EA040097B1 - NEW CHIMERIC INSECTICIDAL PROTEINS TOXIC OR INHIBITORIC AGAINST LEPIDOPTHER PESTS - Google Patents
NEW CHIMERIC INSECTICIDAL PROTEINS TOXIC OR INHIBITORIC AGAINST LEPIDOPTHER PESTS Download PDFInfo
- Publication number
- EA040097B1 EA040097B1 EA201892761 EA040097B1 EA 040097 B1 EA040097 B1 EA 040097B1 EA 201892761 EA201892761 EA 201892761 EA 040097 B1 EA040097 B1 EA 040097B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- plant
- chimeric insecticidal
- insecticidal protein
- chimeric
- Prior art date
Links
Description
Ссылка на родственную заявкуLink to related application
В настоящем изобретении заявляется приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/064989, поданной 16 октября 2014 года, содержание которой в полном объеме включено в настоящий документ посредством ссылки.The present invention claims priority to U.S. Provisional Application No. 62/064989, filed Oct. 16, 2014, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
Включение перечня последовательностейEnabling a sequence listing
Перечень последовательностей в машиночитаемой форме подан с этим заявлением в электронном формате и включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Перечень последовательностей содержится в файле, созданном 23 августа, 2016 года, с именем файла P34230WO00_Seq_PCT_Art34.txt, и размером 898,229 байт (как измерено в операционной системе MSWindows®).The sequence listing in machine readable form is filed with this application in electronic format and incorporated herein by reference in its entirety. The sequence listing is contained in a file created on August 23, 2016, with the file name P34230WO00_Seq_PCT_Art34.txt, and is 898,229 bytes in size (as measured in the MSWindows® operating system).
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение в целом относится к области белков, обладающих ингибиторной активностью в отношении насекомых. В настоящем изобретении описан новый класс химерных инсектицидных белков, обладающих ингибиторной активностью против сельскохозяйственных вредителей культурных растений и семян. В частности, раскрытый класс белков обладает инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых насекомых-вредителей. Предлагаются растения, части растений и семена, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более описанных токсичных белков.The present invention relates generally to the field of proteins having insect inhibitory activity. The present invention describes a new class of chimeric insecticidal proteins with inhibitory activity against agricultural pests of cultivated plants and seeds. In particular, the disclosed class of proteins has insecticidal activity against Lepidoptera insect pests. Plants, plant parts, and seeds are provided that contain a recombinant nucleic acid molecule encoding one or more of the described toxic proteins.
Уровень техникиState of the art
Все большее значение приобретает повышение урожайности сельскохозяйственных культур, в том числе кукурузы, сои, сахарного тростника, риса, пшеницы, овощей и хлопчатника. По прогнозам, в дополнение к растущей потребности в сельскохозяйственной продукции для обеспечения пищей, одеждой и обеспечения энергией растущего населения, климатическим последствиям и давления со стороны растущего населения на использование земли, отличной от сельскохозяйственной, уменьшается количество доступных пахотных земель для ведения сельского хозяйства. Данные факторы привели к неоптимистичным прогнозам в отношении продовольственной безопасности, особенно в условиях отсутствия значительных улучшений в области биотехнологии растений и агрономических приемов. В свете данных факторов экологически устойчивые усовершенствования в области технологий, агротехники и борьбы с вредителями являются жизненно важными инструментами для расширения производства сельскохозяйственных культур на ограниченном количестве пахотных земель, доступных для ведения сельского хозяйства.Improving crop yields, including corn, soybeans, sugar cane, rice, wheat, vegetables and cotton, is becoming increasingly important. In addition to the growing demand for agricultural products to provide food, clothing and energy for a growing population, climate impacts and pressure from a growing population to use non-agricultural land, the amount of available arable land for agriculture is predicted to decrease. These factors have led to less than optimistic food security projections, especially in the absence of significant improvements in plant biotechnology and agronomic practices. In light of these factors, environmentally sustainable improvements in technology, farming practices and pest management are vital tools for expanding crop production on the limited amount of arable land available for agriculture.
Насекомые, особенно насекомые в пределах отряда чешуекрылых, считаются основной причиной повреждения полевых культур, тем самым снижая урожайность культур в зараженных районах. Виды чешуекрылых вредителей, которые имеют негативное влияние на сельское хозяйство, включают, без ограничений, кукурузную листовую совку (Spodoptera frugiperda), совку малую (Spodoptera exigua), совку латуковую (Mamestra configurata), совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку капустную (Trichoplusia ni), соевую совку (Chrysodeixis includens), совку бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), совку клеверную (Hupena scabra), табачную листовертку (Heliothis virescens), совку хлопковую (Agrotis subterranea), совку луговую (Pseudaletia unipuncta), совку прямоугольную (Agrotis orthogonia), мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis), бабочку-огневку (Amyelois transitella), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), огневку подсолнечниковую (Homoeosoma electellum), точильщика зернового кукурузного (Elasmopalpus lignosellus), плодожорку яблонную (Cydia pomonella), листовертку виноградную (Endopiza viteana), листовертку восточную персиковую (Grapholita molesta), листовертку подсолнечника (Suleima helianthana), капустную моль (Plutella xylostella), розовый коробочный червь (Pectinophora gossypiella), розовый сверлильщик (Sesamia inferens), шелкопряда непарного (Lymantria dispar), совку хлопковую американскую (Alabama argillacea), листовертку плодовых деревьев (Archips argyrospila), листовертку резанную золотистую (Archips rosana), огневку азиатскую стеблевую, или желтую рисовую огневку (Chilo suppressalis), листовертку рисовую (Cnaphalocrocis medinalis), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), мотылька травяного (Crambus teterrellus), огневку кукурузную юго-западную (Diatraea grandiosella)), огневку сахарного тростника (Diatraea saccharalis), совку хлопковую египетскую (Earias insulana), совку пятнистую (Earias vittella), совку американскую (Helicoverpa armigera), американскую кукурузную совку, соевую совку или совку хлопковую (Helicoverpa zea), лугового мотылька (Eerpetogramma licarsisalis), гроздевую листовертку (Lobesia botrana), цитрусовую минирующую моль (Phyllocnistis citrella), белянку капустную (Pieris brassicae), репницу или белянку репную (Pieris rapae), азиатскую хлопчатниковую совку или азиатскую хлопковую совку (Spodoptera litura) и пасленовый минер (Tuta absoluta).Insects, especially those within the order Lepidoptera, are considered the main cause of damage to field crops, thereby reducing crop yields in infested areas. Lepidoptera pest species that have a negative impact on agriculture include, without limitation, fall armyworm (Spodoptera frugiperda), little cutworm (Spodoptera exigua), lettuce cutworm (Mamestra configurata), upsilon cutworm (Agrotis ipsilon), cabbage cutworm ( Trichoplusia ni), soybean cutworm (Chrysodeixis includens), velvet bean cutworm (Anticarsia gemmatalis), clover cutworm (Hupena scabra), tobacco leafworm (Heliothis virescens), cotton cutworm (Agrotis subterranea), meadow cutworm (Pseudaletia unipuncta), square cutworm ( Agrotis orthogonia), stem corn borer (Ostrinia nubilalis), moth moth (Amyelois transitella), corn moth (Crambus caliginosellus), meadow borer (Herpetogramma licarsisalis), sunflower moth (Homoeosoma electellum), grain corn borer (Elasmopalpus lignosellus), codling moth apple tree (Cydia pomonella), grape leaflet (Endopiza viteana), oriental peach leaflet (Grapholita molesta), sunflower leafworm (Suleima helianthana), cabbage moth (Plutella xylostella), pink bollworm (Pectinophora gossypiella), pink borer (Sesamia inferens), gypsy moth (Lymantria dispar), American cotton bollworm (Alabama argillacea), leaf roller fruit trees (Archips argyrospila), cut golden leafworm (Archips rosana), Asian stem moth or yellow rice moth (Chilo suppressalis), rice leafworm (Cnaphalocrocis medinalis), corn moth (Crambus caliginosellus), herbal moth (Crambus teterrellus), moth southwestern corn cutworm (Diatraea grandiosella)), sugar cane moth (Diatraea saccharalis), Egyptian cotton cutworm (Earias insulana), spotted cutworm (Earias vittella), American cutworm (Helicoverpa armigera), American corn cutworm, soy cutworm or cotton cutworm ( Helicoverpa zea), meadow moth (Eerpetogramma licarsisalis), grapevine leafworm (L obesia botrana), citrus mining moth (Phyllocnistis citrella), cabbage whitewash (Pieris brassicae), turnip or turnip whiteworm (Pieris rapae), Asian cotton bollworm or Asian cotton bollworm (Spodoptera litura) and nightshade miner (Tuta absoluta).
Исторически сложилось так, что синтетические химические инсектициды интенсивно применяли в качестве средства борьбы с вредителями в сельском хозяйстве. Озабоченность по поводу окружающей среды и здоровья человека, помимо возникающих проблем с устойчивостью, стимулировала исследования и разработку биологических пестицидов. Данное исследование привело к прогрессивному открытию и применению различных энтомопатогенных видов микроорганизмов, включая бактерии.Historically, synthetic chemical insecticides have been used extensively as a pest control agent in agriculture. Concerns about the environment and human health, in addition to emerging problems with resistance, have spurred the research and development of biological pesticides. This research has led to the progressive discovery and use of various entomopathogenic microbial species, including bacteria.
Парадигма биологических методов борьбы изменилась, когда был открыт потенциал энтомопатоThe paradigm of biological control methods changed when the potential of entomopathology was discovered.
- 1 040097 генных бактерий, особенно бактерий, относящихся к роду Bacillus, и применен в разработке агентов для биологической борьбы с вредителями. Штаммы бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) использовали в качестве источника инсектицидных белков, так как было обнаружено, что штаммы Bt проявляют высокую токсичность против конкретных насекомых. Известно, что штаммы Bt продуцируют дельтаэндотоксины, которые локализованы в параспоральном кристаллическом тельце включения в начале споруляции и во время фазы стационарного роста (например, белки Cry), и также известно, что они продуцирует секретируемый инсектицидный белок. При проглатывании восприимчивым насекомым дельтаэндотоксины, а также секретируемые токсины оказывают свое действие на поверхность эпителия средней кишки, разрушают клеточную мембрану, приводя к разрушению и гибели клеток. Гены, кодирующие инсектицидные белки, также были идентифицированы у бактериальных видов, отличных от Bt, включая другие Bacillus и множество других видов бактерий, таких как Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus (is ранее известный как Bacillus sphaericus) и Paenibacillus popilliae.- 1 040097 gene bacteria, especially bacteria belonging to the genus Bacillus, and used in the development of agents for biological pest control. Bacillus thuringiensis (Bt) strains have been used as a source of insecticidal proteins since Bt strains have been found to exhibit high toxicity against specific insects. Bt strains are known to produce deltaendotoxins that are localized in the parasporal inclusion crystal body at the onset of sporulation and during the stationary growth phase (eg, Cry proteins) and are also known to produce a secreted insecticidal protein. When ingested by susceptible insects, deltaendotoxins, as well as secreted toxins, exert their effect on the surface of the midgut epithelium, destroying the cell membrane, leading to cell destruction and death. Genes encoding insecticidal proteins have also been identified in bacterial species other than Bt, including other Bacillus and many other bacterial species such as Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus (is formerly known as Bacillus sphaericus) and Paenibacillus popilliae.
Кристаллические и секретируемые растворимые инсектицидные белковые токсины являются высокоспецифичными для их хозяев и получили мировое признание как альтернативы химическим инсектицидам. Например, инсектицидные токсичные белки применяют в различных сельскохозяйственных целях для защиты хозяйственно-ценных растений от заражения насекомыми, уменьшения потребности в применении химических пестицидов и повышения урожайности. Инсектицидные токсичные белки применяют для борьбы с сельскохозяйственными вредителями культурных растений механизированными способами, такими как распыление дисперсных микробных препаратов, содержащих различные штаммы бактерий, на поверхности растений, и с использованием способов генетической трансформации для получения трансгенных растений и семян, экспрессирующих инсектицидный токсичный белок.Crystalline and secreted soluble insecticidal protein toxins are highly specific for their hosts and have gained worldwide acceptance as alternatives to chemical insecticides. For example, insecticidal toxic proteins are used in a variety of agricultural applications to protect valuable plants from insect infestation, reduce the need for chemical pesticides, and increase yields. Insecticidal toxic proteins are used to control agricultural pests of cultivated plants by mechanized methods, such as spraying dispersed microbial preparations containing various strains of bacteria on the surface of plants, and using genetic transformation methods to obtain transgenic plants and seeds expressing the insecticidal toxic protein.
Применение трансгенных растений, экспрессирующих инсектицидные белки, признано в мировом масштабе. Например, в 2012 году 26,1 млн га были засажены трансгенными культурами, экспрессирующими Bt-токсины (James, С, Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. Краткое содержание отчета ISAAA (Международная служба по сбору сведений о применении биотехнологий в сельском хозяйстве) № 44). Глобальное применение трансгенных культур, защищенных от насекомых, и ограниченное количество инсектицидных белков, применяемых для этих культур, создало давление отбора для существующих аллелей насекомых, которые придают устойчивость к применяемым в настоящее время инсектицидным белкам.The use of transgenic plants expressing insecticidal proteins is recognized worldwide. For example, in 2012, 26.1 million hectares were planted with transgenic crops expressing Bt toxins (James, C, Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Report Summary economy) No. 44). The global use of transgenic insect-protected crops and the limited number of insecticidal proteins used for these crops has created a selection pressure for existing insect alleles that confer resistance to currently used insecticidal proteins.
Развитие резистентности у целевых вредителей к инсектицидным белкам создает постоянную потребность в открытии и разработке новых форм инсектицидных белков, которые полезны для контроля над повышением резистентности насекомых к трансгенным культурам, экспрессирующим инсектицидные белки. Новые инсектицидные белки с повышенной эффективностью (и которые контролируют более широкий спектр восприимчивых видов насекомых) уменьшают число выживших насекомых, которые могут развить резистентные аллели. Кроме того, применение в одном растении двух или более трансгенных инсектицидных белков, токсичных для одного и того же насекомого-вредителя и демонстрирующих различные способы воздействия, снижает вероятность резистентности у любых отдельных целевых видов насекомых.The development of resistance in target pests to insecticidal proteins creates an ongoing need to discover and develop new forms of insecticidal proteins that are useful in controlling the increase in insect resistance to transgenic crops expressing insecticidal proteins. New insecticidal proteins with improved efficacy (and that control a wider range of susceptible insect species) reduce the number of surviving insects that can develop resistant alleles. In addition, the use in the same plant of two or more transgenic insecticidal proteins that are toxic to the same pest and exhibit different modes of action reduces the likelihood of resistance in any individual target insect species.
Следовательно, существует настоятельная необходимость идентифицировать дополнительные инсектицидные белки с улучшенными инсектицидными свойствами, такими как повышенная эффективность против более широкого спектра целевых видов насекомых-вредителей и различные механизмы действия по сравнению с токсинами, применяемыми в настоящее время в агрономических приемах. Для удовлетворения данной потребности настоящее изобретение описывает новые химерные инсектицидные белки Cry1, которые проявляют активность против многочисленных целевых видов чешуекрылых вредителей.Therefore, there is a strong need to identify additional insecticidal proteins with improved insecticidal properties, such as improved efficacy against a wider range of target insect pest species and different mechanisms of action compared to the toxins currently used in agronomic practices. To meet this need, the present invention describes novel Cry1 chimeric insecticidal proteins that exhibit activity against numerous target Lepidoptera pest species.
Члены семейства кристаллических белков Cry1, известные в данной области техники, проявляют биологическую активность против чешуекрылых-вредителей. Форма предшественника кристаллических белков Cry1 состоит из двух сегментов примерно равных размеров. Карбоксиконцевая часть белкапредшественника, известная как сегмент протоксина, стабилизирует образование кристаллов и не проявляет инсектицидной активности. Аминоконцевая половина белка-предшественника содержит сегмент токсина белка Cry и, основываясь на выравнивании консервативных или по существу консервативных последовательностей в пределах членов семейства Cry1, может быть дополнительно разделена на три структурных домена: домен I, домен II и домен III. Домен I содержит около первой трети активного сегмента токсина и, как было показано, является существенным для формирования канала. Домены II и III вовлечены в связывание рецепторов и специфичны к видам насекомых, в зависимости от исследуемого насекомого и инсектицида.Members of the Cry1 crystalline protein family known in the art exhibit biological activity against Lepidoptera pests. The precursor form of Cry1 crystalline proteins consists of two segments of approximately equal size. The carboxy-terminal portion of the precursor protein, known as the protoxin segment, stabilizes crystal formation and exhibits no insecticidal activity. The amino-terminal half of the precursor protein contains a toxin segment of the Cry protein and, based on the alignment of conserved or substantially conserved sequences within members of the Cry1 family, can be further divided into three structural domains: domain I, domain II, and domain III. Domain I contains about the first third of the active toxin segment and has been shown to be essential for channel formation. Domains II and III are involved in receptor binding and are specific to insect species, depending on the insect and insecticide being studied.
Вероятность произвольного создания химерного белка с улучшенными свойствами из ассортимента доменных структур многочисленных нативных инсектицидных белков, известных в данной области техники, является незначительной. Это является результатом сложного характера структуры белка, олигомеризации и активации (включая соответствующий протеолитический процессинг химерного предшественника, если он экспрессирован в такой форме), необходимой для высвобождения сегмента инсектицидного белка. Только путем тщательного отбора протоксинов и конкретных мишеней в каждом исходном белке для создания химерной структуры могут быть созданы функциональные химерные инсектиThe likelihood of randomly generating a chimeric protein with improved properties from the assortment of domain structures of numerous native insecticidal proteins known in the art is negligible. This is a result of the complex nature of the protein structure, oligomerization and activation (including the appropriate proteolytic processing of the chimeric precursor, if expressed in such a form) required to release the insecticidal protein segment. Only by careful selection of protoxins and specific targets in each parent protein to create a chimeric structure can functional chimeric insects be created.
- 2 040097 цидные токсины, которые проявляют улучшенную инсектицидную активность по сравнению с исходными белками, из которых получены химеры. В данной области техники известно, что повторная сборка протоксина и токсиновых доменов I, II и III любых двух или более токсинов, которые отличаются друг от друга, часто приводит к получению белков, которые проявляют дефектное образование кристаллов или у которых полностью отсутствует какая-либо детектируемая инсектицидная активность, направленная на предпочтительный вид насекомых-вредителей. Только метод проб и ошибок является эффективным в получении инсектицидных химер, и даже в таком случае квалифицированный специалист не уверен, в конечном итоге, в химере, которая проявляет инсектицидную активность, которая эквивалентна или улучшена по сравнению с любым единственным исходным токсичным белком, из которого получены домены протоксинов или токсинов химеры. Например, в литературе приводятся многочисленные примеры конструирования или сборки химерных белков из двух или более предшественников кристаллического белка. См., например, Jacqueline S. Knight, et al., A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. J. Economic Entomology, 97 (6) (2004): 1805-1813; Bosch, et al. (патент США № 6204246); Malvar and Gilmer (патент США № 6017534). В каждом из этих примеров многие из полученных химер не проявляли инсектицидных или кристаллообразующих свойств, которые были эквивалентны или улучшены по сравнению с белками-предшественниками, из которых были получены компо ненты химер.- 2 040097 cidal toxins that exhibit improved insecticidal activity compared to the original proteins from which the chimeras are derived. It is known in the art that reassembly of the protoxin and toxin domains I, II, and III of any two or more toxins that differ from each other often results in proteins that exhibit defective crystal formation or that completely lack any detectable insecticidal activity directed at a preferred insect pest species. Trial and error alone is effective in producing insecticidal chimeras, and even so, the skilled artisan is not ultimately sure of a chimera that exhibits insecticidal activity that is equivalent to or improved over any single toxic protein from which it is derived. protoxin or chimera toxin domains. For example, the literature provides numerous examples of the construction or assembly of chimeric proteins from two or more crystalline protein precursors. See, for example, Jacqueline S. Knight, et al., A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. J. Economic Entomology, 97 (6) (2004): 1805-1813; Bosch, et al. (US patent No. 6204246); Malvar and Gilmer (U.S. Patent No. 6,017,534). In each of these examples, many of the resulting chimeras did not exhibit insecticidal or crystal-forming properties that were equivalent to or superior to the precursor proteins from which the chimera components were derived.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Предложены молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют химерные инсектицидные белки, токсичные в отношении видов чешуекрылых-вредителей растений. Каждый из химерных инсектицидных белков может применяться по отдельности или в комбинации друг с другом и с другими инсектицидными белками и агентами, обладающими ингибиторной активностью в отношении насекомых, в препаратах и в условиях in planta (в растении); таким образом, обеспечивая альтернативы инсектицидным белкам и химикатам-инсектицидам, применяемым в настоящее время в сельскохозяйст венных системах.Recombinant nucleic acid molecules are proposed that encode chimeric insecticidal proteins that are toxic to Lepidoptera plant pests. Each of the chimeric insecticidal proteins can be used alone or in combination with each other and with other insecticidal proteins and insect inhibitory agents in formulations and in planta conditions; thus providing alternatives to the insecticidal proteins and insecticide chemicals currently used in agricultural systems.
В некоторых вариантах реализации изобретения в данном документе описан химерный инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в любой из последовательностейIn some embodiments of the invention, this document describes a chimeric insecticidal protein containing the amino acid sequence specified in any of the sequences
SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19,23,SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19.23,
25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61,63,25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61.63,
65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93,95,65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93.95,
97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 или 111.97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111.
Данный химерный инсектицидный белок проявляет ингибирующую активность против видов насе комых отряда Lepidoptera, таких как, без ограниченийThis chimeric insecticidal protein exhibits inhibitory activity against insect species of the order Lepidoptera such as, but not limited to
Anticarsia gemmatalis, Diatraea saccharalis, Elasmopalpus lignosellus, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Chrysodeixis includens, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania,Anticarsia gemmatalis, Diatraea saccharalis, Elasmopalpus lignosellus, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Chrysodeixis includens, Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania,
Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa armigera, Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Diatraea grandiosella, Earias vitella, Helicoverpa gelotopeon, иSpodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa armigera, Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Diatraea grandiosella, Earias vitella, Helicoverpa gelotopeon, and
Rachiplusia nu.Rachiplusia nu.
В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид, кодирующий химерный инсектицидный белок, причем полинуклеотид функционально связан с гетерологичным промотором, и химерный инсектицидный белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в любой из последовательностейIn another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding a chimeric insecticidal protein, wherein the polynucleotide is operably linked to a heterologous promoter, and the chimeric insecticidal protein contains the amino acid sequence specified in any of the sequences
SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19,23,SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19.23,
25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61,63,25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61.63,
65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93,95,65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93.95,
97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 или 111.97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111.
Также рассматривается полинуклеотид, кодирующий химерный инсектицидный белок, причем полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая необязательно гибридизуется в строгих условиях с обратным комплементом полинуклеотидной последовательности, указанной в любой изAlso contemplated is a polynucleotide encoding a chimeric insecticidal protein, wherein the polynucleotide contains a nucleotide sequence that optionally hybridizes under stringent conditions to the reverse complement of the polynucleotide sequence specified in any of
- 3 040097- 3 040097
SEQ IDSEQ ID
NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24,26,NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24.26,
27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51,52,27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51.52,
54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82,84,54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112,86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112,
113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 или 130;113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 or 130;
или кодирует химерный инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в любой изor encodes a chimeric insecticidal protein containing the amino acid sequence specified in any of
SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25,30,SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16, 19, 23, 25,30,
133, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,67,133, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65.67,
69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97,99,69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97.99,
101, 103, 105, 107, 109 или 111.101, 103, 105, 107, 109 or 111.
В других вариантах реализации изобретения в данном документе описана клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, указанный в любой изIn other embodiments of the invention, this document describes a host cell containing a polynucleotide specified in any of
SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14,
15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38,40,15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38.40,
42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68,70,42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68.70,
72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100,72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100,
102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,119,102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,119,
120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 или130,120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 or 130,
Причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки-хозяина или растительной клетки-хозяина. Рассматриваемые бактериальные клетки-хозяева включает Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, и Erwinia; и причем виды Bacillus представляют собой Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанный Brevibacillus представляет собой Brevibacillus laterosperous, и указанная Escherichia представляет собой Escherichia coll. Кроме того, пред полагаемые растительные клетки-хозяева включают однодольные или двудольные растения.Moreover, the host cell is selected from the group consisting of a bacterial host cell or a plant host cell. Contemplated bacterial host cells include Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, and Erwinia; and wherein the Bacillus species is Bacillus cereus or Bacillus thuringiensis, said Brevibacillus is Brevibacillus laterosperous, and said Escherichia is Escherichia coll. In addition, putative plant host cells include monocots or dicots.
Другие варианты реализации изобретения в данном документе описывают композиции, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащие химерный инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в любой изOther embodiments of the invention herein describe compositions having inhibitory activity against insects, containing a chimeric insecticidal protein containing the amino acid sequence specified in any of
SEQ ID NO: 21, 10, 28,SEQ ID NO: 21, 10, 28
7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50,7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50,
53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83,53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83,
85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 или 111.85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, может дополнительно содержать по меньшей мере один агент, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, отличный от химерного инсектицидного белка. Рассматриваемые агенты, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, отличные от химерного инсектицидного белка, включают белок, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых, и химический состав, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых. Данные агенты, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, отличные от химерного инсектицидного белка, могут проявлять активность в отношении одного или более видов вредителей из отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Hemiptera, Homoptera, или Thysanoptera.In some embodiments, the insect-inhibiting composition may further comprise at least one insect-inhibiting agent other than the chimeric insecticidal protein. Contemplated agents having insect inhibitory activity other than the chimeric insecticidal protein include a protein having insect inhibitory activity, a dsRNA molecule having insect inhibitory activity, and a chemical compound having insect inhibitory activity. These insect inhibitory agents, other than the chimeric insecticidal protein, may be active against one or more pest species from the orders Lepidoptera, Coleoptera, Hemiptera, Homoptera, or Thysanoptera.
В еще одном варианте реализации изобретения в данном документе описано семя, содержащее ингибирующе эффективное в отношении насекомых количество химерного инсектицидного белка, содержащего аминокислотную последовательность, указанную в любой из последовательностейIn yet another embodiment of the invention, this document describes a seed containing an insect-inhibitory effective amount of a chimeric insecticidal protein containing the amino acid sequence specified in any of the sequences
SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16,19,SEQ ID NO: 21, 10, 28, 7, 4, 13, 16,19,
123, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59,61,123, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59.61,
63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91,93,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91.93,
95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 или111;95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111;
или полинуклеотид, указанный в любой изor a polynucleotide listed in any of
- 4 040097- 4 040097
SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12,14,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12,14,
15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38,40,15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38.40,
42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68,70,42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68.70,
72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 или 130.72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 or 130.
Рассматриваются также способы борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающие стадию, в которой чешуекрылого вредителя приводят в контакт с ингибирующим количеством химерного инсектицидного белка согласно настоящему изобретению.Also contemplated are methods for controlling lepidopteran pests comprising the step of contacting the lepidopteran pest with an inhibitory amount of a chimeric insecticidal protein of the present invention.
В другом варианте реализации изобретения в данном документе описана трансгенная растительная клетка, растение или часть растения, содержащая химерный инсектицидный белок, причем химерный инсектицидный белок содержит любую аминокислотную последовательность, указанную в любой изIn another embodiment of the invention, this document describes a transgenic plant cell, plant or plant part containing a chimeric insecticidal protein, and the chimeric insecticidal protein contains any amino acid sequence specified in any of
SEQ ID NO: 21, 10, 28,SEQ ID NO: 21, 10, 28
7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 или 111;7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111;
или химерный инсектицидный белок содержит белок, имеющий по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 21, 10; по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO: 28, по меньшей мере 87% идентичности с SEQ ID NO: 7; по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 4; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 13; по меньшей мере 64% идентичности с SEQ ID NO: 16; по меньшей мере 66% идентичности с SEQ ID NO: 19; по меньшей мере 86% идентичности с SEQ ID NO: 23; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 25; по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 30; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 33; по меньшей мере 64% идентичности с SEQ ID NO: 36; по меньшей мере 66% идентичности с SEQ ID NO: 39; по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 41; по меньшей мере 84% идентичности с SEQ ID NO: 43; по меньшей мере с 93% идентичности с SEQ ID NO: 45; по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 47; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 50; или по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO: 53; или по меньшей мере 87% идентичности с SEQ ID NO: 85, 93, 105; или по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79; или по меньшей мере 88% идентичности с SEQ ID NO: 91, 87, 89; или по меньшей мере 89% идентичности с SEQ ID NO: 107, 111; или по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 97; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 109; или по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO: 83; или по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 91 или 103; или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 95, 101; или по меньшей мере 98% идентичности с SEQ ID NO: 99. Также рассматриваются способы борьбы с чешуекрылыми-вредителями, включающие стадию в которой осуществляют воздействие вредителя на эту трансгенную растительную клетку, растение или часть растения, причем указанная растительная клетка, растение или часть растения экспрессирует ингибирующее в отношении чешуекрылых количество химерного инсектицидного белка.or the chimeric insecticidal protein contains a protein having at least 94% identity with SEQ ID NO: 21, 10; at least 93% identity with SEQ ID NO: 28, at least 87% identity with SEQ ID NO: 7; at least 90% identity with SEQ ID NO: 4; at least 91% identity with SEQ ID NO: 13; at least 64% identity with SEQ ID NO: 16; at least 66% identity with SEQ ID NO: 19; at least 86% identity with SEQ ID NO: 23; at least 91% identity with SEQ ID NO: 25; at least 94% identity with SEQ ID NO: 30; at least 91% identity with SEQ ID NO: 33; at least 64% identity with SEQ ID NO: 36; at least 66% identity with SEQ ID NO: 39; at least 94% identity with SEQ ID NO: 41; at least 84% identity with SEQ ID NO: 43; at least 93% identity with SEQ ID NO: 45; at least 94% identity with SEQ ID NO: 47; at least 91% identity with SEQ ID NO: 50; or at least 93% identity with SEQ ID NO: 53; or at least 87% identity with SEQ ID NO: 85, 93, 105; or at least 85% identity with SEQ ID NOs: 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79; or at least 88% identity with SEQ ID NO: 91, 87, 89; or at least 89% identity with SEQ ID NO: 107, 111; or at least 90% identity with SEQ ID NO: 97; at least 91% identity with SEQ ID NO: 109; or at least 93% identity with SEQ ID NO: 83; or at least 94% identity with SEQ ID NO: 91 or 103; or at least 95% identity with SEQ ID NO: 95, 101; or at least 98% identity with SEQ ID NO: 99. Methods for controlling lepidoptera pests are also contemplated, comprising the step of exposing the pest to the transgenic plant cell, plant, or plant part, wherein said plant cell, plant, or plant part expresses a Lepidoptera inhibitory amount of the chimeric insecticidal protein.
В других вариантах реализации изобретения в данном документе предложены товарные продукты, полученные из растительной клетки, растения или части растения, причем продукт содержит обнаруживаемое количество химерного инсектицидного белка. Рассматриваемые товарные продукты включают растительную биомассу, масло, муку, корм для животных, муку, хлопья, отруби, пух, кожуры и обработанные семена.In other embodiments, this document provides commercial products derived from a plant cell, plant, or plant part, wherein the product contains a detectable amount of a chimeric insecticidal protein. Commercial products under consideration include vegetable biomass, oil, flour, animal feed, flour, flakes, bran, fluff, rinds and processed seeds.
Еще один способ, раскрытый в данном документе, представляет собой способ получения семени, содержащего химерный инсектицидный белок, включающий стадии, на которых высаживают по меньшей мере одно семя, содержащее химерный инсектицидный белок; выращивают растения из указанного семени; и собирают семя от растений, причем собранное семя содержит инсектицидный белок.Yet another method disclosed herein is a method for producing a seed containing a chimeric insecticidal protein, comprising the steps of planting at least one seed containing the chimeric insecticidal protein; growing plants from said seed; and harvesting seed from plants, wherein the harvested seed contains an insecticidal protein.
Рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, кодирующие химерный инсектицидный белок, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей изRecombinant polynucleotide molecules encoding a chimeric insecticidal protein containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of
- 5 040097- 5 040097
SEQ ID NO:SEQID NO:
1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52,54,1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52.54,
56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,86,56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84.86,
88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112,113,88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112,113,
114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,126,114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,126,
127, 128, 129 или 130;127, 128, 129 or 130;
и необязательно полинуклеотидную последовательность, кодирующую агент, обладающий ингибиторной активностью в отношении насекомых, отличный от химерного инсектицидного белка.and optionally a polynucleotide sequence encoding an insect inhibitory agent other than the chimeric insecticidal protein.
Другая рассматриваемая в данном документе молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим химерные инсектицидные белки, причем химерный инсектицидный белок содержит любую аминокислотную последовательность, указанную в любой изAnother recombinant nucleic acid molecule discussed herein comprises a heterologous promoter operably linked to a polynucleotide segment encoding chimeric insecticidal proteins, the chimeric insecticidal protein comprising any amino acid sequence specified in any of
SEQ ID NO: 21, 10, 28,SEQ ID NO: 21, 10, 28
7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 или 111;7, 4, 13, 16, 19, 23, 25, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111;
или химерный инсектицидный белок содержит белок, имеющий по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 21, 10; по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO: 28; по меньшей мере 87% идентичности с SEQ ID NO: 7; по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 4; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 13; по меньшей мере 64% идентичности с SEQ ID NO: 16; по меньшей мере 66% идентичности с SEQ ID NO: 19; по меньшей мере 86% идентичности с SEQ ID NO: 23; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 25; по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 30; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 33; по меньшей мере 64% идентичности с SEQ ID NO: 36; по меньшей мере 66% идентичности с SEQ ID NO: 39; по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 41; по меньшей мере 84% идентичности с SEQ ID NO: 43; по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO: 45; по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 47; по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 50; или по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO: 53; или по меньшей мере 87% идентичности с SEQ ID NO: 85, 93, 105; или по меньшей мере 85% идентичности с SEQ ID NO: 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79; или по меньшей мере 8 8% идентичности с SEQ ID NO: 91, 87, 89; или по меньшей мере 89% идентичности с SEQ ID NO: 107, 111; или по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 97; или по меньшей мере 91% идентичности с SEQ ID NO: 109; или по меньшей мере 93% идентичности с SEQ ID NO:83; или по меньшей мере 94% идентичности с SEQ ID NO: 91, 103; или по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 95, 101; или по меньшей мере 98% идентичности с SEQ ID NO: 99; или полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, указанную в любой изor the chimeric insecticidal protein contains a protein having at least 94% identity with SEQ ID NO: 21, 10; at least 93% identity with SEQ ID NO: 28; at least 87% identity with SEQ ID NO: 7; at least 90% identity with SEQ ID NO: 4; at least 91% identity with SEQ ID NO: 13; at least 64% identity with SEQ ID NO: 16; at least 66% identity with SEQ ID NO: 19; at least 86% identity with SEQ ID NO: 23; at least 91% identity with SEQ ID NO: 25; at least 94% identity with SEQ ID NO: 30; at least 91% identity with SEQ ID NO: 33; at least 64% identity with SEQ ID NO: 36; at least 66% identity with SEQ ID NO: 39; at least 94% identity with SEQ ID NO: 41; at least 84% identity with SEQ ID NO: 43; at least 93% identity with SEQ ID NO: 45; at least 94% identity with SEQ ID NO: 47; at least 91% identity with SEQ ID NO: 50; or at least 93% identity with SEQ ID NO: 53; or at least 87% identity with SEQ ID NO: 85, 93, 105; or at least 85% identity with SEQ ID NOs: 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79; or at least 88% identity with SEQ ID NOs: 91, 87, 89; or at least 89% identity with SEQ ID NO: 107, 111; or at least 90% identity with SEQ ID NO: 97; or at least 91% identity with SEQ ID NO: 109; or at least 93% identity with SEQ ID NO:83; or at least 94% identity with SEQ ID NO: 91, 103; or at least 95% identity with SEQ ID NO: 95, 101; or at least 98% identity with SEQ ID NO: 99; or the polynucleotide segment hybridizes to a polynucleotide having the nucleotide sequence specified in any of
SEQ ID NO: 1, 2, 3,5,SEQ ID NO: 1, 2, 3.5
6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31,32,6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31.32,
34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58,60,34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51, 52, 54, 56, 58.60,
62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90,92,62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90.92,
94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 или 130.94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 or 130.
Другие варианты реализации, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, примеров и формулы изобретения.Other implementations, features and advantages of the present invention will be apparent from the following detailed description, examples and claims.
Краткое описание последовательностейBrief description of the sequences
SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC1100, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 1 is the recombinant DNA sequence encoding TIC1100 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 2 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC1100, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 2 is a synthetic DNA sequence encoding TIC1100 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 3 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC1100, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 3 is a synthetic DNA sequence encoding TIC1100 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1100.SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of TIC1100.
SEQ ID NO: 5 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC860,SEQ ID NO: 5 is a recombinant DNA sequence encoding TIC860,
- 6 040097 используемую для экспрессии в бактериальной клетке.- 6 040097 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 6 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC860, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 6 is a synthetic DNA sequence encoding TIC860 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность TIC860.SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of TIC860.
SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC867, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 8 is a recombinant DNA sequence encoding TIC867 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 9 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 9 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867.SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of TIC867.
SEQ ID NO: 11 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC867_20, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 11 is the recombinant DNA sequence encoding TIC867_20 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 12 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867_20 для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 12 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867_20 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867_20.SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of TIC867_20.
SEQ ID NO: 14 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC867_21, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 14 is the recombinant DNA sequence encoding TIC867_21 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 15 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867_21, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 15 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867_21 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867_21.SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence of TIC867_21.
SEQ ID NO: 17 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC867_22, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 17 is the recombinant DNA sequence encoding TIC867_22 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 18 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867_22, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 18 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867_22 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867_22.SEQ ID NO: 19 is the amino acid sequence of TIC867_22.
SEQ ID NO: 20 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867_23, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 20 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867_23 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867_23.SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence of TIC867_23.
SEQ ID NO: 22 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867_24, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 22 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867_24 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867_24.SEQ ID NO: 23 is the amino acid sequence of TIC867_24.
SEQ ID NO: 24 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC867_24, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 24 is a synthetic DNA sequence encoding TIC867_24 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислотную последовательность TIC867_25.SEQ ID NO: 25 is the amino acid sequence of TIC867_25.
SEQ ID NO: 26 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC868, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 26 is a recombinant DNA sequence encoding TIC868 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 27 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868 для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 27 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 28 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868.SEQ ID NO: 28 is the amino acid sequence of TIC868.
SEQ ID NO: 29 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_9, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 29 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_9 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_9.SEQ ID NO: 30 is the amino acid sequence of TIC868_9.
SEQ ID NO: 31 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC868_10, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 31 is a recombinant DNA sequence encoding TIC868_10 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 32 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую вариант TIC868, TIC868_10, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 32 is a synthetic DNA sequence encoding a TIC868 variant, TIC868_10, for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_10.SEQ ID NO: 33 is the amino acid sequence of TIC868_10.
SEQ ID NO: 34 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC868_11, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 34 is the recombinant DNA sequence encoding TIC868_11 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 35 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_11, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 35 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_11 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 36 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_11.SEQ ID NO: 36 is the amino acid sequence of TIC868_11.
SEQ ID NO: 37 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC868_12, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 37 is the recombinant DNA sequence encoding TIC868_12 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 38 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_12, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 38 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_12 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 39 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_12.SEQ ID NO: 39 is the amino acid sequence of TIC868_12.
SEQ ID NO: 40 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_13, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 40 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_13 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 41 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_13.SEQ ID NO: 41 is the amino acid sequence of TIC868_13.
SEQ ID NO: 42 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_14, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 42 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_14 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_14.SEQ ID NO: 43 is the amino acid sequence of TIC868_14.
- 7 040097- 7 040097
SEQ ID NO: 44 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_15, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 44 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_15 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_15.SEQ ID NO: 45 is the amino acid sequence of TIC868_15.
SEQ ID NO: 46 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC868_29, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 46 is a synthetic DNA sequence encoding TIC868_29 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислотную последовательность TIC868_29.SEQ ID NO: 47 is the amino acid sequence of TIC868_29.
SEQ ID NO: 48 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC869, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 48 is a recombinant DNA sequence encoding TIC869 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 49 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC869, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 49 is a synthetic DNA sequence encoding TIC869 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 50 представляет собой аминокислотную последовательность TIC869.SEQ ID NO: 50 is the amino acid sequence of TIC869.
SEQ ID NO: 51 представляет собой последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую TIC836, используемую для экспрессии в бактериальной клетке.SEQ ID NO: 51 is a recombinant DNA sequence encoding TIC836 used for expression in a bacterial cell.
SEQ ID NO: 52 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую TIC836, для экспрессии в растительной клетке.SEQ ID NO: 52 is a synthetic DNA sequence encoding TIC836 for expression in a plant cell.
SEQ ID NO: 53 представляет собой аминокислотную последовательность TIC836.SEQ ID NO: 53 is the amino acid sequence of TIC836.
SEQ ID NO: 54 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC713.SEQ ID NO: 54 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC713.
SEQ ID NO: 55 представляет собой аминокислотную последовательность TIC713, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 54.SEQ ID NO: 55 is the amino acid sequence of TIC713 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 54.
SEQ ID NO: 56 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC843.SEQ ID NO: 56 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC843.
SEQ ID NO: 57 представляет собой аминокислотную последовательность TIC843, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 56.SEQ ID NO: 57 is the amino acid sequence of TIC843 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 56.
SEQ ID NO: 58 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC862.SEQ ID NO: 58 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC862.
SEQ ID NO: 59 представляет собой аминокислотную последовательность TIC862, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 58.SEQ ID NO: 59 is the amino acid sequence of TIC862 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 58.
SEQ ID NO: 60 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099.SEQ ID NO: 60 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC1099.
SEQ ID NO: 61 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 60.SEQ ID NO: 61 is the amino acid sequence of TIC1099 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 60.
SEQ ID NO: 62 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-T507E.SEQ ID NO: 62 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-T507E.
SEQ ID NO: 63 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-T507E, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 62.SEQ ID NO: 63 is the amino acid sequence of TIC1099-T507E translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 62.
SEQ ID NO: 64 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-R522K.SEQ ID NO: 64 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-R522K.
SEQ ID NO: 65 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-R522K, транслированную из открытой рамки считывания, представленной в SEQ ID NO: 64.SEQ ID NO: 65 is the amino acid sequence of TIC1099-R522K translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 64.
SEQ ID NO: 66 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-K490S.SEQ ID NO: 66 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-K490S.
SEQ ID NO: 67 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-K490S, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 66.SEQ ID NO: 67 is the amino acid sequence of TIC1099-K490S translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 66.
SEQ ID NO: 68 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-T562R.SEQ ID NO: 68 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-T562R.
SEQ ID NO: 69 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-T562R, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 68.SEQ ID NO: 69 is the amino acid sequence of TIC1099-T562R translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 68.
SEQ ID NO: 70 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-S553R.SEQ ID NO: 70 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-S553R.
SEQ ID NO: 71 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-S553R, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 70.SEQ ID NO: 71 is the amino acid sequence of TIC1099-S553R translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 70.
SEQ ID NO: 72 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-G498D.SEQ ID NO: 72 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-G498D.
SEQ ID NO: 73 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-G498D, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 72.SEQ ID NO: 73 is the amino acid sequence of TIC1099-G498D translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 72.
SEQ ID NO: 74 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-K490A.SEQ ID NO: 74 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-K490A.
SEQ ID NO: 75 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-K490A, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 74.SEQ ID NO: 75 is the amino acid sequence of TIC1099-K490A translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 74.
SEQ ID NO: 76 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1099-E564A.SEQ ID NO: 76 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1099-E564A.
- 8 040097- 8 040097
SEQ ID NO: 77 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1099-E564A, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 76.SEQ ID NO: 77 is the amino acid sequence of TIC1099-E564A translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 76.
SEQ ID NO: 78 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1103.SEQ ID NO: 78 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC1103.
SEQ ID NO: 79 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1103, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 78.SEQ ID NO: 79 is the amino acid sequence of TIC1103 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 78.
SEQ ID NO: 80 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC1101.SEQ ID NO: 80 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence TIC1101.
SEQ ID NO: 81 представляет собой аминокислотную последовательность TIC1101, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 80.SEQ ID NO: 81 is the amino acid sequence of TIC1101 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 80.
SEQ ID NO: 82 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC845.SEQ ID NO: 82 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC845.
SEQ ID NO: 83 представляет собой аминокислотную последовательность TIC845, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 82.SEQ ID NO: 83 is the amino acid sequence of TIC845 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 82.
SEQ ID NO: 84 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC846.SEQ ID NO: 84 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC846.
SEQ ID NO: 85 представляет собой аминокислотную последовательность TIC84 6, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 84.SEQ ID NO: 85 is the amino acid sequence of TIC84 6 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 84.
SEQ ID NO: 86 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC858.SEQ ID NO: 86 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC858.
SEQ ID NO: 87 представляет собой аминокислотную последовательность TIC858, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 86.SEQ ID NO: 87 is the amino acid sequence of TIC858 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 86.
SEQ ID NO: 88 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC865.SEQ ID NO: 88 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC865.
SEQ ID NO: 89 представляет собой аминокислотную последовательность TIC865, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 88.SEQ ID NO: 89 is the amino acid sequence of TIC865 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 88.
SEQ ID NO: 90 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC866.SEQ ID NO: 90 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC866.
SEQ ID NO: 91 представляет собой аминокислотную последовательность TIC866, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 90.SEQ ID NO: 91 is the amino acid sequence of TIC866 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 90.
SEQ ID NO: 92 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC838.SEQ ID NO: 92 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC838.
SEQ ID NO: 93 представляет собой аминокислотную последовательность TIC838, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 92.SEQ ID NO: 93 is the amino acid sequence of TIC838 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 92.
SEQ ID NO: 94 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC839.SEQ ID NO: 94 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC839.
SEQ ID NO: 95 представляет собой аминокислотную последовательность TIC839, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 94.SEQ ID NO: 95 is the amino acid sequence of TIC839 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 94.
SEQ ID NO: 96 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC841.SEQ ID NO: 96 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC841.
SEQ ID NO: 97 представляет собой аминокислотную последовательность TIC841, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 96.SEQ ID NO: 97 is the amino acid sequence of TIC841 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 96.
SEQ ID NO: 98 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC842.SEQ ID NO: 98 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC842.
SEQ ID NO: 99 представляет собой аминокислотную последовательность TIC842, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 98.SEQ ID NO: 99 is the amino acid sequence of TIC842 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 98.
SEQ ID NO: 100 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC850.SEQ ID NO: 100 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC850.
SEQ ID NO: 101 представляет собой аминокислотную последовательность TIC850, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 100.SEQ ID NO: 101 is the amino acid sequence of TIC850 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 100.
SEQ ID NO: 102 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC859.SEQ ID NO: 102 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC859.
SEQ ID NO: 103 представляет собой аминокислотную последовательность TIC859, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 102.SEQ ID NO: 103 is the amino acid sequence of TIC859 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 102.
SEQ ID NO: 104 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC861.SEQ ID NO: 104 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC861.
SEQ ID NO: 105 представляет собой аминокислотную последовательность TIC861, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 104.SEQ ID NO: 105 is the amino acid sequence of TIC861 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 104.
SEQ ID NO: 106 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC848.SEQ ID NO: 106 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC848.
SEQ ID NO: 107 представляет собой аминокислотную последовательность TIC848, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 106.SEQ ID NO: 107 is the amino acid sequence of TIC848 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 106.
- 9 040097- 9 040097
SEQ ID NO: 108 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC849.SEQ ID NO: 108 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC849.
SEQ ID NO: 109 представляет собой аминокислотную последовательность TIC849, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 108.SEQ ID NO: 109 is the amino acid sequence of TIC849 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 108.
SEQ ID NO: 110 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую химерную аминокислотную последовательность TIC847.SEQ ID NO: 110 is the DNA sequence encoding the chimeric amino acid sequence of TIC847.
SEQ ID NO: 111 представляет собой аминокислотную последовательность TIC847, транслированную из открытой рамки считывания, указанной в SEQ ID NO: 110.SEQ ID NO: 111 is the amino acid sequence of TIC847 translated from the open reading frame shown in SEQ ID NO: 110.
SEQ ID NO: 112 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC713.SEQ ID NO: 112 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC713.
SEQ ID NO: 113 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC713.SEQ ID NO: 113 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC713.
SEQ ID NO: 114 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC843.SEQ ID NO: 114 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC843.
SEQ ID NO: 115 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC862.SEQ ID NO: 115 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC862.
SEQ ID NO: 116 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC1099.SEQ ID NO: 116 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC1099.
SEQ ID NO: 117 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC1103.SEQ ID NO: 117 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC1103.
SEQ ID NO: 118 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC845.SEQ ID NO: 118 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC845.
SEQ ID NO: 119 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC846.SEQ ID NO: 119 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC846.
SEQ ID NO: 120 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC858.SEQ ID NO: 120 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC858.
SEQ ID NO: 121 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC866.SEQ ID NO: 121 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC866.
SEQ ID NO: 122 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC838.SEQ ID NO: 122 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC838.
SEQ ID NO: 123 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC841.SEQ ID NO: 123 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC841.
SEQ ID NO: 124 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC842.SEQ ID NO: 124 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC842.
SEQ ID NO: 125 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC850.SEQ ID NO: 125 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC850.
SEQ ID NO: 126 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC859.SEQ ID NO: 126 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC859.
SEQ ID NO: 127 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC861.SEQ ID NO: 127 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC861.
SEQ ID NO: 128 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC848.SEQ ID NO: 128 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC848.
SEQ ID NO: 129 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC849.SEQ ID NO: 129 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC849.
SEQ ID NO: 130 представляет собой синтетическую последовательность ДНК для экспрессии в клетке растения, кодирующей TIC847.SEQ ID NO: 130 is a synthetic DNA sequence for expression in a plant cell encoding TIC847.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Проблема в области борьбы с сельскохозяйственными вредителями может быть охарактеризована как потребность в новых инсектицидных белках, которые эффективны против целевых вредителей, проявляют токсичность широкого спектра по отношению к целевым видам вредителей, способны экспрессироваться в растениях, не вызывая нежелательных агрономических проблем, и обеспечивают альтернативный способ воздействия по сравнению с существующими на сегодняшний день токсинами, которые используют в растениях в коммерческих целях. В данном документе описаны новые химерные инсектицидные белки и рассмотрена каждая из этих потребностей, в частности в отношении широкого спектра чешуекрылых насекомых-вредителей.A problem in the field of pest control can be characterized as the need for new insecticidal proteins that are effective against target pests, exhibit broad spectrum toxicity to target pest species, are capable of being expressed in plants without causing undesirable agronomic problems, and provide an alternative mode of action. compared to currently existing toxins that are commercially used in plants. This document describes new chimeric insecticidal proteins and discusses each of these needs, in particular in relation to a wide range of Lepidoptera insect pests.
Чтобы избежать развития резистентности насекомых к используемым в настоящее время инсектицидным белкам, устраняя их недостатки, необходимы новые инсектицидные белки с различными механизмами действия (МД), а также с широким спектром действия и эффективностью для борьбы с Lepidoptera. Одним из путей решения этой проблемы является обнаружение новых инсектицидных белков из различных биологических источников, предпочтительно из бактерий, грибов или растений. Другим подходом является перестановка сегментов между различными Bt-белками, которые демонстрируют структурное сходство для создания новых химерных Bt-белков, обладающих ингибирующими свойствами вIn order to avoid the development of insect resistance to currently used insecticidal proteins, eliminating their shortcomings, new insecticidal proteins with different mechanisms of action (MA), as well as with a wide spectrum of action and effectiveness for the control of Lepidoptera, are needed. One way to solve this problem is to find new insecticidal proteins from various biological sources, preferably from bacteria, fungi or plants. Another approach is to swap segments between different Bt proteins that show structural similarity to create new chimeric Bt proteins that have inhibitory properties in
- 10 040097 отношении насекомых. Вероятность создания химерного белка с улучшенными свойствами рекомбинацией доменных структур многочисленных нативных инсектицидных кристаллических белков, известных в данной области техники, незначительна. См., например, Jacqueline S. Knight, et al., A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. J. Economic Entomology, 97 (6) (2004): 18051813.- 10 040097 regarding insects. The likelihood of creating a chimeric protein with improved properties by recombining the domain structures of numerous native insecticidal crystal proteins known in the art is negligible. See, for example, Jacqueline S. Knight, et al., A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. J. Economic Entomology, 97 (6) (2004): 18051813.
В данном документе описаны последовательности молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют новые химерные инсектицидные белки. Данные инсектицидные белки учитывают текущую потребность в данной области технике в разработке дополнительных токсичных инсектицидных белков с улучшенными инсектицидными свойствами, такими как повышенная эффективность против более широкого спектра целевых видов насекомых-вредителей и различных механизмов действия. Члены данной группы белков, включая приведенные в данном документе иллюстративные белки, проявляют инсектицидную активность в отношении видов чешуекрылых насекомых-вредителей.This document describes the sequence of recombinant nucleic acid molecules that encode new chimeric insecticidal proteins. These insecticidal proteins address the current need in the art for the development of additional toxic insecticidal proteins with improved insecticidal properties, such as increased efficacy against a wider range of target insect pest species and different mechanisms of action. Members of this group of proteins, including the exemplary proteins provided herein, exhibit insecticidal activity against Lepidoptera pest species.
Термин сегмент или фрагмент используется в настоящем изобретении для описания непрерывных последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая раскрытый химерный инсектицидный белок. Сегмент или фрагмент, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых, также раскрыт в настоящем изобретении, если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующим участком химерного инсектицидного белка приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100% между сегментом или фрагментом и соответствующим участком химерного инсектицидного белка.The term segment or fragment is used in the present invention to describe continuous amino acid or nucleic acid sequences that are shorter than the full amino acid or nucleotide sequence describing the disclosed chimeric insecticidal protein. A segment or fragment exhibiting insect inhibitory activity is also disclosed in the present invention if alignment of such segment or fragment with the corresponding region of the chimeric insecticidal protein results in amino acid sequence identity of any percentage of a fraction from about 65% to about 100% between the segment or fragment and the corresponding a region of the chimeric insecticidal protein.
В контексте настоящей заявки термины активная или активность, пестицидная активность или пестицидная или инсектицидная активность, ингибитор в отношении насекомых или инсектицидная относятся к эффективности токсического агента, такого как инсектицидный белок, в ингибировании (ингибирование роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), подавлении (подавление роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), контроле (контроль заражения насекомымивредителями, контроль интенсивности питания насекомых-вредителей на определенной культуре, содержащей эффективное количество инсектицидного белка) или уничтожении (вызывающие заболеваемость, смертность или снижение плодовитости) вредителя. Данные термины охватывают результат обеспечения пестицидно эффективного количества инсектицидного белка вредителю, причем воздействие инсектицидного белка на вредителя приводит к заболеваемости, смертности, снижению плодовитости или задержке роста. Данные термины также включают отпугивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семян, растительных клеток или от конкретного географического местоположения, причем растение может расти, в результате обеспечения пестицидно эффективного количества инсектицидного белка в или на растении. В общем, пестицидная активность относится к способности токсичного агента быть эффективным в ингибировании роста, развития, жизнеспособности, кормового поведения, брачного поведения, плодовитости или любого измеримого снижения, вызванного неблагоприятными эффектами, в связи с предоставлением в рацион насекомого данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида, конкретному целевому вредителю, включая, но не ограничиваясь ими, насекомых отряда Lepidoptera. Инсектицидный белок может быть получен растением или может быть применен к растению или к окружающей среде в том месте, где находится растение. Термины биоактивность, эффективный, эффективный или их вариации также являются терминами, взаимозаменяемо используемыми в настоящем изобретении, для описания воздействия химерных инсектицидных белков согласно настоящему изобретению на целевых насекомых-вредителей.In the context of this application, the terms active or activity, pesticidal activity or pesticidal or insecticidal activity, insect inhibitor or insecticidal refer to the effectiveness of a toxic agent, such as an insecticidal protein, in inhibition (inhibition of growth, nutrition, fertility or viability), suppression (inhibition of growth, feeding, fecundity or viability), control (control of pest infestation, control of feeding intensity of insect pests on a particular crop containing an effective amount of an insecticidal protein) or eradication (causing morbidity, mortality or reduced fertility) of the pest. These terms encompass the result of providing a pesticidally effective amount of an insecticidal protein to a pest, wherein exposure of the insecticidal protein to the pest results in morbidity, mortality, reduced fertility, or stunted growth. The terms also include repelling a pest from a plant, plant tissue, plant part, seed, plant cell, or specific geographic location, which plant can grow by providing a pesticidally effective amount of insecticidal protein to or on the plant. In general, pesticidal activity refers to the ability of a toxic agent to be effective in inhibiting growth, development, viability, foraging behavior, mating behavior, fertility, or any measurable reduction caused by adverse effects, in connection with the provision of a given protein, protein fragment, segment protein or polynucleotide, a specific target pest, including, but not limited to, insects of the order Lepidoptera. The insecticidal protein may be produced by the plant or may be applied to the plant or to the environment where the plant is located. The terms bioactivity, effective, effective, or variations thereof are also terms used interchangeably in the present invention to describe the effect of the chimeric insecticidal proteins of the present invention on target insect pests.
Пестицидно эффективное количество токсического агента, обеспеченное в рационе целевого вредителя, проявляет пестицидную активность при контакте токсического агента с вредителем. Токсичным агентом может быть инсектицидный белок или один или более химических агентов, известных в данной области техники. Инсектицидные химические агенты и инсектицидные белковые агенты можно применять по отдельности или в комбинации друг с другом. Химические агенты включают, без ограничений, молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в целевом вредителе, органохлориды, органофосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Инсектицидные белковые агенты включают химерные инсектицидные белки, представленные в настоящем изобретении, а также другие белковые токсичные агенты, в том числе такие, которые нацелены на виды чешуекрылыхвредителей, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как Cry-белки, доступные в данной области техники для применения в борьбе с видами Coleoptera, Thysanoptera, Hemiptera и Homoptera.A pesticidally effective amount of the toxic agent provided in the diet of the target pest exhibits pesticidal activity upon contact of the toxic agent with the pest. The toxic agent may be an insecticidal protein or one or more chemical agents known in the art. The insecticidal chemical agents and insecticidal proteinaceous agents may be used alone or in combination with each other. Chemical agents include, without limitation, dsRNA molecules targeting specific genes for suppression in the target pest, organochlorides, organophosphates, carbamates, pyrethroids, neonicotinoids, and ryanoids. Insecticidal proteinaceous agents include the chimeric insecticidal proteins of the present invention, as well as other proteinaceous toxic agents, including those that target Lepidoptera pest species, as well as proteinaceous toxins that are used to control other plant pests, such as Cry proteins. available in the art for use in the control of Coleoptera, Thysanoptera, Hemiptera and Homoptera species.
Предполагается, что ссылка на вредителя, особенно вредителя сельскохозяйственного растения, означает вредителей культурных растений, особенно тех чешуекрылых-вредителей, которые контролируются описанными химерными инсектицидными белками. Однако ссылка на насекомого-вредителя может также включать насекомых-вредителей Coleoptera, Hemiptera и Homoptera, а также нематоды и грибы при тех условиях, когда токсичные агенты, нацеленные на этих вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с химерным инсектицидным белком или белком, который имеет от около 65 до около 100% идентичности с химерным инсектицидным белком.Reference to a pest, especially a crop pest, is intended to mean crop pests, especially those Lepidoptera pests controlled by the chimeric insecticidal proteins described. However, reference to insect pest may also include insect pests Coleoptera, Hemiptera and Homoptera, as well as nematodes and fungi, under conditions where the toxic agents that target these pests are colocalized or present with a chimeric insecticidal protein or a protein that has about 65 to about 100% identity with the chimeric insecticidal protein.
- 11 040097- 11 040097
Химерные инсектицидные белки, описанные в данном документе, демонстрируют инсектицидную активность по отношению к насекомым-вредителям из видов чешуекрылых насекомых, включая взрослых особей, куколок, личинок и новорожденных, а также представителей отряда Hemiptera, включая взрослых особей и нимф. Насекомые отряда Lepidoptera включают, без ограничений, совок луговых, совок, листоверток, и совок из семейства Noctuidae, например, кукурузную листовую совку (Spodoptera frugiperda), совку малую (Spodoptera exigua), совку латуковую (Mamestra configurata), совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку капустную (Trichoplusia ni), соевую совку (Pseudoplusia includens), совку бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), совку клеверную (Hupena scabra), табачную листовертку (Heliothis virescens), совку хлопковую (Agrotis subterranea), совку луговую (Pseudaletia unipuncta), совку прямоугольную (Agrotis orthogonia); точильщиков, чехлоносок, бабочек, дымчатых листоверток, гусениц бабочки капустницы и пироморфид из семейства Pyralidae, например, мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis), бабочку-огневку (Amyelois transitella), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), огневку подсолнечниковую (Homoeosoma electellum), точильщика зернового кукурузного (Elasmopalpus lignosellus); листоверток, огневок Шишковых, плодожорок, и плодовых листоверток из семейства Tortricidae, например, плодожорку яблонную (Cydia pomonella), листовертку виноградную (Endopiza viteana), листовертку восточную персиковую (Grapholita molesta), листовертку подсолнечника (Suleima helianthana); и многих других экономически важных представителей отряда Lepidoptera, например, капустную моль (Plutella xylostella), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella) и шелкопряда непарного (Lymantria dispar). Другие насекомые-вредители отряда Lepidoptera включает, например, Alabama argillacea (совка хлопковая американская), Archips argyrospila (листовертка плодовых деревьев), Archips rosana (листовертая резанная золотистая) и другие виды Archips, Chilo suppressalis (огневка азиатская стеблевая или желтая рисовая огневка), Cnaphalocrocis medinalis (листовертка рисовая), Crambus caliginosellus (кукурузная огневка), Crambus teterrellus (мотылек травяной), Diatraea grandiosella (огневка кукурузная юго-западная), Diatraea saccharalis (огневка сахарного тростника), Earias insulana (совка хлопковая египетская), Earias vittella (совка пятнистая), Helicoverpa armigera (совка американская), Helicoverpa zea (совка хлопковая или американская кукурузная совка), Heliothis virescens (табачная листовертка), Herpetogramma licarsisalis (луговой мотылек), Lobesia botrana (гроздевая листовертка), Phyllocnistis citrella (цитрусовая минурующая моль), Pieris brassicae (белянка капустная), Pieris rapae (репница или белянка репная), Plutella xylostella (капустная моль), Spodoptera exigua (совка малая), Spodoptera litura (азиатская хлопчатниковая совка, азиатская хлопковая совка) и Tuta absoluta (пасленовый минер).The chimeric insecticidal proteins described herein exhibit insecticidal activity against Lepidoptera insect pests, including adults, pupae, larvae, and neonates, as well as members of the order Hemiptera, including adults and nymphs. Insects of the order Lepidoptera include, but are not limited to, prairie armyworm, armyworm, leafworm, and armyworm from the family Noctuidae, e.g., corn armyworm (Spodoptera frugiperda), little armyworm (Spodoptera exigua), lettuce armyworm (Mamestra configurata), upsilon armyworm (Agrotis ipsilon), cabbage cutworm (Trichoplusia ni), soy cutworm (Pseudoplusia includens), velvet bean cutworm (Anticarsia gemmatalis), clover cutworm (Hupena scabra), tobacco leafworm (Heliothis virescens), cotton cutworm (Agrotis subterranea), meadow cutworm (Pseudaletia unipuncta), rectangular scoop (Agrotis orthogonia); borers, sheath-bearers, butterflies, smoky leafworms, caterpillars of cabbage butterflies and pyromorphids from the family Pyralidae, for example, stem corn borer (Ostrinia nubilalis), moth moth (Amyelois transitella), corn moth (Crambus caliginosellus), meadow borer (Herpetogramma licarsisalis), sunflower moth (Homoeosoma electellum), corn grinder (Elasmopalpus lignosellus); leafworm, cone moth, codling moth, and fruit leafworms from the Tortricidae family, for example, apple codling moth (Cydia pomonella), grape leafworm (Endopiza viteana), eastern peach leafworm (Grapholita molesta), sunflower leafworm (Suleima helianthana); and many other economically important members of the order Lepidoptera, such as the cabbage moth (Plutella xylostella), the pink bollworm (Pectinophora gossypiella) and the gypsy moth (Lymantria dispar). Other insect pests of the order Lepidoptera include, for example, Alabama argillacea (American cotton bollworm), Archips argyrospila (fruit tree leafworm), Archips rosana (golden leafworm) and other species of Archips, Chilo suppressalis (Asian stem moth or yellow rice moth), Cnaphalocrocis medinalis (rice leafworm), Crambus caliginosellus (corn moth), Crambus teterrellus (grass moth), Diatraea grandiosella (southwestern corn moth), Diatraea saccharalis (sugarcane moth), Earias insulana (Egyptian cotton moth), Earias vittella ( spotted cutworm), Helicoverpa armigera (American cutworm), Helicoverpa zea (cotton cutworm or American corn cutworm), Heliothis virescens (tobacco leafworm), Herpetogramma licarsisalis (meadow moth), Lobesia botrana (cluster leafworm), Phyllocnistis citrella (citrus miner moth) , Pieris brassicae (cabbage white), Pieris rapae (turnip silt and turnip bollworm), Plutella xylostella (cabbage moth), Spodoptera exigua (small cutworm), Spodoptera litura (Asian cotton bollworm, Asian cotton bollworm) and Tuta absoluta (nightshade miner).
В контексте настоящей заявки термин изолированная молекула ДНК или эквивалентный термин или фраза означает, что молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не в ее естественной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, терминирующая последовательность транскрипции и т.п., которые, естественно, находятся в ДНК генома организма, не считаются выделенными до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природе. Тем не менее, каждый из этих элементов и их части были бы выделены в рамках настоящего раскрытия при условии, если элемент находится внутри генома организма и в том месте в геноме, в котором он естественным образом находится. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, если нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой естественным образом находится последовательность, кодирующая белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность природного инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей настоящего раскрытия. Для целей настоящего раскрытия любая трансгенная нуклеотидная последовательность, т.е. нуклеотидная последовательность ДНК, вставленная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, считается выделенной нуклеотидной последовательностью, независимо от того, присутствует ли она внутри плазмиды или подобной структуры, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии.In the context of this application, the term isolated DNA molecule or an equivalent term or phrase means that a DNA molecule is a DNA molecule that is present alone or in combination with other compositions, but not in its natural environment. For example, nucleic acid elements such as a coding sequence, an intron sequence, an untranslated leader sequence, a promoter sequence, a transcription termination sequence, and the like, which are naturally found in the DNA of an organism's genome, are not considered isolated as long as the element is in the organism's genome and at the location in the genome where it occurs naturally. However, each of these elements and portions thereof would be isolated within the scope of this disclosure provided that the element is within the organism's genome and at the location in the genome where it naturally occurs. Similarly, a nucleotide sequence encoding an insecticidal protein, or any naturally occurring insecticidal variant of that protein, will be an isolated nucleotide sequence if the nucleotide sequence is not found in the DNA of a bacterium that naturally contains the sequence encoding the protein. A synthetic nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a natural insecticidal protein will be considered isolated for the purposes of this disclosure. For the purposes of this disclosure, any transgenic nucleotide sequence, i. a DNA nucleotide sequence inserted into the genome of a plant or bacterium cell or present in an extrachromosomal vector is considered an isolated nucleotide sequence, whether it is present within a plasmid or similar structure used for cell transformation, in the genome of a plant or bacterium, or present in detectable amounts in tissues, progeny, biological samples or commercial products derived from a plant or bacterium.
Как описано далее в примерах, при помощи химерогенеза из доменов протоксина и токсина известных инсектицидных токсинов (называемые в данном документе исходные белки) сконструировали около восьмисот сорока четырех нуклеотидных последовательностей, которые кодируют химерные инсектицидные белки, и экспрессировали и проводили испытание в биотесте на активность в отношении чешуекрылых. Небольшое количество сконструированных химерных инсектицидных белков продемонстрировало повышенную активность в отношении чешуекрылых или усиленный спектр в отношении чешуекрылых по сравнению с исходными белками, из которых были получены его токсиновые компоненты.As described in the examples below, about eight hundred and forty-four nucleotide sequences were constructed from the protoxin and toxin domains of known insecticidal toxins (referred to herein as parent proteins) by chimerogenesis, which encode chimeric insecticidal proteins, and were expressed and tested in a bioassay for activity against Lepidoptera. A small number of engineered chimeric insecticidal proteins have shown increased activity against Lepidoptera or increased spectrum against Lepidoptera compared to the original proteins from which its toxin components were derived.
Данные новые химерные инсектицидные белки с повышенной активностью в отношении чешуекрылых или усиленным спектром в отношении чешуекрылых были сконструированы из следующих проThese new chimeric insecticidal proteins with increased activity against Lepidoptera or enhanced spectrum against Lepidoptera were constructed from the following
- 12 040097 токсиновых и токсиновых доменов исходных инсектицидных белков: CrylAh (домен I), CrylBbl (домены I и II), Cry1Ве2 (домены I и II), Cry1Ja1 (домены I и II), Cry1Fa1 (домены I и II), Cry1Ac (домен II и протоксин), Cry1Ca (домен III и протоксин), Cry1Ka (домен III и протоксин), Cry1Jx (домен III), Cry1Ab (домен III), Cry1Ab3 (протоксин), Cry1Da1 (протоксин), Cry4 (протоксин), Cry9 (протоксин), Cry1Be (протоксин) и Cry1Ka (протоксин).- 12 040097 toxin and toxin domains of the original insecticidal proteins: CrylAh (domain I), CrylBbl (domains I and II), Cry1Be2 (domains I and II), Cry1Ja1 (domains I and II), Cry1Fa1 (domains I and II), Cry1Ac (domain II and protoxin), Cry1Ca (domain III and protoxin), Cry1Ka (domain III and protoxin), Cry1Jx (domain III), Cry1Ab (domain III), Cry1Ab3 (protoxin), Cry1Da1 (protoxin), Cry4 (protoxin), Cry9 (protoxin), Cry1Be (protoxin) and Cry1Ka (protoxin).
В частности, новые химерные инсектицидные белки согласно настоящему изобретению с повышенной активностью в отношении чешуекрылых или усиленным спектром чешуекрылых включают следующие комбинации протоксинов и доменов: TIC1100/SEQ ID NO: 4 (домен I-Cry1Ah, домен II-Cry1Ac, домен III-Cry1Ca, протоксин-Сгу1Ас), TIC860/SEQ ID NO: 7 (домен I-Cry1Bb1, домен II-Cry1BB1, домен III-Cry1Ca, протоксин-Сгу1Ас), TIC867/SEQ ID NO: 10 (домен I-Cry1Be2, домен II-Cry1Be2, домен IIICry1Ka, протоксин-Сгу1АЬЗ), TIC868/SEQ ID NO: 28 (домен I-Cry1Be2, домен II-Cry1Be2 и домен IIICry1Ca, протоксин-Сгу1АЬЗ), TIC869/SEQ ID NO: 50 (домен I-Cry1Ja1, домен II-Cry1Ja1, домен IIICry1Jx, протоксин-Сгу1АЬЗ) и TIC836/SEQ ID NO: 53 (домен I-Cry1Fa1, домен II-Cry1Fa1, домен IIICry1Ab, протоксин-Сгу1Ас).In particular, novel chimeric insecticidal proteins of the present invention with increased activity against Lepidoptera or enhanced spectrum of Lepidoptera include the following combinations of protoxins and domains: TIC1100/SEQ ID NO: 4 (domain I-Cry1Ah, domain II-Cry1Ac, domain III-Cry1Ca, protoxin-Cry1Ac), TIC860/SEQ ID NO: 7 (domain I-Cry1Bb1, domain II-Cry1BB1, domain III-Cry1Ca, protoxin-Cry1Ac), TIC867/SEQ ID NO: 10 (domain I-Cry1Be2, domain II-Cry1Be2 , domain IIICry1Ka, protoxin-Cry1Ab3), TIC868/SEQ ID NO: 28 (domain I-Cry1Be2, domain II-Cry1Be2 and domain IIICry1Ca, protoxin-Cry1Ab3), TIC869/SEQ ID NO: 50 (domain I-Cry1Ja1, domain II -Cry1Ja1, domain IIICry1Jx, protoxin-Cry1Ab3) and TIC836/SEQ ID NO: 53 (domain I-Cry1Fa1, domain II-Cry1Fa1, domain IIICry1Ab, protoxin-Cry1Ac).
Варианты, в которые вводили аминокислотные замены или альтернативные протоксиновые домены, также были конструированы для химерных инсектицидных белков TIC867 и TIC868. В частности, данные варианты TIC867 и TIC868 включают следующие аминокислотные замены или альтернативные протоксиновые домены: TIC867_20/SEQ ID NO: 13 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Da1), TIC867_21/SEQ ID NO: 16 (альтернативный протоксиновый домен Cry4), TIC867_22/SEQ ID NO: 19 (альтернативный протоксиновый домен Cry9), TIC867_23/SEQ ID NO: 2l (альтернативный протоксиновый домен Cry1Be), TIC867_24/SEQ ID NO: 23 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Ka), TIC867_25/SEQ ID NO: 25 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Ka), TIC868_9/SEQ ID NO: 30 (аминокислотная модификация N240S_Y343Q_N349T), TIC868_10/SEQ ID NO: 33 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Da1), TIC868_11/SEQ ID NO: 36 (альтернативный протоксиновый домен Cry4), TIC868_12/SEQ ID NO: 39 (альтернативный домен протоксина Cry 9), TIC868_13/SEQ ID NO: 41 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Be), TIC868_14/SEQ ID NO: 43 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Ka), TIC868_15/SEQ ID NO: 45 (альтернативный протоксиновый домен Cry1Ca) и TIC868_29/SEQ ID NO: 47 (модификация аминокислоты Q136Y_Y343Q_N349T).Variants in which amino acid substitutions or alternative protoxin domains have been introduced have also been constructed for the TIC867 and TIC868 chimeric insecticidal proteins. In particular, these TIC867 and TIC868 variants include the following amino acid substitutions or alternative protoxin domains: TIC867_20/SEQ ID NO: 13 (Cry1Da1 alternative protoxin domain), TIC867_21/SEQ ID NO: 16 (Cry4 alternative protoxin domain), TIC867_22/SEQ ID NO : 19 (Cry9 alternate protoxin domain), TIC867_23/SEQ ID NO: 2l (Cry1Be alternate protoxin domain), TIC867_24/SEQ ID NO: 23 (Cry1Ka alternate protoxin domain), TIC867_25/SEQ ID NO: 25 (Cry1Ka alternate protoxin domain) , TIC868_9/SEQ ID NO: 30 (amino acid modification N240S_Y343Q_N349T), TIC868_10/SEQ ID NO: 33 (alternative Cry1Da1 protoxin domain), TIC868_11/SEQ ID NO: 36 (alternative Cry4 protoxin domain), TIC868_12/SEQ ID NO: 39 ( Cry 9 protoxin alternative domain), TIC868_13/SEQ ID NO: 41 (Cry1Be alternative protoxin domain), TIC868_14/SEQ ID NO: 43 (Cry1Ka alternative protoxin domain), TIC868_15/SEQ ID NO: 45 (Protoxin alternative th Cry1Ca domain) and TIC868_29/SEQ ID NO: 47 (amino acid modification Q136Y_Y343Q_N349T).
Как продемонстрировано в примерах, у каждого из этих вариантов TIC867 и TIC868 изменена активность в отношении чешуекрылых и/или снижен спектр активности исходного химерного инсектицидного белка в отношении чешуекрылых, указывая, таким образом, на то, что альтернативный протоксиновый домен и аминокислотные замены имели прямое влияние на инсектицидную активность и спектр химерных инсектицидных белков TIC867 и TIC868.As demonstrated in the examples, each of these variants of TIC867 and TIC868 has an altered lepidoptera activity and/or reduced lepidoptera activity spectrum of the parent chimeric insecticidal protein, thus indicating that the alternative protoxin domain and amino acid substitutions had a direct effect on insecticidal activity and spectrum of chimeric insecticidal proteins TIC867 and TIC868.
Многие из химерных инсектицидных белков демонстрируют инсектицидную активность в отношении многочисленных видов чешуекрылых насекомых-вредителей. В частности, новые химерные инсектицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, проявляют активность в отношении одного или более из следующих чешуекрылых насекомых-вредителей: совки бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis), огневки сахарного тростника (SCB, Diatraea saccharalis), точильщика зернового кукурузного (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), американской кукурузной совки (CEW, Helicoverpa zea), соевой совки (SPW, Helicoverpa zea), совки хлопковой CBW, Helicoverpa zea), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), черной совки (BLAW, Spodoptera cosmioides), южной совки (SAW, Spodoptera eridania), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), совки малой (BAW, Spodoptera exigua), совки американской (OBW, Helicoverpa armigera), азиатской хлопковой совки (OLW, Spodoptera litura), розового коробочного червя (PBW, Pectinophora gossypiella), огневки кукурузной юго-западной (SWCB, Diatraea grandiosella), шиповатого северного коробочного червя (SBW, Earias vitella), южноамериканской совки (SABW, Helicoverpa gelotopeon) и пяденицы подсолнечниковой (SFL, Rachiplusia nu). Таким образом, иллюстративные белки, описанные в настоящем изобретении, связаны общей функцией и проявляют инсектицидную активность в отношении видов насекомыхвредителей из отряда Lepidoptera, включая взрослых особей, личинок и куколок.Many of the chimeric insecticidal proteins exhibit insecticidal activity against numerous species of Lepidoptera insect pests. In particular, the novel chimeric insecticidal proteins disclosed in the present invention exhibit activity against one or more of the following Lepidoptera insect pests: Velvet bean cutworm (VBC, Anticarsia gemmatalis), Sugar cane moth (SCB, Diatraea saccharalis), Corn borer (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), American corn armyworm (CEW, Helicoverpa zea), soybean armyworm (SPW, Helicoverpa zea), cotton bollworm CBW, Helicoverpa zea), tobacco leafworm (TBW, Heliothis virescens), soybean armyworm (SBL, Chrysodeixis includens ), Black armyworm (BLAW, Spodoptera cosmioides), Southern armyworm (SAW, Spodoptera eridania), Corn armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), Little armyworm (BAW, Spodoptera exigua), American armyworm (OBW, Helicoverpa armigera), Asian cotton armyworm cutworm (OLW, Spodoptera litura), pink bollworm (PBW, Pectinophora gossypiella), southwestern corn moth (SWCB, Diatraea grandiosella), northern spiny o bollworm (SBW, Earias vitella), South American armyworm (SABW, Helicoverpa gelotopeon) and sunflower moth (SFL, Rachiplusia nu). Thus, the exemplary proteins described herein share a common function and exhibit insecticidal activity against insect pest species of the order Lepidoptera, including adults, larvae, and pupae.
Белки, которые напоминают химерные инсектицидные белки, могут быть идентифицированы путем сравнения друг с другом с использованием различных компьютерных алгоритмов, известных в данной области техники. Например, идентичность аминокислотных последовательностей белков, связанных с химерными инсектицидными белками, может быть проанализирована с использованием выравнивания Clustal W с использованием этих параметров по умолчанию: матрица сравнения: весы, штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,0, штраф на продолжение делеции: 0,05, гидрофильные делеции: вкл, гидрофильные остатки: GPSNDQERK, штраф на остаткоспецифические делеции: вкл (Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент идентичности аминокислот далее рассчитывают в виде выражения: 100% умноженные на (идентичность аминокислот/длина заявленного белка). Другие алгоритмы выравнивания, также доступные в данной области техники, обеспечивают результаты, аналогичные результатам, полученным с использованием выравнивания Clustal W, и рассмотрены в настоящем изобретении.Proteins that resemble chimeric insecticidal proteins can be identified by comparison with each other using various computer algorithms known in the art. For example, amino acid sequence identity of proteins associated with chimeric insecticidal proteins can be analyzed using Clustal W alignment using these default parameters: comparison matrix: weights, alignment deletion penalty: 10.0, deletion extension penalty: 0 .05, hydrophilic deletions: on, hydrophilic residues: GPSNDQERK, residue specific deletion penalty: on (Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Percent amino acid identity is further calculated as: 100% times (amino acid identity/claimed protein length). Other alignment algorithms also available in the art provide similar results to those obtained using Clustal W alignment and are discussed in the present invention.
Предполагается, что искомый белок, проявляющий ингибирующую активность в отношении насеIt is assumed that the desired protein exhibiting inhibitory activity against insects
- 13 040097 комых, раскрыт в настоящем изобретении, если выравнивание такого искомого белка с исследуемыми химерными инсектицидными белками, указанными в- 13 040097 lumps, is disclosed in the present invention, if the alignment of such a desired protein with the investigated chimeric insecticidal proteins specified in
SEQSEQ
ID NO: 4, 7, 10, 13, 16, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 33, 36, 39, 41,ID NO: 4, 7, 10, 13, 16, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 33, 36, 39, 41,
43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,
77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109 и 111 дает в результате по меньшей мере около107, 109 and 111 results in at least about
64%, 65%,64%, 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,
79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или около 100% идентичности аминокислотной последовательности (или любой процент в данном диапазоне) между искомым и исследуемым белком.92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100% amino acid sequence identity (or any percentage within this range) between the protein of interest and the protein of interest.
Как описано далее в примерах настоящей заявки, синтетические или искусственные последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, были сконструированы для применения в растениях. Иллюстративные синтетические нуклеотидные последовательности, которые были сконструированы для применения в растениях, указаны вAs described further in the examples of this application, synthetic or artificial sequences encoding chimeric insecticidal proteins have been designed for use in plants. Illustrative synthetic nucleotide sequences that have been designed for use in plants are listed in
SEQ ID NO: 2 и3 (TIC1100), SEQ ID NO: 6 (TIC860), SEQ ID NO: 9 (TIC867), SEQ IDSEQ ID NO: 2 and 3 (TIC1100), SEQ ID NO: 6 (TIC860), SEQ ID NO: 9 (TIC867), SEQ ID
NO: 12 (TIC867_20), SEQ ID NO: 15 (TIC867_21), SEQ ID NO:18 (TIC867_22), SEQ ID NO: 20 (TIC867_23), SEQ ID NO:22 (TIC867_24), SEQ ID NO: 24 (TIC867_25), SEQ ID NO:27 (TIC868),NO: 12 (TIC867_20), SEQ ID NO: 15 (TIC867_21), SEQ ID NO: 18 (TIC867_22), SEQ ID NO: 20 (TIC867_23), SEQ ID NO: 22 (TIC867_24), SEQ ID NO: 24 (TIC867_25) ), SEQ ID NO:27 (TIC868),
SEQ ID NO: 29 (TIC868_9), SEQ ID NO: 32 (TIC868_10), SEQ ID NO:SEQ ID NO: 29 (TIC868_9), SEQ ID NO: 32 (TIC868_10), SEQ ID NO:
(TIC868_11), SEQ ID NO: 38 (TIC868_12), SEQ ID NO: 40 (TIC868_13), SEQ ID NO: 42 (TIC868_14), SEQ ID NO: 44 (TIC868_15), SEQ ID NO: 46 (TIC868_29), SEQ ID NO: 49 (TIC869) и(TIC868_11), SEQ ID NO: 38 (TIC868_12), SEQ ID NO: 40 (TIC868_13), SEQ ID NO: 42 (TIC868_14), SEQ ID NO: 44 (TIC868_15), SEQ ID NO: 46 (TIC868_29), SEQ ID NO: 49 (TIC869) and
SEQ ID NO: 52 (TIC836), SEQ ID NO: 112 и 113 (TIC713), SEQ IDSEQ ID NO: 52 (TIC836), SEQ ID NO: 112 and 113 (TIC713), SEQ ID
NO: 114 (TIC843), SEQ ID NO: 115 (TIC862), SEQ ID NO: 116 (TIC1099), SEQ ID NO: 117 (TIC1103), SEQ ID NO: 118 (TIC845), SEQ ID NO: 119 (TIC846), SEQ ID NO: 120 (TIC858), SEQ ID NO: 121 (TIC866) , SEQ ID NO: 122 (TIC838), SEQ ID NO: 123 (TIC841), SEQNO: 114 (TIC843), SEQ ID NO: 115 (TIC862), SEQ ID NO: 116 (TIC1099), SEQ ID NO: 117 (TIC1103), SEQ ID NO: 118 (TIC845), SEQ ID NO: 119 (TIC846) ), SEQ ID NO: 120 (TIC858), SEQ ID NO: 121 (TIC866) , SEQ ID NO: 122 (TIC838), SEQ ID NO: 123 (TIC841), SEQ
ID NO: 124 (TIC842), SEQ ID NO: 125 (TIC850), SEQ ID NO: 126 (TIC859) , SEQ ID NO: 127 (TIC861), SEQ ID NO: 128 (TIC848), SEQID NO: 124 (TIC842), SEQ ID NO: 125 (TIC850), SEQ ID NO: 126 (TIC859) , SEQ ID NO: 127 (TIC861), SEQ ID NO: 128 (TIC848), SEQ
ID NO: 129 (TIC849), и SEQ ID NO: 130 (TIC847).ID NO: 129 (TIC849), and SEQ ID NO: 130 (TIC847).
Для экспрессии в растительных клетках химерные инсектицидные белки могут экспрессироваться так, чтобы они находились в цитозоле или были нацелены на различные органеллы растительной клетки. Например, нацеливание белка на хлоропласт может приводить к увеличению уровней экспрессированного белка в трансгенном растении, предотвращая появление признаков иных фенотипов. Нацеливание может также приводить к повышению резистентности к вредителям у трансгенного объекта. Целевой пептид или транзитный пептид представляет собой короткую пептидную цепь (длиной 3-70 аминокислот), которая направляет перенос белка в определенную область клетки, включая ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), хлоропласт, апопласт, пероксисому и плазматическую мембрану. Некоторые сигнальные пептиды отщепляются от белка под действием сигнальной пептидазы после транспортирования белков. Для нацеливания на хлоропласт белки содержат транзитные пептиды, которые содержат около 40-50 аминокислот. Для описания применения хлоропластных транзитных пептидов см. патенты США №№ 5188642 и 5728925. Многие локализованные на хлоропласте белки экспрессируются из ядерных генов как предшественники и нацелены на хлоропласт транзитным пептидом хлоропласта (ТПХ). Примеры таких выделенных хлоропластных белков включают, без ограничений, такие, которые связаны с малой субъединицей (МСУ) рибулозо-1,5,-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксином, ферFor expression in plant cells, the chimeric insecticidal proteins can be expressed so that they reside in the cytosol or are targeted to different plant cell organelles. For example, targeting a protein to a chloroplast can increase the levels of expressed protein in a transgenic plant, preventing the appearance of other phenotype traits. Targeting can also lead to increased pest resistance in the transgenic event. The target peptide or transit peptide is a short peptide chain (3-70 amino acids long) that directs protein transport to a specific region of the cell, including the nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum (ER), chloroplast, apoplast, peroxisome, and plasma membrane. Some signal peptides are cleaved from the protein by signal peptidase after protein transport. For chloroplast targeting, proteins contain transit peptides that contain about 40-50 amino acids. For a description of the use of chloroplast transit peptides, see US Pat. Examples of such isolated chloroplast proteins include, without limitation, those associated with the small subunit (SSU) of ribulose-1,5,-bisphosphate carboxylase, ferredoxin, fer
- 14 040097 редоксин-оксидоредуктазой, белком I и белком II светособирающего комплекса, тиоредоксином F, енолпируват шикимат фосфатсинтазой (ЕПШФС) и транзитными пептидами, описанными в патенте США № 7193133. В условиях in vivo и in vitro было продемонстрировано, что нехлоропластные белки могут быть нацелены на хлоропласт с использованием белковых гибридов с гетерологичным ТПХ и что наличия ТПХ достаточно для нацеливания белка на хлоропласт. Включение подходящего хлоропластного транзитного пептида, такого как ЕПШФС ТПХ Arabidopsis thaliana (ТПХ2) (см. Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) или ЕПШФС ТПХ Petunia hybrid (ТПХ4) (см., della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83: 6873-6877, 1986) было показано, что они нацеливают гетерологичные последовательности белка ЕПШФС на хлоропласты в трансгенных растениях (см., патенты США №№ 5627061, 5633435 и 5312910 и EP 0218571, EP 189707, EP 508909 и EP 924299). Для нацеливания химерных инсектицидных белков на хлоропласт последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропласта, расположена 5' в функциональной связи и в рамке к синтетической кодирующей последовательности, кодирующей химерный инсектицидный белок, который был сконструирован для оптимальной экспрессии в растительных клетках.- 14 040097 redoxin oxidoreductase, light-harvesting complex protein I and protein II, thioredoxin F, enolpyruvate shikimate phosphate synthase (EPSPS), and transit peptides described in US Pat. No. 7,193,133. target the chloroplast using heterologous CTP protein fusions and that the presence of CTP is sufficient to target the protein to the chloroplast. Incorporation of a suitable chloroplast transit peptide, such as Arabidopsis thaliana EPSPS TPX (TPX2) (see Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) or Petunia hybrid EPSPS TPX (TPX4) (see della -Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83: 6873-6877, 1986) have been shown to target heterologous EPSP protein sequences to chloroplasts in transgenic plants (see U.S. Patent Nos. 5,627,061, 5,633,435 and 5,312,910 and EP 0218571, EP 189707, EP 508909 and EP 924299). To target the chimeric insecticidal proteins to the chloroplast, the sequence encoding the chloroplast transit peptide is 5' operably linked and in frame to a synthetic coding sequence encoding the chimeric insecticidal protein that has been engineered for optimal expression in plant cells.
Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие данные синтетические или искусственные нуклеотидные последовательности, конструировали и вводили в клетки растений кукурузы, хлопка и сои в соответствии со способами и методиками трансформации, которые известны в данной области техники. Трансформированные клетки регенерировали в трансформированные растения, которые, как было обнаружено, экспрессировали химерный инсектицидный белок. Для проверки пестицидной активности, биотестирование проводили в присутствии личинок чешуекрылых-вредителей с использованием дисков листьев растений, полученных из трансформированных растений. Рассматриваются композиции молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют химерные инсектицидные белки. Например, химерные инсектицидные белки могут быть экспрессированы конструктами рекомбинантной ДНК, в которых молекула полинуклеотида с ORF, кодирующим химерный инсектицидный белок, функционально связана с генетическими экспрессионными элементами, такими как промотор, и любым другим регуляторным элементом, необходимым для экспрессии в системе, для которых предназначен конструкт. Неограничивающие примеры включают растительный функциональный промотор, функционально связанный с синтетическим химерным инсектицидным белком, кодирующим последовательности, для экспрессии химерного инсектицидного белка в растениях, или Bt-функциональный промотор функционально связанный с последовательностью, кодирующей химерный инсектицидный белок, для экспрессии белка в Bt-бактерии или в другом Bacillus. Другие элементы могут быть функционально связаны с последовательностями, кодирующими химерные инсектицидные белки, включая, без ограничений, энхансеры, интроны, нетранслируемые лидеры, кодированные белковые иммобилизационные метки (гистидиновая метка), транслокационные пептиды (т.е. пластидные транзитные пептиды, сигнальные пептиды), полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени РНКи.Expression cassettes and vectors containing these synthetic or artificial nucleotide sequences were constructed and introduced into corn, cotton and soybean plant cells according to transformation methods and techniques known in the art. The transformed cells were regenerated into transformed plants which were found to express the chimeric insecticidal protein. To test for pesticidal activity, biotesting was carried out in the presence of larvae of Lepidoptera pests using plant leaf discs obtained from transformed plants. Compositions of recombinant nucleic acid molecules that encode chimeric insecticidal proteins are considered. For example, chimeric insecticidal proteins can be expressed by recombinant DNA constructs in which the ORF polynucleotide molecule encoding the chimeric insecticidal protein is operably linked to genetic expression elements, such as a promoter, and any other regulatory element necessary for expression in the system for which the chimeric insecticidal protein is intended. construct. Non-limiting examples include a plant functional promoter operably linked to a synthetic chimeric insecticidal protein coding sequence to express the chimeric insecticidal protein in plants, or a Bt functional promoter operably linked to a chimeric insecticidal protein coding sequence to express the protein in a Bt bacterium or in another Bacillus. Other elements may be operably linked to sequences encoding chimeric insecticidal proteins, including, but not limited to, enhancers, introns, untranslated leaders, encoded protein immobilization tags (histidine tag), translocation peptides (i.e., plastid transit peptides, signal peptides), polypeptide sequences for post-translational modifying enzymes, ribosome binding sites and RNAi target sites.
Приведенные в данном документе примеры рекомбинантных полинуклеотидных молекул включают, без ограничений, гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, таким какExamples of recombinant polynucleotide molecules provided herein include, without limitation, a heterologous promoter operably linked to a polynucleotide such as
SEQSEQ
ID NO: 1, 2,ID NO: 1, 2,
3,3,
5, 6, 8,5, 6, 8,
9,9,
11,eleven,
12,12,
14,14,
15,15,
17,17,
18,18,
20,20,
22,22,
24,24,
26,26,
27,27,
29,29,
31,31,
32,32,
34,34,
35,35,
37,37,
38,38,
40,40,
42,42,
44,44,
46,46,
48,48,
49,49,
51,51,
52,52,
54,54,
56,56,
58,58,
60,60,
62,62,
64,64,
66,66,
68,68,
70,70,
72,72,
74,74,
76,76,
78,78,
80,80,
82,82,
84,84,
86,86
88,88,
90,90,
92,92,
94,94,
96,96,
98,98,
100,100,
102, 104, 106,102, 104, 106
108,108
110, 112, 113,110, 112, 113,
114,114
115, 116, 117,115, 116, 117
118,118,
119,119
120, 121, 122,120, 121, 122
123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 и123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 and
130, который кодирует полипептид или белок, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в130, which encodes a polypeptide or protein containing the amino acid sequence specified in
SEQ ID NO:SEQID NO:
(TIC1100), (TIC860), 10 (TIC867), 13 (TIC867 20), 16 (TIC867 21), (TIC867 22), (TIC867 23), (TIC867 24) , 25 (TIC867 25), (TIC868), 30 (TIC868 9), 33 (TIC868 10), 36 (TIC868 11), (TIC867 12), (TIC867 13) , (TIC867 14) , 45 (TIC867 15), (TIC867 29), (TIC869), 53 (TIC836), 55 (TIC713), 57 (TIC843), (TIC862), (TIC1099), (TIC1099-T507E), 65 (TIC1099- 15 040097(TIC1100), (TIC860), 10 (TIC867), 13 (TIC867 20), 16 (TIC867 21), (TIC867 22), (TIC867 23), (TIC867 24) , 25 (TIC867 25), (TIC868), 30 (TIC868 9), 33 (TIC868 10), 36 (TIC868 11), (TIC867 12), (TIC867 13) , (TIC867 14) , 45 (TIC867 15), (TIC867 29), (TIC869), 53 ( TIC836), 55 (TIC713), 57 (TIC843), (TIC862), (TIC1099), (TIC1099-T507E), 65 (TIC1099- 15 040097
R522K) , 67 (TIC1099-K490S ) , 69 (TIC1099-T562R), 71 (TIC1099S533R) , 73 (TIC1099-G498D), 75 (TIC1099-K490A), 77 (TIC1099E564A), 79 (TIC1103), 81 (TIC1101), 83 (TIC845), 85 (TIC846), 87 (TIC858), 89 (TIC865), 91 (TIC866), 93 (TIC838), 95 (TIC839), 97 (TIC841), 99 (TIC842), 101 (TIC850), 103 (TIC859), 105 (TIC861), 107 (TIC848), 109 (TIC849) и 111 (TIC847).R522K) , 67 (TIC1099-K490S ), 69 (TIC1099-T562R), 71 (TIC1099S533R) , 73 (TIC1099-G498D), 75 (TIC1099-K490A), 77 (TIC1099E564A), 79 (TIC1103), 81 , 83 (TIC845), 85 (TIC846), 87 (TIC858), 89 (TIC865), 91 (TIC866), 93 (TIC838), 95 (TIC839), 97 (TIC841), 99 (TIC842), 101 (TIC850) , 103 (TIC859), 105 (TIC861), 107 (TIC848), 109 (TIC849) and 111 (TIC847).
Гетерологичный промотор также может быть функционально связан с синтетическими кодирующими последовательностями ДНК, кодирующими химерный инсектицидный белок, нацеленный на пластиду, и ненацеленный химерный инсектицидный белок. Предполагается, что кодоны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие химерный инсектицидный белок, описанный в данном документе, могут быть заменены синонимичными кодонами (известны в данной области техники как молчащие замены).The heterologous promoter can also be operably linked to synthetic DNA coding sequences encoding a plastid-targeted chimeric insecticidal protein and a non-targeted chimeric insecticidal protein. It is contemplated that the codons of the recombinant nucleic acid molecule encoding the chimeric insecticidal protein described herein may be replaced by synonymous codons (known in the art as silent substitutions).
Молекула рекомбинантной ДНК или конструкт, содержащий последовательность, кодирующую химерный инсектицидный белок, может дополнительно содержать область ДНК, которая кодирует один или более токсичных агентов, которые могут быть сконструированы для одновременной экспрессии или совместной экспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей химерный инсектицидный белок, отличный от химерного инсектицидного белка, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых, или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают, без исключений, кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые способствуют повышению эффективности агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, например способствуя его экспрессии, влияя на его стабильность в растениях, оптимизируя свободную энергию для олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая спектр его активности. Вспомогательный белок может облегчать захват одного или более агентов, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, например, или усиливать токсическое действие токсического агента.A recombinant DNA molecule or construct containing a sequence encoding a chimeric insecticidal protein may further comprise a region of DNA that encodes one or more toxic agents that can be engineered to be co-expressed or co-expressed with a DNA sequence encoding a chimeric insecticidal protein other than the chimeric one. an insecticidal protein, a dsRNA molecule having insect inhibitory activity, or an accessory protein. Accessory proteins include, without limitation, cofactors, enzymes, binding partners, or other agents that enhance the effectiveness of an insect inhibitory agent, for example by promoting its expression, affecting its stability in plants, optimizing free energy for oligomerization, increasing its toxicity and increasing the spectrum of its activity. The accessory protein may facilitate the uptake of one or more insect inhibitory agents, for example, or enhance the toxic effect of the toxic agent.
Молекулу или конструкт рекомбинантной ДНК можно собирать так, чтобы все белки или молекулы дцРНК экспрессировали из одного промотора, или каждый белок или молекулу дцРНК экспрессировали под контролем отдельного промотора, или в определенной их комбинации. Белки согласно настоящему изобретению могут быть экспрессированы из мультигенной экспрессирующей системы, в которой химерный инсектицидный белок экспрессируется из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от выбранного типа экспрессирующей системы. Например, бактериальная мультигенная экспрессирующая система может использовать единственный промотор для управления экспрессией множественных/тандемных открытых рамок считывания из одного оперона (то есть полицистронная экспрессия). В другом примере растительная мультигенная экспрессирующая система может использовать многократно несвязанные экспрессионные кассеты, каждая из которых экспрессирует другой белок или другой токсичный агент, такой как одна или более молекул дцРНК.The recombinant DNA molecule or construct can be assembled such that all proteins or dsRNA molecules are expressed from a single promoter, or each protein or dsRNA molecule is expressed under the control of a single promoter, or in some combination thereof. The proteins of the present invention can be expressed from a multigene expression system in which the chimeric insecticidal protein is expressed from a common nucleotide segment that also contains other open reading frames and promoters, depending on the type of expression system chosen. For example, a bacterial multigene expression system may use a single promoter to drive the expression of multiple/tandem open reading frames from a single operon (ie, polycistronic expression). In another example, a plant multigene expression system may use multiple unlinked expression cassettes, each expressing a different protein or other toxic agent, such as one or more dsRNA molecules.
Рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность, кодирующую химерный инсектицидный белок, могут быть доставлены в клетки-хозяева векторами, например плазмидой, бакуловирусом, синтетической хромосомой, вирионом, космидой, фагемидой, фагом или вирусным вектором. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или транзиентной экспрессии последовательности, кодирующей химерный инсектицидный белок, в клетке-хозяине, или более поздней экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или конструкт рекомбинантной ДНК, которая содержит последовательность, кодирующую химерный инсектицидный белок, и которая вводится в клетку-хозяин, упоминаемая в данном документе как трансген.Recombinant nucleic acid molecules or recombinant DNA constructs containing a sequence encoding a chimeric insecticidal protein can be delivered to host cells by vectors, such as a plasmid, baculovirus, synthetic chromosome, virion, cosmid, phagemid, phage, or viral vector. Such vectors can be used to achieve stable or transient expression of the chimeric insecticidal protein coding sequence in the host cell, or later expression of the encoded polypeptide. An exogenous recombinant polynucleotide or recombinant DNA construct that contains a sequence encoding a chimeric insecticidal protein and that is introduced into a host cell, referred to herein as a transgene.
В данном документе предложены трансгенные бактерии, трансгенные растительные клетки, трансгенные растения и части трансгенных растений, которые содержат полинуклеотид, который кодирует любой один или более химерных инсектицидных белков. Термин бактериальная клетка или бактерия может включать, без ограничений, клетку Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas или Rhizobium. Термин растительная клетка или растение может включать, без ограничений, клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. Рассматриваемые растения и растительные клетки включают, без ограничений, клетку или растение люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, моркови, маниока, клещевины, цветной капусты, сельдерей, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, клевера, хлопчатника, тыквы, огурца, ели Дугласа, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата, сосны Лоблолли, просо, дыни, грецкого ореха, овса, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, злака, ржи, американского шафрана, кустарник, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, просо, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза, пшеницы. В некоторыхProvided herein are transgenic bacteria, transgenic plant cells, transgenic plants, and transgenic plant parts that contain a polynucleotide that encodes any one or more chimeric insecticidal proteins. The term bacterial cell or bacterium may include, without limitation, an Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, or Rhizobium cell. The term plant cell or plant may include, without limitation, a dicot cell or a monocot cell. Contemplated plants and plant cells include, without limitation, a cell or plant of alfalfa, banana, barley, bean, broccoli, cabbage, carrot, cassava, castor bean, cauliflower, celery, chickpea, bok choy, citrus, coconut, clover, cotton, pumpkin, cucumber, Douglas fir, eggplant, eucalyptus, flax, garlic, grapes, hops, leek, lettuce, Loblolly pine, millet, melon, walnut, oats, peas, peanuts, pepper, pigeon pea, pine, potato, poplar, pumpkin, radish pine, radish, canola, rice, cereal, rye, American saffron, shrub, sorghum, southern pine, soybean, spinach, squash, strawberry, sugar beet, sugar cane, sunflower, sweet corn, amberwood, sweet potatoes, millet, tea, tobacco, tomato, triticale, turf grass, watermelon, wheat. In some
- 16 040097 вариантах реализации изобретения представлены трансгенные растения и части трансгенных растений, которые регенерировали из трансгенной растительной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени путем разрезания, срывания, измельчения или иного отделения части от растения. В определенных вариантах реализации изобретения часть растения может быть семенем, коробочкой, листом, цветком, стеблем, корнем, или любой его частью, или невосстанавливаемой частью трансгенной части растения. Как используется в данном контексте, нерегенерируемая часть трансгенной части растения представляет собой часть, которая не может быть индуцирована для образования целого растения или которая не может быть индуцирована для образования целого растения, способного к половому и/или бесполому размножению. В некоторых вариантах реализации изобретения нерегенерируемая часть отбираемой части растения представляет собой часть трансгенного семени, коробочки, листа, цветка, стебля или корня.- 16 040097 embodiments of the invention presents transgenic plants and parts of transgenic plants that are regenerated from a transgenic plant cell. In some embodiments of the invention, transgenic plants can be obtained from a transgenic seed by cutting, picking, grinding, or otherwise separating a part from a plant. In certain embodiments, the plant part may be a seed, pod, leaf, flower, stem, root, or any part thereof, or a non-reproducible part of a transgenic plant part. As used herein, a non-regenerating portion of a transgenic plant part is a portion that cannot be induced to form a whole plant or that cannot be induced to form a whole plant capable of sexual and/or asexual reproduction. In some embodiments, the non-regenerated portion of the selected plant part is a portion of a transgenic seed, bolus, leaf, flower, stem, or root.
Приведены способы получения трансгенных растений, которые содержат ингибирующее в отношении насекомых Lepidoptera количество химерных инсектицидных белков. Такие растения могут быть получены путем введения полинуклеотида, который кодирует химерные инсектицидные белки, предусмотренные в этом изобретении, в растительную клетку и выбирает растение, полученное из указанной растительной клетки, которое экспрессирует ингибирующее в отношении насекомых или Lepidoptera количество инсектицидного вещества. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации семян, пыльцы или меристемы, полученных способами трансформации. Способы трансформации растений известны в данной области техники. Например, трансформация, опосредованная Agrobacterium, описана в публикациях патентной заявки США 2009/0138985 А1 (соя), 2008/0280361 А1 (соя), 2009/0142837 А1 (кукуруза), 2008/0282432 (хлопчатник) и 2008/0256667 (хлопчатник).Methods for obtaining transgenic plants that contain an amount of chimeric insecticidal proteins that inhibit Lepidoptera insects are presented. Such plants can be obtained by introducing a polynucleotide that encodes the chimeric insecticidal proteins of this invention into a plant cell and selecting a plant derived from said plant cell that expresses an insect or Lepidoptera inhibitory amount of the insecticidal substance. Plants can be obtained from plant cells by regenerating seeds, pollen or meristems obtained by transformation methods. Methods for transforming plants are known in the art. For example, Agrobacterium mediated transformation is described in US Patent Application Publications 2009/0138985 A1 (soybean), 2008/0280361 A1 (soybean), 2009/0142837 A1 (corn), 2008/0282432 (cotton) and 2008/0256667 (cotton) .
Растения, экспрессирующие химерные инсектицидные белки, можно скрещивать путем селекции с трансгенными объектами, экспрессирующими другие инсектицидные белки и/или экспрессирующими другие трансгенные признаки, такие как другие признаки для борьбы с насекомыми, гены устойчивости к гербицидам, гены, повышающие урожайность или устойчивость к стрессу, и т.п., или признаки могут быть объединены в один вектор, так что все признаки будут связаны между собой.Plants expressing chimeric insecticidal proteins can be crossed by breeding with transgenic events expressing other insecticidal proteins and/or expressing other transgenic traits, such as other insect control traits, herbicide resistance genes, yield or stress tolerance genes, etc., or the features can be combined into one vector so that all the features are related.
Обработанные растительные продукты, причем процессированный продукт содержит обнаруживаемое количество химерного инсектицидного белка, сегменты и фрагменты, обладающие ингибиторной активностью в отношении насекомых, или его фрагмент, или любую его отличительную часть, также раскрыты в настоящем изобретении. В некоторых вариантах реализации изобретения обработанный продукт выбирают из группы, состоящей из частей растения, биомассы растений, масла, муки, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, волокна, шелухи обработанных семян и семян. В определенных вариантах реализации изобретения обработанный продукт является нерегенерируемым. Растительный продукт может включать товарные или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или части трансгенных растений, причем товарные или другие продукты можно отследить путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированных РНК или белков, которые кодируют или содержат отличные части химерного инсектицидного белка.Processed vegetable products, wherein the processed product contains a detectable amount of a chimeric insecticidal protein, segments and fragments having insect inhibitory activity, or a fragment thereof, or any distinctive portion thereof, are also disclosed in the present invention. In some embodiments, the treated product is selected from the group consisting of plant parts, plant biomass, oil, flour, sugar, animal feed, flour, flakes, bran, fiber, treated seed and seed husks. In certain embodiments of the invention, the processed product is non-recyclable. The plant product may include commercial or other commercial products derived from the transgenic plant or part of the transgenic plants, wherein the commercial or other products can be traced by detecting nucleotide segments or expressed RNA or proteins that encode or contain distinct portions of the chimeric insecticidal protein.
Также в настоящем изобретении раскрыты способы борьбы с насекомыми, в частности заражениями культурных растений чешуекрылыми насекомыми с использованием химерных инсектицидных белков. Такие способы могут включать выращивание растения, содержащего ингибирующее в отношении насекомых Lepidoptera количество химерного инсектицидного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут дополнительно включать любое одно или более из (I) нанесения любой композиции, содержащей или кодирующей химерный инсектицидный белок, на растение или семя, которое дает начало растению; и (II) трансформации растения или растительной клетки, которые дают начало растению с полинуклеотидом, кодирующим химерный инсектицидный белок. В общем, предполагается, что химерный инсектицидный белок может быть обеспечен в композиции, имеющейся в микроорганизме, или имеющейся в трансгенном растении, чтобы обеспечить ингибирующую активность против чешуекрылых насекомых.Also disclosed in the present invention are methods for controlling insects, in particular lepidoptera infestations of crop plants using chimeric insecticidal proteins. Such methods may include growing a plant containing a Lepidoptera insect-inhibiting amount of the chimeric insecticidal protein. In some embodiments, such methods may further comprise any one or more of (I) applying any composition containing or encoding a chimeric insecticidal protein to a plant or seed that gives rise to a plant; and (ii) transforming a plant or plant cell that gives rise to a plant with a polynucleotide encoding a chimeric insecticidal protein. In general, it is contemplated that the chimeric insecticidal protein can be provided in a composition present in a microorganism or present in a transgenic plant to provide inhibitory activity against lepidopteran insects.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный инсектицидный белок является инсектицидно активным ингредиентом композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, полученной культивированием рекомбинантного Bacillus или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной для экспрессии химерного инсектицидного белка в условиях, подходящих для экспрессии. Такая композиция может быть получена путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрирования культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих химерный инсектицидный белок. Такой процесс может приводить к образованию клеточного экстракта, клеточной суспензии, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или клеточного осадка из Bacillus или других энтомопатогенных бактерий. Получив сконструированный инсектицидный белок, таким образом, создают композицию, которая содержит сконструированный инсектицидном белок, может содержать бактериальные клетки, бактериальные споры, а также параспоральные тельца и может поставляться для различных применений, включая продукты-спреи, обладающие ингибирующей активностью в отношении сельскохозяйственные насекомых, или препараты кормовой биомасIn some embodiments, the chimeric insecticidal protein is an insecticidally active ingredient in a composition having insect inhibitory activity obtained by culturing a recombinant Bacillus or any other recombinant bacterial cell transformed to express the chimeric insecticidal protein under conditions suitable for expression. Such a composition can be obtained by drying, lyophilizing, homogenizing, extracting, filtering, centrifuging, sedimenting or concentrating a culture of such recombinant cells expressing/producing the chimeric insecticidal protein. Such a process may result in the formation of a cell extract, cell suspension, cell homogenate, cell lysate, cell supernatant, cell filtrate, or cell precipitate from Bacillus or other entomopathogenic bacteria. Having obtained the engineered insecticidal protein, a composition is thus created that contains the engineered insecticidal protein, can contain bacterial cells, bacterial spores, as well as parasporal bodies, and can be supplied for various applications, including spray products having agricultural insect inhibitory activity, or feed biomass preparations
- 17 040097 сы, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых в кормовых биотестах.- 17 040097 insects with inhibitory activity against insects in feed bioassays.
Вышеупомянутое соединение или препарат может дополнительно содержать сельскохозяйственно приемлемый носитель, такой как приманка, порошок, пыль, таблетки, гранулы, спреи, эмульсия, коллоидная суспензия, водный раствор, споры Bacillus или кристаллические препараты или обработанные семена. Соединение или препарат также могут дополнительно содержать рекомбинантную растительную клетку, растительную ткань, семена или растение, трансформированные для экспрессии одного или более белков; или бактерии, трансформированные для экспрессии одного или более белков. В зависимости от уровня ингибирования в отношении насекомых или инсектицидного ингибирования, присущего рекомбинантному полипептиду, и уровня соединения или препарата, который должен применяться в анализе растений или рациона, соединение или препарат могут содержать различные массовые количества рекомбинантного полипептида, например от 0,0001 до 0,001%, до 0,01%, до 1%, до 99% от массы рекомбинантного полипептида.The above compound or preparation may further comprise an agriculturally acceptable carrier such as bait, powder, dust, tablets, granules, sprays, emulsion, colloidal suspension, aqueous solution, Bacillus spores or crystalline preparations or treated seeds. The compound or preparation may also further comprise a recombinant plant cell, plant tissue, seed, or plant transformed to express one or more proteins; or bacteria transformed to express one or more proteins. Depending on the level of insect or insecticidal inhibition inherent in the recombinant polypeptide and the level of the compound or preparation to be used in the plant or diet assay, the compound or preparation may contain varying weight amounts of the recombinant polypeptide, e.g., from 0.0001 to 0.001%. , up to 0.01%, up to 1%, up to 99% by weight of the recombinant polypeptide.
В варианте реализации изобретения для снижения вероятности развития резистентности композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, или трансгенное растение, содержащее химерный инсектицидный белок, может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный токсический агент, который проявляет ингибирующую активность против тех же видов чешуекрылых насекомых, но который отличается от химерного инсектицидного белка. Возможные дополнительные токсичные агенты для такой композиции содержат белок, обладающий ингибирующей активностью против насекомых, и молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью против насекомых. Один пример использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описан в Baum, et al. (публикация патента США 2006/0021087 A1). Такой дополнительный полипептид(ы) для борьбы с чешуекрылыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry1A (патент США № 5880275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (публикация патента США 10/525,318), Cry1C (патент США № 6033874), химеры Cry1D, Cry1E, Cry1F и Cry1A/F (патенты США 7070982, 6962705 и 6713063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab (патент США № 7064249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, VIP3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 и AXMI-045 (публикация патента США 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (публикация патента США 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (публикация патента США 2013-0104259 A1), AXMI-134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-150 (публикация патента США 2010-0160231 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209 (публикация патента США 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 2014-0245491 А1), AXMI221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-238 (публикация патента США 2014-0033363 A1), AXMI-270 (публикация патента США 20140223598 А1), AXMI-345 (публикация патента США 2014-0373195 А1), DIG-3 (публикация патента США 2013-0219570 A1), DIG-5 (публикация патента США 2010-0317569 A1), DIG-11 (публикация патента США 2010-0319093 A1), AfIP-1A и его производные (публикация патентной заявки США 2014-0033361 А1 ), AfIP-1B и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (публикация патента США 2014-0007292 А1), PSEEN3174 (публикация патента США 2014-0007292 А1), AECFG592740 (публикация патента 2014-0007292 А1), Pput_1063 (публикация патента США 2014-0007292 А1), Pput_1064 (публикация патента США 2014-0007292 А1), GS-135 и его производные (публикация патента США 2012-0233726 А1), GS153 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 А1), GS154 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 А1), GS155 и его производные (публикация патента 2012-0192310 А1), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 20120047606 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 и 4, и ее производные, как описано в публикации патента США 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикации патента США 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 или 4, и их производных, как описано в публикации патента США 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патенте США № 7772465 (В2), CF161_0085 и его производные, как описано в WO 2014/008054 А2, токсичные белки к чешуекрылым насекомым и их производные, как описано в патенте US 2008-0172762 A1, US 2011-10055968 А1 и US 2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в US 7510878 (В2), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патенте США № 7812129 (В1); и тому подобное.In an embodiment of the invention, in order to reduce the likelihood of developing resistance, a composition having inhibitory activity against insects, or a transgenic plant containing a chimeric insecticidal protein, may additionally contain at least one additional toxic agent that exhibits inhibitory activity against the same species of Lepidoptera insects, but which is different from the chimeric insecticidal protein. Possible additional toxic agents for such a composition comprise a protein having inhibitory activity against insects and a dsRNA molecule having inhibitory activity against insects. One example of the use of such ribonucleotide sequences for insect pest control is described in Baum, et al. (US Patent Publication 2006/0021087 A1). Such additional Lepidoptera pest control polypeptide(s) may be selected from the group consisting of a protein having insect inhibitory activity such as, but not limited to, Cry1A (US Pat. No. 5,880,275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105 , Cry1Ae, Cry1B (U.S. Patent Publication 10/525,318), Cry1C (U.S. Patent No. 6,033,874), Cry1D, Cry1E, Cry1F, and Cry1A/F Chimeras (U.S. Patents 7,070,982, 6,962,705 and 6,713,063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K , Cry1L, Cry2A, Cry2Ab (US Patent No. 7064249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, VIP3A, VIP3Ab, VIP3B -001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 and AXMI-045 (US Patent Publication 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI- 112, AXMI-117, AXMI-100 (U.S. Patent Pub 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (U.S. Patent Pub 2013-0104259 A1), AXMI-134 (U.S. Patent Pub 2013-0167264 A1), AXMI-150 (patent publication US 2010-0160231 A1), AXMI-184 (US Patent Publication 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209 (US Patent Publication 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI -220 (US Patent Publication 2014-0245491 A1), AXMI221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (US Patent Publication 2014-0196175 A1), AXMI-238 (US Patent Publication 2014-0033363 A1 ), AXMI-270 (U.S. Patent Pub 20140223598 A1), AXMI-345 (U.S. Patent Pub 2014-0373195 A1), DIG-3 (U.S. Patent Pub 2013-0219570 A1), DIG-5 (U.S. Patent Pub 2010-0317569 A1 ), DIG-11 (US Patent Publication 2010-0319093 A1), AfIP-1A and its derivatives (US Patent Application Publication 2014-0033361 A1 ), AfIP-1B and its derivatives (US Patent Publication 2014-0033361 A1), PIP- 1APIP-1B (U.S. Patent Pub 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (U.S. Patent Pub 2014-0007292 A1), AECFG592740 (Patent Pub 2014-0007292 A1), Pput_1063 (U.S. Patent Pub 2014-0007292 A1), Pput_1064 (U.S. Patent Pub 2014-0007292 A1), 201 4-0007292 A1), GS-135 and its derivatives (US Patent Publication 2012-0233726 A1), GS153 and its derivatives (US Patent Publication 2012-0192310 A1), GS154 and its derivatives (US Patent Publication 2012-0192310 A1), GS155 and its derivatives (Patent Publication 2012-0192310 A1), SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Patent Publication 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Patent Publication 20120047606 A1 , SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Patent Publication 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Patent Publication 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 and 4, and its derivatives as described in US Patent Publication 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Patent Publication 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Patent Publication 2010 -0077508 A1, SEQ ID NO: 2 and derivatives thereof, as described in US Patent Publication 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 or 4, and derivatives thereof, as to described in US Patent Publication 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 and its derivatives as described in US Pat. and their derivatives as described in US 2008-0172762 A1, US 2011-10055968 A1 and US 2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 and its derivatives, as described in US 7510878 (B2), SEQ ID NO: 2 and its derivatives, as described in US patent No. 7812129 (B1); etc.
В других вариантах реализации изобретения композиция или трансгенное растение, обладающее ингибирующей активностью в отношении насекомых, может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный токсический агент, который проявляет ингибирующую активность в отношении насекомых-вредителей, которые не ингибируются химерными инсектицидными белками согласно наIn other embodiments, the composition or transgenic plant having insect inhibitory activity may further comprise at least one additional toxic agent that exhibits insect pest inhibitory activity that is not inhibited by the chimeric insecticidal proteins according to
- 18 040097 стоящему изобретению (такие насекомые-вредители как жесткокрылые, полужесткокрылые и равнокрылые) с тем, чтобы расширить спектр ингибирующей активности в отношении насекомых.- 18 040097 of the present invention (such insect pests as Coleoptera, Hemiptera and Homoptera) in order to expand the spectrum of inhibitory activity against insects.
Такой дополнительный токсичный агент для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry3Bb (патент США № 6501009), варианты Cry1C, варианты СгуЗА, Cry3, СгуЗВ, Cry34/35, 5307, AXMI134 (публикация патента США 2013-0167264 A1) AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 А1), AXMI-205 (публикация патента США 20140298538 А1), AXMI207 (публикация патента США 2013-0303440 А1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 20140245491А1), AXMI-221z, AXMI-223z (публикация патента США 2014-0196175 А1), AXMI-279 (публикация патента США 2014-0223599 А1), AXMI-R1 и их варианты (публикация патента США 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (публикация патента США 2010-0319092 A1), eHIPs (публикация патентной заявки США 2010/0017914) IP3 и его варианты (публикация патента США 2012-0210462 А1) и ет-гексатоксин-Hv1a (публикация патентной заявки US 2014-0366227 А1).Such additional pest control toxic agent may be selected from the group consisting of a protein having insect inhibitory activity such as, but not limited to, Cry3Bb (US Pat. No. 6,501,009), Cry1C variants, Cry3a variants, Cry3, Cr34/35, 5307, AXMI134 (U.S. Patent Pub 2013-0167264 A1) AXMI-184 (U.S. Patent Pub 2010-0004176 A1), AXMI-205 (U.S. Patent Pub 20140298538 A1), AXMI207 (U.S. Patent Pub 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (U.S. Patent Pub 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (U.S. Patent Pub 2014-0196175 A1), AXMI-279 (U.S. Patent Pub 2014-0223599 A1), AXMI-R1 and variants thereof (US Patent Publication 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (US Patent Publication 2010-0319092 A1), eHIPs (US Patent Application Publication 2010/0017914 ) IP3 and variants thereof (US Patent Publication 2012-0210462 A1) and et-hexatoxin-Hv 1a (Patent Application Publication US 2014-0366227 A1).
Такой дополнительный токсичный агент для борьбы с полужесткокрылыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белков, активных в отношении полужесткокрылых, таких как, без ограничений, TIC1415 (публикация патента США 2013-0097735 A1), TIC807 (патент США № 8609936), TIC834 (публикация патента США 2013-0269060 A1), AXMI-036 (публикация патента США 20100137216 A1) и AXMI-171 (публикация патента США 2013-0055469 A1). Дополнительные полипептиды для борьбы с жесткокрылыми, чешуекрылыми и равнокрылыми насекомыми-вредителями можно найти на сайте номенклатуры токсинов Bacillus thuringiensis, находящемся в ведении Нилом Крикмором (во всемирной паутине по адресу btnomenclature.info).Such additional hemipteran pest control toxic agent may be selected from the group consisting of proteins active against hemipterans such as, but not limited to, TIC1415 (US Patent Publication 2013-0097735 A1), TIC807 (US Patent No. 8609936), TIC834 (US Patent Publication 2013-0269060 A1), AXMI-036 (US Patent Publication 20100137216 A1), and AXMI-171 (US Patent Publication 2013-0055469 A1). Additional polypeptides for the control of Coleoptera, Lepidoptera and Homoptera insect pests can be found on the Bacillus thuringiensis toxin nomenclature site maintained by Neil Creekmore (on the World Wide Web at btnomenclature.info).
Последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, и последовательности, имеющие значительную процентную идентичность с химерными инсектицидными белками, можно идентифицировать с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), термическая амплификация и гибридизация. Например, химерные инсектицидные белки могут быть использованы для получения антител, которые специфически связываются с белками, и могут быть использованы для скрининга и поиска других белков, которые тесно связаны.Sequences encoding chimeric insecticidal proteins and sequences having a significant percentage identity with chimeric insecticidal proteins can be identified using methods known to those skilled in the art, such as polymerase chain reaction (PCR), thermal amplification, and hybridization. For example, chimeric insecticidal proteins can be used to generate antibodies that specifically bind to proteins and can be used to screen for other proteins that are closely related.
Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, могут быть использованы в качестве зондов и праймеров для скрининга и идентификации других членов класса с использованием способов термоциклической или изотермической амплификации и гибридизации. Например, олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 2, могут быть использованы для определения присутствия или отсутствия химерного инсектицидного трансгена в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной из товарного продукта. Учитывая чувствительность определенных способов обнаружения нуклеиновых кислот, которые используют олигонуклеотиды, предполагается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, указанных в любой из SEQ ID NO: 2, могут быть использованы для обнаружения соответствующего химерного инсектицидного белка в товарных продуктах, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта получена из трансгенного растения, содержащего любую из SEQ ID NO: 2.In addition, nucleotide sequences encoding chimeric insecticidal proteins can be used as probes and primers for screening and identifying other members of the class using thermal cycling or isothermal amplification and hybridization techniques. For example, oligonucleotides derived from the sequences set forth in SEQ ID NO: 2 can be used to determine the presence or absence of a chimeric insecticidal transgene in a deoxyribonucleic acid sample obtained from a commercial product. Given the sensitivity of certain nucleic acid detection methods that use oligonucleotides, it is contemplated that oligonucleotides derived from the sequences set forth in any of SEQ ID NO: 2 can be used to detect the corresponding chimeric insecticidal protein in commercial products derived from pooled sources, where only a portion of the commercial product is derived from a transgenic plant containing any of SEQ ID NO: 2.
ПримерыExamples
Ввиду вышеизложенного специалистам в данной области техники будет понятно, что следующие раскрытые варианты реализации являются исключительно репрезентативными для настоящего изобретения, которые могут быть реализованы в различных формах. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, раскрытые в данном документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие.In view of the foregoing, those skilled in the art will appreciate that the following disclosed embodiments are only representative of the present invention and may be embodied in various forms. Thus, the specific structural and functional details disclosed herein should not be interpreted as limiting.
Пример 1.Example 1
Создание и клонирование последовательностей, кодирующих новые химерные инсектицидные белки, активные в отношении чешуекрылых.Creation and cloning of sequences encoding new chimeric insecticidal proteins active against Lepidoptera.
Данный пример иллюстрирует создание новых химерных инсектицидных белков, и клонирование, и экспрессию химерных инсектицидных белков.This example illustrates the creation of new chimeric insecticidal proteins, and the cloning and expression of chimeric insecticidal proteins.
Последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты были сконструированы из известных генов Cry-белка для получения полинуклеотидных последовательностей, кодирующих новые химерные инсектицидные белки. Полученные полинуклеотидные последовательности клонировали в плазмидный экспрессионный вектор Bacillus thuringiensis (Bt). После подтверждения полинуклеотидной последовательности экспрессионную плазмиду трансформировали в Bt и экспрессировали. Препараты новых химерных белков анализировали на активность против различных чешуекрылых-вредителей.Recombinant nucleic acid sequences were constructed from known Cry protein genes to produce polynucleotide sequences encoding novel chimeric insecticidal proteins. The resulting polynucleotide sequences were cloned into a Bacillus thuringiensis (Bt) plasmid expression vector. After confirming the polynucleotide sequence, the expression plasmid was transformed into Bt and expressed. Preparations of new chimeric proteins were analyzed for activity against various Lepidoptera pests.
Многие полинуклеотидные последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, были получены и испытаны в биотесте. Не все химерные инсектицидные белки демонстрировали активность. Только несколько из химерных инсектицидных белков были отобраны на основании их активности в отношении конкретных чешуекрылых, продемонстрированной в биотесте. Варианты аминокислот, в которые были введены аминокислотные замены или альтернативные протоксиновые домены, также были получены на основе исходных химерных инсектицидных белков TIC867 и TIC868. КомпонентыMany polynucleotide sequences encoding chimeric insecticidal proteins have been generated and tested in a bioassay. Not all chimeric insecticidal proteins showed activity. Only a few of the chimeric insecticidal proteins were selected based on their activity against specific Lepidoptera demonstrated in a bioassay. Amino acid variants in which amino acid substitutions or alternative protoxin domains have been introduced have also been derived from the original TIC867 and TIC868 chimeric insecticidal proteins. Components
- 19 040097 химерных инсектицидных белков (домены I, II и III и протоксин) согласно настоящему изобретению представлены в табл. 1. Также представлены аминокислотные замены в вариантах TIC868 относительно исходной последовательности белка TIC868.- 19 040097 chimeric insecticidal proteins (domains I, II and III and protoxin) according to the present invention are presented in table. 1. Amino acid substitutions in TIC868 variants relative to the original TIC868 protein sequence are also shown.
Таблица 1. Новые химерные пестицидные белки и их компонентыTable 1. New chimeric pesticidal proteins and their components
*Аминокислотные мутации идентифицируются с использованием стандартного кода аминокислот ИЮПАК. См. Объединенная комиссия по биохимической номенклатуре ИЮПАК-ШВ по биохимической номенклатуре. Номенклатура и система обозначений аминокислот и пептидов. Eur. J. Biochem. 138:9-37(1984). Первое сокращение первой аминокислотной последовательности обозначает исходную аминокислоту в данном каркасном белке, число представляет положение аминокислоты, а второе сокращение аминокислотной последовательности обозначает аминокислоту, помещенную в данное положение в улучшенном варианте белка.*Amino acid mutations are identified using the IUPAC standard amino acid code. See IUPAC-SHV Joint Commission on Biochemical Nomenclature on Biochemical Nomenclature. Nomenclature and notation for amino acids and peptides. Eur. J Biochem. 138:9-37(1984). The first abbreviation of the first amino acid sequence denotes the original amino acid in the scaffold protein, the number represents the position of the amino acid, and the second abbreviation of the amino acid sequence denotes the amino acid placed at that position in the improved protein.
Пример 2Example 2
Новые химерные инсектицидные белки демонстрируют активность против чешуекрылыхвредителей.New chimeric insecticidal proteins show activity against lepidopteran pests.
Данный пример иллюстрирует тестирование химерных инсектицидных белков, описанных в примере 1, и активность в отношении чешуекрылых, наблюдаемую для химерных инсектицидных белков.This example illustrates testing of the chimeric insecticidal proteins described in Example 1 and the Lepidoptera activity observed for the chimeric insecticidal proteins.
Полинуклеотидные последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, экспрессировали в Bt.Polynucleotide sequences encoding the chimeric insecticidal proteins were expressed in Bt.
Экспрессированные химерные инсектицидные белки затем анализировали против множества чешуекрылых, известных как вредители кукурузы, сахарного тростника, сои и хлопчатника, а также других культурных растений. В частности, инсектицидные белки анализировали на активность против совки бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis), огневки сахарного тростника (SCB, Diatraea saccharalis), точильщика зернового кукурузного (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), хлопковой совки (CEW, Helicoverpa zea), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), черной совки (BLAW, Spodoptera cosmioides), южной совки (SAW, Spodoptera eridania), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), совки малой (BAW, Spodoptera exigua), совки американской (OBW, Helicoverpa armigera), азиатской хлопковой совки (OLW, Spodoptera litura), розового коробочного червя ((PBW, Pectinophora gossypiella), совки-ипсилон (В CW, Agrotis ipsilon), огневки кукурузной юго-20040097 западной (SWCB, Diatraea grandiosella), шиповатого северного коробочного червя (SBW, Earias vitella), и мотылька стеблевого кукурузного (ЕСВ, Ostrinia nubilalis). Американская кукурузная совка (CEW, Helicoverpa zea) также называется коробочный червь (SPW) и совка хлопковая (CBW). Активность определяли при помощи комбинации показателей смертности и задержки роста, а также оценки МИК50 (минимальная ингибирующая концентрация для 50%). МИК50 относится к концентрации ингибирующей линьку, причем как мертвые личинки, так и личинки L1 (личинки, которые лишены линьки до вторых возрастов) учитываются в оценке. В табл. 2 показана активность каждого химерного инсектицидного белка. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомого-вредителя.The expressed chimeric insecticidal proteins were then analyzed against a variety of Lepidoptera known to be pests of corn, sugarcane, soybean and cotton, as well as other crops. In particular, insecticidal proteins were analyzed for activity against velvet cutworm (VBC, Anticarsia gemmatalis), sugar cane moth (SCB, Diatraea saccharalis), corn borer (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), cotton bollworm (CEW, Helicoverpa zea), tobacco leafworm (TBW, Heliothis virescens), soybean cutworm (SBL, Chrysodeixis includens), black cutworm (BLAW, Spodoptera cosmioides), southern cutworm (SAW, Spodoptera eridania), fall armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), little cutworm (BAW, Spodoptera exigua), American cutworm (OBW, Helicoverpa armigera), Asian cotton cutworm (OLW, Spodoptera litura), pink bollworm ((PBW, Pectinophora gossypiella), upsilon cutworm (B CW, Agrotis ipsilon), south-20040097 western corn moth (SWCB, Diatraea grandiosella), northern spiny bollworm (SBW, Earias vitella), and stem corn borer (ECB, Ostrinia nubilalis). a) also called bollworm (SPW) and cotton bollworm (CBW). Activity was determined using a combination of mortality and stunting scores and an MIC50 score (minimum inhibitory concentration for 50%). The MIC50 refers to the moult-inhibiting concentration, with both dead larvae and L1 larvae (larvae that do not molt until their second instars) counted in the assessment. In table. 2 shows the activity of each chimeric insecticidal protein. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest.
Таблица 2. Биологическая активность против выбранных чешуекрылых___________ НасекомоеTable 2. Biological activity against selected Lepidoptera ___________ Insect
Как можно видеть из табл. 2 выше, большинство химерных инсектицидных белков проявляли активность против одного или более видов чешуекрылых-вредителей.As can be seen from Table. 2 above, most of the chimeric insecticidal proteins exhibited activity against one or more species of Lepidoptera pests.
Пример 3.Example 3
Синтез генов, кодирующих химерные инсектицидные белки, для экспрессии в растениях.Synthesis of genes encoding chimeric insecticidal proteins for expression in plants.
Данный пример иллюстрирует синтез полинуклеотидов, кодирующих химерные инсектицидные белки, для экспрессии в растениях.This example illustrates the synthesis of polynucleotides encoding chimeric insecticidal proteins for expression in plants.
Синтетические кодирующие последовательности были сконструированы для применения в экспрессии химерных инсектицидных белков в растениях. Синтетические последовательности были сконструированы и синтезированы в соответствии со способами, как правило, описанными в патенте США 5500365, избегая некоторых неподходящих проблемных последовательностей, таких как последовательности полиаденилирования растений, обогащенные АТТТА и А/Т, при сохранении аминокислотной последовательности химерного инсектицидного белка. Нуклеотидные последовательности для этих генов, кодирующих химерные инсектицидные белки для экспрессии в растениях, перечислены в табл. 3.Synthetic coding sequences have been designed for use in the expression of chimeric insecticidal proteins in plants. Synthetic sequences were designed and synthesized according to methods generally described in US Pat. No. 5,500,365, avoiding some inappropriate problematic sequences such as plant polyadenylation sequences enriched in ATTTA and A/T while maintaining the amino acid sequence of the chimeric insecticidal protein. The nucleotide sequences for these genes encoding chimeric insecticidal proteins for expression in plants are listed in Table 1. 3.
- 21 040097- 21 040097
Таблица 3. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, предназначенные для применения в растенияхTable 3. Polynucleotide sequences encoding chimeric insecticidal proteins for use in plants
Пример 4.Example 4
Экспрессионные кассеты для экспрессии химерных инсектицидных белков в растениях.Expression cassettes for the expression of chimeric insecticidal proteins in plants.
Данный пример иллюстрирует конструкцию экспрессионных кассет, содержащих предназначенные для применения в растениях полинуклеотидные последовательности, которые кодируют химерные инсектицидные белки.This example illustrates the construction of expression cassettes containing polynucleotide sequences for use in plants that encode chimeric insecticidal proteins.
Разнообразные экспрессионные кассеты растений были сконструированы с применением полинуклеотидных последовательностей, кодирующих химерные инсектицидные белки, предложенные в табл. 3 и предназначенные для экспрессии в растениях. Такие экспрессионные кассеты полезны для транзиентной экспрессии в протопластах растений или трансформации растительных клеток. Типичные экспрессионные кассеты были разработаны с учетом возможного размещения белка внутри клетки. Один набор экспрессионных кассет был сконструирован таким образом, чтобы белок был транслирован и хранился в цитозоле. Другой набор экспрессионных кассет был сконструирован так, чтобы содержать транзитный пептид, смежный с белком токсина, для обеспечения нацеливания на органеллы клетки, такие как хлоропласт или пластиду. Все экспрессионные кассеты были сконструированы, чтобы начаться на 5'-конце с промотора, который может состоять из нескольких промоторных элементов, энхансерных элементов или других экспрессионных элементов, известных специалистам в данной области техники, функционально связанных, для повышения экспрессии трансгена. За промоторной последовательностью, как правило, непрерывно следует одна или более лидерная последовательность на 3'-конце промотора. Интронная последовательность, как правило, расположена на 3'-конце лидерной последовательности, для улучшения экспрессии трансгена. Последовательность, кодирующая токсин или транзитный пептид, и последовательность, кодирующая токсин, как правило, расположена на 3'-конце функционально связанного промотора, лидера и интрона. Последовательность 3'-НТО, как правило, расположена, на 3'-конце кодирующей последовательности для облегчения терминации транскрипции и обеспечения последовательности, важной для полиаденилирования получаемого транскрипта. Все элементы, описанные выше, были функциоA variety of plant expression cassettes were constructed using the polynucleotide sequences encoding the chimeric insecticidal proteins shown in Table 1. 3 and intended for expression in plants. Such expression cassettes are useful for transient expression in plant protoplasts or plant cell transformation. Exemplary expression cassettes have been designed taking into account the possible placement of the protein within the cell. One set of expression cassettes was designed so that the protein was translated and stored in the cytosol. Another set of expression cassettes was designed to contain a transit peptide adjacent to the toxin protein to allow targeting of cell organelles such as the chloroplast or plastid. All expression cassettes were designed to start at the 5' end with a promoter, which may consist of several promoter elements, enhancer elements, or other expression elements known to those skilled in the art, operably linked to increase expression of the transgene. The promoter sequence is typically followed continuously by one or more leader sequences at the 3' end of the promoter. The intron sequence is typically located at the 3' end of the leader sequence to improve expression of the transgene. The toxin or transit peptide coding sequence and the toxin coding sequence are typically located at the 3' end of the operably linked promoter, leader and intron. The 3'-UTR sequence is typically located at the 3' end of the coding sequence to facilitate termination of transcription and provide a sequence important for polyadenylation of the resulting transcript. All elements described above were functional
- 22 040097 нально связаны между собой и расположены последовательно, часто с дополнительными последовательностями, используемыми для конструирования экспрессионной кассеты.- 22 040097 are internally linked and arranged sequentially, often with additional sequences used to construct the expression cassette.
Пример 5.Example 5
Активность в отношении чешуекрылых химерного инсектицидного белка в стабильно трансформированной кукурузе.Lepidoptera activity of a chimeric insecticidal protein in stably transformed maize.
Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую химерными инсектицидными белками в отношении чешуекрылых-вредителей, экспрессированными растениями кукурузы и предложенными в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей кукурузы.This example illustrates the inhibitory activity exhibited by chimeric insecticidal proteins against lepidopteran pests expressed by corn plants and offered as food for the respective corn pests.
Сорт кукурузы LH244 трансформировали в бинарные векторы для трансформации, описанные в примере 4, с применением способа трансформации, опосредованной Agrobacterium.Maize variety LH244 was transformed into the binary transformation vectors described in Example 4 using the Agrobacterium mediated transformation method.
Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Биотестирование с использованием листовых дисков растения выполняли по аналогии с теми, которые описаны в патенте США № 8344207. Ткань, полученную из нетрансформированных растений сорта LH244, использовали в качестве отрицательного контроля. Множество объектов трансформации для каждого бинарного вектора оценивали против американской кукурузной совки (CEW, Helicoverpa zea), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), совкиипсилон (BCW, Agrotis ipsilon) и огневки кукурузной юго-западной (SWCB, Diatraea grandiosella).Transformed cells were induced to form plants using methods known in the art. Bioassay using leaf disks of the plant was performed in analogy to those described in US patent No. 8344207. Tissue obtained from untransformed plants of variety LH244 was used as a negative control. Multiple transformation targets for each binary vector were evaluated against Fall Armyworm (CEW, Helicoverpa zea), Fall Armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), Fall Armyworm (BCW, Agrotis ipsilon) and Southwestern Corn Both (SWCB, Diatraea grandiosella).
Биотестирование с использованием листовых дисков выполняли на трансгенных растениях R0 и F1 поколений. Кроме того, степень повреждения листьев оценивали для целых трансгенных F1 растений, экспрессирующих определенные химерные инсектицидные белки, зараженных чешуекрылыми насекомыми-вредителями. F1 трансгенные объекты, экспрессирующие TIC860 и TIC868, также оценивали по активности в поле против FAW, CEW, и SWCB. Результаты анализа приведены в табл. 4. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомого-вредителя. Как видно из табл. 4, большинство химерных инсектицидных белков и многие из вариантов химерных инсектицидных белков демонстрировали активность в отношении одного или более видов чешуекрылых-вредителей.Biotesting using leaf disks was performed on transgenic plants of R0 and F1 generations. In addition, the degree of leaf damage was assessed for whole transgenic F1 plants expressing certain chimeric insecticidal proteins infested with Lepidoptera pests. F1 transgenic events expressing TIC860 and TIC868 were also evaluated for activity in the field against FAW, CEW, and SWCB. The results of the analysis are given in table. 4. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest. As can be seen from Table. 4, most of the chimeric insecticidal proteins and many of the variants of the chimeric insecticidal proteins have shown activity against one or more Lepidoptera pest species.
Таблица 4. Биотестирование активности химерного инсектицидного белка из стабильно трансформированной ткани листа кукурузыTable 4. Bioassay of activity of chimeric insecticidal protein from stably transformed maize leaf tissue
НасекомоеInsect
Пример 6.Example 6
Активность в отношении чешуекрылых химерного инсектицидного белка в стабильно трансформированной сое.Lepidoptera activity of chimeric insecticidal protein in stably transformed soybeans.
Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую химерным инсектицидным белком в отношении чешуекрылых-вредителей, экспрессированным растениями сои и предложенным в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей.This example illustrates the inhibitory activity exhibited by a chimeric insecticidal protein against lepidoptera pests expressed by soybean plants and offered as food for the respective insect pests.
Кодирующие последовательности для выбранного химерного инсектицидного белка изменяли для экспрессии в растениях, клонировали в бинарный вектор для трансформации растений и применяли для трансформации клеток растения сои. Векторы для трансформации растений содержали первую трансгенную кассету для экспрессии химерного инсектицидного белка, как описано в примере 4, и вторую трансгенную кассету для селекции трансформированных растительных клеток, с применением спектиномициновой селекции. В некоторых случаях, например в случае TIC1100, TIC860 и TIC836, последовательность, кодирующая хлоропластный транзитный пептид, была функционально связана с последова- 23 040097 тельностью, кодирующей химерный инсектицидный белок. Анализы выполняли с использованием TIC1100, TIC860 и TIC836, нацеленными и ненацеленными на пластиду. В табл. 5 ниже показан химерный инсектицидный белок, вариант TIC867 химерного инсектицидного белка и связанные кодирующие последовательности, применяемые для экспрессии в стабильно трансформированной сое.The coding sequences for the selected chimeric insecticidal protein were altered for expression in plants, cloned into a binary plant transformation vector, and used to transform soybean plant cells. Plant transformation vectors contained a first transgenic cassette for the expression of a chimeric insecticidal protein as described in Example 4 and a second transgenic cassette for selection of transformed plant cells using spectinomycin selection. In some instances, such as TIC1100, TIC860 and TIC836, the sequence encoding the chloroplast transit peptide has been operably linked to the sequence encoding the chimeric insecticidal protein. Analyzes were performed using TIC1100, TIC860 and TIC836 targeted and untargeted to the plastid. In table. 5 below shows the chimeric insecticidal protein, the TIC867 variant of the chimeric insecticidal protein, and associated coding sequences used for expression in stably transformed soybeans.
Клетки растения сои трансформировали в бинарные векторы для трансформации, описанные выше, с применением способа трансформации, опосредованной Agrobacterium. В результате трансформированные растительные клетки индуцировали для формирования растений сои. Ткани листьев собирали и использовали в биотестировании, как описано в примере 5, или альтернативно, лиофилизированные ткани использовали в виде корма насекомых для биотестирования. Биотестирование выполняли против FAW, южной совки (SAW, Spodoptera eridania), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), коробочного червя (SPW, Helicoverpa zea), совки бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens), черной совки (BLAW, Spodoptera cosmioides), точильщика зернового кукурузного (LSCB, Elasmopalpus lignosellus) и совки американской (OBW, Helicoverpa armigera).Soybean plant cells were transformed into the binary transformation vectors described above using the Agrobacterium mediated transformation method. As a result, transformed plant cells were induced to form soybean plants. Leaf tissues were harvested and used in bioassay as described in Example 5, or alternatively, lyophilized tissues were used as insect food for bioassay. Biotesting was performed against FAW, southern armyworm (SAW, Spodoptera eridania), soybean cutworm (SBL, Chrysodeixis includens), bollworm (SPW, Helicoverpa zea), velvet bean cutworm (VBC, Anticarsia gemmatalis), tobacco leafworm (TBW, Heliothis virescens) , black armyworm (BLAW, Spodoptera cosmioides), grain corn grinder (LSCB, Elasmopalpus lignosellus) and American cutworm (OBW, Helicoverpa armigera).
В табл. 5 показана активность в отношении отдельных видов чешуекрылых для каждого инсектицидного белка в растениях поколения Ro, причем '+' указывает на активность. Как видно из табл. 5, каждый из химерных инсектицидных белков, экспрессируемых в стабильно трансформированной сое, демонстрировал активность против нескольких видов чешуекрылых. Стоит отдельно отметить, что вариант TIC867, TIC867_23 продемонстрировал активность в отношении SPW.In table. 5 shows activity against selected Lepidoptera species for each insecticidal protein in plants of the Ro generation, with '+' indicating activity. As can be seen from Table. 5, each of the chimeric insecticidal proteins expressed in stably transformed soybean showed activity against several Lepidoptera species. It should be noted separately that the TIC867 variant, TIC867_23, showed activity against SPW.
Таблица 5. Биотестирование активности химерного инсектицидного белкаTable 5. Bioassay of chimeric insecticidal protein activity
щивали. Ткани листа собирали с растений поколения R1 и использовали в кормовом биотесте. Ri растения, экспрессирующие TIC1100, TIC860, TIC867, TIC868, TIC869 и TIC836, исследовали на активность против SAW, SBL, SPW и VBC. В табл. 6 показана наблюдаемая в этих тестах активность. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомого-вредителя. Как показано в табл. 6, наиболее экспрессируемый химерный инсектицидный белок из растений R1 поколения проявил активность в отношении одного или более видов чешуекрылых.shackled. Leaf tissues were collected from R 1 generation plants and used in a feed bioassay. Ri plants expressing TIC1100, TIC860, TIC867, TIC868, TIC869 and TIC836 were tested for activity against SAW, SBL, SPW and VBC. In table. 6 shows the activity observed in these tests. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest. As shown in Table. 6, the most expressed chimeric insecticidal protein from R 1 generation plants showed activity against one or more Lepidoptera species.
Таблица 6. Биотестирование активности химерного инсектицидного белка из ткани листа стабильно трансформированной R1 сои.____________________________________________________Table 6. Bioassay of activity of chimeric insecticidal protein from leaf tissue of stably transformed R 1 soybean.
В табл. 7 представлены результаты полевых испытаний, проведенных в теплице с использованием стабильно трансформированных растений сои поколения R1, экспрессирующих TIC1100, TIC860 иIn table. 7 shows the results of a greenhouse field trial using stably transformed R 1 generation soybean plants expressing TIC1100, TIC860 and
- 24 040097- 24 040097
TIC836. Виды, используемые для заражения растений в теплице, включают SAW, SBL и SPW. Резистентность определяли как дефолиацию в растениях сои, которая составляет менее чем или равную 15%. Резистентность, наблюдаемая в экспериментальной клетке, соответствует резистентности, наблюдаемой у ткани листьев Ri поколения растений сои, анализа, представленного в табл. 6. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомого-вредителя.TIC836. Species used to infect plants in the greenhouse include SAW, SBL and SPW. Resistance was defined as defoliation in soybean plants that is less than or equal to 15%. The resistance observed in the experimental cell corresponds to the resistance observed in the leaf tissue Ri of the generation of soybean plants, the analysis presented in table. 6. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest.
Таблица 7. Профиль активности TIC1100, TIC860 и TIC836, экспрессированных в сое поколения R1, исследуемыйTable 7. Activity profile of TIC1100, TIC860 and TIC836 expressed in soybeans of generation R 1 studied
Полевые испытания в теплицах с использованием стабильно трансформированных растений сои поколения R1, экспрессирующих TIC867 и TIC869, также проводили в двух разных местах в Аргентине, в Асеведо и Фонтесуэле. Виды, используемые для заражения растений в теплицах, включают южноамериканскую совку (SABW, Helicoverpa gelotopeon), VBC, BLAW и пяденицу подсолнечниковую (SFL, Rachiplusia nu). Резистентность определяли как дефолиацию в растениях сои, которая составляет менее чем или равная 15%. В табл. 8 ниже показана наблюдаемая резистентность. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомого-вредителя. Как показано в табл. 8, трансгенные растения сои, экспрессирующие TIC867, продемонстрировали резистентность к BLAW и VBC. Трансгенные растения сои, экспрессирующие TIC869, продемонстрировали резистентность к SABW, SFL, BLAW, и VBC.Greenhouse field trials using stably transformed R 1 generation soybean plants expressing TIC867 and TIC869 were also carried out at two different sites in Argentina, Acevedo and Fontezuela. Species used to infect plants in greenhouses include South American armyworm (SABW, Helicoverpa gelotopeon), VBC, BLAW and sunflower moth (SFL, Rachiplusia nu). Resistance was defined as defoliation in soybean plants that is less than or equal to 15%. In table. 8 below shows the observed resistance. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest. As shown in Table. 8, transgenic soybean plants expressing TIC867 showed resistance to BLAW and VBC. Transgenic soybean plants expressing TIC869 have shown resistance to SABW, SFL, BLAW, and VBC.
Таблица 8. Профиль активности TIC867 и TIC869, экспрессируемых ______в сое поколения R1, тестировали в полевых испытаниях в теплице______Table 8. Activity profile of TIC867 and TIC869 expressed by ______ in generation R 1 soybeans tested in greenhouse field trials ______
Пример 7.Example 7
Активность в отношении чешуекрылых химерного инсектицидного белка в стабильно трансформированном хлопчатнике.Lepidoptera activity of a chimeric insecticidal protein in stably transformed cotton.
В данном примере показана ингибиторная активность, проявляемая химерным инсектицидным белком против чешуекрылых насекомых-вредителей, при экспрессии в растениях хлопчатника, и предложены в качестве диеты для соответствующих насекомых-вредителей.This example shows the inhibitory activity exhibited by a chimeric insecticidal protein against lepidoptera pests when expressed in cotton plants and is proposed as a diet for the respective pests.
Кодирующие последовательности для выбранного химерного инсектицидного белка, измененные для экспрессии в растениях, клонировали в бинарный вектор для трансформации растений и применяли для трансформации растительных клеток хлопчатника. Полученные бинарные векторы были похожи на те, что описаны в примере 4, и их использовали, чтобы экспрессировать TIC860, нацеленные и ненацеленные на пластиды, (кодирующая последовательность: SEQ ID NO: 6; последовательность белка: SEQ ID NO: 7), TIC867 (кодирующая последовательность: SEQ ID NO: 9; последовательность белка: SEQ ID NO: 10), TIC868 (кодирующая последовательность: SEQ ID NO: 27; последовательность белка: SEQ ID NO: 28) и TIC867_23 (кодирующая последовательность: SEQ ID NO: 20; последовательность белка: SEQ ID NO: 23).The coding sequences for the selected chimeric insecticidal protein, modified for expression in plants, were cloned into a binary plant transformation vector and used to transform cotton plant cells. The resulting binary vectors were similar to those described in Example 4 and were used to express plastid- and non-targeted TIC860 (coding sequence: SEQ ID NO: 6; protein sequence: SEQ ID NO: 7), TIC867 ( coding sequence: SEQ ID NO: 9; protein sequence: SEQ ID NO: 10), TIC868 (coding sequence: SEQ ID NO: 27; protein sequence: SEQ ID NO: 28) and TIC867_23 (coding sequence: SEQ ID NO: 20 ; protein sequence: SEQ ID NO: 23).
Растительные клетки хлопчатника трансформировали при помощи способа трансформации, опосредованного Agrobacterium. Трансформированные клетки хлопчатника индуцировали для образования целых растений. Ткань листьев хлопчатника использовали в биотестировании, как описано в примере 5, против совки хлопковой (CBW, Helicoverpa zea), FAW, TBW и SBL. В табл. 9 показана активность, наблюдаемая в отношении данных видов чешуекрылых для TIC860, TIC867 и TIC868 в стабильно трансформированном хлопчатнике поколения Ro, причем '+' указывает на активность. Как видно из табл. 9, TIC860, TIC867 и TIC868 продемонстрировали активность в отношении двух или более видов чешуекрылых насекомых-вредителей в стабильно трансформированном хлопчатнике поколения R0.Cotton plant cells were transformed using the Agrobacterium mediated transformation method. Transformed cotton cells were induced to form whole plants. Cotton leaf tissue was used in biotesting as described in Example 5 against cotton bollworm (CBW, Helicoverpa zea), FAW, TBW and SBL. In table. 9 shows the activity observed against these Lepidoptera species for TIC860, TIC867 and TIC868 in stably transformed cotton of the Ro generation, with '+' indicating activity. As can be seen from Table. 9, TIC860, TIC867, and TIC868 showed activity against two or more Lepidoptera pests in stably transformed R0 generation cotton.
- 25 040097- 25 040097
Таблица 9. Биотестирование активности TIC860, TIC867 и TIC868 из листовой ткани стабильно трансформированного хлопчатника поколения R0Table 9. Bioassay of activity of TIC860, TIC867 and TIC868 from leaf tissue of stably transformed R0 generation cotton
Выбранные трансформированные объекты использовали для того чтобы получить R1 семена. R1 растения, экспрессирующие TIC860, TIC867 и TIC868, исследовали на резистентность к CBW, FAW, TBW и SBL. Ткани листа, бутона и коробочки использовали в анализе. В табл. 10 показана наблюдаемая в этих тестах активность. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомоговредителя. Как показано в табл. 10, TIC860 продемонстрировал активность против FAW в ткани листьев. Кроме того, химерный инсектицидный белок TIC867 продемонстрировал активность против CBW и FAW в ткани листа, бутона и коробочки, а также TBW и SBL в листе. Химерный инсектицидный белок TIC868 продемонстрировал активность против FAW в тканях листа, бутона и коробочки, а также TBW и SBL в листе.The selected transformed objects were used to generate R1 seeds. R1 plants expressing TIC860, TIC867 and TIC868 were tested for resistance to CBW, FAW, TBW and SBL. Leaf, bud and boll tissues were used in the analysis. In table. 10 shows the activity observed in these tests. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest. As shown in Table. 10, TIC860 showed anti-FAW activity in leaf tissue. In addition, the chimeric insecticidal protein TIC867 showed activity against CBW and FAW in leaf, bud and boll tissue, and against TBW and SBL in leaf. The chimeric insecticidal protein TIC868 demonstrated activity against FAW in leaf, bud, and boll tissues, as well as TBW and SBL in leaf.
Таблица 10. Биотестирование активности химерного инсектицидного белка из ткани листа стабильно трансформированного R1 хлопчатникаTable 10. Bioassay of activity of chimeric insecticidal protein from leaf tissue of stably transformed R 1 cotton
Пример 8.Example 8
Клонирование последовательностей, кодирующих новые химерные инсектицидные белки, активные в отношении чешуекрылых.Cloning of sequences encoding novel chimeric insecticidal proteins active against Lepidoptera.
Последовательности рекомбинантных нуклеиновых кислот были сконструированы из известных генов Cry-белка для получения кодирующих последовательностей, кодирующих новые химерные инсектицидные белки. Полученные кодирующие последовательности клонировали в плазмидный экспрессионный вектор Bacillus thuringiensis (Bt). После подтверждения клонированной последовательности экспрессионную плазмиду трансформировали в Bt и экспрессировали. Препараты новых химерных Cryбелков исследовали активность против различных чешуекрылых вредителей. Многие кодирующие последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, были получены и испытаны в биоанализе. Не все химерные инсектицидные белки демонстрировали активность. Только несколько из химерных инсектицидных белков были отобраны на основании их активности в отношении конкретных чешуекрылых и представлены в табл. 11 ниже.Recombinant nucleic acid sequences were constructed from known Cry protein genes to obtain coding sequences encoding new chimeric insecticidal proteins. The resulting coding sequences were cloned into a Bacillus thuringiensis (Bt) plasmid expression vector. After confirming the cloned sequence, the expression plasmid was transformed into Bt and expressed. Preparations of new chimeric Cry proteins have been investigated for activity against various Lepidoptera pests. Many coding sequences encoding chimeric insecticidal proteins have been generated and tested in bioassays. Not all chimeric insecticidal proteins showed activity. Only a few of the chimeric insecticidal proteins have been selected based on their activity against specific Lepidoptera and are shown in Table 1. 11 below.
Таблица 11. Новые химерные пестицидные белки и их соответствующие бактериальные кодирующие последовательности и последовательности белкаTable 11. Novel chimeric pesticidal proteins and their respective bacterial and protein coding sequences
- 26 040097- 26 040097
Пример 9.Example 9
Новые химерные инсектицидные белки демонстрируют активность против чешуекрылых вредителей.New chimeric insecticidal proteins show activity against Lepidoptera pests.
Кодирующие последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, экспрессировали в Bt. Затем экспрессированные белки анализировали в отношении различных Lepidoptera, известных как вредители кукурузы, сахарного тростника, сои и хлопчатника, а также других культурных растений. Инсектицидные белки анализировали на активность против совки бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis), огневки сахарного тростника (SCB, Diatraea saccharalis), точильщика зернового кукурузного (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), коробочного червя (CEW, Helicoverpa zea), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), черной совки (BLAW, Spodoptera cosmioides), южной совки (SAW, Spodoptera eridania), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), совки малой (BAW, Spodoptera exigua), совки американской (OBW, Helicoverpa armigera), азиатской хлопковой совки (OLW, Spodoptera litura), розового коробочного червя (PBW, Pectinophora gossypiella), совки-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), огневки кукурузной юго-западной (SWCB, Diatraea grandiosella) и мотылька стеблевого кукурузного (ЕСВ, Ostrinia nubilalis). Американская кукурузная совка (CEW, Helicoverpa zea) также называется как коробочный червь (SPW) и совка хлопковая (CBW). Активность определяли при помощи комбинации показателей смертности и задержки роста, а также оценки МИК50. МИК50 относится к концентрации ингибирующей линьку, причем как мертвые личинки, так и личинки L1 (личинки, которые лишены линьки до вторых возрастов), учитываются в оценке. В табл. 12 ниже показана активность каждого химерного инсектицидного белка. Знак '+' указывает на активность, наблюдаемую у конкретного насекомого-вредителя.The coding sequences encoding the chimeric insecticidal proteins were expressed in Bt. The expressed proteins were then analyzed against various Lepidoptera known to be pests of corn, sugarcane, soybeans and cotton, as well as other crops. The insecticidal proteins were analyzed for activity against velvet cutworm (VBC, Anticarsia gemmatalis), sugarcane moth (SCB, Diatraea saccharalis), corn borer (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), bollworm (CEW, Helicoverpa zea), tobacco leafworm (TBW, Heliothis virescens), soybean cutworm (SBL, Chrysodeixis includens), black cutworm (BLAW, Spodoptera cosmioides), southern cutworm (SAW, Spodoptera eridania), fall armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), little cutworm (BAW, Spodoptera exigua), American cutworm (OBW, Helicoverpa armigera), Asian cotton cutworm (OLW, Spodoptera litura), pink bollworm (PBW, Pectinophora gossypiella), upsilon cutworm (BCW, Agrotis ipsilon), southwestern corn moth (SWCB, Diatraea grandiosella) and stem corn borer (ESB, Ostrinia nubilalis). The American bollworm (CEW, Helicoverpa zea) is also referred to as the bollworm (SPW) and cotton bollworm (CBW). Activity was determined using a combination of mortality and stunting scores as well as MIC50 scores. The MIC50 refers to the moult-inhibiting concentration, with both dead larvae and L1 larvae (larvae that do not molt until their second instars) counted in the assessment. In table. 12 below shows the activity of each chimeric insecticidal protein. The '+' sign indicates the activity observed in a particular pest.
- 27 040097- 27 040097
Таблица 12. Биологическая активность против выбранных LepidopteraTable 12. Biological activity against selected Lepidoptera
Как можно видеть из табл. 12 выше, все химерные инсектицидные белки проявляют активность против нескольких видов чешуекрылых насекомых.As can be seen from Table. 12 above, all chimeric insecticidal proteins are active against several species of Lepidoptera insects.
Пример 10.Example 10
Варианты аминокислот TIC 1099 демонстрируют активность в отношении чешуекрылых.Amino acid variants of TIC 1099 show activity against Lepidoptera.
Кодирующую последовательность для TIC 1099 (SEQ ID NO: 60) модифицировали известными в данной области техники способами для изменения конкретных аминокислот из исходной белковой последовательности TIC 1099 (SEQ ID NO: 61). Полученные варианты исследовали на активность против выбранных Lepidoptera. В табл. 13 ниже показаны варианты TIC 1099 и соответствующие ДНК и белковые SEQ ID NO.The coding sequence for TIC 1099 (SEQ ID NO: 60) was modified by methods known in the art to change specific amino acids from the original TIC 1099 protein sequence (SEQ ID NO: 61). The resulting variants were tested for activity against selected Lepidoptera. In table. 13 below shows TIC 1099 variants and corresponding DNA and protein SEQ ID NOs.
Таблица 13. Варианты TIC 1099Table 13. TIC 1099 options
Для каждого варианта исследовали смертность и замедление роста кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (CEW, Helicoverpa zea), совки-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens) и огневки кукурузной юго-западной (SWCB, Diatraea grandiosella). В табл. 14 ниже показана активность в отношении каждого чешуекрылого вредителя. Активность оценивали от ”+” до ++++, в зависимости от процента смертности.For each variant, the mortality and growth retardation of Fall Armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), Fall Armyworm (CEW, Helicoverpa zea), Fall Armyworm (BCW, Agrotis ipsilon), Soybean Fall Armyworm (SBL, Chrysodeixis includens), and Fall Armyworm (SBL, Chrysodeixis includens) -western (SWCB, Diatraea grandiosella). In table. 14 below shows the activity against each lepidopteran pest. Activity was rated from "+" to ++++, depending on the percentage of mortality.
-28040097-28040097
Таблица 14. Активность вариантов TIC1099 в отношении LepidopteraTable 14 Activity of TIC1099 variants against Lepidoptera
Все варианты TIC1099 продемонстрировали активность против пяти тестируемых видов Lepidoptera. Несколько вариантов продемонстрировали более низкую активность по сравнению с другими для конкретных вредителей.All TIC1099 variants showed activity against the five Lepidoptera species tested. Several variants showed lower activity than others for specific pests.
Пример 11.Example 11.
Химерные инсектицидные белки, экспрессированные в стабильно трансформированной кукурузе, демонстрируют активность в отношении чешуекрылых-вредителей.Chimeric insecticidal proteins expressed in stably transformed maize show activity against Lepidoptera pests.
Синтетические кодирующие последовательности конструировали для экспрессии кодируемого белка в растениях, клонировали в бинарный растительный вектор для трансформации и использовали для трансформации клеток растения кукурузы. Векторы для трансформации растений содержат первую трансгенную кассету для экспрессии химерного инсектицидного белка, который содержит конститутивный промотор, функционально связанный 5' с лидером, функционально связанным 5' с интроном, функционально связанным 5' с последовательностью, кодирующей химерный инсектицидный белок, которая в свою очередь функционально связана 5' с 3'-НТО и; вторую трансгенную кассету для селекции трансформированных клеток растений с применением глифосатной селекции. Ниже в табл. 15 показаны последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, применяемые для экспрессии в кукурузе, и соответствующие SEQ ID NO.Synthetic coding sequences were designed to express the encoded protein in plants, cloned into a binary plant vector for transformation, and used to transform maize plant cells. Plant transformation vectors contain a first transgenic cassette for the expression of a chimeric insecticidal protein, which contains a constitutive promoter operably linked 5' to a leader operably linked 5' to an intron operably linked 5' to a sequence encoding the chimeric insecticidal protein, which in turn is operably linked connected 5' with 3'-UTR and; a second transgenic cassette for selection of transformed plant cells using glyphosate selection. Below in table. 15 shows the coding sequences for chimeric insecticidal proteins used for expression in maize and corresponding to SEQ ID NO.
- 29 040097- 29 040097
Таблица 15. Последовательности, кодирующие инсектицидныеTable 15. Sequences encoding insecticidal
Сорт кукурузы LH244 трансформировали с помощью бинарных векторов для трансформации, описанных выше, с применением способа трансформации, опосредованной Agrobacterium. Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Биотестирование с использованием листовых дисков растения выполняли по аналогии с теми, которые описаны в патенте США № 8344207. Ткань, полученную из ^трансформированных растений сорта LH244, использовали в качестве отрицательного контроля. Множество объектов трансформации для каждого бинарного вектора оценивали против американской кукурузной совки (CEW, Helicoverpa zea), кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), совки-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon) и огневки кукурузной юго-западной (SWCB, Diatraea grandiosella). Результаты анализа показаны в табл. 16, где + обозначает активность.Maize cultivar LH244 was transformed with the binary transformation vectors described above using the Agrobacterium mediated transformation method. Transformed cells were induced to form plants using methods known in the art. Bioassay using leaf discs of the plant was performed in analogy to those described in US patent No. 8344207. Tissue obtained from N-transformed plants cv. LH244 was used as a negative control. Multiple transformation targets for each binary vector were evaluated against Fall Armyworm (CEW, Helicoverpa zea), Fall Armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), Upsilon Cutworm (BCW, Agrotis ipsilon) and Southwestern Corn Both (SWCB, Diatraea grandiosella) . The results of the analysis are shown in table. 16, where + denotes activity.
- 30 040097- 30 040097
Таблица 16. Биотестирование активности химерного инсектицидногоTable 16. Bioassay of the activity of the chimeric insecticidal
Пример 12.Example 12.
Химерные инсектицидные белки, экспрессированные в стабильно трансформированной сое, демонстрируют активность в отношении чешуекрылых-вредителей.Chimeric insecticidal proteins expressed in stably transformed soybean exhibit activity against lepidoptera pests.
Кодирующие последовательности для выбранного химерного инсектицидного белка изменяли для экспрессии в растениях, клонировали в бинарный вектор для трансформации растений и применяли для трансформации клеток растения сои. Векторы для трансформации растений содержат первую трансгенную кассету для экспрессии химерного инсектицидного белка, который содержит конститутивный промотор, функционально связанный 5' с лидером, функционально связанным 5' с кодирующей последовательностью химерного инсектицидного белка, которая, в свою очередь, функционально связана 5' с 3'НТО и; вторую трансгенную кассету для селекции трансформированных растительных клеток с использованием спектиномициновой селекции. В табл. 17 ниже показаны последовательности, кодирующие химерные инсектицидные белки, применяемые для экспрессии в сое, и соответствующие SEQ ID NO.The coding sequences for the selected chimeric insecticidal protein were altered for expression in plants, cloned into a binary plant transformation vector, and used to transform soybean plant cells. Plant transformation vectors contain a first transgenic cassette for the expression of a chimeric insecticidal protein that contains a constitutive promoter operably linked 5' to a leader operably linked 5' to the chimeric insecticidal protein coding sequence, which in turn is operably linked 5' to 3' NTO and; a second transgenic cassette for selection of transformed plant cells using spectinomycin selection. In table. 17 below shows chimeric insecticidal protein coding sequences for use in soybean expression corresponding to SEQ ID NO.
Таблица 17. Последовательности, кодирующие инсектицидные _________________белки, и соответствующие SEQ ID NO_________________Table 17. Sequences encoding insecticidal _________________ proteins and corresponding to SEQ ID NO_________________
Клетки растения сои трансформировали с помощью бинарных векторов для трансформации, описанных выше, с применением способа трансформации, опосредованной Agrobacterium. В результате трансформированные растительные клетки индуцировали для формирования растений сои. Ткани листьев собирали и использовали в биотестировании, как описано в примере 11, или альтернативно, лиофилиSoybean plant cells were transformed with the binary transformation vectors described above using the Agrobacterium mediated transformation method. As a result, transformed plant cells were induced to form soybean plants. Leaf tissues were harvested and used in bioassay as described in Example 11, or alternatively, lyophilized
- 31 040097 зированные ткани использовали в виде корма насекомых для биотестирования. Биотестирование выполняли против кукурузной листовой совки (FAW, Spodoptera frugiperda), южной совки (SAW, Spodoptera eridania), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), коробочного червя (SPW, Helicoverpa zea), совки бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis), соевой совки (SBL, Chrysodeixis includens), табачной листовертки (TBW, Heliothis virescens), черной совки (BLAW, Spodoptera cosmioides), южной совки (SAW, Spodoptera eridania), точильщика зернового кукурузного (LSCB, Elasmopalpus lignosellus) и совки американской (OBW, Helicoverpa armigera). Ниже в табл. 18 показана активность в отношении выбранных видов Lepidoptera для каждого инсектицидного белка в растениях поколения R0.- 31 040097 The zated tissues were used as insect food for biotesting. Biotesting was performed against Fall Armyworm (FAW, Spodoptera frugiperda), Southern Fall Armyworm (SAW, Spodoptera eridania), Soybean Armyworm (SBL, Chrysodeixis includens), Bollworm (SPW, Helicoverpa zea), Velvet Bean Armyworm (VBC, Anticarsia gemmatalis), soybean cutworm (SBL, Chrysodeixis includens), tobacco leafworm (TBW, Heliothis virescens), black cutworm (BLAW, Spodoptera cosmioides), southern cutworm (SAW, Spodoptera eridania), grain corn grinder (LSCB, Elasmopalpus lignosellus) and American cutworm (OBW , Helicoverpa armigera). Below in table. 18 shows activity against selected Lepidoptera species for each insecticidal protein in R 0 generation plants.
Таблица 18. Биотестирование активности химерного инсектицидного __________________белка из ткани листа стабильно трансформированной R0 сои _____________Table 18. Biotesting of activity of chimeric insecticidal __________________ protein from leaf tissue of stably transformed R0 soybean _____________
Как видно из табл. 18, каждый из химерных инсектицидных белков, экспрессированный в стабильно трансформированной сое, демонстрировал активность против нескольких видов чешуекрылых.As can be seen from Table. 18, each of the chimeric insecticidal proteins expressed in stably transformed soybean showed activity against several Lepidoptera species.
Выбранным трансформированным объектам обеспечили самоопыление и полученное зерно выращивали. Ткани листа собирали с растений поколения R1 и использовали в биотестировании корма. В табл. 19 показана активность инсектицидных белков, экспрессированных в ткани листьев соевого листа Rb наблюдаемая в отношении некоторых видов чешуекрылых.The selected transformed objects were allowed to self-pollinate and the resulting grains were grown. Leaf tissues were collected from R1 generation plants and used in feed biotesting. In table. 19 shows the activity of insecticidal proteins expressed in Rb soybean leaf tissue observed in some species of Lepidoptera.
Таблица 19. Биотестирование активности химерногоTable 19. Biotesting of the activity of the chimeric
белки из растений поколения R1 продемонстрировали активность в отношении двух или более видов чешуекрылых.proteins from R1 generation plants have shown activity against two or more Lepidoptera species.
Все композиции, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть сделаны и выполнены без излишнего экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Хотя композиции настоящего изобретения были описаны с точки зрения вышеизложенных иллюстративных вариантов реализации, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты, изменения, модификации и перестройки могут быть применены к композиции, описанной в данном документе, без отступления от концепции, сущности и объема настоящего изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые схожи и химически, и физиологически, могут быть использованы вместо агентов, описанных в данном документе, достигая тех же самых или подобных результатов. Все таковые аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.All compositions disclosed and claimed herein can be made and performed without undue experimentation in light of the present disclosure. While the compositions of the present invention have been described in terms of the above illustrative embodiments, those skilled in the art will appreciate that variations, variations, modifications, and rearrangements may be applied to the composition described herein without departing from the concept, spirit, and scope of the present inventions. More specifically, it will be apparent that certain agents that are similar both chemically and physiologically can be used instead of the agents described herein, achieving the same or similar results. All such similar substitutions and modifications obvious to those skilled in the art are considered to be within the spirit, scope and concept of the present invention as defined in the appended claims.
Все публикации и опубликованные патентные документы, цитируемые в настоящей спецификации, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.All publications and published patent documents cited in this specification are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application were specifically and individually indicated for inclusion by reference.
Claims (18)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/064,989 | 2014-10-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA040097B1 true EA040097B1 (en) | 2022-04-20 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11267849B2 (en) | Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests | |
US11987603B2 (en) | Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests | |
US11591612B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
JP2017533700A5 (en) | ||
US11312752B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
RU2765310C2 (en) | New proteins showing inhibitory activity relatively to insects | |
RU2781075C2 (en) | New proteins with inhibitory effect relatively to insects | |
EA040097B1 (en) | NEW CHIMERIC INSECTICIDAL PROTEINS TOXIC OR INHIBITORIC AGAINST LEPIDOPTHER PESTS | |
EA040152B1 (en) | NEW CHIMERIC INSECTICIDAL PROTEINS TOXIC OR INHIBITORIC AGAINST LEPIDOPTHER PESTS | |
EA040101B1 (en) | NEW CHIMERIC INSECTICIDAL PROTEINS TOXIC OR INHIBITORIC AGAINST LEPIDOPTHER PESTS | |
EA040497B1 (en) | NEW CHIMERIC INSECTICIDAL PROTEINS TOXIC OR INHIBITORIC AGAINST LEPIDOPTHER PESTS |