EA042579B1 - METHOD FOR PURIFICATION OF PUNICALAGIN BASED ON FEATURES OF ISOMERIZATION - Google Patents
METHOD FOR PURIFICATION OF PUNICALAGIN BASED ON FEATURES OF ISOMERIZATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA042579B1 EA042579B1 EA202290221 EA042579B1 EA 042579 B1 EA042579 B1 EA 042579B1 EA 202290221 EA202290221 EA 202290221 EA 042579 B1 EA042579 B1 EA 042579B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- punicalagin
- chromatographic
- column
- concentrated
- reverse phase
- Prior art date
Links
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross-reference to related applications
Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент Китая № 201910711349.9, поданной 2 августа 2019 г., которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.The present application claims priority of Chinese Patent Application No. 201910711349.9, filed August 2, 2019, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к способу очистки пуникалагина, основанному на особенностях изомеризации.The present invention relates to a method for purifying punicalagin based on isomerization features.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of the invention
Получение большого количества мономерных соединений высокой чистоты из сложных натуральных лекарственных материалов или экстрактов всегда было актуальной и сложной задачей. Натуральные продукты имеют много компонентов и очень сложный структурный состав. Одно соединение часто соседствует с соединениями с очень похожими структурами, что вызывает чрезвычайно серьезные препятствия для отделения целевого соединения. Эти препятствия часто называют матричным эффектом. В традиционной колоночной хроматографии, жидкостной хроматографии и противоточной хроматографии этот матричный эффект часто вызывает значительные трудности при разделении чистых соединений или даже приводит к невозможности получения продуктов с требуемой чистотой. Поэтому очень важно изобрести способ разделения, который может эффективно избежать матричного эффекта и может быть применен к простым способам хроматографического разделения, чтобы повысить эффективность очистки мономерных соединений из натуральных продуктов.Obtaining a large number of high-purity monomeric compounds from complex natural medicinal materials or extracts has always been an urgent and difficult task. Natural products have many components and a very complex structural composition. One compound is often adjacent to compounds with very similar structures, which causes extremely serious obstacles to the separation of the target compound. These obstacles are often referred to as the matrix effect. In traditional column chromatography, liquid chromatography and countercurrent chromatography, this matrix effect often causes significant difficulties in separating pure compounds or even makes it impossible to obtain products with the required purity. Therefore, it is very important to invent a separation method that can effectively avoid the matrix effect and can be applied to simple chromatographic separation methods in order to improve the purification efficiency of monomeric compounds from natural products.
Изомеры, которые широко встречаются в натуральных продуктах, представляют собой соединения с одинаковой молекулярной массой, но разной структурой. Существует много видов изомеров, и некоторые из них имеют особую структуру, например определенные эпимеры и цис-транс-изомеры, которые могут быть преобразованы друг в друга при определенных условиях. В настоящее время были проведены достаточно обдуманные и интенсивные исследования касательно данной реакции изомеризации. Однако внедрение этой особенности изомеризации в область разделения и очистки для решения проблемы матричного эффекта при очистке изомеризуемых соединений является совершенно новой концепцией и о ней до сих пор не сообщалось в каком-либо литературном источнике. Такой способ можно назвать способом очистки на основе изомеризации.Isomers, which are widely found in natural products, are compounds with the same molecular weight but different structures. There are many kinds of isomers, and some of them have special structures, such as certain epimers and cis-trans isomers, which can be converted to each other under certain conditions. At present, quite thoughtful and intensive studies have been carried out regarding this isomerization reaction. However, the introduction of this feature of isomerization into the field of separation and purification to solve the problem of the matrix effect in the purification of isomerizable compounds is a completely new concept and has not yet been reported in any literature source. Such a method may be referred to as an isomerization-based purification method.
Основной принцип способа очистки на основе изомеризации заключается в том, что изомеризуемое соединение обычно показывает два или более пика на хроматограмме. Компонент, содержащий один из изомеров и совместно элюируемые примеси, собирают с хроматографии и быстро превращают в компонент, содержащий все изомеры при определенных условиях (одномерное разделение). Когда компонент анализируют с помощью жидкостной хроматографии, на хроматограмме представлены пики всех изомеров. Компонент вторично очищается тем же способом, что и при одномерном разделении. Все изомерные компоненты, кроме компонента исходного изомера, собираются селективно, что позволяет эффективно избежать примесей, включенных в исходный изомер. Затем при определенных условиях полученные компоненты превращаются в смесь всех изомеров без примесей.The basic principle of the isomerization-based purification method is that the isomerizable compound usually shows two or more peaks in the chromatogram. The component containing one of the isomers and the co-eluting impurities is collected from the chromatography and rapidly converted to the component containing all the isomers under certain conditions (one-dimensional separation). When a component is analyzed by liquid chromatography, the chromatogram shows the peaks of all isomers. The component is re-cleaned in the same way as in a one-dimensional separation. All isomeric components other than the original isomer component are collected selectively, effectively avoiding impurities included in the original isomer. Then, under certain conditions, the resulting components are converted into a mixture of all isomers without impurities.
Пуникалагин представляет собой разновидность растительного полифенола с эллаговой кислотой в качестве материнского ядра и им богаты лекарственные вещества из кожуры граната, при этом он демонстрирует различные биологические свойства противовоспалительного, антибактериального, противовирусного действия, предотвращая пролиферацию раковых клеток, что делает его потенциальным соединением для лекарственных средств. В структуре пуникалагина присутствует глюкозид с одним концевым углеродом, что может вызывать образование двух аномеров, а именно α-пуникалагина и β-пуникалагина. Два изомера пуникалагина могут взаимно превращаться при хроматографии. В настоящее время очистка пуникалагина в основном полагается на способы, основанные на колоночной хроматографии, жидкостной хроматографии и противоточной хроматографии, а также на их комбинации. Поскольку матричный эффект в натуральных продуктах очень сложен, очистка пуникалагина очень трудна, пуникалагин высокой чистоты может быть получен в небольшом количестве или даже невозможно получить пуникалагин чрезвычайно высокой чистоты. Используя характеристики изомеризации пуникалагина, разработан способ очистки, основанный на особенностях изомеризации. Путем применения хроматографии в полупромышленном масштабе большие количества пуникалагина высокой чистоты получали с помощью способа очистки, основанном на особенностях. Ключевым моментом настоящего изобретения является разработка способа очистки, основанного на особенностях изомеризации, и его применение в периодическом получении пуникалагина высокой чистоты, что имеет большое значение для исследования и разработки новых лекарственных средств на основе пуникалагина. Способ очистки, основанный на особенностях изомеризации, является подходящим для очистки изомеризуемых соединений, что является новаторским и показательным.Punicalagin is a kind of plant polyphenol with ellagic acid as the parent nucleus and is rich in medicinal substances from pomegranate peel, while it exhibits various biological properties of anti-inflammatory, antibacterial, antiviral action, preventing the proliferation of cancer cells, which makes it a potential drug compound. In the structure of punicalagin, there is a glucoside with one terminal carbon, which can cause the formation of two anomers, namely α-punicalagin and β-punicalagin. The two isomers of punicalagin can be interconverted by chromatography. Currently, the purification of punicalagin mainly relies on methods based on column chromatography, liquid chromatography and countercurrent chromatography, as well as combinations thereof. Since the matrix effect in natural products is very complex, the purification of punicalagin is very difficult, high purity punicalagin can be obtained in small quantities or even it is not possible to obtain extremely high purity punicalagin. Using the characteristics of the isomerization of punicalagin, a purification method based on the characteristics of the isomerization has been developed. By using pilot scale chromatography, large amounts of high purity punicalagin were obtained by a feature based purification method. The key point of the present invention is the development of a purification method based on the characteristics of isomerization and its application in the batch production of high purity punicalagin, which is of great importance for the research and development of new drugs based on punicalagin. The purification method based on the features of isomerization is suitable for the purification of isomerizable compounds, which is innovative and revealing.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Целью настоящего изобретения является предоставление способа очистки пуникалагина, основанного на особенностях изомеризации. Используя характеристики изомеризации пуникалагина, примеси, элюированные вместе с пуникалагином в экстракте кожуры граната, могут быть эффективно удалены с помощью способа, основанного на особенностях изомеризации. Используя препаративную жидкостную хроматографию в полупромышленном масштабе несколько грамм пуникалагина с чистотой выше 98%The aim of the present invention is to provide a method for purifying punicalagin based on isomerization characteristics. Using the isomerization characteristics of punicalagin, impurities eluted with punicalagin in the pomegranate peel extract can be effectively removed by a method based on the isomerization characteristics. Using preparative liquid chromatography on a pilot scale, a few grams of punicalagin with a purity greater than 98%
- 1 042579 получали из сложного экстракта кожуры граната. Способ является простым, эффективным и экономичным, что является ценным для очистки и получения соединений с характеристиками изомеризации.- 1 042579 was obtained from a complex pomegranate peel extract. The process is simple, efficient and economical, which is valuable for purification and obtaining compounds with isomerization characteristics.
Способ очистки пуникалагина, основанный на особенностях изомеризации, по настоящему изобретению включает следующие стадии:The method for purifying punicalagin based on isomerization features of the present invention includes the following steps:
a) отбор хроматографической колонки с обращенной фазой, где подвижная фаза состоит из метанола и 0,01-5% (об./об.) водного раствора муравьиной кислоты в объемном соотношении 1-5:9-5, скорость потока контролируют на уровне 50-300 мл/мин и длина волны УФ-детектирования составляет 220-280 и 350-380 нм, колонку уравновешивают подвижной фазой в течение 3-30 мин перед применением;a) sampling a reverse phase chromatographic column, where the mobile phase consists of methanol and 0.01-5% (v/v) aqueous formic acid in a volume ratio of 1-5:9-5, the flow rate is controlled at 50 -300 ml/min and the UV detection wavelength is 220-280 and 350-380 nm, the column is equilibrated with the mobile phase for 3-30 min before use;
b) взвешивание экстракта кожуры граната, растворение его в воде, отбор надосадочной жидкости после центрифугирования и загрузка его в хроматографическую колонку с обращенной фазой, сбор по отдельности двух компонентов, примерно соответствующих пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина, затем концентрирование с помощью роторного испарителя при 30-50°C;b) weighing the pomegranate peel extract, dissolving it in water, collecting the supernatant after centrifugation and loading it into a reverse phase chromatographic column, collecting separately the two components, approximately corresponding to the peaks of α-punicalagin and β-punicalagin, then concentration using a rotary evaporator at 30-50°C;
c) повторная загрузка концентрированного собранного компонента, соответствующего пику α-пуникалагина, полученного на стадии b), в хроматографическую колонку с обращенной фазой для разделения в тех же условиях, что и на стадии а), и сбор двух компонентов, соответствующих хроматографическим пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина соответственно, где собранный компонент, примерно соответствующий пику β-пуникалагина, концентрируют с помощью роторного испарителя при температуре 30-50°C и лиофилизируют в виде порошка пуникалагина с чистотой выше 98%, как определено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; собранный компонент, примерно соответствующий пику α-пуникалагина, концентрируют с помощью роторного испарителя при температуре 30-50°C и повторно разделяют в тех же хроматографических условиях, что и на стадии а), с получением пуникалагина высокой чистоты; и/или повторная загрузка концентрированного собранного компонента, примерно соответствующего пику β-пуникалагина, полученного на стадии b), в хроматографическую колонку с обращенной фазой в тех же условиях, что и на стадии а), и сбор двух компонентов, примерно соответствующих пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина, где собранный компонент, примерно соответствующий α-пуникалагину, концентрируют с помощью роторного испарителя при температуре 30-50°C и повторно загружают в хроматографическую колонку с обращенной фазой на стадии а), сбор двух компонентов, примерно соответствующих пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина соответственно, где собранный компонент, примерно соответствующий α-пуникалагину, концентрируют с помощью роторного испарителя при температуре 30-50°C и лиофилизируют в виде бледно-желтого порошка пуникалагина с чистотой выше 98%, как определено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; при этом собранный компонент, примерно соответствующий пику β-пуникалагина, концентрируют с помощью роторного испарителя при температуре 30-50°C и повторно очищают в тех же хроматографических условиях, что и на стадии а), с получением пуникалагина высокой чистоты.c) reloading the concentrated collected component corresponding to the α-punicalagin peak obtained in step b) into a reverse phase chromatographic column for separation under the same conditions as in step a), and collecting the two components corresponding to the chromatographic peaks α- punicalagin and β-punicalagin, respectively, where the collected component, approximately corresponding to the β-punicalagin peak, is concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 30-50°C and lyophilized as a powder of punicalagin with a purity greater than 98%, as determined by high performance liquid chromatography; the collected component, approximately corresponding to the α-punicalagin peak, is concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 30-50°C and re-separated under the same chromatographic conditions as in step a), to obtain high purity punicalagin; and/or reloading the concentrated collected component, approximately corresponding to the peak of β-punicalagin obtained in step b), into a reverse phase chromatographic column under the same conditions as in step a), and collecting two components, approximately corresponding to the peaks of α- punicalagin and β-punicalagin, where the collected component, approximately corresponding to α-punicalagin, is concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 30-50°C and reloaded into a reverse phase chromatographic column in step a), collection of two components, approximately corresponding to peaks α -punicalagin and β-punicalagin, respectively, where the collected component, approximately corresponding to α-punicalagin, is concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 30-50°C and freeze-dried as a pale yellow powder of punicalagin with a purity greater than 98%, as determined by high performance liquid chromatography; whereby the collected component, approximately corresponding to the peak of β-punicalagin, is concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 30-50°C and re-purified under the same chromatographic conditions as in step a), obtaining punicalagin of high purity.
Предпочтительно в способе очистки пуникалагина согласно настоящему изобретению на стадии b) 0,1-10 г экстракта кожуры граната взвешивают и растворяют в 10-50 мл воды.Preferably, in the method for purifying punicalagin according to the present invention, in step b), 0.1-10 g of pomegranate peel extract is weighed and dissolved in 10-50 ml of water.
Предпочтительно в способе очистки пуникалагина согласно настоящему изобретению на стадии b) раствор центрифугируют при скорости вращения 5000-10000 об/мин в течение 3-5 мин.Preferably, in the process for purifying punicalagin according to the present invention, in step b), the solution is centrifuged at a rotation speed of 5000-10000 rpm for 3-5 minutes.
Способ очистки пуникалагина согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что концентрирование осуществляют с уменьшением объема до 10-50 мл. Более предпочтительно концентрирование осуществляют с применением роторного испарителя.The method of purification of punicalagin according to the present invention is characterized in that the concentration is carried out with a decrease in volume to 10-50 ml. More preferably, the concentration is carried out using a rotary evaporator.
Согласно любому из описанных выше способов очистки пуникалагина по настоящему изобретению в качестве предпочтительного способа, способ очистки, основанный на особенностях изомеризации пуникалагина, по настоящему изобретению осуществляют с помощью следующих стадий:According to any of the above-described methods for purifying punicalagin of the present invention as a preferred method, the purification method based on the isomerization features of punicalagin of the present invention is carried out by the following steps:
a) отбор хроматографической колонки с обращенной фазой полупромышленного масштаба, где подвижная фаза состоит из метанола и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты в объемном соотношении 12:88, скорость потока контролируют на уровне 180 мл/мин, устанавливают температуру на уровне комнатной температуры, длина волны УФ-детектирования составляет 254 и 366 нм, колонку уравновешивают в течение 15 мин перед применением;a) Sampling of a semi-industrial scale reverse phase column chromatography, where the mobile phase consists of methanol and 0.1% aqueous formic acid in a volume ratio of 12:88, the flow rate is controlled at 180 ml/min, the temperature is set at room temperature temperature, UV detection wavelength is 254 and 366 nm, the column is equilibrated for 15 minutes before use;
b) взвешивание 6 г экстракта кожуры граната, растворение их в 20 мл воды, отбор надосадочной жидкости после центрифугирования раствора экстракта при 10000 об/мин в течение 5 мин и загрузка его в уравновешенную хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба через шестиходовой клапан, сбор двух компонентов, примерно соответствующих двум хроматографическим пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина, концентрирование двух компонентов до 20 мл с помощью роторного испарителя при 50°C соответственно;b) weighing 6 g of pomegranate peel extract, dissolving them in 20 ml of water, withdrawing the supernatant after centrifuging the extract solution at 10,000 rpm for 5 min and loading it into a semi-industrial scale equilibrated reverse phase chromatography column through a six-way valve, collecting two components approximately corresponding to the two chromatographic peaks of α-punicalagin and β-punicalagin, concentration of the two components to 20 ml using a rotary evaporator at 50°C, respectively;
c) повторная загрузка концентрированного собранного компонента, примерно соответствующего пику α-пуникалагина, полученного на стадии b), в хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба для вторичного разделения в тех же условиях, что и на стадии а), и сбор двух компонентов примерно соответствующих хроматографическим пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина соответственно, где собранный компонент, примерно соответствующий пику β-пуникалагина, конценc) reloading the concentrated collected component, approximately corresponding to the peak of α-punicalagin obtained in step b), into a pilot scale reverse phase chromatographic column for secondary separation under the same conditions as in step a), and collecting two components approximately corresponding chromatographic peaks of α-punicalagin and β-punicalagin, respectively, where the assembled component, approximately corresponding to the peak of β-punicalagin, ends
- 2 042579 трируют с помощью роторного испарителя при температуре 39°C и лиофилизируют в виде 137 мг бледно-желтого порошка пуникалагина с чистотой выше 98% после определения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; концентрирование собранного компонента, примерно соответствующего пику α-пуникалагина, до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при температуре 50°C и повторная загрузка концентрированного компонента в тех же хроматографических условиях, что и на стадии а), с получением пуникалагина высокой чистоты; или повторная загрузка концентрированного собранного компонента, примерно соответствующего пику β-пуникалагина, полученного на стадии b), в хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба в тех же условиях, что и на стадии а), и сбор двух хроматографических пиков, примерно соответствующих пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина соответственно, где собранный компонент, примерно соответствующий пику α-пуникалагина, представляет собой необходимый продукт; концентрирование собранного компонента, примерно соответствующего пику β-пуникалагина, до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при температуре 50°C, повторная загрузка концентрированного компонента в хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба на стадии а), сбор компонентов, примерно соответствующих двум хроматографическим пикам α-пуникалагина и β-пуникалагина соответственно, где собранный компонент, примерно соответствующий пику α-пуникалагина, представляет собой необходимый продукт; объединение двух собранных компонентов, примерно соответствующих пику α-пуникалагина, концентрирование объединенных компонентов с помощью роторного испарителя при температуре 39°C, осуществление лиофилизации концентрированных компонентов с получением 280 мг бледно-желтого порошка пуникалагина с чистотой выше 98% после определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии; концентрирование собранного компонента, примерно соответствующего пику β-пуникалагина, до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при температуре 50°C и повторная загрузка концентрированного компонента в тех же хроматографических условиях, что и на стадии а), с получением пуникалагина высокой чистоты.- 2 042579 triturated with a rotary evaporator at 39° C. and lyophilized as 137 mg of punicalagin pale yellow powder with a purity greater than 98% after determination by high performance liquid chromatography; concentrating the collected component, approximately corresponding to the α-punicalagin peak, to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at a temperature of 50°C and reloading the concentrated component under the same chromatographic conditions as in step a), obtaining high purity punicalagin; or reloading the concentrated harvest roughly corresponding to the β-punicalagin peak obtained in step b) into a pilot scale reverse phase chromatographic column under the same conditions as in step a) and collecting two chromatographic peaks roughly corresponding to the α peaks -punicalagin and β-punicalagin, respectively, where the assembled component, approximately corresponding to the peak of α-punicalagin, is the desired product; concentration of the collected component, approximately corresponding to the peak of β-punicalagin, to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at a temperature of 50°C, reloading the concentrated component into a pilot scale reverse phase chromatographic column in step a), collecting components, approximately corresponding to two chromatographic peaks α-punicalagin and β-punicalagin, respectively, where the assembled component, approximately corresponding to the peak of α-punicalagin, is the desired product; combining the two collected components, approximately corresponding to the α-punicalagin peak, concentrating the combined components using a rotary evaporator at a temperature of 39°C, performing lyophilization of the concentrated components to obtain 280 mg of a pale yellow powder of punicalagin with a purity of more than 98% after determination by high performance liquid chromatography; concentrating the collected component, approximately corresponding to the peak of β-punicalagin, to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at a temperature of 50°C and reloading the concentrated component under the same chromatographic conditions as in step a), obtaining high purity punicalagin.
Способ очистки пуникалагина, основанный на особенностях изомеризации, по настоящему изобретению характеризуется тем, что хроматографическая колонка, применяемая в способе, представляет собой хроматографическую колонку с обращенной фазой С18, где применяемый петлевой дозатор объемом 30 мл используется для загрузки образцов, который больше, чем объем образца, т.е. 20 мл.The method for purifying punicalagin based on isomerization features of the present invention is characterized in that the chromatographic column used in the method is a C18 reverse phase chromatographic column, where the 30 ml loop dispenser used is used to load samples that are larger than the sample volume. , i.e. 20 ml.
Способ очистки пуникалагина, основанный на особенностях изомеризации, по настоящему изобретению представляет собой способ очистки на основе изомеризации, разработанный на основе характеристик изомеризации пуникалагина, и используется для периодического получения пуникалагина высокой чистоты. Способ является простым и практичным, может быть использован для получения в большом масштабе. Чистота полученного пуникалагина составляет более 98%. Установленный способ, основанный на особенностях изомеризации, является подходящим для очистки изомеризуемых соединений, что является новаторским и показательным.Punicalagin Purification Method Based on Isomerization Characteristics of the present invention is an isomerization-based purification method developed on the basis of punicalagin isomerization characteristics, and is used for producing high purity punicalagin batchwise. The method is simple and practical, can be used for large scale production. The purity of the obtained punicalagin is more than 98%. The established method, based on the features of isomerization, is suitable for the purification of isomerizable compounds, which is innovative and revealing.
Описание графических материаловDescription of graphic materials
На фиг. 1 представлена хроматограмма, полученная с помощью хроматографии с обращенной фазой в полупромышленном масштабе, экстракта кожуры граната, предусмотренного в настоящем изобретении.In FIG. 1 shows a pilot scale reverse phase chromatography chromatogram of the pomegranate peel extract of the present invention.
На фиг. 2 представлена хроматограмма, полученная с помощью препаративной хроматографии, компонента 1 на основе α-пуникалагина, предусмотренного в настоящем изобретении, после его концентрирования и повторной загрузки в хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба.In FIG. 2 is a preparative chromatography chromatogram of component 1 based on the α-punicalagin of the present invention after it has been concentrated and reloaded onto a pilot scale reverse phase chromatography column.
На фиг. 3 представлена диаграмма для жидкостной хроматографии для определения компонента 3 на основе β-пуникалагина, полученного в соответствии с настоящим изобретением.In FIG. 3 is a liquid chromatography chart for the determination of component 3 based on β-punicalagin obtained in accordance with the present invention.
На фиг. 4 представлена хроматограмма, полученная с помощью препаративной хроматографии, компонента 4 на основе β-пуникалагина, предусмотренного в настоящем изобретении, после его концентрирования и повторной загрузки в хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба.In FIG. 4 is a preparative chromatography chromatogram of component 4 based on the β-punicalagin of the present invention, after it has been concentrated and reloaded onto a pilot scale reverse phase chromatography column.
На фиг. 5 представлена диаграмма для жидкостной хроматографии для определения объединенного компонента 5 на основе α-пуникалагина и компонента 7 на основе α-пуникалагина, полученных в соответствии с настоящим изобретением.In FIG. 5 is a liquid chromatography chart for the determination of the combined α-punicalagin component 5 and α-punicalagin component 7 prepared in accordance with the present invention.
Конкретные варианты осуществления изобретенияSpecific embodiments of the invention
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже в сочетании с конкретными вариантами осуществления.The present invention will be described in more detail below in conjunction with specific embodiments.
Пример 1.Example 1
a) Применяли хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба, где колонка имела размер 250 мм (длина колонки)х80 мм (внутренний диаметр); ее наполнитель характеризовался размером частиц 10 мкм; подвижная фаза состояла из метанола и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты в объемном соотношении 12:88; скорость потока поддерживалась на уровне 180 мл/мин; температуру устанавливали на уровне комнатной температуры, длина волныa) A semi-industrial scale reverse phase chromatography column was used, where the column had a size of 250 mm (column length) x 80 mm (inner diameter); its filler was characterized by a particle size of 10 μm; the mobile phase consisted of methanol and 0.1% aqueous formic acid in a volume ratio of 12:88; the flow rate was maintained at 180 ml/min; temperature was set at room temperature, wavelength
- 3 042579- 3 042579
УФ-детектирования составляла 254 и 366 нм, колонку уравновешивали в течение 15 мин, и колонка была готова к использованию.UV detection was 254 and 366 nm, the column was equilibrated for 15 min and the column was ready to use.
b) Взвешивали 6 г экстракта кожуры граната, в котором содержание пуникалагина составляло приблизительно 32%. Экстракт растворяли в 20 мл воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость собирали и загружали в уравновешенную хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба через шестиходовой клапан, как показано на фиг. 1. Компонент, обозначенный как компонент 1, во временном диапазоне от 10 до 15 мин, т.е. α-пуникалагин, собирали в резервуаре для компонентов и концентрировали до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при 50°C соответственно.b) Weighed 6 g of pomegranate peel extract, in which the content of punicalagin was approximately 32%. The extract was dissolved in 20 ml of water and centrifuged at 10,000 rpm for 5 min. The supernatant was collected and loaded into a pilot scale equilibrated reverse phase chromatography column through a six-way valve as shown in FIG. 1. The component, designated as component 1, in the time range from 10 to 15 minutes, i.e. α-punicalagin was collected in the component reservoir and concentrated to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at 50°C, respectively.
c) Компонент 1 повторно загружали в уравновешенную хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба в соответствии со стадией а). Его хроматограмма показана на фиг. 2. Компоненты, обозначенные как компонент 2, пики которого находятся во временном диапазоне от 12,5 до 20 мин (примерно соответствующие α-пуникалагину), и компонент 3, пики которого находятся во временном диапазоне от 25 до 35 мин (примерно соответствующие β-пуникалагину), собирали в разные резервуары для компонентов соответственно. Компонент 3 концентрировали с помощью роторного испарителя при температуре 39°C, лиофилизировали с получением бледно-желтого порошка. Такой порошок весил в целом 137 мг и продемонстрировал чистоту более 98% после определения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, как показано на фиг. 3. Компонент 2 концентрировали до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при температуре 50°C и повторно загружали в тех же хроматографических условиях, что и на стадии а), с получением пуникалагина высокой чистоты.c) Component 1 was reloaded into a pilot scale equilibrated reverse phase chromatography column according to step a). Its chromatogram is shown in Fig. 2. Components designated as component 2, which peaks in the time range from 12.5 to 20 minutes (approximately corresponding to α-punicalagin), and component 3, which peaks in the time range from 25 to 35 minutes (approximately corresponding to β- punicalagin) were collected in different component tanks, respectively. Component 3 was concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 39°C, lyophilized to obtain a pale yellow powder. This powder weighed a total of 137 mg and exhibited a purity of over 98% when determined by high performance liquid chromatography as shown in FIG. 3. Component 2 was concentrated to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at 50° C. and reloaded under the same chromatographic conditions as in step a) to obtain high purity punicalagin.
Пример 2.Example 2
a) Применяли хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба, где колонка имела размер 250 мм (длина колонки)х80 мм (внутренний диаметр); ее наполнитель характеризовался размером частиц 10 мкм; подвижная фаза состояла из метанола и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты в объемном соотношении 12:88; скорость потока поддерживалась на уровне 180 мл/мин; температуру устанавливали на уровне комнатной температуры, длина волны УФ-детектирования составляла 254 и 366 нм, колонку уравновешивали в течение 15 мин, и колонка была готова к использованию.a) A semi-industrial scale reverse phase chromatography column was used, where the column had a size of 250 mm (column length) x 80 mm (inner diameter); its filler was characterized by a particle size of 10 μm; the mobile phase consisted of methanol and 0.1% aqueous formic acid in a volume ratio of 12:88; the flow rate was maintained at 180 ml/min; the temperature was set at room temperature, the UV detection wavelength was 254 and 366 nm, the column was equilibrated for 15 min, and the column was ready for use.
b) Взвешивали 6 г экстракта кожуры граната, в котором содержание пуникалагина составляло приблизительно 32%. Экстракт растворяли в 20 мл воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость собирали и загружали в уравновешенную хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба через шестиходовой клапан, как показано на фиг. 1. Компонент, обозначенный как компонент 4, примерно соответствующий β-пуникалагину (в диапазоне от 17 до 30 мин), собирали в резервуаре для компонентов и концентрировали до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при 50°C соответственно.b) Weighed 6 g of pomegranate peel extract, in which the content of punicalagin was approximately 32%. The extract was dissolved in 20 ml of water and centrifuged at 10,000 rpm for 5 min. The supernatant was collected and loaded into a pilot scale equilibrated reverse phase chromatography column through a six-way valve as shown in FIG. 1. The component designated as component 4, roughly corresponding to β-punicalagin (range 17 to 30 min), was collected in the component reservoir and concentrated to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at 50°C, respectively.
с) Компонент 4 повторно загружали в уравновешенную хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба в соответствии со стадией а). Его хроматограмма показана на фиг. 4. Компоненты, обозначенные как компонент 5, пики которого находятся во временном диапазоне от 12,5 до 20 мин (примерно соответствующие α-пуникалагину), и компонент 6, пики которого находятся во временном диапазоне от 25 до 35 мин (примерно соответствующие β-пуникалагину), собирали в разные резервуары для компонентов соответственно. Компонент 5 представлял собой необходимый продукт.c) Component 4 was reloaded into a pilot scale equilibrated reverse phase chromatography column according to step a). Its chromatogram is shown in Fig. 4. Components designated as component 5, which peaks in the time range from 12.5 to 20 minutes (approximately corresponding to α-punicalagin), and component 6, which peaks in the time range from 25 to 35 minutes (approximately corresponding to β- punicalagin) were collected in different component tanks, respectively. Component 5 was the required product.
Компонент 6 концентрировали до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при температуре 50°C и повторно загружали в уравновешенную хроматографическую колонку с обращенной фазой полупромышленного масштаба в соответствии со стадией а). Его хроматограмма также представлена на фиг. 4. Компоненты, обозначенные как компонент 7, пики которого находятся во временном диапазоне от 12,5 до 20 мин (примерно соответствующие α-пуникалагину), и компонент 8, пики которого находятся во временном диапазоне от 25 до 35 мин (примерно соответствующие β-пуникалагину), собирали в разные резервуары для компонентов соответственно. Компонент 7 на основе α-пуникалагина представлял собой необходимый продукт. Его объединяли с компонентом 5 и концентрировали с помощью роторного испарителя при температуре 39°C, затем лиофилизировали с получением бледно-желтого порошка. Такой порошок весил в целом 280 мг и продемонстрировал чистоту более 98% после определения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, как показано на фиг. 5. Компонент 8 концентрировали до объема 20 мл с помощью роторного испарителя при температуре 50°C и повторно загружали в тех же хроматографических условиях, что и на стадии а), с получением пуникалагина высокой чистоты.Component 6 was concentrated to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at a temperature of 50° C. and reloaded into a pilot scale equilibrated reverse phase chromatography column according to step a). Its chromatogram is also shown in Fig. 4. Components designated as component 7, which peaks in the time range from 12.5 to 20 minutes (approximately corresponding to α-punicalagin), and component 8, which peaks in the time range from 25 to 35 minutes (approximately corresponding to β- punicalagin) were collected in different component tanks, respectively. Component 7 based on α-punicalagin was the required product. It was combined with component 5 and concentrated using a rotary evaporator at a temperature of 39°C, then lyophilized to obtain a pale yellow powder. This powder weighed a total of 280 mg and exhibited a purity of over 98% when determined by high performance liquid chromatography as shown in FIG. 5. Component 8 was concentrated to a volume of 20 ml using a rotary evaporator at 50° C. and reloaded under the same chromatographic conditions as in step a) to obtain high purity punicalagin.
Помимо смеси метанола и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты, подвижная фаза хроматографической колонки с обращенной фазой, применяемой в примерах, также может представлять собой смесь ацетонитрила и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты, смесь тетрагидрофурана и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты, смесь метанола, ацетонитрила и 0,1%-ного водного раствора муравьиной кислоты, смесь метанола, тетрагидрофурана и 0,1%-ного водного раствора муравьIn addition to a mixture of methanol and 0.1% aqueous formic acid, the mobile phase of the reverse phase chromatography column used in the examples can also be a mixture of acetonitrile and 0.1% aqueous formic acid, a mixture of tetrahydrofuran and 0. 1% aqueous solution of formic acid, a mixture of methanol, acetonitrile and 0.1% aqueous solution of formic acid, a mixture of methanol, tetrahydrofuran and 0.1% aqueous solution
--
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910711349.9 | 2019-08-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA042579B1 true EA042579B1 (en) | 2023-03-01 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220348603A1 (en) | Isomerization feature-based method for purifying punicalagin | |
| Li et al. | Bioassay-guided separation and purification of water-soluble antioxidants from Carthamus tinctorius L. by combination of chromatographic techniques | |
| CN105272844B (en) | Method for purifying high-purity fish oil EPA(eicosapentaenoic acid) ethyl ester and DHA(docosahexaenoic acid) ethyl ester | |
| CN1680392A (en) | Preparation of high-purity ginkgolide | |
| WO2017028397A1 (en) | Method for extracting peroxyergosterol from wall-broken ganoderma lucidum spore powder | |
| Liu et al. | A novel purification method of artemisinin from Artemisia annua | |
| Kou et al. | An integrated strategy for production of four anthocyanin compounds from Ribes nigrum L. by deep eutectic solvents and flash chromatography | |
| Adekenova et al. | Gram-Scale Purification of Two Sesquiterpene Lactones from Chartolepsis Intermedia Boiss. | |
| CN111560024B (en) | Method for separating gelsemium elegans alkaloid monomer from gelsemium elegans alkaloid by combining high-speed counter-current chromatography with preparative liquid chromatography | |
| CN103242402B (en) | The highly purified N of a kind of preparation fast 6the method of-(2-hydroxyethyl) adenosine | |
| EA042579B1 (en) | METHOD FOR PURIFICATION OF PUNICALAGIN BASED ON FEATURES OF ISOMERIZATION | |
| CN114539043B (en) | Preparation method and application of demethoxycurcumin crystal | |
| CN112159440B (en) | Phenolic glycoside compound and preparation method and application thereof | |
| CN111450574B (en) | Chromatographic column for purifying tacrolimus and purification method of tacrolimus | |
| CN110229089B (en) | Method for separating and purifying high-purity canthaxanthin by using double solvents in combination with medium-pressure liquid chromatography | |
| CN109265434B (en) | Method for extracting lignans from Nanshan tea by DAC (digital-to-analog converter) preparation method | |
| CN108409817A (en) | A method of preparing Quercetin -3-D- xylosides and Quercetin -3-D- Arabinosides | |
| Sun et al. | Separation of salidroside from the fermentation broth of engineered Escherichia coli using macroporous adsorbent resins | |
| CN113121320B (en) | Method for separating myricetin from waxberry bark by using high-speed counter-current chromatography | |
| CN109369605B (en) | Method for extracting lignans from Nanshan tea | |
| CN112047988B (en) | Paederoside monomer compound, preparation method and application thereof | |
| CN115232182B (en) | High-purity Zhongshengmycin D reference substance and preparation method thereof | |
| CN109369752B (en) | Method for extracting kaempferol galactose type compound from Nanshan tea | |
| CN114773425B (en) | Method for separating carnosic acid and ursolic acid by liquid-liquid extraction and application thereof | |
| Zhang et al. | Isolation and purification of ergosterol and ergosterolperoxide from an edible and medicinal higher ascomycete mushroom Xylaria striata by high-speed countercurrent chromatography |