EA040775B1

EA040775B1 - NON-THERAPEUTIC USE OF COLLAGEN HYDROLYZATE TO IMPROVE ENDURANCE CAPACITY

Info

Publication number: EA040775B1
Application number: EA201990579
Authority: EA
Inventors: Штеффен ЭССЕР; Штефан Хаусманнс; Ханс-Ульрих ФРЕХ
Original assignee: Гелита Аг
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2022-07-27

Description

Настоящее изобретение относится к нетерапевтическому применению гидролизата коллагена для улучшения способности к выносливости.The present invention relates to the non-therapeutic use of collagen hydrolyzate to improve endurance performance.

Гидролизат коллагена, который в особенности получают путем ферментативного гидролиза исходных материалов животного происхождения, содержащих коллаген, состоит из смеси пептидов, молекулярная масса которых распределена в определенном диапазоне размеров в зависимости от исходного материала и условий получения. Применение гидролизата коллагена в качестве биологически активной пищевой добавки известно достаточно давно, в частности для профилактики и/или лечения нарушений, связанных с костями, суставами или соединительной тканью, тем более, что удалось доказать стимулирующее действие пептидов коллагена на синтез эндогенной внеклеточной матрицы в этих типах тканей (см., например, Bello et al., Curr. Med. Res. Opin. 2006 (22) 2221-2232).Collagen hydrolyzate, which is especially obtained by enzymatic hydrolysis of animal starting materials containing collagen, consists of a mixture of peptides, the molecular weight of which is distributed in a certain size range depending on the starting material and production conditions. The use of collagen hydrolyzate as a dietary supplement has been known for a long time, in particular for the prevention and / or treatment of disorders associated with bones, joints or connective tissue, especially since it was possible to prove the stimulating effect of collagen peptides on the synthesis of the endogenous extracellular matrix in these types. tissues (see, for example, Bello et al., Curr. Med. Res. Opin. 2006 (22) 2221-2232).

В настоящее время неожиданным образом было обнаружено, что гидролизат коллагена также приводит к повышению митохондриальной активности в клетках человека и животных, т.е. к увеличению количества митохондрий на клетку и/или увеличению отдельных митохондрий.It has now been surprisingly found that collagen hydrolyzate also leads to an increase in mitochondrial activity in human and animal cells, i. to an increase in the number of mitochondria per cell and/or an increase in individual mitochondria.

Из этого открытия следует, что гидролизат коллагена в соответствии с настоящим изобретением может быть целенаправленно использован для улучшения способности к выносливости у людей и животных путем повышения митохондриальной активности в мышечных клетках.From this discovery, it follows that the collagen hydrolyzate according to the present invention can be purposefully used to improve endurance capacity in humans and animals by increasing mitochondrial activity in muscle cells.

Способность к выносливости организма человека или животного коррелирует со способностью аэробного метаболизма обеспечивать мускулатуру необходимой энергией в форме АТФ (аденозинтрифосфата) в течение более длительного периода времени. Для аэробной способности решающим является поглощение кислорода, которое, в свою очередь, определяется тремя факторами: поступлением кислорода через легкие, переносом кислорода через сердечно-сосудистую систему и использованием кислорода в мышечных клетках. Тогда как максимальное поступление кислорода в значительной степени предопределено индивидуальными анатомическими данными (общая площадь поверхности альвеол), то перенос и использование кислорода могут быть улучшены с помощью тренировок и других мер, причем последний этап, как правило, является решающим ограничивающим фактором. Поэтому способность к выносливости зависит в основном от количества митохондрий (на мышечную клетку или общую мускулатуру), в которых происходят реакции дыхательной цепи, потребляющие кислород и АТФ.The endurance capacity of the human or animal body correlates with the ability of aerobic metabolism to supply the muscles with the required energy in the form of ATP (adenosine triphosphate) for a longer period of time. For aerobic capacity, oxygen uptake is decisive, which in turn is determined by three factors: oxygen intake through the lungs, oxygen transport through the cardiovascular system, and oxygen utilization in muscle cells. While maximum oxygen delivery is largely determined by individual anatomy (total alveolar surface area), oxygen transport and utilization can be improved through exercise and other measures, with the latter usually being the critical limiting factor. Therefore, endurance capacity depends mainly on the number of mitochondria (per muscle cell or total muscle) in which the respiratory chain reactions take place, consuming oxygen and ATP.

В целом, повышение митохондриальной активности означает, что скорость метаболизма в организме увеличивается, и для получения энергии большее количество питательных веществ метаболизируется за единицу времени. Однако более высокая катаболическая активность обмена веществ неизбежно приводит (при постоянном поступлении питательных веществ) к усиленному снижению резервов организма, т.е. к стимуляции расщепления жиров. Расщепление длинноцепочечных карбоновых кислот, высвобождаемых из жировой ткани, происходит в основном во всем организме и, особенно в печени, так что для данного аспекта изобретения, в отличие от улучшения способности к выносливости, важны не только митохондрии в мышечных клетках.In general, an increase in mitochondrial activity means that the metabolic rate in the body increases, and more nutrients are metabolized per unit of time for energy. However, a higher catabolic activity of metabolism inevitably leads (with a constant supply of nutrients) to an increased decrease in body reserves, i.e. to stimulate the breakdown of fats. The breakdown of long chain carboxylic acids released from adipose tissue occurs primarily throughout the body and especially in the liver, so that it is not only mitochondria in muscle cells that are important for this aspect of the invention, in contrast to improving endurance capacity.

Применение гидролизата коллагена в соответствии с изобретением включает нетерапевтическое применение, т.е. введение гидролизата коллагена людям или животным, которые не нуждаются в медицинском лечении с точки зрения их выносливости или массы тела. Скорее применение осуществляют с целью обычно желаемого увеличения способности к выносливости. Это может способствовать улучшению качества жизни и особенно актуально для спортсменов.The use of the collagen hydrolyzate according to the invention includes non-therapeutic use, i. administering collagen hydrolyzate to humans or animals that do not require medical treatment in terms of their endurance or body weight. Rather, the use is for the purpose of the generally desired increase in endurance capacity. This can improve the quality of life and is especially relevant for athletes.

Повышение митохондриальной активности снижает уровень глюкозы, поэтому введение гидролизата коллагена может также оказать положительное влияние на профилактику и/или лечение рака, т.е. злокачественных опухолей. Это основано на предположении того, что опухолевые клетки покрывают свои потребности в энергии главным образом за счет анаэробного метаболизма (ферментации молочной кислоты) и для этого обязательно зависят от глюкозы. Таким образом, повышенное потребление глюкозы в клетках организма ослабит опухолевые клетки.An increase in mitochondrial activity lowers glucose levels, so the administration of collagen hydrolyzate may also have a positive effect on the prevention and/or treatment of cancer, i.e. malignant tumors. This is based on the assumption that tumor cells cover their energy requirements mainly through anaerobic metabolism (lactic acid fermentation) and are necessarily dependent on glucose for this. Thus, increased consumption of glucose in the cells of the body will weaken the tumor cells.

В рамках изобретения также было обнаружено, что гидролизат коллагена приводит к повышенной экспрессии фермента АМФ-активируемой протеинкиназы (АМФК). Этот регуляторный фермент равным образом влияет на энергетический метаболизм клетки, так что увеличение количества АМФК оказывает положительное влияние на способность к выносливости и расщепление жиров. Возможно, что существует прямая корреляция между обусловленным гидролизатом коллагена повышением митохондриальной активности и повышением экспрессии АМФК.It has also been found within the scope of the invention that collagen hydrolyzate results in increased expression of the enzyme AMP-activated protein kinase (AMPK). This regulatory enzyme also influences the cell's energy metabolism, so that an increase in AMPK has a positive effect on endurance capacity and fat breakdown. It is possible that there is a direct correlation between the collagen hydrolyzate-mediated increase in mitochondrial activity and the increase in AMPK expression.

В случае любых применений в соответствии с настоящим изобретением гидролизат коллагена предпочтительно вводят энтерально, в частности перорально.For all uses according to the invention, the collagen hydrolyzate is preferably administered enterally, in particular orally.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидролизат коллагена вводят в форме биологически активной пищевой добавки. Особенно предпочтительным является введение в виде раствора, например в виде готовых ампул или в виде порошка. Благодаря своей хорошей растворимости гидролизат коллагена также можно добавлять в различные напитки, не вызывая помутнения. Посредством применения нейтрального на вкус гидролизата коллагена можно повысить его восприятие потребителями.In a preferred embodiment, the collagen hydrolyzate is administered in the form of a dietary supplement. Especially preferred is the administration in the form of a solution, for example in the form of ready-made ampoules or in the form of a powder. Due to its good solubility, collagen hydrolyzate can also be added to various drinks without causing cloudiness. Through the use of a taste-neutral collagen hydrolyzate, it is possible to increase its acceptance by consumers.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения биологически активная пищевая добавка наряду с гидролизатом коллагена не содержит никаких других белков илиAccording to one preferred embodiment of the invention, the dietary supplement does not contain any other proteins or proteins besides collagen hydrolyzate.

- 1 040775 гидролизатов белков. В известных биологически активных пищевых добавках используют различные белки для наращивания мышечной массы и поддержания мышц, в особенности у спортсменов, с целью замены углеводов и жиров в значительной степени белками в качестве источников энергии. Однако предлагаемое в изобретении применение основано не на действии гидролизата коллагена как источника энергии, а на описанном выше специфическом воздействии на митохондриальную активность.- 1 040775 protein hydrolysates. Known dietary supplements use various proteins to build muscle mass and maintain muscle, especially in athletes, with the aim of replacing carbohydrates and fats to a large extent with proteins as energy sources. However, the use according to the invention is not based on the action of collagen hydrolyzate as an energy source, but on the specific effect on mitochondrial activity described above.

Соответственно этому в другом варианте осуществления изобретения биологически активная пищевая добавка помимо гидролизата коллагена не содержит других физиологически активных компонентов.Accordingly, in another embodiment of the invention, the biologically active food supplement does not contain other physiologically active components in addition to collagen hydrolyzate.

Однако в качестве альтернативы изобретение также включает в себя тот случай, когда гидролизат коллагена вводят в качестве составной части (пищевой) композиции с различными другими составными частями. В частности, гидролизат коллагена может быть добавлен в пищевой продукт или изделия вкусовой промышленности, например шоколадный батончик, протеиновый батончик или злаковый батончик (так наз. функциональные продукты питания), или в молоко, молочные продукты (например, йогурт) и заменители молока (например, соевое молоко, миндальное молоко и кокосовое молоко).However, as an alternative, the invention also includes the case where the collagen hydrolyzate is administered as a constituent of a (food) composition with various other constituents. In particular, the collagen hydrolyzate can be added to a food or flavored product such as a chocolate bar, protein bar or cereal bar (so-called functional foods), or to milk, dairy products (e.g. yogurt) and milk substitutes (e.g. , soy milk, almond milk and coconut milk).

Независимо от формы введения гидролизат коллагена обычно вводят в количестве от 1 до 40 г в сутки, предпочтительно от 2,5 до 30 г в сутки, более предпочтительно от 10 до 25 г в сутки и в особенности от 12,5 до 20 г в сутки.Regardless of the form of administration, collagen hydrolyzate is usually administered in an amount of 1 to 40 g per day, preferably 2.5 to 30 g per day, more preferably 10 to 25 g per day and in particular 12.5 to 20 g per day .

Если гидролизат коллагена применяют в качестве не единственной физиологически активной составной части биологически активной пищевой добавки, то для применения в соответствии с изобретением его можно комбинировать с одним или несколькими другими компонентами, оказывающими положительное влияние на общее состояние здоровья, и в особенности на способность к выносливости. Такие компоненты предпочтительно выбирают из витамина C, витаминов группы B, D, E и K, конъюгированных линоленовых кислот, кофеина и его производных, экстракта гуараны, экстракта зеленого чая, галлата эпигаллокатехина, креатина, L-карнитина, L-цитруллина, L-аргинина, α-липоевой кислоты, Nацетилцистеина, NADH, D-рибозы, аспартата магния, антиоксидантов, таких как антоциан, каротиноидов, флавоноидов, ресвератола, глутатиона, супероксиддисмутазы и ксантанов, таких как мангиферин, минеральных веществ, таких как железо, магний, кальций, цинк, селен и фосфор, а также других белков, гидролизатов или пептидов, таких как соевый, пшеничный или сывороточный белок.If the collagen hydrolyzate is used as more than the only physiologically active component of a dietary supplement, then for use in accordance with the invention it can be combined with one or more other components that have a positive effect on general health, and in particular on endurance capacity. Such components are preferably selected from vitamin C, vitamins B, D, E and K, conjugated linolenic acids, caffeine and its derivatives, guarana extract, green tea extract, epigallocatechin gallate, creatine, L-carnitine, L-citrulline, L-arginine , α-lipoic acid, Nacetylcysteine, NADH, D-ribose, magnesium aspartate, antioxidants such as anthocyanins, carotenoids, flavonoids, resveratol, glutathione, superoxide dismutase and xanthanes such as mangiferin, minerals such as iron, magnesium, calcium, zinc, selenium and phosphorus, as well as other proteins, hydrolysates or peptides such as soy, wheat or whey protein.

Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к комбинации гидролизата коллагена с убихиноном-10 и/или убихинолом, т.е. окисленной или восстановленной формой коэнзима Q₁₀, причем предпочтение отдают убихинолу в силу его лучшей биодоступности. Даже при ежедневном приеме от 50 до 100 мг убихинола наблюдали положительное влияние на физическую работоспособность, причем повышение митохондриальной активности предполагается благодаря антиоксидантному действию убихинола. Поэтому таким способом может быть поддержано действие гидролизата коллагена при упомянутых выше показаниях, которые сопровождаются митохондриальной дисфункцией. Альтернативно или дополнительно, также возможна комбинация гидролизата коллагена с пирролохинолинхиноном (PQQ), который недавно был обнаружен в качестве важного окислительновосстановительного кофактора.Another preferred embodiment of the invention relates to the combination of collagen hydrolyzate with ubiquinone-10 and/or ubiquinol, i. oxidized or reduced form of coenzyme Q ₁₀ , with preference given to ubiquinol due to its better bioavailability. Even with a daily intake of 50 to 100 mg of ubiquinol, a positive effect on physical performance was observed, with an increase in mitochondrial activity suggested due to the antioxidant effect of ubiquinol. Therefore, the action of collagen hydrolyzate can be maintained in this way in the above-mentioned indications, which are accompanied by mitochondrial dysfunction. Alternatively or additionally, it is also possible to combine collagen hydrolyzate with pyrroloquinoline quinone (PQQ), which has recently been discovered as an important redox cofactor.

В конкретном варианте осуществления изобретения введение гидролизата коллагена комбинируют с тренировкой на выносливость или высотной тренировкой. Тренировки на выносливость могут увеличить аэробную способность обмена веществ. Кроме того, известно, что физическая тренировка в условиях относительной кислородной недостаточности (гипоксическая тренировка) оказывает сильное влияние на способность к выносливости, поэтому при одновременном приеме гидролизата коллагена в каждом случае можно ожидать синергетический эффект. Это представляет особый интерес для спортсменов.In a specific embodiment of the invention, the administration of collagen hydrolyzate is combined with endurance or altitude training. Endurance training can increase the aerobic capacity of the metabolism. In addition, it is known that physical training under conditions of relative oxygen deficiency (hypoxic training) has a strong influence on endurance capacity, so a synergistic effect can be expected in each case when collagen hydrolyzate is taken simultaneously. This is of particular interest to athletes.

С другой стороны, в контексте изобретения в такой же степени возможно и целесообразно, если введение гидролизата коллагена осуществляют при отсутствии тренировки на выносливость, высотной тренировки или тренировки мышц. В частности, в экспериментах на животных (см. ниже) было показано, что в соответствии с изобретением воздействия на митохондриальную активность и т.д. уже проявляются в сочетании с нормальной физической активностью.On the other hand, in the context of the invention, it is equally possible and expedient if the administration of the collagen hydrolyzate is carried out in the absence of endurance training, altitude training or muscle training. In particular, in animal experiments (see below), it has been shown that, in accordance with the invention, effects on mitochondrial activity, etc. already appear in combination with normal physical activity.

В соответствии с изобретением молекулярная масса используемого гидролизата коллагена может варьироваться в широких пределах, причем верхняя граница задается тем, что гидролизат коллагена в отличие от денатурированного коллагена или желатина обладает достаточно высокой степенью гидролиза, чтобы быть водорастворимым при комнатной температуре и не превращаться в гель. Растворимые пептиды гидролизата коллагена могут хорошо всасываться в организме. Как правило, гидролизат коллагена имеет среднюю молекулярную массу от 200 до 25000 Да, предпочтительно от 1000 до 6000 Да, более предпочтительно от 1200 до 4000 Да, еще более предпочтительно от 1500 до 3500 Да и в особенности от 2800 до 3300 Да.According to the invention, the molecular weight of the collagen hydrolyzate used can vary within wide limits, the upper limit being given by the fact that the collagen hydrolyzate, in contrast to denatured collagen or gelatin, has a sufficiently high degree of hydrolysis to be water-soluble at room temperature and not to gel. Soluble collagen hydrolyzate peptides can be well absorbed in the body. Typically, the collagen hydrolyzate has an average molecular weight of 200 to 25000 Da, preferably 1000 to 6000 Da, more preferably 1200 to 4000 Da, even more preferably 1500 to 3500 Da and especially 2800 to 3300 Da.

Гидролизат коллагена выгодно получают посредством ферментативного гидролиза исходного материала, содержащего коллаген. Для этого гидролиза в особенности применяют эндопептидазы и/или экзопептидазы микробного или растительного происхождения.The collagen hydrolyzate is advantageously obtained by enzymatic hydrolysis of the starting material containing collagen. For this hydrolysis, in particular endopeptidases and/or exopeptidases of microbial or plant origin are used.

Содержащий коллаген исходный материал, как правило, выбирают из шкур или костей позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, и в особенности из шкур крупного рогатого скота илиThe collagen-containing starting material is generally selected from the skins or bones of vertebrate animals, preferably mammals, and in particular from the skins of cattle or

- 2 040775 свиней (спилок крупного рогатого скота соответственно свиные шкуры с остатками жира). Гидролизат коллагена может быть получен из этих исходных материалов либо одностадийным способом, либо с помощью промежуточной стадии желатина, и в этом случае можно использовать как желатин типа А, так и желатин типа В.- 2 040775 pigs (split cattle, respectively pork skins with fat residues). The collagen hydrolyzate can be prepared from these starting materials either in a one-step process or with an intermediate gelatin step, in which case both type A gelatin and type B gelatin can be used.

Кроме этого, для целей настоящего описания речь может идти о способе улучшения способности к выносливости за счет увеличения митохондриальной активности. Способ может включать энтеральное, в особенности пероральное, введение гидролизата коллагена человеку или животному. Способ может быть нетерапевтическим.In addition, for the purposes of the present description, we can talk about a way to improve the ability to endurance by increasing mitochondrial activity. The method may include enteral, especially oral administration of collagen hydrolyzate to a human or animal. The method may be non-therapeutic.

Изобретение будет более подробно пояснено с помощью результатов экспериментов in vitro и in vivo, которые описаны в контексте нижеследующих примеров.The invention will be explained in more detail with the help of the results of experiments in vitro and in vivo, which are described in the context of the following examples.

На чертеже представлен флуоресцентно-микроскопический снимок клеток SH-SY5Y, которые были инкубированы в присутствии гидролизата коллагена.The drawing shows a fluorescent microscopic image of SH-SY5Y cells that were incubated in the presence of collagen hydrolyzate.

ПримерыExamples

1. Увеличение числа митохондрий благодаря гидролизату коллагена.1. Increase in the number of mitochondria due to collagen hydrolyzate.

Эффективность гидролизата коллагена для увеличения числа митохондрий можно было показать in vitro с помощью нервных клеток человека (клеточная линия нейробластомы SH-SY5Y).The effectiveness of collagen hydrolyzate to increase the number of mitochondria could be shown in vitro using human nerve cells (neuroblastoma cell line SH-SY5Y).

Клетки SH-SY5Y инкубировали в культуральной среде с различными концентрациями гидролизата коллагена в 0,05 мас.%, 0,2 мас.% и 2,5 мас.%. Для этого использовали гидролизат коллагена из желатина из свиных шкур с остатками жира со средней молекулярной массой в диапазоне от 3000 Да, который был получен ферментативным гидролизом (в дальнейшем упоминается как гидролизат коллагена А). Молекулярно-массовое распределение пептидов, которое было определено с помощью гель-проникающей хроматографии, приведено в нижеследующей табл. 1.SH-SY5Y cells were incubated in culture medium with different concentrations of collagen hydrolyzate of 0.05 wt.%, 0.2 wt.% and 2.5 wt.%. For this, a hydrolyzate of porcine gelatin collagen with residues of fat with an average molecular weight in the range of 3000 Da, which was obtained by enzymatic hydrolysis (hereinafter referred to as collagen A hydrolyzate) was used. The molecular weight distribution of the peptides, which was determined using gel permeation chromatography, is shown in the following table. 1.

Таблица 1 Распределение ММ гидролизата коллагена АTable 1 MW distribution of collagen A hydrolyzate

Фракция Fraction Мас. % wt. % > 7.500 Да > 7.500 Yes < 10 < 10 3.500 - 7.500 Да 3.500 - 7.500 Yes 20 - 30 20 - 30 1.500 - 3.500 Да 1.500 - 3.500 Yes 30 - 33 30 - 33 500 - 1.500 Да 500 - 1.500 Yes 25 - 38 25 - 38 100 - 500 Да 100 - 500 Yes < 5 < 5

Чтобы сделать возможным прямое определение числа митохондрий, митохондриальный белковый компонент ТОМ20 был флуоресцентно помечен. ТОМ20 представляет собой субъединицу рецепторного комплекса во внешней мембране митохондрий, который выполняет функцию переноса цитозольных белков-предшественников (препептидов) в митохондрии. Там белки, которые являются ферментами дыхательной цепи или цикла лимонной кислоты, активируются путем отщепления предварительной последовательности.To enable direct determination of the number of mitochondria, the mitochondrial protein component of TOM20 was fluorescently labeled. TOM20 is a subunit of the receptor complex in the outer mitochondrial membrane that carries out the function of transporting cytosolic precursor proteins (prepeptides) into mitochondria. There, proteins that are enzymes of the respiratory chain or the citric acid cycle are activated by cleavage of a pre-sequence.

Таким образом, количество флуоресцентно меченного ТОМ20, видимое во флуоресцентном микроскопе, является мерой числа митохондрий в клетке. Клетки, инкубированные с 0,05 мас.%, 0,2 мас.% и 2,5 мас.% гидролизата коллагена, представлены на фиг. А, В соответственно С, причем с растущей концентрацией отчетливо виден прирост светлой (в оригинале зеленой) флуоресценции в областях вокруг ядра клетки (в оригинале синей). Таким образом, гидролизат коллагена способствует увеличению числа митохондрий в клетках SH-SY5Y, и тем самым повышению общей митохондриальной активности.Thus, the amount of fluorescently labeled TOM20 seen under a fluorescent microscope is a measure of the number of mitochondria in a cell. Cells incubated with 0.05 wt%, 0.2 wt% and 2.5 wt% collagen hydrolyzate are shown in FIG. A, B, respectively, C, and with increasing concentration, an increase in light (in the original green) fluorescence in the areas around the cell nucleus (in the original blue) is clearly visible. Thus, collagen hydrolyzate promotes an increase in the number of mitochondria in SH-SY5Y cells, and thereby an increase in overall mitochondrial activity.

2. Активация фермента АМФК гидролизатом коллагена in vitro.2. AMPK enzyme activation with collagen hydrolyzate in vitro.

АМФ-активируемая протеинкиназа (АМФК) участвует в снабжении энергией как жировой ткани, так и мышц. Поскольку АМФ образуется при потреблении АТФ, то его можно рассматривать как показатель нехватки энергии. Таким образом, экспрессия АМФК служит для активации энергетических резервов жирового депо и в процессе гликолиза.AMP-activated protein kinase (AMPK) is involved in the energy supply of both adipose tissue and muscles. Since AMP is formed when ATP is consumed, it can be considered as an indicator of lack of energy. Thus, the expression of AMPK serves to activate the energy reserves of the fat depot and in the process of glycolysis.

Чтобы определить влияние гидролизата коллагена на экспрессию АМФК, миоциты человека инкубировали в среде, содержащей 0,5 мг/мл гидролизата коллагена в течение промежутка времени, составляющего 24 ч. После удаления среды РНК экстрагировали из клеточного слоя, а количество АМФК-РНК определяли с помощью ПЦР с использованием специфичных праймеров.To determine the effect of collagen hydrolyzate on AMPK expression, human myocytes were incubated in medium containing 0.5 mg/ml collagen hydrolyzate for a period of 24 h. PCR using specific primers.

По сравнению с контролем без гидролизата коллагена АМФК-РНК была значительно увеличена (более чем в 600 раз). Тем самым из этих данных следует стимулирующее влияние гидролизата коллагена на энергетический метаболизм клетки.Compared to the control without collagen hydrolyzate, AMPK-RNA was significantly increased (more than 600-fold). Thus, from these data follows the stimulating effect of collagen hydrolyzate on the energy metabolism of the cell.

3. Активация фермента АМФК гидролизатом коллагена in vivo.3. AMPK enzyme activation by collagen hydrolyzate in vivo.

Положительное воздействие гидролизата коллагена на экспрессию АМФК также можно было подтвердить с помощью исследования на животных in vivo.The positive effect of collagen hydrolyzate on AMPK expression could also be confirmed by an in vivo animal study.

Для этой цели мышей ежедневно кормили количеством гидролизата коллагена, соответствующим человеческой эквивалентной дозе 10 г, в течение 3 месяцев. После того как мышей умерщвляли, четыFor this purpose, mice were fed daily with an amount of collagen hydrolyzate corresponding to a human equivalent dose of 10 g for 3 months. After mice were sacrificed, four

- 3 040775 рехглавые мышцы полностью иссекали, быстро замораживали и измельчали. Из мышечной ткани были экстрагированы растворимые белки, а количество АМФК было определено с помощью иммуноферментного анализа (ELISA).- 3 040775 rechips were completely excised, quickly frozen and minced. Soluble proteins were extracted from muscle tissue, and the amount of AMPK was determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

По сравнению с контрольной группой, которая не получала гидролизат коллагена, количество АМФК увеличилось в 1,5-2 раза.Compared to the control group, which did not receive collagen hydrolyzate, the amount of AMPK increased by 1.5-2 times.

4. Влияние гидролизата коллагена на выработку NADH in vitro.4. Effect of collagen hydrolyzate on NADH production in vitro.

Образование высокоэнергетической формы NADH+H+ никотинамидадениндинуклеотида из низкоэнергетической формы NAD эквивалентно обеспечению энергией в форме АТФ. Таким образом, оно представляет собой косвенную меру митохондриальной активности в мышечных клетках.Formation of the high energy form NADH+H+ of nicotinamide adenine dinucleotide from the low energy form of NAD is equivalent to providing energy in the form of ATP. Thus, it represents an indirect measure of mitochondrial activity in muscle cells.

Для этого эксперимента миоциты человека инкубировали в течение 6 дней в среде, содержащей 0,5 мг/мл гидролизата коллагена. После удаления среды триглицериды экстрагировали и с помощью ферментов глицеролкиназы и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы определяли энергию, содержащуюся в триглицеридах или глицерине, в форме высвобожденного NADH+H+.For this experiment, human myocytes were incubated for 6 days in medium containing 0.5 mg/ml collagen hydrolyzate. After the medium was removed, the triglycerides were extracted and the energy contained in the triglycerides or glycerol in the form of released NADH+H+ was determined using the enzymes glycerol kinase and glycerol-3-phosphate dehydrogenase.

По сравнению с контролем без гидролизата коллагена количество NADH увеличилось примерно в 2 раза.Compared to the control without collagen hydrolyzate, the amount of NADH increased approximately 2-fold.

5. Повышение плотности митохондрий у крыс in vivo.5. Increasing the density of mitochondria in rats in vivo.

В доклиническом исследовании заметное повышение плотности митохондрий (т.е. увеличение количества и/или размера митохондрий) в скелетных мышцах крыс может быть продемонстрировано путем введения различных гидролизатов коллагена.In a preclinical study, a marked increase in mitochondrial density (ie, an increase in the number and/or size of mitochondria) in rat skeletal muscle can be demonstrated by the administration of various collagen hydrolysates.

Исследование проводили на самцах крыс линии CD® IGS (Charles River Laboratories, Sulzfeld), возраст которых в начале периода исследования составлял 64 дня, и масса тела составляла от 300 до 400 г. Тестируемая группа и контрольная группа состояли из шести животных в каждой.The study was carried out on CD® IGS male rats (Charles River Laboratories, Sulzfeld), which were 64 days old at the beginning of the study period and weighed between 300 and 400 g. The test group and the control group consisted of six animals each.

В начале исследования (t = 0) у каждой крысы была взята биопсия тонкой иглой из четырёхглавой мышцы бедра (quadriceps femoris). Затем животные тестируемых групп в течение четырех недель получали суточную дозу в 200 мг соответствующего гидролизата коллагена (см. ниже) на 1 кг фактической массы тела (что соответствует суточной дозе в 15 г у человека с массой тела 75 кг). Гидролизат коллагена растворяли в концентрации 20 мг/мл в соответствующем количестве водопроводной воды и вводили желудочный зонд. Животные контрольной группы каждый раз получали одинаковое количество водопроводной воды без гидролизата коллагена.At baseline (t = 0), each rat was biopsied with a fine needle from the quadriceps femoris muscle. The animals of the test groups then received a daily dose of 200 mg of the appropriate collagen hydrolyzate (see below) per 1 kg of actual body weight for four weeks (corresponding to a daily dose of 15 g in a human weighing 75 kg). The collagen hydrolyzate was dissolved at a concentration of 20 mg/ml in an appropriate amount of tap water and a gastric tube was introduced. Animals in the control group each time received the same amount of tap water without collagen hydrolyzate.

Наряду с описанным выше гидролизатом коллагена А в других тестируемых группах применяли гидролизат коллагена В из желатина из спилка шкур крупного рогатого скота, который имеет среднюю молекулярную массу 2000 Да, и гидролизат коллагена С из желатина из спилка шкур крупного рогатого скота, который имеет среднюю молекулярную массу 3500 Да, каждый из которых получают ферментативным гидролизом. Распределения молекулярных масс всех трех гидролизатов приведены в нижеследующей табл. 2.In addition to the collagen A hydrolyzate described above, other test groups used hydrolyzate of collagen B from gelatin from split bovine skins, which has an average molecular weight of 2000 Da, and hydrolyzate of collagen C from gelatin from split bovine hides, which has an average molecular weight 3500 Yes, each of which is obtained by enzymatic hydrolysis. The molecular weight distributions of all three hydrolysates are given in the following table. 2.

Таблица 2table 2

Распределение ММ гидролизатов коллагена в мас.%Distribution of MW of collagen hydrolysates in wt.%

Фракция Fraction Гидролизат А Hydrolyzate A Гидролизат В Hydrolyzate B Гидролизат С Hydrolyzate C > 7.500 Да > 7.500 Yes < 10 < 10 < 3 < 3 4-14 4-14 3.500 - 7.500 Да 3.500 - 7.500 Yes 20-30 20-30 10-20 10-20 18-25 18-25 1.500 - 3.500 Да 1.500 - 3.500 Yes 30-33 30-33 25-32 25-32 30-38 30-38 500 - 1.500 Да 500 - 1.500 Yes 25-38 25-38 40-50 40-50 28-36 28-36 100 - 500 Да 100 - 500 Yes < 5 < 5 < 15 < 15 < 7 < 7 Средняя ММ Average MM 3.000 Да 3.000 Yes 2.000 Да 2.000 Yes 3.500 Да 3.500 Yes

После окончания периода исследования (t = 4н.) всех крыс умерщвляли и снова осуществляли биопсию тонкой иглой четырёхглавой мышцы бедра. В течение четырех недель средний прирост массы у крыс составлял около 30%, причем между тестируемой группой и контрольной группой не было существенной разницы.After the end of the study period (t = 4n), all rats were sacrificed and biopsied again with a fine needle of the quadriceps femoris muscle. Within four weeks, the average weight gain in rats was about 30%, and there was no significant difference between the test group and the control group.

Для определения плотности митохондрий биопсии, взятые до и после периода исследования, были препарированы для анализа с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, как описано в литературных источниках (см. A. Glauert und P. Lewis: Biological Specimen Preparation for Transmission Electron Microscopy, Princeton Legacy Library, 2014). В каждом случае были оцифрованы отдельные участки поверхности биопсии мышц размером 15,17x15,17 мкм (230 мкм²) и оценены полуколичественно. При этом с помощью 10 точечных проб из каждой биопсии была определена средняя площадь митохондрий по отношению к общей площади. Митохондрии можно было локализовать благодаря четко видимой характерной структуре внутренней мембраны с её кристами.To determine mitochondrial density, biopsies taken before and after the study period were prepared for transmission electron microscope analysis as described in the literature (see A. Glauert und P. Lewis: Biological Specimen Preparation for Transmission Electron Microscopy, Princeton Legacy Library , 2014). In each case, separate areas of the surface of the muscle biopsy measuring 15.17x15.17 µm (230 µm ² ) were digitized and evaluated semi-quantitatively. At the same time, using 10 point samples from each biopsy, the average area of mitochondria relative to the total area was determined. Mitochondria could be localized due to the clearly visible characteristic structure of the inner membrane with its cristae.

В нижеследующей табл. 3 представлено развитие плотности митохондрий (мкм² митохондрий на 230 мкм² общей площади) у животных тестируемой группы с гидролизатом коллагена А.In the following table. 3 shows the development of mitochondrial density (µm ² mitochondria per 230 µm ² total area) in animals of the test group with collagen A hydrolyzate.

--

Claims

Table 3

Temporal development of test group A No. rat Test group A, t = 0 Test group A, t = 4 and.

1 9.82 11.97

2 10.36 17.44

3 6.84 12.36

4 8.15 17.46

5 8.03 15.61

6 6.18 13.29

Average value 8.23 14.69

Standard deviation ±1.63 ±2.48

As a result, the introduction of collagen A hydrolyzate for four weeks led to a very significant increase in mitochondrial density by an average of 78.5%, which is also statistically significant (p = 0.001).

Similar data are also shown by comparison of mitochondrial density between the test groups with collagen hydrolysates A, B and C, as well as the control group in each case after four weeks, according to the following table. 4.

Table 4

Comparison of test groups A, B and C with control group No. rats Control group t = 4 and. Test group A t = 4 and. Test group B t = 4 and. Test group C t = 4 n.

1 8.95 11.97 15.06 14.66

2 6.84 17.44 15.11 18.76

3 11.73 12.36 16.09 19.97

4 8.76 17.46 13.39 16.53

5 9.74 15.61 15.43 19.72

6 10.28 13.29 14.65 17.56

Average value 9.38 14.69 14.96 17.86

Standard deviation ±1.64 ±2.48 ±0.90 ±2.04

The density of mitochondria in the tested groups was on average 56.6% (A), 59.5% (B) and 90.4% (C) higher than in the control group, which is also statistically significant (p = 0.001 ). The Cohen's d value as a measure of effect size for all test groups is over 2.5, which in each case represents a very strong effect.

In conclusion, this study clearly demonstrates that the administration of collagen hydrolyzate results in a significant increase in mitochondrial density in muscle cells and thus also in a corresponding increase in mitochondrial activity. This effect can be confirmed using collagen hydrolysates of different origin (porcine or bovine) and molecular weight distribution.

CLAIM

1. Non-therapeutic use of collagen hydrolyzate for improving endurance capacity by increasing mitochondrial activity, wherein the collagen hydrolyzate has an average molecular weight of 200 to 25,000 Da, and wherein the collagen hydrolyzate is administered orally in an amount of 1 to 40 g per day.

2. Use according to claim 1, wherein the collagen hydrolyzate is administered as a dietary supplement, in particular as a solution or powder.

3. Use according to claim 2, wherein the dietary supplement does not contain other proteins or protein hydrolysates in addition to the collagen hydrolyzate.

4. Use according to claim 2 or 3, wherein the biologically active food supplement does not contain other physiologically active components in addition to collagen hydrolyzate.

5. Use according to one of claims 1 to 4, wherein the collagen hydrolyzate is administered in an amount of 2.5 to 30 g per day, preferably 10 to 25 g per day, in particular 12.5 to 20 g per day.

6. Use according to claim 2 or 3, wherein the collagen hydrolyzate is combined with one or more components selected from vitamin C, vitamins B, D, E and K, conjugated linolenic acids, caffeine and its derivatives, guarana extract, green leaf extract tea, epigallocatechin gallate, creatine, L-carnitine, L-citrulline, L-arginine, α-lipoic acid, Nacetylcysteine, NADH, D-ribose, magnesium aspartate, antioxidants such as anthocyanin, carotenoids

-