EA040180B1 - METHOD FOR SEPARATING PROTEIN AND OTHER IMPURITIES AND CAPSULE POLYSACCHARIDES OF MICROORGANISMS - Google Patents
METHOD FOR SEPARATING PROTEIN AND OTHER IMPURITIES AND CAPSULE POLYSACCHARIDES OF MICROORGANISMS Download PDFInfo
- Publication number
- EA040180B1 EA040180B1 EA201792366 EA040180B1 EA 040180 B1 EA040180 B1 EA 040180B1 EA 201792366 EA201792366 EA 201792366 EA 040180 B1 EA040180 B1 EA 040180B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- polysaccharide
- solution
- sio
- protein
- impurities
- Prior art date
Links
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Настоящее изобретение относится к способу отделения белка и прочих примесей от капсульных полисахаридов микроорганизмов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделению капсульных полисахаридов микроорганизмов в чистой форме после удаления белка и прочих примесей.The present invention relates to a method for separating protein and other impurities from capsular polysaccharides of microorganisms. More specifically, the present invention relates to the isolation of capsular polysaccharides of microorganisms in pure form after removal of protein and other impurities.
Уровень техникиState of the art
Вакцины имитируют определенные заболевания, таким образом, заставляя организм запускать механизм защиты для индукции иммунного ответа, который обеспечивает борьбу организма с патогеном. Процесс производства вакцин в частности является чрезвычайно важным на каждой стадии в отношении определения их безопасности для применения у людей. Полисахариды представляют собой углеводы, которые используют во многих вариантах промышленных применений, например, в загустителях, гелеобразующих средствах, эмульгаторах и системах доставки многих коммерческих препаратов. Капсульные полисахариды, которые присутствуют на клетках микроорганизмов, также можно использовать в качестве компонента для иммунизации. При иммунизации при помощи очищенных капсульных полисахаридов в составленной композиции они предотвращают развитие заболеваний, вызываемых такими микроорганизмами как Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae тип b и Salmonella typhi путем индуцирования соответствующего иммунного ответа.Vaccines mimic certain diseases, thus causing the body to launch a defense mechanism to induce an immune response that ensures the body fights the pathogen. The manufacturing process of vaccines in particular is extremely important at every stage in relation to determining their safety for use in humans. Polysaccharides are carbohydrates that are used in many industrial applications, such as thickeners, gelling agents, emulsifiers, and delivery systems for many commercial drugs. Capsular polysaccharides, which are present on the cells of microorganisms, can also be used as a component for immunization. When immunized with the purified capsular polysaccharides in the formulated composition, they prevent the development of diseases caused by microorganisms such as Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae type b and Salmonella typhi by inducing an appropriate immune response.
Конъюгированные вакцины запускают развитие усиленных иммуногенных ответов, включая такие у детей и людей с ослабленным иммунитетом, а также в популяции людей старшего возраста. Полисахарид, конъюгированный с такими белками, как CRM197, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, прочие поверхностные белки, является хорошо зарекомендовавшим себя и высоко иммуногенным. Пневмовакс 23 (Pneumovax 23) представляет собой комбинацию неконъюгированного полисахарида, полученного от различных серотипов пневмококков, Превенар 13 (Prevnar 13) в свою очередь представляет собой тринадцативалентный конъюгированный полисахарид 13 серотипов пневмококка. Конъюгаты белков и полисахаридов эффективно применяют в качестве профилактических средств для лечения менингита, бектериемии, пневмонии, эпиглоттита и т.д.Conjugate vaccines trigger the development of enhanced immunogenic responses, including those in children and immunocompromised people, as well as in the older population. The polysaccharide conjugated to proteins such as CRM 197 , tetanus toxoid, diphtheria toxoid, other surface proteins is well established and highly immunogenic. Pneumovax 23 (Pneumovax 23) is a combination of unconjugated polysaccharide derived from various pneumococcal serotypes, Prevenar 13 (Prevnar 13) in turn is a thirteen-valent conjugated polysaccharide of 13 pneumococcal serotypes. Conjugates of proteins and polysaccharides are effectively used as prophylactic agents for the treatment of meningitis, bacteremia, pneumonia, epiglottitis, etc.
Все подобные иммуногенные препараты или вакцины, апробированные для применения в отношении человека, требуют использования высокоочищенных форм полисахаридов. Капсульные полисахариды присутствуют на наружной поверхности бактериальной клетки. В процессе отделения полисахаридов от клетки имеет место высвобождение таких клеточных компонентов, как нуклеиновая кислота, белки, клеточная стенка и т.д. Процесс выделения/очистки полисахарида включает множество стадий, варьирующих от стадии хроматографии, фильтрации, обработки детергентами, растворителями, энзимами для гидролиза нуклеиновой кислоты, белка, полисахарида и т.д.All such immunogenic preparations or vaccines approved for use in humans require the use of highly purified forms of the polysaccharides. Capsular polysaccharides are present on the outer surface of the bacterial cell. During the separation of polysaccharides from the cell, cellular components such as nucleic acid, proteins, cell wall, etc., are released. The polysaccharide isolation/purification process includes many steps ranging from chromatography, filtration, treatment with detergents, solvents, enzymes to hydrolyze nucleic acid, protein, polysaccharide, etc.
При приготовлении мультивалентных конъюгированных пневмококковых вакцин, действие которых направлено на предотвращение развития инвазивных заболеваний, вызываемых микроорганизмом Streptococcus pneumonia, некоторые серотипы Streptococcus pneumonia выращивают в оптимизированной по составу питательной среде для получения требуемых полисахаридов, необходимых для производства вакцины. Клетки выращивают в крупных ферментерах, при этом в конце ферментации индуцируется лизис путем добавления дезоксихолата натрия (DOC) или альтернативного лизирующего средства. Лизатный бульон далее собирают для последующей очистки и извлечения капсульных полисахаридов, которые окружают бактериальные клетки. Несмотря на то, что клеточный лизат, производимый при помощи данного процесса, содержит целевые полисахариды, также он содержит большое количество клеточного детрита, включая белок, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной стенки и прочие примеси.In the preparation of multivalent pneumococcal conjugate vaccines, whose action is aimed at preventing the development of invasive diseases caused by the microorganism Streptococcus pneumonia, some serotypes of Streptococcus pneumoniae are grown in a nutrient-optimized nutrient medium to obtain the required polysaccharides necessary for the production of the vaccine. Cells are grown in large fermenters, with lysis induced at the end of fermentation by the addition of sodium deoxycholate (DOC) or an alternative lysing agent. The lysate broth is then collected for subsequent purification and recovery of the capsular polysaccharides that surround the bacterial cells. While the cell lysate produced by this process contains the targeted polysaccharides, it also contains a large amount of cell debris, including protein, nucleic acids, cell wall components, and other contaminants.
В следующих ссылках раскрыты различные способы отделения белка и прочих примесей от капсульных полисахаридов.The following references disclose various methods for separating protein and other impurities from capsular polysaccharides.
В заявке IPC OM000237738D (2014) раскрыта очистка пневмококковых полисахаридных антигенов, в которой на хроматографической стадии используют CaptoTM adhere, мультимодальный анионный обменник, который был разработан для замещения стандартной вредной стадии экстракции фенолов.IPC application OM000237738D (2014) discloses a purification of pneumococcal polysaccharide antigens that uses Capto™ adhere, a multimodal anion exchanger, in the chromatographic step that has been developed to replace the conventional detrimental phenol extraction step.
В заявке 1572/MUM/2010 раскрыт способ очистки для отделения белковых примесей от полисахаридных антигенов, который включает: а) получение сырого бактериального полисахарида из лизированного бульона; b) подвергание сырого полисахарида процессам концентрации и диафильтрации; с) обработку раствора, включающего полисахарид, нуклеазой; d) обработку обработанного нуклеазой раствора полисахарида смесью детергента и физиологического раствора; е) коррекцию рН между 6,1 и 6,3 и инкубирование смеси при температуре от 2 до 8°С в течение периода времени от 10 до 14 ч; f) подвергание полисахаридного раствора центрифугированию с последующей диафильтрацией; g) проведение хроматографии раствора, где указанный процесс приводит к уменьшению содержания белка.Application 1572/MUM/2010 discloses a purification method for separating protein contaminants from polysaccharide antigens, which includes: a) obtaining crude bacterial polysaccharide from lysed broth; b) subjecting the crude polysaccharide to concentration and diafiltration processes; c) treating the solution containing the polysaccharide with a nuclease; d) treating the nuclease-treated polysaccharide solution with a mixture of detergent and saline; f) adjusting the pH between 6.1 and 6.3 and incubating the mixture at 2 to 8° C. for a period of 10 to 14 hours; f) subjecting the polysaccharide solution to centrifugation followed by diafiltration; g) carrying out chromatography of the solution, where the specified process leads to a decrease in protein content.
В заявке US 4242501 раскрыт способ получения очищенного капсульного полисахарида, который включает одно или два осаждения спиртом.US 4,242,501 discloses a process for preparing a purified capsular polysaccharide that includes one or two alcohol precipitations.
В заявке US 5714354 описан способ очистки пневмококкового полисахарида без применения спирта при помощи катионных детергентов.US Pat. No. 5,714,354 describes a process for purifying pneumococcal polysaccharide without the use of alcohol using cationic detergents.
В заявке US 5847112 раскрыт способ получения измельченных капсульных полисахаридов Streptococcus pneumoniae серотипа 6В, имеющих пониженную полидисперсность, который включает уменьшение размера сырого капсульного полисахарида серотипа 6В путем подвергания капсульного полисахари- 1 040180 да обработке с измельчением, выбираемой из группы, состоящей из термической обработки, ультразвуковой обработки, химического гидролиза, обработки эндолитическими ферментами и физического измельчения.US Pat. No. 5,847,112 discloses a process for the preparation of reduced polydispersity milled serotype 6B Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides, which comprises reducing the size of the crude serotype 6B capsular polysaccharide by subjecting the capsular polysaccharide to a grinding treatment selected from the group consisting of heat treatment, ultrasonic processing, chemical hydrolysis, processing with endolytic enzymes and physical grinding.
В заявке WO 2006/082527 А2 раскрыт процесс очистки капсульного полисахарида S. agalactiae, при котором сахарид изначально обрабатывают водной смесью спирта и соли кальция, после чего подвергают осаждению при помощи катионного детергента.WO 2006/082527 A2 discloses a process for purifying S. agalactiae capsular polysaccharide in which the saccharide is initially treated with an aqueous mixture of alcohol and calcium salt and then precipitated with a cationic detergent.
В заявке WO 2008/045852 А2 описан процесс очистки пневмококкового полисахарида серотипа 3, при котором используют нагревание и процесс осаждения при низком рН.WO 2008/045852 A2 describes a process for purifying pneumococcal polysaccharide serotype 3 using heat and a low pH precipitation process.
В заявке WO 2012/127485 А1 раскрыт способ очистки пневмококковых полисахаридов без использования спирта и цетилтриметиламмония бромида (СТАВ), в котором применяют хроматографическое разделение C-Ps от полисахаридов (PnPs) на основании различий в их суммарных поверхностных зарядах.WO 2012/127485 A1 discloses a method for purifying pneumococcal polysaccharides without the use of alcohol and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), which uses the chromatographic separation of C-Ps from polysaccharides (PnPs) based on differences in their net surface charges.
Тем не менее, в перечисленных выше ссылках на известный уровень техники раскрыты хроматография, осаждение при низком рН, спиртовое осаждение, процессы без использования спирта и т.д. для удаления примесей, которые являются длительными и требуют нескольких стадий обработки. Некоторых из них демонстрируют минимальное уменьшение количества примесей с последующими трудностями в удалении растворимых белков для соответствия требованиям для очищенных полисахаридов и, таким образом, существует высокая нагрузка при удалении загрязняющего растворимого белка в частности для определенных серотипов. Фенол является токсичным, а методы хроматографии требуют больше технических составляющих и использования дорогостоящих смол, что делает процесс неэкономичным с финансовой точки зрения. Таким образом, существует потребность в разработке улучшенных способов удаления белковых примесей из сложных клеточных лизатов.However, the prior art references listed above disclose chromatography, low pH precipitation, alcohol precipitation, alcohol-free processes, and the like. to remove impurities that are long lasting and require multiple processing steps. Some of them show minimal impurity reduction with consequent difficulty in removing soluble proteins to meet the requirements for purified polysaccharides and thus there is a high burden in removing contaminating soluble protein in particular for certain serotypes. Phenol is toxic, and chromatography methods require more technical inputs and the use of expensive resins, making the process uneconomical from a financial point of view. Thus, there is a need to develop improved methods for removing protein contaminants from complex cell lysates.
Авторы настоящего изобретения на протяжении предпринимаемых ими продолжительных попыток разработать простой, эффективный способ, масштаб которого можно было бы легко увеличить, обнаружили, что в случае, если раствор, содержащий полисахарид и прочие примеси, подвергают действию SiO2, конечный раствор будет высокообогащенным полисахаридами при пониженном содержания белка и прочих примесей.The inventors of the present invention, during their long efforts to develop a simple, effective method, which could be easily scaled up, found that if a solution containing a polysaccharide and other impurities is exposed to SiO 2 , the final solution will be highly enriched in polysaccharides at reduced protein content and other impurities.
Цель изобретенияPurpose of the invention
Целью настоящего изобретения является разработка улучшенного способа очистки полисахаридов при снижении содержания белка и прочих примесей, масштаб которого можно легко увеличить.The aim of the present invention is to provide an improved method for purifying polysaccharides while reducing protein and other impurities, which can be easily scaled up.
Другой целью настоящего изобретения является разработка улучшенного простого и эффективного способа очистки полисахарида.Another object of the present invention is to provide an improved, simple and efficient method for purifying a polysaccharide.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу выделения полисахарида практически в чистой форме, который включает подвергание действию или контактирование раствора, включающего полисахарид, белок, нуклеиновую кислоту, компоненты клеточной стенки и прочие примеси, с SiO2 (диоксид кремния), а также выделение полисахарида из смеси белка, нуклеиновой кислоты, полисахарида клеточной стенки и прочих материалов, полученных из клетки.Accordingly, the present invention relates to a method for isolating a polysaccharide in substantially pure form, which includes exposing or contacting a solution comprising the polysaccharide, protein, nucleic acid, cell wall components and other impurities with SiO2 (silicon dioxide), and isolating the polysaccharide from the mixture protein, nucleic acid, cell wall polysaccharide and other materials derived from a cell.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1: Сравнительное содержание белковых примесей различных пневмококковых серотипов перед обработкой SiO2 и после обработки.Fig. 1: Comparative content of protein impurities of different pneumococcal serotypes before and after treatment with SiO 2 .
Фиг. 2: Результаты электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС-ПААГ, SDS-PAGE) для пневмококкового полисахарида серотипа 18С; снижение содержания белка перед обработкой SiO2 и после обработки.Fig. 2: Results of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (DNS-PAGE, SDS-PAGE) for pneumococcal polysaccharide serotype 18C; reduction in protein content before and after treatment with SiO2.
Фиг. 3: Результаты электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС-ПААГ, SDS-PAGE) для пневмококкового полисахарида серотипа 23F; снижение содержания белка перед обработкой SiO2 и после обработки.Fig. 3: Results of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (DNS-PAGE, SDS-PAGE) for pneumococcal polysaccharide serotype 23F; reduction in protein content before and after treatment with SiO2.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Настоящее изобретение относится к способу выделения полисахарида, где источником полисахарида являются бактерии, дрожжевые грибы, нитчатые грибы, клетки водорослей или растений и т.п., который включает подвергание раствора, включающего полисахарид, воздействию SiO2 и в случае необходимости других средств. Конечный раствор после воздействия SiO2 и разделения остается обогащенным полисахаридом и содержит пониженное количество одной или более примесей, таких как белок, нуклеиновая кислота, полисахарид клеточной стенки и прочие материалы, полученные из клеток.The present invention relates to a method for isolating a polysaccharide, where the source of the polysaccharide is bacteria, yeasts, filamentous fungi, algae or plant cells, etc., which includes exposing the solution containing the polysaccharide to SiO 2 and, if necessary, other means. The final solution after exposure to SiO 2 and separation remains enriched in polysaccharide and contains a reduced amount of one or more impurities such as protein, nucleic acid, cell wall polysaccharide and other materials derived from cells.
Полисахариды, полученные в соответствии с настоящим изобретением, находятся в практически чистой форме.The polysaccharides obtained in accordance with the present invention are in substantially pure form.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способам уменьшения содержания или удаления белковых примесей из комплексного клеточного лизата или фильтрата Streptococcus pneumonia, включающего один или более серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19F, 19А, 20, 22F, 23F и 33F полисахаридов.In a preferred embodiment, the invention relates to methods for reducing or removing protein contaminants from a Streptococcus pneumonia complex cell lysate or filtrate comprising one or more serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F and 33F polysaccharides.
В варианте осуществления используемый SiO2 находится в различных формах/имеет различный размер частиц, например, находится в форме мелкодисперсных частиц в диапазоне от 0,01 до 200 мкм,In an embodiment, the SiO 2 used is in various forms/particle sizes, e.g. in the form of fine particles ranging from 0.01 to 200 µm,
- 2 040180 предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 40 мкм. Количество используемого SiO2 может варьироваться от 0,5 до 20% (мас./об.). Используемый SiO2 может быть в случае необходимости приготовлен путем нагревания свыше 60°С и охлаждения по меньшей мере в течение одного часа перед использованием. Используемый SiO2 может быть пирогенизированным или депирогенизированным.- 2 040180 is preferably in the range from 3 to 40 microns. The amount of SiO2 used can vary from 0.5 to 20% (w/v). The SiO 2 used may optionally be prepared by heating above 60° C. and cooling for at least one hour before use. The SiO2 used may be pyrogenated or depyrogenated.
В еще одном варианте осуществления прочие средства, используемые для процесса очистки полисахарида, можно выбирать из хлорида натрия, сульфата аммония и тому подобных, в концентрации по меньшей мере 0,1% (мас./об.), или органических растворителей, таких как спирты, в концентрации по меньшей мере 2% (об.%). Другое средство можно использовать для дополнительного уменьшения содержания примесей и обогащения раствора полисахаридом.In yet another embodiment, other agents used for the polysaccharide purification process may be selected from sodium chloride, ammonium sulfate, and the like, at a concentration of at least 0.1% (w/v), or organic solvents such as alcohols , at a concentration of at least 2% (vol.%). Another agent can be used to further reduce impurities and enrich the solution with polysaccharide.
В другом варианте осуществления рН раствора можно поддерживать в диапазоне от кислотного до щелочного, предпочтительно от 3,0 до 9,0. рН можно корректировать, используя кислоты, такие как уксусная кислота, фосфорная, муравьиная кислота, соляная кислота и тому подобные, а также щелочи, такие как гидроксид натрия, калия или аммония и тому подобные.In another embodiment, the pH of the solution can be maintained in the range from acidic to basic, preferably from 3.0 to 9.0. The pH can be adjusted using acids such as acetic acid, phosphoric, formic acid, hydrochloric acid and the like, as well as alkalis such as sodium, potassium or ammonium hydroxide and the like.
В другом варианте осуществления контакт или воздействие SiO2 на раствор, включающий полисахарид и прочие примеси, осуществляют при температуре в диапазоне от 15 до 60°С в течение периода времени от 10 мин до 16 ч.In another embodiment, the contact or exposure of SiO 2 to a solution containing a polysaccharide and other impurities is carried out at a temperature in the range from 15 to 60 ° C for a period of time from 10 minutes to 16 hours.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает обработку полисахаридного раствора активированным углем для удаления цвета и прочих примесей. Данную обработку проводят перед воздействием SiO2 или после воздействия SiO2.In another embodiment, the present invention includes treating the polysaccharide solution with activated charcoal to remove color and other impurities. This treatment is carried out before exposure to SiO 2 or after exposure to SiO 2 .
Полисахариды, очищенные при помощи способов, описанных в настоящем изобретении, можно использовать для различных вариантов применения, например, в косметической, пищевой, фармацевтической и биофармацевтической промышленности.Polysaccharides purified using the methods described in the present invention can be used for various applications, for example, in the cosmetic, food, pharmaceutical and biopharmaceutical industries.
В рамках изобретения, термин практически чистая форма относится к полисахаридному лизату или фильтрату, из которого было удалено по меньшей мере 30% белка по сравнению с концентрацией белка в лизате или фильтрате до воздействия SiO2. Способы количественного определения концентрации белка в клеточном лизате или фильтрате хорошо известны в области техники и включают, например, биохимические способы, такие как метод Брэдфорда, метод определения белка при помощи бицинхониновой кислоты (ВСА), метод Лоури, методы анализа, такие как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС-ПААГ), хроматография и электрофорез (см., например, Deutscher, M. P. (ed.), Guide to Protein Purification, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)).Within the scope of the invention, the term substantially pure form refers to a polysaccharide lysate or filtrate from which at least 30% protein has been removed compared to the protein concentration in the lysate or filtrate prior to exposure to SiO2. Methods for quantifying protein concentration in a cell lysate or filtrate are well known in the art and include, for example, biochemical methods such as the Bradford method, the bicinchoninic acid (BCA) protein method, the Lowry method, analysis methods such as polyacrylamide electrophoresis. gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (DNS-PAGE), chromatography and electrophoresis (see, for example, Deutscher, M. P. (ed.), Guide to Protein Purification, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)).
Изобретение также относится к способу очистки капсульного сахарида от бактерий, где (а) выход способа составляет по меньшей мере 10% и (b) относительная чистота сахарида составляет приблизительно 30%.The invention also relates to a process for purifying a capsular saccharide from bacteria, wherein (a) the yield of the process is at least 10% and (b) the relative purity of the saccharide is approximately 30%.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выделения полисахарида в чистой форме, который включает:In another embodiment, the present invention relates to a method for isolating a polysaccharide in pure form, which includes:
i) воздействие на раствор, включающий полисахарид, белок, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной стенки и прочие примеси, SiO2, ii) выделение полисахаридного раствора в чистой форме и iii) отделение частиц кремния от полисахарида при помощи фильтрации или при помощи центрифугирования.i) exposing a solution including polysaccharide, protein, nucleic acids, cell wall components and other impurities, SiO2, ii) separating the polysaccharide solution in pure form, and iii) separating the silicon particles from the polysaccharide by filtration or by centrifugation.
Концентрация полисахарида, полученного способом согласно настоящему изобретению, может составлять от 0,1 до более 10 мг/мл.The concentration of the polysaccharide obtained by the method according to the present invention may be from 0.1 to more than 10 mg/ml.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выделения полисахарида в чистой форме, который включает:In another embodiment, the present invention relates to a method for isolating a polysaccharide in pure form, which includes:
i) получение полисахаридного раствора, включающего полисахарид, белок, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной стенки и прочие примеси, ii) обработку полисахаридного раствора детергентом для удаления нуклеиновой кислоты и прочих примесей, iii) получение суспензии SiO2 в воде или буфере, iv) добавление суспензии SiO2 к полисахаридному раствору, полученному на стадии (i), иi) preparing a polysaccharide solution including polysaccharide, protein, nucleic acids, cell wall components and other impurities, ii) treating the polysaccharide solution with a detergent to remove the nucleic acid and other impurities, iii) preparing a suspension of SiO2 in water or buffer, iv) adding a suspension of SiO 2 to the polysaccharide solution obtained in step (i), and
v) выделение полисахаридного раствора в чистой форме.v) isolating the polysaccharide solution in pure form.
Буферы, используемые в настоящем изобретении для выделения полисахарида, включают натрийфосфатный буфер, калий-фосфатный буфер, Трис-буфер и т.д.Buffers used in the present invention for isolating the polysaccharide include sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, Tris buffer, and the like.
Белки имеют гидрофильные поверхности и гидрофобные карманы. При инкубировании полисахаридных составов с диоксидом кремния белковые примеси связываются с диоксидом кремния и отделяются от полисахарида при помощи гидрофильного или гидрофобного механизма, или при помощи механизма простой адсорбции.Proteins have hydrophilic surfaces and hydrophobic pockets. When polysaccharide formulations are incubated with silica, protein contaminants bind to the silica and are separated from the polysaccharide by a hydrophilic or hydrophobic mechanism, or by a simple adsorption mechanism.
Детергенты, используемые в настоящем изобретении, включают СТАВ (цетилтриметиламмония бромид), цетримония хлорид, бензетония хлорид и т.д.Detergents used in the present invention include CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), cetrimonium chloride, benzethonium chloride, etc.
Термины подвергается воздействию или контактирует означают инкубирование полисахаридного состава с другими компонентами для обработки, например, для удаления примесей с целью получе- 3 040180 ния чистого полисахарида.The terms exposed or contacted mean the incubation of the polysaccharide composition with other components for processing, for example, to remove impurities in order to obtain a pure polysaccharide.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу выделения полисахарида в чистой форме, который включает:In a preferred embodiment, the present invention relates to a method for isolating a polysaccharide in pure form, which includes:
i) получение полисахаридного раствора, включающего пневмококковый капсульный полисахарид, белок, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной стенки и прочие примеси, где рН раствора поддерживается в диапазоне от 3,0 до 9,0, ii) в случае необходимости добавление другого реагента, iii) в случае необходимости обработку раствора активированным углем, iv) получение суспензии SiO2 с частицами, размеры которых варьируются от 0,01 до 200 мкм, в воде или буфере,i) obtaining a polysaccharide solution comprising pneumococcal capsular polysaccharide, protein, nucleic acids, cell wall components and other impurities, where the pH of the solution is maintained in the range from 3.0 to 9.0, ii) if necessary, adding another reagent, iii) in if necessary, treating the solution with activated carbon, iv) obtaining a suspension of SiO2 with particles ranging in size from 0.01 to 200 µm in water or buffer,
v) добавление суспензии SiO2 к полисахаридному раствору, полученному на стадии (i), при температуре в диапазоне от 15 до 60°С в течение периода времени от 10 мин до 20 ч, vi) в случае необходимости обработку раствора активированным углем, vii) в случае необходимости добавление другого реагента и viii) выделение полисахаридного раствора в чистой форме.v) adding the suspension of SiO 2 to the polysaccharide solution obtained in step (i) at a temperature in the range from 15 to 60°C for a period of time from 10 minutes to 20 hours, vi) if necessary, treatment of the solution with activated carbon, vii) adding another reagent if necessary; and viii) isolating the polysaccharide solution in pure form.
Прочие реагенты можно выбирать из хлорида натрия, сульфата аммония, спирта и т.п., а также из смеси вышеперечисленных веществ.Other reagents can be selected from sodium chloride, ammonium sulfate, alcohol, and the like, as well as from a mixture of the above substances.
Очищенный капсульный полисахарид по изобретению можно использовать в качестве иммуногена с дальнейшей модификацией или без нее с целью применения для иммунизации. С целью иммунизации предпочтительно конъюгировать сахарид с молекулой-носителем, такой как белок.The purified capsular polysaccharide of the invention can be used as an immunogen with or without further modification for use in immunization. For the purpose of immunization, it is preferable to conjugate the saccharide to a carrier molecule such as a protein.
Предпочтительные белки-носители представляют собой бактериальные токсины или анатоксины, такие как дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин или мутантный дифтерийный токсин CRM197 и т.д.Preferred carrier proteins are bacterial toxins or toxoids such as diphtheria toxoid or tetanus toxoid or CRM197 mutant diphtheria toxin, etc.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей капсульный полисахарид, полученный в соответствии с настоящим изобретением, в конъюгации с белком-носителем, выбираемым из дифтерийного анатоксина или столбнячного анатоксина или CRM197.In another embodiment, the present invention relates to an immunogenic composition comprising a capsular polysaccharide obtained in accordance with the present invention, in conjugation with a carrier protein selected from diphtheria toxoid or tetanus toxoid or CRM197.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей капсульные полисахариды от одного или более серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19F, 19А, 20, 22F, 23F и 33F, конъюгированные с белком-носителем CRM197.In another preferred embodiment, the present invention relates to an immunogenic composition comprising capsular polysaccharides from one or more serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14 , 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F and 33F conjugated to the carrier protein CRM197.
Некоторые широко распространенные товарные наименования SiO2 (диоксида кремния), имеющегося в продаже, которые представляют собой Aerosil®, Aeroperl®, можно использовать в настоящем изобретении.Some of the commonly used trade names of SiO 2 (silicon dioxide) commercially available, which are Aerosil®, Aeroperl®, can be used in the present invention.
Полисахаридный раствор, включающий полисахарид, белок, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной стенки и прочие примеси, можно изготавливать при помощи любых способов, известных в области техники.The polysaccharide solution, including the polysaccharide, protein, nucleic acids, cell wall components, and other impurities, can be made using any of the methods known in the art.
Выделение капсульного полисахарида в чистой форме после воздействия или контактирования с SiO2, проводится при помощи стандартных способов.Isolation of the capsular polysaccharide in pure form after exposure to or contact with SiO2 is carried out using standard methods.
Настоящее изобретение более конкретно иллюстрируется на основании примеров, приведенных далее. Тем не менее, следует понимать, что примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом.The present invention is more specifically illustrated based on the examples below. However, it should be understood that the examples do not limit the present invention in any way.
Пример 1.Example 1
В ферментативном бульоне Streptococcus pneumoniae клеточный лизис проводят путем добавления дезоксихолата (от 0,005 до 2%). После добавления дезоксихолата ферментативный бульон подвергают центрифугированию при 10000-15000 g и производят сбор надосадочной жидкости. рН надосадочной жидкости корректируют при помощи кислот, таких как ортофосфорная кислота, соляная кислота и т.д. до рН 4-6 и инкубируют в течение периода времени от 3 ч до ночи. рН некоторых серотипов снова корректируют до нейтральных значений и нагревают до 60°С в течение периода времени от 10 до 150 мин. После центрифугирования полисахарида при 10000-15000g осадок удаляют. Дополнительно очищают надосадочную жидкость путем пропускания ее через глубинный фильтр или фильтр от 0,22 до 0,45 мкм. Проводят концентрирование фильтрата в 4-15 раз на ультрафильтрационной мембране от 30 до 300 кДа. Буфер, в котором находится концентрат, заменяют 4-12 объемами фосфатного буфера. К концентрированному полисахариду с замененным буфером добавляют СТАВ, т.е. от 0,2 до 5%, инкубируют в течение периода времени от 2 ч до ночи при температуре от 4 до 40°С. Хлорид натрия добавляют к некоторым полисахаридам перед добавлением СТАВ в диапазоне от 0,05 до 2 моль.In Streptococcus pneumoniae fermentation broth, cell lysis is carried out by adding deoxycholate (0.005 to 2%). After adding deoxycholate, the fermentation broth is subjected to centrifugation at 10000-15000 g and the supernatant is collected. The pH of the supernatant is adjusted with acids such as phosphoric acid, hydrochloric acid, etc. to pH 4-6 and incubated for a period of time from 3 h to night. The pH of some serotypes is again adjusted to neutral values and heated to 60° C. for a period of 10 to 150 minutes. After centrifugation of the polysaccharide at 10000-15000g, the precipitate is removed. Additionally, the supernatant is purified by passing it through a depth filter or a filter from 0.22 to 0.45 µm. The filtrate is concentrated 4-15 times on an ultrafiltration membrane from 30 to 300 kDa. The buffer containing the concentrate is replaced with 4-12 volumes of phosphate buffer. CTAB is added to the buffer exchanged concentrated polysaccharide, i.e. from 0.2 to 5%, incubated for a period of time from 2 h to night at a temperature of from 4 to 40°C. Sodium chloride is added to some polysaccharides before adding CTAB in the range of 0.05 to 2 mol.
После обработки СТАВ осадок разделяют при помощи процесса центрифугирования при 1000015000g. Надосадочную жидкость пропускают через угольную колонку/фильтры. Активированный диоксид кремния добавляют к отфильтрованному через уголь полисахариду в диапазоне от 3 до 10% (мас./об.) и добавляют NaCl в количестве от 0,5 до 3 моль. Приготовление полисахарида включает воздействие на него диоксидом кремния в течение периода времени от 2 до 26 ч при температуре от 5 доAfter treatment with CTAB, the precipitate is separated by a centrifugation process at 1000015000g. The supernatant is passed through a carbon column/filters. Activated silica is added to the carbon-filtered polysaccharide in the range of 3 to 10% (w/v) and NaCl is added in an amount of 0.5 to 3 mol. The preparation of the polysaccharide involves exposing it to silica for a period of 2 to 26 hours at a temperature of 5 to
- 4 040180- 4 040180
40°С. Диоксид кремния отделяют от полисахаридного раствора при помощи центрифугирования/тканевой фильтрации/мешочного фильтра. Фильтрат пропускают через глубинный фильтр, угольный фильтр и фильтр от 0,22 до 5 мкм. Отфильтрованный полисахарид концентрируют и подвергают диафильтрации на мембране от 10 до 500 кДа. Буфер, в котором находится концентрат полисахарида, заменяют на фосфатный буфер или воду для инъекции (WFI). Очищенный полисахаридный состав пропускают через 0,22 мкм фильтр и собираются в пакет ПВД (полиэтилен высокого давления) под LAFU. Очищенный полисахарид хранят при температуре > - 20°С.40°C. The silica is separated from the polysaccharide solution by centrifugation/fabric filtration/bag filter. The filtrate is passed through a depth filter, a carbon filter and a 0.22 to 5 µm filter. The filtered polysaccharide is concentrated and subjected to diafiltration on a membrane from 10 to 500 kDa. The buffer containing the polysaccharide concentrate is replaced with phosphate buffer or water for injection (WFI). The purified polysaccharide composition is passed through a 0.22 µm filter and collected in a LDPE bag under LAFU. The purified polysaccharide is stored at >-20°C.
Таблица 1. Удаление белка различных пневмококковых полисахаридовTable 1. Protein removal of various pneumococcal polysaccharides
BDL: ниже предела обнаруженияBDL: below detection limit
Данный вариант осуществления описывает влияние депирогенизации на удаление примесей из полисахаридного состава. Как отображено в табл. 2, белковые примеси удаляются как депирогенизированным, так и пирогенизированным SiO2. Таким образом, для удаления примесей можно использовать как депирогенизированный, так и пирогенизированный SiO2.This embodiment describes the effect of depyrogenation on the removal of impurities from a polysaccharide composition. As shown in Table. 2, protein impurities are removed with both depyrogenated and pyrogenated SiO 2 . Thus, both depyrogenated and pyrogenated SiO 2 can be used to remove impurities.
Таблица 2. Влияние депирогенизации aeroeprl® на удаление белка из различных пневмококковых полисахаридовTable 2 Effect of aeroeprl® depyrogenation on protein removal from various pneumococcal polysaccharides
BDL: ниже предела обнаруженияBDL: below detection limit
Условия: Aeroperl® 5% (мас./об.), NaCl 1 моль, инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч.Conditions: Aeroperl® 5% (w/v), NaCl 1 mol, incubation at room temperature for 1 hour.
Можно использовать Aerosil® концентрацией в диапазоне от 0,1 до 10% или более высоких концентраций. Белок полностью удаляется путем обработки SiO2 в течение периода времени от 1 до более 17 ч. Удаление примесей можно улучшить путем добавления NaCl к суспензии SiO2.You can use Aerosil® concentration in the range from 0.1 to 10% or higher concentrations. The protein is completely removed by treatment with SiO 2 for a period of time from 1 to more than 17 hours. Impurity removal can be improved by adding NaCl to the SiO 2 slurry.
Таблица 3. Влияние концентрации Aerosil® на удаление белка полисахарида пневмококка серотипа 6В.Table 3 Effect of Aerosil® concentration on pneumococcal serotype 6B polysaccharide protein removal.
BDL: ниже предела обнаруженияBDL: below detection limit
Условия: NaCl 1 моль; инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч.Conditions: NaCl 1 mol; incubation at room temperature for 1 hour.
Данный вариант осуществления также подтверждает, что депирогенизированный aeroeprl® может эффективно удалять белок в присутствии NaCl в диапазоне от 0,1 до 2,5 моль или выше. Можно исполь- 5 040180 зовать частицы SiO2 в диапазоне размеров от 0,1 мкм до сотен микрон.This embodiment also confirms that depyrogenated aeroeprl® can effectively remove protein in the presence of NaCl in the range of 0.1 to 2.5 mol or higher. SiO2 particles can be used in the size range from 0.1 µm to hundreds of microns.
Таблица 4. Влияние концентрации aeroperl на удаление белка полисахарида пневмококка, серотип 6ВTable 4. Effect of aeroperl concentration on removal of pneumococcal polysaccharide protein, serotype 6B
BDL: ниже предела обнаруженияBDL: below detection limit
Условие: NaCl 1 моль, инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч.Condition: NaCl 1 mol, incubation at room temperature for 1 hour.
Ферментативный бульон содержит определенное количество загрязняющих веществ. Эти загрязняющие вещества можно удалить при помощи ряда действий, таких как центрифугирование, осаждение, хроматография и т.д.The fermentation broth contains a certain amount of contaminants. These contaminants can be removed by a number of steps such as centrifugation, precipitation, chromatography, etc.
Настоящее изобретение осуществляется в небольших масштабах (50-100 мл) и полупромышленных масштабах (15 л). В случае обоих объемов полисахарида загрязняющие вещества эффективно удаляются различными формами SiO2 (табл. 5 и фиг. 1). Обработку SiO2 можно проводить на различных стадиях очистки полисахарида. Далее частицы SiO2 можно отделять при помощи простого центрифугирования или фильтрации или при помощи любого другого метода, такого как физическое осаждение, осаждение давлением и т.д.The present invention is carried out on a small scale (50-100 ml) and semi-industrial scale (15 L). In the case of both volumes of polysaccharide, contaminants are effectively removed by various forms of SiO2 (Table 5 and Fig. 1). SiO2 treatment can be carried out at various stages of purification of the polysaccharide. Further, the SiO2 particles can be separated by simple centrifugation or filtration, or by any other method such as physical precipitation, pressure precipitation, etc.
Таблица 5. Уменьшение содержания белковых примесей при помощи применения aeroperl в полисахаридах пневмококкаTable 5. Reduction of protein contaminants by the use of aeroperl in pneumococcal polysaccharides
BDL: ниже предела обнаруженияBDL: below detection limit
Условия: Aeroperl: 5% (мас./об.), NaCl 1 моль, инкубирование при комнатной температуре в течение 1 чConditions: Aeroperl: 5% (w/v), NaCl 1 mol, incubation at room temperature for 1 hour
Таблица 6А. Удаление белковых примесей капсульного полисахарида различных серотипов ПневмококкаTable 6A. Removal of protein impurities of the capsular polysaccharide of various serotypes of Pneumococcus
Перед: Перед обработкой aeroperl;Before: Before processing with aeroperl;
После: После обработки aeroperlAfter: After processing by aeroperl
Условие: Aeroperl 5% (мас./об.), NaCl 1 моль, инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч.Condition: Aeroperl 5% (w/v), NaCl 1 mol, incubation at room temperature for 1 hour.
- 6 040180- 6 040180
Таблица 6В. Удаление белковых примесей капсульного полисахарида различных серотипов ПневмококкаTable 6B. Removal of protein impurities of the capsular polysaccharide of various serotypes of Pneumococcus
BDL: ниже предела обнаруженияBDL: below detection limit
Перед: Перед обработкой aeroperl;Before: Before processing with aeroperl;
После: После обработки aeroperlAfter: After processing by aeroperl
ND: Не обнаруженоND: Not found
Условие: Aeroperl 5% (мас./об.)/ NaCl 1 моль, инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч.Condition: Aeroperl 5% (w/v) / NaCl 1 mol, incubation at room temperature for 1 hour.
Предел загрязняющих веществ был установлен для очищенного полисахарида каждого серотипа с целью уменьшения риска развития нежелательных явлений, связанных с введением вакцины. Одним из загрязняющих веществ является полисахарид клеточной стенки (CWPS). Настоящее изобретение взяло на себя заботу о CWPS. CWPS удаляется при комнатной температуре при помощи простого смешивания с последующим разделением SiO2 и полисахаридного образца. Время контакта полисахаридного образца с SiO2 может варьироваться от 10 мин до более 18 ч (табл. 7).A contaminant limit has been set for the purified polysaccharide of each serotype in order to reduce the risk of vaccine-related adverse events. One contaminant is cell wall polysaccharide (CWPS). The present invention has taken care of the CWPS. CWPS is removed at room temperature by simple mixing followed by separation of the SiO2 and polysaccharide sample. The contact time of the polysaccharide sample with SiO2 can vary from 10 min to more than 18 h (Table 7).
Таблица 7. Удаление полисахарида клеточной стенки (CWPS) от полисахаридов пневмококка различных серотиповTable 7. Removal of cell wall polysaccharide (CWPS) from pneumococcal polysaccharides of various serotypes
Условия: Aerosil 5% (мас./об.), NaCl 1 моль;Conditions: Aerosil 5% (w/v), NaCl 1 mol;
инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч.incubation at room temperature for 1 hour.
Удаление белковых примесей можно визуализировать при помощи ДНС-ПААГ. Содержание белковых примесей полисахарида пневмококка серотипов 18С и 23F было снижено до предела спецификации. Как отображено на фиг. 2 и 3, полное удаление белка можно наблюдать на линии 2 и 3. Результаты представлены в табл. 8.Removal of protein contaminants can be visualized using DNS-PAGE. The content of protein impurities of pneumococcal polysaccharide serotypes 18C and 23F was reduced to the specification limit. As shown in FIG. 2 and 3, complete removal of the protein can be observed in lines 2 and 3. The results are presented in table. 8.
Таблица 8. Концентрация белка перед и после обработки aeroperl® (фиг. 2 и 3)Table 8. Protein concentration before and after treatment with aeroperl® (FIGS. 2 and 3)
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM
Claims (12)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN2161/CHE/2015 | 2015-04-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA040180B1 true EA040180B1 (en) | 2022-04-27 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11680111B2 (en) | Method for separation of protein and other impurities from microbial capsular polysaccharides | |
CN104487086B (en) | Non-animal derived nonalcoholic vaccine composition and preparation method thereof | |
CN110831980B (en) | Process for removing impurities from bacterial capsular polysaccharide based formulations | |
Morais et al. | Purification of capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: traditional and new methods | |
CN101724085B (en) | Method for purifying capsular polysaccharide | |
US20100129881A1 (en) | Antigenic Polysaccharides and Process For Their Preparation | |
CN107961369B (en) | Multivalent meningococcal conjugate vaccine and preparation method thereof | |
HU200194B (en) | Process for removal of pertussis endotoxin | |
EA040180B1 (en) | METHOD FOR SEPARATING PROTEIN AND OTHER IMPURITIES AND CAPSULE POLYSACCHARIDES OF MICROORGANISMS | |
OA18456A (en) | Method for separation of protein and other impurities from microbial capsular polysaccharides | |
ES2942133T3 (en) | Streptococcal capsular polysaccharide purification | |
WO2024062494A1 (en) | Method for the purification of capsular polysaccharides | |
RU2407792C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING IgAl-PROTEASE FROM SEROGROUP A NEISSERIA MENINGITIDIS AND RELATED IMMUNOGENIC PREPARATION | |
CN106109486A (en) | A kind of compositions and preparation method and application | |
BR112020000229A2 (en) | purification of polysaccharides for vaccine production using lytic enzymes, tangential flow filtration and multimodal chromatography |