EA040597B1 - METHOD FOR SEPARATING LIPIDS FROM LYSED LIPID-CONTAINING BIOMASS - Google Patents
METHOD FOR SEPARATING LIPIDS FROM LYSED LIPID-CONTAINING BIOMASS Download PDFInfo
- Publication number
- EA040597B1 EA040597B1 EA202090501 EA040597B1 EA 040597 B1 EA040597 B1 EA 040597B1 EA 202090501 EA202090501 EA 202090501 EA 040597 B1 EA040597 B1 EA 040597B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- acetone
- biomass
- cells
- oil
- suspension
- Prior art date
Links
Description
Настоящее изобретение относится к способу отделения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, от липидосодержащей биомассы, с применением ацетона.The present invention relates to a method for separating lipids containing polyunsaturated fatty acids from lipid-containing biomass using acetone.
Липиды, содержащие PUFA (полиненасыщенные жирные кислоты), представляют высокий интерес в кормовой, пищевой и фармацевтической промышленности. Вследствие чрезмерного вылова рыбы существует большая необходимость в альтернативных источниках липидов, содержащих PUFA, помимо рыбьего жира. Оказалось, что также некоторые штаммы дрожжей и водорослей, в частности клетки микроводорослей, например из отряда Thraustochytriales, являются очень хорошим источником липидов, содержащих PUFA.Lipids containing PUFAs (polyunsaturated fatty acids) are of high interest in the feed, food and pharmaceutical industries. Due to overfishing, there is a great need for alternative sources of PUFA-containing lipids other than fish oil. It also turned out that some strains of yeast and algae, in particular microalgae cells, for example from the order Thraustochytriales, are a very good source of PUFA-containing lipids.
Но в отношении микробных организмов и, в частности, клеток организмов из отряда Thraustochytriales, которые продуцируют липиды, содержащие PUFA, выделение масла из клеток оказалось особенной проблемой. Наиболее эффективным методом выделения масла являлось применение органических растворителей, подобных гексану. Но применение органических растворителей, подобных гексану, приводит к формированию опасных условий работы, требует применения дорогостоящего взрывобезопасного оборудования и для него необходимо внедрение дорогостоящего способа регенерации растворителя во избежание загрязнения окружающей среды.But in relation to microbial organisms and, in particular, cells of organisms from the order Thraustochytriales, which produce lipids containing PUFA, the release of oil from cells has proved to be a particular problem. The most efficient method for oil extraction was the use of organic solvents like hexane. But the use of organic solvents like hexane results in hazardous operating conditions, requires expensive explosion-proof equipment, and requires an expensive solvent recovery process to avoid environmental pollution.
В попытке избежать применения органических растворителей, которые приводят к формированию опасных условий работы, в качестве эффективного альтернативного пути выделения масла было обнаружено высаливание масла с помощью больших количеств хлорида натрия. Но применение больших количеств хлорида натрия приводит к образованию побочного продукта, представляющего собой делипидизированную биомассу, который по причине высокого содержания соли невозможно применять в качестве кормового ингредиента, поэтому способ является недостаточно рациональным. Кроме того, высокая концентрация соли приводит к быстрой коррозии применяемого оборудования из стали.In an attempt to avoid the use of organic solvents, which lead to hazardous operating conditions, salting out the oil with large amounts of sodium chloride has been found to be an effective alternative to oil recovery. But the use of large amounts of sodium chloride leads to the formation of a by-product, which is a delipidized biomass, which, due to the high salt content, cannot be used as a feed ingredient, so the method is not rational enough. In addition, high salt concentration leads to rapid corrosion of steel equipment used.
Таким образом, целью настоящего изобретения являлось обеспечить эффективный способ выделения липида, в частности липида, содержащего PUFA, из липидосодержащих клеток, в частности организмов из отряда Thraustochytriales, и одновременно избежать необходимости не только в органических растворителях, которые приводят к формированию опасных условий работы, но дополнительно избежать необходимости в высоких количествах солей для осуществления эффективного выделения масла из клеток.Thus, the aim of the present invention was to provide an efficient method for isolating lipid, in particular lipid containing PUFA, from lipid-containing cells, in particular organisms from the order Thraustochytriales, and at the same time avoid the need not only for organic solvents, which lead to hazardous working conditions, but additionally avoid the need for high amounts of salts to effect efficient oil extraction from the cells.
Дополнительной целью настоящего изобретения являлось обеспечить способ выделения липида, в частности липида, содержащего PUFA, из липидосодержащих клеток, в частности организмов из отряда Thraustochytriales, и одновременно обеспечить получение делипидизированной биомассы, которую можно применять коммерческим образом, предпочтительно в области сельского хозяйства.A further object of the present invention was to provide a method for isolating a lipid, in particular a lipid containing PUFA, from lipid-containing cells, in particular organisms from the order Thraustochytriales, and at the same time to provide a delipidized biomass that can be used commercially, preferably in the field of agriculture.
Оказалось, что очень эффективное отделение липидов от клеточного дебриса, содержащего водную фазу, можно осуществлять, если в качестве растворителя для выделения масла из биомассы применять ацетон. В отличие от гексана, ацетон не приводит к формированию опасных условий работы, и его дополнительным преимуществом оказалось то, что его можно легко удалить после выделения масла из лизированной биомассы. Благодаря его неожиданно простому отделению и регенерации, ацетон можно повторно использовать в способе и, таким образом, предусматривается рациональный экологический способ выделения по настоящему изобретению.It turned out that a very effective separation of lipids from cell debris containing an aqueous phase can be carried out if acetone is used as a solvent for separating oil from biomass. Unlike hexane, acetone does not generate hazardous operating conditions and has the added benefit of being easily removed after the oil has been isolated from the lysed biomass. Due to its surprisingly easy separation and recovery, acetone can be reused in the process and thus provides a rational environmental recovery method of the present invention.
Дополнительным преимуществом предложенного способа по сравнению со способами выделения масла, которые раскрыты в уровне техники, является то, что его можно осуществить достаточно быстро, в частности, также при нейтральных значениях рН, т.е. способ является менее затратным и занимает меньше времени по сравнению с текущими способами выделения масла, раскрытыми в уровне техники.An additional advantage of the method according to the invention compared to the oil recovery methods disclosed in the prior art is that it can be carried out rather quickly, in particular also at neutral pH values, i.e. the method is less expensive and takes less time compared to the current oil recovery methods disclosed in the prior art.
Таким образом, первый объект настоящего изобретения представляет собой способ отделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), от дебриса биомассы, предусматривающий следующие стадии:Thus, the first object of the present invention is a method for separating a lipid containing polyunsaturated fatty acids (PUFA) from biomass debris, comprising the following steps:
а) получение суспензии биомассы, содержащей клетки, которые содержат липид, содержащий PUFA;a) obtaining a suspension of biomass containing cells that contain a lipid containing PUFA;
b) лизирование клеток биомассы;b) lysing the biomass cells;
c) добавление к суспензии, полученной на стадии (b), ацетона до достижения конечного количества, составляющего от 25 до 47,5 вес.% ацетона;c) adding to the suspension obtained in stage (b), acetone to achieve a final amount of 25 to 47.5 wt.% acetone;
d) тщательное перемешивание суспензии, полученной на стадии (с);d) thorough mixing of the suspension obtained in step (c);
e) отделение легкой фазы, содержащей масло и ацетон, полученной на стадии (d), от тяжелой фазы, содержащей воду, ацетон, соль и клеточный дебрис.e) separating the light phase containing oil and acetone obtained in step (d) from the heavy phase containing water, acetone, salt and cell debris.
На стадии (с) предпочтительно добавляют ацетон до достижения конечного количества, составляющего от 27,5 до 45,0, в частности от 30,0 до 42,5, более предпочтительно от 30,0 до 40,0 вес.% ацетона.In step (c), acetone is preferably added until a final amount of 27.5 to 45.0, in particular 30.0 to 42.5, more preferably 30.0 to 40.0% by weight of acetone is reached.
Предпочтительно на стадиях (b), (с) и (d) способа суспензию непрерывно перемешивают с применением мешалки и/или перемешивающего устройства. На стадиях (с) и/или (d) способа предпочтительно применяют перемешивание с низким усилием сдвига и/или перемешивание в аксиальном направлении, в частности, как раскрыто в WO 2015/095694. Импеллеры, подходящие для перемешивания перед осуществлением стадий (с) и/или (d) и в ходе них, включают, в частности, импеллеры с прямыми лопастями,Preferably, in steps (b), (c) and (d) of the process, the suspension is continuously stirred using a stirrer and/or mixing device. In steps (c) and/or (d) of the process, low shear agitation and/or agitation in the axial direction is preferably used, in particular as disclosed in WO 2015/095694. Impellers suitable for mixing before and during steps (c) and/or (d) include, in particular, impellers with straight blades,
- 1 040597 лопастные импеллеры Раштона, аксиально-поточные мешалки, радиально-поточные мешалки, импеллеры с вогнутыми лопастями на диске, высокоэффективные импеллеры, пропеллерные мешалки, лопастные мешалки, турбинные мешалки и их комбинации.- 1 040597 Rushton paddle impellers, axial flow agitators, radial flow agitators, concave disc impellers, high efficiency impellers, propeller agitators, paddle agitators, turbine agitators and combinations thereof.
Предпочтительно обработку ацетоном, т.е. стадии (с)-(е), осуществляют при температуре от 10 до 50°С, более предпочтительно от 15 до 40°С, наиболее предпочтительно от 18 до 35°С, в частности, при температуре, приблизительно соответствующей комнатной.Preferably treatment with acetone, ie. steps (c)-(e) are carried out at a temperature of from 10 to 50°C, more preferably from 15 to 40°C, most preferably from 18 to 35°C, in particular at a temperature approximately corresponding to room temperature.
Лизирование клеток биомассы можно осуществлять с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, в частности ферментативно, механически, физически или химически, или путем применения их комбинаций.Lysing of biomass cells can be carried out using methods known to those skilled in the art, in particular enzymatically, mechanically, physically or chemically, or by using combinations thereof.
В зависимости от времени воздействия и/или степени применяемой силы, может быть получена композиция, содержащая исключительно лизированные клетки, или композиция, содержащая смесь клеточного дебриса и интактных клеток. Термин лизированная липидсодержащая биомасса в такой мере относится к суспензии, которая содержит воду, клеточный дебрис и масло, высвобожденные клетками биомассы, но, помимо этого, также может предусматривать дополнительные компоненты, в частности соли, интактные клетки, дополнительные количества лизированных клеток, а также компоненты ферментационной среды, в частности питательные вещества. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лишь небольшие количества интактных клеток, в частности менее 20%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% (относительно общего количества интактных клеток, присутствующих перед лизированием клеток биомассы) присутствуют в лизированной биомассе после стадии лизирования клеток.Depending on the exposure time and/or the degree of force applied, a composition containing only lysed cells or a composition containing a mixture of cell debris and intact cells can be obtained. The term lysed lipid-containing biomass thus refers to a suspension that contains water, cell debris and oil released by the cells of the biomass, but, in addition, may also include additional components, in particular salts, intact cells, additional amounts of lysed cells, as well as components fermentation medium, in particular nutrients. In a preferred embodiment of the present invention, only small amounts of intact cells, in particular less than 20%, preferably less than 10%, more preferably less than 5% (relative to the total number of intact cells present before cell biomass lyse) are present in the lysed biomass after the cell lysing step.
Лизирование клеток можно осуществлять, например, с применением пресса Френча для клеток, ультразвукового диспергатора, гомогенизатора, микрофлюидизатора, шаровой мельницы, стержневой мельницы, шаровой мельницы с галькой, бисерной мельницы, измельчающих валков с усиленной подачей, центробежно-ударной мельницы, промышленного измельчителя, смесителя с высоким усилием сдвига, лопастного смесителя и/или политронного гомогенизатора.Cell lysing can be carried out, for example, using French Cell Press, Ultrasonic Disperser, Homogenizer, Microfluidizer, Ball Mill, Rod Mill, Pebble Ball Mill, Bead Mill, Power Feed Grinding Rolls, Centrifugal Impact Mill, Industrial Grinder, Mixer high shear, paddle mixer and/or polytron homogenizer.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизирование клеток включает ферментативную обработку клеток с помощью применения фермента, разрушающего клеточные стенки.In a preferred embodiment of the present invention, lysing the cells comprises enzymatic treatment of the cells with the use of a cell wall degrading enzyme.
В соответствии с настоящим изобретением фермент, разрушающий клеточные стенки, предпочтительно выбран из протеаз, целлюлаз (например, Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), гемицеллюлаз, хитиназ, пектиназ (например, Pectinex (Novozymes)), сахараз, мальтаз, лактаз, альфа-глюкозидаз, бета-глюкозидаз, амилаз (например, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), лизоцимов, нейраминидаз, галактозидаз, альфа-маннозидаз, глюкуронидаз, гиалуронидаз, пуллуланаз, глюкоцереброзидаз, галактозилцерамидаз, ацетилгалктозаминидаз, фукозидаз, гексозаминидаз, идуронидаз, мальтаз-глюкоамилаз, ксиланаз (например, Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), бета-глюканаз (например, Vinoflow Max (Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), маннаназ и их комбинаций. Протеаза может быть выбрана из сериновых протеаз, треониновых протеаз, цистеиновых протеаз, аспартат-протеаз, металлопротеаз, глутаминовых протеаз, алкалаз (субтилизинов) и их комбинаций. Хитиназа может представлять собой хитотриозидазу. Пектиназа может быть выбрана из пектолиаз, пектозимов, полигалактуроназ и их комбинаций.According to the present invention, the cell wall degrading enzyme is preferably selected from proteases, cellulases (e.g. Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), hemicellulases , chitinases, pectinases (eg, Pectinex (Novozymes)), sucrases, maltase, lactase, alpha-glucosidases, beta-glucosidases, amylases (eg, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), lysozymes, neuraminidases, galactosidases, alpha -mannosidases, glucuronidases, hyaluronidases, pullulanases, glucocerebrosidases, galactosylceramidases, acetylgalktosaminidases, fucosidases, hexosaminidases, iduronidases, maltase-glucoamylases, xylanases (e.g. Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), beta-glucanases (e.g. Vinoflow Max ( Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), mannanase and combinations thereof. The protease may be selected from serine proteases, threonine proteases, cysteine proteases, aspartate proteases, metalloproteases, glutamine proteases, alcalases (subtilisins), and combinations thereof. The chitinase may be chitotriosidase. The pectinase may be selected from pectoliases, pectozymes, polygalacturonases, and combinations thereof.
Соответствующий уровень pH для использования фермента зависит от pH-оптимума фермента.The appropriate pH level for the use of the enzyme depends on the pH optimum of the enzyme.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют фермент с pHоптимумом, составляющим от 6,5 до 8,5, предпочтительно от 7,0 до 8,0, в частности приблизительно 7,5, таким образом, уровень pH, применяемый на данной стадии, составляет от 6,5 до 8,5, в частности от 7,0 до 8,0, предпочтительно от 7,3 до 7,7. Предпочтительный фермент, который можно применять в данном диапазоне pH, представляет собой алкалазу.In a preferred embodiment of the present invention, an enzyme is used with an optimum pH of 6.5 to 8.5, preferably 7.0 to 8.0, in particular about 7.5, thus the pH used in this step is 6.5 to 8.5, in particular 7.0 to 8.0, preferably 7.3 to 7.7. A preferred enzyme that can be used in this pH range is an alkalase.
Фермент предпочтительно добавляют в виде концентрированного ферментного раствора, предпочтительно в количестве от 0,01 до 1,5 вес.%, более предпочтительно в количестве от 0,03 до 1,0 вес.%, наиболее предпочтительно в количестве от 0,05 до 0,5 вес.% относительно количества добавляемого концентрированного ферментного раствора относительно общего количества суспензии после добавления концентрированного ферментного раствора.The enzyme is preferably added as a concentrated enzyme solution, preferably in an amount of 0.01 to 1.5% by weight, more preferably in an amount of 0.03 to 1.0% by weight, most preferably in an amount of 0.05 to 0 .5 wt.% relative to the amount of added concentrated enzyme solution relative to the total amount of suspension after adding concentrated enzyme solution.
В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизирование клеток осуществляют следующим образом:In a highly preferred embodiment of the present invention, cell lysis is carried out as follows:
i) нагревание суспензии (а) до температуры от 50 до 70°С, предпочтительно до температуры от 55 до 65°С, и добавление фермента, разрушающего клеточные стенки, к ферментационному бульону, и регулирование при необходимости pH до соответствующего значения, при котором фермент работает надлежащим образом;i) heating the suspension (a) to a temperature of 50 to 70°C, preferably to a temperature of 55 to 65°C, and adding a cell wall degrading enzyme to the fermentation broth, and adjusting, if necessary, the pH to an appropriate value at which the enzyme works properly;
ii) поддержание температуры и pH в диапазонах, указанных в (i), в течение по меньшей мере одного часа, предпочтительно в течение по меньшей мере двух часов, более предпочтительно в течение периода от двух до четырех часов.ii) maintaining the temperature and pH in the ranges indicated in (i) for at least one hour, preferably for at least two hours, more preferably for a period of two to four hours.
На стадии (i) фермент можно добавлять до или после нагревания суспензии и/или до или после регулирования уровня pH. Аналогично нагревание суспензии можно осуществлять до или после регулиро- 2 040597 вания уровня pH. Однако в предпочтительном варианте осуществления фермент добавляют после нагревания суспензии и после регулирования уровня pH, если регулирование уровня pH вообще является необходимым. В очень предпочтительном варианте осуществления все действия осуществляют более или менее одновременно.In step (i), the enzyme can be added before or after heating the slurry and/or before or after adjusting the pH. Similarly, heating the slurry can be done before or after adjusting the pH. However, in a preferred embodiment, the enzyme is added after heating the slurry and after pH adjustment, if pH adjustment is necessary at all. In a highly preferred embodiment, all actions are carried out more or less simultaneously.
Предпочтительно на стадиях (i) и (ii) суспензию непрерывно перемешивают с применением мешалки и/или перемешивающего устройства.Preferably, in steps (i) and (ii), the suspension is continuously stirred using a stirrer and/or mixing device.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделение масла осуществляют в отношении суспензии, характеризующейся содержанием сухого вещества от 30 до 60 вес.%, предпочтительно от 35 до 55 вес.%, в частности от 40 до 50 вес.%. Это можно осуществлять либо путем получения суспензии с соответственно высоким содержанием биомассы на стадии (а), либо путем концентрирования суспензии, полученной путем лизирования клеток биомассы на стадии (b). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, после лизирования клеток биомассы и перед добавлением ацетона суспензию концентрируют до общего содержания сухого вещества, составляющего от 30 до 60 вес.%, более предпочтительно от 35 до 55 вес.%, в частности от 40 до 50 вес.%.In a preferred embodiment of the present invention, the oil recovery is carried out on a suspension having a dry matter content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight, in particular 40 to 50% by weight. This can be done either by obtaining a suspension with a correspondingly high biomass content in step (a) or by concentrating the suspension obtained by lysing the biomass cells in step (b). Thus, in a preferred embodiment of the present invention, after lysing the biomass cells and before adding acetone, the suspension is concentrated to a total dry matter content of 30 to 60% by weight, more preferably 35 to 55% by weight, in particular 40 to 50 wt%.
Концентрирование суспензии предпочтительно осуществляют путем выпаривания воды при температуре не выше 100°С, предпочтительно от 70 до 100°С, более предпочтительно от 80 до 90°С, до достижения общего содержания сухого вещества от 30 до 60 вес.%, более предпочтительно от 35 до 55 вес.%, в частности от 40 до 50 вес.%.The concentration of the slurry is preferably carried out by evaporating the water at a temperature not exceeding 100° C., preferably 70 to 100° C., more preferably 80 to 90° C., until a total solids content of 30 to 60 wt % is reached, more preferably 35 up to 55 wt.%, in particular from 40 to 50 wt.%.
Концентрирование суспензии предпочтительно осуществляют в выпарном аппарате с принудительной циркуляцией (например, доступном от GEA, Германия) с обеспечением быстрого удаления воды.The concentration of the slurry is preferably carried out in a forced circulation evaporator (eg available from GEA, Germany) to ensure that the water is removed quickly.
Выделение масла из лизированной биомассы с помощью ацетона в основном работает в широком диапазоне значений pH. Но поскольку выделение масла лучше работает при кислых значениях pH, в частности, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделение масла проводят при кислых значениях pH, в частности при значениях pH от 2,5 до 6,8, более предпочтительно при значениях pH от 3,0 до 6,0. Таким образом, при необходимости, в этом особенно предпочтительном варианте осуществления значения pH регулируют до значения, составляющего от 2,5 до 6,8, в частности от 3,0 до 6,0, перед добавлением ацетона.The extraction of oil from lysed biomass with acetone generally works over a wide range of pH values. But since oil recovery works better at acidic pH values, in particular, in a preferred embodiment of the present invention, oil recovery is carried out at acidic pH values, in particular at pH values from 2.5 to 6.8, more preferably at pH values from 3, 0 to 6.0. Thus, if necessary, in this particularly preferred embodiment, the pH values are adjusted to a value of 2.5 to 6.8, in particular 3.0 to 6.0, before the addition of acetone.
В частности, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделение масла проводят при значениях pH от 2,5 до 4,0, более предпочтительно при значениях pH от 2,5 до 3,5.In particular, in a preferred embodiment of the present invention, the oil recovery is carried out at pH values from 2.5 to 4.0, more preferably at pH values from 2.5 to 3.5.
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделение масла проводят при значениях pH от 5,0 до 6,0.In another particularly preferred embodiment of the present invention, the oil recovery is carried out at pH values from 5.0 to 6.0.
В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделение масла проводят при значениях pH от 7,5 до 8,5.In a further particularly preferred embodiment of the present invention, the oil recovery is carried out at pH values from 7.5 to 8.5.
В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделение масла проводят при значениях pH от 10,0 до 11,0.In a further particularly preferred embodiment of the present invention, the oil recovery is carried out at pH values from 10.0 to 11.0.
В целом регулирование значения pH можно осуществлять в соответствии с настоящим изобретением путем применения либо оснований, либо кислот, известных специалистам в данной области техники. Уменьшение уровня pH можно проводить, в частности, путем применения органических или неорганических кислот, таких как серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, борная кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, перхлорная кислота, гипохлористая кислота, хлористая кислота, фторсерная кислота, гексафторфосфорная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, муравьиная кислота, или их комбинаций. Поскольку желательно избегать высокого содержания хлорида, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в способе по настоящему изобретению не применяют хлористоводородную кислоту или применяют лишь небольшие ее количества. В соответствии с настоящим изобретением серная кислота представляет собой предпочтительное вещество для уменьшения значения pH. Увеличение значения pH можно осуществлять, в частности, путем применения органических или неорганических оснований, таких как гидроксиды, в частности гидроксид натрия, гидроксид лития, гидроксид калия и/или гидроксид кальция, карбонаты, в частности карбонат натрия, карбонат калия или карбонат магния, и/или бикарбонаты, в частности бикарбонат лития, бикарбонат натрия и/или бикарбонат калия. Вследствие легкости использования кислоты и основания предпочтительно применяют в жидкой форме, в частности в виде концентрированных растворов, при этом концентрация кислоты или основания в растворе предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 55 вес.%, в частности в диапазоне от 20 до 50 вес.%.In general, pH adjustment can be carried out in accordance with the present invention by using either bases or acids known to those skilled in the art. The pH can be reduced in particular by using organic or inorganic acids such as sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, boric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, perchloric acid, hypochlorous acid, chlorous acid, fluorosulphic acid, hexafluorophosphoric acid , acetic acid, citric acid, formic acid, or combinations thereof. Since it is desirable to avoid high levels of chloride, in a preferred embodiment of the present invention no or only small amounts of hydrochloric acid are used in the process of the present invention. In accordance with the present invention, sulfuric acid is the preferred pH lowering agent. The increase in pH can be carried out in particular by using organic or inorganic bases such as hydroxides, in particular sodium hydroxide, lithium hydroxide, potassium hydroxide and/or calcium hydroxide, carbonates, in particular sodium carbonate, potassium carbonate or magnesium carbonate, and /or bicarbonates, in particular lithium bicarbonate, sodium bicarbonate and/or potassium bicarbonate. Due to the ease of use, the acids and bases are preferably used in liquid form, in particular in the form of concentrated solutions, the concentration of the acid or base in solution being preferably in the range from 10 to 55% by weight, in particular in the range from 20 to 50% by weight. .
Способ в соответствии с настоящим изобретением в качестве дополнительной стадии включает отделение легкой фазы, содержащей масло и ацетон, полученной на стадии (d), от тяжелой фазы, содержащей воду, ацетон, соль и клеточный дебрис.The process according to the present invention comprises, as an additional step, separating the light phase containing oil and acetone obtained in step (d) from the heavy phase containing water, acetone, salt and cellular debris.
Отделение легкой фазы от тяжелой фазы предпочтительно осуществляют с помощью механических средств и предпочтительно при температуре 10-50°С, более предпочтительно 15-40°С, наиболее предпочтительно 18-35°С, в частности при температуре, приблизительно соответствующей комнатной. Термин механические средства, в частности, относится к способам фильтрации и центрифугирования, известным специалистам в данной области техники.The separation of the light phase from the heavy phase is preferably carried out by mechanical means and preferably at a temperature of 10-50°C, more preferably 15-40°C, most preferably 18-35°C, in particular at a temperature approximately corresponding to room temperature. The term mechanical means specifically refers to filtration and centrifugation methods known to those skilled in the art.
- 3 040597- 3 040597
Отделение легкой фазы от тяжелой фазы можно проводить при значениях pH, присутствующих в суспензии, полученной на стадии (d). Но предпочтительное отделение легкой фазы от тяжелой фазы проводят при значениях pH от 5,5 до 8,5, более предпочтительно от 6,0 до 8,0, в частности от 6,5 до 7,5. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения перед осуществлением отделения легкой фазы от тяжелой фазы значение pH регулируют, как показано выше.The separation of the light phase from the heavy phase can be carried out at the pH values present in the suspension obtained in step (d). But the preferred separation of the light phase from the heavy phase is carried out at pH values from 5.5 to 8.5, more preferably from 6.0 to 8.0, in particular from 6.5 to 7.5. Thus, in a preferred embodiment of the present invention, before the separation of the light phase from the heavy phase is carried out, the pH value is adjusted as shown above.
После отделения легкой фазы, содержащей масло и ацетон, ацетон можно легко отделить от масла, содержащего PUFA, путем испарения растворителя. Неожиданно, испарение растворителя работает настолько эффективно, что в масле не остается выявляемых количеств ацетона.After separation of the light phase containing oil and acetone, acetone can be easily separated from the oil containing PUFA by evaporating the solvent. Surprisingly, solvent evaporation works so efficiently that no detectable amounts of acetone remain in the oil.
Отделение растворителя предпочтительно осуществляют при температуре от 40 до 56°С и предпочтительно при пониженном давлении, составляющем менее 500 мбар, в частности менее 200 мбар, что можно реализовать с помощью вакуумного насоса. В качестве альтернативы или дополнения, ацетон можно отделять от масла путем воздействия на легкую фазу током инертного газа, предпочтительно азота.The separation of the solvent is preferably carried out at a temperature of 40 to 56° C. and preferably under a reduced pressure of less than 500 mbar, in particular less than 200 mbar, which can be realized with a vacuum pump. Alternatively or in addition, acetone can be separated from the oil by exposing the light phase to a stream of an inert gas, preferably nitrogen.
В дальнейшем очищенное масло, полученное таким образом, можно дополнительно обрабатывать путем применения способов, известных специалистам в данной области техники, в частности рафинирования, обесцвечивания, дезодорирования и/или вымораживания.Further, the refined oil thus obtained can be further processed by applying methods known to those skilled in the art, in particular refining, bleaching, deodorizing and/or freezing.
Особенное преимущество способа по настоящему изобретению заключается в том, что его можно осуществлять без применения каких-либо токсичных органических растворителей, подобных гексану, поэтому данный метод является безвредным для окружающей среды.A particular advantage of the method of the present invention is that it can be carried out without the use of any toxic organic solvents like hexane, so that the method is environmentally friendly.
Дополнительное преимущество способа по настоящему изобретению заключается в том, что можно реализовать очень эффективное отделение масла от оставшейся биомассы без добавления хлорида натрия, который обычно применяют для высаливания масла из биомассы. Предпочтительно способ можно осуществлять вообще без добавления хлоридных солей, наиболее предпочтительно без добавления каких-либо солей для высаливания масла. Однако небольшие количества хлоридных солей, в частности хлорида натрия, могут присутствовать в суспензии из-за ферментационной среды, применяемой для выращивания биомассы.An additional advantage of the method of the present invention is that a very efficient separation of oil from the remaining biomass can be realized without the addition of sodium chloride, which is usually used to salt out oil from biomass. Preferably, the process can be carried out without the addition of chloride salts at all, most preferably without the addition of any salts to salt out the oil. However, small amounts of chloride salts, in particular sodium chloride, may be present in the slurry due to the fermentation medium used to grow the biomass.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения не применяют хлорид натрия или применяют лишь небольшие его количества для улучшения выделения масла. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для выделения масла из биомассы применяют менее 1 вес.% хлорида натрия, более предпочтительно применяют менее 0,5 или 0,2 вес.% хлорида натрия, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 вес.%, при этом вес.% относится к общему весу композиции после добавления хлорида натрия. В частности, в случае данного варианта осуществления это означает, что суспензия, применяемая в способе в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно содержит хлорид натрия в количестве менее 2 вес.%, более предпочтительно менее 1 вес.%, в частности менее 0,5 или 0,3 вес.%, наиболее предпочтительно в количестве менее 0,1 или 0,05 вес.%.Thus, in a preferred embodiment of the present invention, no or only small amounts of sodium chloride are used to improve oil recovery. In a preferred embodiment of the present invention, less than 1 wt% sodium chloride is used to extract oil from the biomass, more preferably less than 0.5 or 0.2 wt% sodium chloride is used, most preferably less than 0.1 or 0.05 wt% , while wt.% refers to the total weight of the composition after the addition of sodium chloride. In particular, in the case of this embodiment, this means that the suspension used in the method according to the present invention preferably contains sodium chloride in an amount of less than 2 wt.%, more preferably less than 1 wt.%, in particular less than 0.5 or 0.3 wt.%, most preferably in an amount of less than 0.1 or 0.05 wt.%.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вообще не применяют хлоридных солей или применяют лишь небольшие их количества для улучшения выделения масла. В данном варианте осуществления для выделения масла из биомассы применяют предпочтительно менее 1 вес.% хлоридных солей, более предпочтительно менее 0,5 или 0,2 вес.% хлоридных солей, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 вес.%, при этом вес.% относится к общему весу композиции после добавления хлоридных солей. В частности, в случае данного варианта осуществления это означает, что суспензия, применяемая в способе в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно содержит хлорид, в частности хлоридные соли, в количестве менее 2 вес.%, более предпочтительно менее 1 вес.%, в частности менее 0,5 или 0,3 вес.%, наиболее предпочтительно в количестве менее 0,1 или 0,05 вес.%.In a particularly preferred embodiment of the present invention no chloride salts are used at all or only small amounts are used to improve oil recovery. In this embodiment, preferably less than 1 wt. % chloride salts, more preferably less than 0.5 or 0.2 wt. % chloride salts, most preferably less than 0.1 or 0.05 wt. this wt.% refers to the total weight of the composition after the addition of chloride salts. In particular, in the case of this embodiment, this means that the suspension used in the process according to the invention preferably contains chloride, in particular chloride salts, in an amount of less than 2% by weight, more preferably less than 1% by weight, in particular less than 0.5 or 0.3% by weight, most preferably less than 0.1 or 0.05% by weight.
В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, как правило, не применяют солей или применяют лишь небольшие их количества для улучшения выделения масла. В данном варианте осуществления для выделения масла из биомассы применяют предпочтительно менее 1 вес.% солей, более предпочтительно применяют менее 0,5 или 0,2 вес.% солей, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 вес.%, при этом весовой процент относится к общему весу композиции после добавления солей. В частности, в случае данного варианта осуществления это означает, что суспензия, применяемая в способе в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно содержит соли в целом в количестве, составляющем менее 2 вес.%, более предпочтительно менее 1 вес.%, в частности менее 0,5 или 0,3 вес.%, наиболее предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,1 или 0,05 вес.%.In a highly preferred embodiment of the present invention, salts are generally not used or only small amounts are used to improve oil recovery. In this embodiment, less than 1 wt.% salts is used to extract oil from the biomass, more preferably less than 0.5 or 0.2 wt.% salts are used, most preferably less than 0.1 or 0.05 wt.%, while weight percent refers to the total weight of the composition after the addition of salts. In particular, in the case of this embodiment, this means that the suspension used in the process according to the present invention preferably contains salts in total in an amount of less than 2% by weight, more preferably less than 1% by weight, in particular less than 0 .5 or 0.3 wt.%, most preferably in an amount of less than 0.1 or 0.05 wt.%.
Способы по настоящему изобретению обеспечивают очень эффективное отделение масла, содержащегося в биомассе, от клеточного дебриса и других веществ, содержащихся в ферментационном бульоне. Путем применения способов по настоящему изобретению можно отделить от биомассы и выделить предпочтительно более 80 вес.%, в частности более 90 вес.% масла, содержащегося в биомассе.The methods of the present invention provide a very efficient separation of the oil contained in the biomass from cell debris and other substances contained in the fermentation broth. By using the methods of the present invention, preferably more than 80% by weight, in particular more than 90% by weight of the oil contained in the biomass can be separated from the biomass and recovered.
Хлорид в соответствии с настоящим изобретением относится к количеству выявляемого хлора. Количество присутствующего хлора можно определять с помощью, например, элементного анализа вChloride in accordance with the present invention refers to the amount of detectable chlorine. The amount of chlorine present can be determined using, for example, elemental analysis in
- 4 040597 соответствии с DIN EN ISO 11885. Хлор присутствует в форме солей, которые называются хлоридами.- 4 040597 in accordance with DIN EN ISO 11885. Chlorine is present in the form of salts called chlorides.
Содержание хлорида, упомянутого в соответствии с настоящим изобретением, также называемого хлорид-ионами, относится исключительно к количеству выявляемого хлора, а не к количеству всей хлоридной соли, которая содержит, помимо хлорид-иона, также катионный противоион.The content of chloride mentioned in accordance with the present invention, also called chloride ions, refers solely to the amount of detectable chlorine, and not to the amount of the total chloride salt, which contains, in addition to the chloride ion, also a cationic counterion.
Способ в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать в качестве стадии предварительной обработки пастеризацию суспензии биомассы перед осуществлением лизиса клеток. Пастеризацию предпочтительно осуществляют в течение периода времени, составляющего от 5 до 120 мин, в частности от 20 до 100 мин, при температуре от 50 до 121°С, в частности от 50 до 70°С.The method according to the present invention may further comprise, as a pre-treatment step, pasteurizing the biomass suspension prior to cell lysis. The pasteurization is preferably carried out for a period of 5 to 120 minutes, in particular 20 to 100 minutes, at a temperature of 50 to 121°C, in particular 50 to 70°C.
Клетки биомассы, содержащие PUFA, предпочтительно представляют собой микробные клетки или клетки растений. Предпочтительно, клетки способны к продуцированию PUFA благодаря поликетидсинтазной системе. Поликетидсинтазная система может представлять собой эндогенную систему или, благодаря генетической инженерии, экзогенную систему.The biomass cells containing PUFA are preferably microbial or plant cells. Preferably, the cells are capable of producing PUFA through the polyketide synthase system. The polyketide synthase system may be an endogenous system or, through genetic engineering, an exogenous system.
Клетки растений, в частности, могут быть выбраны из клеток организмов из семейств Brassicaceae, Elaeagnaceae и Fabaceae. Клетки организмов семейства Brassicaceae могут быть выбраны из таковых рода Brassica, в частности из таковых масличного рапса, масличной репы и горчицы сарептской; клетки организмов семейства Elaeagnaceae могут быть выбраны из таковых рода Elaeagnus, в частности из таковых вида Oleae europaea; клетки организмов семейства Fabaceae могут быть выбраны из таковых рода Glycine, в частности из таковых вида Glycine max.Plant cells may in particular be selected from cells of organisms from the Brassicaceae, Elaeagnaceae and Fabaceae families. Cells of organisms of the family Brassicaceae can be selected from those of the genus Brassica, in particular from those of oilseed rape, oilseed turnip and Sarepta mustard; cells of organisms of the family Elaeagnaceae can be selected from those of the genus Elaeagnus, in particular from those of the species Oleae europaea; cells of organisms of the family Fabaceae can be selected from those of the genus Glycine, in particular from those of the species Glycine max.
Микробные организмы, которые содержат липид, содержащий PUFA, широко описаны в уровне техники. В данном контексте применяемые клетки могут, в частности, представлять собой клетки, которые естественным образом уже продуцируют PUFA (полиненасыщенные жирные кислоты); однако они также могут представлять собой клетки, которые в результате осуществления подходящих способов генетической инженерии или вследствие случайного мутагенеза демонстрируют улучшенное продуцирование PUFA, или их вообще сделали способными к продуцированию PUFA. Продуцирование PUFA может быть ауксотрофным, миксотрофным или гетеротрофным.Microbial organisms that contain a lipid containing PUFA are widely described in the prior art. In this context, the cells used may in particular be cells which naturally already produce PUFAs (polyunsaturated fatty acids); however, they may also be cells that, as a result of appropriate genetic engineering techniques or random mutagenesis, show improved PUFA production, or are rendered capable of PUFA production at all. PUFA production can be auxotrophic, mixotrophic, or heterotrophic.
Биомасса предпочтительно содержит клетки, которые продуцируют PUFA гетеротрофно. Клетки в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбраны из водорослей, грибов, в частности дрожжей, бактерий или простейших. Более предпочтительно клетки представляют собой одноклеточные водоросли или грибы.The biomass preferably contains cells that produce PUFA heterotrophically. The cells according to the invention are preferably selected from algae, fungi, in particular yeasts, bacteria or protozoa. More preferably, the cells are unicellular algae or fungi.
Подходящие клетки продуцирующих масло дрожжей представляют собой, в частности, таковые штаммов Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon и Lipomyces.Suitable oil-producing yeast cells are, in particular, those of Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon and Lipomyces strains.
Подходящие клетки продуцирующих масло микроводорослей и подобных водорослям микроорганизмов представляют собой, в частности, клетки микроорганизмов, выбранных из типа Stramenopiles (также называемого Heterokonta). Микроорганизмы типа Stramenopiles, в частности, могут быть выбраны из следующих групп микроорганизмов: Hamatores, протеромонады, опалины, Developayella, Diplophrys, лабиринтулиды, траустохитриды, Biosecids, оомицеты, гифохитриомицеты, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, диатомовые водоросли, ксантофиты, феофиты (бурые водоросли), эустигматофиты, рафидофиты, синуриды, аксодины (включая Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales и Chromulinales. Другие предпочтительные группы микроводорослей включают членов группы зеленых водорослей и динофлагеллятов, включая членов из рода Crypthecodium.Suitable cells of oil-producing microalgae and algae-like microorganisms are, in particular, cells of microorganisms selected from the genus Stramenopiles (also called Heterokonta). Microorganisms of the Stramenopiles type may in particular be selected from the following groups of microorganisms: Hamatores, Proteromonas, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labyrinthulidae, Traustochythrids, Biosecids, Oomycetes, Hyphochitriomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatoms algae, xanthophytes, pheophytes (brown algae), eustigmatophytes, rafidophytes, sinurids, axodins (including Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales and Chromulinales. Other preferred groups of microalgae include members of the green algae group and dinoflagellates, including members of the genus Crypthecodium.
Биомасса в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит клетки организмов из таксона Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, лабиринтуломицетовые грибы, лабиринтулы), в частности клетки организмов из семейства Thraustochytriaceae, и предпочтительно по сути состоит из таких клеток. Семейство Thraustochytriaceae (траустохитриды) включает роды Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium и Ulkenia. Биомасса, в частности, предпочтительно содержит клетки организмов из родов Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium или Thraustochytrium, главным образом организмы из рода Schizochytrium.The biomass according to the invention preferably contains cells of organisms from the taxon Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, labyrinthulomycete fungi, labyrinthules), in particular cells of organisms from the family Thraustochytriaceae, and preferably essentially consists of such cells. The family Thraustochytriaceae (traustochytrids) includes the genera Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium and Ulkenia. The biomass particularly preferably contains cells from organisms of the genera Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium or Thraustochytrium, especially organisms from the genus Schizochytrium.
В соответствии с настоящим изобретением полиненасыщенная жирная кислота (PUFA) предпочтительно представляет собой высоконенасыщенную жирную кислоту (HUFA).In accordance with the present invention, the polyunsaturated fatty acid (PUFA) is preferably a highly unsaturated fatty acid (HUFA).
Клетки, присутствующие в биомассе, предпочтительно характеризуются тем, что они содержат по меньшей мере 20% по весу, предпочтительно по меньшей мере 30% по весу, в частности по меньшей мере 35% по весу PUFA, в каждом случае в пересчете на сухое вещество клеток.The cells present in the biomass are preferably characterized in that they contain at least 20% by weight, preferably at least 30% by weight, in particular at least 35% by weight of PUFA, in each case based on the dry matter of the cells .
В соответствии с настоящим изобретением термин липид включает фосфолипиды; свободные жирные кислоты; сложные эфиры жирных кислот; триацилглицерины; стерины и сложные эфиры стеринов; каротиноиды; ксантофилы (например, оксикаротиноиды); углеводороды; полученные из изопреноидов соединения и другие липиды, известные специалисту в данной области техники. Термины липид и масло применяют взаимозаменяемо в соответствии с настоящим изобретением.In accordance with the present invention, the term lipid includes phospholipids; free fatty acids; esters of fatty acids; triacylglycerols; sterols and esters of sterols; carotenoids; xanthophylls (eg oxycarotenoids); hydrocarbons; isoprenoid-derived compounds; and other lipids known to the person skilled in the art. The terms lipid and oil are used interchangeably in accordance with the present invention.
В предпочтительном варианте осуществления большинство липидов в данном случае присутствует в форме триглицеридов, при этом предпочтительно по меньшей мере 50% по весу, в частности по меньшей мере 75% по весу, и в особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90%In a preferred embodiment, the majority of lipids are present in the form of triglycerides, with preferably at least 50% by weight, in particular at least 75% by weight, and in a particularly preferred embodiment at least 90%
- 5 040597 по весу присутствующих липидов присутствуют в клетке в форме триглицеридов.- 5 040597 by weight of the lipids present are present in the cell in the form of triglycerides.
В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) означают жирные кислоты, имеющие по меньшей мере две, в частности по меньшей мере три двойные С-С-связи. В соответствии с настоящим изобретением высоконенасыщенные жирные кислоты (HUFA) являются предпочтительными среди PUFA. В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что HUFA означают жирные кислоты, имеющие по меньшей мере четыре двойные СС-связи.In accordance with the present invention, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are understood to mean fatty acids having at least two, in particular at least three C-C double bonds. In accordance with the present invention, highly unsaturated fatty acids (HUFAs) are preferred among PUFAs. In accordance with the present invention, HUFAs are meant to mean fatty acids having at least four CC double bonds.
PUFA могут присутствовать в клетке в свободной форме или в связанной форме. Примеры наличия в связанной форме представляют собой фосфолипиды и сложные эфиры PUFA, в частности моноацил-, диацил- и триацилглицериды. В предпочтительном варианте осуществления большинство PUFA присутствует в форме триглицеридов, при этом предпочтительно по меньшей мере 50% по весу, в частности по меньшей мере 75% по весу, и в особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90% по весу присутствующих PUFA присутствуют в клетке в форме триглицеридов.PUFAs can be present in the cell in free form or in bound form. Examples of presence in bound form are phospholipids and PUFA esters, in particular monoacyl, diacyl and triacylglycerides. In a preferred embodiment, most of the PUFAs are present in the form of triglycerides, with preferably at least 50% by weight, in particular at least 75% by weight, and in a particularly preferred embodiment, at least 90% by weight of the PUFAs present are present in the cell in the form of triglycerides.
Предпочтительными PUFA являются омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты, при этом омега-3 жирные кислоты являются особенно предпочтительными. В данном документе предпочтительными омега-3 жирными кислотами являются эйкозапентаеновая кислота (ЕРА, 20:5ω-3), в частности (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкоза-5,8,11,14,17-пентаеновαя кислота, и докозагексаеновая кислота (DHA, 22:6ω-3), в частности (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаеновая кислота.Preferred PUFAs are omega-3 fatty acids and omega-6 fatty acids, with omega-3 fatty acids being particularly preferred. In this document, the preferred omega-3 fatty acids are eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5ω-3), in particular (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic acid , and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6ω-3), in particular (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid.
В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют клетки, в частности клетки штамма Schizochytrium, которые продуцируют одновременно значительное количество ЕРА и DHA, при этом DHA предпочтительно продуцируется в количестве по меньшей мере 20 вес.%, предпочтительно в количестве по меньшей мере 30 вес.%, в частности в количестве от 30 до 50 вес.%, и ЕРА продуцируется в количестве по меньшей мере 5 вес.%, предпочтительно в количестве по меньшей мере 10 вес.%, в частности в количестве от 10 до 20 вес.% (относительно общего количества липида, содержащегося в клетках, соответственно). Продуцирующие DHA и ЕРА штаммы Schizochytrium могут быть получены с помощью последовательного мутагенеза с последующим соответствующим отбором мутантных штаммов, которые демонстрируют преимущественное продуцирование ЕРА и DHA и конкретное соотношение EPA:DHA. Любое химическое или нехимическое (например, ультрафиолетовое (UV) излучение) средство, способное индуцировать генетическое изменение в клетке дрожжей, может применяться в качестве мутагена. Такие средства могут применяться отдельно или в комбинации друг с другом, и химические средства могут применяться в чистом виде или с растворителем.In a very preferred embodiment of the present invention, cells are used, in particular cells of the Schizochytrium strain, which simultaneously produce a significant amount of EPA and DHA, while DHA is preferably produced in an amount of at least 20 wt.%, preferably in an amount of at least 30 wt.% , in particular in an amount of from 30 to 50 wt.%, and EPA is produced in an amount of at least 5 wt.%, preferably in an amount of at least 10 wt.%, in particular in an amount of from 10 to 20 wt.% (relative to the total amount of lipid contained in the cells, respectively). DHA and EPA producing Schizochytrium strains can be obtained by sequential mutagenesis followed by the appropriate selection of mutant strains that exhibit preferential EPA and DHA production and a particular EPA:DHA ratio. Any chemical or non-chemical (eg, ultraviolet (UV) radiation) agent capable of inducing a genetic change in a yeast cell can be used as a mutagen. Such agents may be used alone or in combination with one another, and the chemical agents may be used alone or with a solvent.
Предпочтительные виды микроорганизмов рода Schizochytrium, которые продуцируют одновременно ЕРА и DHA в значительных количествах, как указано выше, депонированы под номер доступа АТСС РТА-10208, РТА-10209, РТА-10210 или РТА-10211, РТА-10212, РТА-10213, РТА-10214, РТА10215.Preferred microbial species of the genus Schizochytrium that produce both EPA and DHA in significant quantities as described above are deposited under ATCC accession number PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 or PTA-10211, PTA-10212, PTA-10213, PTA -10214, PTA10215.
Суспензия биомассы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно характеризуется плотностью биомассы, составляющей по меньшей мере 80 или 100 г/л, предпочтительно по меньшей мере 120 или 140 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 160 или 180 г/л (в пересчете на содержание сухого вещества). Суспензия в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой ферментационный бульон. Таким образом, суспензия может быть получена путем культивирования и выращивания подходящих клеток в ферментационной среде в условиях, при которых PUFA продуцируются микроорганизмом.The biomass suspension according to the invention preferably has a biomass density of at least 80 or 100 g/l, preferably at least 120 or 140 g/l, more preferably at least 160 or 180 g/l (in terms of dry matter). The suspension according to the present invention is preferably a fermentation broth. Thus, a suspension can be obtained by culturing and growing suitable cells in a fermentation medium under conditions under which PUFAs are produced by the microorganism.
Способы получения биомассы, в частности биомассы, которая содержит клетки, содержащие липиды, в частности, PUFA, в частности, организмов из отряда Thraustochytriales, подробно описаны в уровне техники (см., например, WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). Как правило, продуцирование происходит у клеток, которые культивируют в ферментере в присутствии источника углерода и источника азота, вместе с рядом дополнительных веществ, таких как минералы, которые обеспечивают рост микроорганизмов и продуцирование PUFA. В данном контексте могут быть достигнуты значения плотности биомассы, составляющие более 100 г/л, и значения скорости продуцирования, составляющие более 0,5 грамм липида на литр в час. Способ предпочтительно осуществляют с помощью процесса, известного как периодический способ с подпиткой, т.е. осуществляется постепенная подпитка источниками углерода и азота в ходе ферментации. Когда необходимое количество биомассы получено, продуцирование липидов может быть индуцировано различными действиями, например путем ограничения источника азота, источника углерода или содержания кислорода или комбинаций данных действий.Methods for obtaining biomass, in particular biomass, which contains cells containing lipids, in particular PUFA, in particular organisms from the order Thraustochytriales, are described in detail in the prior art (see, for example, WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032 , WO97/36996, WO01/54510). Typically, production occurs in cells that are cultured in a fermenter in the presence of a carbon source and a nitrogen source, along with a number of additional substances such as minerals that support microbial growth and PUFA production. In this context, biomass densities greater than 100 g/l and production rates greater than 0.5 grams lipid per liter per hour can be achieved. The process is preferably carried out by a process known as a fed-batch process, i.e. a gradual replenishment with sources of carbon and nitrogen is carried out during fermentation. Once the required amount of biomass has been obtained, lipid production can be induced by various actions, for example by limiting the nitrogen source, carbon source or oxygen content, or combinations of these actions.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки выращивают до тех пор, пока они не достигнут плотности биомассы, составляющей по меньшей мере 80 или 100 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 120 или 140 г/л, в частности по меньшей мере 160 или 180 г/л (в пересчете на содержание сухого вещества). Такие способы раскрыты, например, в US 7732170.In a preferred embodiment of the present invention, the cells are grown until they reach a biomass density of at least 80 or 100 g/l, more preferably at least 120 or 140 g/l, in particular at least 160 or 180 g/l (in terms of dry matter content). Such methods are disclosed, for example, in US 7732170.
Предпочтительно, клетки подвергают ферментации в среде с низкой соленостью, в частности, чтобы избежать коррозии. Этого можно достичь с применением не содержащих хлора солей натрия в качестве источника натрия вместо хлорида натрия, таких как, например, сульфат натрия, карбонат натрия,Preferably, the cells are fermented in a low salinity environment, in particular to avoid corrosion. This can be achieved by using chlorine-free sodium salts as a source of sodium instead of sodium chloride, such as, for example, sodium sulfate, sodium carbonate,
- 6 040597 гидрокарбонат натрия или кальцинированная сода. Предпочтительно, при ферментации хлорид применяют в количествах менее 3 г/л, в частности менее 500 мг/л, особенно предпочтительно менее 100 мг/л.- 6 040597 sodium bicarbonate or soda ash. Preferably, chloride is used in the fermentation in amounts of less than 3 g/l, in particular less than 500 mg/l, particularly preferably less than 100 mg/l.
Подходящие источники углерода представляют собой как спиртовые, так и неспиртовые источники углерода. Примеры спиртовых источников углерода представляют собой метанол, этанол и изопропанол. Примеры неспиртовых источников углерода представляют собой фруктозу, глюкозу, сахарозу, мелассу, крахмал и кукурузную патоку.Suitable carbon sources are both alcoholic and non-alcoholic carbon sources. Examples of alcoholic carbon sources are methanol, ethanol and isopropanol. Examples of non-alcoholic carbon sources are fructose, glucose, sucrose, molasses, starch and corn syrup.
Подходящие источники азота представляют собой как неорганические, так и органические источники азота. Примеры неорганических источников азота представляют собой нитраты и соли аммония, в частности сульфат аммония и гидроксид аммония. Примеры органических источников азота представляют собой аминокислоты, в частности глутамат и мочевину.Suitable nitrogen sources are both inorganic and organic nitrogen sources. Examples of inorganic nitrogen sources are nitrates and ammonium salts, in particular ammonium sulfate and ammonium hydroxide. Examples of organic nitrogen sources are amino acids, in particular glutamate and urea.
Кроме того, для обеспечения положительного эффекта в отношении ферментации, также можно добавлять неорганические или органические соединения фосфора и/или известные стимулирующие рост вещества, такие как, например, дрожжевой экстракт или жидкий кукурузный экстракт.In addition, inorganic or organic phosphorus compounds and/or known growth-promoting substances, such as, for example, yeast extract or liquid corn extract, can also be added to provide a beneficial effect on fermentation.
Предпочтительно, клетки подвергают ферментации при значении pH от 3 до 11, в частности от 4 до 10, и предпочтительно при температуре, составляющей по меньшей мере 20°С, в частности от 20 до 40°С, особенно предпочтительно по меньшей мере 30°С. Типичный процесс ферментации занимает до примерно 100 ч.Preferably, the cells are fermented at a pH of 3 to 11, in particular 4 to 10, and preferably at a temperature of at least 20° C., in particular 20 to 40° C., particularly preferably at least 30° C. . A typical fermentation process takes up to about 100 hours.
После завершения ферментации клетки можно пастеризовать с целью уничтожения клеток и деактивации ферментов, которые могут способствовать разрушению липидов. Пастеризации предпочтительно достигают путем нагревания биомассы до температуры от 50 до 121°С, предпочтительно от 50 до 70°С, в течение периода времени, составляющего от 5 до 80 мин, в частности от 20 до 60 мин.Once fermentation is complete, cells can be pasteurized to kill cells and deactivate enzymes that may contribute to lipid breakdown. Pasteurization is preferably achieved by heating the biomass to a temperature of 50 to 121°C, preferably 50 to 70°C, for a period of 5 to 80 minutes, in particular 20 to 60 minutes.
Аналогично, после завершения ферментации могут быть добавлены антиоксиданты с целью защиты PUFA, присутствующих в биомассе, от окислительного разрушения. В данном контексте предпочтительные антиоксиданты представляют собой ВНТ, ВНА, ТВНА, этоксихин, бета-каротин, витамин Е, в частности токоферол, и витамин С. Антиоксидант, если применяется, предпочтительно добавляют в количестве от 0,001 до 0,1 вес.%, предпочтительно в количестве от 0,002 до 0,05 вес.% относительно общего количества ферментационного бульона после добавления антиоксиданта.Similarly, after fermentation is complete, antioxidants can be added to protect the PUFAs present in the biomass from oxidative degradation. In this context, preferred antioxidants are BHT, BHA, TBHA, ethoxyquin, beta-carotene, vitamin E, in particular tocopherol, and vitamin C. The antioxidant, if used, is preferably added in an amount of 0.001 to 0.1% by weight, preferably in an amount of from 0.002 to 0.05 wt.% relative to the total amount of the fermentation broth after the addition of the antioxidant.
Демонстрационные примеры.Demo examples.
Пример.Example.
Непромытый клеточный бульон, содержащий микробные клетки (Schizochytrium sp.) при плотности биомассы более 100 г/л, нагревали до 60°С в перемешиваемом сосуде. После нагревания суспензии уровень pH регулировали до 7,5 путем применения каустической соды (50 вес.% раствора NaOH) перед добавлением алкалазы (Alcalase® 2.4 FG (Novozymes)) в жидкой форме в количестве 0,5 вес.% (по весу бульона). Смешивание продолжали в течение 3 ч при 60°С. После этого смесь лизированных клеток переносили в выпарной аппарат с принудительной циркуляцией (полученный от GEA, Германия) и нагревали до температуры 85°С. Концентрировали смесь в выпарном аппарате с принудительной циркуляцией до достижения общего содержания сухого вещества, составляющего приблизительно 30 вес.%.An unwashed cell broth containing microbial cells (Schizochytrium sp.) at a biomass density of more than 100 g/l was heated to 60° C. in a stirred vessel. After heating the slurry, the pH was adjusted to 7.5 by applying caustic soda (50 wt.% NaOH solution) before adding alcalase (Alcalase® 2.4 FG (Novozymes)) in liquid form at 0.5 wt.% (by weight of broth) . Mixing was continued for 3 hours at 60°C. Thereafter, the mixture of lysed cells was transferred to a forced circulation evaporator (obtained from GEA, Germany) and heated to a temperature of 85°C. The mixture was concentrated in a forced circulation evaporator until a total solids content of approximately 30% by weight was reached.
Затем отбирали фракции концентрированной смеси лизированных клеток и регулировали pH до конкретного значения с применением либо NaOH, либо H2SO4, в результате чего получали аликвоты со значениями pH, составляющими 3,1, 5,6, 8,1 и 10,4.Fractions of the concentrated mixture of lysed cells were then taken and the pH adjusted to a specific value using either NaOH or H2SO4, resulting in aliquots with pH values of 3.1, 5.6, 8.1 and 10.4.
После этого аликвоты полученных фракций перемешивали с разными количествами ацетона, которые добавляли к этим аликвотам при комнатной температуре. После добавления ацетона, полученные суспензии тщательно перемешивали с применением вихревого смесителя. После перемешивания проводили разделение фаз с применением центрифуги.After that, aliquots of the obtained fractions were mixed with different amounts of acetone, which was added to these aliquots at room temperature. After addition of acetone, the resulting suspensions were thoroughly mixed using a vortex mixer. After stirring, the phases were separated using a centrifuge.
После центрифугирования в первую очередь определяли, была ли получена маслосодержащая фаза. Если маслосодержащая фаза была получена, определяли количество масла, содержащегося в данной фазе, по сравнению с начальным общим количеством масла, содержащимся в биомассе. Результаты раскрыты в следующих таблицах.After centrifugation, it was first determined whether an oil-containing phase had been obtained. If an oil-containing phase was obtained, the amount of oil contained in this phase was determined compared to the initial total amount of oil contained in the biomass. The results are disclosed in the following tables.
Таблица 1. Экстракция ацетоном при pH 3,1Table 1. Acetone extraction at pH 3.1
Таблица 2. Экстракция ацетоном при pH 5,6Table 2. Acetone extraction at pH 5.6
--
Claims (15)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/554,359 | 2017-09-05 | ||
| EP17196348.1 | 2017-10-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA040597B1 true EA040597B1 (en) | 2022-06-30 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11352651B2 (en) | Method of isolating lipids from a lipids containing biomass | |
| EP3679114B1 (en) | Method of separating lipids from a lysed lipids containing biomass | |
| US11542220B2 (en) | Method of isolating lipids from a lipids containing biomass | |
| CA3030471C (en) | Method of separating lipids from a lysed lipids containing biomass | |
| WO2019122030A1 (en) | Method of separating lipids from a lysed lipids containing biomass | |
| WO2018122057A1 (en) | Method of isolating lipids from a lipids containing biomass | |
| AU2017297752A1 (en) | Method for isolating lipids from lipid-containing cells | |
| US11946017B2 (en) | Method of separating lipids from a lysed lipids containing biomass | |
| WO2019219396A1 (en) | Method of isolating lipids from a lysed lipids containing biomass by emulsion inversion | |
| WO2019121752A1 (en) | Method of isolating lipids from a lipids containing biomass | |
| WO2019048327A1 (en) | Method of separating lipids from a lysed lipids containing biomass | |
| US20190300818A1 (en) | Method for isolating lipids from lipid-containing cells | |
| WO2021254863A1 (en) | Method of isolating lipids from a lipids containing biomass | |
| EA040597B1 (en) | METHOD FOR SEPARATING LIPIDS FROM LYSED LIPID-CONTAINING BIOMASS | |
| BR112019013418B1 (en) | METHOD FOR ISOLATING LIPIDS FROM A LIPID-CONTAINING BIOMASS |