EA041572B1 - ANTIBODIES TO CD3, ANTIBODIES TO CD123 AND BI-SPECIFIC ANTIBODIES THAT BIND SPECIFICALLY TO CD3 AND/OR CD123 - Google Patents

ANTIBODIES TO CD3, ANTIBODIES TO CD123 AND BI-SPECIFIC ANTIBODIES THAT BIND SPECIFICALLY TO CD3 AND/OR CD123 Download PDF

Info

Publication number
EA041572B1
EA041572B1 EA201791666 EA041572B1 EA 041572 B1 EA041572 B1 EA 041572B1 EA 201791666 EA201791666 EA 201791666 EA 041572 B1 EA041572 B1 EA 041572B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
sequence
amino acid
chain variable
acid sequence
Prior art date
Application number
EA201791666
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Яна Альбрехт
Седрик Баррьер
Кристиан Байль
Йохен Бенинга
Шанталь Карре
Стефан Гериф
Катя Кролль
Кристиан Ланге
Сендрин Лемуан
Вульф-Дирк Лойшнер
Эрколе Рао
Марион Шнайдер
Мари-Сесиль Ветзель
Петер Вонеров
Original Assignee
Санофи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Санофи filed Critical Санофи
Publication of EA041572B1 publication Critical patent/EA041572B1/en

Links

Description

Изобретение распространяется на антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3 и специфически связывается по меньшей мере с одним дополнительным антигеном, например CD123. Настоящее изобретение дополнительно распространяется на антитела к CD3 и антитела к CD123. Настоящее изобретение также распространяется на антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD123 и специфически связывается по меньшей мере с одним дополнительным антигеном. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антителоподобный связывающий белок, антитела к CD3 или антитела к CD123 по настоящему изобретению, и их применению в лечении рака. Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным нуклеиновым кислотам, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим последовательность, кодирующую указанный антителоподобный связывающий белок, антитело к CD3 или антитело к CD123, и к применению указанного антитела к CD123 в качестве средства диагностики.The invention extends to an antibody-like binding protein that specifically binds to CD3 and specifically binds to at least one additional antigen, such as CD123. The present invention further extends to anti-CD3 antibodies and anti-CD123 antibodies. The present invention also extends to an antibody-like binding protein that specifically binds to CD123 and specifically binds to at least one additional antigen. The present invention also relates to pharmaceutical compositions containing the antibody-like binding protein, anti-CD3 antibodies or anti-CD123 antibodies of the present invention, and their use in the treatment of cancer. The present invention further relates to isolated nucleic acids, vectors and host cells containing a sequence encoding said antibody-like binding protein, an anti-CD3 antibody, or an anti-CD123 antibody, and to the use of said anti-CD123 antibody as a diagnostic tool.

Первое поколение биспецифических антител было разработано более 20 лет назад. С тех пор в целом ряде клинических исследований были протестированы биспецифические антитела, сконструированные для нацеливания на поверхностные антигены раковых клеток. Эта группа противораковых белков слияния содержит два или более функциональных домена, которые локализуют иммунологические эффекторные клетки возле целевых раковых клеток для обеспечения противораковой активности.The first generation of bispecific antibodies was developed over 20 years ago. Since then, a number of clinical studies have tested bispecific antibodies designed to target the surface antigens of cancer cells. This group of anti-cancer fusion proteins contains two or more functional domains that locate immunological effector cells near target cancer cells to provide anti-cancer activity.

По мере развития технологии биспецифических антител получили другую группу белков слияния под названием биспецифические активаторы Т-клеток (BiTE) путем соединения только двух одноцепочечных вариабельных областей антитела (scFv) (без включения аминокислотных сегментов Fc) с помощью гибкого линкера, при этом один scFv связывает целевые клетки, а другой связывает CD3 на поверхности Т-клетки. Один BiTE, блинатумомаб, характеризующийся биспецифической активностью связывания CD19xCD3, продемонстрировал обнадеживающие результаты для пациентов в клинических испытаниях фазы II с минимальной остаточной болезнью при В-клеточном остром лимфобластном лейкозе.As bispecific antibody technology has advanced, another group of fusion proteins called bispecific T cell activators (BiTEs) have been generated by joining only two single-chain antibody variable regions (scFv) (without including Fc amino acid segments) with a flexible linker, with one scFv binding to the target cells, and the other binds CD3 on the surface of T cells. One BiTE, blinatumomab, characterized by a bispecific CD19xCD3 binding activity, showed encouraging results for patients in phase II clinical trials with minimal residual disease in B-cell acute lymphoblastic leukemia.

CD123 (альфа-цепь рецептора интерлейкина-3, IL-3Ra) представляет собой опухолевый антиген, который сверхэкспрессируется при различных гематологических новообразованиях. Большая часть бластных клеток при AML экспрессирует на поверхности CD123, и такая экспрессия не варьирует у подтипов AML. Как сообщалось, более высокая экспрессия CD123 при AML в момент постановки диагноза ассоциирована с более неблагоприятным прогнозом. Сообщалось, что CD123 экспрессируется на лейкозных стволовых клетках (LSC). Все возрастающее число фактов позволяют предположить, что AML возникает из этих лейкозных стволовых клеток (LSC), которые, как было показано, являются покоящимися и относительно устойчивыми к химиотерапии, повреждающей ДНК.CD123 (interleukin-3 receptor alpha chain, IL-3Ra) is a tumor antigen that is overexpressed in various hematological neoplasms. Most blast cells in AML express CD123 on the surface, and this expression does not vary between AML subtypes. Higher expression of CD123 in AML at diagnosis has been reported to be associated with poorer prognosis. CD123 has been reported to be expressed on leukemic stem cells (LSC). A growing body of evidence suggests that AML arises from these leukemic stem cells (LSCs), which have been shown to be dormant and relatively resistant to DNA-damaging chemotherapy.

Таким образом, повышенная экспрессия CD123 на LSC по сравнению с гемопоэтическими стволовыми клетками (HSC) предоставляет возможность для терапевтического нацеливания на AML-LSC.Thus, the increased expression of CD123 on LSCs compared to hematopoietic stem cells (HSCs) provides an opportunity for therapeutic targeting of AML-LSCs.

Как было показано ранее, моноклональное антитело (MAb) 7G3, вырабатываемое против CD123, ингибирует опосредованную IL-3 пролиферацию и активацию как линий лейкозных клеток, так и первичных клеток (патент США № 6177078). Однако оставалось неясно, может ли нацеливание на CD123 приводить к функциональным нарушениям в AML-LSC.As previously shown, the monoclonal antibody (MAb) 7G3, raised against CD123, inhibits IL-3 mediated proliferation and activation of both leukemic cell lines and primary cells (US Pat. No. 6,177,078). However, it remained unclear whether CD123 targeting could lead to functional impairment in AML-LSC.

Применение антителоподобного связывающего белка к CD123xCD3 приводит к цитолизу опухолевых клеток, как показано в данном документе авторами настоящего изобретения.The use of an antibody-like binding protein to CD123xCD3 leads to the cytolysis of tumor cells, as shown in this document by the authors of the present invention.

Идея получения биспецифического антителоподобного связывающего белка с биспецифической активностью связывания CD123xCD3 уже была предложена и описана в международной патентной заявке WO 2013/173820.The idea of obtaining a bispecific antibody-like binding protein with bispecific CD123xCD3 binding activity has already been proposed and described in international patent application WO 2013/173820.

Кроме того, молекула на основе биспецифического перенацеливающегося антитела с двойной аффинностью (DART) к CD123xCD3 от MacroGenics вступила в фазу I клинических испытаний в 2014 году.In addition, a dual-affinity bispecific retargeting antibody (DART) molecule for CD123xCD3 from MacroGenics entered phase I clinical trials in 2014.

Однако, как показано авторами настоящего изобретения, молекула на основе биспецифического перенацеливающегося антитела с двойной аффинностью (DART) к CD123xCD3 от MacroGenics, например, характеризуется активацией 82% экспрессирующих CD4+ Т-клеток и 83% экспрессирующих CD8+ Тклеток в отсутствие целевых клеток. Несоответствующая активация Т-клеток может приводить к тяжелым побочным эффектам, таким как синдром выброса цитокинов. Синдромом выброса цитокинов называют выброс цитокинов активированными Т-клетками, что приводит к типу системного воспалительного ответа, аналогичного тому, который встречается при тяжелых инфекциях, и характеризующегося гипотензией, гипертермией и дрожью. Сообщалось о смертельных случаях вследствие синдрома выброса цитокинов при применении ОКТ3.However, as shown by the present inventors, the MacroGenics CD123xCD3 bispecific retargeting antibody (DART) molecule, for example, is characterized by activation of 82% of CD4+ expressing T cells and 83% of CD8+ expressing T cells in the absence of target cells. Inappropriate T cell activation can lead to severe side effects such as cytokine release syndrome. Cytokine release syndrome refers to the release of cytokines by activated T cells, resulting in a type of systemic inflammatory response similar to that seen in severe infections and characterized by hypotension, hyperthermia, and shivering. Deaths due to cytokine release syndrome have been reported with OKT3.

Следовательно, несмотря на эти продвижения в технологии биспецифических антител остается необходимость в дополнительных противораковых терапевтических средствах, в частности таких, которые эффективно нацеливаются и уничтожают раковые клетки либо напрямую, либо опосредованно.Therefore, despite these advances in bispecific antibody technology, there remains a need for additional anti-cancer therapeutics, in particular those that effectively target and kill cancer cells, either directly or indirectly.

Авторы настоящего изобретения добились успеха в получении, скрининге и отборе специфических антител крысы к CD3, которые проявляют высокую аффинность в отношении белка CD3 как человека, так и Масаса fascicularis.The present inventors have been successful in generating, screening and selecting rat-specific anti-CD3 antibodies that exhibit high affinity for both human and Macac fascicularis CD3 protein.

Авторы настоящего изобретения разработали антителоподобные связывающие белки, характеризующиеся биологической и иммунологической специфичностью к антигену CD3 и по меньшей мере одThe present inventors have developed antibody-like binding proteins having biological and immunological specificity for the CD3 antigen and at least one

- 1 041572 ному дополнительному целевому антигену. В одном примере, чтобы продемонстрировать применение этих антител к CD3 в получении биспецифических антителоподобных связывающих белков, авторы настоящего изобретения получили антителоподобные связывающие белки к CD3/CD123 и продемонстрировали их терапевтическое применение. Такие биспецифические антителоподобные связывающие белки к CD3/CD123 характеризуются низкой активацией Т-клеток, как это наблюдалось в случае антитела к CD3 отдельно. Однако, если присутствуют экспрессирующие CD123 целевые клетки, такие как клетки ТНР-1, биспецифические антителоподобные связывающие белки к CD3/CD123 проявляют высокую активацию Т-клеток. Соответственно, антитело к CD3 по настоящему изобретению, определяемое выше, особенно применимо для получения антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению.- 1 041572 additional target antigen. In one example, to demonstrate the use of these anti-CD3 antibodies in the production of bespecifically antibody-like binding proteins, the present inventors prepared anti-CD3/CD123 antibody-like binding proteins and demonstrated their therapeutic use. Such bispecific anti-CD3/CD123 antibody-like binding proteins are characterized by low T-cell activation, as observed with anti-CD3 antibody alone. However, if CD123-expressing target cells, such as THP-1 cells, are present, the anti-CD3/CD123 bespecifically antibody-like binding proteins exhibit high T-cell activation. Accordingly, the anti-CD3 antibody of the present invention as defined above is particularly useful for preparing the antibody-like binding proteins of the present invention.

Определения.Definitions.

На всем протяжении настоящей заявки термин и/или представляет собой грамматический союз, который следует интерпретировать как охватывающий то, что могут встречаться один или несколько случаев, которые он соединяет. Например, формулировку такие белки с нативной последовательностью можно получить с применением стандартных рекомбинантных и/или синтетических способов указывает на то, что белки с нативной последовательностью можно получить с применением стандартных рекомбинантных и синтетических способов, или белки с нативной последовательностью можно получить с применением стандартных рекомбинантных способов, или белки с нативной последовательностью можно получить с применением синтетических способов.Throughout this application, the term and/or is a grammatical conjunction, which should be interpreted to mean that one or more of the cases it connects can occur. For example, the formulation of such native sequence proteins can be produced using standard recombinant and/or synthetic methods indicates that native sequence proteins can be produced using standard recombinant and synthetic methods, or native sequence proteins can be produced using standard recombinant methods. , or native sequence proteins can be made using synthetic methods.

Кроме того, на протяжении настоящей заявки термин содержащий следует интерпретировать как охватывающий все специально упомянутые признаки, а также необязательные, дополнительные, неуказанные. Как используется в данном документе, применение термина содержащий также раскрывает вариант осуществления, в котором не присутствуют никакие признаки, за исключением специально упомянутых признаков (т.е. состоящий из). Кроме того, применение формы единственного числа не исключает множественного числа. Сам по себе тот факт, что определенные меры излагаются во взаимоисключающих зависимых пунктах формулы изобретения, не указывает на то, что комбинация этих мер не может применяться как преимущество.In addition, throughout this application, the term containing should be interpreted as covering all the features specifically mentioned, as well as optional, additional, unspecified. As used herein, the use of the term comprising also discloses an embodiment in which no features are present except for the features specifically mentioned (ie, consisting of). In addition, the use of the singular form does not exclude the plural. The fact that certain measures are set forth in mutually exclusive dependent claims does not in itself indicate that a combination of these measures cannot be used to an advantage.

Термин ген означает последовательность ДНК, которая кодирует или соответствует конкретной последовательности из аминокислот, которая представляет собой весь или часть одного или нескольких белков или ферментов, и может включать или не включать регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторные последовательности, например, которые определяют условия, при которых ген экспрессируется. Некоторые гены, которые не представляют собой структурные гены, могут транскрибироваться из ДНК в РНК, но не транслируются в аминокислотную последовательность. Другие гены могут функционировать в качестве регуляторов структурных генов или в качестве регуляторов транскрипции ДНК. В частности, термин ген может предназначаться для геномной последовательности, кодирующей белок, т. е. последовательности, содержащей последовательности регулятора, промотора, интронов и экзонов.The term gene means a DNA sequence that codes for or corresponds to a particular sequence of amino acids that is all or part of one or more proteins or enzymes, and may or may not include DNA regulatory sequences such as promoter sequences, for example, which determine the conditions under which which the gene is expressed. Some genes that are not structural genes can be transcribed from DNA to RNA but are not translated into an amino acid sequence. Other genes may function as regulators of structural genes or as regulators of DNA transcription. In particular, the term gene may refer to a genomic sequence encoding a protein, ie, a sequence containing the sequences of the regulator, promoter, introns and exons.

Последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична эталонной последовательности, представляет собой последовательность, по своей полной длине характеризующуюся 85% или большей, в частности 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с полной длиной эталонной последовательности.A sequence that is at least 85% identical to a reference sequence is one that has 85% or more identity over its entire length, such as 90%, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 99% identity. sequence with the full length of the reference sequence.

В контексте настоящей заявки процентную долю идентичности рассчитывают с применением глобального попарного выравнивания (т. е. две последовательности сравнивают по их полной длине). Способы сравнения идентичности двух или более последовательностей хорошо известны из уровня техники. Например, можно использовать программу needle, использующую алгоритм глобального выравнивания последовательностей Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) для нахождения оптимального выравнивания (с учетом гэпов) двух последовательностей по их полной длине. Программа Needle, например, доступна в сети Интернет на сайте ebi.ac.uk. Согласно настоящему изобретению процентную долю идентичности между двумя полипептидами рассчитывают с применением EMBOSS: программы needle (глобального выравнивания) с параметром штраф за открытие гэпа, равным 10,0, параметром штраф за продолжение гэпа, равным 0,5, и матрицей Blosum62.In the context of the present application, percent identity is calculated using a global pairwise alignment (i.e., two sequences are compared by their full length). Methods for comparing the identity of two or more sequences are well known in the art. For example, you can use the needle program, which uses the Needleman and Wunsch global sequence alignment algorithm (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) to find the optimal alignment (gapped) of two sequences over their full length. The Needle program, for example, is available on the Internet at ebi.ac.uk. According to the present invention, percent identity between two polypeptides is calculated using the EMBOSS: needle (global alignment) program with a gap opening penalty of 10.0, a gap extension penalty of 0.5, and a Blosum62 matrix.

Белки, состоящие из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична эталонной последовательности, могут содержать мутации, такие как делеции, вставки и/или замены, по сравнению с эталонной последовательностью. В случае замен белок, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична эталонной последовательности, может соответствовать гомологичной последовательности, полученной от вида, иного чем тот, из которого получена эталонная последовательность.Proteins consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the reference sequence may contain mutations such as deletions, insertions and/or substitutions compared to the reference sequence. In the case of substitutions, a protein consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the reference sequence may correspond to a homologous sequence derived from a species other than that from which received the reference sequence.

Аминокислотные замены могут быть консервативными или неконсервативными. Предпочтительно, замены представляют собой консервативные замены, в которых одна аминокислота замещена на другую аминокислоту с аналогичными структурными и/или химическими свойствами. Замена предпочтительно соответствует консервативной замене, указанной в таблице ниже.Amino acid substitutions may be conservative or non-conservative. Preferably, the substitutions are conservative substitutions in which one amino acid is substituted for another amino acid with similar structural and/or chemical properties. The substitution preferably corresponds to the conservative substitution indicated in the table below.

- 2 041572- 2 041572

Консервативные замены Conservative substitutions Тип аминокислоты Amino acid type Ala, Vai, Leu, lie, Met, Pro, Phe, Trp Ala, Vai, Leu, lie, Met, Pro, Phe, Trp Аминокислоты с алифатическими гидрофобными боковыми цепями Amino acids with aliphatic hydrophobic side chains Ser, Tyr, Asn, Gin, Cys Ser, Tyr, Asn, Gin, Cys Аминокислоты с незаряженными, но полярными боковыми цепями Amino acids with uncharged but polar side chains Asp, Glu Asp, Glu Аминокислоты с кислотными боковыми цепями Amino acids with acidic side chains Lys, Arg, His Lys, Arg, His Аминокислоты с основными боковыми цепями Amino acids with basic side chains Gly gly Нейтральная боковая цепь Neutral side chain

Антитело, также называемое иммуноглобулин, может представлять собой природное или традиционное антитело, в котором две тяжелые цепи связаны друг с другом дисульфидными связями и каждая тяжелая цепь связана с легкой цепью дисульфидной связью. Существует два типа легких цепей, лямбда (l) и каппа (k). Существует пять основных классов (или изотипов) тяжелых цепей, определяющих функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Каждая цепь содержит разную последовательность доменов. Легкая цепь содержит два домена или области, вариабельный домен (VL) и константный домен (CL).An antibody, also referred to as an immunoglobulin, may be a natural or conventional antibody in which two heavy chains are linked to each other by disulfide bonds and each heavy chain is linked to a light chain by a disulfide bond. There are two types of light chains, lambda (l) and kappa (k). There are five major classes (or isotypes) of heavy chains that determine the functional activity of an antibody molecule: IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE. Each strand contains a different sequence of domains. The light chain contains two domains or regions, a variable domain (VL) and a constant domain (CL).

Тяжелая цепь содержит четыре домена, вариабельный домен (VH) и три константных домена (CH1, CH2 и СН3, совместно именуемых СН). Вариабельные области как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепей определяют распознавание при связывании и специфичность к антигену. Домены константной области легкой (CL) и тяжелой (СН) цепей придают важные биологические свойства, такие как объединение цепей антитела, секреция, перемещение через плаценту, связывание комплемента и связывание с Fcрецепторами (FcR). Fv-фрагмент представляет собой N-концевую часть Fab-фрагмента иммуноглобулина и состоит из вариабельных частей одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Специфичность антитела заключается в структурной комплементарности между паратопом антитела и антигенной детерминантой. Паратопы антител составлены остатками главным образом из гипервариабельных или определяющих комплементарность областей (CDR). Остатки из негипервариабельных или каркасных областей (FR) иногда влияют на общую структуру домена и, следовательно, паратоп. Определяющими комплементарность областями или CDR называют аминокислотные последовательности, которые совместно определяют аффинность связывания и специфичность природной Fv-области связывающего участка нативного иммуноглобулина. Каждая из легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина имеет три CDR, обозначенные как CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L и CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H соответственно. Традиционный антигенсвязывающий участок антитела, таким образом, содержит шесть CDR, которые включают в себя набор CDR из каждой из V-областей тяжелой и легкой цепи.The heavy chain contains four domains, a variable domain (VH) and three constant domains (CH1, CH2 and CH3, collectively referred to as CH). The variable regions of both the light (VL) and heavy (VH) chains determine binding recognition and antigen specificity. The constant region domains of the light (CL) and heavy (CH) chains confer important biological properties such as antibody chain assembly, secretion, placental movement, complement fixation, and binding to Fc receptors (FcRs). The Fv fragment is the N-terminal portion of the Fab fragment of an immunoglobulin and consists of the variable portions of one light chain and one heavy chain. The specificity of an antibody lies in the structural complementarity between the paratope of the antibody and the antigenic determinant. Antibody paratopes are composed of residues primarily of hypervariable or complementarity determining regions (CDRs). Residues from non-hypervariable or framework regions (FRs) sometimes affect the overall structure of the domain and hence the paratope. Complementarity-determining regions or CDRs refer to amino acid sequences that together determine the binding affinity and specificity of the natural Fv binding region of a native immunoglobulin. Each of the immunoglobulin light and heavy chains has three CDRs, designated as CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L and CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respectively. The conventional antigen binding site of an antibody thus contains six CDRs, which include a set of CDRs from each of the heavy and light chain V regions.

В контексте настоящего изобретения антитело или иммуноглобулин представляет собой IgM, IgD, IgG, IgA и IgE.In the context of the present invention, an antibody or immunoglobulin is IgM, IgD, IgG, IgA and IgE.

Каркасными областями (FR) называют аминокислотные последовательности, расположенные между CDR, т.е. те части вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, которые являются относительно консервативными среди различных иммуноглобулинов у одного вида. Каждая из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина имеет четыре FR, обозначенные как FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L и FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H соответственно. Соответственно, вариабельный домен легкой цепи можно таким образом обозначить как (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L), а вариабельный домен тяжелой цепи можно таким образом обозначить как (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H).Framework regions (FRs) are the amino acid sequences located between the CDRs, i.e. those portions of the variable regions of an immunoglobulin light and heavy chain that are relatively conserved among different immunoglobulins in the same species. Each of the immunoglobulin light and heavy chains has four FRs, designated FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, and FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, respectively. Accordingly, the light chain variable domain can thus be designated as (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4- L), and the heavy chain variable domain can thus be referred to as (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4 -H).

Зная аминокислотную последовательность CDR, специалист в данной области легко сможет определить каркасные области FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L и/или FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.Knowing the amino acid sequence of the CDR, one skilled in the art will readily be able to determine the framework regions of FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L and/or FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

Как используется в данном документе, каркасная область человека представляет собой каркасную область, которая практически идентична (приблизительно на 85% или более, в частности, на 90, 95, 97, 99 или 100%) каркасной области встречающегося в природе антитела человека.As used herein, a human framework is a framework that is substantially identical (about 85% or more, in particular 90%, 95%, 97%, 99%, or 100%) to a naturally occurring human antibody framework.

В контексте настоящего изобретения определение CDR/FR в легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина следует давать на основании определения по IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).In the context of the present invention, the definition of CDR/FR in the light or heavy chain of an immunoglobulin should be given based on the determination by IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org) .

Как используется в данном документе, термин антитело обозначает традиционные антитела и их фрагменты, а также однодоменные антитела и их фрагменты, в частности, вариабельную область тяжелой цепи однодоменных антител, и химерные, гуманизированные, биспецифические или полиспецифические антитела.As used herein, the term antibody refers to conventional antibodies and fragments thereof, as well as single domain antibodies and fragments thereof, in particular the heavy chain variable region of single domain antibodies, and chimeric, humanized, bispecific or polyspecific antibodies.

Как используется в данном документе, антитело или иммуноглобулин также включают однодоменные антитела, которые были описаны совсем недавно и которые представляют собой антитела, у которых области, определяющие комплементарность, являются частью однодоменного полипептида. Примеры однодоменных антител включают антитела, состоящие только из тяжелых цепей, антитела, вAs used herein, an antibody or immunoglobulin also includes single-domain antibodies, which have been described more recently, which are antibodies in which complementarity-determining regions are part of a single-domain polypeptide. Examples of single domain antibodies include heavy chain-only antibodies, antibodies

- 3 041572 естественных условиях не имеющие легких цепей, однодоменные антитела, полученные из традиционных антител с четырьмя цепями, сконструированные однодоменные антитела. Однодоменные антитела могут быть получены из любого вида, в том числе, без ограничения, мыши, человека, верблюда, ламы, козы, кролика, крупного рогатого скота. Однодоменные антитела могут представлять собой встречающиеся в природе однодоменные антитела, известные как антитела, состоящие только из тяжелых цепей, не имеющие легких цепей. В частности, виды семейства Camelidae, например верблюд, дромедар, лама, альпака и гуанако, вырабатывают антитела, состоящие только из тяжелых цепей, в естественных условиях не имеющие легких цепей. У антител верблюдовых, состоящих только из тяжелых цепей, также отсутствует СН1-домен.- 3 041572 natural light chain-free, single-domain antibodies derived from conventional four-chain antibodies, engineered single-domain antibodies. Single domain antibodies can be derived from any species including, but not limited to, mouse, human, camel, llama, goat, rabbit, bovine. Single domain antibodies can be naturally occurring single domain antibodies known as heavy chain only antibodies with no light chains. In particular, species of the family Camelidae, such as the camel, dromedary, llama, alpaca, and guanaco, produce antibodies consisting only of heavy chains, which do not naturally have light chains. Camelid antibodies, consisting only of heavy chains, also lack the CH1 domain.

Вариабельная область тяжелой цепи этих однодоменных антител, не имеющих легких цепей, известна из уровня техники как VHH или нанотело. Подобно традиционным VH-доменам VHH содержат четыре FR и три CDR. Нанотела обладают преимуществами по сравнению с традиционными антителами: они приблизительно в десять раз меньше, чем молекулы IgG, и, как следствие, правильно свернутые функциональные нанотела можно получать посредством экспрессии in vitro при достижении высокого выхода. Кроме того, нанотела являются очень стабильными и устойчивыми к действию протеаз. Обзор свойств и получения нанотел был приведен в Harmsen and De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov;77(1):13-22).The heavy chain variable region of these light chain-free single domain antibodies is known in the art as VHH or nanobody. Like traditional VH domains, VHHs contain four FRs and three CDRs. Nanobodies have advantages over traditional antibodies: they are approximately ten times smaller than IgG molecules, and as a result, correctly folded functional nanobodies can be obtained by in vitro expression in high yields. In addition, nanobodies are very stable and resistant to proteases. A review of the properties and preparation of nanobodies has been given in Harmsen and De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov;77(1):13-22).

Как используется в данном документе, термином моноклональное антитело или mAb называют молекулу антитела с единым аминокислотным составом, которое направлено против специфического антигена, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела любым конкретным способом. Моноклональное антитело может быть получено из одного клона В-клеток или гибридомы, но также может быть рекомбинантным, т.е. полученным с помощью белковой инженерии.As used herein, the term monoclonal antibody or mAb refers to an antibody molecule with a single amino acid composition that is directed against a specific antigen and should not be construed as requiring the production of an antibody by any particular method. The monoclonal antibody may be derived from a single B cell clone or hybridoma, but may also be recombinant, ie. obtained using protein engineering.

Термином химерное антитело называют сконструированное антитело, которое в своем самом широком смысле содержит одну или несколько областей из одного антитела и одну или несколько областей из одного или нескольких других антител. В частности, химерное антитело содержит VH-домен и VLдомен антитела, полученного из отличного от человека животного, совместно с СН-доменом и CLдоменом другого антитела, в частности антитела человека. В качестве отличного от человека животного можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик и т.п. Химерное антитело также может означать полиспецифическое антитело, обладающее специфичностью в отношении по меньшей мере двух различных антигенов.The term chimeric antibody refers to an engineered antibody that, in its broadest sense, contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibodies. In particular, a chimeric antibody contains the VH domain and VL domain of an antibody derived from a non-human animal, together with the CH domain and CL domain of another antibody, in particular a human antibody. As the non-human animal, any animal such as mouse, rat, hamster, rabbit, and the like can be used. A chimeric antibody can also mean a polyspecific antibody having specificity for at least two different antigens.

Термином гуманизированное антитело называют антитело, которое полностью или частично происходит не от человека и которое было модифицировано для замены определенных аминокислот, в частности в каркасных областях тяжелой и легкой цепей, чтобы избежать или минимизировать иммунный ответ у человека. Константные домены гуманизированного антитела в большинстве случаев представляют собой СН- и CL-домены человека.The term humanized antibody refers to an antibody that is wholly or partly non-human and has been modified to replace certain amino acids, in particular in the framework regions of the heavy and light chains, in order to avoid or minimize the immune response in humans. The constant domains of a humanized antibody are in most cases human CH and CL domains.

Из уровня техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела; см., например, обзор в Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Одним обычно используемым способом является привитие CDR, или перестройка антитела, предусматривающая привитие последовательностей CDR из донорного антитела, обычно антитела мыши, в остов из каркасной области антитела человека с отличающейся специфичностью. Поскольку привитие CDR может снижать специфичность и аффинность связывания и, таким образом, биологическую активность CDR-привитого антитела, отличного от антитела человека, в выбранные положения CDR-привитого антитела можно вводить обратные мутации, чтобы сохранить специфичность и аффинность связывания исходного антитела. Идентификацию положений для возможных обратных мутаций можно осуществлять с применением информации, доступной в литературе и в базе данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами на проведение обратных мутаций, как правило, представляют собой остатки, расположенные на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые являются погруженными или которые характеризуются низкой степенью нахождения на поверхности, обычно изменять не будут. Методика гуманизации, альтернативная привитию CDR и проведению обратных мутаций, представляет собой изменение поверхности, при котором не находящиеся на поверхности остатки, происходящие не от человека, оставляют, в тоже время поверхностные остатки изменяют на остатки человека. Другая альтернативная методика известна как направляемый отбор (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899), и ее можно применять, например, для получения из антитела мыши или крысы полностью человеческого антитела с сохранением эпитопа и характеристик связывания исходного антитела. Дополнительный способ гуманизации представляет собой так называемую 4D-гуманизацию. Протокол 4D-гуманизации описан в патентной заявке US 20110027266 A1 (WO 2009032661 А1) и приведен в качестве примера ниже путем применения 4D-гуманизации, чтобы гуманизировать вариабельные домены легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей антитела крысы. В одном примере получали гомологичную модель антитела крысы в основном с помощью программного обеспечения МОЕ (v. 2011.10 - Chemical Computing Group, Квебек, Канада) с применением PDB-структур (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242) в качестве матриц и затем подвергали минимизации энергии с применением стандартных процедур, реализованных в МОЕ. Затем на минимизированной 3D гомологичной модели (проводили с помощью программногоNumerous methods for humanizing an antibody sequence are known in the art; see for example the review in Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13:1619-1633. One commonly used method is CDR grafting, or antibody rearrangement, which involves grafting CDR sequences from a donor antibody, typically a mouse antibody, into a backbone from a human antibody framework region of differing specificity. Because CDR grafting can reduce the binding specificity and affinity, and thus the biological activity, of a non-human CDR-grafted antibody, backmutations can be introduced at selected positions in the CDR-grafted antibody to retain the binding specificity and binding affinity of the parent antibody. The identification of positions for possible backmutations can be performed using information available in the literature and in the antibody database. Amino acid residues that are candidates for backmutation are typically those that are located on the surface of the antibody molecule, while residues that are immersed or that are low on the surface will usually not be changed. An alternative humanization technique to CDR grafting and backmutation is resurfacing in which non-surface non-human residues are left while surface residues are changed to human residues. Another alternative technique is known as guided selection (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899) and can be used, for example, to generate a fully human antibody from a mouse or rat antibody while maintaining the epitope and binding characteristics of the parent antibody. An additional humanization method is the so-called 4D humanization. A 4D humanization protocol is described in US 20110027266 A1 (WO 2009032661 A1) and is exemplified below by using 4D humanization to humanize the light (VL) and heavy (VH) rat antibody chain variable domains. In one example, a homologous rat antibody model was generated primarily using MOE software (v. 2011.10 - Chemical Computing Group, Quebec, Canada) using PDB structures (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242 ) as templates and then subjected to energy minimization using standard procedures implemented in MOE. Then, on a minimized 3D homologous model (performed using software

- 4 041572 обеспечения МОЕ) антитела крысы осуществляли моделирование способом молекулярной динамики (MD) и сравнивали, например, с 49 моделями антитела человека, полученными на основании семи репрезентативных легких цепей (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) и семи репрезентативных тяжелых цепей (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6), обозначенных с помощью LGCR/SDI и доступных в МОЕ. Например, одна модель из пары цепей (Vkx-Vhx) с наилучшими как гидрофобными, электростатическими компонентами, так и идентичностью последовательности за пределами CDR, была выбрана для 4D-гуманизации. Для попарного сравнения вариабельного домена антитела крысы и выбранной модели последовательности выравнивали, в основном, на основании оптимального 3D наложения альфа-атомов углерода в соответствующих гомологичных моделях. Затем определяли и подвергали мутированию нежелательные мотивы. Наконец, в отношении полученных гуманизированных последовательностей применяли инструмент Blast для определения сходства последовательностей, например, с базой данных IEDB (http://www.immuneepitope.org; версия 2012/01/30, доступная локально), чтобы убедиться, что ни одна из последовательностей не содержит никакой известный В- или Т-клеточный эпитоп, приведенный в ней.rat antibodies were modeled by molecular dynamics (MD) and compared, for example, with 49 human antibody models derived from seven representative light chains (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) and seven representative heavy chains (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) designated by LGCR/SDI and available from MOE. For example, one chain pair model (Vkx-Vhx) with the best in both hydrophobic, electrostatic components and sequence identity beyond the CDR was selected for 4D humanization. For pairwise comparison of the variable domain of the rat antibody and the selected model, the sequences were aligned mainly based on the optimal 3D overlap of alpha carbons in the respective homologous models. Undesirable motifs were then identified and mutated. Finally, the resulting humanized sequences were subjected to sequence similarity Blast, e.g. to the IEDB database (http://www.immuneepitope.org; version 2012/01/30 available locally) to ensure that none of the sequences does not contain any known B - or T-cell epitope given in it.

В случае химерных антител гуманизация, как правило, предусматривает модификацию каркасных областей последовательностей вариабельных областей.In the case of chimeric antibodies, humanization typically involves modification of the framework regions of the variable region sequences.

Аминокислотные остатки, которые представляют собой часть CDR, как правило, не будут изменять в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях может быть необходимо изменить отдельные аминокислотные остатки CDR, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования или нежелательный остаток цистеина. N-сцепленное гликозилирование происходит путем прикрепления олигосахаридной цепи к аспарагиновому остатку в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может представлять собой любую аминокислоту за исключением Pro. Удаления участка N-гликозилирования можно достичь с помощью мутирования либо Asn, либо остатка Ser/Thr на другой остаток, в частности, путем консервативной замены. Дезамидирование аспарагинового и глутаминового остатков может происходить в зависимости от факторов, таких как рН и нахождение на поверхности. Аспарагиновые остатки особенно подвержены дезамидированию, в первую очередь когда находятся в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. Когда такой участок дезамидирования, в частности Asn-Gly, присутствует в последовательности CDR, тогда может быть желательно удалить данный участок, обычно посредством осуществления консервативной замены для удаления одного из участвующих остатков. Подразумевается, что замена в последовательности CDR для удаления одного из участвующих остатков также охватывается настоящим изобретением.Amino acid residues that are part of a CDR will generally not be changed due to humanization, although in some cases it may be necessary to change individual CDR amino acid residues, for example, to remove a glycosylation site, a deamidation site, or an unwanted cysteine residue. N-linked glycosylation occurs by attaching an oligosaccharide chain to an aspartic residue in the Asn-X-Ser or Asn-X-Thr tripeptide sequence, where X can be any amino acid except Pro. Removal of the N-glycosylation site can be achieved by mutating either the Asn or the Ser/Thr residue to another residue, in particular by conservative substitution. Deamidation of aspartic and glutamine residues can occur depending on factors such as pH and surface exposure. Aspartic residues are particularly susceptible to deamidation, primarily when found in the Asn-Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences such as Asn-Ala. When such a deamidation site, particularly Asn-Gly, is present in a CDR sequence, then it may be desirable to remove that site, usually by making a conservative substitution to remove one of the residues involved. It is understood that a substitution in the CDR sequence to remove one of the residues involved is also covered by the present invention.

Фрагменты (традиционных) антител содержат часть интактного антитела, в частности антигенсвязывающую область или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, диатела, биспецифические и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагмент традиционного антитела также может представлять собой однодоменное антитело, такое как антитело, состоящее только из тяжелых цепей или VHH.Fragments of (traditional) antibodies contain a portion of an intact antibody, in particular the antigen-binding region or variable region of an intact antibody. Examples of antibody fragments include Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, diabodies, bispecific and multispecific antibodies formed from antibody fragments. The conventional antibody fragment can also be a single domain antibody, such as a heavy chain-only or VHH antibody.

Термин Fab обозначает фрагмент антитела с молекулярной массой, составляющей приблизительно 50000, и антигенсвязывающей активностью из числа фрагментов, получаемых путем обработки IgG протеазой папаином, в котором приблизительно половина N-концевой части Н-цепи и вся L-цепь связаны друг с другом с помощью дисульфидной связи.The term Fab denotes an antibody fragment with a molecular weight of approximately 50,000 and antigen-binding activity from among the fragments obtained by treatment of IgG with the protease papain, in which approximately half of the N-terminal part of the H chain and the entire L chain are linked to each other by a disulfide connections.

Термином F(ab')2 называют фрагмент антитела с молекулярной массой, составляющей приблизительно 100000, и антигенсвязывающей активностью из числа фрагментов, получаемых путем обработки IgG протеазой пепсином, который является немного большим, чем Fab, связанные с помощью дисульфидной связи шарнирной области.The term F(ab')2 refers to an antibody fragment with a molecular weight of approximately 100,000 and antigen-binding activity from among the fragments obtained by treating an IgG protease with pepsin, which is slightly larger than Fab, linked by a hinge disulfide bond.

Термином Fab называют фрагмент антитела с молекулярной массой, составляющей приблизительно 50000, и антигенсвязывающей активностью, который получают путем разрезания дисульфидной связи шарнирной области F(ab')2.The term Fab refers to an antibody fragment with a molecular weight of approximately 50,000 and antigen-binding activity, which is obtained by cutting the disulfide bond of the F(ab')2 hinge region.

Одноцепочечный полипептид Fv (scFv) представляет собой объединенный ковалентными связями гетеродимер VH::VL, который обычно экспрессируется за счет генного слияния, содержащего гены, кодирующие VH и VL, соединенные линкером, кодирующим пептид. scFv-фрагмент человека по настоящему изобретению содержит CDR, удерживаемые в надлежащей конформации, в частности, путем применения методик рекомбинации генов. Бивалентные и поливалентные фрагменты антител либо могут образовываться спонтанно путем объединения моновалентных scFv, либо их можно получать путем соединения моновалентных scFv пептидным линкером, как, например, в случае бивалентного sc(Fv)2. dsFv представляет собой гетеродимер VH::VL, стабилизированный дисульфидной связью. (dsFv)2 обозначает два dsFv, соединенных пептидным линкером.A single chain Fv polypeptide (scFv) is a covalently linked VH::VL heterodimer that is typically expressed by gene fusion containing the genes encoding VH and VL connected by a linker encoding the peptide. The human scFv fragment of the present invention contains CDRs maintained in the proper conformation, in particular by the use of gene recombination techniques. Bivalent and polyvalent antibody fragments can either be formed spontaneously by combining monovalent scFvs, or they can be obtained by connecting monovalent scFvs with a peptide linker, such as in the case of bivalent sc(Fv)2. dsFv is a VH::VL heterodimer stabilized with a disulfide bond. (dsFv) 2 denotes two dsFv connected by a peptide linker.

Термин биспецифическое антитело или BsAb обычно обозначает антитело, в котором антигенсвязывающие участки двух антител объединены в пределах одной молекулы. Таким образом, BsAb способны связываться с двумя различными антигенами одновременно. Для разработки, модификации и получения антител или производных антител с необходимым набором свойств связывания и эффекторныхThe term bispecific antibody or BsAb generally refers to an antibody in which the antigen-binding sites of two antibodies are combined within a single molecule. Thus, BsAbs are able to bind to two different antigens simultaneously. For the development, modification and production of antibodies or antibody derivatives with the required set of binding properties and effector

- 5 041572 функций все чаще используют генную инженерию, как описано, например, в ЕР 2050764 А1.- 5 041572 functions are increasingly using genetic engineering, as described, for example, in EP 2050764 A1.

Термин полиспецифическое антитело обозначает антитело, в котором антигенсвязывающие участки двух или более антител объединены в одной молекуле.The term polyspecific antibody means an antibody in which the antigen-binding sites of two or more antibodies are combined in one molecule.

Термином диатела называют небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, при этом данные фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в составе одной полипептидной цепи (VH-VL). Вследствие применения линкера, слишком короткого для обеспечения спаривания между двумя доменами в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих участка.The term diabodies refers to small fragments of antibodies with two antigen-binding sites, while these fragments contain a heavy chain variable domain (VH) connected to a light chain variable domain (VL) as part of a single polypeptide chain (VH-VL). Due to the use of a linker too short to allow pairing between two domains on the same strand, the domains are forced to pair with complementary domains on the other strand and form two antigen-binding sites.

Термин гибридома обозначает клетку, которую получают путем слияния В-клетки, полученной при иммунизации отличного от человека млекопитающего антигеном, с клеткой миеломы, полученной от мыши, и т.д., в которой вырабатывается необходимое моноклональное антитело, характеризующееся специфичностью к антигену.The term hybridoma refers to a cell which is obtained by fusing a B cell obtained by immunizing a non-human mammal with an antigen with a myeloma cell obtained from a mouse, etc., which produces a desired monoclonal antibody having specificity for the antigen.

Под очищенный и выделенный подразумевают, при ссылке на полипептид (т.е. антитело по настоящему изобретению) или нуклеотидную последовательность, что указанная молекула присутствует при фактическом отсутствии других биологических макромолекул того же типа. Термин очищенный, как используется в данном документе, в частности означает, что присутствует по меньшей мере 75, 85, 95 или 98% по весу биологических макромолекул одного типа. Выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный полипептид, называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая практически не содержит других молекул нуклеиновой кислоты, которые не кодируют данный полипептид; однако, молекула может включать некоторые дополнительные основания или фрагменты, которые не оказывают вредного воздействия на основные характеристики состава.By purified and isolated is meant, when referring to a polypeptide (ie, an antibody of the present invention) or nucleotide sequence, that said molecule is present in the virtual absence of other biological macromolecules of the same type. The term "purified" as used herein specifically means that at least 75%, 85%, 95%, or 98% by weight of one type of biological macromolecule is present. An isolated nucleic acid molecule that codes for a particular polypeptide is a nucleic acid molecule that is substantially free of other nucleic acid molecules that do not code for that polypeptide; however, the molecule may include some additional bases or moieties that do not adversely affect the essential characteristics of the composition.

Термином антиген или целевой антиген, как используется в данном документе, называют молекулу или часть молекулы, способную быть связанной антителом или антителоподобным связывающим белком. Термином также называют молекулу или часть молекулы, которую можно применять у животного с получением антител, которые способны связываться с эпитопом такого антигена. Целевой антиген может иметь один или несколько эпитопов. С учетом того, что каждый целевой антиген распознается антителом или антителоподобным связывающим белком, антителоподобный связывающий белок способен конкурировать с интактным антителом, которое распознает целевой антиген.The term antigen or target antigen as used herein refers to a molecule or portion of a molecule capable of being bound by an antibody or antibody-like binding protein. The term also refers to a molecule or portion of a molecule that can be used in an animal to produce antibodies that are capable of binding to an epitope of such an antigen. The target antigen may have one or more epitopes. Given that each target antigen is recognized by an antibody or antibody-like binding protein, the antibody-like binding protein is able to compete with an intact antibody that recognizes the target antigen.

Теоретически, аффинность определятся по равновесной связи между цельным антителом и антигеном. Аффинность можно выражать, например, в виде полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС50) или равновесной константы диссоциации (KD).Theoretically, affinity is determined by the equilibrium relationship between the whole antibody and antigen. Affinity can be expressed, for example, as half maximum effective concentration (EC 50 ) or equilibrium dissociation constant (KD).

Полумаксимальной эффективной концентрацией, также называемой EC50, называют концентрацию лекарственного средства, антитела или токсического вещества, которое индуцирует ответ, лежащий посередине между ответом в начальный момент времени и максимальным ответом после определенного времени воздействия. ЕС50 и аффинность обратно пропорциональны друг другу, причем чем ниже значение ЕС50, тем выше аффинность антитела.The half-maximal effective concentration, also referred to as EC 50 , is the concentration of a drug, antibody, or toxicant that induces a response that is midway between the initial response and the maximum response after a specified exposure time. EC 50 and affinity are inversely proportional to each other, and the lower the EC 50 value, the higher the affinity of the antibody.

KD представляет собой равновесную константу диссоциации, отношение koff/kon, между антителом и его антигеном. KD и аффинность обратно пропорциональны друг другу. Значение KD относится к концентрации антитела, и чем ниже значение KD, тем выше аффинность антитела. Аффинность можно оценивать экспериментальным путем с помощью различных известных способов, как, например, путем измерения скорости ассоциации и диссоциации с помощью поверхностного плазмонного резонанса или измерения ЕС50 в иммунохимическом анализе (ELISA, FACS). Ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) представляет собой биохимический анализ, в котором используется твердофазный ферментный иммуноанализ для обнаружения наличия вещества, обычно антигена, в жидком образце или влажном образце. Антигены из образца прикрепляются к поверхности. Затем дополнительное специфическое антитело наносят на поверхность, чтобы оно могло связаться с антигеном. Данное антитело связано с ферментом, и, в качестве финальной стадии, добавляют вещество, содержащее субстрат фермента. В ходе последующей реакции образуется обнаруживаемый сигнал, чаще всего изменение цвета субстрата. Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) обеспечивает способ сортировки гетерогенной смеси биологический клеток в два или более контейнеров, по одной клетке за раз, на основании специфического светорассеяния и флуоресцентных характеристик каждой клетки. В этих анализах ЕС50 представляет собой концентрацию антитела, которая индуцирует ответ, лежащий посередине между ответом в начальный момент времени и максимальным ответом после некоторого определенного времени воздействия определенной концентрации антигена при ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) или экспрессии антигена клеткой при FACS (сортировка клеток с активацией флуоресценции). Поверхностный плазмонный резонанс представляет собой способ без применения меток, где напрямую измеряют связывание молекулы в растворимой фазе (аналит) с молекулой-лигандом, иммобилизованной на поверхности сенсора. В сенсорном устройстве связывание лиганда отслеживают по оптическому явлению под названием поверхностный плазмон. В частности, когда молекула аналита диссоциирует от молекулы-лиганда, наблюдается снижение SPR-сигнала (выражаемого в резонансных единицах, RU). Скорости ассоциации (скорость ассоциации, ka) и диссоциации (скорость диссоциации, kd) получаютKD is the equilibrium dissociation constant, koff/kon, between an antibody and its antigen. KD and affinity are inversely proportional to each other. The KD value refers to the concentration of the antibody, and the lower the KD value, the higher the affinity of the antibody. Affinity can be measured experimentally using various known methods, such as by measuring the rate of association and dissociation using surface plasmon resonance or measuring the EU 50 in an immunoassay (ELISA, FACS). An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a biochemical assay that uses a solid phase enzyme immunoassay to detect the presence of a substance, usually an antigen, in a liquid sample or wet sample. Antigens from the sample are attached to the surface. An additional specific antibody is then applied to the surface so that it can bind to the antigen. This antibody is bound to the enzyme and, as a final step, a substance containing the substrate of the enzyme is added. The subsequent reaction produces a detectable signal, most often a color change of the substrate. Fluorescence activated cell sorting (FACS) provides a method for sorting a heterogeneous mixture of biological cells into two or more containers, one cell at a time, based on the specific light scattering and fluorescence characteristics of each cell. In these assays, the EC 50 is the concentration of antibody that induces a response that is midway between the response at the initial time point and the maximum response after a certain time of exposure to a certain concentration of antigen in ELISA (enzyme immunosorbent assay) or expression of antigen by a cell in FACS (cell sorting with fluorescence activation). Surface plasmon resonance is a labelless method that directly measures the binding of a molecule in the soluble phase (analyte) to a ligand molecule immobilized on the sensor surface. In a sensor device, ligand binding is monitored by an optical phenomenon called surface plasmon. In particular, when the analyte molecule dissociates from the ligand molecule, there is a decrease in the SPR signal (expressed in resonance units, RU). The rates of association (association rate, k a ) and dissociation (dissociation rate, kd) are obtained

- 6 041572 на основе сигнала, получаемого во время ассоциации и диссоциации, и из них можно рассчитать равновесную константу диссоциации (константа связывания, KD). Сигнал, приводимый в резонансных единицах (RU), зависит от размера лиганда, присутствующего в аналите, однако, в случае одинаковых экспериментальных условий, т.е. лиганд представляет собой ту же молекулу при тех же условиях, полученное значение в RU может измерять аффинность, при этом чем выше полученный сигнал в RU, тем выше связывание.- 6 041572 on the basis of the signal obtained during the association and dissociation, and from them it is possible to calculate the equilibrium dissociation constant (binding constant, K D ). The signal given in resonance units (RU) depends on the size of the ligand present in the analyte, however, in the case of the same experimental conditions, i.e. the ligand is the same molecule under the same conditions, the value obtained in RU can measure affinity, the higher the signal obtained in RU, the higher the binding.

Связывание моноклонального антитела с антигеном 1 (Ag1) является перекрестно-реактивным в отношении антигена 2 (Ag2), когда ЕС50 находятся в аналогичном диапазоне для обоих антигенов.Binding of a monoclonal antibody to antigen 1 (Ag1) is cross-reactive to antigen 2 (Ag2) when the EC 50s are in the same range for both antigens.

В настоящей заявке связывание моноклонального антитела с Ag1 является перекрестно-реактивным в отношении Ag2, когда соотношение аффинности к Ag2 и аффинности к Ag1 равно 10 или менее (в частности, 5, 2, 1 или 0,5), при этом аффинности измеряют с помощью одного способа в случае обоих антигенов.In the present application, the binding of a monoclonal antibody to Ag1 is cross-reactive to Ag2 when the ratio of affinity for Ag2 and affinity for Ag1 is 10 or less (in particular 5, 2, 1 or 0.5), while affinities are measured using one method for both antigens.

Связывание моноклонального антитела с Ag1 не является в значительной степени перекрестнореактивным в отношении Ag2, когда аффинности к этим двум антигенам очень отличаются. Аффинность к Ag2 может быть неизмеряемой, если реакция связывания является слишком слабой. В настоящей заявке связывание моноклонального антитела с Ag1 не является в значительной степени перекрестнореактивным в отношении Ag2, когда реакция связывания моноклонального антитела с Ag2 составляет менее 5% от реакции связывания того же моноклонального антитела с Ag1 в тех же экспериментальных условиях и при той же концентрации антитела. На практике применяемая концентрация антитела может составлять ЕС50 или концентрацию, требуемую для достижения плато насыщения, наблюдаемого в случае Ag1.Binding of a monoclonal antibody to Ag1 is not significantly cross-reactive to Ag2 when the affinities for the two antigens are very different. Affinity for Ag2 may not be measurable if the binding reaction is too weak. In the present application, the binding of a monoclonal antibody to Ag1 is not significantly cross-reactive to Ag2 when the binding reaction of the monoclonal antibody to Ag2 is less than 5% of the binding reaction of the same monoclonal antibody to Ag1 under the same experimental conditions and at the same concentration of antibody. In practice, the concentration of antibody used may be EC 50 or the concentration required to reach the saturation plateau observed with Ag1.

Как используется в данном документе, специфичность обозначает способность антитела отличать целевую пептидную последовательность, с которой оно связывается (эпитоп), от близкородственных, высокогомологичных пептидных последовательностей.As used herein, specificity refers to the ability of an antibody to distinguish the target peptide sequence to which it binds (epitope) from closely related, highly homologous peptide sequences.

Моноклональное антитело специфически связывается с Ag1, когда оно не является в значительной степени перекрестно-реактивным в отношении Ag2.A monoclonal antibody specifically binds Ag1 when it is not significantly cross-reactive with Ag2.

Домен может представлять собой любую область белка, обычно определяемую на основании гомологии последовательностей и зачатую связанную определенным структурным или функциональным единством.A domain can be any region of a protein, usually defined on the basis of sequence homology and conceived associated with a certain structural or functional unity.

Рекомбинантная молекула представляет собой молекулу, которая была получена, экспрессирована, создана или выделена рекомбинантными способами.A recombinant molecule is a molecule that has been produced, expressed, created or isolated by recombinant methods.

Как используется в данном документе, термин субъект обозначает млекопитающее, такое как грызун, представитель кошачьих, представитель собачьих и примат. В частности, субъектом согласно настоящему изобретению является человек.As used herein, the term subject means a mammal, such as a rodent, a feline, a canine, and a primate. In particular, the subject of the present invention is a human.

Антитела к CD3.Antibodies to CD3.

CD3 обозначает антиген, который экспрессируется на Т-клетках в качестве части полимолекулярного комплекса Т-клеточных рецепторов и который состоит по меньшей мере из трех различных цепей, CD3ε, CD3δ и CD3y. CD3δ и CD3y обладают низкой идентичностью последовательности и/или сходства с CD3ε человека (сходство и идентичность составляют менее 20%). CD3ε и CDR3δ вместе могут образовывать комплекс, называемый в данном документе CD3ε/δ-комплекс. CD3ε также образует комплекс с CDR3y, так называемый CD3ε/γ-комплекс. Кластеризация CD3 на Т-клетках, например, с помощью иммобилизованных антител к CD3, приводит к активации Т-клетки, аналогичной вовлечению Тклеточного рецептора, но независимо от специфичности, типичной для ее клона. CD3ε содержит три домена, внутриклеточный домен, трансмембранный домен и внеклеточный домен.CD3 refers to an antigen that is expressed on T cells as part of a multimolecular complex of T cell receptors and that consists of at least three different chains, CD3ε, CD3δ and CD3y. CD3δ and CD3y have low sequence identity and/or similarity to human CD3ε (less than 20% similarity and identity). CD3ε and CDR3δ together may form a complex, referred to herein as the CD3ε/δ complex. CD3ε also forms a complex with CDR3y, the so-called CD3ε/γ complex. Clustering of CD3 on T cells, for example by immobilized anti-CD3 antibodies, results in T cell activation similar to T cell receptor involvement, but independent of the specificity typical of its clone. CD3ε contains three domains, an intracellular domain, a transmembrane domain, and an extracellular domain.

Большинство антител к CD3 из уровня техники распознавали цепь CD3ε. Одно из таких антител к CD3 из уровня техники представляет собой ОКТ3. В уровне техники были приведены примеры явлений активации Т-клеток при использовании молекул антитела, например, при использовании молекулы антитела ОКТ3. Антитело к CD3 и его вариант были описаны в уровне техники (US 4361549; US 4361549; US 5885573; US 5929212 и WO 98/52975 или US 5955358). ОКТ3 дополнительно применялось как эффективное иммуносупрессорное средство при клинической трансплантации для лечения отторжения аллотрансплантата (Thistlethwaite 1984, Transplantation 38, 695-701; Woodle 1991, Transplantation 51, 1207-1212; Choi 2001, Eur. J. Immunol. 31(1), 94-106).Most of the prior art anti-CD3 antibodies recognized the CD3ε chain. One such anti-CD3 antibody of the prior art is OKT3. In the prior art, examples have been given of T cell activation phenomena when using antibody molecules, for example when using an OKT3 antibody molecule. An anti-CD3 antibody and a variant thereof have been described in the prior art (US 4361549; US 4361549; US 5885573; US 5929212 and WO 98/52975 or US 5955358). OKT3 has additionally been used as an effective immunosuppressive agent in clinical transplantation for the treatment of allograft rejection (Thistlethwaite 1984, Transplantation 38, 695-701; Woodle 1991, Transplantation 51, 1207-1212; Choi 2001, Eur. J. Immunol. 31(1), 94 -106).

Основным недостатком данной терапии является активация Т-клеток, проявляющаяся в выбросе цитокинов, вследствие перекрестного связывания Т-клеток и FcyR-несущих клеток и ответа с антителом человека к антителу мыши (НАМА). В некоторых публикациях были описаны изменения, такие как гуманизация ОКТ3, для снижения таких побочных эффектов: US 5929212; US 5885573 и другие. С другой стороны, ОКТ3 или другие антитела к CD3 можно применять в качестве иммуностимулирующих средств для стимуляции активации и пролиферации Т-клеток (US 6406696 от Bluestone; US 6143297 от Bluestone; US 6113901 от Bluestone; Yannelly 1990, J. Immunol. Meth. 1, 91-100). Антитела к CD3 также были описаны в качестве средств, применяемых в комбинации с антителами к CD28 для индуцирования пролиферации Т-клеток (US 6352 694). ОКТ3 дополнительно применяли само по себе или в качестве компонентаThe main disadvantage of this therapy is the activation of T cells, manifested in the release of cytokines, due to cross-linking of T cells and FcyR-bearing cells and response with human anti-mouse antibody (HAMA). Some publications have described changes such as humanizing OKT3 to reduce these side effects: US 5929212; US 5885573 and others. On the other hand, OKT3 or other anti-CD3 antibodies can be used as immunostimulatory agents to stimulate T cell activation and proliferation (US 6406696 from Bluestone; US 6143297 from Bluestone; US 6113901 from Bluestone; Yannelly 1990, J. Immunol. Meth. 1 , 91-100). Anti-CD3 antibodies have also been described as agents used in combination with anti-CD28 antibodies to induce T cell proliferation (US 6352 694). OKT3 was additionally used on its own or as a component

- 7 041572 биспецифического антитела для нацеливания цитотоксических Т-клеток на опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки (Nitta 1990, Lancet 335, 368-376; Sanna 1995, Bio/Technology 13, 12211224; WO 99/54440).- 7 041572 bispecific antibodies for targeting cytotoxic T cells to tumor cells or virus-infected cells (Nitta 1990, Lancet 335, 368-376; Sanna 1995, Bio/Technology 13, 12211224; WO 99/54440).

До сегодняшнего дня подходы с применением антител в качестве средств для рекрутинга Т-клеток сдерживались из-за некоторых данных. Во-первых, природные или сконструированные антитела, характеризующиеся высокой аффинностью связывания с Т-клетками, зачастую не активируют Т-клетки, с которыми они связались. Во-вторых, природные или сконструированные антитела, характеризующиеся низкой аффинностью связывания с Т-клетками, также зачастую являются неэффективными вследствие их способности запускать клеточный лизис, опосредованный Т-клетками.Until now, approaches using antibodies as a means of recruiting T cells have been held back by some data. First, naturally occurring or engineered antibodies with high binding affinity for T cells often do not activate the T cells they bind to. Second, naturally occurring or engineered antibodies with low T cell binding affinity are also often ineffective due to their ability to trigger T cell mediated cell lysis.

Эталонная последовательность полноразмерного белка CD3e человека, включая сигнальный пептид, доступна из базы данных Uniprot под номером доступа Р07766 и раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 1 (в виде, доступном на 12 декабря 2014 года).The reference sequence of the full-length human CD3e protein, including the signal peptide, is available from the Uniprot database under accession number P07766 and is disclosed herein under SEQ ID NO: 1 (as available on December 12, 2014).

Эталонная последовательность полноразмерного белка CD3e Масаса fascicularis, включая сигнальный пептид, доступна из базы данных Uniprot под номером доступа Q95LI5 и раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 2 (в виде, доступном на 12 декабря 2014 года).The reference sequence of the full-length Macac fascicularis CD3e protein, including the signal peptide, is available from the Uniprot database under accession number Q95LI5 and is disclosed herein under SEQ ID NO: 2 (as available on December 12, 2014).

Последовательность белков слияния, содержащих Fc и зрелый CD3e человека с меткой His, клонированных авторами настоящего изобретения из геномной ДНК, раскрыта под SEQ ID NO: 3. Указанный белок слияния, содержащий Fc и зрелый CD3e человека с меткой His, содержит аминокислоты 23-126 из полноразмерного белка CD3e человека и, таким образом, содержит внеклеточный домен CD3e человека.The sequence of fusion proteins containing Fc and His-tagged mature human CD3e cloned by the present inventors from genomic DNA is disclosed under SEQ ID NO: 3. Said fusion protein containing Fc and His-tagged mature human CD3e contains amino acids 23-126 of full-length human CD3e protein and thus contains the extracellular domain of human CD3e.

Последовательность белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD3e Macaca fascicularis, клонированного авторами настоящего изобретения из геномной ДНК, раскрыта под SEQ ID NO: 4. Указанный белок слияния, содержащий Fc и зрелый CD3e Macaca fascicularis, содержит аминокислоты 23-117 из полноразмерного белка CD3e Macaca fascicularis и, таким образом, содержит внеклеточный домен CD3e человека или Macaca fascicularis, содержащий одну замену аланина на валин в аминокислотном положении 35 по сравнению с аминокислотным положением 57 последовательности дикого типа.The sequence of a fusion protein containing Fc and mature Macaca fascicularis CD3e cloned by the present inventors from genomic DNA is disclosed under SEQ ID NO: 4. Said fusion protein containing Fc and mature Macaca fascicularis CD3e contains amino acids 23-117 from the full-length Macaca CD3e protein fascicularis and thus contains an extracellular domain of human or Macaca fascicularis CD3e containing one alanine to valine substitution at amino acid position 35 compared to amino acid position 57 of the wild-type sequence.

Доменная организация CD3e человека и Macaca fascicularis является следующей (на основании последовательности Р07766 в Uniprot (человек) и последовательности Q95LI5 в Uniprot (Macaca fascicularis)):The domain organization of human CD3e and Macaca fascicularis is as follows (based on the P07766 sequence in Uniprot (human) and the Q95LI5 sequence in Uniprot (Macaca fascicularis)):

Домены CD3s CD3s domains Положения в SEQ NO: 1 (человек) Provisions in SEQ NO: 1 (person) ID Положения в SEQ ID NO: 2 (Масаса fascicularis) ID Positions in SEQ ID NO: 2 (Masasa fascicularis) Внеклеточный Extracellular 23-126 23-126 22-117 22-117 Трансмембранный домен transmembrane domain 127-152 127-152 118-138 118-138 Цитоплазматический cytoplasmic 153-207 153-207 139-198 139-198

Соответственно, внеклеточный домен CD3e человека состоит из аминокислот в положениях 23-126 из SEQ ID NO: 1, а внеклеточный домен CD3e Macaca fascicularis состоит из аминокислот в положениях 22-117 из SEQ ID NO: 2.Accordingly, the extracellular domain of human CD3e consists of amino acids at positions 23-126 of SEQ ID NO: 1, and the extracellular domain of Macaca fascicularis CD3e consists of amino acids at positions 22-117 of SEQ ID NO: 2.

Авторы настоящего изобретения добились успеха в получении, скрининге и отборе специфических антител мыши и крысы к CD3. Эти антитела к CD3 проявляют высокую аффинность в отношении белка CD3 как человека, так и Macaca fascicularis и в то же время характеризуются низкой активацией Т-клеток в отсутствие целевых клеток.The authors of the present invention have been successful in obtaining, screening and selection of mouse and rat specific antibodies to CD3. These anti-CD3 antibodies show high affinity for both human and Macaca fascicularis CD3 protein and at the same time have low T-cell activation in the absence of target cells.

Авторы настоящего изобретения определили последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепей таких моноклональных антител, антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7С9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20E5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2 и 8Н2.The present inventors determined the sequence of the heavy and light chain variable regions of such monoclonal antibodies, anti-CD3 antibodies, referred to as 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7C9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1E6-C9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7- F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20E5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2 and 8H2.

Антитело к CD3, называемое 20G6-F3, содержит:The anti-CD3 antibody, called 20G6-F3, contains:

вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиheavy chain variable domain, consisting of the sequence

EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNSYAEVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNSYA

TYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLOMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 5, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 6, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 7 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиTYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLOMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 5, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 7, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 8, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGFSDWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGFS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVDPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIKDRFSGSGSGTDFTLKISRRVDPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK

- 8 041572 (SEQ ID NO: 9, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.- 8 041572 (SEQ ID NO: 9, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the KVS sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 4B4-D7, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 4B4-D7, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLVETGGRLVQPGRSLKLТСАТSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKARSNNYATYYAEEVQLVETGGRLVQPGRSLKLTSATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKARSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSTIYLOMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 12, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 14 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSTIYLOMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 12, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 14, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 15, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCR5SQSLVHDNGNTYLSWSLORPGOSPOVL·IYKVSNRFSGTSDVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCR5SQSLVHDNGNTYLSWSLORPGOSPOVL IYKVSNRFSGTS

DRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 16, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 16, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 4Е7-С9, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 4E7-C9, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOWETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKDKSNNYATYYAEEVOWETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKDKSNNYATYYAE

SLKGRFTISRDDPKRSIYLOMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSLKGRFTISRDDPKRSIYLOMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 19, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 20, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVWTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLOKPGOSPOPLIYKVSNRFSGISDVWTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLOKPGOSPOPLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGPGTKLELK (SEQ ID NO: 21, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 22, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGPGTKLELK (SEQ ID NO: 21, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 22, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 18F5-H10, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 18F5-H10, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOWETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKOLEWVAQIKDKSNNYATYYAEEVOWETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKOLEWVAQIKDKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSSIYLOMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYALDAWGRGTSVSVSS (SEQ ID NO: 23, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 24, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 25, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSSIYLOMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYALDAWGRGTSVSVSS (SEQ ID NO: 23, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 24, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 19, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 25, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVLMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKVSNRLSGISDVLMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKVSNRLSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 26, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 27, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 26, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 27, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28.

Антитело к CD3, называемое 12D2-E5, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 12D2-E5, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFYAYWMGWVROAPGKGLEWIGEIKKDGTTINYTPSLEVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFYAYWMGWVROAPGKGLEWIGEIKKDGTTINYTPSL

KDRFTISRDNAONTLYLOMTKLGSEDTALYYCAREERDGYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 29, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 30, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 31 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 32, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKDRFTISRDNAONTLYLOMTKLGSEDTALYYCAREERDGYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 29, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 30, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 31, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 32, and a light chain variable domain consisting of the sequence

OFVLTOPNSVSTNLGSTVKLSCKRSTGNIGSNYVNWYOOHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFSOFVLTOPNSVSTNLGSTVKLSCKRSTGNIGSNYVNWYOOHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFS

GSIDRSSNSALLTINNVOTEDEADYFCQSYSSGIVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 33, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 34, CDR2-L, состоящий из последовательности RDD, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 35.GSIDRSSNSALLTINNVOTEDEADYFCQSYSSGIVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 33, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 34, a CDR2-L consisting of the sequence RDD, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 35.

Антитело к CD3, называемое 11D7-C3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 11D7-C3, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQFVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVQFVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKS SVYLQMNSLKEEDTATYYCRGLYYGLSPSDYWGQGVMVTVS SSVKGRFTISRDDSKS SVYLQMNSLKEEDTATYYCRGLYYGLSPSDYWGQGVMVTVS S

- 9 041572 (SEQ ID NO: 36, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под- 9 041572 (SEQ ID NO: 36, with CDRs shown in bold and underlined), containing CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence under

SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSEQ ID NO: 37 and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 38, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVWTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKV'SNRFSGISDVWTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKV'SNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 39, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 39, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the KVS sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28.

Антитело к CD3, называемое 11Н3-Е5, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 11H3-E5, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

ЕVQLVEТGGSLVQPGKSLKLТCATSGFTFSNAWMHWVROSРЕKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVQLVEТGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSREKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSL·KEEDTAIYYCRGTYYAYKPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 40, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 41, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSL KEEDTAIYYCRGTYYAYKPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 40, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 41, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLOKPGOSPOVLIYKVSNRFSGTSDWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLOKPGOSPOVLIYKVSNRFSGTS

DRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 42, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 42, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 17, a CDR2-L consisting of the sequence of KVS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 13Н2-С2, содержит:The anti-CD3 antibody, called 13H2-C2, contains:

вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиheavy chain variable domain, consisting of the sequence

EEELVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPDKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEEELVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPDKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLKEEDTAIYYCRYVHYGLAPMDAWG0GTSVTVS5 (SEQ ID NO: 43, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 44, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLKEEDTAIYYCRYVHYGLAPMDAWG0GTSVTVS5 (SEQ ID NO: 43, with CDRs shown in bold and underlined), containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 44, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKAGQSPQLLIYKVSNRFSGISDWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKAGQSPQLLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFILKISRVEPDDLGVFYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 45, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFILKISRVEPDDLGVFYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 45, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 13C1-F6, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 13C1-F6, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOLVETGGTLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVOLVETGGTLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKTSVYLOLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 46, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKTSVYLOLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 46, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 47, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVVMTOSPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLORSGOSPOLLIYKV’SNRLSGISDVVMTOSPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLORSGOSPOLLIYKV’SNRLSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTRLEIK (SEQ ID NO: 48, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTRLEIK (SEQ ID NO: 48, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence of KVS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 18H11-F10, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD3 antibody called 18H11-F10 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFIFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVATISISGSRTYYPDSVEVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFIFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVATISISGSRTYYPDSV

KGRFTVSRDNAKSSLYLQMNSLKSEDTATYYCATNNPGGWFVYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 50, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 51 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 52, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKGRFTVSRDNAKSSLYLQMNSLKSEDTATYYCATNNPGGWFVYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 50, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 51, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 52, and a light chain variable domain consisting of the sequence

NIOMTOSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNINNDLAWYOOKLGEAPRLLIYNANSLOTGIPSRFSGNIOMTOSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNINNDLAWYOOKLGEAPRLLIYNANSLOTGIPSRFSG

SGSGADFTLTISSLOPEDVATYFCOQYSSGDTFGAGTKLELKSGSGADFTLTISSLOPEDVATYFCOQYSSGDTFGAGTKLELK

- 10 041572 (SEQ ID NO: 53, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 54, CDR2-L, состоящий из последовательности NAN, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 55.- 10 041572 (SEQ ID NO: 53, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 54, a CDR2-L consisting of the NAN sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 55.

Антитело к CD3, называемое 1Е6-С9, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 1E6-C9, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLVE TGGS LVQPGKS LKL Т CAT SGFTFSYAWMHWVROSPDKQLQWVAQIKAKSNNYAT Y YAEEVQLVE TGGS LVQPGKS LKL T CAT SGFTFSYAWMHWVROSPDKQLQWVAQIKAKSNNYAT Y YAE

SVEGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRGVYYGLLGLDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 56, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 57, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 58, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVEGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRGVYYGLLGLDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 56, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 57, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 58, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVRLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWFLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGISDWMTOTPVSLSVRLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWFLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSASGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 59, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28.DRFSGSASGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 59, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the KVS sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28.

Антитело к CD3, называемое 10F4-C10, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 10F4-C10, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLVEТGGSLVQPGKSLKIТСАТSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVQLVEТGGSLVQPGKSLKITSATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRAVNYGNYPLDYWGQGVMVTVS S (SEQ ID NO: 60, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 61, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRAVNYGNYPLDYWGQGVMVTVS S (SEQ ID NO: 60, with CDRs shown in bold and underlined), containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with sequence under SEQ ID NO: 61, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWCLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGISDWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWCLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 62, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 62, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence of KVS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 10E6-G6, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 10E6-G6, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLVE Т GGGLVQS GKS LKL Т CAT SGFTVTNAWMHWVROS PEKQLEWVAQIKAKSNNYE TYYAEEVQLVE T GGGLVQS GKS LKL T CAT SGFTVTNAWMHWVROS PEKQLEWVAQIKAKSNNYE TYYAE

SVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 63, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 64, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 65 и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 63, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 64, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 65, and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 47, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOSPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGYTYLSWYLOKPGOSPOVFIYKVSNRFSGISDWMTOSPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGYTYLSWYLOKPGOSPOVFIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 66, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 67, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28.DRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 66, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 67, a CDR2-L consisting of the sequence KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28.

Антитело к CD3, называемое 18G9-H11, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 18G9-H11, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOLVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWIOWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVOLVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWIOWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTALYYCTWRHYYSSHTMDAWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 68, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 69, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTALYYCTWRHYYSSHTMDAWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 68, with CDRs shown in bold and underlined), containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 69, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGOSPOLLIYKVSNRFSGISDWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGOSPOLLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVAPTDLGVYYCGQGSQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 70, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 71.DRFSGSGSGTDFTLKISRVAPTDLGVYYCGQGSQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 70, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 71.

Антитело к CD3, называемое 11F3-B9, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 11F3-B9, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

- 11 041572- 11 041572

EVOLVETGGSLVOPGKSLTLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVOLVETGGSLVOPGKSLTLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKRSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 72, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 84, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKRSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 72, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 84, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGFSDWMTOTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGFS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 73, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 73, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 12G3-E8, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 12G3-E8, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

ЕVRWE Т GGS LVQ Р GKS LKL Т CAT SGFTFSLAWMHWVROSPEKKLEWVAQIKDKANNYATYYAEEVRWE T GGS LVQ R GKS LKL T CAT SGFTFSLAWMHWVROSPEKKLEWVAQIKDKANNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNRLKEEDTAIYYCRGVYYGFSMTPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 74, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 75, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 76 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 77, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNRLKEEDTAIYYCRGVYYGFSMTPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 74, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 75, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 76, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 77, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVAMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQVLIYKVSNRFSGISDVAMTQTPVSLSVSLGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQVLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGADFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGT^YPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 78, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGADFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGT^YPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 78, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the KVS sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 5B1-G2, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 5B1-G2, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOWETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFSFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKDKANNYATYYAEEVOWETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFSFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKDKANNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKGSIYLOMNSLKEEDTAVYYCRGLYYGLFPSDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 79, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 80, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 76 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 81, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKGSIYLOMNSLKEEDTAVYYCRGLYYGLFPSDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 79, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 80, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 76, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 81, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVVMTOTPVSLSVSL·GGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYL·SWYLLKPGOSPOL·L·IYKVSNRFSGISDVVMTOTPVSLSVSL GGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYL SWYLLKPGOSPOL L IYKVSNRFSGIS

DRFSGGGSGTDFTLKISRLEPDDLGIYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 82, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGGGSGTDFTLKISRLEPDDLGIYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 82, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 16F8-A7, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательностьAn anti-CD3 antibody called 16F8-A7 contains a heavy chain variable domain containing the sequence

VETGGNLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAESVKGVETGGNLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKAKSNNYATYYAESVKG

RFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 83, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 84, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 83, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 84, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYL·OKPGOSPOL·L·IYKVSNRFSGFSDVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYL OKPGOSPOL L IYKVSNRFSGFS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence of KVS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 11F9-F8, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 11F9-F8, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

ЕVQLVEТGGTLVQPGKSLKLТCATSGFTFSNAWMHWVRQSРЕKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVQLVEТGGTLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKTSVYLOLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 46, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKTSVYLOLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 46, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 47, and a light chain variable domain consisting of the sequence

- 12 041572- 12 041572

DWLTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWSLOKPGOSPOVLIYKVSNRFSGISDWLTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWSLOKPGOSPOVLIYKVSNRFSGIS

NRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGAHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 87, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 88.NRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGAHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 87, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 88.

Антитело к CD3, называемое 3G5-E10, содержит: вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD3 antibody called 3G5-E10 contains: a heavy chain variable domain consisting of the sequence

ЕVKLVE S GGGLVQ PGRS LKL 3 CAASGFNFNVYWMGWVROAPGKGLEWIGEIKKDSNSINYTP3 LEVKLVE S GGGLVQ PGRS LKL 3 CAASGFNFNVYWMGWVROAPGKGLEWIGEIKKDSNSINYTP3 L

KEKFTISRDNAQNTLYLOVNKLGSEDTAIYYCAREERDGYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 89, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 90, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 91 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 32, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKEKFTISRDNAQNTLYLOVNKLGSEDTAIYYCAREERDGYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 89, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 90, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 91, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 32, and a light chain variable domain consisting of the sequence

NIVMTOSPKSMSMSVGERVTLTCKASENWTYVSWYOOKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGNIVMTOSPKSMSMSVGERVTLTCKASENWTYVSWYOOKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTG

SGSATDFTLT13 SVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 92, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 93, CDR2-L, состоящий из последовательности GAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 94.SGSATDFTLT13 SVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 92, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 93, a CDR2-L consisting of the GAS sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 94.

Антитело к CD3, называемое 9D7-F3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 9D7-F3, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

AVQLVE 3 GGGLVQPKE 3 LKI3 СААЗGFTFSNAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATYYADAVQLVE 3 GGGLVQPKE 3 LKI3 SAAZGFTFSNAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNYATYYAD

SVTGRFIISRDDSRSMVYLQMDNLOTEDTAMYYCTALISTAMAAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 95, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 96, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 97 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 98, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVTGRFIISRDDSRSMVYLQMDNLOTEDTAMYYCTALISTAMAAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 95, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 96, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 97, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 98, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIQMTQS PS FLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYHQMLGEAPKLVISNTNNLQAGIPSRFSGDIQMTQS PS FLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYHQMLGEAPKLVISNTNNLQAGIPSRFSG

SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCLQHRSGYTFGLGTKLELK (SEQ ID NO: 99, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 100, CDR2-L, состоящий из последовательности NTN, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 101.SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCLQHRSGYTFGLGTKLELK (SEQ ID NO: 99, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 100, a CDR2-L consisting of the NTN sequence, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 101.

Антитело к CD3, называемое 8C2-F7, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 8C2-F7, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OIOLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTDFAMNWVKOAPGNGLKWMGWINTQTGKPTYADGFOIOLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFFTDFAMNWVKOAPGNGLKWMGWINTQTGKPTYADGF

KORFVFSLETSASTIYLQINNLNIEDTATYFCTRGALASVGOGVLVTVSS (SEQ ID NO: 102, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 103, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 104 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 105, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKORFVFSLETSASTIYLQINNLNIEDTATYFCTRGALASVGOGVLVTVSS (SEQ ID NO: 102, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 103, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 104, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 105, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTQTPVSLSVSLGSHVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGOSPQPLIYKVSNRFSGISDWMTQTPVSLSVSLGSHVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGOSPQPLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLEINRVEPDDLGVYYCGQGAQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 106, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLEINRVEPDDLGVYYCGQGAQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 106, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 20E5-F10, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD3 antibody called 20E5-F10 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

ЕVQLVE Т GENLVQP GKS LRL Т CAT 3GFSFSNAWMHWIRQS PEKQLEWVAQIKDKSNNYATYYAEEVQLVE T GENLVQP GKS LRL T CAT 3GFSFSNAWMHWIRQS PEKQLEWVAQIKDKSNNYATYYAE

SVNGRFTISRDDSKSSIYLHMDNLKEEDSAIYYCRYVHYGVRFFYTMDVWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 107, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 80, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 108, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVNGRFTISRDDSKSSIYLHMDNLKEEDSAIYYCRYVHYGVRFFYTMDVWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 107, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 80, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 19, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 108, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGDOVSISCRPSQSLVHNNGNTYLSWYLOKPGOSPHPLIYKVSNRFSGISDWMTOTPVSLSVSLGDOVSISCRPSQSLVHNNGNTYLSWYLOKPGOSPHPLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 109, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 109, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 20B5-F10, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD3 antibody called 20B5-F10 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

- 13 041572- 13 041572

EVOLVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAEEVOLVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKQLEWVAQIKAKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSIS SVYLOMNNLKEEDTAIYYCRGVYYGFLGMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 110, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 111, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSIS SVYLOMNNLKEEDTAIYYCRGVYYGFLGMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 110, with CDRs shown in bold and underlined), containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 37, and CDR3-H with sequence under SEQ ID NO: 111, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQRLVHNNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLVYKVSNRFSGISDWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQRLVHNNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLVYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTEYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 112, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 113, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 114.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTEYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 112, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 113, a CDR2-L consisting of the sequence KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 114.

Антитело к CD3, называемое 6C9-C9, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 6C9-C9, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

AVQLVE S GGGLVRPKE S LKIS CAASGFTFRNAAMYWVROAPGKGLEWVARIRTQPNNYAKYYADAVQLVE S GGGLVRPKE S LKIS CAASGFTFRNAAMYWVROAPGKGLEWVARIRTQPNNYAKYYAD

SVKDRFTISRDDSKSMVYLQMDNLKTEDTAMYYCTGLVVTAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 115, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 116, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 117 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 118, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKDRFTISRDDSKSMVYLQMDNLKTEDTAMYYCTGLVVTAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 115, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 116, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 117, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 118, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIOMTOSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYOQKLGEAPKLLIYVTNNLQTGIPSRFSGDIOMTOSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYOQKLGEAPKLLIYVTNNLQTGIPSRFSG

SGSGTDYTLTISSLOPEDVATYFCLQHRSMYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 119, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 100, CDR2-L состоящий из последовательности VTN, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 120.SGSGTDYTLTISSLOPEDVATYFCLQHRSMYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 119, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 100, a CDR2-L consisting of the sequence of VTN, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 120.

Антитело к CD3, называемое 3E8-G1, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 3E8-G1, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOWESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMDWVROAPKKGLEWVATITASGSRIYYPDSVEVOWESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMDWVROAPKKGLEWVATITASGSRIYYPDSV

KGRFTISRDNAKSSLYLLMNSLKSEDTATYYCARERTDAYFDYWGOGVMVTVS5 (SEQ ID NO: 121, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 122, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 123 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 124, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKGRFTISRDNAKSSLYLLMNSLKSEDTATYYCARERTDAYFDYWGOGVMVTVS5 (SEQ ID NO: 121, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 122, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 123, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 124, and a light chain variable domain consisting of the sequence

QFILTOPNSVSTILGSTVKLSCKRSTGNIGTNYVSWYQHHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFSQFILTOPNSVSTILGSTVKLSCKRSTGNIGTNYVSWYQHHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFS

GSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYISGLNPVFGGGSKLTVL (SEQ ID NO: 125, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 126, CDR2-L, состоящий из последовательности RDD, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 127.GSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYISGLNPVFGGGSKLTVL (SEQ ID NO: 125, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 126, a CDR2-L consisting of the sequence under RDD, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 127.

Антитело к CD3, называемое 3H6-D2, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 3H6-D2, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

ЕVQLVEТGGRLVQPGKSLKLТCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKDKSNNYATYYAEEVQLVEТGGRLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVROSPEKOLEWVAQIKDKSNNYATYYAE

SVKGRFTISRDDSKSIIYLQMNSLKEEDTAIYYCRALTYYGYKRDAMDGWGHGTSVTVSS (SEQ ID NO: 128, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 129, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSVKGRFTISRDDSKSIIYLQMNSLKEEDTAIYYCRALTYYGYKRDAMDGWGHGTSVTVSS (SEQ ID NO: 128, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 19, and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 129, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGOSPOLLIYKVSNRFSGISDWMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGOSPOLLIYKVSNRFSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 130, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L, состоящий из последовательности KVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 130, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, a CDR2-L consisting of the sequence under KVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11.

Антитело к CD3, называемое 8Н2, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD3 antibody, called 8H2, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

QIQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTDFAMNWVKOAPGNGLKWMGWINTQTGKPTYADGЕQIQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTFAMNWVKOAPGNGLKWMGWINTQTGKPTYADGE

KQRFVFS LE Т SAS ТIYLQINNLNIEDTATY FCTRGALASVGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 131, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 103, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 104 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 105, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKQRFVFS LE T SAS TIYLQINNLNIEDTATY FCTRGALASVGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 131, with CDRs shown in bold and underlined) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 103, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 104, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 105, and a light chain variable domain consisting of the sequence

- 14 041572- 14 041572

DWMTQTPVSLSVAIGQPASISCKSSQSLVGTSGKTYLNWLLQRPGOSPKRLIYLVSKLDSGIPDWMTQTPVSLSVAIGQPASISCKSSQSLVGTSGKTYLNWLLQRPGOSPKRLIYLVSKLDSGIP

DRFSGSGSETDFTLKISRVETDDLGVYYCLQGSHFPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 132, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 133, CDR2-L, состоящий из последовательности LVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 134.DRFSGSGSETDFTLKISRVETDDLGVYYCLQGSHFPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 132, with CDRs shown in bold and underlined) containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 133, a CDR2-L consisting of the sequence LVS, and a CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 134.

В варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению связывается с CD3 человека. В другом варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению дополнительно связывается с CD3 Масаса fascicularis. В частности, антитело к CD3 по настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом CD3 человека, или CD3 как человека, так и Масаса fascicularis. Более конкретно, антитело связывается с CD3ε. Более конкретно, антитело к CD3 связывается с внеклеточным доменом CD3ε человека и Масаса fascicularis. Антитело к CD3 связывается с CD3ε, когда он присутствует в форме комплекса, такого как CD3ε/δ-комплекс, или когда он присутствует в качестве отдельного белка, не важно экспрессируется ли он в виде выделенной формы или присутствует в виде растворимого внеклеточного домена или полноразмерного заякоренного в мембране CD3ε, представленного, например, в Т-клетках.In an embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention binds to human CD3. In another embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention further binds to Macac fascicularis CD3. In particular, the anti-CD3 antibody of the present invention binds to the extracellular domain of human CD3, or both human and Macac fascicularis CD3. More specifically, the antibody binds to CD3ε. More specifically, the anti-CD3 antibody binds to the extracellular domain of human CD3ε and Macac fascicularis. An anti-CD3 antibody binds to CD3ε when it is present in the form of a complex, such as a CD3ε/δ complex, or when it is present as a single protein, whether it is expressed in an isolated form or present as a soluble extracellular domain or a full-length anchored in the CD3ε membrane, present, for example, in T cells.

Антитело к CD3 согласно настоящему изобретению является специфическим в отношении поверхностного белка CD3 человека, или белков CD3 как человека, так и Масаса fascicularis, в частности, в отношении CD3ε.The anti-CD3 antibody of the present invention is specific for the human CD3 surface protein, or for both human and Macac fascicularis CD3 proteins, in particular for CD3ε.

В варианте осуществления антитело к CD3 согласно настоящему изобретению характеризуется соотношением аффинности к CD3 Масаса fascicularis и аффинности к CD3 человека (KD(Масаса fascicularis)/KD(человек)), которое составляет <10, в частности <6, <5, <4, <3, например <2, <1 или <0,5. Такой полипептид согласно настоящему изобретению можно применять в токсикологических исследованиях, проводимых на обезьянах, поскольку профиль токсичности, наблюдаемый на обезьянах, соответствует ожидаемым потенциальным неблагоприятным эффектам у человека.In an embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention has a ratio of Macaca fascicularis CD3 affinity to human CD3 affinity (KD(Macaca fascicularis)/KD(human)) that is <10, such as <6, <5, <4, <3, such as <2, <1, or <0.5. Such a polypeptide of the present invention can be used in toxicology studies in monkeys because the toxicity profile observed in monkeys is consistent with the expected potential adverse effects in humans.

В частности, антитело к CD3 по настоящему изобретению не связывается с белком(ами) CD3y и/или CD35 или не является в значительной степени перекрестно реактивным в их отношении.In particular, the anti-CD3 antibody of the present invention does not bind to or is not significantly cross-reactive with CD3y and/or CD35 protein(s).

В частности, антитело не связывается с внеклеточным доменом вышеупомянутого белка(ов) CD3y и/или CD35 человека и Масаса fascicularis или не является в значительной степени перекрестно реактивным в их отношении.In particular, the antibody does not bind to the extracellular domain of the aforementioned human CD3y and/or CD35 protein(s) and Macac fascicularis or is not significantly cross-reactive with them.

Последовательность полноразмерного белка CD35 человека доступна в базе данных Uniprot под номером доступа Р04234 (SEQ ID NO: 86, в виде, доступном на 14 декабря 2014 года). Внеклеточный домен CD35 человека состоит из аминокислот в положениях 22-105 из SEQ ID NO: 86.The sequence of the full-length human CD35 protein is available from the Uniprot database under accession number P04234 (SEQ ID NO: 86, as of December 14, 2014). The extracellular domain of human CD35 consists of amino acids at positions 22-105 of SEQ ID NO: 86.

Последовательность полноразмерного белка CD3y человека доступна в базе данных Uniprot под номером доступа Р09693 (SEQ ID NO: 185, в виде, доступном на 14 декабря 2014 года). Внеклеточный домен CD3y человека состоит из аминокислот в положениях 23-116 из SEQ ID NO: 185.The sequence of the full-length human CD3y protein is available from the Uniprot database under accession number P09693 (SEQ ID NO: 185, as accessed on December 14, 2014). The extracellular domain of human CD3y consists of amino acids at positions 23-116 of SEQ ID NO: 185.

Кроме того, антитело к CD3 согласно настоящему изобретению характеризуется аффинностью (KD) к CD3 человека или CD3 Масаса fascicularis, или обоим, которая составляет <90 нМ, <50 нМ, или <30 нМ, например, <20 нМ, <10 нМ, <8 нМ, <6 нМ, <4 нМ или <2 нМ, например аффинностью, составляющей от 0,1 до 10 нМ, в частности от 0,1 до 8 нМ или от 0,1 до 4 нМ.In addition, the anti-CD3 antibody of the present invention has an affinity (KD) for human CD3 or Macac fascicularis CD3, or both, which is <90 nM, <50 nM, or <30 nM, e.g., <20 nM, <10 nM, <8 nM, <6 nM, <4 nM or <2 nM, for example with an affinity of 0.1 to 10 nM, in particular 0.1 to 8 nM or 0.1 to 4 nM.

Аффинность к CD3 человека или к CD3 Масаса fascicularis определяют в виде значения KD с помощью поверхностного плазмонного резонанса с применением растворимого рекомбинантного CD3ε/δкомплекса из белков человека и Масаса fascicularis в качестве антигена для захвата.Affinity for human CD3 or Macac fascicularis CD3 is determined as a KD value by surface plasmon resonance using a soluble recombinant CD3ε/δ complex of human proteins and Macac fascicularis as the capture antigen.

В одном примере, аффинности связывания антитела к CD3 измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением, например, инструмента Biacore3000 (GE Healthcare). Буфер для анализа представляет собой, например, HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). В качестве антигена можно применять, например, конструкции на основании внеклеточного домена субъединиц CD3ε человека и CD3δ человека, включая сигнальный пептид, в форме белков слияния, содержащих Fc, как описано в примерах. В качестве альтернативы в качестве антигена можно применять конструкции на основе внеклеточного домена субъединиц CD3ε Масаса fascicularis и CD3δ Масаса fascicularis, включая сигнальный пептид, в форме белков слияния, содержащих Fc, как описано в примерах. Захват белков слияния, содержащих Fc и CD3ε/δ человека или Масаса fascicularis, достигается с применением, например, набора для захвата антител человека (GE Healthcare). Например, захватывающее антитело может быть соединено с чипами СМ5 (BR-1001-88, GE Healthcare), например, до приблизительно 12000 RU с применением, например, набора для аминного связывания (BR-100-50, GE Healthcare). Белки слияния CD3e/5Fc захватываются при 10 мкл/мин. до приблизительно 70 RU с обеспечением значений Rmax, составляющих 30 RU. Кинетику связывания для антитела к CD3 можно измерять, например, при 30 мкл/мин в течение 240 и 600 с для фаз ассоциации и диссоциации соответственно. Например, можно применять двукратные разведения антитела к CD3 от 3 до 400 нМ в буфере для анализа. Регенерацию поверхности захвата можно проводить, например, с помощью 1-минутной инъекции, например 3М раствора MgCl2 при 30 мкл/мин. Для анализа данных можно применять, например, программное обеспечение BIAevalua- 15 041572 tion v.4.1 (GE Healthcare). Данные можно аппроксимировать в целом с применением 1:1 модели Лэнгмюра с массообменом.In one example, the binding affinities of an antibody to CD3 are measured by surface plasmon resonance (SPR) using, for example, the Biacore3000 instrument (GE Healthcare). The assay buffer is, for example, HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). As an antigen, for example, constructs based on the extracellular domain of human CD3ε and human CD3δ subunits, including a signal peptide, in the form of Fc-containing fusion proteins, as described in the examples, can be used. Alternatively, constructs based on the extracellular domain of Macac fascicularis CD3ε and Macac fascicularis CD3δ subunits, including a signal peptide, in the form of Fc-containing fusion proteins, as described in the examples, can be used as an antigen. Capture of fusion proteins containing human or Macac fascicularis Fc and CD3ε/δ is achieved using, for example, a human antibody capture kit (GE Healthcare). For example, a capture antibody can be coupled to CM5 chips (BR-1001-88, GE Healthcare), for example, up to about 12,000 RU using, for example, an amine coupling kit (BR-100-50, GE Healthcare). CD3e/5Fc fusion proteins are captured at 10 µl/min. up to approximately 70 RU with Rmax values of 30 RU. The binding kinetics for an anti-CD3 antibody can be measured, for example, at 30 μl/min for 240 and 600 s for the association and dissociation phases, respectively. For example, 2-fold dilutions of the anti-CD3 antibody from 3 to 400 nM in assay buffer can be used. Regeneration of the capture surface can be carried out, for example, with a 1 minute injection of, for example, a 3M MgCl 2 solution at 30 μl/min. For data analysis, for example, the software BIAevaluation-15 041572tion v.4.1 (GE Healthcare) can be used. The data can be approximated as a whole using a 1:1 Langmuir model with mass transfer.

В варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению также характеризуется кажущейся EC50, например, определяемой с помощью анализа FACS на Т-клетках человека, которая составляет <60 нМ, например <50 нМ, <40 нМ, <30 нМ, <20 нМ или <15 нМ. Как правило, кажущаяся ЕС50 находится в пределах диапазона 1-60 нМ, в частности 1-30 нМ, например 1-20 нМ.In an embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention also has an apparent EC50, e.g., as determined by a FACS assay on human T cells, that is <60 nM, e.g., <50 nM, <40 nM, <30 nM, <20 nM, or <15 nM. Typically, the apparent EC50 is in the range of 1-60 nM, in particular 1-30 nM, eg 1-20 nM.

В одном варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению характеризуется активацией Т-клеток, которая составляет менее 10%, менее 8%, менее 6%, менее 4%, менее 2%, менее 1%, например, менее 0,5% в отсутствие целевых клеток.In one embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention has a T cell activation that is less than 10%, less than 8%, less than 6%, less than 4%, less than 2%, less than 1%, e.g., less than 0.5% in lack of target cells.

Термином активация Т-клеток в данном документе называют запуск передачи сигнала с участием CD3, что влечет за собой слияние цитотоксических гранул, временный выброс цитокинов и пролиферацию. Антителоподобный связывающий белок и антитело к CD3 по настоящему изобретению нацеливается на CD3ε и активирует Т-клетки в присутствии целевых клеток; данную активность также называют эффект вовлечения Т-клеток. Эффект вовлечения Т-клеток индуцирует цитотоксичность в отношении целевой клетки.The term T cell activation is used herein to refer to the initiation of CD3 signaling, which entails the fusion of cytotoxic granules, the transient release of cytokines, and proliferation. The antibody-like binding protein and anti-CD3 antibody of the present invention targets CD3ε and activates T cells in the presence of target cells; this activity is also referred to as the T cell recruitment effect. The effect of recruiting T cells induces cytotoxicity against the target cell.

Как известно специалисту в данной области, активация Т-клеток индуцирует экспрессию поверхностного маркера, такого как CD69 и CD25. Активацию Т-клеток, таким образом, можно измерять путем обнаружения и измерения экспрессии CD4+/CD25+, CD4+/CD69+, CD8+/CD25+ или CD8+/CD69+ Тклеток. Способы измерения активации Т-клеток известны специалисту в данной области.As known to those skilled in the art, T cell activation induces the expression of a surface marker such as CD69 and CD25. T cell activation can thus be measured by detecting and measuring the expression of CD4+/CD25+, CD4+/CD69+, CD8+/CD25+ or CD8+/CD69+ T cells. Methods for measuring T cell activation are known to those skilled in the art.

Способ измерения активации Т-клеток дополнительно раскрыт в разделе примеров (пример 3.3). Соответственно, в контексте настоящего изобретения активацию Т-клеток измеряют или как процентную долю клеток, экспрессирующих CD69, в % от общего количества клеток, или как процентную долю клеток, экспрессирующих CD4 и CD69, в % от общего количества клеток, или как процентную долю клеток, экспрессирующих CD8 и CD69, в % от общего количества клеток.A method for measuring T cell activation is further disclosed in the examples section (Example 3.3). Accordingly, in the context of the present invention, T cell activation is measured either as the percentage of cells expressing CD69 as % of total cells, or as the percentage of cells expressing CD4 and CD69 as % of total cells, or as the percentage of cells expressing CD8 and CD69, in % of the total number of cells.

Низкой активацией Т-клеток в контексте антитела к CD3 по настоящему изобретению называют менее чем 10%, менее чем 8%, менее чем 6%, менее чем 4%, менее чем 2%, менее чем 1%, например, менее чем 0,5% активацию Т-клеток в отсутствие целевых клеток.Low T cell activation in the context of an anti-CD3 antibody of the present invention refers to less than 10%, less than 8%, less than 6%, less than 4%, less than 2%, less than 1%, e.g., less than 0, 5% T cell activation in the absence of target cells.

Проводили выравнивание последовательностей областей VH и VL из антител к CD3, 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11H3-B5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 18Н1Щ10, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6С9-С9, 3E8-G1, 3H6-D2 и 8Н2. Сравнение последовательностей CDR-H и CDR-L в большинстве случаев указывает на то, что 20G6-F3, 4B4D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10 и 3Н6-О2 являются близкородственными с точки зрения структуры, причем указанные антитела, вероятно, связываются с одним и тем же эпитопом. Сравнение последовательностей CDR-H и CDR-L из указанных родственных антител представлено на фиг. 1 и 2 соответственно. Идентифицировали положения CDR, которые были строго консервативными у разных антител и которые, таким образом, предположительно важны с точки зрения специфичности, тогда как остальные положения могли содержать замену.Sequence alignment of the VH and VL regions from antibodies to CD3, 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11H3-B5, 13H2-C2, 13C1-F6, 18H1Sch10, 1E6-C9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5- F10, 20B5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2 and 8H2. Comparison of the CDR-H and CDR-L sequences in most cases indicates that 20G6-F3, 4B4D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6-C9 , 10F4-C10, 10E6G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10 , and these antibodies are likely to bind to the same epitope. Sequence comparison of CDR-H and CDR-L from these related antibodies is shown in FIG. 1 and 2, respectively. Positions of the CDRs were identified that were strongly conserved across antibodies and thus presumably important in terms of specificity, while the remaining positions could contain substitutions.

Соответственно, антитело согласно настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H, состоящий из последовательности GFX1X2X3X4AW (SEQ ID NO: 331), где X1 представляет собой Т или S, Х2 представляет собой F или V, Х3 представляет собой S или Т, а Х4 представляет собой N, K, L или Y, или любая их комбинация; иAccordingly, the antibody of the present invention contains a heavy chain variable domain containing a CDR1-H, consisting of the sequence GFX1X2X3X4AW (SEQ ID NO: 331), where X1 is T or S, X 2 is F or V, X 3 is S or T and X 4 is N, K, L or Y, or any combination thereof; And

CDR2-H, состоящий из последовательности IKX1X2X3NX4YX5T (SEQ ID NO: 332), где X1 представляет собой А или D, Х2 представляет собой K или R, Х3 представляет собой S или А, Х4 представляет собой N или S и Х5 представляет собой А или Е, или любая их комбинация; иCDR2-H consisting of the sequence IKX1X 2 X 3 NX 4 YX 5 T (SEQ ID NO: 332), where X1 is A or D, X 2 is K or R, X 3 is S or A, X 4 is N or S and X 5 is A or E, or any combination thereof; And

CDR3-H, состоящую из последовательности TWRHYYSSHTMDA (SEQ ID NO: 69), или RALTYYGYKRDAMDG (SEQ ID NO: 129), или RX1X2X3YX4X5X6X7X8X9X10X11DX12 (SEQ ID NO: 333), где X1 представляет собой Y, G или A, X2 представляет собой V, T или L, Х3 представляет собой Н, N, Y или Q, Х4 представляет собой G, R илиCDR3-H consisting of the sequence TWRHYYSSHTMDA (SEQ ID NO: 69) or RALTYYGYKRDAMDG (SEQ ID NO: 129) or RX1X2X3YX4X5X6X7X8X9X10X11DX12 (SEQ ID NO: 333), where X 1 is Y, G or A, X2 is V, T or L, X3 is H, N, Y or Q, X4 is G, R or

А, Х5 представляет собой F, или V, или отсутствие аминокислоты, Х6 представляет собой R или отсутствие аминокислоты, Х7 представляет собой F, S, или I, или отсутствие аминокислоты, Х8 представляет собой F, L, N, M, Y, S, А или G, Х9 представляет собой Y, А, K, S, N, T, F или L, X10 представляет собой А, Р, G или Т, Х11 представляет собой М, L, F или S, а X12 представляет собой А, V или Y, или любая их комбинация, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L, состоящий из последовательности QX1LX2HX3NGX4TY (SEQ ID NO: 334), где Х1 представляет собой R или S, Х2 представляет собой V или Е, Х3 представляет собой N, D или Т, а Х4 представляет собой N или Y, или любая их комбинация; иA, X 5 is F or V or no amino acid, X 6 is R or no amino acid, X 7 is F, S, or I or no amino acid, X 8 is F, L, N, M , Y, S, A or G, X 9 is Y, A, K, S, N, T, F or L, X 10 is A, P, G or T, X11 is M, L, F or S, and X 12 is A, V, or Y, or any combination thereof, and a light chain variable domain containing CDR1-L, consisting of the sequence QX 1 LX 2 HX 3 NGX 4 TY (SEQ ID NO: 334), where X 1 is R or S, X 2 is V or E, X3 is N, D or T, and X4 is N or Y, or any combination thereof; And

CDR2-L, состоящую из последовательности KVS; иCDR2-L, consisting of the KVS sequence; And

CDR3-L, состоящий из последовательности GQGX1X2YPFT (SEQ ID NO: 335), где X1 представляет собой Т, А или S, а Х2 представляет собой Н, Е или Q, или любая их комбинация.CDR3-L, consisting of the sequence GQGX1X2YPFT (SEQ ID NO: 335), where X1 is T, A or S and X2 is H, E or Q, or any combination thereof.

- 16 041572- 16 041572

Согласно варианту осуществления антитело к CD3 согласно настоящему изобретению содержит последовательности CDR из тяжелой и/или легкой цепей одного из 28 антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6С9-С9, 3E8-G1, 3H6-D2 и 8Н2, перечисленных выше.In an embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention comprises the CDR sequences from the heavy and/or light chains of one of 28 anti-CD3 antibodies referred to as 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3 . , 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2 and 8H2 listed above.

Следовательно, настоящее изобретение относится к антителу к CD3, которое содержит:Therefore, the present invention relates to an anti-CD3 antibody that contains:

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 6 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 6 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 7 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 7 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 8 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 8 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 142 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 142 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиa) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 6 or a sequence different from SEQ ID NO: 6 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 7 or a sequence different from SEQ ID NO: 7 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 8 or a sequence different from SEQ ID NO: 8 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 142 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 142 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 14 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 14 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 15 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 15 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 184 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 184 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиb) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 14 or a sequence different from SEQ ID NO: 14 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 15 or a sequence different from SEQ ID NO: 15 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 184 or a sequence different from SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 184 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 20 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 20 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 22 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 22 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиc) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 19 or a sequence different from SEQ ID NO: 19 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 20 or a sequence different from SEQ ID NO: 20 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 22 or a sequence different from SEQ ID NO: 22 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

d) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 24 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 24 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 25 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 25 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 27 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 27 одной аминокислотной заменой;d) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 24 or a sequence different from SEQ ID NO: 24 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 19 or a sequence different from SEQ ID NO: 19 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 25 or a sequence different from SEQ ID NO: 25 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 27 or a sequence different from SEQ ID NO: 27 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 28 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 28 or a sequence different from SEQ ID NO: 28 by one amino acid substitution; or

e) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 30 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 30 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 31 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 31 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 32 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 32 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 34 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 34 одной аминокислотной заменой;e) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 30 or a sequence different from SEQ ID NO: 30 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 31 or a sequence different from SEQ ID NO: 31 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 32 or a sequence different from SEQ ID NO: 32 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 34 or a sequence different from SEQ ID NO: 34 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью RDD или последовательностью, отличающейся от последовательности RDD одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 35 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 35 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the RDD sequence or a sequence different from the RDD sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 35 or a sequence different from SEQ ID NO: 35 by one amino acid substitution; or

f) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой;f) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution;

- 17 041572- 17 041572

CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ IDCDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID

NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQNO: 37 with one or more amino acid substitutions; CDR3-H with sequence under SEQ

ID NO: 38 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 38 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой;ID NO: 38 or a sequence different from SEQ ID NO: 38 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 28 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 28 or a sequence different from SEQ ID NO: 28 by one amino acid substitution; or

g) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 41 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 41 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 17 одной аминокислотной заменой;g) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 41 or a sequence different from SEQ ID NO: 41 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or a sequence different from SEQ ID NO: 17 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

h) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 44 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 44 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой;h) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 44 or a sequence different from SEQ ID NO: 44 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 47 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиi) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 47 or a sequence different from SEQ ID NO: 47 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

j) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 50 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 50 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 51 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 51 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 52 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 52 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 54 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 54 одной аминокислотной заменой;j) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 50 or a sequence different from SEQ ID NO: 50 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 51 or a sequence different from SEQ ID NO: 51 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 52 or a sequence different from SEQ ID NO: 52 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 54 or a sequence different from SEQ ID NO: 54 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью NAN или последовательностью, отличающейся от последовательности NAN одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 55 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 55 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the NAN sequence or a sequence different from the NAN sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 55 or a sequence different from SEQ ID NO: 55 by one amino acid substitution; or

k) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 57 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 57 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 58 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 58 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 28 одной аминокислотной заменой; илиk) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 57 or a sequence different from SEQ ID NO: 57 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 58 or a sequence different from SEQ ID NO: 58 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 28 or a sequence different from SEQ ID NO: 28 by one amino acid substitution; or

l) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной илиl) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 of one or

- 18 041572 несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 61 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 61 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; или- 18 041572 with several amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 61 or a sequence different from SEQ ID NO: 61 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

m) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 64 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 64 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 65 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 65 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 47 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 67 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 67 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 28 одной аминокислотной заменой; илиm) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 64 or a sequence different from SEQ ID NO: 64 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 65 or a sequence different from SEQ ID NO: 65 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 47 or a sequence different from SEQ ID NO: 47 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 67 or a sequence different from SEQ ID NO: 67 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 28 or a sequence different from SEQ ID NO: 28 by one amino acid substitution; or

n) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 69 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 69 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 71 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 71 одной аминокислотной заменой; илиn) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 69 or a sequence different from SEQ ID NO: 69 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 71 or a sequence different from SEQ ID NO: 71 by one amino acid substitution; or

о) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 84 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 84 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 17 одной аминокислотной заменой;o) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 84 or a sequence different from SEQ ID NO: 84 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or a sequence different from SEQ ID NO: 17 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

р) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 75 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 75 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 76 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 76 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 77 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 77 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой;p) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 75 or a sequence different from SEQ ID NO: 75 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 76 or a sequence different from SEQ ID NO: 76 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 77 or a sequence different from SEQ ID NO: 77 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

q) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 80 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 80 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 76 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 76 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 81 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 81 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой;q) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 80 or a sequence different from SEQ ID NO: 80 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 76 or a sequence different from SEQ ID NO: 76 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 81 or a sequence different from SEQ ID NO: 81 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

r) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 84 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 84 одной аминокислотной заменой; иr) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 84 or a sequence different from SEQ ID NO: 84 by one amino acid substitution; And

- 19 041572 вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой;- 19 041572 a light chain variable domain containing a CDR1-L with a sequence under SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

s) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 47 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой;s) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 47 or a sequence different from SEQ ID NO: 47 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 88 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 88 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 88 or a sequence different from SEQ ID NO: 88 by one amino acid substitution; or

t) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 90 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 90 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 91 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 91 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 32 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 32 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 93 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 93 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью GAS или последовательностью, отличающейся от последовательности GAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 94 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 94 одной аминокислотной заменой; илиt) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 90 or a sequence different from SEQ ID NO: 90 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 91 or a sequence different from SEQ ID NO: 91 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 32 or a sequence different from SEQ ID NO: 32 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 93 or a sequence different from SEQ ID NO: 93 by one amino acid substitution; CDR2-L with a GAS sequence or a sequence different from the GAS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with a sequence under SEQ ID NO: 94 or a sequence different from SEQ ID NO: 94 by one amino acid substitution; or

u) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 96 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 96 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 97 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 97 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 98 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 98 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 100 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 100 одной аминокислотной заменой;u) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 96 or a sequence different from SEQ ID NO: 96 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 97 or a sequence different from SEQ ID NO: 97 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 98 or a sequence different from SEQ ID NO: 98 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with a sequence under SEQ ID NO: 100 or a sequence different from SEQ ID NO: 100 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью NTN или последовательностью, отличающейся от последовательности NTN одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 101 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 101 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the NTN sequence or a sequence different from the NTN sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 101 or a sequence different from SEQ ID NO: 101 by one amino acid substitution; or

v) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 103 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 103 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 104 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 104 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 105 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 105 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиv) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 103 or a sequence different from SEQ ID NO: 103 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 104 or a sequence different from SEQ ID NO: 104 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 105 or a sequence different from SEQ ID NO: 105 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

w) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 80 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 8 0 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 108 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 108 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; илиw) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 80 or a sequence different from SEQ ID NO: 8 0 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 19 or a sequence different from SEQ ID NO: 19 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 108 or a sequence different from SEQ ID NO: 108 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or

х) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 37 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQx) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 37 or a sequence different from SEQ ID NO: 37 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with sequence under SEQ

- 20 041572- 20 041572

ID NO: 111 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 111 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 113 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 113 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 114 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 114 одной аминокислотной заменой; илиID NO: 111 or a sequence different from SEQ ID NO: 111 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 113 or a sequence different from SEQ ID NO: 113 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 114 or a sequence different from SEQ ID NO: 114 by one amino acid substitution; or

y) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 116 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 116 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 117 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 117 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 118 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 118 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 100 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 100 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью VIN' или последовательностью, отличающейся от последовательности VTN' одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 120 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 120 одной аминокислотной заменой; илиy) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 116 or a sequence different from SEQ ID NO: 116 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 117 or a sequence different from SEQ ID NO: 117 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 118 or a sequence different from SEQ ID NO: 118 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with a sequence under SEQ ID NO: 100 or a sequence different from SEQ ID NO: 100 by one amino acid substitution; CDR2-L with the VIN' sequence or a sequence different from the VTN' sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 120 or a sequence different from SEQ ID NO: 120 by one amino acid substitution; or

z) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 122 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 122 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 123 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 123 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 124 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 124 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 126 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 126 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью RDD или последовательностью, отличающейся от последовательности RDD одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 127 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 127 одной аминокислотной заменой; или аа) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 13 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 129 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 12 9 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 10 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью KVS или последовательностью, отличающейся от последовательности KVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 11 одной аминокислотной заменой; или bb) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 103 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 103 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 104 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 104 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 105 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 105 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 133 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 133 одной аминокислотной заменой;z) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 122 or a sequence different from SEQ ID NO: 122 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 123 or a sequence different from SEQ ID NO: 123 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 124 or a sequence different from SEQ ID NO: 124 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 126 or a sequence different from SEQ ID NO: 126 by one amino acid substitution; CDR2-L with the RDD sequence or a sequence different from the RDD sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 127 or a sequence different from SEQ ID NO: 127 by one amino acid substitution; or aa) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13 or a sequence different from SEQ ID NO: 13 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 19 or a sequence different from SEQ ID NO: 19 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 129 or a sequence different from SEQ ID NO: 12 by 9 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or a sequence different from SEQ ID NO: 10 by one amino acid substitution; CDR2-L with the KVS sequence or a sequence different from the KVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11 or a sequence different from SEQ ID NO: 11 by one amino acid substitution; or bb) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 103 or a sequence different from SEQ ID NO: 103 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 104 or a sequence different from SEQ ID NO: 104 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 105 or a sequence different from SEQ ID NO: 105 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 133 or a sequence different from SEQ ID NO: 133 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью LVS или последовательностью, отличающейся от последовательности LVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 134 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 134 одной аминокислотной заменой.CDR2-L with the LVS sequence or a sequence differing from the LVS sequence by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 134 or a sequence differing from SEQ ID NO: 134 by one amino acid substitution.

Одну или несколько отдельных аминокислот можно изменить путем введения замены, в частности, консервативной замены, в одну или несколько вышеуказанных последовательностей CDR. Такое изменение может подразумевать, например, удаление участка гликозилирования или участка дезамидирования в сочетании с гуманизацией антитела.One or more individual amino acids can be changed by introducing a substitution, in particular a conservative substitution, into one or more of the above CDR sequences. Such a change may involve, for example, the removal of a glycosylation site or a deamidation site in combination with humanization of the antibody.

Исходя из выравнивания последовательностей областей VH и VL из 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10 и 3H6-D2 были идентифицированы различные аминокислотные замены. Следовательно, в одном варианте осуществления аминокислота является замещенной:Based on sequence alignment of VH and VL regions from 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6-C9, 10F4-C10, 10E6-G6 , 18G9H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10 and 3H6-D2, various amino acid substitutions have been identified. Therefore, in one embodiment, the amino acid is substituted:

в CDR1-H, в одном или нескольких из положений 3-6, например, в положении 3, 5 или 6 из CDR1-Hin CDR1-H, in one or more of positions 3-6, such as position 3, 5 or 6 of CDR1-H

- 21 041572 с последовательностью GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13), или, например, в положении 4 и 5 в CDR1-H с последовательностью GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13); и/или в CDR2-H, в одном или нескольких из положений 3-5, 7 и 9, например, в положениях 3, 4, 5, 7 или 9 из CDR2-H с последовательностью IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37), или, например, в положениях 3 и 5 или 3 и 7 в CDR2-H с последовательностью IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37); и/или в CDR3-H, в одном или нескольких из положений 2-4, 7-10 и 12, например, в положениях 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 и 10, или в положениях 2, 4, 6, 8, 10 и 12, или в положениях 2, 3, 7 и 8 из CDR3-H с последовательностью RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO: 8), или в положении 7 и 8 из CDR3-H с последовательностью RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38), или в положениях 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 и 10 в CDR3-H с последовательностью RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38); и/или в CDR1-L, в одном или нескольких из положений 2, 4, 6 и 9, например, в положении 6 из CDR1-L с последовательностью QSLVHDNGNTY (SEQ ID NO: 17) или QSLVHTNGNTY (SEQ ID NO: 27), или в положении 2 в CDR1-L с последовательностью QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 10) или QRLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 113), или в положении 4, 6 и 9 в CDR1-L с последовательностью QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 10); и/или в CDR3-L, в одном или нескольких из положений 4 и 5, например, в положении 4 из CDR3-L с последовательностью GQGSQYPFT (SEQ ID NO: 71) или GQGTQYPFT (SEQ ID NO: 11), или в положении 4 и 5 в CDR3-L с последовательностью GQGAHYPFT (SEQ ID NO: 88) или в положении 5 в CDR3-L с последовательностью GQGTHYPFT (SEQ ID NO: 28) или GQGTEYPFT (SEQ ID NO: 114).- 21 041572 with the sequence GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13), or, for example, at positions 4 and 5 in CDR1-H with the sequence GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13); and/or in CDR2-H, in one or more of positions 3-5, 7 and 9, for example, positions 3, 4, 5, 7 or 9 of CDR2-H with the sequence IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37), or, for example, at positions 3 and 5 or 3 and 7 in CDR2-H with the sequence IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37); and/or in CDR3-H, in one or more of positions 2-4, 7-10 and 12, such as positions 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 and 10, or positions 2, 4 , 6, 8, 10, and 12, or at positions 2, 3, 7, and 8 of CDR3-H with the sequence RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO: 8), or at positions 7 and 8 of CDR3-H with the sequence RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38), or at positions 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 and 10 in CDR3-H with the sequence RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38); and/or in CDR1-L, at one or more of positions 2, 4, 6 and 9, e.g. at position 6 of CDR1-L with the sequence QSLVHDNGNTY (SEQ ID NO: 17) or QSLVHTNGNTY (SEQ ID NO: 27) , or at position 2 in CDR1-L with the sequence QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 10) or QRLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 113), or at positions 4, 6 and 9 in CDR1-L with the sequence QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 10 ); and/or in CDR3-L, at one or more of positions 4 and 5, for example at position 4 of CDR3-L with the sequence GQGSQYPFT (SEQ ID NO: 71) or GQGTQYPFT (SEQ ID NO: 11), or at position 4 and 5 in CDR3-L with the sequence GQGAHYPFT (SEQ ID NO: 88) or at position 5 in CDR3-L with the sequence GQGTHYPFT (SEQ ID NO: 28) or GQGTEYPFT (SEQ ID NO: 114).

Антитело к CD3 согласно настоящему изобретению, в частности, представляет собой традиционное антитело, в частности традиционное моноклональное антитело или фрагмент антитела, биспецифическое или полиспецифическое антитело.The anti-CD3 antibody of the present invention is particularly a conventional antibody, such as a conventional monoclonal antibody or antibody fragment, a bispecific or polyspecific antibody.

Антитело к CD3 согласно настоящему изобретению, в частности, содержит или состоит из IgG или его фрагмента.The anti-CD3 antibody of the present invention specifically comprises or consists of IgG or a fragment thereof.

Согласно дополнительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к антителу к CD3, которое содержит:According to a further embodiment, the present invention provides an anti-CD3 antibody which comprises:

a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 6, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 7, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 142, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиa) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 7, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 8, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 142, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 14, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 184, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиb) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 14, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 184, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 22, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиc) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 20, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 22, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

d) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 24, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 25, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 27, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28; илиd) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 24, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 25, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 27, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28; or

e) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 30, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 31, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 32, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 34, CDR2-L с последовательностью RDD и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 35; илиe) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 30, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 31, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 32, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 34, CDR2-L with the sequence RDD and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 35; or

f) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28; илиf) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 38, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28; or

g) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 41, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиg) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 41, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

- 22 041572- 22 041572

h) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ IDh) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID

NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQNO: 13, CDR2-H with sequence under SEQ ID NO: 37, CDR3-H with sequence under SEQ

ID NO: 44, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10,ID NO: 44, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10,

CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиCDR2-L with the sequence KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиi) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

j) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 50, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 51, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 52, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 54, CDR2-L с последовательностью NAN и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 55; илиj) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 50, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 51, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 52, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 54, CDR2-L with the sequence NAN and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 55; or

k) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 57, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 58, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28; илиk) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 57, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 58, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28; or

l) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 61, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиl) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 61, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

m) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 64, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 65, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 67, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28; илиm) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 64, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 65, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 67, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 28; or

n) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 69, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 71; илиn) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 69, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 71; or

о) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 84, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиo) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 84, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

р) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 75, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 76, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 77, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиp) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 75, a CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 76, a CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 77, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

q) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 80, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 76, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 81, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиq) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 80, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 76, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 81, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

r) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 84, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиr) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 84, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

s) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 47, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 88; илиs) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 88; or

t) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 90, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 91, CDR3-H с последовательностью под SEQt) heavy chain variable domain containing CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 90, CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 91, CDR3-H with the sequence under SEQ

- 23 041572- 23 041572

ID NO: 32, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ IDID NO: 32, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID

NO: 93, CDR2-L с последовательностью GAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 94;NO: 93, CDR2-L with the sequence GAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 94;

илиor

u) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 96, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 97, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 98, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 100, CDR2-L с последовательностью NTN и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 101; илиu) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 96, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 97, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 98, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 100, CDR2-L with the sequence of NTN and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 101; or

v) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 103, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 104, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 105, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиv) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 103, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 104, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 105, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

w) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 80, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 108, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиw) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 80, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 108, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

х) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 37, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 111, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 113, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 114; илиx) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 37, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 111, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 113, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 114; or

y) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 116, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 117, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 118, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 100, CDR2-L с последовательностью 'VTN' и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 120; илиy) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 116, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 117, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 118, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 100, CDR2-L with the sequence 'VTN' and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 120; or

z) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 122, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 123, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 124, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 126, CDR2-L с последовательностью RDD и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 127; или аа) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 129, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; или bb) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 103, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 104, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 105; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 133, CDR2-L с последовательностью LVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 134.z) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 122, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 123, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 124, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 126, CDR2-L with the sequence RDD and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 127; or aa) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 129, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or bb) a heavy chain variable domain comprising CDR1-H of SEQ ID NO: 103, CDR2-H of SEQ ID NO: 104, CDR3-H of SEQ ID NO: 105; and a light chain variable domain comprising CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 133, CDR2-L with the sequence of LVS, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 134.

В настоящем изобретении также предусмотрено антитело к CD3, содержащее, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи одного из антител к CD3, названия которых перечислены выше.The present invention also provides an anti-CD3 antibody comprising at least a heavy chain variable domain and/or a light chain variable domain of one of the anti-CD3 antibodies listed above.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к антителу к CD3, которое содержит:Thus, the present invention relates in particular to an anti-CD3 antibody which contains:

a) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 5 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 9 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиa) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 5 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 9 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 12 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 16 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиb) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 12 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 16 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 18 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 21 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиc) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 18 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 21 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

d) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 23 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи сd) a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 23 or a sequence that is at least 85% identical thereto and/or a light chain variable domain with

- 24 041572 последовательностью под SEQ ID NO: 26 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; или- 24 041572 sequence under SEQ ID NO: 26 or a sequence that is at least 85% identical to it; or

e) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 29 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 33 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиe) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 29 or a sequence that is at least 85% identical to it, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 33 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

f) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 36 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 39 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиf) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 36 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 39 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

g) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 40 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 42 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиg) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 40 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 42 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

h) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 43 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 45 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиh) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 43 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 45 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

i) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 46 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 48 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиi) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 46 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 48 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

j) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 49 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 53 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиj) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 49 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 53 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

k) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 56 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 59 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиk) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 56 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 59 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

l) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 60 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 62 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиl) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 60 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 62 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

m) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 63 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 66 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиm) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 63 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 66 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

n) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 68 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 70 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиn) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 68 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 70 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

о) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 72 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 73 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиo) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 72 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 73 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

р) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 74 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 78 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиp) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 74 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 78 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

q) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 79 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 82 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиq) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 79 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 82 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

r) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность под SEQ ID NO: 83 или последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 85 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиr) a heavy chain variable domain comprising a sequence of SEQ ID NO: 83 or a sequence that is at least 85% identical thereto and/or a light chain variable domain having a sequence of SEQ ID NO: 85 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

s) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 46 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 87 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиs) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 46 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 87 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

- 25 041572- 25 041572

t) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 89 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 92 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиt) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 89 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 92 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

u) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 95 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 99 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиu) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 95 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 99 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

v) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 102 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 106 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиv) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 102 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 106 or a sequence that is at least 85% identical thereto. 85% identical to her; or

w) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 107 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 109 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиw) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 107 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 109 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

х) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 110 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 112 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиx) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 110 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 112 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

у) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 115 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 119 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиs) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 115 or a sequence that is at least 85% identical to it, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 119 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

z) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 121 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 125 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; или аа) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 128 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 130 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; или bb) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 131 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 132 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.z) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 121 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 125 or a sequence that is at least 85% identical to her; or aa) a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 128 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 130 or a sequence that is at least 85% identical to her; or bb) a heavy chain variable domain having the sequence of SEQ ID NO: 131 or a sequence that is at least 85% identical thereto and/or a light chain variable domain having the sequence of SEQ ID NO: 132 or a sequence that is at least 85% identical to her.

Например, последовательность вариабельного домена тяжелой или легкой цепи может отличаться от эталонной последовательности под SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132, при необходимости, одной или несколькими аминокислотными заменами, в частности, одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами и/или заменами на канонические остатки. В частности, последовательность вариабельного домена тяжелой или легкой цепи может отличаться от эталонной последовательности под SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132 только консервативной аминокислотной заменой(ами).For example, the heavy or light chain variable domain sequence may differ from the reference sequence under SEQ ID NOs: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45 , 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99 , 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132, optionally with one or more amino acid substitutions, in particular one or more conservative amino acid substitutions and/or replacements for canonical remainders. In particular, the sequence of the heavy or light chain variable domain may differ from the reference sequence under SEQ ID NOs: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132 only conservative amino acid substitution(s).

Изменения последовательности по сравнению с последовательностью под SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132, в частности, будут присутствовать в основном в одной или нескольких каркасных областях, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L и/или FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.Sequence changes compared to the sequence under SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53 , 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109 , 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132 in particular will be present primarily in one or more framework regions, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L and/or FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

Однако также возможны аминокислотные замены в одном или нескольких CDR. В частности, последовательность вариабельного домена легкой цепи может отличаться от последовательности под SEQ ID NO: 9 по меньшей мере заменой S на R в положении 28 из SEQ ID NO: 9 (в CDR1-L), и/или по меньшей мере заменой V на Е в положении 30 из SEQ ID NO: 9 (в CDR1-L), и/или по меньшей мере заменой N на D или Т в положении 33 из SEQ ID NO: 9 (в CDR1-L), и/или по меньшей мере заменой N на Y в положении 35 из SEQ ID NO: 9 (в CDR1-L), и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи может отличаться от последовательности под SEQ ID NO: 9 по меньшей мере заменой Т на S или А в положении 97 из SEQ ID NO: 9 (в CDR3-L), и/или по меньшей мере заменой Q на Н или Е в положении 98 из SEQ ID NO: 9 (в CDR3-L), и/или вариабельный домен тяжелой цепи может отличаться от последовательности под SEQ ID NO: 5 по меньшей мере заменой Т на N или S в положении 28 из SEQ ID NO: 5 (в CDR1-H), и/или по меньшей мере заменой F на V в положении 29 из SEQ ID NO: 5 (в CDR1-H), или поHowever, amino acid substitutions in one or more CDRs are also possible. In particular, the sequence of the light chain variable domain may differ from the sequence under SEQ ID NO: 9 by at least replacing S with R at position 28 of SEQ ID NO: 9 (in CDR1-L), and/or at least replacing V with E at position 30 of SEQ ID NO: 9 (in CDR1-L), and/or at least replacing N with D or T at position 33 of SEQ ID NO: 9 (in CDR1-L), and/or at least by changing N to Y at position 35 of SEQ ID NO: 9 (in CDR1-L), and/or the sequence of the light chain variable domain may differ from the sequence of SEQ ID NO: 9 by at least changing T to S or A at position 97 of SEQ ID NO: 9 (in CDR3-L), and/or at least replacing Q with H or E at position 98 of SEQ ID NO: 9 (in CDR3-L), and/or the heavy chain variable domain may differ from the sequence under SEQ ID NO: 5 by at least replacing T with N or S at position 28 of SEQ ID NO: 5 (in CDR1-H), and/or at least replacing F with V at position 29 of SEQ ID NO: 5 (in CDR1-H), or according

- 26 041572 меньшей мере заменой Т на N или Y в положении 30 из SEQ ID NO: 5 (в CDR1-H), или по меньшей мере заменой K на L или Y в положении 31 из SEQ ID NO: 5 (в CDR1-H), и/или вариабельный домен тяжелой цепи может отличаться от последовательности под SEQ ID NO: 5 по меньшей мере заменой D на А в положении 53 из SEQ ID NO: 5 (в CDR2-H), или по меньшей мере заменой K на R в положении 54 из SEQ ID NO: 5 (в CDR2-H), или по меньшей мере заменой S на А в положении 55 из SEQ ID NO: 5 (в CDR2-H), или по меньшей мере заменой S на N в положении 57 из SEQ ID NO: 5 (в CDR2-H), или по меньшей мере заменой А на Е в положении 59 из SEQ ID NO: 5 (в CDR2-H), и/или вариабельный домен тяжелой цепи может отличаться от последовательности под SEQ ID NO: 5 по меньшей мере заменой G на А в положении 100 из SEQ ID NO: 5 (в CDR3-H) и/или по меньшей мере заменой Т на V в положении 101 из SEQ ID NO: 5 (в CDR3-H), по меньшей мере заменой Q на Y в положении 102 из SEQ ID NO: 5 (в CDR3-H).- 26 041572 at least replacing T with N or Y at position 30 of SEQ ID NO: 5 (in CDR1-H), or at least replacing K with L or Y at position 31 of SEQ ID NO: 5 (in CDR1- H), and/or the heavy chain variable domain may differ from the sequence under SEQ ID NO: 5 by at least changing D to A at position 53 of SEQ ID NO: 5 (in CDR2-H), or at least changing K to R at position 54 of SEQ ID NO: 5 (in CDR2-H), or at least a substitution of S for A at position 55 of SEQ ID NO: 5 (in CDR2-H), or at least a substitution of S for N in position 57 of SEQ ID NO: 5 (in CDR2-H), or at least a substitution of A for E at position 59 of SEQ ID NO: 5 (in CDR2-H), and/or the heavy chain variable domain may differ from the sequence under SEQ ID NO: 5 by at least replacing G with A at position 100 of SEQ ID NO: 5 (in CDR3-H) and/or at least replacing T with V at position 101 of SEQ ID NO: 5 (in CDR3 -H) by at least replacing Q with Y at position 102 of SEQ ID NO: 5 (in CDR3-H).

В одном варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению и его фрагмент представляют собой антитело крысы и фрагмент антитела крысы соответственно.In one embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention and a fragment thereof are a rat antibody and a rat antibody fragment, respectively.

В одном аспекте настоящего изобретения антитело к CD3 по настоящему изобретению также может быть химерным антителом и, в частности, антителом крысы/человека, например антителом, содержащим вариабельные домены тяжелой и легкой цепей крысы и СН-домен и CL-домен из антитела человека.In one aspect of the present invention, the anti-CD3 antibody of the present invention may also be a chimeric antibody, and in particular a rat/human antibody, for example an antibody comprising rat heavy and light chain variable domains and a CH domain and a CL domain from a human antibody.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения антитело к CD3 также может быть гуманизированным антителом или фрагментом гуманизированного антитела, полученными, например, с помощью привития CDR или с помощью 4D-способа (US 20110027266).In a further aspect of the present invention, an anti-CD3 antibody can also be a humanized antibody or a humanized antibody fragment obtained, for example, by CDR grafting or by a 4D method (US 20110027266).

Соответственно, в одном варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело, содержащее:Accordingly, in one embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention is a humanized antibody comprising:

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, илиa) a heavy chain variable domain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, and a light chain variable domain containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO : 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, or

b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 182.b) a heavy chain variable domain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, and a light chain variable domain containing the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO : 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 182.

Согласно дополнительному варианту осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело, содержащее:In a further embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention is a humanized antibody comprising:

a) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 138 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 143; илиa) a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 138 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 143; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 171 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 158; илиb) a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 171 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 158; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 17 6 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 164.c) a heavy chain variable domain of the sequence of SEQ ID NO: 176 and/or a light chain variable domain of the sequence of SEQ ID NO: 164.

В одном варианте осуществления антитело к CD3 согласно настоящему изобретению содержит последовательности трех CDR или вариабельный домен тяжелой цепи, или последовательности шести CDR или вариабельные домены тяжелой и легкой цепей одного из антител к CD3, названия которых перечислены выше.In one embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention comprises three CDR sequences or a heavy chain variable domain, or six CDR sequences or heavy and light chain variable domains of one of the anti-CD3 antibodies listed above.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фрагменту гуманизированного антитела к CD3, определяемого выше. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело к CD3, описанное выше, представляет собой химерное антитело.The present invention further relates to a humanized anti-CD3 antibody fragment as defined above. In one embodiment, the humanized anti-CD3 antibody described above is a chimeric antibody.

Антитело к CD3 согласно настоящему изобретению также может представлять собой однодоменное антитело или его фрагмент. В частности, фрагмент однодоменного антитела может состоять из вариабельной области тяжелой цепи (VHH), которая содержит CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H одного из антител, описанных выше. Антитело к CD3 также может представлять собой антитело, состоящее только из тяжелой цепи, т.е. антитело, не имеющее легкой цепи, которое может содержать или может не содержать СН1-домен.An anti-CD3 antibody of the present invention may also be a single domain antibody or a fragment thereof. In particular, a fragment of a single domain antibody may consist of a heavy chain variable region (VHH) that contains the CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of one of the antibodies described above. The anti-CD3 antibody can also be a heavy chain-only antibody, ie. an antibody having no light chain, which may or may not contain a CH1 domain.

Однодоменное антитело или его фрагмент также может содержать каркасные области из однодоменного антитела верблюдовых и необязательно константный домен из однодоменного антитела верблюдовых.The single domain antibody or fragment thereof may also comprise framework regions from the camelid single domain antibody and optionally a constant domain from the camelid single domain antibody.

Антитело к CD3 согласно настоящему изобретению также может быть фрагментом антитела, в частности фрагментом гуманизированного антитела, выбранным из группы, состоящей из Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2 и диател.An anti-CD3 antibody of the present invention may also be an antibody fragment, in particular a humanized antibody fragment, selected from the group consisting of Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv )2 and diatel.

- 27 041572- 27 041572

Соответственно, антитело к CD3 по настоящему изобретению представляет собой Fab, содержащий или состоящий из:Accordingly, an anti-CD3 antibody of the present invention is a Fab containing or consisting of:

a) аминокислотной последовательности тяжелой цепи под SEQ ID NO: 186 и/или аминокислотной последовательности легкой цепи под SEQ ID NO: 187; илиa) the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 186 and/or the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 187; or

b) аминокислотной последовательности тяжелой цепи под SEQ ID NO: 188 и/или аминокислотной последовательности легкой цепи под SEQ ID NO: 189; илиb) the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 188 and/or the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 189; or

c) аминокислотной последовательности тяжелой цепи под SEQ ID NO: 190 и/или аминокислотной последовательности легкой цепи под SEQ ID NO: 191; илиc) the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 190 and/or the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 191; or

d) аминокислотной последовательности тяжелой цепи под SEQ ID NO: 192 и/или аминокислотной последовательности легкой цепи под SEQ ID NO: 193.d) the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 192 and/or the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 193.

В варианте осуществления антитело к CD3 является биспецифическим или полиспецифическим антителом, образованным по меньшей мере из одного фрагмента антитела или по меньшей мере одного вариабельного домена антител к CD3 по настоящему изобретению. Полиспецифические антитела представляют собой поливалентные белковые комплексы, описываемые, например, в ЕР 2050764 А1 или US 2005/0003403 А1.In an embodiment, an anti-CD3 antibody is a bispecific or multispecific antibody formed from at least one antibody fragment or at least one variable domain of an anti-CD3 antibody of the present invention. Multispecific antibodies are polyvalent protein complexes, as described, for example, in EP 2050764 A1 or US 2005/0003403 A1.

Биспецифические или полиспецифические антитела к CD3 согласно настоящему изобретению могут характеризоваться специфичностью в отношении (а) внеклеточного домена CD3 человека или человека и Масаса fascicularis, на который нацеливается одно из описанных выше антител к CD3, и (b) по меньшей мере одного другого антигена.The bispecific or polyspecific anti-CD3 antibodies of the present invention can be characterized by specificity for (a) the extracellular domain of human or human CD3 and Macac fascicularis targeted by one of the anti-CD3 antibodies described above, and (b) at least one other antigen.

В одном варианте осуществления другой антиген представляет собой CD123 и, соответственно, полученное биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело к CD3/CD123. Традиционные биспецифические антитела могут быть получены с помощью методик, которые известны специалисту в данной области.In one embodiment, the other antigen is CD123 and, accordingly, the resulting bispecific antibody is an anti-CD3/CD123 bispecific antibody. Traditional bispecific antibodies can be obtained using techniques that are known to the person skilled in the art.

Антитела и фрагменты антител к CD3 согласно настоящему изобретению можно применять в виде выделенных (например, очищенных) молекул или содержащихся в переносчике, таком как мембрана или липидная везикула (например, липосома).Anti-CD3 antibodies and fragments of the present invention can be used as isolated (eg, purified) molecules or contained in a carrier such as a membrane or lipid vesicle (eg, liposome).

В одном дополнительном варианте осуществления антитело к CD3 по настоящему изобретению служит для применения в получении антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению, дополнительно определяемого в разделе Антителоподобный связывающий белок.In one additional embodiment, an anti-CD3 antibody of the present invention is for use in making an antibody-like binding protein of the present invention, further defined in the Antibody-Like Binding Protein section.

Любая комбинация вышеупомянутых вариантов осуществления составляет часть настоящего изобретения.Any combination of the above embodiments forms part of the present invention.

Антитела к CD123.Antibodies to CD123.

CD123 (кластер дифференцировки 123) также известен как рецептор интерлейкина 3, альфа (IL3RA) или IL3R, IL3RX, IL3RY, IL3RAY, hIL-3Ra и обозначает специфическую в отношении интерлейкина 3 субъединицу гетеродимерного цитокинового рецептора. Функциональный рецептор интерлейкина 3 представляет собой гетеродимер, который содержит специфическую альфа-цепь (IL-3A; CD123) и бета-цепь рецептора IL-3 (β0; CD 131), которая общая с рецепторами гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина 5 (IL-5). CD123 представляет собой интегральный трансмембранный белок I типа с предсказанной молекулярной массой, составляющей приблизительно 43 кДа, который содержит внеклеточный домен, вовлеченный в связывание IL3, трансмембранный домен и короткий цитоплазматическии хвост из приблизительно 50 аминокислот. Внеклеточный домен составляют две области: N-концевая область из приблизительно 100 аминокислот, последовательность которой проявляет сходство с эквивалентными областями альфа-цепей рецепторов GM-CSF и IL-5; и область вблизи трансмембранного домена, которая содержит четыре консервативных цистеиновых остатка и мотив WSXWS, общий для других представителей этого семейства цитокиновых рецепторов. Домен связывания IL-3 содержит мотивы цитокиновых рецепторов (CRM) из приблизительно 200 аминокислотных остатков, которые составлены из двух Ig-подобных складчатых доменов. Внеклеточный домен CD123 является в высокой степени гликозилированным, при этом N-гликозилирование необходимо как для связывания лиганда, так и для передачи сигнала рецептором. Семейство белков объединяет трех представителей: IL3RA (CD123A), CSF2RA и IL5RA. Общая структура у трех представителей является в существенной степени консервативной, но степени гомологии последовательностей очень низки. На данный момент была открыта одна изоформа CD123 длиной 300 аминокислот, но только на уровне РНК, которая доступная в базе данных Getentry под номером доступа АСМ24116.1.CD123 (differentiation cluster 123) is also known as interleukin 3 receptor alpha (IL3RA) or IL3R, IL3RX, IL3RY, IL3RAY, hIL-3Ra and denotes an interleukin 3 specific heterodimeric cytokine receptor subunit. The functional interleukin 3 receptor is a heterodimer that contains a specific alpha chain (IL-3A; CD123) and a beta chain of the IL-3 receptor (β 0 ; CD 131), which is shared with receptors for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 5 (IL-5). CD123 is an integral type I transmembrane protein with a predicted molecular weight of approximately 43 kDa, which contains an extracellular domain involved in IL3 binding, a transmembrane domain, and a short cytoplasmic tail of approximately 50 amino acids. The extracellular domain consists of two regions: an N-terminal region of approximately 100 amino acids, the sequence of which shows similarity to the equivalent regions of the alpha chains of the GM-CSF and IL-5 receptors; and a region near the transmembrane domain that contains four conserved cysteine residues and a WSXWS motif common to other members of this cytokine receptor family. The IL-3 binding domain contains cytokine receptor motifs (CRMs) of approximately 200 amino acid residues, which are composed of two Ig-like folded domains. The extracellular domain of CD123 is highly glycosylated, with N-glycosylation required for both ligand binding and receptor signaling. The family of proteins includes three representatives: IL3RA (CD123A), CSF2RA and IL5RA. The overall structure of the three members is substantially conserved, but the degrees of sequence homology are very low. So far, one isoform of CD123 has been discovered, 300 amino acids long, but only at the RNA level, which is available in the Getentry database under accession number ACM24116.1.

В патенте США № 6177078 раскрыто моноклональное антитело 7G3 к альфа цепи рецептора IL-3 (IL-3Ra, CD123) и способность 7G3 связываться с N-концевым доменом, а именно, аминокислотными остатками 19-49, IL-3Ra. В патенте США № 6733743 раскрыт способ ослабления клеткипредшественника гемабластоза, которая экспрессирует CD123, но не экспрессирует в значительной степени CD131, путем приведения клетки в контакт с композицией из антитела и цитотоксического средства (выбранного из химиотерапевтического средства, токсина или радиоизотопа, излучающего альфачастицы), причем композиция селективно связывается с CD123 в количестве, эффективном для обеспечения гибели клетки. Однако оставалось неясно, может ли нацеливание на CD123 приводить к функцио- 28 041572 нальным нарушениям в AML-LSC.US Pat. No. 6,177,078 discloses the monoclonal antibody 7G3 to the IL-3 receptor alpha chain (IL-3Ra, CD123) and the ability of 7G3 to bind to the N-terminal domain, namely amino acid residues 19-49, of IL-3Ra. US Pat. No. 6,733,743 discloses a method of attenuating a hemablastosis progenitor cell that expresses CD123 but does not significantly express CD131 by contacting the cell with a composition of an antibody and a cytotoxic agent (selected from a chemotherapeutic agent, a toxin, or an alpha particle emitting radioisotope), wherein the composition selectively binds to CD123 in an amount effective to cause cell death. However, it remained unclear whether CD123 targeting could lead to functional impairment in AML-LSC.

Эталонная последовательность полноразмерного белка CD123 человека, включая сигнальный пептид, доступна из базы данных NCBI под номером доступа NP_002174.1 и в Uniprot под номером доступа Р26951, а также раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 194 (в виде, доступном на 14 декабря 2014 года). Эталонная последовательность полноразмерного белка CD123 Масаса fascicularis, включая сигнальный пептид, доступна из базы данных GenBank под номером доступа ЕНН61867.1 и в Uniprot под номером доступа G8F3K3, а также раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 195 (в виде, доступном на 14 декабря 2014 года).The reference sequence of the full-length human CD123 protein, including the signal peptide, is available from the NCBI database under accession number NP_002174.1 and from Uniprot under accession number P26951, and is also disclosed herein under SEQ ID NO: 194 (as available on 14 December 2014). The reference sequence of the full-length Macac fascicularis CD123 protein, including the signal peptide, is available from the GenBank database under accession number EH61867.1 and from Uniprot under accession number G8F3K3, and is also disclosed herein under SEQ ID NO: 195 (as available at 14 December 2014).

Последовательность белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD123 человека с меткой Strep-II, клонированного авторами настоящего изобретения из геномной ДНК, раскрыта под SEQ ID NO: 196. Указанный белок слияния, содержащий Fc и зрелый CD123 человека, содержит аминокислоты 19-305 из полноразмерного белка CD123 человека и, таким образом, содержит внеклеточный домен CD123 человека.The sequence of a fusion protein containing Fc and mature human CD123 labeled with Strep-II cloned by the present inventors from genomic DNA is disclosed under SEQ ID NO: 196. Said fusion protein containing Fc and mature human CD123 contains amino acids 19-305 from the full human CD123 protein and thus contains the extracellular domain of human CD123.

Последовательность белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD123 Масаса fascicularis с меткой Strep-II, клонированного авторами настоящего изобретения из кДНК, раскрыта под SEQ ID NO: 197. Указанный белок слияния, содержащий Fc и зрелый CD123 Масаса fascicularis, содержит аминокислоты 19-305 из полноразмерного белка CD123 Масаса fascicularis и, таким образом, содержит внеклеточный домен CD123 Масаса fascicularis.The sequence of a fusion protein containing Fc and mature Macac fascicularis CD123 labeled with Strep-II cloned by the present inventors from cDNA is disclosed under SEQ ID NO: 197. Said fusion protein containing Fc and mature Macac fascicularis CD123 contains amino acids 19-305 of full-length Macac fascicularis CD123 protein and thus contains the extracellular domain of Macac fascicularis CD123.

Доменная организация CD123 человека и Масаса fascicularis является следующей (на основании последовательности CD123 человека, доступной в базе данных NCBI под номером доступа NP_002174.1 (SEQ ID NO: 194) и основана на последовательности CD123 Масаса fascicularis, доступной в базе данных Uniprot под номером доступа G8F3K3, SEQ ID NO: 195).The domain organization of human CD123 and Macac fascicularis is as follows (based on the sequence of human CD123 available from the NCBI database under accession number NP_002174.1 (SEQ ID NO: 194) and based on the CD123 sequence of Macac fascicularis available from the Uniprot database under accession number G8F3K3, SEQ ID NO: 195).

Положения в SEQ ID Положения в SEQ IDPositions in SEQ ID Positions in SEQ ID

Домены CD123CD123 domains

NO: 194 NO: 195 человека (человек) (Масаса fascicularis)NO: 194 NO: 195 human(s) (Masasa fascicularis)

Внеклеточный Extracellular 19-305 19-305 19-305 19-305 Трансмембранный transmembrane 306-325 306-325 306-325 306-325 домен domain Цитоплазматический cytoplasmic 326-378 326-378 326-378 326-378

Соответственно, внеклеточный домен CD123 человека состоит из аминокислот в положениях 19305 из SEQ ID NO: 194.Accordingly, the extracellular domain of human CD123 consists of amino acids at positions 19305 of SEQ ID NO: 194.

CD123 (альфа-цепь рецептора интерлейкина-3, IL-3Ra) представляет собой опухолевый антиген, который сверхэкспрессируется при различных гематологических новообразованиях. Большая часть бластных клеток при AML экспрессирует на поверхности CD123, и такая экспрессия не варьирует у подтипов AML. Как сообщалось, более высокая экспрессия CD123 при AML в момент постановки диагноза ассоциирована с более неблагоприятным прогнозом. Об экспрессии CD123 сообщалось при других гематологических злокачественных опухолях, включая миелодисплазию, системный мастоцитоз, новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), ALL и злокачественный ретикулоэндотелиоз.CD123 (interleukin-3 receptor alpha chain, IL-3Ra) is a tumor antigen that is overexpressed in various hematological neoplasms. Most blast cells in AML express CD123 on the surface, and this expression does not vary between AML subtypes. Higher expression of CD123 in AML at diagnosis has been reported to be associated with poorer prognosis. CD123 expression has been reported in other hematologic malignancies, including myelodysplasia, systemic mastocytosis, blast plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN), ALL, and malignant reticuloendotheliosis.

CD123 экспрессируется на лейкозных стволовых клетках AML, и возрастающее число фактов позволяет предположить, что AML возникает из этих LSC, которые, как было показано, являются покоящимися и относительно устойчивыми к химиотерапии, повреждающей ДНК. Выказывалась гипотеза, что персистенция LSC лежит в основе рецидива после первичной ремиссии и, таким образом, уничтожение LSC можно считать требованием для излечения и важной терапевтической задачей.CD123 is expressed on AML leukemia stem cells, and a growing body of evidence suggests that AML arises from these LSCs, which have been shown to be dormant and relatively resistant to DNA-damaging chemotherapy. It has been hypothesized that LSC persistence underlies relapse after primary remission, and thus eradication of LSCs can be considered a requirement for cure and an important therapeutic challenge.

Лейкозные стволовые клетки (LSC) представляют собой раковые клетки, которые обладают характеристиками, присущими нормальным стволовым клеткам, а именно, свойством самообновления и способностью к развитию в многочисленные линии. Предполагается, что такие клетки персистируют в гемобластозах, таких как AML, в качестве отдельных популяций. LCS, присутствующие у пациентов с AML, представляют собой так называемые AML-LCS.Leukemic stem cells (LSC) are cancer cells that have the characteristics of normal stem cells, namely, the property of self-renewal and the ability to develop into multiple lines. It is assumed that such cells persist in hemoblastoses, such as AML, as separate populations. The LCS present in AML patients are the so-called AML-LCS.

Острый миелоидный лейкоз (AML) представляет собой клональное нарушение, которое клинически проявляется как повышенная пролиферация гетерогенных и недифференцированных миелоидных бластных клеток. Иерархическая структура лейкоза поддерживается небольшой популяцией LSC (AMLLCS), которые характеризуются выраженной способностью к самообновлению и способны дифференцироваться в клетки-предшественники лейкоза. Эти клетки-предшественники образуют огромные количества бластных клеток лейкоза, которые легко обнаруживаются у пациентов при постановке диагноза и рецидиве, который приводит в конечном итоге к смерти. Обычно сообщалось, что AML-LSC представляют собой покоящиеся клетки, в отличие от быстро делящихся клоногенных клеток-предшественников. Это свойство AML-LSC делает традиционные химиотерапевтические препараты, которые нацеливаются на делящиеся клетки, менее эффективными, что возможно объясняет современные данные, согласно коAcute myeloid leukemia (AML) is a clonal disorder that manifests clinically as an increased proliferation of heterogeneous and undifferentiated myeloid blast cells. The hierarchical structure of leukemia is maintained by a small population of LSCs (AMLLCS), which are characterized by a pronounced ability to self-renewal and are able to differentiate into leukemia progenitor cells. These progenitor cells form huge numbers of leukemia blast cells that are easily detected in patients at diagnosis and relapse, which eventually leads to death. AML-LSCs have generally been reported to be quiescent cells, as opposed to rapidly dividing clonogenic progenitor cells. This property of AML-LSC makes traditional chemotherapy drugs that target dividing cells less effective, possibly explaining the current evidence

- 29 041572 торым большая доля пациентов с AML входит в состояние полной ремиссии, но почти всегда происходит рецидив, при этом <30% взрослых пациентов выживают в течение более 4 лет. Кроме того, появление минимальной остаточной болезни и малый процент выживания были характерны при высокой частоте LSC в момент постановки диагноза у пациентов с AML. Следовательно, для долгосрочного ведения AML (и также других вышеупомянутых состояний гемабластозов) необходимо, чтобы разрабатывались новые средства лечения, которые специфически уничтожают LSC.- 29 041572 In the second, a large proportion of AML patients go into complete remission, but relapse almost always occurs, with <30% of adult patients surviving more than 4 years. In addition, the appearance of minimal residual disease and a low survival rate were characteristic of a high incidence of LSC at the time of diagnosis in patients with AML. Therefore, for the long-term management of AML (and also the other aforementioned hemablastosis conditions), it is necessary that new therapies be developed that specifically kill LSCs.

Сообщалось о сверхэкспрессии CD123 на бластных клетках AML и на CD34+/CD38 AML-LSC по сравнению с нормальными гемопоэтическими клетками.CD123 overexpression has been reported on AML blast cells and on CD34+/CD38 AML-LSC compared to normal hematopoietic cells.

Таким образом, CD123 представляет собой важную терапевтическую мишень для терапии рака, в частности, для терапии рака у пациентов с плохим прогнозом.Thus, CD123 represents an important therapeutic target for cancer therapy, in particular for cancer therapy in patients with a poor prognosis.

Авторы настоящего изобретения добились успеха в получении, скрининге и отборе специфических антител мыши и крысы к CD123, которые проявляют высокую степень аффинности к белку CD123 как человека, так и Масаса fascicularis и которые не являются в значительной степени перекрестнореактивными в отношении белков CSF2RA и IL5RA человека и белков CD3 Масаса fascicularis.The present inventors have been successful in generating, screening and selecting mouse and rat specific anti-CD123 antibodies that exhibit a high degree of affinity for both human and Macac fascicularis CD123 protein and that are not highly cross-reactive with human CSF2RA and IL5RA proteins and CD3 proteins of Macaca fascicularis.

Авторы настоящего изобретения определили последовательность вариабельной области тяжелой и легкой цепей таких моноклональных антител, антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2В8F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8 и 9F6-G3.The present inventors determined the variable region sequence of the heavy and light chains of such monoclonal antibodies, anti-CD123 antibodies, called 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8 and 9F6-G3.

Антитело к CD123, называемое 3E3-D3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD123 antibody called 3E3-D3 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OVOLOESGPGLVOPSOTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGLEWMGRIQNGGITDYNSALKOVOLOESGPGLVOPSOTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGLEWMGRIQNGGITDYNSALK

SRLIISRDTSKSOVFLKMNSVOTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 226, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 227, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 228 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 229, или вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиSRLIISRDTSKSOVFLKMNSVOTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 226, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 227, CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 228 and CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 229, or a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OVOLOESGPGLVOPSOTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGLEWMGRIQNAGITDYNSALKOVOLOESGPGLVOPSOTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGLEWMGRIQNAGITDYNSALK

SRLIISRDTSKSOVFLKMNSVOTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 277, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 227, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO:353 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 229, или вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиSRLIISRDTSKSOVFLKMNSVOTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 277, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 227, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO:353, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 229, or a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OVOLOESGPGLVOPSOTL·SL·TCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGL·EWMGRIODGGITDYNSALKOVOLOESGPGLVOPSOTL SL TCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGL EWMGRIODGGITDYNSALK

SRLIISRDTSKSOVFLKMNSVOTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 278, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 227, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 279 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 229, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSRLIISRDTSKSOVFLKMNSVOTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 278, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 227, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 279, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 229, and a light chain variable domain consisting of the sequence

OFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYOOHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFSOFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYOOHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFS

GSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 230, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 231, CDR2-L, состоящий из последовательности RDD, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 232.GSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 230, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 231, a CDR2-L consisting of the sequence of RDD, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 232.

Антитело к CD123, называемое 1E1-G5, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 1E1-G5, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKAFGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGGTNYNEKFQVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKAFGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGGTNYNEKF

KSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSEDSAICYCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 198, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 199, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 200 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSEDSAICYCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 198, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 199, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 200, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIOMTOSPASLSASLGOTVTIECRPSEDIYSNLAWFOQKPGSSPQLLIYDANNLADGVPSRFSGDIOMTOSPASLSASLGOTVTIECRPSEDIYSNLAWFOQKPGSSPQLLIYDANNLADGVPSRFSG

SGSGTOYSLKINSLOSEDVASYFCOQYNKYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 202, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 203, CDR2-L, состоящий из последовательности DAN, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 204.SGSGTOYSLKINSLOSEDVASYFCOQYNKYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 202, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 203, a CDR2-L consisting of the sequence of DAN, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 204.

Антитело к CD123, называемое 2B8-F3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 2B8-F3, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

- 30 041572- 30 041572

EVOLVESGGGL·VOPGRSLKL·SCAASGFTFSDYNMAWVROAPKKGL·EWVATILYDGGRTYYRGSVEVOLVESGGGL VOPGRSLKL SCAASGFTFSDYNMAWVROAPKKGL EWVATILYDGGRTYYRGSV

KGRFTISRDNAKSTLYLRMDSLRSEDTATYYCATHSRGTDYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 205, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 206, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 207 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 208, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKGRFTISRDNAKSTLYLRMDSLRSEDTATYYCATHSRGTDYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 205, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 206, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 207, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 208, and a light chain variable domain consisting of the sequence

EIVLTQSPTSMTASPGEQVTITCRASSSINYMHWYQQKPGASPRPWIYETSKLASGVPDRFSGSEIVLTQSPTSMTASPGEQVTITCRASSSINYMHWYQQKPGASPRPWIYETSKLASGVPDRFSGS

ASGTSYSLTINNMEAEDAATYYCQQWNYPSWTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 209, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 210, CDR2-L, состоящий из последовательности ETS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 211.ASGTSYSLTINNMEAEDAATYYCQQWNYPSWTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 209, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 210, a CDR2-L consisting of the sequence of ETS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 211.

Антитело к CD123, называемое 2F8-D6, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 2F8-D6, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OVOLKESGPGLVOPSOTLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIATISSAGSTYYDLVLKOVOLKESGPGLVOPSOTLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIATISSAGSTYYDLVLK

SRLSITRDTSKSOVFLKVHSLQTEDTAIYLCARDAPVFNYGSYNAMDSWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 212, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 213, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 214 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 215, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSRLSITRDTSKSOVFLKVHSLQTEDTAIYLCARDAPVFNYGSYNAMDSWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 212, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 213, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 214, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 215, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIQMTOSPSFLSATVGDRVTINCKASQNINKYLNWYOQKLGEAPKRLIYNTNSLQTGIPSRFSGDIQMTOSPSFLSATVGDRVTINCKASQNINKYLNWYOQKLGEAPKRLIYNTNSLQTGIPSRFSG

SGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCLOHKSGLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 216, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 217, CDR2-L, состоящий из последовательности NTN, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 218.SGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCLOHKSGLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 216, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 217, a CDR2-L consisting of the sequence of NTN, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 218.

Антитело к CD123, называемое 3В10-Е6, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 3B10-E6, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OVOLQOSGPELRRPGSSVRLSCKASGYRIKDFLIHWIKNRPEHGLEWIGWIDPEDGETKYAQKFOVOLQOSGPELRRPGSSVRLSCKASGYRIKDFLIHWIKNRPEHGLEWIGWIDPEDGETKYAQKF

QTKATL TADT SSNTAYMQL S S L Т S Е DTATY FCARWGDVYYGLMRGHVMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 219, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 220, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 221 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 222, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиQTKATL TADT SSNTAYMQL S S L T S E DTATY FCARWGDVYYGLMRGHVMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 219, CDRs shown in bold) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 220, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 221 and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 222, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DVLMTOTPVSLPVSLGGOVSISCRSSQSLVHSDGDTYLHWYLQKPGOSPOLLIYRVSNRFSGVPDVLMTOTPVSLPVSLGGOVSISCRSSQSLVHSDGDTYLHWYLQKPGOSPOLLIYRVSNRFSGVP

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGLYYCLQTTHFPPWTFGGGTKLEMK (SEQ ID NO: 223, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 224, CDR2-L, состоящий из последовательности RVS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 225.DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGLYYCLQTTHFPPWTFGGGTKLEMK (SEQ ID NO: 223, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 224, a CDR2-L consisting of the sequence of RVS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 225.

Антитело к CD123, называемое 5А5-В4, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 5A5-B4, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

QIQIVQSGSDVTSТCNGCGTСYFSGFSLSTTGICVSWIRQPSGKGQEWLADFCWDDGKGYNPSLQIQIVQSGSDVTSТCNGCGTСYFSGFSLSTTGICVSWIRQPSGKGQEWLADFCWDDGKGYNPSL

KNRLSISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARRRVYYGIYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 233, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 234, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 235 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 236, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKNRLSISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARRRVYYGIYFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 233, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 234, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 235, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 236, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIVMTOSPALAVSPGERVSISCRASNSVSTRMHWYOOKPGOOPKLLIYGASNLESGVPARFSGSDIVMTOSPALAVSPGERVSISCRASNSVSTRMHWYOOKPGOOPKLLIYGASNLESGVPARFSGS

GSGТDFTLТIDРVEADDIATYFCQQSWNDPLTFGSGТKLEIК (SEQ ID NO: 237, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 238, CDR2-L, состоящий из последовательности GAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 239.GSGTDDFTLTIPDVEADDIATYFCQQSWNDPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 237, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 238, a CDR2-L consisting of the sequence of GAS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 239.

Антитело к CD123, называемое 6В10-Е4, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 6B10-E4, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFTFSHYNMAWVROAPKKGLEWVATITYDDHSTYYRDSVEVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFTFSHYNMAWVROAPKKGLEWVATITYDDHSTYYRDSV

KGRFTISRDTAKSTLYLOMDSLRSEDTATYYCARLVNYAFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 240, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 241, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 242 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 243, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKGRFTISRDTAKSTLYLOMDSLRSEDTATYYCARLVNYAFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 240, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 241, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 242, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 243, and a light chain variable domain consisting of the sequence

- 31 041572- 31 041572

NIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQTVGNNIAWYQQKPGLSPQLLIDYASNRYTGVPNRFTGNIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQTVGNNIAWYQQKPGLSPQLLIDYASNRYTGVPNRFTG

GGYGTDFILTINSVQAEDAAFYYCQRMYNSPTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 244, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 245, CDR2-L, состоящий из последовательности YAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 246.GGYGTDFILTINSVQAEDAAFYYCQRMYNSPTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 244, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 245, a CDR2-L consisting of the sequence of YAS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 246.

Антитело к CD123, называемое 6С10-С4, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 6C10-C4, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVKLQESGPSLVQPSETLSLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQHSGKSLEWMGRMWNDGDTSYNSAFTEVKLQESGPSLVQPSETLSLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQHSGKSLEWMGRMWNDGDTSYNSAFT

SRLSISRDTSKGOVFLKMNSLOTEDTGTYYCARGHRTPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 247, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 248, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 249 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 250, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSRLSISRDTSKGOVFLKMNSLOTEDTGTYYCARGHRTPFDYWGOGVMVTVSS (SEQ ID NO: 247, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 248, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 249, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 250, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGOSPKLLIYWASTRHSGVDIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGOSPKLLIYWASTRHSGV

PDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 251, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 252, CDR2-L, состоящий из последовательности WAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253.PDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 251, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 252, a CDR2-L consisting of the sequence of WAS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 253.

Антитело к CD123, называемое 6D6-B8, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD123 antibody called 6D6-B8 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKASAYTFTDNIIHWVKQSHGKSLDWIGYINPYSGGTNYNGWFQVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKASAYTFDTDNIIHWVKQSHGKSLDWIGYINPYSGGTNYNGWF

RSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSDDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 254, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 255, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 200 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиRSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSDDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 254, with CDRs shown in bold) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 255, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 200, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIQMT QS PAS LSAS LGETVTIDCRPSEDIFNNLAWYOQKPGNSPQLLIYDANSLADGVPSRFS GDIQMT QS PAS LSAS LGETVTIDCRPSEDIFNNLAWYOQKPGNSPQLLIYDANSLADGVPSRFS G

SGSGTQYSLMIIRLQSEDVASYFCHQYNIYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 256, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 257, CDR2-L, состоящий из последовательности DAN, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 258.SGSGTQYSLMIIRLQSEDVASYFCHQYNIYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 256, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 257, a CDR2-L consisting of the sequence of DAN, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 258.

Антитело к CD123, называемое 8В11-В7, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиThe anti-CD123 antibody, called 8B11-B7, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

QVQLQESGPTLVNPGDSVKMSCKASGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGGANYNGKFQVQLQESGPTLVNPGDSVKMSCKASGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGGANYNGKF

KSKATLTIDKSSSTAYMEFSRLTSGDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 259, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 199, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 260 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKSKATLTIDKSSSTAYMEFSRLTSGDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 259, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 199, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 260, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRTSKDIYSNLAWFQQEPGNSPQLLIYDASNLADGVPSRFSGDIQMTQSPASLSASLGETVTIECRTSKDIYSNLAWFQQEPGNSPQLLIYDASNLADGVPSRFSG

SGSGTQYSLOINNLQSEDVASYFCHQYNNYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 261, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 262, CDR2-L, состоящий из последовательности 'DAS', и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 263.SGSGTQYSLOINNLQSEDVASYFCHQYNNYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 261, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 262, a CDR2-L consisting of the sequence of 'DAS', and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 263.

Антитело к CD123, называемое 9B8-G6, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD123 antibody called 9B8-G6 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVKLOESGPSLVOSSOTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTSYSSALKEVKLOESGPSLVOSSOTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTSYSSALK

SRLSISRDTSQSQVFLKMNSLQTEDTATYYCARGDYSSYIYLWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 264, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 265, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 266 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 267, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSRLSISRDTSQSQVFLKMNSLQTEDTATYYCARGDYSSYIYLWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 264, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 265, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 266, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 267, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGOSPKLLIYWASTRHSGVDIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGOSPKLLIYWASTRHSGV

PDRFIGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAIYYCOQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 251, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 252, CDR2-L, состоящий из последовательности WAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253.PDRFIGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAIYYCOQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 251, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 252, a CDR2-L consisting of the sequence of WAS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 253.

Антитело к CD123, называемое 9D7-C8, содержитAn anti-CD123 antibody called 9D7-C8 contains

- 32 041572 вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательности- 32 041572 heavy chain variable domain, consisting of the sequence

EVKLOESGPSLVOSSOTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVROTPGKGLEWMGVMWSDGDTSYNSALKEVKLOESGPSLVOSSOTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVROTPGKGLEWMGVMWSDGDTSYNSALK

SRLSISRDTSOSOVFLKMNSLOTEDTATYYCARGYYSSYLYLWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 268, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 265, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 266 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 269, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиSRLSISRDTSOSOVFLKMNSLOTEDTATYYCARGYYSSYLYLWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 268, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 265, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 266, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 269, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIVMTOSPSSLAVSEGETVTINCKSSQSFLSSGDGKNYVAWYOYKPGOSPKLLIYWASTRQSGVDIVMTOSPSSLAVSEGETVTINCKSSQSFLSSGDGKNYVAWYOYKPGOSPKLLIYWASTRQSGV

PDRFIGSGSGTDFTLTISTVOAEDLAIYYCOQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 270, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 271, CDR2-L, состоящий из последовательности WAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253.PDRFIGSGSGTDFTLTISTVOAEDLAIYYCOQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 270, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 271, a CDR2-L consisting of the sequence of WAS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 253.

Антитело к CD123, называемое 9F6-G3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAn anti-CD123 antibody called 9F6-G3 contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

OVOLOESGPTLVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSDGTNYNEKFOVOLOESGPTLVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSDGTNYNEKF

KSКАТLТVDKSТSTAYMEFSRLТSЕDSAIYFCALNYGSYYAMDAWGOGТSVTVSS (SEQ ID NO: 272, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 273, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 274 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKSCATLTVDKSTAYMEFSRLTSEDSAIYFCALNYGSYYAMDAWGOGTSVTVSS (SEQ ID NO: 272, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 273, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 274, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRPSEDIHSNVAWYQQKPGNSPQLLIYDASNLADGVPSRFSGDIQMTQSPASLSASLGETVTIECRPSEDIHSNVAWYQQKPGNSPQLLIYDASNLADGVPSRFSG

5G5GTOYSLKINSLO5EDVASYFCHQYNIYPYTFGSGTKLELK (SEQ ID NO: 275, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 276, CDR2-L, состоящий из последовательности DAS, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 258.5G5GTOYSLKINSLO5EDVASYFCHQYNIYPYTFGSGTKLELK (SEQ ID NO: 275, with CDRs shown in bold characters) containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 276, a CDR2-L consisting of the sequence of DAS, and a CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO : 258.

В одном аспекте настоящего изобретения антитело к CD123 связывается с CD123 человека. В другом варианте осуществления антитело к CD123 дополнительно связывается с CD123 Масаса fascicularis. В частности, антитело к CD123 по настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом CD123 человека или CD123 как человека, так и Масаса fascicularis. Более конкретно, антитело к CD123 связывается с дистальным фрагментом CD12 3, например, с аминокислотами в положении 19-49 CD123 человека с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 194. Антитело к CD123 связывается с CD123, не важно экспрессируется ли он в виде выделенной формы или присутствует в виде растворимого внеклеточного домена или полноразмерного заякоренного в мембране CD123, представленного в клетках, экспрессирующих CD123, таких как клетки AML или клетки, трансфицированные с помощью CD123. Антитело к CD123 согласно настоящему изобретению является специфическим в отношении клеток, которые экспрессируют белки CD123 человека и Масаса fascicularis на своей поверхности, например, раковых клеток, экспрессирующих CD123.In one aspect of the present invention, an anti-CD123 antibody binds to human CD123. In another embodiment, the anti-CD123 antibody further binds to Macaca fascicularis CD123. In particular, the anti-CD123 antibody of the present invention binds to the extracellular domain of human CD123 or both human and Macac fascicularis CD123. More specifically, an anti-CD123 antibody binds to a distal fragment of CD12 3, such as the amino acids at position 19-49 of human CD123 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 194. An anti-CD123 antibody binds to CD123 whether it is expressed as an isolated form or present as a soluble extracellular domain or full-length membrane-anchored CD123 present in cells expressing CD123, such as AML cells or cells transfected with CD123. The anti-CD123 antibody of the present invention is specific for cells that express human and Macac fascicularis CD123 proteins on their surface, such as CD123-expressing cancer cells.

Антитело к CD123 согласно настоящему изобретению характеризуется соотношением аффинности к CD123 Масаса fascicularis и аффинности к CD123 человека (KD(Масаса fascicularis)/KD(человек)), которое составляет <10, в частности, <6, <5, <4, <3, <2, <1 или <0,5. Таким образом, полипептид согласно настоящему изобретению можно применять в токсикологических исследованиях, проводимых на обезьянах, поскольку профиль токсичности, наблюдаемый на обезьянах, соответствует ожидаемым потенциальным неблагоприятным эффектам у человека.The anti-CD123 antibody of the present invention is characterized by an affinity ratio for Macaca fascicularis CD123 and an affinity for human CD123 (KD(Macaca fascicularis)/KD(human)) which is <10, in particular <6, <5, <4, <3 , <2, <1 or <0.5. Thus, the polypeptide of the present invention can be used in toxicology studies in monkeys because the toxicity profile observed in monkeys is consistent with the expected potential adverse effects in humans.

В частности, антитело к CD123 по настоящему изобретению не связывается с белками CSF2RA и/или IL5RA или не является в значительной степени перекрестно реактивным в их отношении.In particular, the anti-CD123 antibody of the present invention does not bind to or is not significantly cross-reactive with CSF2RA and/or IL5RA proteins.

В частности, антитело не связывается с внеклеточным доменом вышеупомянутого белка(ов) CSF2RA и/или IL5RA человека и Масаса fascicularis или не является в значительной степени перекрестно реактивным в их отношении.In particular, the antibody does not bind to the extracellular domain of the aforementioned human and Macac fascicularis CSF2RA and/or IL5RA protein(s) or is not significantly cross-reactive with them.

Кроме того, антитело к CD123 согласно настоящему изобретению характеризуется аффинностью (KD) к CD123 человека или CD123 Масаса fascicularis, или обоим, которая составляет <50 нМ, <40 нМ, <30 нМ, например, <20 нМ, <15 нМ, <10 нМ, <8 нМ, <6 нМ, <4 нМ, <2 нМ, <1 нМ или <0,5 нМ, например, аффинность составляет от 0,1 нМ до 20 нМ, например, от 0,1 нМ до 10 нМ, в частности, от 0,1 нМ до 2 нМ или от 0,1 нМ до 1 нМ.In addition, the anti-CD123 antibody of the present invention has an affinity (KD) for human CD123 or Macac fascicularis CD123, or both, which is <50 nM, <40 nM, <30 nM, e.g., <20 nM, <15 nM, < 10 nM, <8 nM, <6 nM, <4 nM, <2 nM, <1 nM, or <0.5 nM, e.g., affinity is 0.1 nM to 20 nM, e.g., 0.1 nM to 10 nM, in particular from 0.1 nM to 2 nM or from 0.1 nM to 1 nM.

В одном примере аффинность к CD3 человека или к CD3 Масаса fascicularis определяют как значение KD с помощью поверхностного плазмонного резонанса с применением рекомбинантого белка CD123 от человека и Масаса fascicularis в качестве антигена захвата, например, с применением белка слияния, содержащего Fc и CD123 человека и Масаса fascicularis.In one example, affinity for human CD3 or Macac fascicularis CD3 is determined as a KD value using surface plasmon resonance using recombinant CD123 protein from human and Macac fascicularis as the capture antigen, e.g. using a fusion protein containing Fc and CD123 of human and Macac fascicularis.

В качестве антигена можно применять, например, внеклеточный домен CD123 человека или Масаса fascicularis, включая сигнальную последовательность, соответствующий аминокислотной последовательности от положения M1 до R305 из белка дикого типа (SEQ ID NO: 194 (человек), SEQ ID NO: 195 (Ма- 33 041572 саса fascicularis)). Полученная аминокислотная последовательность зрелого белка CD123 человека илиAs an antigen, for example, the extracellular domain of human CD123 or Macac fascicularis can be used, including a signal sequence corresponding to the amino acid sequence from position M1 to R305 from the wild-type protein (SEQ ID NO: 194 (human), SEQ ID NO: 195 (Ma- 33 041572 caca fascicularis)). The resulting amino acid sequence of the mature human CD123 protein or

Масаса fascicularis приведена под SEQ ID NO: 196 и SEQ ID NO: 197 соответственно. Измерения с помощью Biacore известны специалисту в данной области. В настоящем примере измерение с помощьюMaca fascicularis is listed under SEQ ID NO: 196 and SEQ ID NO: 197, respectively. Biacore measurements are known to the person skilled in the art. In this example, the measurement with

Biacore можно проводить как описано в разделе антитела к CD3 выше.Biacore can be performed as described in the anti-CD3 antibody section above.

Антитело к CD123 по настоящему изобретению также может характеризоваться кажущейся константой аффинности (кажущаяся KD), которую, например, определяют с помощью анализа FACS на клетках, экспрессирующих CD123, таких как клетки HEK293, трансфицированные с помощью CD123, с применением неочищенного антитела к CD123 в супернатанте гибридомы, которая составляет <20 нМ, например, <15 нМ, <10 нМ, <6 нМ, <5 нМ, <4 нМ, <3 нМ, <2 нМ или <1 нМ. Как правило, кажущаяся KD находится в пределах диапазона 0,1-20 нМ, в частности, 0,1-10 нМ, например 0,1-5 нМ.An anti-CD123 antibody of the present invention can also have an apparent affinity constant (apparent KD), which is, for example, determined by FACS analysis on cells expressing CD123, such as HEK293 cells transfected with CD123, using a crude anti-CD123 antibody in the supernatant. a hybridoma that is <20 nM, such as <15 nM, <10 nM, <6 nM, <5 nM, <4 nM, <3 nM, <2 nM, or <1 nM. Typically, the apparent KD is in the range of 0.1-20 nM, in particular 0.1-10 nM, eg 0.1-5 nM.

Выравнивания последовательностей областей VH и VL антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, ЗВ1О-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9В8G6, 9D7-C8, 9F6-G3. Сравнение последовательностей CDR-H и CDR-L в большинстве случаев указывает на то, что антитела к CD123, 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7 и 9F6-G3, с одной стороны, и антитела к CD123, 6С10-С4, 9B8-G6, 9D7-C8, с другой стороны, являются близкородственными с точки зрения структуры, причем указанные антитела, вероятно, связываются с одним и тем же эпитопом. Выравнивание антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7 и 9F6-G3, и антител к CD123, называемых 6С10-С4, 9B8-G6, 9D7-C8, показано на фиг. 3 и 4 соответственно. При сравнении последовательностей CDR-H и CDR-L дополнительно идентифицировали положения CDR, которые были строго консервативными у этих двух групп антител и которые, таким образом, предположительно важны с точки зрения специфичности, тогда как остальные положения могли содержать замену.Sequence alignments of the VH and VL regions of anti-CD123 antibodies referred to as 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7 , 9B8G6, 9D7-C8, 9F6-G3. Comparison of the CDR-H and CDR-L sequences in most cases indicates that antibodies to CD123, 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7 and 9F6-G3, on the one hand, and antibodies to CD123, 6C10-C4, 9B8-G6, 9D7-C8, on the other hand, are closely related in terms of structure, with these antibodies likely to bind to the same epitope. The alignment of anti-CD123 antibodies named 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7 and 9F6-G3 and anti-CD123 antibodies named 6C10-C4, 9B8-G6, 9D7-C8 is shown in FIG. 3 and 4, respectively. Comparing the sequences of CDR-H and CDR-L additionally identified CDR positions that were strongly conserved between the two antibody groups and thus presumably important in terms of specificity, while the remaining positions could contain substitutions.

Соответственно, антитело согласно настоящему изобретению содержит:Accordingly, an antibody of the present invention contains:

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H, состоящую из последовательности X1YTFTDX2I (SEQ ID NO: 336), где X1 представляет собой G или А, а Х2 представляет собой Н, Y или N, или любая их комбинация; иa) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H consisting of the sequence X 1 YTFDDX 2 I (SEQ ID NO: 336), where X 1 is G or A and X 2 is H, Y or N, or any their combination; And

CDR2-H, состоящую из последовательности INPYSX1GX2 (SEQ ID NO: 337), где X1 представляет собой G или D, а Х2 представляет собой Т или А, или любая их комбинация; иCDR2-H, consisting of the sequence INPYSX 1 GX 2 (SEQ ID NO: 337), where X 1 is G or D and X 2 is T or A, or any combination thereof; And

CDR3-H, состоящую из последовательности ALNYGSYYAMDA (SEQ ID NO: 201), и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L, состоящую из последовательности X1DIX2X3N (SEQ ID NO: 338), где X1 представляет собой Е или K, Х2 представляет собой F, Н или Y, а Х3 представляет собой N или S, или любая их комбинация; иCDR3-H consisting of the sequence ALNYGSYYAMDA (SEQ ID NO: 201) and a light chain variable domain containing CDR1-L consisting of the sequence X 1 DIX 2 X 3 N (SEQ ID NO: 338), where X 1 is E or K, X 2 is F, H or Y, and X 3 is N or S, or any combination thereof; And

CDR2-L, состоящую из последовательности DAN или DAS; иCDR2-L, consisting of a DAN or DAS sequence; And

CDR3-L, состоящую из последовательности X1QYNX2YPYT (SEQ ID NO: 339), где X1 представляет собой Н или Q, а Х2 представляет собой I, K или N, или любая их комбинация; илиCDR3-L, consisting of the sequence X 1 QYNX 2 YPYT (SEQ ID NO: 339), where X 1 represents H or Q, and X 2 represents I, K or N, or any combination thereof; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H, состоящий из последовательности GFSLTSYX1 (SEQ ID NO: 340), где X1 представляет собой Н или S; иb) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H, consisting of the sequence GFSLTSYX1 (SEQ ID NO: 340), where X1 is H or S; And

CDR2-H, состоящий из последовательности MWX^GDT (SEQ ID NO: 341), где X1 представляет собой S или N; иCDR2-H, consisting of the sequence MWX^GDT (SEQ ID NO: 341), where X 1 represents S or N; And

CDR3-H, состоящий из последовательности ARGX1X2X3X4X5X6X7X8X9FX10Y (SEQ ID NO: 342), где X1 представляет собой D, Y или Н, Х2 представляет собой Y или R, Х3 представляет собой S или Т, Х4 представляет собой S или Р, Х5 представляет собой Y или отсутствие аминокислоты, Х6 представляет собой L, I или отсутствие аминокислоты, Х7 представляет собой Y или отсутствие аминокислоты, Х8 представляет собой L или отсутствие аминокислоты, Х9 представляет собой W или отсутствие аминокислоты, Х10 представляет собой А или D, или любая их комбинация, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L, состоящую из последовательности QSFLSSGDX1X2NY (SEQ ID NO: 343), где Х1 представляет собой Е или G, а Х2 представляет собой R или K, или любая их комбинация; иCDR3-H consisting of the sequence ARGX 1 X 2 X 3 X4X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 FX 10 Y (SEQ ID NO: 342), where X 1 is D, Y or H, X 2 is Y or R, X 3 is S or T, X 4 is S or P, X 5 is Y or no amino acid, X 6 is L, I or no amino acid, X 7 is Y or no amino acid, X 8 is L or the absence of an amino acid, X 9 is W or the absence of an amino acid, X 10 is A or D, or any combination thereof, and a light chain variable domain containing a CDR1-L consisting of the sequence QSFLSSGDX 1 X 2 NY (SEQ ID NO: 343), where X 1 is E or G and X 2 is R or K, or any combination thereof; And

CDR2-L, состоящую из последовательности WAS; иCDR2-L, consisting of the WAS sequence; And

CDR3-L, состоящую из последовательности QQYYDTPLT (SEQ ID NO: 253).CDR3-L consisting of the sequence QQYYDTPLT (SEQ ID NO: 253).

Согласно варианту осуществления антитело к CD123 согласно настоящему изобретению содержит последовательности CDR из тяжелой и/или легкой цепей одного из 13 антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11В7, 9B8-G6, 9D7-C8 и 9F6-G3, перечисленных выше.In an embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention comprises the CDR sequences from the heavy and/or light chains of one of 13 anti-CD123 antibodies referred to as 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4 , 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11B7, 9B8-G6, 9D7-C8 and 9F6-G3 listed above.

Следовательно, настоящее изобретение относится к антителу к CD123, которое содержит:Therefore, the present invention provides an anti-CD123 antibody which contains:

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 227 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 227 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 228, или SEQ ID NO: 353, или SEQ ID NO: 279, или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 228, или SEQ ID NO: 353, или SEQ ID NO: 279 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 229 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 229 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO:a) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 227 or a sequence different from SEQ ID NO: 227 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 228 or SEQ ID NO: 353 or SEQ ID NO: 279 or a sequence other than SEQ ID NO: 228 or SEQ ID NO: 353 or SEQ ID NO: 279 one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 229 or a sequence different from SEQ ID NO: 229 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO:

- 34 041572- 34 041572

231 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 231 одной аминокислотной заменой;231 or a sequence different from SEQ ID NO: 231 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью RDD или последовательностью, отличающейся от RDD одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 232 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 232 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the RDD sequence or a sequence different from RDD by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 232 or a sequence different from SEQ ID NO: 232 by one amino acid substitution; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 199 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 199 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 200 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 200 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 201 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 203 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 203 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью DAN или последовательностью, отличающейся от DAN одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 204 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 204 одной аминокислотной заменой; илиb) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 199 or a sequence different from SEQ ID NO: 199 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 200 or a sequence different from SEQ ID NO: 200 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 201 or a sequence different from SEQ ID NO: 201 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 203 or a sequence different from SEQ ID NO: 203 by one amino acid substitution; CDR2-L with the DAN sequence or a sequence different from DAN by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 204 or a sequence different from SEQ ID NO: 204 by one amino acid substitution; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 206 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 206 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 207 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 207 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 208 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 208 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 210 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 210 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью ETS или последовательностью, отличающейся от ETS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 211 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 211 одной аминокислотной заменой; илиc) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 206 or a sequence different from SEQ ID NO: 206 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 207 or a sequence different from SEQ ID NO: 207 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 208 or a sequence different from SEQ ID NO: 208 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 210 or a sequence different from SEQ ID NO: 210 by one amino acid substitution; CDR2-L with the ETS sequence or a sequence different from ETS by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 211 or a sequence different from SEQ ID NO: 211 by one amino acid substitution; or

d) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 213 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 213 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 214 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 214 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 215 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 215 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 217 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 217 одной аминокислотной заменой;d) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 213 or a sequence different from SEQ ID NO: 213 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 214 or a sequence different from SEQ ID NO: 214 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 215 or a sequence different from SEQ ID NO: 215 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 217 or a sequence different from SEQ ID NO: 217 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью NTN или последовательностью, отличающейся от NTN одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 218 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 218 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the sequence of NTN or a sequence different from NTN by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 218 or a sequence different from SEQ ID NO: 218 by one amino acid substitution; or

e) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 220 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 22 0 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 221 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 221 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 222 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 222 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 224 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 224 одной аминокислотной заменой;e) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 220 or a sequence different from SEQ ID NO: 220 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 221 or a sequence different from SEQ ID NO: 221 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 222 or a sequence different from SEQ ID NO: 222 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 224 or a sequence different from SEQ ID NO: 224 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью RVS или последовательностью, отличающейся от RVS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 225 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 225 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the sequence of RVS or a sequence different from RVS by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 225 or a sequence different from SEQ ID NO: 225 by one amino acid substitution; or

f) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 234 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 234 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 235 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 235 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 236 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 236 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 238 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 238 одной аминокислотной заменой;f) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 234 or a sequence different from SEQ ID NO: 234 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 235 or a sequence different from SEQ ID NO: 235 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 236 or a sequence different from SEQ ID NO: 236 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 238 or a sequence different from SEQ ID NO: 238 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью GAS или последовательностью, отличающейся от GAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 239 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 239 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with a GAS sequence or a sequence differing from GAS by one amino acid substitution, and CDR3-L with a sequence of SEQ ID NO: 239 or a sequence differing from SEQ ID NO: 239 by one amino acid substitution; or

g) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 241 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 241 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 242 или последовательностью, отличающейся от SEQg) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 241 or a sequence different from SEQ ID NO: 241 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 242 or a sequence different from SEQ

- 35 041572- 35 041572

ID NO: 242 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью подID NO: 242 with one or more amino acid substitutions; CDR3-H with sequence under

SEQ ID NO: 243 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 243 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 245 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 245 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью YAS или последовательностью, отличающейся от YAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 24 6 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 24 6 одной аминокислотной заменой; илиSEQ ID NO: 243 or a sequence different from SEQ ID NO: 243 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 245 or a sequence different from SEQ ID NO: 245 by one amino acid substitution; CDR2-L with a YAS sequence or a sequence different from YAS by one amino acid substitution, and CDR3-L with a sequence under SEQ ID NO: 246 or a sequence different from SEQ ID NO: 246 by one amino acid substitution; or

h) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 248 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 248 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 249 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 249 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 250 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 250 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 252 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 252 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью WAS или последовательностью, отличающейся от WAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 253 одной аминокислотной заменой; илиh) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 248 or a sequence different from SEQ ID NO: 248 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 249 or a sequence different from SEQ ID NO: 249 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 250 or a sequence different from SEQ ID NO: 250 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 252 or a sequence different from SEQ ID NO: 252 by one amino acid substitution; CDR2-L with the sequence of WAS or a sequence different from WAS by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 253 or a sequence different from SEQ ID NO: 253 by one amino acid substitution; or

i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 255 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 255 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 200 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 200 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 201 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 257 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 257 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью DAN или последовательностью, отличающейся от DAN одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 258 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 258 одной аминокислотной заменой; илиi) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 255 or a sequence different from SEQ ID NO: 255 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 200 or a sequence different from SEQ ID NO: 200 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 201 or a sequence different from SEQ ID NO: 201 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 257 or a sequence different from SEQ ID NO: 257 by one amino acid substitution; CDR2-L with the DAN sequence or a sequence different from DAN by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 258 or a sequence different from SEQ ID NO: 258 by one amino acid substitution; or

j) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 199 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 199 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 260 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 260 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 201 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 262 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 262 одной аминокислотной заменой; CDR2-L с последовательностью DAS или последовательностью, отличающейся от DAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 263 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 263 одной аминокислотной заменой; илиj) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 199 or a sequence different from SEQ ID NO: 199 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 260 or a sequence different from SEQ ID NO: 260 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 201 or a sequence different from SEQ ID NO: 201 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain comprising a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 262 or a sequence different from SEQ ID NO: 262 by one amino acid substitution; CDR2-L with a DAS sequence or a sequence different from DAS by one amino acid substitution, and CDR3-L with a sequence under SEQ ID NO: 263 or a sequence different from SEQ ID NO: 263 by one amino acid substitution; or

k) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 265 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 265 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 266 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 266 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 267 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 267 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 252 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 252 одной аминокислотной заменой;k) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 265 or a sequence different from SEQ ID NO: 265 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 266 or a sequence different from SEQ ID NO: 266 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 267 or a sequence different from SEQ ID NO: 267 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 252 or a sequence different from SEQ ID NO: 252 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью WAS или последовательностью, отличающейся от WAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 253 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with the sequence of WAS or a sequence different from WAS by one amino acid substitution, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 253 or a sequence different from SEQ ID NO: 253 by one amino acid substitution; or

l) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 265 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 265 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 266 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 266 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 269 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 269 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 271 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 271 одной аминокислотной заменой;l) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 265 or a sequence different from SEQ ID NO: 265 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 266 or a sequence different from SEQ ID NO: 266 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 269 or a sequence different from SEQ ID NO: 269 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 271 or a sequence different from SEQ ID NO: 271 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью WAS или последовательностью, отличающейся от WAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253 или последовательно- 36 041572 стью, отличающейся от SEQ ID NO: 253 одной аминокислотной заменой; илиCDR2-L with a WAS sequence or a sequence differing from WAS by one amino acid substitution, and a CDR3-L with a sequence of SEQ ID NO: 253 or a sequence differing from SEQ ID NO: 253 by one amino acid substitution; or

m) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 273 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 273 одной аминокислотной заменой; CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 274 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 274 одной или несколькими аминокислотными заменами; CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 201 одной аминокислотной заменой; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 276 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 276 одной аминокислотной заменой;m) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 273 or a sequence different from SEQ ID NO: 273 by one amino acid substitution; CDR2-H with a sequence under SEQ ID NO: 274 or a sequence different from SEQ ID NO: 274 by one or more amino acid substitutions; CDR3-H with a sequence under SEQ ID NO: 201 or a sequence different from SEQ ID NO: 201 by one amino acid substitution; and a light chain variable domain containing a CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 276 or a sequence different from SEQ ID NO: 276 by one amino acid substitution;

CDR2-L с последовательностью DAS или последовательностью, отличающейся от DAS одной аминокислотной заменой, и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 258 или последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO: 258 одной аминокислотной заменой.CDR2-L with a DAS sequence or a sequence different from DAS by one amino acid substitution, and CDR3-L with a sequence under SEQ ID NO: 258 or a sequence different from SEQ ID NO: 258 by one amino acid substitution.

Одну или несколько отдельных аминокислот можно изменить путем введения замены, в частности, консервативной замены, в одну или несколько вышеуказанных последовательностей CDR. Такое изменение может подразумевать, например, удаление участка гликозилирования или участка дезамидирования в сочетании с гуманизацией антитела.One or more individual amino acids can be changed by introducing a substitution, in particular a conservative substitution, into one or more of the above CDR sequences. Such a change may involve, for example, the removal of a glycosylation site or a deamidation site in combination with humanization of the antibody.

Исходя из выравнивания последовательностей областей VH и VL из антител к CD123,1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, были идентифицированы различные аминокислотные замены. Следовательно, в одном варианте осуществления аминокислота может быть замещенной:Based on sequence alignment of the VH and VL regions from antibodies to CD123,1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, various amino acid substitutions were identified. Therefore, in one embodiment, the amino acid may be substituted:

в CDR1-H, в одном или нескольких из положений 1 и 7, например, в положении 7 из CDR1-H с последовательностью GYTFTDHI (SEQ ID NO:199) или GYTFTDYI (SEQ ID NO: 273), например, в положении 1 и 5 из CDR1-H с последовательностью AYTFTDNI (SEQ ID NO: 255); и/или в CDR2-H, в одном или нескольких из положений б и 8, например, в положении 6 и/или 8 из CDR2H с последовательностью INPYSGGT (SEQ ID NO: 200), или INPYSDGT (SEQ ID NO: 274), или INPYSGGA (SEQ ID NO: 260); и/или в CDR1-L, в одном или нескольких из положений 1, 4 и 5, например в положении 1 или 1, 4 и 5 из CDR1-L с последовательностью KDIYSN (SEQ ID NO: 262) или EDIFNN (SEQ ID NO: 257); и/или в CDR2-L, положении 3 из последовательности DAN или DAS; и/или в CDR3-L, в одном или нескольких из положений 1 и 5, например, в положении 1 и/или 5 из CDR3L с последовательностью HQYNIYPYT (SEQ ID NO: 258), или QQYNKYPYT (SEQ ID NO: 204), или HQYNNYPYT (SEQ ID NO: 263).in CDR1-H, at one or more of positions 1 and 7, for example, at position 7 of CDR1-H with the sequence GYTFTDHI (SEQ ID NO:199) or GYTFTDYI (SEQ ID NO:273), for example, at position 1 and 5 from CDR1-H with the sequence AYTFTDNI (SEQ ID NO: 255); and/or in CDR2-H, at one or more of positions b and 8, for example, at position 6 and/or 8 of CDR2H with the sequence INPYSGGT (SEQ ID NO: 200), or INPYSDGT (SEQ ID NO: 274), or INPYSGGA (SEQ ID NO: 260); and/or in CDR1-L, at one or more of positions 1, 4 and 5, for example at position 1 or 1, 4 and 5 of CDR1-L with the sequence KDIYSN (SEQ ID NO: 262) or EDIFNN (SEQ ID NO : 257); and/or at CDR2-L, position 3 of the DAN or DAS sequence; and/or in CDR3-L, at one or more of positions 1 and 5, for example, at position 1 and/or 5 of CDR3L with the sequence HQYNIYPYT (SEQ ID NO: 258), or QQYNKYPYT (SEQ ID NO: 204), or HQYNNYPYT (SEQ ID NO: 263).

В дополнительном варианте осуществления аминокислота является замещенной:In an additional embodiment, the amino acid is substituted:

в CDR1-H, в положении 8, например, в положении 8 из CDR1-H с последовательностью GFSLTSYH (SEQ ID NO: 265) или GFSLTSYS (SEQ ID NO: 248); и/или в CDR2-H, в положении 3, например, в положении 3 из CDR2-H с последовательностью MWSDGD (SEQ ID NO: 265) или MWNDGD (SEQ ID NO: 248); и/или в CDR3-H, в положениях 4 и 9, например, в положениях 4 и 9 из CDR3-H с последовательностью ARGDYSSYIYLWFAY (SEQ ID NO: 267) или ARGYYSSYLYLWFAY (SEQ ID NO: 269); и/или в CDR1-L, в одном или нескольких из положений 9 и 10, например в положении 9 и 10 из CDR1-L с последовательностью QSFLSSGDERNY (SEQ ID NO: 252) или QSFLSSGDGKNY (SEQ ID NO: 271).in CDR1-H, at position 8, for example, at position 8 of CDR1-H with the sequence GFSLTSYH (SEQ ID NO: 265) or GFSLTSYS (SEQ ID NO: 248); and/or in CDR2-H, at position 3, for example at position 3 of CDR2-H with the sequence MWSDGD (SEQ ID NO: 265) or MWNDGD (SEQ ID NO: 248); and/or in CDR3-H, at positions 4 and 9, for example, at positions 4 and 9 of CDR3-H with the sequence ARGDYSSYIYLWFAY (SEQ ID NO: 267) or ARGYYSSYLYLWFAY (SEQ ID NO: 269); and/or in CDR1-L, at one or more of positions 9 and 10, for example at positions 9 and 10 of CDR1-L with the sequence QSFLSSGDERNY (SEQ ID NO: 252) or QSFLSSGDGKNY (SEQ ID NO: 271).

Согласно варианту осуществления антитело содержит:In an embodiment, the antibody comprises:

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 227, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:279, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 229, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 231, CDR2-L с последовательностью RDD и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 232; илиa) heavy chain variable domain containing CDR1-H with the sequence under SEQ ID NO: 227, CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:279, CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 229, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 231, CDR2-L with the sequence of RDD and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 232; or

n) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 199, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 200, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 203, CDR2-L с последовательностью DAN и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 204; илиn) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 199, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 200, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 203, CDR2-L with the sequence DAN and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 204; or

о) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 206, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 207, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 208, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 210, CDR2-L с последовательностью ETS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 211; илиo) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 206, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 207, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 208, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 210, CDR2-L with the sequence of ETS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 211; or

р) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 213, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 214, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 215, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 217, CDR2-L с последовательностью NTN и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 218; илиp) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 213, a CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 214, a CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 215, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 217, CDR2-L with the sequence of NTN and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 218; or

q) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ IDq) heavy chain variable domain containing CDR1-H with the sequence under SEQ ID

- 37 041572- 37 041572

NO: 220, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 221, CDR3-H с последовательностью под SEQNO: 220, CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 221, CDR3-H with the sequence under SEQ

ID NO: 222, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO:ID NO: 222, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO:

224, CDR2-L с последовательностью RVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 225; или224, CDR2-L with the sequence RVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 225; or

r) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 234, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 235, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 236, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 238, CDR2-L с последовательностью GAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 239; илиr) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 234, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 235, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 236, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 238, CDR2-L with the sequence of GAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 239; or

s) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 241, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 242, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 243, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 245, CDR2-L с последовательностью YAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 246; илиs) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 241, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 242, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 243, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 245, CDR2-L with the sequence YAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 246; or

t) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 248, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 249, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 250, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 252, CDR2-L с последовательностью WAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253; илиt) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 248, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 249, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 250, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 252, CDR2-L with the sequence of WAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 253; or

u) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 255, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 200, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 257, CDR2-L с последовательностью DAN и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 258; илиu) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 255, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 200, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 257, CDR2-L with the sequence DAN and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 258; or

v) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 199, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 260, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 262, CDR2-L с последовательностью DAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 263; илиv) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 199, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 260, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 262, CDR2-L with the sequence of DAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 263; or

w) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 265, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 266, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 267, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 252, CDR2-L с последовательностью WAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253; илиw) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 265, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 266, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 267, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 252, CDR2-L with the sequence of WAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 253; or

х) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 265, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 266, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 269, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 271, CDR2-L с последовательностью WAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 253; илиx) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 265, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 266, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 269, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 271, CDR2-L with the sequence of WAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 253; or

у) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 273, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 274, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 201, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 276, CDR2-L с последовательностью DAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 258.s) a heavy chain variable domain containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 273, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 274, CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 201, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 276, CDR2-L with the sequence of DAS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 258.

Антитело к CD123 согласно настоящему изобретению, в частности, представляет собой традиционное антитело, в частности, традиционное моноклональное антитело или фрагмент антитела, биспецифическое или полиспецифическое антитело.An anti-CD123 antibody of the present invention is particularly a conventional antibody, such as a conventional monoclonal antibody or antibody fragment, a bispecific or polyspecific antibody.

Антитело к CD123 согласно настоящему изобретению, в частности, содержит или состоит из IgG или его фрагмента.The anti-CD123 antibody of the present invention specifically comprises or consists of IgG or a fragment thereof.

В настоящем изобретении также предусмотрено антитело к CD123, определяемое выше, дополнительно содержащее по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи одного из антител к CD123, названия которых перечислены выше.The present invention also provides an anti-CD123 antibody as defined above, further comprising at least a heavy chain variable domain and/or a light chain variable domain of one of the anti-CD123 antibodies named above.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к антителу к CD123, которое содержит:Thus, the present invention relates in particular to an anti-CD123 antibody which contains:

a) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 226, или SEQ ID NO: 277, или SEQ ID NO: 278, или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 230 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиa) a heavy chain variable domain with the sequence under SEQ ID NO: 226, or SEQ ID NO: 277, or SEQ ID NO: 278, or a sequence that is at least 85% identical to it, and/or a light chain variable domain with the sequence under SEQ ID NO: 230 or a sequence that is at least 85% identical to it; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 198 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 202 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, илиb) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 198 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 202 or a sequence that is at least 85% identical, or

- 38 041572- 38 041572

c) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 205 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 209 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиc) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 205 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 209 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

d) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 212 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 216 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиd) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 212 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 216 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

e) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 219 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 223 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиe) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 219 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 223 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

f) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 233 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 237 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиf) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 233 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 237 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

g) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 240 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 244 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиg) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 240 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 244 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

h) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 247 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 251 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиh) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 247 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 251 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

i) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 254 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 256 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиi) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 254 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 256 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

j) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 259 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 261 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиj) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 259 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 261 or a sequence that is at least 85% identical thereto. 85% identical to her; or

k) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 264 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 251 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиk) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 264 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 251 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

l) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 268 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 270 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиl) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 268 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 270 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

m) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 272 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 275 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.m) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 272 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 275 or a sequence that is at least 85% identical to her.

Например, последовательность вариабельного домена тяжелой или легкой цепи может отличаться от эталонной последовательности под SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 или 275, при необходимости, одной или несколькими аминокислотными заменами, в частности, одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами и/или заменами на канонические остатки. В частности, последовательность вариабельного домена тяжелой или легкой цепи может отличаться от эталонной последовательности под SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 или 275 только консервативной аминокислотной заменой(ами).For example, the heavy or light chain variable domain sequence may differ from the reference sequence under SEQ ID NOs: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244 , 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 or 275, optionally with one or more amino acid substitutions, in particular one or more conservative amino acid substitutions and/or substitutions for canonical residues . In particular, the sequence of the heavy or light chain variable domain may differ from the reference sequence under SEQ ID NOs: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 or 275 with conservative amino acid substitution(s) only.

Изменения последовательности по сравнению с последовательностью под SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 или 275, в частности, будут присутствовать в основном в одной или нескольких каркасных областях, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L и/или FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.Sequence changes compared to the sequence under SEQ ID NOs: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256 , 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272, or 275, in particular, will be present primarily in one or more framework regions, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L and/or FR1 -H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

В одном варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению и его фрагмент представляют собой антитело крысы и фрагмент антитела крысы соответственно.In one embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention and a fragment thereof are a rat antibody and a rat antibody fragment, respectively.

Антитело к CD123 по настоящему изобретению также может быть химерным антителом и, в частности, антителом крысы/человека, например, антителом, содержащим вариабельные домены тяжелой и легкой цепей крысы и СН-домен и CL-домен из антитела человека. Полипептид может представлять со- 39 041572 бой фрагмент такого антитела. Антитело к CD123 также может быть гуманизированным антителом или фрагментом гуманизированного антитела, полученными с помощью привития CDR или с помощью 4Dспособа (US 20110027266).The anti-CD123 antibody of the present invention may also be a chimeric antibody, and in particular a rat/human antibody, for example, an antibody comprising rat heavy and light chain variable domains and a CH domain and a CL domain from a human antibody. The polypeptide may be a fragment of such an antibody. The anti-CD123 antibody can also be a humanized antibody or a humanized antibody fragment obtained by CDR grafting or by the 4D method (US 20110027266).

Соответственно, в одном варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело, содержащее:Accordingly, in one embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention is a humanized antibody comprising:

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 301 и SEQ ID NO: 302; иa) a heavy chain variable domain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO : 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 301 and SEQ ID NO: 302 ; And

b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304 и SEQ ID NO: 305.b) a light chain variable domain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO : 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304 and SEQ ID NO: 305.

В одном варианте осуществления антитело к CD123 согласно настоящему изобретению содержит последовательности трех CDR или вариабельный домен тяжелой цепи, или последовательности шести CDR или вариабельные домены тяжелой и легкой цепей одного из антител к CD123, названия которых перечислены выше.In one embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention comprises three CDR sequences or a heavy chain variable domain, or six CDR sequences or heavy and light chain variable domains of one of the anti-CD123 antibodies listed above.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фрагменту гуманизированного антитела к CD123, определяемого выше. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело к CD123, описанное выше, представляет собой химерное антитело.The present invention further relates to a humanized anti-CD123 antibody fragment as defined above. In one embodiment, the humanized anti-CD123 antibody described above is a chimeric antibody.

Антитело к CD123 согласно настоящему изобретению также может представлять собой однодоменное антитело или его фрагмент. В частности, фрагмент однодоменного антитела может состоять из вариабельной области тяжелой цепи (VHH), которая содержит CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H одного из антител, описанных выше. Антитело к CD123 также может представлять собой антитело, состоящее только из тяжелой цепи, т.е. антитело, не имеющее легкой цепи, которое может содержать или может не содержать СН1-домен.An anti-CD123 antibody of the present invention may also be a single domain antibody or a fragment thereof. In particular, a fragment of a single domain antibody may consist of a heavy chain variable region (VHH) that contains the CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of one of the antibodies described above. The anti-CD123 antibody can also be a heavy chain-only antibody, ie. an antibody having no light chain, which may or may not contain a CH1 domain.

Однодоменное антитело или его фрагмент также может содержать каркасные области из однодоменного антитела верблюдовых и необязательно константный домен из однодоменного антитела верблюдовых.The single domain antibody or fragment thereof may also comprise framework regions from the camelid single domain antibody and optionally a constant domain from the camelid single domain antibody.

Антитело к CD123 согласно настоящему изобретению также может быть фрагментом антитела, в частности, фрагментом гуманизированного антитела, выбранным из группы, состоящей из Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2 и диател.An anti-CD123 antibody of the present invention may also be an antibody fragment, in particular a humanized antibody fragment selected from the group consisting of Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc( Fv)2 and diatel.

Антитело к CD123 также может быть биспецифическим или полиспецифическим антителом, образованным из по меньшей мере одного фрагмента антитела или по меньшей мере одного вариабельного домена антитела к CD123 по настоящему изобретению.An anti-CD123 antibody can also be a bispecific or polyspecific antibody formed from at least one antibody fragment or at least one variable domain of an anti-CD123 antibody of the present invention.

Полиспецифические антитела представляют собой поливалентные белковые комплексы, описываемые, например, в ЕР 2050764 А1 или US 2005/0003403 А1.Multispecific antibodies are polyvalent protein complexes, as described, for example, in EP 2050764 A1 or US 2005/0003403 A1.

Биспецифические или полиспецифические антитела к CD123 согласно настоящему изобретению могут характеризоваться специфичностью в отношении (а) внеклеточного домена CD123 человека или человека и Масаса fascicularis, на который нацеливается одно из описанных выше антител к CD123, и (b) по меньшей мере одного другого антигена.The anti-CD123 bispecific or polyspecific antibodies of the present invention can be characterized by specificity for (a) the extracellular domain of human or human CD123 and Macac fascicularis targeted by one of the anti-CD123 antibodies described above, and (b) at least one other antigen.

В конкретном варианте осуществления другой антиген представляет собой CD3 и, соответственно, полученное биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело к CD3/CD123. Традиционные биспецифические антитела могут быть получены с помощью методик, которые известны специалисту в данной области.In a specific embodiment, the other antigen is CD3 and accordingly the resulting bispecific antibody is an anti-CD3/CD123 bispecific antibody. Traditional bispecific antibodies can be obtained using techniques that are known to the person skilled in the art.

Антитела и их фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять в виде выделенных (например, очищенных) молекул или содержащихся в переносчике, таком как мембрана или липидная везикула (например, липосома).Antibodies and fragments thereof according to the present invention can be used as isolated (eg, purified) molecules or contained in a carrier such as a membrane or lipid vesicle (eg, liposome).

В одном дополнительном варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению применяют для получения антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению, дополнительно определяемого в разделе Антителоподобный связывающий белок.In one additional embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention is used to produce an antibody-like binding protein of the present invention, further defined in the Antibody-Like Binding Protein section.

Любая комбинация вышеупомянутых вариантов осуществления составляет часть настоящего изобретения.Any combination of the above embodiments forms part of the present invention.

Антителоподобные связывающие белки.Antibody-like binding proteins.

Авторы настоящего изобретения получили несколько антителоподобных связывающих белков, а именно антителоподобных связывающий белков, называемых 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 hz20G6x7G3-TL4 и hz20G6xhz7G3, где термин hz обозначает гуманизированные антитела. Эти антителоподобные связывающие белки характеризуются конструкцией CODV, в частности конструкцией CODV-Fab или CODV-Ig.The present inventors have made several antibody-like binding proteins, namely antibody-like binding proteins, called 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 hz20G6x7G3-TL4 and hz20G6xhz7G3, where the term hz20G6xhz7G3 denotes humanized antibodies. These antibody-like binding proteins are characterized by the CODV construct, in particular the CODV-Fab or CODV-Ig construct.

В контексте настоящего изобретения формат CODV относится к кроссоверной конфигурации с двойной вариабельной областью (CODV) биспецифических антител или полиспецифических антител.In the context of the present invention, the CODV format refers to the dual variable region (CODV) crossover configuration of bispecific antibodies or polyspecific antibodies.

- 40 041572- 40 041572

Формат CODV обеспечивает возможность взаимозаменяемости вариабельных доменов с сохранением укладки и наивысшей аффинности связывания.The CODV format allows variable domain interchangeability with fold preservation and highest binding affinity.

Формат CODV бал ранее описан в международной патентной заявке WO 2012/135345. Соответственно, в одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению находится в формате CODV, описываемом ранее в международной патентной заявке WO 2012/135345, которая включена в данный документ посредством ссылки.The CODV ball format was previously described in international patent application WO 2012/135345. Accordingly, in one embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention is in the CODV format previously described in international patent application WO 2012/135345, which is incorporated herein by reference.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителоподобному связывающему белку в формате CODV-Fab. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителоподобному связывающему белку, содержащему две полипептидные цепи, которые образуют два антигенсвязывающих участка, где первый полипептид имеет структуру, представленную формулой [I] VD1-L1-VD2-L2-CL [1], а второй полипептид имеет структуру, представленную формулой [II] Vd3-L3-VD4-L4-CH1 [II], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;In one embodiment, the present invention provides an antibody-like binding protein in CODV-Fab format. Accordingly, in one embodiment, the present invention relates to an antibody-like binding protein containing two polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where the first polypeptide has the structure represented by the formula [I] V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L [ 1], and the second polypeptide has the structure represented by the formula [II] V d3 -L 3 -V D4 -L 4 -C H1 [II], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

VD4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;CL is an immunoglobulin light chain constant domain;

СН1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;C H1 is the C H1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L 1 , L2, L3 and L4 are amino acid linkers;

и при этом первый и второй полипептиды образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей.and wherein the first and second polypeptides form a light chain-heavy chain crossover pair, wherein both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are variable domains heavy chains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are heavy chain variable domains.

Добавление Fc-домена к антителоподобному связывающему белку в CODV-Fab дополнительно стабилизирует антителоподобный связывающий белок. Точнее говоря, добавление Fc-домена к полипептиду формулы (II) антителоподобного связывающего белка в CODV-Fab повышает время полужизни антителоподобного связывающего белка и, таким образом, улучшает фармакокинетический профиль антителоподобного связывающего белка. Добавление одной Fc-области к CODV-Fab приводит к димеризации полипептидов, содержащих Fc-домен, и полученный антителоподобный связывающий белок представляет собой антителоподобный связывающий белок в формате CODV-Ig. Следовательно, настоящее изобретение дополнительно относится к антителоподобному связывающему белку в формате CODV-Ig.The addition of the Fc domain to the ABP in the CODV-Fab further stabilizes the ABP. More specifically, the addition of an Fc domain to a polypeptide of formula (II) of an antibody-like binding protein in a CODV-Fab increases the half-life of the antibody-like binding protein and thus improves the pharmacokinetic profile of the antibody-like binding protein. The addition of a single Fc region to a CODV-Fab dimerizes the polypeptides containing the Fc domain, and the resulting antibody-like binding protein is an antibody-like binding protein in CODV-Ig format. Therefore, the present invention further relates to an antibody-like binding protein in CODV-Ig format.

Следовательно, настоящее изобретение дополнительно относится к антителоподобному связывающему белку, содержащему четыре полипептидные цепи, которые образуют четыре антигенсвязывающих участка, где две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой [I] VD1-L1-VD2-L2-CL [1], а две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой [III]Therefore, the present invention further relates to an antibody-like binding protein containing four polypeptide chains that form four antigen-binding sites, where two polypeptide chains have the structure represented by the formula [I] V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L [ 1 ] , and two polypeptide chains have the structure represented by the formula [III]

Vd3-L3-VD4-L4-CH1-FC [III], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;Vd3-L3-VD4-L4-CH1-FC [III], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;VD2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

VD4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C L is an immunoglobulin light chain constant domain;

СН1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;C H1 is the C H1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

FC представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;FC represents the immunoglobulin hinge region and the CH 2 , CH 3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L 1 , L 2 , L3 and L4 are amino acid linkers;

и при этом полипептиды формулы I и полипептиды формулы III образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельныеand wherein the polypeptides of formula I and the polypeptides of formula III form a light chain-heavy chain crossover pair, wherein both VD1 and VD2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are variable heavy chain domains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are variable

- 41 041572 домены тяжелых цепей.- 41 041572 heavy chain domains.

В указанном формате CODV-Ig две полипептидные цепи, имеющие структуру, представленную формулой [III], образуют димер с помощью своих Fc-доменов.In this CODV-Ig format, two polypeptide chains having the structure represented by formula [III] form a dimer with their Fc domains.

В дополнительном варианте осуществления первый Fc-домен добавляют к полипептиду формулы [II] антителоподобного связывающего белка CODV-Fab, а второй Fc- домен (называемый Fc2) добавляют к полипептиду формулы [I] антителоподобного связывающего белка CODV-Fab. Кроме того, в том же варианте осуществления линкер L5 присутствует между CL и Pc2-доменом полипептидных цепей формулы [I], что приводит к полипептидным цепям формулы [IV].In a further embodiment, a first Fc domain is added to the CODV-Fab antibody-like binding protein formula [II] polypeptide and a second Fc domain (referred to as Fc2 ) is added to the CODV-Fab antibody-like binding protein formula [I] polypeptide. In addition, in the same embodiment, an L 5 linker is present between the C L and P c2 domain of the polypeptide chains of formula [I], resulting in the polypeptide chains of formula [IV].

Соответственно, настоящее изобретение дополнительно относится к антителоподобному связывающему белку, содержащему две полипептидные цепи, которые образуют два антигенсвязывающих участка, где одна полипептидная цепь имеет структуру, представленную формулой [IV] VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV], и одна полипептидная цепь имеет структуру, представленную формулой [III]Accordingly, the present invention further relates to an antibody-like binding protein comprising two polypeptide chains that form two antigen-binding sites, wherein one polypeptide chain has the structure represented by the formula [IV] V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L -L 5 -F c2 [IV], and one polypeptide chain has the structure represented by the formula [III]

Vd3-L3-Vd4-L4-Chi-Fc [III], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;Vd3-L3-Vd4-L4-Chi-Fc [III], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

Vd4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V d4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;CL is an immunoglobulin light chain constant domain;

CH1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;CH1 is the CH1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

Fc представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;F c represents the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

Fc2 представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;F c2 is the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

L1, L2, L3, L4 и L5 представляют собой аминокислотные линкеры;L1, L2, L 3 , L4 and L 5 are amino acid linkers;

и при этом полипептид формулы [IV] и полипептид формулы [III] образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и Vd4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и Vd4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей.wherein the polypeptide of formula [IV] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair, wherein both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V d4 are heavy chain variable domains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V d4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are heavy chain variable domains.

Этот формат CODV, в котором полипептидные цепи, представленные формулами [III] и [IV], образуют димер с помощью своих соответствующих областей Fc2 и Fc, называется в данном документе CODV-Fab-TL.This CODV format, in which the polypeptide chains represented by formulas [III] and [IV] form a dimer with their respective F c2 and F c regions, is referred to herein as CODV-Fab-TL.

В другом варианте осуществления CODV-Fab первый Fc-домен добавляют к полипептидной цепи, представленной формулой [II] (что приводит к формуле [III]), а антителоподобный связывающий белок содержит третью полипептидную цепь, содержащую или состоящую из второго Fc-домена (называемого Fc3).In another embodiment, the CODV-Fab first Fc domain is added to the polypeptide chain represented by formula [II] (resulting in formula [III]) and the antibody-like binding protein contains a third polypeptide chain containing or consisting of a second Fc domain (referred to as Fc3).

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителоподобному связывающему белку, который содержит три полипептидные цепи, которые образуют два антигенсвязывающих участка, где первый полипептид имеет структуру, представленную формулой [I] VD1-L1-VD2-L2-CL [I], второй полипептид имеет структуру, представленную формулой [III]The present invention further relates to an antibody-like binding protein that contains three polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where the first polypeptide has the structure represented by the formula [I] V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L [I], the second polypeptide has the structure represented by the formula [III]

Vd3-L3-Vd4-L4-Chi-Fc [III], третий полипептид Fc3 (также называемый Fc-stump) представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;Vd3-L3-Vd4-L4-Chi-Fc [III], the third F c3 polypeptide (also called Fc-stump) is the immunoglobulin hinge region and constant domains CH 2 , CH 3 of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

Vd4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V d4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;CL is an immunoglobulin light chain constant domain;

CH1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;CH1 is the CH1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

Fc представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;Fc is the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L1, L2, L 3 and L4 are amino acid linkers;

- 42 041572 и при этом полипептид формулы [I] и полипептид формулы [III] образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей;- 42 041572 and at the same time the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair, and both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are heavy chain variable domains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are variable domains heavy chains;

и при этом полипептид формулы [III] образует гетеродимер с третьим полипептидом при помощи своего Fc-домена.and wherein the polypeptide of formula [III] forms a heterodimer with the third polypeptide via its Fc domain.

Соответственно, в указанном варианте осуществления так называемый Fc-stump (Fc3) образует гетеродимер с Fc-областью полипептида согласно формуле III. Этот формат CODV называется в данном документе CODV-Fab-OL. Эта конструкция предотвращает образование агрегатов CODV-Fab.Accordingly, in this embodiment, the so-called Fc-stump (F c3 ) forms a heterodimer with the Fc region of the polypeptide according to formula III. This CODV format is referred to in this document as CODV-Fab-OL. This design prevents the formation of CODV-Fab aggregates.

В одном варианте осуществления CODV-Fab-OL оба Fc и Fc3 представляют собой варианты иммуноглобулинов, в которых домен СН3 был модифицирован: каждый из Fc и Fc3 был сконструирован генетически в месте контакта СН3-СН3 для стимуляции образования гетерополимера согласно так называемой технологии выступ-во-впадину, которая была описана, в частности, в патентах US5731168 и US8216805 и которая включена в данный документ посредством ссылки.In one embodiment of the CODV-Fab-OL, both Fc and Fc3 are immunoglobulin variants in which the CH3 domain has been modified: each of the Fc and Fc3 has been genetically engineered at the CH3-CH3 interface to promote heteropolymer formation according to the so-called ridge-to-bottom technology, which has been described, in particular, in patents US5731168 and US8216805 and which is incorporated herein by reference.

Соответственно, в варианте осуществления СНЗ-домен одного из Fc и Fc3 содержит мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V, в то же время домен СН3 другого из Fc и Fc3 содержит мутации S354C и T366W (положение аминокислот указывается относительно последовательности IgG1).Accordingly, in an embodiment, the CH3 domain of one of Fc and Fc3 contains mutations Y349C, T366S, L368A, and Y407V, while the CH3 domain of the other of Fc and Fc3 contains mutations S354C and T366W (the amino acid position is indicated relative to the IgG1 sequence). ).

Примеры подходящих пар Fc и Fc3 включают пару SEQ ID NO: 396 (Fc) и SEQ ID NO: 397 (Fc3) и пару SEQ ID NO: 394 (Fc) и SEQ ID NO: 398 (Fc3).Examples of suitable pairs of F c and F c3 include the pair of SEQ ID NO: 396 (F c ) and SEQ ID NO: 397 (F c3 ) and the pair of SEQ ID NO: 394 (Fc) and SEQ ID NO: 398 (Fc 3 ).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первый иммуноглобулин или второй иммуноглобулин представляют собой одно антитело к CD3, как определено в разделе Антитела к CD3 выше.In one embodiment of the present invention, the first immunoglobulin or the second immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody as defined in the Anti-CD3 Antibodies section above.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый иммуноглобулин или второй иммуноглобулин представляют собой одно антитело к CD123, как определено в разделе Антитела к CD123 выше.In another embodiment of the present invention, the first immunoglobulin or the second immunoglobulin is a single anti-CD123 antibody as defined in the Anti-CD123 section above.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения оба VD1 и VD2 из полипептида формулы I или формулы [IV] представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 из полипептида II или III представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей или легких цепей. Данная взаимозаменяемость также называется обмениваемость и, таким образом, определяет кроссоверную конфигурацию с двойной вариабельной областью (CODV) антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению.According to one embodiment of the present invention, both V D1 and V D2 from a polypeptide of formula I or formula [IV] are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 from a polypeptide II or III are variable heavy chain or light chain domains. This interchangeability is also referred to as exchangeability and thus defines the double variable region (CODV) crossover configuration of the antibody-like binding proteins of the present invention.

Согласно вышеприведенному определению VD1 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельные домены тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина, следовательно, VD1 и VD4 рассматриваются как родственные домены, так же как VD2 и VD3.According to the above definition, VD1 and VD4 are the heavy or light chain variable domains of the first immunoglobulin, and VD2 and VD3 are the heavy or light chain variable domains of the second immunoglobulin, therefore, VD1 and VD4 are considered as related domains, as well as V D2 and V D3 .

Соответственно, термином кроссовер называют поменянное местами выравнивание VD1 или VD2 из полипептида формулы [I] или формулы [IV] относительно его родственного вариабельного домена VD4 или VD3 из полипептида формулы [II] или формулы [III].Accordingly, the term crossover refers to an interchanged alignment of V D1 or V D2 from a formula [I] or formula [IV] polypeptide relative to its cognate variable domain V D4 or V D3 from a formula [II] or formula [III] polypeptide.

В одном конкретном варианте осуществления VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легкой цепи, a VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи.In one particular embodiment, V D1 and V D2 are light chain variable domains and V D3 and V D4 are heavy chain variable domains.

Антителоподобные связывающие белки по настоящему изобретению можно получить с применением доменов или последовательностей, полученных или происходящих от любого антитела человека или животного, отличного от человека, в том числе, например, антитела человека, антитела крысы или гуманизированного антитела.The antibody-like binding proteins of the present invention can be made using domains or sequences derived from or derived from any non-human human or animal antibody, including, for example, a human antibody, a rat antibody, or a humanized antibody.

В одном варианте осуществления иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин IgG.In one embodiment, the immunoglobulin is an IgG immunoglobulin.

Соответственно, в одном варианте осуществления CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина IgG. В дополнительном варианте осуществления CH1 представляет собой константный домен тяжелой цепи CH1 иммуноглобулина IgG.Accordingly, in one embodiment, C L is an IgG immunoglobulin light chain constant domain. In a further embodiment, C H1 is the C H1 heavy chain constant domain of an IgG immunoglobulin.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению может быть получен с применением доменов или последовательностей из антитела к CD3 и антитела к CD123, описанных в данном документе.In one embodiment, an antibody-like binding protein of the present invention can be obtained using the domains or sequences from an anti-CD3 antibody and an anti-CD123 antibody described herein.

Термином линкер, как используется в данном документе, называют один или несколько аминокислотный остатков, вставленных между доменами иммуноглобулина для обеспечения подвижности, достаточной для того, чтобы домены легкой и тяжелой цепей сворачивались в иммуноглобулины с кроссоверной областью из двойных вариабельных областей. В некоторых вариантах осуществления линкер состоит из 0 аминокислот, что означает, что линкер отсутствует. Линкер вставлен в переходную зону между вариабельными доменами или между вариабельным и константным доменами, соответственно, на уровне последовательности. Переходную зону между доменами можно идентифицировать, поскольку приблизительный размер доменов иммуноглобулина хорошо известен. Точное местоположение переход- 43 041572 ной зоны доменов можно определить путем определения положения пептидных отрезков, которые не образуют элементов с вторичной структурой, такой как бета-слои или альфа-спирали, как показано с помощью экспериментальных данных или как можно предположить с помощью методик моделирования или предсказания вторичной структуры. Линкеры, описываемые в контексте настоящего изобретения, представляют собой линкеры L1, L2, L3, L4 и L5. L1 расположен между N-концом VD1-домена и VD2доменом; L2 расположен между VD2-доменом и С-концом CL-домена. Линкеры L3 и L4 расположены в полипептиде, определяемом согласно формуле II или III антителоподобных белков. Более точно, L3 расположен между N-концом VD3-домена и VD4-доменом, a L4 расположен между VD4-доменом и С-концом CH1-Fc-домена. L5 расположен между CL и N-концом Fc2. Линкеры L1, L2, L3, L4 и L5 являются независимыми, но в некоторых вариантах осуществления они имеют одинаковую последовательность и/или длину.The term linker, as used herein, refers to one or more amino acid residues inserted between the immunoglobulin domains to provide sufficient mobility for the light and heavy chain domains to fold into immunoglobulins with a dual variable region crossover region. In some embodiments, the implementation of the linker consists of 0 amino acids, which means that the linker is missing. The linker is inserted into the transition zone between variable domains or between variable and constant domains, respectively, at the sequence level. The transition zone between the domains can be identified because the approximate size of the immunoglobulin domains is well known. The exact location of the transition zone of domains can be determined by determining the position of peptide stretches that do not form elements with secondary structure, such as beta sheets or alpha helices, as shown by experimental data or as suggested by modeling techniques or secondary structure predictions. Linkers described in the context of the present invention are linkers L1, L 2 , L 3 , L 4 and L 5 . L1 is located between the N-terminus of the V D1 domain and the V D2 domain; L2 is located between the V D2 domain and the C-terminus of the CL domain. Linkers L 3 and L 4 are located in the polypeptide, defined according to the formula II or III of antibody-like proteins. More precisely, L 3 is located between the N-terminus of the V D3 domain and the V D4 domain, and L 4 is located between the V D4 domain and the C-terminus of the C H1 Fc domain. L 5 is located between CL and the N-terminus of F c2 . Linkers L1, L 2 , L 3 , L 4 and L 5 are independent, but in some embodiments, they have the same sequence and/or length.

В некоторых антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L3 по меньшей мере в два раза превышает длину L1. В других антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L4 по меньшей мере в два раза превышает длину L2. В некоторых антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L1 по меньшей мере в два раза превышает длину L3. В других антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L2 по меньшей мере в два раза превышает длину L4.In some antibody-like binding proteins of the present invention, the length of L 3 is at least twice the length of L1. In other antibody-like binding proteins of the present invention, the length of L4 is at least twice the length of L2. In some antibody-like binding proteins of the present invention, the L 1 length is at least twice the L 3 length. In other antibody-like binding proteins of the present invention, the length of L 2 is at least twice the length of L 4 .

В одном варианте осуществления линкеры L1, L2, L3 и L4 содержат 0-20 аминокислот. В одном варианте осуществления L5 содержит 0-10 аминокислот.In one embodiment, the linkers L1, L 2 , L 3 and L 4 contain 0-20 amino acids. In one embodiment, L 5 contains 0-10 amino acids.

В некоторых антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L1 составляет 3-12 аминокислотных остатков, длина L2 составляет 3-14 аминокислотных остатков, длина L3 составляет 1-8 аминокислотных остатков, а длина L4 составляет 1-3 аминокислотных остатка. В других антителоподобных связывающих белках длина Li составляет 5-10 аминокислотных остатков, длина L2 составляет 5-8 аминокислотных остатков, длина L3 составляет 1-5 аминокислотных остатков, а длина L4 составляет 1-2 аминокислотных остатка. В предпочтительном антителоподобном связывающем белке длина L1 составляет 7 аминокислотных остатков, длина L2 составляет 5 аминокислотных остатков, длина L3 составляет 1 аминокислотный остаток, а длина L4 составляет 2 аминокислотных остатка.In some antibody-like binding proteins of the present invention, L 1 is 3-12 amino acid residues long, L2 is 3-14 amino acid residues long, L 3 is 1-8 amino acid residues long, and L 4 is 1-3 amino acid residues long. In other antibody-like binding proteins, Li is 5-10 amino acid residues long, L2 is 5-8 amino acid residues long, L 3 is 1-5 amino acid residues long, and L 4 is 1-2 amino acid residues long. In a preferred antibody-like binding protein, L1 is 7 amino acid residues long, L2 is 5 amino acid residues long, L 3 is 1 amino acid residue long and L 4 is 2 amino acid residues long.

В некоторых антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L1 составляет 1-3 аминокислотных остатка, длина L2 составляет 1-4 аминокислотных остатка, длина L3 составляет 2-15 аминокислотных остатков, а длина L4 составляет 2-15 аминокислотных остатков. В других антителоподобных связывающий белках длина L1 составляет 1-2 аминокислотных остатка, длина L2 составляет 1-2 аминокислотных остатка, длина L3 составляет 4-12 аминокислотных остатков, а длина L4 составляет 2-12 аминокислотных остатков. В предпочтительном антителоподобном связывающем белке длина L1 составляет 1 аминокислотный остаток, длина L2 составляет 2 аминокислотных остатка, длина L3 составляет 7 аминокислотных остатков, а длина L4 составляет 5 аминокислотных остатков.In some antibody-like binding proteins of the present invention, L 1 is 1-3 amino acid residues long, L 2 is 1-4 amino acid residues long, L 3 is 2-15 amino acid residues long, and L 4 is 2-15 amino acid residues long. In other antibody-like binding proteins, L1 is 1-2 amino acid residues long, L2 is 1-2 amino acid residues long, L3 is 4-12 amino acid residues long, and L4 is 2-12 amino acid residues long. In a preferred antibody-like binding protein, L1 is 1 amino acid residue long, L2 is 2 amino acid residue long, L3 is 7 amino acid residue long and L4 is 5 amino acid residue long.

В некоторых антителоподобных связывающих белках по настоящему изобретению длина L1, L3 или L4 может быть равной нулю. Однако в антителоподобных связывающих белках, в которых длина L3 или L4 равна нулю, соответствующая длина переходного линкера между вариабельной областью и константной областью или между двумя вариабельными доменами в другой цепи не может быть равна нулю. В некоторых вариантах осуществления длина L1 равна нулю, a L3 составляет 2 или более аминокислотных остатков, длина L3 равна нулю, а длина L1 равна 1 или более аминокислотным остаткам, или длина L4 равна 0, a L2 составляет 3 или более аминокислотных остатков.In some antibody-like binding proteins of the present invention, the length of L1, L 3 or L 4 may be zero. However, in antibody-like binding proteins in which the L 3 or L 4 length is zero, the corresponding length of the transient linker between the variable region and the constant region, or between two variable domains in the other chain, cannot be zero. In some embodiments, the length of L 1 is zero and L 3 is 2 or more amino acid residues, the length of L 3 is zero and the length of L 1 is 1 or more amino acid residues, or the length of L 4 is 0 and L 2 is 3 or more amino acid residues.

В некоторых антителоподобный связывающий белках по настоящему изобретению по меньшей мере один из линкеров, выбранных из группы, состоящей из L2, L3 и L4, содержит по меньшей мере один цистеиновый остаток.In some antibody-like binding proteins of the present invention, at least one of the linkers selected from the group consisting of L2, L3 and L4 contains at least one cysteine residue.

Примеры подходящих линкеров включают одиночный глициновый, треониновый или сериновый остаток; дипептид, такой как диглициновый пептид, гистидиново-треониновый пептид или глициновосериновый дипептид; трипептид из трех остатов глицина, трипептид Thr-His-Thr, трипептид Gly-Gly-Ser; пептид из четырех глициновых остатков; пептид из пяти глициновых остатков; пептид из шести глициновых остатков; пептид из семи глициновых остаков; пептид из восьми глициновых остатков. Можно использовать другие комбинации аминокислотных остатков, такие как пептид Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 354), пептид Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344), пептид Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 355), пептид Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 356), пептид Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 357), пептид Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID nO: 358) и пептид Gly-Gly-GlyGly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 345). Другие подходящие линкеры включают одиночный Ser и Val остаток; дипептид Arg-Thr, Gin-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, и Ser-Leu; Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-ThrSer-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-ThrSer-Pro-Pro (SEQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-LysSer-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-ProSer-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-AspExamples of suitable linkers include a single glycine, threonine or serine residue; a dipeptide such as a diglycine peptide, a histidine-threonine peptide, or a glycine serine dipeptide; a tripeptide of three glycine residues, a Thr-His-Thr tripeptide, a Gly-Gly-Ser tripeptide; a peptide of four glycine residues; a peptide of five glycine residues; a peptide of six glycine residues; a peptide of seven glycine residues; peptide of eight glycine residues. Other combinations of amino acid residues can be used, such as Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 354), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 344), Ser-Gly-Gly- Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 355), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 356), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly- peptide Ser (SEQ ID NO: 357), peptide Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID nO: 358), and peptide Gly-Gly-GlyGly-Ser-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser (SEQ ID NO: 345). Other suitable linkers include a single Ser and Val residue; dipeptide Arg-Thr, Gin-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, and Ser-Leu; Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-ThrSer-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-ThrSer-Pro-Pro (SEQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-LysSer-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-ProSer-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp

- 44 041572- 44 041572

Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-SerPro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-SerPro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-GlyGly-Gly (SEQ ID NO: 373); Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-GlyGly-Gly (SEQ ID NO: 374); Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 346), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 347), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 348); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 349), Arg-Thr-Val-AlaAla-Pro-Ser (SEQ ID NO: 350), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 351), и Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389). Примеры, перечисленные выше, не предусмотрены для какого-либо ограничения объема настоящего изобретения, и было показано, что линкеры, содержащие случайным образом выбранные аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из валина, лейцина, изолейцина, серина, треонина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата, аспарагина, глутамина, глицина и пролина, подходят для антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению.Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-SerPro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-SerPro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-GlyGly-Gly (SEQ ID NO: 373); Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-GlyGly-Gly (SEQ ID NO: 374); Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 346), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 347), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 348) ; Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 349), Arg-Thr-Val-AlaAla-Pro-Ser (SEQ ID NO: 350), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala- Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 351), and Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389). The examples listed above are not intended to limit the scope of the present invention in any way, and it has been shown that linkers containing randomly selected amino acids selected from the group consisting of valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, lysine, arginine, histidine , aspartate, glutamate, asparagine, glutamine, glycine, and proline are suitable for the antibody-like binding proteins of the present invention.

Состав и последовательность аминокислотных остатков в линкере может меняться в зависимости от типа элемента вторичной структуры, который необходимо достигнуть при помощи линкера. Например, глицин, серин и аланин являются самыми подходящими для линкеров, характеризующихся максимальной гибкостью. Некоторые комбинации глицина, пролина, треонина и серина применимы, если необходим более жесткий и удлиненный линкер. При необходимости любой аминокислотный остаток может рассматриваться как линкер в комбинации с другими аминокислотными остатками для конструирования более длинных пептидных линкеров, в зависимости от требуемых свойств.The composition and sequence of amino acid residues in the linker may vary depending on the type of element of the secondary structure, which must be achieved using the linker. For example, glycine, serine and alanine are the most suitable linkers for maximum flexibility. Some combinations of glycine, proline, threonine and serine are useful if a stiffer and longer linker is needed. If necessary, any amino acid residue can be considered as a linker in combination with other amino acid residues to construct longer peptide linkers, depending on the desired properties.

В одном варианте осуществления линкер L1 имеет последовательность Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), линкер L2 имеет последовательность Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), линкер L3 имеет последовательность S, а линкер L4 имеет последовательность RT.In one embodiment, the L1 linker has the sequence Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), the L 2 linker has the sequence Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309) , linker L 3 has the sequence S, and linker L 4 has the sequence RT.

В дополнительном варианте осуществления последовательности линкеров L1, L2, L3 и L4 выбраны из группы, состоящей из треонина; дипептида, такого как гистидиново-терониновый пептид; трипептида Thr-His-Thr, Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-HisThr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-SerPro (SeQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (SEQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-HisThr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-LysThr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-SerPro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-GlyGlu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-ProLys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 373) и Gly-Gly-Gly-Glu-ProLys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 374). В одном варианте осуществления последовательность линкера L5 выбрана из группы, состоящей из одиночного серинового остатка, дипептида, такого как глициново-сериновый дипептид; трипептида Gly-Gly-Ser, пептида GlyGly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 354), пептида Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344), пептида Ser-Gly-Gly-GlyGly-Ser (SEQ ID NO: 355), пептида Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 356), пептида Gly-Gly-SerGly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 357), пептида Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 358), пептида Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 345) и пептида Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-SerGly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389).In a further embodiment, the linker sequences L1, L 2 , L 3 and L4 are selected from the group consisting of threonine; a dipeptide such as histidine-theronine peptide; tripeptide Thr-His-Thr, Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-HisThr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-SerPro (SeQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (SEQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-HisThr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-LysThr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-SerPro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-GlyGlu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-ProLys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 373) and Gly-Gly-Gly-Glu -ProLys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 374). In one embodiment, the L 5 linker sequence is selected from the group consisting of a single serine residue, a dipeptide such as a glycine-serine dipeptide; Gly-Gly-Ser tripeptide, GlyGly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 354), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 344), Ser-Gly-Gly-GlyGly-Ser peptide ( SEQ ID NO: 355), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 356), Gly-Gly-SerGly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 357) , Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 358), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser peptide (SEQ ID NO: 345) and the Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-SerGly-Ser-Gly-Gly peptide (SEQ ID NO: 389).

Термин Fc-домен, как используется в данном документе, охватывает нативный Fc, а также варианты Fc и последовательности, определяемые выше. Что касается вариантов Fc и нативных молекул Fc, термин Fc-домен включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, вне зависимости от того, образованы ли они расщеплением целого антитела или получены другими способами.The term Fc domain as used herein encompasses native Fc as well as Fc variants and sequences as defined above. With regard to Fc variants and native Fc molecules, the term Fc domain includes molecules in monomeric or multimeric form, whether formed by cleavage of the whole antibody or obtained by other means.

Термином нативный Fc, как используется в данном документе, называют молекулу, содержащую последовательность, не являющуюся антигенсвязывающим фрагментом, которая получена в результате расщепления антитела или получена другими способами, вне зависимости от того, находится ли она в мономерной или мультимерной форме, и она может содержать шарнирную область. Исходный иммуноглобулиновый источник нативного Fc, в частности, происходит от человека и может представлять собой любой из иммуноглобулинов, хотя предпочтительными являются IgG1 и IgG2. Нативные молекулы Fc составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т.е. дисульфидных связей) и нековалентной связи. Количество межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьирует от 1 до 4, в зависимости от класса (например, IgG, IgA и IgE) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgA1 и IgGA2). Одним примером нативного Fc является димер с дисульфидной связью, образуемый в результате расщепления IgG папаином. Термин нативный Fc, как используется в данном документе, является общим для мономерных, димерных и мультимерных форм.The term native Fc, as used herein, refers to a molecule containing a sequence that is not an antigen-binding fragment, which is obtained by cleavage of an antibody or obtained by other methods, regardless of whether it is in monomeric or multimeric form, and it may contain hinge area. The original immunoglobulin source of the native Fc is particularly human-derived and may be any of the immunoglobulins, although IgG1 and IgG2 are preferred. Native Fc molecules are composed of monomeric polypeptides that can be linked into dimeric or multimeric forms via covalent (ie disulfide bonds) and non-covalent bonds. The number of intermolecular disulfide bonds between the monomeric subunits of native Fc molecules varies from 1 to 4, depending on the class (eg IgG, IgA and IgE) or subclass (eg IgGl, IgG2, IgG3, IgA1 and IgGA2). One example of a native Fc is a disulfide dimer resulting from papain cleavage of IgG. The term native Fc, as used herein, is generic to monomeric, dimeric, and multimeric forms.

Термином вариант Fc, как используется в данном документе, называют молекулу или последовательность, которая модифицирована по сравнению с нативным Fc, но все еще содержит участок связываThe term Fc variant, as used herein, refers to a molecule or sequence that is modified from the native Fc but still contains the binding site

- 45 041572 ния для рецептора реутилизации, FcRn (неонатального Fc-рецептора). Иллюстративные варианты Fc и их взаимодействие с рецептором реутилизации известны из уровня техники. Таким образом, термин вариант Fc может предусматривать молекулу или последовательность, которая является гуманизированной на основе нативного Fc, который получен из молекулы, не относящейся к человеку. Кроме того, нативный Fc содержит области, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки или биологическую активность, которые не требуются для антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению. Таким образом, термин вариант Fc предусматривает молекулу или последовательность, в которой отсутствует один или несколько участков или остатков нативного Fc или в которой были модифицированы один или несколько участков или остатков Fc, воздействующих на или вовлеченных в: (1) образование дисульфидной связи, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) N-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Fc-рецептором, иным чем рецептор реутилизации, или (7) антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).- 45 041572 for the recycling receptor, FcRn (neonatal Fc receptor). Exemplary Fc variants and their interaction with the recycling receptor are known in the art. Thus, the term Fc variant may include a molecule or sequence that is humanized based on a native Fc that is derived from a non-human molecule. In addition, native Fc contains regions that can be removed because they provide structural features or biological activity that are not required for the antibody-like binding proteins of the present invention. Thus, the term Fc variant encompasses a molecule or sequence that lacks one or more native Fc sites or residues or that has been modified with one or more Fc sites or residues that affect or are involved in: (1) disulfide bond formation, (2 ) incompatibility with the selected host cell, (3) N-terminal heterogeneity when expressed in the selected host cell, (4) glycosylation, (5) interaction with complement, (6) binding to an Fc receptor other than a salvage receptor, or (7) antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).

В некоторых вариантах осуществления, когда антителоподобный связывающий белок содержит два Fc-домена, т.е. у CODV-Ig (Fc и Fc2), CODV-Fab-TL (два Fc-домена) и CODV-Fab-OL (Fc и Fc3), два Fc-домена принадлежат к одному изотипу или подклассу изотипа иммуноглобулинов. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления оба Fc и Fc2 из CODV-Ig, или оба Fc-домена из CODV-Fab-TL, или оба Fc и Fc3 из CODV-Fab-OL принадлежат к подклассу IgG1, или подклассу IgG2, или подклассу IgG3, или подклассу IgG4.In some embodiments, when the antibody-like binding protein contains two Fc domains, i.e. in CODV-Ig (F c and F c2 ), CODV-Fab-TL (two Fc domains), and CODV-Fab-OL (F c and F c3 ), the two Fc domains belong to the same immunoglobulin isotype or isotype subclass. Accordingly, in some embodiments, both Fc and Fc2 from CODV-Ig, or both Fc domains from CODV-Fab-TL, or both Fc and Fc3 from CODV-Fab-OL belong to the IgG1 subclass, or the IgG2 subclass , or an IgG3 subclass, or an IgG4 subclass.

Все антителоподобные связывающие белки, описываемые в данном документе, не обладают эффекторной функцией. Это означает, что когда антителоподобный связывающий белок содержит один или несколько Fc-доменов (т.е. Fc в формуле [III], Fc2 в формуле [IV] и/или Fc3), принадлежащих к подклассу IgG1, то указанный один или несколько Fc-доменов с остовом IgG1 содержат двойную мутацию L234A и L235A (называемую мутация LALA), которая нарушает эффекторную функцию Fc. Fc с двойной мутацией L234A и L235A не связывается FcyR или C1q, и обе ADCC и CDC функции Fc-домена подкласса IgGl нарушены (Hezareh, M. et al., J Virol. 2001 Dec; 75(24): 12161-12168).All antibody-like binding proteins described herein do not have an effector function. This means that when an antibody-like binding protein contains one or more Fc domains (i.e., Fc in formula [III], Fc2 in formula [IV] and/or Fc3 ) belonging to the IgG1 subclass, then said one or several IgG1 backbone Fc domains contain a L234A and L235A double mutation (called the LALA mutation) that disrupts F c effector function. Fc with double mutation L234A and L235A does not bind FcyR or C1q, and both ADCC and CDC functions of the IgGl subclass Fc domain are impaired (Hezareh, M. et al., J Virol. 2001 Dec; 75(24): 12161-12168).

В одном примере Fc-область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 394 или SEQ ID NO: 396. В одном варианте осуществления Ес2-область содержит две аминокислотные замены в пределах СН3-домена, H435R и Y436F, как описано в Jendeberg, L. et al. (1997, J. Immunological Meth. 201: 25-34). Соответственно, в одном варианте осуществления Fc2-область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 327. В другом варианте осуществления Fc2область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 392.In one example, the Fc region contains the amino acid sequence under SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 394, or SEQ ID NO: 396. In one embodiment, the E c2 region contains two amino acid substitutions within the CH3 domain, H435R and Y436F, as described in Jendeberg, L. et al. (1997, J. Immunological Meth. 201: 25-34). Accordingly, in one embodiment, the F c2 region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 327. In another embodiment, the F c2 region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 392.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab 7G3x20G6, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab 7G3x20G6, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGFSDWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGFS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVDPDDLGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKLEIKGQPKAAPDFVMTOSPSDRFSGSGSGTDFTLKISRRVDPDDLGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKLEIKGQPKAAPDFVMTOSPS

SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 306, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 9, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 306, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 9, L 1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, V D2 с последовательностью under SEQ ID NO: 308, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF

KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQLVET GGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNSYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 311, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 5, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQLVET GGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNSYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 311, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 5, L 4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab 7G3x4E7, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab 7G3x4E7, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

- 46 041572- 46 041572

DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQPLIYKVSNRFSGIS DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGOGTQYPFTFGPGTKLELKGQPKAAPDFVMTOSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLKDWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQPLIYKVSNRFSGIS DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGOGTQYPFTFGPGTKLELKGQPKAAPDFVMTOSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK

SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 314, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 21, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 314, with linkers shown in bold and underlined) containing V D1 with the sequence of SEQ ID NO: 21, L 1 with the sequence of SEQ ID NO: 307, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 308, L 2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and CL with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQWET GGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNNYATYYAESLKGRFT ISRDDPKRSIYLQMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYAMDAWGQGTSVTVSSRTASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 315, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 18, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQWET GGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNNYATYYAESLKGRFT ISRDDPKRSIYLQMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYAMDAWGQGTSVTVSSRTASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 315, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 18, L4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab 7G3x4B4, содержит: один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab 7G3x4B4, contains: one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQRPGQSPQVLIYKVSNRFSGTS DRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGOGTQYPFTFGSGTKLEIKGQPKAAPDFVMTOSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 316, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 16, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюDWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQRPGQSPQVLIYKVSNRFSGTS DRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGOGTQYPFTFGSGTKLEIKGQPKAAPDFVMTOSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 316, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 16, L 1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 308, L 2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and CL with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQLVET GGRLVQPGRSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKARSNNYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 317, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 12, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQLVET GGRLVQPGRSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKARSNNYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 317, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 12, L4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab 7G3x18F5, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab 7G3x18F5, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DVLMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRLSGISDVLMTQTPVSLSVSLGQVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRLSGIS

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGOGTHYPFTFGAGTKLELKGQPKAAPDFVMTQSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 318, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 26, L1 с последовательностью под SEQ IDDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGOGTHYPFTFGAGTKLELKGQPKAAPDFVMTQSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 318, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 26, L 1 с последовательностью под SEQ ID

- 47 041572- 47 041572

NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюNO: 307, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 308, L 2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and CL with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQWET GGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKQLEWVAQIKDKSNNYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYALDAWGRGTSVSVSSRTASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 319, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 23, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASEVQWET GGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKQLEWVAQIKDKSNNYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYALDAWGRGTSVSVSSRTASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 319, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 23, L 4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab hz20G6x7G3, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab hz20G6x7G3, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGV PDRFTGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKGQPKAAPDIVMTOTP LSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 320, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 143, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGV PDRFTGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKGQPKAAPDIVMTOTP LSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 320, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, V D2 с sequence under SEQ ID NO: 143, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYAD SVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSSEVQLQQ SGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATL TVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 321, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYAD SVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSSEVQLQQ SGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATL TVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 321, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L 4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab 7G3xhz4B4, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab 7G3xhz4B4, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DWMTQTPVSLSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKVSNRFSGVS SRFTGSGSGTDFTLKISSVOPDDLGVYYCGQGTOYPFTFGSGTKLEIKGQPKAAPDFVMTOSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 322, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 158, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюDWMTQTPVSLSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKVSNRFSGVS SRFTGSGSGTDFTLKISSVOPDDLGVYYCGQGTOYPFTFGSGTKLEIKGQPKAAPDFVMTOSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS GTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 322, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 158, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью under SEQ ID NO: 308, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

- 48 041572- 48 041572

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASQVQLVET GGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVAQIKARSNNYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 323, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 171, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSASQVQLVET GGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVAQIKARSNNYATYYAESVKGRFT ISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 323, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 171, L 4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab hz4B4x3E3, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab hz4B4x3E3, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFS GSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVLGQPKAAPDWMTQTPVS LSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKVSNRFSGVSSRFTGSGSGT DFTLKISSVOPDDLGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 32 4, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 230, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 158, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле II с аминокислотной последовательностьюQFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPDGVPDRFS GSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVLGQPKAAPDWMTQTPVS LSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKVSNRFSGVSSRFTGSGSGT DFTLKISSVOPDDLGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 32 4, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 230, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307 , V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 158, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309 and CL with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula II with the amino acid sequence

QVQLVETGGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVAQIKARSNNYATYYAE SVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVMVTVSSSQVQLQE SGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWMGRIQNGGITDYNSALKSRLIIS RDTSKSQVFLKMNSVQTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 325, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 171, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 226, L4 с аминокислотной последовательностью RT и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.QVQLVETGGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVAQIKARSNNYATYYAE SVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVMVTVSSSQVQLQE SGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWMGRIQNGGITDYNSALKSRLIIS RDTSKSQVFLKMNSVQTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 325, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 171, L 3 с аминокислотной последовательностью S, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 226, L 4 with the amino acid sequence RT and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab hz20G6xhz7G3, содержит один полипептид согласно формуле [I], фактически состоящий из аминокислотной последовательностиThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab hz20G6xhz7G3, contains one polypeptide according to formula [I], actually consisting of the amino acid sequence

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCONDYSYPYTFGOGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 388, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, и один полипептид согласно формуле [II], фактически состоящий из аминокислотной последовательностиDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCONDYSYPYTFGOGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 388, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389 and CL with the sequence under SEQ ID NO: 310, and one polypeptide according to formula [II], actually consisting of the amino acid sequence

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASYRGPSYFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASYRGPSYFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV

- 49 041572 (SEQ ID NO: 390), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383 (выделено курсивом и подчеркнуто), причем L4 представляет собой 0 аминокислот, и CH1 с последовательностью под SEQ ID- 49 041572 (SEQ ID NO: 390), containing V D3 with the sequence under SEQ ID NO: 138, and L 3 represents 0 amino acids, V D4 with the sequence under SEQ ID NO: 383 (italicized and underlined), and L 4 is 0 amino acids, and C H1 with the sequence under SEQ ID

NO: 313.NO: 313.

В другом примере полипептиды согласно форме II из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 и hz20G6xhz7G3, дополнительно содержат последовательность EPKSCDKTHTHHHHHH (SEQ ID NO: 352), которая соответствует применяемым последовательности шарнира и His-метки, например, для очистки.In another example, the Form II polypeptides of the antibody-like binding proteins termed CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 and hz20G6xhz7G3, further comprise the sequence EPKSCDKTHTHHHHHH, which further corresponds to the sequence ID: 35 His-tags, for example, for cleaning.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4 (также под названием CODV-Fab-TL4 hz20G6x7G3), содержит:An antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4 (also called CODV-Fab-TL4 hz20G6x7G3) contains:

один полипептид согласно формуле [IV], фактически состоящий из аминокислотной последовательностиone polypeptide according to the formula [IV], actually consisting of the amino acid sequence

DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGV

PDRFTGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKGQPKAAPDIVMTOTPPDRFTGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIKGQPKAAPDIVMTOTP

LSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLKGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEOLK

SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGECESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGECESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE

VTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE5NGQVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE5NGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWOEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 326, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 308, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 143, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309, CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310 и Fc2 (подчеркнуто) с последовательностью под SEQ ID NO: 327, и один полипептид согласно формуле [III] с аминокислотной последовательностьюPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWOEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 326, with linkers shown in bold and underlined) containing V D1 with the sequence of SEQ ID NO: 308, L 1 with the sequence of SEQ ID NO: 307, V D2 with the sequence of SEQ ID NO: 143, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309, CL with the sequence under SEQ ID NO: 310 and F c2 (underlined) with the sequence under SEQ ID NO: 327, and one polypeptide according to formula [III] with the amino acid sequence

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYAD

SVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSSEVQLQQSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSSEVQLQQ

SGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATLSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATL

TVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLATVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLA

PCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL

GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT

CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 328, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, L3 с аминокислотной последовательностью S, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 312, L4 с аминокислотной последовательностью RT, а также CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 329 и Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 330.NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 328, with linkers shown in bold and underlined) containing V D3 with the sequence of SEQ ID NO: 138, L 3 with the amino acid sequence of S, V D4 with the sequence of SEQ ID NO: 312, L 4 with the amino acid sequence RT, as well as C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 329 and F c with the sequence under SEQ ID NO: 330.

В вышеупомянутом антителоподобном связывающем белке CODV-Fab-TL4 hz20G6x7G3 Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 330 и Fc2 с последовательностью под SEQ ID NO: 327 получены из остова IgG4. Указанный антителоподобный связывающий белок находится в формате CODV-Fab-TL и содержит или состоит из одного полипептида формулы III и одного полипептида формулы IV.In the above antibody-like binding protein CODV-Fab-TL4 hz20G6x7G3 Fc with the sequence of SEQ ID NO: 330 and Fc2 with the sequence of SEQ ID NO: 327 are derived from the backbone of IgG4. Said antibody-like binding protein is in CODV-Fab-TL format and contains or consists of one formula III polypeptide and one formula IV polypeptide.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, содержит один полипептид согласно формуле IV с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, contains one polypeptide according to formula IV with the amino acid sequence

- 50 041572- 50 041572

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCONDYSYPYTFGOGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS T L T L S KADYEKHKVYACEVTHQGL S S PVTKS FNRGE CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHO DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNRFTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 391, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, L5, который содержит 0 аминокислот, и Fc2 с последовательностью под SEQ ID NO: 392; и один полипептид согласно формуле III с аминокислотной последовательностьюDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCONDYSYPYTFGOGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGL SS PVTKS FNRGE CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHO DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNRFTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 391, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L 1 с последовательностью under SEQ ID NO: 389, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389, C L with the sequence under SEQ ID NO: 310, L 5 which contains 0 amino acids, and F c2 with sequence under SEQ ID NO: 392; and one polypeptide according to formula III with the amino acid sequence

QVQLVE S GGGWQPGRS LRL S CAAS G FT FTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS NS YAQVQLVE S GGGWQPGRS LRL S CAAS G FT FTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKS NS YA

TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASYRGPSYFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 393), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383 (выделено курсивом), причем L4 представляет собой 0 аминокислот, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313 и Fc (подчеркнуто) с последовательностью под SEQ ID NO: 394.TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASYRGPSYFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 393), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L 3 представляет собой 0 аминокислот, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383 (выделено курсивом ), where L4 is 0 amino acids, C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313 and Fc (underlined) with the sequence under SEQ ID NO: 394.

В антителоподобном связывающем белке CODV-Fab-TL1 hz20G6x7G3 Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 394 и Fc2 с последовательностью под SEQ ID NO: 392 получены из остова IgG1. Указанный антителоподобный связывающий белок находится в формате CODV-Fab-TL. Он содержит или состоит из одного полипептида формулы IV и одного полипептида формулы III.In the antibody-like binding protein CODV-Fab-TL1 hz20G6x7G3 Fc with the sequence of SEQ ID NO: 394 and Fc2 with the sequence of SEQ ID NO: 392 are derived from the backbone of IgG1. Said antibody-like binding protein is in CODV-Fab-TL format. It contains or consists of one formula IV polypeptide and one formula III polypeptide.

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCONDYSYPYTFGOGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 388, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310; и один полипептид согласно формуле III с аминокислотной последовательностьюDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCONDYSYPYTFGOGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 388, при этом линкеры показаны символами с полужирным начертанием и подчеркнуты), содержащий V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L 1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 , V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310; and one polypeptide according to formula III with the amino acid sequence

- 51 041572- 51 041572

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASYKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYIC NVNH К P S N T КVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL·TVL·HQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 395), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383 (выделено курсивом и подчеркнуто), причем L4 представляет собой 0 аминокислот, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313 и Fc (подчеркнуто) с последовательностью под SEQ ID NO: 396;QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASYKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYIC NVNH К PSNT КVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL·TVL·HQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 395), содержащий V D3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L 3 представляет собой 0 аминокислот, V D4 с последовательностью under SEQ ID NO: 383 (italicized and underlined), with L4 representing 0 amino acids, C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313 and F c (underlined) with the sequence under SEQ ID NO: 396;

и где антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3, дополнительно содержит Fc-stump (Fc3) с аминокислотной последовательностьюand wherein the antibody-like binding protein termed CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3 further comprises an Fc-stump (F c3 ) with the amino acid sequence

GSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW

YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 397) и который образует гетеродимер с Fc-областью полипептида согласно формуле III.YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 397) and which forms a heterodimer according to formula III.

Указанный антителоподобный связывающий белок находится в формате CODV-Fab-OL, т.е. он содержит или состоит из одного полипептида формулы I, одного полипептида формулы III и одного Fcstump. Его последовательности Fc и Fc3 были сконструированы согласно технологии выступ-во-впадину и дополнительно содержат двойную мутацию L234A и L235A.Said antibody-like binding protein is in CODV-Fab-OL format, i. e. it contains or consists of one formula I polypeptide, one formula III polypeptide and one Fcstump. Its F c and F c3 sequences were designed according to the ledge-in-trough technique and additionally contain the double mutation L234A and L235A.

Последовательность Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 396 была разработана так, чтобы содержать остатки RF в положениях 200-221 (символы с полужирным начертанием выше), вместо остатков HY, которые в ином случае присутствовали бы в этой Fc-области. Мутация HY > RF (т.е. H435R и Y436F в СН3-домене, как описано в Jendeberg, L. et al. 1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34) имеет преимущество для целей очистки, поскольку она нарушает связывание с белком А. В случае CODV-FabOL1 hz20G6xhz7G3 Fc-stump с последовательностью под SEQ ID NO: 397 содержит остатки HY в положениях 217-218 (символы с полужирным начертанием выше).The F c sequence of SEQ ID NO: 396 was designed to contain RF residues at positions 200-221 (characters in bold above), instead of HY residues that would otherwise be present in this Fc region. The HY > RF mutation (i.e. H435R and Y436F in the CH3 domain as described in Jendeberg, L. et al. 1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34) is advantageous for purification purposes because protein A binding. In the case of CODV-FabOL1 hz20G6xhz7G3 F c -stump with the sequence of SEQ ID NO: 397 contains HY residues at positions 217-218 (symbols in bold above).

Антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3, содержит один полипептид согласно формуле I с аминокислотной последовательностьюThe antibody-like binding protein, called CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3, contains one polypeptide according to formula I with the amino acid sequence

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 388), который содержит VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, Li с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310;DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGSGSSGSGG DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 388), который содержит V D1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, Li с последовательностью под SEQ ID NO: 389, V D2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с the sequence under SEQ ID NO: 389 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310;

один полипептид согласно формуле III с аминокислотной последовательностьюone polypeptide according to formula III with the amino acid sequence

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGOGTMVTVSSASTKG Р SVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPCRDEL·TKNOVSL·WCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 399), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383 (выделено курсивом и подчеркнуто), причем L4 представляет собой 0 аминокислот, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO:QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYA TYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEV QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFKG QVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGOGTMVTVSSASTKG Р SVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPCRDEL·TKNOVSL·WCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 399), содержащий VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, V D4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383 (italicized and underlined), with L 4 representing 0 amino acids, C H1 with the sequence under SEQ ID NO:

- 52 041572- 52 041572

313 и Fc (подчеркнуто) с последовательностью под SEQ ID NO: 400;313 and Fc (underlined) with the sequence under SEQ ID NO: 400;

и где антителоподобный связывающий белок, называемый CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3, дополнительно содержит Fc-stump (Fc3) с аминокислотной последовательностьюand wherein the antibody-like binding protein termed CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3 further comprises an Fc-stump (F c3 ) with the amino acid sequence

GSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNW

YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG

QPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF

LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 398), который образует гетеродимер с Fc-областью полипептида согласно формуле III.LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 398), which forms a heterodimer with the Fc region of a polypeptide according to formula III.

Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 400 содержит остатки HY в положениях 200-221 (символы с полужирным начертанием выше), в то время как Fc-stump с последовательностью под SEQ ID NO: 398 содержит остатки RF в положениях 217-218 (символы с полужирным начертанием выше).F c with the sequence under SEQ ID NO: 400 contains HY residues at positions 200-221 (characters in bold above), while F c -stump with the sequence under SEQ ID NO: 398 contains RF residues at positions 217-218 (characters in bold above).

Указанный антителоподобный связывающий белок находится в формате CODV-Fab-OL, т.е. он содержит или состоит из одного полипептида формулы I, одного полипептида формулы III и одного Fcstump. Его последовательности Fc и Fc3 были сконструированы согласно технологии выступ-во-впадину и содержат двойную мутацию L234A и L235A.Said antibody-like binding protein is in CODV-Fab-OL format, i. e. it contains or consists of one formula I polypeptide, one formula III polypeptide and one Fcstump. Its F c and F c3 sequences were designed according to the ledge-in-trough technique and contain the double mutation L234A and L235A.

В одном варианте осуществления первый иммуноглобулин или второй иммуноглобулин представляют собой одно антитело к CD123, выбранное из антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7C8, и 9F6-G3, или их гуманизированной формы, или антитела к CD123 7G3, описанного в данном документе ниже, например, антител к CD123 3E3-D3 или 7G3 или их гуманизированной формы.In one embodiment, the first immunoglobulin or the second immunoglobulin is a single anti-CD123 antibody selected from the anti-CD123 antibodies referred to as 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4 , 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7C8, and 9F6-G3, or a humanized form thereof, or an anti-CD123 7G3 antibody described herein below, for example, an anti-CD123 antibody 3E3-D3 or 7G3 or their humanized form.

В одном варианте осуществления первый иммуноглобулин или второй иммуноглобулин представляют собой одно антитело к CD3, выбранное из антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7С9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6С9-С9, 3E8-G1, 3H6-D2, и 8Н2, или их гуманизированной формы, например, антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10 и hz20G6, например антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7.In one embodiment, the first immunoglobulin or the second immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody selected from the anti-CD3 antibodies referred to as 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7C9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2 -C2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1E6-C9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10 , 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2, and 8H2, or a humanized form thereof, such as anti-CD3 antibodies called 20G6-F3, 4B4- D7, 4E7-C9, 18F5-H10 and hz20G6, such as anti-CD3 antibodies called 20G6-F3, 4B4-D7.

Соответственно, VD1 и VD4 или VD2 и VD3 представляют собой вариабельные домены тяжелой или легкой цепи антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит:Accordingly, V D1 and V D4 or V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domains of an anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises:

a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 6, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 7, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 142, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиa) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 7, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 8, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 142, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 14, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 184, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиb) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 14, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 184, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 22, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11; илиc) a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H of the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H of the sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR3-H of the sequence of SEQ ID NO: 20, and a light chain variable domain, containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 22, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11; or

d) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 24, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 19, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 25 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 27, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 28, и где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, как определено выше, если VD4 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, или VD1 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, определяемый выше, если VD4 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, илиd) a heavy chain variable domain containing a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 24, a CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 27, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 28, and where V D1 is a heavy chain variable domain as defined above, if V D4 is is a light chain variable domain, or V D1 is a light chain variable domain as defined above if V D4 is a heavy chain variable domain, or

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, как определено выше, если VD3 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, или VD2 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, определяемый выше, если VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи.VD2 is a heavy chain variable domain as defined above if VD3 is a light chain variable domain, or VD2 is a light chain variable domain as defined above if V D3 is a heavy chain variable domain.

В дополнительном варианте осуществления VD1 и VD4 или VD2 и VD3 представляют собой вариабельные домены тяжелой или легкой цепи антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 представляет собой гуманизированное антитело и содержит:In a further embodiment, V D1 and V D4 or V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domains of an anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody is a humanized antibody and contains:

a) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 138 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 143 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиa) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 138 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 143 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

- 53 041572- 53 041572

b) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 171 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 158 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; илиb) a heavy chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 171 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with a sequence of SEQ ID NO: 158 or a sequence that is at least 85% identical to her; or

c) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 176 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 164 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей; или где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, как определено выше, если VD4 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, или VD1 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, определяемый выше, если VD4 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, илиc) a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 176 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 164 or a sequence that is at least 85% identical to her; or where V D1 is a heavy chain variable domain as defined above if V D4 is a light chain variable domain, or V D1 is a light chain variable domain as defined above if V D4 is a heavy chain variable domain, or

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, как определено выше, если VD3 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, или VD2 представляет собой вариабельный домен легкой цепи, определяемый выше, если VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи.V D2 is a heavy chain variable domain as defined above if V D3 is a light chain variable domain, or V D2 is a light chain variable domain as defined above if V D3 is a heavy chain variable domain.

В указанной последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176 или SEQ ID NO: 164, последовательности 6 CDR являются неизмененными по сравнению с 6 CDR, присутствующими в эталонной последовательности под SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176 или SEQ ID NO: 164.In the specified sequence, which is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176 or SEQ ID NO: 164, the 6 CDR sequences are unchanged from the 6 CDRs present in the reference sequence under SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176, or SEQ ID NO: 164.

В варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению связывается с CD3 человека. В другом варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению дополнительно связывается с CD3 Масаса fascicularis. В частности, антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом CD3 человека или CD3 как человека, так и Масаса fascicularis. Более конкретно, антитело связывается с CD3ε. Более конкретно, антителоподобный связывающий белок связывается с внеклеточным доменом CD3ε человека или человека и Масаса fascicularis. Антителоподобный связывающий белок связывается с CD3ε, когда он присутствует в форме комплекса, такого как CD3ε/δ-комплекс, или когда он присутствует в качестве отдельного белка, не важно экспрессируется ли он в виде выделенной формы или присутствует в виде растворимого внеклеточного домена или полноразмерного заякоренного в мембране CD3ε, представленного, например, в Т-клетках. Антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению является специфическим в отношении поверхностного белка CD3 человека или белков CD3 как человека, так и Масаса fascicularis, в частности, в отношении CD3ε.In an embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention binds to human CD3. In another embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention additionally binds to Macac fascicularis CD3. In particular, the antibody-like binding protein of the present invention binds to the extracellular domain of human CD3 or both human and Macac fascicularis CD3. More specifically, the antibody binds to CD3ε. More specifically, the antibody-like binding protein binds to the extracellular domain of human or human CD3ε and Macac fascicularis. An antibody-like binding protein binds to CD3ε when it is present in the form of a complex, such as a CD3ε/δ complex, or when it is present as a single protein, whether it is expressed in an isolated form or present as a soluble extracellular domain or a full-length anchored in the CD3ε membrane, present, for example, in T cells. The antibody-like binding protein of the present invention is specific for human CD3 surface protein or both human and Macac fascicularis CD3 proteins, in particular CD3ε.

Антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению характеризуется соотношением аффинности к CD3 Масаса fascicularis и аффинности к CD3 человека KD(Масаса fascicularis)/KD (человек), которое составляет <10, в частности <6, <5, <4, <3, <2, <1 или <0,5. Таким образом, антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению можно применять в токсикологических исследованиях, проводимых на обезьянах, поскольку профиль токсичности, наблюдаемый на обезьянах, соответствует ожидаемым потенциальным неблагоприятным эффектам у человека.The antibody-like binding protein of the present invention is characterized by a ratio of Macaca fascicularis CD3 affinity and human CD3 affinity KD(Macaca fascicularis)/KD (human) which is <10, in particular <6, <5, <4, <3, <2 , <1 or <0.5. Thus, the antibody-like binding protein of the present invention can be used in toxicology studies in monkeys because the toxicity profile observed in monkeys is consistent with the expected potential adverse effects in humans.

Кроме того, антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению характеризуется аффинностью (KD) к CD3 человека или CD3 Масаса fascicularis, или обоим, которая составляет <50 нМ, <40 нМ или <30 нМ, например <20 нМ, например, аффинность составляет от 0,1 до 30 нМ, в частности, составляет от 0,4 до 20 нМ или составляет от 0,4 до 15 нМ.In addition, the antibody-like binding protein of the present invention has an affinity (KD) for human CD3 or Macac fascicularis CD3, or both, which is <50 nM, <40 nM, or <30 nM, such as <20 nM, such as affinity between 0 .1 to 30 nM, in particular, is from 0.4 to 20 nM or is from 0.4 to 15 nM.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению характеризуется активацией Т-клеток, которая составляет менее 20%, менее 18%, менее 16%, менее 14%, менее 12%, менее 10% в отсутствие целевых клеток.In one embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention has a T cell activation that is less than 20%, less than 18%, less than 16%, less than 14%, less than 12%, less than 10% in the absence of target cells.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению характеризуется активацией Т-клеток, которая превышает 55%, превышает 60%, превышает 62%, превышает 64%, превышает 66%, превышает 68%, превышает 70% в присутствии целевых клеток.In one embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention has a T cell activation that is greater than 55%, greater than 60%, greater than 62%, greater than 64%, greater than 66%, greater than 68%, greater than 70% in the presence of target cells.

Низкой активацией Т-клеток в контексте антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению называют активацию Т-клеток, которая составляет менее 20%, менее 18%, менее 16%, менее 14%, менее 12%, менее 10%.Low T cell activation in the context of the antibody-like binding proteins of the present invention refers to T cell activation that is less than 20%, less than 18%, less than 16%, less than 14%, less than 12%, less than 10%.

Целевыми клетками в данном документе называют клетки, которые экспрессируют второй антиген, в одном примере целевыми клетками в данном документе называют клетки, экспрессирующие CD123, такие как клетки ТНР-1.Target cells herein refer to cells that express the second antigen, in one example, target cells herein refer to cells expressing CD123, such as THP-1 cells.

Высокой активацией Т-клеток в данном документе называют активацию Т-клеток, которая превышает 50%, превышает 55%, превышает 60%, превышает 62%, превышает 64%, превышает 66%, превышает 68%, превышает 70%.High T cell activation is herein referred to as T cell activation that is greater than 50%, greater than 55%, greater than 60%, greater than 62%, greater than 64%, greater than 66%, greater than 68%, greater than 70%.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителоподобному связывающему белку, характеризующемуся биологической и иммунологической специфичностью в отношении по меньшей мере одного дополнительного целевого антигена.In a further embodiment, the present invention provides an antibody-like binding protein having biological and immunological specificity for at least one additional target antigen.

Следовательно, в одном аспекте настоящего изобретения антителоподобный связывающий белок поTherefore, in one aspect of the present invention, the antibody-like binding protein

- 54 041572 настоящему изобретению связывается дополнительно по меньшей мере с одним целевым антигеном.- 54 041572 of the present invention binds additionally to at least one target antigen.

Соответственно, в одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению является биспецифическим и способен связывать два различных антигена-мишени или эпитопа.Accordingly, in one embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention is bispecific and capable of binding two different target antigens or epitopes.

Соответственно, в одном варианте осуществления первый иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, направленный против по меньшей мере одной дополнительной мишени, если второй иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD123, как определено в разделе Антитела к CD123 выше, или второй иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, направленный против по меньшей мере одной дополнительной мишени, если первый иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD123, как определено в разделе Антитела к CD123 выше.Accordingly, in one embodiment, the first immunoglobulin is an immunoglobulin directed against at least one additional target, if the second immunoglobulin is a single anti-CD123 antibody as defined in the Anti-CD123 section above, or the second immunoglobulin is an immunoglobulin directed against at least one additional target if the first immunoglobulin is a single anti-CD123 antibody as defined in the Anti-CD123 section above.

В одном дополнительном варианте осуществления первый иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, направленный против по меньшей мере одной дополнительной мишени, если второй иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD3, как определено в разделе Антитела к CD3 выше, или второй иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, направленный против по меньшей мере одной дополнительной мишени, если первый иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD3, как определено в разделе Антитела к CD3 выше.In one further embodiment, the first immunoglobulin is an immunoglobulin directed against at least one additional target, if the second immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody as defined in the Anti-CD3 antibodies section above, or the second immunoglobulin is an immunoglobulin directed against at least at least one additional target if the first immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody as defined in the Anti-CD3 Antibodies section above.

Антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению характеризуется эффектом вовлечения Т-клеток. Такой эффект вовлечения Т-клеток индуцирует цитотоксичность в отношении целевой клетки. В одном варианте осуществления целевая клетка представляет собой клетку, экспрессирующую CD123, такую как раковая клетка, экспрессирующая CD123, например, ТНР-1 или TF-1.The antibody-like binding protein of the present invention has a T-cell recruiting effect. This T cell recruiting effect induces cytotoxicity to the target cell. In one embodiment, the target cell is a cell expressing CD123, such as a cancer cell expressing CD123, such as THP-1 or TF-1.

Соответственно, в одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению способен вовлекать первичные Т-клетки и приводить к лизису целевых клеток in vitro, при этом (ЕС50) составляет <40 пМ, <35 пМ, например, <30 пМ.Accordingly, in one embodiment, the antibody-like binding protein of the present invention is capable of recruiting primary T cells and leading to lysis of target cells in vitro, wherein (EC 50 ) is <40 pM, <35 pM, e.g., <30 pM.

Цитотоксичностью в данном документе называют качество соединения, такого как антителоподобный связывающий белок или антитело к CD123 по настоящему изобретению, быть токсичным в отношении клеток. Цитотоксичность можно индуцировать с помощью различных механизмов действия и, таким образом, ее можно разделять на клеточно-опосредованную цитотоксичность, апоптоз, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).Cytotoxicity is herein referred to as the quality of a compound, such as an antibody-like binding protein or an anti-CD123 antibody of the present invention, to be toxic to cells. Cytotoxicity can be induced by various mechanisms of action and thus can be classified into cell-mediated cytotoxicity, apoptosis, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), or complement-dependent cytotoxicity (CDC).

Антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью или ADCC называют механизм опосредованной клетками иммунной защиты, при котором эффекторная клетка иммунной системы активно лизирует целевую клетку, у которой антигены, расположенные на поверхности мембраны, были связаны специфическими антителами.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or ADCC refers to a cell-mediated immune defense mechanism in which an effector cell of the immune system actively lyses a target cell whose membrane surface antigens have been bound by specific antibodies.

Комплемент-зависимой цитотоксичностью или CDC, в контексте настоящего изобретения, называют лизис целевой клетки в присутствии белков системы комплемента.Complement-dependent cytotoxicity or CDC, in the context of the present invention, refers to the lysis of a target cell in the presence of proteins of the complement system.

Клеточно-опосредованной цитотоксичностью называют цитолиз целевой клетки эффекторными лимфоцитами, такими как цитотоксические Т-лимфоциты или естественные клетки-киллеры, и, таким образом, ее можно разделять на цитотоксичность, опосредованную Т-клетками, и цитотоксичность под действием NK-клеток.Cell mediated cytotoxicity refers to the cytolysis of the target cell by effector lymphocytes such as cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells, and thus can be divided into T cell mediated cytotoxicity and NK cell cytotoxicity.

В одном варианте осуществления цитотоксичностью в данном документе называют клеточноопосредованную цитотоксичность, например цитотоксичность, опосредованную Т-клетками.In one embodiment, cytotoxicity is herein referred to as cell-mediated cytotoxicity, such as T-cell mediated cytotoxicity.

Кроме того, в одном варианте осуществления клеточно-опосредованной цитотоксичностью называют клеточно-опосредованную цитотоксичность под действием Т-клеток.In addition, in one embodiment, cell-mediated cytotoxicity refers to cell-mediated cytotoxicity by T cells.

Соответственно, антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению индуцирует клеточно-опосредованную цитотоксичность в целевой клетке, которая опосредуется Т-клетками.Accordingly, the antibody-like binding protein of the present invention induces cell-mediated cytotoxicity in the target cell, which is mediated by T cells.

Способы измерения цитотоксичности известны специалисту в данной области и включают применение анализа высвобождения 51-хрома (Cr), окрашивание целевых клеток в отношении живых/погибших клеток, включая окрашивание йодидом пропидия, 7-AAD и другими красителями, которые известны специалисту в данной области, обнаружение литических молекул, высвобождаемых Тклетками, в том числе гранзима и перфорина, с помощью проточной цитометрии или ELISA, обнаружение лактатдегидрогеназы (LDH), высвобождаемой в среду из поврежденных клеток, в качестве биомаркера клеточной цитотоксичности и цитолиза, обнаружение перехода CD107a на поверхность клетки, окрашивание с помощью аннексина V (кальций-зависимые фосфолипид-связывающие белки) апоптотических целевых клеток и, например, обнаружение активированной каспазы-3 (CASP3). Кроме того, специалист в данной области сможет отличить различные механизмы цитотоксичности на основании выбранного теста и на основании экспериментальной установки.Methods for measuring cytotoxicity are known to one of skill in the art and include the use of a 51-chromium (Cr) release assay, staining of target cells for live/dead cells, including staining with propidium iodide, 7-AAD and other dyes that are known to one of skill in the art, detecting lytic molecules released by T cells, including granzyme and perforin, by flow cytometry or ELISA, detection of lactate dehydrogenase (LDH) released into the medium from damaged cells as a biomarker of cellular cytotoxicity and cytolysis, detection of CD107a transfer to the cell surface, staining with using annexin V (calcium-dependent phospholipid-binding proteins) of apoptotic target cells and, for example, detection of activated caspase-3 (CASP3). In addition, one skilled in the art will be able to distinguish between different mechanisms of cytotoxicity based on the test chosen and on the basis of the experimental setup.

В одном примере клеточно-опосредованную цитотоксичность, например, можно измерять с применением CFSE для мечения целевых клеток и 7-AAD для мечения погибших клеток, как описано, например, в примере 3.2.In one example, cell-mediated cytotoxicity, for example, can be measured using CFSE to label target cells and 7-AAD to label dead cells, as described, for example, in Example 3.2.

В дополнительном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок способен связываться с CD3 и по меньшей мере одним дополнительным антигеном-мишенью, например CD123.In a further embodiment, the antibody-like binding protein is capable of binding to CD3 and at least one additional target antigen, such as CD123.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок способен подавлятьIn one embodiment, the antibody-like binding protein is capable of inhibiting

- 55 041572 функционирование этого дополнительного антигена-мишени, например CD 123.- 55 041572 the functioning of this additional target antigen, for example CD 123.

В одном аспекте настоящего изобретения антителоподобный связывающий белок связывается с CD123 человека. В другом варианте осуществления антителоподобный связывающий белок дополнительно связывается с CD123 Масаса fascicularis. В частности, антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом CD123 человека или CD123 как человека, так и Масаса fascicularis. Более конкретно, антителоподобный связывающий белок связывается с дистальным фрагментом CD123, например с аминокислотами, начиная от положения 19 до 49 CD123 человека с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 104. Антителоподобный связывающий белок связывается с CD123, не важно экспрессируется ли он в виде выделенной формы или присутствует в виде растворимого внеклеточного домена или полноразмерного заякоренного в мембране CD123, представленного в клетках, экспрессирующих CD123, таких как клетки AML или клетки, трансфицированные с помощью CD123. Антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению является специфическим в отношении клеток, которые экспрессируют белки CD123 человека или человека и Масаса fascicularis на своей поверхности, например, раковых клеток, экспрессирующих CD123.In one aspect of the present invention, the antibody-like binding protein binds to human CD123. In another embodiment, the antibody-like binding protein further binds to Macaca fascicularis CD123. In particular, the antibody-like binding protein of the present invention binds to the extracellular domain of human CD123 or both human and Macac fascicularis CD123. More specifically, the antibody-like binding protein binds to a distal fragment of CD123, such as amino acids ranging from position 19 to 49 of human CD123 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104. The antibody-like binding protein binds to CD123 whether it is expressed as an isolated form or present as a soluble extracellular domain or full-length membrane-anchored CD123 present in cells expressing CD123, such as AML cells or cells transfected with CD123. The antibody-like binding protein of the present invention is specific for cells that express human or human and Macac fascicularis CD123 proteins on their surface, such as CD123-expressing cancer cells.

Соответственно, антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению характеризуется аффинностью (KD) в отношении CD123 человека или CD123 Масаса fascicularis, или обоих, которая составляет <20 нМ, <15 нМ или <10 нМ, например < 5 нМ, например аффинность составляет от 0,01 до 5 нМ, в частности составляет от 0,1 до 5 нМ.Accordingly, the antibody-like binding protein of the present invention has an affinity (KD) for human CD123 or Macac fascicularis CD123, or both, which is <20 nM, <15 nM, or <10 nM, e.g. 01 to 5 nM, in particular is from 0.1 to 5 nM.

Соответственно, в одном варианте осуществления первый иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD3, выбранное из антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13С1-Е6, 18H11-F10, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6С9-С9, 3E8-G1, 3H6-D2, и 8Н2, или их гуманизированной формы, например антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, hz4B4 и hz20G6, а второй иммуноглобулин представляет собой антитело к CD123, выбранное из антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, и 9F6-G3.Accordingly, in one embodiment, the first immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody selected from the anti-CD3 antibodies referred to as 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2- C2, 13C1-E6, 18H11-F10, 1E6-C9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7-F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2, and 8H2, or their humanized form, such as anti-CD3 antibodies called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, hz4B4 and hz20G6, and the second immunoglobulin is an anti-CD123 antibody selected from the anti-CD123 antibodies referred to as 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5- B4, 6B10-E4, 6C10C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, and 9F6-G3.

Соответственно, в дополнительном варианте осуществления второй иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD3, выбранное из антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1Е6-С9, 10F4C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6С9-С9, 3E8-G1, 3H6-D2, и 8Н2, или их гуманизированной формы, например антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, hz4B4 и hz20G6, а первый иммуноглобулин представляет собой одно антитело к CD123, выбранное из антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, и 9F6-G3.Accordingly, in a further embodiment, the second immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody selected from the anti-CD3 antibodies referred to as 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 12D2-E5, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 18H11-F10, 1E6-C9, 10F4C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 3G5-E10, 9D7F3, 8C2-F7, 20E5-F10, 20B5-F10, 6C9-C9, 3E8-G1, 3H6-D2, and 8H2, or their humanized form, such as anti-CD3 antibodies called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7- C9, 18F5-H10, hz4B4 and hz20G6, and the first immunoglobulin is a single anti-CD123 antibody selected from the anti-CD123 antibodies referred to as 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4 , 6B10-E4, 6C10C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, and 9F6-G3.

Соответственно, в одном варианте осуществления VD1 и VD4 или VD2 и VD3 содержат вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем каждый из них определяется либо последовательностями трех CDR, либо последовательностями вариабельного домена тяжелой и легкой цепей из одного из 13 антител к CD123, называемых 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, и 9F6-G3, определяемых выше, где оба VD1 и VD4 содержат последовательности трех CDR из последовательностей вариабельного домена тяжелой и легкой цепей одного антитела к CD123, как определено выше, если оба VD2 и VD3 содержат последовательности трех CDR из последовательностей вариабельного домена тяжелой и легкой цепей одного из антител к CD3, определяемых выше, или где оба VD2 и VD3 содержат три CDR из последовательностей вариабельного домена тяжелой и легкой цепи одного антитела к CD123, как определено выше, если VD1 и VD4 содержат последовательности CDR из последовательностей вариабельного домена тяжелой и легкой цепей одного из антител к CD3, определяемых выше.Accordingly, in one embodiment, V D1 and VD4 or V D2 and V D3 comprise a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, each defined by either three CDR sequences or heavy and light chain variable domain sequences from one of 13 antibodies to CD123, called 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7- C8, and 9F6-G3 as defined above, wherein both V D1 and V D4 contain three CDR sequences from the heavy and light chain variable domain sequences of a single anti-CD123 antibody as defined above, if both V D2 and V D3 contain three CDR sequences from heavy and light chain variable domain sequences of one of the anti-CD3 antibodies as defined above, or where both VD2 and VD3 contain three CDRs from the heavy and light chain variable domain sequences of a single anti-CD123 antibody as defined above, if VD1 and VD4 contain the CDR sequences and 3 heavy and light chain variable domain sequences from one of the anti-CD3 antibodies defined above.

Соответственно, в одном варианте осуществления VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепей антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 6, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 7, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 142, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.Accordingly, in one embodiment, VD1 and VD4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 7, CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 8, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 142, CDR2-L with the sequence KVS and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11, and V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of antibodies to CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8 -F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, while both V D1 and VD2 are light chain variable domains, if both VD3 and VD4 are heavy chain variable domains , or both VD1 and VD2 are heavy chain variable domains if both VD3 and VD4 are light chain variable domains.

Соответственно, в дополнительном варианте осуществления VD2 и VD3 представляют собой вариаAccordingly, in a further embodiment, V D2 and V D3 are a variation

- 56 041572 бельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 6, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 7, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 8, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 142, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11, a VDi и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.- 56 041572 a heavy or light chain white domain of an anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain comprising CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 7, CDR3 -H with the sequence of SEQ ID NO: 8, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 142, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11, and VDi and V D4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, while both V D1 and V D2 represent are light chain variable domains if both V D3 and V D4 are heavy chain variable domains, or both V D1 and V D2 are heavy chain variable domains chains if both V D3 and V D4 are light chain variable domains.

Соответственно, в дополнительном варианте осуществления VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 14, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 184, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, '^7^8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.Accordingly, in a further embodiment, VD1 and VD4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 14, CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 15, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 184, CDR2-L with the sequence KVS and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 11, and V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of antibodies to CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8 -F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, '^7^8, 9F6-G3, as described above in section Anti-CD123 antibodies where both VD1 and VD2 are light chain variable domains if both VD3 and VD4 are t variable domains heavy chains, or both VD1 and VD2 are heavy chain variable domains if both VD3 and VD4 are light chain variable domains.

Соответственно, в дополнительном варианте осуществления VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 13, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 14, CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 184, CDR2-L с последовательностью KVS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 11, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.Accordingly, in a further embodiment, V D1 and V D4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain comprising a CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2-H with the sequence under SEQ ID NO: 14, CDR3-H with the sequence under SEQ ID NO: 15, and a light chain variable domain containing CDR1-L with the sequence under SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 184, CDR2-L with the sequence of KVS and CDR3-L with the sequence under SEQ ID NO: 11, and VD2 and VD3 represent the variable domain of the heavy or light chain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of antibodies to CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8 -F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, where both V D1 and V D2 are light chain variable domains, if both VD3 and VD4 are variable domains heavy chains, or both VD1 and VD2 are heavy chain variable domains if both VD3 and VD4 are light chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 138 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 143, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.In a further embodiment, V D1 and V D4 are the heavy or light chain variable domain of a humanized anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 138 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 143, and VD 2 and VD 3 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, with both VD1 and VD2 are light chain variable domains if both VD3 and VD4 are heavy chain variable domains, or both VD1 and VD2 are heavy chain variable domains if both VD3 and VD4 are light chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 138 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 143, a VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.In a further embodiment, V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domain of a humanized anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 138 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 143, and V D1 and V D4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, with both VD1 and VD2 are light chain variable domains if both VD3 and VD4 are heavy chain variable domains, or both VD1 and VD2 are heavy chain variable domains if both VD3 and VD4 are light chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 171 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 158, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельныйIn a further embodiment, VD1 and VD4 are the heavy or light chain variable domain of a humanized anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain of the sequence of SEQ ID NO: 171 and/or a light chain variable domain of the sequence of SEQ ID NO: 158, and V D2 and V D3 are variable

- 57 041572 домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к- 57 041572 heavy or light chain domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123 antibodies

CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8,CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8,

8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3 as described above under Antibodies to CD123, where both V D1 and V D2 are light chain variable domains if both V D3 and V D4 are variable heavy chain domains, or both V D1 and V D2 are heavy chain variable domains if both V D3 and V D4 are light chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 171 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 158, a VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.In a further embodiment, V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domain of a humanized anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 171 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 158, and V D1 and V D4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, both V D1 and V D2 are light chain variable domains if both V D3 and V D4 are heavy chain variable domains, or both VD1 and VD2 are heavy chain variable domains if both V D3 and V D4 are light chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 176 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 164, a VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.In a further embodiment, V D1 and V D4 are the heavy or light chain variable domain of a humanized anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 176 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 164, and V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, both V D1 and V D2 are light chain variable domains if both V D3 and V D4 are heavy chain variable domains, or both V D1 and V D2 are heavy chain variable domains if both V D3 and V D4 are light chain variable domains chains.

В дополнительном варианте осуществления VD2 и VD3 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи гуманизированного антитела к CD3, где указанное антитело к CD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 176 и/или вариабельный домен легкой цепи с последовательностью под SEQ ID NO: 164, a VD1 и VD4 представляют собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела к CD123, выбранного из группы, состоящей из антител к CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3В10-Е6, 5А5-В4, 6В10-Е4, 6С10-С4, 6D6-B8, 8В11-В7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, как описано выше в разделе Антитела к CD123, при этом оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, или оба VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей.In a further embodiment, V D2 and V D3 are the heavy or light chain variable domain of a humanized anti-CD3 antibody, wherein said anti-CD3 antibody comprises a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 176 and/or a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 164, and V D1 and V D4 are the heavy or light chain variable domain of an anti-CD123 antibody selected from the group consisting of anti-CD123, 3E3-D3, 1E1-G5, 2B8-F3, 2F8-D6, 3B10-E6, 5A5-B4, 6B10-E4, 6C10-C4, 6D6-B8, 8B11-B7, 9B8-G6, 9D7-C8, 9F6-G3, as described above under Antibodies to CD123, both V D1 and V D2 are light chain variable domains if both V D3 and V D4 are heavy chain variable domains, or both V D1 and V D2 are heavy chain variable domains if both V D3 and V D4 are light chain variable domains chains.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения первый или второй иммуноглобулин представляет собой антитело к CD123, 7G3. Следовательно, в одном варианте осуществления VD1 и VD4 или VD2 и VD3 содержат вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, как определено по последовательностям CDR из последовательностей вариабельного домена тяжелой и легкой цепи, антитела 7G3, как определено в данному документе ниже. В одном варианте осуществления VD1 и VD4 или VD2 и VD3 содержат вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела 7G3, описываемого в патентной заявке WO2013/173820, которая включена в данный документ посредством ссылки.According to a further aspect of the present invention, the first or second immunoglobulin is an anti-CD123, 7G3 antibody. Therefore, in one embodiment, V D1 and V D4 or VD2 and VD3 comprise a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, as determined by the CDR sequences from the heavy and light chain variable domain sequences of the 7G3 antibody, as defined herein below. In one embodiment, V D1 and V D4 or V D2 and V D3 comprise the heavy chain variable domain and the light chain variable domain of the 7G3 antibody described in patent application WO2013/173820, which is incorporated herein by reference.

Соответственно, антитело к CD123, называемое в данном документе 7G3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиAccordingly, the anti-CD123 antibody, referred to herein as 7G3, contains a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKF

KGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 312, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 375, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 376 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 377, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 312, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 375, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 376, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 377, and a light chain variable domain consisting of the sequence

DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGV

PDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 308, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 378, CDR2-L с последовательностью WAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 379.PDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 308, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 378, CDR2-L with the sequence of WAS, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 379.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения антитело 7G3 также может быть гуманизированным антителом или фрагментом гуманизированного антитела. Соответственно, в одном варианте осуществления антитело 7G3 по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное анти- 58 041572 тело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиIn a further aspect of the present invention, the 7G3 antibody may also be a humanized antibody or fragment of a humanized antibody. Accordingly, in one embodiment, the 7G3 antibody of the present invention is a humanized anti-body containing a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSNGATFYNQKFEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSNGATFYNQKF

KGQVTISADKSISТТYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 380, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 381, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 377 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 382, или вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательностиKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 380, with CDRs shown in bold) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 381, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 377, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 382, or a heavy chain variable domain consisting of the sequence

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKFEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGATFYNQKF

KGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 383, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-H с последовательностью под SEQ ID NO: 381, CDR2-H с последовательностью под SEQ ID NO: 384 и CDR3-H с последовательностью под SEQ ID NO: 382, или вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательностиKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 383, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-H with the sequence of SEQ ID NO: 381, CDR2-H with the sequence of SEQ ID NO: 384, and CDR3-H with the sequence of SEQ ID NO: 382, or a light chain variable domain consisting of the sequence

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGV

PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 385, при этом CDR показаны символами с полужирным начертанием), содержащий CDR1-L с последовательностью под SEQ ID NO: 378, CDR2-L с последовательностью WAS и CDR3-L с последовательностью под SEQ ID NO: 379.PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 385, with CDRs shown in bold characters) containing CDR1-L with the sequence of SEQ ID NO: 378, CDR2-L with the sequence of WAS, and CDR3-L with the sequence of SEQ ID NO: 379.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3ε человека и CD123 человека, содержит:In one embodiment, an antibody-like binding protein that specifically binds to human CD3ε and human CD123 comprises:

а) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 9 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 308 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 312 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 5 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, илиa) the light chain variable domain of the first immunoglobulin (V D1 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 9 or a sequence that is at least 85% identical to it, the light chain variable domain of the second immunoglobulin (V D2 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 308 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 312 or a sequence that is at least 85 % is identical to it, and the first immunoglobulin heavy chain variable domain (V D4 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 5 or a sequence that is at least 85% identical to it, or

b) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 21 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 308 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 312 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 18 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, илиb) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (V D2 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 308 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 312 or a sequence that is at least 85 % is identical to it, and the variable domain of the first immunoglobulin heavy chain (V D4 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 18 or a sequence that is at least 85% identical to it, or

c) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 308 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 312 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 12 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, илиc) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (V D2 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 308 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 312 or a sequence that is at least 85 % is identical to it, and the variable domain of the first immunoglobulin heavy chain (V D4 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 12 or a sequence that is at least 85% identical to it, or

d) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 26 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 308 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 312 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 23 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, илиd) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (VD2) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 308 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ), consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 312 or a sequence that is at least 85% identical thereto, and a first immunoglobulin heavy chain variable domain (V D4 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or a sequence that is at least 85% identical thereto, or

e) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 308 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 143 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий изe) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 308 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (VD2) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 143 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ), consisting of

- 59 041572 аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 138 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 312 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, или- 59 041572 amino acid sequence under SEQ ID NO: 138 or a sequence that is at least 85% identical to it, and the variable domain of the heavy chain of the first immunoglobulin (V D4 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 312 or a sequence that at least 85% identical to it, or

f) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 158 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 308 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 312 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 171 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей,f) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 158 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (V D2 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 308 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 312 or a sequence that is at least 85 % is identical to it, and the variable domain of the heavy chain of the first immunoglobulin (V D4 ), consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 171 or a sequence that is at least 85% identical to it,

g) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 230 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 158 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 171 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 226 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей,g) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 230 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (V D2 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 158 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 171 or a sequence that is at least 85 % is identical to it, and the variable domain of the heavy chain of the first immunoglobulin (V D4 ), consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 226 or a sequence that is at least 85% identical to it,

h) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VD1), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 385 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VD2), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 141 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VD3), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 138 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, и вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VD4), состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 383 или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична ей.h) a first immunoglobulin light chain variable domain (V D1 ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 385 or a sequence that is at least 85% identical thereto, a second immunoglobulin light chain variable domain (VD2) consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 141 or a sequence that is at least 85% identical to it, the variable domain of the heavy chain of the second immunoglobulin (V D3 ), consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 138 or a sequence that is at least 85% identical to it, and the variable domain of the heavy chain of the first immunoglobulin (VD4), consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 383 or a sequence that is at least 85% identical to it.

В указанной выше последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична эталонной последовательности (например, последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 383 или SEQ ID NO: 385), последовательности 6 CDR являются неизмененными по сравнению с 6 CDR, присутствующими в эталонной последовательности.In the above sequence that is at least 85% identical to a reference sequence (e.g., a sequence that is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 383 or SEQ ID NO: 385), the 6 CDR sequences are unchanged from with 6 CDRs present in the reference sequence.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно любому из определений а) - g) дополнительно содержит линкер L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309, L3 с аминокислотной последовательностью 'S', L4 с аминокислотной последовательностью 'RT' и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.In one embodiment, the antibody-like binding protein according to any of definitions a) - g) further comprises a linker L1 with the sequence under SEQ ID NO: 307, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309, L 3 with the amino acid sequence 'S', L 4 with the amino acid sequence 'RT' and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно любому из определений α)-g) дополнительно содержит Fc2 с последовательностью под SEQ ID NO: 327.In one embodiment, the antibody-like binding protein according to any of the definitions of α)-g) further comprises F c2 with the sequence of SEQ ID NO: 327.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно определению h) дополнительно содержит линкер L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, L3 и L4, состоящие из 0 аминокислот, и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313.In one embodiment, the antibody-like binding protein according to definition h) further comprises a linker L 1 with the sequence under SEQ ID NO: 389, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389, L 3 and L 4 consisting of 0 amino acids, and CH1 with the sequence under SEQ ID NO: 313.

В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно определению h) дополнительно содержит Fc2 с последовательностью под SEQ ID NO: 392.In one embodiment, the antibody-like binding protein as defined in h) further comprises an Fc2 with the sequence of SEQ ID NO: 392.

В одном варианте осуществления L5 из антителоподобного связывающего белка согласно любому из определений а)-h) содержит 0 аминокислот.In one embodiment, L 5 from an antibody-like binding protein according to any of definitions a)-h) contains 0 amino acids.

В дополнительном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно любому из определений а)-g) дополнительно содержит линкер L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 307, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 309, L3 с аминокислотной последовательностью S, L4 с аминокислотной последовательностью RT, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 329 и Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 330.In an additional embodiment, the antibody-like binding protein according to any of the definitions a)-g) further comprises a linker L1 with the sequence under SEQ ID NO: 307, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 309, L 3 with the amino acid sequence S, L 4 with the amino acid the sequence RT, C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 329 and F c with the sequence under SEQ ID NO: 330.

В дополнительном варианте осуществления, антителоподобный связывающий белок согласно определению h) дополнительно содержит линкер L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, L3 и L4, состоящие из О аминокислот, CHi с последовательностью под SEQ ID NO: 313 и Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 394.In an additional embodiment, the antibody-like binding protein according to definition h) further comprises a linker L1 with the sequence under SEQ ID NO: 389, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389, L 3 and L 4 consisting of O amino acids, C H i with the sequence under SEQ ID NO: 313 and F c with the sequence under SEQ ID NO: 394.

В дополнительном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок согласно определению h) дополнительно содержит Fc-stump с последовательностью под SEQ ID NO: 397 или SEQ ID NO: 398, или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 397 или SEQ ID NO: 398.In an additional embodiment, the antibody-like binding protein according to definition h) further comprises an Fc-stump with the sequence of SEQ ID NO: 397 or SEQ ID NO: 398, or a sequence that is at least 85% identical to the sequence of SEQ ID NO: 397 or SEQ ID NO: 398.

- 60 041572- 60 041572

В варианте осуществления антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3ε человека и CD123 человека, содержит или фактически состоит из:In an embodiment, the antibody-like binding protein that specifically binds to human CD3ε and human CD123 contains or actually consists of:

a) одного полипептида формулы [I], состоящего из последовательности под SEQ ID NO: 388 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310), или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 388, в которой 3 CDR из последовательности под SEQ ID NO: 378, последовательности WAS и последовательности под SEQ ID NO: 379 из вариабельного домена легкой цепи hz7G3 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385) и 3 CDR с последовательностью под SEQ ID NO: 142, последовательностью KVS и последовательностью под SEQ ID NO: 11 из вариабельного домена легкой цепи hz20G6 (VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141) являются неизмененными; иa) one polypeptide of formula [I], consisting of the sequence under SEQ ID NO: 388 (V D1 with the sequence under SEQ ID NO: 385, L1 with the sequence under SEQ ID NO: 389, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141 , L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310), or a sequence that is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 388, in which 3 CDRs from the sequence under SEQ ID NO: 378, WAS sequences and sequences under SEQ ID NO: 379 from hz7G3 light chain variable domain (VD1 with sequence under SEQ ID NO: 385) and 3 CDRs with sequence under SEQ ID NO: 142, KVS sequence and sequence under SEQ ID NO: 11 from the hz20G6 light chain variable domain (V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141) are unchanged; And

b) одного полипептида формулы [II], состоящего из последовательности под SEQ ID NO: 390 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383, L4 представляет собой 0 аминокислот, и CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313), или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 390, в которой 3 CDR из последовательностей под SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 и SEQ ID NO: 382 из вариабельного домена тяжелой цепи hz7G3 (VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383) и 3 CDR с последовательностями под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 из вариабельного домена тяжелой цепи hz20G6 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138) являются неизмененными;b) one polypeptide of formula [II], consisting of the sequence under SEQ ID NO: 390 (V D3 with the sequence under SEQ ID NO: 138, L 3 is 0 amino acids, VD4 with the sequence under SEQ ID NO: 383, L4 is 0 amino acids, and C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313), or a sequence that is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 390, in which 3 CDRs from the sequences under SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 and SEQ ID NO: 382 from the hz7G3 heavy chain variable domain (V D4 with the sequence under SEQ ID NO: 383) and 3 CDRs with the sequences under SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 from the hz20G6 heavy chain variable domain (V D3 with the sequence of SEQ ID NO: 138) are unchanged;

и при этом полипептид формулы [I] и полипептид формулы [II] образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи.wherein the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [II] form a light chain-heavy chain crossover pair.

В варианте осуществления антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3ε человека и CD123 человека, содержит или фактически состоит из:In an embodiment, the antibody-like binding protein that specifically binds to human CD3ε and human CD123 contains or actually consists of:

a) одного полипептида согласно формуле [IV] с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 391 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310, L5, который содержит 0 аминокислот, и Fc2 с последовательностью под SEQ ID NO: 392), или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 391, в которой 3 CDR из последовательности под SEQ ID NO: 378, последовательности WAS и последовательности под SEQ ID NO: 379 из вариабельного домена легкой цепи hz7G3 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385) и 3 CDR с последовательностью под SEQ ID NO: 142, последовательностью KVS и последовательностью под SEQ ID NO: 11 из вариабельного домена легкой цепи hz20G6 (VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141) являются неизмененными; иa) one polypeptide according to formula [IV] with the amino acid sequence under SEQ ID NO: 391 (V D1 with the sequence under SEQ ID NO: 385, L1 with the sequence under SEQ ID NO: 389, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141 , L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389, CL with the sequence under SEQ ID NO: 310, L 5 which contains 0 amino acids, and F c2 with the sequence under SEQ ID NO: 392), or a sequence that is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 391, in which 3 CDRs from the sequence under SEQ ID NO: 378, the WAS sequence and the sequence under SEQ ID NO: 379 from the hz7G3 light chain variable domain (V D1 with the sequence under SEQ ID NO: 385) and 3 CDRs with the sequence of SEQ ID NO: 142, the KVS sequence and the sequence of SEQ ID NO: 11 from the hz20G6 light chain variable domain (VD2 with the sequence of SEQ ID NO: 141) are unchanged; And

b) одного полипептида согласно формуле [III] с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 393 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383, причем L4 представляет собой 0 аминокислот, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313 и Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 394), или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 393, в которой 3 CDR из последовательностей под SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 и SEQ ID NO: 382 из вариабельного домена тяжелой цепи hz7G3 (VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383) и 3 CDR с последовательностями под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 из вариабельного домена тяжелой цепи hz20G6 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138) являются неизмененными;b) one polypeptide according to formula [III] with the amino acid sequence under SEQ ID NO: 393 (V D3 with the sequence under SEQ ID NO: 138, and L 3 is 0 amino acids, V D4 with the sequence under SEQ ID NO: 383, and L4 is 0 amino acids, C H1 with the sequence of SEQ ID NO: 313 and Fc with the sequence of SEQ ID NO: 394), or a sequence that is at least 85% identical to the sequence of SEQ ID NO: 393, in which 3 CDRs from the sequences of SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 and SEQ ID NO: 382 from the hz7G3 heavy chain variable domain (VD 4 with the sequence of SEQ ID NO: 383) and 3 CDRs of the sequences of SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 of hz20G6 heavy chain variable domain (V D3 with the sequence under SEQ ID NO: 138) are unchanged;

и при этом полипептид формулы [IV] и полипептид формулы [III] образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи.wherein the polypeptide of formula [IV] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair.

В указанном антителоподобном связывающем белке полипептидные цепи, представленные формулами [III] и [IV], образуют димер с помощью своих соответствующих областей Fc2 и Fc.In said antibody-like binding protein, the polypeptide chains represented by formulas [III] and [IV] form a dimer with their respective F c2 and F c regions.

В варианте осуществления антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3ε человека и CD123 человека, содержит или фактически состоит из:In an embodiment, the antibody-like binding protein that specifically binds to human CD3ε and human CD123 contains or actually consists of:

a) одного полипептида согласно формуле [I], состоящего из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 388 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310); или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 388, в которой 3 CDR из последовательности под SEQ ID NO: 378, последовательности WAS и последовательности под SEQ ID NO: 379 из вариабельного домена легкой цепи hz7G3 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385) и 3 CDR с последовательностью под SEQ ID NO: 142, последовательностью KVS и последовательностью под SEQ ID NO: 11 из вариабельного домена легкой цепи hz20G6 (VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141) являются неизмененными; иa) one polypeptide according to formula [I], consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 388 (V D1 with the sequence under SEQ ID NO: 385, L1 with the sequence under SEQ ID NO: 389, VD 2 with the sequence under SEQ ID NO: 389, VD 2 with the sequence under SEQ ID NO: : 141, L2 with the sequence of SEQ ID NO: 389 and C L with the sequence of SEQ ID NO: 310); or a sequence that is at least 85% identical to the sequence of SEQ ID NO: 388, in which 3 CDRs from the sequence of SEQ ID NO: 378, the WAS sequence and the sequence of SEQ ID NO: 379 from the hz7G3 light chain variable domain (V D1 with the sequence of SEQ ID NO: 385) and 3 CDRs with the sequence of SEQ ID NO: 142, the KVS sequence and the sequence of SEQ ID NO: 11 from hz20G6 light chain variable domain (VD2 with the sequence of SEQ ID NO: 141) are unchanged; And

- 61 041572- 61 041572

b) одного полипептида согласно формуле [III] с аминокислотной последовательностью под SEQ IDb) one polypeptide according to the formula [III] with the amino acid sequence under SEQ ID

NO: 395 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот,NO: 395 (VD 3 with the sequence under SEQ ID NO: 138, and L 3 represents 0 amino acids,

VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383, причем L4 представляет собой 0 аминокислот, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313 и Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 396), или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 395, в которой 3 CDR из последовательностей под SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 и SEQ ID NO: 382 из вариабельного домена тяжелой цепи hz7G3 (VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383) и 3 CDR с последовательностями под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 из вариабельного домена тяжелой цепи hz20G6 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138) являются неизмененными; иV D4 with the sequence under SEQ ID NO: 383, and L 4 is 0 amino acids, C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313 and F c with the sequence under SEQ ID NO: 396), or a sequence that is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 395, in which 3 CDRs from the sequences under SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 and SEQ ID NO: 382 from the hz7G3 heavy chain variable domain (V D4 with the sequence under SEQ ID NO: : 383) and 3 CDRs with the sequences under SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 from the hz20G6 heavy chain variable domain (V D3 with the sequence under SEQ ID NO: 138) are unchanged; And

с) одного Fc-stump (полипептид Fc3) с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 397 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, где указанный Fc3-stump или последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ему, образует гетеродимер с Fcобластью полипептида согласно формуле [III];c) one Fc-stump (F c3 polypeptide) with the amino acid sequence under SEQ ID NO: 397 or a sequence that is at least 85% identical to it, where the specified F c3 -stump or a sequence that is at least 85% identical him, forms a heterodimer with the Fc region of the polypeptide according to the formula [III];

и при этом полипептид формулы [I] и полипептид формулы [III] образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи.wherein the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair.

В варианте осуществления антителоподобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3ε человека и CD123 человека, содержит или фактически состоит из:In an embodiment, the antibody-like binding protein that specifically binds to human CD3ε and human CD123 contains or actually consists of:

а) одного полипептида согласно формуле [I], состоящего из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 388 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385, L1 с последовательностью под SEQ ID NO: 389, VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141, L2 с последовательностью под SEQ ID NO: 389 и CL с последовательностью под SEQ ID NO: 310) или последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 388, в которой 3 CDR из последовательности под SEQ ID NO: 378, последовательности WAS и последовательности под SEQ ID NO: 379 из вариабельного домена легкой цепи hz7G3 (VD1 с последовательностью под SEQ ID NO: 385) и 3 CDR с последовательностью под SEQ ID NO: 142, последовательностью KVS и последовательностью под SEQ ID NO: 11 из вариабельного домена легкой цепи hz20G6 (VD2 с последовательностью под SEQ ID NO: 141) являются неизмененными;a) one polypeptide according to formula [I], consisting of the amino acid sequence under SEQ ID NO: 388 (V D1 with the sequence under SEQ ID NO: 385, L1 with the sequence under SEQ ID NO: 389, V D2 with the sequence under SEQ ID NO: : 141, L2 with the sequence under SEQ ID NO: 389 and C L with the sequence under SEQ ID NO: 310) or a sequence that is at least 85% identical to the sequence under SEQ ID NO: 388, in which 3 CDRs from the sequence under SEQ ID NO: 378, WAS sequences and sequences under SEQ ID NO: 379 from hz7G3 light chain variable domain (V D1 with sequence under SEQ ID NO: 385) and 3 CDRs with sequence under SEQ ID NO: 142, KVS sequence and sequence under SEQ ID NO: 11 from the hz20G6 light chain variable domain (V D2 with the sequence under SEQ ID NO: 141) are unchanged;

b) полипептида согласно формуле III с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 399 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138, причем L3 представляет собой 0 аминокислот, VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383, причем L4 представляет собой 0 аминокислот, CH1 с последовательностью под SEQ ID NO: 313 и Fc с последовательностью под SEQ ID NO: 400), или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, в которой 3 CDR с последовательностями под SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 384 и SEQ ID NO: 382 из вариабельного домена тяжелой цепи hz7G3 (VD4 с последовательностью под SEQ ID NO: 383) и 3 CDR с последовательностями под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 из вариабельного домена тяжелой цепи hz20G6 (VD3 с последовательностью под SEQ ID NO: 138) являются неизмененными; иb) a polypeptide according to formula III with the amino acid sequence under SEQ ID NO: 399 (V D3 with the sequence under SEQ ID NO: 138, and L 3 is 0 amino acids, V D4 with the sequence under SEQ ID NO: 383, and L 4 is is 0 amino acids, C H1 with the sequence under SEQ ID NO: 313 and F c with the sequence under SEQ ID NO: 400), or a sequence that is at least 85% identical to it, in which 3 CDRs with sequences under SEQ ID NO : 381, SEQ ID NO: 384 and SEQ ID NO: 382 from hz7G3 heavy chain variable domain (VD4 with sequence under SEQ ID NO: 383) and 3 CDRs with sequences under SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 from hz20G6 heavy chain variable domain (VD3 with the sequence under SEQ ID NO: 138) are unchanged; And

c) одного Fc-stump (полипептид Fc3) с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 398 или последовательностью, которая по меньшей мере на 85% идентична ей, где указанный Fc3-stump или последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична ему, образует гетеродимер с Fcобластью полипептида согласно формуле [III];c) one Fc-stump (Fc3 polypeptide) with the amino acid sequence under SEQ ID NO: 398 or a sequence that is at least 85% identical to it, where the specified Fc3-stump or a sequence that is at least 85% identical to it, forms a heterodimer with the Fc region of the polypeptide according to the formula [III];

и при этом полипептид формулы [I] и полипептид формулы [III] образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи.wherein the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair.

Иммуноконъюгаты.Immunoconjugates.

В одном варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению является конъюгированным или связанным со средством для подавления роста, цитотоксическим средством или ферментом, активирующим пролекарство. В частности, антитела к CD123 по настоящему изобретению действительно применимы для нацеливания указанного средства для подавления роста, цитотоксического средства или пролекарства на раковые клетки, экспрессирующие или сверхэкспрессирующие CD123 на своей поверхности.In one embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention is conjugated or linked to a growth inhibitory agent, a cytotoxic agent, or a prodrug activating enzyme. In particular, the anti-CD123 antibodies of the present invention are indeed useful for targeting said growth inhibitor, cytotoxic agent, or prodrug to cancer cells expressing or overexpressing CD123 on their surface.

Нуклеиновые кислоты, векторы и рекомбинантные клетки-хозяева.Nucleic acids, vectors and recombinant host cells.

Дополнительная цель настоящего изобретения относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, кодирующей антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок, определяемые выше.A further object of the present invention relates to a nucleic acid sequence comprising or consisting of a sequence encoding an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein as defined above.

Как правило, указанная нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК или РНК, которую можно включать в любой подходящий вектор, такой как плазмида, космида, эписома, искусственная хромосома, фаг или вирусный вектор.Typically, said nucleic acid is a DNA or RNA molecule that can be incorporated into any suitable vector such as a plasmid, cosmid, episome, artificial chromosome, phage, or viral vector.

Термины вектор, клонирующий вектор и вектор экспрессии означают носитель, при помощи которого последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген) можно вводить в клеткухозяина для того, чтобы трансформировать хозяина и стимулировать экспрессию (например, транскрипцию и трансляцию) введенной последовательности.The terms vector, cloning vector, and expression vector refer to a vehicle by which a DNA or RNA sequence (eg, a foreign gene) can be introduced into a host cell in order to transform the host and stimulate expression (eg, transcription and translation) of the introduced sequence.

Так, дополнительная цель настоящего изобретения относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.Thus, a further object of the present invention relates to a vector containing the nucleic acid of the present invention.

- 62 041572- 62 041572

Такие векторы могут содержать регуляторные элементы, такие как промотор, энхансер, терминатор и т.п., которые вызывают или управляют экспрессией указанного полипептида после введения субъекту. Примеры промоторов и энхансеров, применяемых в векторе экспрессии для животной клетки, включают ранний промотор и энхансер SV40 (Mizukami Т. et al. 1987), LTR-промотор и энхансер вируса мышиного лейкоза Молони (Kuwana Y. et al. 1987), промотор (Mason J.O. et al. 1985) и энхансер (Gillies S.D. et al. 1983) H-цепи иммуноглобулина и т.п.Such vectors may contain regulatory elements, such as a promoter, enhancer, terminator, and the like, that cause or direct the expression of said polypeptide upon administration to a subject. Examples of promoters and enhancers used in an animal cell expression vector include the SV40 early promoter and enhancer (Mizukami T. et al. 1987), the Moloney murine leukemia virus LTR promoter and enhancer (Kuwana Y. et al. 1987), the ( Mason J.O. et al. 1985) and enhancer (Gillies S.D. et al. 1983) immunoglobulin H chain, and the like.

Можно применять любой вектор экспрессии для животной клетки, при условии, что ген, кодирующий С-область антитела человека, может быть вставлен и экспрессирован. Примеры подходящих векторов включают pAGE107 (Miyaji H. et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T. et al. 1987), pHSG274 (Brady G. et al. 1984), pKCR (O'Hare K. et al. 1981), pSG1 бета-d2-4-(Miyαji H. et al. 1990) и т.п. Другие примеры плазмид включают реплицирующиеся плазмиды, содержащие точку начала репликации, или интегративные плазмиды, такие как, например, pUC, pcDNA, pBR и т.п.Any expression vector for an animal cell can be used, as long as the gene encoding the C region of a human antibody can be inserted and expressed. Examples of suitable vectors include pAGE107 (Miyaji H. et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T. et al. 1987), pHSG274 (Brady G. et al. 1984), pKCR (O'Hare K. et al. 1981), pSG1 beta-d2-4- (Miyαji H. et al. 1990) and the like. Other examples of plasmids include replicating plasmids containing an origin of replication or integrative plasmids such as, for example, pUC, pcDNA, pBR, and the like.

Другие примеры вирусных векторов включают векторы на основе аденовируса, ретровируса, вируса герпеса и AAV. Такие рекомбинантные вирусы можно получить при помощи методик, известных из уровня техники, как, например, при помощи трансфекции в упаковывающие клетки или посредством транзиентной трансфекции хелперными плазмидами или вирусами. Типичные примеры клеток, упаковывающих вирус, включают клетки РА317, клетки PsiCRIP, клетки GPenv+, клетки 293 и т.д. Подробные протоколы получения таких рекомбинантных вирусов, дефектных по репликации, можно, например, найти в WO 95/14785, WO 96/22378, US 5882877, US 6013516, US 4861719, US 5278056 и WO 94/19478.Other examples of viral vectors include adenovirus, retrovirus, herpesvirus and AAV vectors. Such recombinant viruses can be obtained using techniques known in the art, such as by transfection into packaging cells or by transient transfection with helper plasmids or viruses. Representative examples of virus packaging cells include PA317 cells, PsiCRIP cells, GPenv+ cells, 293 cells, and so on. Detailed protocols for the production of such recombinant replication-deficient viruses can be found, for example, in WO 95/14785, WO 96/22378, US 5882877, US 6013516, US 4861719, US 5278056 and WO 94/19478.

Дополнительная цель настоящего изобретения относится к клетке, которая была трансфицирована, инфицирована или трансформирована нуклеиновой кислотой и/или вектором согласно настоящему изобретению.A further object of the present invention relates to a cell that has been transfected, infected or transformed with a nucleic acid and/or a vector according to the present invention.

Термин трансформация означает введение чужеродного (т.е. постороннего) гена, последовательности ДНК или РНК в клетку-хозяина таким образом, чтобы клетка-хозяин экспрессировала введенные ген или последовательность с получением требуемого вещества, как правило белка или фермента, кодируемого введенными геном или последовательностью. Клетка-хозяин, которая получила и экспрессирует введенную ДНК или РНК, становится трансформированной.The term transformation means the introduction of a foreign (i.e. foreign) gene, DNA or RNA sequence into a host cell in such a way that the host cell expresses the introduced gene or sequence to obtain the desired substance, usually a protein or enzyme encoded by the introduced gene or sequence. . A host cell that has received and expresses the introduced DNA or RNA becomes transformed.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно применять для получения рекомбинантного антитела по настоящему изобретению в подходящей системе экспрессии. Термин система экспрессии означает клетку-хозяина и совместимый вектор в условиях, подходящих, например, для экспрессии белка, закодированного чужеродной ДНК, которая находится в векторе и вводится в клетку-хозяина.The nucleic acids of the present invention can be used to produce a recombinant antibody of the present invention in a suitable expression system. The term expression system means a host cell and a compatible vector under conditions suitable, for example, for the expression of a protein encoded by foreign DNA that is in the vector and introduced into the host cell.

Стандартные системы экспрессии включают клетки-хозяева Е.coli и плазмидные векторы, клеткихозяева насекомых и векторы на основе бакуловируса, а также клетки-хозяева млекопитающих и векторы для экспрессии у них. Другие примеры клеток-хозяев включают без ограничений прокариотические клетки (такие как бактерии) и эукариотические клетки (такие как клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки и т.д.). Конкретные примеры включают Е.coli, дрожжи Kluyveromyces или Saccharomyces, линии клеток млекопитающих (например, клетки Vero, клетки СНО, клетки 3Т3, клетки COS и т.д.), а также первичные или устойчивые культуры клеток млекопитающих (например, полученные из лимфобластов, фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.д.). Примеры также включают клетку мыши SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), клетку мыши Р3Х63-Ag8.653 (АТсС CRL1580), клетку СНО, в которой ген дигидрофолатредуктазы (называемый далее ген DHFR) является дефектным (Urlaub G et al; 1980), клетку крысы YB2/3HL.Р2.G11.16Ag.20 (АТСС CRL1662, называемую далее клетка YB2/0) и т.п. Клетка YB2/0 является предпочтительной, поскольку активность ADCC химерных или гуманизированных антител усиливается при экспрессии в этой клетке.Standard expression systems include E. coli host cells and plasmid vectors, insect host cells and baculovirus vectors, and mammalian host cells and expression vectors. Other examples of host cells include, without limitation, prokaryotic cells (such as bacteria) and eukaryotic cells (such as yeast cells, mammalian cells, insect cells, plant cells, etc.). Specific examples include E. coli, Kluyveromyces or Saccharomyces yeast, mammalian cell lines (e.g., Vero cells, CHO cells, 3T3 cells, COS cells, etc.), and primary or stable mammalian cell cultures (e.g., derived from lymphoblasts). , fibroblasts, embryonic cells, epithelial cells, nerve cells, adipocytes, etc.). Examples also include mouse SP2/0-Ag14 cell (ATCC CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cell (ATcC CRL1580), CHO cell in which the dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as the DHFR gene) is defective (Urlaub G et al; 1980) , a YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 rat cell (ATCC CRL1662, hereinafter referred to as a YB2/0 cell), and the like. The YB2/0 cell is preferred because the ADCC activity of chimeric or humanized antibodies is enhanced when expressed in this cell.

В частности, для экспрессии гуманизированного антитела или антителоподобного связывающего белка вектор экспрессии может принадлежать или к типу, у которого ген, кодирующий тяжелую цепь антитела, и ген, кодирующий легкую цепь антитела, расположены на отдельных векторах, или к типу, у которого оба гена расположены на одном векторе (тандемный тип). В связи с более простым конструированием вектора экспрессии для гуманизированного антитела и антителоподобного связывающего белка, более простым введением в животные клетки и балансом между уровнями экспрессии Н- и L-цепей антитела в животных клетках тандемный тип вектора экспрессии для гуманизированного антитела является предпочтительным (Shitara K. et al. J. Immunol. Methods. 1994 Jan. 3;167 (1-2):271-8). Примеры тандемного типа вектора экспрессии для гуманизированного антитела включают pKANTEX93 (WO 97/10354), рЕЕ18 и т.п.In particular, for the expression of a humanized antibody or antibody-like binding protein, the expression vector may be either of the type in which the gene encoding the antibody heavy chain and the gene encoding the antibody light chain are located on separate vectors, or of the type in which both genes are located. on one vector (tandem type). Due to the simpler construction of the expression vector for the humanized antibody and the antibody-like binding protein, the easier introduction into animal cells, and the balance between expression levels of the H- and L-chains of the antibody in animal cells, a tandem type of expression vector for the humanized antibody is preferred (Shitara K. et al J Immunol Methods 1994 Jan 3;167(1-2):271-8). Examples of a tandem type expression vector for a humanized antibody include pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18, and the like.

Настоящее изобретение также относится к способу получения рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению, причем указанный способ включает стадии, состоящие из: (i) введения in vitro или ex vivo рекомбинантной нуклеиновой кислоты или вектора, описываемых выше, в компетентную клетку-хозяина, (ii) культивирования in vitro или ex vivo полученной рекомбинантной клеткихозяина и (iii), необязательно, отбора клеток, которые экспрессируют и/или секретируют указанное антитело.The present invention also relates to a method for producing a recombinant host cell expressing an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein of the present invention, said method comprising the steps consisting of: (i) in vitro or ex vivo administering the recombinant nucleic acid, or the vector described above into a competent host cell, (ii) in vitro or ex vivo cultivation of the resulting recombinant host cell, and (iii) optionally selecting cells that express and/or secrete said antibody.

- 63 041572- 63 041572

Такие рекомбинантные клетки-хозяева можно применять для получения антитела к CD3, по меньшей мере одного антитела к CD123 или по меньшей мере одного антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению.Such recombinant host cells can be used to produce an anti-CD3 antibody, at least one anti-CD123 antibody, or at least one antibody-like binding protein of the present invention.

Способы получения антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению.Methods for producing an antibody-like binding protein of the present invention.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения антителоподобного связывающего белка, содержащего две полипептидные цепи, которые образуют два антигенсвязывающих участка, где первый полипептид имеет структуру, представленную формулой [I]:In one embodiment, the present invention provides a method for producing an antibody-like binding protein containing two polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where the first polypeptide has the structure represented by formula [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL Щ, а второй полипептид имеет структуру, представленную формулой [II]VD1 -L 1 -V D2 - L2 -C L SC, and the second polypeptide has the structure represented by the formula [II]

VD3-L3-VD4-L4-CH1 И, где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;VD3 -L 3 -V D4 -L 4 - CH1 And, where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

VD4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C L is an immunoglobulin light chain constant domain;

CHi представляет собой константный домен CHi тяжелой цепи иммуноглобулина;C Hi is the C Hi constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L1, L 2 , L 3 and L 4 are amino acid linkers;

и при этом первый и второй полипептиды образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей.and wherein the first and second polypeptides form a light chain-heavy chain crossover pair, wherein both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are variable domains heavy chains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are heavy chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ получения антителоподобного связывающего белка, содержащего четыре полипептидные цепи, который образуют четыре антигенсвязывающих участка, где две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой [I]:In a further embodiment, the present invention provides a method for producing an antibody-like binding protein comprising four polypeptide chains that form four antigen-binding sites, wherein the two polypeptide chains have the structure represented by formula [I]:

VD1-L1-VD2-L2-CL [1], а две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой (III) V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L [ 1], and two polypeptide chains have the structure represented by formula (III)

Vd3-L3-Vd4-L4-Ch1-Fc [III], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;Vd3-L3-Vd4-L4-Ch1-Fc [III], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

V D2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

V D3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

V D4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

Cl представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C l is an immunoglobulin light chain constant domain;

Ch1 представляет собой константный домен Ch1 тяжелой цепи иммуноглобулина;C h1 is the C h1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

Fc представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;F c represents the hinge region of the immunoglobulin and constant domains CH 2 , CH 3 of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L 1 , L 2 , L 3 and L 4 are amino acid linkers;

и при этом полипептиды формулы I и полипептиды формулы III образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей.and wherein the formula I polypeptides and the formula III polypeptides form a light chain-heavy chain crossover pair, wherein both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are are heavy chain variable domains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are heavy chain variable domains.

В дополнительном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ получения антителоподобного связывающего белка, содержащего четыре полипептидные цепи, который образуют четыре антигенсвязывающих участка, где две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой [IV] VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV], а две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой [III]In a further embodiment, the present invention provides a method for producing an antibody-like binding protein comprising four polypeptide chains that form four antigen-binding sites, wherein the two polypeptide chains have the structure represented by the formula [IV] V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L -L 5 -F c2 [IV] , and two polypeptide chains have the structure represented by the formula [III]

Vd3-L3-Vd4-L4-Ch1-Fc [III], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;Vd3-L3-Vd4-L4-Ch1-Fc [III], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin;

VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin;

- 64 041572- 64 041572

VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin;

VD4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin;

CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C L is an immunoglobulin light chain constant domain;

CH1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;C H1 is the C H1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain;

Fc представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;F c represents the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

Fc2 представляет собой шарнирную область иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина из иммуноглобулина;F c2 represents the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain from immunoglobulin;

L1; L2, L3, L4 и L5 представляют собой аминокислотные линкеры;L1 ; L2, L 3 , L 4 and L 5 are amino acid linkers;

и при этом полипептиды формулы I и полипептиды формулы III образуют кроссоверную пару легкой цепи-тяжелой цепи, и при этом оба VD1 и VD2 представляют собой или вариабельные домены легких цепей, или вариабельные домены тяжелых цепей, а оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легких цепей, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легких цепей, если VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей.and wherein the formula I polypeptides and the formula III polypeptides form a light chain-heavy chain crossover pair, wherein both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are are heavy chain variable domains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are heavy chain variable domains.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первый иммуноглобулин или второй иммуноглобулин представляют собой одно антитело к CD3, как определено в разделе Антитела к CD3 выше.In one embodiment of the present invention, the first immunoglobulin or the second immunoglobulin is a single anti-CD3 antibody as defined in the Anti-CD3 Antibodies section above.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый иммуноглобулин или второй иммуноглобулин представляют собой одно антитело к CD123, как определено в разделе Антитела к CD123 выше.In another embodiment of the present invention, the first immunoglobulin or the second immunoglobulin is a single anti-CD123 antibody as defined in the Anti-CD123 section above.

Антитело к CD3, антитело к CD123 и/или антителоподобные связывающие белки по настоящему изобретению можно получать с помощью любой методики, известной из уровня техники, такой как без ограничений любая химическая, биологическая, генетическая или ферментативная методика, либо отдельно, либо в комбинации.An anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, and/or antibody-like binding proteins of the present invention can be prepared using any technique known in the art, such as, without limitation, any chemical, biological, genetic, or enzymatic technique, either alone or in combination.

Зная аминокислотную последовательность необходимой последовательности, специалист в данной области может легко получить указанные антитела или цепи иммуноглобулина с помощью стандартных методик для получения полипептидов. Например, их можно синтезировать с применением хорошо известного твердофазного метода, в частности, с применением коммерчески доступного устройства для пептидного синтеза (такого как производимый Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния), и следуя инструкциям производителя. В качестве альтернативы антитела, цепи иммуноглобулинов и антителоподобные связывающие белки по настоящему изобретению можно синтезировать с помощью методики рекомбинантной ДНК, хорошо известной из уровня техники. Например, эти фрагменты можно получать в качестве продуктов экспрессии ДНК после внедрения последовательностей ДНК, кодирующих необходимый (поли)пептид, в векторы экспрессии и введения таких векторов в подходящих эукариотических или прокариотических хозяев, которые будут экспрессировать необходимый полипептид, из которых их позже можно выделять с применением хорошо известных методик.Knowing the amino acid sequence of the desired sequence, one skilled in the art can easily prepare said antibodies or immunoglobulin chains using standard techniques for producing polypeptides. For example, they can be synthesized using a well known solid phase method, in particular using a commercially available peptide synthesis device (such as those manufactured by Applied Biosystems, Foster City, CA) and following the manufacturer's instructions. Alternatively, the antibodies, immunoglobulin chains, and antibody-like binding proteins of the present invention can be synthesized using recombinant DNA techniques well known in the art. For example, these fragments can be obtained as DNA expression products after introducing DNA sequences encoding the desired (poly)peptide into expression vectors and introducing such vectors into suitable eukaryotic or prokaryotic hosts that will express the desired polypeptide, from which they can later be isolated with using well known techniques.

В частности, настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения антител к CD3, антител к CD123 и/или антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению, причем указанный способ включает стадии, состоящие из: (i) культивирования трансформированной клеткихозяина согласно настоящему изобретению; (ii) обеспечения экспрессии указанного антитела или полипептида и (iii) извлечения экспрессированного антитела или полипептида.In particular, the present invention further relates to a method for producing anti-CD3 antibodies, anti-CD123 antibodies and/or antibody-like binding proteins of the present invention, said method comprising the steps consisting of: (i) culturing a transformed host cell according to the present invention; (ii) allowing expression of said antibody or polypeptide; and (iii) recovering the expressed antibody or polypeptide.

Антитела к CD3, антитела к CD123 и/или антителоподобные связывающие белки по настоящему изобретению надлежащим образом отделяются от культуральной среды с помощью традиционных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, белок А-сефароза, хроматография с гидроксиапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.Anti-CD3 antibodies, anti-CD123 antibodies and/or antibody-like binding proteins of the present invention are suitably separated from the culture medium by conventional immunoglobulin purification procedures such as, for example, protein A-sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.

В конкретном варианте осуществления гуманизированное химерное антитело к CD3 и/или антитело к CD123 по настоящему изобретению можно получать путем получения нуклеиновых последовательностей, кодирующих VL- и VH-домены, гуманизированные как описано ранее, конструирования вектора экспрессии для химерного антитела человека путем вставки их в вектор экспрессии для животной клетки, который несет гены, кодирующие СН антитела человека и CL антитела человека, и обеспечения экспрессии кодирующей последовательности путем введения вектора экспрессии в животную клетку. По аналогии с ним, гуманизированный антителоподобный связывающий белок можно получать с применением вместо вариабельного домена тяжелой или легкой цепи первого гуманизированного иммуноглобулина (VD1), вместо вариабельного домена тяжелой или легкой цепи второго гуманизированного иммуноглобулина (VD2), вместо вариабельного домена тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина (VD3) и вместо вариабельного домена тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина вариабельные домены тяжелой и легкой цепей двух гуманизированных антител.In a specific embodiment, a humanized chimeric anti-CD3 antibody and/or an anti-CD123 antibody of the present invention can be obtained by obtaining nucleic sequences encoding VL and VH domains humanized as previously described, constructing an expression vector for the human chimeric antibody by inserting them into the vector expression for an animal cell that carries the genes encoding the human CH antibody and the human CL antibody, and causing the expression of the coding sequence by introducing the expression vector into the animal cell. Similarly, a humanized antibody-like binding protein can be prepared by using instead of the heavy or light chain variable domain of the first humanized immunoglobulin (VD1), instead of the heavy or light chain variable domain of the second humanized immunoglobulin (VD2), instead of the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin (VD3) and instead of the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin, the heavy and light chain variable domains of two humanized antibodies.

В качестве СН-домена химерного антитела человека или СН-домена антителоподобного связываю- 65 041572 щего белка по настоящему изобретению может выступать любая область, которая принадлежит тяжелым цепям иммуноглобулина человека, но подходящими являются относящиеся к классу IgG, и также можно использовать относящиеся к любому из подклассов, принадлежащих к классу IgG, таких как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Также, в качестве CL химерного антитела человека или CL антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению может служить любая область, которая принадлежит к легким цепям иммуноглобулина человека, и можно использовать цепи, относящиеся к классу каппа или лямбда.The CH domain of the human chimeric antibody or the CH domain of the antibody-like binding protein of the present invention may be any region that belongs to the heavy chains of human immunoglobulin, but those of the IgG class are suitable, and those of any of subclasses belonging to the IgG class such as IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Also, as the CL of the human chimeric antibody or the CL of the antibody-like binding protein of the present invention, any region that belongs to human immunoglobulin light chains can be used, and chains belonging to the kappa or lambda class can be used.

Способы получения гуманизированных или химерных антител включают традиционные методики рекомбинантной ДНК и трансфекции генов, известные из уровня техники (см. Morrison S.L. et al. (1984) и патентные документы US 5202238 и US 5204244).Methods for producing humanized or chimeric antibodies include conventional recombinant DNA and gene transfection techniques known in the art (see Morrison S. L. et al. (1984) and US 5202238 and US 5204244).

Способы получения гуманизированных антител на основе традиционных методик рекомбинантной ДНК и трансфекции генов хорошо известны из уровня техники (см., например, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M.S. et al. 1985). Антитела можно гуманизировать с применением разнообразных методик, известных из уровня техники, в том числе, например, методики, раскрытой в заявке WO 2009/032661, привития CDR (ЕР 239400; публикации согласно РСТ WO 91/09967; патенты США № 5225539; 5530101 и 5585089), маскировки поверхностных остатков или изменения поверхности (ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan E.A. (1991); Studnicka G.M. et al. (1994); Roguska M.A. et al. (1994)) и шаффлинга цепей (патент США № 5565332). Общая технология рекомбинантной ДНК для получения таких антител также известна (см. европейскую патентную заявку ЕР 125023 и международную патентную заявку WO 96/02576).Methods for producing humanized antibodies based on traditional techniques of recombinant DNA and gene transfection are well known in the art (see, for example, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M.S. et al. 1985). Antibodies can be humanized using a variety of techniques known in the art, including, for example, the technique disclosed in WO 2009/032661, CDR grafting (EP 239400; PCT publications WO 91/09967; US Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101 and 5585089), masking of surface residues or surface changes (EP 592106; EP 519596; Padlan E.A. (1991); Studnicka G.M. et al. (1994); Roguska M.A. et al. (1994)) and chain shuffling (US patent No. 5565332). The general recombinant DNA technology for producing such antibodies is also known (see European patent application EP 125023 and international patent application WO 96/02576).

Fab по настоящему изобретению можно получать путем обработки антитела, которое специфически реагирует с CD3 или CD123, протеазой, такой как папаин. Также Fab можно получать путем вставки последовательностей ДНК, кодирующих обе цепи Fab из антитела, в вектор для экспрессии в эукариотической клетке или для экспрессии в эукариотической клетке и введения вектора в прокариотические или эукариотические клетки (в соответствующих случаях) для экспрессии Fab.The Fab of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically reacts with CD3 or CD123 with a protease such as papain. The Fab can also be generated by inserting DNA sequences encoding both Fab chains from the antibody into a vector for expression in a eukaryotic cell or for expression in a eukaryotic cell and introducing the vector into prokaryotic or eukaryotic cells (as appropriate) to express the Fab.

F(ab')2 по настоящему изобретению можно получать обработкой антитела, которое специфически реагирует с CD3 или CD123, протеазой, такой как пепсин. Также F(ab')2 можно получать путем связывания Fab', описанного ниже, с помощью тиоэфирной связи или дисульфидной связи.The F(ab')2 of the present invention can be produced by treating an antibody that specifically reacts with CD3 or CD123 with a protease such as pepsin. Also, F(ab')2 can be obtained by linking Fab', described below, with a thioether bond or a disulfide bond.

Fab' по настоящему изобретению можно получать обработкой F(ab')2, который специфически реагирует с CD3 или CD123, восстанавливающим средством, таким как дитиотреитол. Также Fab' можно получать путем вставки последовательностей ДНК, кодирующих цепи Fab' из антитела, в вектор для экспрессии в эукариотической клетке или в вектор для экспрессии в эукариотической клетке и введения вектора в прокариотические или эукариотические клетки (в соответствующих случаях) для осуществления его экспрессии.The Fab' of the present invention can be obtained by treating F(ab')2 which specifically reacts with CD3 or CD123, a reducing agent such as dithiothreitol. A Fab' can also be generated by inserting DNA sequences encoding Fab' chains from an antibody into a eukaryotic cell expression vector or eukaryotic cell expression vector and introducing the vector into prokaryotic or eukaryotic cells (as appropriate) to effect its expression.

scFv по настоящему изобретению можно получать путем определения последовательностей CDR или VH- и VL-доменов, описываемых ранее, конструирования ДНК, кодирующей scFv-фрагмент, вставки ДНК в вектор экспрессии для прокариотической или эукариотической клетки и затем введения вектора экспрессии в прокариотические или эукариотические клетки (в соответствующих случаях) для экспрессии scFv. Для получения гуманизированного scFv-фрагмента можно применять хорошо известную технологию, называемую привитие CDR, которая предусматривает отбор областей, определяющих комплементарность (CDR), согласно настоящему изобретению и привития их на каркас scFv-фрагмента человека с известной трехмерной структурой (см., например, WO 98/45322; WO 87/02671; US 5859205; US 5585089; US 4816567; ЕР 0173494).The scFv of the present invention can be obtained by determining the CDR or VH and VL domain sequences described previously, constructing a DNA encoding the scFv fragment, inserting the DNA into an expression vector for a prokaryotic or eukaryotic cell, and then introducing the expression vector into prokaryotic or eukaryotic cells ( where applicable) for scFv expression. To obtain a humanized scFv fragment, a well-known technique called CDR grafting can be used, which involves selecting complementarity determining regions (CDRs) of the present invention and grafting them onto a human scFv fragment scaffold with a known three-dimensional structure (see, e.g., WO 98/45322; WO 87/02671; US 5859205; US 5585089; US 4816567; EP 0173494).

Модификация антител по настоящему изобретению.Modification of the antibodies of the present invention.

Предусмотрена(ы) модификация(и) аминокислотной последовательности антител или антителоподобных связывающих белков, описываемых в данном документе. Например, может потребоваться усилить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела или антителоподобного связывающего белка. Например, известно, что когда гуманизированное антитело получают путем простого привития только CDR из VH и VL антитела, полученного из отличного от человека животного, в FR из VH и VL антитела человека, антигенсвязывающая активность может снижаться по сравнению с таковой исходного антитела, полученного из отличного от человека животного. Считается, что некоторые аминокислотные остатки VH и VL антитела животного, отличного от человека, не только в CDR, но также в FR, могут быть непосредственно или опосредованно ассоциированы с антигенсвязывающей активностью. Следовательно, замена этих аминокислотных остатков на другие аминокислотные остатки, происходящие от FR из VH и VL антитела человека, будут снижать активность связывания. Чтобы решить эту проблему, касающуюся антител человека с привитыми CDR из антител отличных от человека животных, были сделаны попытки идентифицировать в аминокислотных последовательностей FR из VH и VL антител человека аминокислотный остаток, который непосредственно ассоциирован со связыванием антитела, или который взаимодействует с аминокислотным остатком CDR, или который поддерживает трехмерную структуру антитела и который непосредственно ассоциирован со связыванием с антигеном. Сниженную антигенсвязывающую активность можно повышать путем замещения идентифицированных аминокислот аминокислотными остатками из исходного антитела, полученного из отличного от человека животного. Антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению может содержать вариабельные области гуманизированного антитела и, следовательно, рассуждения, упомянутые в данномProvided(s) modification(s) of the amino acid sequence of antibodies or antibody-like binding proteins described in this document. For example, it may be desirable to enhance the binding affinity and/or other biological properties of an antibody or antibody-like binding protein. For example, it is known that when a humanized antibody is produced by simply grafting only the CDRs from the VH and VL of an antibody derived from a non-human animal into the FR from the VH and VL of a human antibody, the antigen-binding activity may be reduced compared to that of the parent antibody derived from a non-human animal. from man to animal. It is believed that certain amino acid residues VH and VL of a non-human antibody, not only in the CDR but also in the FR, may be directly or indirectly associated with antigen-binding activity. Therefore, substitution of these amino acid residues with other amino acid residues derived from the FR from the VH and VL of the human antibody will reduce the binding activity. To solve this problem regarding human antibodies grafted with CDRs from non-human antibodies, attempts have been made to identify in the amino acid sequences of FRs from VH and VL human antibodies an amino acid residue that is directly associated with antibody binding, or that interacts with the amino acid residue of the CDR, or which maintains the three-dimensional structure of the antibody and which is directly associated with antigen binding. Reduced antigen-binding activity can be increased by substituting the identified amino acids with amino acid residues from the parent antibody derived from a non-human animal. The antibody-like binding protein of the present invention may contain the variable regions of a humanized antibody and therefore the considerations mentioned in this

- 66 041572 документе, в равной степени применимы к антителоподобным связывающим белкам по настоящему изобретению.- 66 041572 document, are equally applicable to the antibody-like binding proteins of the present invention.

Модификации и изменения можно проводить в структуре антител по настоящему изобретению и в последовательностях ДНК, кодирующих их, и при этом все еще получают функциональное антитело, антителоподобный связывающий белок или полипептид с требуемыми характеристиками.Modifications and changes can be made in the structure of the antibodies of the present invention and in the DNA sequences encoding them, and still obtain a functional antibody, antibody-like binding protein or polypeptide with the desired characteristics.

При осуществлении изменений в аминокислотных последовательностях полипептида можно учитывать индекс гидропатичности аминокислот. Важность индекса гидропатичности аминокислот в обеспечении биологической функции взаимодействия белка в целом понятна из уровня техники. Принято, что особенность относительной гидропатичности аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру полученного белка, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и т.п. Каждой аминокислоте был присвоен индекс гидропатичности на основе их характеристик гидрофобности и заряда, который составляет: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат(-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).When making changes to the amino acid sequences of a polypeptide, the hydropathic index of the amino acids can be taken into account. The importance of the hydropathic index of amino acids in providing the biological function of protein interaction is generally understood in the art. It is accepted that the feature of the relative hydropathicity of the amino acid contributes to the secondary structure of the resulting protein, which, in turn, determines the interaction of the protein with other molecules, for example, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc. Each amino acid has been assigned a hydropathic index based on their hydrophobicity and charge characteristics, which is: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine/cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate(-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9) and arginine (-4.5).

Дополнительная цель настоящего изобретению также охватывает варианты с консервативной функцией полипептидов антител к CD3, антител к CD123 и антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению.A further object of the present invention also encompasses conserved function variants of the anti-CD3 antibody, anti-CD123 antibody and antibody-like binding protein polypeptides of the present invention.

Например, определенные аминокислоты можно замещать другими аминокислотами в структуре белка без существенной потери активности. Поскольку способность к взаимодействию и природа белка определяют его биологическую функциональную активность, можно производить определенные аминокислотные замены в белковой последовательности и, конечно же, в его кодирующей последовательности ДНК, при этом все же получая белок с аналогичными свойствами. Таким образом, подразумевается, что можно производить различные изменения в последовательностях антител по настоящему изобретению или соответствующих последовательностях ДНК, которые кодируют указанные полипептиды без существенной потери их биологической активности.For example, certain amino acids can be replaced by other amino acids in the protein structure without significant loss of activity. Since the interoperability and nature of a protein determine its biological functional activity, it is possible to make certain amino acid substitutions in the protein sequence and, of course, in its DNA coding sequence, and still obtain a protein with similar properties. Thus, it is understood that it is possible to make various changes in the sequences of the antibodies of the present invention or the corresponding DNA sequences that encode these polypeptides without significant loss of their biological activity.

Из уровня техники известно, что определенные аминокислоты можно заменять другими аминокислотами, характеризующимися аналогичным индексом или баллом гидропатичности, и при этом все еще получать белок с аналогичной биологической активностью, т.е. все еще получать белок с эквивалентной биологической функцией. Также возможно применять хорошо известные технологии, такие как подходы аланинового сканирования, для идентификации в антителе или полипептиде по настоящему изобретению всех аминокислот, которые можно заменить без значительной потери связывания с антигеном. Такие остатки можно характеризовать как нейтральные, поскольку они не вовлечены в связывание антигена или в поддержание структуры антитела. В одно или несколько этих нейтральных положений можно вводить замену на аланин или другую аминокислоту без изменения основных характеристик антитела или полипептида по настоящему изобретению.It is known in the art that certain amino acids can be replaced with other amino acids having a similar hydropathic index or score and still produce a protein with similar biological activity, i.e. still receive a protein with an equivalent biological function. It is also possible to use well known techniques, such as alanine scanning approaches, to identify in an antibody or polypeptide of the present invention all amino acids that can be substituted without significant loss of antigen binding. Such residues can be characterized as neutral because they are not involved in antigen binding or in maintaining the structure of the antibody. One or more of these neutral positions can be substituted for an alanine or other amino acid without changing the essential characteristics of the antibody or polypeptide of the present invention.

Как указывалось выше, аминокислотные замены, следовательно, в целом основаны на относительном сходстве заместителей в боковой цепи аминокислоты, например их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и т.п. Иллюстративные замены, которые учитывают различные из вышеприведенных особенностей, хорошо известны специалистам в данной области и включают: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин; а также валин, лейцин и изолейцин.As stated above, amino acid substitutions are therefore generally based on the relative similarity of the substituents in the amino acid side chain, such as their hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like. Illustrative substitutions that take into account various of the above features are well known to those skilled in the art and include: arginine and lysine; glutamate and aspartate; serine and threonine; glutamine and asparagine; as well as valine, leucine and isoleucine.

Также может потребоваться модифицировать антитело к CD3, антитело к CD123 и антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению с учетом эффекторной функции, например, чтобы усилить или снизить антиген-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) антитела. Этого можно достичь путем введения одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-область антитела, в данном документе это приводит к так называемым Fc-вариантам в контексте антителоподобных связывающих белков по настоящему изобретению. В качестве альтернативы или дополнительно в Fc-область можно вводить цистеиновый остаток(ки), тем самым обеспечивая образование дисульфидной связи между цепями в данной области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может характеризоваться усиленной или сниженной способностью к интернализации и/или повышенным опосредованным комплементом цитолизом и/или антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) (Caron P.C. et al. 1992; и Shopes В. 1992).It may also be desirable to modify the anti-CD3 antibody, anti-CD123 antibody, and antibody-like binding protein of the present invention for effector function, for example, to increase or decrease the antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and/or complement-dependent cytotoxicity (CDC) of the antibody. . This can be achieved by introducing one or more amino acid substitutions in the Fc region of an antibody, herein resulting in so-called Fc variants in the context of the antibody-like binding proteins of the present invention. Alternatively or additionally, a cysteine residue(s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing the formation of a disulfide bond between chains in the region. The homodimeric antibody thus obtained may have increased or decreased internalization capacity and/or increased complement-mediated cytolysis and/or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) (Caron P.C. et al. 1992; and Shopes B. 1992).

Другой тип модификации аминокислот в антителе к CD3, антителе к CD123 и антителоподобном связывающем белке по настоящему изобретению может быть пригоден для изменения исходного паттерна гликозилирования антитела к CD3, антитела к CD123 и антителоподобного связывающего белка, т.е. путем удаления одного или нескольких углеводных фрагментов, находящихся в антителе к CD3, антителе к CD123 и антителоподобном связывающем белке, и/или путем добавления одного или нескольких участков гликозилирования, которые не присутствовали в антителе к CD3, антителе к CD123 и антителоподобном связывающем белке. Присутствие либо трипептидных последовательностей аспарагин-Хсерин и аспарагин-Х-треонин, в которых X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, создает потенциальный участок гликозилирования. Добавление участков гликозилирования вAnother type of amino acid modification in an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, and an antibody-like binding protein of the present invention may be useful to change the original glycosylation pattern of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, and an antibody-like binding protein, i. by removing one or more carbohydrate moieties found in the anti-CD3 antibody, anti-CD123 antibody, and antibody-like binding protein, and/or by adding one or more glycosylation sites that were not present in the anti-CD3 antibody, anti-CD123 antibody, and antibody-like binding protein. The presence of either the asparagine-Xserine and asparagine-X-threonine tripeptide sequences, in which X is any amino acid except proline, creates a potential glycosylation site. Adding glycosylation sites to

- 67 041572 антитело к CD3, антитело к CD123 и антителоподобный связывающий белок или удаление из них удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности, чтобы она содержала один или несколько из вышеописанных трипептидных последовательностей (в случае участков N-сцепленного гликозилирования).The anti-CD3 antibody, the anti-CD123 antibody, and the antibody-like binding protein or removal from them is conveniently accomplished by altering the amino acid sequence to contain one or more of the tripeptide sequences described above (in the case of N-linked glycosylation sites).

Другой тип модификации предусматривает удаление последовательностей, идентифицированных либо in silico, либо экспериментальным путем, как потенциально приводящих к продуктам распада в препаратах на основе антитела к CD3, антитела к CD123 и антителоподобного связывающего белка или их гетерогенности. В качестве примеров, дезамидирование аспарагинового и глутаминового остатков может происходить в зависимости от факторов, таких как рН и нахождение на поверхности. Аспарагиновые остатки особенно подвержены дезамидированию, в первую очередь когда находятся в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. Когда такой участок дезамидирования, в частности Asn-Gly, присутствует в антителе к CD3, антителе к CD123 и антителоподобном связывающем белке или полипептиде по настоящему изобретению, следовательно, может потребоваться удалить данный участок, как правило, путем осуществления консервативной замены для удаления одного из участвующих остатков. Подразумевается, что такие замены в последовательности для удаления одного или нескольких участвующих остатков также охватываются настоящим изобретением.Another type of modification involves the removal of sequences identified, either in silico or experimentally, as potentially resulting in degradation products in anti-CD3 antibody, anti-CD123 antibody, and antibody-like binding protein preparations or their heterogeneity. As examples, deamidation of aspartic and glutamine residues can occur depending on factors such as pH and surface location. Aspartic residues are particularly susceptible to deamidation, primarily when found in the Asn-Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences such as Asn-Ala. When such a deamidation site, in particular Asn-Gly, is present in an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, and an antibody-like binding protein or polypeptide of the present invention, it may therefore be necessary to remove the site, usually by making a conservative substitution to remove one of the involved leftovers. It is intended that such substitutions in sequence to remove one or more of the residues involved are also covered by the present invention.

Другой тип ковалентной модификации предусматривает химическое или ферментативное связывание гликозидов с антителом к CD3, антителом к CD123 и антителоподобным связывающим белком. Эти процедуры имеют преимущество в том, что для них не требуется получение антитела к CD3, антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка в клетке-хозяине, которые обладают способностью к гликозилированию с целью N- или О-сцепленного гликозилирования. В зависимости от применяемого режима связывания сахар(а) можно прикреплять к (а) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (d) свободным гидроксильным группами, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как фенилаланин, тирозин или триптофан, или (f) амидной группе глутамина. Например, такие способы описаны в WO 87/05330.Another type of covalent modification involves the chemical or enzymatic binding of glycosides to an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, and an antibody-like binding protein. These procedures have the advantage that they do not require the production of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein in the host cell that is glycosylated for N- or O-linked glycosylation. Depending on the binding mode employed, the sugar(s) can be attached to (a) arginine and histidine, (b) free carboxyl groups, (c) free sulfhydryl groups such as cysteine groups, (d) free hydroxyl groups such as serine groups , threonine or hydroxyproline, (e) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (f) glutamine amide group. For example, such methods are described in WO 87/05330.

Удаление любых углеводных фрагментов, присутствующих на антителе к CD3, антителе к CD123 или антителоподобном связывающем белке, можно осуществлять химическим или ферментативным путем. Для химического дегликозилирования требуется воздействие на антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок соединения трифторметансульфоновая кислота или эквивалентного соединения. Эта обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением сшивающий сахаров (N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин), при этом оставляя антитело интактным. Химическое дегликозилирование описано в Sojahr H. et al. (1987) и в Edge A.S. et al. (1981). Ферментативное отщепление углеводных фрагментов антител может достигаться с помощью применения различных эндо- и экзогликозидаз, описываемых в Thotakura N.R. et al. (1987).Removal of any carbohydrate moieties present on an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein can be accomplished chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires exposure of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein to a trifluoromethanesulfonic acid compound or equivalent. This treatment removes most or all of the sugars except for the crosslinking sugars (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine) while leaving the antibody intact. Chemical deglycosylation is described in Sojahr H. et al. (1987) and in Edge A.S. et al. (1981). Enzymatic cleavage of carbohydrate fragments of antibodies can be achieved using various endo- and exoglycosidases described in Thotakura N.R. et al. (1987).

Другой тип ковалентной модификации антитела к CD3, антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка включает связывание антитела с одним из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, с помощью способов, изложенных в патентах США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.Another type of covalent modification of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein includes binding the antibody to one of a variety of non-protein polymers, such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, using the methods set forth in US Pat. Nos. 4,640,835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 or 4179337.

Фармацевтические композиции.pharmaceutical compositions.

Антитело к CD3, антитело к CD123 и/или антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению можно объединять с фармацевтически приемлемыми наполнителями и, необязательно, матриксами для замедленного высвобождения, такими как биоразлагаемые полимеры, для образования терапевтических композиций.An anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody and/or an antibody-like binding protein of the present invention can be combined with pharmaceutically acceptable excipients and optionally sustained release matrices such as biodegradable polymers to form therapeutic compositions.

Таким образом, другая цель настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.Thus, another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Настоящее изобретение также относится к антителу к CD3, антителу к CD123 или антителоподобному связывающему белку согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата.The present invention also relates to an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein of the present invention for use as a drug. The present invention also relates to the pharmaceutical composition of the present invention for use as a drug.

Терминами фармацевтическая композиция или терапевтическая композиция, как используется в данном документе, называют соединение или композицию, способные индуцировать необходимый терапевтический эффект при введении должным образом пациенту.The terms pharmaceutical composition or therapeutic composition as used herein refer to a compound or composition capable of inducing the desired therapeutic effect when properly administered to a patient.

Такие терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать терапевтически эффективное количество антитела к CD3, антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка или их конъюгатов с лекарственным средством, в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым средством для составления, выбранным в соответствии с режимом введения.Such therapeutic or pharmaceutical compositions may contain a therapeutically effective amount of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein or drug conjugates thereof, in admixture with a pharmaceutically or physiologically acceptable formulation agent selected according to the mode of administration.

Фармацевтическими или фармацевтически приемлемыми называют молекулярные объекты и композиции, не вызывающие побочную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении млекопитающему, в частности человеку, в соответствующих случаях. Фармацевтически приемле- 68 041572 мым носителем или наполнителем называют нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий заполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное вещество для состава любого типа.Pharmaceutical or pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that do not cause an adverse, allergic or other undesirable reaction when administered to a mammal, in particular a human, as appropriate. A pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to a non-toxic solid, semi-solid, or liquid filler, diluent, encapsulating material, or excipient for any type of formulation.

Как используется в данном документе, фармацевтически приемлемые носители включают все возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают один или несколько из воды, аминокислот, солевого раствора, забуференного фосфатами солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинаций. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических средств, таких как сахара, многоатомные спирты или хлорид натрия, и состав может также содержать антиоксидант, такой как триптамин, и стабилизирующее средство, такое как Tween 20.As used herein, pharmaceutically acceptable carriers include all possible solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, and the like, which are physiologically compatible. Examples of suitable carriers, diluents and/or excipients include one or more of water, amino acids, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, as well as combinations thereof. In many cases it will be preferred to include isotonic agents such as sugars, polyhydric alcohols or sodium chloride in the composition, and the composition may also contain an antioxidant such as tryptamine and a stabilizing agent such as Tween 20.

Форма фармацевтических композиций, путь введения, дозировка и схема, разумеется, зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести болезни, возраста, массы и пола пациента и т.д.The form of pharmaceutical compositions, route of administration, dosage and regimen, of course, depend on the condition to be treated, the severity of the disease, the age, weight and sex of the patient, and so on.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно составлять для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутриглазного введения и т.п.Pharmaceutical compositions of the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraocular administration, and the like.

В частности, фармацевтические композиции содержат основы, которые являются фармацевтически приемлемыми для состава, который подлежит инъецированию. Они могут представлять собой, в частности, изотонические стерильные солевые растворы (фосфат мононатрия или динатрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т.п. или смеси таких солей) или сухие, в частности, высушенные сублимацией, композиции, которые при добавлении, в зависимости от случая, стерилизованной воды или физиологического раствора обеспечивают получение инъекционных растворов.In particular, pharmaceutical compositions contain bases that are pharmaceutically acceptable for the formulation to be injected. They may be, in particular, isotonic sterile saline solutions (monosodium or disodium phosphate, sodium, potassium, calcium or magnesium chloride, etc., or mixtures of such salts) or dry, in particular freeze-dried, compositions which, when added , depending on the case, sterilized water or saline provide injectable solutions.

Дозы, применяемые для введения, можно адаптировать в зависимости от различных параметров и, в частности, в зависимости от применяемого режима введения, от соответствующей патологии или, в качестве альтернативы, от необходимой продолжительности лечения.The doses used for administration can be adapted depending on various parameters and, in particular, depending on the mode of administration used, on the pathology concerned or, alternatively, on the required duration of treatment.

Для получения фармацевтических композиций эффективное количество антитела или иммуноконъюгата по настоящему изобретению можно растворить или диспергировать в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде.To prepare pharmaceutical compositions, an effective amount of an antibody or immunoconjugate of the present invention may be dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier or aqueous medium.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии, составы, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный раствор пропиленгликоля; а также стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы сохранялась возможность ее легкого введения через шприц. Она должна быть стабильной при условиях производства и хранения, и ее необходимо предохранять от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.Pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions, formulations including sesame oil, peanut oil, or aqueous propylene glycol; as well as sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions or dispersions for immediate administration. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that it can be easily injected through a syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage, and it must be protected from the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.

Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей можно получать в воде путем смешивания надлежащим образом с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также можно получать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В случае обычных условий хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.Solutions of the active compounds as free base or pharmacologically acceptable salts can be prepared in water by appropriate mixing with a surfactant such as hydroxypropyl cellulose. Dispersions can also be obtained in glycerol, liquid polyethylene glycols and mixtures thereof, as well as in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.

Антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению можно составлять в композицию в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот (образованные с помощью свободных аминогрупп белка), и они образуются с помощью неорганических кислот, таких как, например, соляная или фосфорная кислоты, или таких органических кислот, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные с помощью свободных карбоксильных групп, также могут быть получены за счет неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, глицин, гистидин, прокаин и т.п.An anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein of the present invention can be formulated in neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with the free amino groups of the protein) and they are formed with inorganic acids such as, for example, hydrochloric or phosphoric acid, or organic acids such as acetic, oxalic, tartaric, mandelic, etc. P. Salts formed with free carboxyl groups can also be prepared with inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium or iron hydroxides, and organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, glycine, histidine, procaine and etc.

Носитель также может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращения действия микроорганизмов можно достичь с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические средства, например сахара или хлорид натрия. Длительного всасывания инъекционных композиций можно добиться путем применения в композициях средств, задерживающих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.The carrier may also be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyhydric alcohol (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, by applying a coating such as lecithin, by maintaining the desired particle size in the case of a dispersion, and by using surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved with various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases it will be preferable to include isotonic agents such as sugars or sodium chloride. Sustained absorption of injectable compositions can be achieved by the use of absorption delaying agents in the compositions, such as aluminum monostearate and gelatin.

Стерильные инъекционные растворы получают путем включения активных соединений в требуемом количестве в соответствующий растворитель вместе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, в случае необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты изSterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compounds in the required amount in an appropriate solvent together with various other ingredients listed above, if necessary, followed by sterilization by filtration. Generally, dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile base which contains the main dispersion medium and other desired ingredients from

- 69 041572 перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительные способы получения представляют собой методики вакуумной сушки и сублимационной сушки, которые обеспечивают получение порошковой формы активного ингредиента с любым дополнительным необходимым ингредиентом из его раствора, предварительно подвергнутого стерилизации путем фильтрации.- 69 041572 listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze-drying techniques, which provide a powder form of the active ingredient with any additional necessary ingredient from its solution, previously subjected to sterilization by filtration.

Также предусмотрен препарат с более концентрированными или высококонцентрированными растворами для непосредственной инъекции, при этом считается, что применение DMSO в качестве растворителя приводит к очень быстрому проникновению, доставке высоких концентраций активных средств в небольшой участок опухоли.A formulation with more concentrated or highly concentrated solutions for direct injection is also contemplated, and the use of DMSO as a solvent is believed to result in very rapid penetration, delivering high concentrations of active agents to a small tumor site.

После составления растворы будут вводить способом, совместимым с дозированным составом, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы без труда вводят в разнообразных лекарственных формах, как, например, типах инъекционных растворов, описанных выше, но капсулы с высвобождением лекарственного средства и т.п. также можно использовать.Once formulated, the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in such amount as is therapeutically effective. The formulations are readily administered in a variety of dosage forms, such as the types of injectable solutions described above, but drug-release capsules and the like. can also be used.

Для парентерального введения в виде водного раствора, например, при необходимости, раствор следует надлежащим образом забуферить, а жидкий разбавитель вначале сделать изотоническим с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В связи с этим стерильные водные среды, которые можно использовать, будут известны специалистам в данной области в свете настоящего раскрытия. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для гиподермоклизиса, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15-е издание, стр. 1035-1038 и 1570-1580). Неизбежно будет иметь место некоторое изменение дозы в зависимости от состояния субъекта, подлежащего лечению. Лицо, ответственное за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для отдельного субъекта.For parenteral administration as an aqueous solution, for example, if necessary, the solution should be suitably buffered and the liquid diluent first made isotonic with sufficient saline or glucose. These particular aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. As such, sterile aqueous media that can be used will be known to those skilled in the art in light of the present disclosure. For example, one dose can be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and either added to 1000 ml of hypodermolysis fluid or injected at the intended infusion site (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th edition, pp. 1035-1038 and 1570 -1580). There will inevitably be some dose variation depending on the condition of the subject being treated. The person responsible for administration will in any event determine the appropriate dose for the individual subject.

В одном варианте осуществления антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению составляют в терапевтическую смесь, содержащую приблизительно 0,01-100 мг на дозу или около того.In one embodiment, an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein of the present invention is formulated into a therapeutic mixture containing about 0.01-100 mg per dose or so.

В добавление к антителу к CD3, антителу к CD123 или антителоподобному связывающему белку, составленным для парентерального введения, такого как внутривенная или внутримышечная инъекция, другие фармацевтически приемлемые формы включают, например, таблетки или другие твердые вещества для перорального введения; капсулы с замедленным высвобождением и любую другую форму, применяемую в настоящее время.In addition to an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein formulated for parenteral administration, such as intravenous or intramuscular injection, other pharmaceutically acceptable forms include, for example, tablets or other solids for oral administration; sustained release capsules; and any other form currently in use.

В определенных вариантах осуществления применение липосом и/или наночастиц предусмотрено для введения полипептидов, таких как антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок, в клетки-хозяева. Состав и применение липосом и/или наночастиц известны специалистам в данной области.In certain embodiments, the use of liposomes and/or nanoparticles is contemplated for introducing polypeptides, such as an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein, into host cells. The composition and use of liposomes and/or nanoparticles are known to those skilled in the art.

Нанокапсулы обычно могут удерживать соединения стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных внутриклеточной перегрузкой полимером, обычно разрабатывают такие сверхмелкие частицы (размером около 0,1 мкм) с применением полимеров, которые могут распадаться in vivo. Биоразлагаемые полиалкил-цианокрилатные наночастицы, которые удовлетворяют этим требованиям, предусмотрены для применения в настоящем изобретении, и такие частицы можно легко получить.Nanocapsules can usually hold compounds in a stable and reproducible way. To avoid side effects due to intracellular polymer overload, such ultrafine particles (about 0.1 μm in size) are usually designed using polymers that can degrade in vivo. Biodegradable polyalkyl cyanoacrylate nanoparticles that meet these requirements are provided for use in the present invention, and such particles can be easily obtained.

Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют многослойные концентрические двуслойные везикулы (также называемые многослойные везикулы (MLV)). MLV обычно имеют диаметр от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию малых однослойных везикул (SUV) с диаметром в диапазоне 200-500 А, содержащих водный раствор в сердцевине. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.Liposomes are formed from phospholipids that are dispersed in an aqueous medium and spontaneously form multilayer concentric bilayer vesicles (also called multilayer vesicles (MLV)). MLVs typically range in diameter from 25 nm to 4 µm. Sonication of the MLV results in the formation of small unilamellar vesicles (SUVs) with a diameter in the range of 200-500 A containing an aqueous solution in the core. The physical characteristics of liposomes depend on pH, ionic strength and the presence of divalent cations.

После того как фармацевтическая композиция составлена, ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или в виде обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие составы можно хранить либо в готовой к употреблению форме или в форме (например, лиофилизированной), требующей восстановления перед введением.Once the pharmaceutical composition has been formulated, it can be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, or as a dehydrated or lyophilized powder. Such formulations can be stored either in a ready-to-use form or in a form (eg, lyophilized) requiring reconstitution prior to administration.

Терапевтические способы и способы применения.Therapeutic methods and methods of application.

Авторы настоящего изобретения показали для некоторых биспецифических соединений по настоящему изобретению, таких как hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 и hz20G6x7G3-TL4, цитотоксичность, опосредованную Т-клетками на модели линии клеток рака, положительных по CD 123. Кроме того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали способность некоторых биспецифических соединений по настоящему изобретению активировать Т-клетки в присутствии целевых клеток, что приводит к цитотоксичности в отношении опухолевых клеток. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали низкую активацию Т-клеток или отсутствие активации Т-клеток в отсутствие целевых клеток.The present inventors have shown for some of the bispecific compounds of the present invention, such as hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 and hz20G6x7G3-TL4, T cell mediated cytotoxicity in a CD 123 positive cancer cell line model. The bispecific compounds of the present invention activate T cells in the presence of target cells, resulting in cytotoxicity against tumor cells. The present inventors also demonstrated low or no T cell activation in the absence of target cells.

Хорошо известно, что терапевтические моноклональные антитела к CD123 могут приводить к ис- 70 041572 тощению популяции клеток, несущих антиген, специфически распознаваемый антителом. Данное истощение популяции может опосредоваться, по меньшей мере, с помощью трех механизмов: антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) и непосредственное подавление роста опухоли с помощью сигналов, передаваемых через антиген, на который нацелено антитело. В одном варианте осуществления антитела к CD123 по настоящему изобретению индуцируют цитотоксичность в клетках, экспрессирующих CD123, посредством антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).It is well known that anti-CD123 therapeutic monoclonal antibodies can deplete the population of cells bearing an antigen specifically recognized by the antibody. This population depletion can be mediated by at least three mechanisms: antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), and direct suppression of tumor growth by signals transmitted through the antigen targeted by the antibody. In one embodiment, the anti-CD123 antibodies of the present invention induce cytotoxicity in cells expressing CD123 via antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement dependent cytotoxicity (CDC).

Комплемент-зависимой цитотоксичностью или CDC называют лизис целевой клетки в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется путем связывания первого компонента системы комплемента с антителами, которые связались с их соответственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить CDC-анализ, например, как описано в GazzanoSantoro et al. (1997).Complement-dependent cytotoxicity or CDC refers to the lysis of a target cell in the presence of complement. Activation of the classical complement pathway is initiated by the binding of the first component of the complement system to antibodies that have bound to their respective antigen. To assess complement activation, a CDC assay can be performed, for example, as described in GazzanoSantoro et al. (1997).

Антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью или ADCC называют форму цитотоксичности, при которой секретируемые антитела, связавшиеся с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, естественных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), позволяют этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с целевой клеткой, несущей антиген, и затем убивать целевую клетку. Для оценки активности ADCC у молекулы, представляющей интерес, можно проводить in vitro ADCC-анализ, такой как описан в патенте США № 5500362 или 5821337.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, or ADCC, is a form of cytotoxicity in which secreted antibodies bound to Fc receptors (FcRs) present on certain cytotoxic cells (eg, natural killer (NK) cells, neutrophils, and macrophages) allow these cytotoxic effector cells to specifically bind to a target cell carrying an antigen and then kill the target cell. An in vitro ADCC assay, such as described in US Pat. No. 5,500,362 or US Pat.

Как описано выше в разделе Антитела к CD3, антитела к CD3 по настоящему изобретению характеризуются низкой активацией Т-клеток, таким образом они обладают терапевтическим потенциалом у субъекта для применения в качестве иммуносупрессорного средства.As described above under Anti-CD3 Antibodies, the anti-CD3 antibodies of the present invention have low T-cell activation, thus they have therapeutic potential in a subject for use as an immunosuppressive agent.

Кроме того, антителоподобный связывающий белок, определяемый выше, направлен на усиление иммуного ответа пациента в отношении опухолей посредством нацеливания Т-клеток на опухолевые клетки. В одном варианте осуществления антителоподобный связывающий белок, определяемый выше, нацеливается на субъединицу CD3ε Т-клеточного рецептора (TCR) на поверхности Т-клетки, а другое плечо нацеливается на раковую клетку, экспрессирующую CD123, при этом такое совместное вовлечение Т-клетки и раковой клетки с помощью биспецифической конструкции приводит к образованию цитолитического синапса, который индуцирует активацию Т-клеток и приводит к цитолизу опухолевых клеток. Цитолиз опухолевых клеток может опосредоваться посредством по меньшей мере двух механизмов: цитолиз с участием перфорина/гранзима и цитолиз с участием FasL/Fas, например, цитолиз с участием перфорина/гранзима.In addition, the antibody-like binding protein as defined above aims to enhance a patient's immune response against tumors by targeting T cells to tumor cells. In one embodiment, an antibody-like binding protein as defined above is targeted to the CD3ε subunit of the T cell receptor (TCR) on the surface of the T cell and the other arm is targeted to a CD123 expressing cancer cell such that the T cell and the cancer cell are co-engaged using a bispecific construct leads to the formation of a cytolytic synapse, which induces the activation of T cells and leads to the cytolysis of tumor cells. Cytolysis of tumor cells can be mediated by at least two mechanisms: perforin/granzyme-mediated cytolysis and FasL/Fas-mediated cytolysis, eg, perforin/granzyme-mediated cytolysis.

Следовательно, в одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела к CD3, антитела к CD123, антителоподобного связывающего белка или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, определяемой выше в разделе Фармацевтическая композиция.Therefore, in one embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing a disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, an antibody-like binding protein, or a pharmaceutical composition of the present invention as defined above in section Pharmaceutical composition.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению антитела к CD3, антитела к CD123, антителоподобного связывающего белка или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания или нарушения у субъекта. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится в применению антитела к CD3, антитела к CD123, антителоподобного связывающего белка или фармацевтической композиции для лечения или предупреждения заболевания или нарушения у субъекта.The present invention further relates to the use of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, an antibody-like binding protein or a pharmaceutical composition of the present invention for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a disease or disorder in a subject. In one embodiment, the present invention relates to the use of an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, an antibody-like binding protein, or a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a disease or disorder in a subject.

Термин субъект или индивидуум применяются взаимозаменяемо и могут обозначать, например, человека или отличное от человека млекопитающее. Например, субъект представляет собой летучую мышь; хорька; кролика; представителя кошачьих (кошку); представителя собачьих (собаку); примата (обезьяну), представителя лошадиных (лошадь); человека, включая мужчину, женщину и ребенка. В одном варианте осуществления субъектом называют человека.The terms subject or individual are used interchangeably and may refer to, for example, a human or a non-human mammal. For example, the subject is a bat; ferret; a rabbit; feline representative (cat); canine representative (dog); primate (monkey), equine representative (horse); person, including man, woman and child. In one embodiment, the subject is a human.

В контексте настоящего изобретения термином осуществление лечения или лечение называют терапевтическое применение (т.е. у субъекта, имеющего данное заболевание), и он означает обращение, облегчение, подавление прогрессирования одного или нескольких симптомов такого нарушения или состояния. Следовательно, лечением называют не только лечение, которое приводит к полному излечению заболевания, но также виды лечения, которые замедляют прогрессирование заболевания и/или продлевают выживание субъекта.In the context of the present invention, the term treatment or treatment refers to therapeutic use (i.e., in a subject having a given disease), and it means the reversal, alleviation, suppression of the progression of one or more symptoms of such a disorder or condition. Therefore, a treatment refers not only to a treatment that leads to a complete cure of a disease, but also to treatments that slow down the progression of the disease and/or prolong the survival of the subject.

Под предупреждением подразумевают профилактическое применение (т.е. субъекта, подверженного развитию данного заболевания).By prevention is meant prophylactic use (ie, a subject susceptible to the development of a given disease).

В одном варианте осуществления заболевание или нарушение представляет собой любое состояние, которое получит пользу от лечения с помощью антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления оно включает хронические или острые нарушения или заболевания, в том числе такие патологические состояния, которые предрасполагают субъекта к нарушениям, о которых идет речь. Термином нуждающийся в лечении называют субъекта, у которого уже имеется заболевание, а также тех, у которых нарушение следует пре- 71 041572 дупредить.In one embodiment, the disease or disorder is any condition that would benefit from treatment with an anti-CD123 antibody or antibody-like binding protein of the present invention. In one embodiment, it includes chronic or acute disorders or diseases, including those pathological conditions that predispose the subject to the disorders in question. The term in need of treatment refers to a subject who already has a disease, as well as those in whom the disorder should be prevented.

В одном варианте осуществления заболевание или нарушение представляет собой любое состояние, которое получит пользу от лечения с помощью антитела к CD3 по настоящему изобретению.In one embodiment, the disease or disorder is any condition that would benefit from treatment with an anti-CD3 antibody of the present invention.

Следовательно, в одном варианте осуществления оно включает заболевания или нарушения, характеризующиеся патологическими иммунными ответами.Therefore, in one embodiment, it includes diseases or disorders characterized by abnormal immune responses.

В контексте настоящего изобретения патологический иммунный ответ представляет собой воспалительный иммунный ответ.In the context of the present invention, an abnormal immune response is an inflammatory immune response.

В одном варианте осуществления заболевание, характеризующееся патологическим иммунным ответом, представляет собой аутоиммунные заболевания, заболевания, связанные с трансплантацией, или заболевания, ассоциированные с воспалением.In one embodiment, the disease characterized by an abnormal immune response is an autoimmune disease, a disease associated with transplantation, or a disease associated with inflammation.

Аутоиммунное заболевание представляет собой, например, болезнь Крона, язвенный колит и диабет 1 типа или заболевание, связанное с трансплантацией, такое как реакция трансплантат против хозяина (GVHD).The autoimmune disease is, for example, Crohn's disease, ulcerative colitis, and type 1 diabetes, or a transplant-associated disease such as graft-versus-host disease (GVHD).

Следовательно, в одном варианте осуществления субъект был диагностирован как страдающий от заболевания или нарушения, характеризующихся патологическим иммунным ответом.Therefore, in one embodiment, the subject has been diagnosed as suffering from a disease or disorder characterized by an abnormal immune response.

В одном варианте осуществления субъект был диагностирован, как страдающий от аутоиммунного заболевания.In one embodiment, the subject has been diagnosed as suffering from an autoimmune disease.

В другом варианте осуществления нарушением называют рак.In another embodiment, the disorder is referred to as cancer.

В дополнительном варианте осуществления рак относится к гемобластозу, в частности, к гемобластозу, ассоциированному с экспрессией CD123.In an additional embodiment, cancer refers to hemoblastosis, in particular hemoblastosis associated with the expression of CD123.

В одном варианте осуществления экспрессию CD123 раковыми клетками легко проанализировать, например, с применением антитела к CD123 согласно настоящему изобретению, как описано в следующем разделе Диагностические способы применения.In one embodiment, expression of CD123 by cancer cells is readily assayed, for example, using an anti-CD123 antibody of the present invention, as described in the following section, Diagnostic Applications.

Гемобластозы, ассоциированные с экспрессией CD123 включают типы лейкоза (такие как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, злокачественный ретикулоэндотелиоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), системный мастоцитоз, включая типы лимфом (такие как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома).Hemoblastoses associated with CD123 expression include types of leukemia (such as acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphoblastic leukemia, malignant reticuloendotheliosis, and myelodysplastic syndrome) and malignant lymphoproliferative conditions, blast plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN), systemic mastocytosis, including types of lymphomas (such as multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, and small and large cell follicular lymphoma).

Как описано выше в разделе Антитела к CD123, LSC экспрессируют CD123.As described above under Anti-CD123 Antibodies, LSCs express CD123.

Таким образом, в близком варианте осуществления раком называют гемобластоз, ассоциированный с лейкозными стволовыми клетками.Thus, in a related embodiment, cancer refers to hemoblastosis associated with leukemic stem cells.

Состояния гемобластозов, ассоциированных с лейкозными стволовыми клетками (LSC), которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают типы лейкозов (такие как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая типы лимфом (такие как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома).Leukemic stem cell (LSC) associated hemoblastosis conditions that can be treated in accordance with the present invention include types of leukemias (such as acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphoblastic leukemia, and myelodysplastic syndrome) and malignant lymphoproliferative conditions. , including types of lymphomas (such as multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, and small cell and large cell follicular lymphoma).

В одном аспекте настоящего изобретения гемобластоз представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML).In one aspect of the present invention, the hemoblastosis is acute myeloid leukemia (AML).

В одном варианте осуществления субъект был диагностирован как страдающих от AML.In one embodiment, the subject has been diagnosed as suffering from AML.

В дополнительном варианте осуществления субъект уже подвергался лечению с помощью химиотерапии до полной ремиссии, но у него произошел рецидив.In a further embodiment, the subject has already been treated with chemotherapy to complete remission but has relapsed.

Рецидив определяется как повторный случай AML после полной ремиссии.Relapse is defined as a recurrence of AML after complete remission.

Полная ремиссия или CR определяется следующим образом: нормальные значения числа нейтрофилов (>1,0*109/л), уровня гемоглобина 10 г/дл и количества тромбоцитов (>100*109/л) и отсутствие потребности в трансфузии эритроцитов; бластных клеток менее 5%, отсутствие кластеров или скоплений бластных клеток и отсутствие телец Ауэра при исследовании костного мозга; а также нормальное созревание клеток крови (морфология; миелограмма) и отсутствие экстрамедуллярного лейкоза.Complete remission or CR is defined as follows: normal neutrophil count (>1.0*10 9 /l), hemoglobin level 10 g/dl and platelet count (>100*10 9 /l) and no need for red blood cell transfusion; less than 5% blast cells, no clusters or clusters of blast cells, and no Auer bodies on bone marrow examination; as well as normal maturation of blood cells (morphology; myelogram) and absence of extramedullary leukemia.

В одном варианте осуществления антитело к CD3, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению применяют отдельно или в комбинации с любым подходящим средством для подавления роста.In one embodiment, an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein of the present invention is used alone or in combination with any suitable growth inhibitor.

Под терапевтически эффективным количеством полипептида по настоящему изобретению подразумевают количество полипептида, достаточное для лечения указанного ракового заболевания, при приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому терапевтическому лечению. Будет, однако, понятно, что общее суточное количество применяемых полипептидов и композиций по настоящему изобретению будет определяться лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. Конкретный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, включающих нарушение, подвергаемое лечению, и тяжесть нарушения; активность конкретного используемого полипептида; конкретную используемую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, путь введения и скорость экскреции кон- 72 041572 кретного используемого полипептида; продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретным используемым полипептидом; и подобные факторы, хорошо известные в области медицины. Например, в рамках компетентности в данной области техники хорошо известно, что следует начинать с доз соединения на уровнях, ниже чем требуются для достижения необходимого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозировку, пока не достигнут необходимого эффекта.By a therapeutically effective amount of a polypeptide of the present invention is meant an amount of the polypeptide sufficient to treat said cancer at an acceptable benefit/risk ratio applicable to any therapeutic treatment. It will be understood, however, that the total daily amount of polypeptides and compositions of the present invention to be used will be determined by the attending physician within the bounds of sound medical judgment. The specific therapeutically effective dose level for any particular patient will depend on a number of factors including the disorder being treated and the severity of the disorder; the activity of the particular polypeptide used; the specific composition used, age, body weight, general health, sex and diet of the patient; the time of administration, route of administration, and rate of excretion of the particular polypeptide used; duration of treatment; drugs used in combination or simultaneously with the specific polypeptide used; and similar factors well known in the medical field. For example, it is well known within the skill in the art to start with doses of the compound at levels lower than those required to achieve the desired therapeutic effect and gradually increase the dosage until the desired effect is achieved.

В одном варианте осуществления эффективность лечения с помощью антитела к CD3, антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка по настоящему изобретению или иммуноконъюгата согласно настоящему изобретению легко проанализировать in vivo, например, на мышиной модели рака и с помощью измерения, например, изменений объема опухоли между группой лечения и контрольной группой.In one embodiment, the effectiveness of treatment with an anti-CD3 antibody, an anti-CD123 antibody, or an antibody-like binding protein of the present invention or an immunoconjugate of the present invention is readily analyzed in vivo, for example, in a mouse model of cancer, and by measuring, for example, changes in tumor volume between groups treatment and control group.

Диагностические способы примененияDiagnostic applications

Сообщалось, что CD123 сверхэкспрессируется на поверхности различных гематологических новообразований.It has been reported that CD123 is overexpressed on the surface of various hematological neoplasms.

Следовательно, CD123 является маркером рака и, следовательно, обладает потенциалом применения для измерения эффективности противораковой терапии или обнаружения рецидива заболевания.Therefore, CD123 is a marker of cancer and therefore has the potential to be used to measure the effectiveness of anti-cancer therapy or detect disease recurrence.

В варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению применяют в качестве компонента анализа в контексте терапии, нацеленной на опухоли, экспрессирующие CD123, чтобы определить восприимчивость пациента к терапевтическому средству, отслеживания эффективности противораковой терапии или обнаружения рецидива заболевания после лечения. В частности, одно и то же антитело к CD123 по настоящему изобретению применяют как в качестве компонента терапевтического средства, так и в качестве компонента диагностического анализа.In an embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention is used as a component of an assay in the context of therapy targeting tumors expressing CD123 to determine a patient's responsiveness to a therapeutic agent, monitor the effectiveness of an anti-cancer therapy, or detect disease recurrence after treatment. In particular, the same anti-CD123 antibody of the present invention is used both as a component of a therapeutic agent and as a component of a diagnostic assay.

Таким образом, дополнительная цель настоящего изобретения относится к антителу к CD123 согласно настоящему изобретению для применения в in vivo обнаружении экспрессии CD123 у субъекта или для применения в ex vivo обнаружении экспрессии CD123 в биологическом образце от субъекта. В одном варианте осуществления указанное обнаружение предназначено, в частности, для:Thus, a further object of the present invention relates to an anti-CD123 antibody of the present invention for use in in vivo detection of CD123 expression in a subject or for use in ex vivo detection of CD123 expression in a biological sample from a subject. In one embodiment, the specified detection is intended, in particular, for:

a) диагностики наличия рака у субъекта, илиa) diagnosing the presence of cancer in the subject, or

b) определения восприимчивости пациента, имеющего рак, к терапевтическому средству, нацеливающемуся на CD123, в частности, антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка согласно настоящему изобретению, илиb) determining the susceptibility of a patient having cancer to a CD123-targeting therapeutic agent, in particular an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein of the present invention, or

c) отслеживания эффективности терапии рака, направленной на CD123, или обнаружения рецидива рака после терапии рака, направленной на CD123, в частности, в случае терапии с помощью антитела к CD123 или антителоподобного связывающего белка согласно настоящему изобретению; путем обнаружения экспрессии поверхностного белка CD123 на опухолевых клетках.c) monitoring the effectiveness of CD123-targeted cancer therapy or detecting cancer recurrence after CD123-targeted cancer therapy, in particular in the case of therapy with an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein of the present invention; by detecting CD123 surface protein expression on tumor cells.

В варианте осуществления антитело предусмотрено для применения in vitro или ex vivo. Например, CD123 обнаруживают in vitro или ex vivo в биологическом образце, полученном от субъекта, с применением антитела к CD123 по настоящему изобретению. Применение согласно настоящему изобретению также может представлять собой in vivo применение. Например, антитело к CD123 или антителоподобный связывающий белок согласно настоящему изобретению вводят субъекту и комплексы антителоклетки обнаруживают и/или оценивают количественно, при этом обнаружение указанных комплексов служит признаком рака.In an embodiment, the antibody is provided for in vitro or ex vivo use. For example, CD123 is detected in vitro or ex vivo in a biological sample obtained from a subject using an anti-CD123 antibody of the present invention. The use according to the present invention may also be an in vivo use. For example, an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein of the present invention is administered to a subject and antibody cell complexes are detected and/or quantified, the detection of these complexes being indicative of cancer.

Настоящее изобретение дополнительно относится к in vitro или ex vivo способу обнаружения наличия рака у субъекта, включающему стадии, состоящие из:The present invention further relates to an in vitro or ex vivo method for detecting the presence of cancer in a subject, comprising the steps consisting of:

(a) приведения биологического образца от субъекта в контакт с антителом к CD123 согласно настоящему изобретению, в частности, в условиях, подходящих для того, чтобы антитело образовало комплексы с указанным биологическим образцом;(a) bringing a biological sample from the subject into contact with the antibody to CD123 according to the present invention, in particular, under conditions suitable for the antibody to form complexes with the specified biological sample;

(b) измерения уровня антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, (c) обнаружения наличия рака путем сравнения измеренного уровня связавшегося антитела с контролем, при этом повышенный уровень связавшегося антитела по сравнению с контролем служит признаком рака.(b) measuring the level of antibody bound to said biological sample, (c) detecting the presence of cancer by comparing the measured level of bound antibody to a control, wherein an increased level of bound antibody compared to the control is indicative of cancer.

Настоящее изобретение также относится к in vitro или ex vivo способу определения восприимчивости пациента, имеющего рак, к терапевтическому средству, нацеливающемуся на CD123, в частности, к антителу к CD123 или антителоподобному связывающему белку согласно настоящему изобретению, причем способ включает стадии, состоящие из:The present invention also relates to an in vitro or ex vivo method for determining the susceptibility of a patient having cancer to a therapeutic agent targeting CD123, in particular an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein according to the present invention, the method comprising the steps consisting of:

(a) приведения биологического образца от пациента, имеющего рак, в контакт с антителом к CD123 согласно настоящему изобретению, в частности, в условиях, подходящих для того, чтобы антитело образовало комплексы с указанным биологическим образцом;(a) contacting a biological sample from a patient with cancer with an anti-CD123 antibody of the present invention, in particular under conditions suitable for the antibody to form complexes with said biological sample;

(b) измерения уровня антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, (c) сравнения измеренного уровня антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, с уровнем антитела, связавшегося с контролем;(b) measuring the level of antibody bound to said biological sample, (c) comparing the measured level of antibody bound to said biological sample with the level of antibody bound to a control;

- 73 041572 где повышенный уровень антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, по сравнению с контролем служит признаком того, что пациент является восприимчивым к терапевтическому средству, нацеливающемуся по меньшей мере на CD123.- 73 041572 where an increased level of antibody bound to the specified biological sample, compared with the control is an indication that the patient is susceptible to a therapeutic agent that targets at least CD123.

В вышеуказанным способах указанный контроль может представлять собой нормальный, не содержащий раковых клеток биологический образец того же типа, или эталонное значение, определенное типичное значение уровня связывания антитела в нормальном биологическом образце того же типа.In the above methods, said control may be a normal, cancer-free biological sample of the same type, or a reference value, a determined typical value of the level of antibody binding in a normal biological sample of the same type.

В варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению пригодно в диагностике гемобластозов, ассоциированных с экспрессией CD123, включая типы лейкозов (такие как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, злокачественный ретикулоэндотелиоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), системный мастоцитоз, включая типы лимфомы (такие как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома).In an embodiment, the anti-CD123 antibody of the present invention is useful in diagnosing hematological malignancies associated with CD123 expression, including types of leukemias (such as acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphoblastic leukemia, malignant reticuloendotheliosis, and myelodysplastic syndrome) and malignant lymphoproliferative diseases. conditions, blast plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN), systemic mastocytosis, including types of lymphoma (such as multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, and small and large cell follicular lymphoma).

Настоящее изобретение дополнительно относится к in vitro или ex vivo способу отслеживания эффективности терапии рака, направленной на CD123, включающему стадии, состоящие из:The present invention further relates to an in vitro or ex vivo method for monitoring the effectiveness of CD123-targeted cancer therapy, comprising the steps consisting of:

(a) приведения биологического образца от субъекта, проходящего терапию рака, направленную на CD123, в контакт с антителом к CD123 или антителоподобным связывающим белком согласно настоящему изобретению, в частности, в условиях, подходящих для того, чтобы антитело образовало комплексы с указанным биологическим образцом;(a) contacting a biological sample from a subject undergoing CD123-targeted cancer therapy with an anti-CD123 antibody or antibody-like binding protein of the present invention, in particular under conditions suitable for the antibody to form complexes with said biological sample;

(b) измерения уровня антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, (c) сравнения измеренного уровня связавшегося антитела с уровнем антитела, связавшегося с контролем;(b) measuring the level of antibody bound to said biological sample, (c) comparing the measured level of bound antibody with the level of antibody bound to the control;

где сниженный уровень антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, по сравнению с контролем служит признаком эффективности указанной терапии рака, направленной на CD123.wherein a reduced level of antibody bound to said biological sample compared to a control is indicative of the efficacy of said CD123-targeted cancer therapy.

В указанном способе повышенный уровень антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, по сравнению с контролем служит признаком неэффективности указанной терапии рака, направленной на CD123.In said method, an increased level of antibody bound to said biological sample compared to a control is indicative of failure of said CD123-targeted cancer therapy.

Указанный контроль представляет собой, в частности, биологический образец того же типа, что и биологический образец, предоставленный для анализа, но который был получен от субъекта ранее по времени, в ходе терапии рака, направленной на CD123.The specified control is, in particular, a biological sample of the same type as the biological sample provided for analysis, but which was obtained from the subject earlier in time, during cancer therapy aimed at CD123.

Настоящее изобретение дополнительно относится к in vitro или ex vivo способу обнаружения рецидива рака после терапии рака, направленной на CD123, включающему стадии, состоящие из:The present invention further relates to an in vitro or ex vivo method for detecting cancer recurrence after cancer therapy directed at CD123, comprising the steps consisting of:

(a) приведения биологического образца от субъекта, закончившего терапию рака, направленную на CD123, в контакт с антителом к CD123 или антителоподобным связывающим белком согласно настоящему изобретению, в частности, в условиях, подходящих для того, чтобы антитело образовало комплексы с указанным биологическим образцом;(a) contacting a biological sample from a subject who has completed CD123-targeted cancer therapy with an anti-CD123 antibody or antibody-like binding protein of the present invention, in particular under conditions suitable for the antibody to form complexes with said biological sample;

(b) измерения уровня антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, (c) сравнения измеренного уровня связавшегося антитела с уровнем антитела, связавшегося с контролем;(b) measuring the level of antibody bound to said biological sample, (c) comparing the measured level of bound antibody with the level of antibody bound to the control;

где повышенный уровень антитела, связавшегося с указанным биологическим образцом, по сравнению с контролем служит признаком рецидива рака после терапии рака, направленной на CD123.where an increased level of antibody bound to the specified biological sample, compared with the control is indicative of cancer recurrence after cancer therapy directed to CD123.

Указанный контроль представляет собой, в частности, биологический образец того же типа, что и биологический образец, предоставленный для анализа, но который был получен от субъекта ранее по времени, в момент завершения или после завершения терапии рака, направленной на CD123.The specified control is, in particular, a biological sample of the same type as the biological sample provided for analysis, but which was obtained from the subject earlier in time, at the time of completion or after completion of cancer therapy directed to CD123.

Указанная терапия рака, направленная на CD123, представляет собой, в частности, терапию с применением антитела к CD123, или антителоподобного связывающего белка, или иммуноконъюгата согласно настоящему изобретению. Указанная терапия рака, направленная на CD123, нацелена рак, экспрессирующий CD123, в частности, гемобластоз, ассоциированный с экспрессией CD123, включая типы лейкоза (такие как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, злокачественный ретикулоэндотелиоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), системный мастоцитоз, включая типы лимфомы (такие как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома).Said cancer therapy directed to CD123 is, in particular, therapy using an anti-CD123 antibody or an antibody-like binding protein or an immunoconjugate according to the present invention. Said CD123-targeted cancer therapy targets CD123-expressing cancer, in particular CD123-expressing hemoblastosis, including types of leukemia (such as acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphoblastic leukemia, malignant reticuloendotheliosis, and myelodysplastic syndrome) and malignant lymphoproliferative conditions, blast plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN), systemic mastocytosis, including types of lymphoma (such as multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, and small and large cell follicular lymphoma).

В варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению является меченным обнаруживаемой молекулой или веществом, таким как флуоресцентная молекула, радиоактивная молекула или любая другая метка, известная тем, что она обеспечивает (либо непосредственно, либо опосредованно) сигнал.In an embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention is labeled with a detectable molecule or substance, such as a fluorescent molecule, a radioactive molecule, or any other label known to provide (either directly or indirectly) a signal.

Как используется в данном документе, термин меченое, в отношении антитела к CD123 согласно настоящему изобретению, подразумевается как охватывающий прямое мечение антитела к CD123 путемAs used herein, the term labeled, in relation to an anti-CD123 antibody of the present invention, is meant to encompass direct labeling of an anti-CD123 antibody by

- 74 041572 связывания (т.е. физического соединения) обнаруживаемого вещества, такого как радиоактивное средство или флуорофор (например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), или фикоэритрин (РЕ), или индоцианин (Су5)) с полипептидом, а также непрямое мечение полипептида вследствие способности реагировать с обнаруживаемым веществом.- 74 041572 binding (i.e. a physical connection) of a detectable substance, such as a radioactive agent or a fluorophore (for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), or phycoerythrin (PE), or indocyanine (Cy5)) with a polypeptide, as well as indirect labeling of the polypeptide due to ability to react with the substance to be detected.

В дополнительном варианте осуществления антитело к CD123 по настоящему изобретению является меченным радиоактивной молекулой с помощью любого способа, известного из уровня техники. Например, радиоактивные молекулы включают без ограничений радиоактивные атомы для сцинтиграфических исследований, такие как I123, I124, In111, Re186, Re188, Тс99. В одном примере полипептиды по настоящему изобретению также являются меченными с помощью спиновой метки для визуализации посредством ядерного магнитного резонанса (NMR) (также известного как магнитно-резонансная томография, MRI), такой как йод-123, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.In a further embodiment, an anti-CD123 antibody of the present invention is labeled with a radioactive molecule using any method known in the art. For example, radioactive molecules include, without limitation, radioactive atoms for scintigraphy studies, such as I 123 , I 124 , In 111 , Re 186 , Re 188 , Tc 99 . In one example, the polypeptides of the present invention are also labeled with a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, MRI), such as iodine-123, indium-111, fluorine-19, carbon -13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

Биологический образец охватывает множество типов образцов, получаемых от субъекта, и его можно использовать в диагностическом или мониторинговом анализе. Биологические образцы включают без ограничения кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы плотных тканей, такие как биоптат, или тканевые культуры, или клетки, полученные из них, и их потомство. Следовательно, биологические образцы охватывают клинические образцы, клетки в культуре, супернатанты клеток, клеточные лизаты, сыворотку крови, плазму крови, биологические жидкости и тканевые образцы, в частности, образец опухоли.A biological sample covers many types of samples obtained from a subject and may be used in a diagnostic or monitoring assay. Biological samples include, without limitation, blood and other liquid samples of biological origin, solid tissue samples such as biopsies or tissue cultures, or cells derived therefrom, and progeny thereof. Therefore, biological samples include clinical samples, cells in culture, cell supernatants, cell lysates, blood serum, blood plasma, biological fluids, and tissue samples, in particular a tumor sample.

Настоящее изобретение также относится к in vivo способу обнаружения наличия рака у субъекта, включающему стадии, состоящие из:The present invention also relates to an in vivo method for detecting the presence of cancer in a subject, comprising the steps consisting of:

a) введения антитела согласно настоящему изобретению, которое является меченным детектируемой меткой, пациенту;a) administering an antibody of the present invention, which is labeled with a detectable label, to a patient;

b) обнаружение локализации указанного меченного детектируемой меткой антитела в пациенте путем визуализации.b) detecting the localization of said detectably labeled antibody in the patient by imaging.

В одном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению применимы для определения стадии рака (например, при визуализации с применением радиоактивных изотопов). Их применяют, например, отдельно или в комбинации с другими маркерами рака.In one embodiment, the antibodies of the present invention are useful for cancer staging (eg, radioisotope imaging). They are used, for example, alone or in combination with other cancer markers.

Термины обнаружение или обнаруженный, как используется в данном документе, включают качественное и/или количественное обнаружение (измерение уровней) с привязкой к контролю или без такой привязки.The terms detection or detected as used herein include qualitative and/or quantitative detection (measurement of levels) with or without reference to a control.

В контексте настоящего изобретения термин постановка диагноза, как используется в данном документе, означает определение природы медицинского состояния, предназначенное для идентификации патологии, которая негативно воздействует на субъекта на основании целого ряда собранных данных.In the context of the present invention, the term diagnosis, as used herein, means determining the nature of a medical condition, intended to identify a pathology that adversely affects the subject based on a set of collected data.

В указанном способе рак представляет собой рак, при котором экспрессируется CD123, определяемый выше.In said method, the cancer is a cancer that expresses CD123 as defined above.

Наборы.Sets.

Наконец, в настоящем изобретении также предусмотрены наборы, содержащие по меньшей мере одно антитело к CD3, по меньшей мере одно антитело к CD123 или по меньшей мере один антителоподобный связывающий белок по настоящему изобретению. Наборы, содержащие антитела к CD123 или антитела к CD3 по настоящему изобретению, находят применение в обнаружении поверхностного белка CD123 или CD3 или в терапевтических, или в диагностических анализах. Наборы по настоящему изобретению могут содержать полипептид или антитело к CD3, по меньшей мере одно антитело к CD123 или по меньшей мере один антителоподобный связывающий белок, связанные с твердой подложкой, например, планшетом для культивирования тканей или гранулами (например, гранулами сефарозы). Могут предусматриваться наборы, которые содержат антитела для обнаружения и количественной оценки поверхностного белка CD123 или CD3 in vitro, например, в анализе ELISA или при вестерн-блоттинге. В одном варианте осуществления указанное антитело применимо для обнаружения и обеспечивается меткой, такой как флуоресцентная или радиоактивная метка.Finally, the present invention also provides kits containing at least one anti-CD3 antibody, at least one anti-CD123 antibody, or at least one antibody-like binding protein of the present invention. Kits containing anti-CD123 antibodies or anti-CD3 antibodies of the present invention find use in detection of CD123 or CD3 surface protein or in therapeutic or diagnostic assays. The kits of the present invention may comprise an anti-CD3 polypeptide or antibody, at least one anti-CD123 antibody, or at least one antibody-like binding protein bound to a solid support, such as a tissue culture plate, or beads (eg, Sepharose beads). Kits may be provided that contain antibodies to detect and quantify CD123 or CD3 surface protein in vitro, for example in an ELISA assay or Western blot. In one embodiment, said antibody is useful for detection and is provided with a label, such as a fluorescent or radioactive label.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает наборы для получения единицы для однократного приема дозы. Каждый из наборов может содержать как первый контейнер с высушенным белком, так и второй контейнер с водным составом. В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).In one embodiment, the present invention encompasses kits for producing a single dose unit. Each of the kits may contain both the first container with the dried protein and the second container with the aqueous composition. Also included within the scope of the present invention are kits containing single and multi-chamber pre-filled syringes (eg, liquid syringes and lyophilisate syringes).

На протяжении настоящей заявки термин содержащий следует интерпретировать как охватывающий все конкретно упомянутые признаки, а также необязательные, дополнительные, неопределенные признаки. Как используется в данном документе, применение термина содержащий также раскрывает вариант осуществления, в котором не присутствуют никакие признаки, за исключением специально упомянутых признаков (т.е. состоящий из). Кроме того применение формы единственного числа не исключает множественного числа. Сам по себе тот факт, что определенные меры излагаются во взаимоисключающих зависимых пунктах формулы изобретения, не указывает на то, что комбинация этих мер не может применяться как преимущество.Throughout this application, the term containing should be interpreted to encompass all of the features specifically mentioned, as well as optional, additional, unspecified features. As used herein, the use of the term comprising also discloses an embodiment in which no features are present except for the features specifically mentioned (ie, consisting of). Moreover, the use of the singular form does not preclude the plural. The fact that certain measures are set forth in mutually exclusive dependent claims does not in itself indicate that a combination of these measures cannot be used to an advantage.

- 75 041572- 75 041572

Настоящее изобретение теперь будет описано более подробно со ссылкой на следующие фигуры и примеры. Все публикации и патентные документы, процитированные в данном документе, тем самым включены посредством ссылки. В то время как настоящее изобретение было проиллюстрировано и подробно описано в вышеизложенном описании, примеры следует считать иллюстративными или приводимыми в качестве примера, а не ограничивающими.The present invention will now be described in more detail with reference to the following figures and examples. All publications and patent documents cited herein are hereby incorporated by reference. While the present invention has been illustrated and described in detail in the foregoing description, the examples are to be considered illustrative or exemplary and not limiting.

Краткое описание последовательностейBrief description of the sequences

Под SEQ ID NO: 1 показана аминокислотная последовательность полноразмерного белка CD3ε человека, включая сигнальный пептид, доступная из базы данных Uniprot под номером доступа Р07766.SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the full length human CD3ε protein, including the signal peptide, available from the Uniprot database under accession number P07766.

Под SEQ ID NO: 2 показана аминокислотная последовательность полноразмерного белка CD3ε Macaca fascicularis, включая сигнальный пептид, доступная из базы данных Uniprot под номером доступа Q95LI5.Under SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the full-length Macaca fascicularis CD3ε protein, including the signal peptide, available from the Uniprot database under accession number Q95LI5.

Под SEQ ID NO: 3 показана аминокислотная последовательность слияния, содержащего Fc и зрелый CD3ε человека с меткой His, которое содержит аминокислоты 23-126 из полноразмерного белка CD3ε человека дикого типа.SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of a fusion containing Fc and a His-tagged mature human CD3ε that contains amino acids 23-126 from the full-length wild-type human CD3ε protein.

Под SEQ ID NO: 4 показана аминокислотная последовательность слияния, содержащего Fc и зрелый CD3ε Macaca fascicularis, которое содержит аминокислоты 23-117 полноразмерного белка CD3ε Macaca fascicularis дикого типа (SEQ ID NO:2), содержащего одну замену Ala на Val в аминокислотном положении 35 по сравнению с аминокислотным положением 57 последовательности дикого типа.SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of a fusion containing Fc and a mature Macaca fascicularis CD3ε that contains amino acids 23-117 of the full-length Macaca fascicularis CD3ε protein (SEQ ID NO:2) containing one Ala to Val substitution at amino acid position 35 compared to amino acid position 57 of the wild-type sequence.

Под SEQ ID NO: 5 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, называемого 20G6-F3.Under SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody, called 20G6-F3.

Под SEQ ID NO: 6, 7 и 8 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3H антитела, называемого 20G6-F3.Under SEQ ID NO: 6, 7 and 8 shows the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3H of an antibody called 20G6-F3.

Под SEQ ID NO: 9 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, называемого 20G6-F3.Under SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody, called 20G6-F3.

Под SEQ ID NO: 10 показана аминокислотная последовательность CDR1-L антител, называемых 20G6-F3, 11D7-C3, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6-С9, 10F4-C10, 18G9-H11, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 8C2-F7, 20E5-F10 и 3H6-D2.Under SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of CDR1-L antibodies referred to as 20G6-F3, 11D7-C3, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6-C9, 10F4-C10, 18G9-H11, 12G3-E8, 5B1-G2 , 16F8-A7, 11F9-F8, 8C2-F7, 20E5-F10 and 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 11 показана аминокислотная последовательность CDR3-L антител, называемых 20G6-F3, 4В4-О7, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 10F4-C10, 4Е7-С9, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 20E5-F10 и 3H6-D2.Under SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of CDR3-L antibodies called 20G6-F3, 4B4-O7, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 10F4-C10, 4E7-C9, 11F3-B9, 12G3-E8 , 5B1-G2, 16F8-A7, 20E5-F10 and 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 12 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, называемого 4B4-D7.Under SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody, called 4B4-D7.

Под SEQ ID NO: 13 показана аминокислотная последовательность CDR1-H антител, называемых 4B4-D7, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 10F4-C10, 18G9-H11, 4Е7-С9, 11F3-B9, 16F8-A7, 11F9-F8, 20B5-F10 и 3H6-D2.Under SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of the CDR1-H antibodies referred to as 4B4-D7, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 10F4-C10, 18G9-H11, 4E7-C9, 11F3-B9 , 16F8-A7, 11F9-F8, 20B5-F10 and 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 14 и 15 показаны аминокислотные последовательности CDR2-H и CDR3-H антитела, называемого 4В4-О7.Under SEQ ID NO: 14 and 15 shows the amino acid sequences of CDR2-H and CDR3-H of an antibody called 4B4-O7.

Под SEQ ID NO: 16 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, называемого 4B4-D7.Under SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody, called 4B4-D7.

Под SEQ ID NO: 17 показана аминокислотная последовательность CDR1-L антител, называемых 4B4-D7, 11Н3-Е5 и 11F3-B9.Under SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the CDR1-L antibodies called 4B4-D7, 11H3-E5 and 11F3-B9.

Под SEQ ID NO: 18 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, называемого 4Е7-С9.Under SEQ ID NO: 18 shows the amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody, called 4E7-C9.

Под SEQ ID NO: 19 показана аминокислотная последовательность CDR2-H антител, называемых 4Е7-С9, 18F5-H10, 20E5-F10 и 3H6-D2.Under SEQ ID NO: 19 shows the amino acid sequence of the CDR2-H antibodies, called 4E7-C9, 18F5-H10, 20E5-F10 and 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 20 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела, называемого 4Е7-С9.Under SEQ ID NO: 20 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of the antibody called 4E7-C9.

Под SEQ ID NO: 21 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, называемого 4Е7-С9.Under SEQ ID NO: 21 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody, called 4E7-C9.

Под SEQ ID NO: 22 показана аминокислотная последовательность CDR1-H антитела, называемого 4Е7-С9.Under SEQ ID NO: 22 shows the amino acid sequence of the CDR1-H of the antibody called 4E7-C9.

Под SEQ ID NO: 23 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, называемого 18F5-H10.Under SEQ ID NO: 23 shows the amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody, called 18F5-H10.

Под SEQ ID NO: 24 показана аминокислотная последовательность CDRl-Н антитела, называемого 18F5-H10.Under SEQ ID NO: 24 shows the amino acid sequence of the CDRl-H of the antibody called 18F5-H10.

Под SEQ ID NO: 25 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела, называемого 18F5-H10.Under SEQ ID NO: 25 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an antibody called 18F5-H10.

Под SEQ ID NO: 26 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, называемого 18F5-H10.Under SEQ ID NO: 26 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody, called 18F5-H10.

Под SEQ ID NO: 27 показана аминокислотная последовательность CDRl-L антитела к CD3, называемого 18F5-H10.Shown under SEQ ID NO: 27 is the amino acid sequence of the CDRl-L of an anti-CD3 antibody called 18F5-H10.

- 76 041572- 76 041572

Под SEQ ID NO: 28 показана аминокислотная последовательность CDR3-L антител к CD3, называемых 18F5-H10, 11D7-C3, 1Е6-С9 и 10E6-G6.Under SEQ ID NO: 28 shows the amino acid sequence of the CDR3-L antibodies to CD3, called 18F5-H10, 11D7-C3, 1E6-C9 and 10E6-G6.

Под SEQ ID NO: 29 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 12D2-E5.Under SEQ ID NO: 29 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 12D2-E5.

Под SEQ ID NO: 30 и 31 показаны аминокислотные последовательности CDRl-Н и CDR2-H антитела к CD3, называемого 12D2-E5.Shown under SEQ ID NOs: 30 and 31 are the amino acid sequences of CDR1-H and CDR2-H of an anti-CD3 antibody called 12D2-E5.

Под SEQ ID NO: 32 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антител к CD3, называемых 12D2-E5 и 3G5-E10.Under SEQ ID NO: 32 shows the amino acid sequence of the CDR3-H antibodies to CD3, called 12D2-E5 and 3G5-E10.

Под SEQ ID NO: 33 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 12D2-E5.SEQ ID NO: 33 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD3 antibody called 12D2-E5.

Под SEQ ID NO: 34 и 35 показаны аминокислотные последовательности CDRl-Н и CDR3-H антитела к CD3, называемого 12D2-E5.Shown under SEQ ID NOs: 34 and 35 are the amino acid sequences of the CDR1-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 12D2-E5.

Под SEQ ID NO: 36 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 11D7-C3.Under SEQ ID NO: 36 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 11D7-C3.

Под SEQ ID NO: 37 показана аминокислотная последовательность CDR2-H антител к CD3, называемых 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6-С9, 10F4-C10, 18О9-Н11, 11F3-B9, 16F8-A7, 11F9-F8 и 20B5-F10.SEQ ID NO: 37 shows the amino acid sequence of the CDR2-H of anti-CD3 antibodies referred to as 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6-C9, 10F4-C10, 18O9-H11, 11F3-B9, 16F8 -A7, 11F9-F8 and 20B5-F10.

Под SEQ ID NO: 38 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого 11D7-C3.Under SEQ ID NO: 38 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 11D7-C3.

Под SEQ ID NO: 39 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 11D7-C3.Under SEQ ID NO: 39 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 11D7-C3.

Под SEQ ID NO: 40 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 11Н3-Е5.Under SEQ ID NO: 40 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 11H3-E5.

Под SEQ ID NO: 41 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого 11Н3-Е5.Under SEQ ID NO: 41 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 11H3-E5.

Под SEQ ID NO: 42 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 11Н3-Е5.Under SEQ ID NO: 42 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 11H3-E5.

Под SEQ ID NO: 43 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 13Н2-С2.Under SEQ ID NO: 43 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 13H2-C2.

Под SEQ ID NO: 44 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого 13Н2-С2.SEQ ID NO: 44 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 13H2-C2.

Под SEQ ID NO: 45 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 13Н2-С2.Under SEQ ID NO: 45 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 13H2-C2.

Под SEQ ID NO: 46 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антител к CD3, называемых 13C1-F6 и 11F9-F8.Under SEQ ID NO: 46 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of antibodies to CD3, called 13C1-F6 and 11F9-F8.

Под SEQ ID NO: 47 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антител к CD3, называемых 13C1-F6, 10E6-G6 и 11F9-F8.Under SEQ ID NO: 47 shows the amino acid sequence of the CDR3-H antibodies to CD3, called 13C1-F6, 10E6-G6 and 11F9-F8.

Под SEQ ID NO: 48 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 13Н2-С2.Under SEQ ID NO: 48 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 13H2-C2.

Под SEQ ID NO: 49 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 18H11-F10.Under SEQ ID NO: 49 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 18H11-F10.

Под SEQ ID NO: 50, 51 и 52 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 18H11-F10.Shown under SEQ ID NOs: 50, 51 and 52 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 18H11-F10.

Под SEQ ID NO: 53 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 18H11-F10.Under SEQ ID NO: 53 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 18H11-F10.

Под SEQ ID NO: 54 и 55 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD3, называемого 18H11-F10.Shown under SEQ ID NOs: 54 and 55 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 18H11-F10.

Под SEQ ID NO: 56 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 1Е6-С9.Under SEQ ID NO: 56 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 1E6-C9.

Под SEQ ID NO: 57 и 58 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 1Е6-С9.Shown under SEQ ID NOs: 57 and 58 are the amino acid sequences of CDR1-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 1E6-C9.

Под SEQ ID NO: 59 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 1Е6-С9.Under SEQ ID NO: 59 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 1E6-C9.

Под SEQ ID NO: 60 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 10F4-C10.Under SEQ ID NO: 60 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 10F4-C10.

Под SEQ ID NO: 61 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого ^4-00.Shown under SEQ ID NO: 61 is the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called ^4-00.

Под SEQ ID NO: 62 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 10F4-C10.Under SEQ ID NO: 62 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 10F4-C10.

Под SEQ ID NO: 63 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 10E6-G6.Under SEQ ID NO: 63 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 10E6-G6.

Под SEQ ID NO: 64 и 65 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR2-H анти- 77 041572 тела к CD3, называемого 10E6-G6.Shown under SEQ ID NOs: 64 and 65 are the amino acid sequences of CDR1-H and CDR2-H of an anti-CD3 body called 10E6-G6.

Под SEQ ID NO: 66 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 10E6-G6.Under SEQ ID NO: 66 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 10E6-G6.

Под SEQ ID NO: 67 показана аминокислотная последовательность CDR1-L антитела к CD3, называемого 10E6-G6.Under SEQ ID NO: 67 shows the amino acid sequence of the CDR1-L of an anti-CD3 antibody called 10E6-G6.

Под SEQ ID NO: 68 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 18G9-H11.Under SEQ ID NO: 68 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 18G9-H11.

Под SEQ ID NO: 69 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого 18О9-Н11.SEQ ID NO: 69 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 18O9-H11.

Под SEQ ID NO: 70 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 18G9-H11.Under SEQ ID NO: 70 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 18G9-H11.

Под SEQ ID NO: 71 показана аминокислотная последовательность CDR3-L антитела к CD3, называемого 18G9-H11.SEQ ID NO: 71 shows the amino acid sequence of the CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 18G9-H11.

Под SEQ ID NO: 72 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 11F3-B9.Under SEQ ID NO: 72 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 11F3-B9.

Под SEQ ID NO: 73 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 11F3-B9.Under SEQ ID NO: 73 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 11F3-B9.

Под SEQ ID NO: 74 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 12G3-E8.Under SEQ ID NO: 74 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 12G3-E8.

Под SEQ ID NO: 75, 76 и 77 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 12G3-E8.Shown under SEQ ID NOs: 75, 76 and 77 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 12G3-E8.

Под SEQ ID NO: 78 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 12G3-E8.Under SEQ ID NO: 78 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 12G3-E8.

Под SEQ ID NO: 79 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 5B1-G2.Under SEQ ID NO: 79 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 5B1-G2.

Под SEQ ID NO: 80 и 81 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 5B1-G2.Shown under SEQ ID NOs: 80 and 81 are the amino acid sequences of CDR1-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 5B1-G2.

Под SEQ ID NO: 82 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 5B1-G2.Under SEQ ID NO: 82 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 5B1-G2.

Под SEQ ID NO: 83 показана аминокислотная последовательность части вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 16F8-A7.Under SEQ ID NO: 83 shows the amino acid sequence of part of the variable domain of the heavy chain of the anti-CD3 antibody, called 16F8-A7.

Под SEQ ID NO: 84 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антител к CD3, называемых 16F8-A7 и 11F3-B9.Under SEQ ID NO: 84 shows the amino acid sequence of the CDR3-H antibodies to CD3, called 16F8-A7 and 11F3-B9.

Под SEQ ID NO: 85 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 16F8-A7.Under SEQ ID NO: 85 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 16F8-A7.

Под SEQ ID NO: 86 показана аминокислотная последовательность полноразмерного белка CD3δ человека, включая сигнальный пептид, доступная из базы данных Uniprot под номером доступа Р04234.SEQ ID NO: 86 shows the amino acid sequence of the full length human CD3δ protein, including the signal peptide, available from the Uniprot database under accession number P04234.

Под SEQ ID NO: 87 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 11F9-F8.Under SEQ ID NO: 87 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody to CD3, called 11F9-F8.

Под SEQ ID NO: 88 показана аминокислотная последовательность CDR3-L антитела к CD3, называемого 11F9-F8.SEQ ID NO: 88 shows the amino acid sequence of the CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 11F9-F8.

Под SEQ ID NO: 89 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 3G5-E10.Under SEQ ID NO: 89 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 3G5-E10.

Под SEQ ID NO: 90 и 91 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR2-H антитела к CD3, называемого 3G5-E10.Shown under SEQ ID NOs: 90 and 91 are the amino acid sequences of CDR1-H and CDR2-H of an anti-CD3 antibody called 3G5-E10.

Под SEQ ID NO: 92 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 3G5-E10.Under SEQ ID NO: 92 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 3G5-E10.

Под SEQ ID NO: 93 и 94 показаны последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD3, называемого 3G5-E10.Shown under SEQ ID NOs: 93 and 94 are the CDR1-L and CDR3-L sequences of an anti-CD3 antibody called 3G5-E10.

Под SEQ ID NO: 95 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 9D7-F3.Under SEQ ID NO: 95 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 9D7-F3.

Под SEQ ID NO: 96, 97 и 98 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 9D7-F3.Shown under SEQ ID NOs: 96, 97 and 98 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 9D7-F3.

Под SEQ ID NO: 99 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 9D7-F3.Under SEQ ID NO: 99 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 9D7-F3.

Под SEQ ID NO: 100 и 101 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антител к CD3, называемых 9D7-F3 и 6C9-C9.Shown under SEQ ID NOs: 100 and 101 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of anti-CD3 antibodies referred to as 9D7-F3 and 6C9-C9.

Под SEQ ID NO: 102 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 8C2-F7.Under SEQ ID NO: 102 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 8C2-F7.

Под SEQ ID NO: 103, 104 и 105 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 8C2-F7.Shown under SEQ ID NOs: 103, 104 and 105 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 8C2-F7.

Под SEQ ID NO: 106 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкойUnder SEQ ID NO: 106 shows the amino acid sequence of the variable domain of light

- 78 041572 цепи антитела к CD3, называемого 8C2-F7.- 78 041572 chain of an anti-CD3 antibody called 8C2-F7.

Под SEQ ID NO: 107 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 20E5-F10.Under SEQ ID NO: 107 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 20E5-F10.

Под SEQ ID NO: 108 показаны аминокислотные последовательности CDR3-H антитела к CD3, называемого 2OE5-F1O.SEQ ID NO: 108 shows the amino acid sequences of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 2OE5-F1O.

Под SEQ ID NO: 109 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 20E5-F10.Under SEQ ID NO: 109 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody to CD3, called 20E5-F10.

Под SEQ ID NO: 110 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 20B5-F10.Under SEQ ID NO: 110 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 20B5-F10.

Под SEQ ID NO: 111 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого 2OB5-F1O.SEQ ID NO: 111 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 2OB5-F1O.

Под SEQ ID NO: 112 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 20B5-F10.Under SEQ ID NO: 112 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody to CD3, called 20B5-F10.

Под SEQ ID NO: 113 и 114 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD3, называемого 20B5-F10.Shown under SEQ ID NOs: 113 and 114 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 20B5-F10.

Под SEQ ID NO: 115 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 6С9-С9.Under SEQ ID NO: 115 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 6C9-C9.

Под SEQ ID NO: 116, 117 и 118 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 6С9-С9.Under SEQ ID NO: 116, 117 and 118 shows the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 6C9-C9.

Под SEQ ID NO: 119 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 6С9-С9.Under SEQ ID NO: 119 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 6C9-C9.

Под SEQ ID NO: 120 показана аминокислотная последовательность CDR3-L антитела к CD3, называемого 6С9-С9.SEQ ID NO: 120 shows the amino acid sequence of the CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 6C9-C9.

Под SEQ ID NO: 121 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 3E8-G1.Under SEQ ID NO: 121 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 3E8-G1.

Под SEQ ID NO: 122, 123 и 124 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD3, называемого 3E8-G1.Under SEQ ID NO: 122, 123 and 124 shows the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 3E8-G1.

Под SEQ ID NO: 125 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 3E8-G1.Under SEQ ID NO: 125 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 3E8-G1.

Под SEQ ID NO: 126 и 127 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD3, называемого 3E8-G1.Shown under SEQ ID NOs: 126 and 127 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 3E8-G1.

Под SEQ ID NO: 128 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 3H6-D2.Under SEQ ID NO: 128 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 129 показана аминокислотная последовательность CDR3-H антитела к CD3, называемого 3H6-D2.SEQ ID NO: 129 shows the amino acid sequence of the CDR3-H of an anti-CD3 antibody called 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 130 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 3H6-D2.SEQ ID NO: 130 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD3 antibody called 3H6-D2.

Под SEQ ID NO: 131 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD3, называемого 8Н2.Under SEQ ID NO: 131 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD3 antibody, called 8H2.

Под SEQ ID NO: 132 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD3, называемого 8Н2.SEQ ID NO: 132 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD3 antibody called 8H2.

Под SEQ ID NO: 133 и 134 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD3, называемого 8Н2.Shown under SEQ ID NOs: 133 and 134 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD3 antibody called 8H2.

Под SEQ ID NO: 135 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1a, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 135 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1a, of the 20G6 humanized anti-CD3 antibody.

Под SEQ ID NO: 136 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1b, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 136 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1b, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 137 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1c, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 137 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1c, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 138 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1d, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 138 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1d, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 139 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1a, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 139 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1a, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 140 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1b, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 140 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1b, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 141 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1c, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 141 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1c, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 142 показана аминокислотная последовательность CDR1-L варианта VL1c гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 142 shows the amino acid sequence of the CDR1-L variant VL1c of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 143 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1d, гуманизированного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 143 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1d, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 144 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH2a, гуманизи- 79 041572 рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 144 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH2a, of the humanized anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 145 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 145 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 146 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 146 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 147 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 147 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 148 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 148 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 149 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 149 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 150 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 150 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 151 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 151 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 152 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 152 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 153 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 153 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 154 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 154 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 155 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 155 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 156 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 156 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 157 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 20G6.SEQ ID NO: 157 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 20G6.

Под SEQ ID NO: 158 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 158 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 159 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 159 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 160 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 160 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 161 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 161 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 162 показана аминокислотная манизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 162 shows the amino acid of the manized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 163 показана аминокислотная манизированного антитела к CD3 4В4.Under SEQ ID NO: 163 shows the amino acid manized antibodies to CD3 4B4.

Под SEQ ID NO: 164 показана аминокислотная манизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 164 shows the amino acid of the manized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 165 показана аминокислотная манизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 165 shows the amino acid of the manized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 166 показана аминокислотная манизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 166 shows the amino acid of the manized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 167 показана аминокислотная манизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 167 shows the amino acid of the manized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 168 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 168 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 169 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 169 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 170 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 170 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 171 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 171 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 172 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 172 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 173 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 173 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 174 показана аминокислотная рованного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 174 shows the amino acid of the anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 175 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH2b, гуманизипоследовательность варианта VH, VH2c, гуманизипоследовательность варианта VH, VH2d, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2a, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2b, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2c, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2d, гуманизипоследовательность варианта VH, VH3a, гуманизипоследовательность варианта VH, VH3b, гуманизипоследовательность варианта VL, VL3a, гуманизипоследовательность варианта VL, VL3b, гуманизипоследовательность варианта VL, VL3c, гуманизипоследовательность варианта VL, VL3d, гуманизипоследовательность варианта VL, VL1A, гуманизипоследовательность варианта VL, VL1B, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2A, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2B, гуманизипоследовательность варианта VL, VL1Cmodif1, гупоследовательность варианта VL, VL1Cmodif2, гупоследовательность варианта VL, VL1Cmodif3, гупоследовательность варианта VL, VL1Amodif1, гупоследовательность варианта VL, VL1Amodif2, гупоследовательность варианта VL, VL1Amodif3, гупоследовательность варианта VL, VL2C, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2D, гуманизипоследовательность варианта VL, VL2F, гуманизипоследовательность варианта VH, VH1A, гуманизипоследовательность варианта VH, VH1B, гуманизипоследовательность варианта VH, VH2A, гуманизипоследовательность варианта VH, VH2B, гуманизипоследовательность варианта VH, VH6Bmodif1, гу- 80 041572 манизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 175 shows the amino acid sequence of VH variant, VH2b, humanization sequence of variant VH, VH2c, humanization sequence of variant VH, VH2d, humanization sequence of variant VL, VL2a, humanization sequence of variant VL, VL2b, humanization sequence of variant VL, VL2c, humanization sequence of variant VL, VL2d, VH variant humanization sequence, VH3a, VH variant humanization sequence, VH3b, VL variant humanization sequence, VL3a, VL variant humanization sequence, VL3b, VL variant humanization sequence, VL3c, VL variant humanization sequence, VL3d, VL variant humanization sequence, VL1A, VL variant humanization sequence, VL1B, variant humanization sequence VL, VL2A, VL variant humanizing sequence, VL2B, VL variant humanizing sequence, VL1Cmodif1, VL variant hyping sequence, VL1Cmodif2, VL variant hyping sequence, VL1Cmodif3, VL variant hyping sequence, VL1Am odif1, VL variant husequence, VL1Amodif2, VL variant husequence, VL1Amodif3, VL variant husequence, VL2C, VL variant humanizationsequence, VL2D, VL variant humanizationsequence, VL2F, VH variant humanizationsequence, VH1A, VH variant humanizationsequence, VH1B, VH variant humanizationsequence, VH2A, the humanization sequence of the VH variant, VH2B, the humanization sequence of the VH variant, VH6Bmodif1, humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 176 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH6Bmodif2, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 176 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH6Bmodif2, a humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 177 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH6Amodif1, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 177 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH6Amodif1, a humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 178 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH6Amodif2, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 178 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH6Amodif2, a humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 179 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH6Amodif3, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 179 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH6Amodif3, a humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 180 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH6C, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 180 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH6C, of the humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 181 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH6D, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 181 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH6D, of the humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 182 показана аминокислотная последовательность варианта VL, D7-VK3mut, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 182 shows the amino acid sequence of the VL variant, D7-VK3mut, a humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 183 показана аминокислотная последовательность варианта VH, D7-VH1mut, гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 183 shows the amino acid sequence of the VH variant, D7-VH1mut, of the humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 184 показана аминокислотная последовательность CDR1-L вариантов VL1B, VL2B, VL1Cmodif3 и VL2F гуманизированного антитела к CD3 4В4.SEQ ID NO: 184 shows the amino acid sequence of the CDR1-L variants VL1B, VL2B, VL1Cmodif3 and VL2F of the humanized anti-CD3 antibody 4B4.

Под SEQ ID NO: 185 показана аминокислотная последовательность полноразмерного белка CD3y человека, включая сигнальный пептид, доступная из базы данных Uniprot под номером доступа Р09693.SEQ ID NO: 185 shows the amino acid sequence of the full length human CD3y protein, including the signal peptide, available from the Uniprot database under accession number P09693.

Под SEQ ID NO: 186 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 20G6-F3.SEQ ID NO: 186 shows the amino acid sequence of the Fab heavy chain from an anti-CD3 antibody called 20G6-F3.

Под SEQ ID NO: 187 показана аминокислотная последовательность легкой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 20G6-F3.SEQ ID NO: 187 shows the light chain amino acid sequence of Fab from an anti-CD3 antibody called 20G6-F3.

Под SEQ ID NO: 188 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 4Е7-С9.SEQ ID NO: 188 shows the amino acid sequence of the Fab heavy chain from an anti-CD3 antibody called 4E7-C9.

Под SEQ ID NO: 189 показана аминокислотная последовательность легкой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 4Е7-С9.SEQ ID NO: 189 shows the light chain amino acid sequence of Fab from an anti-CD3 antibody called 4E7-C9.

Под SEQ ID NO: 190 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 4B4-D7.SEQ ID NO: 190 shows the amino acid sequence of the Fab heavy chain from an anti-CD3 antibody called 4B4-D7.

Под SEQ ID NO: 191 показана аминокислотная последовательность легкой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 4B4-D7.SEQ ID NO: 191 shows the amino acid sequence of the Fab light chain from an anti-CD3 antibody called 4B4-D7.

Под SEQ ID NO: 192 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 18F5-H10.SEQ ID NO: 192 shows the amino acid sequence of the Fab heavy chain from an anti-CD3 antibody called 18F5-H10.

Под SEQ ID NO: 193 показана аминокислотная последовательность легкой цепи Fab из антитела к CD3, называемого 18F5-H10.SEQ ID NO: 193 shows the light chain amino acid sequence of Fab from an anti-CD3 antibody called 18F5-H10.

Под SEQ ID NO: 194 показана аминокислотная последовательность полноразмерного белка CD123 человека, включая сигнальный пептид, доступная из базы данных NCBI под номером доступа NP_002174.1 и из базы данных Uniprot под номером доступа Р26951.SEQ ID NO: 194 shows the amino acid sequence of the full-length human CD123 protein, including the signal peptide, available from the NCBI database under accession number NP_002174.1 and from the Uniprot database under accession number P26951.

Под SEQ ID NO: 195 показана аминокислотная последовательность полноразмерного белка CD123 Масаса fascicularis, включая сигнальный пептид, доступная из базы данных GenBank под ЕНН61867.1 и базы данных Uniprot под G8F3K3.SEQ ID NO: 195 shows the amino acid sequence of the full-length Macac fascicularis CD123 protein, including the signal peptide, available from the GenBank database under EH61867.1 and the Uniprot database under G8F3K3.

Под SEQ ID NO: 196 показана аминокислотная последовательность слияния, содержащего Fc и зрелый CD123 человека с меткой Strep-II, которое содержит аминокислоты 22-305 полноразмерного белка CD123 человека (SEQ ID NO: 194).SEQ ID NO: 196 shows the amino acid sequence of a fusion containing Fc and mature human CD123 labeled Strep-II, which contains amino acids 22-305 of the full-length human CD123 protein (SEQ ID NO: 194).

Под SEQ ID NO: 197 показана аминокислотная последовательность слияния, содержащего Fc и зрелый CD123 Масаса fascicularis с меткой Strep-II, которое содержит аминокислоты 22-305 полноразмерного белка CD123 Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 195).SEQ ID NO: 197 shows the amino acid sequence of a fusion containing Fc and mature Macac fascicularis CD123 tagged Strep-II, which contains amino acids 22-305 of the full-length Macac fascicularis CD123 protein (SEQ ID NO: 195).

Под SEQ ID NO: 198 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 1E1-G5.Under SEQ ID NO: 198 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the antibody to CD123, called 1E1-G5.

Под SEQ ID NO: 199 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H антител к CD123, называемых 1E1-G5 и 8В11-В7.Under SEQ ID NO: 199 shows the amino acid sequences of the CDR1-H antibodies to CD123, called 1E1-G5 and 8B11-B7.

Под SEQ ID NO: 200 показаны аминокислотные последовательности CDR2-H антител к CD123, называемых 1E1-G5 и 6D6-B8.Under SEQ ID NO: 200 shows the amino acid sequences of the CDR2-H antibodies to CD123, called 1E1-G5 and 6D6-B8.

Под SEQ ID NO: 201 показаны аминокислотные последовательности CDR3-H антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7 и 9F6-G3.SEQ ID NO: 201 shows the amino acid sequences of the CDR3-H of the anti-CD123 antibodies referred to as 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7 and 9F6-G3.

Под SEQ ID NO: 202 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 1E1-G5.Under SEQ ID NO: 202 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody to CD123, called 1E1-G5.

Под SEQ ID NO: 203 и 204 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 1E1-G5.Shown under SEQ ID NOs: 203 and 204 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 1E1-G5.

Под SEQ ID NO: 205 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелойUnder SEQ ID NO: 205 shows the amino acid sequence of the variable domain of severe

- 81 041572 цепи антитела к CD123, называемого 2B8-F3.- 81 041572 chain of an anti-CD123 antibody called 2B8-F3.

Под SEQ ID NO: 206, 207 и 208 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H иUnder SEQ ID NO: 206, 207 and 208 shows the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and

CDR3-H антитела к CD123, называемого 2B8-F3.CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 2B8-F3.

Под SEQ ID NO: 209 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 2B8-F3.SEQ ID NO: 209 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD123 antibody called 2B8-F3.

Под SEQ ID NO: 210 и 211 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 2B8-F3.Shown under SEQ ID NOs: 210 and 211 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 2B8-F3.

Под SEQ ID NO: 212 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 2F8-D6.Under SEQ ID NO: 212 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 2F8-D6.

Под SEQ ID NO: 213, 214 и 215 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD123, называемого 2F8-D6.Shown under SEQ ID NOs: 213, 214 and 215 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 2F8-D6.

Под SEQ ID NO: 216 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 2F8-D6.Under SEQ ID NO: 216 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody to CD123, called 2F8-D6.

Под SEQ ID NO: 217 и 218 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 2F8-D6.Shown under SEQ ID NOs: 217 and 218 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 2F8-D6.

Под SEQ ID NO: 219 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 3В10-Е6.Under SEQ ID NO: 219 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the antibody to CD123, called 3B10-E6.

Под SEQ ID NO: 220, 221 и 222 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD123, называемого 3В10-Е6.Shown under SEQ ID NOs: 220, 221 and 222 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 3B10-E6.

Под SEQ ID NO: 223 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 3В10-Е6.Under SEQ ID NO: 223 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 3B10-E6.

Под SEQ ID NO: 224 и 225 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 3В10-Е6.Shown under SEQ ID NOs: 224 and 225 are the amino acid sequences of the CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 3B10-E6.

Под SEQ ID NO: 226 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 3E3-D3.Under SEQ ID NO: 226 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 3E3-D3.

Под SEQ ID NO: 227, 228 и 229 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD123, называемого 3E3-D3.Shown under SEQ ID NOs: 227, 228 and 229 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 3E3-D3.

Под SEQ ID NO: 230 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 3E3-D3.SEQ ID NO: 230 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD123 antibody called 3E3-D3.

Под SEQ ID NO: 231 и 232 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 3E3-D3.Shown under SEQ ID NOs: 231 and 232 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 3E3-D3.

Под SEQ ID NO: 233 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 5А5-В4.Under SEQ ID NO: 233 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 5A5-B4.

Под SEQ ID NO: 234, 235 и 236 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD123, называемого 5А5-В4.Shown under SEQ ID NOs: 234, 235 and 236 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 5A5-B4.

Под SEQ ID NO: 237 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 5А5-В4.Under SEQ ID NO: 237 shows the amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the antibody to CD123, called 5A5-B4.

Под SEQ ID NO: 238 и 239 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 5А5-В4.Shown under SEQ ID NOs: 238 and 239 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 5A5-B4.

Под SEQ ID NO: 240 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 6В10-Е4.Under SEQ ID NO: 240 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 6B10-E4.

Под SEQ ID NO: 241, 242 и 243 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD123, называемого 6В10-Е4.Shown under SEQ ID NOs: 241, 242 and 243 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 6B10-E4.

Под SEQ ID NO: 244 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 6В10-Е4.Under SEQ ID NO: 244 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 6B10-E4.

Под SEQ ID NO: 245 и 246 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 6В10-Е4.Shown under SEQ ID NOs: 245 and 246 are the amino acid sequences of the CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 6B10-E4.

Под SEQ ID NO: 247 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 6С10-С4.Under SEQ ID NO: 247 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the antibody to CD123, called 6C10-C4.

Под SEQ ID NO: 248, 249 и 250 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела к CD123, называемого 6С10-С4.Shown under SEQ ID NOs: 248, 249 and 250 are the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 6C10-C4.

Под SEQ ID NO: 251 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антител к CD123, называемых 6С10-С4 и 9B8-G6.SEQ ID NO: 251 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD123 antibodies referred to as 6C10-C4 and 9B8-G6.

Под SEQ ID NO: 252 показана аминокислотная последовательность CDR1-L антител к CD123, называемых 6С10-С4 и 9B8-G6.Under SEQ ID NO: 252 shows the amino acid sequence of the CDR1-L antibodies to CD123, called 6C10-C4 and 9B8-G6.

Под SEQ ID NO: 253 показана аминокислотная последовательность CDR3-L антител к CD123, называемых 6С10-С4, 9B8-G6 и 9D7-G3.Under SEQ ID NO: 253 shows the amino acid sequence of the CDR3-L antibodies to CD123, called 6C10-C4, 9B8-G6 and 9D7-G3.

Под SEQ ID NO: 254 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 6D6-B8.Under SEQ ID NO: 254 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 6D6-B8.

Под SEQ ID NO: 255 показана аминокислотная последовательность CDR1-H антитела к CD123, называемого 6D6-B8.SEQ ID NO: 255 shows the amino acid sequence of the CDR1-H of an anti-CD123 antibody called 6D6-B8.

Под SEQ ID NO: 256 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкойUnder SEQ ID NO: 256 shows the amino acid sequence of the variable domain of light

- 82 041572 цепи антитела к CD123, называемого 6D6-B8.- 82 041572 chain of an anti-CD123 antibody called 6D6-B8.

Под SEQ ID NO: 257 и 258 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 6D6-B8.Shown under SEQ ID NOs: 257 and 258 are the amino acid sequences of CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 6D6-B8.

Под SEQ ID NO: 259 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 8В11-В7.Under SEQ ID NO: 259 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 8B11-B7.

Под SEQ ID NO: 260 показана аминокислотная последовательность CDR2-H антитела к CD123, называемого 8В11-В7 .Shown under SEQ ID NO: 260 is the amino acid sequence of the CDR2-H of an anti-CD123 antibody called 8B11-B7.

Под SEQ ID NO: 261 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 8В11-В7.SEQ ID NO: 261 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-CD123 antibody, referred to as 8B11-B7.

Под SEQ ID NO: 262 и 263 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L и CDR3-L антитела к CD123, называемого 8В11-В7.Shown under SEQ ID NOs: 262 and 263 are the amino acid sequences of the CDR1-L and CDR3-L of an anti-CD123 antibody called 8B11-B7.

Под SEQ ID NO: 264 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 9B8-G6.Under SEQ ID NO: 264 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 9B8-G6.

Под SEQ ID NO: 25 и 266 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR2-H антител к CD123, называемых 9B8-G6 и 9D7-C8.Shown under SEQ ID NOs: 25 and 266 are the amino acid sequences of the CDR1-H and CDR2-H of the anti-CD123 antibodies referred to as 9B8-G6 and 9D7-C8.

Под SEQ ID NO: 267 показаны аминокислотные последовательности CDR3-H антитела к CD123, называемого 9B8-G6.SEQ ID NO: 267 shows the amino acid sequences of the CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 9B8-G6.

Под SEQ ID NO: 268 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 9D7-C8.Under SEQ ID NO: 268 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 9D7-C8.

Под SEQ ID NO: 269 показаны аминокислотные последовательности CDR3-H антитела к CD123, называемого 9D7-C8.SEQ ID NO: 269 shows the amino acid sequences of the CDR3-H of an anti-CD123 antibody called 9D7-C8.

Под SEQ ID NO: 270 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 9D7-C8.SEQ ID NO: 270 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD123 antibody called 9D7-C8.

Под SEQ ID NO: 271 показаны аминокислотные последовательности CDR1-L антитела к CD123, называемого 9D7-C8.SEQ ID NO: 271 shows the amino acid sequences of the CDR1-L of an anti-CD123 antibody called 9D7-C8.

Под SEQ ID NO: 272 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела к CD123, называемого 9F6-G3.Under SEQ ID NO: 272 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-CD123 antibody, called 9F6-G3.

Под SEQ ID NO: 273 и 274 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR2-H антитела к CD123, называемого 9F6-G3.Shown under SEQ ID NOs: 273 and 274 are the amino acid sequences of the CDR1-H and CDR2-H of an anti-CD123 antibody called 9F6-G3.

Под SEQ ID NO: 275 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела к CD123, называемого 9F6-G3.SEQ ID NO: 275 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of an anti-CD123 antibody called 9F6-G3.

Под SEQ ID NO: 276 показана аминокислотная последовательность CDR1-L антитела к CD123, называемого 9F6-G3.SEQ ID NO: 276 shows the amino acid sequence of the CDR1-L of an anti-CD123 antibody called 9F6-G3.

Под SEQ ID NO: 277 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH_G45A, антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 277 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH_G45A, of the 3E3 anti-CD123 antibody.

Под SEQ ID NO: 278 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VHmDG, антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 278 shows the amino acid sequence of the VH variant, VHmDG, of the 3E3 anti-CD123 antibody.

Под SEQ ID NO: 279 показана аминокислотная последовательность CDR2-H варианта VHmDG антитела к CD123 3Е3 и CDR2-H варианта VH1Fm2DG гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 279 shows the amino acid sequence of the CDR2-H of the VHmDG variant of the anti-CD123 antibody 3E3 and the CDR2-H of the VH1Fm2DG variant of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 280 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1A, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 280 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1A, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 281 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1B, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 281 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1B, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 282 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1C, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 282 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1C, of the humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 283 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1D, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 283 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1D, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 284 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1E, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 284 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1E, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 285 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1F, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.Under SEQ ID NO: 285 shows the amino acid sequence of the variant VH, VH1F, humanized antibodies to CD123 3E3.

Под SEQ ID NO: 286 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1G, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 286 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1G, of the humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 287 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1Fm1, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 287 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1Fm1, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 288 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1Fm2, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 288 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1Fm2, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 289 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1Fm2DG, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 289 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1Fm2DG, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 290 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1Dm1, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 290 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1Dm1, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 291 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH1Em1, гумани- 83 041572 зированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 291 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH1Em1, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 292 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1A, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 292 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1A, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 293 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1B, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 293 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1B, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 294 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1C, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 294 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1C, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 295 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1D, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 295 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1D, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 296 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1E, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 296 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1E, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 297 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1F, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 297 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1F, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 298 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1G, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 298 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1G, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 299 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1Fm1, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 299 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1Fm1, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 300 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL1Fm2, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 300 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL1Fm2, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 301 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH2A, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 301 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH2A, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 302 показана аминокислотная последовательность варианта VH, VH3A, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 302 shows the amino acid sequence of the VH variant, VH3A, of the humanized anti-CD123 antibody 3E3.

Под SEQ ID NO: 303 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL2A, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 303 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL2A, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 304 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL2Am1, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 304 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL2Am1, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 305 показана аминокислотная последовательность варианта VL, VL2Am2, гуманизированного антитела к CD123 3Е3.SEQ ID NO: 305 shows the amino acid sequence of the VL variant, VL2Am2, a humanized anti-CD123 3E3 antibody.

Под SEQ ID NO: 306 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x20G6.Under SEQ ID NO: 306 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x20G6.

Под SEQ ID NO: 307 показана аминокислотная последовательность линкера L1 из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 и CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.Under SEQ ID NO: 307 shows the amino acid sequence of the L1 linker from the antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 and CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 308 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи 7G3, представляющая собой домен VD1 или VD2 из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 и CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.Under SEQ ID NO: 308 shows the amino acid sequence of the 7G3 light chain variable domain, which is the V D1 or V D2 domain of the antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 and CODV-Fab hz20 .

Под SEQ ID NO: 309 показана аминокислотная последовательность линкера L2 из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 и CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.Under SEQ ID NO: 309 shows the amino acid sequence of the L2 linker from the antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 and CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 310 показана аминокислотная последовательность CL из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 и hz4B4x3E3.Under SEQ ID NO: 310 shows the amino acid sequence of CL from antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 and hz4B4x3E3.

Под SEQ ID NO: 311 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x20G6.Under SEQ ID NO: 311 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x20G6.

Под SEQ ID NO: 312 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 7G3, представляющая собой домен VH1 или VH2 из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 и CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.SEQ ID NO: 312 shows the amino acid sequence of the 7G3 heavy chain variable domain, which is the V H1 or VH2 domain of the antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 and CODV-Fab hz20.

Под SEQ ID NO: 313 показана аминокислотная последовательность CH1 из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3.Under SEQ ID NO: 313 shows the amino acid sequence of C H1 from antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3.

Под SEQ ID NO: 314 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x4E7.Under SEQ ID NO: 314 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x4E7.

Под SEQ ID NO: 315 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x4E7.Under SEQ ID NO: 315 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x4E7.

Под SEQ ID NO: 316 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x4B4.Under SEQ ID NO: 316 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x4B4.

Под SEQ ID NO: 317 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формулеUnder SEQ ID NO: 317 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to the formula

- 84 041572- 84 041572

II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x4B4.II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x4B4.

Под SEQ ID NO: 318 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формулеUnder SEQ ID NO: 318 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to the formula

I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x18F5.I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x18F5.

Под SEQ ID NO: 319 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формулеUnder SEQ ID NO: 319 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to the formula

II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3x18F5.II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3x18F5.

Под SEQ ID NO: 320 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3.Under SEQ ID NO: 320 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3.

Под SEQ ID NO: 321 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3.Under SEQ ID NO: 321 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3.

Под SEQ ID NO: 322 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3xhz4B4.Under SEQ ID NO: 322 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3xhz4B4.

Под SEQ ID NO: 323 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab 7G3xhz4B4.Under SEQ ID NO: 323 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab 7G3xhz4B4.

Под SEQ ID NO: 324 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz4B4x3E3.Under SEQ ID NO: 324 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz4B4x3E3.

Под SEQ ID NO: 325 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz4B4x3E3.Under SEQ ID NO: 325 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz4B4x3E3.

Под SEQ ID NO: 326 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.Under SEQ ID NO: 326 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 327 показана аминокислотная последовательность Fc2 из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.SEQ ID NO: 327 shows the amino acid sequence of F c2 from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 328 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле III из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.Under SEQ ID NO: 328 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula III from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 329 показана аминокислотная последовательность CH1 из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.SEQ ID NO: 329 shows the amino acid sequence of CH1 from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 330 показана аминокислотная последовательность Fc из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.Under SEQ ID NO: 330 shows the amino acid sequence of F c from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4.

Под SEQ ID NO: 331 показана консенсусная последовательность CDR1-H антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1E6С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 331 shows the consensus sequence of the CDR1-H antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6C9 , 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 332 показана консенсусная последовательность CDR2-H антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 332 shows the consensus sequence of the CDR2-H antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6C9 , 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 333 показана консенсусная последовательность CDR3-H антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 333 shows the consensus sequence of the CDR3-H antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6C9 , 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 334 показана консенсусная последовательность CDR1-L антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10, 3H6-D2, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 334 shows the consensus sequence of the CDR1-L antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6C9 , 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10, 3H6-D2, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 335 показана консенсусная последовательность CDR3-L антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 335 shows the consensus sequence of the CDR3-L antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6C9 , 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5F10, 20B5-F10, 3H6-D2, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 336 показана консенсусная последовательность CDR1-H антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, , 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 336 shows the consensus sequence of the CDR1-H antibodies to CD123, called 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 337 показана консенсусная последовательность CDR2-H антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 337 shows the consensus sequence of the CDR2-H antibodies to CD123, called 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 338 показана консенсусная последовательность CDR1-L антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 338 shows the consensus sequence of the CDR1-L antibodies to CD123, called 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 339 показана консенсусная последовательность CDR3-L антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 339 shows the consensus sequence of the CDR3-L antibodies to CD123, called 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 340 показана консенсусная последовательность CDR1-H антител к CD123, называемых 6С10-С4, 9B8-G6, 9D7-C8, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 340 shows the consensus sequence of the CDR1-H antibodies to CD123, called 6C10-C4, 9B8-G6, 9D7-C8, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 341 показана консенсусная последовательность CDR2-H антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 341 shows the consensus sequence of the CDR2-H antibodies to CD123, called 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 342 показана консенсусная последовательность CDR3-H антител к CD123, называемых 1E1-G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.Under SEQ ID NO: 342 shows the consensus sequence of the CDR3-H antibodies to CD123, called 1E1-G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3, based on sequence alignment.

- 85 041572- 85 041572

Под SEQ ID NO: 343 показана консенсусная последовательность CDR1-L антител к CD123, 1E1G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3, на основании выравнивания последовательностей.SEQ ID NO: 343 shows the CDR1-L consensus sequence of anti-CD123, 1E1G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3 antibodies based on sequence alignment.

Под SEQ ID NO: 344 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 344 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 345 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 345 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 346 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Thr-Val-Ala-Ala-Pro).Under SEQ ID NO: 346 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Thr-Val-Ala-Ala-Pro).

Под SEQ ID NO: 347 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gln-Pro-Lys-Ala-Ala).Under SEQ ID NO: 347 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gln-Pro-Lys-Ala-Ala).

Под SEQ ID NO: 348 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gln-Arg-Ile-Glu-Gly).Under SEQ ID NO: 348 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gln-Arg-Ile-Glu-Gly).

Под SEQ ID NO: 349 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).Under SEQ ID NO: 349 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).

Под SEQ ID NO: 350 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).Under SEQ ID NO: 350 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).

Под SEQ ID NO: 351 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys).Under SEQ ID NO: 351 shows the amino acid sequence of the linker sequence (His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys).

Под SEQ ID NO: 352 показаны аминокислотная последовательность линкерной последовательности и последовательность метки His, добавленные на С-конце полипептида согласно формуле II из антителоподобных связывающих белков, называемых CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 и hz4B4x3E3, соответствующие последовательности шарнира и метке His, используемым, например, для очистки.SEQ ID NO: 352 shows the amino acid sequence of a linker sequence and a His tag sequence added at the C-terminus of a polypeptide according to formula II from antibody-like binding proteins called CODV-Fab 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, 7G3x18F5, hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4 and hz4B4x3, corresponding to the sequences hinge and His mark, used for cleaning, for example.

Под SEQ ID NO: 353 показана аминокислотная последовательность CDR2-H варианта антитела к CD123, называемого 3Е3.SEQ ID NO: 353 shows the amino acid sequence of the CDR2-H of an anti-CD123 antibody variant called 3E3.

Под SEQ ID NO: 354 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 354 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 355 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Ser-Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 355 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Ser-Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 356 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 356 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 357 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 357 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 358 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).Under SEQ ID NO: 358 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).

Под SEQ ID NO: 359 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Lys-Thr-His-Thr).Under SEQ ID NO: 359 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Lys-Thr-His-Thr).

Под SEQ ID NO: 360 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Lys-Thr-His-Thr-Ser).Under SEQ ID NO: 360 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Lys-Thr-His-Thr-Ser).

Под SEQ ID NO: 361 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Asp -Lys-Thr-His-Thr-Ser).Under SEQ ID NO: 361 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser).

Под SEQ ID NO: 362 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Asp -Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).Under SEQ ID NO: 362 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).

Под SEQ ID NO: 363 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).Under SEQ ID NO: 363 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).

Под SEQ ID NO: 364 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro).Under SEQ ID NO: 364 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro).

Под SEQ ID NO: 365 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).Under SEQ ID NO: 365 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).

Под SEQ ID NO: 366 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).Under SEQ ID NO: 366 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).

Под SEQ ID NO: 367 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro).Under SEQ ID NO: 367 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro).

Под SEQ ID NO: 368 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro).Under SEQ ID NO: 368 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro).

Под SEQ ID NO: 369 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).Under SEQ ID NO: 369 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).

Под SEQ ID NO: 370 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).Under SEQ ID NO: 370 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).

Под SEQ ID NO: 371 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly).Under SEQ ID NO: 371 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly).

- 86 041572- 86 041572

Под SEQ ID NO: 372 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly).Under SEQ ID NO: 372 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly).

Под SEQ ID NO: 373 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly).Under SEQ ID NO: 373 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly) .

Под SEQ ID NO: 374 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly).Under SEQ ID NO: 374 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly- gly).

Под SEQ ID NO: 375, 376 и 377 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H, CDR2-H и CDR3-H антитела, называемого 7G3.Under SEQ ID NO: 375, 376 and 377 shows the amino acid sequences of CDR1-H, CDR2-H and CDR3-H of an antibody called 7G3.

Под SEQ ID NO: 378 и 379 показана аминокислотная последовательность CDR1-L и CDR3-L антитела, называемого 7G3.Under SEQ ID NO: 378 and 379 shows the amino acid sequence of CDR1-L and CDR3-L of an antibody called 7G3.

Под SEQ ID NO: 380 показана аминокислотная последовательность варианта вариабельного домена тяжелой цепи гуманизированного антитела, называемого 7G3.SEQ ID NO: 380 shows the amino acid sequence of a humanized antibody heavy chain variable domain variant called 7G3.

Под SEQ ID NO: 381 и 382 показаны аминокислотные последовательности CDR1-H и CDR3-H гуманизированного антитела, называемого 7G3.Shown under SEQ ID NOs: 381 and 382 are the amino acid sequences of CDR1-H and CDR3-H of a humanized antibody called 7G3.

Под SEQ ID NO: 383 показана аминокислотная последовательность дополнительного варианта вариабельного домена тяжелой цепи гуманизированного антитела, называемого 7G3.Under SEQ ID NO: 383 shows the amino acid sequence of an additional variant heavy chain variable domain of the humanized antibody, called 7G3.

Под SEQ ID NO: 384 показаны аминокислотные последовательности CDR2-H одного из гуманизированных антител, называемых 7G3.SEQ ID NO: 384 shows the amino acid sequences of the CDR2-H of one of the humanized antibodies called 7G3.

Под SEQ ID NO: 385 показана аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи гуманизированного антитела, называемого 7G3.Under SEQ ID NO: 385 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of the humanized antibody, called 7G3.

Под SEQ ID NO: 386 показана аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1, как представлено в WO 2015026892.Shown under SEQ ID NO: 386 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as shown in WO 2015026892.

Под SEQ ID NO: 387 показана аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3, как представлено в WO 2015026892.Shown under SEQ ID NO: 387 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as shown in WO 2015026892.

Под SEQ ID NO: 388 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле I из антителоподобных связывающих белков, называемых Fab hz20G6xhz7G3, CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3 и CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.Under SEQ ID NO: 388 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula I of the antibody-like binding proteins called Fab hz20G6xhz7G3, CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3 and CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 389 показана аминокислотная последовательность линкерной последовательности (Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly).Under SEQ ID NO: 389 shows the amino acid sequence of the linker sequence (Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly).

Под SEQ ID NO: 390 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab hz20G6xhz7G3.Under SEQ ID NO: 390 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 391 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле IV из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3.Under SEQ ID NO: 391 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula IV from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 392 показана аминокислотная последовательность Fc2-области из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 392 shows the amino acid sequence of the F c2 region from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 393 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле IV из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3.Under SEQ ID NO: 393 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula IV from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 394 показана аминокислотная последовательность Fc-области из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3. Под SEQ ID NO: 395 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 394 shows the amino acid sequence of the Fc region from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3. Under SEQ ID NO: 395 shows the amino acid sequence of the polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 396 показана аминокислотная последовательность Fc-области из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 396 shows the amino acid sequence of the Fc region from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 397 показана аминокислотная последовательность Fc-stump (Fc3) из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 397 shows the amino acid sequence of Fc-stump (Fc 3 ) from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 398 показана аминокислотная последовательность Fc-stump (Fc3) из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 398 shows the amino acid sequence of Fc-stump (Fc 3 ) from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 399 показана аминокислотная последовательность полипептида согласно формуле II из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 399 shows the amino acid sequence of a polypeptide according to formula II from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.

Под SEQ ID NO: 400 показана аминокислотная последовательность Fc-stump (Fc3) из антителоподобного связывающего белка, называемого CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.SEQ ID NO: 400 shows the amino acid sequence of Fc-stump (Fc3) from an antibody-like binding protein called CODV-Fab-OL1a hz20G6xhz7G3.

Фигурыfigures

Фиг. 1 - выравнивания последовательностей областей VH антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10, 3H6-D2.Fig. 1 - sequence alignments of the VH regions of antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6-C9, 10F4-C10 , 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10, 3H6-D2.

Фиг. 2 - выравнивания последовательностей областей VL антител к CD3, называемых 20G6-F3, 4B4-D7, 4Е7-С9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11Н3-Е5, 13Н2-С2, 13C1-F6, 1Е6-С9, 10F4-C10, 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10, 3H6-D2.Fig. 2 - sequence alignments of the VL regions of antibodies to CD3, called 20G6-F3, 4B4-D7, 4E7-C9, 18F5-H10, 11D7-C3, 11H3-E5, 13H2-C2, 13C1-F6, 1E6-C9, 10F4-C10 , 10E6-G6, 18G9-H11, 11F3-B9, 12G3-E8, 5B1-G2, 16F8-A7, 11F9-F8, 20E5-F10, 20B5-F10, 3H6-D2.

Фиг. 3 - выравнивания последовательностей областей VH и VL антител к CD123, называемых 1E1- 87 041572Fig. 3 - Sequence alignments of the VH and VL regions of the anti-CD123 antibodies referred to as 1E1- 87 041572

G5, 6D6-B8, 8В11-В7, 9F6-G3.G5, 6D6-B8, 8B11-B7, 9F6-G3.

Фиг. 4 - выравнивания последовательностей областей VH и VL антител к CD123, называемыхFig. 4 - Sequence alignments of the VH and VL regions of antibodies to CD123, called

6С10-С4, 9B8-G6, 9D7-C8.6C10-C4, 9B8-G6, 9D7-C8.

Фиг. 5 и 7 - IV введение полностью человеческого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, каждые 3 дня, в присутствии Т-клеток человека подавляет рост опухоли Molm13 во всем теле при всех тестируемых дозах.Fig. 5 and 7 - IV administration of fully human CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, every 3 days, in the presence of human T-cells suppresses growth of Molm13 tumor throughout the body at all tested doses.

Фиг. 6 и 8 - IV введение полностью человеческого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, каждые 3 дня, в присутствии Т-клеток человека сопряжено с регрессией опухоли в длинных костях при всех тестируемых дозах.Fig. 6 and 8 - IV administration of fully human CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3 every 3 days in the presence of human T cells is associated with tumor regression in long bones at all tested doses.

Фиг. 9 и 11 - IV введение полностью человеческого CODV-Fab hz20G6xhz7G3 в присутствии Тклеток человека подавляет рост опухоли.Fig. 9 and 11 IV administration of the fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 in the presence of human T cells inhibits tumor growth.

Фиг. 10 и 12 - IV введение полностью человеческого CODV-Fab hz20G6xhz7G3 в присутствии Тклеток человека сопряжено с регрессией опухоли в длинных костях.Fig. 10 and 12 - IV administration of the fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 in the presence of human T cells is associated with tumor regression in long bones.

Фиг. 13 и 15 - CIP введение полностью человеческого CODV-Fab hz20G6xhz7G3 в присутствии Тклеток человека подавляет рост опухоли во всем теле при дозировке, составляющей 0,13 нмоль/кг/день или выше.Fig. 13 and 15 - CIP administration of fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 in the presence of human T cells inhibits tumor growth throughout the body at a dosage of 0.13 nmol/kg/day or higher.

Фиг. 14 и 16 - CIP введение полностью человеческого CODV-Fab hz20G6xhz7G3 в присутствии Тклеток человека подавляет рост опухоли в длинных костях при дозировке, составляющей 0,13 нмоль/кг/день или выше.Fig. 14 and 16 - CIP administration of fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 in the presence of human T cells inhibits tumor growth in long bones at a dosage of 0.13 nmol/kg/day or higher.

Фиг. 17 - схематическое изображение структуры CODV-Ig, CODV-Fab-TL и CODV-Fab-OL (дополнительно показаны мутации LALA (если применяется Fc из остова IgG1) и мутации типа выступ-вовпадину).Fig. 17 is a schematic representation of the structure of CODV-Ig, CODV-Fab-TL, and CODV-Fab-OL (further showing LALA mutations (if Fc from the IgG1 backbone is used) and lip-to-bottom mutations).

ПримерыExamples

Пример 1. Получение антител.Example 1. Obtaining antibodies.

1.1. Конструирование плазмиды экспрессии для слияния hCD3ε/δ-hFc (CD3ed-Fc).1.1. Construction of an expression plasmid for the hCD3ε/δ-hFc fusion (CD3ed-Fc).

С применением кДНК-содержащих плазмид в качестве матрицы получали белки слияния, содержащие CD3ε и CDδ человека и Масаса fascicularis, как подробно описано в данном документе ниже, в рамке считывания с константной областью тяжелой цепи, включая шарнирную область, домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG человека, дополнительно несущей метку 8 x His или Strep-II для необязательной тандемной очистки.Using cDNA-containing plasmids as a template, fusion proteins were generated containing CD3ε and CDδ of human and Macaca fascicularis, as detailed herein below, in frame with the heavy chain constant region, including the hinge region, CH2 and CH3 domains of human IgG immunoglobulin. additionally labeled with 8 x His or Strep-II for optional tandem cleaning.

С применением геномной ДНК человека в качестве матрицы амплифицировали внеклеточные домены субъединиц CD3ε человека и CDδ человека, включая сигнальную последовательность. Полученные в результате амплифицированные, расщепленные и очищенные продукты ПЦР объединяли с помощью лигирующей ПЦР и лигировали в вектор экспрессии для млекопитающих pXL с помощью способа InFusion, используя сайты для NheI и HindIII. Каждую субъединицу клонировали в одну плазмиду. Последовательность полученного в результате белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD3ε человека с меткой His, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 3. Аминокислоты 1-104 из SEQ ID NO: 3 соответствуют аминокислотам 23-126 полноразмерного белка CD3ε человека дикого типа (раскрыт в данном документе под SEQ ID NO: 1, доступной в базе данных Uniprot под номером доступа Р07766) и, таким образом, внеклеточному домену CD3ε человека.Using human genomic DNA as a template, the extracellular domains of the human CD3ε and human CDδ subunits, including the signal sequence, were amplified. The resulting amplified, digested and purified PCR products were pooled by ligation PCR and ligated into the mammalian expression vector pXL by InFusion using the NheI and HindIII sites. Each subunit was cloned into one plasmid. The sequence of the resulting fusion protein containing Fc and His-tagged mature human CD3ε is disclosed herein under SEQ ID NO:3. disclosed herein under SEQ ID NO: 1, available from the Uniprot database under accession number P07766) and thus the extracellular domain of human CD3ε.

С применением геномной ДНК макака-крабоеда в качестве матрицы амплифицировали внеклеточные домены CD3ε и CD3δ Масаса fascicularis, включая сигнальную последовательность. Полученные в результате амплифицированные, расщепленные и очищенные продукты ПЦР объединяли с помощью лигирующей ПЦР и лигировали в вектор экспрессии для млекопитающих pXL с помощью способа InFusion, используя NheI и HindIII. Каждую субъединицу клонировали в одну плазмиду. Полученные в результате последовательности белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD3ε Масаса fascicularis, раскрыты под SEQ ID NO: 4. Аминокислоты 1-95 из SEQ ID NO: 3 соответствуют аминокислотам 23-117 полноразмерного белка CD3ε Масаса fascicularis и, таким образом, составляют внеклеточный домен полноразмерного CD3ε Масаса fascicularis дикого типа (раскрыт в данном документе под SEQ ID NO: 2, доступной в базе данных Uniprot под номером доступа Q95LI5). Клонированный белок слияния дополнительно содержит одну замену аланина на валин в аминокислотном положении 35 по сравнению с аминокислотным положением 57 последовательности дикого типа.Using cynomolgus monkey genomic DNA as a template, the extracellular domains of CD3ε and CD3δ of Macac fascicularis were amplified, including the signal sequence. The resulting amplified, digested and purified PCR products were pooled by ligation PCR and ligated into the pXL mammalian expression vector using the InFusion method using NheI and HindIII. Each subunit was cloned into one plasmid. The resulting fusion protein sequences containing Fc and mature Macac fascicularis CD3ε are disclosed under SEQ ID NO:4. wild-type Macaca fascicularis full-length CD3ε domain (disclosed herein under SEQ ID NO: 2, available from the Uniprot database under accession number Q95LI5). The cloned fusion protein further contains one alanine to valine substitution at amino acid position 35 compared to amino acid position 57 of the wild-type sequence.

1.2. Экспрессия и очистка CD3ed-Fc человека и макака-крабоеда.1.2. Expression and purification of human and cynomolgus CD3ed-Fc.

Клетки Freestyle HEK293, выращиваемые в виде суспензионной культуры в бессывороточной среде F17 (Life), временно трансфицировали плазмидой экспрессии. Совместную трансфекцию обеими плазмидами, представляющими субъединицу внеклеточного домена (ECD) CD3ε и CD3δ, выполняли с применением реагента для трансфекции Cellfectin (Life). Клетки культивировали при 37°С в течение 7 дней. Культуральный супернатант, содержащий рекомбинантный белок, собирали путем центрифугирования и очищали от примесей путем фильтрации (0,22 мкм).Freestyle HEK293 cells grown as a suspension culture in F17 serum-free medium (Life) were transiently transfected with the expression plasmid. Co-transfection with both plasmids representing the extracellular domain (ECD) subunit of CD3ε and CD3δ was performed using the Cellfectin (Life) transfection reagent. Cells were cultured at 37°C for 7 days. The culture supernatant containing the recombinant protein was collected by centrifugation and purified from impurities by filtration (0.22 μm).

Для очистки варианты белка слияния, содержащего Fc, захватывали на матрице с белком A (GE) иFor purification, Fc-containing fusion protein variants were captured on a Protein A (GE) matrix and

- 88 041572 элюировали с помощью градиента рН. После доочистки белка с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с применением Superdex 200 (GE) и конечной стадии концентрирования ультрафильтрацией белок применяли для дальнейших анализов.- 88 041572 was eluted with a pH gradient. After further purification of the protein by size exclusion chromatography (SEC) using Superdex 200 (GE) and a final concentration step by ultrafiltration, the protein was used for further analyses.

Гетеродимер белка человека дополнительно наносили на колонку His-Trap (GE) после захвата на белке А и обессоливали. Элюированный белок наносили на колонку со стрептавидином (GE) и элюировали с помощью d-дестиобиотина перед конечной доочистки с помощью SEC с применением Superdex 200 (GE). Эту стратегию применяли для отделения гетеродимеров от гомодимеров.The human protein heterodimer was additionally applied to a His-Trap (GE) column after being captured on Protein A and desalted. The eluted protein was loaded onto a streptavidin (GE) column and eluted with d-destiobiotin before final SEC post-purification using Superdex 200 (GE). This strategy was used to separate heterodimers from homodimers.

1.3. Получение антител с перекрестной реактивностью к CD3 человека/макака-крабоеда кДНК CD3ε и CD3δ человека и Масаса fascicularis клонировали в проприетарные векторы для иммунизации от Aldevron (pB8 и VV8, соответственно) и применяли для генной иммунизации крыс. Крыс в группе иммунизации MR12-266 (CD3-cyno) сначала иммунизировали с помощью кДНК CD3ε и CD3δ человека, с последующими двумя дополнительными иммунизациями с помощью смеси кДНК CD3ε и CD3δ человека и Масаса fascicularis. Забор иммунной сыворотки проводили в день 24 протокола иммунизации, после 4 применений генной иммунизации (IS24d-4). Сыворотку, разведенную в PBS с 1% BSA, тестировали с помощью проточной цитометрии с применением клеток млекопитающих, временно трансфицированных целевыми кДНК в экспериментах совместной трансфекции для получения TCR-комплексов из CD3ε и CD3δ человека и Масаса fascicularis. Кроме того, иммунные сыворотки тестировали на следующих линиях клеток: Jurkat Е6-1 (экспрессирующая TCR человека), Jurkat-RT-Т3.5 (отрицательная в отношении TCR) и HSC-F макака-крабоеда (экспрессирующая TCR макака-крабоеда); при этом не была доступна линия клеток, отрицательная в отношении TCR макака-крабоеда. В качестве вторичного антитела применяли конъюгат антитела козы к IgG крысы с R-фикоэритрином (Southern Biotech, № 3030-09) при концентрации 10 мкг/мл.1.3. Generation of antibodies with cross-reactivity to human CD3/cynomolgus monkey cDNA of human CD3ε and CD3δ and Macaca fascicularis were cloned into proprietary immunization vectors from Aldevron (pB8 and VV8, respectively) and used for gene immunization of rats. Rats in the MR12-266 (CD3-cyno) immunization group were first immunized with human CD3ε and CD3δ cDNA, followed by two additional immunizations with a mixture of human CD3ε and CD3δ cDNA and Macaca fascicularis. Immune sera were collected on day 24 of the immunization protocol, after 4 applications of gene immunization (IS24d-4). Serum diluted in PBS with 1% BSA was tested by flow cytometry using mammalian cells transiently transfected with the target cDNA in co-transfection experiments to generate TCR complexes from human CD3ε and CD3δ and Macaca fascicularis. In addition, immune sera were tested on the following cell lines: Jurkat E6-1 (expressing human TCR), Jurkat-RT-T3.5 (negative for TCR), and cynomolgus HSC-F (expressing cynomolgus TCR); however, no cell line was available that was negative for the cynomolgus TCR. Goat anti-rat IgG conjugate with R-phycoerythrin (Southern Biotech, no. 3030-09) was used as a secondary antibody at a concentration of 10 μg/ml.

Специфическую реактивность иммунной сыворотки, в частности в отношении клеток, трансфицированных комбинациями кДНК CD3ε и CD3δ, можно было обнаружить у иммунизированных животных в сравнении с клетками, трансфицированными нерелевантной кДНК. То же было действительным в тесте с TCR-положительной линией клеток Jurkat (Е6-1) в сравнении с TCR-отрицательной линией клеток (RTT3.5), при этом значительно более слабые сигналы, но все еще значимые сигналы, обнаружили на линии клеток HSC-F яванского макака (см. табл. 1).Specific immune sera reactivity, in particular against cells transfected with CD3ε and CD3δ cDNA combinations, could be detected in immunized animals compared to cells transfected with irrelevant cDNA. The same was valid in the test with the TCR-positive Jurkat cell line (E6-1) compared to the TCR-negative cell line (RTT3.5), with significantly weaker signals, but still significant signals, found in the HSC cell line -F of the cynomolgus macaque (see Table 1).

Таблица 1. Обнаружение специфической реактивности иммунных сывороток в отношении TCRкомплекса у каждого животного с помощью проточной цитометрии. Данные представлены в виде геометрических средних значений относительной интенсивности флуоресценции (rfu)Table 1. Detection of specific reactivity of immune sera against the TCR complex in each animal by flow cytometry. Data are presented as geometric means of relative fluorescence intensity (rfu)

pXL-CD3eчеловека+pXLСОЗс1-человека pXL-CD3ehuman+pXLCOZc1-human pXL-CD3eмакакакрабоеда+pXLС03с1-макакакрабоеда pXL-CD3emaca as a beetle+pXLC03c1-maca as a beetle рВ1_ нерелевантный pB1_ irrelevant Jurkat- Е6-1 Jurkat- E6-1 Jurkat- RT-T3.5 Jurkat- RT-T3.5 HSC-F макакакрабоеда HSC-F monkey eater без первичного антитела without primary antibodies 5 5 5 5 4 4 7 7 10 10 6 6 ОКТЗ OKTZ - - - - - - 858 858 25 25 - - FN18 FN18 - - - - 4 4 7 7 10 10 1256 1256 Антитело мыши к НА Antibody mice to ON 6 6 6 6 - - - - - - - - Антитело крысы к тус Antibody rats to tus 9 9 7 7 1033 1033 10 10 14 14 9 9 крыса № 1 rat No. 1 1:1000 1:1000 290 290 273 273 5 5 186 186 36 36 55 55 1:5000 1:5000 79 79 86 86 5 5 65 65 21 21 20 20 крыса № 2 rat no. 2 1:1000 1:1000 499 499 401 401 5 5 390 390 55 55 75 75 1:5000 1:5000 147 147 110 110 4 4 126 126 28 28 25 25

- 89 041572- 89 041572

крыса № 3 rat no. 3 1:1000 1:1000 239 239 247 247 5 5 108 108 30 thirty 31 31 1:5000 1:5000 89 89 92 92 4 4 32 32 17 17 9 9 крыса № 4 rat no. 4 1:1000 1:1000 280 280 283 283 5 5 176 176 37 37 73 73 1:5000 1:5000 97 97 110 110 4 4 55 55 22 22 23 23 крыса № 5 rat no. 5 1:1000 1:1000 208 208 137 137 4 4 99 99 31 31 11 eleven 1:5000 1:5000 61 61 65 65 4 4 47 47 19 19 7 7

Крыс в группе иммунизации MR12-265 (CD3 человека) совместно иммунизировали с помощью кДНК CD3b и CD3δ, человека, клонированных в соответствующие векторы экспрессии. Забор иммунной сыворотки проводили в день 24 протокола иммунизации, после 4 применений генной иммунизации (IS24d-4). Сыворотку, разведенную в PBS c1% BSA, тестировали с помощью проточной цитометрии с применением клеток млекопитающих, временно трансфицированных вышеупомянутыми целевыми кДНК в экспериментах совместной трансфекции для получения TCR-комплексов CD3s и CD35 человека и Масаса fascicularis. В качестве вторичного антитела применяли конъюгат антитела козы к IgG крысы с R-фикоэритрином (Southern Biotech, № 3030-09) при концентрации 10 мкг/мл. Кроме того, иммунные сыворотки тестировали на следующих линиях клеток: Jurkat Е6-1 (экспрессирующая TCR человека), Jurkat-RT-Т3.5 (отрицательная в отношении TCR) и HSC-F макака-крабоеда (экспрессирующая TCR макакакрабоеда); при этом не была доступна линия клеток, отрицательная в отношении TCR макака-крабоеда. В качестве вторичного антитела применяли конъюгат антитела козы к IgG крысы с R-фикоэритрином (Southern Biotech, № 3030-09) при концентрации 10 мкг/мл.Rats in the MR12-265 (human CD3) immunization group were co-immunized with human CD3b and CD3δ cDNA cloned into their respective expression vectors. Immune sera were collected on day 24 of the immunization protocol, after 4 applications of gene immunization (IS24d-4). Serum diluted in PBS c1% BSA was tested by flow cytometry using mammalian cells transiently transfected with the above target cDNA in co-transfection experiments to generate TCR complexes of human CD3s and CD35 and Macaca fascicularis. Goat anti-rat IgG conjugate with R-phycoerythrin (Southern Biotech, no. 3030-09) was used as a secondary antibody at a concentration of 10 μg/ml. In addition, immune sera were tested on the following cell lines: Jurkat E6-1 (expressing human TCR), Jurkat-RT-T3.5 (negative for TCR), and cynomolgus HSC-F (expressing cynomolgus TCR); however, no cell line was available that was negative for the cynomolgus TCR. Goat anti-rat IgG conjugate with R-phycoerythrin (Southern Biotech, no. 3030-09) was used as a secondary antibody at a concentration of 10 μg/ml.

Специфическую реактивность иммунных сывороток, в частности в отношении клеток, трансфицированных комбинациями кДНК CD3s и CD3δ, можно было обнаружить у иммунизированных животных при сравнении с клетками, трансфицированными нерелевантной кДНК. То же было действительным в тесте с TCR-положительной линией клеток Jurkat (Е6-1) в сравнении с TCR-отрицательной линией клеток (RT-T3.5), но значительно более слабые сигналы (однако у положительных крыс все еще значимые) обнаружили у линии клеток HSC-F макака-крабоеда (см. табл. 2).Specific reactivity of immune sera, in particular against cells transfected with combinations of CD3s and CD3δ cDNA, could be detected in immunized animals when compared with cells transfected with irrelevant cDNA. The same was valid in the test with the TCR-positive Jurkat cell line (E6-1) compared to the TCR-negative cell line (RT-T3.5), but significantly weaker signals (but still significant in positive rats) were found in cynomolgus monkey HSC-F cell lines (Table 2).

Таблица 2. Обнаружение специфической реактивности иммунных сывороток в отношении TCRкомплекса у каждого животного с помощью проточной цитометрии. Данные представлены в виде геометрических средних значений относительной интенсивности флуоресценции (rfu)Table 2. Detection of specific reactivity of immune sera against the TCR complex in each animal by flow cytometry. Data are presented as geometric means of relative fluorescence intensity (rfu)

pXL-CD3eчеловека+pXLСОЗД-человека pXL-CD3ehuman+pXLCREAT-human pXL-CD3eмакака-крабоеда+pXLСОЗД-макака-крабоеда pXL-CD3ecrabeater monkey+pXLCREATION-crabeater monkey рВ1_ нерелевантный pB1_ irrelevant Jurkat- Е6-1 Jurkat- E6-1 Jurkat- RT-T3.5 Jurkat- RT-T3.5 HSC-F макакакрабоеда HSC-F monkey eater без первичного антитела without primary antibodies 5 5 5 5 4 4 7 7 10 10 6 6 ОКТЗ OKTZ - - - - - - 858 858 25 25 - - FN18 FN18 - - - - 4 4 7 7 10 10 1256 1256 Антитело МЫШИ к НА Antibody MOUSE to ON 6 6 6 6 - - - - - - - - Антитело крысы к тус Antibody rats to tus 9 9 7 7 1033 1033 10 10 14 14 9 9 крыса rat 1:1000 1:1000 230 230 132 132 5 5 170 170 33 33 50 50 № 1 No. 1 1:5000 1:5000 78 78 40 40 4 4 54 54 19 19 15 15 крыса № 2 rat No. 2 1:1000 1:1000 216 216 136 136 6 6 216 216 48 48 32 32 1:5000 1:5000 75 75 40 40 4 4 66 66 24 24 11 eleven

- 90 041572- 90 041572

крыса № 3 rat No. 3 1:1000 1:1000 73 73 54 54 5 5 56 56 25 25 7 7 1:5000 1:5000 25 25 20 20 4 4 23 23 15 15 6 6 крыса № 4 rat No. 4 1:1000 1:1000 70 70 56 56 5 5 41 41 25 25 8 8 1:5000 1:5000 25 25 18 18 4 4 15 15 15 15 6 6 крыса № 5 rat No. 5 1:1000 1:1000 65 65 37 37 5 5 42 42 20 20 7 7 1:5000 1:5000 24 24 17 17 4 4 17 17 14 14 6 6

Крыс с положительными сыворотками умерщвляли и В-клетки сливали с клетками миеломы мыши. Полученные в результате гибридомы скринировали на клетках HEK293, трансфицированных плазмидами экспрессии CD3ε и CD3δ человека или макака-крабоеда, на клетках Jurkat E6.1 (CD3+) и Jurkat T3.5 (CD3-) с помощью проточной цитометрии. Супернатант клонов гибридомы применяли для оценки с помощью поверхностного плазмонного резонанса кинетики реакции с комплексом CD3ε/δ человека и Масаса fascicularis методом одной точки путем фиксирования аналита при 25 нМ (данные представлены в табл. 3).Sera positive rats were sacrificed and B cells fused with mouse myeloma cells. The resulting hybridomas were screened on HEK293 cells transfected with human or cynomolgus CD3ε and CD3δ expression plasmids, on Jurkat E6.1 (CD3+) and Jurkat T3.5 (CD3-) cells by flow cytometry. The supernatant of the hybridoma clones was used to evaluate the kinetics of the reaction with the human CD3ε/δ complex and Macac fascicularis using the single point method by fixing the analyte at 25 nM using surface plasmon resonance (data are presented in Table 3).

Таблица 3. Обнаружение специфической реактивности супернатантов различных клонов гибридомы с помощью проточной цитометрии и анализа Biacore. Супернатанты тестировали на различных линиях клеток (Jurkat E6-1, Jurkat-RT-T3.5 и HSC-F макака-крабоеда). Анализ Biacore проводили в отношении комплексов CD3e/d человека и макака-крабоеда соответственноTable 3. Detection of specific reactivity of supernatants of various hybridoma clones by flow cytometry and Biacore analysis. Supernatants were tested on different cell lines (Jurkat E6-1, Jurkat-RT-T3.5 and HSC-F cynomolgus monkey). Biacore analysis was performed on human and cynomolgus CD3e/d complexes, respectively.

ID образца Sample ID Biacore для CD3e/6 человека [RU] при 25 нМ Biacore for human CD3e/6 [RU] at 25 nM Biacore для CD3e/6 макака-крабоеда [RU] при 25 нМ Biacore for Cynomolgus CD3e/6 [RU] at 25 nM 3G5-E10 3G5-E10 27 27 3 3 18G9-H11 18G9-H11 7 7 -7 -7 12D2-E5 12D2-E5 27 27 5 5 6С9-С9 6S9-S9 26 26 32 32 11F9-F8 11F9-F8 11,5 11.5 16 16 8H2-F3 8H2-F3 32,5 32.5 40 40 4B4-D7 4B4-D7 11 eleven 14 14 4Е7-С9 4E7-C9 2,5 2.5 10 10 13C1-F6 13C1-F6 17 17 15, 5 15.5 11D7-C3 11D7-C3 17 17 10 10 13H2-C3 13H2-C3 16 16 7 7 10E6-G6 10E6-G6 10, 5 10.5 0 0 12G3-E8 12G3-E8 24 24 17 17 11F3-B9 11F3-B9 22 22 17 17 20ЕЗ-В5 20EZ-B5 11 eleven 5 5

- 91 041572- 91 041572

10F4-C10 10F4-C10 22 22 27 27 11НЗ-Е5 11НЗ-Е5 7 7 9 9 18F5-H10 18F5-H10 η. а. η. A. η. а. η. A. 18H11-F10 18H11-F10 35 35 55 55 20E5-F10 20E5-F10 12 12 8 8 ID образца Sample ID Biacore для CD3e/6 человека [RU] при 2 5 нМ Biacore for human CD3e/6 [RU] at 2 5 nM Biacore для ΟΌ3ε/δ макака-крабоеда [RU] при 25 нМ Biacore for ΟΌ3ε/δ cynomolgus [RU] at 25 nM 3H6-D2 3H6-D2 9, 5 9.5 7 7 8C2-F7 8C2-F7 4,5 4.5 3 3 5B1-G2 5B1-G2 1 1 0,5 0.5 7B7-F10 7B7-F10 28 28 42 42 20B5-F10 20B5-F10 1 1 9, 5 9.5 16D3-E4 16D3-E4 -2 -2 -2 -2 1Е6-В8 1E6-B8 η. а. η. A. η. а. η. A. 16F8-A7 16F8-A7 17,5 17.5 22,5 22.5 11A8-D6 11A8-D6 3E8-G1 3E8-G1 20G6-F3 20G6-F3 9D7-B5 9D7-B5 η. а. η. A. η. а. η. A. 9G5-G10 9G5-G10 17A11-D3 17A11-D3

Положительные клоны размножали и соответствующие кДНК вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей выделяли с помощью RT-PCR. Последовательности VH и VL клонировали в векторы экспрессии в слиянии с одним из СН1, остовом IGHG1 или каппа-цепью человека, чтобы обеспечить экспрессию Fab-фрагментов, а также полных IgG.Positive clones were expanded and the corresponding heavy and light chain variable domain cDNAs were isolated by RT-PCR. The VH and VL sequences were cloned into expression vectors in fusion with one of the CH1, IGHG1 backbone or human kappa chain to allow expression of Fab fragments as well as complete IgG.

1.4. Экспрессия IgG и Fab-фрагментов.1.4. Expression of IgG and Fab fragments.

Плазмиды экспрессии, кодирующие тяжелую и легкую цепи IgG и Fab-фрагментов, размножали в NEB 10-бета Е.coli (происходит от DH10B). Плазмиды, применяемые для трансфекции, получали из Е.coli с применением набора Plasmid Plus от QIAGEN (№ по кат.: 12991).Expression plasmids encoding IgG heavy and light chains and Fab fragments were propagated in E. coli NEB 10beta (derived from DH10B). Plasmids used for transfection were obtained from E. coli using the Plasmid Plus kit from QIAGEN (cat no.: 12991).

Клетки HEK293-FS, выращиваемые в среде Freestyle (Invitrogen), трансфицировали с помощью указанных плазмид для LC и НС, кодирующих тяжелые цепи и легкие цепи, с применением реагента для трансфекции 293fectin (Invitrogen), как описано производителем. Клетки культивировали при 37°С во встряхивателе-инкубаторе Kuhner ISF1-X при 110 об/мин. с 8% СО2. После 7 дней культивирования клетки удаляли путем центрифугирования, добавляли 10% об./об. 1М Tris-HCl, pH 8,0 и супернатант фильтровали через фильтр на горловине флакона с размером пор 0,2 мкм для удаления частиц. Конструкции CODV-IgG1 очищали с помощью аффинной хроматографии на колонках с белком А (HP-колонки HiTrap Protein A, GE Life Sciences). После элюирования из колонки с помощью 0,1М цитрата, рН 3,0, конструкции CODV-IgG1 обессоливали с применением колонок для обессоливания HiPrep 26/10, затем составляли в PBS (Gibco 14190-136).HEK293-FS cells grown in Freestyle medium (Invitrogen) were transfected with the indicated LC and HC plasmids encoding heavy chains and light chains using the 293fectin transfection reagent (Invitrogen) as described by the manufacturer. Cells were cultured at 37°C in a Kuhner ISF1-X shaker-incubator at 110 rpm. with 8% CO2. After 7 days of cultivation, the cells were removed by centrifugation, 10% v/v was added. 1M Tris-HCl, pH 8.0 and the supernatant were filtered through a 0.2 µm vial neck filter to remove particles. The CODV-IgG1 constructs were purified by affinity chromatography on Protein A columns (HP columns HiTrap Protein A, GE Life Sciences). After eluting from the column with 0.1 M citrate, pH 3.0, the CODV-IgG1 constructs were desalted using HiPrep 26/10 desalting columns, then formulated in PBS (Gibco 14190-136).

Биспецифические конструкции CODV-Fab очищали с помощью высокоэффективных колонок HisTrap (GE Healthcare, № по кат.: 17-5248-02). После элюирования из колонки (элюирующий буфер: 20 мМ фосфат натрия, 0,5М NaCl, 500 мМ имидазола, рН 7,4) фракции, содержащие белок, объединяли и обессоливали с применением колонок для обессоливания HiPrep 26/10, затем составляли в PBS (Gibco 14190136).The bispecific CODV-Fab constructs were purified using HisTrap high performance columns (GE Healthcare, Cat #: 17-5248-02). After elution from the column (elution buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4), protein containing fractions were pooled and desalted using HiPrep 26/10 desalting columns, then compiled in PBS ( Gibco 14190136).

Для отделения мономеров от агрегатов выполняли стадию фракционирования высокого разрешения в PBS (Gibco 14190-136) для обеих конструкций, CODV-IgG и CODV-Fab-фрагмента с применением колонки на 320 мл HiLoad Superdex 200 26/60 (GE Healthcare, № по кат.: 29-9893-36). Фракции мономеров объединяли и концентрировали до 1 мг/мл с применением колонки для центрифугирования Vivaspin 20 (VS2002, Sartorius Stedim biotech) и фильтровали с применением мембраны с размером пор 0,22 мкм (шприцевые фильтры Millex® SLGV033RS).To separate monomers from aggregates, a high resolution fractionation step in PBS (Gibco 14190-136) was performed on both constructs, CODV-IgG and CODV-Fab fragment, using a 320 ml HiLoad Superdex 200 26/60 column (GE Healthcare, cat # .: 29-9893-36). Monomer fractions were pooled and concentrated to 1 mg/mL using a Vivaspin 20 centrifuge column (VS2002, Sartorius Stedim biotech) and filtered using a 0.22 µm membrane (Millex® SLGV033RS syringe filters).

Концентрацию белка определяли путем измерения поглощения при 280 нм. Каждую партию анализировали с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях для определения чистоты и молекулярной массы каждой субъединицы и мономера.The protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm. Each batch was analyzed by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions to determine the purity and molecular weight of each subunit and monomer.

1.5. Оценка аффинности антител к CD3.1.5. Assessment of the affinity of antibodies to CD3.

- 92 041572- 92 041572

1.5.1. Оценка аффинности к обоим CD3ε/δ человека и Масаса fascicularis.1.5.1. Affinity assessment for both human CD3ε/δ and Maca fascicularis.

Аффинности связывания Fab или CODV-Fab, связывающих CD3, измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением инструмента Biacore3000 (GE Healthcare). Буфер для анализа представлял собой HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Захват белков слияния CD3ε/δ-Fc обеспечивали с применением набора для захвата человеческих антител (GE Healthcare). Захватывающее антитело связывали на чипах СМ5 (BR-1001-88, GE Healthcare) до примерно 12000 RU с применением набора для аминного связывания (BR-100-50, GE Healthcare). Белки слияния CD3εδ-Fc захватывали при 10 мл/мин до примерно 70 RU с получением значений Rmax, составляющих 30 RU. Кинетику связывания с Fab или CODV-Fab к CD3 измеряли при 30 мкл/мин в течение 240 и 600 с для фазы ассоциации и диссоциации соответственно. Применяли двукратные разведения Fab от 3 до 400 нМ в буфере для анализа. Все концентрации Fab прогоняли в двух повторностях совместно с контролем буфером в двух повторностях для обеспечения двойного контроля. Регенерацию поверхности захвата обеспечивали с помощью 1минутной инъекции раствора 3М MgCl2 при скорости 30 мкл/мин. Для анализа данных применяли программное обеспечение BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Данные аппроксимировали в целом с помощью 1:1 модели Лэнгмюра с массообменом.The binding affinities of CD3 binding Fab or CODV-Fab were measured by surface plasmon resonance (SPR) using the Biacore3000 instrument (GE Healthcare). The assay buffer was HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Capture of CD3ε/δ-Fc fusion proteins was achieved using a human antibody capture kit (GE Healthcare). The capture antibody was bound on CM5 chips (BR-1001-88, GE Healthcare) to about 12,000 RU using an amine coupling kit (BR-100-50, GE Healthcare). CD3εδ-Fc fusion proteins were captured at 10 ml/min up to about 70 RU to give Rmax values of 30 RU. The kinetics of binding to Fab or CODV-Fab to CD3 was measured at 30 μl/min for 240 and 600 s for the association and dissociation phase, respectively. Two-fold dilutions of Fab from 3 to 400 nM in assay buffer were used. All Fab concentrations were run in duplicate with buffer control in duplicate to provide a dual control. Regeneration of the capture surface was provided with a 1 minute injection of a 3M MgCl 2 solution at a rate of 30 μl/min. BIAevaluation v.4.1 software (GE Healthcare) was used for data analysis. The data were approximated as a whole using a 1:1 Langmuir model with mass transfer.

Измерение аффинности связывания IgG и белков CODV-Fc к CD3 осуществляли аналогично анализу связывания для Fab и CODV-Fab за исключением захватывающего антитела. В данном случае набор His Capture (28-9950-56, GE Healthcare) применяли для захвата белка CD3-Fc человека посредством метки His. Для анализа связывания CD3-Fc Масаса fascicularis в качестве захватывающего антитела применяли классическое антитело Strep-MAB (2-1507-001, IBA). В данном случае раствор для регенерации представлял собой 10 мМ глициновый буфер, рН 2,0.Measurement of the binding affinity of IgG and CODV-Fc proteins for CD3 was performed similarly to the binding assay for Fab and CODV-Fab except for the capture antibody. In this case, the His Capture Kit (28-9950-56, GE Healthcare) was used to capture human CD3-Fc protein via a His tag. For the CD3-Fc binding assay of Macaca fascicularis, the classical antibody Strep-MAB (2-1507-001, IBA) was used as the capture antibody. In this case, the regeneration solution was 10 mM glycine buffer, pH 2.0.

Таблица 4. Аффинности выбранных антител к CD3 в отношении CD3ε/δ-комплексов человека и Масаса fascicularis, измеренные с помощью BiacoreTable 4. Affinities of selected anti-CD3 antibodies for human CD3ε/δ complexes and Macac fascicularis measured with Biacore

CD3 εδ CD3εδ Клон (Fabфрагмент) Clone (Fabfragment) ка (1/Мс) ka (1/ms) kd (1/с) kd (1/s) Rmax (RU) Rmax (RU) KD (Μ) KD (M) Chi2 Chi 2 Соотношение KD (макаккрабоед) /KD (человек) Ratio of KD (macaque crab-eater) / KD (human) человек Human 12D2-E5 12D2-E5 5, 4Е+ 06 5, 4E+ 06 6,2Е-03 6.2E-03 35 35 1,2Ε- 09 1,2Ε- 09 0,34 0.34 4 4 макак- крабоед macaques- crabeater 12D2-E5 12D2-E5 Равновесное состояние equilibrium state Равновесное состояние equilibrium state 8 8 4, 8Ε- 09 4, 8Ε- 09 0, 129 0.129 человек Human 10E6-G6 10E6-G6 1,4Е+ 05 1.4E+ 05 2,0Е-03 2.0E-03 37 37 1,4Ε- 08 1,4Ε- 08 0,218 0.218 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 10E6-G6 10E6-G6 1,9Е+ 05 1.9E+ 05 2,4Е-03 2.4E-03 18 18 1, ЗЕ- 08 1, SE- 08 0,218 0.218 человек Human 4Е7-С9 4E7-C9 8,9Е+ 04 8.9E+ 04 1,6Е-03 1.6E-03 29 29 1,7Ε- 08 1.7Ε- 08 0,244 0.244 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 4Е7-С9 4E7-C9 9, 8Е+ 04 9, 8E+ 04 1,5Е-03 1.5E-03 20 20 1,5Ε- 08 1.5Ε- 08 0,232 0.232 человек Human 12G3-E8 12G3-E8 1, 1Е+ 05 1, 1E+ 05 1,1Е-03 1.1E-03 30 thirty 9, ЗЕ- 09 9, SE- 09 0,307 0.307 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 12G3-E8 12G3-E8 1,7Е+ 05 1.7E+ 05 1,8Е-03 1.8E-03 15 15 1, 0Е- 08 1, 0E- 08 0,349 0.349 человек Human 5B1-G2 5B1-G2 6, 0Е+ 04 6.0E+ 04 3,9Е-04 3.9E-04 36 36 6, ЗЕ- 09 6, SE- 09 0,218 0.218 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 5B1-G2 5B1-G2 3,4Е+ 04 3.4E+ 04 1,5Е-04 1.5E-04 20 20 4, ЗЕ- 09 4, SE- 09 2,1 2.1 человек Human 18F5- Н10 18F5- H10 2,0Е+ 05 2.0E+ 05 1,8Е-04 1.8E-04 28 28 8,9Е- 10 8.9E- 10 0, 235 0.235 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 18F5- Н10 18F5- H10 1,4Е+ 05 1.4E+ 05 1,ЗЕ-04 1,ZE-04 15 15 8,9Е- 10 8.9E- 10 0,224 0.224

- 93 041572- 93 041572

человек Human 18G9- Н11 18G9- H11 2,5Е+ 05 2.5E+ 05 1,1Е-03 1.1E-03 31 31 4,4Е- 09 4.4E- 09 0, 975 0.975 6 6 макак- крабоед macaques- crabeater 18G9- Н11 18G9- H11 5, 1Е+ 04 5, 1E+ 04 1,2Е-03 1.2E-03 18 18 2,4Е- 08 2.4E- 08 0, 617 0.617 человек Human 4B4-D7 4B4-D7 1, 1Е+ 05 1, 1E+ 05 2,9Е-03 2.9E-03 22 22 2,ЗЕ- 08 2,ZE- 08 0, 147 0.147 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 4B4-D7 4B4-D7 1,1Е+0 5 1.1E+0 5 2,7Е-03 2.7E-03 12 12 2,4Е- 08 2.4E- 08 0, 188 0.188 человек Human 1Е6-В8 1E6-B8 9, ЗЕ+ 04 9, WE+ 04 3,9Е-03 3.9E-03 26 26 4, 1Е- 08 4, 1E- 08 0, 157 0.157 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 1Е6-В8 1E6-B8 1, 0Е+ 05 1, 0E+ 05 4,2Е-03 4.2E-03 15 15 4,2Е- 08 4.2E- 08 0, 122 0.122 человек Human 13H2-C3 13H2-C3 1,7Е+ 05 1.7E+ 05 4,9Е-03 4.9E-03 20 20 2,9Е- 08 2.9E- 08 0,317 0.317 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 13H2-C3 13H2-C3 1, 8Е+ 05 1, 8E+ 05 5,9Е-03 5.9E-03 12 12 3,2Е- 08 3.2E- 08 0,166 0.166 человек Human 20G6-F3 20G6-F3 3,5Е+ 04 3.5E+ 04 2,7Е-04 2.7E-04 21 21 3, ЗЕ- 09 3, SE- 09 0,208 0.208 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 20G6-F3 20G6-F3 2,7Е+ 04 2.7E+ 04 2,2Е-04 2.2E-04 15 15 8,2Е- 09 8.2E- 09 0, 184 0.184 человек Human 11F9-F8 11F9-F8 7,7Е+ 04 7.7E+ 04 4,0Е-04 4.0E-04 22 22 5, 2Е- 09 5, 2E- 09 0, 137 0.137 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 11F9-F8 11F9-F8 8, ЗЕ+ 04 8, WE+ 04 3,6Е-04 3.6E-04 13 13 4,4Е- 09 4.4E- 09 0, 109 0.109 человек Human 20Е5- F10 20E5- F10 9, 9Е+ 04 9, 9E+ 04 4,ЗЕ-04 4,ZE-04 25 25 4, ЗЕ- 09 4, SE- 09 0, 125 0.125 1 1 макак- крабоед macaques- crabeater 20Е5- F10 20E5- F10 1,2Е+ 05 1.2E+ 05 3,4Е-04 3.4E-04 14 14 2,9Е- 09 2.9E- 09 0, 104 0.104 человек Human SP-34 SP-34 1, 1Е+ 06 1, 1E+ 06 3,0Е-03 3.0E-03 34 34 2, ЗЕ- 09 2, SE- 09 2, ЗЕ- 01 2, SE- 01 5 5 макак- крабоед macaques- crabeater SP-34 SP-34 2,2Е+ 05 2.2E+ 05 2,8Е-03 2.8E-03 34 34 1, ЗЕ- 08 1, SE- 08 4, ЗЕ- 01 4, SE- 01

SP-34 применяли в качестве IgG.SP-34 was used as IgG.

1.5.2. Связывание антител к CD3 с huCD3ε, huCD3δ и huCD3ε/δ, экспрессируемыми на поверхности клеток HEK293F, с помощью проточной цитометрии.1.5.2. Binding of anti-CD3 antibodies to huCD3ε, huCD3δ, and huCD3ε/δ expressed on the surface of HEK293F cells by flow cytometry.

Для анализа связывания антител с CD3ε человека и CD35 человека, экспрессируемыми на поверхности клеток, клетки HEK293F трансфицировали обеими конструкциями либо отдельно, либо в ходе совместной трансфекции, а сигналы измеряли с помощью проточной цитометрии. Для процедуры трансфекции применяли реагент для трансфекции FuGENE HD (Promega, № E2311) согласно протоколу производителя.To analyze antibody binding to human CD3ε and human CD35 expressed on the cell surface, HEK293F cells were transfected with both constructs, either alone or co-transfected, and signals were measured by flow cytometry. For the transfection procedure, FuGENE HD transfection reagent (Promega, #E2311) was used according to the manufacturer's protocol.

Клетки HEK293F высевали в среду Freestyle293 (Gibco) при плотности 6Е6 клеток на пробирку в 50-мл пробирки Cellstar Cellreactor с фильтром (Greiner bio-one). Трансфекции осуществляли в соответствии с протоколом FuGENE. Образование комплексов осуществляли в OptiMEM без фенолового красного (Gibco) при соотношении 3:1 (протокол для трансфекции клеток 293F, выращенных в 8000 мкл среды в колбах Т-25 с применением соотношения FuGENE® HD:ДНК, составляющего 3,0:1, http://www.promega.com/techserv/tools/FugeneHdTool/default.aspx).HEK293F cells were seeded in Freestyle293 medium (Gibco) at a density of 6E6 cells per tube in 50 ml Cellstar Cellreactor tubes with filter (Greiner bio-one). Transfections were performed according to the FuGENE protocol. Complexation was performed in OptiMEM without phenol red (Gibco) at a ratio of 3:1 (protocol for transfection of 293F cells grown in 8000 μl of medium in T-25 flasks using a FuGENE® HD:DNA ratio of 3.0:1, http ://www.promega.com/techserv/tools/FugeneHdTool/default.aspx).

Клетки инкубировали на встряхивателе при 37°С и 5% СО2. Через один-три дня после трансфекции клетки собирали и связывание антител анализировали с помощью проточной цитометрии.Cells were incubated on a shaker at 37°C and 5% CO 2 . One to three days after transfection, cells were harvested and antibody binding was analyzed by flow cytometry.

Антитела для окрашивания распределяли в количестве 1 мкг в 50 мкл буфера для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) на лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one). Собранные трансфицированные клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания с FBS и добавляли к антителам из расчета 50 мкл на лунку. Клетки инкубировали при 4°С в темноте в течение 30 мин и дважды промывали. В каждую лунку добавляли 0,5 мкг вторичного антитела F(ab')2 козы к IgG человека, конъюгированного с FITC (Beckman Coulter, № 732598), или F(ab')2 козы к каппа-цепи человека, конъюгированного с РЕ (Southern Biotech, № 206209) соответственно в комбинации с 0,5 мкг 7AAD в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS. Клетки инкубировали при 4°С в темноте в течение 15 мин и дважды промывали. Для измерения клетки ресуспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания с FBS. Клетки измеряли с применением MACSQuant (Miltenyi Biotec) или проточного цитометра LSRIIAntibodies for staining were distributed at 1 μg in 50 μl of FBS staining buffer (BD Pharmingen) per well in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one). The harvested transfected cells were resuspended in FBS staining buffer and added to the antibodies at 50 µl per well. Cells were incubated at 4°C in the dark for 30 min and washed twice. 0.5 µg of goat anti-human IgG F(ab')2 secondary antibody FITC conjugated (Beckman Coulter, no. 732598) or goat F(ab')2 anti-human kappa chain conjugated to PE ( Southern Biotech, no. 206209) respectively in combination with 0.5 µg 7AAD in 100 µl FBS staining buffer. Cells were incubated at 4°C in the dark for 15 min and washed twice. For measurement, cells were resuspended in 200 µl of FBS staining buffer. Cells were measured using a MACSQuant (Miltenyi Biotec) or an LSRII flow cytometer.

- 94 041572 (BD) соответственно. Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю 7-AADотрицательных отдельных клеток, положительных в отношении окрашивания антителами (данные представлены в табл. 5).- 94 041572 (BD) respectively. Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of 7-AAD-negative individual cells positive for antibody staining (data are presented in Table 5).

1.5.3. Связывание Fab к CD3 с huCD3ε/δ и huCD3ε/γ, измеренное с помощью SPR.1.5.3. Fab binding to CD3 with huCD3ε/δ and huCD3ε/γ as measured by SPR.

Связывание тестировали с помощью SPR с применением инструмента BIAcore3000, используемого с буфером HBS-EP.Binding was tested by SPR using the BIAcore3000 instrument used with HBS-EP buffer.

Рекомбинантные белки huCD3 (ε/δ (РВ01226), ε/γ (РВ01225)) захватывали при 10 мкл/мин посредством метки Fc с помощью захватывающего антитела к Fc человека МАВ1302 (Millipore), иммобилизированного на сенсорном чипе СМ5. Fab к CD3 применяли в качестве аналитов при 100 нМ с временем ассоциации и диссоциации, составляющим 240 и 300 с соответственно, при 30 мкл/мин. После каждого цикла поверхности регенерировали с помощью пропускания в течение 2 мин 10 мМ глицинового буфера, рН 2,5.Recombinant huCD3 proteins (ε/δ (PB01226), ε/γ (PB01225)) were captured at 10 μl/min via Fc labeling with the human Fc capture antibody MAB1302 (Millipore) immobilized on a CM5 sensor chip. Anti-CD3 Fab were used as analytes at 100 nM with association and dissociation times of 240 and 300 s, respectively, at 30 μl/min. After each cycle, surfaces were regenerated by bubbling for 2 min with 10 mM glycine buffer, pH 2.5.

Когда на поверхности клетки HEK293F экспрессировался только huCD3δ, никаких сигналов нельзя было обнаружить с помощью проточной цитометрии. Напротив, почти все антитела могли связываться с клетками, трансфицированными исключительно huCD3c, или в случае совместной трансфекции с huCD3δ, что указывает на то, что huCD3E необходим в качестве эпитопа. В анализах Biacore было показано, что связывание с huCD3E не зависит от того, применяли ли цепь δ или γ для рекомбинантного белка, что дает основание полагать, что huCD3E является достаточным в качестве антигена. В виде исключения, антитело 12D2 связывается с huCD3E, только если присутствует совместная цепь. Это может объясняться непрямым эффектом совместной экспрессии цепи g или d в отношении конформационной структуры белка, необходимой для выставления эпитопа для этого антитела. Такой же эффект был показан для опубликованного антитела ОКТ3. Описано, что это антитело взаимодействует с конформационным эпитопом, образуемым после ассоциации huCD3E с huCD3δ или γ соответственно (Salmeron et al., 1991, The Journal of Immunology). Также было показано, что оно связывается с исключительно субъединицей huCD3E (Kjer-Nielsen et al., 2004, PNAS). Вследствие аналогичного поведения 12D2 и ОКТ3 взаимодействие с huCD3E является допустимым для 12D2. Учитывая все, по-видимому, huCD3E является антигенной структурой для всех анализируемых антител (данные представлены в табл. 5).When only huCD3δ was expressed on the HEK293F cell surface, no signals could be detected by flow cytometry. In contrast, almost all antibodies could bind to cells transfected exclusively with huCD3c, or when co-transfected with huCD3δ, indicating that huCD3E is required as an epitope. In Biacore assays, binding to huCD3E was shown to be independent of whether the δ or γ chain was used for the recombinant protein, suggesting that huCD3E is sufficient as an antigen. Exceptionally, the 12D2 antibody only binds to huCD3E if a co-chain is present. This may be due to an indirect effect of co-expression of the g or d chain on the conformational structure of the protein required to expose the epitope for this antibody. The same effect was shown for the published OKT3 antibody. This antibody has been described to interact with a conformational epitope formed upon association of huCD3E with huCD3δ or γ, respectively (Salmeron et al., 1991, The Journal of Immunology). It has also been shown to bind exclusively to the huCD3E subunit (Kjer-Nielsen et al., 2004, PNAS). Due to the similar behavior of 12D2 and OKT3, interaction with huCD3E is allowed for 12D2. All things considered, huCD3E appears to be the antigenic structure for all analyzed antibodies (data are presented in Table 5).

Таблица 5. Аффинности выбранных антител к CD3 по отношению к huCD3δ, huCD3E, huCD3E/δ и huCD3ε/γ-комплексам, измеренные с помощью проточной цитометрии и BiacoreTable 5 Affinities of selected CD3 antibodies for huCD3δ, huCD3E, huCD3E/δ and huCD3ε/γ complexes measured by flow cytometry and Biacore

Проточная цитометрия flow cytometry Biacore Biacore % трансфицированных клеток, положительных в отношении антитела (п=3-6) % of transfected cells positive for antibody (n=3-6) RU для связывания Fab при 100 нМ RU for Fab binding at 100 nM Клон Clone huCD35 huCD35 huCD38 ( + /- SEM) huCD38 (+/-SEM) huCD3s/5 (+/-SEM) huCD3s/5 (+/-SEM) huCD3s /δ huCD3s /δ huCD 3ε/γ huCD 3ε/γ 10Е6 10E6 n.b. n.b. 96,3 +/- 2,2 96.3 +/- 2.2 93,3 +/- 4,7 93.3 +/- 4.7 11 eleven 8 8 11F9 11F9 n.b. n.b. 97,0 +/- 1,5 97.0 +/- 1.5 96,0 +/- 2,5 96.0 +/- 2.5 10 10 7 7 12D2 12D2 n.b. n.b. n.b. n.b. 96,3 +/- 2,2 96.3 +/- 2.2 11 eleven 5 5 12G3 12G3 n.b. n.b. 96,3 +/- 2,2 96.3 +/- 2.2 96,7 +/- 1,9 96.7 +/- 1.9 10 10 7 7 13Н2 13H2 n.b. n.b. 93,3 +/- 3,3 93.3 +/- 3.3 93,0 +/- 4,2 93.0 +/- 4.2 9 9 6 6 18F5 18F5 n.b. n.b. 70,6 +/- 11,9 70.6 +/- 11.9 70,4 +/- 9,9 70.4 +/- 9.9 13 13 7 7 18G9 18G9 n.b. n.b. 95,0 +/- 2,5 95.0 +/- 2.5 97,0 +/- 1,5 97.0 +/- 1.5 10 10 3 3 1Е6 1E6 n.b. n.b. 87,7 +/- 4,4 87.7 +/- 4.4 91,7 +/- 4,9 91.7 +/- 4.9 10 10 7 7 20Е5 20E5 n.b. n.b. 96,7 +/- 1,9 96.7 +/- 1.9 95,3 +/- 3,2 95.3 +/- 3.2 11 eleven 8 8 20G6 20G6 n.b. n.b. 68,6 +/- 12,1 68.6 +/- 12.1 67,4 +/- 10,4 67.4 +/- 10.4 7 7 4 4 4В4 4B4 n.b. n.b. 71,5 +/- 10,8 71.5 +/- 10.8 69,5 +/- 8,7 69.5 +/- 8.7 11 eleven 3 3 4Е7 4E7 n.b. n.b. 69,0 +/- 12,3 69.0 +/- 12.3 66,4 +/- 10,0 66.4 +/- 10.0 8 8 6 6 5В1 5B1 n.b. n.b. 97,0 +/- 1,5 97.0 +/- 1.5 97,0 +/- 1,5 97.0 +/- 1.5 10 10 7 7 ОКТЗ OKTZ n.b. n.b. n.b. n.b. 70,2 +/- 9,6 70.2 +/- 9.6 4 4 3 3

n.b. - отсутствие связывания (<20% связывания huCD3e+huCD3d).n.b. - no binding (<20% huCD3e+huCD3d binding).

1.6. Связывание CD3-Fab с Т-клетками человека.1.6. Binding of CD3-Fab to human T cells.

Способность связывания CD3-Fab определяли с помощью проточной цитометрии. Первичные Тклетки человека применяли в качестве целевых клеток. В связи с этим мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из 200 мл периферической крови здоровых доноров, обработанной EDTA, с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. 15 мл Histopaque (Sigma-Aldrich) предварительно загружали в 50-мл пробирку Leucosep (Greiner bio-one). Кровь разводили буфером для промывки autoMACS+1% BSA (Miltenyi Biotec) и загружали на мембрану в общей сложности десяти подготовленных пробирок. Пробирки центрифугировали без торможения в течение 10 мин при 1000 х g. PBMC собирали и промывали с помощью буфера для промывки autoMACS+1% BSA трижды. В конце концов, РВМС ресуспендировали в буфере для прогона autoMACS (Miltenyi Biotec) для выделения Тлимфоцитов с помощью технологии autoMACSpro с применением набора для выделения всех Т-клетокThe ability to bind CD3-Fab was determined using flow cytometry. Primary human T cells were used as target cells. In this regard, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 200 ml of EDTA-treated peripheral blood of healthy donors using ficoll density gradient centrifugation. 15 ml Histopaque (Sigma-Aldrich) was preloaded into a 50 ml Leucosep tube (Greiner bio-one). Blood was diluted with autoMACS+1% BSA wash buffer (Miltenyi Biotec) and loaded onto the membrane in a total of ten prepared tubes. The tubes were centrifuged without braking for 10 min at 1000 xg. PBMCs were harvested and washed with autoMACS+1% BSA wash buffer three times. Finally, the PBMCs were resuspended in autoMACS run buffer (Miltenyi Biotec) to isolate T lymphocytes using autoMACSpro technology using an all T cell isolation kit.

- 95 041572 (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту выделенных Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии MACSQuant с применением 7-цветного набора для иммунофенотипирования человека (Miltenyi Biotec). Выделенные Т-клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) и по 1Е5 клеток в 100 мкл на лунку высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one). Fab-антитела серийно разводили 1:3 в PBS (Invitrogen) и по 5 мкл каждого добавляли к клеткам при конечной максимальной концентрации, составляющей 30000 нг/мл. Анализируемую смесь инкубировали в течение 45 мин при 4°С. Клетки дважды промывали буфером для окрашивания с FBS и в каждую лунку добавляли по 1 мкг вторичного антитела F(ab')2 козы к каппа-цепи человека, конъюгированного с FITC (Beckman Coulter, № 732621), в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку. Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С и после этого дважды промывали. Клетки ресуспендировали в 150 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку и измеряли с применением проточного цитометра MACSQuant (Miltenyi Biotec) или LSRII (BD). Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю клеток, положительных в отношении связывания антителом. Клетки, обработанные только вторичным, а не первичным антителом, применяли для гейтирования. Кривые ЕС50 рассчитывали с помощью XLfit (Algorithm 205), значения ЕС50 рассчитывали как точку перегиба наклона кривой (данные показаны в табл. 6).- 95 041572 (Miltenyi Biotec) in accordance with the manufacturer's instructions. The purity of the isolated T cells was analyzed by MACSQuant flow cytometry using a 7-color human immunophenotyping kit (Miltenyi Biotec). The isolated T cells were resuspended in FBS staining buffer (BD Pharmingen) and plated at 1E5 cells in 100 μl per well in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one). Fab antibodies were serially diluted 1:3 in PBS (Invitrogen) and 5 μl of each was added to cells at a final maximum concentration of 30,000 ng/ml. The analyzed mixture was incubated for 45 min at 4°C. Cells were washed twice with FBS staining buffer and 1 μg of FITC-conjugated goat anti-human kappa chain F(ab')2 secondary antibody F(ab')2 (Beckman Coulter, no. 732621) in 100 μl of FBS staining buffer was added to each well. to the hole The analyzed mixture was incubated for 20 min at 4°C and then washed twice. Cells were resuspended in 150 μl of FBS staining buffer per well and measured using a MACSQuant (Miltenyi Biotec) or LSRII (BD) flow cytometer. Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of cells positive for antibody binding. Cells treated with secondary antibody only and not with primary antibody were used for gating. EC50 curves were calculated using XLfit (Algorithm 205), EC50 values were calculated as the inflection point of the curve slope (data shown in Table 6).

Таблица 6. Аффинности CD3-Fab к Т-клеткам человека, измеренные с помощью проточной цитометрии. Представлены средние значения ЕС50, рассчитанные на основании кривыхTable 6 CD3-Fab affinities for human T cells measured by flow cytometry. Shown are average EC50 values calculated from curves

Антитело Antibody Связывание с Т-клетками человека, средние значения ЕС50 [нМ] +/- SEM Human T cell binding, mean EC50 [nM] +/- SEM 12D2-E5-Fab 12D2-E5-Fab 3, 8 3, 8 + /- +/- 0,2 0.2 4B4-D7-Fab 4B4-D7-Fab 15, 3 15, 3 + /- +/- 3, 0 thirty 1E6-C9-Fab 1E6-C9-Fab 18,7 18.7 + /- +/- 3,5 3.5 10E6-G6-Fab 10E6-G6-Fab 4,7 4.7 + /- +/- 0, 9 0.9 4E7-C9-Fab 4E7-C9-Fab 6, 2 6, 2 + /- +/- 0, 8 0.8 12G3-E8-Fab 12G3-E8-Fab 4,4 4.4 + /- +/- 0,3 0.3 5B1-G2-Fab 5B1-G2-Fab 11, 1 11, 1 + /- +/- 3, 6 3, 6 18F5-H10-Fab 18F5-H10-Fab 4,1 4.1 + /- +/- 0, 0 0, 0 18G9-Hll-Fab 18G9-Hll-Fab 1,7 1.7 + /- +/- 0,5 0.5 13H2-C2-Fab 13H2-C2-Fab 14,3 14.3 + /- +/- 0, 9 0.9 20G6-F3-Fab 20G6-F3-Fab 14,0 14.0 (п=1) (n=1) llF9-F8-huFab llF9-F8-huFab 11, 6 11, 6 (п=1) (n=1) 20E5-F10-huFab 20E5-F10-huFab 8,2 8.2 (п=1) (n=1)

1.7. Оценка безопасности CD3-Fab.1.7. Safety assessment of CD3-Fab.

.7.1. Безопасность CD3-Fab, измеряемая с помощью экспрессии CD25+ и CD69+ на Т-клетках человека..7.1. CD3-Fab safety as measured by CD25+ and CD69+ expression on human T cells.

Эффект Fab-антител к CD3 на статус активации Т-клеток в качестве результатов по безопасности анализировали с помощью основанного на проточной цитометрии обнаружения экспрессии маркера активации CD25 и CD69 на поверхности первичных Т-клеток человека.The effect of anti-CD3 Fab antibodies on T cell activation status as a safety outcome was analyzed by flow cytometry-based detection of CD25 and CD69 activation marker expression on the surface of primary human T cells.

Выделенные первичные Т-лимфоциты человека ресуспендировали в RPMI+GlutaMAX I (Gibco)+10% FCS (Invitrogen) и 2,5Е5 клеток высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one) в 100 мкл на лунку.Isolated primary human T lymphocytes were resuspended in RPMI+GlutaMAX I (Gibco)+10% FCS (Invitrogen) and 2.5E5 cells were seeded in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one) in 100 µl to the hole

мкл Fab-антител к CD3 добавляли к клеткам при конечной концентрации 30000 нг/мл. Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 ч при 37°С в 5% СО2.μl of anti-CD3 Fab was added to the cells at a final concentration of 30,000 ng/ml. The analyzed mixture was incubated for 20 h at 37°C in 5% CO 2 .

После периода инкубации клетки осаждали и окрашивали в течение 15 мин при 4°С в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) на лунку с помощью следующих меченных антител: CD25-V450, CD69-APC.After an incubation period, cells were pelleted and stained for 15 min at 4° C. in 100 μl of FBS staining buffer (BD Pharmingen) per well with the following labeled antibodies: CD25-V450, CD69-APC.

Клетки дважды промывали после окрашивания, ресуспендировали в 150 мкл буфера для окрашивания с FBS и 5000 клеток измеряли с применением проточного цитометра LSRII (BD). Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю Т-клеток CD25pos и CD69pos (табл. 7).Cells were washed twice after staining, resuspended in 150 μl of FBS staining buffer, and 5000 cells were measured using an LSRII flow cytometer (BD). Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of CD25pos and CD69pos T cells (Table 7).

- 96 041572- 96 041572

Таблица 7. Безопасность CD3-Fab, измеренная с помощью экспрессии CD25+ и CD69+ на Т-клетках человекаTable 7 Safety of CD3-Fab measured by expression of CD25+ and CD69+ on human T cells

Антитело Antibody CD25+ % активации Tклеток человека, нормализованный по PBS С=30000 нг/мл п=1 CD25+ % activation of human T cells normalized by PBS C=30,000 ng/mL n=1 CD69+ % активации Т-клеток человека нормализованный по PBS С=30000 нг/мл п=1 CD69+ % activation of human T-cells normalized by PBS С=30000 ng/ml n=1 11H3-E5-Fab 11H3-E5-Fab 0,7 0.7 0,5 0.5 12D2-E5-Fab - SEC 12D2-E5-Fab-SEC 3,2 3.2 11,1 11.1 4B4-D7-Fab 4B4-D7-Fab 2,5 2.5 5, 4 5, 4 1E6-B8/B9-C9-Fab 1E6-B8/B9-C9-Fab 1,8 1.8 3,2 3.2 10E6-G6-Fab 10E6-G6-Fab 0, 8 0.8 2, 6 2, 6 4E7-C9-Fab 4E7-C9-Fab 0,4 0.4 0, 1 0, 1 12G3-E8-Fab 12G3-E8-Fab 0, 0 0, 0 1,5 1.5 5B1-G2-Fab 5B1-G2-Fab 0,4 0.4 4,2 4.2 6F4-D10-Fab 6F4-D10-Fab 2,1 2.1 6, 4 6, 4 18F5-H10-Fab 18F5-H10-Fab 0, 0 0, 0 0, 1 0, 1 18G9-Hll-Fab 18G9-Hll-Fab 0,7 0.7 2,2 2.2 13H2-C2-Fab 13H2-C2-Fab 0,5 0.5 0,4 0.4 13Cl-F6-Fab 13Cl-F6-Fab 0,4 0.4 0,2 0.2 1E6-B8/B9-C9-Fab 1E6-B8/B9-C9-Fab 0, 6 0.6 1,7 1.7 20G6-F3-Fab 20G6-F3-Fab 0,2 0.2 3,2 3.2 1E6-B8/B9-C9-Fab 1E6-B8/B9-C9-Fab 2,5 2.5 7,8 7.8 1E6-B8/B9-C9-Fab 1E6-B8/B9-C9-Fab 0, 1 0, 1 1,0 1.0 HF9-F8-huFab HF9-F8-huFab 1,0 1.0 0, 8 0.8 20E5-F10-huFab 20E5-F10-huFab 1,5 1.5 1,3 1.3

1.7.2. Безопасность CD3-Fab, измеряемая с помощью экспрессии CD4+/CD69+, CD4+/CD25+, CD8+/CD69+ и CD8+/CD25+ на Т-клетках человека.1.7.2. CD3-Fab safety as measured by expression of CD4+/CD69+, CD4+/CD25+, CD8+/CD69+ and CD8+/CD25+ on human T cells.

Эффект Fab-антител к CD3 на статус активации Т-клеток в качестве результатов по безопасности анализировали с помощью основанного на проточной цитометрии обнаружения экспрессии маркера активации CD25 и CD69 на поверхности первичных Т-клеток человека. Выделенные первичные Тлимфоциты человека ресуспендировали в RPMI+GlutaMAX I (Gibco)+10% FCS (Invitrogen) и 2,5Е5 клеток высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one) в 50 мкл на лунку. Либо тестировали исключительно Т-клетки и лунки заполняли 50 мкл RPMI+GlutaMAX I+10% FCS, или целевые клетки (т.е. линию клеток ТНР-1) добавляли из расчета 2,5Е4 клеток на лунку в 50 мкл RPMI+GlutaMAX I+10% FCS. Биспецифические антитела серийно разводили 1:3 в PBS (Invitrogen) и по 5 мкл каждого добавляли к клеткам при конечной максимальной концентрации, составляющей 30000 нг/мл. Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 ч при 37°С в 5% СО2. После периода инкубации клетки осаждали и окрашивали в течение 15 мин при 4°С в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) на лунку с помощью следующих меченных антител: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE-Cy7. В качестве контроля комбинации нескольких антител без одного (Fluorescence Minus One (FMO)) активированные Т-клетки окрашивали как описано выше, но CD25 заменяли его изотипом (изотипическое APC-IG1k) в одной пробирке, a CD69 заменяли его изотипом (изотипическое PE-Cy7-IG1k) во второй пробирке. Клетки дважды промывали после окрашивания, ресуспендировали в 150 мкл буфера для окрашивания с FBS и 5000 клеток измеряли с применением проточного цитометра LSRII (BD). Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю Тклеток CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos и CD8posCD69pos. Гейтирование проводили в соответствии с контролями FMO (см. табл. 8).The effect of anti-CD3 Fab antibodies on T cell activation status as a safety outcome was analyzed by flow cytometry-based detection of CD25 and CD69 activation marker expression on the surface of primary human T cells. Isolated primary human T lymphocytes were resuspended in RPMI+GlutaMAX I (Gibco)+10% FCS (Invitrogen) and 2.5E5 cells were plated in 96-well U-bottom suspension culture plates (Greiner bio-one) at 50 µl per well . Either only T cells were tested and wells filled with 50 µl RPMI+GlutaMAX I+10% FCS, or target cells (i.e. THP-1 cell line) were added at a rate of 2.5E4 cells per well in 50 µl RPMI+GlutaMAX I +10% FCS. The bispecific antibodies were serially diluted 1:3 in PBS (Invitrogen) and 5 μl of each was added to the cells at a final maximum concentration of 30,000 ng/ml. The analyzed mixture was incubated for 20 h at 37°C in 5% CO 2 . After the incubation period, the cells were pelleted and stained for 15 min at 4°C in 100 µl of FBS staining buffer (BD Pharmingen) per well with the following labeled antibodies: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69 -PE-Cy7. As a multi-antibody combination control without one (Fluorescence Minus One (FMO)) activated T cells were stained as described above, but CD25 was replaced with its isotype (isotypic APC-IG1k) in one tube, and CD69 was replaced with its isotype (isotypic PE-Cy7 -IG1k) in the second tube. Cells were washed twice after staining, resuspended in 150 μl of FBS staining buffer, and 5000 cells were measured using an LSRII flow cytometer (BD). Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos and CD8posCD69pos T cells. Gating was performed according to FMO controls (see Table 8).

Таблица 8. Безопасность CD3-Fab измеренная с помощью экспрессии CD4+/CD69+, CD4+/CD25+, CD8+/CD69+ и CD8+/CD25+ на Т-клетках человекаTable 8 Safety of CD3-Fab measured by expression of CD4+/CD69+, CD4+/CD25+, CD8+/CD69+ and CD8+/CD25+ on human T cells

Антитело Antibody CD4+/CD69+ % активации, Нормализованный по PBS С=100 нМ CD4+/CD69+ % activation PBS normalized C=100 nM CD8+/CD69+ % активации, Нормализованный по PBS С=100 нМ CD8+/CD69+ % activation PBS normalized C=100 nM CD4+/CD25+ % активации, Нормализованный по PBS С=100 нМ CD4+/CD25+ % activation PBS normalized C=100 nM CD8+/CD25+ % активации, Нормализованный по PBS CD8+/CD25+ % activation normalized by PBS

- 97 041572- 97 041572

среднее значение + /SEM mean + /SEM среднее значение + /SEM mean + /SEM среднее значение + /SEM mean + /SEM С=100 нМ среднее значение +/- SEM C=100 nM mean +/- SEM 20G6-F3Fab 20G6-F3Fab о,1 oh 1 +/ +/ о,1 oh 1 0,0 0.0 +/- +/- 0,0 0.0 0,4 0.4 +/- +/- о,1 oh 1 0,0 0.0 +/ +/ 0,1 0.1 4B4-D7Fab 4B4-D7Fab 3,2 3.2 +/ +/ 1,1 1.1 0,3 0.3 +/- +/- 0,3 0.3 1,3 1.3 +/- +/- 0,6 0.6 0,0 0.0 +/ +/ 0,0 0.0

Пример 2. Последовательности CD123.Example 2 CD123 sequences.

2.1. Конструирование плазмид экспрессии для слияния CD123 (IL3RA)-hFc (CD123-Fc).2.1. Construction of expression plasmids for CD123(IL3RA)-hFc(CD123-Fc) fusion.

С применением кДНК-содержащих плазмид в качестве матрицы получали белки слияния, содержащие CD123 человека и Масаса fascicularis в рамке считывания с константной областью тяжелой цепи, включая GS-линкер (используемый в белке Масаса), шарнирную область, домены СН2 и СН3 иммуноглобулина IgG человека, дополнительно несущей метку Strep-II (только в версии белка человека).Using cDNA-containing plasmids as a template, fusion proteins were generated containing human CD123 and Macaca fascicularis in frame with a heavy chain constant region, including the GS linker (used in the Macaca protein), the hinge region, the CH2 and CH3 domains of human IgG immunoglobulin, additionally labeled with Strep-II (only in the human protein version).

С применением геномной ДНК человека в качестве матрицы амплифицировали внеклеточный домен CD123 человека (IL3RA), включая сигнальную последовательность. Полученные в результате амплифицированные, расщепленные и очищенные продукты ПЦР объединяли с помощью лигирующей ПЦР и лигировали в вектор экспрессии для млекопитающих pXL с помощью способа InFusion, используя сайты для NheI и HindIII. Последовательность полученного в результате белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD123 человека с меткой Strep-II, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 196. Аминокислоты 1-284 соответствуют аминокислотам 22-305 полноразмерного белка CD123 человека дикого типа (раскрыт в данном документе под SEQ ID NO: 194, доступной из базы данных NCBI под номером доступа NP_002174,1) и, таким образом, внеклеточному домену человеческого CD123.Using human genomic DNA as a template, the extracellular domain of human CD123 (IL3RA) was amplified, including the signal sequence. The resulting amplified, digested and purified PCR products were pooled by ligation PCR and ligated into the mammalian expression vector pXL by InFusion using the NheI and HindIII sites. The sequence of the resulting fusion protein containing Fc and mature human CD123 labeled Strep-II is disclosed herein under SEQ ID NO: 196. under SEQ ID NO: 194 available from the NCBI database under accession number NP_002174.1) and thus the extracellular domain of human CD123.

Для клонирования CD123 Масаса fascicularis кДНК получали из крови популяции Масаса fascicularis. С применением этой выделенной кДНК в качестве матрицы амплифицировали внеклеточный домен CD123 Масаса (IL3ra), включая сигнальную последовательность. Полученные в результате амплифицированные, расщепленные и очищенные продукты ПЦР объединяли с помощью лигирующей ПЦР и лигировали в вектор экспрессии для млекопитающих pXL с помощью способа InFusion, используя NheI и HindIII. Последовательность полученного в результате белка слияния, содержащего Fc и зрелый CD123 человека с меткой Strep-II, раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 197. Аминокислоты 1-284 соответствуют аминокислотам 22-305 полноразмерного белка CD123 Масаса fascicularis дикого типа (раскрыт в данном документе под SEQ ID NO: 195, доступной из базы данных NCBI под номером доступа NP 002174,1) и, таким образом, внеклеточному домену человеческого CD123.For cloning CD123 Macac fascicularis, cDNA was obtained from the blood of the Macac fascicularis population. Using this isolated cDNA as a template, the extracellular domain of CD123 Macaca (IL3ra) was amplified, including the signal sequence. The resulting amplified, digested and purified PCR products were pooled by ligation PCR and ligated into the pXL mammalian expression vector using the InFusion method using NheI and HindIII. The sequence of the resulting fusion protein containing Fc and mature human CD123 tagged Strep-II is disclosed herein under SEQ ID NO:197. document under SEQ ID NO: 195, available from the NCBI database under accession number NP 002174.1) and thus the extracellular domain of human CD123.

2.2. Экспрессия и очистка CD123-FC человека и Масаса fascicularis.2.2. Expression and purification of human CD123-FC and Macac fascicularis.

Клетки Freestyle HEK293, выращиваемые в виде суспензионной культуры в бессывороточной среде F17 (Life), временно трансфицировали плазмидой экспрессии. Трансфекцию осуществляли с применением реагента для трансфекции Cellfectin (Life). Клетки культивировали при 37°С в течение 7 дней. Культуральный супернатант, содержащий рекомбинантный белок, собирали путем центрифугирования и очищали от примесей путем фильтрации (0,22 мкм).Freestyle HEK293 cells grown as a suspension culture in F17 serum-free medium (Life) were transiently transfected with the expression plasmid. Transfection was performed using Cellfectin (Life) transfection reagent. Cells were cultured at 37°C for 7 days. The culture supernatant containing the recombinant protein was collected by centrifugation and purified from impurities by filtration (0.22 μm).

Для очистки варианты белков слияния, содержащих Fc, захватывали на матрице с белком A (GE) и элюировали с помощью градиента рН. После доочистки белка с помощью SEC в PBS с применением Superdex 200 (GE) и конечной стадии концентрирования ультрафильтрацией белок применяли для дальнейших анализов.For purification, Fc-containing fusion protein variants were captured on a Protein A (GE) matrix and eluted with a pH gradient. After purification of the protein by SEC in PBS using Superdex 200 (GE) and a final concentration step by ultrafiltration, the protein was used for further analyses.

2.3. Оценка аффинности IgG крысы из гибридомы к обоим CD123 человека и Масаса fascicularis.2.3. Assessing the affinity of rat IgG from hybridoma for both human CD123 and Macac fascicularis.

Скрининг IgG крысы к CD123 в отношении аффинности связывания с CD123 человека и перекрестной реактивности к CD123 макака-крабоеда осуществляли с использованием супернатантов гибридомы с применением Proteon XPR36 (Biorad) в подходе определения кинетики реакции методом одной точки. Анализ захвата организовывали с применением антитела козы к IgG крысы (112-005-071, Jackson Immuno Research). Захватывающее антитело наносили на чипы GLC (176-5011, Biorad) до примерно 8000 RU в вертикальном направлении с применением набора для аминного связывания (176-2410, Biorad). Захват IgG крысы до примерно 200 RU в вертикальном направлении приводил к значениям Rmax, составляющим до 100 RU, для CD123-FC. Кинетику связывания с белком слияния, содержащим Fc и CD123 человека и макака-крабоеда, измеряли при скорости 100 мкл/мин в горизонтальном направлении в течение 120 и 600 с для ассоциации и диссоциации соответственно. Белки CD123-FC применяли в двукратных разведениях от 6 до 100 нМ. Буфер PBSET (176-2730, Biorad) применяли в качестве буфера для анализа. Регенерацию обеспечивали путем инъекции 10 мМ глицинового буфера, рН 1,5, в течение 18 с при 30 мкл/мин. Обработку данных и анализ осуществляли с применением программного обеспечения ProteonManager v3.0. Аппроксимацию сенсограмм проводили с помощью 1:1 модели Лэнгмюра. Клоны выбирали на основании аффинности к CD123 человека с KD < 1 нМ и перекрестной реактивности с CD123 макака-крабоеда.Rat IgG screening for CD123 for binding affinity to human CD123 and cross-reactivity to cynomolgus CD123 was performed using hybridoma supernatants using Proteon XPR36 (Biorad) in a single point reaction kinetics approach. The capture assay was performed using goat anti-rat IgG (112-005-071, Jackson Immuno Research). Capture antibody was applied to GLC chips (176-5011, Biorad) up to about 8000 RU in the vertical direction using an amine coupling kit (176-2410, Biorad). Uptake of rat IgG up to about 200 RU in the vertical direction resulted in Rmax values of up to 100 RU for CD123-FC. Binding kinetics to the fusion protein containing human and cynomolgus Fc and CD123 were measured at 100 μl/min horizontally for 120 and 600 s for association and dissociation, respectively. CD123-FC proteins were used in two-fold dilutions from 6 to 100 nM. Buffer PBSET (176-2730, Biorad) was used as assay buffer. Regeneration was achieved by injection of 10 mM glycine buffer, pH 1.5, for 18 seconds at 30 μl/min. Data processing and analysis were carried out using ProteonManager v3.0 software. The sensograms were approximated using a 1:1 Langmuir model. Clones were selected based on affinity for human CD123 with KD < 1 nM and cross-reactivity with cynomolgus CD123.

Fab и CODV-Fab.Fab and CODV Fab.

Аффинности связывания Fab или CODV-Fab, связывающих CD123, измеряли с применением инстThe binding affinities of CD123-binding Fab or CODV-Fab were measured using the instrument

- 98 041572 румента Biacore3000 (GE Healthcare). Буфер для анализа представлял собой HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Захват белков слияния CD123-FC обеспечивали с применением набора для захвата антител человека (GE Healthcare). Захватывающее антитело связывали на чипах СМ5 (BR-1001-88, GE Healthcare) до примерно 12000 RU с применением набора для аминного связывания (BR-100-50, GE Healthcare). Белки слияния CD123-Fc захватывали при 10 мл/мин до примерно 70 RU с получением значений Rmax, составляющих 30 RU. Кинетику связывания с Fab или CODV-Fab к CD123 измеряли при 30 мкл/мин в течение 240 и 600 с для фазы ассоциации и диссоциации соответственно. Применяли двукратные разведения Fab от 3 до 200 нМ в буфере для анализа. Все концентрации Fab прогоняли в двух повторностях совместно с контролем буфером в двух повторностях для обеспечения двойного контроля. Регенерацию поверхности захвата обеспечивали с помощью 1-минутной инъекции раствора 3М MgCl2 при скорости 30 мкл/мин. Для анализа данных применяли программное обеспечение BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Данные аппроксимировали в целом с помощью 1:1 модели Лэнгмюра с массообменом.- 98 041572 Biacore3000 (GE Healthcare). The assay buffer was HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). Capture of CD123-FC fusion proteins was achieved using a human antibody capture kit (GE Healthcare). The capture antibody was bound on CM5 chips (BR-1001-88, GE Healthcare) to about 12,000 RU using an amine coupling kit (BR-100-50, GE Healthcare). CD123-Fc fusion proteins were captured at 10 ml/min up to about 70 RU to give Rmax values of 30 RU. The kinetics of binding to Fab or CODV-Fab to CD123 was measured at 30 μl/min for 240 and 600 s for the association and dissociation phase, respectively. Two-fold dilutions of Fab from 3 to 200 nM in assay buffer were used. All Fab concentrations were run in duplicate with buffer control in duplicate to provide a dual control. The capture surface was regenerated with a 1-minute injection of a 3M MgCl 2 solution at a rate of 30 μl/min. BIAevaluation v.4.1 software (GE Healthcare) was used for data analysis. The data were approximated as a whole using a 1:1 Langmuir model with mass transfer.

IgG и белки CODV-Fc.IgG and CODV-Fc proteins.

Измерение аффинности связывания IgG и белков CODV-Fc к CD123 осуществляли аналогично анализу связывания для Fab и CODV-Fab за исключением захватывающего антитела. В данном случае классическое антитело Strep-MAB (2-1507-001, IBA) применяли для захвата CD123 человека-Fc посредством его метки Strep-II. В данном случае раствор для регенерации представлял собой 10 мМ глициновый буфер, рН 2,0.Measurement of the binding affinity of IgG and CODV-Fc proteins for CD123 was carried out similarly to the binding assay for Fab and CODV-Fab except for the capture antibody. In this case, the classic Strep-MAB antibody (2-1507-001, IBA) was used to capture human CD123-Fc via its Strep-II tag. In this case, the regeneration solution was 10 mM glycine buffer, pH 2.0.

2.4. Получение антител с перекрестной реактивностью к CD123 человека и Масаса fascicularis.2.4. Obtaining antibodies with cross-reactivity to human CD123 and Macac fascicularis.

кДНК CD123 человека и Масаса fascicularis клонировали в проприетарные векторы для иммунизации от Aldevron (pB8 и W8) соответственно. Трех крыс в группе иммунизации MR13-296 иммунизировали с помощью вектора для иммунизации IL3RA-hum.-ECD (аа 19-305). Забор иммунной сыворотки проводили в день 24 протокола иммунизации, после 4 применений генной иммунизации (IS24d-4). Сыворотки, разведенные в PBS с 3% FBS, тестировали с помощью проточной цитометрии с применением клеток млекопитающих, временно трансфицированных вариантами кДНК IL3RA человека и макака-крабоеда, IL3RA-hum.ECD и IL3RA-hum.D3.Human CD123 and Macac fascicularis cDNA were cloned into proprietary immunization vectors from Aldevron (pB8 and W8), respectively. Three rats in the MR13-296 immunization group were immunized with the IL3RA-hum.-ECD immunization vector (aa 19-305). Immune sera were collected on day 24 of the immunization protocol, after 4 applications of gene immunization (IS24d-4). Sera diluted in PBS with 3% FBS were tested by flow cytometry using mammalian cells transiently transfected with human and cynomolgus IL3RA cDNA variants, IL3RA-hum.ECD and IL3RA-hum.D3.

Специфическую реактивность иммунных сывороток в отношении клеток, трансфицированных pB1IL3RA-hum.ECD, а также IL3RA-cyno (pFF1262), и клеток ТНР-1 можно было обнаружить у всех иммунизированных животных при сравнении с клетками, трансфицированными нерелевантной кДНК.Specific reactivity of immune sera against cells transfected with pB1IL3RA-hum.ECD as well as IL3RA-cyno (pFF1262) and THP-1 cells could be detected in all immunized animals when compared with cells transfected with irrelevant cDNA.

Крыс с положительными сыворотками умерщвляли и В-клетки сливали с клетками миеломы мыши. Полученные в результате гибридомы скринировали на клетках HEK293, трансфицированных плазмидами экспрессии CD123 человека или макака-крабоеда, на различных линиях клеток, экспрессирующих CD123, с помощью проточной цитометрии (данные показаны в табл. 10).Sera positive rats were sacrificed and B cells fused with mouse myeloma cells. The resulting hybridomas were screened in HEK293 cells transfected with human or cynomolgus CD123 expression plasmids in various CD123 expressing cell lines by flow cytometry (data shown in Table 10).

Целевые клетки высевали из расчета 5Е4 клеток в 50 мкл буфера для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) на лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one).Target cells were seeded at a rate of 5E4 cells in 50 μl of FBS staining buffer (BD Pharmingen) per well in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one).

Супернатанты гибридомы серийно разводили 1:3 в PBS (Invitrogen) и 50 мкл каждого добавляли к клеткам при конечной максимальной концентрации, составляющей 1 мкг/мл. Анализируемую смесь инкубировали в течение 45 мин при 4°С.Hybridoma supernatants were serially diluted 1:3 in PBS (Invitrogen) and 50 μl of each was added to cells at a final maximum concentration of 1 μg/ml. The analyzed mixture was incubated for 45 min at 4°C.

Клетки дважды промывали буфером для окрашивания с FBS и добавляли 1 мкг вторичного антитела козы к IgG (H+L) крысы, конъюгированного с Alexa Fluor 488 (Invitrogen-Life Technologies, № МН10520), в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку. Анализируемую смесь инкубировали в течение 15 мин при 4°С и после этого дважды промывали.Cells were washed twice with FBS staining buffer and 1 µg of goat anti-rat IgG (H+L) secondary antibody conjugated to Alexa Fluor 488 (Invitrogen-Life Technologies, #MH10520) was added to 100 µl of FBS staining buffer per well. The analyzed mixture was incubated for 15 min at 4°C and then washed twice.

Клетки ресуспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку и измеряли с применением проточного цитометра MACSQuant (Miltenyi Biotec) или LSRII (BD). Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю клеток, положительных в отношении связывания антителом. Клетки, обработанные только вторичным, а не первичным антителом, применяли для гейтирования. Кривые рассчитывали с помощью XLfit (алгоритм 205).Cells were resuspended in 200 μl of FBS staining buffer per well and measured using a MACSQuant (Miltenyi Biotec) or LSRII (BD) flow cytometer. Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of cells positive for antibody binding. Cells treated with secondary antibody only and not with primary antibody were used for gating. Curves were calculated using XLfit (Algorithm 205).

Специфическое связывание клонов с CD123 могло быть показано на поверхности трансфицированных HEK293 по сравнению с нетрансфицированными клетками НЕК293, у которых сигнал нельзя было обнаружить (данные не показаны). Связывание антител было зависимым от концентрации, при этом значение ЕС50 находилось в диапазоне от 0,4 до 17,7 нг/мл (табл. 9).Specific clone binding to CD123 could be shown on the surface of transfected HEK293 compared to non-transfected HEK293 cells in which the signal could not be detected (data not shown). Antibody binding was concentration dependent, with EC50 ranging from 0.4 to 17.7 ng/mL (Table 9).

- 99 041572- 99 041572

Таблица 9. Специфическое связывание CD123 клонами IgG крысы в супернатантах гибридомы, обнаруженное с помощью проточной цитометрииTable 9 Specific Binding of CD123 by Rat IgG Clones in Hybridoma Supernatants Detected by Flow Cytometry

Зависимое от концентрации связывание антител измеряли с применением HEK293, трансфицированных CD123, в качестве целевых клеток и вторичного антитела козы к IgG (H+L) крысы, конъюгированного с Alexa Fluor 488. Представлены значения ЕС50, рассчитанные на основе кривы.Concentration-dependent antibody binding was measured using CD123-transfected HEK293 as target cells and secondary goat anti-rat IgG (H+L) conjugated to Alexa Fluor 488. EC50 values calculated from the curve are shown.

Таблица 10. Данные связывания антител к CD123 с рекомбинантным CD123 и клетками, экспрессирующими CD 123Table 10 Anti-CD123 antibody binding data to recombinant CD123 and cells expressing CD 123

Клон Clone ка (1/Мс) ka (1/ms) kd (1/с) kd (1/s) KD (нМ) Человек KD (nM) Human KD (нМ) Макаккрабоед KD (nM) Macaccrabeater Molm-13 Molm-13 ТНР-1 TNR-1 OCI-AML3 OCI-AML3 SP2 SP2 Базофилы Basophils Блокиро вание IL3 Blocking IL3 1Е1 1E1 4,6Е+05 4.6E+05 1,1Е-04 1.1E-04 0,23 0.23 0,72 0.72 + + + + + + + + + + - - 2В8 2B8 6,6Е+05 6.6E+05 1,2Е-05 1.2E-05 0, 018 0.018 0,77 0.77 + + + + + + + + + + - - 2F8 2F8 1,ЗЕ+05 1,ZE+05 6,6Е-05 6.6E-05 0,53 0.53 0,51 0.51 + + + + + + - - + + + + ЗВ10 SG10 2,2Е+05 2.2E+05 0,5Е-05 0.5E-05 0,21 0.21 0,27 0.27 + + + + + + - - + + + + ЗЕЗ ZEZ 1,6Е+05 1.6E+05 6,4Е-05 6.4Е-05 0,4 0.4 0, 12 0.12 + + + + + + - - + + + + 5А5 5A5 1,ЗЕ+05 1,ZE+05 1,2Е-04 1.2E-04 1,1 1.1 0, 05 0.05 + + + + + + + + + + - - 6В10 6B10 2,ЗЕ+05 2,WE+05 1,5Е-05 1.5E-05 0, 15 0.15 0, 1 0, 1 + + + + + + + + + + - - 6С10 6S10 1,8Е+05 1.8E+05 1,4Е-04 1.4Е-04 0,75 0.75 0,79 0.79 + + + + + + + + + + - - 8В11 8B11 4,7Е+05 4.7E+05 6,2Е-06 6.2E-06 0, 01 0.01 0, 1 0, 1 + + + + + + + + + + - - 9В8 9B8 1,5Е+06 1.5E+06 2,8Е-04 2.8E-04 0, 19 0.19 0, 17 0.17 + + + + + + + + + + + + 9D7 9D7 1,0Е+06 1.0E+06 3,2Е-04 3.2E-04 0,3 0.3 0, 07 0.07 + + + + + + + + + + + + 9F6 9F6 1,8Е+05 1.8E+05 6,7Е-06 6.7E-06 0, 04 0.04 0,5 0.5 + + + + + + + + + + - -

Данные связывания, демонстрирующие аффинности антител к CD123 в отношении рекомбинантного белка CD123 человека и макака-крабоеда. Связывание на поверхности клетки обнаруживали с помощью проточной цитометрии. SP2 называются клетки, экспрессирующие N-концевой усеченный (область D1) вариант CD123. Антитела тестировали с помощью Proteon XPR36 в отношении их способности конкурировать со связыванием IL3 с CD123.Binding data showing the affinities of anti-CD123 antibodies for recombinant human and cynomolgus monkey CD123 protein. Cell surface binding was detected by flow cytometry. SP2 refers to cells expressing the N-terminal truncated (D1 region) variant of CD123. Antibodies were tested with Proteon XPR36 for their ability to compete with IL3 binding to CD123.

2.5. Гуманизация последовательностей антитела крысы к CD123.2.5. Humanization of rat anti-CD123 antibody sequences.

- 100 041572- 100 041572

Гуманизацию антител крысы осуществляли с помощью привития CDR или с помощью 4D-cпocoба (US 20110027266). Для антитела крысы к CD3, 3Е3, наиболее близкими идентифицированными последовательностями зародышевой линии Rattus были IGHV2S48*01 и IGHJ3*01 для вариабельной области тяжелой цепи и IGLV3S2*01 и IGKJ3*01 для вариабельной области легкой цепи. Рассчитанный показатель идентичности с последовательностью зародышевого типа крысы (только последовательности каркасных областей) составляет 94,51% для VH и 98,9% для VL.Rat antibodies were humanized by CDR grafting or by the 4D method (US 20110027266). For the rat anti-CD3 antibody, 3E3, the closest identified Rattus germline sequences were IGHV2S48*01 and IGHJ3*01 for the heavy chain variable region and IGLV3S2*01 and IGKJ3*01 for the light chain variable region. The calculated identity with the rat germline sequence (framework sequences only) is 94.51% for VH and 98.9% for VL.

Проверяли потенциальные доступные проблемные остатки, и один остаток в CDRH2 модифицировали.Potential available problematic residues were checked and one residue in CDRH2 was modified.

С применением способа привития создавали множество гуманизированных вариантов, исходя из наиболее близких идентифицированных последовательностей зародышевой линии человека: IGHV459*05 и IGHJ4*01 для VH (показатель идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях: 75,82%); IGLV6-57*01 и IGLJ3*01 для VL (показатель идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях: 72,22%).Using the grafting method, a plurality of humanized variants were generated based on the closest human germline sequences identified: IGHV459*05 and IGHJ4*01 for VH (framework germline sequence identity: 75.82%); IGLV6-57*01 and IGLJ3*01 for VL (Identity rate with germline sequence in framework regions: 72.22%).

Кроме привития CDR применяли протокол 4D-гуманизации (US20110027266) для гуманизации вариабельных доменов легкой цепи (VL) и тяжелой цепи (VH) антитела крысы к CD123, 3Е3. Моделирование молекулярной динамики (MD) осуществляли на минимизированной 3D гомологичной модели (проводили с помощью МОЕ; применяли PDB: 1FLR) антитела крысы к CD123, 3Е3, и сравнивали с 49 моделями антитела человека, полученными на основании семи репрезентативных легких цепей (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) и семи репрезентативных тяжелых цепей (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6), обозначенных с помощью LGCR/SDI и доступных в МОЕ.In addition to CDR grafting, a 4D humanization protocol (US20110027266) was used to humanize the light chain (VL) and heavy chain (VH) variable domains of the rat anti-CD123 antibody, 3E3. Molecular dynamics (MD) modeling was performed on a minimized 3D homologous model (performed with MOE; PDB: 1FLR used) of rat anti-CD123, 3E3 antibodies and compared with 49 human antibody models derived from seven representative light chains (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) and seven representative heavy chains (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) identified by LGCR/SDI and available from MOE.

Для 4D-гуманизации были выбраны две модели: Vl3-vh4 и VL3-VH2 с наилучшими как гидрофобными, так и электростатическими компонентами и идентичностью последовательности за пределами CDR. Для парного сравнения вариабельного домена антитела крысы к CD123, 3Е3, и двух выбранных моделей последовательности выравнивали на основании оптимального 3D наложения альфа-атомов углерода в соответствующих гомологичных моделях.Two models were chosen for 4D humanization: Vl3-vh4 and VL3-VH2 with the best both hydrophobic and electrostatic components and sequence identity beyond the CDR. For pairwise comparison of the variable domain of the rat anti-CD123 antibody, 3E3, and the two selected models, the sequences were aligned based on the optimal 3D overlap of alpha carbons in the respective homologous models.

Пример 3. Антитела в биспецифическом формате CODV-Fab/ .1. Клонирование выбранных последовательностей CD3 в комбинации с mAb к CD123, 7G3, в виде биспецифического формата CODV-Fab для исследования их активности в отношении вовлечения Тклеток.Example 3: Antibodies in CODV-Fab/.1 bispecific format. Cloning of selected CD3 sequences in combination with an anti-CD123 mAb, 7G3, as a bispecific CODV-Fab format to test their T cell recruitment activity.

Выбранные последовательности антител к CD3, таких как I2C, mAb2 (Macrogenics) и называемых 20G6-F3, 4Е7-С9, 4B4-D7 и 18F5-H10, экспрессировали как моноспецифические Fab к CD3. Указанные выбранные последовательности также экспрессировали как биспецифические CODV-Fab к CD3xCD123 с применением последовательностей моноклонального антитела 7G3, что приводило к получению конструкций CODV-Fab I2Cx7G3 и называемых 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4 и 7G3xl8F5, как дополнительно описано в данном документе выше в разделе Антителоподобные связывающие белки. Очищенные белки применяли в анализе Biacore для сравнения аффинности в отношении CD3ε/δ-кoмплекcoв (данные представлены в табл. 11). Никаких изменений в аффинности не смогли обнаружить с помощью анализа Biacore, когда последовательности CD3 вводили в биспецифическом формате CODV-Fab.Selected anti-CD3 antibody sequences such as I2C, mAb2 (Macrogenics) and referred to as 20G6-F3, 4E7-C9, 4B4-D7 and 18F5-H10 were expressed as monospecific anti-CD3 Fabs. These selected sequences were also expressed as anti-CD3xCD123 bispecific CODV-Fabs using sequences from the 7G3 monoclonal antibody, resulting in the CODV-Fab I2Cx7G3 constructs termed 7G3x20G6, 7G3x4E7, 7G3x4B4, and 7G3xl8F5, as further described herein above under Antibody-Like Binding Proteins. . Purified proteins were used in the Biacore assay to compare affinity for CD3ε/δ complexes (data are presented in Table 11). No change in affinity could be detected by the Biacore assay when the CD3 sequences were administered in the CODV-Fab bispecific format.

Таблица 11. Сравнение аффинностей Fab-фрагментов и CODV-Fab в отношении CD3ε/δ-кoмплекcoв человека и макака-крабоедаTable 11. Comparison of the affinities of Fab fragments and CODV-Fab for human and cynomolgus CD3ε/δ complexes

Молекула Molecule hu kon 1/Мс hu kon 1/ms hu koff 1/с hu koff 1/s hu KD нМ hu KD nM су KD нМ su KD nM Fabфрагменты Fab fragments I2C I2C 1,1Е+07 1.1E+07 1,ЗЕ-ОЗ 1,ZE-OZ 0,13 0.13 0,5 0.5 гпАЬ2 rnAb2 3,1Е+05 3.1E+05 4,ЗЕ-ОЗ 4,ZE-OZ 13,7 13.7 16, 3 16, 3 BDW-20G6-F3 BDW-20G6-F3 3,5Е+04 3.5E+04 2,7Е-04 2.7E-04 8 8 8 8 BDX-4E7-C9 BDX-4E7-C9 8,9Е+04 8.9E+04 1,5Е-03 1.5E-03 17 17 15 15 BDW-4B4-D7 BDW-4B4-D7 1,1Е+05 1.1E+05 2,9Е-03 2.9E-03 27 27 24 24 BDX-18F5- Н10 BDX-18F5- H10 2,0Е+05 2.0E+05 1,8Е-04 1.8E-04 1 1 1 1 CODV-Fab CODV Fab 7G3XI2C 7G3XI2C 4,0Е+06 4.0E+06 2,0Е-03 2.0E-03 0,5 0.5 0,4 0.4 7G3X20G6 7G3X20G6 7,2Е+04 7.2E+04 5,1Е-04 5.1E-04 7 7 7 7 7G3X4E7 7G3X4E7 1,2Е+05 1.2E+05 1,9Е-03 1.9E-03 16 16 10 10 7G3X4B4 7G3X4B4 2,7Е+05 2.7E+05 4,4Е-03 4.4E-03 17 17 18 18

3.2. Биспецифические CODV-Fab, направленные против CD123 и CD3, опосредуют сильный пере- 101 041572 направленный цитолиз под действием Т-клеток.3.2. Bispecific CODV-Fabs directed against CD123 and CD3 mediate strong retargeting cytolysis by T cells.

Такие биспецифические CODV-Fab обладают способностью локализовать Т-клетку (путем связывания такой Т-клетки с CD3-связывающей частью CD3-связывающего CODV-Fab) в месте расположения опухолевой клетки (путем связывания такой раковой клетки с частью для связывания CD123 CODV-Fab). Локализованная Т-клетка затем может опосредовать цитолиз опухолевой клетки в процессе, обозначенном в данном документе как перенаправленный цитолиз. Конструировали биспецифические CODVFab, специфические в отношении CD123 и CD3, с вариабельными доменами моноклонального антитела к CD123, 7G3, и вариабельными доменами антител к CD3, выбранных из антител к CD3, полученных в примере 1.Such bispecific CODV-Fabs have the ability to localize a T cell (by associating such a T cell with the CD3 binding portion of a CD3 binding CODV-Fab) at the location of a tumor cell (by associating such a cancer cell with a CD123 binding portion of the CODV-Fab) . The localized T cell can then mediate tumor cell cytolysis in a process referred to herein as redirected cytolysis. Bispecific CD123 and CD3 specific CODVFabs were constructed with the variable domains of an anti-CD123 monoclonal antibody, 7G3, and the variable domains of anti-CD3 antibodies selected from the anti-CD3 antibodies prepared in Example 1.

В связи с этим, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из 200 мл периферической крови здоровых доноров, обработанной EDTA, с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла.In this regard, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 200 ml of EDTA-treated peripheral blood of healthy donors using ficoll density gradient centrifugation.

мл Histopaque (Sigma-Aldrich) предварительно загружали в 50-мл пробирку Leucosep (Greiner bio-one). Кровь разводили буфером для промывки autoMACS+1% BSA (Miltenyi Biotec) и загружали на мембрану в общей сложности десяти подготовленных пробирок. Пробирки центрифугировали без торможения в течение 10 мин при 1000 х g. РВМС собирали и промывали с помощью буфера для промывки autoMACS+1% BSA трижды. В конце концов, РВМС ресуспендировали в буфере для прогона autoMACS (Miltenyi Biotec) для выделения Т-лимфоцитов с помощью технологии autoMACSpro с применением набора для выделения всех Т-клеток (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту выделенных Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии MACSQuant с применением 7-цветного набора для иммунофенотипирования человека (Miltenyi Biotec).ml Histopaque (Sigma-Aldrich) was preloaded into a 50 ml Leucosep tube (Greiner bio-one). Blood was diluted with autoMACS+1% BSA wash buffer (Miltenyi Biotec) and loaded onto the membrane in a total of ten prepared tubes. The tubes were centrifuged without braking for 10 min at 1000 x g. The PBMCs were harvested and washed with autoMACS+1% BSA wash buffer three times. Finally, the PBMCs were resuspended in autoMACS run buffer (Miltenyi Biotec) for T lymphocyte isolation using autoMACSpro technology using the Total T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions. The purity of the isolated T cells was analyzed by MACSQuant flow cytometry using a 7-color human immunophenotyping kit (Miltenyi Biotec).

Эффект вовлечения Т-клеток под действием биспецифических антител анализировали с помощью анализа, основанного на проточной цитометрии. Целевые клетки (т.е. линию клеток ТНР-1) окрашивали в течение 15 мин при 37°С с помощью 1 мкМ CFSE в 1 мл RPMI+GlutaMAX I (Gibco) на 1Е7 клеток. После этого клетки дважды промывали и ресуспендировали в RPMI+GlutaMAX 1+10% FCS (Invitrogen). 2,5Е4 целевых клеток высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one) в 50 мкл среды на лунку.The effect of recruiting T cells under the action of bispecific antibodies was analyzed using analysis based on flow cytometry. Target cells (ie THP-1 cell line) were stained for 15 min at 37°C with 1 μM CFSE in 1 ml RPMI+GlutaMAX I (Gibco) per 1E7 cells. The cells were then washed twice and resuspended in RPMI+GlutaMAX 1+10% FCS (Invitrogen). 2.5E4 target cells were plated in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one) in 50 μl of medium per well.

Выделенные первичные Т лимфоциты человека ресуспендировали в RPMI+GlutaMAX I+10% FCS и добавляли при указанном соотношении эффектор-мишень в 50 мкл на лунку к целевым клеткам (в большинстве случаев Е:Т=10:1).Isolated primary human T lymphocytes were resuspended in RPMI+GlutaMAX I+10% FCS and added at the indicated effector-target ratio at 50 µl per well to target cells (in most cases E:T=10:1).

Биспецифические антитела серийно разводили 1:3 в PBS (Invitrogen) и по 5 мкл каждого добавляли к клеткам при конечной максимальной концентрации, составляющей 3000 нг/мл.The bispecific antibodies were serially diluted 1:3 in PBS (Invitrogen) and 5 μl of each was added to the cells at a final maximum concentration of 3000 ng/ml.

Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 ч при 37°С в 5% СО2.The analyzed mixture was incubated for 20 h at 37°C in 5% CO 2 .

Для обнаружения погибших целевых клеток все клетки окрашивали с помощью 7-AAD. В связи с этим по 5 мкг/мл 7-AAD, разведенного в буфере для окрашивания с FBS (BD Pharmingen), добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 15 мин при 4°С в темноте. Клетки измеряли с применением MACSQuant (Miltenyi Biotec) или проточного цитометра LSRII (BD) соответственно. Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю двойных положительных клеток по CFSE и 7-AAD.To detect dead target cells, all cells were stained with 7-AAD. Therefore, 5 μg/ml of 7-AAD diluted in FBS staining buffer (BD Pharmingen) was added to each well and incubated for 15 min at 4° C. in the dark. Cells were measured using MACSQuant (Miltenyi Biotec) or LSRII flow cytometer (BD), respectively. Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of double positive cells for CFSE and 7-AAD.

Результаты этих исследований, показанные, например, в табл. 20-22, демонстрируют способность CODV-Fab к CD123xCD3 опосредовать перенаправленный цитолиз опухолевых клеток.The results of these studies, shown, for example, in table. 20-22 demonstrate the ability of the anti-CD123xCD3 CODV-Fab to mediate redirected tumor cell cytolysis.

3.3. Оценка безопасности перенаправленного цитолиза под действием Т-клеток.3.3. Evaluation of the safety of redirected cytolysis under the influence of T-cells.

Эффект биспецифических антител на статус активации Т-клеток в качестве результатов по безопасности анализировали с помощью основанного на проточной цитометрии обнаружения экспрессии маркера активации CD25 и CD69 на поверхности первичных Т-клеток человека.The effect of bispecific antibodies on T cell activation status as a safety outcome was analyzed by flow cytometry-based detection of CD25 and CD69 activation marker expression on the surface of primary human T cells.

Выделенные первичные Т-лимфоциты человека ресуспендировали в RPMI+GlutaMAX I (Gibco)+10% FCS (Invitrogen) и 2,5Е5 клеток высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one) в 50 мкл на лунку.Isolated primary human T lymphocytes were resuspended in RPMI+GlutaMAX I (Gibco)+10% FCS (Invitrogen) and 2.5E5 cells were plated in 96-well U-bottom suspension culture plates (Greiner bio-one) in 50 µl to the hole

Либо тестировали исключительно Т-клетки и лунки заполняли 50 мкл RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS, или целевые клетки (т.е. линию клеток ТНР-1) добавляли из расчета 2,5Е4 клеток на лунку в 50 мкл RPMI+GlutaMAX I+10% FCS.Either only T cells were tested and wells filled with 50 µl RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS, or target cells (i.e. THP-1 cell line) were added at a rate of 2.5E4 cells per well in 50 µl RPMI+GlutaMAX I +10% FCS.

Биспецифические антитела серийно разводили 1:3 в PBS (Invitrogen) и по 5 мкл каждого добавляли к клеткам при конечной максимальной концентрации, составляющей 30000 нг/мл.The bispecific antibodies were serially diluted 1:3 in PBS (Invitrogen) and 5 μl of each was added to the cells at a final maximum concentration of 30,000 ng/ml.

Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 ч при 37°С в 5% СО2.The analyzed mixture was incubated for 20 h at 37°C in 5% CO 2 .

После периода инкубации клетки осаждали и окрашивали в течение 15 мин при 4°С в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) на лунку с помощью следующих меченных антител: CD4PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE-Cy7.After the incubation period, the cells were pelleted and stained for 15 min at 4°C in 100 µl of FBS staining buffer (BD Pharmingen) per well with the following labeled antibodies: CD4PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE -Cy7.

В качестве контроля комбинации нескольких антител без одного (Fluorescence Minus One (FMO)) активированные Т-клетки окрашивали как описано выше, но CD2 5 заменяли его изотипом (изотипическое APC-IG1k) в одной пробирке, a CD69 заменяли его изотипом (изотипическое PE-Cy7-IGlk) во второй пробирке.As a multi-antibody combination control without one (Fluorescence Minus One (FMO)) activated T cells were stained as described above, but CD25 was replaced by its isotype (isotypic APC-IG1k) in one tube, and CD69 was replaced by its isotype (isotypic PE- Cy7-IGlk) in the second tube.

- 102 041572- 102 041572

Клетки дважды промывали после окрашивания, ресуспендировали в 150 мкл буфера для окрашивания с FBS и 5000 клеток измеряли с применением проточного цитометра LSRII (BD). Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю Т-клеток CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos и CD8posCD69pos. Гейтирование проводили в соответствии с контролями FMO (см. табл. 12).Cells were washed twice after staining, resuspended in 150 μl of FBS staining buffer, and 5000 cells were measured using an LSRII flow cytometer (BD). Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos and CD8posCD69pos T cells. Gating was performed according to FMO controls (see Table 12).

Таблица 12. Активность CODV-Fab к CD123xCD3, измеряемая в анализе цитотоксичности, и безопасность, измеряемая с помощью экспрессии CD69Table 12 Anti-CD123xCD3 activity of CODV-Fab as measured by cytotoxicity assay and safety as measured by CD69 expression

Молекула Molecule Активность ЕС50 [нг/мл] Activity EC50 [ng/ml] Безопасность Экспрессия CD69 % клеток/% макс. Safety Expression of CD69 % cells/% max. 7G3 х I2C 7G3 x I2C 20 + 9 20+9 25, 8 + 7,6 25.8 + 7.6 7G3 х ОКТЗ 7G3 x OKTZ 16 + 5 16+5 25, 5 + 8,0 25.5 + 8.0 7G3x20G6 7G3x20G6 18 + 5 18+5 8,7 + 0,8 8.7 + 0.8 7G3x4E7 7G3x4E7 12 + 3 12+3 12,3 + 2,5 12.3+2.5 7G3x4B4 7G3x4B4 11 + 2 11+2 11, 6 + 0,8 11.6 + 0.8 7G3X18F5 7G3X18F5 61 + 15 61+15 9,8 + 1,1 9.8+1.1

3.4. Гуманизация последовательностей антитела крысы к CD3 и биспецифических антител.3.4. Humanization of rat anti-CD3 antibody and bispecific antibody sequences.

Гуманизацию антител крысы осуществляли с помощью привития CDR или с помощью 4D-способа (US 20110027266).Humanization of rat antibodies was carried out by CDR grafting or by the 4D method (US 20110027266).

Для антитела крысы к CD3, 20G6, наиболее близкими идентифицированными последовательностями зародышевой линии Rattus были IGHV6S17*01 и IGHJ2*01 (для вариабельной области тяжелой цепи) и IGKV1S21*O1 и IGKJ4*01 (для вариабельной области легкой цепи). Рассчитанный показатель идентичности с последовательностью зародышевого типа крысы (только последовательности каркасных областей) составляет 97,80% для VH и 95,5% для VL.For the rat anti-CD3 antibody, 20G6, the closest identified Rattus germline sequences were IGHV6S17*01 and IGHJ2*01 (for the heavy chain variable region) and IGKV1S21*O1 and IGKJ4*01 (for the light chain variable region). The calculated rate of identity with the rat germline sequence (framework sequences only) is 97.80% for VH and 95.5% for VL.

Создавали множество гуманизированных вариантов с применением способа привития на основании:Created a lot of humanized variants using the grafting method based on:

1) наиболее близких идентифицированных последовательностей зародышевой линии человека (IGHV3-30-01 IGHJ4-01 для VH с показателем идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях, составляющим 77%; IGK2D-29-02 IGKJ4-01 для VL с показателем идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях, составляющим 80%), или1) closest human germline sequences identified (IGHV3-30-01 IGHJ4-01 for VH with 77% germline identity in framework regions; IGK2D-29-02 IGKJ4-01 for VL with sequence identity germinal type in the frame regions, constituting 80%), or

2) на основании наиболее близкой идентифицированной последовательности зародышевой линии с более низкой pI IGVH3-48*02-IGHJ4-01 для VH с показателем идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях, составляющим 75%; IGKV2-28*01-IGKJ4-01 для VL с показателем идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях, составляющим 77,5%, или2) based on the closest germline sequence identified with lower pI IGVH3-48*02-IGHJ4-01 for VH with a germline sequence identity in the framework regions of 75%; IGKV2-28*01-IGKJ4-01 for VL with 77.5% identity with the germline sequence in the framework regions, or

3) на основании более отдаленной последовательности зародышевой линии человека (смена клады зародышевой линии) (IGVH1-46*01-IGHJ4*01 для VH с показателем идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях, составляющим 56%; IGKV4*01-IGKJ4*01 для VL с показателем идентичности с последовательностью зародышевого типа в каркасных областях, составляющим 67,5%).3) based on more distant human germline sequence (germline clade change) (IGVH1-46*01-IGHJ4*01 for VH with 56% germline identity in framework regions; IGKV4*01-IGKJ4*01 for VL with a germline sequence identity in the framework regions of 67.5%).

Гуманизированные последовательности затем водили в формат CODV-Fab в виде молекулы, называемой CODV-Fab 7G3x20G6, в комбинации с последовательностью к CD123 из антитела 7G3, описываемого ранее. Очищенные CODV-Fab к CD123xCD3 применяли в анализе Biacore для оценки аффинности в отношении CD3ε/δ (см. табл. 13).The humanized sequences were then formatted as a CODV-Fab molecule called CODV-Fab 7G3x20G6 in combination with the anti-CD123 sequence from the 7G3 antibody described previously. Purified anti-CD123xCD3 CODV-Fabs were used in the Biacore assay to assess affinity for CD3ε/δ (see Table 13).

- 103 041572- 103 041572

Таблица 13. Аффинность выбранных гуманизированных вариантов антитела к CD3, 20G6, в отношении рекомбинантного CD3ε/δ-комплексаTable 13. Affinity of selected humanized variants of the anti-CD3 antibody, 20G6, for the recombinant CD3ε/δ complex

Комбинации гуманизиров анных последовательностей, применяемых в CODVFab 7G3X20G6 Combinations of humanized sequences used in CODVFab 7G3X20G6 ka (1/Mc) ka (1/Mc) kd (1/c) kd (1/c) Rmax (RU) Rmax (RU) KD (M) KD(M) Исходная последовательность Source sequence 2,17E+04 2.17E+04 5,71E-04 5.71E-04 46 46 2,63E-08 2.63E-08 VL1A_VH1A VL1A_VH1A 2,86E+04 2.86E+04 4,34E-03 4.34E-03 46 46 1,52E-07 1.52E-07 VL1B_VH1A VL1B_VH1A 2,99E+04 2.99E+04 4,14E-03 4.14E-03 45 45 1,38E-07 1.38E-07 VL1C_VH1D VL1C_VH1D 2,30E+04 2.30E+04 1,01E-03 1.01E-03 58 58 4,40E-08 4.40E-08 VL1D_VH1B VL1D_VH1B 1,86E+04 1.86E+04 1,09E-03 1.09E-03 62 62 5,87E-08 5.87E-08 VL1D_VH1C VL1D_VH1C 2,22E+04 2.22E+04 7,13E-04 7.13E-04 71 71 3,21E-08 3.21E-08 VL1D_VH1D VL1D_VH1D 2,40E+04 2.40E+04 7,46E-04 7.46E-04 59 59 3,10E-08 3.10E-08

Для антитела крысы к CD3, 4B4-D7, наиболее близкими идентифицированными последовательностями зародышевой линии Rattus были IGHV6S17*01 (идентичность 93%) и IGHJ2*01 (идентичность 87,5%) для вариабельной области тяжелой цепи и IGKV1S21*01 (идентичность 93%) и IGKJ4*01 (идентичность 100%) для вариабельной области легкой цепи.For the rat anti-CD3 antibody, 4B4-D7, the closest identified Rattus germline sequences were IGHV6S17*01 (93% identity) and IGHJ2*01 (87.5% identity) for the heavy chain variable region and IGKV1S21*01 (93% identity ) and IGKJ4*01 (100% identity) for the light chain variable region.

Рассчитанная процентная доля идентичности идентифицированных V-последовательностей Rattus с последовательностью зародышевого типа человека (только последовательности каркасных областей) составляет 79% для VH и 77,53% для VL.The calculated percentage identity of the identified Rattus V sequences to the human germline sequence (framework sequences only) is 79% for VH and 77.53% for VL.

Ряд пар гуманизированных вариантов для VH и VL создавали путем привития дополнительной сконструированной последовательности с применением наиболее близких последовательностей зародышевой линии человека (IGHV3-30*01_IGHJ6*02; IGKV2-30*02/IGKV2D-39*02_IGKJ2*01). Рассчитанные процентные доли идентичности с последовательностью зародышевого типа человека (только последовательности каркасных областей 4 IMGT) для гуманизированных V-последовательностей перечислены в табл. 14.A number of pairs of humanized variants for VH and VL were generated by grafting an additional engineered sequence using the closest human germline sequences (IGHV3-30*01_IGHJ6*02; IGKV2-30*02/IGKV2D-39*02_IGKJ2*01). The calculated percentages of identity with the human germline sequence (frame 4 IMGT sequences only) for the humanized V sequences are listed in Table 1. 14.

Таблица 14. Процентные доли идентичности с последовательностью зародышевого типа человека для гуманизированных V-последовательностей, полученных путем привития из антитела, называемого B4-D7Table 14. Percentage identity with human germline sequence for humanized V sequences grafted from an antibody termed B4-D7

Привитые варианты 4B4-D7 Grafted variants 4B4-D7 Показатель идентичности с последовательностью зародышевого типа человека, % Index of identity with the human germ type sequence, % VLlCmodifl VLlCmodifl 92,1 92.1 VLlCmodif2 VLlCmodif2 91,0 91.0 VLlCmodif3 VLlCmodif3 91,0 91.0 VLIAmodif1 VLIAmodif1 97,8 97.8 VLlAmodif2 VLlAmodif2 96, 6 96.6 VLlAmodif3 VLlAmodif3 95, 5 95.5 VL2C VL2C 95, 5 95.5 VL2D VL2D 96, 7 96.7 VL2F VL2F 96, 7 96.7 VH6Bmodifl VH6Bmodifl 92,3 92.3 VH6Bmodif2 VH6Bmodif2 90, 1 90.1 VH6Amodifl VH6Amodifl 94,5 94.5 VH6Amodif2 VH6Amodif2 92,3 92.3 VH6Amodif3 VH6Amodif3 91,2 91.2 VH6C VH6C 95, 5 95.5 VH6D VH6D 93,5 93.5

Процентные доли рассчитывали только на основании последовательностей каркасных областей 4 IMGT.Percentages were calculated based on 4 IMGT framework sequences only.

В дополнение к привитию CDR для гуманизации вариабельных доменов легкой цепи (VL) и тяжеIn addition to CDR grafting to humanize light chain (VL) and heavy chain variable domains

- 104 041572 лой цепи (VH) антитела крысы к CD3, 4B4-D7, применяли протокол 4D-гуманизации, описанный в заявке на патент США US 20110027266. Моделирование молекулярной динамики (MD) осуществляли на минимизированной 3D гомологичной модели (проводили с помощью МОЕ; применяли PDB: 1FLR) антитела крысы к CD3, 4B4-D7, и сравнивали с 49 моделями антитела человека, полученными на основании семи репрезентативных легких цепей (vkl, vk2, vk3, vk4, vlambdal, vlambda2, vlambda3) и семи репрезентативных тяжелых цепей (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6), обозначенных с помощью LGCR/SDI и доступных в МОЕ.- 104 041572 rat anti-CD3 antibody VH, 4B4-D7, used the 4D humanization protocol described in US Patent Application US 20110027266. Molecular dynamics (MD) modeling was performed on a minimized 3D homologous model (performed with MOE; used PDB: 1FLR) rat anti-CD3 antibody, 4B4-D7, and compared with 49 human antibody models derived from seven representative light chains (vkl, vk2, vk3, vk4, vlambdal, vlambda2, vlambda3) and seven representative heavy chains ( vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) labeled with LGCR/SDI and available from MOE.

Две модели выбирали для 4D-гуманизации. vk1-vh6 с наиболее высоким 4D-подобием как в отношении гидрофобного, так и в отношении электростатического компонентов. vk2-vh3 с наиболее высокой идентичностью последовательности за пределами CDR. Для парного сравнения вариабельного домена антитела крысы к CD3, 4B4-D7, и двух выбранных моделей последовательности выравнивали на основании оптимального 3D наложения альфа-атомов углерода в соответствующих гомологичных моделях. Ряд других пар гуманизированных вариантов для VH и VL дополнительно оптимизировали.Two models were chosen for 4D humanization. vk1-vh6 with the highest 4D similarity for both hydrophobic and electrostatic components. vk2-vh3 with the highest sequence identity outside the CDR. For pairwise comparison of the variable domain of the rat anti-CD3 antibody, 4B4-D7, and the two selected models, the sequences were aligned based on the optimal 3D overlap of alpha carbons in the respective homologous models. A number of other pairs of humanized variants for VH and VL were further optimized.

Рассчитанные процентные доли идентичности с последовательностью зародышевого типа человека (только последовательности каркасных областей 4 IMGT) для гуманизированных V-последовательностей перечислены в табл. 15.The calculated percentages of identity with the human germline sequence (frame 4 IMGT sequences only) for the humanized V sequences are listed in Table 1. 15.

Таблица 15. Процентные доли идентичности с последовательностью зародышевого типа человека для гуманизированных V-последовательностей, полученныхTable 15. Percentage identity with human germline sequence for humanized V sequences obtained

Процентные доли рассчитывали только на основании последовательностей каркасных областей 4 IMGT.Percentages were calculated based on 4 IMGT framework sequences only.

Гуманизированные последовательности экспрессировали как Fab-фрагменты и очищали с последующим анализом Biacore для оценки аффинности к CD3ε/δ (данные показаны в табл. 16).The humanized sequences were expressed as Fab fragments and purified followed by Biacore analysis to assess affinity for CD3ε/δ (data shown in Table 16).

Таблица 16. Аффинность выбранных гуманизированных вариантов антитела к CD3,Table 16. Affinity of selected humanized anti-CD3 antibody variants,

4B4-D7, в отношении рекомбинантного CD3ε/δ-комплекса4B4-D7, in relation to the recombinant CD3ε/δ complex

Fab fab VL VL VH vh Лиган Д Ligan D ka ka kd kd KD KD 4В4 4B4 huCD3 huCD3 3,26E+05 3.26E+05 2,85E-03 2.85E-03 8,79E-09 8.79E-09 cyCD3 cyCD3 1,90E+05 1.90E+05 2,37E-03 2.37E-03 l,26E-08 l,26E-08 4В4_1 4В4_1 VLla 75% Vlla 75% VH1B 80% VH1B 80% huCD3 huCD3 6,28E+05 6.28E+05 1,74E-03 1.74E-03 2,77E-09 2.77E-09 cyCD3 cyCD3 5,06E+05 5.06E+05 1,58E-03 1.58E-03 3,13E-09 3.13E-09 4В4_2 4B4_2 VLlb 75% Vllb 75% VH1B 80% VH1B 80% huCD3 huCD3 2,86E+05 2.86E+05 2,14E-03 2.14E-03 7,48E-09 7.48E-09 cyCD3 cyCD3 2,77E+05 2.77E+05 2,10E-03 2.10E-03 7,57E-09 7.57E-09 4В4_5 4B4_5 VL2C 95, 5% VL2C 95.5% VH6D 93, 5% VH6D 93.5% huCD3 huCD3 2,33E+05 2.33E+05 4,23E-03 4.23E-03 l,82E-08 l,82E-08 cyCD3 cyCD3 2,53E+05 2.53E+05 4,20E-03 4.20E-03 l,66E-08 l,66E-08 4В4_6 4B4_6 VLla 75% Vlla 75% VH1A 80% VH1A 80% huCD3 huCD3 1,50E+06 1.50E+06 1,85E-03 1.85E-03 l,24E-09 l,24E-09

- 105 041572- 105 041572

cyCD3 cyCD3 1,49E+06 1.49E+06 1,77E-03 1.77E-03 l,19E-09 l,19E-09 4В4_7 4B4_7 VLlb 75% Vllb 75% VH1A 80% VH1A 80% huCD3 huCD3 3,06E+05 3.06E+05 2,48E-03 2.48E-03 8,10E-09 8.10E-09 cyCD3 cyCD3 3,01E+05 3.01E+05 2,19E-03 2.19E-03 7,28E-09 7.28E-09 4В4_9 4B4_9 VL2B 83% VL2B 83% VH2A 80% VH2A 80% huCD3 huCD3 2,18E+05 2.18E+05 2,91E-03 2.91E-03 l,34E-08 l,34E-08 cyCD3 cyCD3 2,85E+05 2.85E+05 3,44E-03 3.44E-03 l,21E-08 l,21E-08 4В4_1 0 4В4_1 0 VL1_CM2 91% VL1_CM2 91% VH6_BM2 90% VH6_BM2 90% huCD3 huCD3 4,34E+05 4.34E+05 3,99E-03 3.99E-03 9,19E-09 9.19E-09 cyCD3 cyCD3 4,30E+05 4.30E+05 3,84E-03 3.84E-03 8,94E-09 8.94E-09 4В4_1 1 4В4_1 1 VL1_CM3 91% VL1_CM3 91% VH6_BM2 90% VH6_BM2 90% huCD3 huCD3 5,66E+05 5.66E+05 7,74E-03 7.74E-03 l,37E-08 l,37E-08 cyCD3 cyCD3 2,38E+05 2.38E+05 4,86E-03 4.86E-03 2,04E-08 2.04E-08 4В4_1 7 4В4_1 7 VL2A 83% VL2A 83% VH2B 84,5% VH2B 84.5% huCD3 huCD3 3,10E+05 3.10E+05 2,76E-03 2.76E-03 8,91E-09 8.91E-09 cyCD3 cyCD3 2,98E+05 2.98E+05 2,70E-03 2.70E-03 9,07E-09 9.07E-09 4В4_2 0 4В4_2 0 VL2F 96, 5% VL2F 96.5% VH6C 95, 5% VH6C 95.5% huCD3 huCD3 5,09E+04 5.09E+04 1,71E-03 1.71E-03 3,35E-08 3.35E-08 cyCD3 cyCD3 4,56E+04 4.56E+04 1,98E-03 1.98E-03 4,34E-08 4.34E-08

3.5. Связывание CODV hu-Fab к CD123xCD3 с клетками ТНР-1 и TF-1.3.5. Binding of CODV hu-Fab to CD123xCD3 with THP-1 and TF-1 cells.

Последовательности выбранных антител к CD123 клонировали в формат CODV-Fab в комбинации с последовательностью связывания CD3 и белки экспрессировали и очищали.Selected anti-CD123 antibody sequences were cloned into CODV-Fab format in combination with a CD3 binding sequence, and the proteins were expressed and purified.

Их способность связывания с клетками, экспрессирующими в естественных условиях CD123, определяли с помощью проточной цитометрии. Линию клеток ТНР-1 или линию клеток TF-1 применяли в качестве целевых клеток.Their ability to bind to cells naturally expressing CD123 was determined by flow cytometry. The THP-1 cell line or the TF-1 cell line was used as target cells.

Целевые клетки блокировали с помощью FcR-блокатора (Sigma). В связи с этим целевые клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания с FBS (BD Pharmingen) и блокировали с помощью 100 мкл блокирующего реагента на мл в течение 1 ч. при 4°С. Клетки заливали буфером для окрашивания с FBS и 1Е5 клеток в 50 мкл на лунку высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one).Target cells were blocked with an FcR blocker (Sigma). In this regard, target cells were resuspended in FBS staining buffer (BD Pharmingen) and blocked with 100 μl of blocking reagent per ml for 1 hour at 4°C. Cells were flooded with FBS staining buffer and 1E5 cells at 50 μl per well were plated in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one).

Антитела добавляли из расчета 3 мкг в 50 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку. Анализируемую смесь инкубировали в течение 30 мин при 4°С.Antibodies were added at the rate of 3 μg in 50 μl of FBS staining buffer per well. The analyzed mixture was incubated for 30 min at 4°C.

Клетки дважды промывали буфером для окрашивания с FBS и в каждую лунку добавляли по 1 мкг вторичного антитела F(ab')2 козы к каппа-цепи человека, конъюгированного с FITC (Beckman Coulter, № 732621), в 100 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку. Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С и после этого дважды промывали.Cells were washed twice with FBS staining buffer and 1 μg of FITC-conjugated goat anti-human kappa chain F(ab')2 secondary antibody F(ab')2 (Beckman Coulter, no. 732621) in 100 μl of FBS staining buffer was added to each well. to the hole The analyzed mixture was incubated for 20 min at 4°C and then washed twice.

Клетки ресуспендировали в 150 мкл буфера для окрашивания с FBS на лунку и измеряли с применением проточного цитометра MACSQuant (Miltenyi Biotec) или LSRII (BD). Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю клеток, положительных в отношении связывания антителом. Клетки, обработанные только вторичным, а не первичным антителом, применяли для гейтирования.Cells were resuspended in 150 μl of FBS staining buffer per well and measured using a MACSQuant (Miltenyi Biotec) or LSRII (BD) flow cytometer. Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of cells positive for antibody binding. Cells treated with secondary antibody only and not with primary antibody were used for gating.

Связывание CODV-Fab к CD123xCD3 с CD123 было показано с двумя разными линиями клеток, экспрессирующими CD123, либо при совместной экспрессии с CD131 на линии клеток TF-1, либо на поверхности клеток ТНР-1 при отсутствии экспрессии CD131. В качестве примера показаны пять различных клонов, связывающихся с целевыми клетками. В качестве отрицательного контроля (контроль специфичности) применяли CODV-Fab к CD19xCD3 и эталонный CODV-Fab к CD123xCD3 - в качестве положительного контроля (табл. 17).CD123xCD3 CODV-Fab binding to CD123 was shown with two different cell lines expressing CD123, either co-expressed with CD131 on a TF-1 cell line or on the surface of THP-1 cells in the absence of CD131 expression. As an example, five different clones are shown binding to target cells. Anti-CD19xCD3 CODV-Fab was used as a negative control (specificity control) and a reference CD123xCD3 CODV-Fab as a positive control (Table 17).

Таблица 17. Специфическое связывание последовательностей, нацеливающихся на CD123, клонированных в остов CODV-Fab в комбинации с последовательностью связывания CD3, с линиями клеток ТНР-1 и TF-1Table 17 Specific binding of CD123 targeting sequences cloned into the backbone of CODV-Fab in combination with CD3 binding sequence to THP-1 and TF-1 cell lines

% FIТС-положительных клеток % FITC-positive cells Антитело Antibody Клетки ТНР-1 THP-1 cells Клетки TF-1 TF-1 cells Контроль co средой Environmental control 0, 10 0.10 0, 00 0.00 Контроль с вторичным АВ Control with secondary AV 0, 00 0.00 0,20 0.20 Контроль специфичности с CD19 х CD3 Specificity control with CD19 x CD3 0, 10 0.10 0,20 0.20 CODV-Fab CD123 х CD3 CODV-Fab CD123 x CD3 99, 90 99, 90 82,50 82.50 CODV-Fab BFX-2F8-D6 х CD3 CODV-Fab BFX-2F8-D6 x CD3 24,00 24.00 9,30 9.30 CODV-Fab BFX-3E3-D3 х CD3 CODV-Fab BFX-3E3-D3 x CD3 99, 00 99.00 31, 60 31, 60 CODV-Fab BFX-9B8-G6 х CD3 CODV-Fab BFX-9B8-G6 x CD3 48,80 48.80 31, 10 31, 10 CODV-Fab BFX-9D7-C8 х CD3 CODV-Fab BFX-9D7-C8 x CD3 88,70 88.70 50,20 50.20 CODV-Fab BFX-9F6-G3 х CD3 CODV-Fab BFX-9F6-G3 x CD3 99, 70 99, 70 60,70 60.70

Связывание антител обнаруживали с применением ТНР-1 и TF-1, экспрессирующих CD123, в каче- 106 041572 стве целевых клеток. Добавляли 3 мкг антитела и обнаруживали с помощью вторичного антитела козы к каппа-цепи человека, конъюгированного с FITC. Показаны процентные доли положительных в отношении антитела целевых клеток.Antibody binding was detected using THP-1 and TF-1 expressing CD123 as target cells. 3 μg of antibody was added and detected with a goat anti-human kappa chain secondary antibody conjugated to FITC. The percentages of antibody-positive target cells are shown.

3.6. Цитотоксический эффект в отношении клеток ТНР-1, опосредованный CODV-Fab к3.6. Cytotoxic effect on THP-1 cells mediated by CODV-Fab to

CD123xCD3.CD123xCD3.

Эффекты вовлечения Т-клеток под действием биспецифических антител, состоящих из новой созданной последовательности к CD123 и той же последовательности связывания CD3, анализировали с помощью анализа цитотоксичности, основанного на проточной цитометрии. Эффекторными клетками были первичные Т-клетки, выделенные из цельной крови здоровых доноров. Клетки ТНР-1 применяли в качестве целевых клеток, экспрессирующих CD123.The effects of T cell recruitment by bispecific antibodies consisting of the newly generated anti-CD123 sequence and the same CD3 binding sequence were analyzed by flow cytometry based cytotoxicity assay. The effector cells were primary T cells isolated from whole blood of healthy donors. THP-1 cells were used as target cells expressing CD123.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из 200 мл периферической крови здоровых доноров, обработанной EDTA, с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. 15 мл Histopaque (Sigma-Aldrich) предварительно загружали в 50-мл пробирку Leucosep (Greiner bio-one). Кровь разводили буфером для промывки autoMACS+1% BSA (Miltenyi Biotec) и загружали на мембрану в общей сложности десяти подготовленных пробирок. Пробирки центрифугировали без торможения в течение 10 мин при 1000xg. РВМС собирали и промывали с помощью буфера для промывки autoMACS+1% BSA трижды. В конце концов, РВМС ресуспендировали в буфере для прогона autoMACS (Miltenyi Biotec) для выделения Т-лимфоцитов с помощью технологии autoMACSpro с применением набора для выделения всех Т-клеток (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту выделенных Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии MACSQuant с применением 7-цветного набора для иммунофенотипирования человека (Miltenyi Biotec).Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 200 ml of EDTA-treated peripheral blood of healthy donors using ficoll density gradient centrifugation. 15 ml Histopaque (Sigma-Aldrich) was preloaded into a 50 ml Leucosep tube (Greiner bio-one). Blood was diluted with autoMACS+1% BSA wash buffer (Miltenyi Biotec) and loaded onto the membrane in a total of ten prepared tubes. The tubes were centrifuged without braking for 10 min at 1000xg. The PBMCs were harvested and washed with autoMACS+1% BSA wash buffer three times. Finally, the PBMCs were resuspended in autoMACS run buffer (Miltenyi Biotec) for T lymphocyte isolation using autoMACSpro technology using the Total T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions. The purity of the isolated T cells was analyzed by MACSQuant flow cytometry using a 7-color human immunophenotyping kit (Miltenyi Biotec).

Целевые клетки (т.е. линию клеток ТНР-1) окрашивали в течение 15 мин при 37°С с помощью 1 мкМ CFSE в 1 мл RPMI+GlutaMAX 1+10% FCS (Invitrogen). 2,5E4 целевых клеток высевали в 96луночные планшеты с U-образным дном для суспензионных культур (Greiner bio-one) в 50 мкл среды на лунку.Target cells (ie THP-1 cell line) were stained for 15 min at 37°C with 1 μM CFSE in 1 ml RPMI+GlutaMAX 1+10% FCS (Invitrogen). 2.5E4 target cells were plated in 96-well U-bottomed suspension culture plates (Greiner bio-one) in 50 μl of medium per well.

Выделенные первичные Т лимфоциты человека ресуспендировали в RPMI+GlutaMAX 1+10% FCS и добавляли при указанном соотношении эффектор-мишень в 50 мкл на лунку к целевым клеткам (в большинстве случаев Е:Т=10:1).Isolated primary human T lymphocytes were resuspended in RPMI+GlutaMAX 1+10% FCS and added at the indicated effector-target ratio at 50 µl per well to target cells (in most cases E:T=10:1).

Биспецифические антитела серийно разводили 1:3 в PBS (Invitrogen) и по 5 мкл каждого добавляли к клеткам при конечной максимальной концентрации, составляющей 3000 нг/мл.The bispecific antibodies were serially diluted 1:3 in PBS (Invitrogen) and 5 μl of each was added to the cells at a final maximum concentration of 3000 ng/ml.

Анализируемую смесь инкубировали в течение 20 ч при 37°С в 5% СО2.The analyzed mixture was incubated for 20 h at 37°C in 5% CO 2 .

Для обнаружения погибших целевых клеток все клетки окрашивали с помощью 7-AAD. В связи с этим по 5 мкг/мл 7-AAD, разведенного в буфере для окрашивания с FBS (BD Pharmingen), добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 15 мин при 4°С в темноте. Клетки измеряли с применением MACSQuant (Miltenyi Biotec) или проточного цитометра LSRII (BD) соответственно. Дополнительные анализы данных осуществляли с применением программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представляли собой процентную долю двойных положительных клеток по CFSE и 7-AAD. Кривые рассчитывали с помощью XLfit (алгоритм 205).To detect dead target cells, all cells were stained with 7-AAD. Therefore, 5 μg/ml of 7-AAD diluted in FBS staining buffer (BD Pharmingen) was added to each well and incubated for 15 min at 4° C. in the dark. Cells were measured using MACSQuant (Miltenyi Biotec) or LSRII flow cytometer (BD), respectively. Additional data analyzes were performed using FlowJo software (Tree Star, Inc.). The results were the percentage of double positive cells for CFSE and 7-AAD. Curves were calculated using XLfit (Algorithm 205).

Как показано в качестве примера в табл. 18, биспецифические антитела обладали способностью вовлекать первичные Т-клетки и обеспечивать лизис целевых клеток ТНР-1 in vitro. Зависимое от концентрации антител повышение уровня погибших целевых клеток можно было обнаружить после 20 ч совместной инкубации. Для антител, показанных здесь, рассчитанные значения ЕС50 находились в диапазоне от 12,2 до 429,3 нг/мл.As shown as an example in table. 18, the bispecific antibodies were able to recruit primary T cells and lyse target THP-1 cells in vitro. An antibody concentration-dependent increase in dead target cells could be detected after 20 hours of co-incubation. For the antibodies shown here, the calculated EC50 values ranged from 12.2 to 429.3 ng/mL.

- 107 041572- 107 041572

Таблица 18. Эффект вовлечения Т-клеток под действием биспецифического CODV-Fab к CD123xCD3, обнаруженный в анализах цитотоксичности, основанных на проточной цитометрииTable 18 T cell recruitment effect of anti-CD123xCD3 bispecific CODV-Fab detected in flow cytometry-based cytotoxicity assays

Антитело Antibody EC50 [нг/мл] геометрическое среднее значение +/- SEM EC50 [ng/ml] geometric mean +/- SEM ЕС50 [нМ] геометрическое среднее значение +/- SEM (п=4) EC50 [nM] geometric mean +/- SEM (n=4) η η (G ι=4) v=4) CODV-Fab х CD3 CODV-Fab x CD3 BFX-2B8-F3 BFX-2B8-F3 106, 9 106.9 + /- +/- 33, 9 33, 9 1420,5 1420.5 +/- 450,2 +/- 450.2 4 4 CODV-Fab х CD3 CODV-Fab x CD3 BFX-3E3-D3 BFX-3E3-D3 12,2 12.2 + /- +/- 5, 9 5, 9 163, 0 163.0 +/- 80,1 +/- 80.1 4 4 CODV-Fab Е4 х CD3 CODV Fab E4 x CD3 BFX-6B10- BFX-6B10- 39, 7 39.7 + /- +/- 17,9 17.9 529, 1 529.1 +/- 237,7 +/- 237.7 4 4 CODV-Fab x CD3 CODV-Fab x CD3 BFX-9B8-G6 BFX-9B8-G6 106, 1 106.1 + /- +/- 36, 1 36, 1 1410,2 1410.2 +/- 479,8 +/- 479.8 4 4 CODV-Fab x CD3 CODV-Fab x CD3 BFX-9D7-C8 BFX-9D7-C8 86, 3 86.3 + /- +/- 29, 3 29, 3 1148,6 1148.6 +/- 390,5 +/- 390.5 4 4 CODV-Fab x CD3 CODV-Fab x CD3 BFX-9F6-G3 BFX-9F6-G3 13, 9 13, 9 + /- +/- 7,7 7.7 185, 9 185.9 +/- 104,1 +/- 104.1 3 3 CODV-Fab E6 x CD3 CODV Fab E6 x CD3 BFX-3B10- BFX-3B10- 429, 3 429.3 + /- +/- 82, 6 82.6 5709,3 5709.3 +/- 1099,0 +/- 1099.0 2 2

Представлены средние значения ЕС50, рассчитанные на основании кривых.Average EC50 values calculated from the curves are shown.

Клон 3Е3 к CD123 объединяли с гуманизированным вариантом антитела к CD3, 4В4, в формате CODV-Fab. Анализировали их эффект вовлечения Т-клеток и их способность активировать Т-клетки in vitro.Anti-CD123 clone 3E3 was combined with a humanized version of the anti-CD3 antibody, 4B4, in CODV-Fab format. Their effect on T cell recruitment and their ability to activate T cells in vitro were analyzed.

Анализы цитотоксичности осуществляли как описано выше. В табл. 20 показан литический эффект первичных Т-клеток человека в отношении целевой клетки ТНР-1, опосредованный этими конструкциями, например, CODV-Fab hz4B4(4D_A)x3E3.Cytotoxicity assays were performed as described above. In table. 20 shows the lytic effect of primary human T cells on the target THP-1 cell mediated by these constructs, eg CODV-Fab hz4B4(4D_A)x3E3.

Цитотоксическую активность могла надежно индуцироваться с зависимым от концентрации эффектом с помощью Т-клеток, выделенных из семи различных здоровых доноров (табл. 19).Cytotoxic activity could be reliably induced with a concentration-dependent effect using T cells isolated from seven different healthy donors (Table 19).

Таблица 19. Эффект вовлечения Т-клеток под действием биспецифического CODV-Fab Fz4B4(4D_A)x3E3, обнаруженный при анализе цитотоксичности, основанном на проточной цитометрииTable 19 T cell recruitment effect of bispecific CODV-Fab Fz4B4(4D_A)x3E3 detected in flow cytometry-based cytotoxicity assay

CODV-Fab CODV Fab Цитотоксичность (ТНР-1) Cytotoxicity (THP-1) Цитотоксичность (ТНР-1) Cytotoxicity (THP-1) геометрическое среднее значение ЕС50 [нМ] +/- SEM п=7 geometric mean EC50 [nM] +/- SEM n=7 геометрическое среднее значение ЕС50 [нг/мл] + /SEM п=7 geometric mean EC50 [ng/ml] + /SEM n=7 hz4B4(4D_A) х ЗЕЗ CODV-Fab hz4B4(4D_A) x ZEZ CODV-Fab 26, 5 26.5 + /- +/- 5, 9 5, 9 2,0 2.0 + /- +/- 0,5 0.5

Представлены средние значения ЕС50, рассчитанные на основании кривых.Average EC50 values calculated from the curves are shown.

3.7. Эффект активации Т-клеток под действием CODV-Fab к CD123xCD3 или DART.3.7. Effect of T cell activation by CODV-Fab to CD123xCD3 or DART.

Эффект биспецифических антител на статус активации Т-клеток в качестве результатов по безопасности анализировали с помощью основанного на проточной цитометрии обнаружения экспрессии маркера активации CD25 и CD69 на поверхности первичных Т-клеток человека, как описано выше. Сравнение включало одноцепочечное биспецифическое диатело к CD123xCD3 в формате DART (называемое в данном документе MGD006), которое было описано в WO 2015026892, содержащее первую полипептидную цепь с последовательностью под SEQ ID NO: 386 (которая представляет собой SEQ ID NO:1, показанную в WO 2015026892) и вторую полипептидную цепь с последовательностью под SEQ ID NO: 387 (которая представляет собой SEQ ID NO: 3, показанную в WO 2015026892), ковалентно связанные друг с другом с помощью дисульфидной связи.The effect of bispecific antibodies on T cell activation status as a safety outcome was analyzed by flow cytometry-based detection of CD25 and CD69 activation marker expression on the surface of primary human T cells as described above. The comparison included a DART format CD123xCD3 bispecific diabody single chain (herein referred to as MGD006) which was described in WO 2015026892 containing a first polypeptide chain with the sequence under SEQ ID NO: 386 (which is SEQ ID NO: 1 shown in WO 2015026892) and a second polypeptide chain with the sequence under SEQ ID NO: 387 (which is SEQ ID NO: 3 shown in WO 2015026892) covalently linked to each other via a disulfide bond.

Когда CODV-Fab инкубировали с выделенными Т-клетками в отдельности, нельзя было обнаружить никаких значимых повышений экспрессии маркера поздней активации CD25 на поверхности CD4положительных и CD8-положительных Т-клеток (данные не показаны). В равной степени, не наблюдалось зависимое от концентрации повышение уровня экспрессии маркера ранней активации CD69 на обеих подгруппах Т-клеток (табл. 20). Вследствие этого, конструкцию оценивали как неактивную (NA) . Напротив, существенное повышение уровня экспрессии обоих маркеров было измеримым, когда добавляли целевые клетки ТНР-1 (данные для CD25 не показаны, данные для CD69 приведены в табл. 21).When CODV-Fab was incubated with isolated T cells alone, no significant increase in expression of the late activation marker CD25 could be detected on the surface of CD4 positive and CD8 positive T cells (data not shown). Equally, no concentration-dependent increase in expression of the early activation marker CD69 was observed on both T cell subgroups (Table 20). As a result, the construct was scored as inactive (NA). In contrast, a significant increase in the expression level of both markers was measurable when target THP-1 cells were added (data for CD25 not shown, data for CD69 are shown in Table 21).

- 108 041572- 108 041572

Таблица 20. Эффект биспецифических CODV-Fab к CD123xCD3 или DART на состояние активации Т-клеток, обнаруженный по уровню экспрессии CD69 при анализе, основанном на проточной цитометрииTable 20. Effect of anti-CD123xCD3 or DART bispecific CODV-Fabs on T cell activation status as detected by CD69 expression level in flow cytometry-based analysis

CODV-Fab CODV Fab Безопасность - активация Т-клеток без целевых клеток п=3 Safety - T cell activation without target cells n=3 CD4+/CD69+% активации, Нормализованный по DBS С=100 нМ среднее значение +/- SEM CD4+/CD69+% activation, DBS normalized C=100 nM mean +/- SEM Минимальная эффективная концентрация [пМ] для CD4+/CD69+ среднее значение +/- SEM Minimum effective concentration [pM] for CD4+/CD69+ mean +/- SEM CD8+/CD69+ активации, нормализованный по BBS С=100 нМ среднее значение +/- SEM CD8+/CD69+ activation normalized to BBS C=100 nM mean +/- SEM Минимальная эффективная концентраци я [пМ]для CD8+/CD69+ среднее значение +/- SEM Minimum effective concentration [pM] for CD8+/CD69+ mean +/- SEM hz4B4(4D_A)хЗЕ 3 CODV-Fab hz4B4(4D_A)x3E 3 CODV-Fab 14 14 + / + / 2 2 NA NA 13 13 + / + / 2 2 NA NA hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab 22 22 + / + / 2 2 22 22 + / + / 2 2 hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl 18 18 + / + / 4 4 15 15 + / + / 2 2 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OLl hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OLl 6 6 + / + / 2 2 9 9 + / + / 2 2 Одноцепочечное антитело в формате DART, MGD006 Single chain antibody in DART format, MGD006 82 82 + / + / 9 9 83 83 + / + / 4 4

Представлены средние процентные доли активированных CD8 и CD4 Т-клеток при концентрации антитела 100 нМ и минимальной эффективной концентрации в анализах исключительно с Т-клетками.Shown are the mean percentages of activated CD8 and CD4 T cells at 100 nM antibody and the lowest effective concentration in T cell-only assays.

Результаты, показанные в табл. 20, указывают на то, что одноцепочечное антитело (DART) вызывает значительно большую активацию Т-клеток в отсутствие целевых клеток при тестируемых условиях.The results shown in table. 20 indicate that the single chain antibody (DART) causes significantly more T cell activation in the absence of target cells under the conditions tested.

Таблица 21. Эффект биспецифического CODV-Fab Hz4B4(4D_A)x3E3 на состояние активации Т-клеток, обнаруженный по уровню экспрессии CD69 при анализе, основанном на проточной цитометрииTable 21. Effect of bispecific CODV-Fab Hz4B4(4D_A)x3E3 on T cell activation state as detected by CD69 expression level in flow cytometry-based analysis

CODV-Fab CODV Fab Безопасность - активация Т-клеток с целевыми клетками ТНР-1 п=3 Safety - T cell activation with target THP-1 cells n=3 CD4+/CD69+% активации,н ормализован ный по PBS С=среднее значение цитотоксичн ости при ЕС50 среднее значение +/- SEM CD4+/CD69+% activation normalized to PBS C=mean cytotoxicity at EC50 mean +/- SEM CD4+/CD69+ активации, нормализов анный по PBS Стах среднее значение +/- SEM CD4+/CD69+ activation normalized to PBS Cmax mean +/- SEM CD8+/CD69+% активации,н ормализован ный по PBS С=среднее значение цитотоксичн ости при ЕС50 среднее значение +/- SEM CD8+/CD69+% activation normalized by PBS C=mean cytotoxicity at EC50 mean +/- SEM CD8+/CD69+ % активации, нормализов анный по PBS Стах среднее значение +/- SEM CD8+/CD69+ % activation normalized by PBS Cmax mean +/- SEM hz4B4(4D_A)х ЗЕЗ CODV-Fab hz4B4(4D_A)x ZEZ CODV-Fab 71 71 + /- +/- 4 4 84 84 + /- +/- 2 2 69 69 + /- +/- 6 6 82 82 + /- +/- 4 4

Представлены средние процентные доли активированных CD8 и CD4 Т-клеток в анализе цитотоксичности при максимальной концентрации антитела (Cmax) и при концентрации антитела ЕС50. Анализы осуществляли при совместной инкубации целевых клеток ТНР-1 и Т-клеток.Shown are the mean percentages of activated CD8 and CD4 T cells in the cytotoxicity assay at maximum antibody concentration (Cmax) and at EC50 antibody concentration. The assays were performed by co-incubation of target THP-1 cells and T cells.

- 109 041572- 109 041572

Таблица 22. Эффект биспецифических, полностью гуманизированных содержащих 7G3 молекулTable 22 Effect of Bispecific, Fully Humanized 7G3 Containing Molecules

CODV и одноцепочечного Dart на состояние активации Т-клеток, обнаруженный по уровню экспрессии CD69 при анализе, основанном на проточной цитометрииCODV and single-stranded Dart on the state of T-cell activation, detected by the level of CD69 expression in the analysis based on flow cytometry

CODV-Fab CODV Fab Безопасность - активация Т-клеток с целевыми клетками ТНР-1 Safety - T cell activation with targeted THP-1 cells CD4 + Т-клетки (% CD69+ клеток) ЕС50 (пМ) п=1- 6 CD4+ T cells (% CD69+ cells) EC50 (pM) n=1-6 CD8+ Т-клетки (% CD69+ клеток) ЕС50 (пМ) п=1- 6 CD8+ T cells (% CD69+ cells) EC50 (pM) n=1-6 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab hz20G6xhz7G3 CODV-Fab 1,4 1.4 3, 1 3, 1 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl 3,2 3.2 9, 9 9, 9 hz20G6xhz7G3 CODV-OL1 hz20G6xhz7G3 CODV-OL1 1, 0 10 3,3 3.3 Одноцепочечное антитело в формате DART, MGD006 Single chain antibody DART format, MGD006 1, 0 10 3,5 3.5

Показаны значения ЕС50 для репрезентативных тестов активированных CD8 и CD4 Т-клеток в анализе цитотоксичности. Анализы осуществляли при совместной инкубации целевых клеток ТНР-1 и Тклеток.Shown are EC50 values for representative assays of activated CD8 and CD4 T cells in a cytotoxicity assay. The assays were performed by co-incubation of target THP-1 cells and T cells.

Чтобы оценить цитотоксические эффекты новых антител к CD123 с гуманизированными частями к CD3, создавали CODV-Fab hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3, содержащие различные комбинации Fv. Также создавали один Fc-содержащий вариант, CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4, несущий метку на Fc легкой цепи для образования гетеродимеров Fc с соответствующей тяжелой цепью (вариант TL4). Аффинности биспецифической конструкции к CD3ε/δ-комплексу и CD123 измеряли с помощью Biacore. Кроме того, осуществляли анализ цитотоксичности, как описано выше, и измеряли активацию CD4+ и активацию CD8+.To evaluate the cytotoxic effects of novel anti-CD123 antibodies with humanized anti-CD3 moieties, CODV-Fab hz20G6x7G3, 7G3xhz4B4, hz4B4x3E3 containing various combinations of Fv were generated. One Fc-containing variant, CODV-Fab hz20G6x7G3-TL4, was also made, labeled on the light chain Fc to form Fc heterodimers with the corresponding heavy chain (variant TL4). The affinities of the bispecific construct for the CD3ε/δ complex and CD123 were measured using Biacore. In addition, a cytotoxicity assay was performed as described above, and CD4+ activation and CD8+ activation were measured.

Таблица 23. Аффинности и активности биспецифических CODV-молекул к CD123xCD3Table 23. Affinities and activities of bispecific CODV molecules for CD123xCD3

Биспецифическая молекула Bispecific molecule KD (CD3e/d) [hM] KD (CD3e/d) [hM] KD (CD123) [HM] KD (CD123) [HM] Анализ цитотоксично сти (клетки ΤΗΡ) ЕС50 [пМ] Cytotoxicity assay (ΤΗΡ cells) EC50 [pM] Экспрессия CD69 при цитотоксичности ЕС50 Expression of CD69 with EC50 cytotoxicity % активац ии CD4+ % activation of CD4+ % активац ии CD8+ % activation of CD8+ hz20G6x7G3 CODV-Fab hz20G6x7G3 CODV-Fab 5, 0 50 0, 6 0.6 30,9+3,6 30.9+3.6 73 73 66 66 7G3 х hz4B4 CODV-Fab 7G3 x hz4B4 CODV-Fab 5, 4 5, 4 o, 1 o, 1 26, 7 + 2,9 26.7 + 2.9 65 65 55 55 hz4B4x3E3 CODV-Fab hz4B4x3E3 CODV-Fab 7,0 7.0 4,8 4.8 26, 5+5, 9 26.5+5.9 71 71 69 69 Fc-меченный вариант TL4 : hz20G6x7G3 CODV-Fab- TL4 Fc-labeled variant TL4 : hz20G6x7G3 CODV-Fab- TL4 13, 9 13, 9 1,7 1.7 16,7+10,1 16.7+10.1 73 73 74 74

Также оценивали цитотоксические эффекты CODV-Fab hz20G6xhz7G3, CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3 и одноцепочечного Dart MGD006. Аффинности каждой биспецифической конструкции к CD3ε/δ-комnлексу и CD123 измеряли с помощью Biacore. Кроме того, осуществляли анализ цитотоксичности, как описано выше, и измеряли активацию CD4+ и активацию CD8+.The cytotoxic effects of CODV-Fab hz20G6xhz7G3, CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, CODV-Fab-OL1 hz20G6xhz7G3 and single chain Dart MGD006 were also evaluated. The affinities of each bispecific construct for the CD3ε/δ complex and CD123 were measured using Biacore. In addition, a cytotoxicity assay was performed as described above, and CD4+ activation and CD8+ activation were measured.

Таблица 24. Аффинности и активности биспецифических CODV-молекул к CD123xCD3 и DART (MGD006)Table 24. Affinities and activities of bispecific CODV molecules for CD123xCD3 and DART (MGD006)

Биспецифическая молекула Bispecific molecule KD (CD3e/d) [hM] KD (CD3e/d) [hM] KD (CD123) [hM] KD (CD123) [hM] Анализ цитотоксичности (клетки ΤΗΡ) ЕС50 [пМ] η= 3 Cytotoxicity assay (ΤΗΡ cells) EC50 [pM] η= 3 hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab 9 9 0,2 0.2 2,1+/-0,2 2.1+/-0.2

- 110 041572- 110 041572

hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl 11 eleven 0,2 0.2 1,0+/-0,1 1.0+/-0.1 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OLl hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OLl 15 15 0,4 0.4 0,9+/-0,1 0.9+/-0.1 Одноцепочечное антитело в формате DART, MGD006 Single chain antibody DART format, MGD006 9 9 0,2 0.2 0,3+/-0,04 0.3+/-0.04

Для оценки потенциала молекул запускать активацию Т-клеток в присутствии (желательно) и отсутствии (нежелательно) целевых клеток применяли новый анализ. Клетки NFAT-RE-luc2 Jurkat (клетки от Promega № CS176403) инкубировали со свежевыделенными Т-клетками человека при соотношении эффектор-мишень 1:1 при 37°С и 5% CO2 в RPMI 1640 с 2 г/л (11 мМ) глюкозы, с GlutaMAX, с 25 мМ HEPES в 386-луночных планшетах. Через 5 ч инкубацию останавливали и люминесценцию измеряли с применением системы для анализа люциферазы Bio-Glo, Promega № G7 940, в микропланшетном ридере для измерения люминесценции HTS.A novel assay was used to assess the potential of molecules to trigger T cell activation in the presence (desirable) and absence (desirable) of target cells. NFAT-RE-luc2 Jurkat cells (cells from Promega no. CS176403) were incubated with freshly isolated human T cells at a 1:1 effector-target ratio at 37°C and 5% CO 2 in RPMI 1640 with 2 g/L (11 mM) glucose, with GlutaMAX, with 25 mM HEPES in 386-well plates. After 5 hours, the incubation was stopped and luminescence measured using a Bio-Glo luciferase assay system, Promega No. G7 940, in an HTS luminescence microplate reader.

Таблица 25. Активация Т-клеток, измеренная как активация, индуцированная под действием CODV-молекул к CD123xCD3 и MGD006, измеренная на линии клеток с репортерным геном Jurkat-NFAT-LucTable 25. T cell activation measured as activation induced by CODV molecules to CD123xCD3 and MGD006 measured in cell line with Jurkat-NFAT-Luc reporter gene

Биспецифическая молекула Bispecific molecule С клетками ТНР1, ЕС50 (пМ) п= 3 With THP1 cells, EC50 (pM) n= 3 Без целевых клеток Активация при Стах относительно максимальной активации в анализе с целевыми клетками (%) п= 3 Without target cells Activation at Cmax relative to maximum activation in the assay with target cells (%) n= 3 hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab 561+0,2 561+0.2 0.2+0,1 0.2+0.1 hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl hz2 0G6xhz7G3 CODV-Fab-TLl 444+0,2 444+0.2 0.4+0,3 0.4+0.3 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OLl hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OLl 320+0,2 320+0.2 0.4+0,3 0.4+0.3 Одноцепочечное антитело в формате DART, MGD006 Single chain antibody DART format, MGD006 370±0,2 370±0.2 25.1±9,9 25.1±9.9

Результаты, показанные в табл. 25, указывают на то, что все антитела индуцируют активацию клеток с репортерным геном со значениями EC50 ниже нМ в присутствии целевых клеток. Для подходов вовлечения Т-клеток активация Т-клеток должна происходить только в присутствии целевых клеток. Это наблюдается в случае молекул CODV, поскольку в отсутствие целевых клеток отсутствует значительный сигнал люминесценции. Напротив, одноцепочечная молекула DART индуцирует более высокую активацию линии клеток с репортерным геном в отсутствие целевых клеток. Эти результаты согласуются с результатами, полученными с первичными Т-клетками.The results shown in table. 25 indicate that all antibodies induce the activation of reporter gene cells with EC50 values below nM in the presence of target cells. For T cell recruitment approaches, T cell activation should only occur in the presence of target cells. This is observed in the case of CODV molecules, since there is no significant luminescence signal in the absence of target cells. In contrast, a single-stranded DART molecule induces higher activation of a cell line with a reporter gene in the absence of target cells. These results are consistent with those obtained with primary T cells.

3.8. In vivo противоопухолевая активность биспецифического CODV-Fab-TL1 к CD123xCD3 и биспецифического CODV-Fab к CD123xCD3.3.8. In vivo antitumor activity of CD123xCD3 bispecific CODV-Fab-TL1 and CD123xCD3 bispecific CODV-Fab.

Материалы и способыMaterials and methods

Выделение РВМС и Т-клеток человека из цельной крови РВМС выделяли из цельной крови здоровых доноров-людей с помощью центрифугирования в градиенте фиколла. Цельную кровь разводили 1: 1 в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Затем два объема по тридцать пять мл разведенной крови помещали в две 50-мл пробирки Falcon в присутствии 15 мл фиколл-пака. Пробирки центрифугировали при 200 g в течение 40 мин при комнатной температуре без торможения. Две лейкоцитарные пленки извлекали и помещали в шесть 50-мл пробирок Falcon с 45 мл стерильного PBS и центрифугировали трижды (в промежутках между каждым центрифугированием супернатант сливали и добавляли 45 мл PBS) при 100 g в течение десяти минут при комнатной температуре без торможения. После последнего центрифугирования два осадка объединяли в конечном объеме, составляющем 50 мл, дополненном PBS, в 50-мл пробирке Falcon. Общее количество жизнеспособных РВМС определяли путем подсчета в Vicell. Осадок затем восстанавливали в буфере для прогона Automacs от Myltenyi Biotech (130091-221) и Т-клетки отделяли от РВМС с применением набора для отрицательной селекции от Miltenyi Biotech (130-091-156) и Automacs в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные Т-клетки извлекали и помещали в культуру в среде Xvivo-15, 5% HIS+пенициллин-стрептомицин 1X при концентрации 2,5 х10Е+6 клеток/мл.Isolation of PBMCs and Human T Cells from Whole Blood PBMCs were isolated from whole blood of healthy human donors by Ficoll gradient centrifugation. Whole blood was diluted 1:1 in sterile phosphate buffered saline (PBS). Then two volumes of thirty-five ml of the diluted blood were placed in two 50-ml Falcon tubes in the presence of 15 ml of Ficoll-Pak. The tubes were centrifuged at 200 g for 40 min at room temperature without braking. Two buffy coats were removed and placed in six 50 ml Falcon tubes with 45 ml sterile PBS and centrifuged three times (between each centrifugation, the supernatant was decanted and 45 ml PBS was added) at 100 g for ten minutes at room temperature without braking. After the last centrifugation, the two pellets were pooled in a final volume of 50 ml supplemented with PBS in a 50 ml Falcon tube. The total number of viable PBMCs was determined by counting in Vicell. The pellet was then reconstituted in Automacs run buffer from Myltenyi Biotech (130091-221) and T cells were separated from PBMCs using a negative selection kit from Miltenyi Biotech (130-091-156) and Automacs according to the manufacturer's instructions. Purified T cells were recovered and placed in culture in Xvivo-15 medium, 5% HIS + penicillin-streptomycin 1X at a concentration of 2.5 x 10E + 6 cells/ml.

Размножение Т-клеток человека.Reproduction of human T-cells.

Обогащенную Т-клетками популяцию клеток человека активировали и размножали in vitro в течение 14 дней с применением набора для активации/размножения Т-клеток от Miltenyi Biotech (130-091441).The T cell-rich population of human cells was activated and expanded in vitro for 14 days using a T cell activation/expansion kit from Miltenyi Biotech (130-091441).

Получение Т-клеток человека для введения in vivo.Preparation of human T cells for in vivo administration.

Клетки и среду для культивирования клеток центрифугировали 10 мин при 400 g. Осадок восстаCells and cell culture medium were centrifuged for 10 min at 400 g. sediment uprising

- 111 041572 навливали при концентрации 2х10Е+7 клеток/мл в стерильном PBS. Удаление активирующих гранул от размноженных Т-клеток проводили с использованием сепаратора MACsiMAG от Myltenyi Biotech (130092-168) в соответствии с инструкциями производителя. Количество клеток в обогащенных Т-клетками популяциях клеток определяли путем подсчета в Vicell и восстанавливали в 25 мл стерильного PBS в 50мл пробирке Falcon. После стадии центрифугирования при 400 g в течение 10 мин при комнатной температуре клеточный осадок восстанавливали в соответствующем объеме стерильного PBS для получения конечной концентрации 5x10E+7 клеток/мл.- 111 041572 was infused at a concentration of 2x10E+7 cells/ml in sterile PBS. Removal of activating beads from expanded T cells was performed using a MACsiMAG separator from Myltenyi Biotech (130092-168) according to the manufacturer's instructions. The number of cells in the T-cell enriched cell populations was determined by Vicell counting and reconstituted in 25 ml sterile PBS in a 50 ml Falcon tube. After a centrifugation step at 400 g for 10 min at room temperature, the cell pellet was reconstituted in an appropriate volume of sterile PBS to obtain a final concentration of 5x10E+7 cells/ml.

Модель опухоли.tumor model.

Клетки острого миелоидного лейкоза человека Molm-13, экспрессирующие CD123, получали из DSMZ - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур при институте Лейбница (DSMZ, Брауншвейг, Германия). Клетки выращивали в культуре (37°С, 5% СО2, влажность 95%) в среде RPMI1640 от Glutamax (дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки). Клетки Molm-13 инфицировали вектором, содержащим ген люциферазы (SV40-PGL4-Puro - т.е. вектор, содержащий ген люциферазы, состоящий из промотора вируса обезьян 40, связанного с последовательностью люциферазы 2 и последовательностью кассеты устойчивости к пуромицину), переносимым нерепликативным лентивирусом.Molm-13 human acute myeloid leukemia cells expressing CD123 were obtained from DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures at the Leibniz Institute (DSMZ, Braunschweig, Germany). Cells were grown in culture (37° C., 5% CO 2 , 95% humidity) in RPMI1640 medium from Glutamax (supplemented with 20% fetal bovine serum). Molm-13 cells were infected with a vector containing a luciferase gene (SV40-PGL4-Puro - i.e. a vector containing a luciferase gene consisting of the simian virus 40 promoter linked to a luciferase 2 sequence and a puromycin resistance cassette sequence) carried by a non-replicative lentivirus .

Опухолевые клетки Molm13-luc+ инъецировали внутривенно (IV) мышам NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ NSG (10E+6 клеток на животное в 200 мкл суспензии в PBS). Через двадцать четыре часа тем же мышам вводили внутрибрюшинно (IP) 10E+7 Т-клеток человека в объеме, составляющем 0,2 мл стерильного PBS.Molm13-luc+ tumor cells were injected intravenously (IV) in NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ NSG mice (10E+6 cells per animal in 200 μl suspension in PBS). Twenty-four hours later, the same mice were injected intraperitoneally (IP) with 10E+7 human T cells in a volume of 0.2 ml of sterile PBS.

Начальную биолюминесцентную визуализацию на третий день после имплантации опухоли осуществляли с применением устройства для визуализации IVIS100 (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США) с программным обеспечением для сбора данных Living Image 3.2 (Perkin-Elmer, Уолтем, Массачусетс, США). За 15 мин до визуализации животным IP инъецировали 120 мг/кг раствор калиевой соли люциферина жука Beetle luciferin (партия № 316019, Promega, Лион, Франция) в PBS. Мышей подвергали анестезии с использованием Ketamine®/Xylazine® (120 мг/кг; 6 мг/кг IM, 5 мл/кг) за 5 мин до визуализации.Initial bioluminescent imaging on the third day after tumor implantation was performed using an IVIS100 imaging device (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) with Living Image 3.2 data acquisition software (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA). 15 min prior to imaging, IP animals were injected with a 120 mg/kg solution of Beetle luciferin potassium salt (batch #316019, Promega, Lyon, France) in PBS. Mice were anesthetized with Ketamine®/Xylazine® (120 mg/kg; 6 mg/kg IM, 5 ml/kg) 5 min prior to imaging.

Обработку с применением CODV-Fab-TL1 hz2 0G6xhz7G3, CODV-Fab hz2 0G6xhz7G3, биспецифического конкурирующего антитела DART к CD123xCD3 (одноцепочечное антитело в формате DART MGD006 или близкий аналог, называемый в данном документе средство DART) или PBS с помощью внутривенного введения (IV) или непрерывной внутрибрюшинной инфузии (CIP) начинали в день четыре после имплантации опухоли на развившихся опухолях, которые уже обнаруживались в костях, как указано в табл. 26 (CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3), табл. 27 (CODV-Fab hz20G6xhz7G3 IV) и табл. 28 (CODV-Fab hz20G6xhz7G3 CIP).Treatment with CODV-Fab-TL1 hz2 0G6xhz7G3, CODV-Fab hz2 0G6xhz7G3, anti-CD123xCD3 DART bispecific competitive antibody (single chain antibody in DART format MGD006 or a close analogue, referred to herein as DART agent) or PBS via intravenous (IV) or continuous intraperitoneal infusion (CIP) was started on day four after tumor implantation on established tumors that were already present in the bones, as indicated in Table 1. 26 (CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3), tab. 27 (CODV-Fab hz20G6xhz7G3 IV) and tab. 28 (CODV-Fab hz20G6xhz7G3 CIP).

Таблица 26. План исследования по оценке внутривенного (IV) введения биспецифического CODV-Fab-TL1 к CD123xCD3Table 26 Study design to evaluate intravenous (IV) administration of anti-CD123xCD3 bispecific CODV-Fab-TL1

Группа лечения Treatment group Доза (нмоль/кг) Dose (nmol/kg) Объем/способ введения Volume / route of administration Схема Scheme Количеств о животных Quantity about animals Контроль Control - - - - - - 7 7 CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 Π CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 Π 1,3 1.3 0,2ml IV 0.2ml IV Q3d (4,7,10) Q3d(4,7,10) 7 7 CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 Π CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 Π 0, 13 0.13 0,2ml IV 0.2ml IV Q3d (4,7,10) Q3d(4,7,10) 8 8 CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 Π CODV-Fab-TLl hz20G6xhz7G3 Π 0, 013 0.013 0,2ml IV 0.2ml IV Q3d (4,7,10) Q3d(4,7,10) 6 6 CODV-Fab hz20G6xhz7G3 Π CODV-Fab hz20G6xhz7G3 Π 1,3 1.3 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 8 8 Одноцепочечно e антитело в формате DART, MGD006 Single-stranded e antibody in DART format, MGD006 1,3 1.3 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 7 7

- 112 041572- 112 041572

Таблица 27. План исследования по оценке внутривенного (IV) введения биспецифического CODV-Fab к CD123xCD3Table 27. Study design to evaluate intravenous (IV) administration of anti-CD123xCD3 bispecific CODV-Fab

Группа лечения Treatment group Доза (нмоль/кг) Dose (nmol/kg) Объем/способ введения Volume / route of administration Схема Scheme Количество животных Number of animals Контроль Control - - - - - - 5 5 CODV-Fab hz20G6xhz7G3 CODV-Fab hz20G6xhz7G3 1,3 1.3 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 8 8 CODV-Fab hz20G6xhz7G3 CODV-Fab hz20G6xhz7G3 0, 13 0.13 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 5 5 Одноцепочечное антитело в формате DART, средство DART Single chain antibody DART format, DART tool 1,3 1.3 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 8 8 Одноцепочечное антитело в формате DART, средство DART Single chain antibody DART format, DART tool 0, 13 0.13 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 7 7 CODV-Fab hz20G6x7G3 CODV-Fab hz20G6x7G3 1,3 1.3 0,2ml IV 0.2ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 8 8

Таблица 28. План исследования по оценке непрерывной внутрибрюшинной инфузии (CIP) биспецифического CODV-Fab к CD123xCD3Table 28. Study design to evaluate continuous intraperitoneal infusion (CIP) of anti-CD123xCD3 bispecific CODV-Fab

Группа лечения Treatment group Доза (нмоль/кг/ день) Dose (nmol/kg/day) Объем/день/ способ введения Volume / day / route of administration Схема Scheme Количество животных Number of animals Среданоситель Media carrier - - 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 9 9 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G 3 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G 3 3, 9 3, 9 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 9 9 CODV-Fab hz20G6xhz7G 3 CODV-Fab hz20G6xhz7G 3 1,3 1.3 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 10 10 Одноцепочечн oe антитело в формате DART, MGD006 Single chain oe antibody in DART format, MGD006 3, 9 3, 9 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 9 9 Одноцепочечн oe антитело в формате DART, MGD006 Single chain oe antibody in DART format, MGD006 1,3 1.3 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 9 9 CODV-Fab hz20G6xhz7G 3 CODV-Fab hz20G6xhz7G 3 1,3 1.3 0,2 мл, IV 0.2 ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 10 10 Среданоситель Media carrier - - 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 10 10 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G 3 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G 3 0, 13 0.13 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 8 8 CODV-Fab hz20G6xhz7G 3 CODV-Fab hz20G6xhz7G 3 0, 013 0.013 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 8 8 Одноцепочечн oe антитело в формате DART, MGD006 Single chain oe antibody in DART format, MGD006 0, 13 0.13 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 8 8 Одноцепочечн oe антитело в формате DART, MGD006 Single chain oe antibody in DART format, MGD006 0, 013 0.013 6 мкл/день, ip, Alzet 1002 6 µl/day, ip, Alzet 1002 Непрерывная инфузия (414) Continuous infusion (414) 9 9 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G 3 CODV-Fab hz2 0G6xhz7G 3 1,3 1.3 0,2 мл, IV 0.2 ml IV Qd (4-13) Qd (4-13) 10 10

Сбор данных и критерии эффективности.Data collection and performance criteria.

Массу тела животных контролировали от дня 3 до конца анализа, чтобы отследить влияние терапии. Дозировка, приводящая к 20% потере веса или 15% потере веса в течение 3 последовательных дней или к 10% или более смертей, связанных с лекарственным средством, считалась чрезмерно токсичной дозировкой. Масса тела животных включала массу опухоли.The body weight of the animals was monitored from day 3 until the end of the analysis to track the effect of therapy. A dosage resulting in 20% weight loss or 15% weight loss for 3 consecutive days or 10% or more drug-related deaths was considered an overly toxic dosage. The body weight of the animals included the mass of the tumor.

Опухолевую нагрузку отслеживали с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации (BLI). Начальную BLI осуществляли на третий день после имплантация опухоли, за 24 ч до начала обработки. Животных распределяли в различные группы на основании сигнала биолюминесценции всего те- 113 041572 ла. Рост опухоли отслеживали во всем теле и длинных костях задних ног путем измерения сигналов BLI в дни 7, 10 и 14 после имплантации опухоли. Сигнал в длинных костях измеряли путем сегментации, и на него мог влиять близкорасположенный локорегионарный сигнал (например, остаточный сигнал в мягких тканях в поздние моменты времени). Группы обработки сравнивали с контрольными животными, несущими дессиминированную опухоль Molm13-luc+ и Т-клетки человека.Tumor burden was monitored using non-invasive bioluminescent imaging (BLI). The initial BLI was performed on the third day after tumor implantation, 24 hours before the start of treatment. Animals were divided into different groups based on the whole body bioluminescence signal. Tumor growth was monitored throughout the body and long bones of the hind legs by measuring BLI signals on days 7, 10 and 14 post tumor implantation. Long bone signal was measured by segmentation and could be influenced by nearby locoregional signal (eg residual soft tissue signal at late time points). The treatment groups were compared with control animals carrying disseminated Molm13-luc+ tumor and human T cells.

Первичными конечными точками эффективности были соотношение изменения сигнала опухоли от начального между группами лечения и контрольными группами (dT/dC), число частичных регрессий опухоли (PR) и число полных регрессий опухоли (CR).The primary efficacy end points were the ratio of tumor signal change from baseline between treatment and control groups (dT/dC), number of partial tumor regressions (PR), and number of complete tumor regressions (CR).

Рост опухоли на основании кривых сигнала биолюминесценции (выраженного в фотон/с) в зависимости от времени отслеживали для каждого животного в каждой группе обработки и представляли как медианная кривая ± MAD для сигналов как всего тела, так и сегментированных сигналов кости. Изменения в сигнале биолюминесценции опухоли рассчитывали для каждого контрольного (С) или подвергаемого обработке (Т) животного и для каждого дня путем вычитания сигнала опухоли в первый день обработки (день определения стадии) из сигнала опухоли в обозначенный день наблюдения. Медиану Т рассчитывали для группы обработки, а медиану С рассчитывали для контрольной группы.Tumor growth based on bioluminescence signal (expressed in photon/s) versus time curves was monitored for each animal in each treatment group and presented as a median ± MAD curve for both whole body and segmented bone signals. Changes in tumor bioluminescence signal were calculated for each control (C) or treated (T) animal and for each day by subtracting the tumor signal on the first day of treatment (staging day) from the tumor signal on the designated observation day. Median T was calculated for the treatment group and median C was calculated for the control group.

Затем рассчитывали соотношение Т/С и выражали как процентную долю:The T/C ratio was then calculated and expressed as a percentage:

dT/dC =[(медиана Т, день наблюдения - медиана Т, день 3)/(медиана С, день наблюдения - медиана С, день 3)]х 100.dT / dC \u003d [(median T, day of observation - median T, day 3) / (median C, day of observation - median C, day 3)] x 100.

Дозу считали терапевтически активной, когда dT/dC в конце эксперимента (день 14) составляло менее 42%, и очень активной, когда dT/dC составляло менее 10%.A dose was considered therapeutically active when dT/dC at the end of the experiment (day 14) was less than 42% and very active when dT/dC was less than 10%.

Процент регрессии опухоли определяли как % снижения сигнала опухоли в группе обработки в обозначенный день наблюдения по сравнению с ее сигналом в первый день обработки. В конкретный момент времени и для каждого животного % регрессии рассчитывали как % Сигнал t0 - Сигнал t регрессии (в момент времени t)=----Сигнал------х 100Percent tumor regression was defined as the % reduction in tumor signal in the treatment group on the designated day of observation compared to its signal on the first day of treatment. At a specific time point and for each animal, % regression was calculated as % Signal t0 - Signal t regression (at time t)=----Signal------x 100

Учитывая риск колебаний сигнала, связанный с кинетикой реакции превращения люциферина и возможным пропуском IP инъекции, регрессия сигнала для животного считалась истинной регрессией опухоли только в том случае, когда наблюдалась по меньшей мере в два последовательных момента времени.Considering the risk of signal fluctuations associated with the kinetics of the luciferin conversion reaction and the possible omission of an IP injection, signal regression in an animal was considered true tumor regression only if it occurred at least two consecutive time points.

Частичная регрессия (PR). Регрессии определяли как частичные, если сигнал опухоли снижался по сравнению с сигналом в начале обработки для двух последовательных моментов времени, при этом сигнал все еще превышал 50% от начального сигнала.Partial regression (PR). Regressions were defined as partial if the tumor signal decreased compared to the signal at the start of treatment for two consecutive time points, while the signal was still greater than 50% of the initial signal.

Полная регрессия (CR). Регрессии определяли как полные, если сигнал опухоли снижался более чем на 50% по сравнению с сигналом в начале обработки для двух последовательных моментов времени.Complete regression (CR). Regressions were defined as complete if the tumor signal was reduced by more than 50% compared to the signal at the start of treatment for two consecutive time points.

Статистический анализ.Statistical analysis.

Оценка соединений, вводимых IV путем.Evaluation of compounds administered by the IV route.

Отдельный сигнал биолюминесценции каждой группы обработки сравнивали с другими с применением поправки по методу Холма-Бонферрони для множественных парных сравнений с последующим двухфакторным ANOVA с повторными измерениями по дню: р>0,05: NS, 0,05 > р > 0,01: *, р<0,01: **. Статистический анализ выполняли как для сигналов биолюминесценции всего тела, так и сигналов биолюминесценции в длинных костях.The individual bioluminescence signal of each treatment group was compared to the others using a Holm-Bonferroni adjustment for multiple pairwise comparisons followed by two-way repeated measures daily ANOVA: p > 0.05: NS, 0.05 > p > 0.01: * , p<0.01: **. Statistical analysis was performed for both whole body bioluminescence signals and long bone bioluminescence signals.

Оценка соединений, вводимых с помощью CIPEvaluation of Compounds Injected with CIP

Оценка CODV-Fab hz20G6xhz7G3, вводимых с помощью CIP, привела к объединению данных двух независимых исследований (1-е исследование относится к высоким дозировкам соединений, во 2-м исследовании рассматривают низкие дозировки, при этом оба исследования включают контрольную группу, получавшую среду-носитель, и группу положительного контроля, получавшую CODV-Fab hz20G6xhz7G3, 1,3 нмоль/кг, IV, Qd). Статистический анализ сигнала биолюминесценции у каждой мыши каждый день осуществляли после нормализации данных по среднему значению сигнала биолюминесценции в группе среды-носителя в тот же день того же эксперимента (объединенные контроли средыносителя, n=19; объединенные положительные контроли, n=20). Отдельный нормализованный сигнал биолюминесценции каждой группы обработки сравнивали с сигналом других групп с применением поправки по методу Холма-Бонферрони для множественных парных сравнений с последующим двухфакторным ANOVA с повторными измерениями по дню: р>0,05: NS, 0,05 > р > 0,01: *, р<0,01: **. Статистический анализ выполняли как для сигналов биолюминесценции всего тела, так и сигналов биолюминесценции в длинных костях.Evaluation of CODV-Fab hz20G6xhz7G3 administered by CIP resulted in a pooling of data from two independent studies (1st study for high compound dosages, 2nd study for low dosages, both studies including a vehicle control group , and a positive control group treated with CODV-Fab hz20G6xhz7G3, 1.3 nmol/kg, IV, Qd). Statistical analysis of the bioluminescence signal in each mouse each day was performed after normalizing the data to the mean value of the bioluminescence signal in the vehicle medium group on the same day of the same experiment (pooled vehicle controls, n=19; pooled positive controls, n=20). The individual normalized bioluminescence signal of each treatment group was compared to that of the other treatment groups using a Holm-Bonferroni adjustment for multiple pairwise comparisons followed by two-way repeated measures daily ANOVA: p > 0.05: NS, 0.05 > p > 0, 01: *, p<0.01: **. Statistical analysis was performed for both whole body bioluminescence signals and long bone bioluminescence signals.

Результатыresults

IV введение биспецифического CODV-Fab-TL1 к CD123xCD3 hz20G6xhz7G3.IV introduction of bispecific CODV-Fab-TL1 to CD123xCD3 hz20G6xhz7G3.

Полностью человеческий CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3, вводимый IV, Q3d, в присутствии Тклеток человека подавлял рост опухоли Molm13 при всех тестируемых дозах (1,3, 0,13 и 0,013 нмоль/кг Q3d), причем dT/dC составляло 20, 14 и 38% соответственно для всего тела (фиг. 5 и 7), и был ассоциирован с регрессией опухоли в длинных костях при всех тестируемых дозах с 4/7 CR, 6/8 CR и 2/6 CR со- 114 -Fully human CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3 administered IV, Q3d in the presence of human T cells inhibited Molm13 tumor growth at all doses tested (1.3, 0.13 and 0.013 nmol/kg Q3d) with dT/dC of 20.14 and 38%, respectively, for the whole body (Fig. 5 and 7), and was associated with tumor regression in long bones at all tested doses with 4/7 CR, 6/8 CR and 2/6 CR co- 114 -

Claims (15)

ответственно (фиг. 6 и 8).responsibly (FIGS. 6 and 8). Максимальный ответ для полностью человеческого CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3 получали во всем теле и в костях при дозе 0,13 нмоль/кг, Q3d. При такой дозе активность статистически не отличалась от активности DART, вводимого при дозе 1,3 нмоль/кг, IV, Qd (dT/dC во всем теле 29% с 1/7CR и 1/7PR в длинных костях), и была эквивалентна активности CODV-Fab hz20G6xhz7G3, вводимому при дозе 1,3 нмоль/кг, IV, Qd (dT/dC во всем теле 23% с регрессией опухоли в длинных костях 1/8CR и 1/8PR). Данные подтверждали с помощью конечного гистопатологического анализа (не показано).The maximum response for fully human CODV-Fab-TL1 hz20G6xhz7G3 was obtained in the whole body and bones at a dose of 0.13 nmol/kg, Q3d. At this dose, activity was not statistically different from DART administered at 1.3 nmol/kg, IV, Qd (whole body dT/dC 29% with 1/7CR and 1/7PR in long bones) and was equivalent to activity CODV-Fab hz20G6xhz7G3 administered at 1.3 nmol/kg, IV, Qd (whole body dT/dC 23% with tumor regression in long bones 1/8CR and 1/8PR). Data were confirmed by final histopathological analysis (not shown). Отличия, наблюдаемые между данными для всего тела и длинных костей, связаны с остаточным ростом опухоли в яичниках и абдоминальном жире вследствие диссеминации экстрамедулярной опухоли после IV инъекции.The differences observed between whole body and long bone data are due to residual tumor growth in the ovaries and abdominal fat due to extramedullary tumor dissemination after IV injection. IV введение биспецифического CODV-Fab к CD123xCD3 hz20G6xhz7G3.IV introduction of a bispecific CODV-Fab to CD123xCD3 hz20G6xhz7G3. Полностью человеческий CODV-Fab hz20G6xhz7G3, вводимый IV, в присутствии Т-клеток человека подавлял рост опухоли при всех тестируемых дозах (1,3 и 0,13 нмоль/кг в Qd4-13), причем dT/dC составляло 14 и 39% соответственно (фиг. 9 и 11), был ассоциирован с регрессией опухоли при дозе 1,3 нмоль/кг в длинных костях с 5/8 CR (фиг. 10 и 12).Fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 administered IV in the presence of human T cells inhibited tumor growth at all doses tested (1.3 and 0.13 nmol/kg in Qd4-13), with dT/dC being 14 and 39%, respectively (FIGS. 9 and 11) was associated with tumor regression at 1.3 nmol/kg in long bones with 5/8 CR (FIGS. 10 and 12). DART, вводимый при дозе 1,3 нмоль/кг, IV, Qd4-13, подавляли рост опухоли при dT/dC во всем теле 29% и регрессией опухоли 3/8 CR в длинных костях, что незначительно отличалось от значений для CODV-Fab hz20G6xhz7G3, вводимого при дозе 1,3 нмоль/кг, IV. DART был неактивен в подавлении сигнала опухоли во всем теле при введении в дозе 0,13 нмоль/кг, IV, Qd4-13 (dT/dC 62%), несмотря на регрессию опухоли 1/7PR в длинных костях. Значимого отличия не наблюдалось при такой же дозировке полностью человеческого CODV-Fab hz20G6xhz7G3 в конце исследования. Статистически значимых отличий не отмечено между полностью человеческим CODV-Fab hz20G6xhz7G3 и частично гуманизированным соединением CODV-Fab hz20G6x7G3, когда их вводили при одинаковой дозировке, составляющей 1,3 нмоль/кг, IV, QD4-13: при этой дозе CODV-Fab hz20G6x7G3 подавлял рост опухоли во всем теле с dT/dC, составляющим 34%, было ассоциировано с регрессией опухолей в длинных костях (1/8CR и 1/8PR).DART given at 1.3 nmol/kg, IV, Qd4-13, suppressed tumor growth at 29% whole body dT/dC and 3/8 CR tumor regression in long bones, not significantly different from CODV-Fab values hz20G6xhz7G3 administered at a dose of 1.3 nmol/kg, IV. DART was inactive in suppressing whole body tumor signal when administered at 0.13 nmol/kg, IV, Qd4-13 (dT/dC 62%) despite regression of 1/7PR tumor in long bones. No significant difference was observed at the same dosage of fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 at the end of the study. No statistically significant difference was noted between the fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 and the partially humanized CODV-Fab hz20G6x7G3 compound when administered at the same dose of 1.3 nmol/kg, IV, QD4-13: at this dose, CODV-Fab hz20G6x7G3 inhibited whole body tumor growth with a dT/dC of 34% was associated with regression of tumors in long bones (1/8CR and 1/8PR). Отличия, наблюдаемые между данными для всего тела и длинных костей, связаны с остаточным ростом опухоли в яичниках и абдоминальном жире вследствие диссеминации экстрамедулярной опухоли после IV инъекции.The differences observed between whole body and long bone data are due to residual tumor growth in the ovaries and abdominal fat due to extramedullary tumor dissemination after IV injection. CIP введение биспецифического CODV-Fab к CD123xCD3.CIP introduction of a bispecific CODV-Fab to CD123xCD3. Полностью человеческое CODV-Fab hz20G6xhz7G3, вводимое CIP, в присутствии Т-клеток человека подавляло рост опухоли во всем теле при дозе 3,9, 1,3 и 0,13 нмоль/кг/день, CIP4-14, и было неактивным при 0,013 нмоль/кг/день с соответствующими dT/dC, составляющими 2, 3, 21 и 57% во всем теле (фиг. 13 и 15). Оно было ассоциировано с регрессией опухоли при дозе 3,9, 1,3, и 0,13 нмоль/кг в длинных костях с 5/9CR 3/9PR, 6/10CR 1/10PR и 7/8CR соответственно (фиг. 14 и 16).Fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3 administered by CIP, in the presence of human T cells, inhibited whole body tumor growth at 3.9, 1.3, and 0.13 nmol/kg/day, CIP4-14, and was inactive at 0.013 nmol/kg/day with corresponding dT/dC of 2, 3, 21 and 57% www (FIGS. 13 and 15). It was associated with tumor regression at 3.9, 1.3, and 0.13 nmol/kg in long bones with 5/9CR 3/9PR, 6/10CR 1/10PR, and 7/8CR, respectively (Fig. 14 and 16). DART, вводимое при дозе 3,9, 1,3 и 0,13 нмоль/кг/день, CIP4-14, но не при дозе 0,013 нмоль/кг/день, подавляло рост опухоли во всем теле с dT/dC, составляющим 21, 5, 21 и 46% соответственно (фиг. 13), индуцируя регрессию опухоли в длинных костях при 3,9, 1,3 и 0,13 нмоль/кг с 3/9 CR 3/9PR; 8/9CR и 4/8CR 2/8PR соответственно (фиг. 14).DART given at 3.9, 1.3 and 0.13 nmol/kg/day, CIP4-14, but not at 0.013 nmol/kg/day, inhibited whole body tumor growth with a dT/dC of 21 , 5, 21, and 46%, respectively (FIG. 13), inducing tumor regression in long bones at 3.9, 1.3, and 0.13 nmol/kg with 3/9 CR 3/9PR; 8/9CR and 4/8CR 2/8PR, respectively (Fig. 14). Полностью человеческое CODV-Fab hz20G6xhz7G3, вводимый при дозе 1,3 нмоль/кг, IV, Qd4-13, подавляло рост опухоли во всем теле с dT/dC, составляющим 4 и 5% (1- и 2-е исследования соответственно), было ассоциировано с регрессией опухоли в длинных костях (8/10CR 1/10PR по сравнению с 8/10 CR в 1- и 2-м исследованиях соответственно).Fully human CODV-Fab hz20G6xhz7G3, administered at 1.3 nmol/kg, IV, Qd4-13, inhibited whole body tumor growth with dT/dC of 4% and 5% (studies 1 and 2, respectively) was associated with tumor regression in long bones (8/10CR 1/10PR versus 8/10 CR in the 1st and 2nd studies, respectively). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Антитело-подобный связывающий белок, который специфически связывается с CD3ε человека и по меньшей мере с одним дополнительным мишеневым антигеном, которым является CD123, содержащий две полипептидные цепи, которые образуют два антиген-связывающих участка, где первый полипептид имеет структуру, представленную формулой [I]1. An antibody-like binding protein that specifically binds to human CD3ε and at least one additional target antigen, which is CD123, containing two polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where the first polypeptide has the structure represented by the formula [ I] VD1-L1-VD2-L2-CL [I];VD1-L1-VD2-L2-CL[I]; и второй полипептид имеет структуру, представленную формулой [II] Vd3-L3-VD4-L4-CH1 [И], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;and the second polypeptide has the structure represented by the formula [II] V d3 -L 3 -V D4 -L 4 -C H1 [And], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin; V D2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin; V D3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin; V D4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin; C L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C L is an immunoglobulin light chain constant domain; - 115 041572- 115 041572 Chi представляет собой константный домен Ch1 тяжелой цепи иммуноглобулина;Chi is the C h1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain; L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L1, L 2 , L 3 and L 4 are amino acid linkers; и где первый и второй полипептиды образуют перекрестную пару легкая цепь-тяжелая цепь, и где оба VD1 и VD2 представляют собой либо вариабельные домены легкой цепи, либо вариабельные домены тяжелой цепи, и оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи, если VD1 и VD2 являются вариабельными доменами легкой цепи, или оба VD3 и VD4 представляют собой вариабельные домены легкой цепи, если VD1 и VD2 являются вариабельными доменами тяжелой цепи;and where the first and second polypeptides form a light chain-heavy chain crossover pair, and where both V D1 and V D2 are either light chain variable domains or heavy chain variable domains, and both V D3 and V D4 are heavy chain variable domains if V D1 and V D2 are light chain variable domains, or both V D3 and V D4 are light chain variable domains if V D1 and V D2 are heavy chain variable domains; где первый или второй иммуноглобулин представляет собой антитело, которое связывается с внеклеточным доменом белка CD3ε человека и которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, CDR2-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, CDR3-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 142, CDR2-L с аминокислотной последовательностью KVS и CDR3-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и где другой из первого или второго иммуноглобулинов представляет собой антитело против CD123, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 381, CDR2-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 384, CDR3-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 382 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 378, CDR2-L с аминокислотной последовательностью WAS и CDR3-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 379.where the first or second immunoglobulin is an antibody that binds to the extracellular domain of the human CD3ε protein and which contains a heavy chain variable domain containing CDR1-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, CDR3-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a light chain variable domain comprising CDR1-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, CDR2-L with the amino acid sequence of KVS and CDR3-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; and wherein the other of the first or second immunoglobulins is an anti-CD123 antibody that contains a heavy chain variable domain comprising CDR1-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 381, CDR2-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 384, CDR3-H with amino acid sequence of SEQ ID NO: 382 and a light chain variable domain containing CDR1-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, CDR2-L with the amino acid sequence of WAS and CDR3-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 379. 2. Антитело-подобный связывающий белок по п.1, где полипептид формулы [II] дополнительно содержит Fc-домен.2. The antibody-like binding protein of claim 1, wherein the polypeptide of formula [II] further comprises an Fc domain. 3. Антитело-подобный связывающий белок по п.1 или 2, содержащий две полипептидные цепи, которые образуют два антиген-связывающих участка, где одна полипептидная цепь имеет структуру, представленную формулой [I] VD1-L1-VD2-L2-CL Hi и второй полипептид имеет структуру, представленную формулой [III] Vd3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [Ш], где VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;3. Antibody-like binding protein according to claim 1 or 2, containing two polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where one polypeptide chain has the structure represented by the formula [I] V D1 -L 1 -V D2 -L 2 -C L Hi and the second polypeptide has the structure represented by the formula [III] V d3 -L 3 -V D4 -L 4 -CH1 -F c [ W], where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin; V D2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin; V D3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin; V D4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V D4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin; Cl представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C l is an immunoglobulin light chain constant domain; Ch1 представляет собой константный домен Ch1 тяжелой цепи иммуноглобулина;C h1 is the C h1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain; Fc представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина;F c is the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain; L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры;L1, L 2 , L 3 and L4 are amino acid linkers; и где полипептид формулы [I] и полипептид формулы [III] образуют перекрестную пару легкая цепь-тяжелая цепь.and wherein the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair. 4. Антитело-подобный связывающий белок по п.2 или 3, где полипептид формулы [I] дополнительно содержит Fc-домен (Fc2).4. The antibody-like binding protein according to claim 2 or 3, wherein the polypeptide of formula [I] further comprises an Fc domain (F c2 ). 5. Антитело-подобный связывающий белок по п.2 или 4, содержащий две полипептидные цепи, которые образуют два антиген-связывающих участка, где одна полипептидная цепь имеет структуру, представленную формулой [IV] Vdi-Li-Vd2-L2-Cl-L5-Fc2 [IV];5. Antibody-like binding protein according to claim 2 or 4, containing two polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where one polypeptide chain has the structure represented by the formula [IV] Vdi-Li-Vd2-L 2 -Cl- L5-Fc2 [IV]; и первая полинуклеотидная цепь имеет структуру, представленную формулой [III] VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [Ш], гд е VD1 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;and the first polynucleotide chain has the structure represented by the formula [III] V D3- L 3 -V D4 -L 4 -C H1 -F c [ W ] , where V D1 represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin; Vd 2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V d 2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin; VD 3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;VD 3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin; VD 4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;VD 4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin; Cl представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;C l is an immunoglobulin light chain constant domain; Ch1 представляет собой константный домен Ch1 тяжелой цепи иммуноглобулина;C h1 is the C h1 constant domain of an immunoglobulin heavy chain; Fc представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тя- 116 041572 желой цепи иммуноглобулина; Fc is the immunoglobulin hinge region and CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain; Fc2 представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина;F c2 represents the immunoglobulin hinge region and the CH2, CH3 constant domains of the immunoglobulin heavy chain; L1, L2, L3, L4 и L5 представляют собой аминокислотные линкеры; и где полипептид формулы [IV] и полипептид формулы [III] образуют перекрестную пару легкая цепь-тяжелая цепь.L 1 , L 2 , L 3 , L4 and L 5 are amino acid linkers; and wherein the polypeptide of formula [IV] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair. 6. Антитело-подобный связывающий белок по п.2 или 3, который содержит третью полипептидную цепь, содержащую Fc-домен (Fc3).6. An antibody-like binding protein according to claim 2 or 3, which contains a third polypeptide chain containing an Fc domain (F c3 ). 7. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп.2, 3 или 6, содержащий три полипептидных цепи, которые образуют два антиген-связывающих участка, где первый полипептид имеет структуру формулы [I]7. Antibody-like binding protein according to any one of claims 2, 3 or 6, containing three polypeptide chains that form two antigen-binding sites, where the first polypeptide has the structure of formula [I] Vdi-Li-Vd2-L2-Cl [I];Vdi-Li-Vd2-L2-Cl [I]; второй полипептид имеет структуру, представленную формулой [III]the second polypeptide has the structure represented by the formula [III] Vd3-L3-Vd4-L4-Chi-Fc [III];Vd3-L3-Vd4-L4-Chi-Fc [III]; третий полипептид Fc3 представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, и СН2, СН3 представляют собой константные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, где VDi представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи первого иммуноглобулина;the third polypeptide F c3 represents the hinge region of the immunoglobulin, and CH 2 , CH 3 represent the constant domains of the heavy chain of the immunoglobulin, where V Di represents the variable domain of the heavy or light chain of the first immunoglobulin; VD2 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи второго иммуноглобулина;V D2 is the heavy or light chain variable domain of the second immunoglobulin; VD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного второго иммуноглобулина;V D3 is the heavy or light chain variable domain of said second immunoglobulin; Vd4 представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи указанного первого иммуноглобулина;V d4 is the heavy or light chain variable domain of said first immunoglobulin; CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;CL is an immunoglobulin light chain constant domain; CHi представляет собой константный домен CHi тяжелой цепи иммуноглобулина;CHi is the CHi constant domain of an immunoglobulin heavy chain; Fc представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, и константные домены СН2, СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина;F c represents the hinge region of the immunoglobulin, and constant domains CH 2 , CH 3 of the immunoglobulin heavy chain; L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры, где полипептид формулы [I] и полипептид формулы [III] образуют перекрестную пару легкая цепьтяжелая цепь; и где полипептид формулы [III] гетеродимеризуется с третьим полипептидом через его Fc-домен.L 1 , L 2 , L 3 and L4 are amino acid linkers, where the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [III] form a light chain-heavy chain crossover pair; and where the polypeptide of formula [III] heterodimerizes with the third polypeptide through its Fc domain. 8. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп.1-7, где VD1 и VD2 представляют собой вариабельные домены легкой цепи и VD3 и Vd4 представляют собой вариабельный домены тяжелой цепи.8. An antibody-like binding protein according to any one of claims 1 to 7, wherein V D1 and V D2 are light chain variable domains and V D3 and V d4 are heavy chain variable domains. 9. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп.1-8, где9. Antibody-like binding protein according to any one of claims 1-8, where V D1 содержитV D1 contains CDR1-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 378,CDR1-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, CDR2-L с аминокислотной последовательностью WAS, иCDR2-L with the amino acid sequence WAS, and CDR3-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 379;CDR3-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 379; V D2 содержитV D2 contains CDR4-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 142,CDR4-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, CDR5-L с аминокислотной последовательностью KVS, иCDR5-L with the amino acid sequence KVS, and CDR6-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11;CDR6-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; V D3 содержитV D3 contains CDR1-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6,CDR1-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, иCDR2-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and CDR3-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8; иCDR3-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; And V d4 содержитV d4 contains CDR4-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 381,CDR4-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 381, CDR5-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 384, иCDR5-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 384, and CDR6-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 382.CDR6-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 382. 10. Антитело-подобный связывающий белок по п.9, где антитело-подобный связывающий белок содержит10. The antibody-like binding protein of claim 9, wherein the antibody-like binding protein comprises VD1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 385 или аминокислотной последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична ей,V D1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 385 or an amino acid sequence that is at least 85% identical to it, VD2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 141 или аминокислотной последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична ей,VD2, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141 or an amino acid sequence that is at least 85% identical to it, VD3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 138 или аминокислотной последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична ей, иV D3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 138 or an amino acid sequence that is at least 85% identical to it, and Vd4, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 383 или аминокислотной последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична ей.V d4 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 383 or an amino acid sequence that is at least 85% identical to it. 11. Антитело-подобный связывающий белок по п.10, который содержит линкер L1 с последовательностью SEQ ID NO: 389, L2 с последовательностью SEQ ID NO: 389, L3 и L4, состоящие из 0 аминокис-11. An antibody-like binding protein according to claim 10, which contains a linker L 1 with the sequence of SEQ ID NO: 389, L2 with the sequence of SEQ ID NO: 389, L 3 and L 4 , consisting of 0 amino acids - - 117 041572 лот, и CH1 с последовательностью SEQ ID NO: 313.- 117 041572 lot, and C H1 with the sequence of SEQ ID NO: 313. 12. Антитело-подобный связывающий белок по п.11, который дополнительно содержит линкер L5, состоящий из 0 аминокислот, Fc с последовательностью SEQ ID NO:394, Fc2 с последовательностью SEQ12. An antibody-like binding protein according to claim 11, which further comprises an L 5 linker consisting of 0 amino acids, an Fc with the sequence of SEQ ID NO:394, an Fc 2 with the sequence of SEQ ID NO: 392.ID NO: 392. 13. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп.1, 2, 4 или 6-12, который содержит:13. An antibody-like binding protein according to any one of claims 1, 2, 4 or 6-12, which contains: a) один полипептид с формулой [I], состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 388, которая содержитa) one polypeptide of formula [I], consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 388, which contains VD1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 385,V D1 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 385, L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 389,L 1 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 389, VD2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 141,V D2 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 389, иL2 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 389, and CL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 310, или из последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 388, которая содержитC L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 310, or from a sequence that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 388, which contains CDR1-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 378,CDR1-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, CDR2-L с аминокислотной последовательностью WAS, иCDR2-L with the amino acid sequence WAS, and CDR3-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 379,CDR3-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 379, CDR4-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 142,CDR4-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, CDR5-L с аминокислотной последовательностью KVS, иCDR5-L with the amino acid sequence KVS, and CDR6-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; иCDR6-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; And b) один полипептид с формулой [II], состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 390, которая содержитb) one polypeptide of formula [II], consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 390, which contains VD3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 138, L3, который имеет 0 аминокислот, VD4 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 383,V D3 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 138, L 3 which has 0 amino acids, VD4 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 383, L4, который имеет 0 аминокислот, иL4, which has 0 amino acids, and CH1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 313, или из последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 390, которая содержитC H1 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 313, or from a sequence that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 390, which contains CDR1-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 381, CDR2-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 384, CDR3-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 382, и CDR4-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, CDR5-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, и CDR6-H с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8; и где полипептид с формулой [I] и полипептид с формулой [II] образуют перекрестную пару легкая цепьтяжелая цепь.CDR1-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 381, CDR2-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 384, CDR3-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 382, and CDR4-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR5 -H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and CDR6-H with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and wherein the polypeptide of formula [I] and the polypeptide of formula [II] form a light chain-heavy chain crossover pair. 14. Антитело-подобный связывающий белок по п.13, который содержит один полипептид с формулой [I], состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 388, и один полипептид с формулой [II], состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 390.14. An antibody-like binding protein according to claim 13, which contains one polypeptide of formula [I], consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 388, and one polypeptide of formula [II], consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 390 . 15. Антитело-подобный связывающий белок по п.5, который содержит:15. An antibody-like binding protein according to claim 5, which contains: а) один полипептид с формулой [IV], состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 391, которая содержитa) one polypeptide with the formula [IV], consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 391, which contains VD1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 385,V D1 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 385, L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 389,L1 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 389, VD2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 141,VD2 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 141, L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 389,L2 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 389, CL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 310,CL with the amino acid sequence SEQ ID NO: 310, L5, который имеет 0 аминокислот, иL5, which has 0 amino acids, and Fc2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 392, или из последовательности, которая по крайней мере на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 391, который содержитF c2 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 392, or from a sequence that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 391, which contains CDR1-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 378, CDR2-L с аминокислотной последовательностью WAS, CDR3-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 379, CDR4-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 142,CDR1-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, CDR2-L with the amino acid sequence of WAS, CDR3-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 379, CDR4-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, CDR5-L с аминокислотной последовательностью KVS, иCDR5-L with the amino acid sequence KVS, and CDR6-L с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; иCDR6-L with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; And b) один полипептид формулы [III], состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 393, гдеb) one polypeptide of formula [III], consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 393, where Vd3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 138,Vd 3 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 138, L3, который имеет 0 аминокислот,L3, which has 0 amino acids, VD4 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 383,VD4 with the amino acid sequence SEQ ID NO: 383, L4, который имеет 0 аминокислот,L4, which has 0 amino acids, CH1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 313, иC H1 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 313, and Fc с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 394,F c with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 394, - 118 -- 118 -
EA201791666 2015-01-23 2016-01-22 ANTIBODIES TO CD3, ANTIBODIES TO CD123 AND BI-SPECIFIC ANTIBODIES THAT BIND SPECIFICALLY TO CD3 AND/OR CD123 EA041572B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15305077.8 2015-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA041572B1 true EA041572B1 (en) 2022-11-09

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210292423A1 (en) Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
TWI790206B (en) Bispecific antibody-like binding proteins specifically binding to cd3 and cd123
TW201809005A (en) Anti- GPRC5D antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind GPRC5D and CD3, and uses thereof
KR20180033501A (en) The bispecific antibody constructs that bind to DLL3 and CD3
CN110914296A (en) Engineered Fc fragments, antibodies comprising same and uses thereof
CA2982682A1 (en) Bispecific antibody constructs for cdh3 and cd3
US20240150464A1 (en) Materials and methods for modulating t cell mediated immunity
US20220089736A1 (en) Immune targeting molecules and uses thereof
JP2024520666A (en) T cell engager molecules and uses thereof
EA041572B1 (en) ANTIBODIES TO CD3, ANTIBODIES TO CD123 AND BI-SPECIFIC ANTIBODIES THAT BIND SPECIFICALLY TO CD3 AND/OR CD123
US20240209113A1 (en) Anti-gpc3 and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use