EA040690B1 - 99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA В КАЧЕСТВЕ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ПРОСТАТСПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому радиофармацевтическому препарату, который представляет собой ингибитор простатспецифического мембранного антигена (iPSMA), содержащий гидразиноникотинамид (HYNIC) в качестве химической группы, крайне важной для повышения липофильности молекулы для связывания с гидрофобными сайтами PSMA, в сочетании с обычным применением HYNIC в качестве хелатирующего агента для радиоактивного металла ^99mTc в случае, когда для заполнения координационной сферы этого радиоактивного металла используется этилендиаминдиуксусная кислота (EDDA). В медицинской радиологии методами молекулярной визуализации SPECT (ОФЭКТ, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии) новый радиофармацевтический препарат ^99mTcEDDA/HYNIC-iPSMA обнаруживает с высокой аффинностью in vivo белок PSMA, сверхэкспрессируемый в раковых клетках предстательной железы.

Сведения о предшествующем уровне техники

Рак предстательной железы (простаты) (PCa) является вторым по распространённости в мире раковым заболеванием у мужчин [Jemal A. et al. Cancer statistics, 2010. CA Cancer J. Clin. 2010, 60: 277-300]. У пациентов с локализованным PCa пятилетняя выживаемость при наличии рака приближается к 100%; однако у пациентов с метастазами пятилетняя выживаемость составляет 31% [Wei Q. et al. Global analysis of differentially expressed genes in androgen-independent prostate cancer. Prostate Cancer Prostatic Dis. 2007, 10: 167-174]. Почти все пациенты с метастазами сначала хорошо реагируют на антиандрогенную терапию. Однако основной причиной смерти пациентов с PCa является прогрессирование заболевания до андрогеннезависимого состояния.

Фермент глутамат карбоксипептидаза II, также известный как простатспецифический мембранный антиген (PSMA), экспрессируется в эпителиальных клетках предстательной железы и сверхэкспрессируется в высокой степени в 95% случаев рака простаты на поздней стадии. Уровни экспрессии PSMA напрямую коррелируют с андрогенной независимостью, метастазированием и прогрессированием PCa [Santoni M. et al. Targeting prostate-specific membrane antigen for personalized therapies in prostate cancer: morphologic and molecular backgrounds and future promises. J. Biol. Regul. Homeost Agents. 2014, 28: 555563]. Поэтому PSMA является подходящей молекулярной мишенью для обнаружения метастатического рака простаты посредством визуализации и лучевой терапии с использованием специфических радиофармацевтических препаратов.

Ген PSMA включает 19 экзонов, которые содержат ~60 т.п.н. геномной ДНК. Этот ген кодирует трансмембранный белок типа II с коротким цитоплазматическим фрагментом (19 аминокислот), гидрофобным трансмембранным доменом (24 аминокислоты) и большим внеклеточным доменом (707 аминокислот). PSMA содержит Zn в активном центре фермента, поэтому в качестве эффективного ингибитора его активности была предложена последовательность Glu-NH-CO-NH-Lys (β-нафтиламин) = GluМочевина-Lys(NaI) [Benesova, M. et al. Preclinical evaluation of a tailor-made DOTA-conjugated PSMA inhibitor with optimized linker moiety for imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. J. Nucl. Med., 58, 2015: 914-920]. В конкретной химической реакции происходит электростатическое взаимодействие 3 карбоксильных групп фрагмента Glu-мочевина-Lys с пептидными боковыми цепями в активном центре PSMA, атом кислорода мочевины образует координационную связь с атомом цинка, а ароматическая структура в NaI в результате взаимодействия связывается с гидрофобным активным сайтом фермента. При проведении недавних клинических исследований применение двух различных производных iPSMA, меченных с помощью Lu-177, показало значительное снижение уровней простатспецифического антигена (PSA) у 70-80% больных PCa при отсутствии серьёзных побочных эффектов, заметно повысив выживаемость пациентов [Ahmadzadehfar H. et al. Early side-effects and first results of radioligand therapy with ¹⁷⁷Lu-DKFZ-617 PSMA of castrate-resistant metastatic prostate cancer: a two-centre study. EJNMMI Res. 2015, 5:36 doi: 10.1186/s13550-015-0114-2; Kratochwil C. et al. [¹⁷⁷Lu]Lutetium-labelled PSMA ligand-induced remission in a patient with metastatic prostate cancer. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 42, 2015: 987-988; Baum, Richard P., et al. Lutetium-177 PSMA radioligand therapy of metastatic castration-resistant prostate cancer: safety and efficacy. J. Nucl. Med., 2016: DOI: doi: 10.2967/jnumed.115.168443; Kratochwil, C. et al. PSMAtargeted radionuclide therapy of metastatic castration-resistant prostate cancer with Lu-177 labeled PSMA-617. J. Nucl. Med., 2016: doi:10.2967/jnumed.115.171397; Rahbar, K. et al. Response and tolerability of a single dose of ¹⁷⁷Lu-PSMA-617 in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer: a multicenter retrospective analysis. J. Nucl. Med., 2016: doi: 10.2967/jnumed.116.173757]. Белок PSMA является мультифункциональным, поскольку он может действовать как интернализуемый рецептор, как фермент в процессе абсорбции питательных веществ или как пептидаза, которая принимает участие в сигнальной трансдукции в эпителиальных клетках и в процессе миграции клеток [Rajasekaran A. et al. Is prostate-specific membrane antigen a multifunctional protein? American Journal of Physiology - Cell Physiology, 2005, 288:C975-C981]. По этой причине радиофармацевтические ингибиторы PSMA можно также применять в случае новообразований другого типа, отличных от PCa, например, среди прочего, при метастатическом раке молочной железы, при остеосаркомах, глиомах и при дифференцированном раке щитовидной железы [la Fougere, et al. In vivo visualization of prostate-specific membrane antigen in glioblastoma. Eur. J. Nucl. Med. and Mol. Imaging, 2015, 42: 170-171; Verburg F.A., et al. First evidence of PSMA expression in differentiated thyroid can- 1 040690 cer using [68Ga] PSMA-HBED-CC PET/CT. Eur. J. Nucl. Med. and Mol. imaging, 2015, 42: 1622-1623; Zeng

C. et al. Prostate-specific membrane antigen: a new potential prognostic marker of osteosarcoma. Medical Oncology, 2012, 29: 2234-2239; Sathekge M. et al. ⁶⁸Ga-PSMA imaging of metastatic breast cancer. (2015). Eur. J.

Nucl. Med. and Mol. imaging, 2015, 42:1482-1483].

Однако перед любой лучевой терапией следует оценить захват радиофармацевтических препаратов опухолями или их метастазами методами ЯМР-визуализации, чтобы убедиться, действительно ли терапия пригодна или не пригодна для пациента, а также, чтобы определить активность, которую необходимо применить, чтобы обеспечить дозу излучения, подходящую для абляции опухоли, т.е. на практике осуществить персонализованную медицину. Поэтому необходимо применить PSMA-ингибирующие диагностические радиофармацевтические препараты с целью молекулярной визуализации методом позитронно-эмиссионной томографии (PET, ПЭТ) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT, ОФЭКТ). Из этих двух методов PET даёт более высокое пространственное разрешение и имеет более высокую чувствительность, поэтому большинство коммерческих PSMA-ингибирующих диагностических радиофармацевтических препаратов разработано на основе ⁶⁸Ga, который является радионуклидом для PET [Eder M. et al. Novel preclinical and radiopharmaceutical aspects of [68Ga]Ga-PSMAHBED-CC: a new PET tracer for imaging of prostate cancer. Pharmaceuticals, 2014, 7: 779-796: Eder M. et al. 68Ga-complex lipophilicity and the targeting property of a urea-based PSMA inhibitor for PET imaging. Bioconjugate Chem., 2012, 23: 688-697; Weineisen et al. 68Ga- and 177Lu-labeled PSMA I&T: optimization of a PSMA-targeted theranostic concept and first proof-of-concept human studies. J. Nucl. Med., 2015, 56: 11691176; Afshar-Oromieh, A. et al. Comparison of PET/CT and PET/MRI hybrid systems using a 68Ga-labelled PSMA ligand for the diagnosis of recurrent prostate cancer: initial experience. Eur. J. Nucl. Med. and Molecular Imaging 41.5 (2014): 887-897].

Однако на национальном и на международном уровне исследования методом SPECT составляют более 70% от общего количества исследований в области медицинской радиологии вследствие их более низкой стоимости и большей доступности оборудования и радионуклидов, так как нет необходимости иметь циклотрон в больницах или поблизости от них. Радионуклидом, чаще всего применяемым для получения изображений методом визуализации SPECT, является ^99mTc, но публикация, посвященная полному клиническому исследованию с использованием ингибиторов PSMA, меченных ^99mTc, отсутствует, и их изучение не пошло далее преклинических исследований [Kularatne A., et al. Design, synthesis, and preclinical evaluation of prostate-specific membrane antigen targeted 99mTc-radioimaging agents. Mol. Pharmaceutics, 2009, 6: 790-800; Lu, G. et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled small molecule prostate specific membrane antigen inhibitors with novel polar chelates. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23: 1557-1563; Hillier S.M. et al. 99mTc-labeled small-molecule inhibitors of prostate-specific membrane antigen for molecular imaging of prostate cancer. J. Nucl. Med., 2013, 54: 1369-1376]. Было опубликовано только диагностическое изображение с использованием ^99mTc, включённое как часть радиотерапевтического исследования с применением ¹⁷⁷Lu у пациентов [Kratochwil, C. et al. PSMA-targeted radionuclide therapy of metastatic castration-resistant prostate cancer with Lu-177 labeled PSMA-617. J. Nucl Med, 2016: doi: 10.2967/jnumed.115.171397].

Для достижения высокой чувствительности, равной чувствительности PET радионуклидов, необходимо разработать молекулы, более конкурентные с точки зрения аффинности и пригодности для мечения радионуклидом ^99mTc, чтобы обнаруживать опухолевые поражения, которые сверхэкспрессируют PSMA, методами SPECT и с высокой чувствительностью.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Для целей патентования представлен новый радиофармацевтический препарат, который представляет собой ингибитор простатспецифического мембранного антигена (iPSMA), который содержит гидразиноникотинамид (HYNIC) в качестве химической группы, крайне важной для повышения липофильности молекулы для связывания с гидрофобными сайтами PSMA, в сочетании с обычным применением HYNIC в качестве хелатирующего агента для радиоактивного металла ^99mTc в случае, когда для заполнения координационной сферы этого радиоактивного металла используется этилендиаминдиуксусная кислота (EDDA). Новый радиофармацевтический препарат ^99mTc-EDDA/HYNIC/iPSMA обнаруживает с высокой аффинностью связывания in vivo белок PSMA, сверхэкспрессируемый к раковых клетках предстательной железы, с помощью метода молекулярной диагностики SPECT в медицинской радиологии. На фиг. 1 схематически показана структура патентуемого радиофармацевтического препарата (^99mTcEDDA/HYNIC-iPSMA).

На основании химического изучения различных производных, которые являются ингибиторами PSMA, которое продемонстрировало чёткую зависимость характеристик связывания или аффинности связывания от липофильности радиофармацевтического препарата [Kularatne A. et al. Design, synthesis, and preclinical evaluation of prostate-specific membrane antigen targeted 99mTc-radioimaging agents. Mol. Pharmaceutics, 2009, 6: 790-800], было сконструировано и синтезировано производное HYNIC-iPSMA, в котором липофильные характеристики молекулы увеличиваются благодаря наличию ароматического гетероцикла гидразиноникотинамида, которое в свою очередь пригодно для хелатирования ^99mTc. В таблице ниже приведены различные ингибиторы PSMA, сравнительные результаты изучения радиофарма- 2 040690 цевтического препарата, который патентуется, и теоретического расчёта величин коэффициента распределения с использованием алгоритмов модели количественного соотношения структура-свойство (QSPR) для предсказания на основе фрагмента (CLogP), где большие величины показывают, что соединение является более липофильным.

Более того, в структуре радиофармацевтического препарата, который патентуется, HYNIC функционирует в качестве спейсера между сайтом биологического распознавания и радиоактивным металлом, в то время как в других радиофармацевтических препаратах HYNIC используется исключительно как бифункциональный агент для мечения технецием ^99mTc [Decristoforo С. et al. ^99mTc-EDDA/HYNIC-TOC: a new ^99mTc-labelled radiopharmaceutical for imaging somatostatin receptor-positive tumours; first clinical results and intra-patient comparison with ¹¹¹In-labelled octreotide derivatives, 2000, J. Nucl. Med. 27; 1318-25; FerroFlores G. et al. Preparation and Evaluation of ^99mTc EDDA/HYNIC-[Lys³]-Bombesin for imaging of GRP Receptor-Positive Tumours. Nucl. Med. Comm., 2006, 27:371-376; Gonzalez-Vazquez A. et al. Dosimetry and Biokinetics of ^99mTc-EDDA/HYNIC-Tyr³ - Octreotide Prepared from Lyophilized Kits. Appl. Rad. Isot., 2006, 64: 792-79; Ortiz-Arzate Z. et al. Kit preparation and biokinetics in women of ^99mTc-EDDA/HYNIC-E[c(RGDfK)]₂ for breast cancer imaging, Nucl. Med. Commun, 2014, 35:423-32; Medina-Garcia V. et al. A Freeze-Dried Kit Formulation for the Preparation of Lys²⁷(^99mTc-EDDA/HYNIC)-Exendin(9-39)/^99mTcEDDA/HYNIC-Tyr³-Octreotide to Detect Benign and Malignant Insulinomas. Nucl. Med. Biol., 2015, 42: 911916].

Способ получения радиофармацевтического препарата согласно данному изобретению

Для синтеза молекулы сначала использовали ди-трет-бутиловый эфир глутаминовой кислоты, который взаимодействовал с карбонилдиимидазолом (CDI) в присутствии триэтиламина (TEA) с образованием производного ацилимидазола, которое активировалось метилтрифлатом (MeOTf) для реакции с (S)трет-бутил-2-амино-6-(бензилоксикарбониламино)гексаноатом (Cbz-Lys-Ot-Bu) с последующим снятием защиты Cbz путём гидрогенолиза, при этом получали производное Glu-мочевина-Lys, которое реагиро вало в твёрдой фазе (смола MBHA) с аминокислотой Fmoc-в-нафтилаланином (HBTU/HOBt) и затем с 6Boc-гидразинопиридин-3-карбоновой кислотой (Boc-HYNIC) в присутствии диизопропилэтиленамина (DiPEA) и диметилформамида (DMF). В конце снимали с соединения защиту с помощью TFA, очищали его методом HPLC (ВЭЖХ) и подвергали лиофилизации. Конечный продукт представлял собой Glu-NHCO-NH-Lys(β-нафтилаланин)-HYNIC (HYNIC-iPSMA), масс-спектр которого показан на фиг. 2.

Ингибиторы простатспецифического мембранного антигена с захватом опухолью, показанным в процессе клинических исследований

- 3 040690

Обращённо-фазовая ВЭЖХ лиофилизированного твёрдого вещества белого цвета показала наличие химической чистоты соединения, степень чистоты составляла 98,25%.

Рецептуру HYNIC-iPSMA (37,5 мкг) составили в виде лиофилизированной лекарственной формы, содержащей 10 мг EDDA, 20 мг трицина, 20 мкг двухлористого олова и 50 мг маннита. Этот состав при восстановлении с помощью 1 мл 0,2М фосфатного буферного раствора с pH 7 и 1 мл раствора пертехнетата натрия (^99mTcO₄Na), полученный in situ из генератора ⁹⁹Mo/^99mTc, приводит к получению патентуемого соединения ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA (фиг. 1) со степенью радиохимической чистоты более 98%, определённой методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, который обеспечил соответствующую радиохроматограмму (фиг. 3).

Радиофармацевтический препарат остаётся стабильным при степени радиохимической чистоты более 95% в течение 24 ч после мечения. In-vitro определение стабильности в сыворотке крови человека показало наличие связывания с сывороточными белками со степенью равной 8,3±2.1% и высокую радиохимическую стабильность (>90%). Аффинность связывания HYNIC-iPSMA, определённая путём изучения компетентности раковых клеток, позитивных в отношении белка PSMA (LNCaP), показала, что величина IC₅₀ составляла 2,9±0,7 нМ.

Это соединение не проявляло токсичности или вредного воздействия, когда его вводили в дозе 40 мг/кг лабораторным мышам линии BALB-C. Определение биораспределения ^99mTc-EDDA/HYNICiPSMA у бестимусных мышей с индуцированными LNCaP опухолями показало захват опухолями 8,7±1,3% активности, введённой на 1 г ткани (% ID/г) в основном с удалением почечным путём. Тесты по биокинетике и дозиметрии, проведённые у здоровых добровольцев, показали наличие быстрого клиренса из крови с большим захватом и удалением почечным путём, меньшим захватом печенью и большим захватом в паращитовидной железе, слюнной и слёзной железе со средней эффективной дозой 4±2 м³ в на 740 МБк введённой активности. На фиг. 4 показаны результаты сканирования методом SPECT радиофармацевтического препарата ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA у здорового добровольца. На фиг. 5 показаны результаты сканирования методом SPECT радиофармацевтического препарата ^99mTc-EDDA/HYNICiPSMA у пациента с раком предстательной железы, подтверждающие способность радиофармацевтического препарата обнаруживать in vivo PSMA, сверхэкспрессированный в клетках рака предстательной железы. Наконец, на фиг. 6 показаны результаты сканирования методами PET и SPECT этого же пациента с метастатическим раком предстательной железы на поздней стадии, которому вводили и ⁶⁸Ga-PSMA617 (PET), и ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA (SPECT), которые свидетельствуют, что оба радиофармацевтических препарата обнаруживают опухоли и метастазы рака предстательной железы с высокой чувствительностью, ассоциированной с распознаванием сверхэкспрессии PSMA. Это подтверждает и является основным доказательством того, что благодаря высокой аффинности, обусловленной липофильностью введённой молекулы HYNIC, ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA способен обеспечить высокую чувствитель- 4 040690 ность, равную чувствительности PET радионуклидов при детекции очагов опухолевого поражения, которые сверхэкспрессируют PSMA.

В заключение можно указать, что получен препарат ^99mTc-EDDA/HYNIC-iPSMA со следующими характеристиками:

со степенью радиохимической чистоты более 95%, со способностью радиофармацевтического препарата обнаруживать, in vivo и специфически, опухоли, которые сверхэкспрессируют простатспецифический мембранный антиген, методом однофотонной эмиссионной томографии (SPECT) в медицинской радиологии.

В дополнение к молекулярному распознаванию последовательности Glu-NH-CO-NH- патентуемого радиофармацевтического препарата, основанного на ^99mTc, он обладает способностью в значительной степени связываться и обнаруживать с высокой чувствительностью опухоли и метастазы в случае наличия рака предстательной железы благодаря повышенной липофильности, обеспеченной наличием молекулы гидразиноникотинамида (HYNIC), которая позволяет эффективно взаимодействовать при сочетании с гидрофобным активным сайтом фермента PSMA для детекции с применением метода SPECT.

Claims (3)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы
2. 2. Соединение формулы
3. 3. Состав для получения соединения по п.2, содержащий 10 мг этилендиаминдиуксусной кислоты (EDDA), 20 мг трицина, 20 мкг двухлористого олова, 50 мг маннита и 37,5 мкг соединения HYNICiPSMA по п.1.