало эозинофилы и макрофаги ЖБАЛ (фиг. 17А и 17В), ИЛ-4 и ИЛ-13 ЖБАЛ (фиг. 17С), гиперплазию бокаловидных клеток (фиг. 17D) и толщину бронхиального эпителиального слоя (фиг. 17Е) по сравнению с носителем.Chronic ovalbumin-induced asthma in rats. Rats were sensitized with alum-supplemented OVA by i/p injection on days 0 and 7, and then stimulated with OVA aerosol twice a week for 3 weeks from days 14 to 31, and 5 consecutive days from 37 to 31. 42 days. Animals were treated with antibody 320-587 or vehicle by intravenous injection on days 24, 29, 34 and 39. JBAL was assessed for total and differentiated cells and a panel of cytokines on the 43rd day. Lung sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and schiff-iodic acid (PAS) and evaluated for a number of pathologies. Treatment with 320-587 significantly reduced eosinophils and macrophages in BALF (Figs. 17A and 17B), IL-4 and IL-13 in BALF (Fig. 17C), goblet cell hyperplasia (Fig. 17D), and bronchial epithelial layer thickness (Fig. 17E). compared to the carrier.
Острая овальбумин-индуцированная астма у морских свинок. Самцы морских свинок Dunkin Hart- 36 042971 ley были сенсибилизированы овальбумином, после чего им была сделана операция по установке баллонного катетера для измерения функции легких и ранних и поздних астматических реакций. На 16, 20, 24 и 28 сутки животных получали и/п инъекции с антителом 320-587 или носителем. Стимуляция аэрозолем с овальбумином (0,05-0,1%) проводили через 30 мин после последнего лечения. Реактивность дыхательных путей (AHR) к гистамину измеряли за 24 ч до стимуляции, через 6 ч после стимуляции (сразу после ранней астматической реакции) и через 24 ч после стимуляции (сразу после поздней астматической реакции). Природу и продолжительность ранних и поздних астматических реакций также регистрировали путем онлайн-регистрации функции легких в течение всего 24-часового периода. Животных умерщвляли через 25 ч после стимуляции и проводили бронхоальвеолярный лаваж. ЖБАЛ оценивали на общие и дифференцированные клетки. Лечение с помощью 320-587 значительно уменьшало количество как эозинофилов, так и макрофагов в ЖБАЛ (фиг. 16А и 16В), а также улучшение AHR после ранней астматической реакции (фиг. 16С) и общей величину ранней астматической реакции (фиг. 16D) по сравнению с носителем.Acute ovalbumin-induced asthma in guinea pigs. Male Dunkin Hart-36 042971 ley guinea pigs were sensitized to ovalbumin and underwent surgery to insert a balloon catheter to measure lung function and early and late asthmatic reactions. On days 16, 20, 24, and 28, animals received i/p injections with 320-587 antibody or vehicle. Aerosol stimulation with ovalbumin (0.05-0.1%) was performed 30 minutes after the last treatment. Airway reactivity (AHR) to histamine was measured 24 hours before stimulation, 6 hours after stimulation (immediately after an early asthmatic response) and 24 hours after stimulation (immediately after a late asthmatic response). The nature and duration of early and late asthmatic reactions were also recorded by online lung function recording over the entire 24-hour period. Animals were sacrificed 25 h after stimulation and bronchoalveolar lavage was performed. JBAL was evaluated for common and differentiated cells. Treatment with 320-587 significantly reduced both eosinophils and macrophages in the BAL (FIGS. 16A and 16B), as well as improvement in AHR after early asthmatic response (FIG. 16C) and overall magnitude of early asthmatic response (FIG. 16D) by compared to the carrier.
Хроническая овальбумин-индуцированная астма у морских свинок. Самцы морских свинок Dunkin Hartley были сенсибилизированы овальбумином, а через 4 недели после этого стимулировали овальбумином еженедельно в течение 12 недель. Стимуляцию овальбумином (0,05-0,5%) проводили путем ингаляции аэрозольного раствора до тех пор, пока не определили обструкцию дыхательных путей. Животные получали лечение антителом 320-587 или носителем при помощи и/п инъекций каждые 5 суток, начиная с 8-й недели стимуляции овальбумином. Функцию дыхательных путей с помощью реактивности дыхательных путей к гистамину измеряли до первичной стимуляции, за 24 ч до конечной стимуляции и через 6 ч после конечной стимуляции. Несмотря на то что никакого эффекта на AHR, вызванного стимуляцией гистамином, не наблюдали, антитело 320-587 значительно уменьшало аллергическую реакцию на OVA, так как для индуцирования обструкции дыхательных путей были необходимы постепенно возрастающие дозы OVA (фиг. 18).Chronic ovalbumin-induced asthma in guinea pigs. Male Dunkin Hartley guinea pigs were sensitized with ovalbumin and ovalbumin stimulated weekly for 12 weeks 4 weeks thereafter. Stimulation with ovalbumin (0.05-0.5%) was performed by inhalation of an aerosol solution until airway obstruction was determined. Animals were treated with antibody 320-587 or vehicle by i/p injections every 5 days starting from the 8th week of ovalbumin stimulation. Airway function by airway reactivity to histamine was measured before the initial stimulation, 24 hours before the final stimulation, and 6 hours after the final stimulation. Although no effect on AHR induced by histamine stimulation was observed, antibody 320-587 significantly reduced the allergic response to OVA, as gradually increasing doses of OVA were needed to induce airway obstruction (FIG. 18).
Считается, что различия в терапевтическом эффекте антител, наблюдаемом в моделях острой и хронической астмы у морских свинок, являются следствием самой модели. Считается, что в хронической модели степень AHR уменьшается со временем и, соответственно, становится менее чувствительной к лечению. В данной области острая модель обычно используется для наблюдения сложных эффектов реактивности дыхательных путей, а хроническая модель обычно используется для наблюдения сложных эффектов ремоделирования дыхательных путей. Оценки ремоделирования продолжаются. Тем не менее было удивительно наблюдать антитела, имеющие влияние на реакцию на аллерген, хотя на этой стадии антитело практически не влияло на абсолютный AHR (ответ на гистамин), это значительно уменьшило прямой аллергический ответ на антиген.The differences in antibody therapeutic effect observed in guinea pig models of acute and chronic asthma are thought to be a consequence of the model itself. It is believed that in the chronic model, the degree of AHR decreases with time and, accordingly, becomes less responsive to treatment. In this field, the acute model is usually used to observe the complex effects of airway reactivity, and the chronic model is usually used to observe the complex effects of airway remodeling. Remodeling evaluations are ongoing. However, it was surprising to observe antibodies having an effect on the allergen response, although at this stage the antibody had little to no effect on the absolute AHR (histamine response), this greatly reduced the direct allergic response to the antigen.
3.0.2. Воспалительное заболевание кишечника.3.0.2. Inflammatory bowel disease.
TNBS-индуцированный колит у крыс. Крыс получали однократную дозу тринитробензолсульфоновой кислоты в этаноле путем внутриректальной инстилляции. Контрольные животные получали эквивалентный объем этанола. В течение 7 суток у животных развился очаговой колит, характеризующийся изъязвлением толстой кишки с воспалительным инфильтратом и различной степенью фиброза (например, в Wirtz et al. (2007), Nat. Protoc., 2:541-546). Введение 320-587 значительно уменьшило множественные симптомы заболевания, включая толщину толстой кишки (фиг. 12А), количество и тяжесть спаек (фиг. 12В), а также количество и тяжесть стриктур (фиг. 12С), что привело к значительно более легкому течению заболевания, чем у животных, получавших или носитель, или связанное с изотипически сходным нерелевантным антителом (фиг. 12D). Уменьшенный фиброз толстой кишки (фиг. 19) также наблюдали у животных, получавших лечение 320-587.TNBS-induced colitis in rats. Rats received a single dose of trinitrobenzenesulfonic acid in ethanol by intrarectal instillation. Control animals received an equivalent volume of ethanol. Within 7 days, the animals developed focal colitis characterized by colonic ulceration with an inflammatory infiltrate and varying degrees of fibrosis (eg, in Wirtz et al. (2007), Nat. Protoc., 2:541-546). Administration of 320-587 significantly reduced multiple symptoms of the disease, including colonic thickness (Fig. 12A), number and severity of adhesions (Fig. 12B), and number and severity of strictures (Fig. 12C), resulting in a significantly milder course of the disease. than in animals treated with either vehicle or coupled to an isotype-like irrelevant antibody (FIG. 12D). Reduced colonic fibrosis (FIG. 19) was also observed in animals treated with 320-587.
Сравнение болезни через 7 и 14 суток при DNBS-индуцированном колите у крыс. Колит индуцировали, как описано выше, используя динитробензолсульфоновую кислоту (DNBS) вместо TNBS, а крысы, используемые в экспериментах DNBS, были крысами линии Wistar. Животных лечили антителом 320-587 или носителем при помощи в/в инъекций на 1 и 8 сутки. Группы оценивали по колитам на 7 и 14 сутки после введения DNBS и тяжести заболевания между двумя точками времени. Лечение антителом 320-587 имело ограниченный эффект на 7-е сутки, но на 14-е сутки животные, получавшие лечение антителом 320-587, показали значительное улучшение в массе и длине толстой кишки (фиг. 20А), фиброзе (фиг. 20В), воспалительном инфильтрате (фиг. 20С) и повреждении толстой кишки (фиг. 20D). Репрезентативные срезы язвы ободочной кишки (фиг. 20Е) демонстрируют степень восстановления повреждений и уменьшения фиброза через 14 суток. На 7- и 14-е сутки животные, получавшие носитель, имели обширный воспалительный инфильтрат и фиброз со значительной потерей кишечной архитектуры. Напротив, животные, получавшие лечение 320-587, показали значительный воспалительный инфильтрат, фиброз и потерю кишечной архитектуры на 7-е сутки, но эти эффекты в значительной степени изменялись за 14 суток.Comparison of disease after 7 and 14 days in DNBS-induced colitis in rats. Colitis was induced as described above using dinitrobenzenesulfonic acid (DNBS) instead of TNBS, and the rats used in the DNBS experiments were Wistar rats. Animals were treated with antibody 320-587 or vehicle by intravenous injection on days 1 and 8. Groups were assessed for colitis on days 7 and 14 after DNBS administration and disease severity between two time points. Treatment with antibody 320-587 had limited effect on day 7, but on day 14, animals treated with antibody 320-587 showed significant improvement in colonic mass and length (Fig. 20A), fibrosis (Fig. 20B) , inflammatory infiltrate (Fig. 20C), and colonic injury (Fig. 20D). Representative sections of a colonic ulcer (FIG. 20E) demonstrate the extent of damage repair and fibrosis reduction after 14 days. On the 7th and 14th days, the animals treated with the vehicle had an extensive inflammatory infiltrate and fibrosis with a significant loss of intestinal architecture. In contrast, animals treated with 320-587 showed significant inflammatory infiltrate, fibrosis, and loss of intestinal architecture by day 7, but these effects were largely reversed over 14 days.
Различия, наблюдаемые в терапевтических эффектах антител, наблюдаемых в моделях TNBS и DNBS, как полагают, возникли из-за использования различных линий крыс (Sprague-Dawley для TNBS против Wistar для DNBS). У каждой линии крыс есть различия в их ответах на иммунизацию, так что считается, что кинетика их реакции в этих моделях различна. Кроме того, TNBS и DNBS отличаютсяThe differences observed in the therapeutic effects of the antibodies observed in the TNBS and DNBS models are believed to have arisen due to the use of different strains of rats (Sprague-Dawley for TNBS vs. Wistar for DNBS). Each line of rats has differences in their responses to immunization, so it is believed that the kinetics of their response in these models is different. Also, TNBS and DNBS are different
- 37 042971 структурно и, как полагают, вызывают изменения в течении заболевания.- 37 042971 structurally and are believed to cause changes in the course of the disease.
Хронический (21-суточный) DSS-индуцированный колит у крыс. Крысам давали декстран сульфата натрия (DSS) в концентрации 5% мас./об. в питьевой воде в течение 7 суток, затем 2% мас./об. в питьевой воде в течение еще 14 суток. У животных развилась диарея, диффузное воспаление толстой кишки, гиперплазия бокаловидных клеток и повреждение эпителия крипт и язвы (например, Randhawa et al. (2014), Korean J. Physiol. Pharmacol., 18:279-88). Крыс лечили антителом 320-587 или носителем путем внутривенной инъекции на 5, 12 и 19 сутки. Животных взвешивали и оценивали на клинические проявления болезни (диарея и скрытая кровь) ежедневно, а массу и длину толстой кишки оценивали на 21 сутки. Лечение антителом 320-587 существенно изменило DSS-индуцированное замедление прироста веса (фиг. 21А), улучшило клинические симптомы заболевания (фиг. 21В) и улучшило массу и длину толстой кишки (фиг. 21С).Chronic (21-day) DSS-induced colitis in rats. Rats were given dextran sodium sulfate (DSS) at a concentration of 5% w/v. in drinking water for 7 days, then 2% wt./about. in drinking water for another 14 days. The animals developed diarrhea, diffuse inflammation of the colon, goblet cell hyperplasia, and damage to the crypt and ulcer epithelium (eg, Randhawa et al. (2014), Korean J. Physiol. Pharmacol., 18:279-88). Rats were treated with antibody 320-587 or vehicle by intravenous injection on days 5, 12 and 19. Animals were weighed and assessed for clinical manifestations of the disease (diarrhea and occult blood) daily, and the weight and length of the colon was assessed on day 21. Treatment with antibody 320-587 significantly altered DSS-induced weight gain retardation (FIG. 21A), improved clinical symptoms of the disease (FIG. 21B), and improved colonic mass and length (FIG. 21C).
Индукция внутрибрюшинных цитокинов при помощи рекомбинантного TL1A человека. Внутрибрюшинная инъекция рекомбинантного мышиного TL1A может индуцировать продуцирование воспалительных цитокинов, таких как ИЛ-5. В этом исследовании мыши получали разовую дозу или антитела 320-587, или носителя, а через час получали 40 мкг/мышь рекомбинантного TL1A человека (rhTL1A). Через 6 ч после введения rhTL1A получали перитонеальный лаваж и оценивали перитонеальную жидкость на содержание цитокинов и хемокинов с помощью мультиплексного анализа. Лечение антителом 320-587 значительно уменьшало перитонеальные концентрации цитокинов Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), ИЛ-1Ь, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-17 и хемокинов IP-10, KC (хемокина кератиноцитов), МХБ-1 (моноцитарный хемоаттрактантный белок-1), МБВ-1a, МБВ-1Ь, МБВ-2 (МБВ - воспалительный белок макрофагов) (фиг. 22).Induction of intraperitoneal cytokines with recombinant human TL1A. Intraperitoneal injection of recombinant mouse TL1A can induce the production of inflammatory cytokines such as IL-5. In this study, mice received a single dose of either 320-587 antibody or vehicle, and an hour later received 40 μg/mouse of recombinant human TL1A (rhTL1A). Six hours after administration of rhTL1A, peritoneal lavage was obtained and peritoneal fluid was assessed for cytokines and chemokines by multiplex analysis. Treatment with antibody 320-587 significantly reduced peritoneal concentrations of the cytokines G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), IL-1b, IL-5, IL-6, IL-17 and chemokines IP-10, KC (keratinocyte chemokine), MHB-1 ( monocytic chemoattractant protein-1), MMB-1a, MMB-1b, MMB-2 (MBV - macrophage inflammatory protein) (Fig. 22).
Раскрытие изобретения не ограничивается вариантами осуществления, описанными и проиллюстрированными примерами выше, но допускает изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.The disclosure of the invention is not limited to the embodiments described and illustrated by the examples above, but is open to changes and modifications within the scope of the appended claims.
Claims (47)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/220,442 | 2015-09-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA042971B1 true EA042971B1 (en) | 2023-04-11 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220185902A1 (en) | Antibodies That Specifically Bind To TL1A | |
US20220127352A1 (en) | Antibodies that specifically bind to human il-15 and uses thereof | |
JP6548696B2 (en) | Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody | |
KR20140041858A (en) | Interleukin-31 monoclonal antibody | |
KR20210005070A (en) | Galectin-10 antibody | |
US20160159922A1 (en) | Novel Antibodies for the Diagnosis and Treatment of Rheumatoid Arthritis | |
KR20190002644A (en) | FcγRIIA specific binding molecules and uses thereof | |
CN111560071A (en) | Binding molecules specific for IL-21 and uses thereof | |
KR102651290B1 (en) | anti-IL-5 antibody | |
TW202221039A (en) | Antibodies to canine and feline oncostatin m receptor beta and uses thereof | |
TW202041535A (en) | Antibodies targeting c5ar | |
JP6501650B2 (en) | Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody | |
TW202229337A (en) | Canine antibody variants | |
CA3124356A1 (en) | Fn14 antibodies and uses thereof | |
EA042971B1 (en) | ANTIBODIES THAT SPECIFICLY BIND TO TL1A | |
CN118488967A (en) | Galectin-10 antibodies |