EA040553B1

EA040553B1 - ANTIBODY TO CD154 WITH IMPROVED BINDING, FUNCTIONALITY AND SAFETY AND ITS USE IN HUMAN IMMUNOTHERAPY

Info

Publication number: EA040553B1
Application number: EA201890297
Authority: EA
Inventors: Джей Ротстейн; Роберт Джордж Эдвард ХОЛГЕЙТ; Аррон Хирн
Original assignee: Иммьюнекст, Инк.
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2016-07-13
Publication date: 2022-06-22

Description

Уровень техникиState of the art

Родственные заявки.Related applications.

Настоящая заявка испрашивает приоритет по каждой из предварительной заявки на патент США с регистрационным № 62/192269, поданной 14 июля 2015 г.; предварительной заявки на патент США с регистрационным № 62/197 966, поданной 28 июля 2015 г.; и предварительной заявки на патент США с регистрационным № 62/277201, поданной 11 января 2016 г. Содержание каждой из этих предварительных заявок включено посредством ссылки во всей своей полноте.This application claims priority under each of US Provisional Application Serial No. 62/192269, filed July 14, 2015; U.S. Provisional Application Serial No. 62/197,966, filed July 28, 2015; and U.S. Provisional Application Serial No. 62/277201, filed January 11, 2016. The contents of each of these provisional applications are incorporated by reference in their entirety.

Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs

Настоящее изобретение относится к улучшенным антителам к CD154 (CD154), обладающим сниженной токсичностью и функциональными свойствами, и их применению в схемах иммунотерапии, в особенности в лечении воспалительных нарушений, аллергии, аутоиммунных реакций, отторжения трансплантата и видов рака. В частности, в настоящем изобретении предусмотрены высокоаффинные антитела к CD154 с улучшенной аффинностью и функциональной активностью, которые не вызывают тромбообразование или реакции свертывания in vivo, а которые вызывают требуемые терапевтические свойства, такие как индукция иммунотолерантности и блокирование гуморального иммунитета.The present invention relates to improved anti-CD154 (CD154) antibodies with reduced toxicity and functionality and their use in immunotherapy regimens, especially in the treatment of inflammatory disorders, allergies, autoimmune reactions, transplant rejection and cancers. In particular, the present invention provides high affinity anti-CD154 antibodies with improved affinity and functional activity, which do not induce thrombosis or coagulation reactions in vivo, but which elicit desired therapeutic properties such as induction of immunotolerance and blocking of humoral immunity.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Prior Art

CD40L (CD154) является весьма обоснованной и значимой терапевтической мишенью при аутоиммунных реакциях, отторжении трансплантата и других связанных с иммунитетом заболеваниях у мышей, отличных от человека приматов (NHP) и людей. Во многих клинических испытаниях II фазы было показано, что aCD154 эффективно блокирует активности CD154 in vivo и облегчает заболевание. aCD154 отличается от всех остальных терапевтических средств своим влиянием на иммунный ответ; при этом оно является одним из нескольких терапевтических средств, которые могут индуцировать функциональную иммунологическую толерантность, как продемонстрировано как на мышах, так и на обезьянах. На мышах фактически все модели аутоиммунных заболеваний могут быть эффективно облегчены с помощью терапии aCD154 (Noelle, R.J., Mackey, M., Foy, Т., Buhlmann, J. and Burns, С, CD40 and its ligand in autoimmunity. Ann N.Y. Acad. Sci 1997. 815: 384-391; Mackey, M.F., Barth, R.J., Jr. and Noelle, R.J., The role of CD40/CD154 interactions in the priming, differentiation, and effector function of helper and cytotoxic T cells, J. Leukoc Biol. 1998. 63: 418-428; Noelle, R.J., CD40 and its ligand in cell-mediated immunity. Agents Actions Suppl 1998. 49: 17-22; и Quezada, S.A., Jarvinen, L.Z., Lind, E.F. and Noelle, R.J., CD40/CD154 Interactions at the Interface of Tolerance and Immunity. Annu Rev. Immunol. 2004. 22: 307-328), при этом наблюдается долгосрочная ремиссия.CD40L (CD154) is a highly valid and significant therapeutic target in autoimmune reactions, transplant rejection, and other immune-related diseases in mice, non-human primates (NHP) and humans. In many phase II clinical trials, aCD154 has been shown to effectively block CD154 activities in vivo and alleviate the disease. aCD154 differs from all other therapeutic agents in its effect on the immune response; however, it is one of several therapeutic agents that can induce functional immunological tolerance, as demonstrated in both mice and monkeys. In mice, virtually all models of autoimmune disease can be effectively alleviated with aCD154 therapy (Noelle, R.J., Mackey, M., Foy, T., Buhlmann, J. and Burns, C, CD40 and its ligand in autoimmunity. Ann N.Y. Acad. Sci 1997. 815: 384-391 Mackey, M. F., Barth, R. J., Jr. and Noelle, R. J., The role of CD40/CD154 interactions in the priming, differentiation, and effector function of helper and cytotoxic T cells, J. Leukoc Biol. R.J., CD40/CD154 Interactions at the Interface of Tolerance and Immunity Annu Rev. Immunol 2004 22: 307-328), with long-term remission observed.

На NHP устойчивая толерантность к аллотрансплантату может быть достигнута с помощью краткосрочных курсов приема средств для лечения, состоящих из aCD154 (Kenyon, N.S., Chatzipetrou, M., Masetti, M., Ranuncoli, A., Oliveira, M., Wagner, J.L., Kirk, A.D., Harlan, D.M., Burkly, L.C. and Ricordi, C, Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized antiCD154. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1999. 96: 8132-8137; Kirk, A.D., Burkly, L.C, Batty, D.S., Baumgartner, R.E., Berning, J.D., Buchanan, K., Fechner, J.H., Jr., Germond, R.L., Kampen, R.L., Patterson, N.B., Swanson, S.J., Tadaki, D.K., TenHoor, C.N., White, L., Knechtle, S.J. and Harlan, D.M., Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates. Nat. Med. 1999. 5: 686-693).At NHP, sustained allograft tolerance can be achieved with short courses of treatments consisting of aCD154 (Kenyon, N.S., Chatzipetrou, M., Masetti, M., Ranuncoli, A., Oliveira, M., Wagner, J.L., Kirk, A. D., Harlan, D. M., Burkly, L. C. and Ricordi, C, Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized antiCD154. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1999. 96: 8132- 8137; Kirk, A.D., Burkly, L.C., Batty, D.S., Baumgartner, R.E., Berning, J.D., Buchanan, K., Fechner, J.H., Jr., Germond, R.L., Kampen, R.L., Patterson, N.B., Swanson, S.J., Tadaki, D.K., TenHoor, C.N., White, L., Knechtle, S.J. and Harlan, D.M., Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates Nat Med 1999 5:686-693).

Также клинические испытания II фазы с участием людей показали, что aCD154 является эффективным при SLE (Sidiropoulos, P.I. and Boumpas, D.T., Lessons learned from anti-CD154 treatment in systemic lupus erythematosus patients, Lupus 2004. 13: 391-397), рассеянном склерозе (см. предварительные данные) и идиопатической тромбоцитопении (Sidiropoulos, P.I. and Boumpas, D.T., Lessons learned from anti-CD154 treatment in systemic lupus erythematosus patients, Lupus 2004. 13: 391-397). В силу этого aCD154 представляет собой уникальное лекарственное средство, которое обеспечивает краткосрочность процедуры вмешательства и долгосрочный клинический результат. Его недостатки заключались не в эффективности, а в непредвиденной токсичности.Also, human phase II clinical trials have shown that aCD154 is effective in SLE (Sidiropoulos, P.I. and Boumpas, D.T., Lessons learned from anti-CD154 treatment in systemic lupus erythematosus patients, Lupus 2004. 13: 391-397), multiple sclerosis (see preliminary data) and idiopathic thrombocytopenia (Sidiropoulos, P.I. and Boumpas, D.T., Lessons learned from anti-CD154 treatment in systemic lupus erythematosus patients, Lupus 2004. 13: 391-397). Because of this, aCD154 is a unique drug that provides a short intervention procedure and a long-term clinical result. Its disadvantages were not effectiveness, but unforeseen toxicity.

В начале 1990-х IDEC Pharmaceuticals и Biogen Inc. (теперь Biogen Idec) запустили многофазные I/II клинические испытания двух разных mAb aCD154. Антитело, разработанное IDEC (IDEC-131), представляло собой гуманизированный IgG1, полученный из мышиного антитела к CD154 человека, разработанного в Дартмутском колледже. Это антитело и гуманизированные варианты раскрыты в патентах США №№ 6001358; 6440418; 6506383; 7074406 и 7122187, содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки. Хотя предварительные оценки демонстрировали, что лекарственное средство было высокоэффективным, токсичность другого антитела к CD154 не позволяла продолжать клиническое исследование. В испытаниях наблюдаемая токсичность включала развитие тромбоэмболических осложнений у пациентов. С учетом вызывающих опасения проблем, связанных с токсичностью, все испытания были приостановлены и усилия были направлены на переконструирование mAb с сохранением эффективности и снижением токсичности.In the early 1990s, IDEC Pharmaceuticals and Biogen Inc. (now Biogen Idec) launched a multi-phase I/II clinical trial with two different aCD154 mAbs. The antibody developed by IDEC (IDEC-131) was a humanized IgG1 derived from a mouse anti-human CD154 antibody developed at Dartmouth College. This antibody and humanized variants are disclosed in US Pat. Nos. 6,001,358; 6440418; 6506383; 7,074,406 and 7,122,187, the contents of each of which are incorporated herein by reference. Although preliminary evaluations showed that the drug was highly effective, the toxicity of the other anti-CD154 antibody prevented the clinical study from continuing. In trials, observed toxicity included the development of thromboembolic complications in patients. Due to concerns about toxicity, all trials were suspended and efforts were directed towards redesigning the mAb while maintaining efficacy and reducing toxicity.

В то время как достигалась сниженная токсичность, наблюдалось существенное уменьшение эффективности и способности mAb aCD154 к индукции толерантности (Ferrant, J.L., Benjamin, C.D., Cutler,While reduced toxicity was achieved, there was a significant reduction in the potency and ability of the aCD154 mAb to induce tolerance (Ferrant, J.L., Benjamin, C.D., Cutler,

- 1 040553- 1 040553

A.H., Railed, S.L., Hsu, Y.M., Garber, E.A., Hess, D.M., Shapiro, R.I., Kenyon, N.S., Harlan, D.M., Kirk, A.D.,A.H., Railed, S.L., Hsu, Y.M., Garber, E.A., Hess, D.M., Shapiro, R.I., Kenyon, N.S., Harlan, D.M., Kirk, A.D.,

Burkly, L.C. and Taylor, F.R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge. Int. Immunol. 2004. 16: 1583-1594).Burkly, L.C. and Taylor, F.R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge. Int. Immunol. 2004. 16: 1583-1594).

Biogen-Idec и UCB недавно сообщили о разработке антител к CD154 с улучшенной согласно имеющимся сообщениям безопасностью. Точнее говоря, они сообщили о получении пегилированного Fab к CD154 человека, названного CDP-7657 или руплизумаб. Поскольку Fab обычно характеризуются очень коротким периодом полувыведения in vivo (т.е. приблизительно 4-8 ч), у этого Fab должны были улучшиться его фармакокинетические свойства. Однако несмотря на имеющиеся сообщения о клинической эффективности, это антитело согласно имеющимся сообщениям проявляет низкую специфическую активность. Кроме того, Bristol Meyers Squibb сообщила о разработке слитого белка на основе Fc-домена антитела, имеющего специфичность в отношении CD154. Согласно имеющимся сообщениям этот слитый белок показал эффективность в мышиных моделях заболеваний, в частности модели с иммунизацией KLH и модели SLE (волчанки) у NZBxNZW.Biogen-Idec and UCB recently reported on the development of anti-CD154 antibodies with reportedly improved safety. More specifically, they reported the production of a pegylated anti-human CD154 Fab called CDP-7657 or ruplizumab. Since Fab's typically have a very short in vivo half-life (ie, approximately 4-8 hours), this Fab should have improved pharmacokinetic properties. However, despite the reports of clinical efficacy, this antibody reportedly exhibits low specific activity. In addition, Bristol Meyers Squibb reported the development of a fusion protein based on the Fc domain of an antibody having specificity for CD154. This fusion protein has been reported to be effective in mouse disease models, in particular the KLH immunization model and the SLE (lupus) model in NZBxNZW.

Несмотря на вышеизложенное, в данной области техники все еще существует значительная потребность в улучшенных антителах к CD154, т.е. антителах, которые являются как безопасными, так и эффективными, и которые имеют хорошую специфическую активность и фармакокинетические свойства. Эти цели достигаются с помощью настоящего изобретения.Notwithstanding the foregoing, there is still a significant need in the art for improved anti-CD154 antibodies, ie. antibodies that are both safe and effective, and that have good specific activity and pharmacokinetic properties. These goals are achieved with the present invention.

Подробное описание графических материаловDetailed description of graphic materials

На фиг. 1А-1С представлены аминокислотные последовательности антитела к CD154 по настоящему изобретению, которое было получено из IDEC-131. На фигурах остатки вариабельной области в полипептидах как тяжелой, так и легкой цепей выделены жирным шрифтом, CDR выделены желтым цветом, мутированные остатки, ответственные за созревание аффинности, подчеркнуты и мутации в Fc (E^R и K^А) выделены красным цветом и подчеркнуты.In FIG. 1A-1C are the amino acid sequences of an anti-CD154 antibody of the present invention, which was derived from IDEC-131. In the figures, variable region residues in both heavy and light chain polypeptides are in bold, CDRs in yellow, mutated residues responsible for affinity maturation are underlined, and mutations in Fc (E^R and K^A) are in red and underlined. .

На фиг. 2А-2С представлены результаты выравнивания разных модифицированных константных областей IgG1 и модифицированных последовательностей легкой и тяжелой цепей, полученных из IDEC-131, с их исходным мышиным антителом.In FIG. 2A-2C show the alignment of various modified IgG1 constant regions and modified light and heavy chain sequences derived from IDEC-131 with their parent mouse antibody.

На фиг. 3 представлены результаты анализов связывания на BIAcore со сравнением связывания гуманизированного антитела к CD154 человека (упоминаемого на фигуре и в настоящей заявке как INX021) с IDEC-131 в отношении их способности к связыванию CD154, экспрессируемого на клетках Jurkat. Как показано, антитело по настоящему изобретению характеризуется приблизительно 5-кратным увеличением аффинности связывания с CD154 (экспрессируемого на клетках Jurkat) по сравнению с IDEC-131.In FIG. 3 shows the results of BIAcore binding assays comparing the binding of a humanized anti-human CD154 antibody (referred to in the figure and in this application as INX021) to IDEC-131 for their ability to bind CD154 expressed on Jurkat cells. As shown, the antibody of the present invention has an approximately 5-fold increase in binding affinity for CD154 (expressed on Jurkat cells) compared to IDEC-131.

На фиг. 4 представлены экспериментальные результаты, показывающие, что антитело по настоящему изобретению (INX021) более эффективно управляет активацией В-клеток, управляемой CD154 Тклетками, чем IDEC-131.In FIG. 4 shows experimental results showing that the antibody of the present invention (INX021) more effectively controls B cell activation driven by CD154 T cells than IDEC-131.

На фиг. 5 представлены экспериментальные результаты, показывающие, что мутанты FcR человеческих IgG-антител к CD154 мыши, содержащие те же мутации, что и INX021 (К322А и E269R), индуцируют толерантность в модели толерантности кожи.In FIG. 5 shows experimental results showing that anti-mouse CD154 human IgG FcR mutants containing the same mutations as INX021 (K322A and E269R) induce tolerance in a skin tolerance model.

На фиг. 6 представлены экспериментальные результаты, показывающие, что иммунные комплексы с INX201 не индуцируют агрегацию или активацию тромбоцитов мыши или человека in vitro.In FIG. 6 presents experimental results showing that immune complexes with INX201 do not induce aggregation or activation of mouse or human platelets in vitro.

На фиг. 7A-7D представлены экспериментальные результаты, показывающие, что INX021 не вызывает активацию тромбоцитов или другие эффекты, оказываемые на тромбоциты, по сравнению с антителом положительного контроля. На фиг. 7А показано, что оно не вызывает нарушение функции тромбоцитов, на фиг. 7В показано, что оно не приводит к агрегации тромбоцитов или свертыванию, о чем свидетельствует отсутствие наблюдаемых эмболов в легких, на фиг. 7С показано, что оно не оказывает влияния на число циркулирующих тромбоцитов, и на фиг. 7D обобщены наблюдаемые преимущества этого антитела, наблюдаемые у трансгенных по FcyRIIa мышей.In FIG. 7A-7D are experimental results showing that INX021 does not cause platelet activation or other effects on platelets compared to the positive control antibody. In FIG. 7A shows that it does not cause platelet dysfunction, FIG. 7B shows that it does not lead to platelet aggregation or clotting, as evidenced by the absence of observable pulmonary emboli, FIG. 7C shows that it has no effect on the number of circulating platelets, and FIG. 7D summarizes the observed benefits of this antibody seen in FcyRIIa transgenic mice.

На фиг. 8А и 8В показано, что IgG1-антитела к CD154 мыши, содержащие мутации в Fc, которые снижают или устраняют связывание FcR и активность системы комплемента (мутации E2669R и К322А, содержащиеся в INX021), подавляют иммунный ответ в животных моделях. На фиг. 8А показано, что антитело к CD154, содержащее эти мутации, подавляет ЕАЕ, и на фиг. 8В показано, что антитело к CD154, содержащее эти мутации, подавляет гуморальный иммунитет и индуцирует толерантность в ответ на воздействие миелинового гликопротеина олигодендроцитов (MOG).In FIG. 8A and 8B show that anti-mouse CD154 IgG1 antibodies containing Fc mutations that reduce or abolish FcR binding and complement system activity (E2669R and K322A mutations contained in INX021) suppress the immune response in animal models. In FIG. 8A shows that an anti-CD154 antibody containing these mutations suppresses EAE, and FIG. 8B shows that an anti-CD154 antibody containing these mutations suppresses humoral immunity and induces tolerance in response to oligodendrocyte myelin glycoprotein (MOG) exposure.

На фиг. 9 сравниваются эффекты разных вариантов антитела IDEC-131, в том числе INX021, на индуцируемую Т-клетками активацию В-клеток на основании экспрессии CD86. Их эффекты различаются, что указывает на то, что повышенная аффинность связывания необязательно коррелирует с лучшей специфической активностью, т.е. активностью подавления иммунного ответа.In FIG. 9 compares the effects of different variants of the IDEC-131 antibody, including INX021, on T cell-induced B cell activation based on CD86 expression. Their effects differ, indicating that increased binding affinity does not necessarily correlate with better specific activity, ie. immunosuppressive activity.

На фиг. 10А и 10В сравниваются эффекты INX021 и химерного антитела 5с8 на продуцирование IgG- и IgM-антител в анализе KLH. На фиг. 10А сравниваются их эффекты в отношении IgG, и на фиг. 10В сравниваются их эффекты в отношении IgM.In FIG. 10A and 10B compare the effects of INX021 and chimeric antibody 5c8 on the production of IgG and IgM antibodies in the KLH assay. In FIG. 10A compares their effects on IgG and FIG. 10B compares their effects on IgM.

На фиг. 11А и 11В сравниваются эффекты среды-носителя, INX021 и антитела 5с8 на баллы оценкиIn FIG. 11A and 11B compare the effects of vehicle, INX021, and 5c8 antibody on scores.

- 2 040553 зародышевых центров. На фиг. 11А показано сравнение баллов оценки зародышевых центров, и на фиг.- 2 040553 germinal centers. In FIG. 11A shows a comparison of germinal center scores, and FIG.

11В представлены гистограммы, сравнивающие число зародышевых центров и степень их насыщенности клетками в селезенках и лимфатических узлах (LN) обработанных животных.11B are histograms comparing the number of germinal centers and their degree of cell saturation in the spleens and lymph nodes (LN) of treated animals.

На фиг. 12 кратко описана наблюдаемая частота возникновения очагов поражения по сравнению с опубликованными результатами по другому антителу к CD154 (пегилированному Fab aCD154 от Biogen/UCB).In FIG. 12 summarizes the observed incidence of lesions compared to published results for another anti-CD154 antibody (pegylated Fab aCD154 from Biogen/UCB).

Цели изобретенияObjectives of the invention

Целью настоящего изобретения является обеспечение антитела к CD154, обладающего улучшенной эффективностью, безопасностью и фармакокинетикой, для применения в терапии у человека.It is an object of the present invention to provide an anti-CD154 antibody having improved efficacy, safety and pharmacokinetics for use in human therapy.

Более конкретно, целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека, которое содержит (i) полипептид вариабельной области тяжелой цепи, содержащий или состоящий из полипептида, имеющего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, 17 и 18, показанных на фиг. 2А-2С, и (ii) полипептид вариабельной области легкой цепи, содержащий или состоящий из полипептида, имеющего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 и 31, показанных на фиг. 2А-2С, при условии, что гуманизированное антитело к CD154 человека не содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи с SEQ ID NO: 15 и полипептид вариабельной области легкой цепи с SEQ ID NO: 20.More specifically, it is an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody that comprises (i) a heavy chain variable region polypeptide comprising or consisting of a polypeptide having a sequence selected from SEQ ID NOS: 15, 17, and 18 shown in FIG. 2A-2C, and (ii) a light chain variable region polypeptide comprising or consisting of a polypeptide having a sequence selected from SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 and 31 shown in FIG. 2A-2C, provided that the humanized anti-human CD154 antibody does not contain the heavy chain variable region polypeptide of SEQ ID NO: 15 and the light chain variable region polypeptide of SEQ ID NO: 20.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека, которое содержит (i) полипептид вариабельной области тяжелой цепи, содержащий или состоящий из полипептида, имеющего последовательность под SEQ ID NO: 1, показанную на фиг. 1А-С, и (ii) полипептид вариабельной области легкой цепи, содержащий или состоящий из полипептида, имеющего последовательность под SEQ ID NO: 2, показанную на фиг. 1А-С.It is also an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody that comprises (i) a heavy chain variable region polypeptide comprising or consisting of a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 1A-C, and (ii) a light chain variable region polypeptide comprising or consisting of a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 2 shown in FIG. 1A-C.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение антитела к CD154 человека, изложенного в предыдущих 3 абзацах, которое содержит константные области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 с отсутствующей способностью к связыванию C1Q и связыванию FcyR2 и/или FcyR3.It is also an object of the present invention to provide an anti-human CD154 antibody as set forth in the previous 3 paragraphs, which contains IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant regions lacking the ability to bind C1Q and bind FcyR2 and/or FcyR3.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение антитела к CD154 человека, изложенного в предыдущих 4 абзацах, которое содержит константные области IgG1 человека с отсутствующей способностью к связыванию C1Q и связыванию FcRy2 и/или FcRy3.It is also an object of the present invention to provide an anti-human CD154 antibody as set forth in the previous 4 paragraphs, which contains human IgG1 constant regions lacking the ability to bind C1Q and bind FcRy2 and/or FcRy3.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение антитела к CD154 человека, изложенного в предыдущих 5 абзацах, содержащего константные области IgG1 человека, содержащие мутации E269R и К322А (нумерация в соответствии с Kabat).It is also an object of the present invention to provide an anti-human CD154 antibody as set forth in the previous 5 paragraphs, comprising human IgG1 constant regions containing mutations E269R and K322A (numbering according to Kabat).

Также целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, которое содержит константные области легкой и тяжелой цепей IgG1 с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 2, показанными на фиг. 1А-С.It is also an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, which contains the IgG1 light and heavy chain constant regions of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 2 shown in FIG. 1A-C.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, где антитело принадлежит к изотипу IgG1, и Fc-область антитела дополнительно мутирована для введения по меньшей мере одной другой мутации, которая влияет на эффекторную функцию, такой как мутация, которая ухудшает связывание FcRn, мутация, которая ухудшает или устраняет гликозилирование, или другая мутация, которая ухудшает способность антитела связываться с FcR, таким как FcyR2, или FcyR3, или другой FcR, или которая ухудшает связывание с системой комплемента.It is also an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, wherein the antibody is of the IgG1 isotype and the Fc region of the antibody is further mutated to introduce at least one other mutation that affects effector function, such as a mutation that impairs FcRn binding, a mutation that impairs or abolishes glycosylation, or another mutation that impairs the ability of the antibody to bind to an FcR such as FcyR2 or FcyR3 or another FcR, or that impairs binding to the complement system.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, где антитело принадлежит к изотипу IgG1, и Fc-область антитела мутирована для дополнительного введения мутации Е233Р и/или D265A или любой из мутаций в Fc, идентифицированных в табл. 1, 2 или 3.It is also an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, wherein the antibody is of the IgG1 isotype and the Fc region of the antibody is mutated to further introduce an E233P and/or D265A mutation or any of the Fc mutations identified in tab. 1, 2 or 3.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, где антитело принадлежит к изотипу IgG1, и Fc-область антитела мутирована для введения мутации Е233Р.It is also an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, wherein the antibody is of the IgG1 isotype and the Fc region of the antibody is mutated to introduce the E233P mutation.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, где Fc-область антитела дополнительно мутирована для введения одной или нескольких других мутаций, которые улучшают период полувыведения in vivo.It is also an object of the present invention to provide a humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, wherein the Fc region of the antibody is further mutated to introduce one or more other mutations that improve the in vivo half-life.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически или профилактически эффективное количество по меньшей мере одного гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of at least one humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически или профилактически эффективное количество по меньшей мере одного гуманизированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, которая дополнительно содержит антиген, клетку, ткань или орган.It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of at least one humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, which further comprises an antigen, cell, tissue, or organ.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически или профилактически эффективное количество по меньшей мере одного гума- 3 040553 низированного антитела к CD154 человека в соответствии с любым из предыдущих абзацев, которая дополнительно содержит аутоантиген, аллерген, агент, вызывающий воспаление, лекарственное средство или несовместимую по HLA (аллогенную) или ксеногенную (отличную от человеческой) донорскую клетку.It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of at least one humanized anti-human CD154 antibody according to any of the preceding paragraphs, which further comprises a self-antigen, an allergen, an inflammatory agent, a drug or an HLA-incompatible (allogeneic) or xenogeneic (non-human) donor cell.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа иммуносупрессии или иммунотерапии с применением антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method for immunosuppression or immunotherapy using an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения субъекта с аллергическим, воспалительным или аутоиммунным нарушением или реципиента трансплантата путем введения антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method of treating a subject with an allergic, inflammatory or autoimmune disorder or transplant recipient by administering an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения или предупреждения GVHD у субъекта путем введения антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев перед, во время или после трансплантации донорской ткани, органа или клеток, которые необязательно могут быть созданы методами генетической инженерии, например, CAR-T (Т-клетки с химерным антигенным рецептором) или NK-клетки (естественные киллеры).It is also an object of the present invention to provide a method for treating or preventing GVHD in a subject by administering an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs before, during, or after transplantation of donor tissue, organ, or cells, which may optionally be generated by genetic engineering, for example, CAR-T (chimeric antigen receptor T cells) or NK (natural killer) cells.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа обеспечения толерантности или продолжительной антигенспецифической иммуносупрессии путем введения антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев, где способ необязательно дополнительно включает введение клетки, антигена, ткани или органа, содержащих антиген, в отношении которого вызывается толерантность или продолжительная иммуносупрессия.It is also an object of the present invention to provide a method of providing tolerance or sustained antigen-specific immunosuppression by administering an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs, wherein the method optionally further comprises administering a cell, antigen, tissue or organ containing the antigen to which tolerance or sustained immunosuppression.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа генной, клеточной, тканевой или органной терапии, который включает введение антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method of gene, cell, tissue or organ therapy, which includes the introduction of an antibody or composition in accordance with any of the previous paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения состояния, выбранного из псориаза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, оофорита, волчанки или SLE, диабета, IBD, болезни Крона, ITP, тиреоидита, ревматоидного артрита, тяжелой миастении, системной красной волчанки, болезни Грейвса, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, гемолитической анемии, сахарного диабета, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, рассеянного склероза, псориаза, лекарственных аутоиммунных заболеваний или лекарственной волчанки, путем введения антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method for treating a condition selected from psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, oophoritis, lupus or SLE, diabetes, IBD, Crohn's disease, ITP, thyroiditis, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Graves' disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, multiple sclerosis, psoriasis, drug-induced autoimmune diseases, or drug-induced lupus, by administering an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа обработки костного мозга, органа или иммунных клеток, которые предназначены для применения в клеточной терапии или трансплантации органа или костного мозга, включающего инкубацию указанных костного мозга, органа, ткани или иммунных клеток с антителом или композицией в соответствии с любым из предыдущих абзацев, например, где обработанные костный мозг, ткань, орган или иммунные клетки содержат Т-клетки донора и/или реципиента.It is also an object of the present invention to provide a method for treating bone marrow, organ, or immune cells that are intended for use in cell therapy or organ or bone marrow transplantation, comprising incubating said bone marrow, organ, tissue, or immune cells with an antibody or composition according to any from the previous paragraphs, for example, where the treated bone marrow, tissue, organ, or immune cells contain donor and/or recipient T cells.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа индукции толерантности без возникновения тромботических осложнений у пациента, нуждающегося в этом, включающего введение пациенту эффективного количества антитела или в соответствии с любым из предыдущих абзацев, который необязательно дополнительно включает введение антигена, например аутоантигена, аллергена, агента, вызывающего воспаление, лекарственного средства или несовместимой по HLA (аллогенной) донорской клетки.It is also an object of the present invention to provide a method for inducing tolerance without causing thrombotic complications in a patient in need thereof, comprising administering to the patient an effective amount of an antibody, or according to any of the preceding paragraphs, which optionally further comprises administering an antigen, e.g. inflammation, a drug, or an HLA-incompatible (allogeneic) donor cell.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа индукции толерантности, продолжительного подавления иммунного ответа или Т- или В-клеточного ответа у пациента, которому должны трансплантировать клетки, орган или ткань или которому уже трансплантировали их, например, где лекарственное средство является биологическим, таким как терапевтическое антитело, рецептор, слитый белок, гормон, фактор роста или цитокин.It is also an object of the present invention to provide a method for inducing tolerance, sustained suppression of an immune response, or a T- or B-cell response in a patient to whom a cell, organ or tissue is to be transplanted or to whom they have already been transplanted, for example, where the drug is a biological agent, such as a therapeutic antibody, receptor, fusion protein, hormone, growth factor, or cytokine.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения опосредованного Тклетками аутоиммунного нарушения путем введения эффективного количества антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method for treating a T cell mediated autoimmune disorder by administering an effective amount of an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения опосредованного Вклетками аутоиммунного нарушения путем введения эффективного количества антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method for treating a B cell-mediated autoimmune disorder by administering an effective amount of an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения аутоиммунного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, тяжелой миастении, системной красной волчанки, болезни Грейвса, болезни Гентингтона, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, гемолитической анемии, сахарного диабета, болезни Паркинсона, псориаза, болезни Аддисона, рассеянного склероза, волчанки и лекарственных аутоиммунных заболеваний, например лекарственной волчанки, путем введения эффективного количества антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.It is also an object of the present invention to provide a method for treating an autoimmune disease selected from rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Graves' disease, Huntington's disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, diabetes mellitus, Parkinson's disease, psoriasis, Addison's disease, multiple sclerosis, lupus and drug-induced autoimmune diseases, such as drug-induced lupus, by administering an effective amount of an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения в соответствии с любым из предыдущих абзацев, который включает введение антигена.It is also an object of the present invention to provide a method of treatment according to any of the preceding paragraphs, which comprises the administration of an antigen.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения или предупрежденияIt is also an object of the present invention to provide a method for treating or preventing

- 4 040553- 4 040553

GVHD, отторжения костномозгового трансплантата (ВМТ), рассеянного склероза, волчанки, ITP, ревматоидного артрита, астмы, IBD или другого воспалительного заболевания кишечника путем введения эффективного количества антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев.GVHD, bone marrow transplant rejection (BMT), multiple sclerosis, lupus, ITP, rheumatoid arthritis, asthma, IBD, or other inflammatory bowel disease by administering an effective amount of an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения состояния, нарушения или заболевания у человека, опосредованных в целом или частично передачей сигнала с участием CD40, или симптома любого из вышеуказанных, при этом способ включает введение эффективного количества антитела или композиции в соответствии с любым из предыдущих абзацев, например, где состояние, нарушение или заболевание у человека представляют собой воспалительный, аллергический или аутоиммунный ответ или фиброз, или состояние, нарушение или заболевание у человека выбраны из волчаночного нефрита, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, спондилоартрита, лекарственной красной волчанки, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, псориаза и рассеянного склероза, или состояние, нарушение или заболевание у человека выбраны из аллергического контактного дерматита, генерализованной алопеции, геморрагической пурпуры, астмы, тяжелой астмы, метаболической астмы, аллергической астмы, атопического дерматита, герпетиформного дерматита, стойкой возвышающейся эритемы, кольцевидной эритемы, многоформной эритемы; узловатой эритемы, аллергического гранулематоза, кольцевидной гранулемы, гранулоцитопении, гиперчувствительного пневмонита, кератита, нефротического синдрома, перекрестного синдрома, аллергоза голубеводов, идиопатического полиневрита, крапивницы, увеита, ювенильного дерматомиозита и витилиго, или состояние, нарушение или заболевание у человека выбраны из аллергического бронхолегочного аспергиллеза; аутоиммунной гемолитической анемии; акантокератодермии; аллергического контактного дерматита; болезни Аддисона; атопического дерматита; гнездной алопеции; генерализованной алопеции; амилоидоза; геморрагической пурпуры; анафилактоидной реакции; апластической анемии; врожденного ангионевротического отека; идиопатического ангионевротического отека; анкилозирующего спондилоартрита; височного артериита; гигантоклеточного артериита; артериита Такаясу; темпорального артериита; астмы; телеангиэктатической атаксии; аутоиммунного оофорита; аутоиммунного орхита; аутоиммунного полиэндокринного синдрома; болезни Бехчета; болезни Бергера; болезни Бюргера; буллезной пузырчатки; хронического кандидоза кожи и слизистых оболочек; синдрома Каплана; постинфарктного синдрома; посткардиотомного синдрома; кардита; целиакии-спру; болезни Шагаша; синдрома Чедиака-Хигаси; болезни ЧерджаСтросса; синдрома Когана; болезни Холодовых агглютининов; CREST-синдрома; болезни Крона; криоглобулинемии; криптогенного фиброзирующего альвеолита; герпетиформного дерматита; дерматомиозита; сахарного диабета; синдрома Даймонда-Блекфена; синдрома Ди Джорджи; дискоидной красной волчанки; эозинофильного фасциита; эписклерита; стойкой возвышающейся эритемы; кольцевидной эритемы; многоформной эритемы; узловатой эритемы; семейной средиземноморской лихорадки; синдрома Фелти; легочного фиброза; геморрагического гломерулонефрита; аутоиммунного гломерулонефрита; постстрептококкового гломерулонефрита; гломерулонефрита, развивающегося после трансплантации; мембранозного гломерулонефрита; синдрома Гудпасчера; реакции трансплантат против хозяина; иммуноопосредованной гранулоцитопении; кольцевидной гранулемы; аллергического гранулематоза; гранулематозного миозита; болезни Грейвса; тиреоидита Хашимото; гемолитической болезни новорожденных; идиопатического гемохроматоза; пурпуры Геноха-Шенлейна; хронического активного и хронического прогрессирующего гепатита; гистиоцитоза х; гиперэозинофильного синдрома; идиопатической тромбоцитопенической пурпуры; синдрома Джоба; ювенильного дерматомиозита; ювенильного ревматоидного артрита (ювенильного хронического артрита); болезни Кавасаки; кератита; сухого кератоконъюнктивита; синдрома Ландри-Гийена-Барре-Штроля; лепроматозной проказы; синдрома Леффлера; синдрома Лайелла; болезни Лайма; лимфоматоидного гранулематоза; системного мастоцитоза; смешанного заболевания соединительной ткани; множественного мононеврита; синдрома Макла-Уэльса; слизистокожного лимфонодулярного синдрома; слизисто-кожного лимфонодулярного синдрома; многоочагового ретикулогистиоцитоза; рассеянного склероза; тяжелой миастении; грибовидного микоза; системного некротического васкулита; нефротического синдрома; перекрестного синдрома; панникулита; пароксизмальной холодовой гемоглобинурии; пароксизмальной ночной гемоглобинурии; пемфигоида; пузырчатки; эритематозной пузырчатки; листовидной пузырчатки; обыкновенной пузырчатки; аллергоза голубеводов; гиперчувствительного пневмонита; узелкового полиартериита; ревматической полимиалгии; полимиозита; идиопатического полиневрита; видов семейной полинейропатии португальского типа; преэклампсии/эклампсии; первичного биллиарного цирроза; прогрессирующего системного склероза (склеродермии); псориаза; псориатического артрита; легочного альвеолярного протеиноза; легочного фиброза, феномена/синдрома Рейно; тиреоидита Риделя; синдрома Рейтера, рецидивирующего полихондрита; острой ревматической лихорадки; ревматоидного артрита; саркоидоза; склерита; склерозирующего холангита; сывороточной болезни; синдрома Сезари; синдрома Шегрена; синдрома Стивенса-Джонсона; болезни Стилла; подострого склерозирующего панэнцефалита; симпатической офтальмии; системной красной волчанки; отторжения трансплантата; язвенного колита; недифференцированного заболевания соединительной ткани; хронической крапивницы; холодовой крапивницы; увеита; витилиго; болезни Вебера-Кристиана; гранулематоза Вегенера и синдрома Вискотта-Олдрича.It is also an object of the present invention to provide a method of treating a human condition, disorder or disease mediated in whole or in part by CD40 signaling or a symptom of any of the foregoing, the method comprising administering an effective amount of an antibody or composition according to any of the preceding paragraphs. , for example, where the condition, disorder, or disease in the human is an inflammatory, allergic, or autoimmune response or fibrosis, or the condition, disorder, or disease in the human is selected from lupus nephritis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, spondyloarthritis, drug-induced lupus erythematosus, inflammatory disease bowel disease, Crohn's disease, psoriasis and multiple sclerosis, or a condition, disorder or disease in a person selected from allergic contact dermatitis, alopecia generalis, purpura hemorrhagica, asthma, severe asthma, metabolic asthma, allergic asthma, atopic hard dermatitis, dermatitis herpetiformis, persistent elevated erythema, annular erythema, erythema multiforme; erythema nodosum, allergic granulomatosis, granuloma annulare, granulocytopenia, hypersensitivity pneumonitis, keratitis, nephrotic syndrome, cross syndrome, pigeon breeder's allergy, idiopathic polyneuritis, urticaria, uveitis, juvenile dermatomyositis, and vitiligo, or a condition, disorder, or disease in a human selected from allergic bronchopulmonary aspergillosis ; autoimmune hemolytic anemia; acantokeratoderma; allergic contact dermatitis; Addison's disease; atopic dermatitis; alopecia areata; generalized alopecia; amyloidosis; hemorrhagic purpura; anaphylactoid reaction; aplastic anemia; congenital angioedema; idiopathic angioedema; ankylosing spondylitis; temporal arteritis; giant cell arteritis; arteritis Takayasu; temporal arteritis; asthma; telangiectatic ataxia; autoimmune oophoritis; autoimmune orchitis; autoimmune polyendocrine syndrome; Behçet's disease; Berger's disease; Buerger's disease; bullous pemphigus; chronic candidiasis of the skin and mucous membranes; Kaplan syndrome; postinfarction syndrome; postcardiotomy syndrome; carditis; celiac sprue; Chagash disease; Chediak-Higashi syndrome; Churg-Strauss disease; Cogan's syndrome; cold agglutinin diseases; CREST syndrome; Crohn's disease; cryoglobulinemia; cryptogenic fibrosing alveolitis; herpetiform dermatitis; dermatomyositis; diabetes; Diamond-Blackfan syndrome; DiGeorge syndrome; discoid lupus erythematosus; eosinophilic fasciitis; episcleritis; persistent elevated erythema; ring-shaped erythema; erythema multiforme; erythema nodosum; familial Mediterranean fever; Felty's syndrome; pulmonary fibrosis; hemorrhagic glomerulonephritis; autoimmune glomerulonephritis; poststreptococcal glomerulonephritis; glomerulonephritis developing after transplantation; membranous glomerulonephritis; Goodpasture's syndrome; graft-versus-host reactions; immune-mediated granulocytopenia; granuloma annulare; allergic granulomatosis; granulomatous myositis; Graves' disease; Hashimoto's thyroiditis; hemolytic disease of the newborn; idiopathic hemochromatosis; purpura of Henoch-Schönlein; chronic active and chronic progressive hepatitis; histiocytosis x; hypereosinophilic syndrome; idiopathic thrombocytopenic purpura; Job's syndrome; juvenile dermatomyositis; juvenile rheumatoid arthritis (juvenile chronic arthritis); Kawasaki disease; keratitis; dry keratoconjunctivitis; Landry-Guillain-Barré-Strohl syndrome; lepromatous leprosy; Loeffler's syndrome; Lyell's syndrome; Lyme disease; lymphomatoid granulomatosis; systemic mastocytosis; mixed connective tissue disease; multiple mononeuritis; Muckle-Wales syndrome; mucocutaneous lymphonodular syndrome; mucocutaneous lymphonodular syndrome; multifocal reticulohistiocytosis; multiple sclerosis; severe myasthenia gravis; mycosis fungoides; systemic necrotizing vasculitis; nephrotic syndrome; cross syndrome; panniculitis; paroxysmal cold hemoglobinuria; paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; pemphigoid; pemphigus; erythematous pemphigus; pemphigus foliaceus; pemphigus vulgaris; allergy of pigeon breeders; hypersensitivity pneumonitis; polyarteritis nodosa; rheumatic polymyalgia; polymyositis; idiopathic polyneuritis; types of family polyneuropathy of the Portuguese type; preeclampsia/eclampsia; primary biliary cirrhosis; progressive systemic sclerosis (scleroderma); psoriasis; psoriatic arthritis; pulmonary alveolar proteinosis; pulmonary fibrosis, Raynaud's phenomenon/syndrome; Riedel's thyroiditis; Reiter's syndrome, recurrent polychondritis; acute rheumatic fever; rheumatoid arthritis; sarcoidosis; scleritis; sclerosing cholangitis; serum sickness; Cesari's syndrome; Sjögren's syndrome; Stevens-Johnson syndrome; Still's disease; subacute sclerosing panencephalitis; sympathetic ophthalmia; systemic lupus erythematosus; transplant rejection; ulcerative colitis; undifferentiated connective tissue disease; chronic urticaria; cold urticaria; uveitis; vitiligo; Weber-Christian disease; Wegener's granulomatosis and Wiskott-Aldrich syndrome.

- 5 040553- 5 040553

Подробное описаниеDetailed description

Прежде чем раскрывать настоящее изобретение более подробно приводятся следующие определения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно рядовому специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.Before disclosing the present invention in more detail, the following definitions are given. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as is generally understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs.

Термин антитело, как он используется в данном документе в отношении настоящего изобретения, предусматривает выделенное, рекомбинантное или синтетическое антитело, конъюгат антитела или производное антитела. Зачастую предполагается, что термин антитело предусматривает фрагмент антитела, в том числе антигенсвязывающий фрагмент, если иное не указано или понятно из контекста. Антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. См. в целом Fundamental Immunology, гл. 7 (под ред. Paul, W., 2-е изд. Raven Press, N.Y. (1989)). Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью методик рекомбинантной ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактных антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты включают Fab, F(ab)₂, Fab', F(ab')₂, F(ab')₃, Fd, Fv, доменные антитела (dAb), другие одновалентные и двухвалентные фрагменты, фрагменты, представляющие собой определяющую комплементарность область (CDR), одноцепочечные антитела (например, scFv, scFab и scFab8C), химерные антитела, диатела, триатела, миниантитела, нанотела и полипептиды, содержащие по меньшей мере часть антитела, которой достаточно для придания полипептиду специфического связывания с антигеном; а также продукты слияния и производные вышеуказанных. См., например, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005) и Hust et al., BMC Biotech 7: 14 (2007).The term antibody, as used herein in relation to the present invention, includes an isolated, recombinant, or synthetic antibody, antibody conjugate, or antibody derivative. The term antibody is often assumed to include an antibody fragment, including an antigen-binding fragment, unless otherwise indicated or clear from the context. The antigen binding fragment competes with the intact antibody for specific binding. See in general Fundamental Immunology, ch. 7 (ed. Paul, W., 2nd ed. Raven Press, NY (1989)). Antigen-binding fragments can be obtained using recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. In some embodiments, antigen-binding fragments include Fab, F(ab) ₂ , Fab', F(ab') ₂ , F(ab') ₃ , Fd, Fv, domain antibodies (dAb), other monovalent and divalent fragments, fragments, Complementarity determining region (CDR), single chain antibodies (e.g., scFv, scFab, and scFab8C), chimeric antibodies, diabodies, tribodies, minibodies, nanobodies, and polypeptides containing at least a portion of the antibody sufficient to confer specific antigen binding on the polypeptide ; as well as fusion products and derivatives of the above. See, for example, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005) and Hust et al., BMC Biotech 7: 14 (2007).

Если не определено иное или в случае, если контекст подразумевает иное, антитело по настоящему изобретению предусматривает целые антитела и любые их антигенсвязывающие фрагменты, производные или варианты антитела, которые могут содержать одну или несколько модификаций (например, вставку, делецию, замену аминокислоты, посттрансляционную модификацию или отсутствие таковой и т.д.), в том числе конъюгаты антитела (т.е. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные или ассоциированные с функциональным компонентом). В основе производных антитела, в том числе конъюгатов антитела, может лежать антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, который специфически связывает CD154, или они могут содержать его. Кроме того, вышеупомянутые варианты осуществления антитела могут представлять собой антитела мыши, хомячка, козы, кролика, химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела, фрагменты, производные или конъюгаты. Следует понимать, что в определенных аспектах настоящего изобретения термин антитело может исключать один или несколько вариантов осуществления антитела, перечисленных выше; такие условия будут очевидны специалисту в данной области техники.Unless otherwise specified, or where the context implies otherwise, an antibody of the present invention includes whole antibodies and any antigen-binding fragments, derivatives, or antibody variants thereof, which may contain one or more modifications (e.g., insertion, deletion, amino acid substitution, post-translational modification or lack thereof, etc.), including antibody conjugates (i.e., an antibody or antigen-binding fragment conjugated to or associated with a functional component). Antibody derivatives, including antibody conjugates, may be based on, or contain, an antigen-binding fragment of the present invention that specifically binds CD154. In addition, the aforementioned antibody embodiments may be mouse, hamster, goat, rabbit, chimeric, humanized or fully human antibodies, fragments, derivatives or conjugates. It should be understood that in certain aspects of the present invention, the term antibody may exclude one or more of the antibody embodiments listed above; such conditions will be apparent to a person skilled in the art.

Термин эффекторная функция обозначает функциональную способность Fc или константной области антитела связывать белки и/или клетки иммунной системы. Антитела, обладающие сниженной эффекторной функцией, и способы конструирования таких антител хорошо известны из уровня техники (см., например, WO 05/18572, WO 05/03175 и патент США № 6242195) и описаны более подробно в данном документе. Типичные эффекторные функции включают способность связывать белок системы комплемента (например, белок C1q системы комплемента) и/или Fc-рецептор (FcR) (например, FcyRI, FcyRII, FcyRIIa, FcyRIII и/или FcyRIIIb). Функциональные последствия способности связывать одну или несколько из вышеуказанных молекул включают без ограничения опсонизацию, фагоцитоз, антигензависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и/или модулирование эффекторных клеток. Уменьшение эффекторной функции обозначает уменьшение одной или нескольких биохимических или клеточных видов активности, индуцированное, по меньшей мере частично, за счет связывания Fc с его когнатным рецептором, или белком системы комплемента, или эффекторной клеткой, с одновременным поддержанием антигенсвязывающей активности вариабельной области антитела (или его фрагмента), несмотря на сниженную, аналогичную, идентичную или повышенную аффинность связывания. Конкретные антитела по настоящему изобретению характеризуются сниженной эффекторной функцией. Уменьшения эффекторной функции, например, связывания Fc с Fcрецептором или белком системы комплемента, можно выразить в виде кратности снижения (например, снижена в 1,5 раза, 2 раза и т.п.) и можно рассчитать на основании, например, процентных значений снижения активности связывания, определенных с применением анализов связывания, известных из уровня техники (см., например, WO 05/18572).The term effector function refers to the functional ability of an Fc or antibody constant region to bind proteins and/or cells of the immune system. Antibodies having reduced effector function and methods for constructing such antibodies are well known in the art (see, for example, WO 05/18572, WO 05/03175 and US Pat. No. 6,242,195) and are described in more detail herein. Exemplary effector functions include the ability to bind a complement system protein (eg, complement C1q protein) and/or an Fc receptor (FcR) (eg, FcyRI, FcyRII, FcyRIIa, FcyRIII and/or FcyRIIIb). Functional consequences of the ability to bind one or more of the above molecules include, without limitation, opsonization, phagocytosis, antigen-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), and/or modulation of effector cells. Decreased effector function refers to a decrease in one or more biochemical or cellular activities induced at least in part by Fc binding to its cognate receptor, or complement system protein, or effector cell, while maintaining the antigen-binding activity of the variable region of the antibody (or its fragment) despite reduced, similar, identical, or increased binding affinity. Specific antibodies of the present invention are characterized by reduced effector function. Decreases in effector function, such as Fc binding to the Fc receptor or a protein of the complement system, can be expressed as a fold reduction (e.g. reduced by 1.5-fold, 2-fold, etc.) and can be calculated based on, for example, percentage reductions binding activities determined using binding assays known in the art (see, for example, WO 05/18572).

Если контекстом не требуется иное, термины в единственном числе будут включать формы множественного числа, и термины во множественном числе будут включать форму единственного числа.Unless the context otherwise requires, singular terms will include the plural forms, and plural terms will include the singular form.

Во всем данном описании и формуле изобретения слово содержать или такие вариации, как содержит или содержащий, будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел.Throughout this specification and claims, the word contain, or variations such as contains or containing, will be understood to mean the inclusion of the specified integer or group of integers, but not the exclusion of any other integer or group of integers.

Термин CD154 обозначает лиганд, который экспрессируется на активированных Т-клетках. CD154 известен в данной области техники под несколькими другими названиями, такими как лиганд CD40 (CD40L), контррецептор CD40 (CD40CR), gp39, Т-ВАМ, активирующая Т-клетки молекула, TRAF,The term CD154 refers to a ligand that is expressed on activated T cells. CD154 is known in the art by several other names such as CD40 ligand (CD40L), CD40 counter receptor (CD40CR), gp39, T-BAM, T-cell activating molecule, TRAF,

- 6 040553 родственный TNF активационный белок (TRAP) и представитель 5 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF5) (Gauchat et al., 1993 FEBS Lett. 315: 259-266; Graf et al., 1992, Europ. J. Immun. 22: 3191-3194; Hollenbaugh et al., 1992 EMBO J. 11: 4313-4321). Эти термины используются взаимозаменяемо во всей настоящей заявке. CD154-связывающие белки, в том числе антитела по настоящему изобретению, специфически связываются с CD154 человека и могут давать перекрестную реакцию, и, следовательно, специфически связываться с CD154 от других видов. В определенных вариантах осуществления CD154-связывающие белки, в том числе антитела по настоящему изобретению, специфически связываются с CD154 человека, CD154 мыши или CD154 отличного от человека примата.- 6 040553 TNF-related activation protein (TRAP) and a member of the tumor necrosis factor ligand superfamily 5 (TNFSF5) (Gauchat et al., 1993 FEBS Lett. 315: 259-266; Graf et al., 1992, Europ. J. Immun. 22: 3191-3194; Hollenbaugh et al., 1992 EMBO J. 11: 4313-4321). These terms are used interchangeably throughout this application. CD154 binding proteins, including the antibodies of the present invention, specifically bind to human CD154 and can cross-react and therefore specifically bind to CD154 from other species. In certain embodiments, CD154 binding proteins, including antibodies of the present invention, specifically bind to human CD154, mouse CD154, or non-human primate CD154.

Термин антитело к CD154 также охватывает синтетическое антитело или рекомбинантное антитело, которое получают с помощью технологии рекомбинантной ДНК, такое как, например, антитело, экспрессируемое бактериофагом. Термин антитело к CD154 также следует толковать как предусматривающий антитело, которое было получено с помощью синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, и при этом молекула ДНК экспрессирует белок-антитело, или аминокислотной последовательности, определяющей антитело, где ДНК или аминокислотная последовательность были получены с помощью технологии синтеза ДНК или аминокислотной последовательности, которая является доступной и хорошо известной из уровня техники.The term anti-CD154 antibody also encompasses a synthetic antibody or a recombinant antibody that is produced by recombinant DNA technology, such as, for example, an antibody expressed by a bacteriophage. The term anti-CD154 antibody should also be interpreted to mean an antibody that has been produced by synthesizing a DNA molecule encoding an antibody, wherein the DNA molecule expresses the antibody protein, or an amino acid sequence defining an antibody, where the DNA or amino acid sequence has been obtained by technology synthesizing a DNA or amino acid sequence that is available and well known in the art.

Выражение мутация или мутации, которые устраняют или снижают связывание FcR и которые устраняют токсичность в данном документе обозначает мутацию или мутации, которые устраняют или снижают тромбоцитопению, или тромбоз, или свертывание in vitro и/или in vivo. Участки в Fc или константные области человеческих антител разных типов, в том числе IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, которые могут быть модифицированы для устранения или снижения связывания FcR и оказания влияния (ослабления или усиления) на другие эффекторные функции Fc, хорошо известны из уровня техники. Иллюстративные мутации, с помощью которых можно модифицировать Fc или константную область IgG1 человека, идентифицированы в табл. 1-3 и в примерах ниже.The expression mutation or mutations that abolish or reduce FcR binding and that abolish toxicity as used herein means a mutation or mutations that abolish or reduce thrombocytopenia or thrombosis or clotting in vitro and/or in vivo. Fc regions or constant regions in human antibodies of various types, including human IgG1, IgG2, IgG3, and human IgG4, that can be modified to eliminate or reduce FcR binding and affect (attenuate or enhance) other Fc effector functions are well known in the art. the level of technology. Illustrative mutations that can modify the Fc or constant region of human IgG1 identified in table. 1-3 and in the examples below.

Выражение мутация или мутации, которые устраняют или снижают функцию системы комплемента и которые поддерживают свойства индукции толерантности обозначает мутацию или мутации в человеческих, химерных или гуманизированных антителах, содержащих константные области человека, предпочтительно константные области IgG1 или IgG3 человека, где их Fc-область была мутирована в одном или нескольких участках с целью устранения или существенного снижения связывания системы комплемента. Предпочтительно такие мутации не будут заметно влиять на способность антитела индуцировать толерантность in vivo. Это можно установить с помощью соответствующих моделей толерантности, таких как модель трансплантации кожи. Участки в Fc или константные области человеческих антител разных типов, в том числе IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, которые могут быть модифицированы для устранения или снижения связывания системы комплемента и которые могут оказывать влияние (ослаблять или усиливать) на другие эффекторные функции Fc, хорошо известны из уровня техники. Иллюстративные участки, которые можно модифицировать в IgG1, идентифицированы в табл. 1-3 и примерах ниже.The expression mutation or mutations that abolish or reduce the function of the complement system and that maintain tolerance inducing properties means a mutation or mutations in human, chimeric or humanized antibodies containing human constant regions, preferably human IgG1 or IgG3 constant regions, where their Fc region has been mutated in one or more sites in order to eliminate or significantly reduce the binding of the complement system. Preferably, such mutations will not significantly affect the ability of the antibody to induce tolerance in vivo. This can be established using appropriate tolerance models such as the skin graft model. Fc regions or constant regions of various types of human antibodies, including human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, which can be modified to eliminate or reduce complement system binding and which can affect (weaken or enhance) other Fc effector functions, well known in the art. Illustrative sites that can be modified in IgG1, identified in table. 1-3 and examples below.

Выражение пациент может означать человека либо отличного от человека животного, предпочтительно млекопитающего. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения получают антитела к CD154 человека, подходящие для терапии у человека, которые содержат мутированные константные области IgG1 или IgG3, где такие мутации устраняют или существенно сдерживают токсичность или проблемы безопасности, такие как тромбоцитопения, или тромбоз, или реакции свертывания, или токсичность, ассоциированную с реакциями системы комплемента, и при этом предпочтительно у таких антител сохраняется способность индуцировать толерантность или продолжительное подавление гуморального ответа in vivo.The expression patient can mean a human or a non-human animal, preferably a mammal. In preferred embodiments of the present invention, anti-human CD154 antibodies suitable for human therapy are prepared, which contain mutated IgG1 or IgG3 constant regions, wherein such mutations eliminate or substantially reduce toxicity or safety concerns such as thrombocytopenia or thrombosis or coagulation reactions, or toxicity associated with reactions of the complement system, and while preferably such antibodies retain the ability to induce tolerance or prolonged suppression of the humoral response in vivo.

Как используется в данном документе, субъект обозначает организм или образец клетки, образец ткани или образец органа, полученные от него, в том числе, например, культивируемые линии клеток, биоптат, образец крови или образец жидкости, содержащие клетку. Во многих случаях субъект или образец, полученный от него, содержит несколько типов клеток. В одном варианте осуществления образец включает, например, смесь опухолевых и нормальных клеток. В одном варианте осуществления образец содержит по меньшей мере 10, 15, 20 и т.д., 90 или 95% опухолевых клеток. Организм может представлять собой животное, в том числе без ограничения такое животное, как корова, свинья, мышь, крыса, цыпленок, кошка, собака и т.д., и обычно представляет собой млекопитающее, такое как человек.As used herein, a subject refers to an organism or cell sample, tissue sample, or organ sample derived from it, including, for example, a cultured cell line, a biopsy specimen, a blood sample, or a fluid sample containing a cell. In many cases, the subject, or the sample obtained from him, contains several types of cells. In one embodiment, the sample includes, for example, a mixture of tumor and normal cells. In one embodiment, the sample contains at least 10, 15, 20, etc., 90 or 95% tumor cells. The organism may be an animal, including but not limited to an animal such as a cow, a pig, a mouse, a rat, a chicken, a cat, a dog, etc., and is typically a mammal such as a human.

Термин лечение в его различных грамматических формах в отношении настоящего изобретения обозначает предупреждение (т.е. химиопрофилактику), излечение, обратное развитие, ослабление, уменьшение интенсивности, сведение к минимуму, подавление или остановку проявления вредоносных эффектов болезненного состояния, прогрессирования заболевания, возбудителя заболевания (например, бактерий или вирусов) или другого аномального состояния. Например, лечение может включать уменьшение интенсивности симптома (т.е. не обязательно всех симптомов) заболевания или уменьшение интенсивности прогрессирования заболевания.The term treatment in its various grammatical forms, in relation to the present invention, means prevention (i.e. chemoprophylaxis), cure, regression, attenuation, reduction in intensity, minimization, suppression or arrest of the harmful effects of a disease state, disease progression, disease agent ( such as bacteria or viruses) or other abnormal condition. For example, treatment may include reducing the intensity of a symptom (ie, not necessarily all symptoms) of the disease or reducing the progression of the disease.

Лечение или предупреждение аутоиммунных реакций или лечение или предупреждение другого болезненного состояния, такого как рак, инфекция, воспаление, аллергия, отторжение трансплантата,Treatment or prevention of autoimmune reactions, or treatment or prevention of another medical condition such as cancer, infection, inflammation, allergy, transplant rejection,

- 7 040553 реакция трансплантат против хозяина и другие состояния, где антитела к CD154, вероятно, имеют терапевтическое преимущество, как используется в данном документе, относится к частичному или полному ингибированию, замедлению или предупреждению прогрессирования заболевания. В случае рака это означает лечение или ингибирование метастазирования рака; ингибирование, замедление или предупреждение рецидивирования рака, в том числе метастазирования рака; или предупреждение возникновения или развития рака (химиопрофилактика) у млекопитающего, например человека. Кроме того, способы по настоящему изобретению можно осуществлять на практике для лечения пациентов-людей с раком. Однако также вполне вероятно, что способы также будут эффективны в лечении рака у других млекопитающих. В предпочтительных вариантах осуществления рассматриваемые антитела применяются для лечения аутоиммунных реакций, аллергии, воспаления, отторжения трансплантата, GVHD, отторжения костномозгового трансплантата (ВМТ) и для индукции антигенспецифической толерантности или продолжительной антигенспецифической иммуносупрессии, в частности подавления дифференцировки, активации и/или пролиферации Т-клеток и/или В-клеток у субъектов, нуждающихся в этом. Предпочтительные показания включают рассеянный склероз, волчанку или SLE, ITP, IBD, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, псориаз, увеит, ревматоидный артрит, астму, GVHD, отторжение костомозгового трансплантата, диабет, ревматоидный артрит, псориатический артрит, псориаз, отторжение клеточного трансплантата, отторжение тканевого трансплантата, отторжение органного трансплантата, отторжение костомозгового трансплантата, клеточную или генную терапию, оофорит и тиреоидит.- 7 040553 graft-versus-host disease and other conditions where anti-CD154 antibodies are likely to be of therapeutic benefit, as used herein, refers to partial or complete inhibition, slowing or prevention of disease progression. In the case of cancer, this means treating or inhibiting cancer metastasis; inhibiting, slowing or preventing the recurrence of cancer, including cancer metastasis; or preventing the occurrence or development of cancer (chemoprevention) in a mammal, such as a human. In addition, the methods of the present invention can be practiced to treat human patients with cancer. However, it is also likely that the methods would also be effective in treating cancer in other mammals. In preferred embodiments, the antibodies in question are used to treat autoimmune reactions, allergies, inflammation, transplant rejection, GVHD, bone marrow transplant (BMT) rejection, and to induce antigen-specific tolerance or long-term antigen-specific immunosuppression, in particular suppression of T-cell differentiation, activation and/or proliferation and/or B cells in subjects in need thereof. Preferred indications include multiple sclerosis, lupus or SLE, ITP, IBD, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, psoriasis, uveitis, rheumatoid arthritis, asthma, GVHD, bone marrow transplant rejection, diabetes, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, psoriasis, rejection cell transplant, tissue transplant rejection, organ transplant rejection, bone marrow transplant rejection, cell or gene therapy, oophoritis and thyroiditis.

Используемый в данном документе термин терапевтически эффективное количество предназначен для определения количества средства для лечения в терапевтическом режиме, необходимого для лечения состояния, например аутоиммунных реакций, аллергии, воспаления, GVHD или отторжения трансплантата, или для уменьшения или устранения иммунного ответа, в особенности Т-клеточного или В-клеточного иммунного ответа на антиген, такой как аутоантиген, аллерген, вызывающий воспаление агент, трансплантированные клетка, ткань или орган, или на лекарственное средство, такое как биологическое, например, терапевтическое антитело, слитый белок на основе Ig, гормон, фактор роста или другой терапевтический белок или полипептид.As used herein, the term therapeutically effective amount is intended to define the amount of an agent in a therapeutic regimen necessary to treat a condition, such as autoimmune reactions, allergies, inflammation, GVHD, or transplant rejection, or to reduce or eliminate an immune response, especially T-cell or a B-cell immune response to an antigen such as a self-antigen, an allergen, an inflammatory agent, a transplanted cell, tissue, or organ, or a drug such as a biological, e.g., therapeutic antibody, Ig-based fusion protein, hormone, growth factor or another therapeutic protein or polypeptide.

Используемый в данном документе термин профилактически эффективное количество предназначен для определения количества средства для лечения в терапевтическом режиме, необходимого для предупреждения состояния или прогрессирования симптомов заболевания, например, аутоиммунных реакций, аллергии, воспаления, GVHD или отторжения трансплантата, реакции на лекарственное средство или реакции отторжения.As used herein, the term prophylactically effective amount is intended to refer to the amount of a therapeutic agent needed to prevent a condition or progression of disease symptoms, e.g., autoimmune reactions, allergies, inflammation, GVHD or transplant rejection, drug reactions, or rejection reactions.

В настоящем изобретении предусмотрено улучшенное антитело к CD154 для применения в терапии у человека, которое было получено из гуманизированного антитела IDEC-131, разработанного IDEC Pharmaceuticals (теперь BiogenIDEC). IDEC-131 представляет собой высокоаффинное антитело, которое, как обнаружено с помощью BIAcore, при 25°С связывается с CD154 человека с K_D 151 пМ.The present invention provides an improved anti-CD154 antibody for use in human therapy, which was derived from the humanized IDEC-131 antibody developed by IDEC Pharmaceuticals (now BiogenIDEC). IDEC-131 is a high affinity antibody found by BIAcore to bind to human CD154 at 25°C with a K _D of 151 pM.

IDEC131 представляет собой гуманизированное антитело к CD154, принадлежащее изотипу IgG1 человека, которое было получено из мышиного антитела к CD154 человека (24-31), которое раскрыто в патенте США № 5747037. Линия клеток гибридомы, секретирующая 24-31, которая является коммерчески доступной, была депонирована в американской коллекции типовых культур, и депонированной линии клеток присвоен номер доступа в АТСС НВ1712.IDEC131 is a humanized anti-CD154 antibody belonging to the human IgG1 isotype, which was derived from the murine anti-human CD154 antibody (24-31) disclosed in US Patent No. 5,747,037. was deposited with the American Type Culture Collection and the deposited cell line was assigned an ATCC Accession Number HB1712.

Последовательность IDEC-131 и его применение в лечении различных показаний аллергического, аутоиммунного и воспалительного характера и для подавления опосредованных Т- и В-клетками иммунных ответов раскрыто в патенте США № 6001358; 6440418; 6506383; 7074406 и 7122187. На основании его свойств, в том числе его сильных иммуносупрессивных эффектов на Т- и В-клеточный иммунитет и высокой аффинности, IDEC-131 продвинулся на стадию клинических испытаний с участием людей. В частности, IDEC-131 применяли в финансируемых IDEC клинических испытаниях с участием людей для лечения 2 показаний аутоиммунного характера, т.е. идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) и ремиттирующего/рецидивирующего рассеянного склероза (RR-MS). Несмотря на то, что эти клинические испытания IDEC-131 показали некоторую клиническую эффективность (хотя у относительно небольшого числа пациентов на очень ранней стадии), они были остановлены после сообщения о том, что другое IgG1-антитело к CD154 человека, разработанное Biogen, также полученное из мышиного антитела к CD154 человека (мышиного антитела 5с8, выделенного Сетом Ледерманом в Колумбийском университете), вызывало нежелательные эффекты у пациентов-людей. В частности, при применении в клинических испытаниях подвергнутого химеризации антитела 5с8 от Biogen возникали нежелательные явления в виде тромбообразования (ТЕ), которые приводили к инсульту и летальному исходу у нескольких пациентов, участвующих в клиническом испытании. Настоящее изобретение преодолевает эти проблемы ввиду получения других преимуществ в отношении фармакокинетики по сравнению с IDEC131.The sequence of IDEC-131 and its use in the treatment of various indications of an allergic, autoimmune and inflammatory nature and for the suppression of T- and B-cell mediated immune responses are disclosed in US patent No. 6001358; 6440418; 6506383; 7,074,406 and 7,122,187. Based on its properties, including its potent immunosuppressive effects on T- and B-cell immunity and high affinity, IDEC-131 has moved into human clinical trials. Specifically, IDEC-131 has been used in IDEC-funded human clinical trials for the treatment of 2 autoimmune indications, ie. idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP); and relapsing/relapsing multiple sclerosis (RR-MS). Although these clinical trials of IDEC-131 showed some clinical efficacy (albeit in a relatively small number of patients at a very early stage), they were stopped after it was reported that another anti-human CD154 IgG1 antibody developed by Biogen was also being obtained. from a mouse anti-human CD154 antibody (mouse antibody 5c8 isolated by Seth Lederman at Columbia University) produced adverse effects in human patients. In particular, when Biogen's chimerized 5c8 antibody was used in clinical trials, thrombus formation (TE) adverse events occurred, leading to stroke and death in several patients participating in the clinical trial. The present invention overcomes these problems by providing other pharmacokinetic advantages over IDEC131.

Для сравнения в настоящем изобретении предусмотрен гуманизированный вариант антитела к CD154 человека, полученный из IDEC-131, который подобно IDEC-131 принадлежит к изотипу IgG1 человека, однако его Fc-область была сконструирована так, чтобы устранить как связывание FcR, так иFor comparison, the present invention provides a humanized variant of an anti-human CD154 antibody derived from IDEC-131, which, like IDEC-131, belongs to the human IgG1 isotype, but its Fc region was designed to eliminate both FcR binding and

- 8 040553 активацию системы комплемента. В частности, его константная область сконструирована так, что она содержит мутации E269R и К322А (при этом эти мутированные остатки пронумерованы в соответствии с системой нумерации антител по Kabat). Эти мутации соответственно приводят к сниженному связыванию с FcyRIIa и с C1q. В частности, полученное модифицированное антитело характеризуется ограниченным связыванием FcR/C1q, т.е. оно не связывается с FcRy2 или FcRy3 на тромбоцитах и не связывается с системой комплемента или не активирует ее. В отличие от этого, на его связывание с FcRn влияние не оказывается. Как раскрывается ниже и подкрепляется экспериментальными данными, раскрытыми в данном документе, IgG1-антитела к CD154, содержащие эти мутации, при проведении анализов в разных экспериментальных моделях не характеризовались какими-либо обнаруживаемыми протромбическими активностями in vitro или in vivo в отношении тромбоцитов мыши или человека.- 8 040553 activation of the complement system. In particular, its constant region is designed to contain the E269R and K322A mutations (with these mutated residues numbered according to the Kabat antibody numbering system). These mutations respectively lead to reduced binding to FcyRIIa and to C1q. In particular, the resulting modified antibody is characterized by limited FcR/C1q binding, i.e. it does not bind to FcRy2 or FcRy3 on platelets and does not bind to or activate the complement system. In contrast, its binding to FcRn is not affected. As discussed below and supported by the experimental data disclosed herein, anti-CD154 IgG1 antibodies containing these mutations did not exhibit any detectable in vitro or in vivo prothrombic activities in mouse or human platelets when tested in various experimental models.

Также последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей IDEC-131 дополнительно конструировали с помощью созревания аффинности. Созревание аффинности осуществляли с надеждой на повышение аффинности связывания полученного антитела к CD154 человека по сравнению с IDEC131, поддерживая при этом его требуемые иммуносупрессивные свойства. Однако этот результат был отнюдь не гарантирован, поскольку, как упоминалось, IDEC-131 уже обладал сильной аффинностью связывания с CD154 человека (161 пМ) и эффективно подавлял иммунный ответ в разных моделях (моделях ЕАЕ, подавления гуморального иммунного ответа и аллоспецифической толерантности).Also, IDEC-131 heavy and light chain variable region sequences were further engineered by affinity maturation. Affinity maturation was performed with the hope of increasing the binding affinity of the resulting anti-human CD154 antibody relative to IDEC131 while maintaining its desired immunosuppressive properties. However, this result was by no means guaranteed, since, as mentioned, IDEC-131 already had a strong binding affinity for human CD154 (161 pM) and effectively suppressed the immune response in different models (EAE models, suppression of the humoral immune response and allospecific tolerance).

После проведения многочисленных экспериментов и последующих способов скрининга получали мутированные версии вариабельной области тяжелой и легкой цепей IDEC-131, из которых получали гуманизированные антитела (в том числе INX021), обладающие улучшенной аффинностью по сравнению с IDEC-131. Конкретно, получали INX021, а также 12 других вариантов. Эти гуманизированные варианты оценивали, и INX021 было выбрано в качестве основного кандидата для терапии у человека на основании его значимого с практической точки зрения связывания (аффинность к CD154 человека —в 5 раз выше, чем у IDEC-131), а также оно обладало лучшими функциональными (иммуносупрессивными) свойствами по сравнению с IDEC-131, а также по сравнению с другими вариантами.After numerous experiments and subsequent screening methods, mutated versions of the variable region of the heavy and light chains of IDEC-131 were obtained, from which humanized antibodies (including INX021) with improved affinity compared to IDEC-131 were obtained. Specifically, received INX021, as well as 12 other options. These humanized variants were evaluated and INX021 was selected as a prime candidate for human therapy based on its practical binding (5-fold higher affinity for human CD154 than IDEC-131) and superior functional performance. (immunosuppressive) properties compared to IDEC-131, as well as compared to other options.

Как показано на фиг. 1А-С (на которых представлены последовательности гуманизированного IgG1-антитела к CD154 человека по настоящему изобретению, INX021), это антитело содержит две мутации в CDR3 тяжелой цепи, три мутации в CDR1 легкой цепи и две мутации в CDR3 легкой цепи (по сравнению с IDEC-131). Следовательно, в общей сложности было модифицировано 7 остатков CDR. Неожиданным образом, как показано ниже, полученное гуманизированное антитело к CD154 человека связывается с CD154 человека с аффинностью, приблизительно в 5 раз превышающей таковую у исходного антитела, которое, как отмечалось ранее, само по себе связывается с CD154 человека с очень высокой аффинностью. Это удивительно, поскольку даже одна модификация в CDR может оказывать существенные эффекты на аффинность связывания антитела. Также непредсказуемым было то, что аффинность антител с уже относительно высокой аффинностью может быть улучшена.As shown in FIG. 1A-C (showing the sequences of the humanized anti-human CD154 IgG1 antibody of the present invention, INX021), this antibody contains two mutations in the heavy chain CDR3, three mutations in the light chain CDR1, and two mutations in the light chain CDR3 (compared to IDEC -131). Therefore, a total of 7 CDR residues were modified. Surprisingly, as shown below, the resulting humanized anti-human CD154 antibody binds to human CD154 with approximately 5-fold higher affinity than the parent antibody, which, as previously noted, itself binds to human CD154 with very high affinity. This is surprising since even a single modification in a CDR can have significant effects on the binding affinity of an antibody. It was also unpredictable that the affinity of antibodies with already relatively high affinity could be improved.

Это модифицированное гуманизированное антитело при проведении анализов в разных моделях in vitro и in vivo обладало очень сильными иммуносупрессивными свойствами. Конкретно, INX021 эффективно подавляло гуморальный иммунитет, ЕАЕ и индуцировало аллоспецифическую толерантность или продолжительное отсутствие антигенспецифической Т-клеточной реактивности. Как показано ниже, INX021 вызывает более сильное ингибирование управляемой CD154 Т-клетками активации В-клеток по сравнению с IDEC-131.This modified humanized antibody, when tested in various in vitro and in vivo models, had very strong immunosuppressive properties. Specifically, INX021 effectively suppressed humoral immunity, EAE, and induced allospecific tolerance or a prolonged lack of antigen-specific T-cell reactivity. As shown below, INX021 causes a stronger inhibition of CD154-driven T cell activation of B cells compared to IDEC-131.

Следовательно, антитело по настоящему изобретению (по сравнению с IDEC-131) (i) обладает аффинностью связывания с CD154 человека, превышающей в 5 раз таковую у IDEC131, (ii) оно более эффективно вызывает иммуносупрессивные виды активности по сравнению с IDEC131, (iii) подобно IDEC-131 оно подавляет Т- и В-клеточный (гуморальный) иммунитет, например оно подавляет ЕАЕ, и оно индуцирует аллоспецифическую толерантность, и (iv) оно характеризуется улучшенным профилем безопасности по сравнению с IDEC-131 благодаря мутациям в Fc-области, которые существенно снижают связывание FcR и C1q, и, как следствие, оно не проявляет каких-либо обнаруживаемых протромбических активностей in vitro или in vivo в отношении тромбоцитов мыши или человека.Therefore, the antibody of the present invention (compared to IDEC-131) (i) has a binding affinity for human CD154 greater than 5 times that of IDEC131, (ii) it is more effective in inducing immunosuppressive activities compared to IDEC131, (iii) like IDEC-131 it suppresses T- and B-cell (humoral) immunity, e.g. it suppresses EAE, and it induces allospecific tolerance, and (iv) it has an improved safety profile compared to IDEC-131 due to mutations in the Fc region, which significantly reduce the binding of FcR and C1q, and, as a result, it does not show any detectable prothrombic activities in vitro or in vivo against mouse or human platelets.

С учетом этих комплексных свойств рассматриваемое антитело к CD154 человека хорошо подходит для применения в терапии у человека, так как оно должно характеризоваться повышенным профилем безопасности у пациентов и должно быть более сильным, и, следовательно, более эффективным, чем IDEC-131. Предполагается, что повышенная аффинность связывания этого антитела должна облегчать его введение посредством подкожного введения дозы. Это является значимым с практической точки зрения для его потенциального применения в лечении показаний у человека хронического характера.Given these complex properties, the subject anti-human CD154 antibody is well suited for use in human therapy, as it should have an improved safety profile in patients and should be more potent, and therefore more effective, than IDEC-131. The increased binding affinity of this antibody is expected to facilitate its administration via subcutaneous dosing. This is significant from a practical point of view for its potential use in the treatment of indications in a person of a chronic nature.

Также рассматриваемое антитело благодаря тому, что является интактным, т.е. оно содержит полноразмерный IgG1, может обеспечить преимущества в отношении фармакокинетики и безопасности пегилированному Fab, разработанному Biogen/UCB, и CD154-специфическому диателу, разработанномуAlso, the antibody in question due to the fact that it is intact, i. it contains full-length IgG1, may provide pharmacokinetic and safety advantages to the PEGylated Fab developed by Biogen/UCB and the CD154-specific diabody developed by

- 9 040553- 9 040553

Bristol Meyers Squibb.Bristol Meyers Squibb.

Кроме того, поскольку рассматриваемое антитело обладает более высокой специфической активностью, это может дополнительно улучшать дозирование, так как, вероятно, антитело можно вводить менее часто. Это важно, так как большинство применений рассматриваемого антитела предназначены для лечения показаний у человека хронического аутоиммунного, аллергического или воспалительного характера, при этом повторное введение доз будет требоваться для любого эффективного терапевтического режима. В частности, антитело по настоящему изобретению должно хорошо подходить для схем лечения, при которых В- или Т-клеточная иммуносупрессия требуется с терапевтической точки зрения.In addition, since the antibody in question has a higher specific activity, this may further improve dosing, since the antibody can probably be administered less frequently. This is important since most uses of the antibody in question are for the treatment of chronic autoimmune, allergic or inflammatory indications in humans, and repeat doses will be required for any effective therapeutic regimen. In particular, the antibody of the present invention should be well suited to treatment regimens in which B - or T-cell immunosuppression is required from a therapeutic point of view.

Следовательно, в настоящей заявке заявитель предусматривает новые и улучшенные гуманизированные антитела к CD154 человека для применения в иммунотерапии у человека, обладающие улучшенной аффинностью и другими фармакокинетическими свойствами, которые не должны вызывать токсичность у пациентов-людей, в частности эти антитела не должны вызывать агрегацию тромбоцитов или тромбоэмболические осложнения у субъектов-людей, и более того, с учетом их дополнительной способности не связывать и активировать систему комплемента, они дополнительно не должны опосредовать ADCC или CDC опосредованную цитотоксичность. Как показано в примерах, антитело по настоящему изобретению обладает существенно улучшенными функциональными и фармакокинетическими свойствами по сравнению с IDEC131 и другим антителом к CD154, ранее применяемыми в терапии у человека. Следовательно, это антитело должно обеспечивать клинические благоприятные эффекты при применении в терапии у человека.Therefore, in the present application, the applicant provides new and improved humanized anti-human CD154 antibodies for use in human immunotherapy, having improved affinity and other pharmacokinetic properties that should not cause toxicity in human patients, in particular these antibodies should not cause platelet aggregation or thromboembolic complications in human subjects, and moreover, given their additional ability to not bind and activate the complement system, they should not additionally mediate ADCC or CDC mediated cytotoxicity. As shown in the examples, the antibody of the present invention has significantly improved functional and pharmacokinetic properties compared to IDEC131 and other anti-CD154 antibody previously used in human therapy. Therefore, this antibody should provide clinically beneficial effects when used in human therapy.

Несмотря на то, что антитело INX021 по настоящему изобретению содержит 2 мутации, которые соответственно снижают связывание FcRy2 и 3 и связывание C1q, дополнительно предполагается, что можно вводить и другие мутации в Fc-области, которые могут дополнительно снизить связывание с другими Fc-рецепторами или системой комплемента или изменить другие эффекторные функции. Примеры других возможных мутаций известны из уровня техники, например, Shields R.L., Namenuk A.K., Hong K., et al. (High resolution mapping of the binding site on Human IgG1 for Fc for FcyRI, Fc for FcyRII, Fc for FcyRIII, and FcRn) сообщают о разработке вариантов IgG1 с ослабленным связыванием Fc с FcyR. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591-604). Кроме того, в US 20070237767 и US 20100104564 описан мутагенез Fc для устранения связывания FcR. Также конкретные мутации в Fc и их эффекты перечислены в табл. 1-3 ниже. Предполагается, что эти мутации являются иллюстративными и не исчерпывают другие мутации и их комбинации, которые, как известно, повышают или ослабляют эффекторные функции Fc, такие как связывание FcR, связывание системы комплемента, гликозилирование, активность ADCC, активность CDC, связывание FcRN, среди прочих.While the INX021 antibody of the present invention contains 2 mutations that reduce FcRy2 and 3 binding and C1q binding, respectively, it is further contemplated that other mutations in the Fc region can be introduced that can further reduce binding to other Fc receptors or complement system or change other effector functions. Examples of other possible mutations are known in the art, for example, Shields R.L., Namenuk A.K., Hong K., et al. (High resolution mapping of the binding site on Human IgG1 for Fc for FcyRI, Fc for FcyRII, Fc for FcyRIII, and FcRn) report the development of IgG1 variants with reduced Fc binding to FcyR. J Biol. Chem. 2001; 276:6591-604). In addition, US 20070237767 and US 20100104564 describe Fc mutagenesis to eliminate FcR binding. Also specific mutations in Fc and their effects are listed in Table. 1-3 below. These mutations are intended to be illustrative and not exhaustive of other mutations and combinations thereof known to increase or decrease Fc effector functions such as FcR binding, complement system binding, glycosylation, ADCC activity, CDC activity, FcRN binding, among others. .

Таблица 1 (из Shields et al., High resolution mapping of the binding site on Human IgG1 for Fc for FcyRI, Fc for FcyRII, _____________Fc for FcyRIII, and FcRn, J Biol Chem 2001; 276: 6591-604)_____________Table 1 (from Shields et al., High resolution mapping of the binding site on Human IgG1 for Fc for FcyRI, Fc for FcyRII, ______Fc for FcyRIII, and FcRn, J Biol Chem 2001; 276: 6591-604)______

Мутация в Fc Mutation in Fc FcyRI FcyRI FcyRIla FcyRIla FcyRIlb FcyRIlb FcyRIIla FcyRIIla FcRn FcRn E233P E233P 0, 12 0.12 0, 08 0.08 0, 12 0.12 0, 04 0.04 0,54 0.54 D2 65A D265A 0,16 0.16 0, 07 0.07 0, 13 0.13 0, 09 0.09 1,23 1.23 D265N D265N 0, 02 0.02 0, 03 0.03 0, 02 0.02 D270N D270N 0, 03 0.03 0, 05 0.05 0, 04 0.04 N297A N297A 0, 15 0.15 0, 05 0.05 0, 1 0, 1 0, 03 0.03 0, 8 0.8 S298N S298N 0, 05 0.05 0, 08 0.08 0, 06 0.06 P329A P329A 0,48 0.48 0, 08 0.08 0, 12 0.12 0,21 0.21 0, 8 0.8 D2 7 0A D270A 0,76 0.76 0, 06 0.06 0, 1 0, 1 0, 14 0.14 1,05 1.05

Таблица 2 (изUS20100104564)Table 2 (from US20100104564)

Мутация в Fc Mutation in Fc FcyR I FcyR I FcyRIla (H131) FcyRIla (H131) FcyRIla (R131) FcyRIla (R131) FcyRII b FcyRII b FcyRIIla (V158) FcyRIIla (V158) Fcyllla (F158) Fcylla (F158) K32 6V K32 6V 0,52 0.52 0, 01 0.01 0, 01 0.01 0, 02 0.02 0, 87 0.87 2,34 2.34 V369R V369R 0,79 0.79 0, 01 0.01 0, 02 0.02 0, 03 0.03 0, 93 0.93 1, 64 1, 64 F405K F405K 1,52 1.52 0, 02 0.02 0, 02 0.02 0, 02 0.02 1,08 1.08 2,55 2.55 L410P L410P 1,27 1.27 0, 01 0.01 0, 01 0.01 0, 01 0.01 0, 99 0.99 1,75 1.75 V427R V427R 1, 69 1.69 0, 03 0.03 0, 05 0.05 0, 03 0.03 1,27 1.27 0,59 0.59

- 10 040553- 10 040553

Таблица 3 (из US20070237767)Table 3 (from US20070237767)

№ варианта option number Мутация в Fc Mutation in Fc FcyR I FcyR I FcyR I la FcyR I la FcyR I lb FcyR I lb FcyR I Ic FcyR I Ic FcyRII la FcyRII la Clq Clq FcRn FcRn 113 113 L234N L234N 0, 1 0, 1 0, 19 0.19 2,05 2.05 0,49 0.49 1,18 1.18 1,06 1.06 744 744 G237M G237M 0, 07 0.07 0, 14 0.14 0,57 0.57 0, 66 0.66 0, 1 0, 1 1, 8 18 1,74 1.74 88 88 S239F S239F 0,28 0.28 0, 02 0.02 0,33 0.33 0, 1 0, 1 0, 95 0.95 0, 85 0.85 826 826 V262E V262E 1, 03 1, 03 0,16 0.16 0, 92 0.92 36, 47 36, 47 2,85 2.85 9, 27 9, 27 76 76 V264F V264F 0,43 0.43 0, 05 0.05 0,22 0.22 0, 06 0.06 1, 87 1, 87 1, 07 1, 07 143 143 V266T V266T 0,28 0.28 0, 1 0, 1 0,16 0.16 0, 18 0.18 1,21 1.21 0,53 0.53 228 228 S267N S267N 0,72 0.72 0, 08 0.08 0,27 0.27 3, 18 3, 18 0, 85 0.85 148 148 E269R E269R 0, 07 0.07 0, 07 0.07 0, 13 0.13 0, 06 0.06 0, 05 0.05 1, 15 1, 15 0,72 0.72 779 779 N2 8 6E N2 8 6E 0, 07 0.07 0,38 0.38 0,37 0.37 0, 01 0.01 0 0 2,12 2.12 858 858 N297R N297R 0, 01 0.01 0, 01 0.01 0, 01 0.01 0, 06 0.06 0, 01 0.01 0,45 0.45 80 80 Т299А T299A 0, 01 0.01 0, 1 0, 1 0,56 0.56 72,84 72.84 0, 06 0.06 2,31 2.31 0, 82 0.82 870 870 R301D R301D 0, 87 0.87 0, 11 0.11 0, 06 0.06 0, 04 0.04 0, 03 0.03 1,58 1.58 0,5 0.5 84 84 N325L N325L 0,42 0.42 0, 04 0.04 1,46 1.46 0, 03 0.03 2,18 2.18 0, 91 0.91 161 161 N325E N325E 1,34 1.34 0, 09 0.09 0, 05 0.05 0, 03 0.03 <0, 02 <0.02 0,86 0.86 0,55 0.55 473 473 L328R L328R 0, 07 0.07 0, 1 0, 1 0, 88 0.88 0,37 0.37 0, 11 0.11 1,21 1.21 1, 82 1, 82

С учетом этой комбинации свойств в отношении безопасности, функциональности и фармакокинетики гуманизированные IgG 1-антитела к CD 154 человека по настоящему изобретению можно применять для лечения или предупреждения состояний, при которых подавление активации, дифференцировки и пролиферации Т- и/или В-клеток требуется с терапевтической точки зрения, таких как аллергические, аутоиммунные состояния, отторжение трансплантата (алло- или ксеногенных органных, клеточных, тканевых трансплантатов) и воспалительные состояния. Их конкретные неограничивающие примеры включают в качестве примера рассеянный склероз, системную красную волчанку (SLE), другие формы волчанки, аутоиммунную тромбоцитопению (ITP), отторжение почечного трансплантата, отторжение трансплантата кожи и островковых клеток, ревматоидный артрит, саркоидоз, псориатический артрит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, COPD, астму, диабет, тироидит, реакцию трансплантат против хозяина, трансплантацию костного мозга (ВМ) или гемопоэтических стволовых клеток и атеросклероз. Также некоторые из этих вариантов, в том числе INX021, обладают повышенной специфической активностью/эффективностью, в том числе способностью вызывать толерантность in vivo.Given this combination of safety, functionality and pharmacokinetic properties, the humanized anti-human CD 154 IgG 1 antibodies of the present invention can be used to treat or prevent conditions in which suppression of T and/or B cell activation, differentiation and proliferation is required with therapeutic point of view, such as allergic, autoimmune conditions, transplant rejection (allo- or xenogeneic organ, cell, tissue transplants) and inflammatory conditions. Specific non-limiting examples thereof include, by way of example, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus (SLE), other forms of lupus, autoimmune thrombocytopenia (ITP), kidney transplant rejection, skin and islet cell graft rejection, rheumatoid arthritis, sarcoidosis, psoriatic arthritis, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, COPD, asthma, diabetes, thyroiditis, graft versus host disease, bone marrow (BM) or hematopoietic stem cell transplantation, and atherosclerosis. Also, some of these variants, including INX021, have increased specific activity/efficacy, including the ability to induce tolerance in vivo.

Как видно из экспериментальных данных, особенно предполагаемое применение антител по настоящему изобретению, в том числе INX021, предназначено для уменьшения интенсивности или предупреждения реакций на лекарственное средство, в частности реакций, вызванных в ответ на биологические препараты и другие лекарственные средства, такие как терапевтические антитела, слитые белки, гормоны, факторы роста, ферменты, пептиды, антибиотики, противовирусные препараты и т.п. Это может обеспечить возможность введения этих лекарственных средств в течение более продолжительного периода времени, может увеличить число пациентов, которые отвечают на лекарственное средство, и/или может способствовать эффективности лекарственного препарата у пациентов, не получавших лечение.As can be seen from experimental data, a particularly intended use of the antibodies of the present invention, including INX021, is to reduce or prevent drug reactions, in particular reactions elicited in response to biologics and other drugs, such as therapeutic antibodies, fusion proteins, hormones, growth factors, enzymes, peptides, antibiotics, antivirals, and the like. This may allow these drugs to be administered over a longer period of time, may increase the number of patients who respond to the drug, and/or may contribute to the efficacy of the drug in untreated patients.

Как обсуждается в данном документе, известно, что другие участки в Fc-области IgGl человека и другие константные области человека участвуют в связывании и/или активации системы комплемента, а также в связывании FcR. Соответственно, описанные мутации являются иллюстративными соответствующими мутациями в Fc-области IgGl или IgG3 или других антител, которые приводят к утрате одного или обоих из связывания системы комплемента и связывания FcR.As discussed herein, other regions in the human IgGl Fc region and other human constant regions are known to be involved in binding and/or activation of the complement system, as well as in FcR binding. Accordingly, the described mutations are exemplary corresponding mutations in the Fc region of IgGl or IgG3 or other antibodies that result in the loss of one or both of complement system binding and FcR binding.

Индукцию толерантности или продолжительные (Т- или В-клеточные) иммуносупрессивные эффекты мутантных в отношении связывания системы комплемента вариантов aCD154 или их вариантов можно оценить в хорошо изученной модели выживания кожного аллотрансплантата, несовпадающего по гаплотипу, в которой долговременная толерантность индуцируется с помощью введения «CD154 и аллоантигена. Однако другие модели толерантности можно альтернативно применять для оценивания способности вариантов aCD154, лишенных способности связывать систему комплемента и/или лишенных способности связывать FcR (содержащих мутированную Fc-облаеть), индуцировать толерантность.Tolerance induction or long-term (T- or B-cell) immunosuppressive effects of complement-binding mutant aCD154 variants or variants can be assessed in a well-characterized haplotype-mismatched skin allograft survival model in which long-term tolerance is induced by administration of "CD154 and alloantigen. However, other tolerance models can alternatively be used to assess the ability of aCD154 variants lacking the ability to bind the complement system and/or lacking the ability to bind FcR (containing a mutated Fc-object) to induce tolerance.

Тромбоэмболические активности мутированных по FcR aCD154 можно тестировать в мышиной модели, экспрессирующей рецептор FcyRIIA человека, которая воспроизводит явления, наблюдаемые у NHP (Ferrant, J.L., Benjamin, C.D., Cutler, А.Н., Railed, S.L., Hsu, Y.M., Garber, E.A., Hess, D.M., Shapiro, R.I., Kenyon, N.S., Harlan, D.M., Kirk, A.D., Burkly, L.C and Taylor, F.R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge. Int Immunol 2004. 16: 1583-1594). У таких мышей обработка с помощью aCD154 (антитела к CD154 мыши)Thromboembolic activities of FcR-mutated aCD154 can be tested in a mouse model expressing the human FcyRIIA receptor that mimics the phenomena seen in NHP (Ferrant, J.L., Benjamin, C.D., Cutler, A.H., Railed, S.L., Hsu, Y.M., Garber, E.A., Hess, D.M., Shapiro, R.I., Kenyon, N.S., Harlan, D.M., Kirk, A.D., Burkly, L.C and Taylor, F.R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge Int Immunol 2004 16:1583-1594). In these mice, treatment with aCD154 (anti-mouse CD154 antibodies)

- 11 040553 индуцирует образование тромбов в легких; следовательно, утрата связывания FcR у антител к CD154, содержащих мутированные Fc-области человека (мутированные константные области IgG1), устраняет или заметно снижает образование тромбов. С использованием этой или аналогичных моделей можно определять эффекты конкретных мутаций в Fc на токсичность, ассоциированную с терапией aCD154.- 11 040553 induces the formation of blood clots in the lungs; therefore, loss of FcR binding in anti-CD154 antibodies containing mutated human Fc regions (mutated IgG1 constant regions) abolishes or markedly reduces thrombus formation. Using this or similar models, the effects of specific Fc mutations on aCD154 therapy-associated toxicity can be determined.

Опять-таки, мутированные специфические антитела к CD154 по настоящему изобретению, которые получены из IDEC-131, можно применять для лечения и предупреждения любого состояния, при котором противодействие эффектам CD154, в том числе передачи сигнала CD154/CD40, или блокирование или ингибирование связывания CD154 с CD40 может быть эффективным с терапевтической точки зрения и может снижать проявление симптомов заболевания. Их примеры включают лечение аллергических, аутоиммунных состояний, рака, отторжения трансплантата, GVHD, воспалительных и других состояний, в особенности состояний, при которых индукция толерантности и/или подавление гуморального иммунитета или Т-клеточного иммунитета требуется с терапевтической точки зрения. Конкретные примеры включают рассеянный склероз, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, тироидит, красную волчанку, аутоиммунную тромбоцитопению, диабет, реакцию трансплантат против хозяина, клеточную терапию, отторжение органного и тканевого трансплантата, например, кожи, почки, поджелудочной железы, костного мозга, атеросклероз и другие состояния, при которых требуется подавление гуморального или Т-клеточного ответа.Again, the mutated anti-CD154 specific antibodies of the present invention, which are derived from IDEC-131, can be used to treat and prevent any condition that counteracts the effects of CD154, including CD154/CD40 signaling, or blocks or inhibits CD154 binding. with CD40 may be therapeutically effective and may reduce symptoms of the disease. Their examples include the treatment of allergic, autoimmune conditions, cancer, transplant rejection, GVHD, inflammatory and other conditions, especially conditions in which the induction of tolerance and/or suppression of humoral immunity or T-cell immunity is required from a therapeutic point of view. Specific examples include multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, thyroiditis, lupus erythematosus, autoimmune thrombocytopenia, diabetes, graft versus host disease, cell therapy, organ and tissue transplant rejection, e.g., skin, kidney, pancreas, bone brain, atherosclerosis and other conditions that require suppression of the humoral or T-cell response.

Рассматриваемые антитела, которые нацеливаются на CD154, обладают улучшенными свойствами безопасности, имеют большой терапевтический потенциал, так как CD154 является чрезвычайно привлекательной мишенью для иммунологического вмешательства в широком спектре аутоиммунных и связанных с трансплантатами заболеваний. Фактически все модели аутоиммунных заболеваний у мышей, протестированные на сегодняшний день, ослаблялись с терапевтической точки зрения с помощью обработки aCD154. Помимо простого блокирования взаимодействий CD154-CD40 терапия aCD154 приводит к индукции иммунологической толерантности (предупреждение отторжения трансплантата путем блокирования взаимодействий CD40-CD154 неоднократно документально подтверждалось в отношении индукции долговременной толерантности к коже, Gordon, E.J., Markees, T.G., Phillips, N.E., Noelle, R.J., Shultz, L.D., Mordes, J.P., Rossini, A.A. and Greiner, D.L., Prolonged survival of rat islet and skin xenografts in mice treated with donor splenocytes and anti-CD154 monoclonal antibody, Diabetes 1998. 47: 1199-1206; Markees, T.G., Phillips, N.E., Noelle, R.J., Shultz, L.D., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Prolonged survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand, Transplantation 1997. 64: 329-335; Jarvinen, L.Z., Blazar, B.R., Adeyi, O.A., Strom, T.B. and Noelle, R.J., CD154 on the surface of CD4+CD25+ regulatory T cells contributes to skin transplant tolerance, Transplantation 2003. 76: 1375-1379; Quezada, S.A., Fuller, В., Jarvinen, L.Z., Gonzalez, M., Blazar, B.R., Rudensky, A.Y., Strom, T.B. and Noelle, R.J., Mechanisms of donor-specific transfusion tolerance: preemptive induction of clonal Tcell exhaustion via indirect presentation, Blood 2003. 102: 1920-1926; Frleta, D., Lin, J.T., Quezada, S.A., Wade, T.K., Barth, R.J., Noelle, R.J. and Wade, W.F., Distinctive maturation of in vitro versus in vivo antiCD40 mAb-matured dendritic cells in mice, J Immunother 2003. 26: 72-84; Quezada, S., Eckert, M., Schned, A., Noelle, R.J. and Burns, C., Distinct mechanisms of action of anti-CD154 in early versus late treatment of murine lupus nephritis, Arth Rheum. 2003.; Elster, E.A., Xu, H., Tadaki, D.K., Montgomery, S., Burkly, L.C, Berning, J.D., Baumgartner, R.E., Cruzata, F., Marx, R., Harlan, D.M. and Kirk, A.D., Treatment with the humanized CD154-specific monoclonal antibody, hu5C8, prevents acute rejection of primary skin allografts in nonhuman primates, Transplantation, 2001. 72: 1473-1478, островковым клеткам (Benda, В., Ljunggren, H.G., Peach, R., Sandberg, J.O. and Korsgren, O., Co-stimulatory molecules in islet xenotransplantation: CTLA4Ig treatment in CD40 ligand-deficient mice, Cell Transplantation 2002. 11: 715-720), костному мозгу (Wekerle, T. and Sykes, M., Mixed chimerism and transplantation tolerance, Annual Review of Medicine 2001, 52: 353-37019, и множеству других трансплантированных органов (Camirand, G., Caron, N.J., Turgeon, N.A., Rossini, A.A. and Tremblay, J.P., Treatment with anti-CD154 antibody and donor-specific transfusion prevents acute rejection of myoblast transplantation, Transplantation 2002. 73: 453-461; Tung, T.H., Mackinnon, S.E. and Mohanakumar, T., Long-term limb allograft survival using anti-CD154 antibody in a murine model, Transplantation 2003. 75: 644-650). Кроме того, у NHP было показано, что aCD154 человека индуцирует долговременную толерантность к аллогенным кожным трансплантатам.Contemplated antibodies that target CD154 have improved safety properties, have great therapeutic potential, since CD154 is an extremely attractive target for immunological intervention in a wide range of autoimmune and transplant-related diseases. Virtually all mouse autoimmune disease models tested to date have been therapeutically attenuated by aCD154 treatment. In addition to simply blocking CD154-CD40 interactions, aCD154 therapy leads to the induction of immunological tolerance (prevention of graft rejection by blocking CD40-CD154 interactions has been repeatedly documented in relation to the induction of long-term skin tolerance, Gordon, E.J., Markees, T.G., Phillips, N.E., Noelle, R.J. , Shultz, L.D., Mordes, J.P., Rossini, A.A. and Greiner, D.L., Prolonged survival of rat islet and skin xenografts in mice treated with donor splenocytes and anti-CD154 monoclonal antibody, Diabetes 1998. 47: 1199-1206; Markees, T.G. , Phillips, N.E., Noelle, R.J., Shultz, L.D., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Prolonged survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand, Transplantation 1997. 64: 329- 335; Jarvinen, L.Z., Blazar, B.R., Adeyi, O.A., Strom, T.B. and Noelle, R.J., CD154 on the surface of CD4+CD25+ regulatory T cells contributes to skin transplant tolerance, Transplantation 2003. 76: 1375-1379; Quezada, S.A., Fuller, B., Jarvinen, L.Z., Gonzalez, M., Blazar, B.R., Rudensky, A.Y., Strom, T.B. and Noelle, R.J., Mechanisms of donor-specific transfusion tolerance: preemptive induction of clonal Tcell exhaustion via indirect presentation, Blood 2003. 102: 1920-1926; Frleta, D., Lin, J.T., Quezada, S.A., Wade, T.K., Barth, R.J., Noelle, R.J. and Wade, W.F., Distinctive maturation of in vitro versus in vivo antiCD40 mAb-matured dendritic cells in mice, J Immunother 2003. 26: 72-84; Quezada, S., Eckert, M., Schned, A., Noelle, R.J. and Burns, C., Distinct mechanisms of action of anti-CD154 in early versus late treatment of murine lupus nephritis, Arth Rheum. 2003.; Elster, E.A., Xu, H., Tadaki, D.K., Montgomery, S., Burkly, L.C, Berning, J.D., Baumgartner, R.E., Cruzata, F., Marx, R., Harlan, D.M. and Kirk, A.D., Treatment with the humanized CD154-specific monoclonal antibody, hu5C8, prevents acute rejection of primary skin allografts in nonhuman primates, Transplantation, 2001. 72: 1473-1478, to islet cells (Benda, B., Ljunggren, H.G., Peach, R., Sandberg, J. O. and Korsgren, O., Co-stimulatory molecules in islet xenotransplantation: CTLA4Ig treatment in CD40 ligand-deficient mice, Cell Transplantation 2002. 11: 715-720), bone marrow (Wekerle, T. and Sykes, M., Mixed chimerism and transplantation tolerance, Annual Review of Medicine 2001, 52: 353-37019, and many other organ transplants (Camirand, G., Caron, N.J., Turgeon, N.A., Rossini, A.A. and Tremblay, J.P., Treatment with anti-CD154 antibody and donor-specific transfusion prevents acute rejection of myoblast transplantation, Transplantation 2002. 73: 453-461; Tung, T. H., Mackinnon, S. E. and Mohanakumar, T., Long-term limb allograft survival using anti-CD154 antibody in a murine model, Transplantation 20 03.75:644-650). In addition, human aCD154 has been shown to induce long-term tolerance to allogeneic skin grafts in NHP.

Общее описание способов по настоящему изобретению для получения антител по настоящему изобретениюGeneral description of the methods of the present invention for obtaining antibodies of the present invention

Иллюстративный способ синтеза антител по настоящему изобретению.An exemplary method for synthesizing antibodies of the present invention.

ДНК, кодирующую V_H и VL антитела хомячка к CD154 мыши, или IDEC-131, или варианта, раскрытого в данном документе, клонировали и сливали с ДНК, кодирующей CH1, CH2, СН3 область γ1 человека, или с вариантами IgG1, раскрытыми в данном документе. Нуклеотидные последовательности подтверждали с применением секвенатора Megabace™. Плазмидным вектором экспрессии, рЕЕ12, содержащим как тяжелую, так и легкую цепи каждого из вариантов MR1, трансфицировали клетки NS0 и продукты очищали в помощью хроматографии на белке А.DNA encoding the V _H and VL of a hamster anti-mouse CD154 antibody, or IDEC-131, or a variant disclosed herein, was cloned and fused with DNA encoding the CH1, CH2, CH3 region of human γ1, or the IgG1 variants disclosed herein. document. Nucleotide sequences were confirmed using a Megabace™ sequencer. The plasmid expression vector, pEE12, containing both the heavy and light chains of each of the MR1 variants, was transfected into NS0 cells and the products were purified by protein A chromatography.

Связывание антител по настоящему изобретению с CD154.Binding of antibodies of the present invention to CD154.

- 12 040553- 12 040553

Сравнение активности связывания вариантов антитела к CD154 определяли по их связыванию с клетками СНО, трансфицированными CD154 мыши. CD154-экспрессирующие клетки СНО инкубировали с меченным биотином aCD154 в присутствии немеченных вариантов тяжелой цепи aCD154 или родственных по изотипу антител в течение 1 ч при 4°С. Связывание биотинилированного MR1 обнаруживали с помощью конъюгированного со стрептавидином флуорохрома и выполняли проточную цитометрию. Процент ингибирования вариантами можно определить путем регистрации значений снижения средней интенсивности флуоресценции окрашенных MR1 клеток.Comparison of the binding activity of anti-CD154 antibody variants was determined by their binding to CHO cells transfected with mouse CD154. CD154-expressing CHO cells were incubated with biotin labeled aCD154 in the presence of unlabeled aCD154 heavy chain variants or isotype-related antibodies for 1 hour at 4°C. Binding of biotinylated MR1 was detected with streptavidin-conjugated fluorochrome and flow cytometry was performed. Percent inhibition by the variants can be determined by recording the reduction in mean fluorescence intensity of MR1-stained cells.

Период полувыведения антител с применением ELISA.Elimination half-life of antibodies using ELISA.

ELISA или Biacore можно применять для определения периода полувыведения in vivo вариантов IgG1-антитела человека. Концентрации hIgG1 в сыворотке крови можно определять в установленное время, например, через 1 месяц после введения.ELISA or Biacore can be used to determine the in vivo half-life of human IgG1 antibody variants. Serum hIgG1 concentrations can be determined at a set time, eg 1 month after administration.

Связывание вариантов с FcR.Linking variants to FcR.

Связывание вариантов IgG1-mAb с FcR можно определить с помощью твердофазного анализа. Вкратце, планшеты для ELISA Maxisorb можно покрыть FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIIIA мыши или человека (R & D Systems). Можно получить биотинилированные версии вариантов. Связывание можно определить с помощью колориметрического обнаружения с применением связанного с ферментом авидина. Снижение связывания определяют для варианта при сравнении с молекулой WT.Binding of IgG1-mAb variants to FcR can be determined using solid phase analysis. Briefly, Maxisorb ELISA plates can be coated with mouse or human FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB or FcyRIIIA (R&D Systems). You can get biotinylated versions of the variants. Binding can be determined by colorimetric detection using enzyme-bound avidin. Reduction in binding is determined for the variant when compared to the WT molecule.

Связывание mAb aCD154 с C1q человека.Binding of mAb aCD154 to human C1q.

Это можно осуществлять с применением известных способов или, как описано в данном документе. Очищенный C1q человека можно титровать в лунки планшетов для ELISA Maxisorb, в которые были абсорбированы варианты IgG1 MR1 или IDEC-131. Связанный C1q будет обнаруживаться с помощью меченного HRP антитела цыпленка к C1q. Все варианты будут сравниваться со связыванием C1q с IgG1 MR1 WT, как описывается в (Ferrant, J.L., Benjamin, C.D., Cutler, A.H., Railed, S.L., Hsu, Y.M., Garber, E.A., Hess, D.M., Shapiro, R.I., Kenyon, N.S., Harlan, D.M., Kirk, A.D., Burkly, L.C. and Taylor, F.R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge, Int Immunol 2004. 16: 1583-1594.; и Taylor, P.A., Lees, C.J., Wilson, J.M., Ehrhardt, M.J., Campbell, M.T., Noelle, R.J. and Blazar, B.R., Combined effects of calcineurin inhibitors or sirolimus with anti-CD40L mAb on alloengraftment under nonmyeloablative conditions, Blood 2002. 100: 3400-3407).This can be done using known methods or as described herein. Purified human C1q can be titrated into wells of Maxisorb ELISA plates into which MR1 or IDEC-131 IgG1 variants have been absorbed. Bound C1q will be detected with an HRP-labeled chicken anti-C1q antibody. All variants will be compared with C1q binding to IgG1 MR1 WT as described in (Ferrant, J.L., Benjamin, C.D., Cutler, A.H., Railed, S.L., Hsu, Y.M., Garber, E.A., Hess, D.M., Shapiro, R.I., Kenyon, N.S., Harlan, D.M., Kirk, A.D., Burkly, L.C. and Taylor, F.R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge, Int Immunol 2004. 16: 1583-1594 .; and Taylor, P.A., Lees, C.J., Wilson, J.M., Ehrhardt, M.J., Campbell, M.T., Noelle, R.J. and Blazar, B.R., Combined effects of calcineurin inhibitors or sirolimus with anti-CD40L mAb on alloengraftment under nonmyeloablative conditions, Blood 2002. 100: 3400-3407).

Индукция толерантности мутантными mAb aCD154.Tolerance induction by mutant mAb aCD154.

Способность антитела к CD154 вызывать толерантность или продолжительную иммуносупрессию можно определить известными способами и, конкретно, как описано в данном документе. Антитело хомячка к CD154 мыши, которое получали в лаборатории авторов настоящего изобретения, MR1, обычно индуцирует долгосрочную толерантность к трансплантату, как было показано (Quezada, S.A., Fuller, В., Jarvinen, L.Z., Gonzalez, M., Blazar, B.R., Rudensky, A.Y., Strom, Т.В. and Noelle, R.J., Mechanisms of donor-specific transfusion tolerance: preemptive induction of clonal T-cell exhaustion via indirect presentation, Blood 2003. 102: 1920-1926; Quezada, S.A., Bennett, K., Blazar, B.R., Rudensky, A.Y., Sakaguchi, S. and Noelle, R.J., Analysis of the underlying cellular mechanisms of anti-CD154-induced graft tolerance: the interplay of clonal anergy and immune regulation, J Immunol 2005. 175: 771-779; Rossini, A.A., Parker, D.C., Phillips, N.E., Durie, F.H., Noelle, R.J., Mordes, J.P. and Greiner, D.L., Induction of immunological tolerance to islet allografts, Cell Transplant 1996. 5:49-52).The ability of an anti-CD154 antibody to induce tolerance or sustained immunosuppression can be determined by known methods and specifically as described herein. The hamster anti-mouse CD154 antibody prepared in our laboratory, MR1, generally induces long-term graft tolerance as shown (Quezada, S.A., Fuller, B., Jarvinen, L.Z., Gonzalez, M., Blazar, B.R., Rudensky , A.Y., Strom, T.B. and Noelle, R.J., Mechanisms of donor-specific transfusion tolerance: preemptive induction of clonal T-cell exhaustion via indirect presentation, Blood 2003. 102: 1920-1926; Quezada, S.A., Bennett, K ., Blazar, B.R., Rudensky, A.Y., Sakaguchi, S. and Noelle, R.J., Analysis of the underlying cellular mechanisms of anti-CD154-induced graft tolerance: the interplay of clonal anergy and immune regulation, J Immunol 2005. 175: 771 -779; Rossini, A.A., Parker, D.C., Phillips, N.E., Durie, F.H., Noelle, R.J., Mordes, J.P. and Greiner, D.L., Induction of immunological tolerance to islet allografts, Cell Transplant 1996. 5:49-52).

Толерантность индуцируется совместным введением аллоантигена (в форме донорских клеток селезенки) и aCD154. Было показано, что MR1 в форме гуманизированного IgG1 также индуцирует толерантность 24 к трансплантату, и, следовательно, вариант y1 WT будет служить в качестве положительного контроля для индукции толерантности. Мутантные версии MR1, у которых была утрачена способность связывать систему комплемента, будут тестировать в отношении их способности индуцировать толерантность к трансплантату.Tolerance is induced by co-administration of the alloantigen (in the form of donor spleen cells) and aCD154. MR1 in the form of humanized IgG1 has also been shown to induce graft tolerance 24 and therefore the y1 WT variant will serve as a positive control for tolerance induction. Mutant versions of MR1 that have lost the ability to bind the complement system will be tested for their ability to induce transplant tolerance.

Трансплантацию кожи выполняют по модифицированной методике, применяемой Markees et al. (12). Вкратце, самцов мышей CB6F1 одного возраста будут использовать в качестве доноров как клеток селезенки (DST), так и кожных трансплантатов. Мышам-реципиентам C57BL/6 будут инъецировать 5х10⁷ клеток DST в 500 мкл сбалансированного солевого раствора Хенкса с помощью инъекции в хвостовую вену (внутривенно) или не будут инъецировать их, а также 500 мкг aCD154 WT, или мутантного aCD154, или контрольного иммуноглобулина хомячка или человека (HIgG1) в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) внутрибрюшинно в дни -3, -5 и -7. Мышей будут обрабатывать соответствующим антителом (250 мкг/инъекция) 3 раза в неделю, а затем в течение всего эксперимента. В день 0 мышейреципиентов будут подвергать анестезии с помощью 50 мкг на грамм веса тела каждого из кетамина и ксилазина, инъецируемых внутрибрюшинно (15 мг/мл в PBS), и кожные трансплантаты от CB6F1 будут получать с помощью общепринятых способов. Отторжение будет определяться по дню, в который останется менее 20% кожного трансплантата. Оценку в отношении отторжения кожного трансплантата у животных будут проводить в течение 100 дней. Кроме того, у каждой из групп с толерантностью кожные трансплантаты будут забирать в день 100 и оценивать с помощью гистохимического анализа в отношении лейкоцитарных инфильтратов и оценивать в баллах на основании числа клеток/измеряемой площаSkin grafting is performed according to a modified technique used by Markees et al. (12). Briefly, male CB6F1 mice of the same age will be used as donors for both spleen cells (DST) and skin grafts. C57BL/6 recipient mice will be injected with 5 x ^{10 7} DST cells in 500 µl of Hank's balanced salt solution via tail vein injection (i.v.) or will not be injected with 500 µg of aCD154 WT or aCD154 mutant or control hamster immunoglobulin or human (HIgG1) in phosphate buffered saline (PBS) intraperitoneally on days -3, -5 and -7. Mice will be treated with the appropriate antibody (250 μg/injection) 3 times a week and then throughout the experiment. On day 0, recipient mice will be anesthetized with 50 μg per gram of body weight each of ketamine and xylazine injected intraperitoneally (15 mg/ml in PBS) and skin grafts from CB6F1 will be obtained using conventional methods. Rejection will be determined by the day that less than 20% of the skin graft remains. Animals will be evaluated for skin graft rejection for 100 days. In addition, from each of the tolerance groups, skin grafts will be harvested on day 100 and assessed by histochemical analysis for leukocyte infiltrates and scored based on cell number/area measured.

- 13 040553 ди. Наконец, трансплантаты от стороннего производителя (H-2Kskin) будут трансплантировать мышам с индуцированной толерантностью (в выбранных группах), чтобы удостовериться, что индуцированная толерантность является антигенспецифичной, как было опубликовано ранее для этой системы (Markees, T.G., Phillips, N.E., Noelle, R.J., Shultz, L.D., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Prolonged survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand, Transplantation 1997. 64: 329-335, Markees, Т., Phillips, N., Gordon, E., Noelle, R.J., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Improved skin allograft tolerance induced by treatment with donor splenocytes and an extended course of anti-CD154 monoclonal antibody, Transplant Proc 1998. 30: 2444-2446; Markees, T.G., Appel, M.C., Noelle, R.J., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Tolerance to islet xenografts induced by dual manipulation of antigen presentation and co-stimulation, Transplantation Proceedings 1996. 28: 814-815) гуморального иммунитета с мутантными mAb aCD154.- 13 040553 di. Finally, transplants from a third party (H-2Kskin) will be transplanted into tolerance-induced mice (in selected groups) to ensure that the induced tolerance is antigen-specific, as previously published for this system (Markees, T.G., Phillips, N.E., Noelle, R.J., Shultz, L.D., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Prolonged survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand, Transplantation 1997. 64: 329-335, Markees, T., Phillips, N., Gordon, E., Noelle, R.J., Mordes, J.P., Greiner, D.L. and Rossini, A.A., Improved skin allograft tolerance induced by treatment with donor splenocytes and an extended course of anti-CD154 monoclonal antibody, Transplant Proc 1998 30: 2444-2446; Markees, T. G., Appel, M. C., Noelle, R. J., Mordes, J. P., Greiner, D. L. and Rossini, A. A., Tolerance to islet xenografts induced by dual manipulation of antigen presentation and co-stimulation, Transplantation Proceedings 1996. 28: 814-815) of humoral immunity with aCD154 mutant mAbs.

В дополнение к измерению влияния мутаций в отношении системы комплемента и FcR на толерантность также будут анализировать влияние обработки антителом на развитие первичного и вторичного гуморальных иммунных ответов, как описано ранее. Вкратце, мышей (4/группа) будут иммунизировать овальбумином цыпленка в CFA (200 мкг/мышь) и обрабатывать вариантами MR1 (200 мкг/мышь х3 раза/неделя). В дни 7, 14 и 21 уровень IgM и IgG к OVA будут измерять с помощью стандартизированного ELISA в отношении антител к OVA и количественно определять концентрации антител к OVA в сыворотке крови.In addition to measuring the effect of mutations in the complement system and FcR on tolerance, the effect of antibody treatment on the development of primary and secondary humoral immune responses will also be analyzed, as previously described. Briefly, mice (4/group) will be immunized with chick ovalbumin in CFA (200 μg/mouse) and treated with MR1 variants (200 μg/mouse x 3 times/week). On days 7, 14 and 21, anti-OVA IgM and IgG levels will be measured using a standardized anti-OVA antibody ELISA and quantitate serum anti-OVA antibody concentrations.

Исследования токсичности mAb (aCD154 по настоящему-изобретению.Toxicity studies mAb (aCD154 according to the present invention.

Тромбогенную активность aCD154 демонстрировали на мышиной модели с использованием мышей, которые экспрессируют FcyRIIA человека. Эта модель уподобляет результаты токсичности у NHP с использованием как интактной, так и агликозилированной форм антитела к CD154 человека. Вкратце, мышам будут инъецировать предварительно образованные иммунные комплексы (IC) SCD154 (R & D Systems) и каждый вариант aCD154 (138 мкг mAb и 50 мкг Ag, соответствующий примерно 500 нМ IC при стехиометрическом соотношении 1:3 (mAb/Ag)). После инъекции, если смесь является тромболитической, у мышей будет проявляться продолжительная дезориентация, учащенное дыхание и нарушение двигательной функции. Ожидается, что те, которые проявляют такую активность, оказывают существенное снижение на количество тромбоцитов. Через 60 мин легкие будут собирать, фиксировать в формалине, получать срезы и окрашивать с помощью Н&Е. Срезы легких мышей будут оценивать на предмет наличия тромбоза (измеряемого по внутрисосудистым тромбам) и будут подсчитывать число тромбов/срез. От каждой мыши будут подсчитывать 10 срезов и общее число тромбов сравнивать между всеми группами, получавшими обработку различными вариантами IgG1 MR1. Кроме того, общее количество тромбоцитов (собранных посредством пункции сердца во время эвтаназии) будут оценивать с помощью проточной цитометрии, и оно, как ожидается, будет снижаться на 80% с использованием тех антител, которые являются тромбогенными. Эти результаты будут определять, какие из вариантов MR1 (связывание FcR (N325L, K326V, E269R)) являются тромбогенными, и оказывает ли изменение связывания FcR влияние на изменение этой активности.The thrombogenic activity of aCD154 was demonstrated in a mouse model using mice that express human FcyRIIA. This model compares the results of NHP toxicity using both intact and aglycosylated forms of the anti-human CD154 antibody. Briefly, mice will be injected with preformed immune complexes (ICs) of SCD154 (R&D Systems) and each aCD154 variant (138 µg mAb and 50 µg Ag, corresponding to about 500 nM IC at a 1:3 stoichiometric ratio (mAb/Ag)). After injection, if the mixture is thrombolytic, mice will show prolonged disorientation, rapid breathing, and impaired motor function. Those that exhibit such activity are expected to have a significant reduction in platelet count. After 60 minutes, the lungs will be harvested, formalin-fixed, sectioned and stained with H&E. Lung sections of mice will be assessed for the presence of thrombosis (as measured by intravascular thrombi) and the number of thrombi/section will be counted. 10 sections will be counted from each mouse and the total number of clots compared between all groups treated with different IgG1 MR1 variants. In addition, the total platelet count (collected by cardiac puncture at the time of euthanasia) will be assessed by flow cytometry and is expected to be reduced by 80% using those antibodies that are thrombogenic. These results will determine which of the MR1 variants (FcR (N325L, K326V, E269R) binding) are thrombogenic and whether altering FcR binding has an effect on altering this activity.

Блокирование развития опосредуемого Т-клетками аутоиммунного заболевания, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ).Blocking the development of a T-cell mediated autoimmune disease, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).

Самок мышей C57BL/6 возрастом 5-8 недель будут иммунизировать подкожным введением 200 мкг пептида MOG35-55, эмульгированного в CFA, дополненном 5 мг/мл Mycobacterium tuberculosis. Мыши будут получать внутрибрюшинные инъекции 250 нг коклюшного токсина во время иммунизации и спустя 48 ч. Через 7 дней мышам будут проводить аналогичную бустерную иммунизацию с MOG/CFA без коклюшного токсина. Клинические проявления болезни обычно начинаются в промежутке между днем 16 и днем 20 после иммунизации. Мышам будут вводить каждый из вариантов MR1, IgG человека (в качестве контроля для вариантов), Ig хомячка (в качестве контроля для MR1) или MR1 хомячка (200 мкг/мышь 3х/неделя) на протяжении всего эксперимента (50 дней).Female C57BL/6 mice 5-8 weeks old will be immunized by subcutaneous injection of 200 μg of MOG35-55 peptide emulsified in CFA supplemented with 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis. Mice will receive intraperitoneal injections of 250 ng of pertussis toxin at the time of immunization and 48 hours later. After 7 days, mice will receive a similar booster immunization with MOG/CFA without pertussis toxin. Clinical manifestations of the disease usually begin between day 16 and day 20 after immunization. Mice will be treated with each of the MR1 variants, human IgG (as a variant control), hamster Ig (as a MR1 control) or hamster MR1 (200 μg/mouse 3x/week) for the duration of the experiment (50 days).

Клиническая оценка. Мышей будут оценивать в баллах четыре раза в неделю следующим образом: 0, отсутствие обнаруживаемых признаков ЕАЕ; 0,5, потеря тонуса в дистальной части хвоста; 1, полная потеря тонуса в хвосте; 1,5, потеря тонуса в хвосте и слабость задних конечностей; 2, односторонний частичный паралич задних конечностей; 2,5, двусторонний частичный паралич задних конечностей; 3, полный двусторонний паралич задних конечностей; 3,5, полный паралич задних конечностей и односторонний паралич передних конечностей; 4, полный паралич как передних конечностей, так и задних конечностей; 5, смерть. Мышей с баллом оценки, превышающим 4, но меньшим, чем 5, будут подвергать эвтаназии.Clinical assessment. Mice will be scored four times per week as follows: 0, no detectable signs of EAE; 0.5, loss of tone in the distal part of the tail; 1, complete loss of tone in the tail; 1.5, loss of tone in the tail and weakness of the hind limbs; 2, unilateral partial paralysis of the hind limbs; 2.5, bilateral partial paralysis of the hind limbs; 3, complete bilateral hind limb paralysis; 3.5, complete paralysis of the hind limbs and unilateral paralysis of the forelimbs; 4, complete paralysis of both the forelimbs and hind limbs; 5, death. Mice with a score greater than 4 but less than 5 will be euthanized.

Определение токсичности.Definition of toxicity.

Требуемое антитело в соответствии с настоящим изобретением будет характеризоваться значительно сниженной токсичностью или ее отсутствием в раскрытой животной модели тромбоза. С помощью моделей, описанных выше, будет показано, что IgG1-антитела к CD154, где константные области тяжелой цепи содержат мутацию E269R и мутацию К322А (в соответствии со схемой нумерации по Kabat), не вызывают агрегацию тромбоцитов.The desired antibody of the present invention will have significantly reduced or no toxicity in the disclosed animal model of thrombosis. Using the models described above, it will be shown that anti-CD154 IgG1 antibodies, where the heavy chain constant regions contain the E269R mutation and the K322A mutation (according to the Kabat numbering scheme), do not cause platelet aggregation.

- 14 040553- 14 040553

Определение эффективности.Definition of efficiency.

Эффективность (индукцию толерантности) можно оценивать в моделях толерантности к кожному трансплантату, как описано выше.Efficacy (tolerance induction) can be assessed in skin graft tolerance models as described above.

Фармацевтические и диагностические применения антитела к hCD154 по настоящему изобретению.Pharmaceutical and diagnostic uses of an anti-hCD154 antibody of the present invention.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать иммунный ответ у субъекта. Антитело по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят субъекту в эффективном для ингибирования количестве.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting an immune response in a subject. The antibody of the present invention or the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a subject in an inhibitory effective amount.

В определенных вариантах осуществления эффективное для ингибирования количество антитела к CD154 или фармацевтической композиции, содержащей антитело, представляет собой любое количество, которое является эффективным для ингибирования взаимодействия CD154-CD40 у субъекта, которому их вводят. Способы определения количества, обеспечивающего ингибирование хорошо известны специалистам в данной области техники, и оно зависит от определенных факторов, в том числе без ограничения типа вовлекаемого субъекта, метрических данных и возраста субъекта и фармакокинетических свойств конкретного доставляемого терапевтического средства.In certain embodiments, an inhibitory effective amount of an anti-CD154 antibody or a pharmaceutical composition comprising the antibody is any amount that is effective to inhibit CD154-CD40 interaction in a subject to which they are administered. Methods for determining the amount to provide inhibition are well known to those skilled in the art and will depend on certain factors, including, without limitation, the type of subject involved, the metrics and age of the subject, and the pharmacokinetic properties of the particular therapeutic agent being delivered.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD 154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать иммунный ответ за счет ингибирования взаимодействия CD154-CD40.In another specific embodiment of the present invention, the anti-CD 154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting an immune response by inhibiting CD154-CD40 interaction.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать воспаление. Для целей настоящего изобретения воспалительные ответы характеризуются покраснением, опуханием, жаром и болью, как следствия расширения капилляров, с отеком и миграцией фагоцитирующих лейкоцитов. Некоторые примеры воспалительных ответов включают артрит, контактный дерматит, синдром гиперпродукции IgE, воспалительное заболевание кишечника, аллергическую астму и идиопатическое воспалительное заболевание. Идиопатическое воспалительное заболевание включает, например, псориаз и волчанку (например, системную красную волчанку (SLE), лекарственную красную волчанку и волчаночный нефрит). См., например, Gallin 1989. Fundamental Immunology, главу 26, Raven Press, 2-е изд., стр. 721-733, New York. В настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения симптома системной красной волчанки (SLE) у индивидуума, при этом способ включает введение индивидууму антитела к CD154 по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения симптома SLE.In one embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting inflammation. For the purposes of the present invention, inflammatory responses are characterized by redness, swelling, heat and pain as a consequence of capillary dilation, with edema and migration of phagocytic leukocytes. Some examples of inflammatory responses include arthritis, contact dermatitis, IgE overproduction syndrome, inflammatory bowel disease, allergic asthma, and idiopathic inflammatory disease. Idiopathic inflammatory disease includes, for example, psoriasis and lupus (eg, systemic lupus erythematosus (SLE), drug-induced lupus erythematosus, and lupus nephritis). See, for example, Gallin 1989. Fundamental Immunology, chapter 26, Raven Press, 2nd ed., pp. 721-733, New York. The present invention provides a method for treating or preventing a symptom of systemic lupus erythematosus (SLE) in a subject, the method comprising administering to the subject an anti-CD154 antibody of the present invention in an amount effective to treat or prevent the symptom of SLE.

Некоторые примеры артрита включают ревматоидный артрит, неревматоидный артрит, артрит, ассоциированный с болезнью Лайма, и воспалительный остеоартрит. Некоторые примеры идиопатического воспалительного заболевания включают псориаз и системную волчанку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать отторжение организмом субъекта трансплантированного органа.Some examples of arthritis include rheumatoid arthritis, non-rheumatoid arthritis, Lyme disease-associated arthritis, and inflammatory osteoarthritis. Some examples of idiopathic inflammatory disease include psoriasis and systemic lupus. In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody or a pharmaceutical composition comprising the antibody is capable of inhibiting the body's rejection of a transplanted organ.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать отторжение организмом субъекта трансплантированных сердца, почки, печени, кожи, островковых клеток поджелудочной железы или костного мозга.In a more specific embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting rejection by a subject's body of transplanted heart, kidney, liver, skin, pancreatic islet cells, or bone marrow.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать реакцию трансплантат против хозяина у субъекта.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting graft-versus-host disease in a subject.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аллергические ответы у субъекта, например сенную лихорадку или аллергию на пенициллин или другие лекарственные средства.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting allergic responses in a subject, such as hay fever or allergy to penicillin or other drugs.

В одном аспекте рассматриваемые антитела к CD154, в том числе INX021, пригодны для уменьшения интенсивности или предупреждения реакций на лекарственное средство, в частности реакций в ответ на биологические препараты и другие лекарственные средства, такие как терапевтические антитела, слитые белки, гормоны, факторы роста, ферменты, пептиды, антибиотики, противовирусные препараты и т.п. Это может обеспечить возможность введения этих лекарственных средств в течение более продолжительного периода времени, может увеличить число пациентов, которые отвечают на лекарственное средство, и/или может способствовать эффективности лекарственного препарата у пациентов, не получавших лечение. Их примеры известны из уровня техники, и включают хумиру, энбрел, ритуксан, ксолар, герцептин и авастин.In one aspect, contemplated anti-CD154 antibodies, including INX021, are useful in reducing or preventing drug reactions, in particular reactions to biologics and other drugs such as therapeutic antibodies, fusion proteins, hormones, growth factors, enzymes, peptides, antibiotics, antivirals, etc. This may allow these drugs to be administered over a longer period of time, may increase the number of patients who respond to the drug, and/or may contribute to the efficacy of the drug in untreated patients. Examples thereof are known in the art and include Humira, Enbrel, Rituxan, Xolair, Herceptin and Avastin.

Другие примеры терапевтических антител, где рассматриваемые антитела к CD154 можно применять для предупреждения или уменьшения интенсивности реакции в ответ на лекарственное средство, включают следующие: 3F8, 8Н9, абаговомаб, абциксимаб, абитузумаб, абрилумаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, адуканумаб, афасевикумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб пэгол, ALD518, алемтузумаб, алирокумаб, алтумомаб пентетат, аматуксимаб, анатумомаб мафенатокс, анетумаб равтансин, анифролумаб, анрукинзумаб, аполизумаб, арцитумомаб, аскринвакумаб, аселизумаб, атезолизумаб,Other examples of therapeutic antibodies where contemplated anti-CD154 antibodies can be used to prevent or attenuate drug reactions include the following: 3F8, 8H9, abagovomab, abciximab, abituzumab, abrilumab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, aducanumab, afacevicumab, afelimomab , afutuzumab, alacizumab pegol, ALD518, alemtuzumab, alirocumab, altumomab pentetate, amatuximab, anatumomab mafenatox, anetumab ravtansin, anifrolumab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumab, askrinvacumab, aselizumab, atezumab

- 15 040553 атинумаб, атлизумаб (= тоцилизумаб), аторолимумаб, авелумаб, бапинеузумаб, базиликсимаб, бавитуксимаб, бектумомаб, бегеломаб, белимумаб, бенрализумаб, бертилимумаб, бесилезомаб, бевацизумаб, безлотоксумаб, бициромаб, бимагрумаб, бимекизумаб, биватузумаб мертансин, блеселумаб, блинатумомаб, блонтуветмаб, блосозумаб, бокоцизумаб, брентуксимаб ведотин, бриакинумаб, бродалумаб, бролуцизумаб, бронтиктузумаб, кабирализумаб, канакинумаб, кантузумаб мертансин, кантузумаб равтансин, каплацизумаб, капромаб пендетид, карлумаб, каротуксимаб, катумаксомаб, иммуноконъюгат CBR96доксорубицин, цеделизумаб, цергутузумаб амуналейкин, цертолизумаб пэгол, цетуксимаб, Ch.14.18, цитатузумаб богатокс, циксутумумаб, клазакизумаб, кленоликсимаб, кливатузумаб тетраксетан, кодритузумаб, колтуксимаб равтансин, конатумумаб, концизумаб, кренезумаб, кротедумаб, CR6261, дацетузумаб, даклизумаб, далотузумаб, дапиролизумаб пэгол, даратумумаб, дектрекумаб, демцизумаб, денинтузумаб мафодотин, денозумаб, дерлотуксимаб биотинилированный, детумомаб, динутуксимаб, диридавумаб, дапиролизумаб пэгол, даратумумаб, дектрекумаб, демцизумаб, денинтузумаб мафодотин, денозумаб, дерлотуксимаб биотинилированный, детумомаб, динутуксимаб, диридавумаб, домагрозумаб, дорлимомаб аритокс, дрозитумаб, дулиготумаб, дупилумаб, дурвалумаб, дусигитумаб, экромексимаб, экулизумаб, эдобакомаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элделумаб, элгемтумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элделумаб, элгемтумаб, элотузумаб, элсилимомаб, эмактузумаб, эмибетузумаб, эмицизумаб, энаватузумаб, энфортумаб ведотин, энлимомаб пэгол, эноблитузумаб, энокизумаб, энситуксимаб, эпитумомаб цитуксетан, эпратузумаб, эрлизумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этролизумаб, эвинакумаб, эволокумаб, эксбивирумаб, фанолезомаб, фаралимомаб, фарлетузумаб, FBTA05, фелвизумаб, фезакинумаб, фибатузумаб, фиклатузумаб, фигитумумаб, фиривумаб, фланвотумаб, флетикумаб, фонтолизумаб, форалумаб, форавирумаб, фрезолимумаб, фулранумаб, футуксимаб, галканезумаб, галиксимаб, ганитумаб, гантенерумаб, гавилимомаб, гемтузумаб озогамицин, гевокизумаб, гирентуксимаб, глембатумумаб ведотин, голимумаб, гомиликсимаб, гуселькумаб, ибализумаб, ибритумомаб тиуксетан, икрукумаб, идаруцизумаб, иговомаб, IMAB362, ималумаб, имциромаб, имгатузумаб, инклакумаб, индатуксимаб равтансин, индусатумаб ведотин, инебилизумаб, инфликсимаб, интетумумаб, инолимомаб, инотузумаб озогамицин, иплимумаб, иратумумаб, изатуксимаб, итолизумаб, иксекизумаб, келиксимаб, лабетузумаб, ламбролизумаб, лампализумаб, ланаделумаб, лапритуксимаб эмтанзин, лебрикизумаб, лендализумаб, лензилумаб, лерделимумаб, лексатумумаб, либивирумаб, лифастузумаб ведотин, лигелизумаб, лилотомаб сатетраксетан, линтузумаб, лирилумаб, лоделцизумаб, локиветмаб, лорвотузумаб мертанзин, лукатумумаб, лулизумаб пэгол, лумиликсимаб, лумретузумаб, мапатумумаб, маргетуксимаб, маслимомаб, маврилимумаб, матузумаб, меполизумаб, метелимумаб, милатузумаб, минретумомаб, мирветуксимаб соравтанзин, митумомаб, могамулизумаб, монализумаб, моролимумаб, мотавизумаб, моксетумомаб пасудотокс, муромонаб-CD3, наколомаб тафенатокс, намилумаб, наптумомаб эстафенатокс, наратуксимаб эмтанзин, нарнатумаб, натализумаб, навициксизумаб, навивумаб, небакумаб, нецитумумаб, немолизумаб, нерелимомаб, несвакумаб, нимотузумаб, нимотузумаб, нимотузумаб, ниволумаб, нофетумомаб мерпентан, обилтоксаксимаб, обинутузумаб, окаратузумаб, окрелизумаб, одулимомаб, офатумумаб, оларатумаб, олокизумаб, онтуксизумаб, опицинумаб, опортузумаб монакокс, ореговомаб, ортикумаб, отеликсизумаб, отлертузумаб, окселумаб, озанезумаб, озорализумаб, пагибаксимаб, паливизумаб, памревлумаб, панитумумаб, панкомаб, панобакумаб, парсатузумаб, пасколизумаб, пасотуксизумаб, патеклизумаб, патритумаб, пембролизумаб, пемтумомаб, перакизумаб, перакизумаб, пертузумаб, пекселизумаб, пинатузумаб ведотин, пинтумамаб, плакулумаб, плозализумаб, погализумаб, полатузумаб ведотин, понезумаб, презализумаб, приликсимаб, притоксаксимаб, притумумаб, PRO 140, квилизумаб, ракотумомаб, радретумаб, рафивирумаб, ралпанцизумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб, раксибакумаб, рефанезумаб, регавирумаб, реслизумаб, рилотумумаб, ринукумаб, ритуксимаб, ривабазумаб пэгол, робатумумаб, роледумаб, ромосозумаб, ронтализумаб, ровалпитузумаб тезирин, ровелизумаб, руплизумаб, сацитузумаб говитекан, самализумаб, сапелизумаб, сарилумаб, сатумомаб пендетид, секукинумаб, серибантумаб, сетоксаксимаб, севирумаб, сибротузумаб, SGN-CD19A, SGN-CD33A, сифалимумаб, силтуксимаб, симтузумаб, сиплизумаб, сирукумаб, софитузумаб ведотин, соланезумаб, солитомаб, сонепцизумаб, сонтузумаб, стамулумаб, сулезомаб, сувизумаб, табалумаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, тамтуветмаб, танезумаб, таплитумомаб паптокс, тарекстумаб, тефибазумаб, телимомаб аритокс, тенатумомаб, тенеликсимаб, теплизумаб, тепротумумаб, тепротумумаб, тесидолумаб, тетуломаб, тезепелумаб, TGN1412, тицилимумаб (тремелимумаб), тилдракизумаб, тигатузумаб, тимолумаб, тисотумаб ведотин, TNX-650, тоцилизумаб (атлизумаб), торализумаб, тосатоксумаб, тоситумомаб, товетумаб, тралокинумаб, трастузумаб, трастузумаб эмтанзин, TRBS07, трегализумаб, тремелимумаб, тревогрумаб, тукотузумаб целмолейкин, тувирумаб, ублитуксимаб, улокуплумаб, урелумаб, уртоксазумаб, устекинумаб, вадастуксимаб талирин, вандортузумаб, ведотин, вантиктумаб, вануцизумаб, вапаликсимаб, варлилумаб, вателизумаб, вепалимомаб, весенкумаб, визилизумаб, вобарилизумаб, волоциксимаб, ворсетузумаб мафодотин, вотумумаб, ксентузумаб, залутумумаб, занолимумаб, затуксимаб, зиралимумаб и золимомаб аритокс.- 15 040553 атинумаб, атлизумаб (= тоцилизумаб), аторолимумаб, авелумаб, бапинеузумаб, базиликсимаб, бавитуксимаб, бектумомаб, бегеломаб, белимумаб, бенрализумаб, бертилимумаб, бесилезомаб, бевацизумаб, безлотоксумаб, бициромаб, бимагрумаб, бимекизумаб, биватузумаб мертансин, блеселумаб, блинатумомаб, блонтуветмаб, блосозумаб, бокоцизумаб, брентуксимаб ведотин, бриакинумаб, бродалумаб, бролуцизумаб, бронтиктузумаб, кабирализумаб, канакинумаб, кантузумаб мертансин, кантузумаб равтансин, каплацизумаб, капромаб пендетид, карлумаб, каротуксимаб, катумаксомаб, иммуноконъюгат CBR96доксорубицин, цеделизумаб, цергутузумаб амуналейкин, цертолизумаб пэгол, цетуксимаб , Ch.14.18, цитатузумаб богатокс, циксутумумаб, клазакизумаб, кленоликсимаб, кливатузумаб тетраксетан, кодритузумаб, колтуксимаб равтансин, конатумумаб, концизумаб, кренезумаб, кротедумаб, CR6261, дацетузумаб, даклизумаб, далотузумаб, дапиролизумаб пэгол, даратумумаб, дектрекумаб, демцизумаб, денинтузумаб мафодотин, denosumab, derlot уксимаб биотинилированный, детумомаб, динутуксимаб, диридавумаб, дапиролизумаб пэгол, даратумумаб, дектрекумаб, демцизумаб, денинтузумаб мафодотин, денозумаб, дерлотуксимаб биотинилированный, детумомаб, динутуксимаб, диридавумаб, домагрозумаб, дорлимомаб аритокс, дрозитумаб, дулиготумаб, дупилумаб, дурвалумаб, дусигитумаб, экромексимаб, экулизумаб , эдобакомаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элделумаб, элгемтумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элделумаб, элгемтумаб, элотузумаб, элсилимомаб, эмактузумаб, эмибетузумаб, эмицизумаб, энаватузумаб, энфортумаб ведотин, энлимомаб пэгол, эноблитузумаб, энокизумаб, энситуксимаб, эпитумомаб цитуксетан, эпратузумаб, эрлизумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этролизумаб, эвинакумаб, эволокумаб, эксбивирумаб, фанолезомаб, фаралимомаб, фарлетузумаб, FBTA05, фелвизумаб, фезакинумаб, фибатузумаб, фиклатузумаб, фигитумумаб, фиривумаб, фланвотумаб, флетикумаб, фонтолизумаб, форалумаб, форавирумаб, фрезолимумаб, фулранумаб, futuximab, galcanezumab , галиксимаб, ганитумаб, гантенерумаб, гавилимомаб, гемтузумаб озогамицин, гевокизумаб, гирентуксимаб, глембатумумаб ведотин, голимумаб, гомиликсимаб, гуселькумаб, ибализумаб, ибритумомаб тиуксетан, икрукумаб, идаруцизумаб, иговомаб, IMAB362, ималумаб, имциромаб, имгатузумаб, инклакумаб, индатуксимаб равтансин, индусатумаб ведотин, инебилизумаб, инфликсимаб, интетумумаб, инолимомаб, инотузумаб озогамицин, иплимумаб, иратумумаб, изатуксимаб, итолизумаб, иксекизумаб, келиксимаб, лабетузумаб, ламбролизумаб, лампализумаб, ланаделумаб, лапритуксимаб эмтанзин, лебрикизумаб, лендализумаб, лензилумаб, лерделимумаб, лексатумумаб, либивирумаб, лифастузумаб ведотин , лигелизумаб, лилотомаб сатетраксетан, линтузумаб, лирилумаб, лоделцизумаб, локиветмаб, лорвотузумаб мертанзин, лукатумумаб, лулизумаб пэгол, лумиликсимаб, лумретузумаб, мапатумумаб, маргетуксимаб, маслимомаб, маврилимумаб, матузумаб, меполизумаб, метелимумаб, милатузумаб, минретумомаб, мирветуксимаб соравтанзин, митумомаб, могамулизум аб, монализумаб, моролимумаб, мотавизумаб, моксетумомаб пасудотокс, муромонаб-CD3, наколомаб тафенатокс, намилумаб, наптумомаб эстафенатокс, наратуксимаб эмтанзин, нарнатумаб, натализумаб, навициксизумаб, навивумаб, небакумаб, нецитумумаб, немолизумаб, нерелимомаб, несвакумаб, нимотузумаб, нимотузумаб, нимотузумаб, ниволумаб, нофетумомаб мерпентан, обилтоксаксимаб, обинутузумаб, окаратузумаб, окрелизумаб, одулимомаб, офатумумаб, оларатумаб, олокизумаб, онтуксизумаб, опицинумаб, опортузумаб монакокс, ореговомаб, ортикумаб, отеликсизумаб, отлертузумаб, окселумаб, озанезумаб, озорализумаб, пагибаксимаб, паливизумаб, памревлумаб, панитумумаб, панкомаб, панобакумаб, парсатузумаб, пасколизумаб, пасотуксизумаб, патеклизумаб, патритумаб, пембролизумаб, пемтумомаб, перакизумаб, перакизумаб, пертузумаб, пекселизумаб, пинатузумаб ведотин, пинтумамаб, плакулумаб, плозализумаб, погализумаб, полатузумаб ведотин, понезумаб, презализумаб, приликсимаб, притоксаксимаб, притумумаб, PRO 140, quilizumab, r акотумомаб, радретумаб, рафивирумаб, ралпанцизумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб, раксибакумаб, рефанезумаб, регавирумаб, реслизумаб, рилотумумаб, ринукумаб, ритуксимаб, ривабазумаб пэгол, робатумумаб, роледумаб, ромосозумаб, ронтализумаб, ровалпитузумаб тезирин, ровелизумаб, руплизумаб, сацитузумаб говитекан, самализумаб, сапелизумаб , сарилумаб, сатумомаб пендетид, секукинумаб, серибантумаб, сетоксаксимаб, севирумаб, сибротузумаб, SGN-CD19A, SGN-CD33A, сифалимумаб, силтуксимаб, симтузумаб, сиплизумаб, сирукумаб, софитузумаб ведотин, соланезумаб, солитомаб, сонепцизумаб, сонтузумаб, стамулумаб, сулезомаб, сувизумаб , табалумаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, тамтуветмаб, танезумаб, таплитумомаб паптокс, тарекстумаб, тефибазумаб, телимомаб аритокс, тенатумомаб, тенеликсимаб, теплизумаб, тепротумумаб, тепротумумаб, тесидолумаб, тетуломаб, тезепелумаб, TGN1412, тицилимумаб (тремелимумаб), тилдракизумаб, тигатузумаб , timolumab, tisotumab vedotin, TNX-650, tocilizumab (atlyzuma б), торализумаб, тосатоксумаб, тоситумомаб, товетумаб, тралокинумаб, трастузумаб, трастузумаб эмтанзин, TRBS07, трегализумаб, тремелимумаб, тревогрумаб, тукотузумаб целмолейкин, тувирумаб, ублитуксимаб, улокуплумаб, урелумаб, уртоксазумаб, устекинумаб, вадастуксимаб талирин, вандортузумаб, ведотин, вантиктумаб, vanucizumab, vapaliximab, varlilumab, vatelizumab, vepalimumab, vesencumab, vizilizumab, vobarilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotin, votumumab, xentuzumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, and zolimomab aritox.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аутоиммунный ответ у субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунный ответ ассоциирован с или обусловлен состоянием, выбранным из группы, состоя- 16 040553 щей из ревматоидного артрита, тяжелой миастении, системной красной волчанки, болезни Грейвса, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, гемолитической анемии, сахарного диабета, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, рассеянного склероза, псориаза, лекарственных аутоиммунных заболеваний или лекарственной волчанки. В определенных вариантах осуществления аутоиммунный ответ ассоциирован с или обусловлен системной красной волчанкой.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting an autoimmune response in a subject suffering from an autoimmune disease. In some embodiments, the autoimmune response is associated with or due to a condition selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Graves' disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease, Crohn's, multiple sclerosis, psoriasis, drug-induced autoimmune disease, or drug-induced lupus. In certain embodiments, the autoimmune response is associated with or caused by systemic lupus erythematosus.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аутоиммунный ответ у субъекта, страдающего от аутоиммунного ответа, который обусловлен инфекционным заболеванием.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting an autoimmune response in a subject suffering from an autoimmune response that is due to an infectious disease.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аутоиммунный ответ у субъекта, страдающего от аутоиммунного ответа, который обусловлен синдромом Рейтера, спондилоартритом, болезнью Лайма, ВИЧ-инфекцией, сифилисом или туберкулезом.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting an autoimmune response in a subject suffering from an autoimmune response that is due to Reiter's syndrome, spondyloarthritis, Lyme disease, HIV infection, syphilis, or tuberculosis.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать фиброз у субъекта.In one embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting fibrosis in a subject.

Некоторые примеры фиброза включают легочный фиброз или фиброзное заболевание. Некоторые примеры легочного фиброза включают легочный фиброз на фоне синдрома расстройства дыхания у взрослых, лекарственный легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз или гиперчувствительный пневмонит. Некоторые примеры фиброзных заболеваний включают гепатит С; гепатит В; цирроз; цирроз печени на фоне токсического шока; цирроз печени на фоне приема лекарственных средств; цирроз печени на фоне вирусной инфекции и цирроз печени на фоне аутоиммунного заболевания.Some examples of fibrosis include pulmonary fibrosis or fibrotic disease. Some examples of pulmonary fibrosis include pulmonary fibrosis associated with adult respiratory distress syndrome, drug-induced pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, or hypersensitivity pneumonitis. Some examples of fibrotic diseases include hepatitis C; Hepatitis B; cirrhosis; cirrhosis of the liver on the background of toxic shock; cirrhosis of the liver while taking medications; cirrhosis of the liver on the background of a viral infection and cirrhosis of the liver on the background of an autoimmune disease.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать заболевание желудочно-кишечного тракта. Некоторые примеры заболевания желудочно-кишечного тракта включают пищеводную дискинезию, воспалительное заболевание кишечника (в том числе болезнь Крона и язвенный колит), гастрит, коллагенозный колит (в том числе лимфоцитарный колит и микроскопический колит), целиакию (также называемую глютеновой энтеропатией, целиакией-спру или непереносимостью глютена) и склеродермию.In one embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting a disease of the gastrointestinal tract. Some examples of gastrointestinal disease include esophageal dyskinesia, inflammatory bowel disease (including Crohn's disease and ulcerative colitis), gastritis, collagenous colitis (including lymphocytic colitis and microscopic colitis), celiac disease (also called celiac disease, celiac sprue). or gluten intolerance) and scleroderma.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать сосудистое заболевание. Некоторые примеры сосудистого заболевания включают атеросклероз, заболевание, поражающее почечные артерии, лимфедему, ишемические нарушения и реперфузионное повреждение. Также включены иммунокомплексные заболевания с коллагенозом сосудов, такие как системная красная волчанка или криоглобулинемия.In one embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting vascular disease. Some examples of vascular disease include atherosclerosis, disease affecting the renal arteries, lymphedema, ischemic disorders, and reperfusion injury. Also included are immunocomplex diseases with vascular collagenosis such as systemic lupus erythematosus or cryoglobulinemia.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать пролиферацию опухолевых Т-клеток у субъекта, страдающего Т-клеточным раком, например, Т-клеточным лейкозом или лимфомой. Такие антитело к CD154 или фармацевтическую композицию, содержащую антитело, можно вводить субъекту в количестве, эффективном для ингибирования пролиферации опухолевых Т-клеток у такого субъекта.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting tumor T cell proliferation in a subject suffering from a T cell cancer such as T cell leukemia or lymphoma. Such an anti-CD154 antibody or a pharmaceutical composition containing the antibody may be administered to a subject in an amount effective to inhibit the proliferation of tumor T cells in such subject.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать у субъекта вирусную инфекцию с поражением Т-клеток, вызываемую Т-лимфотропным вирусом человека типа 1 (HTLV I). Такие антитело к CD154 или фармацевтическую композицию, содержащую антитело, можно вводить субъекту в количестве, эффективном для ингибирования вирусной инфекции.In one embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising the antibody, is capable of inhibiting a human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV I) T cell-infecting viral infection in a subject. Such an anti-CD154 antibody or a pharmaceutical composition containing the antibody may be administered to a subject in an amount effective to inhibit viral infection.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны визуализировать опухолевые клетки или неопластические клетки у субъекта, у которого экспрессируется белок CD154, с которым специфически связывается антитело по настоящему изобретению. Способ визуализации опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта включает стадии: введения субъекту эффективного количества антитела к CD154 по настоящему изобретению или композиции, содержащей его, в условиях, обеспечивающих образование комплекса между антителом и белком на поверхности опухолевых клеток или неопластических клеток; и осуществление визуализации любого образованного комплекса антитело/белок, визуализируя тем самым любые опухолевые клетки или неопластические клетки у субъекта.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising an antibody, is capable of imaging tumor cells or neoplastic cells in a subject that expresses the CD154 protein to which the antibody of the present invention specifically binds. A method for imaging tumor cells or neoplastic cells in a subject includes the steps of: administering to the subject an effective amount of an anti-CD154 antibody of the present invention, or a composition containing it, under conditions to form a complex between the antibody and the protein on the surface of the tumor cells or neoplastic cells; and visualizing any antibody/protein complex formed, thereby visualizing any tumor cells or neoplastic cells in the subject.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны обнаруживать наличие опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта, у которого экспрессируется белок CD154, с которым специфически связывается антитело по настоящему изобретению. Один такой способ обнаружения наличия опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта включает стадии введения субъекту эффективного количества антитела к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей его, в условиях, обеспечивающих образование комплекса между антите- 17 040553 лом и белком; обеспечения выведения любого несвязанного визуализирующего средства из организма субъекта; и обнаружение наличия любого образованного комплекса антитело/белок, при этом наличие такого комплекса указывает на наличие опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта.In one embodiment of the present invention, an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising an antibody, is capable of detecting the presence of tumor cells or neoplastic cells in a subject that expresses the CD154 protein to which the antibody of the present invention specifically binds. One such method of detecting the presence of tumor cells or neoplastic cells in a subject comprises the steps of administering to the subject an effective amount of an anti-CD154 antibody of the present invention, or a pharmaceutical composition containing the same, under conditions such that a complex is formed between the antibody and protein; ensuring that any unbound imaging agent is cleared from the subject's body; and detecting the presence of any antibody/protein complex formed, wherein the presence of such a complex is indicative of the presence of tumor cells or neoplastic cells in the subject.

Фармацевтические композиции.pharmaceutical compositions.

В настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие CD154связывающий белок, например антитело к CD154, описываемое в настоящем изобретении.The present invention provides pharmaceutical compositions containing a CD154 binding protein, such as an anti-CD154 antibody described in the present invention.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно антитело к CD154 по настоящему изобретению.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition comprises at least one anti-CD154 antibody of the present invention.

Антитела к CD154 по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, не вызывают тромбоз, в том числе тромбоэмболические осложнения, и, следовательно, хорошо подходят для терапии у человека.Anti-CD154 antibodies of the present invention or a pharmaceutical composition containing the antibody do not cause thrombosis, including thromboembolic complications, and therefore are well suited for human therapy.

Такие фармацевтические композиции могут дополнительно содержать любое одно или несколько из фармацевтически приемлемого носителя, вспомогательного вещества, среды-носителя для доставки, буфера и/или стабилизатора. Иллюстративные методики составления и введения антител по настоящему изобретению можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание.Such pharmaceutical compositions may further comprise any one or more of a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, delivery vehicle, buffer, and/or stabilizer. Illustrative methods for formulating and administering antibodies of the present invention can be found, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой фосфатно-солевой буферной раствор, физиологический раствор, воду, составы на основе цитрата/сахарозы/Tween и эмульсии, например, эмульсии типа масло/вода.In a more specific embodiment of the present invention, the pharmaceutically acceptable carrier is phosphate buffered saline, saline, water, citrate/sucrose/Tween formulations, and emulsions, eg, oil/water emulsions.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может доставляться в виде микроинкапсулирующего устройства с тем, чтобы снизить или предупредить иммунный ответ у хозяина на композицию. Связывающиеся средства, такие как антитела или фрагменты антитела по настоящему изобретению, также могут доставляться в виде микроинкапсулированных в мембране, такой как, например, липосома или другое инкапсулированное или защищенное от воздействия иммунной системой средство доставки.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition may be delivered as a microencapsulating device in order to reduce or prevent the host's immune response to the composition. Binding agents, such as antibodies or antibody fragments of the present invention, can also be delivered microencapsulated in a membrane, such as, for example, a liposome or other encapsulated or immune-protected delivery vehicle.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть в форме стерильного инъекционного препарата, например стерильной инъекционной водной или масляной суспензии. Эта суспензия может быть составлена в соответствии с методиками, известными из уровня техники, с применением подходящих диспергирующих, смачивающих и суспендирующих веществ.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition may be in the form of a sterile injectable preparation, such as a sterile injectable aqueous or oily suspension. This suspension may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing, wetting and suspending agents.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может доставляться перорально, местно или внутривенно. В случае системного введения терапевтическая композиция должна быть стерильной, фактически апирогенной и в приемлемом для парентерального введения растворе с надлежащими pH, изотоничностью и стабильностью. Например, фармацевтический препарат фактически не содержит пирогенных веществ с тем, чтобы подходить для введения в качестве терапевтического средства для человека. Эти условия известны специалистам в данной области техники.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition may be delivered orally, topically, or intravenously. In the case of systemic administration, the therapeutic composition must be sterile, substantially pyrogen-free and in a parenteral-acceptable solution with proper pH, isotonicity and stability. For example, the pharmaceutical formulation is substantially free of pyrogens so as to be suitable for administration as a human therapeutic agent. These conditions are known to those skilled in the art.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения для перорального введения фармацевтическую композицию составляют в форме подходящей капсулы, таблетки, водной суспензии или раствора. Твердые составы на основе композиции для перорального введения могут содержать подходящие носители или наполнители, такие как кукурузный крахмал, желатин, лактоза, аравийская камедь, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, каолин, манит, фосфат дикальция, карбонат кальция, хлорид натрия или альгиновая кислота. Разрыхлители, которые можно использовать, включают без ограничения микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, крахмалгликолят натрия и альгиновую кислоту. Связующие вещества для таблеток, которые можно использовать, включают аравийскую камедь, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, поливинилпирролидон (Povidone™), гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу, крахмал и этилцеллюлозу. Смазывающие вещества, которые можно использовать, включают стеарат магния, стеариновую кислоту, кремнийорганическую жидкость, тальк, воски, масла и коллоидный диоксид кремния.In a more specific embodiment of the present invention for oral administration, the pharmaceutical composition is in the form of a suitable capsule, tablet, aqueous suspension or solution. Solid formulations based on compositions for oral administration may contain suitable carriers or excipients such as corn starch, gelatin, lactose, gum arabic, sucrose, microcrystalline cellulose, kaolin, mannitol, dicalcium phosphate, calcium carbonate, sodium chloride, or alginic acid. Disintegrators that can be used include, without limitation, microcrystalline cellulose, corn starch, sodium starch glycolate, and alginic acid. Tablet binders that can be used include gum arabic, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone (Povidone™), hydroxypropyl methylcellulose, sucrose, starch, and ethylcellulose. Lubricants that can be used include magnesium stearate, stearic acid, silicone fluid, talc, waxes, oils, and colloidal silicon dioxide.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения для местных применений фармацевтические композиции могут быть составлены в форме подходящей мази. Некоторые примеры составов на основе композиции для местного применения включают капли, настойки, лосьоны, кремы, растворы и мази, содержащие активный ингредиент и различные вспомогательные средства и средыносители.In a more specific embodiment of the present invention for topical applications, the pharmaceutical compositions may be in the form of a suitable ointment. Some examples of topical formulations include drops, tinctures, lotions, creams, solutions and ointments containing the active ingredient and various adjuvants and vehicles.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения состав в виде полужидкой мази для местного применения, как правило, содержит активный ингредиент в концентрации от приблизительно 1 до 20%, например от 5 до 10%, в носителе, таком как фармацевтическая основа для крема.In one embodiment of the present invention, a semi-fluid topical ointment formulation typically contains the active ingredient at a concentration of about 1 to 20%, such as 5 to 10%, in a carrier such as a pharmaceutical cream base.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения также можно легко получить фармацевтические композиции для ингаляции и трансдермальные композиции. Терапевтическую композицию можно вводить через нос или легкое, например, в виде жидкого или порошкообразного аэрозоля (лиофилизированного).In one embodiment of the present invention, pharmaceutical compositions for inhalation and transdermal compositions can also be easily prepared. The therapeutic composition can be administered through the nose or lung, for example, in the form of a liquid or powder aerosol (lyophilized).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения жидкие составы на основе фармацевтической композиции для перорального введения получают в воде или других водных средах-носителях,In one embodiment of the present invention, liquid formulations based on a pharmaceutical composition for oral administration are prepared in water or other aqueous vehicles,

- 18 040553 при этом они могут содержать различные суспендирующие вещества, такие как метилцеллюлоза, альгинаты, трагакант, пектин, кельгин, каррагенан, аравийская камедь, поливинилпирролидон и поливиниловый спирт. Жидкие составы на основе фармацевтических композиций по настоящему изобретению также могут предусматривать растворы, эмульсии, сиропы и крепкие настои, содержащие наряду с активным соединением (активными соединениями) смачивающие вещества, подсластители, а также красители и ароматизаторы. Различные жидкие и порошкообразные составы на основе фармацевтических композиций можно получить традиционными способами для обеспечения их попадания при ингаляции в легкие млекопитающего, подлежащего лечению.- 18 040553 while they may contain various suspending substances, such as methylcellulose, alginates, tragacanth, pectin, kelgin, carrageenan, gum arabic, polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol. Liquid formulations based on the pharmaceutical compositions of the present invention may also include solutions, emulsions, syrups and strong infusions containing, along with the active compound (active compounds), wetting agents, sweeteners, as well as colors and flavors. Various liquid and powder formulations based on pharmaceutical compositions can be prepared by conventional methods to ensure that they are inhaled into the lungs of a mammal to be treated.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения жидкие составы на основе фармацевтической композиции для инъекции могут содержать различные носители, такие как растительные масла, диметилацетамид, диметилформамид, сложный этиловый эфир молочной кислоты, сложный этиловый эфир угольной кислоты, изопропилмиристат, этанол, полиолы, т.е. глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п. В некоторых вариантах осуществления композиция включает носитель на основе цитрата/сахарозы/Tween. В случае внутривенных инъекций водорастворимые версии композиций можно вводить капельным способом, при котором вливают фармацевтический состав, содержащий противогрибковое средство и физиологически приемлемый наполнитель. Физиологически приемлемые наполнители могут включать, например, 5% раствор декстрозы, 0,9% солевой раствор, раствор Рингера или другие подходящие наполнители. Подходящую нерастворимую форму композиции можно получить и вводить в виде суспензии на водной основе или фармацевтически приемлемой масляной основе, такой как сложный эфир длинноцепочной жирной кислоты, например этилолеат.In one embodiment of the present invention, pharmaceutical injectable liquid formulations may contain various carriers such as vegetable oils, dimethylacetamide, dimethylformamide, lactic acid ethyl ester, carbonic acid ethyl ester, isopropyl myristate, ethanol, polyols, i.e. glycerin, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc. In some embodiments, the implementation of the composition includes a carrier based on citrate/sucrose/Tween. In the case of intravenous injections, water-soluble versions of the compositions can be administered by drip in which a pharmaceutical formulation containing an antifungal agent and a physiologically acceptable excipient is infused. Physiologically acceptable vehicles may include, for example, 5% dextrose, 0.9% saline, Ringer's solution, or other suitable vehicles. A suitable insoluble form of the composition may be prepared and administered as an aqueous suspension or a pharmaceutically acceptable oily base such as a long chain fatty acid ester such as ethyl oleate.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит антитело к CD154 по настоящему изобретению в количестве от приблизительно 0,1 до 90 вес.% (как, например, от 1 до 20% или от 1 до 10%) в фармацевтически приемлемом носителе.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition comprises an anti-CD154 antibody of the present invention in an amount of from about 0.1 to 90% by weight (such as 1 to 20% or 1 to 10%) in a pharmaceutically acceptable carrier.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения оптимальное процентное содержание антитела к CD154 по настоящему изобретению в каждой фармацевтической композиции варьирует в зависимости от самого состава и требуемого терапевтического эффекта при конкретных патологиях и взаимосвязанных терапевтических режимах. Фармацевтические составы хорошо описаны в уровне техники. Традиционные способы, известные рядовым специалистам в области медицины, можно применять для введения фармацевтической композиции субъекту.In one embodiment of the present invention, the optimal percentage of the anti-CD154 antibody of the present invention in each pharmaceutical composition varies depending on the formulation itself and the desired therapeutic effect in particular pathologies and interrelated therapeutic regimens. Pharmaceutical formulations are well described in the prior art. Conventional methods known to those of ordinary skill in the medical field may be used to administer the pharmaceutical composition to a subject.

Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению относятся к составам с замедленным высвобождением. Замедленное высвобождение, или контролируемое высвобождение, или медленное высвобождение относятся к составам на основе лекарственного средства, которые высвобождают активное лекарственное средство, такое как лекарственное средство на основе полипептида или антитела, в течение некоторого периода времени после введения субъекту. Замедленное высвобождение лекарственных средств на основе полипептида, которое может происходить в пределах требуемых промежутков времени (например, минуты, часы, дни, недели или дольше в зависимости от состава лекарственного средства), отличается от стандартных составов, в которых фактически вся дозированная единица доступна для немедленного поглощения или немедленного распространения с кровотоком. В определенных вариантах осуществления составы с замедленным высвобождением за одно введение могут обеспечивать такой уровень лекарственного средства в кровотоке, который сохраняется, например, в течение 8 ч или дольше, 12 ч или дольше, 24 ч или дольше, 36 ч или дольше, 48 ч или дольше, 60 ч или дольше, 72 ч или дольше, 84 ч или дольше, 96 ч или дольше, или даже, например, в течение 1 недели или 2 недель или дольше, например, 1 месяца или дольше. Композиции с замедленным высвобождением могут содержать антитело к CD154 по настоящему изобретению.Accordingly, the pharmaceutical compositions of the present invention relate to sustained release formulations. Sustained release or controlled release or slow release refers to drug-based formulations that release the active drug, such as a polypeptide or antibody drug, over a period of time after administration to a subject. The sustained release of polypeptide-based drugs, which can occur within desired time frames (e.g., minutes, hours, days, weeks, or longer depending on the drug formulation), differs from standard formulations in which virtually the entire dosage unit is available for immediate absorption or immediate distribution with the bloodstream. In certain embodiments, sustained release formulations in a single administration can provide a blood level of drug that persists, for example, for 8 hours or more, 12 hours or more, 24 hours or more, 36 hours or more, 48 hours, or longer, 60 hours or longer, 72 hours or longer, 84 hours or longer, 96 hours or longer, or even, for example, for 1 week or 2 weeks or longer, for example, 1 month or longer. Sustained release compositions may contain an anti-CD154 antibody of the present invention.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит другое иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение. Например, такое иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение может представлять собой одно из следующих: средство, которое прерывает костимулируемую Т-клетками передачу сигнала через CD28; средство, которое прерывает передачу сигнала кальциневрином, кортикостероид, антипролиферативное средство и антитело, которое специфически связывается с белком, экспрессируемым на поверхности иммунных клеток, в том числе без ограничения CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 и RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTe и VLA-4.In some embodiments of the present invention, the pharmaceutical composition further comprises another immunosuppressive or immunomodulatory compound. For example, such an immunosuppressive or immunomodulatory compound may be one of the following: an agent that interrupts T-cell co-stimulated signaling through CD28; an agent that interrupts calcineurin signaling, a corticosteroid, an antiproliferative agent, and an antibody that specifically binds to a protein expressed on the surface of immune cells, including but not limited to CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 and RANK FcR, B7, CTLA4, TNF , LTE and VLA-4.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение представляет собой такролимус, сиролимус, мофетила микофенолат или его активную форму - микофеноловую кислоту, мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар натрия, лефлуномид, рапамицин или азаспиран.In some embodiments, the immunosuppressive or immunomodulatory compound is tacrolimus, sirolimus, mycophenolate mofetil, or its active form, mycophenolic acid, mizoribine, deoxyspergualine, brequinar sodium, leflunomide, rapamycin, or azaspiran.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению или фармацевтические композиции, содержащие их, могут содержаться в контейнере, упаковке или дозирующем устройстве отдельно или в виде части набора с этикетками и инструкциями касательно введения.In other embodiments, the antibodies of the present invention, or pharmaceutical compositions containing them, may be contained in a container, package, or dispenser alone or as part of a kit with labels and instructions for administration.

Пути введения и доставки.Routes of administration and delivery.

Антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящемуAnti-CD154 antibodies of the present invention and pharmaceutical compositions of the present

- 19 040553 изобретению можно вводить субъекту любым способом, который является приемлемым с медицинской точки зрения. Для целей настоящего изобретения введение означает любой из стандартных способов введения антитела, фрагмента антитела или фармацевтической композиции, известных специалистам в данной области техники, и не должно ограничиваться примерами, приведенными в данном документе.- 19 040553 of the invention can be administered to a subject by any method that is medically acceptable. For the purposes of the present invention, administration means any of the standard methods for administering an antibody, antibody fragment, or pharmaceutical composition known to those skilled in the art, and should not be limited to the examples provided herein.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту с помощью инъекции внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрамедуллярно, интравентрикулярно, интраэпидурально, внутриартериально, интраваскулярно, интраартикулярно, внутрисиновиально, интрастернально, интратекально, внутрипеченочно, внутрипозвоночно, внутрь опухоли, интракраниально; энтеральным, внутрилегочным, чрезслизистым, внутриматочным или сублингвальным путями введения или местно, например, в участки воспаления или роста опухоли.In some embodiments, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention can be administered to a subject by injection intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intramuscularly, intramedullary, intraventricularly, intraepidurally, intraarterially, intravascularly, intraarticularly, intrasynovially, intrasternally, intrathecally, intrahepatic, intravertebral, inside the tumor, intracranial; enteral, intrapulmonary, transmucosal, intrauterine or sublingual routes of administration, or locally, for example, at sites of inflammation or tumor growth.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту перорально или назально, или с помощью ингаляции, глазным, ректальным или местным путями.In some embodiments, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered to a subject orally or nasally, or by inhalation, ophthalmic, rectal, or topical routes.

В более конкретном варианте осуществления антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту перорально в форме капсул, таблеток, водных суспензий или растворов.In a more specific embodiment, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered orally to a subject in the form of capsules, tablets, aqueous suspensions, or solutions.

В более конкретном варианте осуществления антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту местно путем нанесения крема, мази или т.п.In a more specific embodiment, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered topically to a subject by application of a cream, ointment, or the like.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно вводить с помощью ингаляции посредством применения небулайзера, порошкового ингалятора или дозирующего ингалятора.In other embodiments, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may also be administered by inhalation through the use of a nebulizer, powder inhaler, or metered dose inhaler.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту с помощью введения форм с замедленным высвобождением, такими способами, как инъекции депо-препаратов, или с помощью эродируемых имплантатов, непосредственно внесенных в ходе хирургического вмешательства, или с помощью имплантации субъекту инфузионного насоса или биологически совместимого имплантата с замедленным высвобождением.In additional embodiments of the present invention, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered to a subject via the administration of sustained release formulations, by methods such as injections of depot formulations, or via erosive implants directly placed during surgery. , or by implanting an infusion pump or biocompatible sustained release implant into the subject.

В более конкретном варианте осуществления антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту путем введения инъекционных депо-препаратов, как, например, с использованием депо-препаратов, которые инъецируют каждые 1, 3 или 6 месяцев, или биоразлагаемых материалов и способов.In a more specific embodiment, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered to a subject by injectable depot formulations, such as using depot formulations that are injected every 1, 3, or 6 months, or biodegradable materials. and ways.

В более конкретном варианте осуществления антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту путем нанесения на кожу субъекта трансдермального пластыря, содержащего антитело, производное антитела или фармацевтическую композицию, при этом оставляя пластырь контактировать с кожей субъекта обычно в течение 1-5 ч из расчета на один пластырь.In a more specific embodiment, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered to a subject by applying a transdermal patch containing the antibody, antibody derivative, or pharmaceutical composition to the subject's skin while leaving the patch in contact with the subject's skin, typically for 1- 5 hours per patch.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту в любой дозе в пересчете на вес тела и с любой частотой введения дозы, которые являются приемлемыми с медицинской точки зрения. Приемлемая доза включает диапазон от приблизительно 0,01 до 200 мг/кг веса тела субъекта.In other embodiments, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered to a subject at any dose based on body weight and at any dose frequency that is medically acceptable. A suitable dose includes the range from about 0.01 to 200 mg/kg of the subject's body weight.

Рассматриваемые антитела к CD154 вводят субъекту в количестве, эффективном, чтобы вызвать требуемый эффект в отношении иммунитета, т.е. подавление Т- или В-клеточного иммунитета, или количестве, эффективном для предупреждения, лечения или ослабления симптомов заболевания, при котором подавление В- или Т-клеточного иммунитета требуется с терапевтической точки зрения. Как упоминалось, эти состояния включают, в частности, показания аутоиммунного, воспалительного и аллергического характера.The anti-CD154 antibodies in question are administered to the subject in an amount effective to produce the desired immune effect, i. suppression of T- or B-cell immunity, or an amount effective to prevent, treat, or ameliorate the symptoms of a disease in which suppression of B- or T-cell immunity is required from a therapeutic point of view. As mentioned, these conditions include, in particular, indications of an autoimmune, inflammatory and allergic nature.

Общая вводимая доза антитела альтернативно может включать 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100 мг или больше или может включать любое количество, лежащее в промежутке между вышеуказанными значениями в мг. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к CD154, описанные в данном документе, или их связывающие фрагменты, а также комбинации указанных фрагментов антитела можно вводить субъекту-реципиенту с частотой один раз в двадцать шесть недель или меньше, как, например, один раз в шестнадцать недель или меньше, один раз в восемь недель или меньше или один раз в четыре недели, ежемесячно, один раз в две недели или меньше.The total dose of antibody administered may alternatively include 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100 mg or more, or may include any amount between the above mg values. In a preferred embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibodies described herein, or their binding fragments, as well as combinations of these antibody fragments, can be administered to the recipient subject at a frequency of once every twenty-six weeks or less, such as, for example, once every sixteen weeks or less, once every eight weeks or less or once every four weeks, monthly, once every two weeks or less.

В любом из способов применения антител или фармацевтических композиций по настоящему изобретению антитела или фармацевтические композиции можно вводить субъекту в однократной или многократных дозах ежедневно, каждые 2, 3, 4, 5 или 6 дней, еженедельно, ежемесячно или любой период, дробный или кратный этому, и дополнительно можно вводить субъекту повторно с интервалами в диапазоне от одного раза в день до одного раза в два месяца, что определяется квалифицированным специали- 20 040553 стом.In any of the methods of using the antibodies or pharmaceutical compositions of the present invention, the antibodies or pharmaceutical compositions can be administered to a subject in single or multiple doses daily, every 2, 3, 4, 5, or 6 days, weekly, monthly, or any period, fractional or multiple thereof, and may additionally be administered to the subject repeatedly at intervals ranging from once a day to once every two months, as determined by the skilled artisan.

В любом из способов применения антител или фармацевтических композиций по настоящему изобретению антитела или фармацевтические композиции, содержащие их, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, с интервалами такой длительности, как показано с медицинской точки зрения, в диапазоне от нескольких дней или недель до целой жизни субъекта. В дополнительных вариантах осуществления антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту повторно с интервалами в диапазоне от одного раза в день до одного раза в два месяца.In any of the methods of using the antibodies or pharmaceutical compositions of the present invention, the antibodies or pharmaceutical compositions containing them may be administered to a subject in need thereof at intervals as long as medically indicated, ranging from a few days or weeks to a lifetime. subject. In additional embodiments, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered repeatedly to a subject at intervals ranging from once a day to once every two months.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в многократных дозах в день, если это необходимо, с достижением общей требуемой суточной дозы. Эффективность способа лечения можно оценивать путем контроля наличия у субъекта известных признаков или симптомов заболевания.In one embodiment of the present invention, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention can be administered in multiple doses per day, if necessary, to achieve the total required daily dose. The effectiveness of a method of treatment can be assessed by monitoring the presence of known signs or symptoms of the disease in the subject.

Во всех вариантах осуществления настоящего изобретения дозировка и уровень дозы антител к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтических композиций по настоящему изобретению, эффективные для получения требуемых эффектов, будут зависеть от ряда факторов, таких как характер заболевания, подлежащего лечению, метрических данных и возраста субъекта, цели лечения, конкретной применяемой фармацевтической композиции, фармакокинетики активного средства и решения лечащего врача.In all embodiments of the present invention, the dosage and dose level of the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention effective to obtain the desired effects will depend on a number of factors such as the nature of the disease being treated, the metrics and age of the subject, the target treatment, the particular pharmaceutical composition used, the pharmacokinetics of the active agent, and the judgment of the attending physician.

Следует понимать, что эффективная дозировка может зависеть от отличительных признаков субъекта-реципиента, таких как, например, возраст, пол, наличие беременности, индекс массы тела, безжировая масса тела, состояние или состояния, против которых дается композиция, другие состояния здоровья субъекта-реципиента, которые могут влиять на биотрансформацию композиции или толерантность к ней, уровни IL-6 у субъекта-реципиента и наличие резистентности к композиции (например, возникающей у пациента, у которого вырабатываются антитела к композиции). Специалист в данной области техники сможет определить эффективную дозировку и частоту введения посредством проведения обычных экспериментов, например, руководствуясь раскрытием данного документа и идеями, изложенными в Goodman, L.S., Gilman, A., Brunton, L.L., Lazo, J.S., & Parker, K.L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R.D., Mycek, M.J., Harvey, R.A., Champe, P.C., & Mycek, M.J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; и Golan, D.E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.It should be understood that the effective dosage may depend on the characteristics of the recipient subject, such as, for example, age, sex, pregnancy, body mass index, lean body mass, condition or conditions against which the composition is given, other health conditions of the recipient subject. , which may affect the biotransformation of the composition or tolerance to it, the levels of IL-6 in the recipient subject and the presence of resistance to the composition (for example, occurring in a patient who develops antibodies to the composition). One skilled in the art will be able to determine the effective dosage and frequency of administration through routine experimentation, for example, guided by the disclosure herein and the teachings set forth in Goodman, L.S., Gilman, A., Brunton, L.L., Lazo, J.S., & Parker, K.L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R.D., Mycek, M.J., Harvey, R.A., Champe, P.C., & Mycek, M.J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins; and Golan, D.E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.

Соответственно, антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению будут вводиться в количестве, эффективном для достижения намеченной для них цели. Терапевтически эффективное количество может обозначать количество антитела, эффективное для предупреждения, уменьшения интенсивности или ослабления симптомов заболевания или продления выживания субъекта, подвергаемого лечению. Терапевтически эффективное количество может быть достигнуто путем изменения дозы или схемы дозирования вводимых рассматриваемых антител.Accordingly, the anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention will be administered in an amount effective to achieve their intended purpose. A therapeutically effective amount may refer to an amount of an antibody effective to prevent, ameliorate or lessen the symptoms of a disease or prolong the survival of the subject being treated. A therapeutically effective amount can be achieved by varying the dose or dosing schedule of the antibodies in question administered.

Антитела к CD154 по настоящему изобретению и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в виде однократной дозы для определенных показаний, таких как предупреждение иммунного ответа на антиген, к которому организм субъекта подвергается в течение короткого времени, такой как экзогенный антиген, который вводят в первый день лечения. Примеры такой терапии будут включать совместное введение фрагмента антитела по настоящему изобретению вместе с терапевтическим средством, например, фармацевтическим препаратом на основе антигена, аллергеном, или препаратом крови, или вектором для генной терапии. При показаниях, когда антиген присутствует длительное время, таких как при контроле иммунной реакции на трансплантированную ткань или в ответ на длительное введение фармацевтических препаратов антигенной природы, фрагменты антитела или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводят с интервалами такой длительности, как показано с медицинской точки зрения, в диапазоне от нескольких дней или недель до целой жизни субъекта.The anti-CD154 antibodies of the present invention and the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as a single dose for certain indications such as preventing an immune response to an antigen to which the subject is exposed in a short time, such as an exogenous antigen administered on the first day. treatment. Examples of such therapy would include the co-administration of an antibody fragment of the present invention together with a therapeutic agent, such as an antigen-based pharmaceutical, an allergen, or a blood product, or a gene therapy vector. In indications where the antigen is present for a long time, such as when monitoring an immune response to transplanted tissue or in response to long-term administration of pharmaceuticals of an antigenic nature, antibody fragments or pharmaceutical compositions of the present invention are administered at intervals of such duration, as indicated from a medical point of view, ranging from a few days or weeks to a lifetime of the subject.

В любом из способов, описанных в данном документе, антитела или фармацевтические композиции можно вводить субъекту со вторым средством. В определенных вариантах осуществления средство представляет собой терапевтическое средство, такое как, например, иммуномодулирующее или иммуносупрессирующее средство. Иммуномодулирующее или иммуносупрессирующее средство может представлять собой любое из следующих:In any of the methods described herein, antibodies or pharmaceutical compositions can be administered to a subject with a second agent. In certain embodiments, the agent is a therapeutic agent such as, for example, an immunomodulatory or immunosuppressive agent. The immunomodulatory or immunosuppressive agent may be any of the following:

(a) средство, которое прерывает костимулируемую Т-клетками передачу сигнала через CD28;(a) an agent that interrupts co-stimulated T-cell signaling through CD28;

(b) средство, которое прерывает передачу сигнала кальциневрином, (c) кортикостероид, (d) антипролиферативное средство и (e) антитело, которое специфически связывается с белком, экспрессируемым на поверхности иммунных клеток, в том числе без ограничения CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 и RANK FcR, В7, CTLA4, TNF,(b) an agent that interrupts calcineurin signaling, (c) a corticosteroid, (d) an antiproliferative agent, and (e) an antibody that specifically binds to a protein expressed on the surface of immune cells, including but not limited to CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 and RANK FcR, B7, CTLA4, TNF,

- 21 040553- 21 040553

LTe и VLA-4.LTE and VLA-4.

Иммуносупрессирующее или иммуномодулирующее соединение может представлять собой, например, такролимус, сиролимус, мофетила микофенолат, мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар натрия, лефлуномид, рапамицин или азаспиран. Антитело и второе средство можно вводить одновременно или последовательно. В некоторых примерах преимущественным может быть введение одной или нескольких нуклеиновых кислот по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Терапевтические и диагностические способы по настоящему изобретению, включающие стадию введения по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в соответствии с хорошо известными способами, включены в объем настоящего изобретения.The immunosuppressive or immunomodulating compound may be, for example, tacrolimus, sirolimus, mycophenolate mofetil, mizoribine, deoxyspergualine, brequinar sodium, leflunomide, rapamycin or azaspiran. The antibody and the second agent may be administered simultaneously or sequentially. In some examples, it may be advantageous to administer one or more nucleic acids of the present invention to a subject in need thereof. Therapeutic and diagnostic methods of the present invention, comprising the step of administering at least one nucleic acid of the present invention in accordance with well known methods, are included within the scope of the present invention.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения субъектом(субъектами), которого(которых) можно лечить с помощью вышеописанных способов, является животное. Предпочтительно животное является млекопитающим. Примеры млекопитающих, которых можно лечить, включают без ограничения людей, отличных от человека приматов, грызунов (в том числе крыс, мышей, хомячков и морских свинок), коров, коней, овец, коз, свиней, собак и кошек. Предпочтительно млекопитающим является человек.In one embodiment of the present invention, the subject(s) that can be treated using the methods described above is an animal. Preferably the animal is a mammal. Examples of mammals that can be treated include, without limitation, humans, non-human primates, rodents (including rats, mice, hamsters, and guinea pigs), cows, horses, sheep, goats, pigs, dogs, and cats. Preferably the mammal is a human.

Настоящее изобретение можно лучше понять с учетом нижеследующих примеров. Однако специалист в данной области с легкостью поймет, что конкретные обсуждаемые способы и результаты являются лишь иллюстративными для настоящего изобретения, описанного в данном документе.The present invention can be better understood with reference to the following examples. However, one of skill in the art will readily appreciate that the specific methods and results discussed are merely illustrative of the present invention described herein.

Следующие примеры изложены для того, чтобы обеспечить рядовых специалистов в данной области техники полным раскрытием и описанием того, как осуществлять и применять рассматриваемое изобретение, и они не предполагают ограничение объема того, что рассматривается в качестве настоящего изобретения. Были приложены усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры, концентраций и т.п.), однако могут допускаться некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, то части являются частями по массе, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура представлена в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.The following examples are set forth to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what is considered to be the present invention. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numbers used (eg, amounts, temperatures, concentrations, etc.), however, some experimental errors and deviations may be allowed. Unless otherwise indicated, parts are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is atmospheric or near atmospheric.

ПримерыExamples

Пример 1. Разработка вариантов антитела с более высокой аффинностью к CD154 человека (более низкими значениями KD).Example 1 Development of antibody variants with higher affinity for human CD154 (lower KD values).

В настоящей заявке авторы настоящего изобретения описывают новое гуманизированное IgG1антитело к CD154 человека, имеющее последовательности, представленные на фиг. 1А-С, которые предназначены для применения в терапии у человека, в частности терапевтических показаний, при которых подавление Т- и В-клеточного иммунитета требуется с терапевтической точки зрения. Как изложено выше, это антитело получали из IDEC131 с помощью комплексного применения способов созревания аффинности и мутагенеза и с помощью модификации Fc-области IgG1 IDEC-131 с целью устранения связывания FcyRII и FcyRIIII и C1q (связывания системы комплемента).In the present application, the present inventors describe a novel humanized anti-human CD154 IgG1 antibody having the sequences shown in FIG. 1A-C, which are intended for use in human therapy, in particular therapeutic indications in which suppression of T- and B-cell immunity is required from a therapeutic point of view. As described above, this antibody was generated from IDEC131 by a combination of affinity maturation and mutagenesis methods and by modifying the Fc region of IDEC-131 IgG1 to eliminate FcyRII and FcyRIIII and C1q binding (complement system binding).

В частности, различные комбинации остатков CDR в вариабельных областях как тяжелой, так и легкой цепей IDEC131 подвергали мутации с целью получения варианта IDEC-131, обладающего улучшенной аффинностью связывания с CD154 человека. В результате этих экспериментов получали большое число вариантов. Подавляющее число этих вариантов не связывалось с CD154 человека лучше, чем IDEC-131, вместо этого они характеризовались такими же или худшими значениями аффинности связывания с CD154 человека (результаты не показаны).In particular, various combinations of CDR residues in both the IDEC131 heavy and light chain variable regions were mutated to produce an IDEC-131 variant with improved binding affinity for human CD154. As a result of these experiments, a large number of variants were obtained. The vast majority of these variants did not bind to human CD154 better than IDEC-131, instead they had the same or worse binding affinities for human CD154 (results not shown).

В результате этих экспериментов получали 11 гуманизированных вариантов, которые идентифицировали и которые содержали последовательности вариабельной области легкой и тяжелой цепей, показанные на фиг. 2А-2С и 3. Затем аффинность связывания с CD154 человека для каждого из этих вариантов оценивали путем скрининга с помощью Biacore. Анализ на Biacore проводили, как показано ниже.These experiments resulted in 11 humanized variants that were identified and contained the light and heavy chain variable region sequences shown in FIG. 2A-2C and 3. The binding affinity for human CD154 for each of these variants was then assessed by Biacore screening. The Biacore assay was performed as shown below.

Анализ на Biacore.Biacore analysis.

Оборудование: Biacore 3000.Equipment: Biacore 3000.

Буфер для анализа - 10 нМ буфер HEPES (pH 7,4), 150 нМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Р20 (полиоксиэтиленсорбитана).Assay buffer - 10 nM HEPES buffer (pH 7.4), 150 nM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20 (polyoxyethylene sorbitan).

Буфер для восстановления - 10 мМ глицин HCl (pH 1,75).Recovery buffer - 10 mM glycine HCl (pH 1.75).

Буфер для конъюгации - 10 нМ натрий-ацетатный буфер (pH 5).Conjugation buffer - 10 nM sodium acetate buffer (pH 5).

Расход - расход для захвата лиганда составлял 5 мкл/мин. Расход для анализа кинетики составлял 30 мкл/мин.Flow Rate—The flow rate for ligand capture was 5 μl/min. The flow rate for kinetic analysis was 30 µl/min.

Процедуры.Procedures.

Эксперименты по связыванию выполняли на Biacore 300 при 25°С. Антитела непосредственно иммобилизировали на проточной ячейке 2 (1000 RU комбинации № 23) и проточной ячейке 4 (1000 RU EWT № 131) и антиген CD154 пропускали через чип. Связывание антигена с тестируемыми антителами контролировали в режиме реального времени. Из наблюдаемой k_on для каждого варианта определяли kof_fи Kd.Binding experiments were performed on Biacore 300 at 25°C. Antibodies were directly immobilized on flow cell 2 (1000 RU combination #23) and flow cell 4 (1000 RU EWT #131) and the CD154 antigen was passed through the chip. Antigen binding to test antibodies was monitored in real time. From the observed k _on for each variant, _koff and Kd were determined.

Оценочный анализ выполняли с использованием конкретных концентраций аналита. При тестируе- 22 040553 мой концентрации связывание должно наблюдаться даже, если аффинность связывания лиганда является относительно слабой. Полный анализ кинетики можно выполнять с помощью известных способов. Для молекулярных взаимодействий с быстрой скоростью диссоциации стационарную кинетику можно использовать для определения значения KD.Estimated analysis was performed using specific concentrations of the analyte. At the concentration tested, binding should be observed even if the binding affinity of the ligand is relatively weak. A complete analysis of the kinetics can be performed using known methods. For molecular interactions with fast dissociation rates, stationary kinetics can be used to determine the KD value.

Анализ с использованием критерия хи-квардат (χ2) можно проводить для определения точности анализа. Значение χ2 в пределах 1-2 считается значимым, а ниже 1 считается высокозначимым. В результате этого скрининга было идентифицировано ряд вариантов последовательностей со значимо улучшенными значениями аффинности связывания, т.е. в 4-5 раз превышающими таковые у IDEC-131. Как отмечалось ранее, этот исход был весьма неожиданным, так как IDEC-131 обладает аффинностью связывания или KD, составляющей 151 пМ. Этот результат был также удивительным, поскольку IDEC-131 был выбран в качестве основного клинического кандидата среди ряда других кандидатных гуманизированных последовательностей на основании его сильной аффинности связывания с CD154.Chi-square (χ2) analysis can be performed to determine the accuracy of the analysis. A χ2 value in the range of 1-2 is considered significant, and below 1 is considered highly significant. As a result of this screening, a number of sequence variants with significantly improved binding affinities were identified, ie. 4-5 times higher than those of IDEC-131. As noted earlier, this outcome was quite unexpected as IDEC-131 has a binding affinity or KD of 151 pM. This result was also surprising as IDEC-131 was selected as the main clinical candidate among a number of other candidate humanized sequences based on its strong binding affinity for CD154.

Как показано ниже, получали гуманизированные антитела к CD154, происходящие из IDEC-131, которые характеризовались значениями KD в диапазоне от всего лишь 26 пМ до 57 пМ. Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей этих вариантов, которые идентифицированы в настоящей заявке как вариант 21, вариант 22, вариант 23, вариант 24, вариант 25, вариант 26, вариант 27, вариант 28, вариант 29, вариант 30 и вариант 31, представлены на фиг. 2.As shown below, humanized anti-CD154 antibodies derived from IDEC-131 were generated that had KD values ranging from as little as 26 pM to 57 pM. The amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions of these variants, which are identified in this application as variant 21, variant 22, variant 23, variant 24, variant 25, variant 26, variant 27, variant 28, variant 29, variant 30 and variant 31, shown in Fig. 2.

В табл. 4 кратко описаны разные значения аффинности связывания этих вариантов, определенные с помощью Biacore.In table. 4 briefly describes the different binding affinities of these variants as determined by Biacore.

Таблица 4Table 4

Вариант* Option* К_а (1/мс)K _a (1/ms) Ка (1/с) Ka (1/s) K_D K _D Хи² Hee ² Кратность увеличения K_D(по сравнению с IDEC131)Magnification factor K _D (compared to IDEC131) IDEC-131 IDEC-131 3,4 68Е +0 6 3.4 68E +0 6 5,25Е -04 5.25E -04 1,51Е -10 1.51E -10 0,097 0.097 1, 0 10 21 21 4,42Е +06 4.42E +06 1,28Е -04 1.28E -04 2,89Е -11 2.89E -11 0,184 0.184 4,7 4.7 22 22 4,48Е +06 4.48E +06 1,17Е -04 1.17E -04 2,62Е -11 2.62E -11 0,222 0.222 5,2 5.2 23 23 3,35Е +06 3.35E +06 1,41Е -04 1.41E -04 4,21Е -11 4.21E -11 0,242 0.242 4,2 4.2 24 24 3,70Е +06 3.70E +06 1,35Е -04 1.35E -04 3,64Е -11 3.64E -11 0,265 0.265 4, 9 4, 9 25 25 4,НЕ +06 4, NOT +06 1,49Е +04 1.49E +04 3,62Е -11 3.62E -11 0,243 0.243 3, 9 3, 9 26 26 2,ОЗЕ +06 2,OZE +06 1,17 +04 1.17 +04 5,76Е -11 5.76E -11 0,201 0.201 2,5 2.5 27 27 3,58Е +06 3.58E +06 1,20Е -04 1.20E -04 3,36Е -11 3.36E -11 0,135 0.135 4,5 4.5 28 28 3,65Е +06 3.65E +06 1,15Е -04 1.15E -04 3,15Е -11 3.15E -11 0,108 0.108 4, 8 4, 8 29 29 3,86Е +06 3.86E +06 1,ЗЗЕ -04 1,ZZE -04 3,44Е -11 3.44E -11 0,152 0.152 4,2 4.2 30 thirty 4,24Е +06 4.24E +06 1,40Е -04 1.40E -04 3,29Е -11 3.29E -11 0,171 0.171 4, 4 4, 4 31 31 3,61Е +06 3.61E +06 1,23Е -04 1.23E -04 3,41Е -11 3.41E -11 0,121 0.121 4, 8 4, 8

(в среднем n=6)(average n=6)

Пример 2. Применение вариантов антитела с более высокой аффинностью к CD154 человека (более низкими значениями KD) для SC введения.Example 2 Use of antibody variants with higher affinity for human CD154 (lower KD values) for SC administration.

Как показано в таблице выше, вариант № 21, выбранный в качестве основного кандидата, характеризовался значением KD, составляющим 29 пМ, который в 4,7 раза превышал таковое у IDEC131. Это улучшение аффинности имеет важное значение, поскольку это должно обеспечивать возможность подкожного введения этого антитела. Предыдущие исследования IDEC131 показали клиническую эффективность у человека при дозе выше 10 мг/кг или для целей анализа верхний предел 20 мг/кг. С учетом этого и принимая за средний вес индивидуума приблизительно 80 кг, количество, соответствующее эффективной дозе, можно рассчитать следующим образом:As shown in the table above, option #21 selected as the prime candidate had a KD value of 29 pM, which was 4.7 times that of IDEC131. This improvement in affinity is important as it should allow subcutaneous administration of this antibody. Previous studies with IDEC131 have shown clinical efficacy in humans above 10 mg/kg, or for analysis purposes an upper limit of 20 mg/kg. With this in mind, and assuming an average individual weight of approximately 80 kg, the amount corresponding to an effective dose can be calculated as follows:

мг/кгх80 кг=800 мг доза.mg/kgx80 kg=800 mg dose.

Однако доза состава антитела для sc применения обычно не превышает 100 нг/мл (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X06000 895).However, the dose of an antibody formulation for sc application is typically not more than 100 ng/mL (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X06000895).

Более того, объем типичной переносимой дозы для s.q. введения находится в диапазоне от приблизительно 0,5-5 мл (объемы более 3 мл считаются большими). Следовательно, для эффективной дозировки IDEC-131 будет требоваться приблизительно 8 мл (см. расчет ниже). Этот объем дозировки значительно превышает медицинские нормы для s.q.Moreover, the typical tolerated dose volume for s.q. administration is in the range of approximately 0.5-5 ml (volumes greater than 3 ml are considered large). Therefore, an effective dosage of IDEC-131 would require approximately 8 ml (see calculation below). This dosage volume significantly exceeds the medical norms for s.q.

(10 мг/кгх80 кг)/100 мг/мл=8 мл.(10 mg/kgx80 kg)/100 mg/ml=8 ml.

В отличие от этого, поскольку вариант № 21 (INX021) характеризуется KD, которая является в 5 раз меньшей (т.е. связывается с CD154 с большей аффинностью), для варианта будет требоваться в 5 раз меньше лекарственного средства для достижения такой же эффективности. Как показано ниже, это будет приводить к объему дозировки приблизительно 1,6 мл, что согласуется с уровнем общепринятых медицинских норм для s.q. инъекций для пациентов.In contrast, since variant #21 (INX021) has a KD that is 5 times lower (i.e. binds to CD154 with higher affinity), the variant will require 5 times less drug to achieve the same potency. As shown below, this will result in a dosage volume of approximately 1.6 ml, which is consistent with the level of conventional medical practice for s.q. injections for patients.

(2 мг/кгх80 кг)/100 мг/мл=1,6 мл.(2 mg/kgx80 kg)/100 mg/ml=1.6 ml.

Следовательно, в отличие от IDEC131 INX021 должен хорошо подходить для введения s.q. путями.Therefore, unlike IDEC131, INX021 should be well suited for administering s.q. ways.

Пример 3. Сравнение специфической активности антител к CD154 в соответствии с настоящим изо- 23 040553 бретением.Example 3 Comparison of specific activity of anti-CD154 antibodies according to the present invention.

На фиг. 4 схематически изображены результаты экспериментов по обнаружению ингибирования управляемой CD154 Т-клетками активации В-клеток. Эти результаты, представленные на фигуре, демонстрируют улучшенную специфическую активность, т.е. более значительное ингибирование управляемойIn FIG. 4 schematically depicts the results of experiments to detect inhibition of CD154-driven T cell activation of B cells. These results, presented in the figure, demonstrate improved specific activity, i. more significant inhibition of controlled

CD154 Т-клетками активации В-клеток у INX-021 по сравнению с IDEC-131.CD154 T cell activation of B cells in INX-021 compared to IDEC-131.

Пример 4. Способность антитела по настоящему изобретению вызывать толерантность.Example 4 Ability of an antibody of the present invention to induce tolerance.

На фиг. 5 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что IgG1-антитела к CD154 мыши, содержащие такие же мутации в Fc, как содержатся в INX021 (E269R и К322А), способны индуцировать толерантность в кожной пробе, описанной ранее. Следовательно, антитела к CD154 человека, содержащие эти мутированные константные области IgG1, должны вызывать толерантность и блокировать другие эффекты CD154 у пациентов-людей.In FIG. 5 shows experimental results demonstrating that anti-mouse CD154 IgG1 antibodies containing the same Fc mutations as found in INX021 (E269R and K322A) are able to induce tolerance in the skin test described previously. Therefore, anti-human CD154 antibodies containing these mutated IgG1 constant regions should induce tolerance and block other effects of CD154 in human patients.

Пример 6. INX021 не вызывает агрегацию тромбоцитов in vitro.Example 6 INX021 does not cause platelet aggregation in vitro.

На фиг. 6 показаны результаты экспериментов, которые показывают, что антитело INX021, содержащее мутации, которые снижают или устраняют связывание FcR, не вызывает агрегацию тромбоцитов in vitro в анализе с применением иммунных комплексов рассматриваемого антитела INX021 и коллагена. Эти эксперименты in vitro показали, что иммунные комплексы мутантов FcR в течение 16- или 20минутного периода не индуцировали активацию или агрегацию выделенных тромбоцитов мыши либо человека. В отличие от этого, в этом же анализе контрольное антитело 5с8 вызывало агрегацию тромбоцитов.In FIG. 6 shows the results of experiments that show that the INX021 antibody containing mutations that reduce or abolish FcR binding does not induce platelet aggregation in vitro in an immune complex assay of the subject INX021 antibody and collagen. These in vitro experiments showed that the immune complexes of the FcR mutants did not induce activation or aggregation of isolated mouse or human platelets over a 16- or 20-minute period. In contrast, in the same assay, the control 5c8 antibody induced platelet aggregation.

Пример 7. Антитела к CD154 в соответствие с настоящим изобретением не вызывают агрегацию тромбоцитов in vivo.Example 7 Anti-CD154 antibodies according to the present invention do not induce platelet aggregation in vivo.

На фиг. 7A-D показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что INX021 не активирует тромбоциты, не индуцирует агрегацию тромбоцитов и не оказывает влияния (снижения) на число тромбоцитов in vivo. Результаты эксперимента на фиг. 7А показывают, что INX021 не индуцирует нарушение функции тромбоцитов или активирует тромбоциты по сравнению с положительным контролем. Результаты эксперимента на фиг. 7В показывают, что INX021 не оказывает влияния на число циркулирующих тромбоцитов по сравнению с положительным контролем. Результаты эксперимента на фиг. 7С показывают, что INX021 не вызывает образование сгустков (эмболов) в легком по сравнению с положительным контролем. На фиг. 7D обобщены благоприятные эффекты INX021 in vivo, т.е. оно не снижает число тромбоцитов, оно не активирует тромфоциты, оно не вызывает нарушение функции тромбоцитов и оно не индуцирует образование сгустков.In FIG. 7A-D show experimental results demonstrating that INX021 does not activate platelets, does not induce platelet aggregation, and does not affect (reduce) platelet count in vivo. The results of the experiment in Fig. 7A show that INX021 does not induce platelet dysfunction or activate platelets compared to the positive control. The results of the experiment in Fig. 7B show that INX021 has no effect on the number of circulating platelets compared to the positive control. The results of the experiment in Fig. 7C show that INX021 does not cause clots (emboli) in the lung compared to the positive control. In FIG. 7D summarizes the beneficial effects of INX021 in vivo, ie. it does not decrease platelet count, it does not activate platelets, it does not cause platelet dysfunction, and it does not induce clots.

Пример 8. Применение антител к CD154 в соответствии с настоящим изобретением в моделях аутоиммунных реакций.Example 8 Use of Anti-CD154 Antibodies According to the Invention in Models of Autoimmune Responses.

Результаты экспериментов, обобщенные на фиг. 8А-В, показывают, что гуманизированные IgG1антитела к CD154, содержащие мутации в Fc INX021, которые снижают или устраняют связывание FcR, активны в разных моделях аутоиммунных или воспалительных реакций.The experimental results summarized in FIG. 8A-B show that humanized anti-CD154 IgG1 antibodies containing mutations in Fc INX021 that reduce or eliminate FcR binding are active in different models of autoimmune or inflammatory responses.

Результаты эксперимента на фиг. 8А показывают, что гуманизированные IgG1-антитела к CD154, содержащие мутации в Fc INX021, эффективно подавляют ЕАЕ в течение приблизительно 20-дневного периода. Результаты эксперимента на фиг. 8В показывают, что гуманизированные IgG1-антитела к CD154, содержащие мутации в Fc INX021, эффективно подавляют гуморальный иммунный ответ на миелиновый гликопротеин олигодендроцитов (MOG), сравнимо с исходным антителом.The results of the experiment in Fig. 8A show that humanized anti-CD154 IgG1 antibodies containing mutations in Fc INX021 effectively suppress EAE over a period of approximately 20 days. The results of the experiment in Fig. 8B show that humanized anti-CD154 IgG1 antibodies containing mutations in Fc INX021 effectively suppress the humoral immune response to oligodendrocyte myelin glycoprotein (MOG), comparable to the parent antibody.

Пример 9. Тестирование вариантов IDEC-131, в том числе INX021, в отношении их способности подавлять индуцируемую Т-клетками активацию В-клеток.Example 9 Testing of IDEC-131 variants, including INX021, for their ability to suppress T cell-induced B cell activation.

Результаты эксперимента на фиг. 9 сравнивают эффекты разных вариантов антитела в соответствии с настоящим изобретением, т.е. вариантов № 21 - № 31 (INX021), к подавлению индуцируемой Тклетками активации В-клеток на основании экспрессии CD86. В этих экспериментах эффекты вариантов антитела в соответствии с настоящим изобретением в отношении подавления сравнивали в реакции смешанных лимфоцитов. Считываемым показателем была экспрессия CD86 активированными В-клетками. Как показано на фигуре, антитела с более высокими значениями K_D не обязательно коррелируют с улучшенным функциональным эффектом в реакциях MLR. INX021 обладал превосходными иммуносупрессивными свойствами по сравнению с другими вариантами.The results of the experiment in Fig. 9 compares the effects of different variants of an antibody in accordance with the present invention, i.e. options No. 21 - No. 31 (INX021), to the suppression of T-cell-induced activation of B-cells based on the expression of CD86. In these experiments, the inhibitory effects of the antibody variants of the present invention were compared in a mixed lymphocyte reaction. The readout was CD86 expression by activated B cells. As shown in the figure, antibodies with higher K _D values do not necessarily correlate with improved performance in MLR reactions. INX021 had superior immunosuppressive properties compared to other variants.

Пример 10. Токсикологическое исследование INX021 и измерения Т-клеточно-зависимого иммунного ответа (TDAR).Example 10 INX021 Toxicology Study and T-Cell Dependent Immune Response (TDAR) Measurements.

Для того чтобы оценить пригодность для применения в терапии у человека антитело INX021 по настоящему изобретению изучали в токсикологическом исследовании за рамками GLP длительностью 8 недель на макаках-резусах в CRL и лабораториях Гарварда. Схема исследования показана в таблицах ниже. Целями исследования была оценка безопасности и эффективности INX021 у отличного от человека примата (NHP).In order to assess suitability for use in human therapy, the INX021 antibody of the present invention was studied in an 8 week non-GLP toxicology study in rhesus monkeys at CRL and Harvard Laboratories. The study design is shown in the tables below. The objectives of the study were to evaluate the safety and efficacy of INX021 in a non-human primate (NHP).

- 24 040553- 24 040553

Таблица 5Table 5

Обзор эксперимента TDAROverview of the TDAR experiment

Начало введения доз Start of dosing День 1 Day 1 1-ая доза KLH 1st dose KLH День 29 Day 29 Забор образцов крови Collection of blood samples Дни 29, 36, 39 (дни 0, 7, 10 после введения дозы KLH) Days 29, 36, 39 (days 0, 7, 10 post KLH dose) 2-ая доза KLH 2nd dose KLH День 43 Day 43 Забор образцов крови Collection of blood samples Дни 43, 50, 53, 57 (дни 14, 21, 24, 28 после введения дозы KLH) Days 43, 50, 53, 57 (Days 14, 21, 24, 28 post KLH) Измерения IgG и IgM IgG and IgM measurements

Таблица 6Table 6

Группы NHP в исследовании TDARNHP groups in the TDAR study

Центр Center Обработка Treatment N N Виды NHP Types of NHPs CRL CRL Среда-носитель Carrier medium 4 4 Резус Rhesus CRL CRL 50 мг/кг INX021 50 mg/kg INX021 8 8 Резус Rhesus CRL CRL 20 мг/кг 5С8 20 mg/kg 5C8 8 8 Резус Rhesus Гарвард Harvard Среда-носитель Carrier medium 3 3 Яванский Javanese Гарвард Harvard 1 мг/кг INX021 1 mg/kg INX021 3 3 Яванский Javanese Гарвард Harvard 5 мг/кг INX021 5 mg/kg INX021 3 3 Яванский Javanese

На фиг. 10А-В сравниваются эффекты INX021 и химерного антитела 5с8 на продуцирование IgG- и IgM-антител в анализе KLH. На фиг. 10А сравниваются их эффекты в отношении IgG, и на фиг. 10В сравниваются их эффекты в отношении IgM.In FIG. 10A-B compare the effects of INX021 and chimeric antibody 5c8 on the production of IgG and IgM antibodies in the KLH assay. In FIG. 10A compares their effects on IgG and FIG. 10B compares their effects on IgM.

На фиг. 11А-В сравниваются эффекты среды-носителя, INX021 и антитела 5с8 на баллы оценки зародышевых центров. На фиг. 11А показано сравнение баллов оценки зародышевых центров, и на фиг. 11В представлены гистограммы, сравнивающие число зародышевых центров и степень их насыщенности клетками в селезенках и лимфатических узлах (LN) обработанных животных.In FIG. 11A-B compare the effects of vehicle medium, INX021, and 5c8 antibody on germinal center scores. In FIG. 11A shows a comparison of germinal center scores, and FIG. 11B are histograms comparing the number of germinal centers and their degree of cell saturation in the spleens and lymph nodes (LN) of treated animals.

Эти результаты указывают, что INX021 должен быть безопасным и эффективным в терапии у человека.These results indicate that INX021 should be safe and effective in human therapy.

Пример 11. INX021 подавляет образование антител к лекарственному средству (ADA) у NHP.Example 11 INX021 inhibits the formation of anti-drug antibodies (ADA) in NHP.

В течении экспериментов по изучению токсичности/TDAR INX021, обсуждаемых в предыдущем примере, авторы настоящего изобретения определяли наличие ADA во всех когортах. TDAR-ответы у всех животных подавлялись, что свидетельствует о том, что образование антител в ответ на растворимые антигены может быть предотвращено у животных, обработанных INX021. Для изучения этого авторы настоящего изобретения определяли образование ADA у макаков-резусов после 8-недельного инъецирования INX021 или 5с8. У всех, кроме одного животного, из группы INX021 при наиболее низких дозах (1 мг/кг) не наблюдали никаких обнаруживаемых ADA.During the INX021 toxicity/TDAR experiments discussed in the previous example, the present inventors determined the presence of ADA in all cohorts. TDAR responses were suppressed in all animals, indicating that antibody formation in response to soluble antigens could be prevented in animals treated with INX021. To study this, the authors of the present invention determined the formation of ADA in rhesus monkeys after 8 weeks of injection of INX021 or 5c8. All but one animal from the INX021 group at the lowest doses (1 mg/kg) showed no detectable ADA.

Способы.Ways.

Обнаружение антител к INX021 и ch5C8 у макаков-резусов (ELISA).Detection of antibodies to INX021 and ch5C8 in rhesus monkeys (ELISA).

Получение 2н. серной кислоты (останавливающий раствор).Getting 2n. sulfuric acid (stopping solution).

Для каждых 1000 мл получаемой 2н. серной кислоты объединяли 500 мл 4н. серной кислоты с 500 мл дистиллированной воды. Хорошо перемешивали. Для каждого отдельного компонента будет устанавливаться срок хранения, составляющий один год от даты получения, или срок хранения согласно производителю, в зависимости от того, что наступит раньше. Растворы будут хранится при комнатной температуре (17-27°С).For every 1000 ml of 2n. sulfuric acid was combined with 500 ml of 4N. sulfuric acid with 500 ml of distilled water. Well mixed. Each individual component will have a shelf life of one year from the date of receipt, or a manufacturer's shelf life, whichever comes first. Solutions will be stored at room temperature (17-27°C).

Получение покрытых 96-луночных планшетов.Preparation of coated 96-well plates.

В этих протоколах тестируемый материал обозначает образцы, содержащие сыворотку крови макаков-резусов или яванских макаков, образцы, содержащие положительный контроль, и/или холостые пробы.In these protocols, test material refers to samples containing rhesus or cynomolgus monkey blood, samples containing a positive control, and/or blanks.

Протокол.Protocol.

1. Получают раствор для покрытия с концентрацией INX021 или ch5С8 1,0 пг/мл с использованием буфера для покрытия (0,2 карбонатно-бикарбонатного буфера) в качестве разбавителя.1. Prepare a coating solution at 1.0 pg/ml INX021 or ch5C8 using coating buffer (0.2 carbonate/bicarbonate buffer) as diluent.

2. Добавляют 100 пл раствора для покрытия в каждую лунку прозрачного 96-луночного полистирольного планшета(планшетов) и закрывают.2. Add 100 pl of coating solution to each well of a clear 96-well polystyrene plate(s) and seal.

3. Инкубируют планшет(планшеты) в течение 12-24 ч при 2-8°С.3. Incubate the plate(s) for 12-24 hours at 2-8°C.

4. Аспирируют (удаляют) раствор для покрытия из каждой лунки планшета(планшетов), затем промывают каждую лунку с помощью 3x300 пл 1X PBS-T.4. Aspirate (remove) the coating solution from each well of the plate(s), then wash each well with 3x300pl 1X PBS-T.

5. Добавляют 200 пл блокирующего раствора казеина в каждую лунку планшета(планшетов) и закрывают.5. Add 200 pl of casein blocking solution to each well of the plate(s) and seal.

6. Инкубируют планшет в течение 1 ч ± 5 мин.6. Incubate the plate for 1 h ± 5 min.

- 25 040553- 25 040553

7. Аспирируют блокирующий раствор казеина из каждой лунки планшета(планшетов), затем промывают каждую лунку с помощью 3x300 пл 1X PBS-T.7. Aspirate the casein blocking solution from each well of the plate(s), then wash each well with 3x300pl 1X PBS-T.

8. Используют планшет(планшеты) сразу же после промывания (завершают добавление в планшеты в течение 2 ч после завершения промывания). Устанавливают срок хранения от даты, когда была завершена подготовка планшета.8. Use the plate(s) immediately after washing (complete addition to plates within 2 hours of completion of washing). Set the shelf life from the date when the preparation of the tablet was completed.

Процедура анализа обнаружения антител к INX021 или ch5C8.Assay procedure for detecting antibodies to INX021 or ch5C8.

В этих экспериментальных протоколах тестируемый материал обозначает образцы, содержащие сыворотку крови макаков-резусов или яванских макаков, образцы, содержащие положительный контроль, и/или холостые пробы. Комнатная температура/температура окружающей среды составляет 1727°С.In these experimental protocols, test material refers to samples containing rhesus or cynomolgus monkey blood, samples containing a positive control, and/or blanks. Room temperature/ambient temperature is 1727°C.

Протокол.Protocol.

1. Добавляют 100 пл каждого тестируемого материала в соответствующую(соответствующие) лунку(лунки) планшета(планшетов), покрытого(покрытых) INX021 или ch5С8, и закрывают с помощью устройства для герметизации планшетов.1. Add 100 pl of each test material to the appropriate well(s) of the INX021 or ch5C8 coated plate(s) and seal with a plate sealer.

2. Используют шаблон планшета для регистрации расположения тестируемого материала.2. Use the plate template to record the location of the test material.

3. Инкубируют тестируемый материал в планшете(планшетах), покрытом(покрытых) INX021 или ch5С8, при комнатной температуре в течение 1 ч ± 5 мин.3. Incubate the test material in the plate(s) coated with INX021 or ch5C8 at room temperature for 1 h ± 5 min.

Процедура анализа.analysis procedure.

1. Аспирируют тестируемый материал из каждой лунки планшета(планшетов), затем промывают каждую лунку планшета(планшетов) с помощью 3x300 пл 1X PBS-T.1. Aspirate test material from each well of the plate(s), then wash each well of the plate(s) with 3x300pl 1X PBS-T.

2. Добавляют 100 пл 0,125 пг/мл INX021-6uotuh или 1,0 пг/мл ch5С8-биотин в каждую лунку планшета(планшетов) и закрывают с помощью устройства для герметизации планшетов.2. Add 100 pl of 0.125 pg/ml INX021-6uotuh or 1.0 pg/ml ch5C8-biotin to each well of the plate(s) and seal with a plate sealer.

3. Инкубируют планшет(планшеты) при комнатной температуре в течение 1 ч ± 5 мин.3. Incubate the plate(s) at room temperature for 1 h ± 5 min.

4. Аспирируют (удаляют) INX021-6uotuh или ch5С8-биотин из каждой лунки планшета(планшетов), затем промывают каждую лунку планшета(планшетов) с помощью 3x300 пл 1X PBS-T.4. Aspirate (remove) INX021-6uotuh or ch5C8-biotin from each well of the plate(s), then wash each well of the plate(s) with 3x300pl 1X PBS-T.

5. Добавляют 100 пл 0,1 пг/мл SA-HRP в каждую лунку планшета(планшетов) и закрывают.5. Add 100 pl of 0.1 pg/ml SA-HRP to each well of the plate(s) and seal.

6. Инкубируют планшет(планшеты) при комнатной температуре в течение 30 ± 5 мин.6. Incubate the plate(s) at room temperature for 30 ± 5 min.

7. Аспирируют (удаляют) SA-HRP из каждой лунки планшета(планшетов), затем промывают каждую лунку планшета(планшетов) с помощью 3x300 пл 1X PBS-T.7. Aspirate (remove) SA-HRP from each well of the plate(s), then wash each well of the plate(s) with 3x300pl 1X PBS-T.

8. Добавляют 100 пл ТМВ в каждую лунку планшета(планшетов).8. Add 100 pl TMB to each well of the plate(s).

9. Инкубируют планшет(планшеты) при комнатной температуре в течение 20 ± 5 мин.9. Incubate plate(s) at room temperature for 20 ± 5 min.

10. Добавляют 100 пл 2н. серной кислоты в каждую лунку планшета(планшетов).10. Add 100 pl 2n. sulfuric acid in each well of the tablet(s).

11. Считывают планшет(планшеты) при 450 нм с применением микропланшетного спектрофотометра с анализом в течение 30 мин.11. Read the plate(s) at 450 nm using a microplate spectrophotometer with analysis within 30 minutes.

Общая обработка данных.General data processing.

Для всех тестируемых материалов будут рассчитывать среднее значение А450, стандартное отклонение и % различие (если n=2) или CV% (если n>3), чтобы оценить дисперсию, если не определено иное. Все критерии приемлемости CV% будут применяться к % значениям различия, если % различие рассчитывается вместо CV%. Если анализируют три или более лунок с тестируемым материалом, одну лунку можно не учитывать, если CV% не соответствует указанным критериям.For all materials tested, the A450 mean, standard deviation and % difference (if n=2) or CV% (if n>3) will be calculated to estimate the variance unless otherwise specified. All CV% acceptance criteria will apply to % difference values if % difference is calculated instead of CV%. If three or more wells of test material are analyzed, one well may be discarded if the CV% does not meet the specified criteria.

% CV: r стандартное отклонение > среднее значениех100.% CV: r standard deviation > mean x 100.

% различия: r значение А - значение В v среднее значениех100.% difference: r value A - value B v average value x100.

Анализ максимальных нормированных остатков (MNR) будут выполнять для оценки дисперсии при 5% уровне с учетом холостого TS для отбрасывания не более чем двух выпадающих значений А450 холостых тестируемых образцов (TS). Среднее значение А450 будет рассчитываться из всех значений, не отброшенных в качестве выпадающих значений. Дополнительные лунки можно не учитывать из-за технической ошибки.Maximum Normalized Residuals (MNR) analysis will be performed to estimate the variance at the 5% level considering blank TS to discard no more than two outliers of A450 blank test samples (TS). The average value of A450 will be calculated from all values not discarded as outliers. Additional wells may be omitted due to a technical error.

Порог отсечения для конкретного планшета (PSCP) будет рассчитываться в виде общий порог отсечения (СР) x среднее значение А450 холостого TS (без выпадающих значений)=PSCP.The plate-specific cut-off threshold (PSCP) will be calculated as total cut-off (CP) x blank TS A450 average (no outliers)=PSCP.

Общие критерии приемлемости.General acceptance criteria.

Если холостой TS имеет более двух выпадающих значений, то планшет не дает результатов и его следует повторно анализировать. По меньшей мере 5 значений А450 холостого TS должны остаться для анализа MNR после скрывания выпадающих значений и значений от лунок, которые были скрыты из-за технической ошибки. Следующее уравнение будет применяться для расчета значения MNR:If the blank TS has more than two outliers, then the plate is not giving results and should be reanalyzed. At least 5 blank TS A450 values must remain for MNR analysis after hiding outliers and values from wells that were hidden due to a technical error. The following equation will be applied to calculate the MNR value:

значение MNR холостого TS - среднее значение холостого TS.blank TS MNR value - the average blank TS value.

Стандартное отклонение x Vn-1.Standard deviation x Vn-1.

Значение будет определено как выпадающее, если значение MNR превышает критическое значение. Критические значения определяются как: n=12=0,727, n=11=0,745, n=10=0,763, n=9=0,783, n=8=0,804, n=7=0,825, n=6=0,844 и n=5=0,858. Все выпадающие значения будут скрываться.The value will be defined as an outlier if the MNR value exceeds the critical value. Critical values are defined as: n=12=0.727, n=11=0.745, n=10=0.763, n=9=0.783, n=8=0.804, n=7=0.825, n=6=0.844 and n=5 =0.858. All drop-down values will be hidden.

Среднее значение А450 холостой пробы, представляющей собой блокирующий раствор казеина иThe average A450 value of a blank sample, which is a blocking solution of casein and

- 26 040553 холостого TS после отбрасывания выпадающих значений, должно быть меньше чем LPC А<<0. Порог отсечения для конкретного планшета (PSCP) будет рассчитываться в виде PSCP=CF * общее среднее значение холостого TS (без выпадающих значений). Поправочный коэффициент (CF) будет добавляться к файлу исследования. Среднее значение А450 LPC должно превышать PSCP. В противном случае LPC для данного набора не дает результатов.- 26 040553 idle TS after dropping outliers, must be less than LPC A<<0. The plate-specific cut-off threshold (PSCP) will be calculated as PSCP=CF * total average blank TS (no outliers). A correction factor (CF) will be added to the study file. The average value of A450 LPC must exceed PSCP. Otherwise, LPC for this set will not produce results.

CV% холостой пробы, представляющей собой буфер для анализа, должен составлять <30%. Если холостая проба, представляющая собой буфер для анализа, не соответствует критериям, перечисленным выше, то планшет будет оцениваться в ходе научного обзора для определения того, можно ли использовать данные.The CV% of the assay blank should be <30%. If the assay buffer blank does not meet the criteria listed above, then the plate will be evaluated during a scientific review to determine if the data can be used.

HPOMPOLPC для среднего значения А450 каждого набора PC.HPOMPOLPC for the A450 average of each PC set.

По меньшей мере две-третьих уровней PC должны соответствовать критериям приемлемости, при этом по меньшей мере один PC на каждом уровне PC должен соответствовать критериям приемлемости.At least two-thirds of the PC levels must meet the eligibility criteria, with at least one PC at each PC level must meet the eligibility criteria.

% различие тестируемых образцов между параллельными лунками должно составлять <25%. Если тестируемый образец не соответствует этим критериям, то образец будут повторно анализировать.The % difference between test samples between parallel wells should be <25%. If the test sample does not meet these criteria, the sample will be reanalyzed.

Получение положительных контролен, холостых TS и холостой пробы, представляющей собой буфер для анализа.Obtaining positive controls, blank TS and a blank sample, which is a buffer for analysis.

Положительные контроли будут получать путем внесения суррогатного антитела в качестве положительного контроля в 100% сыворотку крови макака-резуса (RHS) или сыворотку крови яванского макака. Положительные контроли в 100% матрице будут разводить в 10 раз блокирующим раствором казеина с получением соответствующей рабочей концентрации и 10% матрицы. Каждый набор PC будут получать независимо друг от друга и будут анализировать на каждом планшете. В день анализа PC будут анализировать на каждом планшете.Positive controls will be generated by adding a surrogate antibody as a positive control to 100% rhesus monkey serum (RHS) or cynomolgus monkey serum. Positive controls in 100% matrix will be diluted 10-fold with casein blocking solution to obtain the appropriate working concentration and 10% matrix. Each PC set will be received independently and will be analyzed on each plate. On the day of analysis, PCs will be analyzed on each plate.

Каждый планшет будет содержать два набора PC LPC (50 нг/мл), МРС (250 нг/мл) и НРС (1000 нг/мл). Холостой TS также будут получать в конечной концентрации 10% матрицы, разведенной блокирующим раствором казеина. 12 лунок холостого TS будет включено на каждом планшете. Блокирующий раствор казеина будет включен по меньшей мере в две лунки на каждом планшете. Весь тестируемый материал будут анализировать минимум в двух лунках, если не определено иное.Each plate will contain two sets of PC LPC (50 ng/ml), MPC (250 ng/ml) and HPC (1000 ng/ml). Blank TS will also be prepared at a final concentration of 10% matrix diluted with casein blocking solution. 12 wells of a TS blank will be included on each plate. The casein blocking solution will be included in at least two wells on each plate. All test material will be analyzed in a minimum of two wells unless otherwise specified.

Анализ скрининга.Screening analysis.

Для скрининга образцы разводили 1/10 в блокирующем растворе казеина и анализировали согласно процедуре, описанной в разделе 7.0. Среднее значение поглощения исследуемых образцов в ходе анализа образцов будут сравнивать с PSCP и будут представлять в качестве потенциально положительного, если среднее значение поглощения составляет >PSCP, или отрицательного, если среднее значение поглощения составляет <PSCP.For screening, samples were diluted 1/10 in casein blocking solution and analyzed according to the procedure described in section 7.0. The mean absorbance of test samples during sample analysis will be compared to PSCP and will be reported as potentially positive if the mean absorbance is >PSCP or negative if the mean absorbance is <PSCP.

Результаты.Results.

TDAR-ответы у всех животных подавлялись, что свидетельствует о том, что образование антител в ответ на растворимые антигены может быть предотвращено у животных, обработанных INX021. Для изучения этого авторы настоящего изобретения определяли образование ADA у макаков-резусов после 8-недельного инъецирования INX021 или 5С8. У всех, кроме одного животного, из группы INX021 при наиболее низких дозах (1 мг/кг) не наблюдали никаких обнаруживаемых ADA. Следовательно, антитело INX021 по настоящему изобретению можно применять для подавления гуморальных иммунных реакций, например, в ответ на иммуногенные лекарственные средства, такие как биологические препараты, например терапевтические антитела, слитые белки и т.п.TDAR responses were suppressed in all animals, indicating that antibody formation in response to soluble antigens could be prevented in animals treated with INX021. To study this, the authors of the present invention determined the formation of ADA in rhesus monkeys after 8 weeks of injection of INX021 or 5C8. All but one animal from the INX021 group at the lowest doses (1 mg/kg) showed no detectable ADA. Therefore, the INX021 antibody of the present invention can be used to suppress humoral immune responses, for example, in response to immunogenic drugs such as biologics, eg, therapeutic antibodies, fusion proteins, and the like.

Ссылки, цитируемые в настоящей заявкеReferences cited in this application

Цитируются следующие ссылки. Содержание всех включено в данный документ посредством ссылки.The following references are cited. The contents of all are incorporated herein by reference.

1. Noelle, R. J., Mackey, М., Foy, T., Buhlmann, J. и1. Noelle, R. J., Mackey, M., Foy, T., Buhlmann, J. and

Burns, C., CD40 and its ligand in autoimmunity. Ann N Y Acad Sci 1997. 815: 384-391.Burns, C., CD40 and its ligand in autoimmunity. Ann N Y Acad Sci 1997. 815: 384-391.

2. Mackey, M. F., Barth, R. J., Jr. и Noelle, R. J., The role of CD40/CD154 interactions in the priming, differentiation, and effector function of helper and cytotoxic T cells. J Leukoc2. Mackey, M. F., Barth, R. J., Jr. and Noelle, R. J., The role of CD40/CD154 interactions in the priming, differentiation, and effector function of helper and cytotoxic T cells. J Leukoc

Biol 1998. 63: 418-428.Biol 1998. 63: 418-428.

3. Noelle, R. J., CD40 and its ligand in cell-mediated immunity. Agents Actions Suppl 1998. 49: 17-22.3. Noelle, R. J., CD40 and its ligand in cell-mediated immunity. Agents Actions Suppl 1998. 49: 17-22.

- 27 040553- 27 040553

4. Quezada, S. A., Jarvinen, L. Z. , Lind, E. F. и Noelle, R. J., CD40/CD154 Interactions at the Interface of Tolerance and Immunity. Annu Rev Immunol 2004. 22: 307-328.4. Quezada, S. A., Jarvinen, L. Z. , Lind, E. F. and Noelle, R. J., CD40/CD154 Interactions at the Interface of Tolerance and Immunity. Annu Rev Immunol 2004. 22: 307-328.

5. Kenyon, N. S., Chatzipetrou, M., Masetti, M., Ranuncoli, A., Oliveira, M., Wagner, J. L., Kirk, A. D., Harlan, D. M., Burkly, L. С. и Ricordi, C., Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154. Proc Natl Acad Sci USA 1999. 96: 81328137 .5. Kenyon, N. S., Chatzipetrou, M., Masetti, M., Ranuncoli, A., Oliveira, M., Wagner, J. L., Kirk, A. D., Harlan, D. M., Burkly, L. C. and Ricordi, C., Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154. Proc Natl Acad Sci USA 1999. 96: 81328137.

6. Kirk, A. D., Burkly, L. C., Batty, D. S., Baumgartner, R. E., Berning, J. D., Buchanan, K., Fechner, J. H., Jr., Germond, R. L., Kampen, R. L., Patterson, N. B., Swanson, S. J., Tadaki, D. K. , TenHoor, C. N., White, L., Knechtle, S. J. и Harlan, D. M., Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates. Nat Med 1999. 5: 686-693.6. Kirk, A. D., Burkly, L. C., Batty, D. S., Baumgartner, R. E., Berning, J. D., Buchanan, K., Fechner, J. H., Jr., Germond, R. L., Kampen, R. L., Patterson, N. B., Swanson, S. J., Tadaki, D. K. , TenHoor, C. N., White, L., Knechtle, S. J. and Harlan, D. M., Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates. Nat Med 1999. 5: 686-693.

7. Sidiropoulos, P. I. and Boumpas, D. T., Lessons learned from anti-CD40L treatment in systemic lupus erythematosus patients. Lupus 2004. 13: 391-397.7. Sidiropoulos, P. I. and Boumpas, D. T., Lessons learned from anti-CD40L treatment in systemic lupus erythematosus patients. Lupus 2004. 13: 391-397.

8. Sidiropoulos, P. I. and Boumpas, D. T., Lessons learned from anti-CD40L treatment in systemic lupus erythematosus patients. Lupus 2004. 13: 391-397.8. Sidiropoulos, P. I. and Boumpas, D. T., Lessons learned from anti-CD40L treatment in systemic lupus erythematosus patients. Lupus 2004. 13: 391-397.

9. Ferrant, J. L., Benjamin, C. D., Cutler, A. H., Railed, S. L., Hsu, Y. M., Garber, E. A., Hess, D. M., Shapiro, R. I., Kenyon, N. S., Harlan, D. M., Kirk, A. D., Burkly, L. С. и Taylor, F. R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge. Int Immunol 2004. 16: 1583-1594.9. Ferrant, J. L., Benjamin, C. D., Cutler, A. H., Railed, S. L., Hsu, Y. M., Garber, E. A., Hess, D. M., Shapiro, R. I., Kenyon, N. S., Harlan, D. M., Kirk, A. D., Burkly, L. C. and Taylor, F. R., The contribution of Fc effector mechanisms in the efficacy of anti-CD154 immunotherapy depends on the nature of the immune challenge. Int Immunol 2004. 16: 1583-1594.

10. U.S. Patent No. 6,444,01810 U.S. Patent No. 6,444,018

11. Gordon, E. J., Markees, T. G., Phillips, N. E., Noelle, R. J., Shultz, L. D., Mordes, J. P., Rossini, А. А. и Greiner, D. L., Prolonged survival of rat islet and skin xenografts in mice treated with donor splenocytes and anti-CD154 monoclonal antibody. Diabetes 1998. 47: 1199-1206.11. Gordon, E. J., Markees, T. G., Phillips, N. E., Noelle, R. J., Shultz, L. D., Mordes, J. P., Rossini, A. A., and Greiner, D. L., Prolonged survival of rat islet and skin xenografts in mice treated with donor splenocytes and anti-CD154 monoclonal antibody. Diabetes 1998. 47: 1199-1206.

12. Markees, T. G., Phillips, N. E., Noelle, R. J., Shultz, L. D., Mordes, J. P., Greiner, D. L. и Rossini, A. A., Prolonged12. Markees, T. G., Phillips, N. E., Noelle, R. J., Shultz, L. D., Mordes, J. P., Greiner, D. L. and Rossini, A. A., Prolonged

- 28 040553 survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand. Transplantation 1997. 64: 329-335.- 28 040553 survival of mouse skin allografts in recipients treated with donor splenocytes and antibody to CD40 ligand. Transplantation 1997. 64: 329-335.

13. Jarvinen, L. Z., Blazar, B. R., Adeyi, 0. A., Strom, T. В. и Noelle, R. J., CD154 on the surface of CD4+CD25+ regulatory T cells contributes to skin transplant tolerance. Transplantation 2003. 76: 1375-1379.13. Jarvinen, L. Z., Blazar, B. R., Adeyi, 0. A., Strom, T. B. and Noelle, R. J., CD154 on the surface of CD4+CD25+ regulatory T cells contributes to skin transplant tolerance. Transplantation 2003. 76: 1375-1379.

14. Quezada, S. A., Fuller, B., Jarvinen, L. Z. , Gonzalez, M., Blazar, B. R., Rudensky, A. Y., Strom, T. В. и Noelle, R. J., Mechanisms of donor-specific transfusion tolerance: preemptive induction of clonal T-cell exhaustion via indirect presentation. Blood 2003. 102: 1920-1926.14. Quezada, S. A., Fuller, B., Jarvinen, L. Z. , Gonzalez, M., Blazar, B. R., Rudensky, A. Y., Strom, T. B. and Noelle, R. J., Mechanisms of donor-specific transfusion tolerance: preemptive induction of clonal T-cell exhaustion via indirect presentation. Blood 2003. 102: 1920-1926.

15. Frleta, D., Lin, J. T., Quezada, S. A., Wade, T. K. , Barth, R. J., Noelle, R. J. и Wade, W. F., Distinctive maturation of in vitro versus in vivo anti-CD40 mAb-matured dendritic cells in mice. J Immunother 2003. 26: 72-84.15. Frleta, D., Lin, J. T., Quezada, S. A., Wade, T. K. , Barth, R. J., Noelle, R. J., and Wade, W. F., Distinctive maturation of in vitro versus in vivo anti-CD40 mAb-matured dendritic cells in mice. J Immunother 2003. 26: 72-84.

16. Quezada, S., Eckert, M., Schned, A., Noelle, R. J. и Burns, 0., Distinct mechanisms of action of anti-CD154 in early versus late treatment of murine lupus nephritis. Arth Rheum. 2003. в печати.16. Quezada, S., Eckert, M., Schned, A., Noelle, R. J. and Burns, 0., Distinct mechanisms of action of anti-CD154 in early versus late treatment of murine lupus nephritis. Arth Rheum. 2003. in press.

17. Elster, E. A., Xu, H., Tadaki, D. K., Montgomery, S., Burkly, L. 0., Berning, J. D., Baumgartner, R. E., Cruzata, F., Marx, R., Harlan, D. M. и Kirk, A. D., Treatment with the humanized CD154-specific monoclonal antibody, hu5C8, prevents acute rejection of primary skin allografts in nonhuman primates. Transplantation 2001. 72: 1473-1478.17. Elster, E. A., Xu, H., Tadaki, D. K., Montgomery, S., Burkly, L. 0., Berning, J. D., Baumgartner, R. E., Cruzata, F., Marx, R., Harlan, D. M. and Kirk , A. D., Treatment with the humanized CD154-specific monoclonal antibody, hu5C8, prevents acute rejection of primary skin allografts in nonhuman primates. Transplantation 2001. 72: 1473-1478.

18. Benda, B., Ljunggren, H. G., Peach, R., Sandberg, J. 0. и Korsgren, 0., Co-stimulatory molecules in islet xenotransplantation: CTLA4Ig treatment in CD40 ligand-deficient mice. Cell transplantation 2002. 11: 715-720.18. Benda, B., Ljunggren, H. G., Peach, R., Sandberg, J. 0. and Korsgren, 0., Co-stimulatory molecules in islet xenotransplantation: CTLA4Ig treatment in CD40 ligand-deficient mice. Cell transplantation 2002. 11: 715-720.

19. Wekerle, T. и Sykes, M., Mixed chimerism and transplantation tolerance. Annual review of medicine 2001. 52: 353-370.19. Wekerle, T. and Sykes, M., Mixed chimerism and transplantation tolerance. Annual review of medicine 2001. 52: 353-370.

20. Camirand, G., Caron, N. J., Turgeon, N. A., Rossini, A. А. и Tremblay, J. P., Treatment with anti-CD154 antibody and20. Camirand, G., Caron, N. J., Turgeon, N. A., Rossini, A. A. and Tremblay, J. P., Treatment with anti-CD154 antibody and

- 29 040553 donor-specific transfusion prevents acute rejection of myoblast transplantation. Transplantation 2002. 73: 453-461.- 29 040553 donor-specific transfusion prevents acute rejection of myoblast transplantation. Transplantation 2002. 73: 453-461.

21. Tung, T. H., Mackinnon, S. E. и Mohanakumar, T., Longterm limb allograft survival using anti-CD40L antibody in a murine model. Transplantation 2003. 75: 644-650.21. Tung, T. H., Mackinnon, S. E. and Mohanakumar, T., Longterm limb allograft survival using anti-CD40L antibody in a murine model. Transplantation 2003. 75: 644-650.

22. Koyama, I., Kawai, T., Andrews, D., Boskovic, S., Nadazdin, 0., Wee, S. L., Sogawa, H., Wu, D. L., Smith, R. N., Colvin, R. B., Sachs, D. H. и Cosimi, A. B., Thrombophilia associated with anti-CD154 monoclonal antibody treatment and its prophylaxis in nonhuman primates. Transplantation 2004. 77: 460462 .22. Koyama, I., Kawai, T., Andrews, D., Boskovic, S., Nadazdin, 0., Wee, S. L., Sogawa, H., Wu, D. L., Smith, R. N., Colvin, R. B., Sachs, D. H. and Cosimi, A. B., Thrombophilia associated with anti-CD154 monoclonal antibody treatment and its prophylaxis in nonhuman primates. Transplantation 2004.77:460462.

23. Kawai, T., Andrews, D., Colvin, R. B., Sachs, D. H. и Cosimi, A. B., Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand. Nat Med 2000. 6: 114.23. Kawai, T., Andrews, D., Colvin, R. B., Sachs, D. H. and Cosimi, A. B., Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand. Nat Med 2000. 6:114.

24. Daley, S. R., Cobbold, S. В. и Waldmann, H., Fcdisabled anti-mouse CD40L antibodies retain efficacy in promoting transplantation tolerance. Am J Transplant 2008. 8: 2265-2271.24. Daley, S. R., Cobbold, S. B. and Waldmann, H., Fcdisabled anti-mouse CD40L antibodies retain efficacy in promoting transplantation tolerance. Am J Transplant 2008. 8: 2265-2271.

25. Sanchez-Fueyo, A., Domenig, C., Strom, T. В. и Zheng, X. X., The complement dependent cytotoxicity (CDC) immune effector mechanism contributes to anti-CD154 induced immunosuppression. Transplantation 2002. 74: 898-900.25. Sanchez-Fueyo, A., Domenig, C., Strom, T. B. and Zheng, X. X., The complement dependent cytotoxicity (CDC) immune effector mechanism contributes to anti-CD154 induced immunosuppression. Transplantation 2002. 74: 898-900.

26. Monk, N. J., Hargreaves, R. E., Marsh, J. E., Farrar, C. A., Sacks, S. H., Millrain, M., Simpson, E., Dyson, J. и Jurcevic, S., Fc-dependent depletion of activated T cells occurs through CD40L-specific antibody rather than costimulation blockade. Nat Med 2003. 9: 1275-1280.26. Monk, N. J., Hargreaves, R. E., Marsh, J. E., Farrar, C. A., Sacks, S. H., Millrain, M., Simpson, E., Dyson, J. and Jurcevic, S., Fc-dependent depletion of activated T cells occurs through CD40L-specific antibody rather than costimulation blockade. Nat Med 2003. 9: 1275-1280.

27. Truscott, S. M., Abate, G., Price, J. D., Kemper, C., Atkinson, J. P. и Hoft, D. F., CD46 engagement on human CD4+ T cells produces T regulatory type 1-like regulation of antimycobacterial T cell responses. Infection and immunity 2010. 78: 5295-5306.27. Truscott, S. M., Abate, G., Price, J. D., Kemper, C., Atkinson, J. P. and Hoft, D. F., CD46 engagement on human CD4+ T cells produces T regulatory type 1-like regulation of antimycobacterial T cell responses. Infection and immunity 2010. 78: 5295-5306.

28. Cardone, J., Le Friec, G., Vantourout, P., Roberts, A., Fuchs, A., Jackson, I., Suddason, T., Lord, G., Atkinson, J. P., Cope, A., Hayday, А. и Kemper, C., Complement regulator CD4628. Cardone, J., Le Friec, G., Vantourout, P., Roberts, A., Fuchs, A., Jackson, I., Suddason, T., Lord, G., Atkinson, J. P., Cope, A ., Hayday, A. and Kemper, C., Complement regulator CD46

- 30 040553 temporally regulates cytokine production by conventional and unconventional T cells. Nature immunology 2010. 11: 862-871.- 30 040553 temporally regulates cytokine production by conventional and unconventional T cells. Nature immunology 2010. 11: 862-871.

29. Fuchs, A., Atkinson, J. P., Fremeaux-Bacchi, V. и Kemper, C., CD46-induced human Treg enhance В-cell responses. European journal of immunology 2009. 39: 3097-3109.29. Fuchs, A., Atkinson, J. P., Fremeaux-Bacchi, V. and Kemper, C., CD46-induced human Treg enhance B-cell responses. European journal of immunology 2009. 39: 3097-3109.

30. Alford, S. K., Longmore, G. D., Stenson, W. F. и Kemper, C., CD46-induced immunomodulatory CD4+ T cells express the adhesion molecule and chemokine receptor pattern of intestinal T cells. Journal of immunology 2008. 181: 2544-2555.30. Alford, S. K., Longmore, G. D., Stenson, W. F. and Kemper, C., CD46-induced immunomodulatory CD4+ T cells express the adhesion molecule and chemokine receptor pattern of intestinal T cells. Journal of immunology 2008. 181: 2544-2555.

31. Barchet, W., Price, J. D., Celia, M., Colonna, M., MacMillan, S. K. , Cobb, J. P., Thompson, P. A., Murphy, К. M., Atkinson, J. P. и Kemper, C., Complement-induced regulatory T cells suppress T-cell responses but allow for dendritic-cell maturation. Blood 2006. 107: 1497-1504.31. Barchet, W., Price, J. D., Celia, M., Colonna, M., MacMillan, S. K. , Cobb, J. P., Thompson, P. A., Murphy, K. M., Atkinson, J. P. and Kemper, C., Complement -induced regulatory T cells suppress T-cell responses but allow for dendritic-cell maturation. Blood 2006. 107: 1497-1504.

32. Liszewski, Μ. K. , Kemper, C., Price, J. D. и Atkinson, J. P., Emerging roles and new functions of CD46. Springer seminars in immunopathology 2005. 27: 345-358.32. Liszewski, M. K. , Kemper, C., Price, J. D. and Atkinson, J. P., Emerging roles and new functions of CD46. Springer seminars in immunopathology 2005. 27: 345-358.

33. Kawai, T., Andrews, D., Colvin, R. B., Sachs, D. H. и Cosimi, A. B., Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand [In Process Citation]. Nat Med 2000 . 6: 114.33. Kawai, T., Andrews, D., Colvin, R. B., Sachs, D. H. and Cosimi, A. B., Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand [In Process Citation]. Nat Med 2000. 6:114.

34. Langer, F., Ingersoll, S. B., Amirkhosravi, A., Meyer, T., Siddiqui, F. A., Ahmad, S., Walker, J. M., Amaya, M., Desai, H. и Francis, J. L., The role of CD40 in CD40L- and antibodymediated platelet activation. Thrombosis and haemostasis 2005. 93: 1137-1146.34. Langer, F., Ingersoll, S. B., Amirkhosravi, A., Meyer, T., Siddiqui, F. A., Ahmad, S., Walker, J. M., Amaya, M., Desai, H. and Francis, J. L., The role of CD40 in CD40L- and antibodymediated platelet activation. Thrombosis and haemostasis 2005. 93: 1137-1146.

35. Robles-Carrillo, L., Meyer, T., Hatfield, M., Desai, H., Davila, M., Langer, F., Amaya, M., Garber, E., Francis, J. L., Hsu, Y. M. и Amirkhosravi, A., Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice. J Immunol 2010. 185: 1577-1583.35. Robles-Carrillo, L., Meyer, T., Hatfield, M., Desai, H., Davila, M., Langer, F., Amaya, M., Garber, E., Francis, J. L., Hsu, Y. M. and Amirkhosravi, A., Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice. J Immunol 2010. 185: 1577-1583.

36. Couzin, J., Drug discovery. Magnificent obsession. Science 2005. 307: 1712-1715.36. Couzin, J., Drug discovery. Magnificent obsession. Science 2005. 307: 1712-1715.

37. Hessell, A. J., Hangartner, L., Hunter, M., Havenith, С. E., Beurskens, F. J., Bakker, J. M., Lanigan, С. M., Landucci, G., Forthal, D. N., Parren, P. W., Marx, P. А. и37. Hessell, A. J., Hangartner, L., Hunter, M., Havenith, C. E., Beurskens, F. J., Bakker, J. M., Lanigan, C. M., Landucci, G., Forthal, D. N., Parren, P. W. , Marx, P. A. and

- 31 040553- 31 040553

Burton, D. R., Fc receptor but not complement binding is important in antibody protection against HIV. Nature 2007. 449: 101-104.Burton, D. R., Fc receptor but not complement binding is important in antibody protection against HIV. Nature 2007. 449: 101-104.

38. Armour, K. L., Clark, M. R., Hadley, A. G. и Williamson, L. M., Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol 1999. 29: 2613-2624.38. Armour, K. L., Clark, M. R., Hadley, A. G. and Williamson, L. M., Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol 1999. 29: 2613-2624.

39. Taylor, P. A., Lees, C. J., Wilson, J. M., Ehrhardt, M. J., Campbell, Μ. T., Noelle, R. J. и Blazar, B. R., Combined effects of calcineurin inhibitors or sirolimus with anti-CD40L mAb on alloengraftment under nonmyeloablative conditions. Blood 2002. 100: 3400-3407.39. Taylor, P. A., Lees, C. J., Wilson, J. M., Ehrhardt, M. J., Campbell, M. T., Noelle, R. J. and Blazar, B. R., Combined effects of calcineurin inhibitors or sirolimus with anti-CD40L mAb on alloengraftment under nonmyeloablative conditions. Blood 2002. 100: 3400-3407.

40. Noelle, R. J., Roy, M., Shepherd, D. M., Stamenkovic, I., Ledbetter, J. А. и Aruffo, A., A novel ligand on activated T helper cells binds CD40 and transduces the signal for the cognate activation of В cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. 89: 6550-6554.40. Noelle, R. J., Roy, M., Shepherd, D. M., Stamenkovic, I., Ledbetter, J. A. and Aruffo, A., A novel ligand on activated T helper cells binds CD40 and transduces the signal for the cognate activation of In cells. Proc. Natl. Acad. sci. USA 1992. 89: 6550-6554.

41. Quezada, S. A., Bennett, K. , Blazar, B. R., Rudensky, A. Y., Sakaguchi, S. и Noelle, R. J., Analysis of the underlying cellular mechanisms of anti-CD154-induced graft tolerance: the interplay of clonal anergy and immune regulation. J Immunol 2005. 175: 771-779.41. Quezada, S. A., Bennett, K. , Blazar, B. R., Rudensky, A. Y., Sakaguchi, S. and Noelle, R. J., Analysis of the underlying cellular mechanisms of anti-CD154-induced graft tolerance: the interplay of clonal anergy and immune regulation. J Immunol 2005. 175: 771-779.

42. Rossini, A. A., Parker, D. C., Phillips, N. E., Durie, F. H., Noelle, R. J., Mordes, J. P. и Greiner, D. L., Induction of immunological tolerance to islet allografts. Cell Transplant 1996. 5: 49-52.42. Rossini, A. A., Parker, D. C., Phillips, N. E., Durie, F. H., Noelle, R. J., Mordes, J. P. and Greiner, D. L., Induction of immunological tolerance to islet allografts. Cell Transplant 1996. 5: 49-52.

43. Markees, T., Phillips, N., Gordon, E., Noelle, R. J., Mordes, J. P., Greiner, D. L. и Rossini, A. A., Improved skin allograft tolerance induced by treatment with donor splenocytes and an extended course of anti-CD154 monoclonal antibody. Transplant Proc 1998. 30: 2444-2446.43. Markees, T., Phillips, N., Gordon, E., Noelle, R. J., Mordes, J. P., Greiner, D. L. and Rossini, A. A., Improved skin allograft tolerance induced by treatment with donor splenocytes and an extended course of anti- CD154 monoclonal antibody. Transplant Proc 1998. 30: 2444-2446.

44. Markees, T. G., Appel, M. C., Noelle, R. J., Mordes, J. P., Greiner, D. L. и Rossini, A. A., Tolerance to islet xenografts induced by dual manipulation of antigen presentation and co-stimulation. Transplantation Proceedings 1996. 28: 814815.44. Markees, T. G., Appel, M. C., Noelle, R. J., Mordes, J. P., Greiner, D. L. and Rossini, A. A., Tolerance to islet xenografts induced by dual manipulation of antigen presentation and co-stimulation. Transplantation Proceedings 1996. 28: 814815.

- 32 040553- 32 040553

45. van den Eertwegh, A. J., Van Meurs, M., Foy, T. M., Noelle, R. J., Boersma, W. J. и Claassen, E., In vivo gp39-CD40 interactions occur in the non-follicular compartments of the spleen and are essential for thymus dependent antibody responses and germinal center formation. Adv Exp Med Biol 1994. 355: 7580 .45. van den Eertwegh, A. J., Van Meurs, M., Foy, T. M., Noelle, R. J., Boersma, W. J. and Claassen, E., In vivo gp39-CD40 interactions occur in the non-follicular compartments of the spleen and are essential for thymus dependent antibody responses and germinal center formation. Adv Exp Med Biol 1994. 355:7580.

46. van, den, Eertwegh, Aj , Van, Μ. M., Foy, T. M., Noelle, R. J., Boersma, W. J. и Claassen, E., In vivo gp39-CD40 interactions occur in the non-follicular compartments of the spleen and are essential for thymus dependent antibody responses and germinal center formation. Advances in experimental medicine and biology 1994. 355: 75-80.46. van, den, Eertwegh, Aj, Van, M. M., Foy, T. M., Noelle, R. J., Boersma, W. J. and Claassen, E., In vivo gp39-CD40 interactions occur in the non-follicular compartments of the spleen and are essential for thymus dependent antibody responses and germinal center formation. Advances in experimental medicine and biology 1994. 355: 75-80.

47. Foy, T. M., Laman, J. D., Ledbetter, J. A., Aruffo, A., Claassen, E. и Noelle, R. J., gp39-CD40 interactions are essential for germinal center formation and the development of В cell memory. J. Exp. Med. 1994. 180: 157-164.47. Foy, T. M., Laman, J. D., Ledbetter, J. A., Aruffo, A., Claassen, E. and Noelle, R. J., gp39-CD40 interactions are essential for germinal center formation and the development of B cell memory. J. Exp. Med. 1994. 180: 157-164.

48. Gerritse, K. , Laman, J. D., Noelle, R. J., Aruffo, A., Ledbetter, J. A., Boersma, W. J. и Claassen, E., CD40-CD40 ligand interactions in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. National Academy of Sciences, Washington, D.c, Proceedings of the National Academy of Sciences 1996. 93: 2499-2504.48. Gerritse, K., Laman, J. D., Noelle, R. J., Aruffo, A., Ledbetter, J. A., Boersma, W. J. and Claassen, E., CD40-CD40 ligand interactions in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. National Academy of Sciences, Washington, D.c., Proceedings of the National Academy of Sciences 1996. 93: 2499-2504.

49. Nagelkerken, L., Haspels, I., van Rijs, W., Blauw, B., Ferrant, J. L., Hess, D. M., Garber, E. A., Taylor, F. R. и Burkly, L. C., FcR interactions do not play a major role in inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by antiCD154 monoclonal antibodies. J Immunol 2004. 173: 993-999.49. Nagelkerken, L., Haspels, I., van Rijs, W., Blauw, B., Ferrant, J. L., Hess, D. M., Garber, E. A., Taylor, F. R. and Burkly, L. C., FcR interactions do not play a major role in inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by antiCD154 monoclonal antibodies. J Immunol 2004. 173: 993-999.

50. Becher, B., Durell, B. G. и Noelle, R. J., Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin-12. J Clin Invest 2002. 110: 493-497.50. Becher, B., Durell, B. G. and Noelle, R. J., Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin-12. J Clin Invest 2002. 110: 493-497.

51. Becher, B., Durell, B. G., Miga, A. V., Hickey, W. F. и Noelle, R. J., The clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis and inflammation is controlled by the expression of CD40 within the central nervous system. J Exp Med 2001. 193: 967-974.51. Becher, B., Durell, B. G., Miga, A. V., Hickey, W. F., and Noelle, R. J., The clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis and inflammation is controlled by the expression of CD40 within the central nervous system. J Exp Med 2001. 193: 967-974.

52. Howard, L. M., Miga, A. J., Vanderlugt, C. L., Dal Canto, M. C., Laman, J. D., Noelle, R. J. и Miller, S. D., Mechanisms of immunotherapeutic intervention by anti-CD40L (CD154) antibody in an animal model of multiple sclerosis. J Clin Invest 1999. 103: 281-290.52. Howard, L. M., Miga, A. J., Vanderlugt, C. L., Dal Canto, M. C., Laman, J. D., Noelle, R. J. and Miller, S. D., Mechanisms of immunotherapeutic intervention by anti-CD40L (CD154) antibody in an animal model of multiple sclerosis . J Clin Invest 1999. 103: 281-290.

Полное раскрытие каждого цитируемого документа (в том числе патентов, заявок на патенты, статей из журналов, рефератов, руководств, книг или других раскрытий) в разделах Уровень техники изобретения, Подробное описание и Примеры включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.The entire disclosure of each document cited (including patents, patent applications, journal articles, abstracts, manuals, books, or other disclosures) in the Background, Detailed Description, and Examples sections is incorporated herein by reference in its entirety.

Эти и другие изменения можно осуществлять по отношению к настоящему изобретению в свете приведенного выше подробного описания. В целом, в следующей формуле изобретения используемые термины не должны ограничивать настоящее изобретение конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в описании и формуле изобретения. Следовательно, настоящее изобретение не ограничиваетсяThese and other changes can be made with respect to the present invention in light of the above detailed description. In general, in the following claims, the terms used should not limit the present invention to the specific embodiments disclosed in the specification and claims. Therefore, the present invention is not limited

--

Claims

disclosure, and instead the scope of the present invention is defined solely by the following claims.

The present invention may be practiced in other ways than those specifically described in the foregoing description and examples. Numerous modifications and variations of the present invention are permitted in light of the above teachings, and therefore are within the scope of the appended claims.

CLAIM

1. Humanized antibody to human CD154, which contains:

(i) a heavy chain variable region polypeptide comprising CDR1, CDR2, CDR3 of SEQ ID NOs: 5, 6 and 7, respectively, and (ii) a light chain variable region polypeptide comprising CDR1, CDR2, CDR3 of SEQ ID NOs: 8, 9 and 10, respectively.

2. An anti-human CD154 antibody according to claim 1, which contains:

(i) a heavy chain variable region polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and (ii) a light chain variable region polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

3. An anti-human CD154 antibody according to claim 1 or 2, which contains at least one of the following:

(i) IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant regions lacking C ₁ q binding and additionally lacking FcyR2 and/or FcyR3 binding;

(ii) human IgG1 constant regions lacking Ciq binding and additionally missing FcRy2 and/or FcRy3 binding;

(iii) human IgG1 constant regions that contain the E269R and K322A mutations (numbered according to Kabat);

(iv) IgG1 light and heavy chain constant region polypeptides comprising the sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 3, respectively;

(v) IgG1 constant regions that contain at least one further mutation that affects effector function, such as a mutation that impairs FcRn binding, a mutation that impairs or abolishes glycosylation, another mutation that impairs the ability of the antibody to bind to FcR , such as FcyR2, or FcyR3, or with another FcR, or another mutation that impairs binding to the complement system;

(vi) IgG1 constant regions that contain the E233P and/or D265A mutation, or that contain any of the Fc mutations identified in Table 1. 1, 2 or 3 (where the numbering is in accordance with Kabat);

(vii) IgG1 constant regions that contain the E233P mutation (numbered according to Kabat);

(viii) an Fc region that has been mutated to introduce one or more other mutations that improve in vivo half-life; or (ix) the anti-human CD154 antibody contains any combination of the sequences or mutations listed in (i)-(viii).

4. Antibody to human CD154 according to claim 1, which contains:

(i) a heavy chain polypeptide comprising a heavy chain variable region polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and an IgG1 heavy chain constant region polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (ii) a light chain polypeptide comprising the polypeptide a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and an IgG1 light chain constant region polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

5. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of at least one humanized anti-human CD154 antibody according to any one of claims 1 to 4 and a pharmaceutically acceptable carrier.

6. An immunosuppressive combination containing:

(i) a humanized anti-human CD154 antibody according to any one of claims 1 to 4, and (ii) an antigen or cell, tissue or organ expressing an antigen against which a prolonged antigen-specific immunosuppression or tolerogenic response is induced; or (iii) a self-antigen, an allergen, a drug that is selected from the group consisting of a therapeutic antibody, a receptor, a fusion protein, a hormone, a growth factor, and a cytokine, or an HLA-incompatible (allogeneic) or xenogeneic (non-human) donor cell, against which an antigen-specific immunosuppression or a tolerogenic response is induced;

wherein the immunosuppressive combination is administered to the patient to induce a prologated antigen specific immunosuppression or tolerogenic response against (ii) or (iii).

7. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for immunosuppression or immunotherapy in a patient.

8. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for the induction of tolerance or long-term antigen-specific immunosuppression in a recipient.

9. Use according to claim 8, wherein the recipient is a transplant recipient and the anti-CD154 antibody-containing drug is administered to the transplant recipient before, during, or after transplantation of the donor tissue, organ, or cells, wherein said donor tissue, organ, or cells may optionally be genetically engineered and also optionally contain CAR-T or NK cells, and thus each administration provides for the induction of tolerance and prolonged antigen-specific immunosuppression against the transplanted donor tissue, organ, or cell.

10. Use according to claim 9, wherein the recipient of the transplant to which the anti-CD154 antibody-containing drug is administered before, during, or after transplantation of the donor tissue, organ, or cells is a bone marrow, organ, or immune cell recipient, where the bone marrow, the tissue, organ, or immune cells optionally contains donor and/or recipient T cells, and also optionally incubated with an anti-CD154 antibody according to any one of claims 1-4 prior to transplantation.

11. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for the treatment of a patient with an allergic, inflammatory or autoimmune disorder selected from Sjögren's syndrome, psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, oophoritis, lupus, diabetes, Crohn's disease, thyroiditis , myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Graves' disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, drug-induced autoimmune disease, or drug-induced lupus.

12. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a drug for inducing tolerance without causing thrombotic complications in a patient.

13. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for inducing tolerance without causing thrombotic complications in a patient, wherein said use also involves the use of an antigen optionally selected from (1) a self antigen, (2) an allergen, (3) a drug, where the drug is optionally a biological drug, such as a therapeutic antibody, receptor, fusion protein, hormone, growth factor, or cytokine; or (4) an HLA incompatible (allogeneic) donor cell.

14. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a drug for the induction of tolerance without the occurrence of thrombotic complications in a patient in the case when transplantation of cells, organ or tissue to the patient is expected, or has already been carried out, and where this use is also optional includes the use of an antigen; where said antigen is optionally selected from (1) a self-antigen, (2) an allergen, (3) a drug, where the drug is optionally a biological agent, such as a therapeutic antibody, receptor, fusion protein, hormone, growth factor, or cytokine; or (4) an HLA incompatible (allogeneic) donor cell.

15. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for the treatment of a T-cell mediated autoimmune disorder, wherein said use optionally also includes the use of an antigen against which prolonged tolerance or immunosuppression is induced.

16. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for the treatment of a B-cell mediated autoimmune disorder, wherein said use optionally also includes the use of an antigen against which prolonged tolerance or immunosuppression is induced.

17. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for the treatment of a T-cell mediated autoimmune disorder selected from Sjögren's syndrome, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Graves' disease, Huntington's disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, diabetes mellitus, Parkinson's disease, psoriasis, Addison's disease, multiple sclerosis, lupus, and drug-induced autoimmune diseases such as drug-induced lupus, said use also optionally involving the use of an antigen against which prolonged tolerance or immunosuppression is induced.

18. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of GVHD, bone marrow transplant rejection (BMT), multiple sclerosis,

- 35 040553 lupus, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), rheumatoid arthritis, asthma, inflammatory bowel disease (IBD) or other inflammatory bowel disease in a patient.

19. The use of an antibody according to any one of claims 1 to 4 for the manufacture of a medicament for the treatment of a human condition, disorder or disease mediated in whole or in part by CD40 signaling in a patient.

20. Use according to claim 19, wherein the condition, disorder, or disease in a human is an inflammatory, allergic, or autoimmune response or fibrosis.

21. Use according to claim 19 or 20, wherein the condition, disorder, or disease in a human is selected from lupus nephritis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, spondyloarthritis, drug-induced lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, psoriasis, and multiple sclerosis.

22. Use according to claim 19, wherein the condition, disorder, or disease in a human is selected from allergic contact dermatitis, alopecia generalis, purpura hemorrhagica, asthma, severe asthma, metabolic asthma, allergic asthma, atopic dermatitis, dermatitis herpetiformis, persistent erythema elevation, annulare erythema, erythema multiforme; erythema nodosum, allergic granulomatosis, granuloma annulare, granulocytopenia, hypersensitivity pneumonitis, keratitis, nephrotic syndrome, cross syndrome, pigeon breeder's allergy, idiopathic polyneuritis, urticaria, uveitis, juvenile dermatomyositis and vitiligo.

23. Use according to claim 19, wherein the condition, disorder or disease in a human is selected from allergic bronchopulmonary aspergillosis, autoimmune hemolytic anemia, acanthosis keratoderma, allergic contact dermatitis, Addison's disease, atopic dermatitis, alopecia areata, alopecia generalis, amyloidosis, hemorrhagic purpura, anaphylactoid reactions, aplastic anemia, congenital angioedema, idiopathic angioedema, ankylosing spondylitis, temporal arteritis, giant cell arteritis, Takayasu's arteritis, temporal arteritis, asthma, telangiectatic ataxia, autoimmune oophoritis, autoimmune orchitis, autoimmune syndrome, disease of the Behler's syndrome, polyendocrine disease, polyendocrine disease Buerger's disease, bullous pemphigus, chronic candidiasis of the skin and mucous membranes, Kaplan's syndrome, postinfarction syndrome, postcardiotomy syndrome, carditis, celiac sprue, Chagash disease, Chediak-Higashi syndrome, C disease erg-Strauss syndrome, Cogan syndrome, cold agglutinin disease, CREST syndrome, Crohn's disease, cryoglobulinemia, cryptogenic fibrosing alveolitis, dermatitis herpetiformis, dermatomyositis, diabetes mellitus, Diamond Blackfen syndrome, DiGeorge syndrome, discoid lupus erythematosus, eosinophilic fasciitis, episcleritis, persistent elevated erythema, erythema annulare, erythema multiforme, erythema nodosum, familial Mediterranean fever, Felty's syndrome, pulmonary fibrosis, hemorrhagic glomerulonephritis, autoimmune glomerulonephritis, post-streptococcal glomerulonephritis, transplantation-mediated glomerulonephritis, membranous glomerulonephritis, granuloma host reaction, host immune reaction granuloma annulare, allergic granulomatosis, granulomatous myositis, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hemolytic disease of the newborn, idiopathic hemochromatosis, Henoch-Schönlein purpura, chronic active hepatitis, chronic progressive hepatitis, histiocytosis x, hypereosinophilic syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura, Job's syndrome, juvenile dermatomyositis, juvenile rheumatoid arthritis (juvenile chronic arthritis), Kawasaki disease, keratitis, keratoconjunctivitis sicca, Landry-Guillain-Barrestroll syndrome, leprosy , Loeffler's syndrome, Lyell's syndrome, Lyme disease, lymphomatoid granulomatosis, systemic mastocytosis, mixed connective tissue disease, multiple mononeuritis, Mackle-Wales syndrome, mucocutaneous lymphonodular syndrome, mucocutaneous lymphonodular syndrome, multifocal reticulohistiocytosis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, mycosis fungoides, systemic necrotizing vasculitis, nephrotic syndrome, overlapping syndrome, panniculitis, paroxysmal cold hemoglobinuria, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, pemphigoid, pemphigus, erythematous Pemphigus, Pemphigus foliaceus, Pemphigus vulgaris, Pigeon allergy, Hypersensitivity pneumonitis, Polyarteritis nodosa, Polymyalgia rheumatica, Polymyositis, Idiopathic polyneuritis, Portuguese-type familial polyneuropathy, Pre-eclampsia/eclampsia, Primary biliary cirrhosis, Progressive systemic sclerosis (psoriasis arthritis), Psoriasis arthritis, Psoriatic arthritis pulmonary alveolar proteinosis, pulmonary fibrosis, Raynaud's phenomenon/syndrome, Riedel's thyroiditis, Reiter's syndrome, relapsing polychondritis, acute rheumatic fever, rheumatoid arthritis, sarcoidosis, scleritis, sclerosing cholangitis, serum sickness, Cesari's syndrome, Sjögren's syndrome, Stevens-Johnson syndrome, Still's disease, subacute sclerosing panencephalitis, sympathetic ophthalmia, systemic lupus erythematosus, transplant rejection, ulcerative colitis, undifferentiated connective tissue disease, chronic urticaria, cold urticaria, uveitis, vitiligo, Weber-Christian disease, Wegener's granulomatosis and

-