EA042513B1

EA042513B1 - Psma-нацеленные триспецифические белки и способы их применения

Info

Publication number: EA042513B1
Application number: EA201991181
Authority: EA
Inventors: Патрик Бауэрле; Жанмари Гуно; Хольгер Веше; Роберт Б. ДАБРИДЖ; Брайан Д. Лемон; Ричард Дж. Остин; Пуи Сето
Original assignee: Харпун Терапьютикс, Инк.
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2023-02-21

Description

Перечень последовательностей

Настоящий документ содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII, и он включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 22 ноября 2017 г., имеет название 47517-708_601_SL.txt, и ее размер составляет 150 911 байт.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Зачастую в различных клинических условиях желательным является избирательное уничтожение отдельной клетки или конкретного типа клеток. Например, основной целью терапии рака является специфическое уничтожение опухолевых клеток, чтобы здоровые клетки и ткани оставались при этом интактными и неповрежденными. Одним из таких способов является индукция иммунного ответа в отношении опухоли с целью стимуляции иммунных эффекторных клеток, таких как естественные клеткикиллеры (NK) или цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), к атаке и уничтожению опухолевых клеток.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

В настоящем документе представлены триспецифический антигенсвязывающий белок, фармацевтические композиции на его основе, а также нуклеиновые кислоты, рекомбинантные векторы экспрессии и клетки-хозяева для получения таких триспецифических антигенсвязывающих белков и способы применения для лечения заболеваний, нарушений или состояний. Согласно одному аспекту в настоящем документе описаны нацеленные на простатический специфический мембранный антиген (PSMA) триспецифические белки, где указанные белки содержат (а) первый домен (А), который специфически связывается с CD3 человека; (b) второй домен (В), который представляет собой домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни; и (с) третий домен (С), который специфически связывается с PSMA, причем домены соединены в порядке H₂N-(A)-(C)-(B)-COOH, H₂N-(B)-(A)-(C)-COOH, H₂N-(C)-(B)-(A)-COOH или посредством линкеров L1 и L2. Согласно некоторым вариантам осуществления первый домен предусматривает вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, каждая из которых способна к специфическому связыванию с CD3 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления первый домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-88. Согласно некоторым вариантам осуществления первый домен является гуманизированным или представляет собой домен человека. Согласно некоторым вариантам осуществления первый домен характеризуется KD связывания с CD3 на поверхности экспрессирующих CD3 клеток

150 нМ или менее. Согласно некоторым вариантам осуществления второй домен связывает сывороточный альбумин человека. Согласно некоторым вариантам осуществления второй домен содержит scFv, вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL), пептид, лиганд или малую молекулу. Согласно некоторым вариантам осуществления второй домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 89-112. Согласно некоторым вариантам осуществления третий домен содержит scFv, VH-домен, VL-домен, домен отличного от Ig типа, лиганд, ноттин или низкомолекулярное соединение, которые специфически связываются с PSMA. Согласно некоторым вариантам осуществления третий домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113-140.

Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из линкеров L1 и L2 независимо выбран из (GS)n (SEQ ID NO: 153), (GGS)n (SEQ ID NO: 154), (GGGS)n (SEQ ID NO: 155), (GGSG)n (SEQ ID NO: 156), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 157) или (GGGGS)n (SEQ ID NO: 158), причем n равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из линкеров L1 и L2 независимо представляет собой (GGGGS)₄ (SEQ ID NO: 159) или (GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 160). Согласно некоторым вариантам осуществления домены соединены в порядке H₂N-(A)-(C)-(B)-COOH. Согласно некоторым вариантам осуществления домены соединены в порядке H₂N-(B)-(C)-(A)-COOH.

Согласно некоторым вариантам осуществления размер белка составляет менее чем приблизительно 80 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления размер белка составляет от приблизительно 50 до приблизительно 75 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления размер белка составляет менее чем приблизительно 60 кДа.

Согласно некоторым вариантам осуществления белок характеризуется периодом полувыведения по меньшей мере приблизительно 50 ч. Согласно некоторым вариантам осуществления белок характеризуется периодом полувыведения по меньшей мере приблизительно 100 ч. Согласно некоторым вариантам осуществления белок характеризуется повышенной степенью проникновения в ткань по сравнению с IgG к одному и тому же PSMA.

Согласно некоторым вариантам осуществления белок содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 140-152.

Согласно другому аспекту в настоящем документе представлена фармацевтическая композиция,

- 1 042513 содержащая (i) PSMA-нацеленный триспецифический белок в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов осуществления и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.

Также в настоящем документе представлены способы лечения индивидуума, нуждающегося в лечении рака, причем способ включает введение эффективного количества фармацевтической композиции или PSMA-нацеленных триспецифических белков в соответствии с любым из вышеупомянутых вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления рак представляет собой рак предстательной железы или рак почки.

Один вариант осуществления относится к PSMA-нацеленному триспецифическому белку, где указанный белок содержит (а) первый домен (А), который специфически связывается с CD3 человека; (b) второй домен (В), который представляет собой домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни; и (с) третий домен (С), который специфически связывается с PSMA, причем второй домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113-140. Согласно некоторым вариантам осуществления домены соединены в порядке H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH или посредством линкеров L1 и L2. Согласно некоторым вариантам осуществления первый домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-88. Согласно некоторым вариантам осуществления второй домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 89-112.

Один вариант осуществления относится к PSMA-нацеленному триспецифическому белку, где указанный белок содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 140-152. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный белок содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 150-152.

Один вариант осуществления относится к нацеленному на простатический специфический мембранный антиген (PSMA) триспецифическому белку, где указанный белок содержит (а) первый домен (А), который специфически связывается с CD3 человека; (b) второй домен (В), который представляет собой домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни; и (с) третий домен (С), который специфически связывается с PSMA, причем домены соединены в порядке H₂N-(C)-(B)-(A)-COOH или посредством линкеров L1 и L2, и причем третий домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113-140.

Один вариант осуществления относится к PSMA-нацеленному триспецифическому белку, где указанный белок содержит (а) первый домен (А), который специфически связывается с CD3 человека; (b) второй домен (В), который представляет собой домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни; и (с) третий домен (С), который специфически связывается с PSMA, причем домены соединены в порядке H₂N-(C)-(B)-(A)-COOH или посредством линкеров L1 и L2, и причем первый домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-88.

Один вариант осуществления относится к способу лечения рака предстательной железы, причем способ включает введение эффективного количества PSMA-нацеленного триспецифического белка, причем указанный белок содержит (а) первый домен (А), который специфически связывается с CD3 человека; (b) второй домен (В), который представляет собой домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни; и (с) третий домен (С), который специфически связывается с PSMA, причем домены соединены в порядке H2N-(C)-(B)-(A)-COOH или посредством линкеров L1 и L2, и причем третий домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113-140.

Один вариант осуществления относится к способу лечения рака предстательной железы, причем способ включает введение эффективного количества PSMA-нацеленного триспецифического белка, причем указанный белок содержит (а) первый домен (А), который специфически связывается с CD3 человека; (b) второй домен (В), который представляет собой домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни; и (с) третий домен (С), который специфически связывается с PSMA, причем домены соединены в порядке H2N-(C)-(B)-(A)-COOH или посредством линкеров L1 и L2, и причем первый домен содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-88.

Включение посредством ссылки

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.

Краткое описание чертежей

Новые признаки настоящего изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет обеспечено со ссылкой на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы настоящего изобретения, и прилагаемые чертежи.

Фиг. 1 представляет собой схематическое представление иллюстративного PMSA-нацеленного триспецифического антигенсвязывающего белка, где белок содержит константный коровый элемент, предусматривающий CD3ε-связывающий одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) и HSA-связывающую вариабельную область тяжелой цепи; и PMSA-связывающий домен, который может представлять собой VH, scFv, связывающий домен отличного от Ig типа или лиганд.

- 2 042513

На фиг. 2А-2С представлено сравнение способности иллюстративных PSMA-нацеленных триспецифических белков (PSMA-нацеленных молекул TriTAC) с разными показателями аффинности в отношении CD3 индуцировать Т-клетки к уничтожению клеток рака предстательной железы человека.

На фиг. 2А показаны результаты по уничтожению, обусловленному разными PMSA-нацеленными молекулами TriTAC в модели рака предстательной железы LNCaP.

На фиг. 2В показаны результаты по уничтожению, обусловленному разными PMSA-нацеленными молекулами TriTAC в модели рака предстательной железы 22Rv1.

На фиг. 2С показаны значения ЕС₅₀ для PMSA-нацеленных TriTAC в моделях рака предстательной железы LNCaP и 22Rv1.

На фиг. 3 показана концентрация в сыворотке крови PSMA-нацеленной TriTAC C236 у яванских макаков после i.v. введения (100 мкг/кг) в течение трех недель.

На фиг. 4 показана концентрация в сыворотке крови PSMA-нацеленных молекул TriTAC с разными показателями аффинности в отношении CD3 у яванских макаков после i.v. введения (100 мкг/кг) в течение трех недель.

На фиг. 5А-5С показана способность PSMA-нацеленных молекул TriTAC с разными показателями аффинности в отношении PSMA индуцировать Т-клетки к уничтожению клеточной линии рака предстательной железы человека LNCaP.

На фиг. 5А показаны результаты эксперимента, осуществляемого в отсутствие сывороточного альбумина человека, с PSMA-нацеленной BiTE в качестве положительного контроля.

На фиг. 5В показаны результаты эксперимента, осуществляемого в присутствии сывороточного альбумина человека, с PSMA-нацеленной BiTE в качестве положительного контроля.

На фиг. 5С показаны значения ЕС₅₀ для PMSA-нацеленной TriTAC в присутствии или в отсутствие HSA, с PSMA-нацеленной BiTE в качестве положительного контроля, в моделях рака предстательной железы LNCaP.

На фиг. 6 продемонстрирована способность PSMA-нацеленных молекул TriTAC ингибировать опухолевый рост клеток рака предстательной железы человека в эксперименте по ксенотрансплантации у мыши.

На фиг. 7A-7D проиллюстрирована специфичность молекул TriTAC в анализах уничтожения клеток с использованием линий клеток-мишеней, которые экспрессируют или не экспрессируют белок-мишень.

На фиг. 7А показаны результаты экспрессии EGFR и PSMA в клеточных линиях LNCaP, KMS12BM и OVCAR8.

На фиг. 7В показаны результаты по уничтожению опухолевых клеток LNCaP, обусловленному PSMA-нацеленными, EGFR-нацеленными TriTAC и TriTAC в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 7С показаны результаты по уничтожению опухолевых клеток KMS12BM, обусловленному PSMA-нацеленными, EGFR-нацеленными TriTAC и TriTAC в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 7D показаны результаты по уничтожению клеток OVCAR8, обусловленному PSMA-нацеленными, EGFR-нацеленными TriTAC и TriTAC в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 8A-8D показано влияние предварительной инкубации при 37°С и циклов замерзанияоттаивания на активность TriTAC.

На фиг. 8А показана активность PSMA TriTAC C235 после предварительной инкубации при 37°С или циклов замерзания-оттаивания.

На фиг. 8В показана активность PSMA TriTAC C359 после предварительной инкубации при 37°С или циклов замерзания-оттаивания.

На фиг. 8С показана активность PSMA TriTAC C360 после предварительной инкубации при 37°С или циклов замерзания-оттаивания.

На фиг. 8D показана активность PSMA TriTAC C361 после предварительной инкубации при 37°С или циклов замерзания-оттаивания.

На фиг. 9А, 9В показана активность PSMA-нацеленной молекулы TriTAC по настоящему раскрытию в анализах уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками посредством зависимой от Т-клеток клеточной цитотоксичности (TDCC).

На фиг. 9А показано влияние PSMA-нацеленной молекулы TriTAC на перенаправление мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) яванского макака, от донора-яванского макака G322, на уничтожение клеток LNCaP.

На фиг. 9В показано влияние PSMA-нацеленной молекулы TriTAC на перенаправление РВМС яванского макака, от донора-яванского макака D173, на уничтожение клеток MDAPCa2b.

На фиг. 10 показано влияние PSMA-нацеленной молекулы TriTAC по настоящему раскрытию на экспрессию маркеров активации Т-клеток CD25 и CD69.

На фиг. 11 показана способность PSMA-нацеленной молекулы TriTAC по настоящему раскрытию стимулировать пролиферацию Т-клеток в присутствии экспрессирующих PSMA клеток-мишеней.

На фиг. 12А, 12В показаны результаты по уничтожению перенаправленными Т-клетками клеток LnCaP, обусловленному PSMA-нацеленными молекулами TriTAC.

- 3 042513

На фиг. 12А показаны результаты по уничтожению перенаправленными Т-клетками клеток LnCaP, обусловленному молекулами PSMA PH1T TriTAC (SEQ ID NO: 150) и PSMA PHI TriTAC (SEQ ID NO: 151).

На фиг. 12В показаны результаты по уничтожению перенаправленными Т-клетками клеток LnCaP, обусловленному молекулами PSMA Z2 TriTAC (SEQ ID NO: 152).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

В настоящем документе описаны триспецифические белки, нацеленные на простатический специфический мембранный антиген (PSMA), фармацевтические композиции на их основе, а также нуклеиновые кислоты, рекомбинантные векторы экспрессии и клетки-хозяева для получения таких белков. Также представлены способы применения раскрытых PSMA-нацеленных триспецифических белков в предупреждении и/или лечении заболеваний, состояний и нарушений. PSMA-нацеленные триспецифические белки способны к специфическому связыванию с PSMA, а также CD3, и имеют домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, такой как домен, связывающийся с сывороточным альбумином человека (HSA). На фиг. 1 показан один неограничивающий пример триспецифического антигенсвязывающего белка.

Согласно одному аспекту PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен (А), который специфически связывается с CD3, домен (В), который специфически связывается с сывороточным альбумином человека (HSA), и домен (С), который специфически связывается с PSMA. Три домена в PSMA-нацеленных триспецифических белках расположены в любом порядке. Таким образом, предусматривается, что порядок доменов PSMA-нацеленных триспецифических белков является следующим:

H₂N-(A)-(B)-(C)-COOH H₂N-(A)-(C)-(B)-COOH, H₂N-(B)-(A)-(C)-COOH, H₂N-(B)-(C)-(A)-COOH, H₂N-(C)-(B)-(A)-COOH или H₂N-(C)-(A)-(B)-COOH.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки имеют порядок доменов H₂N-(A)-(B)-(C)-COOH. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки имеют порядок доменов H₂N-(A)-(C)-(B)-COOH. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки имеют порядок доменов H₂N-(B)-(A)-(C)-COOH. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки имеют порядок доменов H₂N-(B)-(C)-(A)-COOH. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки имеют порядок доменов H₂N-(C)-(B)-(A)-COOH. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки имеют порядок доменов H₂N-(C)-(A)-(B)-COOH.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат HSA-связывающий домен в виде среднего домена, так что порядок доменов является следующим H₂N-(A)-(B)-(C)-COOH или H₂N-(C)-(B)-(A)-COOH. Предусматривается, что согласно таким вариантам осуществления, в которых HSA-связывающий домен является средним доменом, CD3- и PSMA-связывающие домены характеризуются дополнительной гибкостью для связывания с их соответствующими мишенями.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, предусматривают полипептид с последовательностью, описанной в табл. 10 (SEQ ID NO: 140-152), и ее подпоследовательностями. Согласно некоторым вариантам осуществления триспецифический антигенсвязывающий белок содержит полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70-95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 10 (SEQ ID NO: 140-152). Согласно некоторым вариантам осуществления триспецифический антигенсвязывающий белок содержит полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 10 (SEQ ID NO: 140-152). Согласно некоторым вариантам осуществления триспецифический антигенсвязывающий белок имеет последовательность, содержащую по меньшей мере участок последовательности, описанной в табл. 10 (SEQ ID NO: 140-152). Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок содержит полипептид, содержащий одну или более из последовательностей, описанных в табл. 10 (SEQ ID NO: 140-152). Согласно еще одним вариантам осуществления PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок содержит одну или более CDR, как описано в последовательностях в табл. 10 (SEQ ID NO: 140-152).

PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, сконструированы с возможностью специфического нацеливания на экспрессирующие PSMA клетки за счет привлечения цитотоксических Т-клеток. Это улучшает эффективность по сравнению с ADCC (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью), при которой задействованы полноразмерные антитела, направленные на одиночный антиген, и при которой отсутствует возможность прямого привлечения ци- 4 042513 тотоксических Т-клеток. В отличие от этого, путем вовлечения молекул CD3, специфически экспрессируемых на поверхности этих клеток, PSMA-нацеленные триспецифические белки могут перекрестно связывать цитотоксические Т-клетки с экспрессирующими PSMA клетками высокоспецифическим образом, направляя тем самым цитотоксический потенциал Т-клетки в отношении клетки-мишени. PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, обеспечивают вовлечение цитотоксических Т-клеток посредством связывания с экспрессируемыми на поверхности белками CD3, которые образуют часть TCR. Одновременное связывание нескольких PSMA-триспецифических антигенсвязывающих белков с CD3 и с экспрессируемым на поверхности конкретных клеток PSMA обусловливает активацию Т-клеток и опосредует последующий лизис конкретной PSMA-экспрессирующей клетки. Таким образом, предусматривается, что PSMA-нацеленные триспецифические белки демонстрируют интенсивное, специфическое и эффективное уничтожение клетки-мишени. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, стимулируют уничтожение клетки-мишени за счет цитотоксических Т-клеток с целью устранения патогенных клеток (например, экспрессирующих PSMA опухолевых клеток). Согласно некоторым из таких вариантов осуществления клетки уничтожаются избирательно, за счет чего снижается вероятность токсичных побочных эффектов.

PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, обладают дополнительными терапевтическими преимуществами по сравнению с традиционными моноклональными антителами и другими биспецифическими молекулами меньшего размера. В целом, эффективность рекомбинантных белков в качестве фармацевтических средств в значительной степени зависит от естественных фармакокинетических параметров самого белка. Одно из таких преимуществ заключается в том, что PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, характеризуются увеличенным фармакокинетическим периодом полувыведения благодаря наличию домена с увеличенным временем полужизни, таким как специфический в отношении HSA домен. В этом отношении PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, характеризуются увеличенным периодом полувыведения из сыворотки крови, составляющим приблизительно 2, 3, приблизительно 5, приблизительно 7, приблизительно 10, приблизительно 12 или приблизительно 14 дней, согласно некоторым вариантам осуществления. Это отличает их от других связывающих белков, таких как молекулы BiTE или DART, которые характеризуются относительно значительно более коротким периодом полувыведения. Например, в случае слитой молекулы scFv-scFv в виде биспецифического антитела к CD19xCD3 формата BiTE требуется непрерывная внутривенная инфузионная (i.v.) доставка лекарственного средства из-за ее короткого периода полувыведения. Более продолжительный естественный период полувыведения PSMA-нацеленных триспецифических белков позволяет решить эту проблему, обеспечивая тем самым повышенный терапевтический потенциал, например, фармацевтические составы с низкими дозами, сокращенное периодическое введение и/или новые фармацевтические композиции. PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, также имеют оптимальный размер для усиленного проникновения в ткань и распределения в ткани. Более крупные размеры ограничивают или препятствуют проникновению или распределению белка в тканях-мишенях. PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, позволяют избежать этого благодаря маленькому размеру, который обеспечивает усиленное проникновение и распределение в ткани. Следовательно, согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, имеют размер от приблизительно 50 до приблизительно 80 кДа, от приблизительно 50 до приблизительно 75 кДа, от приблизительно 50 до приблизительно 70 кДа или от приблизительно 50 до приблизительно 65 кДа. Таким образом, размер PSMA-нацеленных триспецифических белков является преимущественным в сравнении с IgG-антителами, размер которых составляет приблизительно 150 кДа, и молекул диател BiTE и DART, размер которых составляет приблизительно 55 кДа, но время полужизни которых не увеличено, и, следовательно, они быстро выводятся почкой.

Согласно еще одним вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, имеют оптимальный размер для усиленного проникновения и распределения в ткани. Согласно таким вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки конструируют так, чтобы они были как можно меньшего размера, с сохранением при этом специфичности в отношении их мишеней. Следовательно, согласно таким вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, имеют размер от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа или от приблизительно 25 до приблизительно 35 кДа, до приблизительно 40 кДа, до приблизительно 45 кДа, до приблизительно 50 кДа, до приблизительно 55 кДа, до приблизительно 60 кДа, до приблизительно 65 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, имеют размер приблизительно 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, приблизительно 39, приблизительно 38, приблизительно 37, приблизительно 36, приблизительно 35, приблизительно 34, приблизительно33, приблизительно 32, приблизительно 31, приблизительно 30, приблизительно 29, приблизительно28, приблизительно 27, приблизительно 26, приблизительно 25, приблизительно 24, приблизительно23,

- 5 042513 приблизительно 22, приблизительно 21 или приблизительно 20 кДа. Иллюстративный подход к обеспечению маленького размера заключается в применении фрагментов однодоменных антител (sdAb) для каждого из доменов. Например, конкретный PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок содержит sdAb к CD3, sdAb к HSA и sdAb к PSMA. Это позволяет уменьшить размер иллюстративного PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка до 40 кДа. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления все домены PSMA-нацеленных триспецифических белков являются фрагментами однодоменных антител (sdAb). Согласно другим вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, содержат низкомолекулярные соединения (small molecule entity, SME), связывающие HSA и/или PSMA. Связывающие структуры SME являются малыми молекулами со средним размером от приблизительно 500 до 2000 Да, и их присоединяют к PSMA-нацеленным триспецифическим белкам с помощью известных способов, таких как лигирование с использованием сортазы или конъюгация. В таких случаях один из доменов PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка представляет собой последовательность распознавания для сортазы, например, LPETG (SEQ ID NO: 57). Для присоединения связывающей структуры SME к PSMAтриспецифическому антигенсвязывающему белку с последовательностью распознавания для сортазы белок инкубируют с сортазой и связывающей структурой SME, в результате чего сортаза обеспечивает присоединение связывающей структуры SME к последовательности распознавания. Известные связывающие структуры SME включают MIP-1072 и MIP-1095, которые связываются с простатическим специфическим мембранным антигеном (PSMA). Согласно еще одним вариантам осуществления домен PSMA-нацеленных триспецифических белков, описанных в настоящем документе, который связывается с PSMA, содержит пептид ноттин для связывания PSMA. Ноттины представляют собой стабилизированные дисульфидными связями пептиды со скэффолдом в виде цистеинового узла, и их средние размеры составляют приблизительно 3,5 кДа. Ноттины предусмотрены для связывания с определенными опухольассоциированными молекулами, такими как PSMA. Согласно еще одним вариантам осуществления домен PSMA-нацеленных триспецифических белков, описанных в настоящем документе, который связывается с PSMA, содержит естественный лиганд PSMA.

Другим признаком PSMA-нацеленных триспецифических белков, описанных в настоящем документе, является то, что они сконструированы в виде одного полипептида с гибкой связью между их доменами. Это позволяет легко получать и производить PSMA-нацеленные триспецифические белки, поскольку они могут кодироваться одной молекулой кДНК, без труда введенной в вектор. Кроме того, поскольку PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, являются мономерной одной полипептидной цепью, не возникает проблем со спариванием цепей или необходимости димеризации. Предусматривается, что PSMA-нацеленные триспецифические белки, описанные в настоящем документе, характеризуются сниженной склонностью к агрегации, в отличие от других известных молекул, таких как биспецифические белки с Fc-гамма иммуноглобулиновыми доменами.

В PSMA-нацеленных триспецифических белках, описанных в настоящем документе, домены соединены посредством внутренних линкеров L1 и L2, где L1 соединяет первый и второй домены PSMA-нацеленных триспецифических белков, a L2 соединяет второй и третий домены PSMA-нацеленных триспецифических белков. Линкеры L1 и L2 имеют оптимизированные длину и/или аминокислотный состав. Согласно некоторым вариантам осуществления линкеры L1 и L2 имеют одинаковые длину и аминокислотный состав. Согласно другим вариантам осуществления L1 и L2 отличаются. Согласно определенным вариантам осуществления внутренние линкеры L1 и/или L2 являются короткими, т.е. состоят из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков. Таким образом, в определенных случаях внутренние линкеры состоят из приблизительно 12 или менее аминокислотных остатков. В случае 0 аминокислотных остатков, внутренним линкером является пептидная связь. Согласно определенным вариантам осуществления внутренние линкеры L1 и/или L2 являются длинными, т.е. состоят из 15, 20 или 25 аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления такие внутренние линкеры состоят из от приблизительно 3 до приблизительно 15, например 8, 9 или 10, смежных аминокислотных остатков. Что касается аминокислотного состава внутренних линкеров L1 и L2, выбирают пептиды со свойствами, которые придают гибкость PSMA-нацеленным триспецифическим белкам, не затрагивают связывающие домены, а также являются устойчивыми к расщеплению протеазами. Например, как правило, глициновые и сериновые остатки обеспечивают устойчивость к протеазам. Примеры внутренних линкеров, подходящих для соединения доменов в составе PSMA-нацеленных триспецифических белков, включают, без ограничения, (GS)_n (SEQ ID NO: 153), (GGS)n (SEQ ID NO: 154), (GGGS)n (SEQ ID NO: 155), (GGSG)n (SEQ ID NO: 156), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 157) или (GGGGS)n (SEQ ID NO: 158), причем n равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Согласно одному варианту осуществления внутренний линкер L1 и/или L2 представляет собой (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 159) или (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 160).

CD3-связывающий домен.

Специфичность ответа Т-клеток опосредована распознаванием антигена (представленного в контексте главного комплекса гистосовместимости, МНС) TCR. Как часть TCR, CD3 представляет собой белковый комплекс, который включает цепь CD3y (гамма), цепь CD3δ (дельта) и две цепи CD3ε (эпси- 6 042513 лон), которые присутствуют на клеточной поверхности. CD3 связывается с цепями α (альфа) и β (бета)

TCR, а также CD3 ζ (зета), в совокупности образуя полный TCR. Кластеризация CD3 на поверхности Тклеток, например, посредством иммобилизированных антител к CD3, приводит к активации Т-клетки, аналогично ситуации с вовлечением Т-клеточного рецептора, но не зависит от его клональной специфичности.

Согласно одному аспекту описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывается с CD3. Согласно одному аспекту описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывается с CD3 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывается с CD3y. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывается с CD3δ. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывается с CD3ε.

Согласно еще одним вариантам осуществления описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывается с TCR. В определенных случаях описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывает α-цепь TCR. В определенных случаях описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, который специфически связывает β-цепь TCR.

Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен описанных в настоящем документе PSMA-нацеленных триспецифических белков характеризуется не только сильной аффинностью связывания CD3 в отношении CD3 человека, но также проявляет превосходную перекрестную реактивность с соответствующими белками CD3 яванского макака. В некоторых случаях CD3связывающий домен PSMA-нацеленных триспецифических белков характеризуется перекрестной реактивностью с CD3 яванского макака. В определенных случаях соотношения KD человека:K_D яванского макака для CD3 составляют от 5 до 0,2.

Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка может представлять собой любой домен, который связывается с CD3, включая, без ограничения, домены моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, антитела человека, гуманизированного антитела. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы CD3-связывающий домен происходил из того же вида, у которого в конечном итоге будет применяться PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок. Например, для применения у людей может быть предпочтительно, чтобы CD3-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка содержал остатки человека или гуманизированные остатки антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.

Таким образом, согласно одному аспекту антигенсвязывающий домен предусматривает гуманизированное антитело или антитело человека, или фрагмент антитела, или антитело мыши, или фрагмент антитела. Согласно одному варианту осуществления гуманизированный CD3-связывающий домен или CD3-связывающий белок человека содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющей комплементарность области 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области 3 легкой цепи (CDR3 LC) гуманизированного CD3-связывающего домена или CD3-связывающего домена человека, описанного в настоящем документе, и/или одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (CDR1 НС), определяющей комплементарность области 2 тяжелой цепи (CDR2 НС) и определяющей комплементарность области 3 тяжелой цепи (CDR3 НС) гуманизированного CD3-связывающего домена или CD3-связывающего домена человека, описанного в настоящем документе, например гуманизированного CD3-связывающего домена или CD3-связывающего домена человека, содержащего одну или более, например все три, CDR LC и одну или более, например все три, CDR НС.

Согласно некоторым вариантам осуществления гуманизированный CD3-связывающий домен или CD3-связывающий домен человека предусматривает гуманизированную вариабельную область легкой цепи или вариабельную область легкой цепи человека, специфическую в отношении CD3, где вариабельная область легкой цепи, специфическая в отношении CD3, предусматривает CDR легкой цепи человека или отличного от человека вида в каркасной области легкой цепи человека. В определенных случаях каркасная область легкой цепи представляет собой каркасную область легкой λ-(лямбда)-цепи. В других случаях каркасная область легкой цепи представляет собой каркасную область легкой к-(каппа)-цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления гуманизированный CD3-связывающий домен или CD3-связывающий домен человека предусматривает гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область тяжелой цепи человека, специфическую в отношении CD3, где вариабельная область тяжелой цепи, специфическая в отношении CD3, предусматривает CDR тяжелой цепи

- 7 042513 человека или отличного от человека вида в каркасной области тяжелой цепи человека.

В определенных случаях определяющие комплементарность области тяжелой цепи и/или легкой цепи происходят из известных антител к CD3, таких как, например, муромонаб-CD3 (OKT3), отеликсизумаб (TRX4), теплизумаб (MGA031), визилизумаб (Nuvion), SP34, TR-66 или Х35-3, VIT3, ВМА030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, М-Т301, SMC2, F101.01, UCHT-1 и WT-31.

Согласно одному варианту осуществления CD3-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в настоящем документе. В контексте настоящего документа одноцепочечный вариабельный фрагмент или scFv относится к фрагменту антитела, содержащему вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепей непрерывно соединены посредством короткого гибкого полипептидного линкера, и способному экспрессироваться в виде единой полипептидной цепи, и при этом scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он происходит. Согласно одному варианту осуществления CD3-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной, двумя или тремя модификациями (например, заменами), но не более чем с 30, 20 или 10 модификациями (например, заменами), аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в настоящем документе, или последовательности, характеризующейся 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной в настоящем документе; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной, двумя или тремя модификациями (например, заменами), но не более чем с 30, 20 или 10 модификациями (например, заменами), аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в настоящем документе, или последовательности, характеризующейся 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной в настоящем документе.

Согласно одному варианту осуществления гуманизированный CD3-связывающий домен или CD3-связывающий домен человека представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, соединена с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, посредством scFv-линкера. Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-scFv-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-scFv-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В некоторых случаях scFv, которые связываются с CD3, получают в соответствии с известными способами. Например, молекулы scFv могут быть получены путем соединения VH- и VL-областей вместе с применением гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат scFv-линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом. Следовательно, согласно некоторым вариантам осуществления длина scFv-линкера является такой, чтобы VH- или VL-домен был способен к межмолекулярной ассоциации с другим вариабельным доменом с образованием сайта связывания CD3. Согласно определенным вариантам осуществления такие scFv-линкеры являются короткими, т.е. состоят из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков. Таким образом, в определенных случаях scFv-линкеры состоят приблизительно из 12 или менее аминокислотных остатков. В случае 0 аминокислотных остатков scFv-линкером является пептидная связь. Согласно некоторым вариантам осуществления такие scFv-линкеры состоят приблизительно из 3-15, например 8, 9 или 10 смежных аминокислотных остатков. Что касается аминокислотного состава scFv-линкеров, выбирают пептиды, которые придает гибкость, не затрагивают вариабельные домены, а также обеспечивают межцепочечное сворачивание для соединения двух вариабельных доменов вместе с образованием функционального сайта связывания CD3. Например, scFv-линкеры, содержащие глициновые и сериновые остатки, как правило, обеспечивают устойчивость к протеазам. Согласно некоторым вариантам осуществления линкеры в scFv содержат глициновые и сериновые остатки. Аминокислотная последовательность scFv-линкеров может быть оптимизирована, например, с помощью способов фагового дисплея, с целью улучшения связывания CD3 и выхода продукта в виде scFv. Примеры пептидных scFv-линкеров, подходящих для соединения вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи в scFv, включают, без ограничения, (GS)_n (SEQ ID NO: 153), (GGS)_n (SEQ ID NO: 154), (GGGS)n (SEQ ID NO: 155), (GGSG)n (SEQ ID NO: 156), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 157) или (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 158), причем n равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Согласно одному варианту осуществления scFv-линкер может представлять собой (GGGGS)₄ (SEQ ID NO: 159) или (GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 160). Изменение длины линкера может обеспечить сохранение или повышение активности, способствуя превосходной эффективности в исследованиях активности.

Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка характеризуется аффинностью в отношении CD3

- 8 042513 на поверхности экспрессирующих CD3 клеток с KD 1000 нМ или менее, 500 нМ или менее, 200 нМ или менее, 100 нМ или менее, 80 нМ или менее, 50 нМ или менее, 20 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5 нМ или менее, 1 нМ или менее или 0,5 нМ или менее. Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка характеризуется аффинностью в отношении CD3ε, γ или δ с KD 1000 нМ или менее, 500 нМ или менее, 200 нМ или менее, 100 нМ или менее, 80 нМ или менее, 50 нМ или менее, 20 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5 нМ или менее, 1 нМ или менее или 0,5 нМ или менее. Согласно еще одним вариантам осуществления CD3-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка характеризуется низкой аффинностью в отношении CD3, т.е. приблизительно 100 нМ или более.

Аффинность связывания с CD3 можно определять, например, по способности самого PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка или его CD3-связывающего домена связываться с CD3, которым покрыт планшет для анализа; представленным на клеточной поверхности микроорганизма; в растворе и т.д. Активность связывания самого PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка или его CD3-связывающего домена по настоящему раскрытию с CD3 можно анализировать путем иммобилизации лиганда (например, CD3) или самого PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка или его CD3-связывающего домена на грануле, субстрате, поверхности клетки и т.д. В соответствующий буфер можно добавлять определенные средства, и партнеры по связыванию можно инкубировать в течение определенного периода времени при заданной температуре. После промывок с целью удаления несвязавшегося материала связанный белок может быть высвобожден с помощью, например, SDS, буферов с высоким рН и т.д. и подвержен анализу, например, с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают полипептид с последовательностью, описанной в табл. 7 (SEQ ID NO: 188), и ее подпоследовательностями. Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70-95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 7 (SEQ ID NO: 1-88). Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 7 (SEQ ID NO: 1-88). Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен имеет последовательность, содержащую по меньшей мере участок последовательности, описанной в табл. 7 (SEQ ID NO: 1-88). Согласно некоторым вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает полипептид, содержащий одну или более из последовательностей, описанных в табл. 7 (SEQ ID NO: 1-88).

Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает scFv с CDR1 тяжелой цепи, предусматривающей SEQ ID NO: 16 и 22-33. Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает scFv с CDR2 тяжелой цепи, предусматривающей SEQ ID NO: 17 и 34-43. Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает scFv с CDR3 тяжелой цепи, предусматривающей SEQ ID NO: 18 и 44-53. Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает scFv с CDR1 легкой цепи, предусматривающей SEQ ID NO: 19 и 54-66. Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает scFv с CDR2 легкой цепи, предусматривающей SEQ ID NO: 20 и 67-79. Согласно определенным вариантам осуществления CD3-связывающий домен предусматривает scFv с CDR3 легкой цепи, предусматривающей SEQ ID NO: 21 и 80-86.

Домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни.

В настоящем документе предусмотрены домены, которые обеспечивают увеличение времени полужизни антигенсвязывающего домена. Предусматривается, что такие домены включают, без ограничения, HSA-связывающие домены, Fc-домены, малые молекулы и другие известные в данной области домены, обеспечивающие увеличение времени полужизни.

Сывороточный альбумин человека (HSA) (молекулярная масса ~67 кДа) является наиболее распространенным белком в плазме крови, присутствующим в количестве приблизительно 50 мг/мл (600 мкМ), и у людей характеризуется временем полужизни около 20 дней. HSA служит для поддержания рН плазмы крови, влияет на онкотическое кровяное давление, выполняет функции переносчика многих метаболитов и жирных кислот и служит основным белковым транспортером лекарственных средств в плазме крови.

Нековалентная связь с альбумином обеспечивает увеличение периода полувыведения короткоживущих белков. Например, рекомбинантное слияние альбумин-связывающего домена с Fab-фрагментом обеспечивает 25- и 58-кратное снижение клиренса и 26- и 37-кратное увеличение времени полужизни in vivo при внутривенном введении мышам и кроликам по сравнению с введением Fab-фрагмента отдельно. Согласно другому примеру, в случае ацилирования инсулина жирными кислотами для содействия связывания с альбумином, при подкожной инъекции кроликам и свиньям наблюдали продолжительный эффект. В совокупности эти исследования демонстрируют взаимосвязь между связыванием с альбумином и пролонгированным действием.

- 9 042513

Согласно одному аспекту описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки содержат домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, например домен, который специфически связывается с HSA. Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка может представлять собой любой домен, который связывается с HSA, включая, без ограничения, домены моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, антитела человека, гуманизированного антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), однодоменное антитело, как, например, вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) однодоменного антитела, происходящего от представителя верблюдовых, пептид, лиганд, или низкомолекулярное соединение, специфические в отношении HSA. Согласно определенным вариантам осуществления HSA-связывающий домен представляет собой однодоменное антитело. Согласно другим вариантам осуществления HSA-связывающий домен представляет собой пептид. Согласно еще одним вариантам осуществления HSA-связывающий домен представляет собой малую молекулу. Предусматривается, что HSA-связывающий домен PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка является относительно небольшим и весит не более 25 кДа, не более 20 кДа, не более 15 кДа или не более 10 кДа согласно некоторым вариантам осуществления. В определенных случаях размер HSA-связывающего домена составляет 5 кДа или менее, если он представляет собой пептид или низкомолекулярное соединение.

Домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка обеспечивает измененные фармакодинамические и фармакокинетические параметры самого PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка. Как упоминалось выше, домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, обеспечивает увеличение периода полувыведения. Домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, также обеспечивает изменение фармакодинамических свойств, включая изменение распределения, проникновения и диффузии триспецифического антигенсвязывающего белка в тканях. Согласно некоторым вариантам осуществления домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, обеспечивает улучшенное нацеливание на ткань (включая опухоль), распределение в ткани, проникновение в ткань, диффузию в пределах ткани, и повышенную эффективность в сравнении с белком без домена, обеспечивающего увеличение времени полужизни. Согласно одному варианту осуществления в терапевтических способах успешно и эффективно используется сниженное количество триспецифического антигенсвязывающего белка, что обусловливает сниженное проявление побочных эффектов, такое как сниженная цитотоксичность в отношении неопухолевых клеток.

Кроме того, аффинность связывания домена, обеспечивающего увеличение времени полужизни, может быть выбрана для управления специфическим периодом полувыведения конкретного триспецифического антигенсвязывающего белка. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, характеризуется высокой аффинностью связывания. Согласно другим вариантам осуществления домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, характеризуется средней аффинностью связывания. Согласно еще одним вариантам осуществления домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, характеризуется низкой или минимальной аффинностью связывания. Иллюстративные показатели аффинности связывания включают Kd при концентрациях 10 нМ или менее (высокая), от 10 до 100 нМ (средняя) и более 100 нМ (низкая). Как упоминалось выше, показатели аффинности связывания для HSA определяют с помощью известных способов, таких как метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают полипептид с последовательностью, описанной в табл. 8 (SEQ ID NO: 89-112), и ее подпоследовательностями. Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен предусматривает полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70-95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 8 (SEQ ID NO: 89-112). Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен предусматривает полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 8 (SEQ ID NO: 89-112). Согласно некоторым вариантам осуществления HSAсвязывающий домен имеет последовательность, содержащую по меньшей мере участок последовательности, описанной в табл. 8 (SEQ ID NO: 89-112). Согласно некоторым вариантам осуществления HSAсвязывающий домен предусматривает полипептид, содержащий одну или более из последовательностей, описанных в табл. 8 (SEQ ID NO: 89-112).

Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают однодоменное антитело с CDR1, предусматривающей SEQ ID NO: 96 и 99-101. Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают однодоменное антитело с CDR1, предусматривающей SEQ ID NO: 97 и 102-107. Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают однодоменное антитело с CDR1, предусматривающей SEQ ID NO: 98, 108 и 109.

- 10 042513

Домен, связывающий простатический специфический мембранный антиген (PSMA).

Простатический специфический мембранный антиген (PSMA) представляет собой мембранный гликопротеин типа II размером 100 кДа, экспрессируемый в тканях предстательной железы, характеризующийся идентичностью последовательности с рецептором трансферрина с NAALAD-азной активностью. PSMA экспрессируется в повышенных количествах при раке предстательной железы, и повышенные уровни PSMA также можно выявить в сыворотке крови таких пациентов. Уровень экспрессии PSMA повышается по мере прогрессирования заболевания, становясь наиболее высоким при метастатическом гормонально-рефрактерном заболевании, для которого в настоящее время не существует терапии.

Помимо описанных CD3-связывающего и обеспечивающего увеличение времени полужизни доменов, описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки также содержат домен, который связывается с PSMA. Конструкция описанных в настоящем документе PSMA-нацеленных триспецифических белков обеспечивает гибкость PSMA-связывающего домена, так что PSMA-связывающий домен может представлять собой связывающий домен любого типа, включая, без ограничения, домены моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, антитела человека, гуманизированного антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), однодоменное антитело, как, например, вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) однодоменного антитела, происходящего от представителя верблюдовых. Согласно другим вариантам осуществления PSMA-связывающий домен представляет собой связывающий домен отличного от Ig типа, т.е. имитатор антитела, как, например, антикалины, аффилины, молекулы аффител, аффимеры, аффитины, альфатела, авимеры, DARP-ины, финомеры, пептиды домена Кунитца и монотела. Согласно еще одним вариантам осуществления PSMA-связывающий домен представляет собой лиганд или пептид, который связывается или ассоциируется с PSMA. Согласно еще одним вариантам осуществления PSMA-связывающий домен представляет собой ноттин. Согласно еще одним вариантам осуществления PSMA-связывающий домен представляет собой низкомолекулярное соединение.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен предусматривает нижеследующую формулу: f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4, причем r1, r2 и r3 являются определяющими комплементарность областями CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, a f1, f2, f3 и f4 являются каркасными остатками, причем r1 предусматривает SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 или SEQ ID NO: 125; r2 предусматривает SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 или SEQ ID NO: 126 и r3 предусматривает SEQ ID NO: 124 или SEQ ID NO: 127.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, где (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX₁YX₂MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX4X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY). Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотные остатки X_b X₂, Х₃, X₄, X₅, Х₆ и Х₇ независимо выбраны из глутаминовой кислоты, пролина, серина, гистидина, треонина, аспарагиновой кислоты, глицина, лизина, треонина, глутамина и тирозина. Согласно некоторым вариантам осуществления X₁ представляет собой пролин. Согласно некоторым вариантам осуществления Х₂ представляет собой гистидин. Согласно некоторым вариантам осуществления Х3 представляет собой аспарагиновую кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления Х4 представляет собой лизин. Согласно некоторым вариантам осуществления X₅ представляет собой глутамин. Согласно некоторым вариантам осуществления Х₆ представляет собой тирозин. Согласно некоторым вариантам осуществления Х₇ представляет собой серин. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий белок по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х2 представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х₄ представляет собой глицин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х₇ представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX₁YX₂MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем X₁ представляет собой пролин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем Х₅ представляет собой глутамин.

- 11 042513

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX₂MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем Х₆ представляет собой тирозин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем Х4 представляет собой лизин и Х7 представляет собой серин. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х₄ представляет собой лизин и Х₇ представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем X1 представляет собой пролин, Х2 представляет собой гистидин, Х3 представляет собой аспарагиновую кислоту и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX₇YGY), причем Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, X₅ представляет собой глутамин и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем Х2 представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х₆ представляет собой тирозин и Х₇ представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, причем (а) аминокислотная последовательность CDR1 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 162 (RFMISX1YX2MH); (b) аминокислотная последовательность CDR2 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 163 (X₃INPAX₄X₅TDYAEX₆VKG); и (с) аминокислотная последовательность CDR3 является такой, как представлено в SEQ ID NO: 164 (DX7YGY), причем Х2 представляет собой гистидин, Х3 представляет собой аспарагиновую кислоту и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х2 представляет собой гистидин, Х3 представляет собой треонин, Х4 представляет собой глицин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой серин. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой треонин, Х₄ представляет собой глицин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х2 представляет собой серин, Х3 представляет собой треонин, Х4 представляет собой лизин, Х₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой пролин, Х₂ представляет собой серин, Х₃ представляет собой треонин, Х4 представляет собой глицин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х₇ представляет собой глицин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскры- 12 042513 тию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х₂ представляет собой серин, Х₃ представляет собой треонин, Х₄ представляет собой глицин, X₅ представляет собой глутамин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой глицин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х₂ представляет собой серин, Х₃ представляет собой треонин, Х₄ представляет собой глицин, Х₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой тирозин и Х7 представляет собой глицин. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X₁ представляет собой глутаминовую кислоту, Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х₄ представляет собой лизин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой пролин, Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х₄ представляет собой глицин, Х₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х₄ представляет собой глутамин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой серин и Х7 представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем X1 представляет собой глутаминовую кислоту, Х₂ представляет собой гистидин, Х₃ представляет собой аспарагиновую кислоту, Х4 представляет собой глицин, X₅ представляет собой треонин, Х₆ представляет собой тирозин и Х₇ представляет собой серин.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающий домен по настоящему раскрытию может содержать последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем Х₂ представляет собой гистидин и Х7 представляет собой серин. Иллюстративные каркасные последовательности раскрыты как SEQ ID NO: 165-168.

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают полипептид с последовательностью, описанной в табл. 9 (SEQ ID NO: 113-140), и ее подпоследовательностями. Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен предусматривает полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70-95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 9 (SEQ ID NO: 113-140). Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен предусматривает полипептид, характеризующийся по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более гомологией с последовательностью, описанной в табл. 9 (SEQ ID NO: 113-140).

Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен имеет последовательность, содержащую по меньшей мере участок последовательности, описанной в табл. 9 (SEQ ID NO: 113-140). Согласно некоторым вариантам осуществления HSA-связывающий домен предусматривает полипептид, содержащий одну или более из последовательностей, описанных в табл. 9 (SEQ ID NO: 113-140).

Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают однодоменное антитело с CDR1, предусматривающей SEQ ID NO: 114-116 и 125. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают однодоменное антитело с CDR1, предусматривающей SEQ ID NO: 117-123 и 126. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-связывающие домены, описанные в настоящем документе, предусматривают однодоменное антитело с CDR1, предусматривающей SEQ ID NO: 124 и 127.

Модификации PSMA-триспецифических белков.

Описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки охватывают производные или аналоги, в которых (i) аминокислота заменена аминокислотным остатком, который не кодируется в соответствии с генетическим кодом, (ii) зрелый полипептид слит с другим соединением, таким как полиэтиленгликоль, или (iii) дополнительные аминокислоты слиты с белком, как, например, лидерная последовательность, или последовательность сигнала секреции, или последовательность для очистки белка.

Типичные модификации включают, без ограничения, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование кова- 13 042513 лентных сшивок, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование, и убиквитинирование.

Модификации выполняют в любой части описанных в настоящем документе PSMA-нацеленных триспецифических белков, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбокси-концы. Определенные распространенные модификации пептида, которые являются пригодными для модификации PSMA-нацеленных триспецифических белков, включают гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование, блокировку амино- или карбоксильной группы в полипептиде, или обоих, посредством ковалентной модификации, и АДФ-рибозилирование.

Полинуклеотиды, кодирующие PSMA-нацеленные триспецифические белки.

Также согласно некоторым вариантам осуществления представлены молекулы полинуклеотидов, кодирующие описанный в настоящем документе PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок. Согласно некоторым вариантам осуществления молекулы полинуклеотидов представлены в виде ДНКконструкции. Согласно другим вариантам осуществления молекулы полинуклеотидов представлены в виде транскрипта матричной РНК.

Молекулы полинуклеотидов конструируют с помощью известных способов, например, путем объединения генов, кодирующих три связывающих домена, либо в разделенном посредством пептидных линкеров виде, либо, согласно другим вариантам осуществления, непосредственно соединенных пептидной связью, в единой генетической конструкции, функционально связанной с подходящим промотором, и необязательно подходящим терминатором транскрипции, и экспрессии в клетках бактерий или другой соответствующей системе экспрессии, такой как, например, клетки СНО. Согласно вариантам осуществления, в которых PSMA-связывающий домен представляет собой малую молекулу, полинуклеотиды предусматривают гены, кодирующие CD3-связывающий домен и домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни. Согласно вариантам осуществления, в которых домен, обеспечивающий увеличение времени полужизни, представляет собой малую молекулу, полинуклеотиды предусматривают гены, кодирующие домены, которые связываются с CD3 и PSMA. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина можно применять любое число подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Промотор выбирают так, чтобы он управлял экспрессией полинуклеотида в соответствующей клетке-хозяине.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотид вставляют в вектор, предпочтительно вектор экспрессии, который является дополнительным вариантом осуществления. Такой рекомбинантный вектор может быть сконструирован в соответствии с известными способами. Представляющие особый интерес векторы включают плазмиды, фагмиды, производные фагов, вирусы (например, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, лентивирусы и т.д.) и космиды.

Ряд систем вектор экспрессии/хозяин можно использовать для содержания и экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид описанного триспецифического антигенсвязывающего белка. Примерами векторов экспрессии для экспрессии в E.coli являются pSKK (Le Gall et al., J. Immunol. Methods. (2004), 285(1):111-27) или pcDNA5 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих.

Таким образом, PSMA-нацеленные триспецифические белки, как описано в настоящем документе, согласно некоторым вариантам осуществления получают путем введения в клетку-хозяин вектора, кодирующего белок, как описано выше, и культивирования указанной клетки-хозяина в условиях, в которых белковые домены экспрессируются, могут быть выделены и, необязательно, дополнительно очищены.

Фармацевтические композиции.

Согласно некоторым вариантам осуществления также представлены фармацевтические композиции, содержащие описанный в настоящем документе PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок, вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид PSMA-нацеленных триспецифических белков, или клетку-хозяина, трансформированную таким вектором, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

Термин фармацевтически приемлемый носитель включает, без ограничения, любой носитель, который не воздействует негативным образом на эффективность биологической активности ингредиентов и который не токсичен для пациента, которому его вводят. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области и включают забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих веществ, стерильные растворы и т.д. Такие носители могут быть составлены с помощью традиционных способов и могут быть введены субъекту в подходящей дозе. Предпочтительно композиции являются стерильными. Такие композиции также могут содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, эмульгирующие вещества и диспергирующие вещества. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено включением различных антибактериальных и противогрибковых средств.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтических композиций описанные в на- 14 042513 стоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки инкапсулированы в наночастицы. Согласно некоторым вариантам осуществления наночастицы представляют собой фуллерены, жидкие кристаллы, липосому, квантовые точки, суперпарамагнитные наночастицы, дендримеры или наностержни. Согласно другим вариантам осуществления фармацевтических композиций PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок присоединен к липосомам. В некоторых случаях PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок конъюгирован с поверхностью липосом. В некоторых случаях PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок инкапсулирован в оболочку липосомы. В некоторых случаях липосома представляет собой катионную липосому.

Описанные в настоящем документе PSMA-нацеленные триспецифические белки предусмотрены для применения в качестве лекарственного препарата. Введение выполняют различными путями, например путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. Согласно некоторым вариантам осуществления путь введения зависит от типа терапии и типа соединения, содержащегося в фармацевтической композиции. Схема применения будет определена лечащим врачом и с учетом других клинических факторов. Дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное соединение, подлежащее введению, продолжительность и путь введения, тип терапии, общее состояние здоровья и другие вводимые одновременно лекарственные средства. Эффективная доза относится к количествам активного ингредиента, которые являются достаточными для воздействия на течение и тяжесть заболевания, что приводит к уменьшению интенсивности или ремиссии такой патологии, и они могут быть определены с применением известных способов.

Способы лечения.

Согласно некоторым вариантам осуществления также в настоящем документе представлены способы и варианты применения стимуляции иммунной системы у нуждающегося в этом индивидуума, предусматривающие введение описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. В некоторых случаях введение описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка обеспечивает индукцию и/или поддержание цитотоксичности в отношении экспрессирующей PSMA клетки. В некоторых случаях экспрессирующая PSMA клетка представляет собой раковую клетку.

Также в настоящем документе представлены способы и варианты применения для лечения заболевания, нарушения или состояния, ассоциированных с PSMA, предусматривающие введение нуждающемуся в этом индивидууму описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Заболевания, нарушения или состояния, ассоциированные с PSMA, включают, без ограничения, пролиферативное заболевание или опухолевое заболевание. Согласно одному варианту осуществления заболевание, нарушение или состояние, ассоциированные с PSMA, представляют собой рак предстательной железы. Согласно другому варианту осуществления заболевание, нарушение или состояние, ассоциированные с PSMA, представляют собой рак почки.

Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы на поздней стадии. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является резистентным к лекарственным средствам. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является резистентным к антиандрогенным препаратам. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является метастатическим. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является метастатическим и резистентным к лекарственным средствам (например, резистентным к антиандрогенным препаратам). Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является кастрационнорезистентным. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является метастатическим и кастрационно-резистентным. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является резистентным к энзалутамиду. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является резистентным к энзалутамиду и абиратерону. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является резистентным к энзалутамиду, абиратерону и бикалутамиду. Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы является резистентным к доцетакселу. Согласно некоторым из этих вариантов осуществления рак предстательной железы является резистентным к энзалутамиду, абиратерону, бикалутамиду и доцетакселу.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка обеспечивает ингибирование роста клеток рака предстательной железы; обеспечивает ингибирование миграции клеток рака предстательной железы; обеспечивает ингибирование инвазии клеток рака предстательной железы; обеспечивает уменьшение интенсивности симптомов рака предстательной железы; обеспечивает уменьшение размера раковой опухоли предстательной железы; обеспечивает уменьшение числа раковых опухолей предстательной железы; обеспечивает уменьшение числа клеток рака предстательной железы; индуцирует некроз, пироптоз, онкоз, апоптоз, аутофагию или другой механизм гибели клеток рака предстательной железы; или обеспечивает усиление терапевтических эффектов соединения, выбранного из группы, состоящей из энзалутамида, абиратерона, доцетаксела, бикалутамида и любых их комбинаций.

- 15 042513

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает ингибирование роста клеток рака предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает ингибирование миграции клеток рака предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает ингибирование инвазии клеток рака предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает уменьшение интенсивности симптомов рака предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает уменьшение размера раковой опухоли предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает уменьшение числа раковых опухолей предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает уменьшение числа клеток рака предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает индуцирование некроза, пироптоза, онкоза, апоптоза, аутофагии или другого механизма гибели клеток рака предстательной железы за счет введения описанного в настоящем документе PSMA-нацеленного триспецифического белка.

В контексте настоящего документа согласно некоторым вариантам осуществления лечение, или осуществление лечения, или подвергнутый лечению относится к терапевтическому лечению, при котором целью является замедление (облегчение) течения нежелательного физиологического состояния, нарушения или заболевания или получение благоприятных или требуемых клинических результатов. Для описанных в настоящем документе целей благоприятные или требуемые клинические результаты включают, без ограничения, ослабление симптомов; уменьшение степени выраженности состояния, нарушения или заболевания; стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) течения состояния, нарушения или заболевания; задержку проявления или замедление прогрессирования состояния, нарушения или заболевания; облегчение течения состояния, нарушения или заболевания и ремиссию (частичную или полную), не зависимо от того, является она выявляемой или невыявляемой, или повышение положительных показателей или улучшение течения состояния, нарушения или заболевания. Лечение включает стимуляцию клинически значимого ответа без чрезмерных уровней побочных эффектов. Лечение также включает продление выживания по сравнению с ожидаемым выживанием в случае отсутствия получения лечения. Согласно другим вариантам осуществления лечение, или осуществление лечения, или подвергнутый лечению относится к профилактическим мерам, при которых целью является задержка проявления или снижение тяжести нежелательного физиологического состояния, нарушения или заболевания, например, у лица с предрасположенностью к заболеванию (например, индивидуума, который является носителем генетического маркера заболевания, такого как рак предстательной железы).

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе способов PSMA-нацеленные триспецифические белки вводят в комбинации со средством для лечения конкретного заболевания, нарушения или состояния. Средства включают, без ограничения, виды терапии с вовлечением антител, малых молекул (например, химиотерапевтических препаратов), гормонов (стероидных, пептидных и т.д.), виды лучевой терапии (γ-излучение, рентгеновское излучение и/или направленная доставка радиоизотопов, микроволновое излучение, УФ-излучение и т.д.), виды генной терапии (например, антисмысловая, ретровирусная терапия и т.д.), а также виды иммунотерапии. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки вводят в комбинации с противодиарейными средствами, противорвотными средствами, анальгетиками, опиоидами и/или нестероидными противовоспалительными средствами. Согласно некоторым вариантам осуществления PSMA-нацеленные триспецифические белки вводят до, во время или после хирургического вмешательства.

Некоторые определения.

В контексте настоящего документа термин период полувыведения применяется в его обычном значении, как описано в Goodman and Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (под ред. Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, and Alfred Gilman, 6-е изд., 1980). Вкратце, указанный термин охватывает количественное измерение времени выведения лекарственного средства. Выведение большинства лекарственных средств является экспоненциальным (т.е. соответствует кинетике первого порядка), поскольку концентрации лекарственного средства обычно не достигают таковых, требуемых для насыщения процесса выведения. Скорость экспоненциального процесса может быть выражена его константой скорости k, которая выражает относительное изменение за единицу времени, или его полупериодом ti/₂, промежутком времени, необходимым для 50% завершения процесса. Единицами этих двух констант являются время^-1 и время соответственно. Константа скорости первого порядка и полупериод реак

- 16 042513 ции связаны простым соотношением (kxt_1/2=0,693) и могут соответственно быть взаимозаменяемыми. Поскольку кинетика выведения первого порядка предусматривает, что постоянная доля лекарственного средства теряется за единицу времени, график зависимости логарифма концентрации лекарственного средства от времени является линейным во все моменты времени после начальной фазы распределения (т.е. после всасывания лекарственного средства и завершения распределения). Полупериод выведения лекарственного средства может быть точно определен из такого графика.

В контексте настоящего документа фраза рак предстательной железы или рак предстательной железы на поздней стадии включает класс форм рака предстательной железы, при котором происходит прогрессирование после ранних стадий заболевания. Как правило, формы рака предстательной железы на поздней стадии ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. Типы рака предстательной железы на поздней стадии включают, без ограничения, метастатический рак предстательной железы, резистентный к лекарственным средствам рак предстательной железы, такой как резистентный к антиандрогенам рак предстательной железы (например, резистентный к энзалутамиду рак предстательной железы, резистентный к абиратерону рак предстательной железы, резистентный к бикалутамиду рак предстательной железы и т.д.), гормонально-рефрактерный рак предстательной железы, кастрационно-резистентный рак предстательной железы, метастатический кастрационно-резистентный рак предстательной железы, резистентный к доцетакселу рак предстательной железы, индуцированный сплайс-вариантом-7 андрогенового рецептора (AR-V7) резистентный к лекарственным средствам рак предстательной железы, такой как AR-V7-индуцированный резистентный к антиандрогенам рак предстательной железы (например, AR-V7индуцированный резистентный к энзалутамиду рак предстательной железы), индуцированный членом 3 альдокеторедуктаз семейства 1 (AKR1C3) резистентный к лекарственным средствам рак предстательной железы, такой как AKR1C3-индуцированный резистентный к антиандрогенам рак предстательной железы (например, AKR1C3-индуцированный резистентный к энзалутамиду рак предстательной железы), и их комбинации. В некоторых случаях для форм рака предстательной железы на поздней стадии вовсе не наблюдалось ответа, или они были резистентными к лечению одним или несколькими из следующих традиционных терапевтических препаратов против рака предстательной железы: энзалутамид, абиратерон, бикалутамид и доцетаксел. Представлены соединения, композиции и способы по настоящему раскрытию для лечения рака предстательной железы, такого как рак предстательной железы на поздней стадии, включая любой один или более (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более) типов рака предстательной железы на поздней стадии, раскрытых в настоящем документе.

Примеры

Пример 1. Способы оценки связывания и цитотоксической активности триспецифических антигенсвязывающих молекул.

Получение белка.

Последовательности триспецифических молекул, которым предшествует лидерная последовательность и после которых следует 6х гистидиновая метка (SEQ ID NO: 161), клонировали в вектор экспрессии pcDNA 3.4 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих. Клетки Expi293F (Life Technologies A14527) поддерживали в суспензии в колбах Optimum Growth (Thomson) в количестве от 0,2 до 8х1е6 клеток/мл в среде Expi293. Клетки Expi293 трансфицировали очищенной плазмидной ДНК в соответствии с протоколами набора для системы экспрессии Expi293 (Life Technologies, А14635) и поддерживали в течение 4-6 дней после трансфекции. Кондиционированную среду частично очищали с помощью аффинной и высаливающей хроматографии. Триспецифические белки затем очищали с помощью ионообменного метода или, в качестве альтернативы, концентрировали с использованием фильтров для ультрацентрифугирования Amicon (EMD Millipore), вносили в среду для эксклюзионной хроматографии Superdex 200 (GE Healthcare) и разделяли в нейтральном буфере, содержащем вспомогательные вещества. Фракции объединяли и конечную чистоту оценивали с помощью SDS-PAGE и аналитической SEC.

Измерения аффинности.

Показатели аффинности для всех молекул связывающих доменов измеряли с помощью интерферометрии биослоя с применением прибора Octet.

Показатели аффинности в отношении PSMA измеряли путем нагрузки белка PSMA-Fc человека (100 нМ) на биосенсоры с Fc к IgG человека в течение 120 с, с последующим 60-секундным измерением исходного уровня, после чего события связывания измеряли путем инкубирования кончика сенсора в сериях разведений триспецифических молекул в течение 180 с, с последующей диссоциацией в течение 50 с. Показатели аффинности в отношении EGFR и CD3 измеряли путем нагрузки белка EGFR-Fc человека или белка CD3-Flag-Fc человека соответственно (100 нМ) на биосенсоры с Fc к IgG человека в течение 120 с, с последующим 60-секундным измерением исходного уровня, после чего события связывания измеряли путем инкубирования кончика сенсора в сериях разведений триспецифических молекул в течение 180 с, с последующей диссоциацией в течение 300 с. Показатели аффинности в отношении сывороточного альбумина человека (HSA) измеряли путем нагрузки биотинилированного альбумина на стрептавидиновые биосенсоры, затем измеряли те же параметры кинетики, что и в случае измерений аффин- 17 042513 ности в отношении CD3. Все стадии осуществляли при 30°С в 0,25% казеине в забуференном фосфатом солевом растворе.

Анализы цитотоксичности.

Анализ зависимой от Т-клеток человека клеточной цитотоксичности (TDCC) применяли для измерения способности привлекающих Т-клетки активаторов, включая триспецифические молекулы, направлять Т-клетки на уничтожение опухолевых клеток (Nazarian et al. 2015. J. Biomol. Screen. 20:519-27). В этом анализе Т-клетки и клетки-мишени раковой клеточной линии смешивали вместе в соотношении 10:1 в 384-луночном планшете, и добавляли различные количества привлекающего Т-клетки активатора. Спустя 48 ч Т-клетки вымывали, оставляя прикрепленные к планшету клетки-мишени, которые не были уничтожены Т-клетками. Для количественного определения оставшихся живых клеток применяли люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega). В некоторых случаях клеткимишени были сконструированы для экспрессии люциферазы. В таких случаях жизнеспособность клетокмишеней оценивали путем осуществления люминесцентного люциферазного анализа с использованием реагента STEADYGLO® (Promega), в котором жизнеспособность прямо пропорциональна уровню активности люциферазы.

Анализы стабильности.

Стабильность триспецифических связывающих белков оценивали при низких концентрациях в присутствии сыворотки крови отличного от человека примата. TriTAC разводили до 33 мкг/мл в сыворотке крови яванского макака (BioReclamationIVT) и либо инкубировали в течение 2 дней при 37°С, либо подвергали пяти циклам замерзания-оттаивания. После обработки образцы оценивали в анализах цитотоксичности (TDCC) и их остаточную активность сравнивали с необработанными исходными растворами.

Анализы ксенотрансплантатов.

Эффективность триспецифических связывающих белков in vivo оценивали в экспериментах с ксенотрансплантатами (Crown Bioscience, Тайцан). Мышам NOD/SCID, дефицитным по общей гамма-цепи (NCG, Центр исследований на модельных животных Нанкинского университета, (Model Animal Research Center of Nanjing University)) в день 0 инокулировали смесь 5е6 клеток рака предстательной железы человека 22Rv1 и 5е6 покоящихся Т-клеток человека, которые были выделены из организма здорового донора-человека. Мышей рандомизировали в три группы и обрабатывали средой-носителем, 0,5 мг/кг PSMA TriTAC C324 или 0,5 мг/кг PSMA BiTE. Препараты вводили ежесуточно в течение 10 дней посредством i.v. болюсной инъекции. Животных ежесуточно проверяли в отношении заболеваемости и смертности. Показатели объема опухоли определяли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Исследование завершали спустя 30 дней.

Анализы PK.

Целью этого исследования была оценка фармакокинетических параметров однократной дозы триспецифических связывающих белков после внутривенной инъекции. Ранее не участвующим в экспериментах двум яванским макакам на группу (1 самец и 1 самка) давали соединение посредством медленной IV болюсной инъекции, вводимой в течение примерно 1 мин. После введения дозы один раз в сутки проводили наблюдения у клетки и каждую неделю регистрировали показатели веса тела. Собирали образцы крови и обрабатывали их с получением сыворотки крови для фармакокинетического анализа в течение 21 дня после введения дозы.

Концентрации тестируемых препаратов определяли в сыворотке крови обезьяны путем электролюминесцентного считывания (Meso Scale Diagnostics, Роквилл). Для захвата анализируемого вещества применяли 96-луночные планшеты с иммобилизированным рекомбинантным CD3. Выявление осуществляли с использованием меченного SULFO-TAG рекомбинантного PSMA на MSD-ридере в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 2. Оценка влияния аффинности в отношении CD3 на свойства триспецифических молекул PSMA-нацеленные триспецифические молекулы с отличающимися CD3-связывающими доменами изучали для того, чтобы показать эффекты изменения аффинности в отношении CD3.

Иллюстративная PSMA-нацеленная триспецифическая молекула показана на фиг. 1. В табл. 1 приведена аффинность каждой молекулы для трех партнеров по связыванию (PSMA, CD3, HSA). Показатели аффинности измеряли с помощью интерферометрии биослоя с применением прибора Octet (Pall Forte Bio). Сниженная аффинность в отношении CD3 приводит к потере эффективности в контексте опосредованной Т-клетками клеточной цитотоксичности (фиг. 2А-2С). Фармакокинетические свойства таких триспецифических молекул оценивали у яванских макаков. Молекулы с высокой аффинностью в отношении CD3, как и TriTAC C236, характеризовались периодом полувыведения в конечной фазе примерно 90 ч (фиг. 3). Несмотря на измененную способность к связыванию CD3 на поверхности Т-клеток, период полувыведения в конечной фазе двух молекул с разными показателями аффинности в отношении CD3, показанными на фиг. 4, является очень похожим. Однако сниженная аффинность в отношении CD3, повидимому, обусловливает больший объем распределения, что согласуется с уменьшением секвестрации триспецифической молекулы Т-клетками. В течение периода исследования не было отмечено неблагоприятных клинических наблюдений или изменений веса тела.

- 18 042513

Таблица 1

Показатели аффинности связывания в отношении антигенов человека и яванского макака.

Значение KD антитела к PSMA (нМ)	Значение KD антитела к альбумину (нМ)	Значение KD антитела к CD3e (нМ)
человек	яванский макак	соотношение значений у	pHSA	CSA	соотношение значений у	человек	яванский макак	соотношение значений у

			яванского макака/ человека			яванского макака/ человека			яванского макака/ человека
TriTAC, высокая афф., в качестве инструмента -С236	16,3	0	0	22,7	25,4	1,1	6,0	4,7	0,8
TriTAC CD3, высокая афф. - С324	17,9	0	0	9,8	9,7	1	7,4	5,8	0,8
TriTAC CD3, средняя афф. -С339	13,6	0	0	8,8	8,3	0,9	40,6	33,6	0,8
TriTAC CD3, низкая афф. - С325	15,3	0	0	10,1	9,7	1	217	160	0,7

Пример 3. Оценка влияния аффинности в отношении PSMA на свойства триспецифических молекул.

PSMA-нацеленные триспецифические молекулы с отличающимися PSMA-связывающими доменами изучали для того, чтобы показать эффекты изменения аффинности в отношении PSMA. В табл. 2 приведена аффинность каждой молекулы для трех партнеров по связыванию (PSMA, CD3, HSA). Сниженная аффинность в отношении PSMA приводит к потере эффективности в контексте опосредованной Т-клетками клеточной цитотоксичности (фиг. 5А-5С).

Таблица 2

Показатели аффинности связывания в отношении антигенов человека и яванского макака

			яванского макака/ человека			яванского макака/ человека			яванского макака/ человека
PSMA- ГпТАС (р8)- С362	22,0	0	н.д.	6,6	6,6	1,0	8,3	4,3	0,52
PSMA TriTAC (HDS) С363	3,7	540	146	7,6	8,4	1,1	8,0	5,2	0,65
PSMA TriTAC (HTS)- C364	0,15	663	4423	8,4	8,6	1,0	7,7	3,8	0,49

Пример 4. Эффективность PSMA-нацеленных триспецифических молекул in vivo.

PSMA-нацеленную триспецифическую молекулу С324 оценивали в отношении ее способности ингибировать рост опухолей у мышей. Для этого эксперимента иммунодефицитным мышам, реконструированным с Т-клетками человека, подкожно инокулировали экспрессирующие PSMA клетки опухоли предстательной железы человека (22Rv1) и обрабатывали ежесуточно в течение 10 дней 0,5 мг/кг i.v. либо молекул PSMA-нацеленных BiTE, либо TriTAC. Рост опухоли измеряли в течение 30 дней. На протяжении эксперимента триспецифическая молекула была способна ингибировать рост опухоли с эффективностью, сравнимой с таковой в случае молекулы BiTE (фиг. 6).

Пример 5. Специфичность триспецифических молекул.

С целью оценки специфичности PSMA-нацеленных молекул TriTAC тестировали их способность индуцировать Т-клетки к уничтожению опухолевых клеток, с использованием опухолевых клеток, кото

- 19 042513 рые являются негативными по PSMA (фиг. 7А). EGFR-нацеленная молекула TriTAC служила в качестве положительного контроля, GFP-нацеленная молекула TriTAC служила в качестве отрицательного контроля. Для всех трех TriTAC с отличающимися PSMA-связывающими доменами наблюдали ожидаемую активность в отношении PSMA-положительной клеточной линии LNCaP (фиг. 7В), но не достигались ЕС50 в PSMA-отрицательных опухолевых клеточных линиях KMS12BM и OVCAR8 (фиг. 7С и 7D). ЕС50 приведены в табл. 3. При очень высоких концентрациях TriTAC (>1 нМ) могло наблюдаться некоторое ограниченное нецелевое уничтожение клеток в случае TriTAC C362 и С363, тогда как в случае С364 не наблюдали значимого уничтожения клеток ни в одном из тестируемых условий.

Таблица 3

Обеспечивающая уничтожение клеток активность молекул TriTAC в антиген-положительных и антиген-отрицательных опухолевых клеточных линиях (ЕС50 [пМ])

TriTAC	LNCaP	KMS12BM	OVCAR8
PSMAp8 TriTAC С362	13,0	>10000	>10000
PSMA HDS TriTAC C363	6,2	>10000	>10000
PSMA HTS TriTAC C364	0,8	>10000	>10000
EGFR TriTAC C131	9,4	>10000	6
GFP TriTAC C	>10000	>10000	>10000

Пример 6. Стресс-тесты и стабильность белка.

Четыре PSMA-нацеленных триспецифических молекулы либо инкубировали в течение 48 ч в сыворотке крови яванского макака при низких концентрациях (33,3 мкг/мл), либо подвергали пяти циклам замерзания-оттаивания в сыворотке крови яванского макака. После обработки оценивали биологическую активность молекул TriTAC в анализах уничтожения клеток и сравнивали с образцами, не подвергавшимися стрессу (положительный контроль, фиг. 8A-8D). У всех молекул сохранялась большая часть их обеспечивающей уничтожение клеток активности. TriTAC С362 была наиболее устойчивой к стрессу, и, по-видимому, вовсе не теряла активность в условиях, тестируемых в данном случае.

Пример 7. Ксенотрансплантатная модель опухоли PSMA-нацеленные триспецифические белки из предыдущих примеров оценивали в ксенотрансплантатной модели.

Самцам иммунодефицитных мышей NCG в их дорзальную часть правого бока подкожно инокулировали 5х10⁶ клеток 22Rv1. Если размер опухолей достигал 100-200 мм³, животных распределяли в 3 группы обработки. Группам 2 и 3 (по 8 животных в каждой) путем внутрибрюшинной инъекции вводили 1,5 х10⁷ активированных Т-клеток человека. Через три дня животных из группы 3 обрабатывали в общей сложности 9 внутривенными дозами 50 мкг PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка из примера 1 (qdx9d). Группы 1 и 2 обрабатывали только средой-носителем. Вес тела и объем опухоли определяли в течение 30 дней.

Ожидается, что рост опухоли у мышей, обработанных PSMA-триспецифическим антигенсвязывающим белком, значительно уменьшается в сравнении с ростом опухоли в соответствующей контрольной группе, обработанной средой-носителем.

Пример 8. Протокол клинического исследования для подтверждения концепции для введения PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка из примера 1 пациентам с раком предстательной железы.

Речь идет о клиническом исследовании фазы I/II для изучения PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка из примера 1 в качестве лечения рака предстательной железы.

Исходы исследования:

Первичные: Максимальная переносимая доза PSMA-нацеленных триспецифических белков из предыдущих примеров

Вторичные: Определение того, ассоциирован ли in vitro ответ на PSMA-нацеленные триспецифические белки из предыдущих примеров с клиническим ответом

Фаза I.

Максимальная переносимая доза (MTD) будет определяться в фазе I исследования.

1.1. Максимальная переносимая доза (MTD) будет определяться в фазе I исследования.

1.2. Пациенты, соответствующие критериям пригодности к участию, будут включены в исследование PSMA-нацеленных триспецифических белков из предыдущих примеров.

1.3. Целью является идентификация наиболее высокой дозы PSMA-нацеленных триспецифических белков из предыдущих примеров, которую можно вводить безопасно без серьезных или неконтролируемых побочных эффектов у участников. Вводимая доза будет зависеть от числа участников, ранее включенных в исследование, и от того, насколько хорошо доза переносилась. Не все участники будут получать одинаковую дозу.

- 20 042513

Фаза II.

2.1. В последующей второй фазе II участники будут получать лечение при MTD, при этом целью является определение того, обеспечивает ли терапия PSMA-нацеленными триспецифическими белками из предыдущих примеров по меньшей мере 20% частоту ответа.

Первичный исход для фазы II - определение того, обеспечивает ли терапия PSMA-нацеленными триспецифическими белками из предыдущих примеров достижение клинического ответа по меньшей мере у 20% пациентов (взрывной ответ, минимальный ответ, частичный ответ или полный ответ)

Пригодность к участию:

Гистологически подтвержденный недавно диагностированный агрессивный рак предстательной железы в соответствии с действующей классификацией Всемирной организации здравоохранения, с 2001 по 2007 гг.

Любая стадия заболевания.

Лечение доцетакселом и преднизоном (± хирургическое вмешательство).

Возраст >18 лет.

Индекс общего состояния пациента по Карновскому >50% или показатель общего состояния пациента по шкале ECOG 0-2.

Ожидаемая продолжительность жизни >6 недель.

Пример 9. Активность иллюстративного PSMA-нацеленного антигенсвязывающего белка (PSMA-нацеленной молекулы TriTAC) в анализах уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками с применением панели экспрессирующих PSMA клеточных линий и Т-клеток от разных доноров.

Это исследование осуществляли для того, чтобы продемонстрировать, что активность иллюстративного PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка не ограничивается клетками LNCaP или одним донором клеток.

Анализы уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками осуществляли с применением Т-клеток от четырех разных доноров и экспрессирующих PSMA человека клеточных линий рака предстательной железы VCaP, LNCaP, MDAPCa2b и 22Rv1. За одним исключением PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок был способен направлять уничтожение этих раковых клеточных линий с участием Т-клеток от всех доноров со значениями EC₅₀ от 0,2 до 1,5 пМ, как показано в табл. 4. В случае клеточной линии рака предстательной железы 22 Rv1 и донора 24 наблюдали уничтожение от незначительного вплоть до его отсутствия (данные не показаны). Также у донора 24 обеспечивалось только примерно 50% уничтожение клеточной линии MDAPCa2b, тогда как Т-клетки от других 3 доноров обеспечивали почти полное уничтожение этой клеточной линии (данные не показаны). В контрольных анализах было продемонстрировано, что уничтожение с помощью PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка было PSMA-специфическим. В случае, когда экспрессирующие PSMA клетки обрабатывали контрольным триспецифическим белком, нацеленным на зеленый флуоресцентный белок (GFP), а не на PSMA, уничтожение не наблюдали (данные не показаны). Аналогичным образом, PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок был неактивным в случае клеточных линий, у которых отсутствовала экспрессия PSMA, NCI-1563 и НСТ116, также показано в табл. 4.

Таблица 4

Значения EC₅₀ из анализов TDCC с шестью раковыми клеточными линиями человека и четырьмя разными донорами Т-клеток

Клеточная линия	Значения ECso (M) для TDCC
Донор 24	Донор 8144	Донор 72	Донор 41
LNCaP	1,5E-12	2,2E-13	3,6E-13	4,3E-13
MDAPCa2b	4,8E-12	4ДЕ-13	4,9E-13	6,5E-13
VCaP	6,4E-13	1,6E-13	2,0E-13	3,5E-13
22Rvl	Н.Д.	7,2E-13	1,4E-12	1,3E-12
HCT116	>l,0E-8	>l,0E-8	>l,0E-8	>l,0E-8
NCI-1563	>l,0E-8	>l,0E-8	>l,0E-8	>l,0E-8

Пример 10. Стимуляция экспрессии цитокинов иллюстративным PSMA-триспецифическим антигенсвязывающим белком (PSMA-нацеленной молекулой TriTAC) в анализах уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками.

Это исследование осуществляли для того, чтобы продемонстрировать активацию Т-клеток иллюстративным PSMA-триспецифическим антигенсвязывающим белком в ходе анализов уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками путем измерения секреции цитокина в среду для анализа активированными Т-клетками.

Кондиционированную среду, собранную после анализов уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками, как описано выше в примере 9, анализировали в отношении экспрессии цитокинов TNFa и

- 21 042513

IFNy. Уровень цитокинов измеряли с применением анализов AlphaLISA (Perkin-Elmer). Добавление титра PSMA-нацеленного антигенсвязывающего белка к Т-клеткам от четырех разных доноров и четырем экспрессирующим PSMA клеточным линиям, LNCaP, VCaP, MDAPCa2b и 22Rv1, обеспечивало повышение уровней TNFa. Результаты по уровням экспрессии TNFa и экспрессии IFNy в кондиционированной среде показаны в табл. 5 и 6 соответственно. Значения EC₅₀ для индуцированной PSMA-нацеленным антигенсвязывающим белком экспрессии этих цитокинов находились в диапазоне от 3 до 15 пМ. В случае контрольного триспецифического GFP-нацеленного белка повышенные уровни цитокинов не наблюдали. Аналогичным образом, в случае, когда анализы осуществляли с использованием двух клеточных линий, у которых отсутствовала экспрессия PSMA, HCT116 и NCI-H1563, PSMA HTS TriTAC также не приводила к повышению уровней экспрессии TNFa или IFNy.

Таблица 5

Значения EC₅₀ для экспрессии TNFa в среду из анализов индуцированной PSMA-триспецифическим антигенсвязывающим белком TDCC с шестью раковыми клеточными линиями человека и Т-клетками от четырех разных доноров

Клеточная линия	Донор 24	Донор 8144	Донор 41	Донор 72
LNCaP	4,9E-12	2,8E-12	4,0E-12	3,2E-12
VCaP	3,2E-12	2,9E-12	2,9E-12	2,9E-12
MDAPCa2b	2, IE-11	4,0E-12	5,5E-12	3,6E-12
22Rvl	8,9E-12	2,5E-12	4,0E-12	3,3E-12
HCT116	>lE-8	>lE-8	>lE-8	>lE-8
NCI-H1563	>lE-8	>lE-8	>lE-8	>lE-8

Таблица 6

Значения EC50 для экспрессии IFNy в среду из анализов индуцированной PSMA-триспецифическим антигенсвязывающим белком TDCC с шестью раковыми клеточными линиями человека и

Т-клетками от четырех разных доноров

Клеточная линия	Донор 24	Донор 8144	Донор 41	Донор 72
LNCaP	4,2E-12	4,2E-12	4,2E-12	2,8E-12
VCaP	5ДЕ-12	1,5E-11	3,4E-12	4,9E-12
MDAPCa2b	1,5E-11	5,8E-12	9,7E-12	3,5E-12
22Rvl	7,8E-12	3,0E-12	9ДЕ-12	3,0E-12
HCT116	>lE-8	>lE-8	>lE-8	>lE-8
NCI-H1563	>lE-8	>lE-8	>lE-8	>lE-8

Пример 11. Активность иллюстративного PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка (PSMA-нацеленной TriTAC) в анализе уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками (TDCC) с применением Т-клеток от яванских макаков.

Это исследование осуществляли для тестирования способности иллюстративного PSMAтриспецифического антигенсвязывающего белка направлять Т-клетки от яванских макаков на уничтожение экспрессирующих PSMA клеточных линий.

Анализы TDCC проводили с применением мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от яванских макаков. РВМС яванского макака добавляли к клеткам LNCaP в соотношении 10:1. Было показано, что PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок обеспечивал перенаправление уничтожения LNCaP РВМС яванского макака со значением EC₅₀ 11 пМ. Результат показан на фиг. 9А. Для подтверждения этих результатов применяли вторую клеточную линию, MDAPCa2b, и тестировали РВМС от второго донора-яванского макака. Перенаправленное уничтожение клеток-мишеней наблюдали со значением EC₅₀ 2,2 пМ. Результат показан на фиг. 9В. Уничтожение было специфическим для PMSA-связывающего плеча PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка, так как уничтожение в случае триспецифического GFP-нацеленного белка в качестве отрицательного контроля не наблюдали. Из этих данных видно, что PSMA-нацеленный антигенсвязывающий триспецифический белок может направлять Т-клетки яванского макака на уничтожение клеток-мишеней, экспрессирующих PSMA человека.

Пример 12. Экспрессия маркеров активации Т-клеток в анализах уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками с использованием иллюстративного PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка (PSMA-нацеленной молекулы TriTAC).

- 22 042513

Это исследование осуществляли для оценки того, активировались ли Т-клетки в случае, когда иллюстративный PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок направлял Т-клетки на уничтожение клеток-мишеней.

Анализы проводили с применением условий для анализов уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками, описанных в примере выше. Активацию Т-клеток оценивали путем измерения уровней экспрессии CD25 и CD69 на поверхности Т-клеток с применением проточной цитометрии. PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок добавляли к смеси очищенных Т-клеток человека и клеточной линии рака предстательной железы VCaP 10:1. После добавления возрастающих количеств PSMA-триспецифического антигенсвязывающего белка наблюдали повышенный уровень экспрессии CD69 и экспрессии CD25, как показано на фиг. 10. Значение EC₅₀ составляло 0,3 пМ для CD69 и 0,2 пМ для CD25. Триспецифический GFP-нацеленный белок был включен в эти анализы в качестве отрицательного контроля, и в случае GFP-нацеленного триспецифического белка наблюдали повышение уровня экспрессии CD69 или CD25 от незначительного вплоть до его отсутствия, также показано на фиг. 10.

Пример 13. Стимуляция пролиферации Т-клеток иллюстративным PSMA-триспецифическим антигенсвязывающим белком (PSMA-нацеленной молекулой TriTAC) в присутствии экспрессирующих PSMA клеток-мишеней.

Это исследование применяли в качестве дополнительного способа для демонстрации того, что иллюстративный PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок был способен активировать Т-клетки при перенаправлении их на уничтожение клеток-мишеней.

Анализы пролиферации Т-клеток проводили с применением условий для анализа уничтожения клеток перенаправленными Т-клетками с применением клеток-мишеней LNCaP, как описано выше, и измерения числа Т-клеток, присутствующих через 72 ч. Иллюстративный PSMA-триспецифический антигенсвязывающий белок обеспечивал стимуляцию пролиферации со значением EC₅₀ 0,5 пМ. Триспецифический GFP-нацеленный белок был включен в анализ в качестве отрицательного контроля, и в случае этого белка повышение степени пролиферации не наблюдали. Результаты анализа пролиферации Т-клеток показаны на фиг. 11.

Пример 14. Уничтожение перенаправленными Т-клетками клеток LNCaP, обусловленное тремя иллюстративными PSMA-триспецифическими антигенсвязывающими белками (PSMA-нацеленными молекулами TriTAC PH1T, РН и Z2).

Это исследование осуществляли для тестирования способности трех иллюстративных PSMA-триспецифических антигенсвязывающих белков с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 150, 151 и 152, перенаправлять Т-клетки на уничтожение клеточной линии LNCaP.

В анализах TDCC, проведенных как описано в примерах выше, белки PSMAPH1T TriTAC (SEQ ID NO: 150) и PSMAPH1 TriTAC (SEQ ID NO: 151) обеспечивали перенаправление уничтожения со значениями EC₅₀ 25 и 20 пМ соответственно, как показано на фиг. 12А; и белок PSMA Z2 TriTAC (SEQ ID NO: 152) обеспечивал перенаправление уничтожения со значением EC₅₀ 0,8 пМ, как показано на фиг. 12В.

- 23 042513

Таблица 7

Последовательности CD3-связывающего домена

SEQ ID NO:	Описание	Аминокислотная последовательность
1	CD3-связывающая, клон 2В2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWV RQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISR DDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISY WAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQE PSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPE DEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
2	CD3-связывающая, клон 9F2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFEFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNKYAIYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSFGAVTSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPE DEAEYYCVLWYDNRWVFGGGTKLTVL
3	CD3-связывающая, клон 5А2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAIYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSHIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGYVTSGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTSFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQP EDEAEYYCVLWYSNRWIFGGGTKLTVL
4	CD3-связывающая, клон 6А2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFMFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYAIYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYIS YWATWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSFGAVTSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTKLLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQP EDEAEYYCVLWYSNSWVFGGGTKLTVL
	CD3-связывающая, клон 2D2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWV RQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAIYYKDSVKDRFTISR DDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSPISY WAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQE PSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVVSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTEFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPE DEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
6	CD3-связывающая, клон 3F2

- 24 042513

		EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTYNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADEVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSPIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSKGAVTSGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTKELAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQ PEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
7	CD3-связывающая, клон 1А2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGNTFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYEIYYADSVKDRFTIS RDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHTNFGNSYIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPG QAPRGLIGGIYFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQ PEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
8	CD3-связывающая, клон 1С2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAIYYADAVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSQIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTDGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGIKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQP EDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
9	CD3-связывающая, клон 2Е4	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAVNWV RQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISR DDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISY WAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQE PSLTVSPGGTVTLTCGESTGAVTSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTKILAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPE DEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
10	CD3 -связывающая, клон 10Е4	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYPMNWV RQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISR DDSKNTAYLQMNNLKNEDTAVYYCVRHGNFNNSYIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTKGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTKMLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQ PEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
11	CD3-связывающая, клон 2Н2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAIYYADEVKDRFTIS

- 25 042513

		RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSPIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVVSGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTEFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQP EDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
12	CD3-связывающая, клон 2А4	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGNTFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGDSYIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTHGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTKVLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQ PEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
13	CD3-связывающая, клон 10В2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSGYNNYATYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSYTGAVTSGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTKFNAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQ PEDEAEYYCVLWYANRWVFGGGTKLTVL
14	CD3-связывающая, клон 1G4	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFEFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYETYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSLIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSSGAVTSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTKFGAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQP EDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
15	CD3-связывающая wt	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNW VRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTIS RDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYIS YWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQ EPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPG QAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQ PEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
16	CD3-связывающая CDR1 HCwt	GFTFNKYAMN

- 26 042513

17	CD3-связывающая CDR2 HCwt	RIRSKYNNYATYYADSVK
18	CD3-связывающая CDR3 HCwt	HGNFGNSYISYWAY
19	CD3-связывающая CDR1 LCwt	GSSTGAVTSGNYPN
20	CD3-связывающая CDR2 LCwt	GTKFLAP
21	CD3-связывающая CDR3 LC wt	VLWYSNRWV
22	Вариант 1 CDR1 НС	GNTFNKYAMN
23	Вариант 2 CDR1 НС	GFEFNKYAMN
24	Вариант 3 CDR1 НС	GFMFNKYAMN
25	Вариант 4 CDR1 НС	GFTYNKYAMN
26	Вариант 5 CDR1 НС	GFTFNNYAMN
27	Вариант 6 CDR1 НС	GFTFNGYAMN
28	Вариант 7 CDR1 НС	GFTFNIYAMN
29	Вариант 8 CDR1 НС	GFTFNEYAMN
30	Вариант 9 CDR1 НС	GFTFNKYPMN
31	Вариант 10 CDR1 НС	GFTFNKYAVN
32	Вариант 11 CDR1 НС	GFTFNKYAIN
33	Вариант 12 CDR1 НС	GFTFNKYALN
34	Вариант 1 CDR2 НС	RIRSGYNNYATYYADSVK
35	Вариант 2 CDR2 НС	RIRSKSNNYATYYADSVK
36	Вариант 3 CDR2 НС	RIRSKYNKYATYYADSVK
37	Вариант 4 CDR2 НС	RIRSKYNNYETYYADSVK
38	Вариант 5 CDR2 НС	RIRSKYNNYATEYADSVK
39	Вариант 6 CDR2 НС	RIRSKYNNYATYYKDSVK
40	Вариант 7 CDR2 НС	RIRSKYNNYATYYADEVK
41	Вариант 8 CDR2 НС	RIRSKYNNYATYYADAVK
42	Вариант 9 CDR2 НС	RIRSKYNNYATYYADQVK
43	Вариант 10 CDR2 НС	RIRSKYNNYATYYADDVK
44	Вариант 1 CDR3 НС	HANFGNSYISYWAY
45	Вариант 2 CDR3 НС	HTNFGNSYISYWAY

- 27 042513

46	Вариант 3 CDR3 НС	HGNFNNSYISYWAY
47	Вариант 4 CDR3 НС	HGNFGDSYISYWAY
48	Вариант 5 CDR3 НС	HGNFGNSHISYWAY
49	Вариант 6 CDR3 НС	HGNFGNSPISYWAY
50	Вариант 7 CDR3 НС	HGNFGNSQISYWAY
51	Вариант 8 CDR3 НС	HGNFGNSLISYWAY
52	Вариант 9 CDR3 НС	HGNFGNSGISYWAY
53	Вариант 10 CDR3 НС	HGNFGNSYISYWAT
54	Вариант 1 CDR1 LC	ASSTGAVTSGNYPN
55	Вариант 2 CDR1 LC	GESTGAVTSGNYPN
56	Вариант 3 CDR1 LC	GSYTGAVTSGNYPN
57	Вариант 4 CDR1 LC	GS SFGAVTSGNYPN
58	Вариант 5 CDR1 LC	GSSKGAVTSGNYPN
59	Вариант 6 CDR1 LC	GSSSGAVTSGNYPN
60	Вариант 7 CDR1 LC	GSSTGYVTSGNYPN
61	Вариант 8 CDR1 LC	GSSTGAVVSGNYPN
62	Вариант 9 CDR1 LC	GSSTGAVTDGNYPN
63	Вариант 10 CDR1 LC	GSSTGAVTKGNYPN
64	Вариант 11 CDR1 LC	GSSTGAVTHGNYPN
65	Вариант 12 CDR1 LC	GSSTGAVTVGNYPN
66	Вариант 13 CDR1 LC	GSSTGAVTSGYYPN
67	Вариант 1 CDR2 LC	GIKFLAP
68	Вариант 2 CDR2 LC	GTEFLAP
69	Вариант 3 CDR2 LC	GIYFLAP
70	Вариант 4 CDR2 LC	GTSFLAP
71	Вариант 5 CDR2 LC	GTNFLAP
72	Вариант 6 CDR2 LC	GTKLLAP
73	Вариант 7 CDR2 LC	GTKELAP
74	Вариант 8 CDR2 LC	GTKILAP
75	Вариант 9 CDR2 LC	GTKMLAP
76	Вариант 10 CDR2 LC	GTKVLAP
77	Вариант 11 CDR2 LC	GTKFNAP
78	Вариант 12 CDR2 LC	GTKFGAP
79	Вариант 13 CDR2 LC	GTKFLVP

- 28 042513

80	Вариант 1 CDR3 LC	TLWYSNRWV
81	Вариант 2 CDR3 LC	ALWYSNRWV
82	Вариант 3 CDR3 LC	VLWYDNRWV
83	Вариант 4 CDR3 LC	VLWYANRWV
84	Вариант 5 CDR3 LC	VLWYSNSWV
85	Вариант 6 CDR3 LC	VLWYSNRWI
86	Вариант 7 CDR3 LC	VLWYSNRWA
87	CD3-связывающая, клон 2G5	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYALNWV RQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATEYADSVKDRFTISR DDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSPISY WAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQE PSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTNFLAPGTPERFSGSLLGGKAALTLSGVQPE DEAEYYCVLWYSNRWAFGGGTKLTVL
88	CD3-связывающая, клон 8А5	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNEYAMNWV RQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADDVKDRFTISR DDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSGISY WAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQE PSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTVGNYPNWVQQKPGQ APRGLIGGTEFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPE DEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL

Таблица 8

Последовательности HSA-связывающего домена.

SEQ ID NO:	Описание	Аминокислотная последовательность
89	sdAb к HSA, клон 6С	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSRFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTV SS
90	sdAb к HSA, клон 7А	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGADTLYADSLKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSKSSQGTLVTV SS

- 29 042513

91	sdAb к HSA, клон 7G	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTYSSFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSKSSQGTLVTV SS
92	sdAb к HSA, клон 8H	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGTDTLYADSVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTV SS
93	sdAb к HSA, клон 9А	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSRFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSKSSQGTLVTV SS
94	sdAb к HSA, клон 10G	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTV SS
95	HSA-связывающая, wt	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVR QAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAK TTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVS S
96	HSA-связывающая CDR1 wt	GFTFSSFGMS
97	HSA-связывающая CDR2 wt	SISGSGSDTLYADSVK
98	HSACDR3 -связывающая wt	GGSLSR
99	Вариант 1 CDR1	GFTFSRFGMS
100	Вариант 2 CDR1	GFTFSKFGMS
101	Вариант 3 CDR1	GFIYSSFGMS
102	Вариант 1 CDR2	SISGSGADTLYADSLK
103	Вариант 2 CDR2	SISGSGTDTLYADSVK
104	Вариант 3 CDR2	SISGSGRDTLYADSVK
105	Вариант 4 CDR2	SISGSGSDTLYAESVK
106	Вариант 5 CDR2	SISGSGTDTLYAESVK
107	Вариант 6 CDR2	SISGSGRDTLYAESVK
108	Вариант 1 CDR3	GGSLSK
109	Вариант 2 CDR3	GGSLSV
ПО	sdAb к HSA, клон 6СЕ	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSRFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYAESVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTV SS
111	sdAb к HSA, клон 8НЕ	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGTDTLYAESVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTV SS
112	sdAb к HSA, клон 10GE	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWV RQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYAESVKGRFTISRDNA KTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTV SS

- 30 042513

Таблица 9

Последовательности PSMA-связывающего домена

SEQ ID NO:	Описание	Аминокислотная последовательность
113	PSMA-связывающая, wt	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYSMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLKPEDTAVYYCDGYGYRGQGTQVTVSS
114	Вариант 1 CDR1	RFMISEYHMH
115	Вариант 2 CDR1	RFMISPYSMH
116	Вариант 3 CDR1	RFMISPYHMH
117	Вариант 1 CDR2	DINPAGTTDYAESVKG
118	Вариант 2 CDR2	TINPAKTTDYAESVKG
119	Вариант 3 CDR2	TINPAGQTDYAESVKG
120	Вариант 4 CDR2	TINPAGTTDYAEYVKG
121	Вариант 5 CDR2	DINPAKTTDYAESVKG
122	Вариант 6 CDR2	DINPAGQTDYAESVKG
123	Вариант 7 CDR2	DINPAGTTDYAEYVKG
124	Вариант 1 CDR3	DSYGY

- 31 042513

125	Вариант 4 CDR1	RFMISEYSMH
126	Вариант 8 CDR2	TINPAGTTDYAESVKG
127	Вариант 2 CDR3	DGYGY
128	PSMA-связывающая, клон 1	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYSMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDGYGYRGQGTLVTVSS
129	PSMA-связывающая, клон 2	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGKGLEWVSDINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
130	PSMA-связывающая, клон 3	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
131	PSMA-связывающая, клон 4	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYSMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAKTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
132	PSMA-связывающая, клон 5	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISPYSMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDGYGYRGQGTLVTVSS
133	PSMA-связывающая, клон 6	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYSMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGQTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDGYGYRGQGTLVTVSS
134	PSMA-связывающая, клон 7	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYSMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAEYVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDGYGYRGQGTLVTVS S
135	PSMA-связывающая, клон 8	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGI<GLEWVSDINPAI<TTDYAESVI<GRFTISRDNAI< NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
136	PSMA-связывающая, клон 9	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISPYHMHWV RQAPGKGLEWVSDINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
137	PSMA-связывающая, клон 10	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGKGLEWVSDINPAGQTDYAESVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
138	PSMA-связывающая, клон 11	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGKGLEWVSDINPAGTTDYAEYVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSS
139	PSMA-связывающая, клон 12	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGKGLEWVSDINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLKPEDTAVYYCDSYGYRGQGTQVTVSS
140	PSMA-связывающая, клон 13	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWV RQAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLKPEDTAVYYCDSYGYRGQGTQVTVSS

- 32 042513

Таблица 10

Последовательности PSMA-нацеленного триспецифического белка

SEQ ID NO:	Сномер	Конструкция	Последовательность
141	С00324	PSMA TriTAC CD3, высокая афф.	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYSMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLKPEDTAVYYCDGYGYRGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAV YYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTS GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLL GGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKL TVLHHHHHH
142	С00339	PSMA TriTAC CD3, средняя афф.	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYSMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLKPEDTAVYYCDGYGYRGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSGYNN YATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTA VYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSYTGAV TSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFNAPGTPARFSGS LLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYANRWVFGGG TKLTVLHHHHHH

- 33 042513

143	C00325	PSMA TriTAC CD3, низкая афф.	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYSMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLKPEDTAVYYCDGYGYRGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFEFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNN YETYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTA VYYCVRHGNFGNSLISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSSGAV TSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFGAPGTPARFSGS LLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGT KLTVLHHHHHH
144	C00236	PSMA TriTAC в качестве инструмента	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYSMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLKPEDTAVYYCDGYGYRGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSF GMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQG TLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSC AASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAV YYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTS GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLL GGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKL TVLHHHHHH
145	C00362	PSMA р8 TriTAC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFMISEYSMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCDGYGYRGQGTLVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAV YYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTS GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLL GGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKL TVLHHHHHH
146	C00363	PSMA HDS TriTAC C363	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWVR QAPGKGLEWVSDINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLKPEDTAVYYCDSYGYRGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAV YYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTS GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLL

- 34 042513

			GGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKL TVLHHHHHH
147	C00364	PSMA HTS TriTAC C364	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLKPEDTAVYYCDSYGYRGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAV YYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTS GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLL GGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKL TVLHHHHHH
148	C00298	PSMA BiTE	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWV RQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSAS YRYSDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQY DSYPYTFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGG SLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKT EDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS SGG GGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSS TGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPAR FSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVF GGGTKLTVLHHHHHH
149	C00131	EGFR TriTAC	QVKLEESGGGSVQTGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWF RQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNA KNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYGTLYEYD YWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGN SLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSG SDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAV YYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESG GGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYL QMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGT LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGT VTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKF LAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLW YSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH

- 35 042513

150	С00457	PSMA РН1Т TriTAC	QVQLVESGGGVVQAGRSLTLSCAYSGVTVNVYRMGW FRQAPGKEREFVANINWSGNNRDYADSVRGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASEKPGRLGEYDYGS QGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRL SCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDT LYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYC TIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL VQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWV ARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQM NNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVT VSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTL TCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVP GTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSN RWVFGGGTKLTVLHHHHHH
151	С00404	PSMA PHI TriTAC	QVQLVESGGGVVQAGRSLRLSCAYSGVTVNVYRMGW FRQAPGKEREFVANINWSGNNRDYADSVRGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASEKPGRLGEYDYGS QGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRL SCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDT LYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYC TIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL VQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWV ARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQM NNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVT VSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTL TCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVP GTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSN RWVFGGGTKLTVLHHHHHH
152	С00410	PSMA Z2 TriTAC	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYHMHWVR QAPGKGLEWVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCDSYGYRGQGTLVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSK FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRF TISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNY ATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAV YYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTS GNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLL GGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKL TVLHHHHHH

Таблица 11

Последовательности CDR PSMA-связывающего домена.

SEQ ID No.	Последовательность
SEQIDNo. 162	RFMISXiYX₂MH
SEQIDNo. 163	X3INPAX4X5TDYAEX6VKG
SEQIDNo. 164	DX7YGY

Таблица 12

Иллюстративные каркасные последовательности

SEQ ID NO:	Описание	Последовательность
165	Каркас (fl)	EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAAS
166	Каркас (f2)	WVRQAPGKGLEWVS
167	Каркас (β)	RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
168	Каркас (f4)	DGYGYRGQGTLVTVS s

Хотя в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, для специалистов в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления приведены исключительно в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены будут приходить на ум специалистам в данной области без отступления от настоящего изобретения. Следует понимать, что при применении настоящего изобретения на практике можно использовать различные альтернативы описанным в настоящем документе вариантам осуществления настоящего изобретения. Подразумевается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения и что способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения и их эквиваленты также охватываются ею.

Claims

1. Нацеленный на простатический специфический мембранный антиген (PSMA) триспецифический белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147.

2. PSMA-нацеленный триспецифический белок по п.1, где размер PSMA-нацеленного триспецифического белка составляет менее чем 80 кДа.

3. PSMA-нацеленный триспецифический белок по п.1, где размер PSMA-нацеленного триспецифического белка составляет от 50 до 75 кДа.

4. PSMA-нацеленный триспецифический белок по п.1, где PSMA-нацеленный триспецифический белок характеризуется периодом полувыведения по меньшей мере 50 ч.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая (i) PSMA-нацеленный триспецифический белок по любому из пп.1-4 и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.

6. Применение фармацевтической композиции по п.5 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.