EA042698B1 - NEW GLUTAMINE CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES - Google Patents

NEW GLUTAMINE CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES Download PDF

Info

Publication number
EA042698B1
EA042698B1 EA202192892 EA042698B1 EA 042698 B1 EA042698 B1 EA 042698B1 EA 202192892 EA202192892 EA 202192892 EA 042698 B1 EA042698 B1 EA 042698B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
compounds
administration
cells
intact
Prior art date
Application number
EA202192892
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Владимир Евгеньевич Небольсин
Татьяна Александровна Кромова
Анастасия Владимировна Рыдловская
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента-Интеллект"
Ип Небольсин Владимир Евгеньевич
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента-Интеллект", Ип Небольсин Владимир Евгеньевич filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента-Интеллект"
Publication of EA042698B1 publication Critical patent/EA042698B1/en

Links

Description

Область техникиTechnical field

Данное изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается терапии заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности для терапии заболеваний легких, дыхательных путей и брюшной полости Также настоящее изобретение касается терапии лучевой болезни и болевого синдрома, а так же других заболеваний посредством применения соединений, обладающих эффективностью в ингибировании фермента глутаминилциклазы, вовлеченной, в частности, в процессы пост-трансляционной модификации хемокинов и хемотаксиса клеток иммунной системы.This invention relates to chemistry of organic compounds, pharmacology and medicine and relates to the treatment of diseases associated with aberrant activity of cells of the immune system, in particular for the treatment of diseases of the lungs, respiratory tract and abdominal cavity. Also, the present invention relates to the treatment of radiation sickness and pain syndrome, as well as other diseases through the use of compounds that are effective in inhibiting the enzyme glutaminyl cyclase, which is involved, in particular, in the processes of post-translational modification of chemokines and chemotaxis of cells of the immune system.

Уровень техникиState of the art

Хемотаксис или направленное движение клеток иммунной системы по градиенту концентрации некоторых эндогенных и экзогенных веществ (хемоаттрактантов) является одной из важнейших составных частей функционирования клеток иммунной системы. Избыточный приток клеток иммунной системы как правило вызывает избыточную активность клеток иммунной системы и повреждению окружающих органов и тканей. Понимание участников и процессов, связанных с процессом хемотаксиса, на молекулярном уровне может привести к новым эффективным подходам в лечении и профилактике целого ряда заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы.Chemotaxis or directed movement of cells of the immune system along the concentration gradient of some endogenous and exogenous substances (chemoattractants) is one of the most important components of the functioning of cells of the immune system. An excess influx of immune system cells typically causes overactivity of immune system cells and damage to surrounding organs and tissues. Understanding the participants and processes associated with the process of chemotaxis at the molecular level can lead to new effective approaches in the treatment and prevention of a number of diseases associated with the aberrant activity of immune system cells.

Хемокины семейства CCL (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), являющиеся лигандами рецептора CCR2, являются наиболее мощными факторами хемотаксиса моноцитов и макрофагов в организме млекопитающих (Biochem J. 2012 Mar 1;442(2): 403-12). Хемокины семейства CCL составляют важный класс цитокинов, необходимых для активации нейтрофилов и моноцитов и привлечения этих клеток в очаг воспаления. Однако высокие концентрации хемокинов как правило вызывают избыточный приток клеток иммунной системы. Аберрантная активность клеток иммунной системы может привести к серьезным повреждением окружающих органов и тканей. Например, в ряде случаев продукты окисления липидов могут активировать клетки эндотелия сосудов (интиму), что приводит к выделению CCL2, привлечению макрофагов которые, в свою очередь выделяют маркеры воспаления, провоцирующие повреждение артериальной стенки и развитие атеросклероза (Mol Cell. 1998 Aug; 2(2):275-81; Nature. 1998 Aug 27;394 (6696):894-7). Аналогичную патогенетическую картину можно наблюдать в случае радиационноиндуцированного повреждения тканей дыхательных путей: повреждение и активация клеток эпителия легких и дыхательных путей приводит к выделению CCL2, что в свою очередь вызывает экстравазацию иммунных клеток и циркулирующих опухолевых клеток в легкие и дыхательные пути (Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458).CCL family chemokines (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), which are CCR2 receptor ligands, are the most potent monocyte and macrophage chemotaxis factors in mammals (Biochem J. 2012 Mar 1;442(2): 403-12). Chemokines of the CCL family constitute an important class of cytokines required for the activation of neutrophils and monocytes and the recruitment of these cells to the site of inflammation. However, high concentrations of chemokines tend to cause an overabundance of immune system cells. Aberrant activity of immune system cells can lead to serious damage to surrounding organs and tissues. For example, in some cases, lipid oxidation products can activate vascular endothelial cells (intima), which leads to the release of CCL2, attracting macrophages, which, in turn, release inflammatory markers that provoke damage to the arterial wall and the development of atherosclerosis (Mol Cell. 1998 Aug; 2( 2):275-81 Nature 1998 Aug 27;394(6696):894-7). A similar pathogenetic picture can be observed in the case of radiation-induced damage to respiratory tissues: damage and activation of epithelial cells of the lungs and respiratory tract leads to the release of CCL2, which in turn causes extravasation of immune cells and circulating tumor cells into the lungs and respiratory tract (Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458).

Известна роль хемокинов семейства CCL в патофизиологии целого ряда аутоиммунных и аллергических состояний, опосредованных аберрантной активностью моноцитов CCR2+, CD14+ и CD16lo (ревматоидный артрит, рассеянный склероз). Кроме того, хемокины семейства CCL (в частности CCL2) вовлечены в патогенез ожирения, метаболического синдрома, хронической боли, фиброза, неалкогольной жировой болезни печени и некоторых форм рака.The role of CCL family chemokines in the pathophysiology of a number of autoimmune and allergic conditions mediated by aberrant activity of CCR2+, CD14+ and CD16lo monocytes (rheumatoid arthritis, multiple sclerosis) is known. In addition, CCL family chemokines (particularly CCL2) are implicated in the pathogenesis of obesity, metabolic syndrome, chronic pain, fibrosis, non-alcoholic fatty liver disease, and some forms of cancer.

Подавление аберрантной активности клеток иммунной системы, за счет ингибирования CCLопосредованного хемотаксиса, может быть крайне востребовано для терапии целого круга заболеваний, таких, как острое повреждение легких (ОПЛ), бронхиальная астма, бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких, болезнь Крона, диабетическая нефропатия и т.д.Suppression of the aberrant activity of immune system cells by inhibiting CCL-mediated chemotaxis can be highly demanded for the treatment of a whole range of diseases, such as acute lung injury (ALI), bronchial asthma, bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, Crohn's disease, diabetic nephropathy, etc. .d.

Например, в случае диабетической нефропатии воздействие глюкозы в высоких концентрациях приводит к увеличению секреции CCL2 тубулярными клетками почек, что в свою очередь вызывает миграцию моноцитов (Kidney Int. 2006 Jan; 69(1):73-80). Увеличение концентрации моноцитов в тканях почек и их созревание в макрофаги, вызывает развитие аберрантного ответа ассоциированного с выделением большего количества хемокинов и активных форм кислорода, повреждающих окружающие клетки почек (Mediators Inflamm. 2012; 2012:146154). Повреждение ткани почек приводит к развитию и сохранению аберрантной активности клеток иммунной системы и дальнейшему разрушению тканей почек, а блокада взаимодействия CCL2/CCR2 низкомолекулярными антагонистами снижает выраженность патологии (Nephrol Dial Transplant. 2013 Jul; 28(7):1700-10). Аналогичные процессы характерны для патогенеза неалкогольной жировой болезни печени: накопление жирных кислот в клетках печени приводит к активации сигнального пути NF-кВ и развитию воспалительной реакции, индуцирующей высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 и CCL2. Высвобождение провоспалительных цитокинов приводит к миграции моноцитов в очаг воспаления развитие аберрантного ответа ассоциированного с выделением большего количества хемокинов и активных форм кислорода, повреждающих окружающие клетки (Int J Exp Pathol. 2013 Jun; 94(3): 217-225).For example, in the case of diabetic nephropathy, exposure to high concentrations of glucose leads to increased secretion of CCL2 by renal tubular cells, which in turn causes monocyte migration (Kidney Int. 2006 Jan; 69(1):73-80). An increase in the concentration of monocytes in the tissues of the kidneys and their maturation into macrophages causes the development of an aberrant response associated with the release of more chemokines and reactive oxygen species that damage the surrounding kidney cells (Mediators Inflamm. 2012; 2012:146154). Damage to kidney tissue leads to the development and maintenance of aberrant activity of immune system cells and further destruction of kidney tissues, and blockade of the CCL2/CCR2 interaction by small molecule antagonists reduces the severity of the pathology (Nephrol Dial Transplant. 2013 Jul; 28(7):1700-10). Similar processes are characteristic of the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease: the accumulation of fatty acids in liver cells leads to the activation of the NF-κB signaling pathway and the development of an inflammatory response that induces the release of pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and CCL2. The release of pro-inflammatory cytokines leads to the migration of monocytes to the site of inflammation, the development of an aberrant response associated with the release of more chemokines and reactive oxygen species that damage surrounding cells (Int J Exp Pathol. 2013 Jun; 94(3): 217-225).

Члены семейства CCL (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), фракталкин, а также ряда других гормонов и секретируемых белков, содержат остаток пироглутаминовой кислоты (рЕ), роль которого заключается в защите от деградации аминопептидазами (Chem Immunol. 1999; 72:42-56; Biochemistry. 1999 Oct 5; 38 (40):13013-25). Пироглутаминирование N-концевого остатка катализируется ферментом глутаминилциклазой (QPCT или QC) (J Biol Chem. 2003 Dec 12; 278(50):49773-9; J Mol Biol. 2008 Jun 20; 379(5):966-80). Глутаминилциклаза обладает широкой субстратной специфичностью и участвует в посттрансляционной модификации целого ряда пептидных молекул. В исследованиях субстратной специфичности глутами- 1 042698 нилциклазы было показано, что фермент может катализировать пироглутаминирование различных субстратов, вне зависимости от длинны полипептидной цепи (FEBS Lett. 2004 Apr 9; 563(1-3): 191-6, J BiolMembers of the CCL family (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), fractalkine, as well as a number of other hormones and secreted proteins, contain a pyroglutamic acid residue (pE), whose role is to protect against degradation by aminopeptidases (Chem Immunol. 1999; 72:42- 56 Biochemistry 1999 Oct 5; 38(40):13013-25). Pyroglutamination of the N-terminal residue is catalyzed by the enzyme glutaminyl cyclase (QPCT or QC) (J Biol Chem. 2003 Dec 12; 278(50):49773-9; J Mol Biol. 2008 Jun 20; 379(5):966-80). Glutaminyl cyclase has a broad substrate specificity and is involved in the post-translational modification of a number of peptide molecules. In studies of the substrate specificity of glutamine 1 042698 nylcyclase, it was shown that the enzyme can catalyze the pyroglutamination of various substrates, regardless of the length of the polypeptide chain (FEBS Lett. 2004 Apr 9; 563(1-3): 191-6, J Biol

Chem. 2011 Apr 8; 286(14):12439-49).Chem. 2011 Apr 8; 286(14):12439-49).

В ходе экспериментальных исследований было показано, что ингибирование глутаминилциклаз приводит к резкому снижению хемоаттракторной активности непироглутаминированных форм хемокинов CCL2, CCL7, CCL8 и CCL13 (Biochem. J. (2012) 442, 403-412) и фракталкина (Biosci Rep. 2017 Aug 23; 37(4)). Таким образом ингибиторы глутаминилциклазы очевидно могут применяться для терапии широкого круга заболеваний, и в частности, заболеваний легких и дыхательных путей, таких, как бронхиальная астма, острый и хронический бронхит, фарингит, эмфизема легкого, ринит, риносинусит и хроническая обструктивная болезнь легких. Патогенез указанных заболеваний связан с избыточным производством цитокинов и в частности моноцитарных хемоатрактантных белков CCL2 и CCL7 (Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 Jan; 50(1):144-57) и фракталкина (Expert Opin Ther Targets. 2010 Feb;14(2):207-19), являющихся субстратами глутаминилциклазы (Biosci Rep. 2017 Aug 23; 37(4). pii: BSR20170712; EMBO Mol Med. 2011 Sep; 3(9):545-58). Было показано, что нейтрализации CCL2 и CCL7 с использованием антител значительно уменьшает приток лейкоцитов, моноцитов и нейтрофилов в дыхательные пути экспериментальных животных (Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 Jan; 50(1):144-57).In experimental studies, it was shown that inhibition of glutaminyl cyclases leads to a sharp decrease in the chemoattractor activity of non-pyroglutaminated forms of the chemokines CCL2, CCL7, CCL8 and CCL13 (Biochem. J. (2012) 442, 403-412) and fractalkine (Biosci Rep. 2017 Aug 23; 37(4)). Thus, glutaminyl cyclase inhibitors can obviously be used to treat a wide range of diseases, and in particular diseases of the lungs and respiratory tract, such as bronchial asthma, acute and chronic bronchitis, pharyngitis, emphysema, rhinitis, rhinosinusitis and chronic obstructive pulmonary disease. The pathogenesis of these diseases is associated with excessive production of cytokines and in particular the monocytic chemoattractant proteins CCL2 and CCL7 (Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 Jan; 50(1):144-57) and fractalkine (Expert Opin Ther Targets. 2010 Feb;14( 2):207-19), which are substrates of glutaminyl cyclase (Biosci Rep. 2017 Aug 23; 37(4). pii: BSR20170712; EMBO Mol Med. 2011 Sep; 3(9):545-58). Neutralization of CCL2 and CCL7 using antibodies has been shown to significantly reduce the influx of leukocytes, monocytes and neutrophils into the airways of experimental animals (Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 Jan; 50(1):144-57).

Воздействие бактериальных липополисахаридов, липотейхоевой кислоты или других раздражителей на слизистую оболочку органов дыхательной системы приводит к увеличению секреции CCL2 клетками гладкой мускулатуры бронхов (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012 Apr 15; 302(8):L785-92) и росту концентрации CCL2 в бронхоальвеолярном лаваже (Mol Immunol. 2011 Jul; 48(12-13):1468-76). Увеличение концентрации CCL2 в свою очередь вызывает миграцию эозинофилов, моноцитов и базофилов и развитие аберрантного ответа, ассоциированного с выделением большего количества хемокинов (TNFa, IL-1, IL-6, IL-4) и активных форм кислорода, повреждающих окружающие клетки бронхов и органов дыхания (Immunobiology. 2016 Feb;221(2):182-7; Int J Biol Sci. 2012; 8(9):1281-90; Mol Immunol. 2013 Nov; 56(1-2):57-63). Повреждение бронхов приводит к развитию и сохранению аберрантной активности клеток иммунной системы, и дальнейшему разрушению тканей органов дыхания. В in vivo моделях аллергической астмы блокада взаимодействия CCL2/CCR2 низкомолекулярными антагонистами показала значительную эффективность (Int Arch Allergy Immunol. 2015;1 66(1):52-62).Exposure of bacterial lipopolysaccharides, lipoteichoic acid, or other irritants to the respiratory mucosa results in an increase in CCL2 secretion by bronchial smooth muscle cells (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012 Apr 15; 302(8):L785-92) and an increase in CCL2 concentration in bronchoalveolar lavage (Mol Immunol. 2011 Jul; 48(12-13):1468-76). An increase in the concentration of CCL2, in turn, causes the migration of eosinophils, monocytes and basophils and the development of an aberrant response associated with the release of more chemokines (TNFa, IL-1, IL-6, IL-4) and reactive oxygen species that damage the surrounding cells of the bronchi and organs respiration (Immunobiology. 2016 Feb;221(2):182-7; Int J Biol Sci. 2012; 8(9):1281-90; Mol Immunol. 2013 Nov; 56(1-2):57-63). Damage to the bronchi leads to the development and preservation of aberrant activity of cells of the immune system, and further destruction of respiratory tissues. In in vivo models of allergic asthma, blockade of the CCL2/CCR2 interaction with small molecule antagonists has shown significant efficacy (Int Arch Allergy Immunol. 2015;1 66(1):52-62).

Важно отметить, что CCL2-опосредованное развитие нейтрофильного воспаления развитие аберрантного ответа, ассоциированного с выделением пирогенных цитокинов (TNFa, IL-1, IL-6) приводит к повышению температуры и развитию лихорадки (J Infect Dis. 1999 Mar; 179 Suppl 2:S294-304; Front Biosci. 2004 May 1; 9:1433-49).It is important to note that the CCL2-mediated development of neutrophilic inflammation, the development of an aberrant response associated with the release of pyrogenic cytokines (TNFa, IL-1, IL-6) leads to an increase in temperature and the development of fever (J Infect Dis. 1999 Mar; 179 Suppl 2:S294 -304; Front Biosci. 2004 May 1; 9:1433-49).

Помимо лихорадки и повышенной температуры болевой синдром также является крайне распространенным симптомом различных заболеваний. Очевидно, что снижение выраженности аберрантного ответа ассоциированного ассоциированного с выделением большего количества активных форм кислорода, повреждающих окружающие ткани, само по себе должно приводить к снижению выраженности болевого синдрома. Однако в недавних работах была показана ключевая роль фракталкина в патогенезе хронической боли (J Neurochem. 2017 May; 141(4): 520-531).In addition to fever and fever, pain is also an extremely common symptom of various diseases. Obviously, a decrease in the severity of the associated aberrant response associated with the release of a larger amount of reactive oxygen species that damage the surrounding tissues should in itself lead to a decrease in the severity of the pain syndrome. However, recent studies have shown the key role of fractalkine in the pathogenesis of chronic pain (J Neurochem. 2017 May; 141(4): 520-531).

Ингибиторы глутаминилциклазы могут применяться для терапии различных аутоиммунных заболеваний, в частности ревматоидного артрита и псориаза.Glutaminyl cyclase inhibitors can be used to treat various autoimmune diseases, in particular rheumatoid arthritis and psoriasis.

Фракталкин, является одним из ключевых провоспалительных медиаторов, участвующих в развитии аутоиммунных заболеваний. Взаимодействие между фракталкином и его уникальным рецептором (CX3CR1) индуцирует клеточную адгезию, хемотаксис и выживаемость клеток (Mol Interv. 2010 Oct; 10(5):263-70). Уровень фракталкина повышен у пациентов с ревматоидным артритом (PA) (Mod Rheumatol. 2017 Мау; 27 (3): 392-397) и псориазом (Ann Clin Lab Sci. 2015 Fall; 45(5): 556-61) коррелирует с активностью заболевания. Фракталкин экспрессируется на фибробластоподобных синовиоцитах и эндотелиальных клетках в синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом. При псориазе, высокие уровни продукции фракталкина наблюдаются в дермальных сосочках и у антигенпредставляющих клеток (Br J Dermatol. 2001 Jun; 144(6):1105-13). Экспрессия фракталкина усиливается фактором некроза опухоли-α и интерфероном-γ и при ревматоидном артрите, способствует миграции моноцитов, Т-клеток и предшественников остеокластов в синовиальную ткань (Mod Rheumatol. 2017 May; 27(3):392-397). Повышенная экспрессия фракталкина у дермальных сосочков дает правдоподобное объяснение миграции и накопления Т-клеток в этих местах при псориазе (Br J Dermatol. 2001 Jun; 144(6):1105-13). Фракталкин также индуцирует образование воспалительных медиаторов макрофагами, Т-клетками и фибробластоподобными синовиоцитами. Более того, фракталкин способствует ангиогенезу и остеокластогенезу. В модели коллаген-индуцированного артрита у мышей использование антител к фракталкину позволило существенно облегчить течение патологии (Mod Rheumatol. 2017 May; 27(3): 392-397 ).Fractalkin is one of the key pro-inflammatory mediators involved in the development of autoimmune diseases. The interaction between fractalkine and its unique receptor (CX3CR1) induces cell adhesion, chemotaxis and cell survival (Mol Interv. 2010 Oct; 10(5):263-70). Fractalkine levels are elevated in patients with rheumatoid arthritis (PA) (Mod Rheumatol. 2017 Mau; 27(3): 392-397) and psoriasis (Ann Clin Lab Sci. 2015 Fall; 45(5): 556-61) correlates with activity diseases. Fractalkin is expressed on fibroblast-like synoviocytes and endothelial cells in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis. In psoriasis, high levels of fractalkine production are observed in dermal papillae and in antigen presenting cells (Br J Dermatol. 2001 Jun; 144(6):1105-13). The expression of fractalkine is enhanced by tumor necrosis factor-α and interferon-γ and in rheumatoid arthritis, promotes the migration of monocytes, T cells and osteoclast precursors into the synovial tissue (Mod Rheumatol. 2017 May; 27(3):392-397). Increased expression of fractalkin in dermal papillae provides a plausible explanation for the migration and accumulation of T cells at these sites in psoriasis (Br J Dermatol. 2001 Jun; 144(6):1105-13). Fractalkin also induces the production of inflammatory mediators by macrophages, T cells, and fibroblast-like synoviocytes. Moreover, fractalkine promotes angiogenesis and osteoclastogenesis. In a model of collagen-induced arthritis in mice, the use of antibodies to fractalkine made it possible to significantly alleviate the course of the pathology (Mod Rheumatol. 2017 May; 27(3): 392-397 ).

На основании результатов недавних научных исследований можно утверждать, что ингибирование CCL-опосредованного хемотаксиса является новым перспективным терапевтическим подходом к лечению лучевой болезни (Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458, Int J Radiat Biol. 2015 Jun;91(6):510-8). В моделях на животных было показано, что выраженность радиационноBased on the results of recent scientific studies, it can be argued that inhibition of CCL-mediated chemotaxis is a promising new therapeutic approach to the treatment of radiation sickness (Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458, Int J Radiat Biol. 2015 Jun;91 (6):510-8). In animal models, it has been shown that the severity of radiation

- 2 042698 индуцированной дисфункции сосудов может быть эффективно снижена за счет ингибирования CCLопосредованных сигнальных путей. Использование животных, нокаутных по гену рецептора CCL2, равно как при использовании антагонистов указанного рецептора блокирует радиационно-индуцированное изменение морфологии и деструкцию эндотелиальных клеток, и предотвращает развитие воспаления дыхательных путей непосредственно после радиационного облучения (Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458). Более того, подавление CCL-опосредованных сигнальных путей позволяет существенно снизить выраженность радиационно-индуцированного фиброза легких, являющегося одним из основных отложенных побочных эффектов радиационного облучения.- 2 042698 induced vascular dysfunction can be effectively reduced by inhibiting CCL-mediated signaling pathways. The use of CCL2 receptor knockout animals, as well as the use of antagonists of this receptor, blocks radiation-induced changes in the morphology and destruction of endothelial cells, and prevents the development of airway inflammation immediately after radiation exposure (Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ ars.2017.7458). Moreover, suppression of CCL-mediated signaling pathways can significantly reduce the severity of radiation-induced pulmonary fibrosis, which is one of the main delayed side effects of radiation exposure.

Таким образом, на основании литературных данных можно заключить, что стратегия, направленная на ингибирование глутаминилциклазы, является возможным подходом к лечению аутоиммунных заболеваний, ожирения, заболеваний легких, дыхательных путей и брюшной полости, лучевой болезни и болевого синдрома.Thus, based on the literature data, it can be concluded that a strategy aimed at inhibiting glutaminyl cyclase is a possible approach to the treatment of autoimmune diseases, obesity, diseases of the lungs, respiratory tract and abdominal cavity, radiation sickness and pain syndrome.

К настоящему времени известны ингибиторы глутаминилциклазы, включающие сульфолипиды (WO 2017/046256), производные флавоноидов (Bioorg Med Chem. 2016 May 15; 24(10):2280-6), производные пиридина (US 2015/0291632) и некоторые небольшие молекулы, описанные в работах последнего времени (J Med Chem. 2017 Mar 23; 60(6):2573-2590; WO 2014/193974, US 2015/0291557). Наиболее близкие аналоги соединения, являющегося предметом настоящего изобретения, приведены в публикациях компании Probiodrug Aktiengesellschaft (J Biol Chem. 2003 Dec 12; 278(50):49773-9). В данной работе описаны ингибиторы глутаминилциклазы на основе производных имидазола. Однако в структурах соединений, опубликованных компанией Probiodrug Aktiengesellschaft, имидазол содержит алифатический заместитель по одному из атомов азота имидазольного цикла. Введение алифатического заместителя снижает метаболическую стабильность соединений. Кроме того, введение алифатического заместителя увеличивает гидрофобность соединений и облегчает проникновение соединения через гематоэнцефалический барьер, что явно излишне для подавления аберрантной активности клеток иммунной системы и потенциально может привести к возникновению побочных эффектов.Glutaminyl cyclase inhibitors are currently known, including sulfolipids (WO 2017/046256), flavonoid derivatives (Bioorg Med Chem. 2016 May 15; 24(10):2280-6), pyridine derivatives (US 2015/0291632) and some small molecules, described in recent works (J Med Chem. 2017 Mar 23; 60(6):2573-2590; WO 2014/193974, US 2015/0291557). The closest analogues of the compound that is the subject of the present invention are given in the publications of the company Probiodrug Aktiengesellschaft (J Biol Chem. 2003 Dec 12; 278(50):49773-9). This paper describes glutaminylcyclase inhibitors based on imidazole derivatives. However, in the structures of the compounds published by Probiodrug Aktiengesellschaft, imidazole contains an aliphatic substituent at one of the nitrogen atoms of the imidazole ring. The introduction of an aliphatic substituent reduces the metabolic stability of the compounds. In addition, the introduction of an aliphatic substituent increases the hydrophobicity of the compounds and facilitates the penetration of the compound through the blood-brain barrier, which is clearly unnecessary for suppressing the aberrant activity of immune system cells and can potentially lead to side effects.

На сегодняшний день нет ни одного препарата, действующего как ингибитор глутаминилциклазы, который бы применяли в терапии заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, поэтому сохраняется потребность в создании и внедрении для использования в терапии новых эффективных лекарственных средств на основе ингибиторов глутаминилциклазы.To date, there is not a single drug that acts as an inhibitor of glutaminyl cyclase, which would be used in the treatment of diseases associated with the aberrant activity of immune system cells, therefore, there is still a need to create and introduce new effective drugs based on glutaminyl cyclase inhibitors for use in therapy.

Данное изобретение касается применения химических соединений, обладающего эффективностью в ингибировании глутаминилциклазы, в терапии заболеваний дыхательных путей и брюшной полости, лучевой болезни и различных видов болевого синдрома, а также других заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы.This invention relates to the use of chemical compounds effective in inhibiting glutaminyl cyclase in the treatment of diseases of the respiratory tract and abdominal cavity, radiation sickness and various types of pain syndrome, as well as other diseases associated with aberrant activity of cells of the immune system.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей настоящего изобретения является разработка новых лекарственных средств, являющихся ингибиторами глутаминилциклазы и эффективных для лечения заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в особенности заболеваний легких, дыхательных путей и брюшной полости, лучевой болезни и болевого синдрома, а также прочих заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы.The objective of the present invention is to develop new drugs that are inhibitors of glutaminyl cyclase and effective for the treatment of diseases associated with aberrant activity of cells of the immune system, in particular diseases of the lungs, respiratory tract and abdominal cavity, radiation sickness and pain syndrome, as well as other diseases associated with aberrant activity of cells of the immune system.

Техническим результатом данного изобретения является разработка и получение эффективных ингибиторов глутаминилциклазы, характеризующихся высокой ингибирующей активностью, позволяющей использовать данные ингибиторы для лечения заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности заболеваний легких и дыхательных путей, таких как бронхиальная астма, острый и хронический бронхит, фарингит, ринит (в частности аллергический ринит), риносинусит, хроническая обструктивная болезнь легких и ее проявления (в частности эмфизема легкого, бронхиальная обструкция); заболеваний органов брюшной полости, таких как болезнь Крона, язвенный колит, перитониты и нефропатии (в частности диабетической нефропатии) ; лучевой болезни и болевого синдрома, а так же прочих заболеваний связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы.The technical result of this invention is the development and production of effective inhibitors of glutaminyl cyclase, characterized by high inhibitory activity, allowing the use of these inhibitors for the treatment of diseases associated with aberrant activity of immune system cells, in particular diseases of the lungs and respiratory tract, such as bronchial asthma, acute and chronic bronchitis , pharyngitis, rhinitis (in particular allergic rhinitis), rhinosinusitis, chronic obstructive pulmonary disease and its manifestations (in particular pulmonary emphysema, bronchial obstruction); diseases of the abdominal cavity, such as Crohn's disease, ulcerative colitis, peritonitis and nephropathy (in particular diabetic nephropathy); radiation sickness and pain syndrome, as well as other diseases associated with aberrant activity of immune system cells, in particular with aberrant chemotaxis of immune system cells.

Указанный технический результат достигается путем применения соединений формулы (А)The specified technical result is achieved by using compounds of formula (A)

в которойwherein

R1 представляет собой группу -C(O)-R2-C (О) - или -R2-C(O)-, где R2 представляет собой группу -(СН2)п-, необязательно замещенную одним или двумя C16-алкилами, или фенил, n представляет собой целое число от 0 до 4;R 1 is -C(O)-R 2 -C(O)- or -R 2 -C(O)-, where R 2 is -(CH 2 ) p - optionally substituted with one or two C 1 -C 6 -alkyl, or phenyl, n is an integer from 0 to 4;

при этом указанные соединения формулы (А) выбраны из группы, состоящей из любого из соединений I-Х и их комбинацийwherein said compounds of formula (A) are selected from the group consisting of any of compounds I-X and combinations thereof

- 3 042698- 3 042698

или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов, сольватов, в качестве ингибиторов глутаминилциклазы.or their pharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates, as glutaminyl cyclase inhibitors.

Указанный технический результат достигается также посредством применения соединений формулы (А), выбранных из любого из соединений I-Х или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов, сольватов для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с активностью глутаминилциклазы.This technical result is also achieved by using compounds of formula (A) selected from any of the compounds IX or their pharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates to obtain a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of a disorder associated with glutaminyl cyclase activity.

Указанный технический результат достигается также посредством применения любого из соединений I-Х или их солей, гидратов, сольватов для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы.The specified technical result is also achieved by using any of the compounds IX or their salts, hydrates, solvates to obtain a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of a disorder associated with aberrant activity of immune system cells, in particular with aberrant chemotaxis of immune system cells.

Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с активностью глутаминилциклазы и/или с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы, и характеризующиеся тем, что они содержит эффективное количество соединения по изобретению и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах воплощениях изобретения вспомогательное вещество представляет собой фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.In addition, the invention provides pharmaceutical compositions for the prevention and/or treatment of a disorder associated with glutaminyl cyclase activity and/or aberrant activity of cells of the immune system, in particular with aberrant chemotaxis of cells of the immune system, and characterized in that they contain an effective amount of a compound according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the excipient is a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient.

Изобретение также включает способ предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с активностью глутаминилциклазы в организме, включающий введение в указанный организм фармацевтической композиции по изобретению. Такое расстройство, связанное с активностью глутаминилциклазы, представляет собой заболевание, связанное с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы, в особенности заболевание легких и дыхательных путей. В некоторых неограничивающих вариантах воплощения изобретения заболевание легких и дыхательных путей представляет собой бронхиальную астму, острый и хронический бронхит, фарингит, эмфизему легкого, ринит, риносинусит или хроническую обструктивную болезнь легких. В частных случаях воплощения изобретения организм представляет собой человека или животного.The invention also includes a method for preventing and/or treating a disorder associated with glutaminyl cyclase activity in an organism, comprising administering a pharmaceutical composition of the invention to said organism. Such a disorder associated with glutaminyl cyclase activity is a disease associated with aberrant activity of cells of the immune system, in particular, aberrant chemotaxis of cells of the immune system, especially a disease of the lungs and respiratory tract. In some non-limiting embodiments of the invention, the disease of the lungs and respiratory tract is bronchial asthma, acute and chronic bronchitis, pharyngitis, pulmonary emphysema, rhinitis, rhinosinusitis, or chronic obstructive pulmonary disease. In particular cases of embodiment of the invention, the organism is a human or an animal.

Подробное раскрытие изобретенияDetailed disclosure of the invention

Получение соединений I-Х, как и ряда других химических соединений, описано в заявке на изобретение RU 2013/116822. В указанной патентной заявке описаны производные бисамидов дикарбоновых кислот, обладающие способностью к комплексообразованию или хелатированию ионов металлов, а также их применение в качестве средства для профилактики и/или лечения вирусного гепатита, ВИЧинфекции, онкологических, нейродегенеративных, сердечно-сосудистых, воспалительных заболеваний, диабета, геронтологических заболеваний, заболеваний, вызываемых токсинами микроорганизмов, а также алкоголизма, алкогольного цирроза печени, анемии, поздней порфирии, отравлений солями переходных металлов.The preparation of compounds I-X, as well as a number of other chemical compounds, is described in the application for invention RU 2013/116822. This patent application describes derivatives of dicarboxylic acid bisamides with the ability to complex or chelate metal ions, as well as their use as a means for the prevention and/or treatment of viral hepatitis, HIV infection, oncological, neurodegenerative, cardiovascular, inflammatory diseases, diabetes, gerontological diseases, diseases caused by toxins of microorganisms, as well as alcoholism, alcoholic cirrhosis of the liver, anemia, late porphyria, poisoning with transition metal salts.

В ходе исследований специфической фармакологической активности Соединения формулы (А) авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что соединения формулы (А) влияют на хемотаксис клеток иммунной системы. Снижение притока клеток иммунной системы может применяться в терапии целого ряда заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности заболеваний легких и дыхательных путей, таких как бронхиальная астма, острый и хронический бронхит, фарингит, ринит (в частности аллергический ринит), риносинусит, хроническая обструктивная болезнь легких и ее проявления (в частности эмфизема легкого, бронхиальная обструкция); а также заболеваний органов брюшной полости, таких как болезнь Крона, язвенный колит, перитониты и нефропатии (в частности диабетической нефропатии); и лучевой болезни.In the course of studies of the specific pharmacological activity of the Compound of formula (A), the authors of the present invention unexpectedly found that the compounds of formula (A) affect the chemotaxis of cells of the immune system. A decrease in the influx of immune system cells can be used in the treatment of a number of diseases associated with aberrant activity of immune system cells, in particular diseases of the lungs and respiratory tract, such as bronchial asthma, acute and chronic bronchitis, pharyngitis, rhinitis (in particular, allergic rhinitis), rhinosinusitis , chronic obstructive pulmonary disease and its manifestations (in particular, pulmonary emphysema, bronchial obstruction); as well as diseases of the abdominal cavity, such as Crohn's disease, ulcerative colitis, peritonitis and nephropathy (in particular diabetic nephropathy); and radiation sickness.

Поскольку влияние на хемотаксис не может быть предсказано или объяснено способностью соединения к комплексообразованию или хелатированию ионов металлов, была предпринята попытка поискаSince the effect on chemotaxis cannot be predicted or explained by the ability of a compound to complex or chelate metal ions, an attempt was made to find

- 4 042698 возможных терапевтических мишеней. В ходе исследований автора настоящего изобретения обнаружили, что наблюдаемый терапевтический эффект соединений формулы (А) связан со способностью данных соединений подавлять активность глутаминилциклазы. В ходе дальнейших исследований способность подавлять активность глутаминилциклазы была показана также для соединений III, IV, V, VI, VII, VIII,- 4 042698 possible therapeutic targets. During the research of the author of the present invention found that the observed therapeutic effect of the compounds of formula (A) is associated with the ability of these compounds to inhibit the activity of glutaminylcyclase. In the course of further studies, the ability to inhibit the activity of glutaminyl cyclase was also shown for compounds III, IV, V, VI, VII, VIII,

IX и X.IX and X.

Таким образом, Соединения I-Х являются новыми ингибиторами глутаминилциклазы, которые влияют на хемотаксис клеток иммунной системы и могут применяться для терапии заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности заболеваний легких и дыхательных путей, таких как таких как бронхиальная астма, острый и хронический бронхит, фарингит, ринит (в частности, аллергический ринит), риносинусит, хроническая обструктивная болезнь легких и ее проявления (в частности, эмфизема легкого, бронхиальная обструкция); а также заболеваний органов брюшной полости, таких как болезнь Крона, язвенный колит, перитониты и нефропатии (в частности диабетической нефропатии); а также лучевой болезни и болевого синдрома.Thus, Compounds I-X are new inhibitors of glutaminyl cyclase that affect the chemotaxis of cells of the immune system and can be used to treat diseases associated with aberrant activity of immune system cells, in particular diseases of the lungs and respiratory tract, such as bronchial asthma, acute and chronic bronchitis, pharyngitis, rhinitis (particularly allergic rhinitis), rhinosinusitis, chronic obstructive pulmonary disease and its manifestations (particularly emphysema, bronchial obstruction); as well as diseases of the abdominal cavity, such as Crohn's disease, ulcerative colitis, peritonitis and nephropathy (in particular diabetic nephropathy); as well as radiation sickness and pain syndrome.

Термины и определенияTerms and Definitions

Термин Соединение I относится к К,К’-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]оксаламиду, соответствующему следующей структурной формуле:The term Compound I refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]oxalamide corresponding to the following structural formula:

0 ;...........= Y......V 0 ; ...........= Y......V

Термин Соединение II относится к К,К’-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]изофталамиду, соответствующему следующей структурной формуле:The term Compound II refers to K,K'-bis[2-(N-imidazol-4-yl)ethyl]isophthalamide corresponding to the following structural formula:

Термин Соединение III относится к К,К’-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]карбамиду, также представленному структурной формулойThe term Compound III refers to K,K'-bis[2-(N-imidazol-4-yl)ethyl]urea, also represented by the structural formula

Термин Соединение IV относится к К,К'-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]малонамиду, также представленному структурной формулойThe term Compound IV refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]malonamide, also represented by the structural formula

Термин Соединение V относится к К,К'-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]сукцинамиду, также представленному структурной формулойThe term Compound V refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]succinamide, also represented by the structural formula

Термин Соединение VI относится к К,К'-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]глутараимиду, соответствующему следующей структурной формуле:The term Compound VI refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]glutaraimide corresponding to the following structural formula:

Термин Соединение VII относится к К,К'-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]адипамиду, соответствующему следующей структурной формуле:The term Compound VII refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]adipamide corresponding to the following structural formula:

Термин Соединение VIII относится к К,К'-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]-3метилпентанедиамиду, соответствующему структурной формуле:The term Compound VIII refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]-3-methylpentanediamide corresponding to the structural formula:

Термин Соединение IX относится к К,К'-бис[2-(Ш-имидазол-4-ил)этил]-3,3-диметилпентанедиамиду, соответствующему структурной формуле:The term Compound IX refers to K,K'-bis[2-(III-imidazol-4-yl)ethyl]-3,3-dimethylpentanediamide corresponding to the structural formula:

- 5 042698- 5 042698

Термин Соединение X относится к N,N'-бис[2-(1Н-имидазол-4-ил)этил]терефталамиду, соответствующему следующей структурной формуле:The term Compound X refers to N,N'-bis[2-(1H-imidazol-4-yl)ethyl]terephthalamide corresponding to the following structural formula:

Термин С, когда он используется со ссылкой на температуру, означает стоградусную шкалу или температурную шкалу Цельсия.The term C, when used with reference to temperature, means the centigrade scale or the Celsius temperature scale.

Термин IC5o означает концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование фермента.The term IC5o refers to the concentration of a test compound at which half-maximal enzyme inhibition is achieved.

Термин фармацевтически приемлемые соли или соли включает соли активных соединений, которые получены с помощью относительно нетоксичных кислот. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей могут служить соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная, лимонная или малоновая кислоты, или полученные другими методами, используемыми в данной области, например, с помощью ионного обмена. К другим фармацевтически приемлемым солям относятся адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептанат, гексанат, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат (мезилат), 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, полуфумарат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, птолуолсульфонат (тозилат), ундеканат, валериат и подобные.The term pharmaceutically acceptable salts or salts includes salts of the active compounds which are prepared with relatively non-toxic acids. Examples of pharmaceutically acceptable non-toxic salts are salts formed with inorganic acids such as hydrochloric, hydrobromic, phosphoric, sulfuric and perchloric acids, or with organic acids such as acetic, oxalic, maleic, tartaric, succinic, citric or malonic acids, or obtained by others. methods used in this area, for example, using ion exchange. Other pharmaceutically acceptable salts include adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzenesulfonate, benzoate, bisulfate, borate, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, citrate, cyclopentane propionate, digluconate, dodecyl sulfate, ethanesulfonate, formate, fumarate, glucoheptonate, glycerophosphate, gluconate, hemisulfate, heptanate, hexanate, hydroiodide, 2-hydroxyethanesulfonate, lactobionate, lactate, laurate, lauryl sulfate, malate, maleate, malonate, methanesulfonate (mesylate), 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, nitrate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, pectinate, persulfate, 3-phenylpropionate, phosphate, picrate, pivalate, propionate, hemi-fumarate, stearate, succinate, sulfate, tartrate, thiocyanate, ptoluenesulfonate (tosylate), undecanate, valeriate, and the like.

Термин сольват используется для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение по изобретению и одну или более молекул фармацевтически приемлемого растворителя, например этанола. Термин гидрат используется, когда указанным растворителем является вода.The term solvate is used to describe a molecular complex containing a compound of the invention and one or more pharmaceutically acceptable solvent molecules, such as ethanol. The term hydrate is used when said solvent is water.

Термин аберрантная активность клеток иммунной системы в настоящем документе означает активность, существенно отличающуюся от базового уровня активности клеток иммунной системы в организме при отсутствии патологии. Аберрантная активность может быть вызвана избыточным притоком клеток иммунной системы к органу или ткани, нарушением процессов, приводящих к активации клеток иммунной системы, дерегулированием процессов связанных с гибелью клеток иммунной системы, а также другими факторами.The term aberrant immune system cell activity as used herein means activity that is substantially different from the baseline level of immune system cell activity in the body in the absence of pathology. Aberrant activity can be caused by an excessive influx of immune system cells to an organ or tissue, disruption of processes leading to the activation of immune system cells, deregulation of processes associated with the death of immune system cells, and other factors.

Термин вспомогательное вещество означает любое фармацевтически приемлемое вещество неорганического или органического происхождения, входящее в состав лекарственного препарата или используемое в процессе производства, изготовления лекарственного препарата для придания ему необходимых физико-химических свойств.The term excipient means any pharmaceutically acceptable substance of inorganic or organic origin, which is part of the medicinal product or used in the manufacturing process, the manufacture of the medicinal product to give it the necessary physical and chemical properties.

Термин среда RPMI (англ. Roswell Park Memorial Institute medium) означает среду для культур клеток и тканей. RPMI традиционно используется для выращивания лимфоидных клеток человека. Среда содержит значительное количество фосфата и имеет состав для выращивания в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%.The term RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) means cell and tissue culture medium. RPMI has traditionally been used to grow human lymphoid cells. The medium contains a significant amount of phosphate and is formulated to grow in an atmosphere containing 5% carbon dioxide.

Термин глутаминилциклаза означает фермент аминоацилтрансферазу участвующую в преобразовании N-концевой глутамина в пироглутамин в различных пептидных субстратах. Образование Nконцевого пироглутамата защищает биологически активные пептиды, гормоны и хемокины (например, тиреотропин-высвобождающий гормон, β-хемокиновый лиганд-2) от деградации экзопептидазами и в некоторых случаях может увеличивать аффинность лигандов к их рецепторам.The term glutaminyl cyclase refers to the enzyme aminoacyltransferase involved in the conversion of N-terminal glutamine to pyroglutamine in various peptide substrates. The formation of N-terminal pyroglutamate protects biologically active peptides, hormones, and chemokines (eg, thyrotropin-releasing hormone, β-chemokine ligand-2) from degradation by exopeptidases and, in some cases, can increase the affinity of ligands for their receptors.

Термин хемотаксис означает направленное движение клеток в ответ на химический раздражитель. В основе хемотаксиса лежит способность клетки отвечать на градиент концентрации хемотаксического медиатора. Хемотаксис является тем процессом, благодаря которому клетки иммунной системы покидают сосудистое русло и мигрируют в поврежденную ткань. Ведущую роль в хемотаксисе играют хемотаксические вещества (хемоатрактанты). Одним из наиболее мощных хемоатрактантов для моноцитов и макрофагов является хемокин CCL2.The term chemotaxis refers to the directed movement of cells in response to a chemical stimulus. Chemotaxis is based on the ability of a cell to respond to a concentration gradient of a chemotactic mediator. Chemotaxis is the process by which cells of the immune system leave the vascular bed and migrate to damaged tissue. The leading role in chemotaxis is played by chemotactic substances (chemoattractants). One of the most powerful chemoattractants for monocytes and macrophages is the CCL2 chemokine.

Термины лечение, терапия охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) снижение, б) блокирование (приостановку) течения заболевания, в) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания, г) реверсирование заболевания или состояния, к которому данный термин применяется, или одного или более симптомовThe terms treatment, therapy cover the treatment of pathological conditions in mammals, preferably in humans, and include: a) reduction, b) blocking (suspension) of the course of the disease, c) alleviation of the severity of the disease, i. induction of regression of the disease, d) reversal of the disease or condition to which the term is applied, or one or more symptoms

- 6 042698 данного заболевания или состояния.- 6 042698 of this disease or condition.

Термин профилактика, предотвращение охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у млекопитающих, предпочтительно у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится: а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых еще не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.The term prophylaxis encompasses the elimination of risk factors as well as the prophylactic treatment of subclinical stages of disease in a mammal, preferably in humans, to reduce the likelihood of occurrence of clinical stages of the disease. Patients for prophylactic therapy are selected on the basis of factors that, based on known data, entail an increased risk of clinical stages of the disease compared with the general population. Preventive therapy includes: a) primary prevention and b) secondary prevention. Primary prevention is defined as prophylactic treatment in patients who have not yet reached the clinical stage of the disease. Secondary prevention is the prevention of the recurrence of the same or a similar clinical disease state.

Соединения I-Х перспективны для лечения заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в особенности заболеваний, связанных с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы, в частности для терапии заболеваний легких и дыхательных путей, таких как бронхиальная астма, острый и хронический бронхит, фарингит, ринит (в частности аллергический ринит), риносинусит, хроническая обструктивная болезнь легких и ее проявления (в частности эмфизема легкого, бронхиальная обструкция); заболеваний органов брюшной полости, таких как болезнь Крона, язвенный колит, перитониты и нефропатии (в частности диабетической нефропатии); лучевой болезни и болевого синдрома имеющих как системный, так и локальный характер, в том числе, обусловленных первичными патологическими изменениями, или связанных с различными заболеваниями или длительным приемом некоторых лекарственных препаратов. В некоторых частных вариантах соединения по изобретению могут быть использованы для лечения других заболеваний, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы.Compounds I-X are promising for the treatment of diseases associated with aberrant activity of cells of the immune system, in particular diseases associated with aberrant chemotaxis of cells of the immune system, in particular for the treatment of diseases of the lungs and respiratory tract, such as bronchial asthma, acute and chronic bronchitis, pharyngitis , rhinitis (in particular allergic rhinitis), rhinosinusitis, chronic obstructive pulmonary disease and its manifestations (in particular pulmonary emphysema, bronchial obstruction); abdominal diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis, peritonitis and nephropathies (particularly diabetic nephropathy); radiation sickness and pain syndrome, both systemic and local in nature, including those caused by primary pathological changes, or associated with various diseases or long-term use of certain medications. In some particular embodiments, the compounds of the invention may be used to treat other diseases associated with aberrant activity of cells of the immune system.

Способ терапевтического применения соединенийMethod for Therapeutic Use of the Compounds

Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество одного или нескольких соединений, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.The subject matter of this invention also includes administering to a subject in need of appropriate treatment a therapeutically effective amount of one or more compounds of the invention. By a therapeutically effective amount is meant that amount of one or more compounds administered or delivered to a patient in which the patient is most likely to exhibit the desired response to treatment (prophylaxis). The exact amount required may vary from subject to subject, depending on the age, body weight and general condition of the patient, the severity of the disease, the method of administration of the drug, combination treatment with other drugs, and the like.

Соединения по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая одного или нескольких соединений, может быть введена в организм пациента в любом количестве (предпочтительно, суточная доза действующего вещества составляет до 0,5 г на пациента в сутки, наиболее предпочтительно, суточная доза составляет 5-50 мг/сутки) и любым путем введения (предпочтительно, пероральный путь введения), эффективным для лечения или профилактики заболевания.The compounds of the invention or a pharmaceutical composition containing one or more compounds may be administered to the patient in any amount (preferably, the daily dose of the active substance is up to 0.5 g per patient per day, most preferably, the daily dose is 5-50 mg /day) and by any route of administration (preferably the oral route) effective for the treatment or prevention of the disease.

После смешения лекарственного препарата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных перорально, парентерально, местно и т.п.After mixing the drug with a specific suitable pharmaceutically acceptable carrier at the desired dosage, the compositions constituting the essence of the invention can be administered to humans or other animals orally, parenterally, topically, and the like.

Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, одного или нескольких соединений могут вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема вещества (например, 1-30 дней).The introduction can be carried out as a single, and several times a day, a week (or any other time interval), or from time to time. In addition, one or more compounds may be administered to the patient daily for a period of days (eg 2-10 days) followed by a period without the substance (eg 1-30 days).

В том случае, когда соединения по изобретению используются как часть режима комбинированной терапии, доза каждого из компонентов комбинированной терапии вводится в течение требуемого периода лечения. Соединения, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.When the compounds of the invention are used as part of a combination therapy regimen, the dose of each of the components of the combination therapy is administered during the desired treatment period. The compounds constituting the combination therapy can be administered to the patient both at the same time, in the form of a dosage containing all the components, and in the form of individual dosages of the components.

Фармацевтические композицииPharmaceutical compositions

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат формулы (А), в частности, Соединения I-Х (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с соединением, составляющем суть данного изобретения, и которые не влияют на фармакологическую активность этого соединения, и являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.The invention also relates to pharmaceutical compositions which contain formulas (A), in particular Compounds IX (or a prodrug or other pharmaceutically acceptable derivative) and one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants, diluents and/or excipients, such that may be co-administered to a patient with a compound of the invention that does not interfere with the pharmacological activity of the compound and is non-toxic when administered at doses sufficient to deliver a therapeutic amount of the compound.

Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат одного или нескольких соединений формулы (А) совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, скользящие материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахаPharmaceutical compositions claimed in this invention contain one or more compounds of formula (A) together with pharmaceutically acceptable carriers, which may include any solvents, diluents, dispersions or suspensions, surfactants, isotonic agents, thickeners and emulsifiers, preservatives , binders, sliding materials, etc., suitable for a particular dosage form. Materials that can serve as pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, mono- and oligosaccharides.

- 7 042698 ридами, а также их производными; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые скользящие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.- 7 042698 reads, as well as their derivatives; gelatin; talc; excipients such as cocoa butter and suppository wax; oils such as peanut, cottonseed, safrole, sesame, olive, corn and soybean oils; glycols such as propylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; buffer substances such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic solution, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffer solutions. Other non-toxic compatible lubricants, such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate, as well as colorants, film formers, sweeteners, flavoring and flavoring agents, preservatives and antioxidants may also be included in the composition.

Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определенного пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например для введения в организм орально, местно, ингаляционно, например, в виде ингаляционного спрея, или внутрисосудистым способом, интраназально, подкожно, внутримышечно, а также инфузионным способом, в рекомендованных дозировках.The subject of this invention are also dosage forms - a class of pharmaceutical compositions, the composition of which is optimized for a certain route of administration into the body in a therapeutically effective dose, for example, for administration to the body orally, topically, inhalation, for example, in the form of an inhaled spray, or intravascularly, intranasally, subcutaneously, intramuscularly, and also by infusion method, in the recommended dosages.

Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике.The dosage forms of the present invention may contain formulations prepared by liposome techniques, microencapsulation techniques, nanoformulation techniques, or other techniques known in the pharmaceutical art.

При получении композиции, например в форме таблетки, активное начало смешивают с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, аравийская камедь, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналогичные соединения.In preparing the composition, for example in the form of a tablet, the active principle is mixed with one or more pharmaceutical excipients, such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, silica, gum arabic, mannitol, microcrystalline cellulose, hypromellose or similar compounds.

Таблетки можно покрыть сахарозой, целлюлозным производным или другими веществами, подходящими для нанесения оболочки. Таблетки могут быть получены различными способами, такими как непосредственное сжатие, сухое или влажное гранулирование или горячее сплавление в горячем состоянии.Tablets can be coated with sucrose, a cellulose derivative, or other materials suitable for coating. Tablets can be prepared in a variety of ways, such as direct compression, dry or wet granulation, or hot melting.

Фармацевтическую композицию в форме желатиновой капсулы можно получить, смешивая активное начало с другими веществами и заполняя полученной смесью мягкие или твердые капсулы.A pharmaceutical composition in the form of a gelatin capsule can be obtained by mixing the active principle with other substances and filling the resulting mixture into soft or hard capsules.

Для введения парентеральным путем используются водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные растворы для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутиленгликоль.For parenteral administration, aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile injectable solutions are used, which contain pharmacologically compatible agents, such as propylene glycol or butylene glycol.

Примеры фармацевтических композицийExamples of pharmaceutical compositions

Соединения формулы (А), описанные в данном изобретении, могут быть использованы для профилактики и/или лечения болезней человека, или животных в виде следующих составов (под Веществом понимается Соединение формулы (А)):The compounds of formula (A) described in this invention can be used for the prevention and/or treatment of diseases in humans or animals in the form of the following compositions (substance means the Compound of formula (A)):

Таблетка I мг/таблеткаTablet I mg/tablet

Вещество 0.5Substance 0.5

Микрокристаллическая целлюлоза 66.5Microcrystalline cellulose 66.5

Карбоксиметилкрахмал натрия 2,3Sodium carboxymethyl starch 2.3

Магния стеарат 0.7Magnesium stearate 0.7

Таблетка II мг/таблеткаTablet II mg/tablet

Вещество 5.0Substance 5.0

Микрокристаллическая целлюлоза 62.0Microcrystalline cellulose 62.0

Карбоксиметилкрахмал натрия 2,3Sodium carboxymethyl starch 2.3

Магния стеарат 0.7Magnesium stearate 0.7

Таблетка III мг/таблеткаTablet III mg/tablet

Вещество 50Substance 50

Микрокристаллическая целлюлоза 620Microcrystalline cellulose 620

Карбоксиметилкрахмал натрия 23Sodium carboxymethyl starch 23

Магния стеарат 7Magnesium stearate 7

Таблетка IV мг/таблеткаTablet IV mg/tablet

Вещество 50Substance 50

Лактоза Ph. Eur 223.75Lactose Ph. EUR 223.75

Кроскармеллоза натрия 6.0Croscarmellose sodium 6.0

Кукурузный крахмал 15Cornstarch 15

Поливинилпироллидон (5% моб паста) 2.25Polyvinylpyrolidon (5% mob paste) 2.25

Стеарат магния 3.0Magnesium stearate 3.0

Таблетка V мг/таблеткаTablet V mg/tablet

Вещество 200Substance 200

Лактоза Ph. Eur 182.75Lactose Ph. EUR 182.75

Кроскармеллоза натрия 12.0Croscarmellose sodium 12.0

Кукурузный крахмал (5 об.% паста) 2.25Corn starch (5% vol. paste) 2.25

Стеарат магния 3.0Magnesium stearate 3.0

Капсула мг/капсулаCapsule mg/capsule

- 8 042698- 8 042698

Вещество 10Substance 10

Лактоза Ph. Eur 488.5Lactose Ph. EUR 488.5

Магнезия 1.5Magnesia 1.5

Состав для инъекций I (50 мг/мл)Formulation for injection I (50 mg/ml)

Вещество 5.0% w/vSubstance 5.0% w/v

1М раствор гидроксида натрия 15.0% w/v1M sodium hydroxide solution 15.0% w/v

1М раствор соляной кислоты до рН 7.61M hydrochloric acid solution to pH 7.6

Полиэтиленгликоль 400 4.5% w/vPolyethylene glycol 400 4.5% w/v

Вода для инъекций до 100%Water for injection up to 100%

Мазь млOintment ml

Вещество 40 мгSubstance 40 mg

Этанол 300 μлEthanol 300 µl

Вода 300 μлWater 300 µl

1-додецилазациклогептанон 50 цл1-dodecylasecycloheptanone 50 cl

Пропиленгликоль до 1 млPropylene glycol up to 1 ml

Данные составы могут быть приготовлены в соответствии со стандартными фармацевтическими методиками. Таблетки (I)-(II) могут быть покрыты кишечнорастворимой оболочкой с использованием, например, фталата ацетата целлюлозы.These formulations may be prepared in accordance with standard pharmaceutical procedures. Tablets (I)-(II) may be enteric coated using, for example, cellulose acetate phthalate.

Применение Соединений I-Х в комбинированной терапииUse of Compounds I-X in Combination Therapy

Несмотря на то, что Соединения I-Х могут вводить в качестве индивидуального активного фармацевтического средства, их также можно использовать в сочетании с одним или несколькими другими агентами, в частности, другой агент может представлять собой антибиотик, НПВС или другое противовоспалительное средство, антигипертензивные средство, глюкокортикостероид, моноклональное антитело и т.д. При совместном приеме внутрь терапевтические агенты могут представлять собой разные лекарственные формы, которые вводятся одновременно или последовательно в разное время, либо терапевтические агенты могут быть объединены в одну лекарственную форму.Although Compounds IX can be administered as the active pharmaceutical agent alone, they can also be used in combination with one or more other agents, in particular, the other agent may be an antibiotic, NSAID or other anti-inflammatory agent, antihypertensive agent, glucocorticosteroid, monoclonal antibody, etc. When co-administered orally, the therapeutic agents may be in different dosage forms administered simultaneously or sequentially at different times, or the therapeutic agents may be combined into a single dosage form.

Фраза комбинированная терапия в отношении соединений данного изобретения в сочетании с другими фармацевтическими агентами, означает одновременный или последовательный прием всех агентов, который так или иначе обеспечит благоприятное воздействие сочетания лекарств. Совместное введение подразумевает, в частности, совместную доставку, например, в одной таблетке, капсуле, инъекции или в другой форме, имеющий фиксированное соотношение активных веществ, также как и одновременную доставку в нескольких, отдельных лекарственных формах для каждого соединения соответственно.The phrase combination therapy, in relation to the compounds of this invention in combination with other pharmaceutical agents, means the simultaneous or sequential administration of all agents, which in one way or another will provide a beneficial effect of the combination of drugs. Co-administration means in particular co-delivery, for example, in a single tablet, capsule, injection or other form, having a fixed ratio of active substances, as well as simultaneous delivery in several, separate dosage forms for each compound, respectively.

Таким образом, введение соединений I-Х может быть осуществлено в сочетании с дополнительными методами лечения, известными специалистам в области профилактики и лечения соответствующих заболеваний, включающими применение антибактериальных, цитостатических и цитотоксических препаратов, препаратов для подавления симптомов или побочных эффектов одного из лекарств.Thus, the administration of compounds IX can be carried out in combination with additional methods of treatment known to specialists in the field of prevention and treatment of relevant diseases, including the use of antibacterial, cytostatic and cytotoxic drugs, drugs to suppress symptoms or side effects of one of the drugs.

Если лекарственное средство представляет собой фиксированную дозу, такая комбинация использует соединения данного изобретения в приемлемом дозовом диапазоне. Соединения I-Х по данному изобретению также могут быть введены в организм пациента последовательно с другими агентами, в том случае, когда комбинация этих препаратов невозможна. Изобретение не ограничено последовательностью введения; соединения данного изобретения могут быть введены в организм пациента совместно, до или после введения другого препарата.If the drug is a fixed dose, such a combination uses the compounds of this invention in an acceptable dose range. Compounds IX of this invention can also be administered to the patient sequentially with other agents, when the combination of these drugs is not possible. The invention is not limited to the sequence of administration; the compounds of this invention can be administered to the patient together, before or after administration of another drug.

Примеры Получение соединений по изобретениюEXAMPLES Preparation of Compounds of the Invention

Способы получения соединений I-Х раскрыты в заявке на изобретение RU 2013/116822. В той же заявке описана способность подобных соединений к комплексообразованию или хелатированию ионов металлов.Methods for obtaining compounds I-X are disclosed in the application for invention RU 2013/116822. The same application describes the ability of such compounds to complex or chelate metal ions.

Характеристика биологической активности соединений по изобретениюCharacterization of the biological activity of the compounds according to the invention

Биологическая активность соединений I-Х была изучена в различных in vitro и in vivo экспериментах. В частности, при изучении активности Соединений I и II в различных in vitro и in vivo моделях было показано ингибирующее действие Соединений I и II на хемотаксис моноцитов, макрофагов и других клеток иммунной системы. Данное биологическое действие Соединений I и II не может быть предсказано или объяснено на основе предшествующих знаний о способности Соединений I и II к хелатированию ионов металлов.The biological activity of compounds IX was studied in various in vitro and in vivo experiments. In particular, when studying the activity of Compounds I and II in various in vitro and in vivo models, the inhibitory effect of Compounds I and II on the chemotaxis of monocytes, macrophages and other cells of the immune system was shown. This biological action of Compounds I and II cannot be predicted or explained on the basis of prior knowledge of the ability of Compounds I and II to chelate metal ions.

Исследования биологической активности Соединений III-X in vitro, позволили установить, что Соединения III-X также являются ингибиторами фермента глутаминилциклазы и, таким образом, действие Соединений III-X на хемотаксис клеток иммунной системы может быть опосредованно ингибированием активности глутаминилциклазы.Studies of the biological activity of Compounds III-X in vitro have shown that Compounds III-X are also inhibitors of the enzyme glutaminyl cyclase and thus the effect of Compounds III-X on chemotaxis of immune system cells may be mediated by inhibition of glutaminyl cyclase activity.

- 9 042698- 9 042698

Исследование влияния соединений I-Х на ферментативную активность глутаминилциклазы человека in vitroStudy of the effect of compounds I-X on the enzymatic activity of human glutaminyl cyclase in vitro

В ходе исследований влияния соединений I-Х, являющихся предметом настоящего изобретения, на ферментативную активность глутаминилциклазы in vitro впервые было обнаружено прямое ингибирующее действие соединений I-Х на рекомбинантную внутриклеточную глутаминилциклазу человека.In the course of studies of the effect of compounds IX, which are the subject of the present invention, on the enzymatic activity of glutaminyl cyclase in vitro, for the first time, a direct inhibitory effect of compounds IX on recombinant intracellular human glutaminyl cyclase was discovered.

Активность глутаминилциклазы при различных концентрациях Соединений I-Х изучалась при 25 °С с использованием флуоресцентного субстрата L-глутаминил 2-нафтиламида (Gln-bNA) (Anal Biochem. 2002 Apr 1;303(1):49-56). Реакционная смесь объемом 100 -μ1 содержала 50 цМ флуорогенного субстрата; ~0,2 единицы пироглутаминил аминопептидазы человека (1 единица определяется как количество, гидролизующее 1 микромоль pGlu-bNA в минуту), и аликвоту рекомбинантной внутриклеточной глутаминилциклазы человека (gQC) в 50 mM трисаминометан-HCl и 5% глицерине, рН 8,0. Реакцию инициировали добавлением к реакционной смеси аликвоты глутаминилциклазы, инкубированной с Соединениями I-Х в течение 5 мин.Glutaminyl cyclase activity at various concentrations of Compounds I-X was studied at 25°C using the fluorescent substrate L-glutaminyl 2-naphthylamide (Gln-bNA) (Anal Biochem. 2002 Apr 1;303(1):49-56). The 100 -μ1 reaction mixture contained 50 µM fluorogenic substrate; ~0.2 units of human pyroglutaminyl aminopeptidase (1 unit is defined as the amount that hydrolyzes 1 micromol pGlu-bNA per minute), and an aliquot of recombinant intracellular human glutaminyl cyclase (gQC) in 50 mM trisaminomethane-HCl and 5% glycerol, pH 8.0. The reaction was initiated by adding to the reaction mixture an aliquot of glutaminyl cyclase incubated with Compounds 1-X for 5 minutes.

Таблица 1. Влияние Соединений I-Х на ферментативную активность глутаминилциклазы человека in vitroTable 1. Effect of Compounds I-X on the enzymatic activity of human glutaminyl cyclase in vitro

Дальнейшее протекание реакции отслеживали спектрофотометрически (длина волны возбуждения и эмиссии составляли 320 и 410 нм). Ферментативную активность определяли по количеству выделившегося 2-нафтиламида (bNA), рассчитанному по калибровочной кривой. Значения IC50 рассчитывали с помощью нелинейной регрессии кривой концентрация ингибитора-ферментативная активность. В качестве вещества сравнения использовали известный ингибитор глутаминилциклаз -- соединение PBD150 (J Med Chem. 2006 Jan 26; 49(2):664-77).The further course of the reaction was monitored spectrophotometrically (the excitation and emission wavelengths were 320 and 410 nm). The enzymatic activity was determined from the amount of 2-naphthylamide (bNA) released, calculated from the calibration curve. IC 50 values were calculated using non-linear regression of the inhibitor concentration-enzymatic activity curve. The known glutaminyl cyclase inhibitor compound PBD150 (J Med Chem. 2006 Jan 26; 49(2):664-77) was used as a reference substance.

В результате эксперимента было установлено, что Соединения I-Х ингибируют активность глутаминилциклазы с IC50 в диапазоне от 0,8 до 20 мкМ (см. табл. 1)As a result of the experiment, it was found that Compounds I-X inhibit the activity of glutaminyl cyclase with an IC50 in the range from 0.8 to 20 μM (see table. 1)

- 10 042698- 10 042698

Исследование влияния Соединений I и II на миграцию моноцитов in vitroStudy of the effect of Compounds I and II on monocyte migration in vitro

Влияние Соединений I и II на миграцию моноцитов in vitro было изучено с использованием клеток линии U937, подрощенных до концентрации (2-3)х106 клеток/мл на среде RPMI 1640 с добавлением 10% термоинактивированной фетальной коровьей сыворотки (Biochem J. 2012 Mar 1; 442 (2): 403-12). Примерно 1х107 клеток U937 инкубировали с различными концентрациями Соединений I и II (всего 7 концентраций для каждого из соединений) при 37°С в течение 2 ч и затем обрабатывали липополисахаридом E.coli (О111:В4). Супернатант (кондиционированная среда) использовали для изучения миграции моноцитов.The effect of Compounds I and II on monocyte migration in vitro was studied using U937 cells grown to a concentration of (2-3)x10 6 cells/ml on RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Biochem J. 2012 Mar 1 ; 442 (2): 403-12). Approximately 1x10 7 U937 cells were incubated with various concentrations of Compounds I and II (total 7 concentrations for each of the compounds) at 37°C for 2 hours and then treated with E. coli lipopolysaccharide (O111:B4). The supernatant (conditioned medium) was used to study the migration of monocytes.

Свежую порцию клеток U937 окрашивали флуоресцентным красителем Calcein AM в течение 1 ч при 37°С. После этого аликвоту окрашенных клеток помещали верхнее отделение лунок планшета BD FalconTM HTS FluoroBlok, ячейки которого разделены полупроницаемыми оптически непрозрачными мембранами. В нижнее отделение лунок планшета помещали кондиционированную среду, полученную после инкубирования клеток с ингибитором и липополисахаридом. Планшеты инкубировали 2 ч при 37°С, количество (% относительно эксперимента без ингибитора) клеток, мигрировавших в нижний отсек лунок определяли флуориметрически. В качестве вещества сравнения использовали известный ингибитор глутаминилциклаз - соединение PBD150 (J Med Chem. 2006 Jan 26;49 (2) :664-77) .A fresh portion of U937 cells was stained with the fluorescent dye Calcein AM for 1 h at 37°C. An aliquot of stained cells was then placed in the top compartment of a BD FalconTM HTS FluoroBlok plate, the wells of which were separated by semi-permeable, optically opaque membranes. The conditioned medium obtained after incubation of the cells with the inhibitor and lipopolysaccharide was placed in the lower compartment of the wells of the tablet. The plates were incubated for 2 h at 37°C, the number (% relative to the experiment without inhibitor) of cells migrating into the lower compartment of the wells was determined fluorimetrically. The known glutaminyl cyclase inhibitor compound PBD150 (J Med Chem. 2006 Jan 26;49 (2) :664-77) was used as a reference substance.

В результате эксперимента было установлено, что Соединение I и Соединение II в микромолярном диапазоне концентраций оказывают ингибирующий эффект на миграцию моноцитов in vitro. Соединение I подавляет миграцию моноцитов в широком диапазоне концентраций от 1 мкМ до 300 мкМ с эффективностью близкой к 60%. В том же диапазоне концентраций Соединение II подавляет миграцию моноцитов с эффективностью 50-70%.As a result of the experiment, it was found that Compound I and Compound II in the micromolar concentration range have an inhibitory effect on the migration of monocytes in vitro. Compound I inhibits the migration of monocytes in a wide range of concentrations from 1 μM to 300 μM with an efficiency close to 60%. In the same concentration range, Compound II inhibits monocyte migration with an efficiency of 50-70%.

Исследование влияния Соединения I на хемотаксис лейкоцитов in vivo на модели бронхиальной астмы у морских свинокStudy of the effect of Compound I on leukocyte chemotaxis in vivo in a model of bronchial asthma in guinea pigs

Индукцию бронхиальной астмы у морских свинок осуществляли по стандартной методике (Current Drug Targets. 2008 Jun; 9(6):452-65). Животных иммунизировали однократным внутрибрюшинным введением 0,5 мл раствора, содержащего 100 мкг/мл овальбумина (Sigma) и 100 мг/мл гидроокиси алюминия. Интактным животным внутрибрюшинно вводили физ. раствор в объеме 0,5 мл.Induction of asthma in guinea pigs was carried out according to the standard method (Current Drug Targets. 2008 Jun; 9(6):452-65). Animals were immunized with a single intraperitoneal injection of 0.5 ml of a solution containing 100 μg/ml ovalbumin (Sigma) and 100 mg/ml aluminum hydroxide. Intact animals were intraperitoneally injected with saline. solution in a volume of 0.5 ml.

На 29, 30 и 31 день эксперимента проводили провокацию гиперреактивности дыхательных путей путем ингаляционного введения овальбумина в возрастающих концентрациях - 0,1, 0,3 и 0,5 мг/мл (на 29, 30 и 31 день соответственно). Ингаляцию осуществляли в течение 5 мин или до появления выраженных признаков асфиксии (падение на бок). На 32-ой день животным вводили разрешающую дозу овальбумина - 1 мг/мл в течение 5 мин с оценкой бронхоспастической реакции.On days 29, 30, and 31 of the experiment, airway hyperreactivity was provoked by inhalation administration of ovalbumin at increasing concentrations of 0.1, 0.3, and 0.5 mg/ml (on days 29, 30, and 31, respectively). Inhalation was carried out for 5 minutes or until the appearance of pronounced signs of asphyxia (falling on one side). On the 32nd day, the animals were injected with a resolving dose of ovalbumin - 1 mg/ml for 5 minutes with an assessment of the bronchospastic reaction.

Исследуемое соединение вводили животным внутрижелудочно ежедневно один раз в день в течение 10 суток, заканчивая за 24 ч до введения разрешающей дозы антигена.The test compound was administered to the animals intragastrically once a day for 10 days, ending 24 hours before the administration of the resolving dose of the antigen.

Через 24 ч после введения разрешающей дозы овальбумина у животных отбирали бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Взятие БАЛ проводили под наркозом путем промывания легких 5 мл подогретого до 37°С физиологического раствора через трахею при помощи шприцевого дозатора.Bronchoalveolar lavage (BAL) was taken from the animals 24 hours after the administration of a resolving dose of ovalbumin. BAL was taken under anesthesia by flushing the lungs with 5 ml of saline warmed up to 37°C through the trachea using a syringe dispenser.

В жидкости бронхоальвеолярного смыва с помощью камеры Горяева подсчитывали абсолютное количество клеточных элементов в 1 мкл смыва. Затем бронхоальвеолярный лаваж центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Из осадка клеток готовили мазки, которые в дальнейшем фиксировали в метаноле и окрашивали по Романовскому-Гимзе для подсчета эндопульмональной цито граммы.In the bronchoalveolar lavage fluid, the absolute number of cellular elements in 1 µl of lavage was counted using a Goryaev camera. Then bronchoalveolar lavage was centrifuged at 200 g for 10 min. Smears were prepared from the cell sediment, which were subsequently fixed in methanol and stained according to Romanovsky-Giemsa to calculate the endopulmonary cytogram.

Цитологический анализ бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) выявил многократное увеличение клеточных элементов в БАЛ сенсибилизированных морских свинок (фиг. 1). Таким образом, данная модель характеризуется воспалительной реакцией респираторного тракта экспериментальных животных. Анализ отдельных типов клеток показал, что наиболее выраженный приток клеток приходился на эозинофилы. Полученные результаты подтверждают литературные данные и позволяют сделать заключение о том, что смоделированное воспаление носит аллергический характер.Cytological analysis of bronchoalveolar lavage (BAL) revealed a multiple increase in cellular elements in the BAL of sensitized guinea pigs (Fig. 1). Thus, this model is characterized by an inflammatory reaction of the respiratory tract of experimental animals. Analysis of individual cell types showed that the most pronounced influx of cells accounted for eosinophils. The results obtained confirm the literature data and allow us to conclude that the simulated inflammation is of an allergic nature.

Ежедневное внутрижелудочное введение Соединения I в течение 10 дней снизило приток клеток воспаления в бронхоальвеолярное пространство. Соединение I оказывало терапевтический эффект во всем тестируемом диапазоне доз (0.14-14 мг/кг), снижало как общее количество лейкоцитов, так и количество отдельных клеточных типов: эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов (фиг. 1).Daily intragastric administration of Compound I for 10 days reduced the influx of inflammatory cells into the bronchoalveolar space. Compound I had a therapeutic effect in the entire tested dose range (0.14-14 mg/kg), reduced both the total number of leukocytes and the number of individual cell types: eosinophils, neutrophils, macrophages (Fig. 1).

При этом на фиг. 1 знаком * обозначены различия, статистически значимые по сравнению с интактной группой (р<0,05); и знаком - & - различия, статистически значимые по сравнению с группой контроля (р<0,05).Meanwhile, in FIG. 1 sign * indicates differences that are statistically significant compared with the intact group (p<0.05); and sign - & - differences, statistically significant compared with the control group (p<0.05).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Соединение I оказывает выраженный терапевтический эффект бронхиальной астме.The results obtained indicate that Compound I has a pronounced therapeutic effect in bronchial asthma.

Исследование влияния Соединения I на хемотаксис макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов in vivo на модели сефадекс-индуцированного бронхита легких у крысStudy of the effect of Compound I on the chemotaxis of macrophages, neutrophils and eosinophils in vivo in a model of Sephadex-induced pulmonary bronchitis in rats

Модель сефадекс-индуцированного бронхита легких у крыс реализовали по стандартной методике (Int Arch Allergy Immunol. 2011; 154(4) :286-94). Крысам-самцам линии Вистар однократно ингаляционно вводили Сефадекс G-200 (Pharmacia, Sweden) в дозе 5 мг/кг. Исследуемые соединения вводили живот- 11 042698 ным внутрижелудочно четырехкратно: за 24 и 1 ч до, а также 24 и 45 ч после введения сефадекса. Препарат сравнения будесонид вводили по той же схеме ингаляционно в дозе 0,5 мг/кг. Через 48 ч после ингаляции сефадекса производили забор бронхоальвеолярного лаважа. В лаваже оценивали суммарное количество лейкоцитов и определяли лейкоцитарную формулу.The model of Sephadex-induced lung bronchitis in rats was implemented according to the standard method (Int Arch Allergy Immunol. 2011; 154(4):286-94). Male Wistar rats were injected with Sephadex G-200 (Pharmacia, Sweden) at a dose of 5 mg/kg once by inhalation. The test compounds were administered intragastrically to animals four times: 24 and 1 h before and 24 and 45 h after the administration of Sephadex. The reference drug budesonide was administered according to the same scheme by inhalation at a dose of 0.5 mg/kg. Bronchoalveolar lavage was taken 48 hours after Sephadex inhalation. In lavage, the total number of leukocytes was assessed and the leukocyte formula was determined.

Анализ бронхоальвеолярного лаважа показал, что однократное ингаляционное введение сефадекса G-200 крысам вызывает выраженный приток лейкоцитов в легкое. Количество всех клеточных типов было увеличено в группе контроля по сравнению с интактными (табл. 2).Analysis of bronchoalveolar lavage showed that a single inhalation administration of Sephadex G-200 to rats causes a pronounced influx of leukocytes into the lung. The number of all cell types was increased in the control group compared to the intact ones (Table 2).

Таблица 2. Количество клеточных элементов в бронхоальвеолярном лаваже на модели сефадексиндуцированного бронхита у крыс (М±ш, n=10)Table 2. The number of cellular elements in bronchoalveolar lavage in the model of sephadex-induced bronchitis in rats (M±m, n=10)

Группа Group Количество клеточных элементов в 1 мкл БИЛ The number of cellular elements in 1 µl of BIL Лейкоциты Leukocytes Нейтрофилы Neutrophils Эозинофилы Eosinophils Макрофаги macrophages Лимфоциты Lymphocytes Интактные Intact 2209+348 2209+348 270+54 270+54 0+0 0+0 1975+346 1975+346 0+0 0+0 Контроль Control 4617+582* 4617+582* 989+135* 989+135* 248+65* 248+65* 3209+397* 3209+397* 0+0 0+0 Соединение I (0,18 мг/кг) Compound I (0.18 mg/kg) 38331525* 38331525* 283+75 & 283+75 & 0+0 & 0+0 & 3127+351* 3127+351* 0+0 0+0 Соединение I (1л 8 мг/кг) Compound I (1l 8 mg/kg) 4133+454* 4133+454* 846+101* 846+101* 0+0 & 0+0 & 3287+381* 3287+381* 0+0 0+0

Примечания * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0, 05Notes * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05

Внутрижелудочное введение Соединения I крысам снизило содержание нейтрофилов и эозинофилов в БАЛ до уровня интактных животных. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Соединение I оказывает терапевтический эффект при воспалении нижних дыхательных путей, в частности при бронхите.Intragastric administration of Compound I to rats reduced the content of neutrophils and eosinophils in BAL to the level of intact animals. The results obtained indicate that Compound I has a therapeutic effect in inflammation of the lower respiratory tract, in particular in bronchitis.

Исследование активности Соединения I на модели неинфекционного воспаления легкого, индуцированного экстрактом сигаретного дымаStudy of the activity of Compound I in a model of non-infectious lung inflammation induced by cigarette smoke extract

Индукцию неинфекционного воспаления легкого мышей осуществляли по стандартной методике [Exp Lung Res. 2013 Feb;39(1):18-31]. Мышам-самцам линии Balb/c внутрибрюшинно вводили экстракт сигаретного дыма (ЭСД, 0.45 мл/20 мг) на 0, 11, 15, 17, 19 и 22 сутки. ЭСД получали следующим образом: 5 сигарет сжигали, с помощью вакуумного насоса дым фильтровали для удаления частиц и собирали в сосуд, содержащий фосфатно-солевой буфер. Соединение I вводили внутрижелудочно, ежедневно, 1 раз в сутки с 7 по 27 сутки. Эвтаназию проводили на 28 сутки. Правую долю легкого фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили через спирты восходящих концентраций до ксилола и заливали в парафин по стандартной методике. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и проводили гистологический анализ.The induction of non-infectious inflammation of the lung of mice was carried out according to the standard method [Exp Lung Res. 2013 Feb;39(1):18-31]. Balb/c male mice were intraperitoneally injected with cigarette smoke extract (ESD, 0.45 ml/20 mg) on days 0, 11, 15, 17, 19, and 22. The ESD was prepared as follows: 5 cigarettes were burned, the smoke was filtered to remove particles using a vacuum pump, and collected in a vessel containing phosphate-buffered saline. Compound I was administered intragastrically, daily, 1 time per day from 7 to 27 days. Euthanasia was performed on the 28th day. The right lobe of the lung was fixed in 10% neutral formalin solution, passed through alcohols of ascending concentrations to xylene, and embedded in paraffin according to the standard method. Deparaffinized sections 5 μm thick were stained with hematoxylin-eosin and histological analysis was performed.

Каждое поражение было оценено по 5-ти бальной шкале: 1 балл - воспалительный инфильтрат занимает 0-20% площади исследуемого гистологического препарата, 2 балла - воспалительный инфильтрат занимает 21-40% площади исследуемого гистологического препарата, 3 балла - воспалительный инфильтрат занимает 41-60% площади исследуемого гистологического препарата, 4 балла - воспалительный инфильтрат занимает 61-80% площади исследуемого гистологического препарата, 5 баллов - воспалительный инфильтрат занимает 81-100% площади исследуемого гистологического препарата. Также вычисляли индекс деструкции альвеол (DI) процент поврежденных альвеол относительно общего числа альвеол.Each lesion was assessed on a 5-point scale: 1 point - inflammatory infiltrate occupies 0-20% of the area of the studied histological preparation, 2 points - inflammatory infiltrate occupies 21-40% of the area of the studied histological preparation, 3 points - inflammatory infiltrate occupies 41-60 % of the area of the studied histological preparation, 4 points - inflammatory infiltrate occupies 61-80% of the area of the studied histological preparation, 5 points - inflammatory infiltrate occupies 81-100% of the area of the studied histological preparation. Alveolar destruction index (DI) was also calculated, the percentage of damaged alveoli relative to the total number of alveoli.

Результаты исследования показали, что многократное внутрибрюшинное введение экстракта сигаретного дыма мышам индуцирует формирование периваскулита, перибронхита, альвеолита и интерстициальной пневмонии (табл. 3).The results of the study showed that repeated intraperitoneal administration of cigarette smoke extract to mice induces the formation of perivasculitis, peribronchitis, alveolitis, and interstitial pneumonia (Table 3).

Внутрижелудочное введение Соединения I значительно снизило развитие периваскулита и альвеолита (табл. 3). Полученные результаты позволяют заключить, что Соединение I оказывает терапевтический эффект при периваскулите и альвеолите.Intragastric administration of Compound I significantly reduced the development of perivasculitis and alveolitis (Table 3). The results obtained allow us to conclude that Compound I has a therapeutic effect in perivasculitis and alveolitis.

Таблица 3. Результаты гистологического исследования на модели неинфекционной пневмонии, __________ индуцированной экстрактом сигаретного дыма (М±ш, n=12)_______Table 3. Results of a histological study on a model of non-infectious pneumonia __________ induced by cigarette smoke extract (M±w, n=12)_______

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Периваскулит, баллы Perivasculitis, points Перибронхит, баллы Peribronchitis, points Альвеолит (DI, %) Alveolitis (DI, %) Интерстициальная пневмония, баллы Interstitial pneumonia, points Интактные Intact - - 0,71+0,20 0.71+0.20 0,51+0,19 0.51+0.19 11,50+1,20 11.50+1.20 0,99+0,20 0.99+0.20 Контроль Control - - 1,50+0,24* 1.50+0.24* 1,2 9+0,18 1.2 9+0.18 30,90±2,30* 30.90±2.30* 1,81+0,27* 1.81+0.27* Соединение I Compound I 0.3 0.3 0,38+0,13 & 0.38+0.13 & 1,09+0,24 1.09+0.24 17,70+2,00*& 17.70+2.00*& 1,08+0,26 1.08+0.26 Примечание: * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05. & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05. Note: * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05. & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

Исследование активности Соединения I in vivo на модели эмфиземы легкого у мышейStudy of the activity of Compound I in vivo in a model of pulmonary emphysema in mice

Воспаление и эмфизему легких вызывали однократной интратрахеальной инъекцией свиной пан- 12 042698 креатической эластазы. Эластазу вводили однократно интратрахеально в дозе 0, Ед/мышь в 30 мкл NaCl 0,9%. Для анестезии во время операции использовали пентобарбитал интраперитонеально в дозе 30 мг/кг. Операционное поле дезинфицировали 70% раствором этанола и освобождали от волосяного покрова. По средней линии шеи рассекали кожу, подкожную клетчатку и собственную фасцию шеи. Методом тупого раздвижения тканей раздвигали мышцы на вентральной стороне трахеи. По ходу тока воздуха на вдохе производили инъекцию свиной панкреатической эластазы с помощью шприца Гамильтона. После ушивания раны операционное поле обрабатывали антисептиком. Введение эластазы принимали за 0 день эксперимента.Pulmonary inflammation and emphysema were induced by a single intratracheal injection of porcine pancreatic elastase. Elastase was administered once intratracheally at a dose of 0 U/mouse in 30 µl NaCl 0.9%. Pentobarbital intraperitoneally at a dose of 30 mg/kg was used for anesthesia during the operation. The operating field was disinfected with 70% ethanol solution and freed from hair. The skin, subcutaneous tissue, and own fascia of the neck were dissected along the midline of the neck. Muscles on the ventral side of the trachea were separated by blunt tissue expansion. Porcine pancreatic elastase was injected with a Hamilton syringe along the course of air flow. After suturing the wound, the surgical field was treated with an antiseptic. The introduction of elastase was taken as day 0 of the experiment.

Соединение I вводили в дозе 3 мг/кг ежедневно внутрижелудочно один раз в сутки на 8-21-е сутки эксперимента. На 21-е сутки исследования животных эвтаназировали в СО2-камере и выделяли легкие. Для оценки динамики и выраженности развития эмфиземы в ткани легких из левого легкого изготавливались гистологические препараты. Для этого легкое фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и затем заливали в парафин по стандартной методике. Из депарафинизированных срезов получали препараты верхушки легкого, среднего легочного поля и нижнего легочного поля толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Далее делали фотографии верхушки легкого, среднего легочного поля и нижнего легочного поля. С помощью средств компьютерной обработки графических данных исследовали локализацию и площадь эмфизематозно-расширенной ткани легких (% от нормальной ткани), из расчетов исключались сосуды и бронхи (Int J Biomed Imaging. 2012;2012:734734; Front Physiol. 2015 May 12;6:14).Compound I was administered at a dose of 3 mg/kg daily intragastrically once a day on days 8-21 of the experiment. On the 21st day of the study, the animals were euthanized in a CO 2 chamber and the lungs were isolated. To assess the dynamics and severity of the development of emphysema in the lung tissue, histological preparations were made from the left lung. To do this, the lung was fixed in 10% neutral formalin solution and then embedded in paraffin according to the standard method. From deparaffinized sections, preparations of the apex of the lung, middle lung field and lower lung field were obtained with a thickness of 5 μm and stained with hematoxylin and eosin according to the standard method. Next, photographs were taken of the apex of the lung, the middle lung field, and the lower lung field. The localization and area of emphysematous-dilated lung tissue (% of normal tissue) was studied using computer graphics processing tools, vessels and bronchi were excluded from the calculations (Int J Biomed Imaging. 2012;2012:734734; Front Physiol. 2015 May 12;6: 14).

При гистологическом исследовании на 21 сутки после введения эластазы во всех зонах легкого мышей обнаруживалось умеренно выраженное полнокровие сосудов микроциркулярного русла и капилляров межальвеолярных перегородок. Кроме этого, эластаза приводила к утолщению стенок альвеол за счет лимфо-макрофагальной инфильтрации, а также воспалительной инфильтрации интерстициальной ткани. Просвет отдельных альвеол также заполнен макрофагами и лимфоцитами. В результате действия повреждающего агента на эластические волокна бронхиол, альвеолярных ходов и альвеол в паренхиме легких отмечались растяжение альвеол и разрывы альвеолярных перегородок, развивалась диффузная эмфизема. Анализ препаратов показал, что на 21-е сутки опыта значительная часть ткани левого легкого была занята эмфизематозно-расширенными альвеолами с разрушением межальвеолярных перегородок. Эмфизема локализовалась во всех легочных полях. Наиболее выраженные поражения наблюдались в нижнем легочном поле (табл. 4).Histological examination on the 21st day after the injection of elastase in all areas of the lung of mice revealed a moderately pronounced plethora of the vessels of the microcirculatory bed and capillaries of the interalveolar septa. In addition, elastase led to thickening of the walls of the alveoli due to lympho-macrophage infiltration, as well as inflammatory infiltration of the interstitial tissue. The lumen of individual alveoli is also filled with macrophages and lymphocytes. As a result of the action of the damaging agent on the elastic fibers of the bronchioles, alveolar passages and alveoli in the lung parenchyma, stretching of the alveoli and ruptures of the alveolar septa were noted, and diffuse emphysema developed. The analysis of preparations showed that on the 21st day of the experiment, a significant part of the tissue of the left lung was occupied by emphysematous-dilated alveoli with destruction of the interalveolar septa. Emphysema was localized in all lung fields. The most pronounced lesions were observed in the lower lung field (Table 4).

Таблица 4. Площадь эмфизематозно расширенной ткани легких (% от нормальной) у мышей в условиях интратрахеального введения эластазы на 21-е сутки эксперимента (М±ш, n=5)Table 4. Area of emphysematous enlarged lung tissue (% of normal) in mice under conditions of intratracheal injection of elastase on the 21st day of the experiment (M±m, n=5)

Группы Groups Верхнее легочное поле Upper lung field Среднее легочное поле Middle lung field Нижнее легочное поле Inferior lung field Интактный контроль Intact control 0 0 0 0 0 0 Патологический контроль pathological control 24,06 + 6, 12* 24.06 + 6.12* 63,76 + 5, 02 * 63.76+5.02* 82,90 ± 2,88 82.90 ± 2.88 Соединение I (3 мг/кг) Compound I (3 mg/kg) 11,76 ± 1,48 * 11.76±1.48* 37,09 ± 5,86 *· 37.09 ± 5.86* 35,28 ± 5,81 35.28±5.81

Примечания:Notes:

- * - различия достоверны по сравнению с интактным контролем (р<0,05);- * - differences are significant in comparison with the intact control (p<0.05);

- · - различия достоверны по сравнению с патологическим контролем (р<0,05).- · - differences are significant in comparison with pathological control (p<0.05).

Введение Соединения I снижало интенсивность воспалительной инфильтрации паренхимы легких и выраженности полнокровия сосудов микроциркуляторного русла и капилляров межальвеолярных перегородок, уменьшало относительную площадь эмфизематозно-расширенных альвеол по сравнению с группой патологического контроля (табл. 4). Полученные данные дают основание заключить, что Соединение II оказывает терапевтический эффект при эмфиземе легкого.The introduction of Compound I reduced the intensity of inflammatory infiltration of the lung parenchyma and the severity of plethora of vessels of the microvasculature and capillaries of the interalveolar septa, reduced the relative area of emphysematous-dilated alveoli compared with the pathological control group (Table 4). The obtained data give grounds to conclude that Compound II has a therapeutic effect in pulmonary emphysema.

Исследование терапевтической активности Соединения I на модели ХОБЛ у морских свинокStudy of Therapeutic Activity of Compound I in a Guinea Pig Model of COPD

Исследование проводили на морских свинках самцах. Хроническую обструктивную болезнь легких вызывали курсовым эндотрахеальным введением липополисахарида клеточной стенки Е. Coli (ЛПС) и экстрактом табачного дыма (ЭТД) (Biol Pharm Bull. 2009 Sep;32(9):1559-64). ЭТД получали из сигарет марки Hi-Lite (Япония) (состав 1 сигареты: смола 17 мг/сиг, никотин 1,4 мг/сиг). Перед получением экстракта удаляли сигаретный фильтр, длина сигареты с фильтром 80 мм, при удалении фильтра 55 мм. Экстракцию производили путем протягивания дыма зажженной сигареты через PBS с постоянной скоростью, при помощи вакуумного насоса (0 мл/40 сигарет). Время сжигания одной сигареты составляло 180 с. Для удаления частиц полученный экстракт фильтровали через бактериальный фильтр с величиной поры 45 нм. ЭСД ингалировали морским свинкам (0.3 мл/мин, 40 мин) ежедневно один раз в сутки на 1-4, 6-9, 11-14, 16-19 сутки. ЛПС ингалировали морским свинкам (25 мкг/мл, 0.3 мл/мин, 1 ч) один раз в сутки на 5, 10 и 15-е сутки. До последней ингаляции ЭСД, сразу после последней ингаляции ЭСД и через 1.5 ч после последней ингаляции ЭСД проводили оценку функции дыхания (в течение 15 мин). Сразу после оценки функции дыхания проводили забор бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Взятие БАЛ про- 13 042698 водили под наркозом путем промывания легких 5 мл подогретого до 37°С физиологического раствора через трахею при помощи шприцевого дозатора.The study was carried out on male guinea pigs. Chronic obstructive pulmonary disease was induced by a course of endotracheal administration of E. coli cell wall lipopolysaccharide (LPS) and tobacco smoke extract (ETS) (Biol Pharm Bull. 2009 Sep;32(9):1559-64). ETD was obtained from Hi-Lite brand cigarettes (Japan) (composition of 1 cigarette: tar 17 mg/cig, nicotine 1.4 mg/cig). Before obtaining the extract, the cigarette filter was removed, the length of the cigarette with the filter was 80 mm, while the filter was removed 55 mm. Extraction was performed by drawing the smoke of a lit cigarette through PBS at a constant speed using a vacuum pump (0 ml/40 cigarettes). The burning time of one cigarette was 180 s. To remove particles, the obtained extract was filtered through a bacterial filter with a pore size of 45 nm. ESD was inhaled in guinea pigs (0.3 ml/min, 40 min) daily once a day on days 1-4, 6-9, 11-14, 16-19. LPS was inhaled in guinea pigs (25 μg/ml, 0.3 ml/min, 1 h) once a day on days 5, 10, and 15. Prior to the last ESD inhalation, immediately after the last ESD inhalation, and 1.5 hours after the last ESD inhalation, respiratory function was assessed (within 15 min). Immediately after the assessment of respiratory function, bronchoalveolar lavage (BAL) was taken. BAL was taken under anesthesia by flushing the lungs with 5 ml of saline warmed to 37°C through the trachea using a syringe dispenser.

В жидкости бронхоальвеолярного смыва с помощью камеры Горяева подсчитывали абсолютное количество клеточных элементов в 1 мкл смыва (цитоз). Затем БАЛ центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Из осадка клеток готовили мазки, которые в дальнейшем фиксировали в метаноле и окрашивали по Романовскому-Гимзе для подсчета эндопульмональной цитограммы.In the bronchoalveolar lavage fluid, the absolute number of cellular elements per 1 μl of lavage (cytosis) was counted using a Goryaev camera. Then BAL was centrifuged at 200 g for 10 min. Smears were prepared from the cell sediment, which were subsequently fixed in methanol and stained according to Romanovsky-Giemsa to calculate the endopulmonary cytogram.

Соединение I вводили животным внутрижелудочно ежедневно 1 раз в сутки на 10-19-е сутки исследования (последнее введение - за 1 ч до последней ингаляции ЭСД). Группе ложной патологии вместо ЭТД и ЛПС ингалировали физ. раствор. Контрольные животные вместо исследуемого вещества получали растворитель в эквивалентном объеме.Compound I was administered to animals intragastrically daily once a day on the 10-19th day of the study (the last injection was 1 hour before the last ESD inhalation). The false pathology group received physical inhalation instead of ETD and LPS. solution. Control animals received an equivalent volume of solvent instead of the test substance.

Проведенное исследование показало, что на модели ХОБЛ Соединение 1 снижает приток клеток воспаления в бронхоальвеолярное пространство морских свинок. Наиболее выражено Соединение I снижает приток нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов (табл. 5).The study showed that in the COPD model, Compound 1 reduces the influx of inflammatory cells into the bronchoalveolar space of guinea pigs. The most pronounced Compound I reduces the influx of neutrophils, macrophages and eosinophils (Table 5).

Таблица 5. Количество клеточных элементов в бронхоальвеолярном лаваже на модели ХОБЛ у морских свинок (М±m, n=10)Table 5. Number of cellular elements in bronchoalveolar lavage in COPD model in guinea pigs (M±m, n=10)

Группы Groups Количество клеточных элементов в 1 мкл бронхоальвеолярного лаважа The number of cellular elements in 1 µl of bronchoalveolar lavage Лейко циты leukocytes Нейтро филы Neutrofils Эозино филы Eosino phyla Макро фаги macro phages Лимф о циты Lymphocytes Ложная патология false pathology 2488+154 2488+154 2876+27 2876+27 184+65 184+65 2016+120 2016+120 48+15 48+15 Контроль Control 7925+1458# 7925+1458# 1632+319 # 1632+319# 676+187# 676+187# 4789+782# 4789+782# 168+60 168+60 Соединение I (0.014 мг/кг) Compound I (0.014 mg/kg) 2748+174 & 2748+174 & 684+62#& 684+62#& 171+32 & 171+32 & 1805+123 #& 1805+123 #& 8 8+2 9 8 8+2 9 Соединение I (0.14 мг/кг) Compound I (0.14 mg/kg) 3422+434 & 3422+434 & 937+141# 937+141# 287+64 # 287+64# 2064+313 & 2064+313 & 134+60 134+60 Соединение I (1.4 мг/кг) Compound I (1.4 mg/kg) 4149+357#& 4149+357#& 931+166# 931+166# 245+55 # 245+55 # 2820+273& 2820+273& 71+2 9 71+2 9

Примечания: # - отличие от группы ложной патологии по t-критерию Стьюдента при р< 0,05;Notes: # - difference from the group of false pathology according to Student's t-test at p<0.05;

& - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05.& - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что Соединение II оказывает выраженное терапевтическое действие при ХОБЛ.Summarizing the obtained results, we can conclude that Compound II has a pronounced therapeutic effect in COPD.

Исследование активности Соединения I in vivo на модели аллергического ринита у морских свинокIn Vivo Activity Study of Compound I in a Guinea Pig Model of Allergic Rhinitis

Модель аллергического ринита реализовали по стандартной методике (Int Immunopharmacol. 2013 Sep;17(1):18-25). Морских свинок (250-300 гр) иммунизировали 4-кратным (на 0, 7, 14 и 21 сутки) внутрибрюшинным введением смеси овальбумина (100 мкг/свинка) и гидроксида аллюминия (5 мг/свинка), разведенных и суспендированных в физиологическом растворе. На 28-е сутки исследования раствор овальбумина (60 мг/мл) животным вводили интраназально по 20 мкл в каждую ноздрю. На 35-е сутки животным вводили раствор овальбумина (200 мкг/мл, 25 мкл) внутрикожно, предварительно выбрив участок кожи на спине. Подтверждением наличия сенсибилизации было формирование отека и покраснения в месте инъекции. На 42-е сутки исследования проводили интраназальное введение раствора овальбумина (60 мг/мл, 20 мкл/ноздря). С целью контроля формирования именно аллергического воспаления была сформирована группа ложноиммунизированных животных: на 0, 7, 14 и 21 сутки свинки получали раствор гидроксида аллюминия (5 мг/свинка), на 28-е и 35-е сутки - физ. раствор, на 42-е овальбумина (60 мг/мл, 20 мкл/ноздря).The allergic rhinitis model was implemented according to the standard method (Int Immunopharmacol. 2013 Sep;17(1):18-25). Guinea pigs (250-300 g) were immunized 4 times (on days 0, 7, 14 and 21) intraperitoneally with a mixture of ovalbumin (100 μg/gilt) and aluminum hydroxide (5 mg/gilt), diluted and suspended in saline. On the 28th day of the study, a solution of ovalbumin (60 mg/ml) was administered to the animals intranasally, 20 μl in each nostril. On the 35th day, the animals were injected with a solution of ovalbumin (200 µg/ml, 25 µl) intradermally, having previously shaved the area of the skin on the back. The presence of sensitization was confirmed by the formation of edema and redness at the injection site. On the 42nd day of the study, intranasal administration of an ovalbumin solution (60 mg/ml, 20 μl/nostril) was performed. In order to control the formation of precisely allergic inflammation, a group of falsely immunized animals was formed: on days 0, 7, 14 and 21, the pigs received a solution of aluminum hydroxide (5 mg/mumps), on the 28th and 35th days - physical. solution, on the 42nd ovalbumin (60 mg / ml, 20 μl / nostril).

Соединения I, III, IV (0.14, 1.4 мг/кг) вводили животным внутрижелудочно однократно за 3 ч до последнего интраназального введения овальбумина.Compounds I, III, IV (0.14, 1.4 mg/kg) were administered to animals intragastrically once 3 hours before the last intranasal administration of ovalbumin.

В течение 2 ч после последнего введения овальбумина проводили оценку клинических проявлений ринита: подсчитывали количество чихов, почесываний носа.Within 2 hours after the last injection of ovalbumin, the clinical manifestations of rhinitis were assessed: the number of sneezes and scratching of the nose was counted.

Результаты исследований представлены в табл. 6-8.The research results are presented in table. 6-8.

Учет клинических проявлений аллергического ринита в течение 2 ч после последнего интраназального введения овальбумина животным показал выраженное увеличение у экспериментальных животных количества чихов и почесываний носа, что свидетельствует о корректности реализованной модели аллергического ринита.Accounting for the clinical manifestations of allergic rhinitis within 2 hours after the last intranasal administration of ovalbumin to animals showed a pronounced increase in the number of sneezes and scratching of the nose in experimental animals, which indicates the correctness of the implemented model of allergic rhinitis.

- 14 042698- 14 042698

Таблица 6. Клинические проявления аллергического ринита у морских свинок при терапии _____________животных Соединением I (M±m, n=10)_________Table 6. Clinical manifestations of allergic rhinitis in guinea pigs treated with ______ animals Compound I (M±m, n=10)_________

Группа Group Количество Quantity Количество Quantity чихов/2часа chikhov / 2 hours почесываний носа/2 scratching nose/2 часа hours Ложная иммунизация False immunization 5,9+1,3 5.9+1.3 12,5+3,1 12.5+3.1 Контроль Control 17+1,8* 17+1.8* 69+7,4* 69+7.4* Соединение I (0.14 Compound I (0.14 9,3+1,7 9.3+1.7 37,3+7,8*& 37.3+7.8*& мг/кг) mg/kg) Соединение I (1.4 Compound I (1.4 12,1+1,5 12.1+1.5 41,0+12,0 41.0+12.0 мг/кг) mg/kg) Примечания: Notes: * - отличие от интактной группы по t-критерию Стьюдента при * - difference from the intact group according to Student's t-test with р<0,05 p<0.05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при & - difference from the control group according to Student's t-test at р<0,05 p<0.05

Таблица 7. Клинические проявления аллергического ринита у морских свинок при терапии животных Соединением III (M±m, n=10)Table 7. Clinical manifestations of allergic rhinitis in guinea pigs treated with Compound III (M±m, n=10)

Группа Group Количество чихов/2часа Number of sneezes / 2 hours Количество почесываний носа/2 часа Number of nose scratches / 2 hours Ложная иммунизация False immunization 5, 9+0,3 5.9+0.3 10,3+2,2 10.3+2.2 Контроль Control 20,6+0,9* 20.6+0.9* 75,4+6,5* 75.4+6.5* Соединение III (0.14 мг/кг) Compound III (0.14 mg/kg) 17,8+0,7*& 17.8+0.7*& 32,5+8,0*& 32.5+8.0*& Соединение III (1.4 мг/кг) Compound III (1.4 mg/kg) 19,0+1,1* 19.0+1.1* 39,9+9,5*& 39.9+9.5*&

Таблица 8. Клинические проявления аллергического ринита у морских свинок при терапии животных Соединением IV (М±m, n=10)Table 8. Clinical manifestations of allergic rhinitis in guinea pigs treated with Compound IV (M±m, n=10)

Группа Group Количество чихов/2часа Number of sneezes / 2 hours Количество почесываний носа/2 часа Number of nose scratches / 2 hours Ложная иммунизация False immunization 3,2±1,06 3.2±1.06 6,5+2,33 6.5+2.33 Контроль Control 15,2+2,1* 15.2+2.1* 20,8+4,2* 20.8+4.2* Соединение IV (0.14 мг/кг) Compound IV (0.14 mg/kg) 1,4+0,67 & 1.4+0.67 & 5,3+1,14 5.3+1.14 Соединение IV (1.4 мг/кг) Compound IV (1.4 mg/kg) 1,4+0,6 & 1.4+0.6 & 1,8+1& 1.8+1&

Внутрижелудочное введение морским свинкам Соединений I, III, IV выраженно снижало количество клинических проявлений ринита. Полученные результаты дают основание заключить, что Соединения I, III, IV оказывают выраженное терапевтическое действие при аллергическом рините.Intragastric administration of Compounds I, III, IV to guinea pigs significantly reduced the number of clinical manifestations of rhinitis. The results obtained give grounds to conclude that Compounds I, III, IV have a pronounced therapeutic effect in allergic rhinitis.

Исследование активности Соединения I in vivo на модели формалин-индуцированного острого риносинусита у крысStudy of the activity of Compound I in vivo on the model of formalin-induced acute rhinosinusitis in rats

Индукцию острого риносинусита проводили у крыс-самцов Вистар путем интраназального введения 20 мкл 7,5% формалина в каждый носовой ход. Соединение I вводили в дозах 1.8 мг/кг и 18 мг/кг ежедневно один раз в сутки, начиная через 24 ч после введения формалина, последнее введение происходило на 7-е сутки. Дексаметазон (0.6 мг/кг) вводили в том же режиме. На 8-е сутки производили забор назального смыва. В назальном смыве оценивали суммарное количество лейкоцитов и определяли лейкоцитарную формулу.Acute rhinosinusitis was induced in male Wistar rats by intranasal administration of 20 µl of 7.5% formalin into each nasal passage. Compound I was administered at doses of 1.8 mg/kg and 18 mg/kg daily once a day, starting 24 hours after the administration of formalin, the last administration occurred on the 7th day. Dexamethasone (0.6 mg/kg) was administered in the same regimen. On the 8th day, a nasal wash was taken. In the nasal wash, the total number of leukocytes was assessed and the leukocyte formula was determined.

Анализ назального смыва показал, что острый риносинусит сопровождается выраженным притоком лейкоцитов в полость носа. Максимальное увеличение было отмечено в отношении количества макрофагов (табл. 9).Analysis of nasal wash showed that acute rhinosinusitis is accompanied by a pronounced influx of leukocytes into the nasal cavity. The maximum increase was noted in relation to the number of macrophages (Table 9).

Внутрижелудочное введение исследуемого соединения крысам снизило содержание макрофагов и нейтрофилов в назальном смыве до уровня интактных животных. По выраженности действия Соединение I не уступало дексаметазону (табл. 9).Intragastric administration of the test compound to rats reduced the content of macrophages and neutrophils in the nasal wash to the level of intact animals. Compound I was as effective as dexamethasone (Table 9).

- 15 042698- 15 042698

Таблица 9. Количество клеточных элементов в назальном смыве крыс на модели острого риносинусита (М±m, n=10)Table 9. The number of cellular elements in the nasal wash of rats on the model of acute rhinosinusitis (M±m, n=10)

Группы Groups Количество клеточных элементов в 1 мкл назального The number of cellular elements in 1 µl of nasal смыва flush Лейкоциты Leukocytes Нейтро филы Neutrofils Эозино филы Eosino phyla Макрофаги macrophages Лимфоциты Lymphocytes Интактные Intact 3420+641 3420+641 3313+632 3313+632 7+5 7+5 67+16 67+16 0+0 0+0 Контроль Control 5568+1015 5568+1015 5217+980 5217+980 16+10 16+10 291+72* 291+72* 0+0 0+0 Соединение I (1.8 мг/кг) Compound I (1.8 mg/kg) 5410+1143 5410+1143 5132+1096 5132+1096 11+11 11+11 231+49* 231+49* 0+0 0+0 Соединение I (18 мг/кг) Compound I (18 mg/kg) 2490+339& 2490+339& 2461+339 & 2461+339 & 0+0 0+0 28+7& 28+7& 0+0 0+0 Дексаметаз он (0.6 мг/кг) Dexametazon (0.6 mg/kg) 1735+451* & 1735+451* & 1664+433* & 1664+433* & 0+0 0+0 68+23& 68+23& 0+0 0+0

Примечания:Notes:

* - отличие от интактной группы по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05* - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05

Таким образом, полученные результаты показали, что Соединение I оказывает выраженное терапевтическое действие при риносинусите.Thus, the results obtained showed that Compound I has a pronounced therapeutic effect in rhinosinusitis.

Исследование активности Соединения I in vivo на модели неинфекционного фарингита у крыс Модель неинфекционного фарингита реализовали на крысах-самцах линии Вистар. Крысам производили анестезию натрий-тиопентоном (50 мг/кг, внутрибрюшинно) и в наружную яремную вену вставляли канюлю с трубкой из силиконового каучука RenaSil® (SIL 037, Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA) с помощью гепаринизированного физиологического раствора (40 ЕД/мл). Краситель Эванс голубой (Evans Blue, ЭГ) (30 мг/кг) вводили всем животным внутривенно через катетер; через 10 мин после введения красителя ЭГ на поверхность слизистой глотки наносили 30%-ый раствор формалина следующим образом: язык слегка вытаскивали, область глотки открывали глубоко в полости рта с помощью тупых щипцов и осторожно стерильным ватным тампоном 3 раза наносили раствор формалина (50 мкл) в течение 5 сек при каждом нанесении. В интактной группе применяли физиологический раствор.Study of the activity of Compound I in vivo on the model of non-infectious pharyngitis in rats The model of non-infectious pharyngitis was implemented on male Wistar rats. Rats were anesthetized with sodium thiopentone (50 mg/kg, ip) and the external jugular vein was cannulated with RenaSil® silicone rubber tubing (SIL 037, Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA) with heparinized saline (40 U /ml). Evans Blue dye (EG) (30 mg/kg) was administered to all animals intravenously through a catheter; 10 minutes after the introduction of the EG dye, a 30% formalin solution was applied to the surface of the pharyngeal mucosa as follows: the tongue was slightly pulled out, the pharynx area was opened deep in the oral cavity using blunt forceps, and formalin solution (50 μl) was carefully applied 3 times with a sterile cotton swab for 5 seconds with each application. In the intact group, physiological saline was used.

Через 60 мин после нанесения 30% раствора формалина животных эвтаназировали путем обескровливания. Головную часть каждой крысы перфузировали гепаринизированным физиологическим раствором (40 ЕД/мл), чтобы удалить внутрисосудистый краситель ЭГ.60 min after applying a 30% formalin solution, the animals were euthanized by exsanguination. The head of each rat was perfused with heparinized saline (40 U/ml) to remove intravascular EG dye.

Степень воспаления оценивали по тесту экссудации красителя Эванса голубого (ЭГ). Краситель ЭГ из ткани экстрагировали в формамид при 55 °С в течение 24 ч и поглощение определяли спектрофотометрически при 620 нм. Количество красителя в ткани рассчитывали, используя стандартную кривую для красителя Эванса голубого, и выражали в микрограммах красителя на грамм сырого веса ткани (мкг/г).The degree of inflammation was assessed by the Evans blue dye (EG) exudation test. The EG dye was extracted from the tissue into formamide at 55°C for 24 h, and the absorption was determined spectrophotometrically at 620 nm. The amount of dye in tissue was calculated using the standard Evans blue dye curve and expressed as micrograms of dye per gram wet weight of tissue (μg/g).

Соединение I вводили внутрижелудочно за 24 и 1 ч до нанесения формальдегида в дозах 6 и 18 мг/кг. Контрольной группе вводили раствор формальдегида с концентрацией 30%. В качестве препаратов сравнения использовали дексаметазон и диклофенак. Дексаметазон (0,6 мг/кг) и диклофенак (8 мг/кг) вводили внутрижелудочно за 24 и 1 ч до нанесения формальдегида. Результаты исследования представлены в табл. 10.Compound I was administered intragastrically 24 and 1 h before application of formaldehyde at doses of 6 and 18 mg/kg. The control group was injected with a formaldehyde solution with a concentration of 30%. Dexamethasone and diclofenac were used as reference drugs. Dexamethasone (0.6 mg/kg) and diclofenac (8 mg/kg) were administered intragastrically 24 and 1 h before formaldehyde application. The results of the study are presented in table. 10.

Из табл. 10 видно, что введение формальдегида (контроль) приводит значительному увеличению концентрации красителя в ткани, что говорит о воспалении глотки у крыс - фарингите. Исследуемое соединение проявило значительную защиту от вызываемого формальдегидом фарингита. Соединение I оказало действие во всех тестируемых дозах (6 и 18 мг/кг) - концентрация красителя в ткани снизилась в 2.8 и 6.4 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Введение дексаметазона (0,6 мг/кг) также приводило к уменьшению воспаления: концентрация красителя снизилась в 2,1 раза. Диклофенак эффекта не оказал.From Table. 10 shows that the introduction of formaldehyde (control) leads to a significant increase in the concentration of the dye in the tissue, which indicates inflammation of the pharynx in rats - pharyngitis. The test compound showed significant protection against formaldehyde-induced pharyngitis. Compound I had an effect at all tested doses (6 and 18 mg/kg) - the concentration of the dye in the tissue decreased by 2.8 and 6.4 times, respectively, compared with the control. The introduction of dexamethasone (0.6 mg/kg) also led to a decrease in inflammation: the concentration of the dye decreased by 2.1 times. Diclofenac had no effect.

Таким образом, полученные результаты показали, что Соединение I оказывает выраженное противовоспалительное действие при фарингите.Thus, the results obtained showed that Compound I has a pronounced anti-inflammatory effect in pharyngitis.

- 16 042698- 16 042698

Таблица 10. Концентрации красителя Эванса голубого в ткани глотки крысTable 10 Evans blue concentrations in rat pharyngeal tissue

Группа Group Концентрация красителя в ткани, мкг/мг Dye concentration in tissue, mcg/mg Интактные Intact 0,029+0,004 0.029+0.004 Контроль (формальдегид - 30%) Control (formaldehyde - 30%) 0,141+0,015* 0.141+0.015* Соединение I (6 мг/кг) Compound I (6 mg/kg) 0,051+0,01б*& 0.051+0.01b*& Соединение I (18 мг/кг) Compound I (18 mg/kg) 0,022+0,003 & 0.022+0.003 & Дексаметазон 0,6 мг/кг Dexamethasone 0.6 mg/kg 0,Обб+О,009*& 0,Obb+O,009*& Диклофенак 8 мг/кг Diclofenac 8 mg/kg 0,112+0,031* 0.112+0.031*

Примечания:Notes:

- * - различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05);- * - differences are statistically significant compared to intact (p<0.05);

- & - различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05).- & - differences are statistically significant compared to intact (p<0.05).

Исследование активности Соединения II на модели блеомицин-индуцированного поражения легкихStudy of the activity of Compound II in a model of bleomycin-induced lung injury

Модель блеомицин-индуцированного поражения легких реализовали по стандартной методике [Am J Respir Cell Mol Biol. 2009 V. 41(1). P. 50-58]. Мышам-самцам линии Balb/c однократно эндотрахеально вводили раствор блеомицина (4 единицы/кг в объеме 50 мкл). Соединение II вводили мышам линии C57BL/6 внутрижелудочно, двукратно - за 1 ч до введения блеомицина и через 12 ч после введения блеомицина. Через 24 ч после введения блеомицина проводили забор бронхоальвеолярного лаважа. В лаваже оценивали суммарное количество лейкоцитов и определяли лейкоцитарную формулу.The model of bleomycin-induced lung injury was implemented according to the standard method [Am J Respir Cell Mol Biol. 2009 V. 41(1). P. 50-58]. Balb/c male mice received a single endotracheal injection of a bleomycin solution (4 units/kg in a volume of 50 µl). Compound II was administered to C57BL/6 mice intragastrically, twice - 1 hour before the administration of bleomycin and 12 hours after the administration of bleomycin. Bronchoalveolar lavage was taken 24 hours after the administration of bleomycin. In lavage, the total number of leukocytes was assessed and the leukocyte formula was determined.

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение Соединения II снижает приток клеток воспаления в бронхоальвеолярное пространство (табл. 11). Это дает основание заключить, что Соединение II оказывает противовоспалительное действие при поражении легкого.The results of the study showed that intragastric administration of Compound II reduces the influx of inflammatory cells into the bronchoalveolar space (Table 11). This gives grounds to conclude that Compound II has an anti-inflammatory effect in lung lesions.

Таблица 11. Количество клеточных элементов в бронхоальвеолярном лаваже мышей на модели блеомицин-индуцированного острого поражения легких (М±m, n=10)Table 11. The number of cellular elements in the bronchoalveolar lavage of mice in the model of bleomycin-induced acute lung injury (M±m, n=10)

Группы Groups Доза соединения, мг/ кг Dose of compound, mg/kg Количество клеточных элементов в 1 мкл бронхоальвеолярном лаваже The number of cellular elements in 1 µl of bronchoalveolar lavage Лейкоциты Leukocytes Нейтрофилы Neutrophils Эозинофилы Eosinophils Макрофаги Macrophages Лимфоциты Lymphocytes Интактные Intact - - 151,32+23,85 151.32+23.85 8,51+4,12 8.51+4.12 0,40+0,30 0.40+0.30 122,15+14,69 122.15+14.69 0,00+0,00 0.00+0.00 Контроль Control - - 412,13±65,00* 412.13±65.00* 212,39±37,00* 212.39±37.00* 0,00±0,00 0.00±0.00 199,74±34,00 199.74±34.00 0,00±0,00 0.00±0.00 Соединение II Compound II 3 3 122,34+15,96 & 122.34+15.96 & 82,77+16,87 *& 82.77+16.87 *& 0,00+0,00 0.00+0.00 39,57+7,91*& 39.57+7.91*& 0,00+0,00 0.00+0.00 30 thirty 199, 12+46, 59 & 199, 12+46, 59 & 55,21+12,53* & 55.21+12.53* & 0,00+0,00 0.00+0.00 143,90+39,26 143.90+39.26 0,00+0,00 0.00+0.00

Примечания * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05Notes * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05

Исследование активности Соединения IV модели липополисахарид-индуцированного острого поражения легких у крысStudy of the activity of Compound IV in a model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats

Модель липополисахарид-индуцированного острого поражения легких реализовали по стандартной методике [Lin Tong, Jing Bi, Xiaodan Zhu, Guifang Wang, Jie Liu, Linyi Rong, Qin Wang,Nuo Xu, Ming Zhong, Duming Zhu, Yuanlin Song, Chunxue Bai. Keratinocyte growth factor-2 is protective inlipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats // Respiratory Physiology & Neurobiology. 2014. V. 201. P. 7-14]. Самкам крыс линии Вистар эндотрахеально вводили раствор липополисахарида (ЛПС), приготовленный на физиологическом растворе. Животным группы ложной патологии вводили физиологический раствор в том же объеме. Через 48 ч после введения ЛПС у животных отбирали бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Взятие БАЛ проводили под наркозом путем промывания легких 5 мл подогретого до 37С физиологического раствора через трахею при помощи шприцевого дозатора.The model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury was implemented according to the standard method [Lin Tong, Jing Bi, Xiaodan Zhu, Guifang Wang, Jie Liu, Linyi Rong, Qin Wang, Nuo Xu, Ming Zhong, Duming Zhu, Yuanlin Song, Chunxue Bai. Keratinocyte growth factor-2 is protective inlipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats // Respiratory Physiology & Neurobiology. 2014. V. 201. P. 7-14]. Female Wistar rats were endotracheally injected with a solution of lipopolysaccharide (LPS) prepared in physiological saline. Animals of the false pathology group were injected with saline in the same volume. Bronchoalveolar lavage (BAL) was taken from the animals 48 hours after LPS administration. BAL was taken under anesthesia by flushing the lungs with 5 ml of saline warmed up to 37C through the trachea using a syringe dispenser.

В жидкости бронхоальвеолярного смыва с помощью камеры Г оряева подсчитывали абсолютное количество клеточных элементов в 1 мкл смыва. Затем бронхоальвеолярный лаваж центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Из осадка клеток готовили мазки, которые в дальнейшем фиксировали в метаноле и окрашивали по Романовскому-Гимзе для подсчета цитограммы.In the bronchoalveolar lavage fluid, the absolute number of cellular elements in 1 µl of lavage was calculated using a Goryaev camera. Then bronchoalveolar lavage was centrifuged at 200 g for 10 min. Smears were prepared from the cell sediment, which were subsequently fixed in methanol and stained according to Romanovsky-Giemsa to calculate the cytogram.

Соединение IV вводили крысам двукратно, внутрижелудочно, за 1 ч до введения ЛПС и через 24 ч после введения ЛПС.Compound IV was administered to rats twice, intragastrically, 1 hour before the administration of LPS and 24 hours after the administration of LPS.

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение Соединения IV снижает приток клеток воспаления в бронхоальвеолярное пространство (табл. 12). Это дает основание заключить, чтоThe results of the study showed that intragastric administration of Compound IV reduces the influx of inflammatory cells into the bronchoalveolar space (Table 12). This gives reason to conclude that

- 17 042698- 17 042698

Соединение IV оказывает противовоспалительное действие при поражении легкого.Compound IV has an anti-inflammatory effect in lung lesions.

Таблица 12. Количество клеточных элементов в бронхоальвеолярном лаваже крыс на моделиTable 12. The number of cellular elements in the bronchoalveolar lavage of rats in the model

ЛПС-индуцированного острого поражения легких (M±m, n=10)LPS-induced acute lung injury (M±m, n=10)

Группы Groups Доза соединен ИЯ, мг/кг Dose connected IA, mg/kg Количество клеточных элементов в 1 мкл бронхоальвеолярном лаваже The number of cellular elements in 1 µl bronchoalveolar lavage Лейкоциты Leukocytes Нейтрофилы Neutrophils Эозинофилы Eosinophils Макрофаги Macrophages Лимфоциты Lymphocytes Интактные Intact - - 2263+311 2263+311 199+59 199+59 0+0 0+0 2063+265 2063+265 0+0 0+0 Ложная патология False pathology 3434+351 3434+351 825+115 825+115 0+0 0+0 2609+302 2609+302 0+0 0+0 Контроль Control - - 12937+1837 , 5*# 12937+1837 , 5*# 3304+597 *# 3304+597 *# 0+0 0+0 9633+1502 *# 9633+1502 *# 0+0 0+0 Соединение IV Compound IV 1.8 1.8 4485+815* & 4485+815* & 785+181& 785+181& 0+0 0+0 3699+653& 3699+653& 0+0 0+0

Примечания * - отличие от группы интактных по критерию Краскела- Уоллиса при р<0,05 # - отличие от группы ложной патологии по критерию КраскелаУоллиса при р<0,05 & - отличие от группы контроля по критерию Краскела- Уоллиса при р<0,05Notes * - difference from the intact group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05 # - difference from the group of false pathology according to the Kruskal-Wallis criterion at p<0.05 & - difference from the control group according to the Kruskal-Wallis criterion at p<0, 05

Исследование активности Соединения II, Соединения IV, Соединения VI, Соединения I на модели лихорадочной реакции у крысStudy of the activity of Compounds II, Compounds IV, Compounds VI, Compounds I in a febrile reaction model in rats

Модель лихорадочной реакции реализовали по стандартной методике [J Neurosci Methods. 2005. V. 147. P. 29-35]. Крысам линии Wistar подкожно вводили 2 0% суспензии пекарских дрожжей (12 мл/кг). Соединения I, II, IV, VI, VIII вводили однократно, внутрижелудочно, через 14 ч после введения дрожжей. Ректальную температуру измеряли электротермометром до введения пирогена и на самой высокой точке развития термической реакции - через 19 ч после него. Антипирогенное действие соединений исследовалось в 2-7 экспериментах.The febrile reaction model was implemented according to the standard method [J Neurosci Methods. 2005. V. 147. P. 29-35]. Wistar rats were injected subcutaneously with a 20% suspension of baker's yeast (12 ml/kg). Compounds I, II, IV, VI, VIII were administered once, intragastrically, 14 h after yeast injection. The rectal temperature was measured with an electrothermometer before pyrogen administration and at the highest point of thermal reaction development, 19 h after it. The antipyrogenic effect of the compounds was studied in 2-7 experiments.

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение исследуемых соединений снизило прирост ректальной температуры тела крыс (табл. 13-17). Полученные данные позволяют заключить, что Соединения I, II, IV, VI, VIII оказывают антипирогенное действие.The results of the study showed that intragastric administration of the test compounds reduced the increase in rectal body temperature in rats (Tables 13-17). The data obtained allow us to conclude that Compounds I, II, IV, VI, VIII have an antipyrogenic effect.

Таблица 13. Прирост ректальной температуры тела через 19 ч после подкожного введения _____________ дрожжей крысам, °С (М±ш, n=30-90)___________Table 13. Increase in rectal body temperature 19 hours after subcutaneous injection of _____________ yeast in rats, °С (M±w, n=30-90)___________

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in the group Прирост ректальной температуры тела, °C Increase in rectal body temperature, °C Интактные Intact - - 70 70 0,05+0,05 0.05+0.05 Контроль Control - - 90 90 1,70+0,06* 1.70+0.06* Соединение II Compound II 0.18 0.18 40 40 1,18+0,08*& 1.18+0.08*& 0.6 0.6 30 thirty 0,78+0,07*& 0.78+0.07*& 1.8 1.8 70 70 1,09+0,06*& 1.09+0.06*& Примечания: * - отличие от группы интактных по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05 & - отличие от группы контроля по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05 Notes: * - difference from the intact group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05 & - difference from the control group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05

- 18 042698- 18 042698

Таблица 14. Прирост ректальной температуры тела через 19 ч после подкожного введения дрожжей ___________________крысам, °С (М±ш, n=30-90)___________________Table 14. Increase in rectal body temperature 19 hours after subcutaneous injection of yeast in ______ rats, °C (M±w, n=30-90)___________________

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in Group Прирост ректальной температуры тела, °C Increase in rectal body temperature, °C Интактные Intact - - 70 70 0,3 0+0,10 0.3 0+0.10 Контроль Control - - 90 90 1,90+0,10* 1.90+0.10* Соединение Compound 0.018 0.018 40 40 0,90+0,10*& 0.90+0.10*& VI VI 0.18 0.18 30 thirty 1,00+0,20*& 1.00+0.20*&

Примечания * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05__________________________________________________________________Notes * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05__________________________________________________________________

Таблица 15. Прирост ректальной температуры тела через 19 ч после подкожного введения дрожжей крысам, °С (М±ш, n=40-70)Table 15. Increase in rectal body temperature 19 hours after subcutaneous injection of yeast in rats, °C (M±w, n=40-70)

Группа Group Доза соединения, мг/ кг Dose of compound, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in the group Прирост ректальной температуры тела, °C Increase in rectal body temperature, °C Интактные Intact - - 50 50 0,01+0,08 0.01+0.08 Контроль Control - - 70 70 1,70±0,07* 1.70±0.07* Соединение I Compound I 0.018 0.018 40 40 1,01+0,09*& 1.01+0.09*& 0.06 0.06 40 40 0,88+0,11*& 0.88+0.11*& 0.18 0.18 50 50 1,01+0,08*& 1.01+0.08*& 0.6 0.6 40 40 0,88+0,11*& 0.88+0.11*& 1. 8 18 50 50 1,14+0,09*& 1.14+0.09*&

Примечания * - отличие от группы интактных по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05 & - отличие от группы контроля по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05_________________________________________________________________Notes * - difference from the intact group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05 & - difference from the control group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05_________________________________________________________________

Таблица 16. Прирост ректальной температуры тела через 19 ч после подкожного введения дрожжей крысам, °С (M±m, n=40-70)Table 16. Increase in rectal body temperature 19 hours after subcutaneous injection of yeast in rats, °С (M±m, n=40-70)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in the group Прирост ректальной температуры тела, °C Increase in rectal body temperature, °C Интактные Intact - - 50 50 0,03+0,07 0.03+0.07 Контроль Control - - 70 70 1,75+0,07* 1.75+0.07* Соедине- ние IV Connect- IV 0.018 0.018 40 40 1,18+0,08*& 1.18+0.08*& 0.06 0.06 40 40 1,28+0,07*& 1.28+0.07*& 0.18 0.18 50 50 1,36+0,05* 1.36+0.05* 0.6 0.6 40 40 1,27+0,09*& 1.27+0.09*&

Примечания * - отличие от группы интактных по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05 & - отличие от группы контроля по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05Notes * - difference from the intact group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05 & - difference from the control group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05

- 19 042698- 19 042698

Таблица 17. Прирост ректальной температуры тела через 19 ч после подкожного введения дрожжей крысам, °С (M±m, n=40-70)Table 17. Increase in rectal body temperature 19 hours after subcutaneous injection of yeast in rats, °С (M±m, n=40-70)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in the group Прирост ректальной температуры тела, °C Increase in rectal body temperature, °C Интактные Intact - - 10 10 0,32+0,21 0.32+0.21 Контроль Control - - 10 10 1,83+0,11* 1.83+0.11* Соединение VIII Compound VIII 1.8 1.8 10 10 1,16+0,12*& 1.16+0.12*&

Примечания * - отличие от группы интактных по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05 & - отличие от группы контроля по критерию Краскела-Уоллиса при р<0,05Notes * - difference from the intact group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05 & - difference from the control group according to the Kruskal-Wallis test at p<0.05

Исследование активности Соединения I и Соединения IV на модели специфической болевой реакции методом химического раздражения брюшины (тест уксусные корчи)Study of the activity of Compounds I and Compounds IV on the model of a specific pain reaction by the method of chemical irritation of the peritoneum (acetic writhing test)

Модель специфической болевой реакции методом химического раздражения брюшины (тест уксусные корчи) реализовали по стандартной методике. Для проведения теста уксусные корчи мышам линии Balb/c интраперитонеально вводили 1% уксусную кислоту в объеме 10 мл на 1 кг массы животного. Соединения I, IV, VII, IX, X вводили внутрижелудочно, однократно, за 1 ч до введения уксусной кислоты. Оценивали количество корчей (судорожные сокращения брюшных мышц, сопровождающихся вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины) за 15 мин после введения уксусной кислоты.The model of a specific pain reaction by the method of chemical irritation of the peritoneum (acetic writhing test) was implemented according to the standard method. To perform the acetic writhing test, Balb/c mice were intraperitoneally injected with 1% acetic acid in a volume of 10 ml per 1 kg of animal weight. Compounds I, IV, VII, IX, X were administered intragastrically, once, 1 hour before the administration of acetic acid. The number of writhings (convulsive contractions of the abdominal muscles, accompanied by stretching of the hind limbs and arching of the back) was assessed 15 minutes after the administration of acetic acid.

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение Соединений I, IV, VII, IX, X выраженно снижает количество корчей у мышей, вызванных внутрибрюшинным введением уксусной кислоты (табл. 18-19). Полученные результаты позволяют заключить, что Соединения I, IV, VII, IX, X оказывают выраженное терапевтическое действие при болевом синдроме.The results of the study showed that intragastric administration of Compounds I, IV, VII, IX, X significantly reduced the number of writhing in mice caused by intraperitoneal administration of acetic acid (table. 18-19). The results obtained allow us to conclude that Compounds I, IV, VII, IX, X have a pronounced therapeutic effect in pain syndrome.

Таблица 18. Количество уксусных корчей на модели специфической болевой реакции методом химического раздражения брюшины (тест уксусные корчи) (М±m, n=10-31)Table 18. The number of acetic writhing in the model of specific pain reaction by the method of chemical irritation of the peritoneum (acetic writhing test) (M±m, n=10-31)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in the group Количество корчей за 15 минут Number of cramps in 15 minutes Контроль Control 31 31 34,68+2,40 34.68+2.40 Соединение I Compound I 0.03 0.03 10 10 22,70+2,14* 22.70+2.14* 0.3 0.3 20 20 13,90+2,23* 13.90+2.23* 3 3 20 20 18,65±2,44* 18.65±2.44* 30 thirty 20 20 21,15+2,97* 21.15+2.97* Соединение IV Compound IV 0.03 0.03 10 10 23,60+2,54* 23.60+2.54* 0.3 0.3 10 10 15,50±2,63* 15.50±2.63* 3 3 10 10 19,20+3,43* 19.20+3.43* 30 thirty 10 10 15,30+3,10* 15.30+3.10* Кеторол Ketorol 15 15 20 20 23,60±1,87* 23.60±1.87*

Примечания * - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05.Notes * - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

Таблица 19. Количество уксусных корчей на модели специфической болевой реакции методом химического раздражения брюшины (тест уксусные корчи) (М±m, n=10-31)Table 19. The number of acetic writhing in the model of specific pain reaction by the method of chemical irritation of the peritoneum (acetic writhing test) (M±m, n=10-31)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Количество животных в группе Number of animals in the group Количество корчей за 15 минут Number of cramps in 15 minutes Контроль Control 10 10 48±5,71 48±5.71 Соединение VII Compound VII 0.3 0.3 10 10 17,6+2,81* 17.6+2.81* Соединение IX Compound IX 0.3 0.3 10 10 11,6±3,5* 11.6±3.5* Соединение X Compound X 0.3 0.3 10 10 17,2+3,4* 17.2+3.4*

Примечания:Notes:

* - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05.* - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

- 20 042698- 20 042698

Исследование активности Соединения I и Соединения II на модели термического болевого раздражения горячая пластинаThe study of the activity of Compounds I and Compounds II on the model of thermal pain stimulation hot plate

Модель термического болевого раздражения горячая пластина реализовали по стандартной методике [Barrot M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012 Jun 1; 211:39-50.]. Соединение I и Соединение II вводили мышам линии Balb/c внутрижелудочно, однократно. Через 1 ч после введения препарата проводили тест горячая пластина. Для проведения теста горячая пластина мышей помещали на горячую пластину, температура (+55±1°С) которой постоянна. Регистрировали время первых проявлений болевой реакции у мышей (облизывание лап, подпрыгивание) и вычисляли среднее латентное время порога болевой чувствительности (ПБЧ, сек) в каждой группе.The model of thermal pain stimulation hot plate was implemented according to the standard method [Barrot M. Tests and models of nociception and pain in rodents. neuroscience. 2012 Jun 1; 211:39-50]. Compound I and Compound II were administered to Balb/c mice intragastrically, once. A hot plate test was performed 1 hour after drug administration. For the hot plate test, mice were placed on a hot plate whose temperature (+55±1°C) was constant. The time of the first manifestations of the pain reaction in mice (licking paws, jumping) was recorded and the average latent time of the pain sensitivity threshold (TPB, sec) was calculated in each group.

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение исследуемых соединений в 1,5 раза увеличило порог болевой чувствительности мышей при проведении теста горячая пластина (табл. 20). Полученные данные позволяют заключить, что Соединение I и Соединение II оказывают выраженный анальгетический эффект при болевом синдроме.The results of the study showed that intragastric administration of the studied compounds increased the threshold of pain sensitivity by 1.5 times in mice during the hot plate test (Table 20). The data obtained allow us to conclude that Compound I and Compound II have a pronounced analgesic effect in pain syndrome.

Таблица 20. Порог болевой чувствительности (ПБЧ) на модели термического болевого раздражения горячая пластина, % к значениям до введения препарата (М±ш, n=20)Table 20. Pain sensitivity threshold (PBC) on the model of thermal pain stimulation hot plate, % of the values before drug administration (M±w, n=20)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Через 1 час, % к фону After 1 hour, % to background Контроль Control 72,51+5,80 72.51+5.80 Соединение I Compound I 0.3 0.3 101,13+9,64* 101.13+9.64* 3 3 95,28+6,79* 95.28+6.79* 30 thirty 104,55+8,52* 104.55+8.52* Соединение II Compound II 0.3 0.3 97,43+6,43* 97.43+6.43* 3 3 90,54+6,59* 90.54+6.59* 30 thirty 110,18+11,9* 110.18+11.9* Примечания: * - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05. Notes: * - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

Исследование активности соединения II на модели спонтанного ожирения у мышей линии db/dbStudy of the activity of compound II in a model of spontaneous obesity in db/db mice

Для моделирования спонтанного ожирения использовали мышей линии db/db, которые несут рецессивный ген leptin receptor-Leprdb-(db) (8-я группа сцепления, 4-я хромосома) [Cardiovasc. Diabetol. 2012. V.11. P. 139-147; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016. V. 472. P. 603-609].To model spontaneous obesity, db/db mice were used, which carry the recessive leptin receptor-Leprdb-(db) gene (linkage group 8, chromosome 4) [Cardiovasc. Diabetol. 2012.V.11. P. 139-147; Biochem. Biophys. Res. commun. 2016. V. 472. P. 603-609].

Соединение II вводили внутрижелудочно, начиная с 7 недели жизни животных. Еженедельно на 612 неделях жизни животных измеряли массу тела животных.Compound II was administered intragastrically, starting from the 7th week of life of the animals. The body weight of the animals was measured weekly at 612 weeks of life of the animals.

Результаты исследования показали, что на модели ожирения внутрижелудочное введение Соединения II в дозе 7.5 мг/кг мышам снижает прирост массы тела db/db-мышей (табл. 21).The results of the study showed that intragastric administration of Compound II at a dose of 7.5 mg/kg to mice reduced body weight gain in db/db mice in an obesity model (Table 21).

Полученные результаты говорят о терапевтическом действии Соединения II при ожирении. Терапевтический эффект начинается уже на 4 неделе применения Соединения II.The results obtained indicate the therapeutic effect of Compound II in obesity. The therapeutic effect begins as early as 4 weeks of application of Compound II.

Исследование активности Соединения II на модели метаболического синдромаStudy of the activity of Compound II in a metabolic syndrome model

Модель метаболического синдрома реализовали путем содержания крыс-самцов линии Wistar в течение 16 недель на высокожировой диете (диета кафетерия) в соответствии со стандартной методикой [Rothwell N.J., Stock M.J., Warwick В. P. Energy balance and brown fat activity in rats fed cafeteria diets or high-fat, semisynthetic diets at several levels of intake//Metabolism. 1985. Vol. 34(5). P. 474-480].The metabolic syndrome model was implemented by keeping male Wistar rats for 16 weeks on a high-fat diet (cafeteria diet) in accordance with the standard methodology [Rothwell N.J., Stock M.J., Warwick B.P. Energy balance and brown fat activity in rats fed cafeteria diets or high-fat, semisynthetic diets at several levels of intake//Metabolism. 1985 Vol. 34(5). P. 474-480].

С 10-й по 16-ю недели диеты животным опытных групп внутрижелудочно один раз в сутки вводили Соединение II. Оценку активности исследуемого соединения проводили с помощью еженедельного измерения массы тела.From the 10th to the 16th week of the diet, Compound II was administered intragastrically once a day to the animals of the experimental groups. The activity of the test compound was assessed by weekly body weight measurements.

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение Соединения II снижает прирост массы тела животных.The results of the study showed that intragastric administration of Compound II reduces the weight gain of animals.

Фармакологическое действие начинает проявляться, начиная с 5-й недели терапии (табл. 22).Pharmacological action begins to appear, starting from the 5th week of therapy (Table 22).

Таким образом, на модели метаболического синдрома Соединение II снижает ожирение животных.Thus, in a metabolic syndrome model, Compound II reduces animal obesity.

- 21 042698- 21 042698

Таблица 21. Прирост массы тела животных относительно начала введения Соединения II на модели спонтанного ожирения у мышей линии db/db (M±m)Table 21. Increase in body weight of animals relative to the start of administration of Compound II in a model of spontaneous obesity in mice of the db/db line (M±m)

Группы Groups Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Возраст животных к моменту снятия показателей, недели Age of animals at the time of reading, weeks 66 77 8 1 9 8 1 9 10 10 11eleven 12 12 Недели введения Соединения 1 Weeks of administration of Compound 1 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 Интактные (db/m) Intact (db/m) 100,0+4, 4 100.0+4.4 100,0+0,9 100.0+0.9 103,3+0,9 103.3+0.9 106,0+0,9 106.0+0.9 109,8+1,5 109.8+1.5 113,3+1,1 113.3+1.1 116,5+1, 5 116.5+1.5 Контроль (db/db) Control (db/db) 100,0+2, 9 100.0+2.9 10 9,6+3,1 10 9.6+3.1 118,3+3,3 118.3+3.3 126,2+3,3 126.2+3.3 131,0±3,4* 131.0±3.4* 134,2+4,2* 134.2+4.2* 139,2+4, 8* 139.2+4.8* Соединение II Compound II 0.75 0.75 100,0+1, 7 100.0+1.7 108,5+1,5 108.5+1.5 119,6+3,7 119.6+3.7 123,9+3,8 123.9+3.8 126,5+4,0* 126.5+4.0* 127,3+4,2* 127.3+4.2* 129,8+5, 2* 129.8+5.2* 7.5 7.5 100,0+2, 3 100.0+2.3 111,4+2,9 111.4+2.9 119,9+2,6 119.9+2.6 122,1+2,5 122.1+2.5 121,7+2,5* & 121.7+2.5* & 121,7+3,1* & 121.7+3.1* & 109,4+4 & 109.4+4&

Примечания * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05Notes * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05

Таблица 22. Масса тела крыс на модели метаболического синдрома (М±ш, n=12)Table 22. Body weight of rats in the metabolic syndrome model (M±w, n=12)

Недели weeks Соединение II (1.5 Compound II (1.5 Недели терапии weeks of therapy Интактные Intact Контроль Control мг/кг) mg/kg) исследования research 0 0 - - 245,50+5,30 245.50+5.30 250,17+3,95 250.17+3.95 239,67+3,27 239.67+3.27 1 1 - - 259,08+5,80 259.08+5.80 312,83+8,84*# 312.83+8.84*# 292,08+4,70* # 292.08+4.70* # 2 2 - - 276,42+6,20# 276.42+6.20# 325,33+7,60*# 325.33+7.60*# 307,33+5,53* # 307.33+5.53* # 3 3 - - 305,00+7,30# 305.00+7.30# 345,08+9,84*# 345.08+9.84*# 327,25+7,81* # 327.25+7.81* # 4 4 - - 327,92+6,50# 327.92+6.50# 374,75+11,28*# 374.75+11.28*# 355,50+9,05* # 355.50+9.05* # 5 5 - - 348,00+5,70# 348.00+5.70# 409,25+12,37*# 409.25+12.37*# 379,42+7,41* # 379.42+7.41* # 6 6 - - 354,83+5,60# 354.83+5.60# 471,33+12,88*# 471.33+12.88*# 443,00+7,70* # 443.00+7.70* # 7 7 - - 321,00+5,60# 321.00+5.60# 498,25+13,08*# 498.25+13.08*# 469,08+6,38* # 469.08+6.38* # 8 8 - - 341,08+5,60# 341.08+5.60# 520,83+13,77*# 520.83+13.77*# 491,83+6,04* # 491.83+6.04* # 9 9 - - 359,17+6,00# 359.17+6.00# 546,50+14,78*# 546.50+14.78*# 518,25+6,04* # 518.25+6.04* # 10 10 1 1 374,17+6,60# 374.17+6.60# 559,08+16,87*# 559.08+16.87*# 528,08+6,01* # 528.08+6.01* # 11 eleven 2 2 394,75+6,80# 394.75+6.80# 571,92+18,62*# 571.92+18.62*# 547,92+8,27* # 547.92+8.27* # 12 12 3 3 393,33+7,90# 393.33+7.90# 579,50+18,66*# 579.50+18.66*# 551,00+8,36* # 551.00+8.36* # 13 13 4 4 394,17+8,50# 394.17+8.50# 592,58+18,47*# 592.58+18.47*# 553,58+8,52* # 553.58+8.52* # 14 14 5 5 396,83+10,20# 396.83+10.20# 613,17+18,86*# 613.17+18.86*# 563, 67+9,75*&# 563, 67+9.75*&# 15 15 6 6 398,42+9,50# 398.42+9.50# 631,50+18,94*# 631.50+18.94*# 570,75+9,13*&# 570.75+9.13*&# 16 16 7 7 397,42+8,30# 397.42+8.30# 627,17+18,72*# 627.17+18.72*# 572,08+8,23*&# 572.08+8.23*&# Примечания: Notes: * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента πρι * - difference from the group of intact according to Student's t-test πρι 1 р<0,05 1 p<0.05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при & - difference from the control group according to Student's t-test at р<0,05 p<0.05 # - отличие от значений на 0 неделе исследования по t-критерию Стьюдента при р<0,05 # - difference from the values at week 0 of the study according to Student's t-test at p<0.05

Исследование активности Соединения I и Соединения II на модели псориаза у мышейStudy of the activity of Compounds I and Compounds II in a mouse model of psoriasis

Индукцию псориаза у мышей осуществляли по стандартной методике [European Journal of Pharmacology. 2015. V. 756. P. 43-51]. Мышам-самкам линии Balb/c наносили крем Алдара (5% имиквимод) на внутреннюю сторону правого уха 1 раз в сутки по 30 мг/мышь в течение 7 дней (0-6 сутки). Интактным животным наносили вазелин. Соединение I, Соединение II и препарат сравнения (циклоспорин) вводили животным внутрижелудочно, ежедневно, 1 раз в сутки в течение 6 дней (0-5е сутки). Эвтаназию проводили через 24 ч (6-е сутки) после последнего нанесения крема Альдара. Ежедневно на 0, 2, 3, 4, 5-е сутки утром перед очередным нанесением крема Алдара и перед эвтаназией измеряли толщину правого уха.The induction of psoriasis in mice was carried out according to the standard method [European Journal of Pharmacology. 2015. V. 756. P. 43-51]. Balb/c female mice were treated with Aldara cream (5% imiquimod) on the inner side of the right ear once a day at 30 mg/mouse for 7 days (0-6 days). Vaseline was applied to intact animals. Compound I, Compound II and reference drug (cyclosporine) were administered to animals intragastrically, daily, 1 time per day for 6 days (0-5th day). Euthanasia was performed 24 hours (day 6) after the last application of Aldara cream. Daily on days 0, 2, 3, 4, 5 in the morning before the next application of Aldara cream and before euthanasia, the thickness of the right ear was measured.

Оценку выраженности псориаза проводили по измерению прироста толщины пораженного уха в динамике.The severity of psoriasis was assessed by measuring the increase in the thickness of the affected ear in dynamics.

Результаты исследования представлены в табл. 23.The results of the study are presented in table. 23.

- 22 042698- 22 042698

Таблица 23. Прирост толщины пораженного уха в определенный день исследования к 0 дню на модели псориаза у мышей, % (М±ш, n=10)Table 23. Increase in the thickness of the affected ear on a certain day of the study to day 0 in a model of psoriasis in mice, % (M±w, n=10)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Прирост толщины уха в определенный день исследования к 0 дню, % Increase in ear thickness on a certain day of the study to day 0, % 3 сутки 3 days 4 сутки 4 days 5 сутки 5 days 6 сутки 6 days Интактные Intact - - 4, 8 6± 0, 9 4.8 6± 0.9 7, 8± 0, 98 7, 8± 0.98 9, 81± 1,83 9, 81± 1.83 14, 8± 1,3 14.8± 1.3 Контроль Control - - 4 0,3+ 5, 3* 4 0.3+ 5.3* 67,7+ 7,9* 67.7+ 7.9* 82, 6± 9, 5* 82.6± 9.5* 101± 9, 8* 101± 9, 8* Соединение I Соединение II Compound I Compound II 0.3 0.3 38,3+ 5, 8* 38.3+ 5.8* 45, 2± 4, 1*& 45.2± 4, 1*& 57,3± 3, 9*& 57.3± 3.9*& 62,8 + 5, 4*& 62.8+ 5, 4*& 0.3 0.3 35, 3± 2,1* 35, 3± 2.1* 4 8, 1± 2,8*& 4 8, 1± 2.8*& 59, 6± 4,5*& 59.6± 4.5*& 7 0, 6± 4,4*& 7 0, 6± 4.4*&

Примечания * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05Notes * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение Соединения I и Соединения II на модели псориаза у мышей снижает прирост толщины пораженного уха животных. Это свидетельствует о терапевтическом действии Соединений I и II при псориазе.The results of the study showed that intragastric administration of Compound I and Compound II in a mouse model of psoriasis reduced the increase in the thickness of the affected animal ear. This indicates the therapeutic effect of Compounds I and II in psoriasis.

Таким образом, на модели псориаза у мышей Соединения I и II оказывают выраженный терапевтический эффект.Thus, in a mouse model of psoriasis, Compounds I and II have a pronounced therapeutic effect.

Исследование активности Соединения I и Соединения II на модели атопического дерматита у мышейStudy of the activity of Compounds I and Compounds II in a model of atopic dermatitis in mice

Модель атопического дерматита реализовали по стандартной методике [J Ginseng Res. 2011. Vol.4. P. 479-86]. Атопический дерматит моделировали на мышах-самцах линии balb/c. В качестве индуктора контактного дерматита использовали 1-хлор-2,4-динитробензол (ДНХБ). На 0 и 12 сутки эксперимента животным на предварительно выбритые участки спины наносили 100 мкл 2% раствора ДНХБ с целью сенсибилизации организма. На 17 сутки на правое опытное ухо животным наносили 20 мкл 2% спиртового раствора ДНХБ дважды с интервалом 1 ч. Интактным животным вместо раствора ДНХБ наносили этанол. Животных в группе ложной иммунизации сенсибилизировали этанолом. Соединение I и Соединение II вводили внутрижелудочно один раз в сутки с 8 по 17 сутки. На 18 сутки проводили забой животных. Для оценки степени отека после эвтаназии определяли массу опытного и контрольного уха. Вычисляли индекс реакции (ИР), выраженный в процентах разницы в массах опытного и контрольного уха.The model of atopic dermatitis was implemented according to the standard method [J Ginseng Res. 2011. Vol.4. P. 479-86]. Atopic dermatitis was modeled on balb/c male mice. 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB) was used as an inducer of contact dermatitis. On the 0th and 12th days of the experiment, 100 μl of a 2% solution of DNCB was applied to the previously shaved areas of the back of the animals in order to sensitize the body. On the 17th day, 20 µl of a 2% alcohol solution of DNCB was applied to the right ear of the animals twice with an interval of 1 hour. Ethanol was applied to intact animals instead of a solution of DNCB. Animals in the sham immunization group were sensitized with ethanol. Compound I and Compound II were administered intragastrically once a day from 8 to 17 days. On the 18th day, the animals were slaughtered. To assess the degree of edema after euthanasia, the mass of the experimental and control ear was determined. The reaction index (RI) was calculated, expressed as a percentage of the difference in the masses of the experimental and control ear.

Результаты исследования представлены в табл. 24.The results of the study are presented in table. 24.

Таблица 24. Разница массы опытного и контрольного уха мышей и индекс реакции на модели атопического дерматита у мышей (М±ш, n=12)Table 24. Difference in the mass of the experimental and control mouse ear and the response index to the model of atopic dermatitis in mice (M±w, n=12)

Название группы Group name Разница массы опытного и контрольного уха (мг) Difference in mass of experimental and control ear (mg) Индекс реакции (%) Reaction index (%) Интактная Intact -0,001+0,002 -0.001+0.002 -0,82+5,3 -0.82+5.3 Ложная иммунизация Контроль патологии Соединение I (3 мг/кг) Соединение II (3 мг/кг) False immunization Pathology control Compound I (3 mg/kg) Compound II (3 mg/kg) 0,018+0,003* 0,029+0,002*# 0,007+0,003 #& 0,013+0,002* & 0.018+0.003* 0.029+0.002*# 0.007+0.003 #& 0.013+0.002* & 57,8+11,3* 83,3+6,1* 25,4+10,2*#& 38,1+7,7* & 57.8+11.3* 83.3+6.1* 25.4+10.2*#& 38.1+7.7* & Примечания: * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 # - отличие от группы ложной иммунизации по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05 Notes: * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 # - difference from the sham immunization group by t-test Student at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05

Результаты исследования показали, что внутрижелудочное введение Соединения I и Соединения II на модели атопического дерматита у мышей снижает индекс реакции патологического процесса. Это свидетельствует о терапевтическом действии Соединений I и II при атопическом дерматите.The results of the study showed that intragastric administration of Compounds I and Compounds II in a model of atopic dermatitis in mice reduces the reaction index of the pathological process. This indicates the therapeutic effect of Compounds I and II in atopic dermatitis.

Таким образом, на модели атопического дерматита у мышей Соединения I и II оказывают выраженный терапевтический эффект.Thus, in a mouse model of atopic dermatitis, Compounds I and II have a pronounced therapeutic effect.

- 23 042698- 23 042698

Исследование влияния Соединения II на хемотаксис макрофагов In vivo на модели каррагенинового мешочкаStudy of the effect of Compound II on macrophage chemotaxis In vivo using a carrageenan sac model

Для оценки эффективности действия лекарственного препарата на активность клеток иммунной системы на доклиническом этапе исследований как правило используются различные модели острого воспалительного процесса. На сегодняшний день наиболее часто используют модели, в которых паталогический процесс развивается в ограниченной полости. Данные модели позволяют достаточно близко сымитировать заболевания при котором аберрантная активностью клеток иммунной системы локализуется в определенной полости (перитонит, холангит, артрит) (J Pharmacol Toxicol Methods. 1994 Nov; 32(3):13947). Модель каррагенинового мешочка часто используется на доклиническом этапе исследований для исследования паталогических процессов, связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы, локализованной в изолированной полости. В этой модели изолированный мешочек формируется подкожной инъекцией воздуха во внутрикапсульную область спины мыши или крысы. Подкожная инъекция воздуха в область спины, за несколько дней приводит к морфологическим изменениям в клеточной выстилке мешочка. Мешочек состоит главным образом из макрофагов и фибробластов и хорошо васкуляризирован. На шестой день от момента формирования воздушного мешочка в полость воздушного мешочка вводят раствор λ-каррагенина.To assess the effectiveness of the action of a drug on the activity of cells of the immune system at the preclinical stage of research, various models of an acute inflammatory process are usually used. To date, the most commonly used models in which the pathological process develops in a limited cavity. These models allow to closely simulate diseases in which the aberrant activity of immune system cells is localized in a certain cavity (peritonitis, cholangitis, arthritis) (J Pharmacol Toxicol Methods. 1994 Nov; 32(3):13947). The carrageenan sac model is often used at the preclinical stage of research to study pathological processes associated with aberrant activity of immune system cells localized in an isolated cavity. In this model, an isolated pouch is formed by subcutaneous injection of air into the intracapsular region of the mouse or rat back. Subcutaneous injection of air into the dorsal area leads to morphological changes in the cellular lining of the sac within a few days. The sac is composed mainly of macrophages and fibroblasts and is well vascularized. On the sixth day from the moment of formation of the air sac, a solution of λ-carrageenan is injected into the cavity of the air sac.

Каррагенин взаимодействует с рецепторами TLR4 на поверхности макрофагов, выстилающих внутрикапсульную область мешочка, что вызывает их активацию и последующий синтез хемокинов и других медиаторов (IL-1; IL-6; TNFa, IL-8, простагландинов и лейкотриенов, NO) и также к миграцию клеток иммунной системы внутрь мешочка.Carrageenan interacts with TLR4 receptors on the surface of macrophages lining the intracapsular region of the sac, which causes their activation and subsequent synthesis of chemokines and other mediators (IL-1; IL-6; TNFa, IL-8, prostaglandins and leukotrienes, NO) and also to migration cells of the immune system inside the sac.

Исследование активности Соединения II выполняли на мышах-самцах линии Balb/с по стандартной методике (Curr Protoc Pharmacol. 2012 Mar;Chapter 5:Unit5.6). Опытным группам животным внутрижелудочно вводили Соединение II в дозе 3 мг/кг сразу перед введением каррагенина и затем каждые 10-12 ч. Последнее введение - за 12 ч до забоя.The study of the activity of Compound II was performed on Balb/c male mice according to the standard method (Curr Protoc Pharmacol. 2012 Mar;Chapter 5:Unit5.6). Experimental groups of animals were injected intragastrically with Compound II at a dose of 3 mg/kg immediately before the introduction of carrageenan and then every 10-12 hours. The last injection was 12 hours before slaughter.

Спустя 48 ч после инъекции λ-каррагенина отдельные группы животных подвергались эвтаназии ингаляцией СО2. Сразу же после эвтаназирования внутрь мешочка стерильным шприцом 25G вводили 1 мл физиологического раствора, содержащего 5,4 mM EDTA, комнатной температуры. После легкого массажа области воздушного мешочка делали саггитальный разрез поперек мешочка и дозатором собирали экссудат в стерильные пробирки объемом 15 мл. В экссудате с помощью камеры Г оряева определяли абсолютное количество клеточных элементов на 1 мкл смыва (цитоз). Затем экссудат центрифугировали при 200 g в течение 10 минут. Из осадка клеток готовили мазки, которые в дальнейшем фиксировали в метаноле (5 мин) и окрашивали по Романовскому-Гимзе (40 мин при t 20-22°C). На мазках рутинным способом под микроскопом Olympus bx51 (на увеличении 100) подсчитывали количество макрофагов. Подсчет клеток производили до 100 шт.48 hours after the injection of λ-carrageenan, separate groups of animals were euthanized by inhalation of CO 2 . Immediately after euthanasia, 1 ml of saline containing 5.4 mM EDTA at room temperature was injected into the pouch with a sterile 25G syringe. After a light massage of the area of the air sac, a sagittal incision was made across the sac, and the exudate was collected with a dispenser into sterile 15 ml tubes. In the exudate, the absolute number of cellular elements per 1 μl of washout (cytosis) was determined using a Goryaev camera. Then the exudate was centrifuged at 200 g for 10 minutes. Smears were prepared from the cell sediment, which were subsequently fixed in methanol (5 min) and stained according to Romanovsky-Giemsa (40 min at t 20–22°C). On smears, the number of macrophages was counted routinely under an Olympus bx51 microscope (at a magnification of 100). Cells were counted up to 100 pcs.

Проведенные исследования показали, что применение Соединения II в 10 раз снизило приток лейкоцитов и макрофагов (до уровня интактного контроля) (табл. 25). Таким образом, Соединение II может иметь потенциал для терапии широкого круга заболеваний, таких как болезнь Крона, язвенный колит, перитониты и артриты.Studies have shown that the use of Compound II reduced the influx of leukocytes and macrophages by 10 times (to the level of intact control) (Table 25). Thus, Compound II may have potential in the treatment of a wide range of diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis, peritonitis and arthritis.

Таблица 25. Количество клеток иммунной системы в экссудате из каррагенинового мешочка при исследовании активности Соединения II на модели хемотаксиса макрофагов (каррагениновый мешочек), х 109/л (М±m, n= 10)Table 25. The number of cells of the immune system in the exudate from the carrageenan sac in the study of the activity of Compound II on the model of macrophage chemotaxis (carrageenan sac), x 109/l (M±m, n= 10)

Группы Groups Количество клеточных элементов в 1мкл экссудата, х109The number of cellular elements in 1 µl of exudate, x10 9 /l Лейкоциты Leukocytes Макрофаги Macrophages Интактные Intact 0,9+0,2 0.9+0.2 0,6+0,1 0.6+0.1 Контроль Control 9, 9+1,5* 9, 9+1.5* 7,7+1,5* 7.7+1.5* Соединение II (3 мг/кг) Compound II (3 mg/kg) 1,0+0,1 & 1.0+0.1 & 0,5+0,1 & 0.5+0.1 &

* - различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05) & - различия статистически значимы по сравнению с контрольными (р<0,05)* - differences are statistically significant compared to intact (p<0.05) & - differences are statistically significant compared to controls (p<0.05)

Исследование влияния Соединения II на хемотаксис макрофагов in vivo на модели тиогликолятного перитонитаStudy of the effect of Compound II on macrophage chemotaxis in vivo in a model of thioglycolate peritonitis

Исследование выполнено на мышах-самцах линии balb/c по стандартной методике (J Leukoc Biol. 2009 Aug;86(2):361-70). Мышам контрольной группы внутрибрюшинно вводили 2 мл 3% тиогликолевой среды, хранившейся в течение 1 месяца. Интактным животным внутрибрюшинно вводили 2 мл физиологического раствора. Опытным группам животным внутрижелудочно вводили Соединения II за 1 ч до введения тиогликолята, 24 и 48 ч после введения тиогликолята в дозе 1 мг/кг. Через 72 ч животных эвтаназировали в СО2-камере, область брюшины смачивали 70% спиртом, аккуратно срезали кожу на брюшThe study was performed on male mice of the balb/c line according to the standard method (J Leukoc Biol. 2009 Aug;86(2):361-70). Mice of the control group were intraperitoneally injected with 2 ml of 3% thioglycol medium, stored for 1 month. Intact animals were intraperitoneally injected with 2 ml of saline. Compounds II were intragastrically administered to experimental groups of animals 1 hour before the administration of thioglycolate, 24 and 48 hours after the administration of thioglycolate at a dose of 1 mg/kg. After 72 hours, the animals were euthanized in a CO2 chamber, the peritoneal area was moistened with 70% alcohol, and the skin on the abdomen was carefully cut off.

- 24 042698 ной полости, шприцом внутрибрюшинно вводили 5 мл холодного фосфатно-солевого буфера, содержащего 0.1% ЭДТА. После легкого массажа брюшной полости экссудат собирали шприцом в пробирки, определяли объем собранного экссудата. В экссудате с помощью камеры Горяева определяли абсолютное количество клеточных элементов на 1 мкл смыва (цитоз). Затем эксудат центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Из осадка клеток готовили мазки, которые в дальнейшем фиксировали в метаноле (5 мин) и окрашивали по Романовскому-Гимзе (40 мин при t 20-22°С).- 24 042698 of the cavity, 5 ml of cold phosphate-buffered saline containing 0.1% EDTA was injected intraperitoneally with a syringe. After a light massage of the abdominal cavity, the exudate was collected with a syringe into test tubes, and the volume of the collected exudate was determined. In the exudate, using a Goryaev camera, the absolute number of cellular elements per 1 μl of washout (cytosis) was determined. Then the exudate was centrifuged at 200 g for 10 min. Smears were prepared from the cell sediment, which were subsequently fixed in methanol (5 min) and stained according to Romanovsky-Giemsa (40 min at t 20–22°C).

На мазках рутинным способом под микроскопом Olympus Ьх51 (на увеличении 100) подсчитывали количество моноцитов/макрофагов. Подсчет клеток производили до 100 шт.On smears, the number of monocytes/macrophages was counted in a routine way under an Olympus bx51 microscope (at a magnification of 100). Cells were counted up to 100 pcs.

Проведенные исследования показали, что применение Соединения II снижает приток макрофагов в перитонеальную полость крыс, индуцированный 3% тиогликолиевой средой и снижает тяжесть паталогии индуцированной введением тиогликолиевой средой (табл. 26). Таким образом, Соединение II может иметь потенциал для терапии перитонитов, болезни Крона и язвенного колита.Studies have shown that the use of Compound II reduces the influx of macrophages into the peritoneal cavity of rats induced by 3% thioglycol medium and reduces the severity of pathology induced by the introduction of thioglycol medium (Table 26). Thus, Compound II may have potential for the treatment of peritonitis, Crohn's disease and ulcerative colitis.

Таблица 26. Количество клеток иммунной системы в экссудате из брюшной полости при исследовании активности Соединения II на модели хемотаксиса макрофагов (тиогликолятный перитонит), ____________________________х109/л (М±m, n=10)_______________________Table 26. The number of cells of the immune system in the exudate from the abdominal cavity in the study of the activity of Compound II on the model of macrophage chemotaxis (thioglycolate peritonitis), ____________________________x10 9 /l (M±m, n=10) _______________________

Группы Groups Количество клеточных элементов в 1мкл экссудата, х109The number of cellular elements in 1 µl of exudate, x10 9 /l Лейкоциты Leukocytes Моноциты Monocytes Интактные Intact 0,71±0,09 0.71±0.09 0,б1±0,07 0.61±0.07 Контроль Control 3,99±0,42* 3.99±0.42* 3,бб±О,44* 3.bb±0.44* Соединение II (1 мг/кг) Compound II (1 mg/kg) 1,97±0,36*& 1.97±0.36*& 0,65±0,12& 0.65±0.12& * - различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0Л05) & - различия статистически значимы по сравнению с контрольными (р<0,05)* - differences are statistically significant compared to intact (p<0 L 05) & - differences are statistically significant compared to controls (p<0.05)

Исследование активности Соединения II и Соединения I на модели адъювантного артрита, индуцированного введением полного адъюванта ФрейндаStudy of the activity of Compounds II and Compounds I in a model of adjuvant arthritis induced by administration of complete Freund's adjuvant

Модель адъювантного артрита реализовали на беспородных крысах-самцах по стандартной методике [Chem Pharm Bull (Tokyo). 2018. V.66(4). P.410-415]. Ha 0 и 5 сутки в правую заднюю конечность животных субплантарно вводили полный адъювант Фрейнда (Freund's Adjuvant, Complete (Pierce)) в объеме 100 мкл на животное. Объем правой задней лапы (пораженной) и левой задней лапы (контрлатеральной) измеряли на 0, 14, 16, 18, 21, 25, 28 и 30 сутки с помощью плетизмометра (Ugo Basel). По изменению объема пораженной лапы судили о первичной (воспалительной) реакции, по изменению объема контрлатеральной лапы судили о вторичной (иммунной) реакции. Соединение II вводили внутрижелудочно, ежедневно, 1 раз в сутки, с 14 по 30-е сутки исследования.The model of adjuvant arthritis was implemented on outbred male rats according to the standard method [Chem Pharm Bull (Tokyo). 2018. V.66(4). P.410-415]. On days 0 and 5, Freund's Adjuvant, Complete (Pierce) was subplantarly injected into the right hind limb of the animals in a volume of 100 μl per animal. The volume of the right hind paw (affected) and left hind paw (contralateral) were measured on days 0, 14, 16, 18, 21, 25, 28 and 30 using a plethysmometer (Ugo Basel). The change in the volume of the affected paw was judged on the primary (inflammatory) reaction, on the change in the volume of the contralateral paw was judged on the secondary (immune) reaction. Compound II was administered intragastrically, daily, once a day, from the 14th to the 30th day of the study.

Результаты исследования представлены в табл. 27-28.The results of the study are presented in table. 27-28.

Проведенное исследование показало, что применение Соединения II снижает прирост объема как пораженной лапы, так и контрлатеральной лапы. Это позволяет заключить о наличии у Соединения II как противовоспалительного действия, так и иммунотропного действия. Таким образом, Соединение II имеет высокий терапевтический потенциал для лечения ревматоидного артрита и других видов артритов, а также артрозов.The study showed that the use of Compound II reduces the increase in volume of both the affected paw and the contralateral paw. This allows us to conclude that Compound II has both an anti-inflammatory effect and an immunotropic effect. Thus, Compound II has a high therapeutic potential for the treatment of rheumatoid arthritis and other types of arthritis, as well as arthrosis.

Таблица 27. Прирост объема пораженной лапы на модели адъювантного артрита, индуцированного введением полного адъюванта Фрейнда, % (М±m, n=10)Table 27. Increase in the volume of the affected paw in the model of adjuvant arthritis induced by the introduction of complete Freund's adjuvant, % (M±m, n=10)

Группа Group Доза соединения , мг/кг Compound dose, mg/kg Прирост объема пораженной лапы, % к исходному уровню Increase in the volume of the affected paw, % to the initial level 14 сутки 14 day 16 сутки 16 day 18 сутки 18 day 21 сутки 21 days 25 сутки 25 day 28 сутки 28 day 30 сутки 30 days Интактные Intact 1,8+0,8 1.8+0.8 1,9+0,7 1.9+0.7 1,4+0,3 1.4+0.3 1,9+0,4 1.9+0.4 2,2+0,2 2.2+0.2 2,7+0,2 2.7+0.2 3+0,2 3+0.2 Контроль Control 122,3+6, 4* 122.3+6.4* 118,7+5, 6* 118.7+5.6* 114,3+2, 1* 114.3+2.1* 98,9+3,2 98.9+3.2 100,6+2, 6* 100.6+2.6* 102,5+1, 8* 102.5+1.8* 101,4±2,8* 101.4±2.8* Соединение II Compound II 0.5 0.5 118,8+3, 6* 118.8+3.6* 105+3,2* 105+3.2* 104,4+2, 7*& 104.4+2, 7*& 86,3±3,9 *& 86.3±3.9 *& 88,5+2,4 *& 88.5+2.4 *& 86,9±2,3 *& 86.9±2.3 *& 83,2+2,2*& 83.2+2.2*&

Примечание * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05 & - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05.Note * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05 & - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

- 25 042698- 25 042698

Таблица 28. Прирост объема контрлатеральной лапы на модели адъювантного артрита, индуцированного введением полного адъюванта Фрейнда, % (М±m, n=10)Table 28. Increase in the volume of the contralateral paw in the model of adjuvant arthritis induced by the introduction of complete Freund's adjuvant, % (M±m, n=10)

Группа Group Доза соединения, мг/кг Compound dose, mg/kg Прирост объема контрлатеральной лапы, % к исходному уровню Increase in the volume of the contralateral paw, % to the initial level 14 сутки 14 day 16 сутки 16 day 18 сутки 18 day 21 сутки 21 days 25 сутки 25 day 28 сутки 28 day 30 сутки 30 days Интактные Intact 1,27±0,3 1.27±0.3 1,59+0,4 8 1.59+0.4 8 1,77+0,2 5 1.77+0.2 5 1,62±0,31 1.62±0.31 2,18+0,3 2.18+0.3 2,76+0,1 6 2.76+0.16 2,98±0,3 2.98±0.3 Контроль Control 5,48+0,5 8* 5.48+0.58* 7,08+1,2 4* 7.08+1.2 4* 21,69+1, 28* 21.69+1.28* 25,29+1,6 9* 25.29+1.6 9* 2 0,16+1, 66* 2 0.16+1.66* 18,75+1, 13* 18.75+1, 13* 17,51+1,59* 17.51+1.59* Соединение II Compound II 0.5 0.5 5,39+1,6 7* 5.39+1.6 7* 6, 75+1,5 8* 6, 75+1.5 8* 18,48+1* 18.48+1* 19,77+1,6 7*& 19.77+1.6 7*& 15,45+1, 21*& 15.45+1, 21*& 14,04+1, 75*& 14.04+1.75*& 13,02+0,94* & 13.02+0.94* &

Примечание * - отличие от группы интактных по t-критерию Стьюдента при р<0,05.Note * - difference from the intact group according to Student's t-test at p<0.05.

& - отличие от группы контроля по t-критерию Стьюдента при р<0,05.& - difference from the control group according to Student's t-test at p<0.05.

Исследование активности Соединения II на модели каррагенинового отекаStudy of the activity of Compound II on the model of carrageenan edema

Для оценки влияния Соединения II на функциональный статус иммунной была использована модель каррагенин-индуцированного отека лапы крыс. Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах самцах массой 250-270 г. Острое воспаление лапы у крыс вызывали интраплантарным введением (подкожно) в объеме 0,1 мл в правую лапу 1.5% раствора каррагенина. Исследуемое соединение вводили внутрижелудочно за 1 ч до введения каррагенина. Действие Соединения II и контрольного вещества (диклофенак) оценивали по степени снижения отека лапы в сравнении с интактной левой лапой. Объем лапы оценивали до введения Соединения II и через 2 ч после введения каррагенина.To assess the effect of Compound II on the functional status of the immune system, a model of carrageenan-induced rat paw edema was used. The experiments were performed on non-linear white male rats weighing 250-270 g. Acute paw inflammation in rats was induced by intraplantar (subcutaneous) injection of 1.5% carrageenan solution into the right paw in a volume of 0.1 ml. The test compound was administered intragastrically 1 hour before the administration of carrageenan. The effect of Compound II and the control substance (diclofenac) was evaluated by the degree of reduction in paw edema compared to the intact left paw. Paw volume was assessed prior to administration of Compound II and 2 hours after administration of carrageenan.

Результаты исследования представлены в табл. 29.The results of the study are presented in table. 29.

Таблица 29. Влияние Соединения II на торможение прироста отека лапы крыс (относительно контроля) в модели каррагенин-индуцированного отекаTable 29. Effect of Compound II on the inhibition of the increase in rat paw edema (relative to control) in a model of carrageenan-induced edema

Группа Group Индукция патологии pathology induction Введение препаратов Introduction of drugs Сроки проведения оценки Timing of the assessment Торможение прироста отека, % Inhibition of edema growth, % Интактные Intact Интраплантар ное введение в объеме 0,1 мл в правую лапу 1.5% раствора каррагенина Intraplantar introduction in a volume of 0.1 ml into the right paw of 1.5% solution of carrageenan Внутрижелудочно, однократно, за 1 ч до введения каррагенина Intragastrically, once, 1 hour before the administration of carrageenan через 2 ч после введения каррагенина 2 hours after administration of carrageenan 0 0 Контроль Control 0 0 Соединение II (1.8 мг/кг) Compound II (1.8 mg/kg) 34 34 Соединение II (0.18 мг/кг) Compound II (0.18 mg/kg) 34 34 Диклофенак натрия (8 мг/кг) Diclofenac sodium (8 mg/kg) 42 42

Из приведенных результатов видно, что Соединение II обладает прямым тормозящим действием на прирост отека лапы и может быть использовано для лечения широкого круга заболеваний, связанных с активностью клеток иммунной системы.From these results, it can be seen that Compound II has a direct inhibitory effect on the growth of paw edema and can be used to treat a wide range of diseases associated with the activity of immune system cells.

Изучение активности Соединения II в модели диабетической нефропатии у крысStudy of the activity of Compound II in a model of diabetic nephropathy in rats

Модель диабетической нефропатии у крыс индуцировали длительным содержанием животных на рационе высокожировой диеты и однократным или двукратным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 30 мг/кг (Int J Clin Exp Med. 2015 Apr 15;8(4):6388-96).A model of diabetic nephropathy in rats was induced by long-term maintenance of animals on a high-fat diet and single or double intraperitoneal administration of streptozotocin at a dose of 30 mg/kg (Int J Clin Exp Med. 2015 Apr 15;8(4):6388-96).

Животных содержали на высокожировой диете в течение 16 недель, на 9-ой неделе крысам внутрибрюшинно вводили стрептозотоцин двукратно (2 дня подряд) в дозе 30 мг/кг. Через 7 дней после введения стрептозотоцина начинали введение Соединения II. Субстанцию вводили ежедневно внутрижелудочно один раз в день в дозе 50 мг/кг.The animals were kept on a high-fat diet for 16 weeks; on the 9th week, streptozotocin was intraperitoneally injected twice (2 days in a row) at a dose of 30 mg/kg. 7 days after the administration of streptozotocin, the administration of Compound II was started. The substance was administered daily intragastrically once a day at a dose of 50 mg/kg.

Внутрижелудочное введение Соединения II, начиная с 10 недели исследования, снизило суточное содержание белка в мочи экспериментальных животных до уровня интактного контроля (табл. 30). Полученные результаты позволяют заключить, что Соединение II оказывает терапевтическое действие при диабетической нефропатии.Intragastric administration of Compound II, starting from the 10th week of the study, reduced the daily protein content in the urine of experimental animals to the level of intact control (Table 30). The results obtained allow us to conclude that Compound II has a therapeutic effect in diabetic nephropathy.

--

Claims (2)

Таблица 30. Биохимический анализ мочи после 6 недели внутрижелудочного введения Соединения II крысам в модели диабетической нефропатии, индуцированной высокожировой диетой и введением стрептозотоцина (15 недель высокожировой диеты)Table 30 Urinalysis after 6 weeks of intragastric administration of Compound II to rats in a model of diabetic nephropathy induced by high-fat diet and administration of streptozotocin (15 weeks of high-fat diet) Группы Доза и режим введения стрептозотоцина Кол-во животных Диурез, мл/ 18 ч. Суточный белок, мкг/18ч ACR (белок (мкг/л)/ креатинин (мг/л)Groups Dose and mode of administration of streptozotocin Number of animals Diuresis, ml/ 18 o'clock Daily protein, mcg/18h ACR (protein (mcg/L)/creatinine (mg/L) Интактные - 8 4,35±0, 5 1041,2±153,5 273,2±68,0Intact - 8 4.35±0.5 1041.2±153.5 273.2±68.0 Контроль 30 мг/кг, двукратно 14 8,32±1, 5 3718,2±572,7 -к 952,8±186,4*Control 30 mg/kg, twice 14 8.32±1, 5 3718.2±572.7 -To 952.8±186.4* Соединение II (5 мг/кг) 30 мг/кг, двукратно 12 7,45±1, 0 1846,3±337,6 * & 202,3±26,8 &Compound II (5 mg/kg) 30 mg/kg, twice 12 7.45±1.0 1846.3±337.6 *& 202.3±26.8 & * - различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05) & - различия статистически значимы по сравнению с контрольными (р<0,05)* - differences are statistically significant compared to intact (p<0.05) & - differences are statistically significant compared to controls (p<0.05) Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.While the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be clear that various modifications are possible without departing from the essence of the present invention. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение соединения формулы IV или его фармацевтически приемлемых солей, гидратов или сольватов для предупреждения и/или лечения ринита.1. The use of a compound of formula IV or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or solvate thereof for the prevention and/or treatment of rhinitis. 2. Способ лечения ринита, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевти чески эффективного количества соединения формулы IV или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата.2. A method of treating rhinitis comprising administering to a subject in need of treatment a therapeutically effective amount of a compound of formula IV or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or solvate thereof. Евразийская патентная организация, ЕАПВEurasian Patent Organization, EAPO Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2Russia, 109012, Moscow, Maly Cherkassky per., 2
EA202192892 2018-05-24 2018-05-24 NEW GLUTAMINE CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES EA042698B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201991188 EA044574B1 (en) 2017-05-26 2018-05-24 NEW GLUTAMINYL CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA042698B1 true EA042698B1 (en) 2023-03-15

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240116898A1 (en) Novel glutaminyl cyclase inhibitors and the use thereof in treatment of various diseases
AU6503200A (en) Nicotine in therapeutic angiogenesis and vasculogenesis
RU2727142C2 (en) Bisamide derivative of dicarboxylic acid as agent stimulating tissue regeneration and restoration of reduced functions of tissues
RU2662559C1 (en) New inhibitor of glutaminyl cyclase and its use for treatment of lung and respiratory diseases
JP2019077615A (en) Therapeutic agents for non-alcoholic fatty liver diseases/non-alcoholic steatohepatitis
Li et al. Cabozantinib ameliorates lipopolysaccharide-induced lung inflammation and bleomycin--induced early pulmonary fibrosis in mice
CN111093661B (en) Use of glutarimide derivatives for the treatment of diseases associated with abnormal cytokine activity
AU2011208939B2 (en) Compounds for use in the treatment of diseases
JP2002522398A (en) Pharmaceutical compositions showing efficacy against overproduction and accumulation of extracellular matrix
EA042698B1 (en) NEW GLUTAMINE CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES
RU2685277C1 (en) Use of the bisamide malonic acid derivative for treating allergic and other human and animal diseases
US11376233B2 (en) Composition, containing sarpogrelate as active ingredient, for preventing or treating sensorineural hearing loss
EA044574B1 (en) NEW GLUTAMINYL CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES
US10624883B2 (en) Pulmonary hypertension preventative or therapeutic agent containing component exhibiting selenoprotein P activity-inhibiting effect
EA045566B1 (en) NEW GLUTAMINYL CYCLASE INHIBITORS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES
RU2665633C1 (en) New inhibitor of glutaminyl cyclase and its use
RU2791703C2 (en) New glutamine cyclase inhibitor and its application
EA043907B1 (en) USE OF GLUTARIMIDE DERIVATIVE FOR TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH ABERRANT CYTOKINE ACTIVITY
CN106692972B (en) Formulations containing autophagy inhibitors and their use in the treatment of airway mucus hypersecretion
RU2356555C2 (en) Antineutrophilic agent
OA19594A (en) Use of a glutarimide derivative to treat diseases related to the aberrant activity of cytokines
JP2022533503A (en) Pharmaceutical composition comprising a fraction of Melissa officinalis leaf extract
WO2007117111A1 (en) A phamaceutical composition for treating allergic diseases
Sorbera RDP-58
BG65575B1 (en) Use of amtolmetin guacyl for the prioduction of anti-inflammatory drugs for intestinal inflammations