EA042132B1 - PEPTIDE WITH CYTOPROTECTOR EFFECT AGAINST ENVIRONMENTAL POLLUTANTS AND ITS APPLICATION - Google Patents
PEPTIDE WITH CYTOPROTECTOR EFFECT AGAINST ENVIRONMENTAL POLLUTANTS AND ITS APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA042132B1 EA042132B1 EA201992304 EA042132B1 EA 042132 B1 EA042132 B1 EA 042132B1 EA 201992304 EA201992304 EA 201992304 EA 042132 B1 EA042132 B1 EA 042132B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- dioxin
- seq
- amino acid
- acid sequence
- peptide
- Prior art date
Links
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к пептиду с цитопротекторным эффектом против загрязняющих окружающую среду веществ и к его применению.The present invention relates to a peptide with a cytoprotective effect against environmental pollutants and to its use.
Уровень техникиState of the art
Загрязняющие окружающую среду вещества называются так называемыми эндокринными разрушителями и включают в себя такие типы веществ, как хлорорганические соединения, такие как диоксины, пестициды, фталаты, бензопирены, различные фенолы (от пентафенолов до нонилфенолов), бисфенол А, тяжелые металлы, димеры и тримеры стирола и т.п. Эти соединения являются очень стабильными химически и сохраняются в окружающей среде в течение длительного времени, тем самым имея возможность попасть в организм человека через пищевую цепь вследствие высокой степени биоаккумуляции.Environmental pollutants are called so-called endocrine disruptors and include types of substances such as organochlorine compounds such as dioxins, pesticides, phthalates, benzopyrenes, various phenols (from pentaphenols to nonylphenols), bisphenol A, heavy metals, styrene dimers and trimers and so on. These compounds are very stable chemically and persist in the environment for a long time, thus being able to enter the human body through the food chain due to the high degree of bioaccumulation.
Из этих соединений диоксинами обычно называют хлорированные углеводородные соединения, имеющие сходную химическую структуру, а именно полихлорированные дибензо-п-диоксины (ПХДД) и полихлорированные дибензофураны (ПХДФ), и существует 75 различных типов изомеров ПХДД и 135 различных типов изомеров ПХДФ в зависимости от числа замещенных атомов хлора.Of these compounds, chlorinated hydrocarbon compounds having a similar chemical structure, namely, polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD) and polychlorinated dibenzofurans (PCDF), are commonly referred to as dioxins, and there are 75 different types of PCDD isomers and 135 different types of PCDF isomers, depending on the number substituted chlorine atoms.
Диоксины выделяются или образуются при сжигании отходов, в процессе отбеливания бумаги или целлюлозы, при производстве пластмасс, при производстве хлорорганических пестицидов и в аналогичных процессах. Поскольку при комнатной температуре диоксины представляют собой бесцветные кристаллические твердые вещества, термохимически стабильные и легкорастворимые в жирах, при попадании в живые организмы они накапливаются в жировой ткани. Их воздействие на организм человека может включать нарушение репродуктивной функции, невынашивание беременности, аномальное развитие плода, изменения гормональных регуляторных функций, развитие диабета, аномалии в иммунной системе, повреждение иммунной системы, потенциальную канцерогенность и т.п.Dioxins are released or generated from the incineration of waste, the bleaching of paper or pulp, the production of plastics, the production of organochlorine pesticides, and similar processes. Since dioxins are colorless crystalline solids at room temperature, thermochemically stable and readily soluble in fats, they accumulate in adipose tissue when ingested by living organisms. Their effects on the human body may include impaired reproductive function, miscarriage, abnormal fetal development, changes in hormonal regulatory functions, the development of diabetes, anomalies in the immune system, damage to the immune system, potential carcinogenicity, and the like.
Мелкая пыль состоит из диоксида серы, оксидов азота, свинца, озона, оксида углерода и т.п. Мелкая пыль с диаметром частиц 10 мкм или ниже называется крупнодисперсными аэрозольными частицами (РМ10). Ультратонкая пыль с диаметром частиц 2,5 мкм или ниже называется мелкодисперсными аэрозольными частицами (РМ2,5). Источники мелкой пыли могут быть природными, например почвенная пыль, морская соль или пыльца растений, или могут быть антропогенными, например дым, образующийся при сжигании ископаемого топлива, выхлопные газы автомобилей, пыль со строительных площадок, порошковое сырье и вспомогательные материалы на заводах, а также дым от мусоросжигательных заводов.Fine dust consists of sulfur dioxide, nitrogen oxides, lead, ozone, carbon monoxide, etc. Fine dust with a particle diameter of 10 µm or below is called coarse aerosol particles (PM10). Ultra-fine dust with a particle diameter of 2.5 µm or less is called fine aerosol particles (PM2.5). Sources of fine dust can be natural, such as soil dust, sea salt, or plant pollen, or they can be anthropogenic, such as smoke from fossil fuels, vehicle exhaust, dust from construction sites, powdered raw materials and auxiliary materials in factories, and smoke from incinerators.
Такая мелкая пыль, имеющая очень маленький диаметр, составляющий примерно от 1/7 до 1/5 толщины человеческого волоса, глубоко проникает в тело человека при прохождении через полость носа, рта и бронхи, избегая фильтрации. Попадающая в организм человека мелкая пыль, которая включает вышеописанные токсичные вещества, может вызывать воспалительные реакции таких органов, как дыхательные пути, легкие, сердечно-сосудистая система и мозг, вызывая тем самым респираторные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. В октябре 2013 г. Международное агентство по исследованию рака при Всемирной организации здравоохранения отнесло мелкую пыль к канцерогенам 1-й группы.Such fine dust, which has a very small diameter, about 1/7 to 1/5 of the thickness of a human hair, penetrates deeply into the human body when passing through the nasal cavity, mouth and bronchi, avoiding filtration. Fine dust that enters the human body, which includes the above-described toxic substances, can cause inflammatory reactions in organs such as the respiratory tract, lungs, cardiovascular system and brain, thereby causing respiratory diseases and cardiovascular diseases. In October 2013, the International Agency for Research on Cancer of the World Health Organization classified fine dust as a group 1 carcinogen.
Известно, что как диоксины, так и полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), содержащиеся в мелкой пыли, проникают в клетки и активируют рецептор арильных углеводородов (AhR). Через механизм активации AhR в клетках происходит увеличение количества активных форм кислорода (ROS), а гетеродимерный комплекс AhR и ARNT связывается с элементом ксенобиотического ответа (XRE), усиливающим экспрессию различных медиаторов воспаления, ассоциированного с микрофтальмией фактора транскрипции, (MITF), который представляет собой связанный с синтезом меланина фактор транскрипции, и матриксной металлопротеиназы (ММР), которая представляет собой фермент, способствующий образованию морщин, вследствие чего на коже возникают дерматит, пигментная гиперплазия (пятна и веснушки), морщины и аналогичные поражения.Both dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contained in fine dust are known to enter cells and activate the aryl hydrocarbon receptor (AhR). Through the activation mechanism of AhR in cells, an increase in the number of reactive oxygen species (ROS) occurs, and the heterodimeric complex of AhR and ARNT binds to the xenobiotic response element (XRE), which enhances the expression of various inflammatory mediators, the microphthalmia-associated transcription factor (MITF), which is a transcription factor associated with the synthesis of melanin; and matrix metalloproteinase (MMP), which is an enzyme that promotes the formation of wrinkles, resulting in dermatitis, pigmentary hyperplasia (spots and freckles), wrinkles and similar lesions on the skin.
В доступных ранее продуктах против действия загрязняющих соединений использовались вещества, которые предотвращают адсорбцию мелкой пыли на коже или укрепляют кожный барьер с помощью электрического заряда. Однако они обеспечивают только непрямой защитный эффект вместо прямого ингибирования механизмов, активируемых загрязняющими окружающую среду веществами, такими как диоксины или мелкая пыль. Исходные вещества или продукты, препятствующие неблагоприятному воздействию загрязняющих окружающую среду веществ при контакте с кожей, еще не разработаны.Previously available anti-pollution products have used substances that prevent adsorption of fine dust on the skin or strengthen the skin barrier with an electrical charge. However, they provide only an indirect protective effect instead of direct inhibition of mechanisms activated by environmental pollutants such as dioxins or fine dust. Source substances or products that prevent the adverse effects of environmental pollutants in contact with the skin have not yet been developed.
Описание вариантов осуществления Техническая проблемаDescription of Embodiments Technical Problem
Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, напрямую связывается с 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пдиоксином (в дальнейшем указывается как ТХДД), известным как наиболее токсичное соединение из диоксинов, тем самым предупреждая его проникновение через кожу и механизм активации арилуглеводородного рецептора (AhR) ТХДД, и полициклическими ароматическими углеводородами, содержащимися в мелкой пыли.Accordingly, the present inventors found that a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 directly binds to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin (hereinafter referred to as TCDD), known to be the most toxic compound from dioxins, thereby preventing its penetration through the skin and the activation mechanism of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) of TCDD, and polycyclic aromatic hydrocarbons contained in fine dust.
- 1 042132- 1 042132
Таким образом, целью настоящего изобретения является пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.Thus, the aim of the present invention is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
Еще одной целью настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами, причем фармацевтическая композиция включает по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by dioxin-like substances, wherein the pharmaceutical composition comprises at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
Еще одной целью настоящего изобретения является пищевая композиция для облегчения и/или ослабления заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами, причем пищевая композиция включает по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, в качестве действующего ингредиента.Yet another object of the present invention is a food composition for alleviating and/or attenuating diseases caused by dioxin-like substances, the food composition comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 as an active ingredient.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание косметической композиции для улучшения состояния кожи, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, в качестве действующего ингредиента.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving skin condition, comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, as an active ingredient.
Еще одной целью настоящего изобретения является способ предупреждения или лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами.Another object of the present invention is a method for the prevention or treatment of diseases caused by dioxin-like substances.
Еще одной целью настоящего изобретения является пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, для предупреждения или лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами.Another object of the present invention is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, for the prevention or treatment of diseases caused by dioxin-like substances.
Решение проблемыSolution
Настоящее изобретение относится к пептиду с цитопротекторным эффектом против загрязняющих окружающую среду веществ и к его применению. Было подтверждено, что пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, напрямую связывается с 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксином, известным как наиболее токсичное соединение из диоксинов, тем самым предупреждая его проникновение через кожу и механизм активации арилуглеводородных рецепторов (AhR) содержащимися в мелкой пыли ТХДД и полициклическими ароматическими углеводородами. Такой прямой цитопротекторный эффект против действия загрязняющих окружающую среду веществ отличается от ранее существующих способов, которые направлены на непрямое блокирование возможности контакта с этими веществами или на снижение токсичности за счет усиления барьерной функции.The present invention relates to a peptide with a cytoprotective effect against environmental pollutants and to its use. It was confirmed that a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 directly binds to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, known as the most toxic compound among dioxins, thereby preventing its penetration through the skin and the mechanism of activation of aryl hydrocarbon receptors (AhR) by fine dust TCDD and polycyclic aromatic hydrocarbons. Such a direct cytoprotective effect against the action of environmental pollutants differs from previously existing methods that aim to indirectly block the possibility of contact with these substances or to reduce toxicity by enhancing the barrier function.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
Аспект настоящего изобретения относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.An aspect of the present invention relates to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
Пептид может представлять собой пептид с N-концевой и/или С-концевой модификацией, затрагивающей участок аминокислотной последовательности и повышающей его активность. Такая N-концевая и/или С-концевая модификация может значительно улучшить стабильность пептида по настоящему изобретению, например увеличить время полужизни введения пептида in vivo.The peptide may be a peptide with an N-terminal and/or C-terminal modification that affects a portion of the amino acid sequence and increases its activity. Such an N-terminal and/or C-terminal modification can significantly improve the stability of the peptide of the present invention, for example, increase the in vivo administration half-life of the peptide.
N-концевая модификация может быть получена путем присоединения защитной группы, выбранной из группы, состоящей из ацетильной группы, флуореонилметоксикарбонильной группы, формильной группы, пальмитоильной группы, миристильной группы, стеарильной группы и полиэтиленгликоля (ПЭГ) к N-концу пептида. Защитная группа действует для защиты пептида по настоящему изобретению от расщепляющего белки фермента в живом организме.An N-terminal modification can be obtained by attaching a protecting group selected from the group consisting of an acetyl group, a fluoreonylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and polyethylene glycol (PEG) to the N-terminus of the peptide. The protecting group functions to protect the peptide of the present invention from a protein-cleaving enzyme in vivo.
Модификация С-конца может быть получена путем связывания гидроксильной группы (-OH), аминогруппы (-NH2), азидной группы (-NHNH2) или т.п. с С-концом пептида, без ограничения указанными вариантами.The C-terminal modification can be obtained by coupling a hydroxyl group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an azide group (-NHNH 2 ) or the like. with the C-terminus of the peptide, without limitation to these options.
Согласно варианту осуществления пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, напрямую связывается с 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксином, тем самым предупреждая его проникновение через кожу и механизм активации AhR ТХДД, и полициклическими ароматическими углеводородами, содержащимися в мелкой пыли.In an embodiment, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 binds directly to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, thereby preventing its skin penetration and TCDD AhR activation mechanism, and polycyclic aromatic hydrocarbons contained in fine dust.
Полициклический ароматический углеводород при попадании в клетку связывается с AhR и перемещается в ядро, а затем образует комплекс с ядерным транслокатором AhR (ARNT), который связывается с чувствительным к диоксину элементом (DRE), индуцируя экспрессию зависимых генов. Зависимые гены включают CYP1A1 и различные воспалительные факторы. CYP1A1 участвует в метаболизме различных канцерогенных предшественников, таких как бензопирен, и образующиеся при этом метаболиты реагируют с ДНК, вызывая мутации. Кроме того, повышается экспрессия воспалительных факторов, таких как циклооксигеназа 2 (СОХ2), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкин-1 бета (IL-1e), что приводит к местной воспалительной реакции в области контакта и системному воспалению.The polycyclic aromatic hydrocarbon, upon entering the cell, binds to AhR and moves to the nucleus, and then forms a complex with the AhR nuclear translocator (ARNT), which binds to the dioxin-sensitive element (DRE), inducing the expression of dependent genes. Dependent genes include CYP1A1 and various inflammatory factors. CYP1A1 is involved in the metabolism of various carcinogenic precursors such as benzopyrene, and the resulting metabolites react with DNA to cause mutations. In addition, the expression of inflammatory factors such as cyclooxygenase 2 (COX2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-1 beta (IL-1e) is increased, leading to a local inflammatory reaction at the site of contact and systemic inflammation.
Эти результаты указывают на то, что пептид по настоящему изобретению обладает превосходными эффектами в отношении профилактики и/или лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами.These results indicate that the peptide of the present invention has excellent effects in the prevention and/or treatment of diseases caused by dioxin-like substances.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для профилак- 2 042132 тики или лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by dioxin-like substances, comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 .
Заболевания, вызванные диоксиноподобными веществами, являются очень сложными, и их примеры включают, но не ограничиваются ими, кожные заболевания, включая хлоракне, снижение количества сперматозоидов, рак яичка, рак простаты, гиперплазию эндометрия, рак молочной железы, гепатотоксичность, ослабленный иммунитет, гиперлипидемию, гипоспадию, крипторхизм, врожденные пороки развития, повреждение кровеносных сосудов, гепатоцеллюлярную карциному, гепатомегалию, аденофиброз, потерю веса, выпадение волос, отек полости рта, блефарему и язву слизистой желудка (Carter et al., Science, 188:738(1975); Fourth Annual Report on Carcinogens, NTP 85-002:170, 185(1985)).Diseases caused by dioxin-like substances are very complex and examples include, but are not limited to, skin diseases including chloracne, decreased sperm count, testicular cancer, prostate cancer, endometrial hyperplasia, breast cancer, hepatotoxicity, compromised immunity, hyperlipidemia, hypospadias, cryptorchidism, congenital malformations, blood vessel damage, hepatocellular carcinoma, hepatomegaly, adenofibrosis, weight loss, hair loss, oral edema, blepharema, and gastric ulcer (Carter et al., Science, 188:738(1975); Fourth Annual Report on Carcinogens, NTP 85-002:170, 185(1985)).
Используемый в настоящем описании термин диоксин, обычно используемый в средствах массовой информации, используется в качестве сокращения 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксина (далее именуемого ТХДД). Однако ТХДД является членом семейства полихлорированных дибензо-п-диоксинов (далее ПХДД), а ПХДД включает 75 различных типов родственных соединений с различным положением и числом атомов хлора. В отношении биологических объектов ТХДД известен как наиболее токсичный из ПХДД.As used herein, the term dioxin commonly used in the media is used as an abbreviation for 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (hereinafter referred to as TCDD). However, TCDD is a member of the polychlorinated dibenzo-p-dioxins (hereinafter referred to as PCDD) family, and PCDD includes 75 different types of related compounds with different positions and numbers of chlorine atoms. With regard to biological objects, TCDD is known to be the most toxic of the PCDDs.
Между тем, в литературе опубликованы данные о других ароматических углеводородах, имеющих аналогичные биологические характеристики, что и у ТХДД, например о семействе полихлорированных дибензофуранов (ПХДФ) и семействе полихлорированных бифенилов (ПХБ).Meanwhile, other aromatic hydrocarbons with similar biological characteristics to TCDD have been published in the literature, such as the polychlorinated dibenzofurans (PCDF) family and the polychlorinated biphenyl (PCB) family.
Таким образом, термин диоксин, используемый в данном документе, относится ко всем соединениям, включенным в ПХДД, а термин диоксиноподобные вещества включает ПХДД, ПХДФ и ПХБ, описанные выше, и относится к веществам, обладающим такими же клеточными эффектами, что и ПХДД.Thus, the term dioxin as used herein refers to all compounds included in PCDDs, while the term dioxin-like substances includes the PCDDs, PCDFs and PCBs described above and refers to substances having the same cellular effects as PCDDs.
Было опубликовано, что диоксин как канцерогенное вещество вызывает серьезные заболевания, такие как нарушение репродуктивных процессов и процессов развития, нарушение иммунной системы и нарушение гормональной регуляции (Yang, J.H. et al., Carcinogenesis. 20:13-18(1999), Lee, Y.W. et al., Toxicol. Lett., 102-103:29-83(1998)).As a carcinogen, dioxin has been reported to cause serious diseases such as reproductive and developmental disorders, immune system disorders, and hormonal dysregulation (Yang, J.H. et al., Carcinogenesis. 20:13-18(1999), Lee, Y.W. et al., Toxicol Lett., 102-103:29-83 (1998)).
Агентство по охране окружающей среды США (ЕРА) собрало статистические данные о неблагоприятном воздействии диоксинов и диоксиноподобных веществ на организм человека и опубликовало данные о том, что за последние 50 лет количество сперматозоидов у мужчин снизилось примерно на 50%, заболеваемость раком яичка увеличилась примерно в 3 раза, а раком простаты - в 2 раза. Кроме того, было подтверждено увеличение случаев возникновения гиперплазии эндометрия и рака молочной железы, вызванных диоксином и аналогичными соединениями, по сравнению с таковыми в прошлом.The US Environmental Protection Agency (EPA) has compiled statistics on the adverse effects of dioxins and dioxin-like substances on the human body and published data that over the past 50 years, the number of sperm in men has decreased by about 50%, the incidence of testicular cancer has increased by about 3 times, and prostate cancer - 2 times. In addition, an increase in the incidence of endometrial hyperplasia and breast cancer caused by dioxin and similar compounds was confirmed compared to those in the past.
Фармацевтическая композиция может включать фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.The pharmaceutical composition may include a pharmaceutically effective amount of at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.In addition, the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любое вещество, обычно используемое в фармацевтических препаратах, и его примеры включают, но не ограничиваются этим, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гумиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и препараты подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).A pharmaceutically acceptable carrier may be any substance commonly used in pharmaceutical preparations, and examples include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum arabic, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences ( 19th ed., 1995).
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать в дополнение к ингредиентам, но не ограничиваясь этим, смазывающее вещество, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспензию и консервант.The pharmaceutical composition of the present invention may further include, in addition to the ingredients, but not limited to, a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavor, an emulsifier, a suspension, and a preservative.
Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. При парентеральном введении можно использовать внутримышечную инъекцию, внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, местное введение, трансдермальное введение и т.п., без ограничения вышеуказанными способами.The pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally, preferably parenterally. For parenteral administration, intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, and the like can be used, without being limited to the above methods.
Дозировка фармацевтической композиции может представлять собой количество (но не ограничивается этим) в диапазоне от 0,0001 до 1000 мкг, от 0,001 до 1000 мкг, от 0,01 до 1000 мкг, от 0,1 до 1000 мкг или от 1,0 до 1000 мкг в день, и может назначаться в различных вариантах в зависимости от таких факторов, как форма препарата, способ введения, возраст, вес, пол и заболевание пациента, питание, время введения, путь введения, скорость выведения и степень реакции.The dosage of the pharmaceutical composition may be an amount (but not limited to) in the range of 0.0001 to 1000 µg, 0.001 to 1000 µg, 0.01 to 1000 µg, 0.1 to 1000 µg, or 1.0 to 1000 mcg per day, and may be administered in various ways depending on factors such as the form of the drug, route of administration, age, weight, sex and disease of the patient, nutrition, time of administration, route of administration, rate of elimination and degree of response.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде однодозовой или многодозовой лекарственной формы с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или вспомогательного вещества хорошо известным в данной области способом.The pharmaceutical composition may be formulated as a single dose or multi-dose dosage form using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient in a manner well known in the art.
Состав может представлять собой раствор в масле или водной среде, суспензию, эмульсию, экстракт, порошок, гранулы, таблетку или капсулу и может дополнительно включать способствующее рас- 3 042132 падаемости вещество или стабилизатор.The formulation may be an oil or aqueous solution, suspension, emulsion, extract, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally include a disintegrant or stabilizer.
Другой аспект настоящего изобретения относится к пищевой композиции, противодействующей диоксиноподобным веществам, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, в качестве действующего ингредиента.Another aspect of the present invention relates to a dietary composition against dioxin-like substances, comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, as an active ingredient.
Другой аспект настоящего изобретения относится к пищевой композиции для облегчения и/или ослабления заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, в качестве действующего ингредиента.Another aspect of the present invention relates to a food composition for alleviating and/or attenuating diseases caused by dioxin-like substances, comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, in as an active ingredient.
Заболевания, вызываемые диоксиноподобными веществами, могут включать, но не ограничиваются ими, снижение количества сперматозоидов, рак яичка, рак простаты, гиперплазию эндометрия, рак молочной железы, гепатотоксичность, ослабление иммунитета, гиперлипидемию, гипоспадию, крипторхизм, врожденные пороки развития, повреждение кровеносных сосудов, гепатоцеллюлярную карциному, гепатомегалию, аденофиброз, потерю веса, выпадение волос, отек полости рта, блефарему и язву слизистой желудка.Diseases caused by dioxin-like substances may include, but are not limited to, decreased sperm count, testicular cancer, prostate cancer, endometrial hyperplasia, breast cancer, hepatotoxicity, immunosuppression, hyperlipidemia, hypospadias, cryptorchidism, congenital malformations, damage to blood vessels, hepatocellular carcinoma, hepatomegaly, adenofibrosis, weight loss, hair loss, oral edema, blepharema, and gastric ulcer.
Пищевой продукт может представлять собой различные пищевые продукты, напитки, пищевые добавки и т.п.The food product may be a variety of food products, beverages, nutritional supplements, and the like.
Количество пептида в качестве действующего ингредиента, содержащегося в пищевой композиции, конкретно не ограничено и может быть соответствующим образом подобрано в соответствии с типом пищевого продукта, его назначением и т.п., например, в диапазоне от 0,01 до 15 мас.% в расчете на общую массу пищевого продукта или в диапазоне от 0,02 до 10 г, предпочтительно от 0,3 до 1 г в расчете на 100 мл композиции функционального напитка.The amount of the peptide as an active ingredient contained in the food composition is not particularly limited and can be appropriately selected according to the type of food product, its purpose, and the like, for example, in the range of 0.01 to 15 wt.% in calculated on the total weight of the food product or in the range from 0.02 to 10 g, preferably from 0.3 to 1 g per 100 ml of the functional drink composition.
Когда пищевой продукт представляет собой напиток, жидкие ингредиенты конкретно не ограничены при условии, что пептид содержится в качестве основного ингредиента в заданном соотношении. Кроме того, напиток может включать дополнительные ингредиенты, такие как различные ароматизаторы или натуральные углеводы.When the food product is a drink, the liquid ingredients are not particularly limited as long as the peptide is contained as the main ingredient in a predetermined ratio. In addition, the beverage may include additional ingredients such as various flavors or natural carbohydrates.
Примеры природных углеводов включают обычные подсластители, например моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза, дисахариды, такие как мальтоза и сахароза, и полисахариды, такие как декстрин и циклодекстрин, и сахарный спирт, такой как ксилит, сорбит и эритрит.Examples of natural carbohydrates include conventional sweeteners such as monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohol such as xylitol, sorbitol and erythritol.
В дополнение к описанным выше веществам, в качестве ароматизатора могут быть эффективно использованы натуральные ароматизаторы (например, тауматин и экстракт стевии, например ребаудиозид А и глицирризин) и синтетические ароматизаторы (например, сахарин и аспартам). Количество природных углеводов может составлять от примерно 1 до примерно 20 г, предпочтительно от примерно 5 до примерно 12 г в расчете на 100 мл композиции по настоящему изобретению.In addition to the substances described above, natural flavors (eg, thaumatin and stevia extract, eg, rebaudioside A and glycyrrhizin) and synthetic flavors (eg, saccharin and aspartame) can be effectively used as flavoring agents. The amount of natural carbohydrates may be from about 1 to about 20 grams, preferably from about 5 to about 12 grams, based on 100 ml of the composition of the present invention.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать питательные вещества, витамины, минералы, ароматизаторы, такие как синтетические ароматизаторы и натуральные ароматизаторы, красители и наполнители (сыр, шоколад и т.п.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органическую кислоту, защитные коллоидные загустители, регуляторы рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт и газообразующие агенты, используемые в газированных напитках.The food composition of the present invention may further include nutrients, vitamins, minerals, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colors and fillers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts. , organic acid, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol and gas generating agents used in carbonated beverages.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фруктовую мякоть для приготовления натуральных фруктовых соков, напитков из фруктовых соков и напитков из овощей. Эти ингредиенты могут использоваться независимо или в комбинации. Количество добавок не важно, но может находиться в диапазоне от 0 до примерно 20 мас.ч. в расчете на 100 мас.ч. композиции по настоящему изобретению.The food composition of the present invention may further include fruit pulp for preparing natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks. These ingredients may be used independently or in combination. The amount of additives is not important, but may range from 0 to about 20 parts by weight. per 100 wt.h. compositions of the present invention.
Другой аспект настоящего изобретения относится к косметической композиции для улучшения состояния кожи, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.Another aspect of the present invention relates to a cosmetic composition for improving skin condition, comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
Косметическая композиция может включать (а) косметически эффективное количество пептида по настоящему изобретению, описанное выше, и/или (b) косметически приемлемый носитель, не ограничиваясь ими.The cosmetic composition may include (a) a cosmetically effective amount of the peptide of the present invention, as described above, and/or (b) a cosmetically acceptable carrier, without being limited to them.
Используемый в данном документе термин косметически эффективное количество относится к количеству, достаточному для достижения эффекта композиции по настоящему изобретению в отношении улучшения состояния кожи.As used herein, the term cosmetically effective amount refers to an amount sufficient to achieve the skin-improving effect of the composition of the present invention.
Косметическая композиция может быть изготовлена в виде любой композиции, обычно используемой в данной области. Например, косметическая композиция может быть изготовлена в виде, но не ограничена этим, раствора, суспензии, эмульсии, пасты, геля, крема, лосьона, порошка, мыла, содержащего поверхностно-активное вещество средства для умывания, масла, порошкообразного тонального средства, эмульсионного тонального средства, воскового тонального средства и спрея. Более конкретно, косметическая композиция может быть изготовлена в виде смягчающего лосьона, питательного лосьона, питательного крема, массажного крема, эссенции, крема для глаз, очищающего крема, очищающей пены, очищающей воды, пакета, спрея или порошка.The cosmetic composition can be made in the form of any composition commonly used in this field. For example, a cosmetic composition may be in the form of, but is not limited to, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleanser, oil, powder foundation, emulsion foundation. product, wax foundation and spray. More specifically, the cosmetic composition may be in the form of an emollient lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pouch, spray, or powder.
- 4 042132- 4 042132
Когда косметическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде пасты, крема или геля, носителем может быть животное масло, растительное масло, воск, парафин, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоль, силикон, бентонит, диоксид кремния, тальк, оксид цинка и т.п.When the cosmetic composition of the present invention is formulated as a paste, cream or gel, the carrier may be animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silicon dioxide, talc, zinc oxide, etc. .P.
Когда косметическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде порошка или спрея, носителем может быть лактоза, тальк, диоксид кремния, гидроксид алюминия, силикат кальция или порошковый полиамид. В частности, в спрее может дополнительно использоваться пропеллент, такой как хлорфторуглеводород, пропан/бутан или диметиловый эфир.When the cosmetic composition of the present invention is formulated as a powder or spray, the carrier may be lactose, talc, silicon dioxide, aluminum hydroxide, calcium silicate or powdered polyamide. In particular, a propellant such as a chlorofluorocarbon, propane/butane or dimethyl ether may be additionally used in the spray.
Когда косметическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде раствора или эмульсии, носитель может представлять собой растворитель, солюбилизатор или эмульгатор, такой как вода, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутилгликоль, масло, алифатический эфир глицерина, полиэтиленгликоль или эфир жирной кислоты и сорбита.When the cosmetic composition of the present invention is formulated as a solution or emulsion, the carrier may be a solvent, solubilizer or emulsifier such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol, oil, an aliphatic ester of glycerol, polyethylene glycol or a fatty acid ester of sorbitol.
Когда косметическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде суспензии, носитель может представлять собой жидкий разбавитель, такой как вода, этанол или пропиленгликоль, суспендирующий агент, такой как этоксилированный изостеариловый спирт, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитола и сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана. микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар и трагакант.When the cosmetic composition of the present invention is formulated as a suspension, the carrier may be a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester. microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar and tragacanth.
Когда косметическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде содержащего поверхностно-активное вещество средства для умывания, носителем может быть сульфат алифатического спирта, сульфат простого эфира алифатического спирта, сульфосукциновый сложный моноэфир, изотионат, производные имидазолиния, метилтаурат, саркозинат, сульфат эфира амида жирной кислоты, алкиламидобетаин, алифатический спирт, глицерид жирной кислоты, диэтаноламид жирной кислоты, растительное масло, производные ланолина или сложный эфир этоксилированного глицерина и жирной кислоты.When the cosmetic composition of the present invention is formulated as a surfactant-containing cleanser, the carrier may be aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic monoester, isothionate, imidazolinium derivatives, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide ester sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid ester.
Косметическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать, помимо пептида и носителя в качестве действующих ингредиентов, другие компоненты, обычно используемые в косметических композициях. Например, в композицию могут быть включены стандартные адъюванты, такие как антиоксидант, стабилизатор, солюбилизатор, витамины, пигмент и ароматизатор.The cosmetic composition of the present invention may further include, in addition to the peptide and carrier as active ingredients, other components commonly used in cosmetic compositions. For example, standard adjuvants such as an antioxidant, stabilizer, solubilizer, vitamins, pigment, and flavor may be included in the composition.
Используемый в настоящем документе термин улучшение состояния кожи в широком смысле относится к процессам лечения, устранения и облегчения поражений кожи, вызванных внутренним или внешним фактором, и эффекты улучшения, например, можно интерпретировать как наблюдаемый эффект облегчения или ослабления кожного воспаления, но не ограниченные этим.As used herein, the term skin improvement broadly refers to the processes of treating, eliminating and alleviating skin lesions caused by an internal or external factor, and improvement effects, for example, can be interpreted as an observable effect of alleviating or alleviating skin inflammation, but not limited to this.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу предупреждения лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами.Another aspect of the present invention relates to a method for preventing the treatment of diseases caused by dioxin-like substances.
Способ может включать осуществление контакта фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере один пептид, выбранный из пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с субъектом.The method may include contacting a pharmaceutical composition comprising at least one peptide selected from peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 with a subject.
Фармацевтическая композиция описана выше.The pharmaceutical composition is described above.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, для предупреждения или лечения заболеваний, вызванных диоксиноподобными веществами.Another aspect of the present invention relates to the use of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 for the prevention or treatment of diseases caused by dioxin-like substances.
Пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, описан выше.The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is described above.
Во всем описании термин пептид относится к линейной молекуле, состоящей из аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. Пептид по настоящему изобретению может быть получен в соответствии с любыми известными способами химического синтеза, в частности методами твердофазного синтеза (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) или методами жидкофазного синтеза (патент США № 5516891).Throughout the description, the term peptide refers to a linear molecule consisting of amino acid residues linked by peptide bonds. The peptide of the present invention can be prepared according to any known chemical synthesis methods, in particular solid phase synthesis methods (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis methods (US Pat. No. 5,516,891).
Используемый в настоящем документе термин стабильность относится не только к стабильности in vivo, но также к стабильности при хранении (например, к стабильности при хранении при комнатной температуре).As used herein, the term stability refers not only to in vivo stability, but also to storage stability (eg, storage stability at room temperature).
Во всем описании термин фармацевтически эффективное количество относится к количеству, достаточному для достижения эффекта или действия пептида.Throughout the description, the term pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to achieve the effect or effect of the peptide.
Полезный эффект изобретенияUseful effect of the invention
Настоящее изобретение относится к пептиду с цитопротекторным эффектом против загрязняющих окружающую среду веществ и к его применению. Было подтверждено, что пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, напрямую связывается с 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксином (далее называемым ТХДД), известным как наиболее токсичное соединение в классе диоксинов, тем самым предупреждая проникновение через кожу и активацию арилуглеводородного рецептора (AhR) содержащимися в мелкой пыли ТХДД и полициклическими ароматическими углеводородами. Такой прямой цитопротекторный эффект в отношении загрязняющих окружающую среду веществThe present invention relates to a peptide with a cytoprotective effect against environmental pollutants and to its use. A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 has been confirmed to directly bind to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (hereinafter referred to as TCDD), known as the most toxic compound in the class of dioxins. , thereby preventing skin penetration and activation of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) by TCDD and polycyclic aromatic hydrocarbons contained in the fine dust. Such a direct cytoprotective effect on environmental pollutants
- 5 042132 отличается от ранее существующих способов, которые направлены на непрямое блокирование возможности контакта с этими веществами или на снижение токсичности за счет усиления барьерной функции.- 5 042132 differs from previously existing methods that are aimed at indirectly blocking the possibility of contact with these substances or at reducing toxicity by enhancing the barrier function.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1А представляет собой график, показывающий силу связывания пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, с ТХДД согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 1A is a graph showing the binding strength of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to TCDD according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 1В представляет собой график, показывающий силу связывания пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, с ТХДД согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 1B is a graph showing the binding strength of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to TCDD according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 1С представляет собой график, показывающий силу связывания пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, с ТХДД согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 1C is a graph showing the binding strength of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to TCDD according to an embodiment of the present invention.
На фиг. 2А показаны результаты теста на ядерную транслокацию AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.In FIG. 2A shows the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 2В представляет собой график, показывающий результаты теста на ядерную транслокацию AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 2B is a graph showing the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention.
На фиг. 2С показаны результаты теста на ядерную транслокацию AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.In FIG. 2C shows the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 2D представляет собой график, показывающий результаты теста на ядерную транслокацию AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 2D is a graph showing the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
На фиг. 2Е показаны результаты теста на ядерную транслокацию AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.In FIG. 2E shows the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 2F представляет собой график, показывающий результаты теста на ядерную транслокацию AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 2F is a graph showing the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 3A представляет собой график, показывающий результаты иммуноцитофлуоресцентного анализа на ТХДД для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 3A is a graph showing the results of TCDD immunocytofluorescence analysis for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 3B представляет собой график, показывающий результаты иммуноцитофлуоресцентного анализа на ТХДД для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 3B is a graph showing the results of TCDD immunocytofluorescence analysis for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 3C представляет собой график, показывающий результаты иммуноцитофлуоресцентного анализа на ТХДД для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 3C is a graph showing the results of TCDD immunocytofluorescence analysis for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 4А представляет собой график, показывающий результаты анализа на ROS для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения в клетках.Fig. 4A is a graph showing the results of a ROS assay for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention in cells.
Фиг. 4В представляет собой график, показывающий результаты анализа на ROS для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно варианту осуществления настоящего изобретения в клетках.Fig. 4B is a graph showing the results of a ROS assay for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention in cells.
Фиг. 4С представляет собой график, показывающий результаты анализа на ROS для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения в клетках.Fig. 4C is a graph showing the results of a ROS assay for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention in cells.
Фиг. 5А представляет собой график, показывающий результаты ОТ-ПЦР на CYP1A1 и воспалительные молекулы при использовании пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 5A is a graph showing RT-PCR results for CYP1A1 and inflammatory molecules using a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 5В представляет собой график, показывающий результаты ОТ-ПЦР на CYP1A1 и воспалительные молекулы при использовании пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 5B is a graph showing RT-PCR results for CYP1A1 and inflammatory molecules using a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 5С представляет собой график, показывающий результаты ОТ-ПЦР на CYP1A1 и воспалительные молекулы при использовании пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 5C is a graph showing RT-PCR results for CYP1A1 and inflammatory molecules using a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 6A представляет собой график, показывающий результаты теста на ядерную транслокации AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 6A is a graph showing the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 6B представляет собой график, показывающий результаты теста на ядерную транслокации AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно вариантуFig. 6B is a graph showing the results of the AhR nuclear translocation test for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, according to the variant
- 6 042132 осуществления настоящего изобретения.- 6 042132 implementation of the present invention.
Фиг. 6C представляет собой график, показывающий результаты теста на ядерную транслокацииFig. 6C is a graph showing the results of the nuclear translocation test.
AhR для пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.AhR for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 7А представляет собой график, показывающий результаты ОТ-ПЦР на CYP1A1 и воспалительные молекулы при использовании пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 7A is a graph showing RT-PCR results for CYP1A1 and inflammatory molecules using a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 7В представляет собой график, показывающий результаты ОТ-ПЦР на CYP1A1 и воспалительные молекулы при использовании пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 7B is a graph showing RT-PCR results for CYP1A1 and inflammatory molecules using a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
Фиг. 7С представляет собой график, показывающий результаты ОТ-ПЦР на CYP1A1 и воспалительные молекулы при использовании пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.Fig. 7C is a graph showing RT-PCR results for CYP1A1 and inflammatory molecules using a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 according to an embodiment of the present invention.
Лучший вариант осуществления изобретенияThe best embodiment of the invention
Настоящее изобретение относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3.The present invention relates to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
Вариант осуществления изобретения.An embodiment of the invention.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на нижеследующие примеры. Однако эти примеры предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present disclosure.
Пример изготовления.Manufacturing example.
Синтез пептидов из списка последовательностей.Synthesis of peptides from a list of sequences.
г хлор-тритилхлоридной смолы (смола СТС, Nova biochem, кат. № 01-64-0021) добавляли в реактор и туда добавляли 490 мл метиленхлорида (МС) с последующим перемешиванием в течение 3 мин. Затем после удаления из него раствора добавляли 490 мл диметилформамида (DMF), смесь перемешивали в течение 3 мин и из нее удаляли растворитель. В реактор добавляли 700 мл раствора дихлорметана, а затем в него добавляли 200 ммоль Fmoc-Tyr(tBu)-OH (Bachem, Swiss) и 400 ммоль диизопропилэтиламина (DIEA). Смесь растворяли при перемешивании и выдерживали в течение 1 ч при перемешивании. После промывки полученного продукта метанолом и DIEA (2:1) его растворяли в дихлорметане (DCM) и выдерживали в течение 10 мин, а затем полученный продукт промывали избытком смеси DCM/DMF (1:1). Затем после удаления раствора к нему добавляли 490 мл DMF и смесь перемешивали в течение 3 мин, а затем из нее удаляли растворитель. В реактор добавляли 700 мл раствора для снятия защиты (20%-ный пиперидин в DMF) и перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем раствор удаляли. После повторного добавления того же количества раствора для снятия защиты и инкубации в течение 10 мин раствор удаляли и полученный продукт дважды промывали DMF, один раз МС и один раз DMF, каждый раз в течение 3 мин, чтобы получить Tyr(tBu)-CTL смолу.g of chlorotrityl chloride resin (CTC resin, Nova biochem, cat. no. 01-64-0021) was added to the reactor, and 490 ml of methylene chloride (MC) was added thereto, followed by stirring for 3 minutes. Then, after removing the solution therefrom, 490 ml of dimethylformamide (DMF) was added, the mixture was stirred for 3 minutes, and the solvent was removed from it. 700 ml of dichloromethane solution was added to the reactor, and then 200 mmol of Fmoc-Tyr(tBu)-OH (Bachem, Swiss) and 400 mmol of diisopropylethylamine (DIEA) were added thereto. The mixture was dissolved with stirring and kept for 1 hour with stirring. After washing the resulting product with methanol and DIEA (2:1), it was dissolved in dichloromethane (DCM) and kept for 10 min, and then the resulting product was washed with an excess of a mixture of DCM/DMF (1:1). Then, after removing the solution, 490 ml of DMF was added thereto, and the mixture was stirred for 3 minutes, and then the solvent was removed from it. 700 ml of deprotection solution (20% piperidine in DMF) was added to the reactor and stirred for 10 minutes at room temperature, and then the solution was removed. After re-adding the same amount of deprotection solution and incubating for 10 minutes, the solution was removed and the resulting product was washed twice with DMF, once with MC and once with DMF, each time for 3 minutes, to obtain a Tyr(tBu)-CTL resin.
В новый реактор добавляли 700 мл раствора DMF и к нему добавляли 200 ммоль Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Bachem, Swiss), 200 ммоль HoBt и 200 ммоль HBTu и растворяли при перемешивании. В реактор двумя порциями добавляли 400 ммоль DIEA и смесь перемешивали в течение по меньшей мере 5 мин, чтобы полностью растворить все твердое вещество. Растворенную смесь аминокислот добавляли в реактор, включая смолу со снятой защитой, и выдерживали в течение 1 ч при перемешивании при комнатной температуре. После удаления реакционного раствора полученный продукт перемешивали с раствором DMF три раза, каждый раз в течение 5 мин, а затем из него удаляли раствор DMF. Отбирали небольшое количество реакционной смолы и степень прохождения реакции проверяли с помощью теста Кайзера (нингидринового теста). Реакцию снятия защиты проводили дважды одинаковым образом с использованием раствора для снятия защиты, таким образом получая смолу Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTL. Смолу в достаточной степени промывали DMF и МС и снова проверяли с помощью теста Кайзера с последующим тестом на связывание аминокислот, как описано выше. В соответствии с выбранной аминокислотной последовательностью цепные реакции проводили в следующем порядке: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, FmocGly-OH, Fmoc-Trp-OH и Fmoc-Lys(Boc)-OH. После того как для удаления Fmoc-защитной группы продукт два раза обрабатывали раствором для снятия защиты, каждый раз в течение 10 мин, раствор для снятия защиты удаляли промывкой. Пептидильную смолу промывали DMF, МС и метанолом по три раза каждым растворителем и сушили в медленном токе азота, а затем полностью досушивали над Р2О5 в вакууме. Затем добавляли 1900 мл отщепляющего раствора [81,5% трифторуксусной кислоты, 5,0% дистиллированной воды, 5,0% тиоанизола, 5,0% фенола, 2,5% этандитиола (EDT) и 1,0% триизопропилсилана (TIS)] и реакционную смесь оставляли при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании. Смолу отфильтровывали, промывали небольшим количеством раствора TFA и смешивали с маточным раствором. Холодный эфир добавляли к 2090 мл маточного раствора, чтобы получить осадок, смесь центрифугировали для сбора осадка, а затем дважды промывали холодным эфиром. После удаления маточного раствора полученный продукт сушили в атмосфере азота в достаточной степени, чтобы получить до очистки 70,8 г пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (выход: 97,0%). Молекулярная масса пептида, составляющая 822,9 (теоретическое значение: 822,9), была полу- 7 042132 чена с помощью измерения молекулярной массы.700 ml of DMF solution was added to the new reactor and 200 mmol of Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Bachem, Swiss), 200 mmol of HoBt and 200 mmol of HBTu were added thereto and dissolved with stirring. 400 mmol DIEA was added to the reactor in two portions and the mixture was stirred for at least 5 minutes to completely dissolve all solids. The dissolved mixture of amino acids was added to the reactor, including the deprotected resin, and kept for 1 hour with stirring at room temperature. After the reaction solution was removed, the resulting product was stirred with the DMF solution three times for 5 minutes each time, and then the DMF solution was removed therefrom. A small amount of the reaction resin was taken, and the progress of the reaction was checked by the Kaiser test (ninhydrin test). The deprotection reaction was carried out twice in the same manner using the deprotection solution, thus obtaining an Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTL resin. The resin was washed sufficiently with DMF and MC and tested again with the Kaiser test followed by the amino acid binding test as described above. According to the chosen amino acid sequence, chain reactions were carried out in the following order: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, FmocGly-OH, Fmoc-Trp-OH, and Fmoc-Lys(Boc)-OH. After the product was treated with the deprotection solution twice to remove the Fmoc protecting group, each time for 10 minutes, the deprotection solution was removed by washing. The peptidyl resin was washed with DMF, MC and methanol three times with each solvent and dried under a slow stream of nitrogen and then completely dried over P 2 O 5 in vacuo. Then 1900 ml of a cleaving solution [81.5% trifluoroacetic acid, 5.0% distilled water, 5.0% thioanisole, 5.0% phenol, 2.5% ethanedithiol (EDT) and 1.0% triisopropylsilane (TIS) was added. ] and the reaction mixture was left at room temperature for 2 h with shaking. The resin was filtered off, washed with a small amount of TFA solution and mixed with the mother liquor. Cold ether was added to 2090 ml of the mother liquor to give a precipitate, the mixture was centrifuged to collect the precipitate, and then washed twice with cold ether. After removal of the mother liquor, the resulting product was dried sufficiently under nitrogen to obtain 70.8 g of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (yield: 97.0%) before purification. The molecular weight of the peptide, 822.9 (theoretical value: 822.9), was obtained by molecular weight measurement.
Пептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, синтезируют таким же образом, что и описанный выше способ.Peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 are synthesized in the same manner as the method described above.
Таблица 1Table 1
Пример 1. Анализ связывания in vitro.Example 1 In Vitro Binding Assay.
Каждый из пептидов, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, смешанных с буфером для покрытия (20 мМ фосфат натрия, рН 9,6) в концентрации 1,8 мМ, вносили в лунки планшета для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и инкубировали при 4°C в течение ночи. Затем пептид промывали фосфатно-солевым буферным раствором с Tween-20 (PBST) и блокировали 3%-ным бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания PBST в каждую лунку добавляли 2 мкМ 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксина (далее называемого ТХДД) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем после промывания PBST добавляли антитела к ТХДД, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), в соотношении антитело:PBST, равном 1:100, и полученную смесь инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем после промывания PBST измеряли эмиссию при 520 нм после возбуждения при 488 нм с использованием флуоресцентного спектрофотометра, и результаты показаны на фиг. 1А-1С и приведены в табл. 2.Each of the peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, mixed with coating buffer (20 mM sodium phosphate, pH 9.6) at a concentration of 1.8 mM, was added to the wells of an ELISA plate. ) and incubated at 4°C overnight. The peptide was then washed with Tween-20 phosphate buffered saline (PBST) and blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) for 2 hours at room temperature. After washing with PBST, 2 μM 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (hereinafter referred to as TCDD) was added to each well and incubated at room temperature for 2 h. Then, after washing with PBST, anti-TCDD antibodies conjugated with fluorescein isothiocyanate ( FITC) in an antibody:PBST ratio of 1:100 and the resulting mixture was incubated for 2 hours at room temperature. Then, after washing with PBST, the emission at 520 nm was measured after excitation at 488 nm using a fluorescence spectrophotometer, and the results are shown in FIG. 1A-1C and are given in table. 2.
Таблица 2table 2
Как видно из фиг. 1А-1С и табл. 2, было подтверждено, что пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, напрямую связывается с ТХДД.As can be seen from FIG. 1A-1C and Table. 2, it was confirmed that a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 directly binds to TCDD.
Пример 2. Тест на ядерную транслокацию AhR.Example 2 AhR nuclear translocation test.
Клетки НаСаТ (клетки кератиноцитов человека) высевали на 6-луночный планшет с плотностью 3х105 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Затем в культуральную среду добавляли 10 нМ ТХДД и 50 мкМ пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3. После 30-минутной реакции клетки обрабатывали в течение 1 ч и собирали для получения ядерных и цитоплазматических белков, отделенных друг от друга. Вестерн-блоттинг проводили с использованием антител к арилуглеводородному рецептору (AhR) (Santa Cruz Biotechnology, США) для идентификации активации ядерной транслокации AhR, и результаты показаны на фиг. 2A-2F и приведены в табл. 3.HaCaT cells (human keratinocyte cells) were seeded in a 6-well plate at a density of 3x10 5 cells/well and cultured overnight. Then, 10 nM TCDD and 50 μM of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 were added to the culture medium. After a 30-minute reaction, cells were treated for 1 h and harvested to obtain nuclear and cytoplasmic proteins separated from friend. Western blotting was performed using anti-aryl hydrocarbon receptor (AhR) antibodies (Santa Cruz Biotechnology, USA) to identify AhR nuclear translocation activation, and the results are shown in FIG. 2A-2F and are given in table. 3.
Таблица 3Table 3
Как видно из фиг. 2A-2F и табл. 3, было подтверждено, что пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, ингибирует ядерную транслокацию AhR, вызываемую ТХДД.As can be seen from FIG. 2A-2F and Table. 3, it was confirmed that a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 inhibits AhR nuclear translocation caused by TCDD.
Пример 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание ТХДД.Example 3 Immunofluorescent staining with TCDD.
Клетки НаСаТ (клетки кератиноцитов человека) высевали на 6-луночный планшет с плотностью 3х105 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Затем в культуральную среду добавляли 50 нМ ТХДД и 50 мкМ пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3. После 30-минутной реакции клетки обрабатывали в течение 5 мин и иммобилизовали 4%-ным парафор- 8 042132 мальдегидом в течение 30 мин. Затем, после трехкратной промывки, клетки обрабатывали 0,5%-ным Triton X-100 в течение 15 мин и трижды промывали. Затем клетки блокировали 3%-ным BSA в течение 1 ч и окрашивали первичными антителами к ТХДД, конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (в разведении 1:100), при 4°C в течение ночи. Клетки окрашивали 4,6-диамидино-2фенилиндолом (DAPI), монтировали и наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Результаты показаны на фиг. 3A-3C.HaCaT cells (human keratinocyte cells) were seeded in a 6-well plate at a density of 3x10 5 cells/well and cultured overnight. Then, 50 nM TCDD and 50 μM of the peptide consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, 2, or 3 were added to the culture medium. After a 30-minute reaction, the cells were treated for 5 minutes and immobilized with 4% paraformaldehyde in within 30 min. Then, after washing three times, the cells were treated with 0.5% Triton X-100 for 15 min and washed three times. Cells were then blocked with 3% BSA for 1 hour and stained with fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated primary anti-TCDD antibody (1:100 dilution) at 4° C. overnight. Cells were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), mounted and observed with a fluorescent microscope. The results are shown in FIG. 3A-3C.
Как показано на фиг. 3A-3C, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, ингибировал вхождение ТХДД в клетки.As shown in FIG. 3A-3C, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 inhibited the entry of TCDD into cells.
Пример 4. Анализ на ROS в клетках.Example 4 ROS assay in cells.
Клетки НаСаТ (клетки кератиноцитов человека) высевали на 6-луночный планшет с плотностью 3x105 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Затем в культуральную среду добавляли 10 нМ ТХДД и 50 мкМ пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3. После 30-минутной реакции клетки обрабатывали в течение 24 ч и дополнительно обрабатывали DCFH-DA в течение 30 мин. Затем клетки собирали и анализировали методом флуоресцентноактивируемой проточной цитометрии (FACS), чтобы измерить изменение средних значений в канале FL1 (зеленая флуоресценция), и результаты показаны на фиг. 4А-4С.HaCaT cells (human keratinocyte cells) were plated in a 6-well plate at a density of 3x105 cells/well and cultured overnight. Then, 10 nM TCDD and 50 μM of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 were added to the culture medium. After a 30-minute reaction, the cells were treated for 24 h and additionally treated with DCFH-DA for 30 min. The cells were then harvested and analyzed by fluorescence activated flow cytometry (FACS) to measure the change in mean values in the FL1 channel (green fluorescence), and the results are shown in FIG. 4A-4C.
Как показано на фиг. 4А-4С, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, снижает уровень ROS в клетках, повышающийся при действии ТХДД.As shown in FIG. 4A-4C, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 reduces the level of ROS in cells that is elevated by TCDD.
Пример 5. Анализ CYP1A1 и воспалительных молекул с помощью ОТ-ПЦР.Example 5 Analysis of CYP1A1 and inflammatory molecules by RT-PCR.
Клетки НаСаТ (клетки кератиноцитов человека) высевали на 6-луночный планшет с плотностью 3x105 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Затем в культуральную среду добавляли 10 нМ ТХДД и 50 мкМ пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3. После 30-минутной реакции клетки обрабатывали в течение 6 или 24 ч и собирали для выделения от них РНК. После количественного определения РНК синтезировали кДНК с использованием набора для синтеза кДНК (Intron, Корея). Затем проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием набора PCR PreMix (Intron, Корея) и праймеров для каждого из CYP1A1, TNF-α, IL-6, IL/β и СОХ-2, показанных в табл. 4. Затем полученные продукты разделяли на 5%-ном агарозном геле и проводили сравнение уровней экспрессии мРНК факторов роста в образцах с различными условиями обработки, и результаты показаны на фиг. 5А-5С.HaCaT cells (human keratinocyte cells) were plated in a 6-well plate at a density of 3x105 cells/well and cultured overnight. Then, 10 nM TCDD and 50 μM of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 were added to the culture medium. After a 30-minute reaction, the cells were treated for 6 or 24 hours and harvested for RNA isolation. After RNA quantification, cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (Intron, Korea). A polymerase chain reaction (PCR) was then performed using the PCR PreMix kit (Intron, Korea) and primers for each of CYP1A1, TNF-α, IL-6, IL/β, and COX-2 shown in Table 1. 4. The resulting products were then separated on a 5% agarose gel, and the growth factor mRNA expression levels in the samples under different processing conditions were compared, and the results are shown in FIG. 5A-5C.
Таблица 4Table 4
Как показано на фиг. 5А-5С, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, обладает эффектом ингибирования экспрессии CYPIAI и различных воспалительных факторов, индуцированной ТХДД.As shown in FIG. 5A-5C, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 has an effect of inhibiting the expression of CYPIAI and various TCDD-induced inflammatory factors.
Пример 6. Тест на ядерную транслокацию AhR.Example 6 AhR nuclear translocation test.
Клетки НаСаТ (клетки кератиноцитов человека) высевали на 6-луночный планшет с плотностью 3x105 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. 10 нМ городских пылевидных частиц (РМ, Sigma Aldrich, США) и 50 мкМ пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, добавляли в культуральную среду. После 30-минутной реакции клетки обрабатывали в течение 1 ч и собирали для получения ядерных и цитоплазматических белков, отделенных друг от друга. Затем проводили Вестерн-блоттинг с использованием антител к арилуглеводородному рецептору (AhR) (Santa Cruz Biotechnology, США) для идентификации активации ядерной транслокации AhR, и результаты показаны на фиг. 6А-6С.HaCaT cells (human keratinocyte cells) were plated in a 6-well plate at a density of 3x105 cells/well and cultured overnight. 10 nM urban dust particles (PM, Sigma Aldrich, USA) and 50 μM of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 were added to the culture medium. After a 30 minute reaction, the cells were treated for 1 hour and harvested to obtain nuclear and cytoplasmic proteins separated from each other. A Western blot was then performed using anti-aryl hydrocarbon receptor (AhR) antibodies (Santa Cruz Biotechnology, USA) to identify AhR nuclear translocation activation, and the results are shown in FIG. 6A-6C.
Как показано на фиг. 6А-6С, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, ингибировал ядерную транслокацию AhR, вызываемую частицами.As shown in FIG. 6A-6C, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 inhibited particle-induced AhR nuclear translocation.
Пример 7. Анализ CYP1A1 и воспалительных молекул с помощью ОТ-ПЦР.Example 7 Analysis of CYP1A1 and inflammatory molecules by RT-PCR.
Клетки НаСаТ (клетки кератиноцитов человека) высевали на 6-луночный планшет с плотностью 3x105 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Затем в культуральную среду добавляли 10 нМ пылевидных частиц (РМ) и 50 мкМ пептида, состоящего из аминокислотной последовательностиHaCaT cells (human keratinocyte cells) were plated in a 6-well plate at a density of 3x105 cells/well and cultured overnight. Then, 10 nM of dust particles (PM) and 50 μM of a peptide consisting of the amino acid sequence
- 9 042132- 9 042132
SEQ ID NO: 1, 2 или 3. После 30-минутной реакции клетки обрабатывали в течение 6 или 24 ч и собирали для выделения от них РНК. После количественного определения РНК синтезировали кДНК с использованием набора для синтеза кДНК (Intron, Корея). Затем проводили ПЦР с использованием набора PCR PreMix (Intron, Корея) и праймеров для каждого из CYP1A1, TNF-α, IL-6, IL-1e и СОХ-2, показанных в табл. 5. Затем полученные продукты разделяли на 5%-ном агарозном геле и проводили сравнение уровней экспрессии мРНК факторов роста в образцах с различными условиями обработки, и результаты показаны на фиг. 7А-7С.SEQ ID NO: 1, 2, or 3. After a 30 minute reaction, cells were treated for 6 or 24 hours and harvested for RNA isolation. After RNA quantification, cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (Intron, Korea). PCR was then performed using the PCR PreMix kit (Intron, Korea) and primers for each of CYP1A1, TNF-α, IL-6, IL-1e, and COX-2 shown in Table 1. 5. The resulting products were then separated on a 5% agarose gel, and the growth factor mRNA expression levels in the samples under different processing conditions were compared, and the results are shown in FIG. 7A-7C.
Таблица 5Table 5
Как показано на фиг. 7А-7С, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3, обладает эффектом ингибирования экспрессии CYPIAI и различных воспалительных факторов, индуцируемой пылевидными частицами.As shown in FIG. 7A-7C, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 has an effect of inhibiting the expression of CYPIAI and various inflammatory factors induced by dust particles.
Промышленное применениеIndustrial Application
Настоящее раскрытие относится к пептиду с цитопротекторным эффектом против загрязняющих окружающую среду веществ и к его применению.The present disclosure relates to a peptide with a cytoprotective effect against environmental pollutants and its use.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2017-0040514 | 2017-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA042132B1 true EA042132B1 (en) | 2023-01-18 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11597748B2 (en) | Peptide having cytoprotective effect against environmental pollutant and use thereof | |
| KR102497726B1 (en) | Improved peptide pharmaceuticals for insulin resistance | |
| EP2156846B1 (en) | Prophylactic or therapeutic agent for diarrhea | |
| JP6868724B2 (en) | Peptides showing melanin production promoting activity and their uses | |
| ES2879641T3 (en) | Anti-inflammatory, antifibrotic and wound healing octapeptides and compositions containing them | |
| CN105531284B (en) | Cell penetrating peptides and conjugates comprising the same | |
| CN112236441A (en) | Peptide for preventing skin damage caused by atmospheric pollutants and resisting aging and application thereof | |
| JP2009537511A (en) | Antibacterial and anticancer novel peptide analogs synthesized and extracted from Gaegrin 5 | |
| EA042132B1 (en) | PEPTIDE WITH CYTOPROTECTOR EFFECT AGAINST ENVIRONMENTAL POLLUTANTS AND ITS APPLICATION | |
| KR101954214B1 (en) | Peptides Having Activity for Promoting Melanin Synthesis and Uses Thereof | |
| JP2007099677A (en) | Tyrosinase inhibitor, bleaching agent and bleaching external preparation | |
| KR102266613B1 (en) | Novel Peptide Having Anti-inflammatory Activity and Uses Thereof | |
| KR101920052B1 (en) | Peptides Having Activity for Promoting Melanin Synthesis and Uses Thereof | |
| DE60025332T2 (en) | SYNTHETIC PEPTIDE FOR TROUBLESHOOTING INTRA-CELLULAR SIGNALS | |
| KR102290215B1 (en) | Novel Peptide Having Anti-inflammatory Activity and Uses Thereof | |
| KR102290200B1 (en) | Novel Peptide Having Anti-inflammatory Activity and Uses Thereof | |
| KR102290204B1 (en) | Novel Peptide Having Anti-inflammatory Activity and Uses Thereof | |
| KR102474470B1 (en) | Peptide Having Activity of Protecting Cell Damage From Particulate Matter and Uses Thereof | |
| KR102539445B1 (en) | Peptide Having Activity of Protecting Cell Damage From Particulate Matter and Uses Thereof | |
| RU2818535C1 (en) | Peptide having protective activity against cell damage caused by solid particles, and use thereof | |
| KR100615971B1 (en) | Analogues of anticancer peptide synthesized and prepared from Gaegurin 5 | |
| KR20110040371A (en) | Vaccinium uliginosum l. extract which enhances cell transducibility of superoxide dismutase fusion protein | |
| CN116782944A (en) | Compositions for enhancing adrenomedullin gene expression | |
| KR20230068866A (en) | Peptide for treating sepsis derived from rv3364c protein of mycobacterium tuberculosis |