EA042694B1 - BUFFER-CONTAINING COMPOSITIONS, VACCINES CONTAINING BUFFER-CONTAINING COMPOSITIONS AND WAYS OF THEIR APPLICATION - Google Patents
BUFFER-CONTAINING COMPOSITIONS, VACCINES CONTAINING BUFFER-CONTAINING COMPOSITIONS AND WAYS OF THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA042694B1 EA042694B1 EA202090699 EA042694B1 EA 042694 B1 EA042694 B1 EA 042694B1 EA 202090699 EA202090699 EA 202090699 EA 042694 B1 EA042694 B1 EA 042694B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- norovirus
- composition
- genogroup
- vlp
- vaccine
- Prior art date
Links
Description
Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США 61/506447, поданной 11 июля 2011 г., полное содержание которой включено данный документ посредством ссылки.The present application claims priority over US provisional application 61/506447, filed July 11, 2011, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
Область изобретенияField of invention
Настоящее изобретение относится к области, связанной с вакцинами, в частности, вакцинами от норовирусов. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения композиций вакцины и способам индуцирования и оценивания защитных иммунных ответов против норовируса у людей.The present invention relates to the field of vaccines, in particular norovirus vaccines. In addition, the present invention relates to methods for preparing vaccine compositions and methods for inducing and evaluating protective immune responses against norovirus in humans.
Предпосылки изобретенияBackground of the invention
Норовирусы являются некультивируемыми калицивирусами человека, которые, как выяснилось, являются единственной наиболее важной причиной эпидемических вспышек разновидностей небактериального гастроэнтерита (Glass et al., 2000; Hardy et al., 1999). Клиническое значение норовирусов недооценивали до того, как были разработаны чувствительные анализы молекулярной диагностики. Клонирование генома прототипного вируса Norwalk (NV) геногруппы I и получение вирусоподобных частиц (VLP) с помощью системы экспрессии рекомбинантного бакуловируса привело к разработке анализов, которые выявляют распространенную норовирусную инфекцию (Jiang et al. 1990; 1992).Noroviruses are non-culturable human caliciviruses that have been found to be the single most important cause of epidemic outbreaks of non-bacterial gastroenteritis varieties (Glass et al., 2000; Hardy et al., 1999). The clinical significance of noroviruses was underestimated before sensitive molecular diagnostic assays were developed. Cloning the genome of the prototype genogroup I Norwalk virus (NV) and generating virus-like particles (VLPs) using a recombinant baculovirus expression system has led to the development of assays that detect widespread norovirus infection (Jiang et al. 1990; 1992).
Норовирусы являются вирусами, содержащими одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности, которые содержат несегментированный РНК-геном. Вирусный геном кодирует три открытые рамки считывания, из которых последние две определяют продуцирование главного капсидного белка и малого структурного белка, соответственно (Glass et al. 2000). При экспрессии капсидного белка NV и некоторых других норовирусов на высоком уровне в эукариотических системах экспрессии, он самоорганизуется в VLP, которые структурно имитируют нативные вирионы норовирусов. При исследовании с помощью трансмиссионной электронной микроскопии VLP морфологически неотличимы от инфекционных вирионов, выделенных из образцов фекалий человека.Noroviruses are positive-polarity single-stranded RNA viruses that contain an unsegmented RNA genome. The viral genome encodes three open reading frames, of which the last two determine the production of a major capsid protein and a small structural protein, respectively (Glass et al. 2000). When the NV capsid protein and some other noroviruses are expressed at high levels in eukaryotic expression systems, it self-assembles into VLPs that structurally mimic native norovirus virions. When examined by transmission electron microscopy, VLPs are morphologically indistinguishable from infectious virions isolated from human fecal samples.
Иммунные ответы на норовирусы являются комплексными, и корреляты защиты в настоящее время только выясняют. Исследования на людях-добровольцах, осуществлявшиеся с нативным вирусом, показали, что иммунологическая память слизистых оболочек обеспечивала краткосрочную защиту от инфекции, и позволили предположить, что защита, опосредованная вакциной, является возможной (Lindesmith et al. 2003; Parrino et al. 1977; Wyatt et al, 1974).Immune responses to noroviruses are complex, and the correlates of protection are currently only being elucidated. Studies in human volunteers with native virus showed that mucosal immunological memory conferred short-term protection against infection and suggested that vaccine-mediated protection was possible (Lindesmith et al. 2003; Parrino et al. 1977; Wyatt et al, 1974).
Хотя норовирус невозможно культивировать in vitro, благодаря доступности VLP и их способности вырабатываться в больших количествах был достигнут значительный прогресс в определении антигенной и структурной топографии норовирусного капсида. VLP сохраняют исходную конформацию вирусного капсидного белка, при этом у них отсутствует инфекционный генетический материал. Следовательно, VLP имитируют функциональные взаимодействия вируса с клеточными рецепторами, вызывая, таким образом, соответствующий иммунный ответ хозяина, но при этом у них отсутствует способность к репродукции или способность вызывать инфекцию. Медицинский колледж Бэйлора (Baylor College of Medicine) совместно с NIH изучали гуморальный, мукозный и клеточный иммунные ответы на VLP NV на людях-добровольцах в I фазе академических клинических испытаний, спонсируемых исследователем. Перорально применяемые VLP характеризовались безопасностью и иммуногенностью у здоровых взрослых (Ball et al. 1999; Tacket et al. 2003). Но для появления иммунного ответа требовались многократные дозы с относительно высоким количеством VLP. В других научных центрах доклинические эксперименты на животных моделях продемонстрировали усиление иммунных ответов на VLP при их применении интраназально с адъювантами-бактериальными экзотоксинами (Guerrero et al. 2001; Nicollier-Jamot et al. 2004; Periwal et al. 2003; Souza et al. (2007) Vaccine, Vol. 25(50):8448-59). Однако защитный иммунитет против норовируса у людей остается неясным в связи с тем, что показатели защитного иммунного ответа у людей все еще четко не определены (Herbst-Kralovetz et al. (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307).Although norovirus cannot be cultivated in vitro, due to the availability of VLPs and their ability to be produced in large quantities, significant progress has been made in determining the antigenic and structural topography of the norovirus capsid. VLPs retain the original conformation of the viral capsid protein and lack infectious genetic material. Therefore, VLPs mimic the functional interactions of the virus with cellular receptors, thus eliciting an appropriate host immune response, but lack the ability to reproduce or cause infection. The Baylor College of Medicine collaborated with the NIH to study humoral, mucosal, and cellular immune responses to VLP NV in human volunteers in an investigator-sponsored phase I academic clinical trial. Orally administered VLPs have been shown to be safe and immunogenic in healthy adults (Ball et al. 1999; Tacket et al. 2003). But multiple doses with a relatively high amount of VLP were required to generate an immune response. In other centers, preclinical experiments in animal models have demonstrated an increase in immune responses to VLPs when administered intranasally with bacterial exotoxin adjuvants (Guerrero et al. 2001; Nicollier-Jamot et al. 2004; Periwal et al. 2003; Souza et al. ( 2007) Vaccine, Vol 25(50):8448-59). However, protective immunity against norovirus in humans remains unclear due to the fact that measures of protective immune response in humans are still not well defined (Herbst-Kralovetz et al. (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307).
Краткое описание настоящего изобретенияBrief description of the present invention
Настоящее изобретение частично основано на открытии, что однократная доза норовирусной вакцины вызывает быстрый, сильный защитный иммунный ответ против норовируса у людей при парентеральном введении. Соответственно, в настоящем изобретении представлен способ стимулирования формирования защитного иммунитета против норовируса у человека, включающий парентеральное введение человеку не более однократной дозы композиции вакцины, при этом указанная композиция содержит VLP норовируса геногруппы I и/или геногруппы II, при этом указанная композиция индуцирует по меньшей мере трехкратное увеличение титра норовирус-специфичных сывороточных антител по сравнению с титром у человека до введения композиции. В определенных вариантах осуществления индукция увеличения титра норовирус-специфичных антител происходит в течение семи дней после введения однократной дозы композиции. В некоторых вариантах осуществления композицию вакцины вводят человеку посредством внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного пути введения. В одном варианте осуществления композицию вакцины вводят человеку посредством внутримышечного пути введения.The present invention is based in part on the discovery that a single dose of a norovirus vaccine induces a rapid, strong protective immune response against norovirus in humans when administered parenterally. Accordingly, the present invention provides a method for stimulating protective immunity against norovirus in a human, comprising parenterally administering to a human no more than a single dose of a vaccine composition, said composition comprising a genogroup I and/or genogroup II norovirus VLP, said composition inducing at least a three-fold increase in the titer of norovirus-specific serum antibodies compared to the titer in humans before the administration of the composition. In certain embodiments, the induction of an increase in the titer of norovirus-specific antibodies occurs within seven days after administration of a single dose of the composition. In some embodiments, the vaccine composition is administered to a human via an intravenous, subcutaneous, intradermal, or intramuscular route of administration. In one embodiment, the vaccine composition is administered to a human via the intramuscular route of administration.
Композиции вакцины однократной дозы могут содержать VLP норовируса геногруппы I, VLP норовируса геногруппы II или и те, и те в дозе, составляющей от приблизительно 5 мкг до приблизительно 150 мкг. В вариантах осуществления, в которых композиции вакцины однократной дозы содержат VLP норовируса и геногруппы I, и геногруппы II, доза VLP каждой геногруппы может быть одинаковой илиSingle dose vaccine compositions may contain genogroup I norovirus VLP, genogroup II norovirus VLP, or both, at a dose of from about 5 μg to about 150 μg. In embodiments in which single dose vaccine compositions contain both genogroup I and genogroup II norovirus VLPs, the dose of each genogroup VLP may be the same or
- 1 042694 различной. В одном варианте осуществления композиция содержит не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы I. В другом варианте осуществления композиция содержит не более 25 мкг VLP норовируса геногруппы I. В еще одном варианте осуществления композиция содержит не более 150 мкг VLP норовируса геногруппы П. В еще другом варианте осуществления композиция содержит не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы II. VLP норовируса могут быть моновалентными VLP или мультивалентными VLP.- 1 042694 various. In one embodiment, the composition contains no more than 50 µg of genogroup I norovirus VLP. In another embodiment, the composition contains no more than 25 µg of genogroup I norovirus VLP. In another embodiment, the composition contains no more than 150 µg of genogroup P norovirus VLP. implementation, the composition contains no more than 50 μg VLP of norovirus genogroup II. Norovirus VLPs can be monovalent VLPs or multivalent VLPs.
В некоторых аспектах настоящего изобретения VLP норовируса геногруппы I в композициях вакцины содержат капсидный белок, полученный из вирусного штамма геногруппы I. В одном варианте осуществления VLP норовируса геногруппы I содержат капсидный белок из норовируса 1 генотипа геногруппы I. В другом варианте осуществления VLP норовируса геногруппы I содержат капсидный белок из вируса Norwalk. В других аспектах настоящего изобретения VLP норовируса геногруппы II в композициях вакцины содержат капсидный белок, полученный из вирусного штамма геногруппы II. В некоторых вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы II содержат капсидный белок из норовируса 4 генотипа геногруппы II. В определенных вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы II представляют собой VLP, образованные в результате экспрессии консенсусной последовательности норовируса геногруппы II. В одном конкретном варианте осуществления VLP норовируса геногруппы II содержат капсидный белок с последовательностью SEQ ID NO: 1.In some aspects of the present invention, the genogroup I norovirus VLPs in the vaccine compositions comprise a capsid protein derived from a genogroup I viral strain. In one embodiment, the genogroup I norovirus VLPs comprise a capsid protein from genogroup I norovirus 1. capsid protein from the Norwalk virus. In other aspects of the present invention, the genogroup II norovirus VLPs in the vaccine compositions comprise a capsid protein derived from a genogroup II viral strain. In some embodiments, the genogroup II norovirus VLPs comprise a capsid protein from genogroup II norovirus 4 genotype. In certain embodiments, the genogroup II norovirus VLPs are VLPs resulting from the expression of a genogroup II norovirus consensus sequence. In one specific embodiment, genogroup II norovirus VLPs comprise a capsid protein with the sequence of SEQ ID NO: 1.
В определенных вариантах осуществления композиция вакцины дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант. Адъювант предпочтительно не является адъювантом-бактериальным экзотоксином. В одном варианте осуществления адъювант представляет собой агонист toll-подобных рецепторов, такой как монофосфорил-липид A (MPL), флагеллин или CpG. В другом варианте осуществления адъювант представляет собой гидроксид алюминия (например, квасцы). В определенных вариантах осуществления композиция вакцины содержит два адъюванта, таких как MPL и гидроксид алюминия. В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины может дополнительно содержать буфер, такой как L-гистидин, имидазол, янтарная кислота, трис и лимонная кислота. Композиция вакцины может быть составлена в виде сухого порошка или жидкости. В одном варианте осуществления композицию вакцины составляют в виде жидкости (например, водный состав).In certain embodiments, the vaccine composition further comprises at least one adjuvant. The adjuvant is preferably not a bacterial exotoxin adjuvant. In one embodiment, the adjuvant is a toll-like receptor agonist such as monophosphoryl lipid A (MPL), flagellin, or CpG. In another embodiment, the adjuvant is aluminum hydroxide (eg, alum). In certain embodiments, the vaccine composition contains two adjuvants such as MPL and aluminum hydroxide. In some embodiments, the vaccine composition may further comprise a buffer such as L-histidine, imidazole, succinic acid, tris, and citric acid. The vaccine composition may be formulated as a dry powder or liquid. In one embodiment, the vaccine composition is formulated as a liquid (eg, an aqueous formulation).
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Фиг. 1. Результаты анализов по методу ELISA для общего Ig по измерению объединенных сывороточных уровней IgG, IgA и IgM у людей-добровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15, 50 или 150 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Средний геометрический титр антител к GI. 1 (А) и к GII.4 (В) показан для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 1. Results of total Ig ELISA assays measuring pooled serum levels of IgG, IgA, and IgM in human volunteers immunized intramuscularly with placebo (saline) or a vaccine formulation containing 5, 15, 50, or 150 µg of each of the genogroup norovirus VLPs 1.1 and VLP of norovirus genogroup II.4. Geometric mean titer of antibodies to GI. 1 (A) and to GII.4 (B) is shown for each of the dosage levels on days 7 and 21 after the first immunization and on days 7 and 28 after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 2. Результаты анализов по методу ELISA для общего Ig по измерению объединенных сывороточных уровней IgG, IgA и IgM у людей-добровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15, 50 или 150 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Фактор сероконверсии для антител к GI.1 (А) и к GII.4 (В) показан для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 2. Results of total Ig ELISA assays measuring pooled serum levels of IgG, IgA, and IgM in human volunteers immunized intramuscularly with placebo (saline) or with a vaccine formulation containing 5, 15, 50, or 150 µg of each of the genogroup norovirus VLPs 1.1 and VLP of norovirus genogroup II.4. The seroconversion factor for antibodies to GI.1 (A) and to GII.4 (B) is shown for each of the dosage levels at 7 and 21 days after the first immunization and 7 and 28 days after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 3. Результаты анализов по методу ELISA для общего Ig по измерению объединенных сывороточных уровней IgG, IgA и IgM у людей-добровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15, 50 или 150 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовирус геногруппы II.4. Процентные показатели серологической реакции (т.е. четырехкратное увеличение титра антител по сравнению с титрами до иммунизации) для антител к GI.1 (А) и к GII.4 (В) показаны для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 3. Results of total Ig ELISA assays measuring pooled serum levels of IgG, IgA, and IgM in human volunteers immunized intramuscularly with placebo (saline) or a vaccine formulation containing 5, 15, 50, or 150 μg of each of the genogroup norovirus VLPs 1.1 and VLP norovirus genogroup II.4. Percentages of serological response (i.e., a fourfold increase in antibody titer compared to pre-immunization titers) for antibodies to GI.1 (A) and to GII.4 (B) are shown for each of the dosage levels at 7 and 21 days after the first immunization and 7 and 28 days after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 4. Результаты анализов по методу ELISA по измерению сывороточного IgA у людейдобровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15 или 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Средний геометрический титр антител к GI. 1 (А) и к GII.4 (В) показан для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 4. Results of ELISA assays measuring serum IgA in human volunteers immunized intramuscularly with a placebo (saline) or vaccine formulation containing 5, 15, or 50 µg of each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup II.4 norovirus VLP. Geometric mean titer of antibodies to GI. 1 (A) and to GII.4 (B) is shown for each of the dosage levels on days 7 and 21 after the first immunization and on days 7 and 28 after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 5. Результаты анализов по методу ELISA по измерению сывороточного IgA у людейдобровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15 или 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовирус геногруппы II.4. Фактор сероконверсии для антител к GI.1 (А) и к GII.4 (В) показан для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 5. Results of ELISA assays measuring serum IgA in human volunteers immunized intramuscularly with a placebo (saline) or vaccine formulation containing 5, 15, or 50 μg each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup II.4 norovirus VLP. The seroconversion factor for antibodies to GI.1 (A) and to GII.4 (B) is shown for each of the dosage levels at 7 and 21 days after the first immunization and 7 and 28 days after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 6. Результаты анализов по методу ELISA по измерению сывороточного IgA у людейдобровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15 или 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппыFig. 6. Results of ELISA assays measuring serum IgA in human volunteers immunized intramuscularly with a placebo (saline) or vaccine formulation containing 5, 15, or 50 µg of each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup norovirus VLP
- 2 042694- 2 042694
II.4. Процентные показатели серологической реакции (т.е. четырехкратное увеличение титра антител по сравнению с титрами до иммунизации) для антител к GI. 1 (А) и к GII.4 (В) показаны для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.II.4. Percentages of serologic response (i.e., a fourfold increase in antibody titer compared to pre-immunization titers) for anti-GI antibodies. 1 (A) and to GII.4 (B) are shown for each of the dosage levels on days 7 and 21 after the first immunization and on days 7 and 28 after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 7. Результаты анализов по методу ELISA по измерению сывороточного IgG у людейдобровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15 или 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Средний геометрический титр антител к GI. 1 (А) и к GII.4 (В) показан для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 7. Results of ELISA assays measuring serum IgG in human volunteers immunized intramuscularly with a placebo (saline) or vaccine formulation containing 5, 15, or 50 µg of each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup II.4 norovirus VLP. Geometric mean titer of antibodies to GI. 1 (A) and to GII.4 (B) is shown for each of the dosage levels on days 7 and 21 after the first immunization and on days 7 and 28 after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 8. Результаты анализов по методу ELISA по измерению сывороточного IgG у людейдобровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15 или 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Фактор сероконверсии для антител к GI.1 (А) и к GII.4 (В) показан для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 8. Results of ELISA assays to measure serum IgG in human volunteers immunized intramuscularly with a placebo (saline) or vaccine formulation containing 5, 15, or 50 μg each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup II.4 norovirus VLP. The seroconversion factor for antibodies to GI.1 (A) and to GII.4 (B) is shown for each of the dosage levels at 7 and 21 days after the first immunization and 7 and 28 days after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 9. Результаты анализов по методу ELISA по измерению сывороточного IgG у людейдобровольцев, иммунизированных внутримышечно плацебо (солевым раствором) или составом вакцины, содержащим 5, 15 или 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Процентные показатели серологической реакции (т.е. четырехкратное увеличение титра антител по сравнению с титрами до иммунизации) для антител к GI. 1 (А) и к GII.4 (В) показаны для каждого из уровней дозировки на 7 и 21 день после первой иммунизации и на 7 и 28 день после второй иммунизации. Добровольцев иммунизировали в 0 и на 28 день исследования.Fig. 9. Results of ELISA assays to measure serum IgG in human volunteers immunized intramuscularly with a placebo (saline) or vaccine formulation containing 5, 15, or 50 µg of each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup II.4 norovirus VLP. Percentages of serologic response (i.e., a fourfold increase in antibody titer compared to pre-immunization titers) for anti-GI antibodies. 1 (A) and to GII.4 (B) are shown for each of the dosage levels on days 7 and 21 after the first immunization and on days 7 and 28 after the second immunization. Volunteers were immunized on days 0 and 28 of the study.
Фиг. 10. Результаты анализов по методу ELISA для общего Ig по измерению объединенных сывороточных уровней IgG, IgA и IgM у людей-добровольцев, иммунизированных либо норовирусной моновалентной вакциной для интраназального введения, как описано в El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-1658, (группы LV01-103), либо норовирусной бивалентной вакциной для внутримышечного введения, как описано в примере 1 (группы LV03-104), в указанные моменты времени. Людидобровольцы получали либо плацебо, либо две дозы состава вакцины либо для внутримышечного введения, либо для интраназального введения. Бивалентная норовирусная вакцина для внутримышечного введения содержала 5 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы 1.1 и VLP норовируса геногруппы II.4. Моновалентная вакцина для интраназального введения содержала 100 мкг норовируса геногруппы 1.1. Добровольцам, получавшим вакцину для интраназального введения или плацебо, вводили провокационную пробу с живым норовирусом после второй иммунизации.Fig. 10. Results of total Ig ELISA assays measuring pooled serum levels of IgG, IgA and IgM in human volunteers immunized with either a norovirus monovalent intranasal vaccine as described in El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-1658, (groups LV01-103), or a norovirus bivalent intramuscular vaccine as described in Example 1 (groups LV03-104), at the indicated time points. Human volunteers received either a placebo or two doses of the vaccine formulation either intramuscularly or intranasally. The bivalent intramuscular norovirus vaccine contained 5 μg each of genogroup 1.1 norovirus VLP and genogroup II.4 norovirus VLP. The monovalent intranasal vaccine contained 100 μg of norovirus genogroup 1.1. Volunteers receiving intranasal vaccine or placebo were challenged with live norovirus after the second immunization.
Фиг. 11. FACS-анализ мононуклеарных клеток периферической крови, полученной от людейдобровольцев в 0 день перед иммунизацией либо 5 мкг дозой бивалентной норовирусной вакцины для внутримышечного введения (А), либо плацебо (В) и на 7 день после иммунизации. CD19+ РВМС являются нацеленными на слизистые, о чем свидетельствует экспрессия хоминг-рецептора альфа 4/бета7 и хемокинового рецептора CCR10.Fig. 11. FACS analysis of peripheral blood mononuclear cells obtained from human volunteers on day 0 before immunization with either a 5 μg dose of bivalent intramuscular norovirus vaccine (A) or placebo (B) and on day 7 after immunization. CD19+ PBMCs are mucosally targeted, as evidenced by the expression of the alpha4/beta7 homing receptor and the CCR10 chemokine receptor.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Настоящее изобретение относится к способам стимулирования формирования защитного иммунитета к норовирусным инфекциям у субъекта. В частности, в настоящем изобретении представлены способы стимулирования формирования защитного иммунитета против норовируса у человека посредством парентерального введения человеку не более однократной дозы вакцины, содержащей VLP норовируса и необязательно по меньшей мере один адъювант, где вакцина обеспечивает защиту от или облегчение по меньшей мере одного симптома норовирусной инфекции. Изобретатели обнаружили, что внутримышечное введение людям не более однократной дозы композиции вакцины, содержащей VLP норовируса, индуцирует быструю (т.е. в течение 7 дней после иммунизации) сероконверсию в сыворотке крови (т.е. по меньшей мере трехкратное увеличение титров антиген-специфичных сывороточных антител по сравнению с уровнями до вакцинации), что указывает на защитный иммунный ответ против норовирусной инфекции и заболевания. Иммунные ответы, индуцируемые данной композицией вакцины однократной дозы, достигают такого же высокого уровня титров антител, что и уровень, наблюдаемый при природной инфекции в результате введения живого вируса в исследованиях с введением провокационной пробы людям. Примечательно, что ревакцинирующая доза вакцины не требуется, поскольку иммунный ответ не повышается при дополнительном введении еще одной дозы вакцины.The present invention relates to methods for inducing protective immunity to norovirus infections in a subject. In particular, the present invention provides methods for inducing protective immunity against norovirus in a human by parenterally administering to a human no more than a single dose of a vaccine comprising a norovirus VLP and optionally at least one adjuvant, wherein the vaccine provides protection against or amelioration of at least one symptom of norovirus infections. The inventors have found that intramuscular administration of no more than a single dose of a vaccine composition containing norovirus VLP to humans induces rapid (i.e., within 7 days of immunization) serum seroconversion (i.e., at least a three-fold increase in antigen-specific titers). serum antibodies compared to pre-vaccination levels), indicating a protective immune response against norovirus infection and disease. Immune responses induced by this single dose vaccine composition achieve the same high level of antibody titers as observed in natural infection with live virus in human challenge studies. Notably, a booster dose of vaccine is not required because the immune response does not increase with an additional dose of vaccine.
В настоящем изобретении представлена композиция вакцины, содержащая один или несколько норовирусных антигенов. Под норовирусом, норовирусом (NOR) и грамматическими эквивалентами в данном документе понимают члены рода Norovirus семейства Caliciviridae. В некоторых вариантах осуществления норовирус может включать группу родственных вирусов, содержащих одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности, не имеющих оболочки, которые могут быть инфекционными для человека или видов млекопитающих, не являющихся человеком. В некоторых вариантах осуществления норовирус может вызывать острый гастроэнтерит у людей. Норовирусы также могут упоминатьсяThe present invention provides a vaccine composition containing one or more norovirus antigens. Norovirus, norovirus (NOR), and grammatical equivalents are used herein to mean members of the genus Norovirus in the Caliciviridae family. In some embodiments, a norovirus may include a group of related non-enveloped positive polarity single-stranded RNA viruses that can be infectious to humans or non-human mammalian species. In some embodiments, norovirus can cause acute gastroenteritis in humans. Noroviruses may also be mentioned
- 3 042694 как небольшие сферические структурированные вирусы (SRSV), имеющие определенную поверхностную структуру или неровный контур, как видно при рассмотрении с помощью электронной микроскопии.- 3 042694 as small spherical structured viruses (SRSV) having a defined surface structure or irregular outline as seen by electron microscopy.
Норовирусы включают по меньшей мере пять геногрупп (GI, GII, GIII, GIV и GV). Норовирусы GI, GII и GIV являются инфекционными для людей, тогда как норовирусы GIII в основном инфицируют крупный рогатый скот. GV в недавнем времени был выделен из мышей (Zheng et al. (2006) Virology, Vol 346: 312-323). Типичными представителями GIII являются штаммы Jena и Newbury, тогда как типичными представителями GIV являются штаммы Alphatron, Fort Lauderdale и Saint Cloud. Группы GI и GII можно дополнительно разделить на генетические кластеры или генотипы на основе генетической классификации (Ando et al. (2000) J. Infectious Diseases, Vol. 181(Supp2):S336-S348; Lindell et al. (2005) J. Clin. Microbiol., Vol. 43(3): 1086-1092). Используемое в данном документе выражение генетические кластеры применяется взаимозаменяемо с выражением генотипы. В геногруппу I входит 8 кластеров GI, известных на сегодняшний день (с названием прототипного вирусного штамма): GI.1 (Norwalk (NV-USA93)); GI.2 (Southhampton (SOV-GBR93)); GI.3 (Desert Shield (DSV-USA93)); GI.4 (Cruise Ship virus/Chiba (Chiba-JPN00)); GI.5 (318/Musgrove (Musgrov-GBR00)); GI.6 (Hesse (Hesse-DEU98)); GI.7 (WnchestGBR00) и GI.8 (Boxer-USA02). В геногруппу II входит 19 кластеров GII, известных на сегодняшний день (с названием прототипного вирусного штамма): GII.1 (Hawaii (Hawaii-USA94)); GII.2 (Snow Mountain/Melksham (Msham-GBR95)); GII.3 (Toronto (Toronto-CAN93)); GII.4 (Bristol/Lordsdale (BristolGBR93)); GII.5 (290/Hillingdon (Hilingd-GBR00)); GII.6 (269/Seacroft (Seacrof-GBR00)); GII.7 (273/Leeds (Leeds-GBR00)); GII.8 (539/Amsterdam (Amstdam-NLD99)); GII.9 (378 (VABeach-USA01)), GII.10 (ErfurtDEU01); GII.11 (SW9180JPN01); GII.12 (Wortley-GBR00); GII.13 (Faytvil-USA02); GII.14 (M7-USA03); GII.15 (J23-USA02); GII.16 (Tiffin-USA03); GII.17 (CSE1-USA03); GII.18 (QW101/2003/US) и GII.19 (QW170/2003/US).Noroviruses include at least five genogroups (GI, GII, GIII, GIV and GV). Noroviruses GI, GII, and GIV are infectious to humans, while noroviruses GIII mainly infect cattle. GV has recently been isolated from mice (Zheng et al. (2006) Virology, Vol 346: 312-323). GIII is typified by the Jena and Newbury strains, while GIV is typified by the Alphatron, Fort Lauderdale and Saint Cloud strains. Groups GI and GII can be further divided into genetic clusters or genotypes based on genetic classification (Ando et al. (2000) J. Infectious Diseases, Vol. 181(Supp2):S336-S348; Lindell et al. (2005) J. Clin Microbiol., Vol 43(3): 1086-1092). As used herein, the expression genetic clusters is used interchangeably with the expression genotypes. Genogroup I includes 8 GI clusters known to date (with the name of the prototype viral strain): GI.1 (Norwalk (NV-USA93)); GI.2 (Southhampton (SOV-GBR93)); GI.3 (Desert Shield (DSV-USA93)); GI.4 (Cruise Ship virus/Chiba (Chiba-JPN00)); GI.5 (318/Musgrove (Musgrov-GBR00)); GI.6 (Hesse (Hesse-DEU98)); GI.7 (WnchestGBR00) and GI.8 (Boxer-USA02). Genogroup II includes 19 GII clusters known to date (with the name of the prototype viral strain): GII.1 (Hawaii (Hawaii-USA94)); GII.2 (Snow Mountain/Melksham (Msham-GBR95)); GII.3 (Toronto (Toronto-CAN93)); GII.4 (Bristol/Lordsdale (BristolGBR93)); GII.5 (290/Hillingdon (Hilingd-GBR00)); GII.6 (269/Seacroft (Seacrof-GBR00)); GII.7 (273/Leeds (Leeds-GBR00)); GII.8 (539/Amsterdam (Amstdam-NLD99)); GII.9 (378 (VABeach-USA01)), GII.10 (ErfurtDEU01); GII.11 (SW9180JPN01); GII.12 (Wortley-GBR00); GII.13 (Faytvil-USA02); GII.14 (M7-USA03); GII.15 (J23-USA02); GII.16 (Tiffin-USA03); GII.17 (CSE1-USA03); GII.18 (QW101/2003/US) and GII.19 (QW170/2003/US).
Под норовирусом также в данном документе понимают вирусоподобные частицы рекомбинантного норовируса (VLP rNOR). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная экспрессия по меньшей мере норовирусного капсидного белка, кодируемого ORF2, в клетках, например, из бакуловирусного вектора в клетках Sf9, может привести к самопроизвольной самоорганизации капсидного белка в VLP. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная экспрессия по меньшей мере норовирусных белков, кодируемых ORF1 и ORF2, в клетках, например, из бакуловирусного вектора в клетках Sf9, может привести к самопроизвольной самоорганизации капсидного белка в VLP. VLP структурно схожи с норовирусами, но у них отсутствует вирусный РНК-геном и, следовательно, они не являются инфекционными. Соответственно, норовирус включает вирионы, которые могут представлять собой инфекционные или неинфекционные частицы, которые включают неполные частицы.Norovirus is also herein understood to mean recombinant norovirus virus-like particles (VLP rNOR). In some embodiments, recombinant expression of at least a norovirus capsid protein encoded by ORF2 in cells, for example from a baculovirus vector in Sf9 cells, can result in the capsid protein spontaneously self-assembling into VLPs. In some embodiments, recombinant expression of at least the norovirus proteins encoded by ORF1 and ORF2 in cells, for example, from a baculovirus vector in Sf9 cells, can lead to spontaneous self-assembly of the capsid protein into the VLP. VLPs are structurally similar to noroviruses, but they lack a viral RNA genome and are therefore not infectious. Accordingly, norovirus includes virions, which may be infectious or non-infectious particles, which include incomplete particles.
Неограничивающие примеры норовирусов включают норовирус геногруппы 1 штамм Hu/NoV/West Chester/200 I/USA, номер доступа в GenBank AY502016; Chiba virus (CHV, GenBank AB042808); норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502015; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Fayette/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502014; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Fairfield/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502013; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Sandusky/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502012; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Canton/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502011; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Tiffin/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502010; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/CS-E1/2002/USA, номер доступа в GenBank AY50200; норовирус геногруппы 1 штамм Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA, номер доступа в GenBank AY502008; норовирус геногруппы 1 штамм Hu/NoV/CS-841/2001/USA, номер доступа в GenBank AY502007; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Hiram/2000/USA, номер доступа в GenBank AY502006; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Tontogany/1999/USA, номер доступа в GenBank AY502005; вирус Norwalk, полный геном, номер доступа в GenBank NC.sub.--001959; норовирус Hu/GI/Otofuke/1979/JP, геномная РНК, полный геном, номер доступа в GenBank AB187514; норовирус Hu/Hokkaido/133/2003/JP, номер доступа в GenBank AB212306; норовирус Sydney 2212, номер доступа в GenBank AY588132; вирус Norwalk штамм SN2000JA, номер доступа в GenBank AB190457; вирус Lordsdale, полный геном, номер доступа в GenBank Х86557; Norwalk-подобный вирус, геномная РНК, Gifu'96, номер доступа в GenBank AB045603; вирус Norwalk штамм Vietnam 026, полный геном, номер доступа в GenBank AF504671; норовирус Hu/GII.4/2004/N/L, номер доступа в GenBank AY883096; норовирус Hu/GII/Hokushin/03/JP, номер доступа в GenBank АВ195227; норовирус Hu/GII/Kamo/03/JP, номер доступа в GenBank АВ195228; норовирус Hu/GII/Sinsiro/97/JP, номер доступа в GenBank АВ195226; норовирус Hu/GII/Ina/02/JP, номер доступа в GenBank АВ195225; норовирус Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE, номер доступа в GenBank AY772730; норовирус Hu/NLV/Dresden174/pUS-NorII/1997/GE, номер доступа в GenBank AY741811; норовирус Hu/NLV/Oxford/B2S16/2002/UK, номер доступа в GenBank AY587989; норовирусNon-limiting examples of noroviruses include genogroup 1 norovirus strain Hu/NoV/West Chester/200 I/USA, GenBank accession number AY502016; Chiba virus (CHV, GenBank AB042808); norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA, GenBank accession number AY502015; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Fayette/1999/USA, GenBank accession number AY502014; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Fairfield/1999/USA, GenBank accession number AY502013; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Sandusky/1999/USA, GenBank accession number AY502012; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Canton/1999/USA, GenBank accession number AY502011; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Tiffin/1999/USA, GenBank accession number AY502010; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/CS-E1/2002/USA, GenBank accession number AY50200; norovirus genogroup 1 strain Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA, GenBank accession number AY502008; norovirus genogroup 1 strain Hu/NoV/CS-841/2001/USA, GenBank accession number AY502007; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Hiram/2000/USA, GenBank accession number AY502006; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Tontogany/1999/USA, GenBank accession number AY502005; Norwalk virus, complete genome, GenBank accession number NC.sub.--001959; norovirus Hu/GI/Otofuke/1979/JP, genomic RNA, complete genome, GenBank accession number AB187514; norovirus Hu/Hokkaido/133/2003/JP, GenBank accession number AB212306; norovirus Sydney 2212, GenBank accession number AY588132; Norwalk virus strain SN2000JA, GenBank accession number AB190457; Lordsdale virus, complete genome, GenBank accession number X86557; Norwalk-like virus, genomic RNA, Gifu'96, GenBank accession number AB045603; Norwalk virus strain Vietnam 026, complete genome, GenBank accession number AF504671; norovirus Hu/GII.4/2004/N/L, GenBank accession number AY883096; norovirus Hu/GII/Hokushin/03/JP, GenBank accession number AB195227; norovirus Hu/GII/Kamo/03/JP, GenBank accession number AB195228; norovirus Hu/GII/Sinsiro/97/JP, GenBank accession number AB195226; norovirus Hu/GII/Ina/02/JP, GenBank accession number AB195225; norovirus Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE, GenBank accession number AY772730; norovirus Hu/NLV/Dresden174/pUS-NorII/1997/GE, GenBank accession number AY741811; norovirus Hu/NLV/Oxford/B2S16/2002/UK, GenBank accession number AY587989; norovirus
- 4 042694- 4 042694
Hu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK, номер доступа в GenBank AY588021; изолят Norwalk-подобного вируса Bo/Thirsk10/00/UK, номер доступа в GenBank AY126468; изолят Norwalk-подобного вируса Bo/Penrith55/00/UK, номер доступа в GenBank AY126476; изолят Norwalk-подобного вируса Bo/Aberystwyth24/00/UK, номер доступа в GenBank AY126475; изолят Norwalk-подобного вируса Bo/Dumfries/94/UK, номер доступа в GenBank AY126474; норовирус NLV/IF2036/2003/Iraq, номер доступа в GenBank AY675555; норовирус NLV/IF1998/2003/Iraq, номер доступа в GenBank AY675554; норовирус NLV/BUDS/2002/USA, номер доступа в GenBank AY660568; норовирус NLV/Paris Island/2003/USA, номер доступа в GenBank AY652979; вирус Snow Mountain, полный геном, номер доступа в GenBank AY134748; Norwalk-подобный вирус NLV/Fort Lauderdale/560/1998/US, номер доступа в GenBank AF414426; Hu/Norovirus/hiroshima/1999/JP(9912-02F), номер доступа в GenBank AB044366; Norwalkподобный вирус штамм 11MSU-MW, номер доступа в GenBank AY274820; Norwalk-подобный вирус штамм B-1SVD, номер доступа в GenBank AY274819; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA, номер доступа в GenBank AY502023; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/CS-G4/2002/USA, номер доступа в GenBank AY502022; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/CS-G2/2002/USA, номер доступа в GenBank AY502021; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/CS-G1/2002/USA, номер доступа в GenBank AY502020; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Anchorage/2002/USA, номер доступа в GenBank AY502019; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN, номер доступа в GenBank AY502018; норовирус геногруппы 2 штамм Hu/NoV/Germanton/2002/USA, номер доступа в GenBank AY502017; калицивирус человека NLV/GII/Langen1061/2002/DE, полный геном, номер доступа в GenBank AY485642; норовирус мышей 1, полипротеин, номер доступа в GenBank AY228235; вирус Norwalk, номер доступа в GenBank AB067536; калицивирус человека NLV/Mex7076/1999, номер доступа в GenBank AF542090; калицивирус человека NLV/Oberhausen 455/01/DE, номер доступа в GenBank AF539440; калицивирус человека NLV/Herzberg 385/01/DE, номер доступа в GenBank AF539439; калицивирус человека NLV/Boxer/2001/US, номер доступа в GenBank AF538679; Norwalk-подобный вирус, геномная PHK, полный геном, номер доступа в GenBank AB081723; Norwalk-подобный вирус, геномная PHK, полный геном, изолят: Saitama U201, номер доступа в GenBank AB039782; Norwalk-подобный вирус, геномная PHK, полный геном, изолят: Saitama U18, номер доступа в GenBank АВ039781; Norwalk-подобный вирус, геномная PHK, полный геном, изолят: Saitama U25, номер доступа в GenBank AB039780; вирус Norwalk штамм:U25GИ, номер доступа в GenBank AB067543; вирус Norwalk штамм:U201 GII, номер доступа в GenBank AB067542; Norwalkподобные вирусы штамм 416/97003156/1996/LA, номер доступа в GenBank AF080559; Norwalk-подобные вирусы штамм 408/97003012/1996/FL, номер доступа в GenBank AF080558; Norwalk-подобный вирус NLV/Burwash Landing/331/1995/US, номер доступа в GenBank AF414425; Norwalk-подобный вирус NLV/Miami Beach/326/1995/US, номер доступа в GenBank AF414424; Norwalk-подобный вирус NLV/White River/290/1994/US, номер доступа в GenBank AF414423; Norwalk-подобный вирус NLV/New Orleans/306/1994/US, номер доступа в GenBank AF414422; Norwalk-подобный вирус NLV/Port Canaveral/301/1994/US, номер доступа в GenBank AF414421; Norwalk-подобный вирус NLV/Honolulu/314/1994/US, номер доступа в GenBank AF414420; Norwalk-подобный вирусHu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK, GenBank accession number AY588021; Norwalk-like virus isolate Bo/Thirsk10/00/UK, GenBank accession number AY126468; Norwalk-like virus isolate Bo/Penrith55/00/UK, GenBank accession number AY126476; Norwalk-like virus isolate Bo/Aberystwyth24/00/UK, GenBank accession number AY126475; Norwalk-like virus isolate Bo/Dumfries/94/UK, GenBank accession number AY126474; norovirus NLV/IF2036/2003/Iraq, GenBank accession number AY675555; norovirus NLV/IF1998/2003/Iraq, GenBank accession number AY675554; norovirus NLV/BUDS/2002/USA, GenBank accession number AY660568; norovirus NLV/Paris Island/2003/USA, GenBank accession number AY652979; Snow Mountain virus, complete genome, GenBank accession number AY134748; Norwalk-like virus NLV/Fort Lauderdale/560/1998/US, GenBank accession number AF414426; Hu/Norovirus/hiroshima/1999/JP(9912-02F), GenBank accession number AB044366; Norwalk-like virus strain 11MSU-MW, GenBank accession number AY274820; Norwalk-like virus strain B-1SVD, GenBank accession number AY274819; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA, GenBank accession number AY502023; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/CS-G4/2002/USA, GenBank accession number AY502022; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/CS-G2/2002/USA, GenBank accession number AY502021; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/CS-G1/2002/USA, GenBank accession number AY502020; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Anchorage/2002/USA, GenBank accession number AY502019; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN, GenBank accession number AY502018; norovirus genogroup 2 strain Hu/NoV/Germanton/2002/USA, GenBank accession number AY502017; human calicivirus NLV/GII/Langen1061/2002/DE, complete genome, GenBank accession number AY485642; murine norovirus 1, polyprotein, GenBank accession number AY228235; Norwalk virus, GenBank accession number AB067536; human calicivirus NLV/Mex7076/1999, GenBank accession number AF542090; human calicivirus NLV/Oberhausen 455/01/DE, GenBank accession number AF539440; human calicivirus NLV/Herzberg 385/01/DE, GenBank accession number AF539439; human calicivirus NLV/Boxer/2001/US, GenBank accession number AF538679; Norwalk-like virus, genomic RNA, complete genome, GenBank accession number AB081723; Norwalk-like virus, genomic RNA, whole genome, isolate: Saitama U201, GenBank accession number AB039782; Norwalk-like virus, genomic RNA, whole genome, isolate: Saitama U18, GenBank accession number AB039781; Norwalk-like virus, genomic RNA, whole genome, isolate: Saitama U25, GenBank accession number AB039780; Norwalk virus strain: U25G, GenBank accession number AB067543; Norwalk virus strain: U201 GII, GenBank accession number AB067542; Norwalk-like viruses, strain 416/97003156/1996/LA, GenBank accession number AF080559; Norwalk-like viruses, strain 408/97003012/1996/FL, GenBank accession number AF080558; Norwalk-like virus NLV/Burwash Landing/331/1995/US, GenBank accession number AF414425; Norwalk-like virus NLV/Miami Beach/326/1995/US, GenBank accession number AF414424; Norwalk-like virus NLV/White River/290/1994/US, GenBank accession number AF414423; Norwalk-like virus NLV/New Orleans/306/1994/US, GenBank accession number AF414422; Norwalk-like virus NLV/Port Canaveral/301/1994/US, GenBank accession number AF414421; Norwalk-like virus NLV/Honolulu/314/1994/US, GenBank accession number AF414420; Norwalk-like virus
NLV/Richmond/283/1994/US, номер доступа в GenBank AF414419; Norwalk-подобный вирусNLV/Richmond/283/1994/US, GenBank accession number AF414419; Norwalk-like virus
NLV/Westover/302/1994/US, номер доступа в GenBank AF414418; Norwalk-подобный вирус NLV/UK317/12700/1992/GB, номер доступа в GenBank AF414417; Norwalk-подобный вирус NLV/Miami/81/1986/US, номер доступа в GenBank AF414416; штамм Snow Mountain, номер доступа в GenBank U70059; вирус Desert Shield DSV395, номер доступа в GenBank U04469; вирус Norwalk, полный геном, номер доступа в GenBank AF093797; калицивирус Hawaii, номер доступа в GenBank U07611; вирус Southampton, номер доступа в GenBank L07418; вирус Norwalk (SRSV-KY-89/89/J), номер доступа в GenBank L23828; вирус Norwalk (SRSV-SMA/76/US), номер доступа в GenBank L23831; вирус Camberwell, номер доступа в GenBank U46500; калицивирус человека штамм Melksham, номер доступа в GenBank X81879; калицивирус человека штамм MX, номер доступа в GenBank U22498; миниреовирус TV24, номер доступа в GenBank U02030; и Norwalk-подобный вирус NLV/Gwynedd/273/1994/US, номер доступа в GenBank AF414409; последовательности всех из которых (как внесено на дату подачи настоящей заявки) включены в данный документ посредством ссылки. Дополнительные последовательности норовируса раскрыты в следующих патентных публикациях: WO 2005/030806, WO 2000/79280, JP2002020399, US2003129588, патент США № 6572862, WO 1994/05700 и WO 05/032457, все из которых включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Для сравнения последовательностей и для рассмотрения генетического разнообразия и филогенетического анализа норовирусов см. также Green et al. (2000) J. Infect. Dis., Vol. 181(Suppl. 2):S322-330; Wang et al. (1994) J. Virol., Vol. 68:59825990; Chen et al. (2004) J. Virol., Vol. 78: 6469-6479; Chakravarty et al. (2005) J. Virol., Vol. 79: 554-568;NLV/Westover/302/1994/US, GenBank accession number AF414418; Norwalk-like virus NLV/UK317/12700/1992/GB, GenBank accession number AF414417; Norwalk-like virus NLV/Miami/81/1986/US, GenBank accession number AF414416; strain Snow Mountain, GenBank accession number U70059; Desert Shield DSV395 virus, GenBank access number U04469; Norwalk virus, complete genome, GenBank accession number AF093797; Hawaii calicivirus, GenBank accession number U07611; Southampton virus, GenBank accession number L07418; Norwalk virus (SRSV-KY-89/89/J), GenBank accession number L23828; Norwalk virus (SRSV-SMA/76/US), GenBank accession number L23831; Camberwell virus, GenBank access number U46500; human calicivirus strain Melksham, GenBank accession number X81879; human calicivirus strain MX, GenBank accession number U22498; minireovirus TV24, GenBank access number U02030; and Norwalk-like virus NLV/Gwynedd/273/1994/US, GenBank accession number AF414409; the sequences of all of which (as entered on the filing date of this application) are incorporated herein by reference. Additional norovirus sequences are disclosed in the following patent publications: WO 2005/030806, WO 2000/79280, JP2002020399, US2003129588, US Pat. . For sequence comparisons and for a review of the genetic diversity and phylogenetic analysis of noroviruses, see also Green et al. (2000) J. Infect. Dis., Vol. 181(Suppl. 2):S322-330; Wang et al. (1994) J. Virol., Vol. 68:59825990; Chen et al. (2004) J. Virol., Vol. 78: 6469-6479; Chakravarty et al. (2005) J. Virol., Vol. 79:554-568;
- 5 042694- 5 042694
Hansman et al. (2006) J. Gen. Virol., Vol. 87:909-919; Bull et al. (2006) J. Clin. Micro., Vol. 44(2):327-333; Siebenga, et al. (2007) J. Virol., Vol. 81(18):9932-9941 и Fankhauser et al. (1998) J. Infect. Dis., Vol. 178:15711578. Bce нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности каждого из них включены в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления для целей идентификации может использоваться шифр, и он имеет следующий порядок: вид хозяина, из которого вирус был выделен/сокращенное обозначение рода/сокращенное обозначение вида/название штамма/год обнаружения/страна происхождения (Green et al., Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841-874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). Вирусные штаммы 4 генотипа геногруппы II (GII.4) (например, штаммы Houston, Minerva (также известный как Den Haag) и Laurens (также известный как Yerseke)) являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления. По мере того, как идентифицируют новые штаммы и их генетические последовательности становятся доступными, специалист в данной области сможет применять VLP с использованием этих современных штаммов в композициях и способах по настоящему изобретению с помощью обычных методик. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены VLP, полученные из таких штаммов, в качестве подходящих антигенов для применения в композициях и способах, описанных в данном документе.Hansman et al. (2006) J. Gen. Virol., Vol. 87:909-919; Bull et al. (2006) J. Clin. Micro., Vol. 44(2):327-333; Siebenga, et al. (2007) J. Virol., Vol. 81(18):9932-9941 and Fankhauser et al. (1998) J. Infect. Dis., Vol. 178:15711578. All nucleic acids and the corresponding amino acid sequences of each are incorporated by reference in their entirety. In some embodiments, a code may be used for identification purposes and is in the following order: host species from which the virus was isolated/abbreviated genus designation/abbreviated species designation/strain name/year of discovery/country of origin (Green et al., Human Caliciviruses , in Fields Virology Vol.1 841-874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). Genotype II (GII.4) genotype 4 virus strains (eg, strains of Houston, Minerva (also known as Den Haag), and Laurens (also known as Yerseke)) are preferred in some embodiments. As new strains are identified and their genetic sequences become available, one skilled in the art will be able to apply VLPs using these current strains in the compositions and methods of the present invention using conventional techniques. Thus, the present invention contemplates VLPs derived from such strains as suitable antigens for use in the compositions and methods described herein.
Норовирусные антигены могут быть в форме пептидов, белков или вирусоподобных частиц (VLP). В предпочтительном варианте осуществления норовирусные антигены включают VLP. Используемое в данном документе выражение вирусоподобная частица (вирусоподобные частицы) или VLP относится к вирусоподобной частице (вирусоподобным частицам), ее фрагменту (фрагментам), комплексам или части (частям), полученным из последовательности, кодирующей капсидный белок норовируса, и включающим антигенную характеристику (характеристики), аналогичные таковым инфекционных частиц норовируса. Норовирусные антигены могут также быть в форме капсидных мономеров, капсидных мультимеров, белковых или пептидных фрагментов VLP или их комплексов или смесей. Норовирусные антигенные белки или пептиды могут также находиться в денатурированной форме, их можно получить посредством способов, известных в уровне техники.Norovirus antigens can be in the form of peptides, proteins, or virus-like particles (VLPs). In a preferred embodiment, norovirus antigens include VLPs. As used herein, the expression virus-like particle(s) or VLP refers to a virus-like particle(s), fragment(s), complexes, or portion(s) thereof derived from the norovirus capsid protein coding sequence and comprising an antigenic characteristic(s). ), similar to those of norovirus infectious particles. Norovirus antigens may also be in the form of capsid monomers, capsid multimers, VLP protein or peptide fragments, or complexes or mixtures thereof. Norovirus antigenic proteins or peptides may also be in denatured form and may be prepared by methods known in the art.
VLP по настоящему изобретению могут быть образованы либо из норовирусного капсидного белка полной длины, такого как белки VP1 и/или VP2, либо определенных производных VP1 или VP2 посредством стандартных способов из уровня техники. Альтернативно, капсидный белок, применяемый для образования VLP, является усеченным капсидным белком. В некоторых вариантах осуществления, например, по меньшей мере один из VLP содержит усеченный белок VP1. В других вариантах осуществления все VLP содержат усеченные белки VP1. Усечение может быть N- или С-концевым усечением. Усеченные капсидные белки являются подходящими функциональными производными капсидного белка. Функциональные производные капсидного белка способны вызывать иммунный ответ (при необходимости, при наличии подходящего адъюванта) таким же образом, как вызывают иммунный ответ VLP, состоящие из капсидного белка полной длины.The VLPs of the present invention can be formed from either a full length norovirus capsid protein, such as the VP1 and/or VP2 proteins, or certain derivatives of VP1 or VP2, by standard methods of the art. Alternatively, the capsid protein used to form the VLP is a truncated capsid protein. In some embodiments, for example, at least one of the VLPs contains a truncated VP1 protein. In other embodiments, all VLPs contain truncated VP1 proteins. The truncation may be N- or C-terminal truncation. Truncated capsid proteins are suitable functional derivatives of the capsid protein. Functional derivatives of the capsid protein are capable of eliciting an immune response (if necessary, in the presence of a suitable adjuvant) in the same way that VLPs consisting of a full length capsid protein elicit an immune response.
VLP могут содержать главные белки VP1 и/или малые белки VP2. В некоторых вариантах осуществления каждая VLP содержит белок VP1 и/или VP2 из норовируса только одной геногруппы, образуя моновалентную VLP. Используемое в данном документе выражение моновалентный означает, что антигенные белки получены из норовируса одной геногруппы. Например, VLP содержат VP1 и/или VP2 из штамма вируса геногруппы I (например, VP1 и VP2 из вируса Norwalk). Предпочтительно VLP преимущественно состоят из белков VP1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антиген представляет собой смесь моновалентных VLP, где композиция включает VLP состоящие из VP1 и VP2 из норовируса одной геногруппы, смешанные с VLP, состоящими из VP1 и VP2 норовируса другой геногруппы (например, вируса Norwalk и вируса Houston), полученными из нескольких вирусных штаммов. Исключительно в качестве примера композиция может содержать моновалентные VLP из одного или нескольких штаммов норовируса геногруппы I совместно с моновалентными VLP из одного или нескольких штаммов норовируса геногруппы II. Штаммы могут быть выбраны на основе их преобладания в кровотоке в данное время. В определенных вариантах осуществления смесь VLP норовируса включает вирусные штаммы GI.1 и GII.4. Более предпочтительно смесь VLP норовируса содержит последовательность штаммов Norwalk и консенсусную последовательность капсидного белка, полученную из норовирусов геногруппы II. Консенсусные последовательности капсидного белка, полученные из последовательностей циркулирующих норовирусов, и VLP, созданные из таких последовательностей, описаны в WO 2010/017542, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Например, в одном варианте осуществления консенсусная последовательность капсидного белка, полученная из вирусных штаммов 4 генотипа геногруппы II (GII.4), содержит последовательность SEQ ID NO: 1. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция вакцины содержит смесь моновалентных VLP, где одни моновалентные VLP содержат капсидный белок из норовируса геногруппы I (например, Norwalk), а другие моновалентные VLP содержат капсидный белок с консенсусной последовательностью, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1.VLPs may contain major VP1 proteins and/or minor VP2 proteins. In some embodiments, each VLP contains a VP1 and/or VP2 protein from a norovirus of only one genogroup, forming a monovalent VLP. As used herein, the term "monovalent" means that the antigenic proteins are derived from a norovirus of the same genogroup. For example, VLPs contain VP1 and/or VP2 from a strain of genogroup I virus (eg, VP1 and VP2 from Norwalk virus). Preferably the VLPs are predominantly composed of VP1 proteins. In one embodiment of the present invention, the antigen is a mixture of monovalent VLPs, where the composition comprises VLPs consisting of VP1 and VP2 from a norovirus of one genogroup mixed with VLPs consisting of VP1 and VP2 of a norovirus of another genogroup (e.g., Norwalk virus and Houston virus) obtained from several viral strains. By way of example only, the composition may comprise monovalent VLPs from one or more genogroup I norovirus strains together with monovalent VLPs from one or more genogroup II norovirus strains. Strains can be selected based on their predominance in the bloodstream at a given time. In certain embodiments, the norovirus VLP mixture comprises the GI.1 and GII.4 viral strains. More preferably, the norovirus VLP mixture contains a sequence of Norwalk strains and a consensus capsid protein sequence derived from genogroup II noroviruses. Capsid protein consensus sequences derived from circulating norovirus sequences and VLPs generated from such sequences are described in WO 2010/017542, which is incorporated herein by reference in its entirety. For example, in one embodiment, the consensus capsid protein sequence derived from genotype II (GII.4) genotype 4 viral strains contains the sequence SEQ ID NO: 1. Thus, in some embodiments, the vaccine composition contains a mixture of monovalent VLPs, VLPs contain a capsid protein from genogroup I norovirus (e.g., Norwalk), and other monovalent VLPs contain a consensus sequence capsid protein containing the sequence of SEQ ID NO: 1.
- 6 042694- 6 042694
MKMASSDANPSDGSTANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPV AGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGP DLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKIIFAAV PPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYH YNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPD FDFIFLVPPTVESRTKPFTVPILTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGP SGAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHIAG TQEYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQ TTRGDGSTRGHKATVSTGSVHFTPKLGSVQFSTDTSNDFETG QNTKFTPVGVVQDGSTTHQNEPQQWVLPDYSGRDSHNVHL APAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMNLDCLLPQEWVQ HFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVA HTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL (SEQ ID NO: 1).MKMASSDANPSDGSTANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPV AGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGP DLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKIIFAAV PPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYH YNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPD FDFIFLVPPTVESRTKPFTVPILTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGP SGAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHIAG TQEYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQ TTRGDGSTRGHKATVSTGSVHFTPKLGSVQFSTDTSNDFETG QNTKFTPVGVVQDGSTTHQNEPQQWVLPDYSGRDSHNVHL APAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMNLDCLLPQEWVQ HFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVA HTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL (SEQ ID NO: 1).
Однако в альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения VLP могут быть мультивалентными VLP, которые содержат, например, белки VP1 и/или VP2 из норовируса одной геногруппы, смешанные с белками VP1 и/или VP2 из норовируса второй геногруппы, где различные белки VP1 и VP2 не являются химерными белками VP1 и VP2, но связаны вместе в одной капсидной структуре с образованием иммуногенных VLP. Используемое в данном документе выражение мультивалентный означает, что антигенные белки получены из двух или более геногрупп или штаммов норовируса. Мультивалентные VLP могут содержать антигены VLP, взятые из двух или более вирусных штаммов. Исключительно в качестве примера композиция может содержать мультивалентные VLP, состоящие из капсидных мономеров или мультимеров из одного или нескольких штаммов норовируса геногруппы I (например, вируса Norwalk) совместно с капсидными мономерами или мультимерами из одного или нескольких штаммов норовируса геногруппы II (например, вируса Houston). Предпочтительно мультивалентные VLP содержат капсидные белки из штаммов норовируса Norwalk и Houston или других преобладающих в данное время циркулирующих штаммов.However, in an alternative embodiment of the present invention, the VLPs may be multivalent VLPs that contain, for example, VP1 and/or VP2 proteins from a norovirus of one genogroup mixed with VP1 and/or VP2 proteins from a norovirus of a second genogroup, where different VP1 and VP2 proteins are not VP1 and VP2 chimeric proteins, but linked together in a single capsid structure to form immunogenic VLPs. As used herein, the expression multivalent means that the antigenic proteins are derived from two or more genogroups or strains of norovirus. Multivalent VLPs may contain VLP antigens taken from two or more viral strains. By way of example only, the composition may comprise multivalent VLPs consisting of capsid monomers or multimers from one or more genogroup I norovirus strains (e.g., Norwalk virus) together with capsid monomers or multimers from one or more genogroup II norovirus strains (e.g., Houston virus) . Preferably, the multivalent VLPs contain capsid proteins from Norwalk and Houston strains of norovirus or other currently predominant circulating strains.
Комбинирование моновалентных или мультивалентных VLP в композиции предпочтительно не будет снижать иммуногенность VLP каждого типа. В частности, предпочтительно, чтобы между VLP норовируса в комбинации по настоящему изобретению не было взаимного воздействия так, чтобы комбинированная композиция VLP по настоящему изобретению была способна стимулировать формирование иммунитета к инфекции с помощью норовируса каждого генотипа, представленного в вакцине. Соответственно, иммунный ответ против данного типа VLP в комбинации составляет по меньшей мере 50% иммунного ответа против того же типа VLP при измерении отдельно, предпочтительно 100% или практически 100%. Иммунный ответ можно подходящим образом определять, например, посредством гуморальных иммунных ответов, как иллюстрируется в примерах данного документа.The combination of monovalent or multivalent VLPs in a composition will preferably not reduce the immunogenicity of each type of VLP. In particular, it is preferred that there is no interaction between the norovirus VLPs in the combination of the present invention, so that the combined VLP composition of the present invention is capable of stimulating immunity to infection by each norovirus genotype present in the vaccine. Accordingly, the immune response against a given VLP type in combination is at least 50% of the immune response against the same VLP type when measured alone, preferably 100% or substantially 100%. The immune response can be appropriately determined, for example, by means of humoral immune responses, as illustrated in the examples of this document.
Используемое в данном документе выражение VLP норовируса геногруппы I относится либо к моновалентным, либо к мультивалентным VLP, которые содержат капсидный белок, полученный из одного или нескольких штаммов норовируса геногруппы I. В некоторых вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы I содержат капсидный белок полной длины из норовируса геногруппы I (например, вируса Norwalk). В других вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы I содержат капсидный белок с консенсусной последовательностью, полученный из различных штаммов геногруппы I. Штаммы геногруппы I, из которых получена консенсусная последовательность капсидного белка, могут входить в один и тот же генотип или генетический кластер или в разные генотипы или генетические кластеры. Аналогично, используемое в данном документе выражение VLP норовируса геногруппы II относится либо к моновалентным, либо к мультивалентным VLP, которые содержат капсидный белок, полученный из одного или нескольких штаммов норовируса геногруппы II. В некоторых вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы II содержат капсидный белок полной длины из норовируса геногруппы II (например, вируса Laurens или Minerva). В других вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы II содержат капсидный белок с консенсусной последовательностью, полученный из различных штаммов геногруппы II. Штаммы геногруппы II, из которых получена консенсусная последовательность капсидного белка, могут входить в один и тот же генотип или генетический кластер или в разные генотипы или генетические кластеры. В одном варианте осуществления VLP норовируса геногруппы II содержат консенсусную последовательность капсидного белка из норовируса 4 генотипа геногруппы II (GII.4). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления VLP норовируса геногруппы II содержатAs used herein, the term genogroup I norovirus VLPs refers to either monovalent or multivalent VLPs that contain a capsid protein derived from one or more strains of genogroup I norovirus. I (for example, the Norwalk virus). In other embodiments, the genogroup I norovirus VLPs comprise a consensus sequence capsid protein derived from different genogroup I strains. The genogroup I strains from which the consensus capsid protein sequence is derived may be in the same genotype or genetic cluster, or in different genotypes, or genetic clusters. Similarly, as used herein, the term genogroup II norovirus VLP refers to either monovalent or multivalent VLPs that contain a capsid protein derived from one or more strains of genogroup II norovirus. In some embodiments, the genogroup II norovirus VLPs comprise a full length capsid protein from a genogroup II norovirus (eg Laurens or Minerva virus). In other embodiments, the genogroup II norovirus VLPs comprise a consensus sequence capsid protein derived from various genogroup II strains. The strains of genogroup II from which the consensus sequence of the capsid protein is derived may belong to the same genotype or genetic cluster, or to different genotypes or genetic clusters. In one embodiment, the genogroup II norovirus VLPs comprise a consensus capsid protein sequence from genogroup II norovirus 4 genotype (GII.4). Thus, in some embodiments, genogroup II norovirus VLPs comprise
- 7 042694 последовательность капсидного белка SEQ ID NO: 1.- 7 042694 capsid protein sequence SEQ ID NO: 1.
Мультивалентные VLP можно получать посредством раздельной экспрессии отдельных капсидных белков с последующим комбинированием для получения VLP. Альтернативно множество капсидных белков может экспрессироваться в одной и той же клетке из одного или нескольких ДНК-конструктов. Например, клетки-хозяева можно трансформировать или трансфицировать с помощью множества ДНКконструктов, причем каждый вектор кодирует отличный капсидный белок. Альтернативно, можно применять один вектор со множеством генов капсидных белков, регулируемых общим промотором или несколькими отдельными промоторами. IRES-элементы также можно при необходимости внедрять в вектор. С помощью таких стратегий экспрессии совместно экспрессируемые капсидные белки можно совместно очищать для дальнейшего образования VLP, или они могут самопроизвольно образовывать мультивалентные VLP, которые можно затем очищать.Multivalent VLPs can be generated by separate expression of individual capsid proteins followed by combination to produce VLPs. Alternatively, multiple capsid proteins can be expressed in the same cell from one or more DNA constructs. For example, host cells can be transformed or transfected with a variety of DNA constructs, with each vector encoding a different capsid protein. Alternatively, a single vector with multiple capsid protein genes driven by a common promoter or several separate promoters can be used. IRES elements can also be embedded in the vector if desired. With these expression strategies, co-expressed capsid proteins can be co-purified to further form VLPs, or they can spontaneously form multivalent VLPs that can then be purified.
Предпочтительный способ получения мультивалентных VLP включает получение капсидных белков или производных VLP, таких как белки VP1, из норовирусов различных генотипов, смешивание белков и сборку белков с получением мультивалентных VLP. Белки VP1 могут быть в форме неочищенного экстракта, могут быть частично очищенными или очищенными перед смешиванием. Собранные моновалентные VLP различных геногрупп можно разбирать, смешивать вместе и собирать заново в мультивалентные VLP. Предпочтительно белки или VLP по меньшей мере частично очищены перед комбинированием. Необязательно дополнительное очищение мультивалентных VLP можно проводить после сборки.A preferred method for making multivalent VLPs involves making capsid proteins or VLP derivatives such as VP1 proteins from noroviruses of different genotypes, mixing the proteins, and assembling the proteins to make multivalent VLPs. The VP1 proteins may be in the form of a crude extract, may be partially purified or purified prior to mixing. The assembled monovalent VLPs of different genogroups can be taken apart, mixed together and reassembled into multivalent VLPs. Preferably, the proteins or VLPs are at least partially purified prior to combination. Optionally, additional purification of multivalent VLPs can be carried out after assembly.
В подходящем случае VLP по настоящему изобретению получают, разбирая и заново собирая VLP для обеспечения гомогенных и чистых VLP. В одном варианте осуществления мультивалентные VLP можно получать, разбирая две или более VLP, с последующим комбинированием разобранных компонентов VLP в любой подходящий момент до новой сборки. Этот подход можно применять, когда VLP образуются самопроизвольно из экспрессированного белка VP1, что происходит, например, у некоторых штаммов дрожжей. В случае когда экспрессия белка VP1 не приводит к самопроизвольному образованию VLP, получения белков VP1 или капсомеров можно комбинировать до сборки в VLP.Suitably, the VLPs of the present invention are obtained by disassembling and reassembling VLPs to provide homogeneous and clean VLPs. In one embodiment, multivalent VLPs can be obtained by disassembling two or more VLPs, and then recombining the disassembled VLP components at any appropriate time prior to reassembly. This approach can be applied when VLPs are generated spontaneously from the expressed VP1 protein, which occurs, for example, in some yeast strains. In the case where expression of the VP1 protein does not spontaneously form a VLP, the production of VP1 proteins or capsomers can be combined prior to assembly into a VLP.
В случае когда используют мультивалентные VLP, компоненты VLP предпочтительно смешивают в процентном соотношении, в котором они должны быть в конечных смешанных VLP. Например, смесь одинакового количества частично очищенного белка VP1 из вирусов Norwalk и Houston (или других штаммов норовируса) обеспечивает мультивалентные VLP с приблизительно равными количествами каждого белка.In the case where multivalent VLPs are used, the VLP components are preferably blended at the percentage they should be in the final blended VLPs. For example, a mixture of the same amount of partially purified VP1 protein from Norwalk and Houston viruses (or other strains of norovirus) provides multivalent VLPs with approximately equal amounts of each protein.
Композиции, содержащие мультивалентные VLP, можно стабилизировать с помощью растворов, известных в уровне техники, таких как растворы из WO 98/44944, WO 00/45841, включенных в данный документ посредством ссылки.Compositions containing multivalent VLPs can be stabilized using solutions known in the art, such as those from WO 98/44944, WO 00/45841, incorporated herein by reference.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать другие белки или фрагменты белков в дополнение к белкам или производным VP1 и VP2 норовируса. Другие белки или пептиды можно также вводить вместе с композицией по настоящему изобретению. Необязательно композицию можно также составлять или вводить вместе с антигенами, не являющимися норовирусными антигенами. Соответственно, эти антигены могут обеспечивать защиту от других заболеваний.The compositions of the present invention may contain other proteins or protein fragments in addition to the norovirus VP1 and VP2 proteins or derivatives. Other proteins or peptides may also be administered with the composition of the present invention. Optionally, the composition may also be formulated or administered with antigens other than norovirus antigens. Accordingly, these antigens may confer protection against other diseases.
Белок VP1 или функциональное производное белка в подходящем случае способны образовывать VLP, и образование VLP можно оценивать с помощью стандартных техник, таких как, например, эксклюзионная хроматография, электронная микроскопия и динамическое рассеяние лазерного излучения.The VP1 protein or functional protein derivative is suitably capable of forming VLPs, and VLP formation can be assessed using standard techniques such as, for example, size exclusion chromatography, electron microscopy, and dynamic laser light scattering.
Молекулы антигена по настоящему изобретению можно получать с помощью выделения и очищения из организмов, в которых они встречаются в природе, или их можно получать с помощью техник рекомбинации. Предпочтительно антигены VLP норовируса получают из клеток насекомых, таких как клетки Sf9 или Н5, хотя можно применять любые подходящие клетки, такие как клетки Е. coli или дрожжей, например, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastori или другие системы экспрессии на основе Pichia, системы экспрессии на основе клеток млекопитающих, такие как системы экспрессии на основе СНО или HEK. При получении с помощью рекомбинантного способа или с помощью синтеза можно производить одну или несколько вставок, делеций, инверсий или замещений аминокислот, составляющих пептид. Каждый из вышеуказанных антигенов предпочтительно применяют в по сути чистом состоянии.The antigen molecules of the present invention can be obtained by isolation and purification from the organisms in which they occur naturally, or they can be obtained using recombination techniques. Preferably norovirus VLP antigens are derived from insect cells such as Sf9 or H5 cells, although any suitable cell such as E. coli or yeast cells, e.g. S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastori or other expression systems based on Pichia, mammalian cell based expression systems such as CHO or HEK based expression systems. When obtained using a recombinant method or by synthesis, one or more insertions, deletions, inversions or substitutions of the amino acids that make up the peptide can be made. Each of the above antigens is preferably used in a substantially pure state.
Процедуры получения VLP норовируса в культуре клеток насекомых были ранее раскрыты в патенте США № 6942865, который включен в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки. Вкратце, клонируют кДНК от 3'-конца генома, содержащего ген вирусного капсида (ORF2) и малый структурный ген (ORF3). Рекомбинантные бакуловирусы, несущие гены вирусного капсида, конструируют на основе клонированных кДНК. VLP норовируса получают в культурах клеток насекомых Sf9 или Н5.Procedures for obtaining norovirus VLPs in insect cell culture have previously been disclosed in US Pat. No. 6,942,865, which is hereby incorporated by reference in its entirety. Briefly, cDNA is cloned from the 3' end of the genome containing the viral capsid gene (ORF2) and the small structural gene (ORF3). Recombinant baculoviruses carrying viral capsid genes are constructed from cloned cDNA. Norovirus VLPs are obtained in Sf9 or H5 insect cell cultures.
В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины содержит один или несколько адъювантов в комбинации с норовирусным антигеном. Большинство адъювантов содержат вещество, предназначенное защищать антиген от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как белки, полученные из Bordatella pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Подходящие адъюванты коммерчески доступны, как, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант (Pifco Laboratories, Детройт, Мичиган); адъювант Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Рахвей, Нью-Джерси); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминияIn some embodiments, the vaccine composition comprises one or more adjuvants in combination with a norovirus antigen. Most adjuvants contain a substance designed to protect the antigen from rapid catabolism, such as aluminum hydroxide or mineral oil, and an immune response stimulator, such as proteins derived from Bordatella pertussis or Mycobacterium tuberculosis. Suitable adjuvants are commercially available, such as incomplete Freund's adjuvant and complete adjuvant (Pifco Laboratories, Detroit, Michigan); adjuvant Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, New Jersey); aluminum salts such as aluminum hydroxide gel
- 8 042694 (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина, ацилированных сахаров; катионно или анионно полученные полисахариды; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы и Quil A.- 8 042694 (alum) or aluminum phosphate; salts of calcium, iron or zinc; insoluble suspension of acylated tyrosine, acylated sugars; cationically or anionically derived polysaccharides; polyphosphazenes; biodegradable microspheres and Quil A.
Подходящие адъюванты также включают без ограничений агонисты ton-подобных рецепторов (TLR), в частности, агонисты toll-подобных рецепторов 4 типа (TLR-4) (например, монофосфорил-липид A (MPL), синтетический липид А, миметики или аналоги липида А), соли алюминия, цитокины, сапонины, производные мурамилдипептида (MDP), CpG-олигонуклеотиды, липополисахарид (LPS) грамотрицательных бактерий, полифосфазены, эмульсии, виросомы, кохлеаты, микрочастицы сополимеров (лактида и гликолида) (PLG), полоксамерные частицы, микрочастицы, липосомы, эмульсии масло в воде, MF59 и сквален. В некоторых вариантах осуществления адъюванты не являются экзотоксинами бактериального происхождения. Предпочтительные адъюванты включают адъюванты, которые стимулируют ответ по Th1-типу, такие как 3DMPL или QS21.Suitable adjuvants also include, without limitation, ton-like receptor (TLR) agonists, in particular toll-like type 4 receptor (TLR-4) agonists (e.g., monophosphoryl lipid A (MPL), synthetic lipid A, lipid A mimetics or analogues ), aluminum salts, cytokines, saponins, muramyl dipeptide (MDP) derivatives, CpG oligonucleotides, lipopolysaccharide (LPS) of gram-negative bacteria, polyphosphazenes, emulsions, virosomes, cochleates, microparticles of copolymers (lactide and glycolide) (PLG), poloxamer particles, microparticles, liposomes, oil-in-water emulsions, MF59 and squalene. In some embodiments, the adjuvants are not exotoxins of bacterial origin. Preferred adjuvants include adjuvants that stimulate a Th1-type response such as 3DMPL or QS21.
Монофосфорил-липид A (MPL), нетоксичное производное липида А, полученного из Salmonella, является сильным агонистом TLR-4, который был разработан в качестве адъюванта вакцины (Evans et al. 2003). В доклинических исследованиях на мышах было показано, что интраназальное введение MPL усиливает секреторные, а также системные гуморальные ответы (Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002). Также была доказана его безопасность и эффективность в качестве адъюванта вакцины в клинических исследованиях на более 120000 пациентов (Baldrick et al., 2002; Baldridge et al. 2004). MPL стимулирует индукцию врожденного иммунитета посредством рецептора TLR-4 и, таким образом, способен стимулировать формирование неспецифических иммунных ответов против широкого спектра инфекционных патогенов, в том числе грамотрицательных и грамположительных бактерий, вирусов и паразитов (Baldridge et al. 2004; Persing et al. 2002). Включение MPL в составы вакцин должно обеспечивать быструю индукцию врожденных ответов, стимулируя формирование неспецифических иммунных ответов, после введения вирусной провокационной пробы и при этом усиливать специфические ответы, вызываемые антигенными компонентами вакцины.Monophosphoryl lipid A (MPL), a non-toxic lipid A derivative derived from Salmonella, is a potent TLR-4 agonist that has been developed as a vaccine adjuvant (Evans et al. 2003). In preclinical studies in mice, intranasal administration of MPL has been shown to enhance secretory as well as systemic humoral responses (Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002). It has also been shown to be safe and effective as a vaccine adjuvant in over 120,000 clinical trials (Baldrick et al., 2002; Baldridge et al. 2004). MPL stimulates the induction of innate immunity via the TLR-4 receptor and thus is able to stimulate non-specific immune responses against a wide range of infectious pathogens, including gram-negative and gram-positive bacteria, viruses and parasites (Baldridge et al. 2004; Persing et al. 2002 ). The inclusion of MPL in vaccine formulations should ensure rapid induction of innate responses, stimulating the formation of non-specific immune responses, after the introduction of a viral challenge and, at the same time, enhance specific responses caused by the antigenic components of the vaccine.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет композицию, содержащую монофосфорил-липид A (MPL) или 3-де-О-ацилированный монофосфорил-липид A (3D-MPL) в качестве стимулятора адаптивного и врожденного иммунитета. В химическом отношении 3D-MPL представляет собой смесь 3-де-О-ацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная форма 3-де-О-ацилированного монофосфорил-липида А раскрыта в Европейском патенте 0689454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA), который включен в данный документ посредством ссылки. В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет композицию, содержащую синтетический липид А, миметики или аналоги липида А, такие как PET липид А от BioMira, или синтетические производные, разработанные таким образом, что функционируют как агонисты TLR-4.In one embodiment, the present invention provides a composition containing monophosphoryl lipid A (MPL) or 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A (3D-MPL) as an adaptive and innate immune stimulant. Chemically, 3D-MPL is a mixture of 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A with 4, 5 or 6 acylated chains. A preferred form of 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A is disclosed in EP 0689454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA), which is incorporated herein by reference. In another embodiment, the present invention provides a composition comprising synthetic lipid A, lipid A mimetics or analogs, such as PET lipid A from BioMira, or synthetic derivatives designed to function as TLR-4 agonists.
В определенных вариантах осуществления композиция вакцины содержит два адъюванта. Комбинацию адъювантов можно выбрать из комбинаций, описанных выше. В одном конкретном варианте осуществления два адъюванта представляют собой MPL и гидроксид алюминия (например, квасцы). В другом конкретном варианте осуществления два адъюванта представляют собой MPL и масло.In certain embodiments, the vaccine composition contains two adjuvants. The combination of adjuvants can be selected from the combinations described above. In one particular embodiment, the two adjuvants are MPL and aluminum hydroxide (eg, alum). In another specific embodiment, the two adjuvants are MPL and oil.
Выражение эффективное количество адъюванта будет хорошо понятно специалисту в данной области и включает количество одного или нескольких адъювантов, которое способно стимулировать иммунный ответ на введенный антиген, т.е. количество, которое увеличивает иммунный ответ на введенную композицию антигена, который измеряют на основе уровней IgA в смывах из носовой полости, уровней сывороточного IgG или IgM или В- и Т-клеточной пролиферации. Подходящее эффективное увеличение уровней иммуноглобулинов включает более чем на 5%, предпочтительно более чем на 25% и, в частности, более чем на 50% по сравнению с такой же композицией антигена без какого-либо адъюванта.The term "effective amount of adjuvant" will be well understood by one skilled in the art and includes the amount of one or more adjuvants that is capable of stimulating an immune response to the administered antigen, i.e. an amount that enhances the immune response to the administered antigen composition as measured by IgA levels in nasal swabs, serum IgG or IgM levels, or B and T cell proliferation. Suitable effective increases in immunoglobulin levels include more than 5%, preferably more than 25% and in particular more than 50% compared to the same antigen composition without any adjuvant.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет композицию вакцины, составленную для парентерального введения, где композиция включает по меньшей мере два типа VLP норовируса в комбинации с гидроксидом алюминия и буфером. Буфер может быть выбран из группы, включающей L-гистидин, имидазол, янтарную кислоту, трис, лимонную кислоту, бис-трис, PIPES, MES, HEPES, глицинамид и трицин. В одном варианте осуществления буфер представляет собой L-гистидин или имидазол. Предпочтительно буфер присутствует в концентрации от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, более предпочтительно от приблизительно 18 мМ до приблизительно 40 мМ или наиболее предпочтительно от приблизительно 20 мМ до приблизительно 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления рН композиции антигена или вакцины составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, или от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, или приблизительно 6,5. Композиция вакцины может представлять собой водный состав. В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины представляет собой лиофилизированный порошок и ее ресуспендируют с получением водного состава.In one embodiment, the present invention provides a vaccine composition formulated for parenteral administration, wherein the composition comprises at least two types of norovirus VLPs in combination with aluminum hydroxide and a buffer. The buffer may be selected from the group consisting of L-histidine, imidazole, succinic acid, tris, citric acid, bis-tris, PIPES, MES, HEPES, glycinamide and tricine. In one embodiment, the buffer is L-histidine or imidazole. Preferably the buffer is present at a concentration of from about 15 mM to about 50 mM, more preferably from about 18 mM to about 40 mM, or most preferably from about 20 mM to about 25 mM. In some embodiments, the pH of the antigen or vaccine composition is from about 6.0 to about 7.0, or from about 6.2 to about 6.8, or about 6.5. The vaccine composition may be an aqueous formulation. In some embodiments, the vaccine composition is a lyophilized powder and is resuspended to form an aqueous formulation.
В определенных вариантах осуществления композиция вакцины дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант в дополнение к VLP норовируса двух или более типов, гидроксиду алюминия и буферу. Например, адъювант может представлять собой агонист toll-подобных рецепторов, такой как MPL, флагеллин, CpG-олигонуклеотиды, синтетический липид А или миметики или аналоги липида А. В одном конкретном варианте осуществления адъювант представляет собой MPL.In certain embodiments, the vaccine composition further comprises at least one adjuvant in addition to two or more types of norovirus VLP, aluminum hydroxide, and a buffer. For example, the adjuvant may be a toll-like receptor agonist such as MPL, flagellin, CpG oligonucleotides, synthetic lipid A, or lipid A mimetics or analogs. In one specific embodiment, the adjuvant is MPL.
- 9 042694- 9 042694
VLP норовируса, которые включают в композиции вакцины по настоящему изобретению, могут представлять собой любые VLP, описанные в данном документе. В одном варианте осуществления каждый из двух типов VLP норовируса содержит капсидный белок различных геногрупп (например, геногруппы I и геногруппы II). Например, VLP норовируса одного типа содержат капсидный белок, полученный из норовируса геногруппы I, a VLP норовируса другого типа содержат капсидный белок, полученный из норовируса геногруппы II. В одном варианте осуществления VLP норовируса одного типа содержат капсидный белок из вируса Norwalk, a VLP норовируса другого типа содержат капсидный белок с консенсусной последовательностью, полученный из норовирусов 4 генотипа геногруппы II (например, капсидный белок, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1). Композиция вакцины может содержать от приблизительно 5 мкг до приблизительно 200 мкг VLP норовируса каждого типа, более предпочтительно от приблизительно 15 мкг до приблизительно 50 мкг VLP норовируса каждого типа. В некоторых вариантах осуществления доза VLP норовируса одного типа отличается от дозы VLP норовируса другого типа. Например, в определенных вариантах осуществления композиция вакцины содержит от приблизительно 5 мкг до приблизительно 15 мкг VLP геногруппы I и от приблизительно 15 мкг до приблизительно 50 мкг VLP геногруппы II. В других вариантах осуществления композиция вакцины содержит от приблизительно 15 мкг до приблизительно 50 мкг VLP геногруппы I и от приблизительно 50 мкг до приблизительно 150 мкг VLP геногруппы II.The norovirus VLPs that are included in the vaccine compositions of the present invention may be any of the VLPs described herein. In one embodiment, each of the two types of norovirus VLPs contains a capsid protein of different genogroups (eg, genogroup I and genogroup II). For example, one type of norovirus VLPs contain a capsid protein derived from a genogroup I norovirus, and another type of norovirus VLPs contain a capsid protein derived from a genogroup II norovirus. In one embodiment, one type of norovirus VLPs contain a capsid protein from the Norwalk virus, and another type of norovirus VLPs contain a capsid protein with a consensus sequence derived from genotype 4 noroviruses of genogroup II (e.g., a capsid protein containing the sequence of SEQ ID NO: 1). The vaccine composition may contain from about 5 µg to about 200 µg of each type of norovirus VLP, more preferably from about 15 µg to about 50 µg of each type of norovirus VLP. In some embodiments, the dose of one type of norovirus VLP is different from the other type of norovirus VLP. For example, in certain embodiments, the vaccine composition contains from about 5 µg to about 15 µg of genogroup I VLP and from about 15 µg to about 50 µg of genogroup II VLP. In other embodiments, the vaccine composition contains from about 15 µg to about 50 µg of genogroup I VLP and from about 50 µg to about 150 µg of genogroup II VLP.
В некоторых вариантах осуществления композиции вакцины дополнительно содержат фармацевтически приемлемую соль, включая без ограничений хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, сульфат аммония и цитрат натрия. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид натрия. Концентрация фармацевтически приемлемой соли может составлять от приблизительно 10 мМ до приблизительно 200 мМ с предпочтительными концентрациями в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ. Предпочтительно композиции вакцины по настоящему изобретению содержат менее 2 мМ свободного фосфата. В некоторых вариантах осуществления композиции вакцины содержат менее 1 мМ свободного фосфата. Композиции вакцины могут также дополнительно содержать другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как сахара (например, сахароза, трегалоза, маннит) и поверхностно-активные вещества.In some embodiments, the vaccine compositions further comprise a pharmaceutically acceptable salt, including, without limitation, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, ammonium sulfate, and sodium citrate. In one embodiment, the pharmaceutically acceptable salt is sodium chloride. The concentration of the pharmaceutically acceptable salt may be from about 10 mM to about 200 mM, with preferred concentrations ranging from about 100 mM to about 150 mM. Preferably, the vaccine compositions of the present invention contain less than 2 mM free phosphate. In some embodiments, the vaccine compositions contain less than 1 mM free phosphate. Vaccine compositions may also additionally contain other pharmaceutically acceptable excipients such as sugars (eg sucrose, trehalose, mannitol) and surfactants.
Как рассматривалось в данном документе, композиции по настоящему изобретению можно составлять для введения в виде составов вакцины. Используемое в данном документе выражение вакцина относится к составу, который содержит VLP норовируса или другие норовирусные антигены по настоящему изобретению, описанные выше, который представлен в форме, которую можно вводить позвоночным, в частности, человеку, и который индуцирует защитный иммунный ответ, достаточный для индукции иммунитета для предупреждения и/или облегчения течения норовирусной инфекции или индуцируемой норовирусом болезни и/или для уменьшения по меньшей мере одного симптома норовирусной инфекции или болезни.As discussed herein, the compositions of the present invention can be formulated for administration as vaccine formulations. As used herein, the expression vaccine refers to a formulation that contains norovirus VLPs or other norovirus antigens of the present invention as described above, which is in a form that can be administered to vertebrates, in particular humans, and which induces a protective immune response sufficient to induce immunity to prevent and/or alleviate the course of a norovirus infection or norovirus-induced disease and/or to reduce at least one symptom of a norovirus infection or disease.
Используемое в данном документе выражение иммунный ответ относится как к гуморальному иммунному ответу, так и к клеточно-опосредованному иммунному ответу. Гуморальный иммунный ответ включает стимуляцию продукции антител В-лимфоцитами, которые, например, нейтрализуют возбудителей инфекции, препятствуют проникновению возбудителей инфекции в клетки, препятствуют репликации указанных возбудителей инфекции и/или защищают клетки-хозяева от инфекции и разрушения. Клеточно-опосредованный иммунный ответ относится к иммунному ответу, опосредованному Тлимфоцитами и/или другими клетками, такими как макрофаги, направленному против возбудителя инфекции, проявляющемуся у позвоночных (например, человека), который предупреждает или облегчает течение инфекции или уменьшает по меньшей мере один ее симптом. В частности, защитный иммунитет или защитный иммунный ответ относится к иммунитету или стимулированию формирования иммунного ответа против возбудителя инфекции, проявляющемуся у позвоночных (например, человека), который предупреждает или облегчает течение инфекции или уменьшает по меньшей мере один ее симптом. В частности, об индукции защитного иммунного ответа при введении вакцины свидетельствует устранение или уменьшение проявления одного или нескольких симптомов острого гастроэнтерита или уменьшение длительности или тяжести таких симптомов. Клинические симптомы гастроэнтерита, вызванного норовирусом, включают тошноту, диарею, жидкий стул, рвоту, лихорадку и общее недомогание. Защитный иммунный ответ, который уменьшает или устраняет симптомы заболевания будет уменьшать или останавливать распространение эпидемии норовируса в популяции. Получение вакцины в целом описано в Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). Композиции по настоящему изобретению можно составлять, например, для доставки в одну или несколько из слизистых ротовой полости, желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей (например, носовой полости). Композиции по настоящему изобретению можно составлять, например, для доставки посредством инъекции, такой как парентеральная инъекция (например, внутривенная, подкожная, внутрикожная или внутримышечная инъекция).As used herein, the term immune response refers to both a humoral immune response and a cell-mediated immune response. The humoral immune response includes stimulating the production of antibodies by B lymphocytes, which, for example, neutralize infectious agents, prevent the entry of infectious agents into cells, prevent the replication of said infectious agents, and/or protect host cells from infection and destruction. Cell-mediated immune response refers to an immune response mediated by T-lymphocytes and/or other cells such as macrophages against an infectious agent in vertebrates (e.g., humans) that prevents or alleviates infection or reduces at least one of its symptoms. . In particular, protective immunity or protective immune response refers to immunity or stimulation of the formation of an immune response against an infectious agent, manifested in vertebrates (for example, humans), which prevents or alleviates the infection or reduces at least one of its symptoms. In particular, the induction of a protective immune response upon administration of a vaccine is indicated by the elimination or reduction of one or more symptoms of acute gastroenteritis, or by a reduction in the duration or severity of such symptoms. Clinical symptoms of norovirus gastroenteritis include nausea, diarrhea, loose stools, vomiting, fever, and general malaise. A protective immune response that reduces or eliminates the symptoms of a disease will reduce or stop the spread of an epidemic of norovirus in a population. Vaccine preparation is generally described in Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). The compositions of the present invention can be formulated, for example, for delivery to one or more of the mucous membranes of the oral cavity, gastrointestinal tract and respiratory tract (eg, nasal cavity). The compositions of the present invention can be formulated, for example, for delivery by injection, such as parenteral injection (eg intravenous, subcutaneous, intradermal or intramuscular injection).
В случае когда композиция предназначена для доставки в слизистую дыхательных путей (например, носовой полости), ее обычно составляют в виде водного раствора для введения в форме аэрозоля, или назальных капель, или, альтернативно, в форме сухого порошка, например, для быстрого накопленияWhen the composition is intended to be delivered to the mucosa of the respiratory tract (e.g., nasal cavity), it is usually formulated as an aqueous solution for administration in the form of an aerosol or nasal drops, or alternatively, in the form of a dry powder, for example, for rapid accumulation
- 10 042694 в носовом ходе. Композиции для введения в форме назальных капель могут содержать одно или несколько вспомогательных веществ таких, какие обычно включают в подобные композиции, например, консерванты, средства, регулирующие вязкость, средства, регулирующее тоничность, буферные средства и т.п. Средствами для изменения вязкости могут быть микрокристаллическая целлюлоза, хитозан, крахмалы, полисахариды и т.п. Композиции для введения в форме сухого порошка могут также содержать одно или несколько вспомогательных веществ, какие обычно включают в подобные композиции, например, средства, регулирующие мукоадгезивные свойства, наполнители и средства для придания порошку соответствующих характеристик текучести и объема. Наполнители и средства, регулирующие текучесть и объем порошка, могут включать маннит, сахарозу, трегалозу и ксилит.- 10 042694 in the nasal passage. Compositions for administration in the form of nasal drops may contain one or more adjuvants such as are commonly included in such compositions, for example, preservatives, viscosity adjusting agents, tonicity adjusting agents, buffering agents, and the like. Viscosity modifiers can be microcrystalline cellulose, chitosan, starches, polysaccharides, and the like. Compositions for administration in the form of a dry powder may also contain one or more adjuvants such as are commonly included in such compositions, for example, mucoadhesive agents, excipients, and agents for imparting appropriate flow and volume characteristics to the powder. Fillers and powder flow and bulk agents may include mannitol, sucrose, trehalose, and xylitol.
В случае когда композиция предназначена для парентеральной инъекции, такой как внутривенная (i.v.), подкожная (s.c), внутрикожная или внутримышечная (i.m.) инъекция, ее обычно составляют в форме жидкой суспензии (т.е. водного состава), содержащей по меньшей мере один тип VLP норовируса и необязательно по меньшей мере один адъювант. В одном варианте осуществления адъювант может представлять собой MPL. В другом варианте осуществления в жидкой вакцине, составленной для парентерального введения, может содержаться более одного адъюванта. В предпочтительном варианте осуществления жидкая вакцина, составленная для парентерального введения (например, составленная для i.m., i.v. или s.c. введения), содержит VLP норовируса геногруппы I и/или геногруппы II с гидроксидом алюминия (например, квасцами) и монофосфорил-липидом A (MPL) в качестве адъювантов. В одном варианте осуществления, жидкий состав для парентерального введения содержит антиген (антигены) геногрупп норовируса, такой как один или несколько типов VLP норовируса, описанных в данном документе, MPL, гидроксид алюминия и буфер. В другом варианте осуществления жидкий состав для парентерального введения содержит антиген (антигены) геногрупп норовируса, MPL, масло и буфер. В определенных вариантах осуществления буфер в составах вакцины для парентерального введения представляет собой L-гистидин или имидазол. Парентеральное введение жидких вакцин можно осуществлять посредством иглы и шприца, как хорошо известно в уровне техники.When the composition is intended for parenteral injection, such as intravenous (i.v.), subcutaneous (s.c), intradermal or intramuscular (i.m.) injection, it is usually formulated in the form of a liquid suspension (i.e., an aqueous formulation) containing at least one norovirus VLP type; and optionally at least one adjuvant. In one embodiment, the adjuvant may be MPL. In another embodiment, a liquid vaccine formulated for parenteral administration may contain more than one adjuvant. In a preferred embodiment, the liquid vaccine formulated for parenteral administration (e.g., formulated for i.m., i.v., or s.c. administration) contains genogroup I and/or genogroup II norovirus VLPs with aluminum hydroxide (e.g., alum) and monophosphoryl lipid A (MPL) as adjuvants. In one embodiment, the parenteral liquid formulation comprises a norovirus genogroup antigen(s), such as one or more of the norovirus VLP types described herein, MPL, aluminum hydroxide, and a buffer. In another embodiment, the parenteral liquid formulation comprises the norovirus genogroup antigen(s), MPL, an oil, and a buffer. In certain embodiments, the buffer in parenteral vaccine formulations is L-histidine or imidazole. Parenteral administration of liquid vaccines can be done with a needle and syringe, as is well known in the art.
В определенных вариантах осуществления композиция вакцины по настоящему изобретению для стимулирования формирования защитного иммунного ответа против норовируса у людей содержит VLP норовируса геногруппы I и/или геногруппы II в дозе не более 150 мкг. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция вакцины содержит не более 150 мкг, не более 100 мкг, не более 50 мкг, не более 25 мкг, не более 15 мкг или не более 10 мкг VLP норовируса геногруппы I. В других вариантах осуществления композиция вакцины содержит не более 150 мкг, не более 100 мкг, не более 50 мкг, не более 25 мкг, не более 15 мкг или не более 10 мкг VLP норовируса геногруппы II. В определенных вариантах осуществления композиция вакцины содержит не более 150 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы I и геногруппы II. В таких вариантах осуществления доза VLP норовируса геногруппы I и VLP геногруппы II может быть одинаковой или различной. Например, в одном варианте осуществления композиция вакцины может содержать не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 150 мкг VLP норовируса геногруппы II. В другом варианте осуществления композиция вакцины может содержать не более 25 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы II. В других вариантах осуществления композиция вакцины может содержать не более 15 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы II. В еще других вариантах осуществления композиция вакцины может содержать не более 25 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 150 мкг VLP норовируса геногруппы II.In certain embodiments, the vaccine composition of the present invention for stimulating a protective immune response against norovirus in humans comprises a genogroup I and/or genogroup II norovirus VLP at a dose of not more than 150 μg. For example, in some embodiments, the vaccine composition contains no more than 150 µg, no more than 100 µg, no more than 50 µg, no more than 25 µg, no more than 15 µg, or no more than 10 µg of genogroup I norovirus VLP. In other embodiments, the vaccine composition contains not more than 150 µg, not more than 100 µg, not more than 50 µg, not more than 25 µg, not more than 15 µg, or not more than 10 µg VLP of norovirus genogroup II. In certain embodiments, the vaccine composition contains no more than 150 μg of each of genogroup I and genogroup II norovirus VLPs. In such embodiments, the dosage of genogroup I norovirus VLP and genogroup II VLP may be the same or different. For example, in one embodiment, the vaccine composition may contain no more than 50 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 150 μg of genogroup II norovirus VLP. In another embodiment, the vaccine composition may contain no more than 25 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 50 μg of genogroup II norovirus VLP. In other embodiments, the vaccine composition may contain no more than 15 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 50 μg of genogroup II norovirus VLP. In still other embodiments, the vaccine composition may contain no more than 25 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 150 μg of genogroup II norovirus VLP.
VLP норовируса геногруппы I и геногруппы II могут быть получены из любого штамма норовируса, описанного в данном документе. В одном варианте осуществления VLP норовируса геногруппы I представляют собой VLP 1 генотипа геногруппы I (GI.1) (т.е. содержат капсидный белок из норовируса GI.1). В другом варианте осуществления VLP норовируса геногруппы I представляют собой VLP вируса Norwalk. В другом варианте осуществления VLP норовируса геногруппы II представляют собой VLP 4 генотипа геногруппы II (GII.4). В другом варианте осуществления VLP норовируса геногруппы II представляют собой VLP, полученные в результате экспрессии консенсусной последовательности норовируса геногруппы II. В конкретном варианте осуществления VLP норовируса геногруппы II содержат капсидный белок с последовательностью SEQ ID NO: 1.Norovirus genogroup I and genogroup II VLPs can be obtained from any norovirus strain described herein. In one embodiment, the genogroup I norovirus VLPs are genogroup I genotype 1 (GI.1) VLPs (ie, contain the capsid protein from norovirus GI.1). In another embodiment, the genogroup I norovirus VLPs are Norwalk virus VLPs. In another embodiment, the genogroup II norovirus VLPs are genogroup II (GII.4) genotype 4 VLPs. In another embodiment, the genogroup II norovirus VLPs are VLPs resulting from the expression of a genogroup II norovirus consensus sequence. In a specific embodiment, genogroup II norovirus VLPs comprise a capsid protein with the sequence of SEQ ID NO: 1.
Композиции вакцины, описанные ранее в данном документе, можно лиофилизировать и хранить в безводном состоянии до того, как они будут готовы к использованию, и тогда их ресуспендируют с помощью разбавителя. Альтернативно, различные компоненты композиции можно хранить отдельно в наборе (любой или все компоненты можно лиофилизировать). Компоненты можно оставлять в лиофилизированной форме для сухого состава или можно ресуспендировать для жидких составов и либо смешивать перед применением, либо вводить пациенту отдельно. В некоторых вариантах осуществления композиции вакцины хранятся в наборах в форме жидких составов, и к ним могут прилагаться устройства доставки, такие как шприцы с иглами. В других вариантах осуществления жидкие композиции вакцины можно хранить в устройствах доставки в наборе. Например, набор может содержать предварительно заполненные шприцы, автоинжекторы или устройства шприц-ручки, содержащие жидкий состав композиции вакцины, описанный в данном документе.Vaccine compositions described earlier herein can be lyophilized and stored anhydrous until ready for use, at which time they are resuspended with a diluent. Alternatively, the various components of the composition may be stored separately in a kit (any or all of the components may be lyophilized). The components may be left in lyophilized form for dry formulations or may be resuspended for liquid formulations and either mixed prior to use or administered separately to the patient. In some embodiments, the vaccine compositions are stored in kits in the form of liquid formulations and may be accompanied by delivery devices such as syringes with needles. In other embodiments, liquid vaccine formulations may be stored in delivery devices in a kit. For example, the kit may contain pre-filled syringes, auto-injectors, or pen devices containing the liquid formulation of the vaccine composition described herein.
- 11 042694- 11 042694
Лиофилизация вакцин хорошо известна в уровне техники. Обычно жидкий антиген лиофилизируют в присутствии средств для защиты антигена во время процесса лиофилизации и для получения осадка с необходимыми характеристиками порошка. Сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или лактоза (присутствующие в начальной концентрации 10-200 мг/мл) обычно применяют для криозащиты белковых антигенов и для получения лиофилизированного осадка с необходимыми характеристиками порошка. Лиофилизация композиций теоретически дает в результате более устойчивую композицию.Lyophilization of vaccines is well known in the art. Typically, the liquid antigen is lyophilized in the presence of agents to protect the antigen during the lyophilization process and to obtain a pellet with the desired powder characteristics. Sugars such as sucrose, mannitol, trehalose, or lactose (present at an initial concentration of 10-200 mg/ml) are commonly used to cryoprotect protein antigens and to produce a lyophilized pellet with the desired powder characteristics. Lyophilization of compositions theoretically results in a more stable composition.
Количество антигена в каждой композиции вакцины выбирают как количество, которое индуцирует сильный иммунный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов. Такое количество будет варьировать в зависимости от того, какой специфический антиген (антигены) используют, от пути введения и используемых адъювантов. В общем, доза, которую вводят пациенту, согласно настоящему изобретению должна быть достаточной для того, чтобы вызвать защитный иммунный ответ у пациента через какое-то время или чтобы индуцировать выработку антиген-специфичных антител. Таким образом, композицию вводят пациенту в количестве, достаточном для стимулирования формирования иммунного ответа на специфические антигены и/или для предупреждения, облегчения, уменьшения или излечения симптомов и/или осложнений заболевания или инфекции и, таким образом, уменьшения или остановки распространения эпидемии норовируса в популяции. Количество, достаточное для выполнения вышеуказанного, определяют как терапевтически эффективную дозу.The amount of antigen in each vaccine composition is chosen as the amount that induces a strong immune response without significant adverse side effects. This amount will vary depending on which specific antigen(s) are used, the route of administration and the adjuvants used. In general, the dose administered to a patient according to the present invention should be sufficient to elicit a protective immune response in the patient over time or to induce the production of antigen-specific antibodies. Thus, the composition is administered to a patient in an amount sufficient to stimulate the formation of an immune response to specific antigens and/or to prevent, alleviate, reduce or cure the symptoms and/or complications of a disease or infection and thereby reduce or stop the spread of the norovirus epidemic in the population. . An amount sufficient to accomplish the foregoing is defined as a therapeutically effective dose.
Композиции вакцины по настоящему изобретению можно вводить посредством пути введения через слизистые или не через слизистые. Эти пути введения могут включать in vivo введение посредством парентеральной инъекции (например, внутривенной, подкожной, внутрикожной и внутримышечной), или другие традиционные прямые пути, такие как буккальный/сублингвальный, ректальный, пероральный, назальный, местный (такой как трансдермальный и глазной), вагинальный, легочный, интраартериальный, внутрибрюшинный, интраокулярный или интраназальный пути, или введение непосредственно в конкретную ткань. Другие подходящие пути введения включают чрескожный, субдермальный и посредством суппозитория. В одном варианте осуществления вакцину вводят посредством парентерального пути введения, такого как внутривенный, подкожный, внутрикожный или внутримышечный. В определенных вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутримышечного пути введения. Введение можно осуществлять просто путем непосредственного введения с помощью иглы, катетера или сходного устройства (например, предварительно заполненных шприцев или автоинжекторов) одномоментно или в разные моменты времени. Другие составы для парентерального введения могут быть доставлены подкожно или внутрикожно посредством микроинъекции или способов доставки с использованием трансдермального пластыря.Vaccine compositions of the present invention may be administered via a mucosal or non-mucosal route. These routes of administration may include in vivo administration via parenteral injection (such as intravenous, subcutaneous, intradermal and intramuscular), or other conventional direct routes such as buccal/sublingual, rectal, oral, nasal, topical (such as transdermal and ophthalmic), vaginal, pulmonary, intra-arterial, intraperitoneal, intraocular or intranasal routes, or administration directly to a specific tissue. Other suitable routes of administration include transdermal, subdermal and suppository. In one embodiment, the vaccine is administered via a parenteral route such as intravenous, subcutaneous, intradermal, or intramuscular. In certain embodiments, the vaccine is administered via the intramuscular route of administration. Administration can be accomplished simply by direct administration with a needle, catheter, or similar device (eg, pre-filled syringes or auto-injectors) at the same time or at different times. Other parenteral formulations may be delivered subcutaneously or intradermally via microinjection or transdermal patch delivery methods.
В настоящем изобретении представлены способы стимулирования формирования защитного иммунитета против норовируса у субъекта, включающие парентеральное введение субъекту не более однократной дозы композиции вакцины по настоящему изобретению, где указанная вакцина содержит VLP норовируса геногруппы I и/или геногруппы II, описанные в данном документе, и необязательно по меньшей мере один адъювант. В таких вариантах осуществления композиция вакцины однократной дозы индуцирует по меньшей мере трехкратное увеличение титра норовирус-специфичных сывороточных антител по сравнению с титром у человека до введения композиции. В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины однократной дозы индуцирует по меньшей мере шестикратное увеличение титра норовирус-специфичных сывороточных антител по сравнению с титром у человека до введения композиции. В других вариантах осуществления композиция вакцины однократной дозы индуцирует титр норовирус-специфичных сывороточных антител, сопоставимый с титром антител, индуцируемым контактом с живым норовирусом при природной инфекции, т.е. более чем десятикратное увеличение титра норовирус-специфичных сывороточных антител по сравнению с титром у человека до введения композиции. В определенных вариантах осуществления композиция вакцины однократной дозы индуцирует увеличение титра норовирус-специфичных сывороточных антител в течение семи дней после введения композиции. Предпочтительно композицию вакцины однократной дозы вводят посредством внутривенного, подкожного или внутримышечного пути введения. В определенном варианте осуществления композицию вакцины однократной дозы вводят человеку внутримышечно.The present invention provides methods for inducing protective immunity against norovirus in a subject, comprising parenterally administering to the subject no more than a single dose of a vaccine composition of the present invention, wherein said vaccine contains the genogroup I and/or genogroup II norovirus VLPs described herein and optionally at least one adjuvant. In such embodiments, the single-dose vaccine composition induces at least a three-fold increase in norovirus-specific serum antibody titer compared to the human titer prior to administration of the composition. In some embodiments, the single dose vaccine composition induces at least a six-fold increase in norovirus-specific serum antibody titer compared to the titer in a human prior to administration of the composition. In other embodiments, the single dose vaccine composition induces a norovirus-specific serum antibody titer comparable to the antibody titer induced by exposure to live norovirus in natural infection, i. more than a tenfold increase in the titer of norovirus-specific serum antibodies compared to the titer in humans before the administration of the composition. In certain embodiments, the single dose vaccine composition induces an increase in norovirus-specific serum antibody titer within seven days of administration of the composition. Preferably, the single dose vaccine composition is administered via the intravenous, subcutaneous or intramuscular routes of administration. In a particular embodiment, the single dose vaccine composition is administered intramuscularly to a human.
Как описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления композиции вакцины однократной дозы, подходящие для применения в способе, содержат не более 150 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы I и/или геногруппы II. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция вакцины содержит не более 150 мкг, не более 100 мкг, не более 50 мкг, не более 25 мкг, не более 15 мкг или не более 10 мкг VLP норовируса геногруппы I. В других вариантах осуществления композиция вакцины содержит не более 150 мкг, не более 100 мкг, не более 50 мкг, не более 25 мкг, не более 15 мкг или не более 10 мкг VLP норовируса геногруппы II. В определенных вариантах осуществления композиция вакцины содержит не более 50 мкг каждого из VLP норовируса геногруппы I и геногруппы II. В вариантах осуществления, в которых композиция вакцины однократной дозы содержит VLP норовируса и геногруппы I, и геногруппы II, доза VLP норовируса геногруппы I и VLP геногруппы II может быть одинаковой или различной. Например, в одном варианте осуществления композиция вакцины может содержать не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 150 мкг VLP норовируса геноAs described herein, in some embodiments, single dose vaccine compositions suitable for use in the method contain no more than 150 μg of each of genogroup I and/or genogroup II norovirus VLPs. For example, in some embodiments, the vaccine composition contains no more than 150 µg, no more than 100 µg, no more than 50 µg, no more than 25 µg, no more than 15 µg, or no more than 10 µg of genogroup I norovirus VLP. In other embodiments, the vaccine composition contains not more than 150 µg, not more than 100 µg, not more than 50 µg, not more than 25 µg, not more than 15 µg, or not more than 10 µg VLP of norovirus genogroup II. In certain embodiments, the vaccine composition contains no more than 50 μg of each of genogroup I and genogroup II norovirus VLPs. In embodiments in which the single dose vaccine composition comprises both genogroup I and genogroup II norovirus VLPs, the dose of genogroup I norovirus VLP and genogroup II VLP may be the same or different. For example, in one embodiment, the vaccine composition may contain no more than 50 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 150 μg of genogroup I norovirus VLP.
- 12 042694 группы II. В другом варианте осуществления композиция вакцины может содержать не более 25 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы II. В других вариантах осуществления композиция вакцины может содержать не более 15 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 50 мкг VLP норовируса геногруппы II. В еще других вариантах осуществления композиция вакцины может содержать не более 25 мкг VLP норовируса геногруппы I и не более 150 мкг VLP норовируса геногруппы II.- 12 042694 group II. In another embodiment, the vaccine composition may contain no more than 25 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 50 μg of genogroup II norovirus VLP. In other embodiments, the vaccine composition may contain no more than 15 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 50 μg of genogroup II norovirus VLP. In still other embodiments, the vaccine composition may contain no more than 25 μg of genogroup I norovirus VLP and no more than 150 μg of genogroup II norovirus VLP.
В одном варианте осуществления способа субъект является человеком, и вакцина обеспечивает защиту от одного или нескольких симптомов норовирусной инфекции. Хотя в других источниках и сообщалось о способах индукции иммунного ответа с помощью норовирусных антигенов (см. публикацию заявки на патент США № US 2007/0207526), показатели защитного иммунного ответа против норовируса у людей все еще четко не определены (Herbst-Kralovetz et al. (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307). В отличие от некоторых вакцин, лицензированных в настоящее время в США, где эффективность вакцины коррелирует с сывороточными антителами, исследования показали, что маркеры иммунного ответа, такие как увеличение титров сывороточных антител IgG к вирусу Norwalk, не связаны с защитным иммунитетом у людей (Johnson et al. (1990) J. Infectious Diseases 161: 18-21). Более того, другое исследование, в котором изучали реакцию людей на введение провокационной пробы с вирусом Norwalk, показало, что восприимчивость к инфекции Norwalk является мультифакториальной и включает такие факторы, как секреторный статус и иммунологическая память слизистых (Lindesmith et al. (2003) Nature Medicine 9: 548-553).In one embodiment of the method, the subject is a human and the vaccine provides protection against one or more symptoms of a norovirus infection. Although methods for inducing an immune response using norovirus antigens have been reported elsewhere (see U.S. Patent Application Publication No. US 2007/0207526), indicators of a protective immune response against norovirus in humans are still not well defined (Herbst-Kralovetz et al. (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307). Unlike some vaccines currently licensed in the US, where vaccine efficacy is correlated with serum antibodies, studies have shown that immune response markers, such as increased serum IgG titers to Norwalk virus, are not associated with protective immunity in humans (Johnson et al. al (1990) J. Infectious Diseases 161: 18-21). Moreover, another study investigating human response to Norwalk virus challenge showed that susceptibility to Norwalk infection is multifactorial and includes factors such as secretory status and mucosal immunological memory (Lindesmith et al. (2003) Nature Medicine 9:548-553).
Поскольку норовирус невозможно культивировать in vitro, то анализы нейтрализации вирусов в настоящее время не доступны. Функциональным анализом, который служит заменой анализу нейтрализации, является анализ ингибирования гемагглютинации (HAI) (см. пример 1). HAI позволяет измерять способность антител, индуцированных норовирусной вакциной, ингибировать агглютинацию эритроцитов, покрытых антигенами, VLP норовируса, так как VLP норовируса связываются с антигенами эритроцитов (например, антигенами группы крови). Данный анализ также известен как анализ блокирования углеводов, поскольку он показывает функциональную способность антитела блокировать связывание вируса или VLP с углеводами антигенов группы крови на поверхности эритроцитов. В данном анализе определенное количество VLP норовируса смешивают с определенным количеством эритроцитов и сыворотки от иммунизированных субъектов. Если образец сыворотки содержит функциональные антитела, антитела будут связываться с VLP и, таким образом, ингибировать агглютинацию эритроцитов. Используемое в данном документе выражение функциональные антитела относится к антителам, способным ингибировать взаимодействие между частицами норовируса и антигенами эритроцитов. Другими словами, титр функциональных антител равен титру антител, блокирующих антигены группы крови (HBGA) или углеводы. Сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител можно измерять с помощью анализа HAI, описанного выше. Сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител можно также измерять с помощью анализа на основе ELISA, в котором углеводный Нантиген связан с лунками микротитровального планшета и связывание VLP норовируса с Н-антигеном выявляют в присутствии сыворотки (см. пример 1 и Reeck et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(8): 12121218). Увеличение уровня норовирус-специфичных функциональных антител может служить показателем защитного иммунного ответа. Таким образом, в одном варианте осуществления введение вакцины стимулирует формирование защитного иммунитета, что включает увеличение сывороточного титра норовирус-специфичных функциональных антител по сравнению с сывороточным титром у человека, не получавшего вакцину. Сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител, служащий показателем защитного иммунного ответа, предпочтительно представляет собой средний геометрический титр, составляющий более 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 по результатам измерения с помощью анализа HAI, или средний геометрический титр блокирующих антител (BT)50 (50% ингибирование связывания Н-антигена с VLP норовирусом) составляет более 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 по результатам измерения с помощью анализа связывания Н-антигена. В одном варианте осуществления сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител представляет собой средний геометрический титр, составляющий более 40 по результатам измерения с помощью анализа HAL В другом варианте осуществления сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител представляет собой средний геометрический титр, составляющий более 100 по результатам измерения с помощью анализа HAL В другом варианте осуществления сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител представляет собой средний геометрический титр ВТ50, составляющий более 100 по результатам измерения с помощью анализа связывания Н-антигена. В еще другом варианте осуществления сывороточный титр норовирус-специфичных функциональных антител представляет собой средний геометрический титр ВТ50, составляющий более 200 по результатам измерения с помощью анализа связывания Н-антигена.Because norovirus cannot be cultured in vitro, virus neutralization assays are not currently available. A functional assay that serves as a replacement for the neutralization assay is the hemagglutination inhibition (HAI) assay (see Example 1). HAI measures the ability of norovirus vaccine-induced antibodies to inhibit the agglutination of antigen-coated erythrocytes by norovirus VLPs, since norovirus VLPs bind to erythrocyte antigens (eg, blood group antigens). This assay is also known as a carbohydrate blocking assay because it measures the functional ability of an antibody to block virus or VLP binding to blood group antigen carbohydrates on the surface of red blood cells. In this assay, a certain amount of norovirus VLP is mixed with a certain amount of red blood cells and serum from immunized subjects. If the serum sample contains functional antibodies, the antibodies will bind to the VLP and thus inhibit erythrocyte agglutination. As used herein, the term functional antibodies refers to antibodies capable of inhibiting the interaction between norovirus particles and erythrocyte antigens. In other words, the titer of functional antibodies is equal to the titer of antibodies that block blood group antigens (HBGA) or carbohydrates. Serum titer of norovirus-specific functional antibodies can be measured using the HAI assay described above. Serum titer of norovirus-specific functional antibodies can also be measured using an ELISA-based assay in which the carbohydrate Nantigen is bound to the wells of a microtiter plate and binding of the norovirus VLP to the H antigen is detected in the presence of serum (see example 1 and Reeck et al. (2010). ) J Infect Dis, Vol 202(8): 12121218). An increase in the level of norovirus-specific functional antibodies may serve as an indicator of a protective immune response. Thus, in one embodiment, the introduction of the vaccine stimulates the formation of protective immunity, which includes an increase in the serum titer of norovirus-specific functional antibodies compared with the serum titer in a person who did not receive the vaccine. The serum titer of norovirus-specific functional antibodies indicative of a protective immune response is preferably a geometric mean titer greater than 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 as measured by HAI assay, or geometric mean titer blocking antibodies (BT) 50 (50% inhibition of H antigen binding to norovirus VLP) is greater than 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, or 500 as measured by the H antigen binding assay. In one embodiment, the norovirus-specific functional antibody serum titer is a geometric mean titer of greater than 40 as measured by the HAL assay In another embodiment, the norovirus-specific functional antibody serum titer is a geometric mean titer of greater than 100 as measured by HAL assay In another embodiment, the serum titer of norovirus-specific functional antibodies is a geometric mean BT50 titer of greater than 100 as measured by an H-antigen binding assay. In yet another embodiment, the serum titer of norovirus-specific functional antibodies is a geometric mean BT 50 titer of greater than 200 as measured by an H-antigen binding assay.
В дополнительном аспекте введением вакцины стимулируют формирование защитного иммунитета, включая IgA-опосредованный мукозный иммунный ответ и IgG-опосредованный системный иммунный ответ, посредством парентерального введения (предпочтительно внутримышечного) субъекту не более однократной дозы антигенной композиции или композиции вакцины, содержащей один или не- 13 042694 сколько типов норовирусных антигенов и необязательно по меньшей мере один эффективный адъювант.In a further aspect, protective immunity, including an IgA-mediated mucosal immune response and an IgG-mediated systemic immune response, is stimulated by administration of the vaccine by parenteral (preferably intramuscular) administration to a subject of no more than a single dose of an antigenic composition or a vaccine composition containing one or more how many types of norovirus antigens and optionally at least one effective adjuvant.
Изобретатели обнаружили, что парентеральное введение композиций норовирусной вакцины, описанных в данном документе, индуцирует сильный IgA-опосредованный ответ в дополнение к сильному IgGопосредованному ответу. Как правило, сильные IgA-опосредованные ответы наблюдаются только когда вакцины вводят посредством пути введения через слизистые.The inventors have found that parenteral administration of the norovirus vaccine compositions described herein induces a strong IgA-mediated response in addition to a strong IgG-mediated response. Typically, strong IgA-mediated responses are observed only when vaccines are administered via the mucosal route of administration.
В определенных вариантах осуществления введение вакцины стимулирует формирование защитного иммунитета, что включает увеличение уровня клеток, секретирующих норовирус-специфичные антитела класса IgA, в крови по сравнению с уровнем у человека, не получавшего вакцину. В некоторых вариантах осуществления введение вакцины стимулирует формирование защитного иммунитета, что включает увеличение уровня клеток, секретирующих норовирус-специфичные антитела класса IgA, в крови по сравнению с уровнем у человека до получения вакцины. В одном варианте осуществления клетками, секретирующими норовирус-специфичные антитела класса IgA, являются CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ и α4β7+. Клетки, секретирующие антитела, с данным маркерным профилем способны к хоумингу как в периферическую лимфоидную ткань, такую как пейеровы бляшки в кишечнике, так и в лимфоидную ткань слизистой, такой как слизистая кишечника. В одном варианте осуществления количество CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ и α4β7+ клеток, секретирующих антитела класса IgA, составляет более приблизительно 500, приблизительно 700, приблизительно 1000, приблизительно 1500 или более приблизительно 2000 клеток на 1x106 моноцитов периферической крови. В другом варианте осуществления клетками, секретирующими норовирус-специфичные антитела класса IgA, являются CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- и α4β7+. Σ секретирующих антитела клеток с данным маркерным профилем обычно наблюдается хоуминг только в участки слизистой, и они могут служить показателями вторичного В-клеточного ответа. В некоторых вариантах осуществления, в которых вакцину вводят внутримышечно, количество CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- и α4β7+ клеток, секретирующих антитела класса IgA, составляет более приблизительно 5000, приблизительно 6500, приблизительно 7000, приблизительно 10000, приблизительно 13000, приблизительно 15000 или более приблизительно 20000 клеток на 1x106 моноцитов периферической крови.In certain embodiments, the administration of the vaccine stimulates the formation of protective immunity, which includes an increase in the level of cells that secrete norovirus-specific IgA antibodies in the blood compared to the level in a person who did not receive the vaccine. In some embodiments, the administration of the vaccine stimulates the formation of protective immunity, which includes an increase in the level of cells that secrete norovirus-specific IgA antibodies in the blood compared to the level in a person before the vaccine is received. In one embodiment, cells secreting norovirus-specific IgA antibodies are CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+, and α4β7+. Antibody secreting cells with this marker profile are capable of homing to both peripheral lymphoid tissue, such as Peyer's patches in the intestine, and mucosal lymphoid tissue, such as the intestinal mucosa. In one embodiment, the number of CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+, and α4β7+ IgA class antibody-secreting cells is greater than about 500, about 700, about 1000, about 1500, or greater than about 2000 cells per 1x106 peripheral blood monocytes. In another embodiment, cells secreting norovirus-specific IgA class antibodies are CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- and α4β7+. Σ antibody-secreting cells with this marker profile are usually only homing to mucosal sites and may be indicative of a secondary B-cell response. In some embodiments in which the vaccine is administered intramuscularly, the number of CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L-, and α4β7+ IgA class-secreting cells is greater than about 5000, about 6500, about 7000, about 10000, about 13000, about 15000 or more approximately 20,000 cells per 1x106 peripheral blood monocytes.
Аналогичные результаты получали с вакцинами против других вирусов, таких как ротавирус. В отношении ротавирусной вакцины существуют разногласия по поводу того, вовлечены ли сывороточные антитела непосредственно в защиту или только отражают недавнюю инфекцию (Jiang, 2002; Franco, 2006). Определение таких взаимосвязей с защитой особенно затруднительно в отношении острых кишечных инфекций, таких как ротавирусные или норовирусные, поскольку доклинические исследования, по результатам которых можно сделать вывод о защитном эффекте, могут быть многофакторными и учитывать защитные свойства слизистых (такие как опосредованные IgA кишечника), выработку цитокинов и клеточный иммунитет. Сложность измерения таких иммунных ответов во время клинических исследований и слабая взаимосвязь с данными измерений сывороточных антител подразумевают, что эффективность вакцины против этих типов вирусов можно обнаружить только с помощью клинических экспериментов по введению провокационной пробы людям.Similar results were obtained with vaccines against other viruses such as rotavirus. For rotavirus vaccine, there is controversy over whether serum antibodies are directly involved in protection or only reflect recent infection (Jiang, 2002; Franco, 2006). Determining such relationships with protection is particularly difficult for acute enteric infections such as rotavirus or norovirus because preclinical studies suggesting a protective effect may be multifactorial and take into account mucosal defenses (such as intestinal IgA mediated), production cytokines and cellular immunity. The difficulty of measuring such immune responses during clinical trials and the weak correlation with serum antibody measurements imply that the effectiveness of a vaccine against these types of viruses can only be detected by human challenge clinical experiments.
Как указано выше, введение композиции вакцины по настоящему изобретению предупреждает и/или уменьшает по меньшей мере один симптом норовирусной инфекции. Симптомы норовирусной инфекции хорошо известны в уровне техники и включают тошноту, рвоту, диарею и спастические боли в желудке. Кроме того, у пациента с норовирусной инфекцией может наблюдаться субфебрильная лихорадка, головная боль, озноб, мышечные боли и слабость. Настоящее изобретение также охватывает способ индукции защитного иммунного ответа у субъекта с наличием норовирусной инфекции посредством введения субъекту состава вакцины по настоящему изобретению таким образом, что облегчают и/или уменьшают по меньшей мере один симптом, связанный с норовирусной инфекцией. Уменьшение симптома может быть определено субъективно или объективно, например, посредством самостоятельной оценки своего состояния субъектом, оценки клиницистом или посредством проведения соответствующего анализа или измерения (например, температуры тела), включая, например, оценку качества жизни, замедление прогрессирования норовирусной инфекции или дополнительных симптомов, уменьшение тяжести симптомов норовирусной инфекции, или подходящих анализов (например, титр антител, выявление антигенов методом ОТ-ПЦР и/или анализ активации В-клеток или Т-клеток). Эффективный ответ также можно определять посредством прямого измерения (например, ОТ-ПЦР) вирусной нагрузки в образцах испражнений, которая отражает количество вирусов, выделяемых из кишечника). Объективное оценивание включает методы оценки, применяемые как для животных, так и для человека.As indicated above, administration of the vaccine composition of the present invention prevents and/or reduces at least one symptom of a norovirus infection. The symptoms of norovirus infection are well known in the art and include nausea, vomiting, diarrhea, and stomach cramps. In addition, a patient with norovirus infection may experience low-grade fever, headache, chills, muscle pain, and weakness. The present invention also encompasses a method of inducing a protective immune response in a subject having a norovirus infection by administering to the subject a vaccine composition of the present invention in a manner that alleviates and/or reduces at least one symptom associated with a norovirus infection. Symptom reduction can be determined subjectively or objectively, for example, through the subject's self-assessment, clinician's assessment, or through appropriate analysis or measurement (for example, body temperature), including, for example, assessment of quality of life, slowing the progression of norovirus infection, or additional symptoms, reducing the severity of symptoms of norovirus infection, or appropriate tests (eg, antibody titer, antigen detection by RT-PCR, and/or B-cell or T-cell activation assay). An effective response can also be determined by direct measurement (eg, RT-PCR) of the viral load in stool samples, which reflects the amount of virus shed from the gut). Objective assessment includes assessment methods applied to both animals and humans.
В настоящем изобретении также представлен способ стимулирования образования антител к одному или нескольким норовирусным антигенам, причем указанный способ включает введение композиции вакцины по настоящему изобретению, описанной выше, субъекту. Эти антитела можно выделять и очищать с помощью обычных способов из уровня техники. Выделенные антитела, специфичные в отношении норовирусных антигенов, можно использовать при разработке диагностических иммунологических анализов. Эти анализы можно использовать для выявления норовируса в клинических образцах и идентификации конкретного вируса, вызывающего инфекцию (например, Norwalk, Houston, Snow Mountain иThe present invention also provides a method for stimulating the production of antibodies to one or more norovirus antigens, said method comprising administering the vaccine composition of the present invention described above to a subject. These antibodies can be isolated and purified using conventional methods from the prior art. Isolated antibodies specific for norovirus antigens can be used in the development of diagnostic immunoassays. These assays can be used to detect norovirus in clinical specimens and identify the specific virus causing the infection (for example, Norwalk, Houston, Snow Mountain, and
- 14 042694- 14 042694
т.д.). Альтернативно, выделенные антитела можно вводить субъектам, восприимчивым к норовирусной инфекции, для обеспечения пассивного или краткосрочного иммунитета.etc.). Alternatively, isolated antibodies can be administered to subjects susceptible to norovirus infection to provide passive or short-term immunity.
Настоящее изобретение будет далее более подробно иллюстрировано основываясь на конкретных вариантах осуществления, описанных в следующих примерах. Примеры, как предполагается, служат исключительно иллюстративным целям настоящего изобретения и, как предполагается, не ограничивают каким-либо образом его объем.The present invention will be further illustrated in more detail based on the specific embodiments described in the following examples. The examples are intended to serve purely illustrative purposes of the present invention and are not intended to limit its scope in any way.
ПримерыExamples
Пример 1. Исследование с эскалацией дозы по изучению безопасности и иммуногенности норовирусной бивалентной вакцины для внутримышечного введения на основе вирусоподобных частиц (VLP) у людей (исследование LV03-104), когорта А.Example 1 Dose Escalation Study to Investigate the Safety and Immunogenicity of Norovirus Bivalent Intramuscular Virus-Like Particle (VLP) Vaccine in Humans (Study LV03-104), Cohort A.
В данном примере описана когорта А рандомизированного многоцентрового исследования с эскалацией дозы по изучению безопасности и иммуногенности четырех уровней дозировки норовирусной бивалентной вакцины для внутримышечного введения (IM) на основе VLP с адъювантом монофосфориллипидом A (MPL) и гидроксидом алюминия (А10Н) по сравнению с плацебо у взрослых субъектов. Приблизительно 48 субъектов в возрасте от 18 до 49 лет включили в когорту. Субъекты получали две дозы вакцины или плацебо посредством внутримышечной (IM) инъекции с использованием 1,5-дюймовой (38 мм) иглы с разницей в 28 дней.This example describes Cohort A of a randomized, multicentre, dose-escalation study investigating the safety and immunogenicity of four dosage levels of a VLP-based bivalent intramuscular (IM) norovirus vaccine with adjuvant monophosphoryl lipid A (MPL) and aluminum hydroxide (A10H) compared with placebo in adult subjects. Approximately 48 subjects aged 18 to 49 were included in the cohort. Subjects received two doses of vaccine or placebo via intramuscular (IM) injection using a 1.5-inch (38 mm) needle 28 days apart.
Норовирусная бивалентная вакцина на основе VLP содержала VLP 1 генотипа геногруппы I (GI.1) и IV генотипа геногруппы II (GII.4) в качестве антигенов и монофосфорил-липид A (MPL) и гидроксид алюминия (AlOH) в качестве адъювантов, хлорид натрия (NaCl) и L-гистидин (L-His) в качестве буфера (рН 6,3-6,7), этанол и воду для инъекций. Композиция норовирусной бивалентной вакцины для внутримышечного введения на основе VLP изложена в табл.1. VLP GII.4 содержали последовательность капсидного белка SEQ ID NO: 1, полученную из трех штаммов GII.4.Norovirus bivalent VLP vaccine contained VLP 1 genotype genogroup I (GI.1) and genotype IV genogroup II (GII.4) as antigens and monophosphoryl lipid A (MPL) and aluminum hydroxide (AlOH) as adjuvants, sodium chloride (NaCl) and L-histidine (L-His) as a buffer (pH 6.3-6.7), ethanol and water for injection. The composition of the norovirus bivalent intramuscular vaccine based on VLP is set forth in Table 1. VLP GII.4 contained the sequence of the capsid protein SEQ ID NO: 1, obtained from three strains of GII.4.
Таблица 1Table 1
Конечная композиция готовой лекарственной формы для четырех составов норовирусных бивалентных IM вакцин на основе VLP в расчете на 0,5 млFinal formulation of the finished dosage form for four compositions of norovirus bivalent IM vaccines based on VLP based on 0.5 ml
* в виде гидроксида алюминия* as aluminum hydroxide
Плацебо представляло собой стерильный нормальный солевой раствор для инъекций (0,9% NaCl, без консервантов). Эскалацию дозы вакцины проводили следующим образом: после соответствующего скрининга на предмет удовлетворительного состояния здоровья субъектов когорты А последовательно включали в каждую из четырех групп по дозировке, по ~12 субъектов каждая (группы по дозировке А1, А2, A3 и А4). Группы по дозировке А1, А2, A3 и А4 представляли дозировки бивалентных антигенов, составляющие 5/5 мкг, 15/15 мкг, 50/50 мкг и 150/150 мкг VLP норовируса GI.1 и GII.4, соответственно. Субъекты в каждой группе по дозировке были рандомизированы в соотношении 5: 1 для получения вакцины или плацебо. Субъекты в группе по дозировке А1 получали свое соответствующее рандомизированное лечение (10 субъектов получали 5/5 мкг вакцины и 2 субъекта получали плацебо). Субъектов наблюдали с целью оценки безопасности посредством рассмотрения симптомов, зарегистрированных во дневнике самонаблюдения (дни 0-7) и индивидуальных картах, начиная с дня посещения 7, 21, 28, 35 и 56. Данные по безопасности рассматривались главным наблюдателем, ответственным за безопасность (CSM). После того, как от субъектов группы по дозировке А1 были получены для рассмотрения данные по безопасности по истечении 7 дней после приема дозы 2 (день исследования 35) и их сочли приемлемыми, субъекты группы по дозировке А2 допускались к приему своей начальной дозы. То же правило применяли для дозирования в последующих группах по дозировке; то есть после того, как от группы по дозировке были получены для рассмотрения данные по безопасности по истечении 7 дней после приема дозы 2 (день исследования 35), следующая группа по дозировке допускалась к приему своей начальной дозы.The placebo was sterile normal saline injection (0.9% NaCl, no preservatives). Vaccine dose escalation was performed as follows: after appropriate screening for satisfactory health, cohort A subjects were sequentially assigned to each of four dose groups, ˜12 subjects each (dose groups A1, A2, A3, and A4). Dosage groups A1, A2, A3, and A4 represented bivalent antigen dosages of 5/5 µg, 15/15 µg, 50/50 µg, and 150/150 µg of norovirus GI.1 and GII.4 VLPs, respectively. Subjects in each dosage group were randomized 5:1 to receive vaccine or placebo. Subjects in the A1 dosage group received their respective randomized treatment (10 subjects received 5/5 μg of vaccine and 2 subjects received placebo). Subjects were observed for the purpose of assessing safety by reviewing symptoms recorded in the self-observation diary (days 0-7) and individual charts starting on visit day 7, 21, 28, 35, and 56. Safety data were reviewed by the chief safety monitor (CSM ). Once safety data from subjects in the A1 dosage group were available for review after 7 days post-dose 2 (study day 35) and deemed acceptable, subjects in the A2 dosage group were allowed to take their initial dose. The same rule was applied for dosing in subsequent dosage groups; that is, once safety data had been obtained from the dosage group for review after 7 days post dose 2 (study day 35), the next dosage group was allowed to take its initial dose.
По окончании включения в когорту А приблизительно 10 субъектов в каждой группе по дозировке получали вакцину (в сумме 40 вакцинированных) и 2 субъекта в каждой группе получали солевой раствор (в сумме приблизительно 8 реципиентов, получавших солевой раствор-контроль).At the end of cohort A enrollment, approximately 10 subjects in each dosage group received the vaccine (total of 40 vaccinated) and 2 subjects in each group received saline (total of approximately 8 recipients receiving saline control).
Субъекты ежедневно вели записи в дневнике самонаблюдения об ожидаемых симптомах, включая четыре местные реакции в местах инъекций, такие как боль, болезненная чувствительность, покраснение и припухлость, и 10 системных проявлений или симптомов, включая ежедневную температуру тела, из- 15 042694 меряемую в ротовой полости, головную боль, слабость, мышечные боли, озноб, боли в суставах и гастроинтестинальные симптомы, а именно тошноту, рвоту, диарею, абдоминальные спастические боли/абдоминальную боль, от дня 0 до 7 после каждой дозы норовирусной бивалентной IM вакцины на основе VLP или контроля. Покраснение и припухлость в месте инъекции измеряли и регистрировали ежедневно в течение 7 дней после каждой инъекции.Subjects made daily entries in a self-monitoring diary of expected symptoms, including four local injection site reactions such as pain, tenderness, redness, and swelling, and 10 systemic manifestations or symptoms, including daily body temperature measured in the mouth. , headache, weakness, muscle pain, chills, joint pain, and gastrointestinal symptoms, namely nausea, vomiting, diarrhea, abdominal cramps/abdominal pain, day 0 to 7 after each dose of norovirus bivalent IM vaccine based on VLP or control . Redness and swelling at the injection site was measured and recorded daily for 7 days after each injection.
Индивидуальные карты заполняли при каждом последующем посещении в дни 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 и 393+14 и во время последующего телефонного звонка в день 265+14; субъектов расспрашивали о перенесенных за данный период заболеваниях, посещениях врача, любых серьезных неблагоприятных явлениях (SAE) и возникновении любых новых значимых медицинских состояний. У субъектов определяли количество форменных элементов крови с определением лейкоцитарной формулы и определением количества тромбоцитов и осуществляли оценку сывороточной мочевины, креатинина, глюкозы, ACT и АЛТ при скрининге и в дни 21 и 35 (~7 дней после каждой дозы) для оценки того, продолжают ли они соответствовать требованиям, и для оценки безопасности, соответственно.Individual cards were completed at each subsequent visit on days 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14, and 393+14 and during a subsequent phone call on day 265+14; Subjects were asked about past medical conditions, physician visits, any serious adverse events (SAEs), and the occurrence of any new significant medical conditions. Subjects were quantified with leukocyte count and platelet count, and assessed for serum urea, creatinine, glucose, AST, and ALT at screening and on days 21 and 35 (~7 days after each dose) to assess whether continued they meet the requirements, and to assess the safety, respectively.
У субъектов забирали образцы крови перед вакцинацией в день 0 и в дни 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 и 393 +14 для измерения сывороточных антител (IgG, IgA и IgM по отдельности и в совокупности), выработанных в ответ на норовирусную бивалентную IM вакцину на основе VLP, посредством иммуноферментных анализов (ELISA). Также измеряли уровни антител, обуславливающих активность блокирования углеводов в сыворотке крови и HAI в сыворотке крови. У субъектов когорты А анализировали клетки, секретирующие антитела (ASC), маркеры хоуминга, В-клетки памяти и клеточные иммунные ответы.Subjects had pre-vaccination blood samples taken on day 0 and on days 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 and 393+14 to measure serum antibodies (IgG, IgA and IgM individually and collectively) generated in response to a norovirus bivalent IM VLP-based vaccine by enzyme immunoassays (ELISA). Also measured the levels of antibodies that cause the activity of blocking carbohydrates in the blood serum and HAI in the blood serum. In Cohort A subjects, antibody-secreting cells (ASCs), homing markers, memory B cells, and cellular immune responses were analyzed.
Следующие способы применяли для анализа образцов крови, собранных от иммунизированных лиц или лиц, получавших плацебо.The following methods were used to analyze blood samples collected from immunized or placebo treated individuals.
Измерения уровней сывороточных антител посредством ELISAMeasurements of Serum Antibody Levels by ELISA
Измерение уровней антител к норовирусам посредством ELISA осуществляли у всех субъектов с использованием очищенных рекомбинантных VLP норовируса (GI.1 и GII.4 по отдельности) в качестве целевых антигенов для того, чтобы осуществлять скрининг проб с присвоенным шифром. Вкратце, VLP норовируса в карбонатном покрывающем буфере с рН 9,6 использовали для нанесения на титрационные микропланшеты. Планшеты промывали, блокировали и инкубировали с двукратными серийными разведениями исследуемой сыворотки с последующим промыванием и инкубированием со связанными с ферментом вторичными антителами-реагентами, специфичными в отношении всех IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgM человека. Добавляли соответствующие субстратные растворы, осуществляли проявление окрашивания, считывание планшетов и определяли конечные титры IgG, IgA и IgM в сравнении с контрольной стандартной кривой для каждого класса антител. Определяли средние геометрические титры (GMT), фактор сероконверсии (GMFR) и показатели серологической реакции для каждой группы. Серологическую реакцию характеризовали как 4-кратное увеличение титра антител по сравнению с титрами до иммунизации.Measurement of norovirus antibody levels by ELISA was performed in all subjects using purified recombinant norovirus VLPs (GI.1 and GII.4 separately) as target antigens in order to screen for code-assigned samples. Briefly, norovirus VLP in carbonate coating buffer pH 9.6 was used for coating on microtiter plates. Plates were washed, blocked, and incubated with 2-fold serial dilutions of test serum, followed by washing and incubation with enzyme-linked secondary antibody reagents specific for all human IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, and IgM human. Appropriate substrate solutions were added, staining was developed, plates were read, and final titers of IgG, IgA, and IgM were determined against a control standard curve for each antibody class. Geometric mean titers (GMT), seroconversion factor (GMFR), and serological response rates were determined for each group. The serological response was characterized as a 4-fold increase in antibody titer compared to pre-immunization titers.
Активность норовирусов по блокированию углеводных антигенов группы крови (HBGA)Activity of noroviruses to block carbohydrate blood group antigens (HBGA)
Анализы блокирования для определения способности сывороточных антител ингибировать связывание VLP NV с синтетическими углеводными Н-антигенами 1 типа или Н-антигенами 3 типа осуществляли, как описано ранее (Reeck et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(8): 1212-1218). Вкратце, VLP NV для анализов блокирования инкубировали с равным объемом сыворотки и осуществляли двукратное серийное разведение, начиная от исходного разведения 1:25. Покрытые нейтравидином 96-луночные титрационные микропланшеты промывали и на них наносили 2,5 мкг/мл либо синтетического поливалентного комплекса Н-антиген 1 типа-РАА-биотин, либо поливалентного комплекса Н-антиген 3 типа-РААбиотин. Добавляли растворы VLP в сыворотке. Планшеты промывали и добавляли поликлональную сыворотку кролика, специфичную в отношении VLP NV, промывали и затем инкубировали с антителами козы к IgG кролика, связанными с пероксидазой хрена. Окрашивание проявляли с помощью жидкого субстрата для пероксидазы тетраметилбензидина и останавливали с помощью 1М фосфорной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 450. Выполняли положительный и отрицательный контроли. Определяли пятидесятипроцентные титры блокирующих антител (ВТ50), их характеризовали как титры, при которых результаты считывания OD (после удаления данных контроля) составляли 50% положительного контроля. Значение 12,5 было присвоено образцам с ВТ50 менее 25. Определяли средние геометрические титры (GMT), фактор сероконверсии (GMFR) и показатели серологической реакции для каждой группы. Серологическую реакцию характеризовали как 4-кратное увеличение титра антител по сравнению с титрами до иммунизации. Контрольные образцы блокирующей сыворотки использовали в качестве внутреннего контроля. Анализ для подтверждения специфичности блокирования осуществляли с использованием того же самого протокола для анализа блокирования со следующими особенностями: после нанесения углеводов сыворотки инкубировали непосредственно на планшете без первого предварительного инкубирования с VLP. После промывки VLP инкубировали на планшете и выявляли так же, как в анализе блокирования.Blocking assays to determine the ability of serum antibodies to inhibit NV VLP binding to synthetic carbohydrate type 1 H antigens or type 3 H antigens were performed as previously described (Reeck et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(8): 1212 -1218). Briefly, NV VLPs for blocking assays were incubated with an equal volume of serum and a two-fold serial dilution was made starting from an initial dilution of 1:25. Neutravidin-coated 96-well microtiter plates were washed and coated with 2.5 μg/mL of either synthetic type 1 H-antigen polyvalent-PAA-biotin complex or type 3 H-antigen polyvalent-PAAbiotin complex. Serum VLP solutions were added. The plates were washed and polyclonal rabbit serum specific for NV VLP was added, washed and then incubated with horseradish peroxidase-coupled goat anti-rabbit IgG. Staining was developed with tetramethylbenzidine peroxidase liquid substrate and stopped with 1M phosphoric acid. Optical density was measured at 450. Positive and negative controls were performed. Fifty percent blocking antibody titers (BT50) were determined and were characterized as the titers at which the OD reading (after removing control data) was 50% of the positive control. A value of 12.5 was assigned to samples with a BT50 less than 25. Geometric mean titers (GMT), seroconversion factor (GMFR), and serological response rates were determined for each group. The serological response was characterized as a 4-fold increase in antibody titer compared to pre-immunization titers. Blocking serum control samples were used as internal controls. An assay to confirm blocking specificity was performed using the same blocking assay protocol with the following features: after carbohydrate loading, sera were incubated directly on the plate without the first pre-incubation with VLP. After washing, the VLPs were incubated on the plate and detected in the same way as in the blocking assay.
- 16 042694- 16 042694
Анализ антитело-опосредованного ингибирования гемагглютинации (HAI) норовирусом Индуцированные вакциной антитела исследовали на способность ингибировать гемагглютинацию эритроцитов человека О-типа VLP норовируса, как описано ранее (Е1 Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58). Титры HAI вычисляли как величину, обратную наибольшему разведению, при котором происходило ингибирование гемагглютинации с образованием компактного отрицательного паттерна эритроцитов, и представляли в виде GMT, GMFR и >4-кратного увеличения.Norovirus Hemagglutination Inhibition (HAI) Assay Vaccine-induced antibodies were tested for their ability to inhibit hemagglutination of human erythrocyte O-type norovirus VLPs as described previously (E1 Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649 -58). HAI titers were calculated as the reciprocal of the highest dilution at which hemagglutination was inhibited to form a compact negative erythrocyte pattern and presented as GMT, GMFR and >4-fold increase.
Проводили серийное разведение VLP норовируса GI.1 и GII.4 по отдельности и инкубировали их с равным объемом 0,5% суспензии эритроцитов человека в 96-луночном планшете с V-образным дном. Определяли количество антигенов, VLP норовируса, соответствующее 4 ГА единицам, и подтверждали посредством обратного титрования. Исследуемые сыворотки инактивировали теплом при 56°С в течение 30 минут и обрабатывали свежеполученной 25% суспензией каолина. Для того, чтобы исключить сывороточные ингибиторы, исследуемые образцы были предварительно адсорбированы на эритроцитах. Анализ HAI осуществляли следующим образом: предварительно обработанные сыворотки (в двукратном разведении в PBS, рН 5,5) добавляли в 96-луночные планшеты с V-образным дном и инкубировали с равным объемом антигена, VLP норовируса GI.1 и GII.4, соответственно, содержащим 4 ГА единицы. Добавляли 0,5% суспензию эритроцитов в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение дополнительных 90 минут при 4°С. Лунки, содержавшие только PBS или антиген без сыворотки, служили в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно. Определяли средние геометрические титры (GMT), фактор сероконверсии (GMFR) и показатели серологической реакции для каждой группы. Серологическую реакцию характеризовали как 4-кратное увеличение титра антител по сравнению с титрами до иммунизации.Norovirus GI.1 and GII.4 VLPs were serially diluted separately and incubated with an equal volume of 0.5% human erythrocyte suspension in a 96-well V-bottom plate. The number of antigens, norovirus VLP corresponding to 4 HA units, was determined and confirmed by back titration. The test sera were heat inactivated at 56°C for 30 minutes and treated with a freshly prepared 25% kaolin suspension. In order to exclude serum inhibitors, the test samples were pre-adsorbed on erythrocytes. HAI analysis was performed as follows: Pretreated sera (two-fold dilution in PBS, pH 5.5) were added to 96-well V-bottom plates and incubated with equal volumes of antigen, norovirus GI.1 and GII.4 VLPs, respectively. containing 4 HA units. A 0.5% erythrocyte suspension was added to each well and the plates were incubated for an additional 90 minutes at 4°C. Wells containing only PBS or antigen without serum served as negative and positive controls, respectively. Geometric mean titers (GMT), seroconversion factor (GMFR), and serological response rates were determined for each group. The serological response was characterized as a 4-fold increase in antibody titer compared to pre-immunization titers.
Анализы клеток, секретирующих антителаAntibody-secreting cell assays
РВМС выделяли из приблизительно 60 мл крови с добавленным антикоагулянтом в дни 0, 7+3, 28+3 и 35+3 после введения норовирусной бивалентной IM вакцины на основе VLP или плацебо. Получали приблизительно 25 мл крови для анализов РВМС непосредственно после получения и 35 мл крови для криоконсервации РВМС. Анализы ASC позволяют выявить клетки, секретирующие антитела к VLP норовируса (Tacket et al. (2000) J. Infect. Dis., Vol. 182:302-305; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108:241-247; El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58). Свежезабранные РВМС от группы субъектов оценивали на частоту встречаемости ASC и определяли маркеры хоуминга. Замороженные РВМС от субъектов, входивших в когорту А, оценивали на частоту встречаемости ASC. Показатели ответа и среднее количество ASC на 10 РВМС описаны в каждый момент времени для каждой группы. Положительный ответ определяли как число ASC после вакцинации на 106 РВМС, которое по меньшей мере на 3 стандартных отклонения (SD) превышает среднее число до вакцинации для всех субъектов (в логарифмическом виде), и наличие по меньшей мере 8 пятен ASC, что соответствовало среднему значению стимулированных средой лунок отрицательного контроля (2 пятна) плюс 3 SD, как определено в аналогичных анализах.PBMCs were isolated from approximately 60 ml of anticoagulant-suppressed blood on days 0, 7+3, 28+3, and 35+3 after administration of the VLP-based norovirus bivalent IM vaccine or placebo. Approximately 25 ml of blood was obtained for PBMC assays immediately after collection and 35 ml of blood for PBMC cryopreservation. ASC assays detect cells secreting anti-norovirus VLP antibodies (Tacket et al. (2000) J. Infect. Dis., Vol. 182:302-305; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108: 241-247; El Kamary et al (2010) J Infect Dis, Vol 202(11): 1649-58). Freshly collected PBMCs from a group of subjects were evaluated for ASC frequency and homing markers were determined. Frozen PBMCs from subjects in cohort A were evaluated for the incidence of ASC. Response rates and mean ASCs per 10 PBMCs are described at each time point for each group. A positive response was defined as the number of post-vaccination ASCs per 106 PBMCs that was at least 3 standard deviations (SD) greater than the pre-vaccination mean for all subjects (in logarithmic form), and the presence of at least 8 ASC spots, which corresponded to the mean. medium stimulated negative control wells (2 spots) plus 3 SD as determined in similar assays.
Измерение количества вирус-специфичных В-клеток памяти, специфичных в отношении норовирусаMeasuring the number of virus-specific memory B cells specific for norovirus
Образцы крови с добавленным антикоагулянтом собирали только от субъектов когорты А (приблизительно 25 мл в дни 0, 28, 56 и 180) для измерения количества В-клеток памяти в дни 0, 28, 56 и 180 после вакцинации с помощью анализа ELISpot с предшествующей антигенной стимуляцией in vitro (Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118). Мононуклеарные клетки периферической крови (5x106 клеток/мл, 1 мл/лунка в 24-луночных планшетах) инкубировали в течение 4 дней с антигенами, VLP норовируса GI.1 и GII.4, по отдельности для того, чтобы обеспечить возможность клональной экспансии антиген-специфичных В-клеток памяти и дифференциации в клетки, секретирующие антитела. Контроли включали клетки, инкубированные в тех же условиях В отсутствие антигена, и/или клетки, инкубированные с неродственным антигеном. После стимуляции клетки промывали, подсчитывали и переносили в планшеты для ELISpot с нанесенными VLP Norwalk. Для того, чтобы определить частоту встречаемости вирус-специфичных В-клеток памяти по отношению к общему количеству Ig-секретирующих В-лимфоцитов, размноженные В-клетки также добавляли в лунки с нанесенными антителами к IgG человека и к IgA человека. Связавшиеся антитела выявляли с помощью HRP-меченных антител к IgG человека или к IgA человека, после которых применяли соответствующий субстрат. Конъюгаты к подклассам IgA и IgG (IgA1, IgA2 и IgG1-4) также применяют для определения антиген-специфичных ответов, опосредованных антителами этих подклассов, которые могут быть связаны с определенными эффекторными механизмами и локализацией иммунного примирования. Пятна подсчитывали с помощью ELISpot-ридера. Популяции размноженных клеток для каждого субъекта изучали с помощью проточной цитометрии для того, чтобы, среди прочего, подтвердить фенотип В-клеток памяти, т.е. CD19+, CD27+, IgG+, IgM+, CD38+, IgD (Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118).Anticoagulant-suppressed blood samples were collected from Cohort A subjects only (approximately 25 mL on days 0, 28, 56, and 180) to measure memory B cell counts on days 0, 28, 56, and 180 post-vaccination using an antigen-preceded ELISpot assay. in vitro stimulation (Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118). Peripheral blood mononuclear cells (5x106 cells/ml, 1 ml/well in 24-well plates) were incubated for 4 days with antigens, norovirus GI.1 and GII.4 VLPs, separately to allow clonal expansion of antigen- specific memory B cells and differentiation into antibody-secreting cells. Controls included cells incubated under the same conditions in the absence of antigen and/or cells incubated with unrelated antigen. Following stimulation, cells were washed, counted, and transferred to ELISpot plates coated with Norwalk VLPs. In order to determine the frequency of virus-specific memory B cells relative to total Ig-secreting B lymphocytes, expanded B cells were also added to anti-human IgG and anti-human IgA coated wells. Bound antibodies were detected with HRP-labeled anti-human IgG or anti-human IgA antibodies, followed by the application of the appropriate substrate. Conjugates to the IgA and IgG subclasses (IgA1, IgA2 and IgG1-4) are also used to determine antigen-specific responses mediated by antibodies of these subclasses, which may be associated with certain effector mechanisms and localization of immune priming. Spots were counted using an ELISpot reader. Proliferated cell populations for each subject were studied by flow cytometry to, among other things, confirm the memory B cell phenotype, ie. CD19+, CD27+, IgG+, IgM+, CD38+, IgD (Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313 :110-118).
- 17 042694- 17 042694
Клеточные иммунные ответыCellular immune responses
Образцы крови с добавленным антикоагулянтом (приблизительно 25 мл в дни 0, 28, 56 и 180) от субъектов когорты А собирали в виде проб с присвоенным шифром и РВМС выделяли и замораживали в жидком азоте для возможного оценивания в будущем CMI-ответов на антигены, VLP норовируса GI. 1 и GII.4. Анализы, которые проводят, включают, среди прочего, анализы пролиферации РВМС и цитокиновых ответов на антигены, VLP норовируса GI.1 и GII.4, посредством измерения уровней интерферона (IFN)-y и интерлейкина (IL)-4 согласно принятым техникам (Samandari et al. (2000) J. Immunol., Vol. 164:2221-2232; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108:241-247). Также оценивают Т-клеточные ответы.Anticoagulant-suppressed blood samples (approximately 25 ml on days 0, 28, 56, and 180) from cohort A subjects were collected as coded samples and PBMCs were isolated and frozen in liquid nitrogen for possible future evaluation of CMI antigen responses, VLP norovirus GI. 1 and GII.4. The assays that are performed include, among others, assays for PBMC proliferation and cytokine responses to antigens, norovirus GI.1 and GII.4 VLPs, by measuring levels of interferon (IFN)-y and interleukin (IL)-4 according to accepted techniques (Samandari et al (2000) J. Immunol., Vol 164:2221-2232 Tacket et al (2003) Clin Immunol., Vol 108:241-247). Also evaluate T-cell responses.
Результатыresults
Оценка безопасности включала местные и системные ожидаемые симптомы в течение 7 дней и неожидаемые симптомы в течение 28 дней после каждой дозы. Осуществляли наблюдение на предмет серьезных нежелательных явлений в течение 12 месяцев. Иммуногенность оценивали на основе сыворотки, полученной до и после каждой вакцинации, по антителам из ELISA для общего Ig (IgG, IgA и IgM в совокупности) и мононуклеарным клеткам периферической крови (РВМС) в отношении клеток, секретирующих антитела класса IgG и IgA (ASC), посредством Elispot.The safety assessment included local and systemic expected symptoms within 7 days and unexpected symptoms within 28 days after each dose. Monitored for serious adverse events for 12 months. Immunogenicity was assessed on the basis of serum obtained before and after each vaccination, for antibodies from ELISA for total Ig (IgG, IgA and IgM in total) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) against cells secreting antibodies of the IgG and IgA class (ASC) , via Elispot.
Все четыре группы по дозировке были включены в когорту А с наличием данных по безопасности после дозы два для всех четырех групп по дозировке (40 вакцинированных в сумме). Среди 40 вакцинированных боль или болезненная чувствительность были самыми распространенными местными симптомами, зарегистрированными после каждой дозы, тогда как припухлость или покраснение были редкими. Не было зарегистрировано тяжелых местных симптомов. Системные симптомы, а именно головная боль, миалгия или недомогание, после каждой дозы были зарегистрированы у менее чем половины вакцинированных. Ни у одного вакцинированного не была зарегистрирована лихорадка. Никаких родственных SAE зарегистрировано не было.All four dosage groups were included in cohort A with safety data available after dose two for all four dosage groups (40 vaccinees in total). Among the 40 vaccinated, pain or tenderness was the most common local symptom reported after each dose, while swelling or redness was rare. No severe local symptoms were reported. Systemic symptoms, namely headache, myalgia or malaise, were reported after each dose in less than half of those vaccinated. None of the vaccinated had a fever. No related SAEs have been registered.
Как показано на фиг. 1-3, по результатам ELISA для общего Ig сильные анамнестические антителоопосредованные ответы (IgG, IgA и IgM в совокупности) наблюдали в отношении обоих типов антигенов VLP спустя 7 дней после первой дозы с наименьшей дозировкой (5 мкг VLP GI.1 + 5 мкг VLP GII.4). Вторая доза не усилила ответы после дозы один. Аналогичные результаты наблюдали для ответов, опосредованных антиген-специфичными сывороточными IgG и сывороточными IgA, измеряемых по отдельности (фиг. 4-9). Доза-зависимые ответы наблюдали для антитело-опосредованных ответов на оба антигена (фиг. 1-9). Однако максимальный ответ на VLP GI.1, как оказалось, получали с меньшей дозой, чем для получения максимального ответа на VLP GII.4 (15 мкг по сравнению с 50 мкг). Что примечательно, однократная доза вводимой внутримышечно норовирусной бивалентной вакцины индуцировала неожиданно значительно больший титр антиген-специфичных антител, чем титр, индуцированный двумя дозами вводимых интраназально моновалентных вакцин на основе VLP, содержащих в 20 раз большую дозу VLP (фиг. 10; сравнивается группа 5 мкг LV03-104 с группой 100 мкг LV01-103). Более того, низкая доза (5 мкг) бивалентной норовирусной IM вакцины обеспечивала такой же титр норовирусспецифичных антител, что и титр, индуцированный у людей, контактировавших с нативным норовирусом (фиг. 10).As shown in FIG. 1-3, in total Ig ELISA, strong anamnestic antibody-mediated responses (IgG, IgA, and IgM combined) were observed against both types of VLP antigens 7 days after the first dose at the lowest dose (5 μg VLP GI.1 + 5 μg VLP GII.4). The second dose did not enhance responses after dose one. Similar results were observed for responses mediated by antigen-specific serum IgG and serum IgA measured separately (FIGS. 4-9). Dose-dependent responses were observed for antibody-mediated responses to both antigens (FIGS. 1-9). However, the maximum response to VLP GI.1 appeared to be obtained with a lower dose than to obtain the maximum response to VLP GII.4 (15 μg compared to 50 μg). Remarkably, a single dose of intramuscularly administered bivalent norovirus vaccine induced an unexpectedly significantly higher titer of antigen-specific antibodies than that induced by two doses of intranasally administered VLP-based monovalent vaccines containing 20 times the VLP dose (Fig. 10; comparison of the 5 μg group LV03-104 with 100 µg group LV01-103). Moreover, a low dose (5 μg) of the bivalent norovirus IM vaccine produced the same norovirus-specific antibody titer as that induced in humans exposed to native norovirus (FIG. 10).
Сильные IgG- и IgA-опосредованные ответы по результатам Elispot также наблюдали спустя 7 дней после первой дозы с наименьшей дозировкой (5 мкг) в отношении обоих типов антигенов VLP (табл.2). Примечательно, ответы, опосредованные клетками, секретирующими антитела (ASC), были смещены в сторону IgA по сравнению с IgG, и у ASC наблюдался фенотип рецепторов хоуминга в слизистые (альфа 4/бета7) и фенотип хемокиновых (CCR10) рецепторов, как оценивалось с помощью проточной цитометрии (фиг. 11; табл.3). Как показано в таблице 3, у большего количества ASC наблюдались маркеры хоуминга в слизистые (бета 7+, CD62L-) по сравнению с двойственными маркерами хоуминга в слизистые/периферические ткани (бета 7+, CD62L+). В табл.4 показано процентное соотношение В-клеток памяти на 106 моноцитов периферической крови, осуществляющих ответ на антигены, VLP. Больший процент антиген-специфичных В-клеток памяти также экспрессируют маркеры хоуминга в слизистые по сравнению с двойственными маркерами в слизистые/периферические ткани или хоуминга в периферические ткани. Аналогичные ответы также наблюдали у реципиентов, получавших дозы 15 мкг и 50 мкг (табл.2-4).Strong IgG- and IgA-mediated Elispot responses were also observed 7 days after the first dose at the lowest dose (5 μg) for both types of VLP antigens (Table 2). Notably, antibody-secreting cell (ASC) mediated responses were biased towards IgA versus IgG, and ASC exhibited a mucosal homing receptor phenotype (alpha 4/beta 7) and a chemokine receptor (CCR10) phenotype as assessed by flow cytometry (Fig. 11; table 3). As shown in Table 3, more ASCs had mucosal homing markers (beta 7+, CD62L-) compared to dual mucosal/peripheral tissue homing markers (beta 7+, CD62L+). Table 4 shows the percentage of memory B cells per 106 peripheral blood monocytes responding to antigens, VLP. A greater percentage of antigen-specific memory B cells also express mucosal homing markers compared to dual mucosal/peripheral tissue or peripheral homing markers. Similar responses were also observed in recipients receiving doses of 15 μg and 50 μg (Tables 2-4).
- 18 042694- 18 042694
Таблица 2table 2
День 7, характеристика ответа, опосредованного РВМС. Приблизительное количество клеток, секретирующих антитела (ASC)/миллион CD19+ клетокDay 7, characterization of the PBMC-mediated response. Approximate number of antibody-secreting cells (ASC)/million CD19+ cells
- 19 042694- 19 042694
Таблица 3Table 3
Маркеры ASC у реципиентов, получавших вакцину и плацебо, определенные с помощью проточной цитометрии - день 7ASC markers in vaccine and placebo recipients determined by flow cytometry - day 7
* в случае, когда большинство ASC являются норовирус-специфичными*in case most ASCs are norovirus-specific
- 20 042694- 20 042694
Таблица 4Table 4
Ответы В-клеток памяти у реципиентов, получавших вакцину и плацебо -день 7Memory B cell responses in vaccine and placebo recipients - Day 7
* в случае, когда большинство ASC являются норовирус-специфичными*in case most ASCs are norovirus-specific
В отсутствие доступного прямого анализа нейтрализации вируса в связи с отсутствием возможности культивировать норовирус in vitro проводили функциональные анализы, которые служат заменой анализам нейтрализации вируса, для измерения количества функциональных антител у вакцинированных.In the absence of a direct virus neutralization assay available due to the inability to culture norovirus in vitro, functional assays, which serve as a substitute for virus neutralization assays, have been performed to measure the amount of functional antibodies in the vaccinated.
С помощью анализа активности блокирования углеводного Н-антигена, описанного выше, измеряли ингибирование связывания VLP GI.1 с Н-антигеном, опосредованное сывороточными антителами, индуцированными вакциной. Данные представлены в виде фактора сероконверсии (GMFR) и серологической реакции (4-кратное увеличение) в табл. 5 и в виде среднего геометрического титра (GMT) в табл. 6. К удивлению, после всего одной внутримышечной инъекции состава вакцины наблюдали значительную активность блокирования углеводов для всех групп доз; фактически, введение второй дозы вакцины не повышало значительно активность блокирования по сравнению с уровнями после дозы 1. Активность ингибирования связывания сохранялась в течение всего периода испытаний вплоть до 56-го дня после дозы 1.The inhibition of GI.1 VLP binding to the H antigen mediated by vaccine-induced serum antibodies was measured using the carbohydrate H antigen blocking activity assay described above. Data are presented as seroconversion factor (GMFR) and serological response (4-fold increase) in Table. 5 and as geometric mean titer (GMT) in Table. 6. Surprisingly, after just one intramuscular injection of the vaccine formulation, significant carbohydrate blocking activity was observed for all dose groups; in fact, the administration of the second dose of the vaccine did not significantly increase the blocking activity compared to the levels after dose 1. The binding inhibition activity was maintained throughout the test period up to day 56 after dose 1.
- 21 042694- 21 042694
Таблица 5Table 5
Активность блокирования углеводов (HBGA BT50). Фактор сероконверсии (GMFR) и серологическая реакция (4-кратное увеличение) для антител к норовирусам GI. 1Carbohydrate blocking activity (HBGA BT50). Seroconversion factor (GMFR) and serological response (4-fold increase) for GI norovirus antibodies. 1
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны; одно из этих частных значений представляло собой данные базовой пробы, что привело в результате к тому, что для субъекта не были получены данные по кратности увеличения для какого-либо момента времени.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples were possibly mixed up; one of these data points was baseline data, which resulted in no fold data for the subject at any point in time.
Таблица 6Table 6
Активность блокирования углеводов (HBGA BT50). Средний геометрический титр (GMT) антител к норовирусам GI. 1Carbohydrate blocking activity (HBGA BT50). Geometric mean titer (GMT) of anti-GI norovirus antibodies. 1
- 22 042694- 22 042694
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples may have been mixed up.
Аналогично, измеряли активность блокирования углеводов сывороточных антител против VLP GII.4. Значительный ответ наблюдали во всех группах дозирования, как было измерено с помощью GMFR и серологической реакции (табл. 7), а также GMT (табл. 8). Аналогично антителоопосредованному блокированию связывания GI.1, описанному выше, выявляли сильную активность блокирования связывания углеводов VLP GII.4 после всего одной дозы, причем вторая доза, как оказалось, не усиливала активность блокирования.Similarly, the carbohydrate blocking activity of anti-VLP GII.4 serum antibodies was measured. A significant response was observed in all dosing groups as measured by GMFR and serological response (Table 7) and GMT (Table 8). Similar to the antibody-mediated blocking of GI.1 binding described above, strong GII.4 VLP carbohydrate binding blocking activity was detected after just one dose, with the second dose not appearing to enhance the blocking activity.
Таблица 7Table 7
Активность блокирования углеводов (HBGA BT50). Фактор сероконверсии (GMFR) и серологическая реакция (4-кратное увеличение) для антител к норовирусам GII.4Carbohydrate blocking activity (HBGA BT50). Seroconversion factor (GMFR) and serological response (4-fold increase) for anti-norovirus antibodies GII.4
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны; одно из этих частных значений представляло собой данные базовой пробы, что привело в ре- 23 042694 зультате к тому, что для субъекта не были получены данные по кратности увеличения для какого-либо момента времени.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples were possibly mixed up; one of these data points was base sample data, which resulted in no fold data for the subject at any point in time.
Таблица 8Table 8
Активность блокирования углеводов (HBGA BT50). Средний геометрический титр (GMT) антител к норовирусам GII.4Carbohydrate blocking activity (HBGA BT50). Geometric mean titer (GMT) of antibodies to noroviruses GII.4
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples may have been mixed up.
Анализы ингибирования гемагглютинации (HAI) также использовали для исследования ответа сывороточных антител от вакцинированных субъектов против целевых антигенов, VLP норовируса. Аналогично исследованиям связывания углеводных Н-антигенов всего одна доза вакцины на основе VLP индуцировала антитела, которые ингибировали гемагглютинацию во всех группах дозирования, что измеряли с помощью GMFR (табл. 9), 4-кратного увеличения (табл. 9) и GMT (табл. 10). Хотя уровень ингибирования гемагглютинации сохранялся до последнего дня испытаний (28 дней после дозы 2, 56 дней после дозы 1), вторая доза вакцины на основе VLP, как оказалось, не усиливала ингибирование гемагглютинации, опосредованное антителами, индуцированными вакциной.Hemagglutination inhibition (HAI) assays were also used to investigate the serum antibody response from vaccinated subjects against the target antigens, norovirus VLP. Similar to carbohydrate H antigen binding studies, just one dose of the VLP-based vaccine induced antibodies that inhibited hemagglutination in all dose groups, as measured by GMFR (Table 9), 4-fold magnification (Table 9), and GMT (Table 9). 10). Although the level of hemagglutination inhibition was maintained until the last day of the trial (28 days after dose 2, 56 days after dose 1), the second dose of the VLP-based vaccine did not appear to enhance the inhibition of hemagglutination mediated by vaccine-induced antibodies.
Таблица 9Table 9
Анализ ингибирования гемагглютинации. Фактор сероконверсии (GMFR) и серологическая реакция (4-кратное увеличение) для антител к норовирусам GI. 1Hemagglutination inhibition assay. Seroconversion factor (GMFR) and serological response (4-fold increase) for GI norovirus antibodies. 1
- 24 042694- 24 042694
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны; одно из этих частных значений представляло собой данные базовой пробы, что привело в результате к тому, что для субъекта не были получены данные по кратности увеличения для какого-либо момента времени.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples were possibly mixed up; one of these data points was baseline data, which resulted in no fold data for the subject at any point in time.
Таблица 10Table 10
Анализ ингибирования гемагглютинации. Средний геометрический титр (GMT) антител к норовирусам GI.1Hemagglutination inhibition assay. Geometric mean titer (GMT) of anti-norovirus GI.1 antibodies
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples may have been mixed up.
Ингибирование гемагглютинации также достигали, когда целевые VLP относились к несоответствующему вирусу. Сывороточные антитела, индуцированные вакциной, ингибировали гемагглютинацию VLP штамма вируса Houston, что измеряли с помощью GMFR и серологической реакции (табл. 11), а также GMT (табл. 12). В данном случае, более высокие дозы вакцины на основе VLP обеспечивали более сильные ответы, что, в частности, измеряли с помощью 4-кратного увеличения или GMT. Также наблюдалось значительное повышение GMFR и 4-кратного увеличения, когда целевые VLP относились к штамму вируса 2003 Cincinnati, что измеряли всего 7 дней после дозы 1 (табл. 13).Hemagglutination inhibition was also achieved when the target VLPs were assigned to the wrong virus. Serum antibodies induced by the vaccine inhibited hemagglutination of the VLP strain of the Houston virus, as measured by GMFR and serological reaction (Table 11) and GMT (Table 12). In this case, higher doses of the VLP-based vaccine provided stronger responses, as measured by 4-fold or GMT in particular. There was also a significant increase in GMFR and a 4-fold increase when the target VLPs were treated with the 2003 Cincinnati strain of the virus, measured only 7 days after dose 1 (Table 13).
- 25 042694- 25 042694
Таблица 11Table 11
Анализ ингибирования гемагглютинации (VLP штамма вируса Houston). Фактор сероконверсии (GMFR) и серологическая реакция (4-кратное увеличение) для антител к норовирусам GII.4Hemagglutination inhibition assay (Houston virus strain VLP). Seroconversion factor (GMFR) and serological response (4-fold increase) for anti-norovirus antibodies GII.4
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны; одно из этих частных значений представляло собой данные базовой пробы, что привело в результате к тому, что для субъекта не были получены данные по кратности увеличения для какого-либо момента времени.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples were possibly mixed up; one of these data points was baseline data, which resulted in no fold data for the subject at any point in time.
Таблица 12Table 12
Анализ ингибирования гемагглютинации (VLP штамма вируса Houston). Средний геометрический титр (GMT) антител к норовирусам GII.4Hemagglutination inhibition assay (Houston virus strain VLP). Geometric mean titer (GMT) of antibodies to noroviruses GII.4
- 26 042694- 26 042694
Результаты на основе данных по всем субъектам, получавшим обе дозы исследуемого продукта.Results based on data from all subjects receiving both doses of study product.
Исключены два частных значения от двух субъектов в связи с тем, что пробы возможно были перепутаны.Excluded two data points from two subjects due to the fact that the samples may have been mixed up.
Таблица 13Table 13
Ингибирование гемагглютинации у группы плацебо по сравнению с группой 50/50 мкг вакцин на основе VLPHemagglutination inhibition in the placebo group compared with the 50/50 µg VLP group
Результаты данного исследования продемонстрировали, что бивалентная норовирусная IM вакцина на основе VLP в целом хорошо переносилась. Данные по иммуногенности позволяют считать, что однократной дозы вакцины может быть достаточно для защиты серопозитивных взрослых людей. Результаты анализов активности блокирования углеводов и ингибирования гемагглютинации представили дополнительные доказательства того, что однократная доза вакцины индуцировала сильную противоноровирусную активность сывороточных антител. Сила и быстрота наблюдаемых иммунных ответов после введения однократной парентеральной дозы у людей были значительно большими по сравнению с иммунными ответами после введений множества вакцин на основе VLP для назального введения с более высокими дозировками VLP, о которых сообщалось ранее (El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 16491658). Эти ответы также превосходили ответы, индуцированные перорально вводимыми VLP норовируса (Tacket et al. (2003) Clin Immunol 108:241-247; Ball et al. (1999, Gastroenterology 117:40-48), а также ответы, индуцированные VLP норовируса, продуцируемыми трансгенными растениями (Tacket et al. (2000) J Infect Dis 182:302-305). В частности, данный состав вакцины для внутримышечного введения вызывал анамнестические ответы в течение семи дней после иммунизации, и наблюдались максимальные ответы, опосредованные сывороточными антителами, после однократной дозы, включая значительный IgAопосредованный ответ, и функциональную активность блокирования углеводов, и активность ингибирования гемагглютинации. Таким образом, данная норовирусная бивалентная вакцина индуцировала сильный защитный иммунный ответ у людей, который превосходил иммунные ответы, индуцированные любой в настоящее время доступной норовирусной вакциной.The results of this study demonstrated that the VLP-based bivalent norovirus IM vaccine was generally well tolerated. Immunogenicity data suggest that a single dose of the vaccine may be sufficient to protect seropositive adults. The results of analyzes of carbohydrate blocking activity and hemagglutination inhibition provided additional evidence that a single dose of the vaccine induced strong anti-norovirus activity of serum antibodies. The strength and speed of the observed immune responses after a single parenteral dose in humans were significantly greater compared to the immune responses after multiple VLP-based nasal vaccines with higher VLP dosages previously reported (El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol 202(11): 16491658). These responses also outperformed those induced by orally administered norovirus VLPs (Tacket et al. (2003) Clin Immunol 108:241-247; Ball et al. (1999, Gastroenterology 117:40-48), as well as those induced by norovirus VLPs, produced by transgenic plants (Tacket et al. (2000) J Infect Dis 182:302-305) Specifically, this intramuscular vaccine formulation elicited anamnestic responses up to seven days post-immunization, and maximal serum antibody-mediated responses were observed after single dose, including a significant IgA-mediated response, and functional carbohydrate blocking activity, and hemagglutination inhibition activity.Thus, this bivalent norovirus vaccine induced a strong protective immune response in humans, which was superior to those induced by any currently available norovirus vaccine.
Пример 2. Эскалация дозы. Исследование безопасности и иммуногенности норовирусной бивалентной вакцины для внутримышечного введения на основе вирусоподобных частиц (VLP) у людей (исследование LV03-104).Example 2 Dose escalation. Safety and Immunogenicity Study of Virus-Like Particle (VLP) Intramuscular Norovirus Bivalent Vaccine in Humans (Study LV03-104).
- 27 042694- 27 042694
В следующем примере представлена оставшаяся запланированная часть клинического исследования, описанного в примере 1, где проводили рандомизированное многоцентровое исследование с эскалацией дозы среди взрослых в возрасте >18 лет по изучению безопасности и иммуногенности четырех уровней дозировки норовирусной бивалентной вакцины для внутримышечного введения (IM) на основе VLP с адъювантом монофосфорил-липидом A (MPL) и гидроксидом алюминия (AlOH) по сравнению с плацебо. Субъекты получали две дозы вакцины или плацебо посредством внутримышечной (IM) инъекции с использованием 1,5-дюймовой (38 мм) иглы с разницей в 28 дней. Данный пример предназначен для дополнительного иллюстрирования основных идей настоящего изобретения.The following example represents the remaining planned portion of the clinical study described in Example 1, which conducted a randomized, multicentre, dose-escalation study in adults >18 years of age to study the safety and immunogenicity of four dosage levels of a norovirus bivalent intramuscular (IM) vaccine based on VLP. with adjuvant monophosphoryl lipid A (MPL) and aluminum hydroxide (AlOH) compared with placebo. Subjects received two doses of vaccine or placebo via intramuscular (IM) injection using a 1.5-inch (38 mm) needle 28 days apart. This example is intended to further illustrate the main ideas of the present invention.
Отбор в когорту А исследования завершен и был описан выше в примере 1. Когорта В включает ~20 субъектов в возрасте 50-64 года. Когорта С включает ~30 субъектов в возрасте 65-85 лет. Всего в исследование включено приблизительно 98 субъектов.Selection for Cohort A of the study is complete and has been described above in Example 1. Cohort B includes ~20 subjects aged 50-64 years. Cohort C includes ~30 subjects aged 65-85 years. A total of approximately 98 subjects were included in the study.
В когорте В ~20 субъектов в возрасте 50-64 года отобраны и рандомизированы в соотношении 1: 1 для получения вакцины (N=10) или плацебо (N=10). После того, как получены для рассмотрения данные по безопасности по истечении 7 дней после дозы 2 (день исследования 35) от субъектов когорты В, субъекты когорты С допускаются к получению своей начальной дозы. В когорте С ~30 субъектов в возрасте от 65 до 85 лет отобраны и рандомизированы в соотношении 1:1:1 для получения вакцины с адъювантом MPL и AlOH (N=10), или вакцины только с адъювантом AlOH, т.е. без MPL (N=10), или плацебо (N=10). Концентрации антигена, VLP норовируса, и AlOH в двух составах вакцины, которые оценивают, в когорте С одинаковы; отличие только в наличии или отсутствии MPL.In cohort B, ~20 subjects aged 50-64 years were selected and randomized in a 1:1 ratio to receive either vaccine (N=10) or placebo (N=10). Once safety data have been received for review after 7 days post-dose 2 (study day 35) from Cohort B subjects, Cohort C subjects are eligible to receive their initial dose. In cohort C, ~30 subjects aged 65 to 85 years were selected and randomized in a 1:1:1 ratio to receive an MPL-AlOH adjuvanted vaccine (N=10), or an AlOH-adjuvanted vaccine alone, i.e. no MPL (N=10), or placebo (N=10). The concentrations of antigen, norovirus VLP, and AlOH in the two vaccine formulations evaluated are the same in cohort C; the difference is only in the presence or absence of MPL.
Норовирусная бивалентная вакцина на основе VLP содержит VLP 1 генотипа геногруппы I (GI.1) и IV генотипа геногруппы II (GII.4) в качестве антигенов и монофосфорил-липид A (MPL) и гидроксид алюминия (AlOH) в качестве адъювантов, хлорид натрия (NaCl) и L-гистидин (L-His) в качестве буфера (рН 6,3-6,7), этанол и воду для инъекций. VLP GII.4 содержат последовательность капсидного белка SEQ ID NO: 1, которая была получена из трех штаммов GII.4.Norovirus bivalent VLP vaccine contains VLP 1 genotype genogroup I (GI.1) and genotype IV genogroup II (GII.4) as antigens and monophosphoryl lipid A (MPL) and aluminum hydroxide (AlOH) as adjuvants, sodium chloride (NaCl) and L-histidine (L-His) as a buffer (pH 6.3-6.7), ethanol and water for injection. VLP GII.4 contain the sequence of the capsid protein SEQ ID NO: 1, which was obtained from three strains of GII.4.
Однократная дозировка вакцины, выбранная для дальнейшего оценивания в когортах В и С, представляет собой наименьшую дозировку из когорты А, которая дает в результате наиболее сильный и воспроизводимый иммунный ответ, которая также в целом хорошо переносится. Данные по безопасности и иммуногенности на день 56 от субъектов когорты А рассматривают с помощью CSM/SMC, и выбирают дозировку бивалентной вакцины для оценивания в когортах В и С.The single dose of vaccine selected for further evaluation in cohorts B and C is the lowest dose from cohort A that results in the strongest and most reproducible immune response, which is also generally well tolerated. Day 56 safety and immunogenicity data from cohort A subjects are reviewed by CSM/SMC, and the bivalent vaccine dosage is selected for evaluation in cohorts B and C.
Субъекты ведут записи в дневнике самонаблюдения об ожидаемых симптомах, включая четыре местные реакции в месте инъекции, такие как боль, болезненная чувствительность, покраснение и припухлость, и 10 системных проявлений или симптомов, включая ежедневную температуру тела, измеряемую в ротовой полости, головную боль, слабость, мышечные боли, озноб, боли в суставах и гастроинтестинальные симптомы, а именно тошноту, рвоту, диарею, абдоминальные спастические боли/абдоминальную боль, от дня 0 до 7 после каждой дозы норовирусной бивалентной IM вакцины на основе VLP или контроля. Покраснение и припухлость в месте инъекции измеряют и фиксируют ежедневно в течение 7 дней после каждой инъекции.Subjects record expected symptoms in a self-monitoring diary, including four local reactions at the injection site, such as pain, tenderness, redness, and swelling, and 10 systemic manifestations or symptoms, including daily body temperature measured in the mouth, headache, weakness , muscle pain, chills, joint pain and gastrointestinal symptoms, namely nausea, vomiting, diarrhea, abdominal cramps/abdominal pain, from day 0 to 7 after each dose of norovirus bivalent IM vaccine based on VLP or control. Redness and swelling at the injection site is measured and recorded daily for 7 days after each injection.
Индивидуальные карты заполняют при каждом последующем посещении в дни 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 и 393+14 и во время последующего телефонного звонка в день 265+14; субъектов расспрашивают о перенесенных за данный период заболеваниях, посещениях врача, любых серьезных неблагоприятных явлениях (SAE) и возникновении любых новых значимых медицинских состояний. У субъектов определяют количество форменных элементов крови с определением лейкоцитарной формулы и определением количества тромбоцитов и осуществляют оценку сывороточной мочевины, креатинина, глюкозы, ACT и АЛТ при скрининге и в дни 21 и 35 (~7 дней после каждой дозы) для оценки того, продолжают ли они соответствовать требованиям, и для оценки безопасности соответственно.Individual cards are completed at each subsequent visit on days 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 and 393+14 and during the subsequent phone call on day 265+14; Subjects are asked about past medical conditions, physician visits, any serious adverse events (SAEs), and the occurrence of any new significant medical conditions. Subjects are quantified with leukocyte count and platelet count and assessed for serum urea, creatinine, glucose, AST, and ALT at screening and on days 21 and 35 (~7 days after each dose) to assess whether continued they meet the requirements, and to evaluate the safety accordingly.
Образцы крови от субъектов собирают до вакцинации в день 0 и в дни 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 и 393+14 для измерения количества сывороточных антител (IgG, IgA и IgM вместе и по отдельности), выработанных в ответ на норовирусную бивалентную IM вакцину на основе VLP, посредством иммуноферментных анализов (ELISA). Также измеряют уровни антител, обуславливающих активность блокирования углеводов в сыворотке крови и HAI в сыворотке крови.Blood samples from subjects are collected prior to vaccination on day 0 and on days 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 and 393+14 to measure serum antibodies (IgG, IgA and IgM together and separately) generated in response to a norovirus bivalent IM vaccine based on VLP, by enzyme immunoassays (ELISA). Also measure the levels of antibodies that cause the activity of blocking carbohydrates in the blood serum and HAI in the blood serum.
Способы, описанные выше для когорты А, применяют для анализа образцов крови, собранных от иммунизированных лиц или лиц, получающих плацебо. Результаты исследования будут использоваться в разработке клинического протокола введения составов вакцины по настоящему изобретению.The methods described above for cohort A are used to analyze blood samples collected from immunized individuals or individuals receiving placebo. The results of the study will be used in the development of a clinical protocol for the administration of the vaccine formulations of the present invention.
Настоящее изобретение не следует ограничивать в объеме конкретными описанными вариантами осуществления, которые, как предполагается, являются только иллюстрациями отдельных аспектов настоящего изобретения, и функциональные эквиваленты способов и компонентов охвачены объемом настоящего изобретения. Безусловно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к таковым, приведенным и описанным в данном документе, станут очевидными специалистам в данной области из вышеизложенного описания и сопутствующих графических материалов при использовании не более чем обычного экспериментирования. Такие модификации и эквиваленты, как предполагается, охвачены объемом прилагаемой формулы изобретения.The present invention should not be limited in scope to the specific embodiments described, which are intended to be merely illustrative of certain aspects of the present invention, and functional equivalents of the methods and components are embraced by the scope of the present invention. Certainly, various modifications of the present invention in addition to those given and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying drawings using no more than routine experimentation. Such modifications and equivalents are intended to be covered by the scope of the appended claims.
Все публикации, патенты и заявки на патент, упоминаемые в настоящем описании, в данном доку- 28 042694 менте включены в настоящее описание посредством ссылки в том же объеме, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент конкретно и индивидуально включены в данный документ посредством ссылки.All publications, patents, and patent applications referred to in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application were specifically and individually incorporated herein by reference.
Цитирование или рассмотрение литературных источников в данном документе не следует истолковывать как признание, что таковые являются уровнем техники для настоящего изобретения.Citation or review of literary sources in this document should not be construed as an admission that they are prior art for the present invention.
Список литературы.Bibliography.
1. Glass, RI, JS Noel, T Ando, RL Fankhauser, G Belloit, A Mounts, UD Parasher, JS Bresee and SS Monroe. The Epidemiology of Enteric Caliciviruses from Human: A Reassessment1. Glass, RI, JS Noel, T Ando, RL Fankhauser, G Belloit, A Mounts, UD Parasher, JS Bresee and SS Monroe. The Epidemiology of Enteric Caliciviruses from Human: A Reassessment
Using New Diagnostics. J Infect Dis 2000; 181 (Sup 2): S254-S261.Using New Diagnostics. J Infect Dis 2000; 181 (Sup 2): S254-S261.
2. Hardy, ME. Norwalk and «Norwalk-like Viruses» in Epidemic Gastroenteritis. Clin Lab2. Hardy, M.E. Norwalk and "Norwalk-like Viruses" in Epidemic Gastroenteritis. Clin Lab
Med 1999,19(3): 675-90.Med 1999,19(3): 675-90.
3. Jiang, X, DY Graham, KN Wang, and MK Estes. Norwalk Virus Genome Cloning and Characterization. Science 1990; 250: 1580-1583.3. Jiang, X, DY Graham, KN Wang, and MK Estes. Norwalk Virus Genome Cloning and Characterization. Science 1990; 250: 1580-1583.
4. Jiang, X, M Want, DY Graham, and MK Estes. Expression, Self-Assembly, and4. Jiang, X, M Want, DY Graham, and MK Estes. Expression, Self-Assembly, and
Antigenicity of the Norwalk Virus Capsid Protein. J Virol 1992; 66: 6527-6532.Antigenicity of the Norwalk Virus Capsid Protein. J Virol 1992; 66:6527-6532.
5. Glass, P, LJ White, JM Ball, I Leparc-Goffart, ME Hardy, and MK Estes. Norwalk Virus5. Glass, P, LJ White, JM Ball, I Leparc-Goffart, ME Hardy, and MK Estes. Norwalk Virus
Open Reading Frame 3 Encodes a Minor Structural Protein. J Virol 2000; 74: 6581-6591.Open Reading Frame 3 Encodes a Minor Structural Protein. J Virol 2000; 74:6581-6591.
- 29 042694- 29 042694
6. Lindesmith, L, C Moe, S Marionneau, N Ruvoen, X Jiang, L Lindblad, P Stewart, J6. Lindesmith, L, C Moe, S Marionneau, N Ruvoen, X Jiang, L Lindblad, P Stewart, J
LePendu, and R Baric. Human Susceptibility and Resistance to Norwalk Virus Infection. NatLePendu, and R Baric. Human Susceptibility and Resistance to Norwalk Virus Infection. Nat
Med2QQ3- 9: 548-553.Med2QQ3-9:548-553.
7. Parrino, TA, DS Schreiber, JS Trier, AZ Kapikian, and NR Blacklow. Clinical Immunity in Acute Gastroenteritis Caused by Norwalk Agent. N Engl J Med 1977; 297: 86-89.7. Parrino, TA, DS Schreiber, JS Trier, AZ Kapikian, and NR Blacklow. Clinical Immunity in Acute Gastroenteritis Caused by Norwalk Agent. N Engl J Med 1977; 297:86-89.
8. Wyatt, RG, R Dolin, NR Blacklow, HL DuPont, RF Buscho, TS Thornhill, AZ Kapikian, and RM Chanock. Comparison of Three Agents of Acute Infectious Nonbacterial Gastroenteritis by Cross-challenge in Volunteers. J Infect Dis 1974; 129: 709.8. Wyatt, RG, R Dolin, NR Blacklow, HL DuPont, RF Buscho, TS Thornhill, AZ Kapikian, and RM Chanock. Comparison of Three Agents of Acute Infectious Nonbacterial Gastroenteritis by Cross-challenge in Volunteers. J Infect Dis 1974; 129:709.
9. Ball, JM, DY Graham, AR Opekum, MA Gilger, RA Guerrero, and MK Estes. Recombinant Norwalk Virus-like Particles Given Orally to Volunteers: Phase I Study. Gastroenterology 1999; 117: 40-48.9. Ball, JM, DY Graham, AR Opekum, MA Gilger, RA Guerrero, and MK Estes. Recombinant Norwalk Virus-like Particles Given Orally to Volunteers: Phase I Study. Gastroenterology 1999; 117:40-48.
10. Tacket, CO, MB Sztein, GA Losonky, SS Wasserman, and MK Estes. Humoral, Mucosal, and Cellular Immune Responses to Oral Norwalk Virus-like Particles in Volunteers. Clin Immunol 2003; 108: 241.10. Tacket, CO, MB Sztein, GA Losonky, SS Wasserman, and MK Estes. Humoral, Mucosal, and Cellular Immune Responses to Oral Norwalk Virus-like Particles in Volunteers. Clin Immunol 2003; 108:241.
11. Guerrero, RA, JM Ball, SS Krater, SE Pacheco, JD Clements, and MK Estes. Recombinant Norwalk Virus-like Particles Administered Intranasally to Mice Induce Systemic and Mucosal (Fecal and Vaginal) Immune Responses. J Virol 2001; 75: 9713.11. Guerrero, RA, JM Ball, SS Krater, SE Pacheco, JD Clements, and MK Estes. Recombinant Norwalk Virus-like Particles Administered Intranasally to Mice Induce Systemic and Mucosal (Fecal and Vaginal) Immune Responses. J Virol 2001; 75:9713.
12. Nicollier-Jamot, B, A Ogier, L Piroth, P Pothier, and E Kohli. Recombinant Virus-like Particles of a Norovirus (Genogroup II Strain) Administered Intranasally and Orally with Mucosal Adjuvants LT and LT(R192G) in BALB/c Mice Induce Specific Humoral and Cellular Thl/Th2-like Immune Responses. Vaccine 2004; 22:1079-1086.12. Nicollier-Jamot, B, A Ogier, L Piroth, P Pothier, and E Kohli. Recombinant Virus-like Particles of a Norovirus (Genogroup II Strain) Administered Intranasally and Orally with Mucosal Adjuvants LT and LT(R192G) in BALB/c Mice Induce Specific Humoral and Cellular Thl/Th2-like Immune Responses. Vaccine 2004; 22:1079-1086.
13. Periwal, SB, KR Kourie, N Ramachandaran, SJ Blakeney, S DeBruin, D Zhu, TJ Zamb, L Smith, S Udem, JH Eldridge, KE Shroff, and PA Reilly. A Modified Cholera Holotoxin CTE29H Enhances Systemic and Mucosal Immune Responses to Recombinant Norwalk Viruslike Particle Vaccine. Vaccine 2003; 21: 376-385.13. Periwal, SB, KR Kourie, N Ramachandaran, SJ Blakeney, S DeBruin, D Zhu, TJ Zamb, L Smith, S Udem, JH Eldridge, KE Shroff, and PA Reilly. A Modified Cholera Holotoxin CTE29H Enhances Systemic and Mucosal Immune Responses to Recombinant Norwalk Viruslike Particle Vaccine. Vaccine 2003; 21:376-385.
14. Isaka, Μ, Y Yasuda, S Kozuka, T Taniguchi, К Matano, J Maeyama, T Komiya, К Ohkuma, N Goto, and К Tochikubo. Induction of systemic and mucosal antibody responses in mice immunized intranasally with aluminum-non-adsorbed diphtheria toxoid together with recombinant cholera toxin В subunit as an adjuvant. Vaccine 1999; 18: 743-751.14. Isaka, M, Y Yasuda, S Kozuka, T Taniguchi, K Matano, J Maeyama, T Komiya, K Ohkuma, N Goto, and K Tochikubo. Induction of systemic and mucosal antibody responses in mice immunized intranasally with aluminum-non-adsorbed diphtheria toxoid together with recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant. Vaccine 1999; 18:743-751.
--
Claims (19)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/506,447 | 2011-07-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA042694B1 true EA042694B1 (en) | 2023-03-15 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11701420B2 (en) | Parenteral norovirus vaccine formulations | |
US11826415B2 (en) | Method of conferring a protective immune response to Norovirus | |
US9821049B2 (en) | Method of conferring a protective immune response to Norovirus | |
EA042694B1 (en) | BUFFER-CONTAINING COMPOSITIONS, VACCINES CONTAINING BUFFER-CONTAINING COMPOSITIONS AND WAYS OF THEIR APPLICATION | |
AU2014200084B2 (en) | Method of conferring a protective immune response to norovirus |