EA040320B1

EA040320B1 - Способы прогнозирования у пациентов терапевтического эффекта терапии с использованием антител к cd19

Info

Publication number: EA040320B1
Application number: EA201892542
Authority: EA
Inventors: Ян ЭНДЕЛЛЬ; Марк ВИНДЕРЛИХ; Райнер БОКСХАММЕР
Original assignee: МорфоСис АГ
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2017-05-30
Publication date: 2022-05-19

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение направлено на идентификацию у пациентов, которые получают пользу от лечения антителами к CD19, характеристик и биомаркеров.

Предпосылки создания изобретения

CD19 представляет собой трансмембранный гликопротеин размером 95 кДа надсемейства иммуноглобулинов, содержащий два внеклеточных иммуноглобулиноподобных домена и крупный цитоплазматический хвост. Белок является поверхностным рецептором для всех типов В-лимфоцитов и повсеместно экспрессируется с самых ранних стадий развития пре-В-клеток вплоть до тех пор, пока он не будет подавлен во время терминальной дифференцировки в плазматические клетки. Он является специфичным для линии В-лимфоцитов и не экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках и других иммунных клетках, за исключением некоторых фолликулярных дендритных клеток. CD19 функционирует как положительный регулятор передачи сигналов В-клеточного рецептора (BCR) и имеет большое значение для активации и пролиферации В-клеток и при развитии типов гуморального иммунного ответа. Он действует как ко-стимулирующая молекула в сочетании с CD21 и CD81 и имеет решающее значение для ответов с участием В-клеток на зависимые от Т-клеток антигены. Цитоплазматический хвост CD19 физически связан с семейством тирозинкиназ, которые запускают нижерасположенные сигнальные пути посредством src-семейства протеинтирозинкиназ. CD19 является привлекательной мишенью при типах рака лимфоидного происхождения, поскольку он экспрессируется на высоком уровне почти при всех хронических лимфоцитарных лейкозах (CLL) и неходжкинских лимфомах (NHL), а также при многих других различных типах лейкозов, в том числе остром лимфоцитарном лейкозе (ALL) и лейкозе ворсистых клеток (HCL).

Клиническая разработка направленных на CD19 антител ранее была ограничена интернализацией антигена CD19, однако улучшенная технология модификации антител позволила вернуть эту потенциальную терапевтическую мишень. MOR00208 (ранее называемое XmAb5574) представляет собой полученное с помощью генной инженерии гуманизированное моноклональное Fc-антитело, которое связывает CD19. Повышение степени связывания Fc MOR00208 с FcyR, вследствие полученных с помощью генной инженерии мутаций XmAb, значительно усиливает in vitro антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP) и прямые цитотоксические эффекты (апоптоз) в отношении опухоли по сравнению с немодифицированным антителом. Не было показано, что MOR00208 опосредует комплементзависимую питотоксичность.

MOR00208 проходило и в настоящее время проходит клинические испытания в отношении CLL, ALL и NHL. В частности, завершены фаза I испытания под названием Безопасность и переносимость XmAb®5574 при хроническом лимфоцитарном лейкозе и фаза IIa испытания под названием Исследование Fc-оптимизированного антитела к CD19 (MOR00208) для лечения В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL). Завершен набор на фазу IIa испытания под названием Исследование Fcоптимизированного антитела к CD19 (MOR00208) для лечения неходжкинской лимфомы (NHL). Также запланированы/продолжаются следующие испытания: фаза II/III испытания под названием Испытание для оценки эффективности и безопасности MOR00208 с бендамустином (BEN) в сравнении с ритуксимабом (RTX), с BEN у взрослых пациентов с рецидивирующей или рефрактерной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой (DLBCL) (B-MIND), фаза II испытания под названием Исследование для оценки эффективности и безопасности MOR00208 с иделалисибом у пациентов с R/R CLL/SLL, предварительно получавших BTKi, фаза II испытания под названием Исследование для оценки безопасности и эффективности леналидомида с MOR00208 у пациентов с R-R DLBCL и фаза II испытания под названием Фаза II, MOR00208 в комбинации с леналидомидом для пациентов с рецидивирующим или рефрактерным CLL, SLL или PLL или пожилых пациентов с CLL, SLL или PLL без лечения. В ходе еще одной проходящей в настоящее время фазы II испытания (COSMOS) изучают эффективность и безопасность MOR00208 в комбинации с иделалисибом или венетоклаксом у пациентов с рецидивирующим или рефрактерным CLL, SLL.

Сообщалось об эффективности монотерапии с использованием MOR00208 при CLL и NHL. Однако общие вариабельные значения частоты ответа у пациентов на различные виды терапии моноклональными антителами указывают на то, что необходимы способы для точного прогнозирования того, какие пациенты могут отвечать на такие виды терапии антителами, чтобы это лечение можно было назначать тем пациентам, которые, скорее всего, получат положительные результаты. Можно найти специфические биомаркеры или характеристики пациентов, для которых определенная концентрация или диапазон каждого биомаркера коррелирует с восприимчивостью такой терапии.

Оценивали влияние количества клеток натуральных киллеров (NK) на выживаемость пациентов с DLBCL, получающих лечение ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицина гидрохлоридом (гидроксидауномицином), винкристина сульфатом (онковином) и преднизоном (R-CHOP). Kim et al., Blood Research, 49:3, 162-169 (сентябрь 2014 г.). Ранее сообщалось, что количество периферических NK-клеток связано с клиническим исходом у пациентов с DLBCL с aaIPI 2-3. Plonquet et al., Ann Oncol 2007; 18:1209-15.

- 1 040320

Понятно, что необходимы значительные усилия и инвестиции для выявления и идентификации таких характеристик и биомаркеров пациентов, с помощью которых прогнозируют эффективность.

Краткое описание изобретения

MOR00208 изучали с участием пациентов с CLL, ALL, NHL и SLL. Соответственно к настоящему времени был проведен тщательный анализ клинических данных с целью идентификации характеристик или биомаркеров пациентов, которые с большей вероятностью получат пользу от лечения с помощью MOR00208.

MOR00208 специфически нацелено на поверхностный антиген CD19 и опосредует прямой цитолиз опухолевых клеток посредством своей усиленной эффекторной функции ADCC. Было показано, что в доклинических исследованиях MOR00208 значительно усиливает ADCC, ADCP и прямые цитотоксические эффекты (апоптоз) in vitro в отношении линий опухолевых клеток CD19+, охватывающих широкий диапазон лимфом и лейкозов человека (лимфому Беркитта, CLL, лейкоз ворсистых клеток (HCL), CD19+ хронический миелоидный лейкоз (CML), диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL) и острый лимфобластный лейкоз (ALL)), экспрессирующих уровни антигена CD19 в диапазоне от 15000 до 105000 молекул/клетка. Аналогичные эффекты наблюдали и в отношении свежевыделенных клеток пациентов с CLL или ALL, а также ожидается, что их можно транслировать на клетки первичной неходжкинской лимфомы (NHL), так как диапазон экспрессии, зарегистрированный для В-клеток при ALL и CLL, охватывает диапазон, наблюдаемый для В-клеток при NHL (Ginaldi et al., 1998; Olejniczak et al., 2006). Основываясь на широкой и однородной поверхностной экспрессии CD19 среди различных типах В-клеточных новообразований, эффект MOR00208 в настоящем исследовании можно перенести на широкий диапазон лимфом и лейкозов человека, таких как CLL, ALL, NHL и SLL и их подтипы.

Подробно проанализированы данные фазы IIa испытания под названием Исследование Fcоптимизированного антитела к CD19 (MOR00208) для лечения неходжкинской лимфомы (NHL). В результате этих усилий описанное ниже изобретение предусматривает характеристики и биомаркеры пациентов, для которых антитела к CD19 являются эффективными.

В частности, оценивали, по меньшей мере, следующие характеристики пациентов: а) возраст, b) пол, с) получали ли пациенты дозу ритуксимаба в течение последних 6 месяцев, d) были ли пациенты резистентными к ритуксимабу, е) имеют ли пациенты аллель FCgammaRIIIa высокой или низкой аффинности, f) имеют ли пациенты аллель FCgammaRIIa высокой или низкой аффинности, g) была ли у пациентов длительность ответа на предыдущее лечение большей, чем 12 месяцев, h) исходное количество периферических Т-клеток (клетки/мкл), i) исходное количество периферических NK-клеток (клетки/мкл) и j) исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках (количество связанных антител на клетку - ABC).

Как 1) исходные количества периферических NK-клеток, так и 2) исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках показали явные корреляции с ответами пациентов на терапию с использованием MOR00208. В частности, у пациентов с более высоким исходным количеством периферических NK-клеток на мкл наблюдали корреляцию с более высокой частотой контроля заболевания (DCR). DCR включает пациентов, характеризующихся полным ответом (CR) + частичным ответом (PR) + стабильным заболеванием (SD). Кроме того, у таких пациентов наблюдали значительно лучшую выживаемость без прогрессирования (PFS) по сравнению с пациентами с более низкими количествами NKклеток. В дополнение, у пациентов с исходным уровнем экспрессии CD16 на NK-клетках, составляющим по меньшей мере 60000 (ABC), наблюдали корреляцию с более высокой частотой контроля заболевания (DCR).

Таким образом, пациенты с диагнозом CLL, ALL, NHL и SLL и наличием либо а) высокого количества периферических NK-клеток, либо 2) исходным уровнем экспрессии CD16 на периферических NKклетках, составляющим по меньшей мере 60000 ABC, более вероятно получат пользу от лечения с использованием MOR00208.

Как 1) исходные количества периферических NK-клеток, так и 2) исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках показали явные корреляции с ответами пациентов на терапию с использованием MOR00208. В частности, у пациентов с исходным количеством периферических NKклеток, составляющим по меньшей мере 50 клеток/мкл, наблюдали корреляцию с более высокой частотой контроля заболевания (DCR). DCR включает пациентов, характеризующихся полным ответом (CR) + частичным ответом (PR) + стабильным заболеванием (SD). Кроме того, у пациентов с исходным количеством NK-клеток, составляющим по меньшей мере 50 клеток/мкл, наблюдали значительно лучшую выживаемость без прогрессирования (PFS) по сравнению с пациентами с более низкими количествами NKклеток. В дополнение, у пациентов с исходным уровнем экспрессии CD16 на NK-клетках, составляющим по меньшей мере 60000 (ABC), наблюдали корреляцию с более высокой частотой контроля заболевания (DCR).

Таким образом, пациенты с диагнозом CLL, ALL, NHL и SLL и наличием либо а) исходного количества периферических NK-клеток, составляющего по меньшей мере 50 клеток/мкл, либо 2) исходного уровня экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющего по меньшей мере 60000 ABC, более вероятно получат пользу от лечения с использованием MOR00208.

- 2 040320

Как 1) исходные количества периферических NK-клеток, так и 2) исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках показали явные корреляции с ответами пациентов на терапию с использованием MOR00208. В частности, у пациентов с исходным количеством периферических NKклеток, составляющим по меньшей мере 100 клеток/мкл, наблюдали корреляцию с более высокой частотой контроля заболевания (DCR). DCR включает пациентов, характеризующихся полным ответом (CR) + частичным ответом (PR) + стабильным заболеванием (SD). Кроме того, у пациентов с исходным количеством NK-клеток, составляющим по меньшей мере 100 клеток/мкл, наблюдали значительно лучшую выживаемость без прогрессирования (PFS) по сравнению с пациентами с более низкими количествами NKклеток. В дополнение, у пациентов с исходным уровнем экспрессии CD16 на NK-клетках, составляющим по меньшей мере 60000 (ABC), наблюдали корреляцию с более высокой частотой контроля заболевания (DCR).

Таким образом, пациенты с диагнозом CLL, ALL, NHL и SLL и наличием либо а) исходного количества периферических NK-клеток, составляющего по меньшей мере 100 клеток/мкл, либо 2) исходного уровня экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющего по меньшей мере 60000 ABC, более вероятно получат пользу от лечения с использованием MOR00208.

Описание графических материалов

На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности вариабельных доменов и CDR MOR00208.

На фиг. 2 показаны аминокислотные последовательности полных тяжелой и легкой цепей MOR00208.

На фиг. 3 показан анализ рабочей характеристики приемника (ROC) количеств периферических NK-клеток в качестве прогностического параметра для DCR.

На фиг. 4 показан ROC-анализ уровней экспрессии CD16 на периферических NK-клетках (ABC) в качестве прогностического параметра для DCR.

На фиг. 5 показан ROC-анализ количества периферических Т-клеток в качестве прогностического параметра для DCR.

На фиг. 6 показано, что количества периферических NK-клеток и уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках являются независимыми переменными и не коррелируют.

На фиг. 7 показана диаграмма Фореста в отношении DCR в подгруппах пациентов с конкретными исходными характеристиками и биомаркерами.

На фиг. 8 показана разница в выживаемости без прогрессирования между пациентами с количествами, составляющими по меньшей мере 100 клеток/мкл периферических NK-клеток, по сравнению с пациентами с более низкими количествами NK-клеток.

На фиг. 9 показана разница в выживаемости без прогрессирования между пациентами, характеризующимися по меньшей мере 60000 ABC при экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, по сравнению с пациентами с более низким уровнем экспрессии CD16 на NK-клетках.

На фиг. 10 показана разница в выживаемости без прогрессирования между пациентами с количествами, составляющими по меньшей мере 500 клеток/мкл периферических Т-клеток, по сравнению с пациентами с более низкими количествами Т-клеток.

Подробное описание изобретения

Термин антитело означает моноклональные антитела, в том числе любой изотип, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Антитело IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединены дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область. Каждая вариабельная область содержит три сегмента, называемых определяющими комплементарность областями (CDR) или гипервариабельными областями, которые в первую очередь отвечают за связывание эпитопа антигена. Они обозначены как CDR1, CDR2 и CDR3, пронумерованные последовательно от N-конца. Более высоко консервативные части вариабельных областей вне CDR называются каркасными областями. Термин фрагмент антитела означает фрагмент Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другой фрагмент, который содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, при этом каждая содержит CDR и каркасные области.

VH относится к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина антитела или фрагмента антитела. VL относится к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина антитела или фрагмента антитела.

Fc-область означает константную область антитела, которая у людей может быть из подкласса IgG1, 2, 3, 4 или других подклассов. Последовательности Fc-областей человека доступны на IMGT, Human IGH C-REGIONs, www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/HuIGHCallgenes.html (взяты 16 мая 2011 г.).

Термин пациент включает в себя человека.

NHL представляет собой неоднородное злокачественное новообразование, происходящее из лимфоцитов. В США частота возникновения заболевания оценивается на уровне 65000/год, при этом смертность составляет примерно 20000 (Американское онкологическое общество, 2006 г.; и обзор SEER статистических данных по раку). Заболевание может возникать во всех возрастных группах, обычно начало

- 3 040320 наблюдается у взрослых старше 40 лет с увеличением частоты возникновения заболевания с возрастом. NHL характеризуется клональной пролиферацией лимфоцитов, которые накапливаются в лимфатических узлах, крови, костном мозге и селезенке, хотя может быть вовлечен любой крупный орган. Существующая система классификации, используемая патоморфологами и клиницистами, представляет собой классификацию опухолей согласно Всемирной организации здравоохранения (WHO), которая группирует NHL по новообразованиям из предшественников и зрелых В-клеток и Т-клеток. PDQ в настоящее время отделяет NHL как индолентную или агрессивную для включения в клинические испытания. Группа индолентной NHL состоит в основном из фолликулярных подтипов, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, MALT (лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек) и лимфомы маргинальной зоны; индолентная включает примерно 50% пациентов с вновь диагностированной В-клеточной NHL. Агрессивная NHL включает пациентов с диагностированиями на гистологическом уровне преимущественно диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBL, DLBCL или DLCL) (40% всех вновь диагностированных пациентов характеризуются диффузными крупными клетками), лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной ткани. Клиническое течение NHL чрезвычайно изменчиво. Основной детерминантой клинического течения является гистологический подтип. Наиболее индолентные типы NHL рассматриваются как неизличимое заболевание. Пациенты первоначально отвечают либо на химиотерапию, либо на терапию антителами, и у большинства из них будет рецидив. Исследования, проведенные до настоящего времени, не продемонстрировали улучшения выживаемости при раннем вмешательстве. У бессимптомных пациентов приемлемо наблюдать и ждать до тех пор, пока у пациента не проявятся симптомы или темп заболевания не окажется ускоряющимся. Со временем заболевание может трансформироваться в более агрессивную гистологическую форму. Медиана выживаемости составляет от 8 до 10 лет, и пациенты с индолентной формой часто получают 3 или более вида лечения во время фазы лечения их заболевания. Первоначальное лечение пациента с симптомами индолентной NHL исторически представляло собой комбинированную химиотерапию. Наиболее часто используемые средства включают циклофосфамид, винкристин и преднизон (CVP); или циклофосфамид, адриамицин, винкристин, преднизон (CHOP). Примерно от 70 до 80% пациентов будут отвечать на начальную химиотерапию, продолжительность ремиссий длится порядка 2-3 лет. В конечном итоге у большинства пациентов развивается рецидив. Открытие и клиническое применение антитела к CD20, ритуксимаба, обеспечило значительное улучшение значения частоты ответа и выживаемости. Современным стандартом лечения большинства пациентов является ритуксимаб + CHOP (R-СНОР) или ритуксимаб + CVP (R-CVP). Интерферон одобрен для первоначального лечения NHL в комбинации с алкилирующими средствами, но имеет ограниченное применение в США. Терапия ритуксимабом оказалась эффективной при нескольких типах NHL и в настоящее время одобрена в качестве лечения первой линии как для индолентной (фолликулярной лимфомы), так и для агрессивной NHL (диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы). Тем не менее, существуют значительные ограничения моноклонального антитела (mAb) к CD20, включая первичную резистентность (50% ответ у рецидивирующих пациентов с индолентной формой), приобретенную резистентность (50% частота ответа при повторном лечении), редкий полный ответ (2% частота полного ответа рецидивирующей популяции), а также длительный характер рецидива. Наконец, многие В-клетки не экспрессируют CD20, и поэтому многие нарушения с участием В-клеток не поддаются лечению с применением терапии антителами к CD20.

В дополнение к NHL существует несколько типов лейкозов, которые являются результатом дисрегуляции функции В-клеток. Хронический лимфоцитарный лейкоз (также известный как хронический лимфоидный лейкоз или CLL) представляет собой тип лейкоза взрослых, вызванный аномальным накоплением В-лимфоцитов. При CLL злокачественные лимфоциты могут выглядеть нормальными и зрелыми, но они не способны эффективно справляться с инфекцией. CLL является наиболее распространенной формой лейкоза у взрослых. У мужчин вероятность развития CLL в два раза выше, чем у женщин. Однако ключевым фактором риска является возраст. Свыше 75% новых случаев диагностируется у пациентов старше 50 лет. Ежегодно диагностируют более 10000 случаев, а смертность составляет почти 5000 в год (Американское онкологическое общество, 2006 г., и обзор SEER статистических данных по раку). CLL является неизлечимым заболеванием, но в большинстве случаев прогрессирует медленно.

Многие люди с CLL ведут нормальную и активную жизнь в течение многих лет. Из-за медленного начала CLL на ранней стадии, как правило, не лечится, поскольку считается, что раннее вмешательство при CLL не улучшает время выживания или качество жизни. Вместо этого состояние контролируют с течением времени. Первоначальные виды лечения CLL варьируют в зависимости от точного диагноза и прогрессировать заболевания. Существуют десятки средств, используемых для терапии CLL. Комбинированные схемы химиотерапии, такие как FCR (флударабин, циклофосфамид и ритуксимаб) и BR (ибрутиниб и ритуксимаб), эффективны как при недавно диагностированном CLL, так и при его рецидиве. Аллогенную трансплантацию костного мозга (стволовых клеток) редко используют в качестве лечения первой линии для CLL из-за ее риска.

Другим типом лейкоза является мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL), которая рассматривается как вариант CLL без клонального лимфоцитоза, необходимого для диагностики CLL, но в остальном имеющий общие патологические и иммунофенотипические признаки (Campo et al., 2011). Опре- 4 040320 деление SLL требует наличия лимфаденопатии и/или спленомегалии. Более того, количество Влимфоцитов в периферической крови не должно превышать 5х10⁹/л. При SLL диагноз должен подтверждаться гистопатологической оценкой биопсии лимфатических узлов, когда это возможно (Hallek et al.,

2008). Коэффициент заболеваемости SLL составляет примерно 25% от CLL в США (Dores et al., 2007).

Другим типом лейкоза является острый лимфобластный лейкоз (ALL), также известный как острый лимфоцитарный лейкоз. ALL характеризуется избыточной продукцией и непрерывным размножением злокачественных и незрелых белых клеток крови (также известных как лимфобласты) в костном мозге. Острый обозначает недифференцированное, незрелое состояние циркулирующих лимфоцитов (бластов) и то, что болезнь прогрессирует быстро с ожидаемой продолжительностью жизни от нескольких недель до нескольких месяцев при отсутствии лечения. ALL наиболее часто встречается в детском возрасте с пиком заболеваемости в 4-5 лет. Дети в возрасте от 12 до 16 лет легче погибают от него, чем другие. В настоящее время по меньшей мере 80% случаев ALL в детском возрасте считают излечимыми. Ежегодно диагностируется около 4000 случаев, а смертность составляет почти 1500 в год (Американское онкологическое общество, 2006 г., и обзор SEER статистических данных по раку).

Применение антитела к CD19 при неспепифических В-клеточных лимфомах обсуждается в WO 2007076950 (US 2007154473), оба из которых включены посредством ссылки. Применение антитела к CD19 при CLL, NHL и ALL описано в Scheuermann et al., CD19 Antigen in Leukemia and Lymphoma Diagnosis and Immunotherapy, Leukemia and Lymphoma, Vol. 18, 385-397 (1995), которая включена посредством ссылки в полном объеме.

Дополнительные антитела, специфичные в отношении CD19, описаны в

WO2005012493 (US7109304), WO2010053716 (US12/266999) (Immunomedics);

WO2007002223 (US8097703) (Medarex); WO2008022152 (12/377251) и

WO2008150494 (Xencor), WO2008031056 (US11/852106) (Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648505) (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US12/253895) (Seattle Genetics) и WO2010095031 (12/710442) (Glenmark Pharmaceuticals), WO2012010562 и WO2012010561 (International Drug Development), WO2011147834 (Roche Glycart) и WO2012/156455 (Sanofi), все из которых включены посредством ссылки в полном объеме.

Термин CD19 относится к белку, известному как CD19, имеющему следующие синонимы: В4, антиген CD19 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В4 В-лимфоцитов, CVID3, антиген CD19 дифференцировки, MGC12802 и поверхностный антиген Leu-12 Т-клеток.

CD19 человека имеет аминокислотную последовательность

MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLT WSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKA WQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVW AKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSW THVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNL TMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLR RKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGT APSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQ DQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGS AWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPD GPDPAWGGGGRMGTWSTR (SEQ ID NO: 7).

MOR00208 представляет собой антитело к CD19. Аминокислотная последовательность вариабельных доменов представлена на фиг. 1. Аминокислотная последовательность Fc-областей тяжелой и легкой цепей MOR00208 представлена на фиг. 2. MOR00208 и XmAb 5574 используются как синонимы для описания антитела, показанного на фиг. 1 и 2. Антитело MOR00208 описано в заявке на выдачу патента США с серийным номером 12/377251, которая включена посредством ссылки в полном объеме.

В заявке на выдачу патент США с серийным номером 12/377251 описано антитело под названием 4G7 H1.52 гибрид S239D/I332E/4G7 L1.155 (позднее названное MOR00208) следующим образом:

- 5 040320 >4G7 H1.52 гибрид S239D/I332E

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIG YINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYY GTRVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 8) >4G7L1.155

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQ LLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSK

ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9)

Фармацевтическая композиция включает активное средство, например антитело для терапевтического применения у людей. Фармацевтическая композиция дополнительно может включать фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.

Введенный или введение относится к доставке фармацевтической композиции с помощью инъецируемой формы, при помощи такого как, например, внутривенный, внутримышечный, внутрикожный или подкожный путь доставки или путь доставки через слизистые, например в виде назального спрея или аэрозоля для ингаляции или в виде проглатываемых раствора, капсулы или таблетки.

Антитело, вводимое согласно настоящему изобретению, вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, достаточному для обеспечения некоторого улучшения клинических проявлений данного заболевания или расстройства. Например, пациенты в приведенном в качестве примера исследовании получали дозу MOR00208 в количестве 12 мг/кг один раз в неделю, а для поддержания - раз в две недели или ежемесячно.

Количество, которое эффективно для конкретной терапевтической цели, будет зависеть от тяжести заболевания или поражения, а также от веса и общего состояния субъекта. Будет понятно, что определение подходящей дозы может быть выполнено путем проведения общепринятых экспериментов, путем построения матрицы значений и проверки разных точек в матрице, причем все это находится в пределах обычных навыков подготовленного терапевта или исследователя в области клинической медицины.

Исходный уровень означает уровень до введения необходимой терапии. Например, до введения необходимого антитела к CD19.

Анализ рабочей характеристики приемника (ROC) использовали для анализа прогнозируемости, чувствительности, специфичности и для определения пределов отсечения для потенциальных биомаркеров, таких как количества NK-клеток, уровни экспрессии CD16 на NK-клетках и количества Т-клеток. Существуют следующие дополнительные способы оценки оптимального предела отсечения: Max.Accuracy - предел отсечения, который максимально увеличивает точность; b) Max.DOR - предел отсечения, который максимально увеличивает диагностическое отношение шансов; с) Error.rate - предел отсечения, который сводит к минимуму частоту ошибок; d) Max.Accuracy.area - предел отсечения, который максимально увеличивает площадь точности; е) Max.Sens+Spec - предел отсечения, который максимально увеличивает сумму чувствительности и специфичности; f) Max.Youden - предел отсечения, который максимально увеличивает индекс Юдена; g) Se=Sp - предел отсечения, при котором чувствительность равна специфичности; h) Min.ROC.Dist - предел отсечения, который сводит к минимуму расстояние между кривой и верхним левым углом графика; i) Max.Efficiency - предел отсечения, который максимально увеличивает эффективность; и j) Min.MCT - предел отсечения, который сводит к минимуму значение стоимости ошибочной классификации. См. Lopez-Raton, M., Rodriguez-Alvarez, М.Х, Cadarso-Suarez, С. and Gude-Sampedro, F. (2014). Optimal Outpoints: An R Package for Selecting Optimal Outpoints in Diagnostic Tests. Journal of Statistical Software 61 (8), 1-36.

Антитела, специфичные к CD19, также протестировали доклинически в комбинации с другими лекарственными средствами. Например, MOR00208 тестировали в комбинации с хлорметинами, аналогами пурина, аналогами талидомида, ингибитором фосфоинозитид-3-киназы, ингибиторами BCL-2 и ингибиторами тирозинкиназы Брутона (ВТК).

Хлорметин представляет собой неспецифическое средство для алкилирования ДНК, используемое

- 6 040320 в качестве химиотерапии. Алкилирующие средства добавляют алкильную группу (СпН2п+1) к основаниям нуклеиновой кислоты, например добавляют алкильную группу к гуаниновому основанию ДНК у 7го атома азота имидазольного кольца. Стадии алкилирования приводят к образованию межцепочечных поперечных сшивок (ICL). Эти ICL чрезвычайно цитотоксичны, поскольку блокируют основные метаболические процессы, такие как репликация и транскрипция. К хлорметинам относятся циклофосфамид, хлорамбуцил, урамустин, ифосфамид, мелфалан и бендамустин.

Бендамустин продается под названиями Ribomustin® и Treanda®, а также известен как SDX-105 от Mundipharma International Corporation Limited (лицензиат Astellas Pharma GmbH) и Cephalon, для лечения хронических лимфоцитарных лейкозов (CLL), индолентной В-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL) и других лимфом. Бендамустин имеет следующую структуру:

Аналог пурина представляет собой антиметаболит, который имитирует структуру метаболических пуринов, тем самым препятствуя синтезу нуклеиновых кислот. Флударабин, например, можно включить в РНК и ДНК путем замены пуриновых нуклеотидов аденина и гуанина. Аналоги пурина ингибируют рост быстро пролиферирующих клеток индивидуума, например раковых клеток, клеток костного мозга или клеток, присутствующих в желудочно-кишечном тракте. К аналогам пурина относятся меркаптопурин, азатиоприн, тиогуанин и флударабин. Флударабин или флударабина фосфат (Fludara®) представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, используемое для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза и индолентных неходжкинских лимфом. Флударабин представляет собой аналог пурина. Флударабин ингибирует синтез ДНК, препятствуя рибонуклеотидредуктазе и ДНК-полимеразе, и является специфичным для S-фазы (поскольку эти ферменты высокоактивны во время репликации ДНК). Флударабин имеет следующую структуру:

Аналог талидомида включает без ограничения сам талидомид, леналидомид (СС-5013, Ftevlimid™), помалидомид (СС4047, Actimid™) и соединения, раскрытые в WO 2002068414 и WO 2005016326, которые включены посредством ссылки в полном объеме. Термин относится к синтетическому химическому соединению с использованием структуры талидомида в качестве остова (например, добавлены боковые группы или такие группы удалены из исходной структуры). Аналог отличается по структуре от талидомида и его соединений-метаболитов, например разницей в длине алкильной цепи, молекулярным фрагментом, одной или несколькими функциональными группами или изменением ионизации. Термин аналог талидомида также включает метаболиты талидомида. К аналогам талидомида относится рацемическая смесь S-и R-энантиомера соответствующего соединения и S-энантиомер или Rэнантиомер в отдельности. Рацемическая смесь является предпочтительной.

К аналогам талидомида относятся соединения следующих структур.

- 7 040320 (А) Леналидомид.

Ингибитор фосфоинозитид-3-киназы представляет собой класс медицинских лекарственных средств, функционирующих путем ингибирования одного или нескольких ферментов фосфоинозитид-3киназ, которые являются частью пути PI3K/AKT/mTOR, важного сигнального пути для многих клеточных функций, таких как контроль роста, метаболизм и инициация трансляции.

Существует несколько различных классов и изоформ PI3K. PI3K класса 1 имеют каталитическую субъединицу, известную как p110, четырех типов (изоформ) - p110 альфа, p110 бета, p110 гамма и p110 дельта. Изучаемые в настоящее время ингибиторы ингибируют одну или несколько изоформ PI3K класса I.

К ингибиторам фосфоинозитид-3-киназы относятся, по меньшей мере, иделалисиб, дувелисиб и копанлисиб. Иделалисиб продается компанией Gilead Sciences, Inc. (торговое название Зиделиг, также называемый GS-1101 или CAL-101). Иделалисиб в настоящее время отмечен для лечения рецидивирующего хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) в комбинации с ритуксимабом у пациентов, для которых только один ритуксимаб будет считаться подходящей терапией из-за других сопутствующих осложнений; рецидивирующей фолликулярной В-клеточной неходжкинской лимфомы (FL) у пациентов, получивших по меньшей мере две предшествующие системные терапии; рецидивирующей мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (SLL) у пациентов, получивших по меньшей мере две предшествующие системные терапии. Данное вещество действует как ингибитор фосфоинозитид-3-киназы; более конкретно, оно блокирует Р110δ, дельта-изоформу фермента фосфоинозитид-3-киназы.

Формула иделалисиба представляет собой:

Ингибитор тирозинкиназы Брутона (ВТК) представляет собой класс лекарственных средств, которые функционируют путем ингибирования фермента тирозин-протеинкиназы ВТК, который играет важную роль в развитии В-клеток. В частности, ВТК содержит домен РН, который связывает фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфат (PIP3). Связывание PIP3 индуцирует Btk к фосфорилированию фосфолипазы С, которая, в свою очередь, гидролизует PIP2, фосфатидилинозитол, на два вторичных мессенджера, инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерол (DAG), которые затем продолжают модулировать активность нижерасположенных белков во время передачи сигналов В-клеток.

К ингибиторам тирозинкиназы Брутона (ВТК) относится ибрутиниб. Ибрутиниб продается компанией Pharmacyclics, Inc. и Johnson & Johnson's Janssen Pharmaceutical (торговое название Имбрувика, также называемый PCI-32765). Ибрутиниб в настоящее время отмечен для лечения пациентов с лимфомой из клеток мантийной зоны (MCL), которые получили по меньшей мере одну предшествующую терапию, с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), которые получили по меньшей мере одну предшествующую терапию, с хроническим лимфоцитарным лейкозом с делецией 17р и с макроглобулинемией Вальденстрема. Формула ибрутиниба представляет собой 1-[(3R)-3-[4-амино-3-(4-феноксифенил)-1Hпиразоло[3,4-d]пиримидин-1-ил]-1-пиперидинuл]-2-пропен-1-он и имеет следующую структуру:

- 8 040320

Ингибитор BCL-2 представляет собой класс лекарственных средств, которые функционируют путем ингибирования антиапоптотического белка В-клеточной лимфомы-2 (Вс1-2), что приводит к запрограммированной гибели клеток. К ингибиторам BCL-2 относится венетоклакс. Венетоклакс продается компаниями Abbvie и Genentech (торговое название VENCLEXTA™, также известный как GDC-0199, АВТ-199 и RG7601). Венетоклакс в настоящее время отмечен для лечения пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) с делецией 17р, как обнаружено с помощью одобренного FDA теста, которые получили по меньшей мере одну предшествующую терапию. Формула венетоклакса представляет собой 4-(4-{[2-(4хлорфенил)-4,4-диметил-1 -циклогексен-1 -ил]метил} -1 -пиперазинил)-N-({3-нитро-4-[(тетрагидро-2Нпиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2-(1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-5-илокси)бензамид и имеет следующую структуру:

CI

Венетоклакс, АВТ и АВТ-199 используются в данном документе в качестве синонимов.

Варианты осуществления

Одним аспектом является способ идентификации субъекта, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), который отвечает на лечение антителом к CD19, при этом указанный способ включает

a) взятие образца, полученного от указанного субъекта до лечения указанным антителом к CD19,

b) определение уровня по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце, выбранного из группы, состоящей из

i) количества периферических NK-клеток и ii) уровней экспрессии CD16 на периферических NK-клетках,

с) сравнение уровня указанного по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце с заданным уровнем отсечения, где уровни указанного по меньшей мере одного биомаркера, соответствующие заданному уровню отсечения или превышающие его, указывают на субъекта, который получит пользу от лечения антителом к CD19.

В вариантах осуществления образец представляет собой образец крови. В вариантах осуществления указанный образец содержит периферические NK-клетки.

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения указанного биомаркера представляет собой такое исходное количество периферических NK-клеток, как по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 75 клеток/мкл, по меньшей мере 100 клеток/мкл, по меньшей мере 125 клеток/мкл, по меньшей мере 150 клеток/мкл, по меньшей мере 175 клеток/мкл, по меньшей мере 200 клеток/мкл, по меньшей мере 225 клеток/мкл или по меньшей мере 250 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданный уровень отсечения указанного биомаркера представляет собой такие исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках как по меньшей мере 45000 ABC, по меньшей мере 60000 ABC, по меньшей мере 75000 ABC или по меньшей мере 90000 ABC.

В вариантах осуществления заданный предел отсечения указанного биомаркера представляет собой следующее:

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 50 клеток/мкл, или

b) исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой следующее:

- 9 040320

а) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 50 клеток/мкл, и

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения представляет собой исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 50 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 (ABC).

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 70 клеток/мкл, или

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 70 клеток/мкл, и

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения представляет собой исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 70 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 (ABC).

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 80 клеток/мкл, или

а) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 80 клеток/мкл, и

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения представляет собой исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 80 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 (ABC).

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 90 клеток/мкл, или

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 90 клеток/мкл, и

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения представляет собой исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 90 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 (ABC).

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл, или

a) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл, и

b) исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей

- 10 040320 мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения представляет собой исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 (ABC).

a) взятие образца крови, полученного от указанного субъекта до лечения указанным антителом к CD19,

c) сравнение уровня указанного по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце с заданным уровнем отсечения, где исходное количество периферических NK-клеток составляет по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 60 клеток/мкл, по меньшей мере 70 клеток/мкл, по меньшей мере 80 клеток/мкл, по меньшей мере 90 клеток/мкл или по меньшей мере 100 клеток/мкл, и исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках составляют по меньшей мере 60000 (ABC), и где антитело к CD19 содержит область HCDR1, предусматривающую последовательность SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2, предусматривающую последовательность NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3, предусматривающую последовательность GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1, предусматривающую последовательность RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2, предусматривающую последовательность RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3, предусматривающую последовательность MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

c) сравнение уровня указанного по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце с заданным уровнем отсечения, где исходное количество периферических NK-клеток составляет по меньшей мере 100 клеток/мкл, или исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках составляют по меньшей мере 60000 (ABC), и где антитело к CD19 содержит область HCDR1, предусматривающую последовательность SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2, предусматривающую последовательность NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3, предусматривающую последовательность GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1, предусматривающую последовательность RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2, предусматривающую последовательность RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3, предусматривающую последовательность MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

В вариантах осуществления заданный уровень отсечения указанного биомаркера представляет собой такое исходное количество периферических NK-клеток как по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 75 клеток/мкл, по меньшей мере 100 клеток/мкл, по меньшей мере 125 клеток/мкл, по меньшей мере 150 клеток/мкл, по меньшей мере 175 клеток/мкл, по меньшей мере 200 клеток/мкл, по меньшей мере 225 клеток/мкл или по меньшей мере 250 клеток/мкл. В вариантах осуществления заданный уровень отсечения указанного биомаркера представляет собой такие исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках как по меньшей мере 45000 ABC, по меньшей мере 60000 ABC, по меньшей мере 75000 ABC или по меньшей мере 90000 ABC.

Одним аспектом является способ лечения пациента, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или мелкоклеточную

- 11 040320 лимфоцитарную лимфому (SLL), антителом к CD19, при этом способ включает

а) получение исходного количества периферических NK-клеток у пациента или исходного уровня экспрессии CD16 на периферических NK-клетках пациента и

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту с исходным количеством периферических NK-клеток, составляющим по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 60 клеток/мкл, по меньшей мере 70 клеток/мкл, по меньшей мере 80 клеток/мкл, по меньшей мере 90 клеток/мкл или по меньшей мере 100 клеток/мкл, или исходным уровнем экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющим по меньшей мере 60000 (ABC).

Одним аспектом является способ лечения пациента, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), антителом к CD19, при этом способ включает

a) получение исходного количества периферических NK-клеток у пациента или исходного уровня экспрессии CD16 на периферических NK-клетках пациента и

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту с исходным количеством периферических NK-клеток, составляющим по меньшей мере 100 клеток/мкл, или исходным уровнем экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющим по меньшей мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления способ лечения пациента с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), неходжкинской лимфомой (NHL), острым лимфобластным лейкозом (ALL) или мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой (SLL) при помощи антитела к CD19 включает

a) получение исходного количества периферических NK-клеток у пациента и

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту с количеством NK-клеток, составляющим по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 60 клеток/мкл, по меньшей мере 70 клеток/мкл, по меньшей мере 80 клеток/мкл, по меньшей мере 90 клеток/мкл или по меньшей мере 100 клеток/мкл.

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту с количеством NK-клеток, составляющим по меньшей мере 100 клеток/мкл.

a) получение исходных уровней экспрессии CD16 на периферических NK-клетках пациента и

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту с уровнями CD16 на NK-клетках, составляющими по меньшей мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам, имеющим как исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 60 клеток/мкл, по меньшей мере 70 клеток/мкл, по меньшей мере 80 клеток/мкл, по меньшей мере 90 клеток/мкл или по меньшей мере 100 клеток/мкл, так и исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющий по меньшей мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам, имеющим как исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл, так и исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющий по меньшей мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам с исходным количеством периферических NK-клеток, составляющим по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 75 клеток/мкл, по меньшей мере 100 клеток/мкл, по меньшей мере 125 клеток/мкл, по меньшей мере 150 клеток/мкл, по меньшей мере 175 клеток/мкл, по меньшей мере 200 клеток/мкл, по меньшей мере 225 клеток/мкл или по меньшей мере 250 клеток/мкл. В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам с исходными уровнями экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющими по меньшей мере 45000 ABC, по меньшей мере 60000 ABC, по меньшей мере 75000 ABC или по меньшей мере 90000 ABC.

Одним аспектом является способ лечения пациента, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), антителом к CD19, при этом указанный способ включает

- 12 040320

а) взятие образца, полученного от указанного субъекта до лечения указанным антителом к CD19,

c) сравнение уровня указанного по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце с заданным уровнем отсечения,

d) введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту с количеством периферических NK-клеток, составляющим по меньшей мере 100 клеток/мкл, или уровнем экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющим по меньшей мере 60000 (ABC).

Одним аспектом является способ лечения пациента, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), включающий введение эффективного количества антитела к CD19 пациенту, если

а) исходное количество периферических NK-клеток пациента составляет по меньшей мере 100 клеток/мкл, или

b) исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках составляют по меньшей мере 60000 (ABC).

Одним аспектом является способ лечения пациента, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), включающий

a) получение количества периферических NK-клеток у пациента,

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациентам с количествами периферических NK-клеток, составляющими по меньшей мере 100 клеток/мкл.

a) получение уровней экспрессии CD16 на периферических NK-клетках пациента,

b) введение эффективного количества антитела к CD19 пациентам с уровнями экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющими по меньшей мере 60000 (ABC).

В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам, имеющим как исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл, так и исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющий по меньшей мере 60000 (ABC). В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам с исходным количеством периферических NKклеток, составляющим по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 75 клеток/мкл, по меньшей мере 100 клеток/мкл, по меньшей мере 125 клеток/мкл, по меньшей мере 150 клеток/мкл, по меньшей мере 175 клеток/мкл, по меньшей мере 200 клеток/мкл, по меньшей мере 225 клеток/мкл или по меньшей мере 250 клеток/мкл. В вариантах осуществления антитело к CD19 вводят пациентам с исходными уровнями экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющими по меньшей мере 45000 ABC, по меньшей мере 60000 ABC, по меньшей мере 75000 ABC или по меньшей мере 90000 ABC.

В вариантах осуществления исходное количество периферических NK-клеток или исходные уровни CD16 (ABC) на периферических NK-клетках получают из образца крови, взятого у пациента. В вариантах осуществления количество периферических NK-клеток и/или уровни экспрессии CD16 измеряют до введения антитела к CD19.

В вариантах осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, содержит область HCDR1, предусматривающую последовательность SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2, предусматривающую последовательность NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3, предусматривающую последовательность GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1, предусматривающую последовательность RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2, предусматривающую последовательность RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3, предусматривающую последовательность MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

В вариантах осуществления исходное количество периферических NK-клеток или исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках получают из образца крови, взятого у пациента.

В одном варианте осуществления у пациента имеется неходжкинская лимфома. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфомы маргинальной зоны, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой фолликулярную лимфому. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома является индолентной неходжкинской лимфомой. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому лимфоидной ткани слизистых оболочек. В одном вари- 13 040320 анте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому маргинальной зоны. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому Беркитта. В одном варианте осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому из клеток мантийной зоны. В одном варианте осуществления у пациента имеется хронический лимфоцитарный лейкоз. В одном варианте осуществления у пациента имеется острый лимфобластный лейкоз. В одном варианте осуществления у пациента имеется мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL).

В вариантах осуществления лечение приводит к терапевтическому эффекту, выбранному из группы, состоящей из частоты контроля заболевания (DCR) и более длительной выживаемости без прогрессирования.

В вариантах осуществления лечение дополнительно включает введение эффективного количества хлорметина. В одном варианте осуществления хлорметин представляет собой бендамустин. В вариантах осуществления лечение дополнительно включает введение эффективного количества аналога пурина. В вариантах осуществления аналог пурина представляет собой флударабин. В вариантах осуществления лечение дополнительно включает введение эффективного количества ингибитора тирозинкиназы Брутона (ВТК). В вариантах осуществления ингибитор тирозинкиназы Брутона (ВТК) представляет собой ибрутиниб. В вариантах осуществления лечение дополнительно включает введение эффективного количества ингибитора фосфоинозитид-3-киназы. В одном варианте осуществления ингибитор фосфоинозитид3-киназы представляет собой иделалисиб. В вариантах осуществления лечение дополнительно включает введение эффективного количества аналога талидомида. В одном варианте осуществления аналог талидомида представляет собой леналидомид. В вариантах осуществления лечение дополнительно включает введение эффективного количества ингибитора BCL-2. В одном варианте осуществления ингибитор BCL-2 представляет собой венетоклакс.

Поскольку проиллюстрированное антитело к CD19 и другие антитела к CD19 связывают CD19, полагают, что аналогичные результаты можно увидеть с другими антителами к CD19. Другие антитела к CD19 описаны в заявке на выдачу патента США с серийным номером 12/377251 (Xencor), WO 2005012493, WO 2010053716 (Immunomedics); WO 2007002223 (Medarex); WO 2008022152 (Xencor); WO 2008031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics) и WO 2010095031 (Glenmark Pharmaceuticals), все из которых включены посредством ссылки в полном объеме.

В вариантах осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, включает антитело, которое конкурирует с антителом, содержащим область HCDR1, предусматривающую последовательность SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2, предусматривающую последовательность NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3, предусматривающую последовательность GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1, предусматривающую последовательность RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2, предусматривающую последовательность RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3, предусматривающую последовательность MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

В вариантах осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, включает антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее область HCDR1, предусматривающую последовательность SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2, предусматривающую последовательность NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3, предусматривающую последовательность GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1, предусматривающую последовательность RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2, предусматривающую последовательность RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3, предусматривающую последовательность MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

В вариантах осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINP

Y

NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVF

DYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10) и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью

- 14 040320

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR

MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEI

К (SEQ ID NO: 11).

В одном варианте осуществления указанное антитело содержит константный домен тяжелой цепи с последовательностью

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 12).

В одном варианте осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, содержит константный домен легкой цепи с последовательностью

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDS KD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13).

В одном варианте осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, содержит тяжелую цепь с последовательностью

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINP YNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRV FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 8).

В одном варианте осуществления антитело, специфичное в отношении CD19, содержит легкую цепь с последовательностью

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR MSNLNGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK RTVAAPSVFIFPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSST LTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9).

Варианты осуществления включают фармацевтическую композицию. В вариантах осуществления композиция содержит приемлемый носитель. В вариантах осуществления композицию вводят в эффективном количестве.

Примеры

Пример 1. Подсчет Т-клеток и NK-клеток.

Объем клинического исследования MOR00208C201 включал оценку нескольких диагностических биомаркеров. В рамках этой инициативы проводили исходный подсчет периферических Т- и NK-клеток в клинических центрах.

Т-клетки представляют собой тип лимфоцитов (подтип белых кровяных клеток), которые играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Их можно отличить от других лимфоцитов, таких как В-клетки и NK-клетки, по наличию Т-клеточного рецептора на поверхности клетки.

Клетки натуральные киллеры или NK-клетки представляют собой тип цитотоксических лимфоцитов, крайне необходимый для врожденной иммунной системы. NK-клетки обеспечивают быстрые ответы в отношении инфицированных вирусом клеток, действуя приблизительно через 3 дня после инфицирования, и отвечают на формирование опухоли. Как правило, иммунные клетки выявляют главный комплекс гистосовместимости (МНС), презентированный на поверхностях инфицированных клеток, инициируя высвобождение цитокинов, вызывающее лизис или апоптоз. Однако NK-клетки уникальны, поскольку они обладают способностью распознавать стрессированные клетки в отсутствие антител и МНС, что обеспечивает гораздо более быструю иммунную реакцию.

- 15 040320

Материалы и способы.

TriTest CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP (с пробирками TruCOUNT), BD Biosciences, номер по каталогу: 340403 (США); 342442 (Европа). Пипетторы и наконечники пипеток, способные доставлять мкл, 50 мкл и 450 мкл, Gilson Inc. Лизирующие растворы FACS, BD Biosciences, номер по каталогу:

349202.

Инструменты: проточный цитометр, вихревая мешалка.

Подготовка к проточной цитометрии.

Цельную кровь окрашивают мечеными флуорохромом антителами (реагенты TriTEST), которые специфически связываются с поверхностными антигенами лейкоцитов. Клетки проходят в лазерном луче и рассеивают свет лазера. Окрашенные клетки флуоресцируют. Эти сигналы светорассеяния и флуоресценции, выявляемые прибором, предоставляют информацию о размере клетки, сложности внутреннего строения и относительной интенсивности флуоресценции. Реагенты TriTEST используют инициирование флуоресценции, что позволяет прямое гейтирование по флуоресценции популяции лимфоцитов NK-и Т клеток для снижения загрязнения нелизированными или имеющими ядро красными кровяными клетками в проточной ячейке.

Окрашивание.

Для каждого образца пациента пробирку TruCOUNT маркировали идентификационным номером образца. 20 мкл реагента TriTEST CD3/CD16+CD56/CD45 помещали с помощью пробирки на дно пробирки. 50 мкл хорошо перемешанной цельной крови с антикоагулянтом помещали с помощью пипетки на дно пробирки. Кровь с антикоагулянтом (EDTA), хранящуюся при комнатной температуре (20-25°С), необходимо окрасить в течение 24 ч после получения и проанализировать в течение 6 ч после окрашивания (выдерживать при комнатной температуре и защищать от света). Пробирку осторожно встряхивали для смешивания. Пробирку инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре (2025°С). В пробирку добавляли 450 мкл лизирующего раствора 1X FACS. Пробирку перемешивали и снова инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре (20-25°С).

При помощи пробирок TruCOUNT известный объем образца окрашивают непосредственно в пробирке TruCOUNT. Лиофилизированный осадок в пробирке растворяется, высвобождая известное количество флуоресцентных гранул. Во время анализа абсолютное число (клеток/мкл) положительных клеток в образце можно определить путем сравнения клеточных событий с событиями гранул.

Проточная цитометрия.

Клетки тщательно перемешивали (на низкой скорости), чтобы уменьшить агрегацию, прежде чем прогонять их на проточном цитометре.

Анализы данных.

Визуально осматривали точечный график CD45 в зависимости от SSC. Лимфоциты выглядят как яркая, компактная клеточная популяция с от низкого до среднего SSC. Моноциты (М) и гранулоциты (G) выглядят как отдельные популяции. Анализ завершали, когда клеточные популяции моноцитов и лимфоцитов показывали четкое разделение.

Лимфоциты сначала гейтировали как CD45-положительную популяцию клеток с низким SSC. Предварительно отбирали CD16/CD56, в зависимости от CD3. Т-клетки (Т) должны выглядеть как компактный яркий CD3-nоложительный кластер. NK-клетки (NK) должны выглядеть как компактный яркий CD16/CD56-πоложительный кластер. Гейтирование завершали и подсчитывали Т- и NK-клетки.

Подсчет событий гранул выполняли с использованием графика CD16/CD56, в зависимости от CD3, без какого-либо предварительно выбранного гейта. Гранулы должны выглядеть как двойной PE/FITCположительный кластер.

Расчет абсолютных количеств.

Абсолютное число (клетки/мкл крови) Т-клеток или NK-клеток в образце определяли путем сравнения клеточных событий с событиями гранул. Анализ данных проводили либо с использованием программного обеспечения MultiSET, либо вручную (при помощи CellQuest или другого программного обеспечения).

Для ручного подсчета число (№) полученных положительных клеточных событий делили на число (№) полученных событий гранул, затем умножали на общее число гранул TruCOUNT (в зависимости от партии), деленное на объем образца цельной крови, составляющий 50 мкл. Результат представляет собой значения абсолютного числа клеток на микролитр.

Уравнение:

содержащий популяцию клеток количество событий в гейте (Т или NK) « количество событий в гейте 2 содержащий количество гранул № всех гранул TruCOUNT --№ клеток/мкл крови мкл цельной крови

Пример:

2709 полученных всего 51 667

Т - клеток _χ гранул в пробирке 10 000 полученных гранул 50мкл = 280 Т - клеток /мкл

- 16 040320

Пример 2. Количественная оценка CD16 на NK-клетках.

В рамках клинического исследования MOR00208C201 количественно оценивали CD16 (диагностический биомаркер) на периферических NK-клетках централизованно в Центральных лабораториях ICON (Farmingdale, Нью Йорк).

Материалы и способы.

Антитела.

CD45 AmCyan (клон 2D1, BD Biosciences, номер по каталогу 339192); CD3 FITC (клон UCHT1, BioLegend, номер по каталогу 300406); мышиный IgG FITC (клон МОРС-21, BioLegend, номер по каталогу 400110); CD16 РЕ (клон 3G8, BioLegend, номер по каталогу 302008); MOR00208; мышиный IgG РЕ (клон МОРС-21, BioLegend, номер по каталогу 400114); CD56 PerCP-Су5.5 (клон HCD56, BioLegend, номер по каталогу 318322) и мышиный IgG PerCP-Cy5.5 (клон МОРС-21, BioLegend, номер по каталогу 400150).

Материал.

Защитная транспортная тара PharmaTherm (Intelsius, номер по каталогу РНТ014); пробирки для получения мононуклеарных клеток с гепарином натрия BD Vacutainer® CPT™ (16x125 мм/8 мл) (BD, номер по каталогу 362753); круглодонные пробирки BD Falcon™ 12x75 мм (BD, номер по каталогу 352052); гранулы CS&T (BD Biosciences номер по каталогу 642212); фетальная бычья сыворотка (FBS), инактивированная нагреванием (Sigma F4135 или эквивалент); PBS Дульбекко без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ (Gibco, номер по каталогу 14190, или эквивалент); BD Falcon, фильтр с размером пор 100 мкм для клеток, желтый (BD Bioscience, номер по каталогу 352360); буфер FACS, 3% инактивированной нагреванием FBS в 1X DPBS; деионизированная вода, лабораторный материал; измельченный (мокрый) лед; емкость для льда; алюминиевая фольга; конические пробирки, 50 мл; конические пробирки, 15 мл; стерильные наконечники с фильтром для пипетки; лизирующий буфер BD Pharm Lyse (BD Biosciences, номер по каталогу 555899); набор для окрашивания мертвых клеток ViViD LIVE/DEAD® Fixable Violet Dead Cell Stain, для длины волны возбуждения 405 нм (Life Technologies, номер по каталогу L34955); гранулы ArC Amine Reactive Beads (Life Technologies, номер по каталогу А10346); гранулы BD QuantiBRITE (BD Biosciences, номер по каталогу 340495) и нейлоновое сито 52 мкм (Miami Aqua Culture, для кат.: нейлон 52 мкм, 32% живого сечения, вплетенного в материал).

Оборудование.

Центрифуга (с возможностью охлаждения); лабораторный встряхиватель (встряхиватель-качалка для пробирок); вихревой смеситель; ламинарный вытяжной шкаф; инкубатор (устанавливается на 37°С, 5% СО₂); Advia (счетчик клеток); проточный питометр BD FACSCANTO II; контейнер Desi-Vac™, 1,5 л (VWR, номер по каталогу 62344-930); Humidity Sponge™ с индикатором (VWR, номер по каталогу 61161-319) и устройство для отслеживания значения влажности с памятью Traceable Humidity-On-A-Card (VWR, номер по каталогу 15551-012).

Таблица 1. Набор реагентов для количественной оценки CD16 в отношении РВМС (мононуклеарной клетки периферической крови)

Описание	№ пробирки	V450	AmCyan	FITC	PE	PerCPCy5.5	APC
Контрольная пробирка 1	1	ViViD	CD45	Ms IgG	Ms IgG	Ms IgG	___
CD 16 АВС	2	ViViD	CD45	CD3	CD16	CD56	—

Процедуры получения и введения метки в РВМС.

Периферическую кровь пациента собирали в пробирки СРТ и отправляли в течение ночи из клинических центров в центральную лабораторию в защитной транспортной таре. Пробирки СРТ центрифугировали в течение 25 мин при 1800 х g при комнатной температуре в положении тормоз включен. После центрифугирования пробирки СРТ сразу же ставили вверх дном и помещали на 10 мин на лабораторный встряхиватель, чтобы повторно суспендировать слой РВМС в аутологичной плазме и растворить большинство образовавшихся клеточных агрегатов. В стерильных условиях гомогенизированную суспензию РВМС/плазмы медленно декантировали в центр фильтра с размером пор 100 мкм для клеток, находящегося на стерильной конической пробирке объемом 50 мл. Равный объем 1 X DPBS добавляли к суспензии РВМС/плазмы (примерно 4 мл) в конической пробирке объемом 15 мл. Пробирки центрифугировали при 300 х g в течение 10 мин при 4°С и удаляли надосадочную жидкость. Пробирки перемешивали для ресуспендирования осадка клеток. Осадок клеток промывали с помощью DBPS, центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли и ресуспендировали путем перемешивания. Промытую суспензию РВМС добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 1 мкл исходного раствора ViViD; инкубировали в течение 15 мин на льду и выдерживали в темноте (накрыть алюминиевой фольгой). Окрашенные ViViD РВМС переносили в новую промаркированную коническую пробирку, а затем добавляли ледяной буфер FACS. Клетки центрифугировали и снова перемешивали для ресуспендирования. Пробирки из полистирола фирмы Falcon маркировали для каждого образца (табл. 1). Антитела или контрольные изотипические антитела добавляли в соответствующие пробирки. Аликвоту окрашенных ViViD РВМС добавляли в

- 17 040320 каждую пробирку (табл. 1). Пробирки перемешивали и инкубировали. Добавляли буфер FACS и клетки центрифугировали и снова перемешивали для ресуспендирования. Добавляли лизирующий буфер BD Pharm Lyse и клетки перемешивали, центрифугировали и аспирировали для удаления надосадочной жидкости и снова перемешивали для ресуспендирования. Снова добавляли буфер FACS и клетки центрифугировали и снова перемешивали для ресуспендирования. Затем образцы обрабатывали на питометре FACSCanto II и оценивали ABC (количество связанных антител на клетку) по стандартизированной MFI, как описано в Iyer S, et al., Expression of CD69 on activated T cells using R-phycoerythrin labeled beads, Cytometry, 1996; #AC78 (Suppl.8):113 и Iyer S., et al., QuantiBRITE: A New Standard for Fluorescence Quantitation, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA. 1997. White Paper.

Пример 3. Испытание NHL.

Исследование Fc-оптимизированного антитела к CD19 (MOR00208) для лечения неходжкинской лимфомы (NHL), идентификатор на ClinicalTrials.gov: NCT01685008, набор прекращен.

Критерии включения были такими, как приведенные ниже.

1. Пациенты мужского или женского пола возрастом >18 лет.

2. Гистологически подтвержденный диагноз в соответствии с классификацией REAL/WHO следующих В-клеточных лимфом: a) FL, b) MCL, с) DLBCL, d) другие индолентные NHL (например, MZL/MALT).

3. NHL пациентов должна прогрессировать после по меньшей мере 1 предшествующей схемы, предусматривающей ритуксимаб.

4. Один очаг измеряемого заболевания определен с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) или компьютерной томографии (СТ) как по меньшей мере одно поражение, которое имеет размеры по меньшей мере 1,5х1,5 см, за исключением: только для пациентов с MCL, могут зачисляться пациенты с неизмеряемым заболеванием, но с поддающимися оценке очагами (костный мозг, селезенка, периферическая кровь, желудочно-кишечный тракт).

5. Для пациентов, которые ранее получали аутологичную трансплантацию стволовых клеток, должно пройти по меньшей мере 4 недели после трансплантации перед введением исследуемого лекарственного средства, и они должны продемонстрировать полное восстановление на гематологическом уровне.

6. Прерывание предыдущей терапии моноклональными антителами (за исключением ритуксимаба) или введения радиоиммунотерапии по меньшей мере за 60 дней до введения исследуемого лекарственного средства.

7. Прекращение введения ритуксимаба по меньшей мере за 14 дней до скринингового визита и подтверждение того, что либо отсутствует ответ, либо есть прогрессирование заболевания после лечения ритуксимабом.

8. У пациентов с DLBCL была положительная сканограмма [18F]фтордезоксиглюкоза-позитронноэмиссионной томографии (FDG-PET) в начале исследования (критерии ответа Cheson).

9. Ожидаемая продолжительность жизни >3 месяцев.

10. Функциональный статус согласно ECOG<3.

11. Лабораторные критерии при скрининге: а) абсолютное количество нейтрофилов (ANC) >1,0 (1000/мм³), b) количество тромбоцитов >75х109/л без предшествующего переливания в течение 10 дней до первого введения исследуемого лекарственного средства, с) гемоглобин >8,0 г/дл (может быть перелит), d) креатинин сыворотки <2,0 х верхний предел нормы (ULN), е) общий билирубин <2,0xULN, f) аланинтрансаминаза (ALT) и аспартатаминотрансфераза (AST)<2,5xULN.

12. Если женщина детородного возраста, отрицательный тест на беременность должен быть подтвержден до регистрации, и применение двухбарьерной контрацепции, орального контрацептива плюс барьерного контрацептива, или подтверждение прохождения клинически задокументированной общей гистерэктомии и/или оофорэктомии, перевязки маточных труб.

13. Если мужчина, эффективный барьерный способ контрацепции должен использоваться во время исследования и в течение 3 месяцев после последней дозы, если пациент проявляет половую активность с женщиной детородного возраста.

14. Способность соблюдать требования всех связанных с исследованием процедур, применений лекарственных препаратов и оцениваний.

15. Способность понять и дать письменное информированное согласие и соблюдать протокол исследования.

Критерии исключения были такими, как описанные ниже.

1. Предшествующее лечение с применением цитотоксической химиотерапии, иммунотерапии, лучевой терапии или другой специфической для лимфомы терапии в течение 14 дней до скринингового визита, или пациент не восстановился от побочных эффектов предшествующей специфической для лимфомы терапии.

2. Лечение системным экспериментальным средством в течение 28 дней перед скрининговым визитом.

3. Предшествующее лечение антителом или фрагментами антитела к CD19.

4. Предшествующая аллогенная трансплантация стволовых клеток.

- 18 040320

5. Известная или подозреваемая гиперчувствительность к вспомогательным веществам, содержащимся в составе исследуемого лекарственного средства.

6. Клинически значимые сердечно-сосудистые заболевания или сердечная недостаточность, кардиомиопатия, ранее существовавшая клинически значимая аритмия, острый инфаркт миокарда в течение 3 месяцев после включения в исследование, стенокардия в течение 3 месяцев после включения в исследование.

7. Клинические или лабораторные свидетельства активного гепатита В или гепатита С.

8. История ВИЧ-инфекции.

9. Любая активная системная инфекция (вирусная, грибковая или бактериальная), требующая активной парентеральной терапии антибиотиками в течение 4 недель после введения исследуемого лекарственного средства.

10. Текущее лечение иммунодепрессантами, отличными от предписанных кортикостероидов (эквивалентно не более 10 мг преднизона).

11. Крупная хирургическая операция или лучевая терапия в течение 4 недель перед первым введением исследуемого лекарственного средства.

12. Системные заболевания (сердечно-сосудистые, почечные, печеночные и т.д.), которые по мнению исследователя препятствовали бы изучению лечения.

13. История или клинические признаки заболевания центральной нервной системы (CNS), менингеального или эпидурального заболевания, включая метастазы в головной мозг.

14. Активное лечение/химиотерапия для другой первичной злокачественности в течение последних 5 лет.

15. Беременность или грудное вскармливание у женщины, и женщина детородного возраста, не использующая приемлемый способ контроля рождаемости.

16. История несоблюдения схем лечения или пациенты, которые считаются потенциально ненадежными, не готовыми к взаимодействию.

Пациенты получали лечение с помощью MOR00208 следующим образом. Пациенты получали лечение двумя 28-дневными циклами, где MOR00208 давали в дозе 12 мг/кг в дни 1, 8, 15 и 22. По окончании двух циклов пациенты, имеющие стабильное заболевание или лучше, получали третий 28-дневный цикл, применяя те же дозы и график, что и в первых двух циклах. По окончании третьего цикла пациенты, имеющие частичный ответ или лучше, переходили на поддерживающую терапию. В режиме поддерживающей терапии MOR00208 вводили в дозе 12 мг/кг каждые 14 или 28 дней до прогрессирования заболевания.

По состоянию на конец исследования характеристики пациентов были такими, как приведены ниже.

Таблица 2

Исходные характеристики
Характеристика		DLBCL п=35	iNHL п=45	MCL п=12	Итого п=92
Возраст, лет	Срединное значение	71	66	64,5	66,5
Пол	Мужской	24 (69)	21 (47)	11 (92)	56 (61)
ECOG PS	0	20 (57)	33 (73)	7(58)	60 (65)
	1	12 (34)	11 (24)	4 (33)	27 (29)
	2	3(9)	1(2)	1(8)	5(5)
Резистентность к ритуксимабу	Да	24 (69)	22 (49)	6 (50)	52 (57)
	Нет	11(31)	23 (51)	6 (50)	40 (43)
Последняя доза ритуксимаба	<6 мес.	14 (40)	6(13)	1(8)	21 (23)

- 19 040320

Предшествующая трансплантация стволовых клеток	Да	2(6)	7(16)	1(8)	Ю (И)
DoR до последней предшествующей терапии	>12 месяцев	3(9)	18 (40)	4(33)	25 (27)
	<12 месяцев	26 (74)	25 (56)	7(58)	58 (63)
	Неизвестно	6(17)	2(4)	1(8)	9(Ю)
Исходное количество NK-клеток	>100 клеток/мкл	19 (54)	23 (51)	8(67)	51 (55)
	<100 клеток/мкл	И(31)	8(18)	1(8)	20 (22)
	Неизвестно	5(14)	14 (31)	3(25)	21 (23)
Исходная экспрессия CD16 на NK-клетках	> 60000 АВС	15 (43)	33 (73)	5(42)	53 (58)
	< 60000 АВС	И(31)	5(H)	4 (33)	20 (22)
	Неизвестно	9(26)	7(16)	3(25)	19 (21)
Исходное количество Т-клеток	>500 клеток/мкл	20 (57)	26 (58)	8(67)	54 (59)
	<500 клеток/мкл	10 (29)	6(13)	1(8)	17 (18)
	Неизвестно	5(14)	13 (29)	3(25)	21 (23)
FcyRIIIa	Высокая аффинность	5(14)	4(9)	1(8)	10(11)
	Низкая аффинность	27 (77)	28 (62)	9(57)	64 (70)
	Неизвестно	3(9)	13 (29)	2(17)	18 (20)
FcyRIIa	Высокая аффинность	И(31)	10 (22)	3(25)	24 (26)
	Низкая аффинность	21 (60)	22 (49)	7(58)	50 (54)
	Неизвестно	3(9)	13 (29)	2(17)	18 (18)

DLBCL, диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома;

ECOG PS, функциональный статус согласно Восточной объединенной онкологической группе; iNHL, индолентная неходжкинская лимфома (включая фолликулярную лимфому и другие iNHL); MCL, лимфома из клеток мантийной зоны;

мес. - месяцы

Другое iNHL означает гетерогенную группу, дополнительно не уточняемых индолентных не агрессивных типов NHL, например лимфому маргинальных клеток, лимфому маргинальной зоны и лимфому лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT).

Основные первичные и вторичные конечные точки были такими, как приведены ниже.

Первичная: общая частота ответа (ORR)=CR+PR.

Вторичная: частота контроля заболевания (DCR)=CR+PR+SD выживаемость без прогрессировать (PFS).

- 20 040320

Таблица 3

Ответ
Лучший общий ответ,* η (%)	DLBCL η =35	iNHL¹n=45	MCL n=12	Итого n=92
Полный ответ, CR	2(6)	5(H)	0	7(8)
Частичный ответ, PR	7 (20)	8(18)	0	15 (16)
Стабильное заболевание, SD	5(H)	20 (44)	6 (50)	31 (34)
Прогрессирующее заболевание	И(31)	7(16)	5(42)	23 (25)
Оценка отсутствует*	10 (29)	5(H)	1(8)	16 (17)
DCR (CR+PR+SD)	14 (40)	33 (73)	6(50)	53 (58)
ORR (CR+PR/все пациенты)	9(26)	13 (29)	0	22 (24)
ORR (CR+PR/пациенты с оценкой⁵)	9(36)	13 (33)	0	22 (29)

Данные представляют собой n (%).

*По оценке исследователя;

t включает фолликулярную лимфому и другие индолентные NHL;

? Оценку ответа после исходного уровня не проводили/данные недоступны;

§n=25, 40, 11 и 76 соответственно;

DCR, частота контроля заболевания;

iNHL, индолентная неходжкинская лимфома;

MCL, лимфома из клеток мантийной зоны;

ORR, общая частота ответа

Критериями ответа в этом исследовании являются те, которые определены в табл. 4. Все они основаны на критериях ответа согласно Международной рабочей группы (2007 г.).

Таблица 4. Критерии ответа

Ответ	Определение	Значения массы узлов	Селезенка, печень	Костный мозг
CR	Исчезновение всех признаков заболевания	а) FDG-авидный или РЕТ-положительный до лечения; масса любого размера разрешена, если РЕТ-отрицательный Ь) Вариабельный FDG-авидный или РЕТотрицательный; регрессия к нормальному размеру согласно СТ	Не пальпируемый, узлы исчезли	Инфильтрат устранен при повторной биопсии;если неопределимо по морфологии, иммуногистохимия должна быть отрицательной

- 21 040320

PR	Регрессия измеряемого заболевания и отсутствие новых очагов	> 50%-е снижение SPD до 6 самых крупных доминантных масс; нет увеличения размера согласно СТ а) а) FDG-авидный или РЕТ-положительный до лечения; один или несколько РЕТ- положительных в ранее задействованном очаге Ь) вариабельный FDGавидный или РЕТотрицательный; регрессия согласно СТ	> 50%-е снижение SPD узлов (для единичного узла по большему поперечному диаметру); отсутствие увеличения размера печени или селезенки	Неприменимо, если положительный до лечения; следует указать тип клеток
SD	Отсутствие достижения CR/PR или PD	а) FDG-авидный или РЕТ-положительный до терапии; РЕТположительный на предыдущих очагах заболевания и отсутствие новых очагов согласно СТ или РЕТ Ь) вариабельный FDGавидный или РЕТ отрицательный; никаких изменений в размере предыдущих поражений согласно СТ
Рецидив заболевания или PD	Любое новое поражение или увеличение на > 50% от самого низкого уровня ранее вовлеченных очагов	Появление нового(-ых) поражения(-ий) > 1,5 см по любой оси, > 50% увеличение SPD более чем одного узла или > 50% увеличение самого длинного диаметра ранее идентифицированного узла > 1 см по короткой оси Поражения РЕТположительные, в случае FDG-авидной лимфомы или РЕТ-положительной до терапии	> 50% увеличение от самого низкого уровня SPD любых предыдущих поражений	Новое или рекуррентное поражение

Сокращения: CR, полная ремиссия;

FDG, [¹⁸F]фтордезоксиглюкоза;

PET, позитронно-эмиссионная томография;

СТ, компьютерная томография;

PR, частичная ремиссия;

SPD, сумма произведений диаметров;

SD, стабильное заболевание;

PD, прогрессирующее заболевание

DCR (CR+PR+SD) считалась наиболее подходящей конечной точкой эффективности анализа характеристик и биомаркеров пациента в этом испытании, так как большинство пациентов с SD отмечали уменьшение целевых поражений, но согласно плану исследования не получали лечение после цикла 3. Соответственно пациенты с SD включены в анализ.

По меньшей мере, следующие характеристики пациентов оценивали для определения того, существует ли корреляция между характеристикой и наблюдаемой DCR у пациентов, получивших лечение антителом к CD19: а) возраст, b) пол, с) получали ли пациенты дозу ритуксимаба в течение последних 6 месяцев, d) были ли пациенты резистентными к ритуксимабу, е) имеют ли пациенты аллель FCgammaRIIIa высокой или низкой аффинности, f) имеют ли пациенты аллель FCgammaRIIa высокой или низкой аффинности, g) была ли у пациентов длительность ответа на предыдущее лечение большей чем 12 месяцев, h) исходные количества периферических Т-клеток (клетки/мкл), i) исходное количество периферических NK-клеток (клетки/мкл) и j) исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NKклетках (количество связанных антител на клетку - ABC).

Пример 1 и пример 2 выше использовали для оценки исходных количеств периферических NK- 22 040320 клеток, количеств Т-клеток и исходного уровня экспрессии CD16 на периферических NK-клетках. Данные показаны в табл. 2.

Анализ рабочей характеристики приемника (ROC) использовали для анализа прогнозируемости, специфичности и чувствительности, а также для определения пределов отсечения для потенциальных биомаркеров количества NK-клеток, количества Т-клеток и уровня экспрессии CD16 (ABC) на периферических NK-клетках. График ROC отображает эффективность способа двоичной классификации с непрерывным или дискретным порядковым выходом. Он показывает чувствительность (долю правильно классифицированных положительных наблюдений) и специфичность (долю правильно классифицированных отрицательных наблюдений), поскольку пороговое значение выхода перемещается в диапазоне всех возможных значений. См. Swets JA: The Relative Operating Characteristic in Psychology. Science 1973, 182: 990-1000 и Pepe MS: The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. Oxford: Oxford University Press; 2003. В контексте ROC с помощью площади под кривой (AUC) измеряют эффективность классификатора и ее часто применяют для сравнения способов. Более высокая AUC означает лучшую классификацию. AUC для количеств периферических NK/T-клеток и для уровня экспрессии CD16 на NK-клетках составляет 0,66, 0,53 и 0,61 соответственно (фиг. 3, 4 и 5).

В целом определение предела отсечения зависит от цели, на которую направлен соответствующий способ. Различные критерии, такие как максимальная точность, максимальное диагностическое отношение шансов, минимальная частота ошибок, максимальная чувствительность и/или максимальная специфичность, приведут к другому определению предела отсечения. Кроме того, баланс между большим количеством таких критериев, например чувствительностью и специфичностью, также приведет к конкретному определению предела отсечения.

Поэтому существует несколько способов или критериев для выбора оптимальных пределов отсечения, включая способы, увеличивающие до максимума точность, чувствительность+специфичность, прогностические значения, диагностические коэффициенты правдоподобия или распространенность. Из-за ассимметрии ROC-кривой для уровня экспрессии CD16 (см. фиг. 4) большинство способов приводят к пределу отсечения, составляющему 60000 ABC (точки с наибольшим расстоянием между ROC-кривой и биссектрисой), тогда как симметрия ROC-кривой для количества NK-клеток (см. фиг. 3) объясняет, почему при применении разных способов могут быть получены разные значения для наилучшего предела отсечения. В этом конкретном исследовании для обоих биомаркеров больший вес был отнесен к чувствительности, и поэтому 100 NK-клеток/мкл и уровень экспрессии CD16 в 60000 ABC соответственно выбрали в качестве пределов отсечения для анализа DCR и PFS в подгруппах. Для количеств периферических Т-клеток AUC равна 0,53, а ROC-кривая близка к биссектрисе при любом значении специфичности и чувствительности, поэтому даже выбор отличного от 500 клеток/мкл предела отсечения не повлиял на отрицательные результаты анализа DCR и PFS в подгруппах.

Определение предела отсечения может быть сбалансировано в пользу либо чувствительности, либо специфичности. Если еще больший вес относят к чувствительности, для идентификации оптимального предела отсечения данный способ будет отличным, и предполагается более низкий предел отсечения для количества NK-клеток. В этом случае определяют предел отсечения по меньшей мере 50 NK-клеток/мкл. В качестве альтернативы определяют предел отсечения, составляющий по меньшей мере 60 NKклеток/мкл, по меньшей мере 70 NK-клеток/мкл, по меньшей мере 80 NK-клеток/мкл, по меньшей мере 90 NK-клеток/мкл или по меньшей мере 100 NK-клеток/мкл.

Для увеличения до максимума специфичности раскрытого способа предел отсечения для количества NK-клеток увеличивают и определяют от по меньшей мере 100 NK-клеток/мкл до по меньшей мере 150 NK-клеток/мкл. Поэтому для увеличения до максимума специфичности выбирают предел отсечения, составляющий по меньшей мере 100 NK-клеток/мкл, по меньшей мере 110 NK-клеток/мкл, по меньшей мере 120 NK-клеток/мкл, по меньшей мере 130 NK-клеток/мкл, по меньшей мере 140 NK-клеток/мкл или по меньшей мере 150 NK-клеток/мкл.

Значения предела отсечения, определенные в этом конкретном исследовании (100 NK-клеток/мкл и уровень экспрессии CD16 в 60000 ABC), использовали для следующего статистического анализа.

Диаграммы Фореста использовали для анализа всех характеристик и биомаркеров пациента, чтобы определить корреляцию отдельной характеристики с DCR. Результаты показаны на фиг. 7. На основании анализа диаграмм Фореста различных характеристик пациента и их корреляции с DCR у пациентов с DLBCL и iNHL следующие характеристики показали статистически значимые различия: 1) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл, и исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющий по меньшей мере 60000 ABC (нескорректированное по χ² значение р=0,029/0,003) (фиг. 7).

Чтобы гарантировать, что уровень экспрессии CD16 и количество NK-клеток являются независимыми характеристиками, которые не влияли друг на друга, провели параметрический и непараметрический корреляционный анализ. Данные об уровне экспрессии CD16 и количестве NK-клеток были доступны для 51 пациента. Коэффициент Пирсона r составил 0,019 с двухсторонним значением р=0,9, а коэффициент Спирмана r составил 0,036 с двухсторонним значением р=0,8. Результаты графически представлены на фиг. 6. В заключение, уровень экспрессии CD16 и количество NK-клеток при определенных

-

Claims

пороговых значениий не коррелируют, поэтому они считаются полностью независимыми прогностическими параметрами вероятности того, что пациент получит пользу от лечения с помощью MOR00208.

Следующие характеристики не были признаны прогностическими для DCR: а) возраст, b) пол, с) получали ли пациенты дозу ритуксимаба в течение последних 6 месяцев, d) были ли пациенты резистентными к ритуксимабу, е) имеют ли пациенты аллель FCgammaRIIIa высокой или низкой аффинности, f) имеют ли пациенты аллель FCgammaRIIa высокой или низкой аффинности, g) была ли у пациентов длительность ответа на лечение большей чем 12 месяцев или h) исходные количества периферических Т-клеток. См. фиг. 7.

Как 1) исходные количества периферических NK-клеток, так и 2) исходный уровень экспрессии CD16 на периферических NK-клетках показали явные корреляции с ответом пациентов на терапию с помощью MOR00208. В частности, у пациентов, имеющих исходное количество NK-клеток по меньшей мере 100 клеток/мкл, наблюдалась корреляция с более высокой частотой контроля заболевания (DCR). DCR включает пациентов, характеризующихся полным ответом (CR) + частичным ответом (PR) + стабильным заболеванием (SD). В дополнение, у пациентов, имеющих исходный уровень экспрессии CD16 на NK-клетках в количестве по меньшей мере 60000 ABC, наблюдалась корреляция с более высокой частотой контроля заболевания (DCR).

Выживаемость без прогрессирования (PFS) представляет собой продолжительность времени в ходе и после лечения заболевания, когда пациент живет с заболеванием, но оно не ухудшается. Это дополнительная важная конечная точка клинического испытания и показатель эффективности у пациентов. PFS сравнивали в рамках следующих характеристик пациента: а) исходного количества периферических NKклеток, составляющего по меньшей мере 100 клеток/мкл или менее, b) исходного уровня экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющего по меньшей мере 60000 ABC или менее, и с) исходного количества периферических Т-клеток, составляющего по меньшей мере 500 клеток/мкл или менее. Результаты показаны на фиг. 8-10. Сравнение PFS пациентов с количествами NK-клеток, составляющими по меньшей мере 100 клеток/мкл, относительно пациентов с более низкими количествами NKклеток показало статистически значимую разницу с HR 0,1561 (р=0,0003 для нескорректированного логрангового критерия). Это дополнительно подтверждает прогностичность количеств NK-клеток при ответе пациентов, получающих лечение с помощью MOR00208, для пациентов с CLL, NHL, ALL или SLL.

Следует понимать, что описание, конкретные примеры и данные с указанием иллюстративных вариантов осуществления приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Различные изменения и модификации в соответствии с настоящим изобретением станут очевидными для специалиста в данной области из рассмотрения, раскрытия и данных, содержащихся в данном документе, и поэтому рассматриваются как часть настоящего изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ идентификации субъекта, имеющего хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL) или острый лимфобластный лейкоз (ALL), который отвечает на лечение антителом к CD19, при этом указанный способ включает:

a) взятие образца крови, полученного от указанного субъекта до лечения указанным антителом к CD19,

b) определение уровня по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце, выбранного из группы, состоящей из:

i) количества периферических NK-клеток и ii) уровней экспрессии CD16 на периферических NK-клетках,

c) сравнение уровня указанного по меньшей мере одного биомаркера в указанном образце с заданным уровнем отсечения, где уровни указанного по меньшей мере одного биомаркера, соответствующие заданному уровню отсечения или превышающие его, указывают на субъекта, который получит пользу от лечения антителом к CD19.
2. Способ по п.1, где заданный уровень отсечения указанного биомаркера представляет собой:

a) исходное количество NK-клеток, составляющее по меньшей мере 50 клеток/мкл, или

b) исходные уровни экспрессии CD16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 ABC (количество связанных антител на клетку).
3. Способ по п.1 или 2, где заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой:

а) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 60 клеток/мкл.
4. Способ по любому из пп.1-3, где заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой: а) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 70 клеток/мкл.
5. Способ по любому из пп.1-4, где заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой: а) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 80 клеток/мкл.
6. Способ по любому из пп.1-5, где заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой:

- 24 040320

а) исходное количество периферических NK-клеток, составляющее по меньшей мере 100 клеток/мкл.
7. Способ по любому из пп.1-6, где заданное отсечение указанного биомаркера представляет собой:

а) исходные уровни экспрессии CD 16 на периферических NK-клетках, составляющие по меньшей мере 60000 ABC.
8. Способ по любому из пп.1-7, где антитело к CD19 содержит область HCDR1, предусматривающую последовательность SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2, предусматривающую последовательность NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3, предусматривающую последовательность GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1, предусматривающую последовательность RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2, предусматривающую последовательность RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), и область LCDR3, предусматривающую последовательность MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).
9. Способ по любому из пп.1-8, где антитело к CD19 содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY

NDGTKYNEKFQGRVTIS SDKSISTAYMELS SLRSEDTAMYYC ARGT YYYGTRVFD Y

WGQGTLVTVSS (SEQ Ш NO: 10) и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью

DIVMTQ SP ATLSLSPGERATLSCRS SKSLQNVNGNT YLYWFQQKPGQ SPQLLIYR

MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQIDNO: И).
10. Способ по любому из пп.1-9, где антитело к CD19 содержит тяжелую цепь с последовательностью EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYND GTKYNEKFQGRVTIS SDKSISTAYMELS SLRSEDTAMYYC ARGT YYYGTRVFD YWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH

TCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTIS

KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ

ID NO: 8) и легкую цепь с последовательностью

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSN

LNSGVPDRF SGSGSGTEFTLTIS SLEPEDF AVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ Ш NO: 9).
11. Способ по любому из пп.1-10, где указанный субъект имеет неходжкинскую лимфому.
12. Способ по п.11, где неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфомы маргинальной зоны, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны.
13. Способ по п.11, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому.
14. Способ по п.11, где неходжкинская лимфома представляет собой фолликулярную лимфому.
15. Способ по п.11, где неходжкинская лимфома представляет собой лимфому маргинальных клеток.
16. Способ по любому из пп.1-10, где указанный субъект имеет хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).
17. Способ по любому из пп.1-10, где указанный субъект имеет мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL).
18. Способ по любому из пп.1-10, где указанный субъект имеет острый лимфобластный лейкоз (ALL).
19. Применение антитела к CD19 для лечения пациента с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), неходжкинской лимфомой (NHL), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой (SLL) или острым

- 25 040320 лимфобластным лейкозом (ALL), идентифицированного в соответствии со способом по любому из пп.1-10.
20. Применение по п.19, где указанный пациент имеет неходжкинскую лимфому.
21. Применение по п.20, где неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфомы маргинальной зоны, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны.
22. Применение по п.20, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому.
23. Применение по п.20, где неходжкинская лимфома представляет собой фолликулярную лимфому.
24. Применение по п.20, где неходжкинская лимфома представляет собой лимфому маргинальных клеток.
25. Применение по п.19, где указанный пациент имеет хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).
26. Применение по п.19, где указанный пациент имеет мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL).
27. Применение по п.19, где указанный пациент имеет острый лимфобластный лейкоз (ALL).
28. Способ лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), неходжкинской лимфомы (NHL), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (SLL) или острого лимфобластного лейкоза (ALL) у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела к CD19, где пациента идентифицируют в соответствии со способом по любому из пп.1-10.
29. Способ по п.28, где указанный пациент имеет неходжкинскую лимфому.
30. Способ по п.29, где неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфомы маргинальной зоны, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны.
31. Способ по п.29, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому.
32. Способ по п.29, где неходжкинская лимфома представляет собой фолликулярную лимфому.
33. Способ по п.29, где неходжкинская лимфома представляет собой лимфому маргинальных клеток.
34. Способ по п.28, где указанный пациент имеет хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).
35. Способ по п.28, где указанный пациент имеет мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL).
36. Способ по п.28, где указанный пациент имеет острый лимфобластный лейкоз (ALL).

-