EA040179B1

EA040179B1 - METHOD FOR PURIFICATION OF FVIII OR ITS VARIANT WITH REMOVED DOMAIN B FROM IN VITRO CELL CULTURE

Info

Publication number: EA040179B1
Application number: EA201990926
Authority: EA
Inventors: Том Джонстон; Айан Гарнер (умер)
Original assignee: Профактор Фарма Лтд
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2022-04-27

Description

Область изобретенияField of invention

Изобретение относится к очистке рекомбинантного фактора свертывания крови VIII (FVIII) от культуры in vitro с использованием хроматографических приемов.The invention relates to the purification of recombinant blood coagulation factor VIII (FVIII) from an in vitro culture using chromatographic techniques.

Предпосылки изобретенияBackground of the invention

FVIII представляет собой большой сложный гликопротеин. Он синтезируется в виде белка 330 кДа с доменной структурой A1-A2-B-A3-C1-C2, где домены A и С имеют внутреннюю гомологию последовательностей и приблизительно 40% идентичность последовательностей с доменами A и С фактора V. Домен B, который составляет 38% от всей последовательности, не обладает идентичностью последовательностей с другими известными белками, включая домен В фактора V. Однако он сильно гликозилирован и содержит 19 из 26 аспарагиновых (К)-связанных участков гликозилирования во всей молекуле.FVIII is a large complex glycoprotein. It is synthesized as a 330 kDa protein with an A1-A2-B-A3-C1-C2 domain structure, where the A and C domains share internal sequence homology and approximately 40% sequence identity with the Factor V A and C domains. The B domain, which constitutes 38% of the entire sequence does not share sequence identity with other known proteins, including the B domain of factor V. However, it is highly glycosylated and contains 19 of the 26 aspartic (K)-linked glycosylation sites in the entire molecule.

Например, в WO 2014/147386 описаны способы экспрессии рекомбинантного FVIII с оптимизированными кодонами in vitro для последующего терапевтического использования.For example, WO 2014/147386 describes methods for in vitro expression of codon-optimized recombinant FVIII for subsequent therapeutic use.

В WO 2009/057883 описан процесс для очистки FVIII с использованием мультимодальной смолы. Описано, что FVIII загружают на мультимодальную смолу с использованием высокой ионной силы (соответствующей проводимости от 25 до 200 мСм/см при 25°С) и элюируют с использованием буфера, который содержит по меньшей мере одну аминокислоту, которая положительно заряжена при т pH 6 до 8, например, аргинин, лизин или гистидин.WO 2009/057883 describes a process for purifying FVIII using a multimodal resin. It is described that FVIII is loaded onto a multimodal resin using high ionic strength (corresponding to a conductivity of 25 to 200 mS/cm at 25°C) and eluted using a buffer that contains at least one amino acid that is positively charged at pH 6 to 8, for example, arginine, lysine or histidine.

Аналогично указанному выше, в WO 2009/007451 также описано использование мультимодальной смолы для того, чтобы очищать FVIII. Элюирование из мультимодальной смолы осуществляют с использованием по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40 мас./об.% этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, вместе с ионами кальция. Начальная загрузка смолы не требует корректировки pH или проводимости.Similar to the above, WO 2009/007451 also describes the use of a multimodal resin in order to purify FVIII. Elution from the multimodal resin is carried out using at least 1.5 M salt and at least 40% w/v ethylene glycol, propylene glycol or a mixture thereof, together with calcium ions. Initial resin loading does not require pH or conductivity adjustments.

В WO 2006/103258 описан способ увеличения количества рекомбинантного белка, такого как FVIII, которое можно получать из клеточной культуры, который включает проведение в суспензии клеток, получаемой из культуры, не физиологического увеличения концентрации по меньшей мере одного ионного вещества. Увеличение ионной силы выполнять посредством добавления соли и/или заряженной аминокислоты. Описаны различные концентрации добавляемого вещества, в зависимости от конкретного вещества.WO 2006/103258 describes a method for increasing the amount of a recombinant protein, such as FVIII, that can be obtained from a cell culture, which comprises subjecting the cell suspension obtained from the culture to a non-physiological increase in the concentration of at least one ionic substance. The increase in ionic strength is accomplished by adding a salt and/or a charged amino acid. Various concentrations of added substance are described, depending on the specific substance.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение основано на разработке процесса очистки, который может быть, например, проще, дешевле, экологичнее, менее опасным и/или более быстрым, чем другие процессы очистки, известные в данной области.The present invention is based on the development of a purification process that can be, for example, simpler, cheaper, more environmentally friendly, less hazardous and/or faster than other purification processes known in the art.

В первом аспекте предоставлен способ очистки или обогащения FVIII или его варианта с удаленным доменом В (включая его модифицированные версии, такие как слияния с другими белковыми фрагментами или пегилированными молекулами) из клеточной культуры in vitro, который включает предоставление культурального супернатанта, содержащего указанный FVIII или его вариант с удаленным доменом В;In a first aspect, a method is provided for purifying or enriching FVIII or a B domain-deleted variant thereof (including modified versions thereof such as fusions with other protein fragments or PEGylated molecules) from an in vitro cell culture, which comprises providing a culture supernatant containing said FVIII or its variant with remote domain B;

приведение супернатанта, содержащего FVIII или его вариант с удаленным доменом В, в контакт с мультимодальной смолой для того, чтобы абсорбировать FVIII или его вариант с удаленным доменом В на мультимодальной смоле;bringing the supernatant containing FVIII or its B-domain-deleted variant into contact with the multimodal resin in order to absorb FVIII or its B-domain-deleted variant onto the multimodal resin;

необязательно промывание мультимодальной смолы, имеющей абсорбированный FVIII или его вариант с удаленным доменом В, с использованием водного буфера для промывания;optionally washing the multimodal resin having absorbed FVIII or its B-domain-deleted variant using an aqueous wash buffer;

элюирование содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций с использованием водного элюирующего буфера, содержащего 4-метилимидазол; и необязательно сбор содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций в очищенной или обогащенной форме.eluting fractions containing FVIII or a domain-deleted variant thereof using an aqueous eluting buffer containing 4-methylimidazole; and optionally collecting FVIII or domain-deleted variant B fractions in purified or enriched form.

Клеточная культура может представлять собой любую подходящую клеточную культуру, которая способна экспрессировать FVIII, такую как культура клеток млекопитающего, способная экспрессировать FVIII или его вариант с удаленным доменом В, необязательно совместно экспрессируя фактор фон Виллебранда. Культура клеток млекопитающего может представлять собой клеточную культуру, которая экспрессирует рекомбинантную форму FVIII или его вариант с удаленным доменом В. То есть, клетки млекопитающих могут быть модифицированы с тем, чтобы экспрессировать экзогенно введенный ген FVIII или нуклеиновую кислоту, кодирующие его вариант с удаленным доменом В. В одном из вариантов осуществления FVIII или его вариант с удаленным доменом В представляет собой версию FVIII с оптимизированными кодонами или его вариант с удаленным доменом В, как описано, например, в WO2014/147386, к которой отправляют опытного читателя, и полное содержание которой включено, таким образом, посредством ссылки.The cell culture may be any suitable cell culture that is capable of expressing FVIII, such as a mammalian cell culture capable of expressing FVIII or a B domain deleted variant thereof, optionally co-expressing von Willebrand factor. The mammalian cell culture may be a cell culture that expresses a recombinant form of FVIII or a B domain deleted variant thereof. That is, mammalian cells may be modified to express an exogenously introduced FVIII gene or nucleic acid encoding a B domain deleted variant thereof. In one embodiment, FVIII or a B domain deleted variant thereof is a codon optimized version of FVIII or a B domain deleted variant thereof, as described, for example, in WO2014/147386, to which the expert reader is directed and the full content of which is included , thus by means of a link.

В целях удобства клетки, которые используют для культивирования и экспрессии FVIII или его варианта с удаленным доменом В, представляют собой НЕК 293, СНО, 3T3, ВНК, MICK, Varo, Junket, Hela, а также производные таких клеток, известные в данной области. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки СНО.For convenience, the cells used to culture and express FVIII or its B domain deleted variant are HEK 293, CHO, 3T3, BHK, MICK, Varo, Junket, Hela, and derivatives of such cells known in the art. In one embodiment, the cells are CHO cells.

Обычно супернатант предоставляют посредством центрифугирования и/или фильтрования культу- 1 040179 ры, содержащей экспрессирующие FVIII или его вариант с удаленным доменом В клетки, чтобы отделять культуральный супернатант от клеток, присутствующих в культуре. При необходимости, отделенные клетки можно возвращать в культуру для дальнейшего культивирования. В целях удобства, клеточную культуру не обрабатывают перед стадией отделения клеток, например, посредством добавления дополнительных средств, таких как ионные вещества, которые предназначены для увеличения ионной силы культуры и ее супернатанта, и/или аминокислоты с заряженными боковыми цепями, такие как аргинин, гистидин и/или лизин.Typically, the supernatant is provided by centrifuging and/or filtering the culture containing FVIII-expressing or domain-deleted variant B cells to separate the culture supernatant from the cells present in the culture. If necessary, separated cells can be returned to culture for further cultivation. For convenience, the cell culture is not treated before the cell separation step, for example by adding additional agents such as ionic substances that are designed to increase the ionic strength of the culture and its supernatant and/or amino acids with charged side chains such as arginine, histidine and/or lysine.

Перед приведением супернатанта клеток в контакт с мультимодальной смолой, pH супернатанта можно корректировать до pH 5,5-8,0, например, pH 6-7, обычно pH 6,5, используя подходящий реактив или буфер. Другие реактивы, такие как аминокислоты (например, гистидин), соли и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как Tween 20, Tween 80 и/или Pluronic F68, можно добавлять в супернатант перед приведением в контакт с мультимодальной смолой.Before contacting the cell supernatant with the multimodal resin, the pH of the supernatant can be adjusted to pH 5.5-8.0, eg pH 6-7, typically pH 6.5, using a suitable reagent or buffer. Other reagents such as amino acids (eg histidine), salts and/or non-ionic surfactants such as Tween 20, Tween 80 and/or Pluronic F68 may be added to the supernatant prior to contacting the multimodal resin.

В одном из вариантов осуществления гистидин, CaCl₂ и NaCl добавляют в супернатант в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации в диапазоне от 0,05 до 0,2 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,25 до 0,75 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,05 до 0,2 М. Неионное поверхностноактивное средство можно добавлять в количестве вплоть до 1 об./об.%.In one embodiment, histidine, CaCl ₂ and NaCl are added to the supernatant at a concentration ranging from: histidine at a concentration ranging from 0.05 to 0.2 M; NaCl in a concentration in the range of 0.25 to 0.75 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.05 to 0.2 M. The non-ionic surfactant can be added in an amount up to 1 v/v%.

В одном из вариантов осуществления супернатант корректируют до pH 6,5 с добавлением 100 мМ гистидина (pH 6,0), 100 мМ CaCl₂, 500 мМ NaCl и 0,02% Tween 80.In one embodiment, the supernatant is adjusted to pH 6.5 with 100 mM histidine (pH 6.0), 100 mM CaCl ₂ , 500 mM NaCl and 0.02% Tween 80.

Супернатант также дополнительно можно фильтровать (например, через 0,1-1 мкм фильтр или фильтры) для того, чтобы удалять любые мелкие частицы.The supernatant can also optionally be filtered (eg, through a 0.1-1 µm filter or filters) in order to remove any fine particles.

Термин мультимодальная смола, как используют в настоящем описании, относится к хроматографическому материалу, имеющему носитель и фрагменты, связанные с носителем, эти фрагменты взаимодействуют с химическими группами веществ, подлежащих отделению, и способны взаимодействовать с FVIII или его вариантом с удаленным доменом В в смеси посредством ионных взаимодействий и взаимодействий других типов, таких как образование водородных связей и/или гидрофобное взаимодействие. В одном из вариантов осуществления мультимодальную хроматографию можно осуществлять в хроматографической колонке. Подходящие смолы для мультимодальной хроматографии включают следующие коммерчески доступные смолы HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; МЕР Hypercel™.The term multimodal resin, as used herein, refers to a chromatographic material having a carrier and fragments associated with the carrier, these fragments interact with the chemical groups of the substances to be separated, and are able to interact with FVIII or its variant with a removed domain B in the mixture through ionic interactions; and other types of interactions such as hydrogen bonding and/or hydrophobic interaction. In one embodiment, multimodal chromatography can be performed on a chromatographic column. Suitable resins for multimodal chromatography include the following commercially available HEP Hypercel™ resins; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; CaptoMMC™; MEP Hypercel™.

После связывания FVIII или его варианта с удаленным доменом В с мультимодальной смолой, мультимодальную смолу необязательно можно промывать буфером для промывания, содержащим имидазол, обычно в количестве 0,05-0,2 М, например, 0,1 М. Буфер для промывания может содержать реактивы, которые в остальном представляют собой схожие или те же реактивы, что используют для того, чтобы адаптировать супернатант перед приведением в контакт с мультимодальной смолой. Например, буфер для промывания дополнительно может содержать аминокислоты (например, гистидин), соли и/или поверхностно-активное средство(а). В одном из вариантов осуществления буфер для промывания дополнительно содержит гистидин, CaCl2 и NaCl в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,2 до 0,4 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,05 М. Поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также может присутствовать в концентрации 0,01-0,03 об./об.%.After binding FVIII or a B domain deleted variant thereof to the multimodal resin, the multimodal resin may optionally be washed with a wash buffer containing imidazole, typically in an amount of 0.05-0.2 M, for example 0.1 M. The wash buffer may contain reagents that are otherwise similar or the same as those used to tailor the supernatant prior to contacting the multimodal resin. For example, the wash buffer may further comprise amino acids (eg, histidine), salts, and/or surfactant(s). In one embodiment, the wash buffer further comprises histidine, CaCl2, and NaCl at a concentration in the range of: histidine at a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M; NaCl in a concentration in the range of 0.2 to 0.4 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.05 M. A surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0. 03 v/v%.

Элюирование FVIII или его варианта с удаленным доменом В из мультимодальной смолы осуществляют с использованием элюирующего буфера, содержащего 4-метилимидазол, обычно в концентрации 0,5-1 М, например, 0,75 М. Элюирующий буфер может содержать реактивы, которые в остальном схожи, или соли и/или поверхностно-активное средство(а). В одном из вариантов осуществления элюирующий буфер дополнительно содержит гистидин, CaCl₂ и NaCl в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,03 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,4 до 0,8 М и CaCl2 в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. Также может присутствовать поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, в концентрации 0,01-0,03 об./об.% и/или этиленгликоль 10-15 об./об.%.Elution of FVIII or its B-domain-deleted variant from the multimodal resin is carried out using an elution buffer containing 4-methylimidazole, typically at a concentration of 0.5-1 M, for example 0.75 M. The elution buffer may contain reagents that are otherwise similar , or salts and/or surfactant(s). In one embodiment, the elution buffer further comprises histidine, CaCl ₂ and NaCl at a concentration ranging from: histidine at a concentration ranging from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.4 to 0.8 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. A surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0.03 vol./vol.% and/or ethylene glycol 10-15 vol./vol.%.

Необязательно можно предусматривать стадию инактивации вирусов, которую можно осуществлять в элюате или фракциях из мультимодальной смолы, которые содержат FVIII или его вариант с удаленным доменом В. Обычно стадия инактивации вирусов может включать процесс с растворителем/детергентом, хорошо известных опытному адресату. В одном таком подходящем процессе с растворителем/детергентом используют три-н-бутилфосфат и Triton-Х-100. три-н-бутилфосфат можно предоставлять в концентрации в диапазоне 0,15-0,6% (например, 0,3%) и Triton-X-100 можно предоставлять в концентрации в диапазоне 0,5-1,5% (например, 1%). Обычно реактив растворителя/детергента приводят в контакт с элюатом/фракциями на 15-60 мин, например, 30 мин, при температуре 4-30°С, например, 22°С±2°С Подходящий процесс описан в Roberts, Biologicals, 2008, 36/5, стр. 330-335, к которому отправляют опытного читателя и полное содержание которого настоящим включено по ссылке.Optionally, a virus inactivation step may be provided, which may be carried out on the eluate or fractions from the multimodal resin that contain FVIII or its B-domain-deleted variant. Typically, the virus inactivation step may include a solvent/detergent process well known to the skilled recipient. One such suitable solvent/detergent process uses tri-n-butyl phosphate and Triton-X-100. tri-n-butyl phosphate may be provided in a concentration in the range of 0.15-0.6% (eg 0.3%) and Triton-X-100 may be provided in a concentration in the range of 0.5-1.5% (eg 1%). Typically the solvent/detergent reagent is contacted with the eluate/fractions for 15-60 minutes, e.g. 30 minutes, at a temperature of 4-30°C, e.g. 22°C±2°C. A suitable process is described in Roberts, Biologicals, 2008, 36/5, pp. 330-335, to which the experienced reader is referred and the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

После элюирования и необязательного сбора содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций в очищенной или обогащенной форме, FVIII или его вариант домена В дополнительно можно очищать или обогащать с использованием стадии аффинной хроматографии FVIII, в которой аф- 2 040179 финность обеспечивают с помощью белкового лиганда, такого как фрагмент антитела со специфической реактивностью к эпитопу, который присутствует на FVIII или его варианте с удаленным доменом В.After eluting and optionally collecting fractions containing FVIII or its B-domain-deleted variant in purified or enriched form, FVIII or its B-domain variant can be further purified or enriched using an FVIII affinity chromatography step in which affinity is provided by a protein a ligand, such as an antibody fragment with specific reactivity for an epitope that is present on FVIII or a B domain-deleted variant thereof.

Таким образом, способ очистки или обогащения FVIII или его варианта с удаленным доменом В из клеточной культуры in vitro дополнительно может включать приведение раствора, содержащего FVIII или его вариант с удаленным доменом В, в контакт с иммуноаффинной матрицей, которая связывается с полипептидом FVIII или варианта с удаленным доменом В;Thus, a method for purifying or enriching FVIII or a B domain-deleted variant thereof from an in vitro cell culture may further comprise contacting a solution containing FVIII or a B-deleted variant thereof with an immunoaffinity matrix that binds to a FVIII polypeptide or variant with remote domain B;

необязательное промывание иммуноаффинной матрицы с адсорбированным на ней FVIII или его вариантом с удаленным доменом В с использованием водного буфера для промывания;optionally washing the FVIII-adsorbed immunoaffinity matrix or its B-domain-deleted variant using an aqueous wash buffer;

элюирование содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций посредством водного элюирующего буфера, содержащего имидазол; и необязательно сбор содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций в очищенной или обогащенной форме.eluting the FVIII-containing or domain-deleted variant B fractions with an aqueous eluting buffer containing imidazole; and optionally collecting FVIII or domain-deleted variant B fractions in purified or enriched form.

Благоприятно раствор, содержащий FVIII или его вариант с удаленным доменом В, может представлять собой разведенный раствор FVIII или его варианта с удаленным доменом В, содержащий элюированные фракции/раствор, получаемый элюированием мультимодальной смолы. Таким образом, замена буфера не требуется, что упрощает процесс и также может вести к увеличенной эффективности очистки.Advantageously, the solution containing FVIII or its B-domain-deleted variant may be a diluted solution of FVIII or its B-domain-deleted variant containing eluted fractions/solution obtained by elution of the multimodal resin. Thus, buffer replacement is not required, which simplifies the process and can also lead to increased cleaning efficiency.

Разведение можно осуществлять с использованием буфера для разведения (pH 6-7, например, pH 6,5) который содержит аминокислоту(ы) (например, гистидин) и/или соли В одном из вариантов осуществления буфер для разведения содержит гистидин, CaCl2 и NaCl в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,03 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,2 до 0,4 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также может присутствовать в концентрации 0,01-0,03 об./об.%.Dilution can be done using a dilution buffer (pH 6-7, e.g. pH 6.5) that contains amino acid(s) (e.g. histidine) and/or salts In one embodiment, the dilution buffer contains histidine, CaCl2 and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.2 to 0.4 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. A surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0. 03 v/v%.

После связывания FVIII или его варианта с удаленным доменом В с иммуноаффинной матрицей, иммуноаффинную матрицу необязательно можно промывать буфером для промывания. Буфер для промывания может содержать реактивы, которые в остальном схожи или являются тем же, что и реактивы, используемые для буфера для разведения. Например, буфер для промывания может содержать аминокислоту(ы) (например, гистидин), соль(и) и/или поверхностно-активное средство(а). В одном из вариантов осуществления буфер для промывания содержит гистидин, CaCl₂ и NaCl в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,03 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,5 до 1,5 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. Поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также может присутствовать в концентрации 0,01-0,03 об./об.%Following binding of FVIII or a B domain deleted variant to an immunoaffinity matrix, the immunoaffinity matrix can optionally be washed with wash buffer. The wash buffer may contain reagents that are otherwise similar or the same as those used for the dilution buffer. For example, the wash buffer may contain amino acid(s) (eg, histidine), salt(s), and/or surfactant(s). In one embodiment, the wash buffer contains histidine, CaCl ₂ and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range of 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.5 to 1.5 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. A surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0. 03 v/v%

Элюирование FVIII или его варианта с удаленным доменом В из иммуноаффинной матрицы осуществляют с использованием элюирующего буфера, содержащего имидазол, обычно в концентрации 0,5-1 М, например, 0,75 М. Элюирующий буфер дополнительно может содержать реактивы, которые в остальном схожи или являются тем же, что и реактивы, используемые в буфере для разведения, и дополнительно содержат этиленгликоль в количестве 35-65%, например, 50 об./об.%. Например, элюирующий буфер дополнительно может содержать аминокислоту (ы) (например, гистидин), соль(и) и/или поверхностноактивное средство (а). В одном из вариантов осуществления элюирующий буфер дополнительно содержит гистидин, CaCl₂ и NaCl в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,03 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,2 до 0,4 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. Поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также присутствует в концентрации 0,01-0,03 об./об.%.Elution of FVIII or its B-domain-deleted variant from the immunoaffinity matrix is carried out using an imidazole-containing elution buffer, typically at a concentration of 0.5-1 M, e.g., 0.75 M. The elution buffer may additionally contain reagents that are otherwise similar or are the same as the reagents used in the dilution buffer, and additionally contain ethylene glycol in an amount of 35-65%, for example, 50 vol./vol.%. For example, the elution buffer may further comprise amino acid(s) (eg, histidine), salt(s), and/or surfactant(s). In one embodiment, the elution buffer further comprises histidine, CaCl ₂ and NaCl at a concentration ranging from: histidine at a concentration ranging from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.2 to 0.4 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. A surfactant such as Tween 80 is also present in a concentration of 0.01-0.03 vol./vol.%.

После элюирования и необязательного сбора содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций в очищенной или обогащенной форме, FVIII или его вариант домена В дополнительно можно очищать или обогащать с использованием стадии анионообменной хроматографии, например, с использованием смол Q-Sepharose, Amberlite или Dowex.After eluting and optionally collecting fractions containing FVIII or its B domain removed variant in purified or enriched form, FVIII or its B domain variant can be further purified or enriched using an anion exchange chromatography step, for example using Q-Sepharose, Amberlite or Dowex resins. .

Благоприятно раствор, содержащий FVIII или его вариант с удаленным доменом В, может представлять собой разведенный раствор FVIII или его варианта с удаленным доменом В, который содержит элюированные фракции/раствор, полученный из процесса иммуноаффинной очистки. Таким образом, замена буфера не требуется, что упрощает процесс и также может вести к увеличенной эффективности очистки.Advantageously, the solution containing FVIII or its B domain deleted variant may be a dilute solution of FVIII or its B domain deleted variant that contains the eluted fractions/solution obtained from the immunoaffinity purification process. Thus, buffer replacement is not required, which simplifies the process and can also lead to increased cleaning efficiency.

Разведение можно осуществлять с использованием буфера для разведения (pH 7-8, например, pH 7,5), который содержит имидазол, соль(и) и/или поверхностно-активное средство (а). В одном из вариантов осуществления буфер для разведения содержит имидазол, CaCl2 и поверхностно-активное средство в концентрации в диапазоне: имидазол в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М; CaCl2 в концентрации в диапазоне от 0,002 до 0,01 М и поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, в диапазоне концентраций 0,01-0,03%.Dilution can be carried out using dilution buffer (pH 7-8, eg pH 7.5) which contains imidazole, salt(s) and/or surfactant(s). In one embodiment, the dilution buffer contains imidazole, CaCl2 and surfactant in a concentration in the range: imidazole in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M; CaCl2 in a concentration range of 0.002 to 0.01 M and a surfactant such as Tween 80 in a concentration range of 0.01-0.03%.

Необязательно, перед приведением разведенного раствора в контакт с анионообменной смолой, раствор можно подвергать нанофильтрованию для того, чтобы гарантировать удаление любых вирусов или инактивированного вирусного материала из раствора. Подходящие фильтры для нанофильтрования производит AsahiKASEI под торговой маркой Planova. Альтернативно, эту стадию можно проводить по- 3 040179 сле анионообменной стадии.Optionally, prior to bringing the diluted solution into contact with the anion exchange resin, the solution may be nanofiltered to ensure that any viruses or inactivated viral material is removed from the solution. Suitable filters for nanofiltration are manufactured by AsahiKASEI under the brand name Planova. Alternatively, this step can be carried out after the anion exchange step.

Разведенный раствор приводят в контакт с анионообменной смолой для того, чтобы связывать FVIII или его вариант с удаленным доменом В. После связывания FVIII или его варианта с удаленным доменом В с анионообменной матрицей, матрицу необязательно можно промывать буфером для промывания. Буфер для промывания может содержать реактивы, которые в остальном схожи или являются тем же, что и реактивы, используемые для буфера для разведения. Например, буфер для промывания может содержать имидазол, соль(и) и/или поверхностно-активное средство(а). В одном из вариантов осуществления буфер для промывания содержит имидазол, CaCl2 и NaCl: имидазол в концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,03 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,1 до 0,5 М и CaCl2 в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. Поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также может присутствовать в концентрации 0,01-0,03 об./об.%.The diluted solution is contacted with an anion exchange resin in order to bind FVIII or its B-deleted variant. After binding of FVIII or its B-deleted variant to the anion exchange matrix, the matrix can optionally be washed with wash buffer. The wash buffer may contain reagents that are otherwise similar or the same as those used for the dilution buffer. For example, the wash buffer may contain imidazole, salt(s), and/or surfactant(s). In one embodiment, the wash buffer contains imidazole, CaCl2 and NaCl: imidazole at a concentration ranging from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.1 to 0.5 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. A surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0.03 vol./vol.%.

Элюирование FVIII или его варианта с удаленным доменом В из анионообменной матрицы осуществляют с использованием элюирующего буфера, содержащего гистидин, обычно в концентрации 0,010,05 М, например, 0,02 М. Элюирующий буфер дополнительно может содержать реактивы, которые в остальном схожи или являются тем же, что и реактивы, используемые в буфере для промывания. Например, элюирующий буфер дополнительно может содержать соль(и) и/или поверхностно-активное средство(а). В одном из вариантов осуществления элюирующий буфер дополнительно содержит CaCl₂ и NaCl в концентрации в диапазоне: NaCl в концентрации в диапазоне от 0,3 до 0,6 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. Поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также может присутствовать в концентрации 0,01-0,03 об./об.%.Elution of FVIII or its B-domain-deleted variant from the anion exchange matrix is carried out using an elution buffer containing histidine, typically at a concentration of 0.010.05 M, such as 0.02 M. The elution buffer may additionally contain reagents that are otherwise similar or the same as the reagents used in the wash buffer. For example, the elution buffer may further contain salt(s) and/or surfactant(s). In one embodiment, the elution buffer further comprises CaCl ₂ and NaCl in a concentration in the range: NaCl in a concentration in the range of 0.3 to 0.6 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. Surfactant an agent such as Tween 80 may also be present at a concentration of 0.01-0.03 v/v%.

После элюирования и необязательного сбора содержащих FVIII или его вариант с удаленным доменом В фракций в очищенной или обогащенной форме, FVIII или его вариант домена В дополнительно можно очищать или обогащать с использованием стадии гельфильтрационной хроматографии, например, с использованием гельфильтрационных сред Superdex, Sephacryl, Sephadex, Sepharose или Superose.After eluting and optionally collecting fractions containing FVIII or its B domain removed variant in purified or enriched form, FVIII or its B domain variant can be further purified or enriched using a size exclusion chromatography step, e.g. using Superdex, Sephacryl, Sephadex, Sepharose or Superose.

Благоприятно раствор, содержащий FVIII или его вариант с удаленным доменом В, может представлять собой концентрированный раствор FVIII или его варианта с удаленным доменом В, содержащий элюированные фракции/раствор, полученный из процесса анионообменной очистки. Таким образом, замена буфера не требуется, что упрощает процесс и также может вести у увеличенной эффективности очистки. Раствор можно концентрировать посредством испарения или более обычно посредством центрифугирования через обогатительную мембрану, такую как обогатитель Spin X UF. В целях удобства, раствор можно концентрировать посредством уменьшения исходного объема раствора по меньшей мере на 25%, более предпочтительно на 40% или даже на 50%.Advantageously, the solution containing FVIII or its B-domain-deleted variant may be a concentrated solution of FVIII or its B-domain-deleted variant containing the eluted fractions/solution obtained from the anion exchange purification process. Thus, buffer replacement is not required, which simplifies the process and can also lead to increased cleaning efficiency. The solution can be concentrated by evaporation, or more usually by centrifugation through an enrichment membrane such as a Spin X UF enricher. For convenience, the solution can be concentrated by reducing the original volume of the solution by at least 25%, more preferably 40% or even 50%.

Концентрированный раствор приводят в контакт с гельфильтрационными средами для того, чтобы удерживать FVIII или его вариант с удаленным доменом В.The concentrated solution is contacted with gel filtration media in order to retain FVIII or its B domain-deleted variant.

Элюирование FVIII или его варианта с удаленным доменом В из гельфильтрационных сред осуществляют с использованием буфера, который служит для того, чтобы удалять FVIII или его вариант с удаленным доменом В из гельфильтрационных сред и предоставлять FVIII или его вариант с удаленным доменом В непосредственно в буфер для формулирования. Буфер для элюирования/формулирования содержит гистидин, сахарозу, CaCl₂, NaCl и поверхностно-активное средство в концентрации в диапазоне: гистидин в концентрации 0,005-0,02 М гистидина при pH 6,5-7,5; сахарозу в концентрации 0,005-0,02 М; NaCl в концентрации в диапазоне от 0,3 до 0,6 М и CaCl₂ в концентрации в диапазоне от 0,005 до 0,02 М. Поверхностно-активное средство, такое как Tween 80, также может присутствовать в концентрации 0,01-0,03 об./об.%.Elution of FVIII or its B domain-deleted variant from gel filtration media is carried out using a buffer that serves to remove FVIII or its B domain-deleted variant from gel filtration media and provide FVIII or its B domain-deleted variant directly to the formulation buffer. . The elution/formulation buffer contains histidine, sucrose, CaCl ₂ , NaCl and a surfactant at a concentration in the range: histidine at a concentration of 0.005-0.02 M histidine at pH 6.5-7.5; sucrose at a concentration of 0.005-0.02 M; NaCl in a concentration in the range of 0.3 to 0.6 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M. A surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0. 03 v/v%.

В одном из вариантов осуществления изобретения процесс по настоящему изобретению может включать следующие стадии очистки:In one of the embodiments of the invention, the process of the present invention may include the following purification steps:

i) отделение клеток;i) cell separation;

ii) корректировка pH и солей в супернатанте;ii) adjusting the pH and salts in the supernatant;

iii) мультимодальная хроматография (например, с использованием Capto MMC);iii) multimodal chromatography (eg using Capto MMC);

iv) необязательная обработка растворителем/детергентом (например, с использованием три-нбутилфосфата и Triton X-100);iv) optional solvent/detergent treatment (eg using tri-nbutyl phosphate and Triton X-100);

v) иммуноаффинная хроматография (например, с использованием лиганда GE Healthcare VIIISelect);v) immunoaffinity chromatography (eg using GE Healthcare VIIISelect ligand);

vi) необязательно одну или несколько стадий нанофильтрования для того, чтобы удалять вирусы (например, с использованием фильтра Planova 35N VRF);vi) optionally one or more nanofiltration steps in order to remove viruses (eg using a Planova 35N VRF filter);

vii) анионообменная хроматография (например, с использованием Q Sepharose);vii) anion exchange chromatography (eg using Q Sepharose);

viii) необязательное нанофильтрование для того, чтобы удалять вирусы (например, с использованием фильтра Planova 35N VRF); и ix) гельфильтрационная хроматография (например, с использованием Superdex 200).viii) optional nanofiltration in order to remove viruses (eg using a Planova 35N VRF filter); and ix) gel filtration chromatography (eg using Superdex 200).

Благоприятно замена буфера не требуется и только добавление реактивов, стадии разведения и/или концентрирования необходимы перед каждой стадией хроматографии.Advantageously no buffer change is required and only the addition of reagents, dilution and/or concentration steps are necessary prior to each chromatography step.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Настоящее изобретение далее дополнительно описано со ссылкой на следующие фигуры и неограничивающие примеры:The present invention is further described with reference to the following figures and non-limiting examples:

- 4 040179 на фиг. 1 представлена схематическая последовательность операций для типичного процесса очистки в соответствии с настоящим изобретением; и на фиг. 2 представлена фотография SDS PAGE геля (4-12% ВТ) с образцами, полученными в процессе очистки по настоящему изобретению.- 4 040179 in FIG. 1 is a schematic flow of operations for a typical cleaning process in accordance with the present invention; and in FIG. 2 is a photograph of an SDS PAGE gel (4-12% WB) with samples obtained from the purification process of the present invention.

Легенда для геля:Gel legend:

1: маркеры молекулярной массы;1: molecular weight markers;

2: размороженный супернатант клеточной культуры (без обработки);2: thawed cell culture supernatant (no treatment);

3: супернатант после центрифугирования;3: supernatant after centrifugation;

4: супернатант после корректировки pH до pH 6,5;4: supernatant after pH adjustment to pH 6.5;

5: Супернатант после глубинного и 0,45 мкм фильтрования;5: Supernatant after depth and 0.45 µm filtration;

6: инновационный материал Capto MMC;6: innovative material Capto MMC;

7: элюированный из Capto MMC материал/загрузка на иммуноаффинную VIIISelect;7: material eluted from Capto MMC/loaded onto immunoaffinity VIIISelect;

8: элюированный из иммуно аффинной VIIISelect материал/загрузка на Q Sepharose;8: material eluted from immunoaffinity VIIISelect/loaded onto Q Sepharose;

9: материал промывания Q Sepharose;9: Q Sepharose wash material;

10: элюированный из Q Sepharose материал;10: material eluted from Q Sepharose;

11: концентрированный материал перед Superdex 200;11: concentrated material before Superdex 200;

12: ранняя (высокомолекулярная) фракция из Superdex 200;12: early (high molecular weight) fraction from Superdex 200;

13: активная фракция FVIII из Superdex 200;13: FVIII active fraction from Superdex 200;

14: поздняя (низкомолекулярная) фракция из Superdex 200;14: late (low molecular weight) fraction from Superdex 200;

15: стандарт ReFacto;15: ReFacto standard;

16: маркеры молекулярной массы.16: Molecular weight markers.

Предпочтительный процесс очистки описан далее в настоящем описании.The preferred purification process is described later in this specification.

Последовательность операций процесса показана на фиг. 1.The process flow is shown in Fig. 1.

Пример 1.Example 1

Ферментационную культуру, объем (750 мл), которую замораживали при -80°С, содержащую rHFVIII и предварительно фильтрованную в ходе сбора с использованием 0,2 мкм фильтра, корректировали для достижения pH 6,0±0,5 посредством добавления 100 мМ гистидина, pH 6,0, 100 мМ CaCl₂, 500 мМ NaCl, 0,2% Tween 80. За этим следовало фильтрование через 0,1-0,85 мкм объемный фильтр и последующий 0,45 мкм конечный фильтр. Фильтрат использовали непосредственно на последующих стадиях очистки с использованием хроматографической системы GE Healthcare Akta AVANT 25.The fermentation culture, volume (750 ml), which was frozen at -80°C, containing rHFVIII and pre-filtered during collection using a 0.2 μm filter, was adjusted to reach a pH of 6.0±0.5 by adding 100 mM histidine, pH 6.0, 100 mM CaCl ₂ , 500 mM NaCl, 0.2% Tween 80. This was followed by filtration through a 0.1-0.85 µm bulk filter and a subsequent 0.45 µm final filter. The filtrate was used directly in subsequent purification steps using a GE Healthcare Akta AVANT 25 chromatographic system.

Сначала образец наносили со скоростью потока 5 мл/мин на колонку GE Healthcare CaptoMMC HiScale 16 (диаметр 1,6 смх высота слоя 10,8 см=объем набитой смолы 21,7 мл), предварительно уравновешенную с использованием 10 мМ гистидина, pH 6,5, 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, 0,02% Tween 80. Элюирование связанного образца из нее достигают посредством нанесения буфера из 20 мМ гистидина, pH 7,5, 10 мМ CaCl₂, 650 мМ NaCl, 750 мМ 4-метилимидазола, 12,5% этиленгликоля, 0,02% Tween 80.The sample was first loaded at a flow rate of 5 ml/min onto a GE Healthcare CaptoMMC HiScale 16 column (1.6 cm diameter x 10.8 cm bed height = 21.7 ml resin packed volume) pre-equilibrated with 10 mM histidine, pH 6, 5, 10 mM CaCl ₂ , 100 mM NaCl, 0.02% Tween 80. Elution of the bound sample from it is achieved by applying a buffer of 20 mM histidine, pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 650 mM NaCl, 750 mM 4- methylimidazole, 12.5% ethylene glycol, 0.02% Tween 80.

Затем концентрированный образец наносили на 1,17 мл смолы GE Healthcare VIII-Select, набитой в 1 см колонку OmniFit. После уравновешивание колонки с использованием 10 мМ гистидина, pH 6,5, 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, 0,02% Tween 80. Образец разводили 2 части на одну часть с использованием 20 мМ гистидина, pH 6,5, 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl, 0,02% Tween 80. После нанесения, колонку промывали с использованием 20 мМ гистидина, pH 6,5, 10 мМ CaCl₂, 1 М NaCl, 0,02% Tween 80. Образец элюировали с использованием 20 мМ гистидина, pH 7,0, 10 мМ CaCl₂, 300 мМ NaCl, 750 мМ имидазола, 50% этиленгликоля, 0,02% Tween 80.The concentrated sample was then applied to 1.17 ml of GE Healthcare VIII-Select resin packed into a 1 cm OmniFit column. After column equilibration using 10 mM histidine, pH 6.5, 10 mM CaCl ₂ , 100 mM NaCl, 0.02% Tween 80. Sample was diluted 2 parts to one part using 20 mM histidine, pH 6.5, 10 mM CaCl ₂ , 100 mM NaCl, 0.02% Tween 80. After loading, the column was washed with 20 mM histidine, pH 6.5, 10 mM CaCl ₂ , 1 M NaCl, 0.02% Tween 80. The sample was eluted using 20 mM histidine, pH 7.0, 10 mM CaCl ₂ , 300 mM NaCl, 750 mM imidazole, 50% ethylene glycol, 0.02% Tween 80.

Затем элюированный образец наносили на колонку для анионообменной хроматографии GE 1 ml Hi-Trap Q-Sepharose Fast Flow после разведения 1 части образца с использованием 2 частей буфера, содержащего 10 мМ имидазола, pH 7,5, 5 мМ CaCl₂, 0,02% Tween 80. Связанный образец элюировали с использованием 20 мМ гистидина, pH 6,0, 10 мМ CaCl₂, 400 мМ NaCl, 0,02% Tween 80.The eluted sample was then applied to a GE 1 ml Hi-Trap Q-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography column after diluting 1 part sample with 2 parts buffer containing 10 mM imidazole, pH 7.5, 5 mM CaCl ₂ , 0.02% Tween 80. The bound sample was eluted with 20 mM histidine, pH 6.0, 10 mM CaCl ₂ , 400 mM NaCl, 0.02% Tween 80.

Образцы, содержащие FVIII, дополнительно очищали с использованием гельфильтрационной хроматографии Superdex 200 и колонки GE Superdex 200 10/300 GL. Колонку уравновешивали 2 объемами колонки буфером, содержащим 9,6 мМ гистидина, pH 7,0, 8,8 мМ сахарозы, 1,7 мМ CaCl₂, 308 мМ NaCl, 0,01% Tween 80 (как в буфере для формулирования FVIII из Osterberg, 2001). Образцы собранных фракций брали посредством FVIII ELISA, анализа активности и SDS-PAGE анализа перед хранением при 80°С.Samples containing FVIII were further purified using Superdex 200 gel filtration chromatography and a GE Superdex 200 10/300 GL column. The column was equilibrated with 2 column volumes of buffer containing 9.6 mM histidine, pH 7.0, 8.8 mM sucrose, 1.7 mM CaCl ₂ , 308 mM NaCl, 0.01% Tween 80 (as in FVIII formulation buffer from Osterberg, 2001). Samples of the collected fractions were taken by FVIII ELISA, activity analysis and SDS-PAGE analysis before storage at 80°C.

SDS PAGE образцов, взятых на различных стадиях образца, очищенного в соответствии с вышеуказанным процессом очистки, показан на фиг. 2. Как можно видеть, активные образцы, которые разгоняли на дорожке 13, очень схожи с продуктом Refracto FVIII, который разгоняли на дорожке 15, демонстрируют, что процесс очистки эффективен для получения, очищенного FVIII или его варианта с удаленным доменом В.SDS PAGE of samples taken at various stages of a sample purified according to the above purification process is shown in FIG. 2. As can be seen, the active samples run in lane 13 are very similar to the Refracto FVIII product run in lane 15, demonstrating that the purification process is effective to produce purified FVIII or its B domain-deleted variant.

Claims

CLAIM

1. A method for purifying FVIII or a B-domain-deleted variant thereof from an in vitro cell culture, which comprises

- 5 040179 providing a culture supernatant containing the specified FVIII or its variant with a deleted B domain;

contacting the supernatant containing FVIII or a B-deleted variant thereof with a multimodal resin to absorb FVIII or a B-deleted variant thereof on the multimodal resin, wherein the multimodal resin is capable of reacting with FVIII or a B-deleted variant thereof by ionic interactions and other types of interactions selected from hydrogen bonding and/or hydrophobic interaction;

eluting fractions containing FVIII or its domain-deleted variant using an aqueous eluting buffer containing 4-methylimidazole.

2. The method of claim 1, wherein FVIII or a B-domain-deleted variant thereof may be fused to another protein or pegylated.

3. The method of claim 1, further comprising washing the multimodal resin having absorbed FVIII or a B-domain-deleted variant thereof with an aqueous wash buffer.

4. The method of claim 1, further comprising collecting the FVIII-containing or domain-deleted variant thereof fractions in purified or enriched form.

5. The method of claim 1, wherein the cell culture is any suitable cell culture that is capable of expressing FVIII, such as a mammalian cell culture capable of expressing FVIII or a B domain deleted variant thereof, optionally co-expressing von Willebrand factor.

6. The method according to any of the preceding claims, wherein the cell culture is not treated prior to the cell separation step, for example by adding ionic substances that are intended to increase the ionic strength of the culture and its supernatant and/or amino acids with charged side chains.

7. The method according to any of the preceding claims, wherein the pH of the supernatant is adjusted to pH 5.5-8.0, such as pH 6-7, typically pH 6.5, using a suitable reagent before contacting the cell supernatant with the multimodal resin. or buffer.

8. The method according to any preceding paragraph, in which histidine, CaCl ₂ and NaCl are added to the supernatant at a concentration in the range: histidine at a concentration in the range from 0.05 to 0.2 M; NaCl in a concentration in the range of 0.25 to 0.75 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.05 to 0.2 M, and optionally a non-ionic surfactant in an amount up to 1 v/v%.

9. The method according to any of the preceding claims, wherein the multimodal resin is washed with a wash buffer containing imidazole, typically in an amount of 0.05-0.2 M, for example 0.1 M, optionally, wherein the wash buffer further comprises histidine, CaCl ₂ and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range from 0.005 to 0.02 M; NaCl in a concentration in the range of 0.2 to 0.4 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.05 M and optionally a surfactant such as Tween 80 in a concentration of 0.01-0.03 vol. /about.%.

10. The method according to any of the preceding claims, wherein the elution of FVIII or its B-domain-deleted variant from the multimodal resin is carried out using an elution buffer containing 4-methylimidazole, typically at a concentration of 0.5-1 M, for example 0.75 M , optionally, where the elution buffer additionally contains histidine, CaCl ₂ and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.4 to 0.8 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M and optionally a surfactant such as Tween 80 in a concentration of 0.01-0.03 vol./ vol.% and/or ethylene glycol (10-15 vol./vol.%.

11. The method of claim 10 wherein, after eluting and optionally collecting fractions containing FVIII or its domain B deleted variant in purified form, FVIII or its domain B variant is further purified or using an FVIII affinity chromatography step in which affinity is provided with using a protein ligand, such as an antibody fragment with specific epitope reactivity that is present on FVIII or a B domain-deleted variant thereof.

12. The method of claim 11, wherein the step of affinity chromatography comprises contacting a solution containing FVIII or a B domain deleted variant thereof with an immunoaffinity matrix that binds to a FVIII polypeptide or B domain deleted variant;

optionally, washing the immunoaffinity matrix having FVIII adsorbed thereon, or a B-domain-deleted variant thereof, with an aqueous wash buffer;

eluting the FVIII-containing or domain-deleted variant B fractions with an aqueous eluting buffer containing imidazole; and optionally collecting FVIII or B domain deleted variant fractions in purified form, optionally wherein the solution containing FVIII or B domain deleted variant is a dilute solution of FVIII or B domain deleted variant containing the eluted fractions/solution obtained from the elution of the multimodal resin.

13. The method according to claim 12, wherein the solution is diluted in a dilution buffer (pH 6-7, e.g. pH 6.5),

- 6 040179 which contains histidine and/or salts, optionally, where the dilution buffer contains histidine,

CaCl2 and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.2 to 0.4 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M, and optionally contains a surfactant such as Tween 80, which may also be present in a concentration of 0, 01-0.03 v/v%.

14. The method of claim 13 wherein, after binding FVIII or a variant thereof with a deleted B domain to the immunoaffinity matrix, the immunoaffinity matrix is washed with a wash buffer, optionally wherein the wash buffer contains histidine, salt(s), and/or a surfactant. means(s).

15. The method according to item 14, in which the buffer for washing contains histidine, CaCl ₂ and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range from 0.01 to 0.03 M; NaCl in a concentration in the range of 0.5 to 1.5 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M, and optionally a surfactant such as Tween 80 may also be present in a concentration of 0.01-0 .03 v/v%.

16. The method according to claims 12-15, in which the elution of FVIII or its variant with a deleted domain B from the immunoaffinity matrix is carried out using an elution buffer containing imidazole, usually at a concentration of 0.5-1 M, for example 0.75 M, optionally where the elution buffer additionally contains reagents that are otherwise similar or the same as those used in the dilution buffer, and additionally contains ethylene glycol in an amount of 35-65%, for example, 50 vol./vol.%.

17. The method according to item 16, in which the eluent buffer additionally contains histidine, CaCl ₂ and NaCl in a concentration in the range: histidine in a concentration in the range from 0.01 to 0.03 M; NaCl at a concentration in the range of 0.2 to 0.4 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M, and optionally a surfactant such as Tween 80, is also present at a concentration of 0.01-0. 03 v/v%.

18. The method according to any one of claims 12-17, wherein, after eluting and optionally collecting fractions containing FVIII or its domain B deleted variant in purified form, FVIII or its domain B variant is further purified using an anion exchange chromatography step.

19. The method of claim 18 wherein the solution containing FVIII or its B domain deleted variant is a diluted solution of FVIII or its B domain deleted variant containing eluted fractions/solution obtained from an immunoaffinity purification process, optionally wherein dilution is carried out using dilution buffer (pH 7-8, eg pH 7.5) which contains imidazole, salt(s) and/or surfactant(s).

20. The method according to item 19, in which the dilution buffer contains imidazole, CaCl ₂ and surfactant in a concentration in the range: imidazole in a concentration in the range from 0.005 to 0.02 M; CaCl2 in a concentration in the range of 0.002 to 0.01 M and a surfactant such as Tween 80 in a concentration range of 0.01-0.03%, optionally, where before bringing the diluted solution into contact with an anion exchange resin, the solution is subjected to nanofiltration.

21. The method of claims 19-20 wherein the dilute solution is contacted with an anion exchange resin in order to bind FVIII or a variant thereof to the deleted B domain.

22. The method of claim 21 wherein, after binding FVIII or a B domain deleted variant to the anion exchange matrix, the matrix is washed with a wash buffer, optionally wherein the wash buffer contains reagents that are otherwise similar or the same as reagents used for dilution buffer.

23. The method of claim 22 wherein the wash buffer comprises imidazole, salt(s) and/or surfactant(s), optionally wherein the wash buffer comprises imidazole, CaCl2 and NaCl: imidazole at a concentration ranging from 0.01 to 0.03 M; NaCl at a concentration in the range of 0.1 to 0.5 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M, and optionally a surfactant such as Tween 80 may also be present at a concentration of 0.01-0 .03 v/v%.

24. The method according to claims 18-23, in which the elution of FVIII or its B-domain-deleted variant from the anion exchange matrix is carried out using an elution buffer containing histidine, usually at a concentration of 0.01-0.05 M, for example, 0.02 M, optionally, wherein the elution buffer further comprises reagents that are otherwise similar or the same as those used in the wash buffer.

25. The method of claim 24 wherein the elution buffer further comprises salt(s) and/or surfactant(s), optionally wherein the elution buffer further comprises CaCl2 and NaCl in a concentration in the range of: NaCl in a concentration in the range of 0.3 to 0.6 M and CaCl2 in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M, and a surfactant such as Tween 80 may also be present at a concentration of 0.01-0.03 v/v. %.

26. The method according to claims 18-25, wherein, after eluting and optionally collecting fractions containing FVIII or its domain B deleted variant in purified form, FVIII or its domain B variant is further purified using a size exclusion chromatography step, optionally

- 7 040179 where the solution containing FVIII or its B domain removed variant that is subjected to gel filtration is a concentrated solution of FVIII or its B domain removed variant containing eluted fractions/solution obtained from an anion exchange purification process.

27. The method of claim 26 wherein the solution is concentrated by evaporation or more typically by centrifugation through an enrichment membrane, optionally wherein the concentrated solution is contacted with gel filtration media in order to retain FVIII or a B domain-deleted variant thereof.

28. The method of claim 27, wherein the elution of FVIII or its B-domain-deleted variant from the gelling media is performed using a buffer that serves to remove FVIII or its B-domain-deleted variant from the gelling media and provide FVIII or its variant with the B domain removed directly in the formulation buffer, optionally, where the elution/formulation buffer contains histidine, sucrose, CaCl ₂ , NaCl and a surfactant in a concentration in the range: histidine at a concentration of 0.005-0.02 histidine at pH 6, 5-7.5; sucrose at a concentration of 0.005-0.02; NaCl in a concentration in the range of 0.3 to 0.6 M and CaCl ₂ in a concentration in the range of 0.005 to 0.02 M, and optionally a surfactant such as Tween 80, may also be present in a concentration of 0.01- 0.03 v/v%.

29. A method for purifying FVIII or its B-domain-deleted variant from an in vitro cell culture, which includes:

x) separation of cells;

xi) adjusting the pH and salts in the supernatant;

xii) multimodal chromatography;

xiii) immunoaffinity chromatography;

xiv) anion exchange chromatography; and xv) gel filtration chromatography.

30. The method of claim 29, wherein FVIII or a B-domain-deleted variant thereof may be fused to another protein or pegylated.

31. The method of claim 29, further comprising solvent/detergent treatment.

32. The method of claim 29, further comprising one or more nanofiltration steps in order to remove viruses.

33. The method of claim 29, further comprising nanofiltration in order to remove viruses.