EA039208B1 - Tau pet imaging ligands - Google Patents
Tau pet imaging ligands Download PDFInfo
- Publication number
- EA039208B1 EA039208B1 EA201990319A EA201990319A EA039208B1 EA 039208 B1 EA039208 B1 EA 039208B1 EA 201990319 A EA201990319 A EA 201990319A EA 201990319 A EA201990319 A EA 201990319A EA 039208 B1 EA039208 B1 EA 039208B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- compound
- mmol
- formula
- 4alkyl
- mixture
- Prior art date
Links
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Изобретение относится к новым, селективным, меченым радиоактивным изотопом лигандам таубелков, которые являются пригодными для визуализации и количественного определения агрегатов таубелков с применением позитронно-эмиссионной томографии (PET). Изобретение также направлено на композиции, содержащие такие соединения, на способы получения таких соединений и композиций, на применение таких соединений и композиций для визуализации ткани или субъекта, in vitro или in vivo, и на предшественниов указанных соединений.The invention relates to novel, selective, radiolabeled tau protein ligands that are suitable for imaging and quantifying tau protein aggregates using positron emission tomography (PET). The invention is also directed to compositions containing such compounds, to methods for preparing such compounds and compositions, to the use of such compounds and compositions for tissue or subject imaging, in vitro or in vivo, and to the precursors of said compounds.
Уровень техники изобретенияState of the art invention
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нейродегенеративное заболевание, связанное со старением. Пациенты с AD страдают от нарушений познавательной способности и потери памяти, а также от поведенческих проблем, таких как тревожность. У более чем 90% пораженных AD выявлена спорадическая форма расстройства, в то время как в менее 10% случаев наблюдается семейный или наследственный характер. В Соединенных Штатах приблизительно один из десяти людей в возрасте 65 лет имеет AD, а в возрасте 85 лет один из каждых двух индивидуумов поражен AD. Ожидаемая средняя продолжительность жизни с момента первоначального диагноза составляет 7-10 лет, и при этом пациенты с AD нуждаются во всестороннем уходе, осуществляемом либо в доме престарелых, либо членами семьи. Учитывая рост количества пожилых людей среди населения, AD представляет собой растущую медицинскую проблему. С помощью доступных в настоящее время видов терапии в отношении AD лечат только симптомы заболевания, но не лежащую в основе патологию, обуславливающую заболевание.Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease associated with aging. Patients with AD suffer from cognitive impairment and memory loss, as well as behavioral problems such as anxiety. More than 90% of those affected by AD have a sporadic form of the disorder, while less than 10% of cases have a familial or hereditary pattern. In the United States, approximately one in ten people at age 65 has AD, and at age 85, one out of every two individuals is affected by AD. Life expectancy from initial diagnosis is 7-10 years, and AD patients require comprehensive care, either in a nursing home or family members. Given the growing number of older people in the population, AD is a growing medical problem. Currently available therapies for AD treat only the symptoms of the disease and not the underlying pathology causing the disease.
Отличительными патологическими признаками в головном мозге пациентов с AD являются нейрофибриллярные клубки, которые возникают из-за агрегатов гиперфосфорилированного тау-белка и амилоидных бляшек, которые образуются путем агрегации пептида бета-амилоида. Хотя наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством является AD, агрегированный тау-белок также является характерным для других нейродегенеративных заболеваний, известных как виды таупатии, которые также, но не исключительно, включают в себя деменцию, характеризующуюся только клубками (TD), заболевание, характеризующееся появлением аргирофильных зерен (AGD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), кортикобазальную дегенерацию (CBD), болезнь Пика (PiD), а также лобно-височную деменцию и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17). Гетерогенность этих расстройств тесно связана с широким диапазоном изоформ и посттрансляционных модификаций тау у человека. Ультраструктура агрегатов тау-белков может выглядеть как спаренные спиральные филаменты (PHF), прямые филаменты (SF), произвольным образом свернутые филаменты (RCF) или перекрученные филаменты (TF); эта вариабельность преобразовывается в полиморфизм. Была выявлена корреляция нейрофибриллярных клубков с уровнем когнитивного нарушения при AD и/или шансом развития AD. Однако диагноз все еще может быть поставлен только после вскрытия с помощью биопсии/аутопсии. В исследовании на основании анамнеза и статистического тестирования памяти требуется четкое доказательство нарушения или деменции, и оно часто является неточным или нечувствительным, при этом измерение Авпептидов и общего количества тау-белков в спинно-мозговой жидкости с помощью люмбальной пункции является инвазивным и подвержено нежелательным эффектам. Помимо собственной сложности AD, разработке средств для лечения препятствует недостаток надежных инструментов для ранней постановки диагноза, определения стадии и точного контроля за прогрессированием заболевания. Следовательно, все еще существует потребность в определении средств для постановки диагноза и/или контроля за прогрессированием заболевания. Визуализация агрегатов тау-белков может обеспечить такие способы, в частности, при появлении способов лечения в отношении тау-белков.The hallmark pathological features in the brains of AD patients are neurofibrillary tangles, which arise from aggregates of hyperphosphorylated tau protein, and amyloid plaques, which form from aggregation of beta-amyloid peptide. Although AD is the most common neurodegenerative disorder, tau aggregates are also characteristic of other neurodegenerative diseases known as taupathies, which also, but not exclusively, include tangle-only dementia (TD), a disease characterized by the appearance of argyrophilic granules. (AGD), progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration (CBD), Pick's disease (PiD), and chromosome 17-associated frontotemporal dementia and parkinsonism (FTDP-17). The heterogeneity of these disorders is closely related to the wide range of isoforms and post-translational modifications of tau in humans. The ultrastructure of tau protein aggregates can appear as paired helical filaments (PHF), straight filaments (SF), randomly folded filaments (RCF), or twisted filaments (TF); this variability translates into polymorphism. Neurofibrillary tangles have been correlated with the level of cognitive impairment in AD and/or the chance of developing AD. However, the diagnosis can still only be made after autopsy by biopsy/autopsy. History-based and statistical memory testing requires clear evidence of impairment or dementia and is often inaccurate or insensitive, and measurement of Avpeptides and total CSF tau by lumbar puncture is invasive and prone to adverse effects. In addition to the inherent complexity of AD, the development of treatments is hampered by a lack of reliable tools for early diagnosis, staging, and precise control of disease progression. Therefore, there is still a need to identify means for diagnosing and/or monitoring disease progression. Imaging of tau aggregates may provide such methods, particularly as tau therapies emerge.
Позитронно-эмиссионная томография (PET) представляет собой неинвазивную методику визуализации, которая предоставляет самое высокое пространственное и временное разрешение среди всех методик радионуклидной визуализации и обладает дополнительным преимуществом, заключающимся в том, что она может обеспечивать возможность правильного количественного определения концентраций маркеров в тканях. В ней для обнаружения применяются позитронно-активные радионуклиды.Positron emission tomography (PET) is a non-invasive imaging technique that provides the highest spatial and temporal resolution of any radionuclide imaging technique and has the added benefit of being able to correctly quantify marker concentrations in tissues. It uses positron-active radionuclides for detection.
До настоящего времени было заявлено несколько радиоактивных маркеров для позитронноэмиссионной томографии для визуализации агрегатов тау-белков (для обзора см., например, Ariza et al. J. Med. Chem. 2015, 58, 4365-4382). В Preclinical Characterization of 18F-MK-6240, a promising PET Tracer for In Vivo Quantification of Human Neurofibrillary Tangles in J. Nucl. Med 2016; 57: 1599-1610 раскрыт 6фтор-3-(1Н-пирроло[2,3-c]пиридин-1-ил)изохинолин-5-амин, который связывается с высокой аффинностью с гомогентами коры головного мозга больного AD человека, содержащими избыточную NFT, но плохо связывается с богатыми на амилоидные бляшки, бедными на NFT гомогентами головного мозга больного AD. Умеренное дефторирование наблюдается с 18F-MK-6240, поглощаемым черепной коробкой. В статье Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer's disease in Eur. J. Nucl. Med. Imaging 2010; 37(8): 1575-1593 сообщается об изохинолиновом соединении [11C]PK11195, которое связывается с периферическими кортикальными бензодиазепиновыми рецепторами в активированной микроглии и которое, как далее сообщается в статье Carbon 11-labeled Pittsburgh compound B and carbon 11-labeled (R)-PK11195 positron emission tomographic imaging in Alzheimer's disease in Arch. Neurol. 2009; 66(1): 60-67, не демонстрирует каких-либо различий в удержании в мозге у боль- 1 039208 ных и здоровых добровольцев. РЕТ-визуализация головного мозга человека с хинолиновым соединениемTo date, several radioactive markers have been claimed for positron emission tomography to visualize tau protein aggregates (for a review, see, for example, Ariza et al. J. Med. Chem. 2015, 58, 4365-4382). In Preclinical Characterization of 18F-MK-6240, a promising PET Tracer for In Vivo Quantification of Human Neurofibrillary Tangles in J. Nucl. Med 2016; 57:1599-1610 discloses 6fluoro-3-(1H-pyrrolo[2,3-c]pyridin-1-yl)isoquinolin-5-amine, which binds with high affinity to human AD cerebral cortex homogents containing excess NFT , but binds poorly to the amyloid-rich, NFT-poor brain homogenates of AD patients. Moderate defluorination is observed with 18F-MK-6240 absorbed by the cranium. In the article Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer's disease in Eur. J. Nucl. Med. Imaging 2010; 37(8): 1575-1593 report an isoquinoline compound [ 11 C]PK11195 that binds to peripheral cortical benzodiazepine receptors in activated microglia and which, as further reported in Carbon 11-labeled Pittsburgh compound B and carbon 11-labeled (R )-PK11195 positron emission tomographic imaging in Alzheimer's disease in Arch. Neurol. 2009; 66(1): 60-67 does not show any difference in brain retention between sick and healthy volunteers. PET imaging of the human brain with a quinoline compound
18F-THK5351, характеризующимся высокой аффинностью по отношению к PHF, как было показано, затрудняется нецелевым связыванием с ферментом моноаминоксидазой МАО-В (Alzheimer's Research &18F-THK5351, which has a high affinity for PHF, has been shown to be difficult to off-target binding to the enzyme MAO-B monoamine oxidase (Alzheimer's Research &
Therapy 2017; 9; 25 DOI 10.1186/s13195-017-0253-y).therapy 2017; 9; 25 DOI 10.1186/s13195-017-0253-y).
Все еще существует потребность в обеспечении селективных, улучшенных радиоактивных маркеров для позитронно-эмиссионной томографии для визуализации агрегатов тау-белков с надлежащим балансом свойств, включающих без ограничения высокую аффинность и селективность в отношении агрегатов тау-белков, обратимое связывание, проницаемость, подходящий фармакокинетический профиль в головном мозге, т.е. быстрое распределение в мозге, быстрый клиренс, минимальное неспецифическое связывание и доступность для синтеза.There is still a need to provide selective, improved radioactive markers for positron emission tomography for imaging tau protein aggregates with the right balance of properties, including, but not limited to, high affinity and selectivity for tau protein aggregates, reversible binding, permeability, a suitable pharmacokinetic profile in the brain, i.e. fast distribution in the brain, fast clearance, minimal non-specific binding and availability for synthesis.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении изохинолин-6-аминовых соединений, применимых в качестве радиоактивных маркеров tau PET. Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению, характеризующемуся формулой (I)Therefore, it is an object of the present invention to provide isoquinoline-6-amine compounds useful as radioactive tau PET markers. Therefore, in one aspect, the present invention relates to a compound characterized by formula (I)
где по меньшей мере один атом является радиоактивным, и гдеwhere at least one atom is radioactive, and where
R2 представляет собой метил, и либо R1 представляет собой F, и R3 представляет собой Н, либо R1 представляет собой Н, и R3 представляет собой F; илиR 2 is methyl and either R 1 is F and R 3 is H, or R 1 is H and R 3 is F; or
R1 и R3 одновременно представляют собой Н, и R2 выбран из группы, состоящей из -С1-4алкил-F, -OC1-4алкил-F и -NR4-С1-4алкил-F, где R4 представляет собой Н или метил;R 1 and R 3 are both H, and R 2 is selected from the group consisting of -C1-4alkyl-F, -OC1-4alkyl-F and -NR 4 -C1-4alkyl-F, where R 4 is H or methyl;
или его фармацевтически приемлемым соли или сольвату.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В частности, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I')In particular, the present invention relates to a compound of formula (I')
где R2 представляет собой метил, и либо R1 представляет собой 18F, и R3 представляет собой Н, либо R1 представляет собой Н, и R3 представляет собой 18F; илиwhere R 2 is methyl and either R 1 is 18 F and R 3 is H, or R 1 is H and R 3 is 18 F; or
R1 и R3 одновременно представляют собой Н, и R2 выбран из группы, состоящей из -С1-4алкил-18F, -ОС1-4алкил-18F и -NR4-С1-4алкил-18F, где R4 представляет собой Н или метил;R 1 and R 3 are both H, and R 2 is selected from the group consisting of -C 1-4 alkyl- 18 F, -OC 1-4 alkyl- 18 F and -NR 4 -C 1-4 alkyl- 18 F, where R 4 is H or methyl;
или его фармацевтически приемлемым соли или сольвату.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям-предшественникам для синтеза соединений формулы (I) или (I'), определенным ранее. Таким образом, настоящее изобретение также относится к соединению формулы (Р-1)In another aspect, the present invention relates to precursor compounds for the synthesis of compounds of formula (I) or (I') as defined above. Thus, the present invention also relates to a compound of formula (P-1)
где R2 представляет собой метил, и либо R1 выбран из группы, состоящей из Br, -NO2, -[N(CH3)3]+ и 4-CH3-Ph-SO2-O-, и R3 представляет собой Н, либо R1 представляет собой Н, и R3 выбран из группы, состоящей из Br, -NO2, -Щ(СНз)з]+ и 4-CH3-Ph-SO2-O-; илиwhere R 2 is methyl and either R 1 is selected from the group consisting of Br, -NO2, -[N(CH3)3] + and 4-CH3-Ph-SO 2 -O- and R 3 is H , or R 1 is H and R 3 is selected from the group consisting of Br, -NO2, -H(CH3)3] + and 4-CH3-Ph-SO2-O-; or
R1 и R3 одновременно представляют собой Н, и R2 выбран из группы, состоящей из -С1-4алкил-Br, -С1-4алкил-I, -С1-4алкил-О-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-С1-4алкил-, -С1-4алкил-OH, -OC1-4алкил-Br, -OC1-4алкил-I, -OC1-4алкил-O-SO2CHз, 4-СНз-Ph-SO2-О-С1-4алкил-О-, -ОС^лкил-ОН, -NR4-С1-4алкил-Br, -NR4-С1-4алкил-I, -NR4-С1-4алкил-О-SO2CH3, 4-СН3-Ph-SO2-О-С1-4алкил-NR4- и -NR4-С1-4алкил-OH, где R4 представляет собой Н или метил;R 1 and R 3 are both H, and R 2 is selected from the group consisting of -C1-4alkyl-Br, -C1-4alkyl-I, -C1-4alkyl-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2- O-C1-4alkyl-, -C1-4alkyl-OH, -OC1-4alkyl-Br, -OC1-4alkyl-I, -OC1-4alkyl-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-C1-4alkyl -O-, -OC^alkyl-OH, -NR 4 -C1-4alkyl-Br, -NR 4 -C1-4alkyl-I, -NR 4 -C1-4alkyl-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2 -O-C1-4alkyl-NR 4 - and -NR 4 -C1-4alkyl-OH, where R 4 represents H or methyl;
или его фармацевтически приемлемым соли или сольвату.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В соединениях формулы (Р-1), в случае если либо R1, либо R3 представляет собой -[N(CH3)3]+, то приемлемые анионные противоионы включают в себя без ограничения трифторацетат (-[OC(O)CF3]-), органический сульфонат (например, С1-4алкилсульфонат или фенилсульфонат, где фенил может быть необязательно замещен С1-4алкилом, галогеном или нитрогруппой) и тартрат. Конкретные примеры С1-4алкилсульфоната включают метансульфонат (мезилат), 4-метилбензолсульфонат (тозилат), 4-бром- 2 039208 бензолсульфонат и 4-нитробензолсульфонат. В частности, анионный противоион выбран из трифторацетата, тозилата и мезилата.In compounds of formula (P-1), if either R 1 or R 3 is -[N(CH3)3] + , then acceptable anionic counterions include, but are not limited to, trifluoroacetate (-[OC(O)CF3] - ), an organic sulfonate (eg C 1-4 alkylsulfonate or phenylsulfonate, where phenyl may be optionally substituted with C 1-4 alkyl, halogen or nitro group) and tartrate. Specific examples of the C 1-4 alkylsulfonate include methanesulfonate (mesylate), 4-methylbenzenesulfonate (tosylate), 4-bromo-2 039208 benzenesulfonate and 4-nitrobenzenesulfonate. In particular, the anionic counterion is selected from trifluoroacetate, tosylate and mesylate.
Настоящее изобретение также относится к эталонным материалам соединений формулы (I) или (I'), соответствующих аналогичным немеченым радиоактивным изотопом соединениям, в данном документе называемым соединениями формулы [19F]-(I)The present invention also relates to reference materials of compounds of formula (I) or (I'), corresponding to similar unlabeled compounds, herein referred to as compounds of formula [ 19 F]-(I)
R1 R1
[19F]- (I) где R2 представляет собой метил, и либо R1 представляет собой F, и R3 представляет собой Н, либо R1 представляет собой Н, и R3 представляет собой F; или[ 19 F]- (I) where R 2 is methyl and either R 1 is F and R 3 is H or R 1 is H and R 3 is F; or
R1 и R3 одновременно представляют собой Н, и R2 выбран из группы, состоящей из -С1-4алкил-F, -OC1-4алкил-F и -NR4-С1-4алкил-F, где R4 представляет собой Н или метил;R 1 and R 3 are both H, and R 2 is selected from the group consisting of -C1-4alkyl-F, -OC1-4alkyl-F and -NR 4 -C1-4alkyl-F, where R 4 is H or methyl;
или его фармацевтически приемлемым соли или сольвату.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемые носитель или разбавитель. В частности, указанная фармацевтическая композиция представляет собой диагностическую фармацевтическую композицию. Указанная фармацевтическая композиция представляет собой, в частности, стерильный раствор. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением иллюстративным является стерильный раствор, содержащий соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), описанное в данном документе.The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. In particular, said pharmaceutical composition is a diagnostic pharmaceutical composition. Said pharmaceutical composition is in particular a sterile solution. Thus, according to the present invention, illustrative is a sterile solution containing a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I') as described herein.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), в качестве средства для визуализации. В качестве примера, в настоящем изобретении представлено применение соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), описанного в настоящем документе, для визуализации ткани или субъекта in vitro или in vivo, или способ такой визуализации.The present invention further relates to the use of a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), as an imaging agent. As an example, the present invention provides the use of a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I') described herein, for in vitro or in vivo imaging of a tissue or a subject, or a method for such imaging.
В частности, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I), в частности соединению формулы (I'), для применения для связывания и визуализации агрегатов тау-белков у пациентов, страдающих таупатией или предположительно страдающих таковой. Конкретные таупатии представляют собой, например, болезнь Альцгеймера, деменцию, характеризующуюся только клубками (TD), заболевание, характеризующееся появлением аргирофильных зерен (AGD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), кортикобазальную дегенерацию (CBD), болезнь Пика (PiD), а также лобно-височную деменцию и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17). В частности, таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера.In particular, the present invention relates to a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), for use in binding and visualizing tau protein aggregates in patients suffering from or suspected of having tauopathy. Specific taupathies are, for example, Alzheimer's disease, tangle-only dementia (TD), argyrophilic granule disease (AGD), progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration (CBD), Pick's disease (PiD), and frontotemporal dementia and parkinsonism associated with chromosome 17 (FTDP-17). In particular, taupathy is Alzheimer's disease.
Настоящее изобретение дополнительно относится к соединению формулы (I), в частности соединению формулы (I'), для диагностической визуализации агрегатов тау-белков в головном мозге субъекта и к применению соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), для связывания и визуализации агрегатов тау-белков у пациентов, страдающих таупатией или предположительно страдающих ей. Конкретные таупатии представляют собой, например, болезнь Альцгеймера, деменцию, характеризующуюся только клубками (TD), заболевание, характеризующееся появлением аргирофильных зерен (AGD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), кортикобазальную дегенерацию (CBD), болезнь Пика (PiD), а также лобно-височную деменцию и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17). В частности, таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера.The present invention further relates to a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), for diagnostic imaging of tau protein aggregates in the brain of a subject, and to the use of a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), for binding and imaging of tau protein aggregates in patients with or suspected of having tauopathy. Specific taupathies are, for example, Alzheimer's disease, tangle-only dementia (TD), argyrophilic granule disease (AGD), progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration (CBD), Pick's disease (PiD), and frontotemporal dementia and parkinsonism associated with chromosome 17 (FTDP-17). In particular, taupathy is Alzheimer's disease.
Изобретение также относится к способу визуализации ткани или субъекта, предусматривающему приведение выявляемого количества меченого соединения формулы (I), в частности меченого соединения формулы (I'), описанного в данном документе, в контакт с тканью или субъектом, или доставку в них, или введение в них, и выявление соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I').The invention also relates to a method for imaging a tissue or a subject, which involves bringing a detectable amount of a labeled compound of formula (I), in particular a labeled compound of formula (I') described herein, into contact with, or delivery to, a tissue or a subject, or introduction in them, and identifying a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I').
Дополнительно, в качестве примера настоящего изобретения представлен способ визуализации ткани или субъекта, предусматривающий приведение соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), описанного в данном документе, в контакт с тканью или субъектом или его доставку в них и визуализацию ткани или субъекта с помощью системы для визуализации с применением позитронноэмиссионной томографии.Additionally, as an example of the present invention, a method for imaging a tissue or a subject is provided, comprising bringing a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I') described herein, into contact with or delivering it to a tissue or subject and imaging the tissue or a subject using a positron emission tomography imaging system.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I'-а) или (I'-b), упоминаемого, в частности, ниже, как (I'-a1), (I'-a2), (I'-b1), (I'-b2), (I'-b3), или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, описанных в данном документе, предусматривающего:In addition, the present invention relates to a process for the preparation of a compound of formula (I'-a) or (I'-b), referred to in particular below as (I'-a1), (I'-a2), (I' -b1), (I'-b2), (I'-b3), or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof as described herein, providing:
(a) стадию осуществления реакции соединения формулы (Р-а1) или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, определенных в данном документе, с источником фторида 18F- в приемлемых условиях, или (b) стадию осуществления реакции соединения формулы (Р-а2) или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, определенных в данном документе, с источником фторида 18F- в приемлемых(a) the step of reacting a compound of formula (P-a1), or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, as defined herein, with a source of 18 F - fluoride under suitable conditions, or (b) a step of reacting a compound of formula (P-a2) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, as defined herein, with a source of 18 F fluoride - in acceptable
- 3 039208 условиях, или (c) стадию осуществления реакции соединения формулы (Р-bl) или его фармацевтически приемлемой соли, определенных в данном документе, с активирующим реагентом, таким как метансульфонилхлорид или 4-толуолсульфонилхлорид, в присутствии основания, такого как триэтиламин или N,Nдиизопропилэтиламин (DIPEA), и последующего осуществления реакции полученного в результате метансульфоната или 4-толуолсульфоната с источником фторида 18F- в приемлемых условиях, или (d) стадию осуществления реакции соединения формулы (Р-Ь2) или его фармацевтически приемлемой соли, определенных в данном документе, с активирующим реагентом, таким как метансульфонилхлорид или 4-толуолсульфонилхлорид, в присутствии основания, такого как триэтиламин или DIPEA, и последующего осуществления реакции полученного в результате метансульфоната или 4-толуолсульфоната с источником фторида 18F- в приемлемых условиях, или (е) стадию осуществления реакции соединения формулы (Р-ЬЗ) или его фармацевтически приемлемой соли, определенных в данном документе, с активирующим реагентом, таким как метансульфонилхлорид или 4-толуолсульфонилхлорид, в присутствии основания, такого как триэтиламин или DIPEA, и последующего осуществления реакции полученного в результате метансульфоната или 4-толуолсульфоната с источником фторида 18F- в приемлемых условиях.- 3 039208 conditions, or (c) the step of reacting a compound of formula (P-bl) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as defined herein with an activating agent such as methanesulfonyl chloride or 4-toluenesulfonyl chloride in the presence of a base such as triethylamine or N,N-diisopropylethylamine (DIPEA), and then reacting the resulting methanesulfonate or 4-toluenesulfonate with a source of 18F - fluoride under suitable conditions, or (d) the step of reacting a compound of formula (P-L2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as defined herein, with an activating agent such as methanesulfonyl chloride or 4-toluenesulfonyl chloride in the presence of a base such as triethylamine or DIPEA and then reacting the resulting methanesulfonate or 4-toluenesulfonate with a source of 18 F fluoride - under suitable conditions, or ( f) the step of carrying out the reaction of a compound of formula (P-b3) or its pharmaceutical an acceptable salt as defined herein with an activating agent such as methanesulfonyl chloride or 4-toluenesulfonyl chloride in the presence of a base such as triethylamine or DIPEA and then reacting the resulting methanesulfonate or 4-toluenesulfonate with a source of 18 F fluoride - in acceptable conditions.
Типичные условия для активации предшественников формул (Р-Ь1), (Р-Ь2) и (Р-ЬЗ) включают, например, метансульфонилхлорид в качестве активирующего средства, сухой диметилсульфоксид (DMSO) в качестве растворителя, при комнатной температуре на протяжении периода времени, достаточного для доведения реакции до завершения, как правило 10 мин. Специалисту в данной области будет понятно, что в случае, если R4 представляет собой Н в (Р-ЬЗ) - получение соединения формулы (I'-b3) будет предусматривать дополнительные стадии защиты аминной функциональной группы с помощью приемлемой защитной группы, например такой, как трет-бутилоксикарбонил (Boc) или альтернативная приемлемая защитная группа амина, и последующего отщепления такой защитной группы с использованием, как правило, трифторуксусной кислоты (TFA), в случае если защитной группой является Boc.Typical conditions for activating the precursors of formulas (P-L1), (P-L2) and (P-L3) include, for example, methanesulfonyl chloride as an activating agent, dry dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent, at room temperature for a period of time, sufficient to bring the reaction to completion, typically 10 min. The person skilled in the art will understand that if R 4 is H in (P-b3) - the preparation of a compound of formula (I'-b3) will involve the additional steps of protecting the amine functional group with a suitable protecting group, such as, for example, as tert-butyloxycarbonyl (Boc) or an alternative suitable amine protecting group, and then cleaving off such a protecting group using, as a rule, trifluoroacetic acid (TFA) when the protecting group is Boc.
Подходящий источник 18F- представляет собой, например, 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло[8.8.8]гексакозана [18F]-фторид калия (1:1) (также называемый [18F]KF.K222). Приемлемые условия предусматривают такие, которые соответствуют нуклеофильному замещению, известному из уровня техники, например с использованием DMSO или DMF в качестве растворителя, в частности DMSO, при традиционном нагревании или микроволновом излучении (например, 50 Вт), например, при приблизительно 90-160°С или при приблизительно 120-160°С, в частности при приблизительно 90 или 160°С, на протяжении периода времени, достаточного обеспечения протекания реакции до завершения, например 10 мин, в случае если реакцию осуществляют при микроволновом излученииA suitable source of 18 F - is, for example, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane [ 18 F]-potassium fluoride (1:1) (also called [ 18 F]KF.K222). Acceptable conditions include those that correspond to nucleophilic substitution known in the art, for example using DMSO or DMF as a solvent, in particular DMSO, under conventional heating or microwave radiation (for example, 50 W), for example, at about 90-160° C or at about 120-160°C, in particular at about 90 or 160°C, for a period of time sufficient to allow the reaction to proceed to completion, for example 10 minutes, if the reaction is carried out under microwave radiation
- 4 039208- 4 039208
(Р-ЬЗ), (Г-ЬЗ).(P-b3), (G-b3).
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На фиг. 1 показана in vitro авторадиография (ARG) с использованием [18F]coeg. № 1 (7,4 кБк/500 мкл/срез) на срезе зрительной зоны коры пациента с AD (стадия по Брааку VI) (А). Смежные срезы подвергали иммуноокрашиванию в отношении патологии, связанной с тау-белками (В, АТ8), и в отношении патологии, связанной с бета-амилоидами (С, 4G8);In FIG. 1 shows in vitro autoradiography (ARG) using [ 18 F]coeg. No. 1 (7.4 kBq/500 µl/section) on a section of the visual cortex of a patient with AD (Braak stage VI) (A). Adjacent sections were immunostained for tau-associated pathology (B, AT8) and for beta-amyloid pathology (C, 4G8);
на фиг. 2 - сравнение между ARG, показанной на фиг. 1 (А), и смежными срезами головного мозга больного AD человека, инкубируемыми с [18F]сoeд. № 1 (7,4 кБк/500 мкл/срез) в присутствии аутентичного эталонного соединения соед. № 1 (В) или Т808 (С) при 1 мкмоль/л;in fig. 2 is a comparison between the ARG shown in FIG. 1(A) and adjacent brain sections of a human AD patient incubated with [ 18 F]comp. No. 1 (7.4 kBq/500 µl/section) in the presence of an authentic reference compound comp. No. 1 (B) or T808 (C) at 1 µmol/l;
на фиг. 3 - инкубация с 10 нМ [3Н]соед. № 1 на ткани базального ганглия (стриатума) человека (А) с последующей обработкой 10 мкМ соед. № 1 (В) или 10 мкМ THK5351 (С). На фиг. 3D показана инкубация с 10 нМ [3Н]соед. № 1 на ткани больного AD человека (париентальная-височная кора, стадия по Брааку VI) с подтвержденной патологией, связанной с тау-белками, и патологией, связанной с амилоидами, с помощью IHC, как показано на фиг. 4. На фиг. 3Е показана инкубация с 10 нМ [3Н]соед. № 1 на ткани больного AD человека (латеральная затылочная извилина, стадия по Брааку 0), с подтвержденной патологией, связанной с амилоидами, но без патологии, связанной с тау-белками, с помощью IHC, как показано на фиг. 5. На фиг. 3F показана инкубация с 10 нМ [3Н]ТНК5351 на ткани базального ганглия человека и обработка 10 мкМ соед. № 1 (G) или 10 мкМ ТНК5351 (Н). На фиг. 3I показана инкубация с [3Н]ТНК-5351 на ткани больного AD человека (париентальная-височная кора, стадия по Брааку VI) с подтвержденной патологией, связанной с тау-белками, и патологией, связанной с амилоидами, как показано на фиг. 4. На фиг. 3J показана инкубация с 10 нМ [3Н]ТНК5351 на ткани больного AD человека (латеральная затылочная извилина, стадия по Брааку 0), с подтвержденной патологией, связанной с амилоидами, но без патологии, связанной с тау-белками, как показано на фиг. 5. На фиг. 3K показана инкубация с 3 нМ [3H]-AV-45 на базальном ганглии человека (K) вышеупомянутой ткани больного AD человека как с патологией, связанной с бета-амилоидами, так и патологией, связанной с тау-белками (L), и вышеупомянутой ткани больного AD человека с патологией, связанной с бета-амилоидами, но без патологии, связанной с тау-белками (М);in fig. 3 - incubation with 10 nm [ 3 H]comp. No. 1 on the tissue of the basal ganglion (striatum) of a person (A), followed by treatment with 10 μM comp. No. 1 (B) or 10 μM THK5351 (C). In FIG. 3D shows incubation with 10 nM [ 3 H]Comp. No. 1 on tissue from a human AD patient (pariental-temporal cortex, Braak stage VI) with confirmed tau-associated pathology and amyloid-associated pathology by IHC, as shown in FIG. 4. In FIG. 3E shows incubation with 10 nM [ 3 H]comp. #1 on tissue from a human AD patient (lateral occipital gyrus, Braak stage 0), with confirmed amyloid-related pathology but no tau-related pathology, by IHC, as shown in FIG. 5. In FIG. 3F shows incubation with 10 nM [ 3 H]THK5351 on human basal ganglion tissue and treatment with 10 μM Comp. No. 1 (G) or 10 μM TNK5351 (H). In FIG. 3I shows incubation with [ 3 H]TNK-5351 on tissue from a human AD patient (pariental-temporal cortex, Braak stage VI) with confirmed tau-associated pathology and amyloid-associated pathology as shown in FIG. 4. In FIG. 3J shows incubation with 10 nM [ 3 H]TNK5351 on tissue from a human patient with AD (lateral occipital gyrus, Braak stage 0), with confirmed amyloid-related pathology but no tau-related pathology, as shown in FIG. 5. In FIG. 3K shows incubation with 3 nM [ 3 H]-AV-45 on the human basal ganglion (K) of the aforementioned human AD patient tissue with both beta-amyloid and tau-related pathologies (L), and the aforementioned human AD patient tissue with beta-amyloid-related pathology but no tau-related pathology (M);
на фиг. 4 - 4G8 и АТ8 IHC патологии, связанной с амилоидами, и патологии, связанной с таубелками, на срезах мозга больного AD из области париентальной-височной коры того же пациента, что и срезы, используемые для изображений на фиг. 3;in fig. 4 - 4G8 and AT8 IHC pathology associated with amyloid and pathology associated with tauproteins, on sections of the brain of an AD patient from the region of the pariental-temporal cortex of the same patient as the sections used for images in FIG. 3;
на фиг. 5 - срез головного мозга больного AD человека (латеральная затылочная извилина, женщина), смежный со срезом, используемым на фиг. 3Е и 3J. Присутствие бета-амилоидных бляшек (А, В) иin fig. 5 is a section of the brain of a patient with human AD (lateral occipital gyrus, female) adjacent to the section used in FIG. 3E and 3J. The presence of beta-amyloid plaques (A, B) and
- 5 039208 отсутствие тау-клубков (С, D) подтверждали иммуногистохимией с использованием соответственно антител 4G8 и АТ 8;- 5 039208 the absence of tau tangles (C, D) was confirmed by immunohistochemistry using 4G8 and AT 8 antibodies, respectively;
на фиг. 6 - IHC-подтверждение экспрессии МАО-В (слева) и МАО-А (справа) в ткани базального ганглия человека, используемой для in vitro связывания, показанного на фиг. 3;in fig. 6 - IHC confirmation of MAO-B (left) and MAO-A (right) expression in human basal ganglion tissue used for in vitro binding shown in FIG. 3;
на фиг. 7 - инкубация с 0,2 мКи/мл [18F]соед. № 1 на срезах ткани больного AD человека (париентальной-височной коры, стадия по Брааку VI) (А), и обработка 10 мкМ клоргилина (В), 10 мкМ депренила (С) и 10 мкМ соед. № 1 (D);in fig. 7 - incubation with 0.2 mCi/ml [ 18 F]comp. No. 1 on tissue sections of a patient with human AD (pariental-temporal cortex, Braak stage VI) (A), and treatment with 10 μM clorgyline (B), 10 μM deprenyl (C) and 10 μM comp. No. 1 (D);
на фиг. 8 - АТ8 и 4G8 IHC соответственно патологии, связанной с тау-белками, и патологии, связанной с амилоидами, на срезах мозга больного AD (париентальная-височная кора, стадия по Брааку VI), смежных со срезами, упомянутыми на фиг. 7;in fig. 8 - AT8 and 4G8 IHC, respectively, tau-associated pathology and amyloid-associated pathology, in sections of the brain of an AD patient (pariental-temporal cortex, Braak stage VI) adjacent to the sections referred to in FIG. 7;
на фиг. 9 - кривые время-активность для цРЕТ, выраженные как стандартизированные величины поглощения (SUV) для [18F]соед. № 1;in fig. 9 are time-activity curves for cRET, expressed as standardized uptake values (SUV) for [ 18 F]comp. No. 1;
на фиг. 10 - кривые время-активность для рРЕТ для [18F]T807 (С) на целом мозге трех самок крыс Wistar. Показаны три отдельных исследования: исходное сканирование (только маркер); эксперимент перед обработкой (холодное соед. № 1 или Т807, 10 мг/кг, инъецировали подкожно за 60 мин до инъекции радиоактивного маркера), и исследование слежения за меткой (холодное соед. № 1 или Т807, 1 мг/кг, инъецировали внутривенно через 30 мин после инъекции радиоактивного маркера);in fig. 10 - time-activity curves for pPET for [ 18 F]T807 (C) on the whole brain of three female Wistar rats. Three separate studies are shown: original scan (marker only); pre-treatment experiment (cold Comp. No. 1 or T807, 10 mg/kg, injected subcutaneously 60 min before injection of the radioactive marker), and a tracer study (cold Comp. No. 1 or T807, 1 mg/kg, injected intravenously through 30 minutes after injection of a radioactive marker);
на фиг. 11 - кривые %SUVмαкс. кривых время-активность, полученных с помощью PET на мелком животном, [18F]соед. № 1 и [18F]T807 в целом головном мозге крысы линии Wistar;in fig. 11 - curves %SUV max . curves time-activity obtained using PET on a small animal, [ 18 F]Comp. No. 1 and [ 18 F]T807 in the whole brain of a Wistar rat;
на фиг. 12 - кривые время-активность, полученные с помощью pPET для [18F] соед. № 1, и на фиг. 13 показаны кривые время-активность, полученные с помощью рРЕТ для [18F] T807 в целом головном мозге, в мозолистом теле, в мозжечке и в энторинальной области коры и черепе макака-резуса;in fig. 12 - time-activity curves obtained using pPET for [ 18 F] Comm. No. 1, and in Fig. 13 shows pPET activity curves for [ 18 F] T807 in the whole brain, corpus callosum, cerebellum and entorhinal cortex and skull of the rhesus monkey;
на фиг. 14 - кривые %SUVмαкс. кривых время-активность, полученных с помощью рРЕТ на мелком животном, [18F]соед. № 1 и [18F]T807 в целом головном мозге макака-резуса.in fig. 14 - curves %SUV max . time-activity curves obtained using pRET on a small animal, [ 18 F] Comm. No. 1 and [ 18 F]T807 in the whole rhesus monkey brain.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
В одном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой, в частности, соединение формулы (I-а)In one embodiment, the compound of formula (I) is, in particular, the compound of formula (I-a)
где по меньшей мере один атом является радиоактивным и где R1 представляет собой F, и R3 представляет собой Н, или R1 представляет собой Н, и R3 представляет собой F;where at least one atom is radioactive and where R 1 is F and R 3 is H, or R 1 is H and R 3 is F;
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
Более конкретно, соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I'-а)More specifically, the compound of formula (I) is a compound of formula (I'-a)
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В другом варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой, в частности, соединение формулы (I-b)In another embodiment, the compound of formula (I) is, in particular, the compound of formula (I-b)
где по меньшей мере один атом является радиоактивным, и где R2 выбран из группы, состоящей из -C1.4алкил-F, -ОС1.4алкил-F и -NR4-C1.4алкил-F, где R4 представляет собой Н или метил;where at least one atom is radioactive, and where R 2 is selected from the group consisting of -C1.4alkyl-F, -OC1.4alkyl-F and -NR 4 -C1. 4 alkyl-F, where R 4 is H or methyl;
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
Более конкретно, соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I'-b)More specifically, the compound of formula (I) is a compound of formula (I'-b)
- 6 039208- 6 039208
(I'-b) где R2 выбран из группы, состоящей из -C1-4алкил-19F, -OC1-4алкил-18F и -NR4-C1-4алкил-18F, где R4 представляет собой Н или метил;(I'-b) where R 2 is selected from the group consisting of -C 1-4 alkyl- 19 F, -OC 1-4 alkyl- 18 F and -NR 4 -C 1-4 alkyl- 18 F, where R 4 represents H or methyl;
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В одном варианте осуществления соединение формулы (I), в частности формулы (I'), представляет собойIn one embodiment, the compound of formula (I), in particular formula (I'), is
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В другом конкретном варианте осуществления соединение-предшественник для синтеза соединения формулы (I) или (I'), как определено выше, представляет собой, в частности, соединение формулы (Р-1)In another specific embodiment, the precursor compound for the synthesis of a compound of formula (I) or (I') as defined above is, in particular, a compound of formula (P-1)
где R2 представляет собой метил, и либо R1 выбран из группы, состоящей из Br, -NO2, -[N(CH3)3]+ и 4-Me-Ph-SO2-O-, и R3 представляет собой Н, либо R1 представляет собой Н, и R3 выбран из группы, состоящей из Br, -NO2, -[N(CH3)3]+ и 4-Me-Ph-SO2-O-; либоwhere R 2 is methyl and either R 1 is selected from the group consisting of Br, -NO2, -[N(CH3)3] + and 4-Me-Ph-SO2-O- and R 3 is H, or R 1 is H and R 3 is selected from the group consisting of Br, -NO2, -[N(CH3)3] + and 4-Me-Ph-SO2-O-; or
R1 и R3 одновременно представляют собой Н, и R2 выбран из группы, состоящей из -C1-4алкил-OH, -OC1-4алкил-OH и -NR4-C1-4алкил-ОН, где R4 представляет собой Н или метил;R 1 and R 3 are both H, and R 2 is selected from the group consisting of -C1-4alkyl-OH, -OC1-4alkyl-OH and -NR 4 -C1-4alkyl-OH, where R 4 is H or methyl;
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
Настоящее изобретение также относится к эталонному материалу, соответствующему немеченому радиоактивным изотопом соединению 1, соответствующему [19F]-соединениюThe present invention also relates to a reference material corresponding to an unlabeled compound 1 corresponding to [ 19 F]-compound
или его фармацевтически приемлемым соли или сольвату.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В другом конкретном варианте осуществления соединение формулы [19F]-(I) представляет собой, в частности, соединение формулы [19F]-(I-a)In another specific embodiment, the compound of formula [ 19 F]-(I) is, in particular, the compound of formula [ 19 F]-(Ia)
[19F] - (I-a) где R1 представляет собой F, и R3 представляет собой Н, или R1 представляет собой Н, и R3 представляет собой F;[ 19 F] - (Ia) where R 1 is F and R 3 is H, or R 1 is H and R 3 is F;
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В другом конкретном варианте осуществления соединение формулы [19F]-(I) представляет собой, в частности, соединение формулы (I-b)In another specific embodiment, the compound of formula [ 19 F]-(I) is, in particular, the compound of formula (Ib)
[19F] - (I-b) где R2 выбран из группы, состоящей из -C1-4алкил-F, -OC1-4алкил-F и -NR4-C1-4алкил-F, где R4 представляет собой Н или метил;[ 19 F] - (Ib) where R 2 is selected from the group consisting of -C1-4alkyl-F, -OC1-4alkyl-F and -NR 4 -C1-4alkyl-F, where R 4 represents H or methyl;
или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
[19F]-соед. № 1 продемонстрировало сильное связывание (pIC50 8,24) с выделенными агрегатами тау-белков человека в анализе с замещением радиоактивной меткой с применением тритиевого аналога соединения Т-808 собственного производства (Т-808, разработанное Siemens, см., например, J. Alzheim[ 19 F]-Comp. No. 1 demonstrated strong binding (pIC 50 8.24) to isolated human tau aggregates in a radiolabeled assay using a proprietary tritium analog of compound T-808 (T-808 developed by Siemens, see e.g. J. Alzheim
- 7 039208 ers Dis. 2014, 38, 171-184), и который называется в данном документе [3Н]-Т808. В дополнение, соед. № 1 продемонстрировало слабое связывание с выделенными агрегатами бета-амилоидов человека (pIC50 5,18) в анализе с замещением радиоактивной меткой с применением тритиевого аналога флорбетапира собственного производства (также известного как Amyvid® от Eli Lilly and Со. или AV-45, см., например, J. Nucl. Med. 2010, 51, 913-920), и который называется в данном документе как [3H]-AV-45. Описание протоколов представлено в данном документе далее.- 7 039208 ers Dis. 2014, 38, 171-184), and which is referred to in this document as [ 3 H]-T808. In addition, Comm. No. 1 showed poor binding to isolated human beta-amyloid aggregates (pIC 50 5.18) in a radiolabeled assay using the proprietary tritium analog florbetapyr (also known as Amyvid® from Eli Lilly and Co. or AV-45, see ., for example, J. Nucl. Med. 2010, 51, 913-920), and which is referred to herein as [ 3 H]-AV-45. Protocols are described later in this document.
[3Н]-Т808 получали путем подвергания раствора бромсодержащего предшественника (1 экв.) в метаноле каталитическому тритированию над палладием на углероде (5%) в присутствии диизопропилэтиламина (5 экв.) при комнатной температуре. Бромсодержащий предшественник получали с помощью бромирования Т808 с N-бромсукцинимидом (1 экв.) в ацетонитриле.[ 3 H]-T808 was prepared by subjecting a solution of the bromine-containing precursor (1 eq.) in methanol to catalytic tritiation over palladium on carbon (5%) in the presence of diisopropylethylamine (5 eq.) at room temperature. The bromine-containing precursor was obtained by bromination of T808 with N-bromosuccinimide (1 eq.) in acetonitrile.
[3H]-AV-45 получали с помощью катализируемого иридием (катализатор Крабтри) тритиевого обмена AV-45, растворенного в дихлорметане[ 3 H]-AV-45 was prepared using iridium catalyzed (Crabtree catalyst) tritium exchange AV-45 dissolved in dichloromethane
[3Н]-Т808, [3H]-AV-45.[ 3 H]-T808, [ 3 H]-AV-45.
Как уже упоминалось, соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), и композиции, содержащие соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), могут применяться для визуализации ткани или субъекта in vitro или in vivo. В частности, настоящее изобретение относится к способу визуализации или количественного определения агрегатов тау-белков в ткани или у субъекта in vitro или in vivo.As already mentioned, a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), and compositions containing a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), can be used to image a tissue or a subject in vitro or in vivo. . In particular, the present invention relates to a method for visualizing or quantifying tau protein aggregates in a tissue or subject in vitro or in vivo.
В частности, способ визуализации агрегатов тау-белков предусматривает предоставление субъекту, в частности пациенту, выявляемого количества соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I').In particular, the method for visualizing tau protein aggregates involves providing a subject, in particular a patient, with a detectable amount of a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I').
Дополнительно, настоящее изобретение относится к способу визуализации отложений агрегатов тау-белков, включающему стадии предоставления субъекту выявляемого количества соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), обеспечения времени, достаточного для ассоциации соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), с отложениями агрегатов тау-белков, и выявления соединения, ассоциированного с отложениями агрегатов тау-белков.Additionally, the present invention relates to a method for visualizing deposits of tau protein aggregates, comprising the steps of providing a subject with a detectable amount of a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), providing time sufficient for association of a compound of formula (I), in particular a compound formula (I'), with deposits of aggregates of tau proteins, and detection of a compound associated with deposits of aggregates of tau proteins.
Если способ осуществляют in vivo, то соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), может вводиться внутривенно, например путем инъекции с помощью шприца или посредством периферической внутривенной трубки, такой как короткий катетер. Соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), или стерильный раствор, содержащий соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), может, в частности, вводиться путем внутривенного введения в руку в любую различимую вену, в частности, с тыльной стороны кисти руки или в срединную локтевую вену в локтевой области.If the method is carried out in vivo, then the compound of formula (I), in particular the compound of formula (I'), can be administered intravenously, for example by injection with a syringe or through a peripheral intravenous tube, such as a short catheter. A compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), or a sterile solution containing a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), may in particular be administered by intravenous injection into the arm in any recognizable vein , in particular, from the back of the hand or into the median cubital vein in the cubital region.
Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу визуализации субъекта, включающему внутривенное введение соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), определенного в данном документе, или композиции, в частности стерильного состава, содержащего соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), субъекту, и визуализацию субъекта с помощью системы для визуализации с применением позитронно-эмиссионной томографии.Thus, in a specific embodiment, the present invention relates to a method for imaging a subject, comprising intravenously administering a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I') as defined herein, or a composition, in particular a sterile composition containing a compound of formula ( I), in particular the compound of formula (I'), to the subject, and imaging of the subject with a system for imaging using positron emission tomography.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу количественного определения отложений агрегатов тау-белков у субъекта, включающему внутривенное введение соединения формулы (I), в частности соединения формулы (I'), или композиции, содержащей соединение формулы (I), в частности соединение формулы (I'), субъекту и визуализацию с помощью системы для визуализации с применением позитронно-эмиссионной томографии.In a further embodiment, the present invention relates to a method for quantifying deposits of tau protein aggregates in a subject, comprising intravenously administering a compound of formula (I), in particular a compound of formula (I'), or a composition containing a compound of formula (I), in particular a compound formula (I'), the subject and imaging using a system for imaging using positron emission tomography.
Соединение предоставляют субъекту в выявляемом количестве и после истечения времени, достаточного для того, чтобы соединение ассоциировалось с отложениями агрегатов тау-белков, при этом меченое соединение выявляют неинвазивным способом.The compound is provided to the subject in a detectable amount and after sufficient time has elapsed for the compound to associate with deposits of tau protein aggregates, with the labeled compound being detected in a non-invasive manner.
Определения.Definitions.
Подразумевается, что используемый в данном документе термин композиция охватывает продукт, содержащий определенные ингредиенты в определенных количествах, а также любой продукт, который получают прямо или опосредованно из комбинаций определенных ингредиентов в определенных количествах. Термин ''Cl-4алкил'' означает прямую или разветвленную насыщенную алкильную группу соответственно с 1, 2, 3 или 4 атомами углерода, например метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, бутил и т.п.As used herein, the term composition is intended to cover a product containing certain ingredients in certain amounts, as well as any product that is obtained directly or indirectly from combinations of certain ingredients in certain amounts. The term "Cl- 4 alkyl" means a straight or branched saturated alkyl group with 1, 2, 3 or 4 carbon atoms, respectively, eg methyl, ethyl, 1-propyl, 2-propyl, butyl, and the like.
Подразумевается, что соли присоединения соединений в соответствии с настоящим изобретениемIt is understood that the addition salts of the compounds in accordance with the present invention
- 8 039208 также охватываются объемом настоящего изобретения.- 8 039208 are also covered by the scope of the present invention.
Приемлемыми солями соединений по настоящему изобретению являются те, в которых противоион является фармацевтически приемлемым. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут находить применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения. Все соли независимо от того, являются ли они фармацевтически приемлемыми или нет, включены в объем настоящего изобретения. Фармацевтически приемлемые соли определяют как включающие терапевтически активные нетоксичные формы солей присоединения кислоты, которые могут быть образованы соединениями в соответствии с настоящим изобретением. Указанные соли могут быть получены путем обработки соединений в соответствии с настоящим изобретением в форме основания подходящими кислотами, например неорганическими кислотами, например галогеноводородной кислотой, в частности хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой и фосфорной кислотой; органическими кислотами, например уксусной кислотой, гидроксиуксусной кислотой, пропановой кислотой, молочной кислотой, пировиноградной кислотой, щавелевой кислотой, малоновой кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, яблочной кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, метансульфоновой кислотой, этансульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой, цикламовой кислотой, салициловой кислотой, п-аминосалициловой кислотой и памовой кислотой.Acceptable salts of the compounds of the present invention are those in which the counterion is pharmaceutically acceptable. However, salts of acids and bases which are not pharmaceutically acceptable may also find use, for example, in the preparation or purification of a pharmaceutically acceptable compound. All salts, whether pharmaceutically acceptable or not, are included within the scope of the present invention. Pharmaceutically acceptable salts are defined as including the therapeutically active non-toxic acid addition salt forms which may be formed by the compounds of the present invention. Said salts can be obtained by treating the compounds of the present invention in base form with suitable acids, for example inorganic acids, for example hydrohalic acid, in particular hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid and phosphoric acid; organic acids, e.g. acetic acid, hydroxyacetic acid, propanoic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid acid, p-toluenesulfonic acid, cyclamic acid, salicylic acid, p-aminosalicylic acid and pamoic acid.
И наоборот, упомянутые формы солей могут быть превращены в форму свободного основания путем обработки соответствующим основанием.Conversely, said salt forms can be converted to the free base form by treatment with an appropriate base.
В дополнение, некоторые из соединений по настоящему изобретению могут образовывать сольваты с водой (т.е. гидраты) или обычными органическими растворителями, и подразумевается, что такие сольваты также охватываются объемом настоящего изобретения.In addition, some of the compounds of the present invention may form solvates with water (ie, hydrates) or common organic solvents, and such solvates are also intended to be within the scope of the present invention.
Термин субъект, используемый в данном документе, относится к человеку, который является или являлся объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Если не указано иное, то термин субъект включает людей без симптомов, людей с предсимптомами и пациентов-людей.The term subject as used herein refers to a person who is or has been the subject of treatment, observation, or experiment. Unless otherwise indicated, the term subject includes asymptomatic humans, pre-symptomatic humans, and human patients.
Получение.Receipt.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением обычно могут быть получены с помощью последовательности стадий, каждая из которых известна специалисту в данной области техники. В частности, соединения могут быть получены в соответствии со следующими способами синтеза.Compounds in accordance with the present invention can usually be obtained using a sequence of stages, each of which is known to the person skilled in the art. In particular, the compounds can be obtained according to the following synthetic methods.
Соединения формулы [19F]-(I-a) или [19F]-(I-b), раскрытые в данном документе, могут быть получены с помощью реакции 6-бром-изохинолина с соответствующим 2-аминопиридиновым соединением формулы (II-а), где все переменные представляют собой описанные в данном документе для [19F]-(I)Compounds of formula [ 19 F]-(Ia) or [ 19 F]-(Ib) disclosed herein can be prepared by reacting 6-bromo-isoquinoline with the corresponding 2-aminopyridine compound of formula (II-a), where all variables are those described in this document for [ 19 F]-(I)
при условиях аминирования по Бухвальду-Хартвигу, где все переменные представляют собой описанные в данном документе для [19F]-(I), или, в качестве альтернативы, с помощью реакции соединения формулы (II-а'), где R1 представляет собой -NO2, и R3 представляет собой Н, или R1 представляет собой Н, и R3 представляет собой -NO2, с источником фторида, таким как KF, в реакционно инертном растворителе, таком как DMSO, при условиях нагреванияunder Buchwald-Hartwig amination conditions where all variables are those described herein for [ 19 F]-(I), or alternatively by reacting a compound of formula (II-a') where R 1 is -NO2 and R 3 is H or R 1 is H and R 3 is -NO2 with a fluoride source such as KF in a reaction inert solvent such as DMSO under heating conditions
или, в качестве альтернативы, с помощью реакции изохинолин-6-амина с соответствующим 2-хлорпиридиновым соединением формулы (II-b), где все переменные представляют собой описанные в данном документе для [19F]-(I)or, alternatively, by reacting isoquinoline-6-amine with the corresponding 2-chloropyridine compound of formula (II-b), where all variables are those described herein for [ 19 F]-(I)
при условиях аминирования по Бухвальду-Хартвигу.under the conditions of amination according to Buchwald-Hartwig.
Соединение формулы (II-а') может быть получено, например, с помощью реакции изохинолин-6- 9 039208 амина с 6-бром-3-метил-2-нитропиридином или 2-бром-5-метил-4-нитропиридином при условиях аминирования по Бухвальду-Хартвигу.The compound of formula (II-a') can be obtained, for example, by reacting isoquinoline-6-9 039208 amine with 6-bromo-3-methyl-2-nitropyridine or 2-bromo-5-methyl-4-nitropyridine under the conditions amination according to Buchwald-Hartwig.
Пути применения.Ways of application.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением находят различные пути применения в визуализации тканей или субъекта как in vitro, так и in vivo. Таким образом, например, они могут применяться для картирования дифференциального распределения отложений агрегатов тау-белков у субъектов разного возраста и пола. Дополнительно, они дают возможность исследовать дифференциальное распределение отложений агрегатов тау-белков у субъектов, страдающих различными заболеваниями или расстройствами, в том числе болезнью Альцгеймера, а также другими заболеваниями, обусловленными отложениями агрегатов тау-белков, т.е. другими таупатиями.The compounds of the present invention find various uses in tissue or subject imaging, both in vitro and in vivo. Thus, for example, they can be used to map the differential distribution of tau aggregate deposits in subjects of different ages and sexes. Additionally, they provide an opportunity to investigate the differential distribution of tau protein aggregate deposits in subjects suffering from various diseases or disorders, including Alzheimer's disease, as well as other diseases associated with tau protein aggregate deposits, i.e. other taupathies.
Таким образом, избыточное распределение может быть полезно для постановки диагноза, выявления случаев заболевания, стратификации групп субъектов и при отслеживании прогрессирования заболевания у отдельных субъектов, в частности, если способы терапии в отношении тау-белков, например антитела, становятся доступными. Поскольку радиоактивный лиганд вводят в следовых количествах, т.е. в выявляемых количествах для РЕТ-визуализации, то терапевтический эффект не может объясняться введением радиоактивных лигандов в соответствии с настоящим изобретением.Thus, overdistribution can be useful for diagnosis, case finding, stratification of subject groups, and in tracking disease progression in individual subjects, particularly as tau therapies, such as antibodies, become available. Since the radioactive ligand is administered in trace amounts, i.e. in detectable amounts for PET imaging, then the therapeutic effect cannot be explained by the introduction of radioactive ligands in accordance with the present invention.
Экспериментальная часть.Experimental part.
Химия.Chemistry.
Используемый в данном документе термин ACN или MeCN означает ацетонитрил, водн. означает водный, tBuOH означает трет-бутанол, DCM означает дихлорметан, DIPE означает диизопропиловый эфир, DIPEA означает N,N-диизопропилэтиламин, DMF означает N,N-диметилформамид, DMSO означает диметилсульфоксид, Et2O означает диэтиловый эфир, EtOAc означает этилацетат, ч означает часы, HPLC означает высокоэффективную жидкостную хроматографию, LCMS означает жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, МеОН означает метанол, мин означает минуты, т.пл. означает точку плавления, орг. означает органический, Pd2(dba)3 означает трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0), преп. Означает препаративный, р.см. означает реакционную смесь, к.т. означает комнатную температуру, Rt означает время удерживания (в минутах), насыщ. означает насыщенный, раств. означает раствор, TFA означает трифторуксусную кислоту, THF означает тетрагидрофуран, XantPhos означает 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен.As used herein, the term ACN or MeCN means acetonitrile, aq. means aqueous, tBuOH means tert-butanol, DCM means dichloromethane, DIPE means diisopropyl ether, DIPEA means N,N-diisopropylethylamine, DMF means N,N-dimethylformamide, DMSO means dimethyl sulfoxide, Et 2 O means diethyl ether, EtOAc means ethyl acetate, h means hours, HPLC means high performance liquid chromatography, LCMS means liquid chromatography/mass spectrometry, MeOH means methanol, min means minutes, m.p. means melting point, org. means organic, Pd 2 (dba) 3 means tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0), prep. Means preparative, r.cm. means the reaction mixture, k.t. means room temperature, Rt means retention time (in minutes), sat. means saturated, sol. means solution, TFA means trifluoroacetic acid, THF means tetrahydrofuran, XantPhos means 4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene.
Тонкослойную хроматографию (TLC) проводили на пластинах со слоем силикагеля 60 F254 (Merck) с применением химически чистых растворителей. Хроматографию на открытых колонках проводили на силикагеле с размером частиц 230-400 меш и размером пор 60 A (Merck) в соответствии со стандартными методиками.Thin layer chromatography (TLC) was carried out on plates with a layer of silica gel 60 F254 (Merck) using chemically pure solvents. Open column chromatography was performed on silica gel with a particle size of 230-400 mesh and a pore size of 60 A (Merck) according to standard procedures.
Автоматизированную колоночную флеш-хроматографию проводили с применением готовых к подключению одноразовых картриджей, приобретенных у Grace (картриджи GraceResolv™) или Teledyne ISCO (картриджи RediSep®), на силикагеле с зернами неправильной формы с размером частиц 35-70 мкм на аппарате ISCO CombiFlash или Biotage Isolera™ Spektra.Automated flash column chromatography was performed using ready-to-connect disposable cartridges purchased from Grace (GraceResolv™ cartridges) or Teledyne ISCO (RediSep® cartridges) on irregularly shaped silica gel with a particle size of 35-70 µm on an ISCO CombiFlash or Biotage apparatus. Isolera™ Spektra.
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР): для нескольких соединений 'Н-ЯМР-спектры записывали на ЯМР-спектрометре либо Bruker Ultrashield AV300, Bruker DPX 360 МГц NMR, либо Bruker Avance III 400 МГц со стандартными последовательностями импульсов, работающих при 300, 360 и 400 МГц соответственно. Образцы растворяли в DMSO-d6 или CDCl3 и переносили в пробирки для ЯМР объемом 5 мм для измерения. Химические сдвиги (δ) указаны в частях на миллион (ppm) для слабопольного сдвига от тетраметилсилана (TMS), который применяли в качестве внутреннего стандарта.Nuclear Magnetic Resonance (NMR): For several compounds, 'H-NMR spectra were recorded on either a Bruker Ultrashield AV300, Bruker DPX 360 MHz NMR, or Bruker Avance III 400 MHz NMR spectrometer with standard pulse trains operating at 300, 360, and 400 MHz respectively. Samples were dissolved in DMSO-d 6 or CDCl 3 and transferred to 5 mm NMR tubes for measurement. Chemical shifts (δ) are given in parts per million (ppm) for the downfield shift from tetramethylsilane (TMS), which was used as an internal standard.
Очистку HPLC выполняли на GILSON Semi-Preparative System, функционирующей с помощью программного обеспечения Trilution, оснащенной колонкой Phenomenex Gemini C18 100А (длина 100 мм х 30 мм I.D.; частицы 5 мкм) при к.т. °С, со скоростью потока 40 мл/мин, с использованием градиентного элюирования за 20 мин, как указано в протоколах синтеза. Объем вводимой пробы составлял 8000 мкл. Частоту сбора данных устанавливали на 284 нм для детектора UV-Dual.HPLC purification was performed on a GILSON Semi-Preparative System running with Trilution software equipped with a Phenomenex Gemini C18 100A column (100 mm length x 30 mm I.D.; 5 µm particles) at rt. °C, at a flow rate of 40 ml/min, using a 20 min gradient elution as specified in the synthesis protocols. The volume of the injected sample was 8000 µl. The acquisition frequency was set to 284 nm for the UV-Dual detector.
Некоторые способы получения соединений по настоящему изобретению проиллюстрированы в следующих примерах, которые предназначены для иллюстрации, но не для ограничения объема настоящего изобретения. Если не указано иное, то все исходные материалы получали от коммерческих поставщиков и применяли без дополнительной очистки.Some methods for preparing the compounds of the present invention are illustrated in the following examples, which are intended to illustrate, but not to limit the scope of the present invention. Unless otherwise indicated, all starting materials were obtained from commercial suppliers and used without further purification.
А. Синтез промежуточных соединений.A. Synthesis of intermediates.
Получение промежуточного соединения 1Getting Intermediate 1
Тетраметилолово (0,736 мл, 5,309 ммоль) добавляли к смеси 5-бром-4-фторпиридин-2-амина (0,338 г, 1,77 ммоль, CAS 944401-69-8), бис(трифенилфосфин)палладия(П) хлорида (0,062 г, 0,0885 ммоль) и LiCl (0,300 г, 7,078 ммоль) в 10 мл DMF. Эту смесь закупоривали в пробирке после дегазирования азо- 10 039208 том. Затем смесь взбалтывали при 120°С в течение 18 ч, после чего ее разбавляли водой. Затем добавляли насыщенный водный раствор KF и водн. слой экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные орг. слои высушивали (MgSO4), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный материал очищали колоночной флэш-хроматографией (оксид кремния; DCM/MeOH от 100/0 до 95/5). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 1 (0,190 г, 79%).Tetramethyltin (0.736 mL, 5.309 mmol) was added to a mixture of 5-bromo-4-fluoropyridine-2-amine (0.338 g, 1.77 mmol, CAS 944401-69-8), bis(triphenylphosphine)palladium(II) chloride (0.062 g, 0.0885 mmol) and LiCl (0.300 g, 7.078 mmol) in 10 ml DMF. This mixture was sealed in a test tube after degassing with nitrogen. The mixture was then agitated at 120°C for 18 hours, after which it was diluted with water. Then a saturated aqueous solution of KF and aq. layer was extracted with EtOAc. United org. the layers were dried (MgSO 4 ), filtered and the solvents were evaporated in vacuo. The crude material was purified by flash column chromatography (silica; DCM/MeOH 100/0 to 95/5). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 1 (0.190 g, 79%).
Получение промежуточного соединения 2Preparation of Intermediate 2
Оч ,О *N + нO h , O * N + n
Способ 1: ко взбалтываемому раствору 6-аминоизохинолина (18,3 г, 127,1 ммоль) в толуоле (400 мл) добавляли 2-бром-5-метил-4-нитропиридин (23,0 г, 105,9 ммоль), Xantphos (2,45 г, 4,24 ммоль), Pd2(dba)3 (1,94 г, 2,12 ммоль), tBuOK (16,6 г, 148,3 ммоль) под азотом. Азот барботировали через смесь в течение 5 мин, а затем флакон закупоривали и нагревали при 100°С в течение 2 ч. Смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали с помощью EtOAc до экстрагирования всего продукта. К фильтрату добавляли воду и орг. слой отделяли, высушивали (MgSO4), фильтровали и концентрировали. Остаток помещали в воду, растирали в течение 1 ч, фильтровали и высушивали в вакууме при 55°С. Полученное в результате коричневое твердое вещество (растворенное в МеОН при рН 4) очищали посредством препаративной HPLC (стационарная фаза: RP XBridge Prep C18 OBD-10 мкм, 50x150 мм, подвижная фаза: 0,5% раствор NH4OAc в воде+10% CH3CN, МеОН). Чистые фракции объединяли и органический компонент элюента выпаривали. Формировался красный осадок, который фильтровали, промывали водой и высушивали. Полученный в результате осадок взбалтывали в DCM/MeOH/1н. NaOH (2 л/0,2 л/1 л) до полного растворения и орг. слой отделяли. Водн. слой экстрагировали еще раз с DCM. Объединенные орг. слои высушивали (MgSO4), фильтровали и выпаривали. Остаток растирали в двухфазной смеси эфира и воды, фильтровали и высушивали в вакууме в течение 2 дней при 50°С и 4 ч в лиофилизаторе при к.т. с получением промежуточного соединения 2 в виде оранжевых кристаллов (6,11 г, 18%). 1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ ppm 2,40 (s, 3 Н) 7,50 (s, 1 Н) 7,62-7,71 (m, 2 Н) 8,01 (d, J=9,0 Гц, 1 H) 8,36 (d, J=5,7 Гц, 1 H) 8,45 (s, 2 Н) 9,09 (s, 1 Н) 9,97 (s, 1 Н)Method 1: To a stirred solution of 6-aminoisoquinoline (18.3 g, 127.1 mmol) in toluene (400 ml) was added 2-bromo-5-methyl-4-nitropyridine (23.0 g, 105.9 mmol), Xantphos (2.45 g, 4.24 mmol), Pd 2 (dba) 3 (1.94 g, 2.12 mmol), tBuOK (16.6 g, 148.3 mmol) under nitrogen. Nitrogen was bubbled through the mixture for 5 minutes and then the vial was stoppered and heated at 100° C. for 2 hours. The mixture was filtered and the filter cake washed with EtOAc until all product was extracted. Water and org. the layer was separated, dried (MgSO 4 ), filtered and concentrated. The residue was taken up in water, triturated for 1 h, filtered and dried in vacuo at 55°C. The resulting brown solid (dissolved in MeOH at pH 4) was purified by preparative HPLC (stationary phase: RP XBridge Prep C18 OBD-10 µm, 50x150 mm, mobile phase: 0.5% NH 4 OAc in water+10% CH 3 CN, MeOH). Pure fractions were combined and the organic component of the eluent was evaporated. A red precipitate formed which was filtered, washed with water and dried. The resulting precipitate was shaken in DCM/MeOH/1N. NaOH (2 l / 0.2 l / 1 l) until completely dissolved and org. layer was separated. Water the layer was extracted again with DCM. United org. the layers were dried (MgSO 4 ), filtered and evaporated. The residue was triturated in a biphasic mixture of ether and water, filtered and dried in vacuo for 2 days at 50°C and 4 hours in a lyophilizer at rt. to give intermediate 2 as orange crystals (6.11 g, 18%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 2.40 (s, 3 H) 7.50 (s, 1 H) 7.62-7.71 (m, 2 H) 8.01 (d , J=9.0 Hz, 1 H) 8.36 (d, J=5.7 Hz, 1 H) 8.45 (s, 2 H) 9.09 (s, 1 H) 9.97 (s , 1 N)
Способ 2. Ко взбалтываемому раствору 6-аминоизохинолина (7,62 г, 52,85 ммоль) в 200 мл толуола добавляли 2-бром-5-метил-4-нитропиридин (11,47 г, 52,85 ммоль), Xantphos (0,611 г, 1,057 ммоль), Pd2(dba)3 (0,484 г, 0,529 ммоль) и tBuOK (8,30 г, 74,00 ммоль). Азот барботировали через смесь в течение 5 мин, а затем сосуд закупоривали и нагревали при 100°С в течение 2 ч, и еще 3 ч при 110°С. К смеси добавляли EtOAc, после чего ее взбалтывали в течение 30 мин. Затем смесь фильтровали через дикалит и осадок на фильтре промывали с помощью EtOAc до экстрагирования всего продукта. К фильтрату добавляли воду и орг. слой отделяли. Водн. слой экстрагировали с помощью EtOAc до тех пор, пока продукта не оставалось (LCMS контроль). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали (MgSO4), фильтровали и концентрировали. Остаток помещали в воду/DIPE, растирали в течение ночи, фильтровали и высушивали в вакууме при 55°С с получением промежуточного соединения 2 (10,5 г, 71%, 57% чистота), которое использовали как таковое для следующей реакционной стадии.Method 2 To a stirred solution of 6-aminoisoquinoline (7.62 g, 52.85 mmol) in 200 ml of toluene was added 2-bromo-5-methyl-4-nitropyridine (11.47 g, 52.85 mmol), Xantphos ( 0.611 g, 1.057 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.484 g, 0.529 mmol) and tBuOK (8.30 g, 74.00 mmol). Nitrogen was bubbled through the mixture for 5 minutes, and then the vessel was sealed and heated at 100°C for 2 hours, and another 3 hours at 110°C. EtOAc was added to the mixture, after which it was agitated for 30 minutes. The mixture was then filtered through dicalite and the filter cake washed with EtOAc until all product was extracted. Water and org. layer was separated. Water the layer was extracted with EtOAc until no product remained (LCMS control). The combined organic layers were washed with brine, dried (MgSO 4 ), filtered and concentrated. The residue was taken up in water/DIPE, triturated overnight, filtered and dried in vacuo at 55° C. to give Intermediate 2 (10.5 g, 71%, 57% pure) which was used as such for the next reaction step.
Получение промежуточного соединения 3Preparation of Intermediate 3
Триметилбороксин (0,256 мл, 1,83 ммоль) добавляли ко взбалтываемому раствору 5-бром-6фторпиридин-2-амина (0,291 г, 1,52 ммоль, CAS 944401-65-4), тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (0,176 г, 0,152 ммоль) и Cs2CO3 (0,993 г, 3,047 ммоль) в 1,4-диоксане (5,3 мл) при барботировании азотом. Реакционную смесь взбалтывали при 105°С в течение 16 ч под азотом. Добавляли воду и EtOAc. Фазы отделяли и органическую высушивали над MgSO4, фильтровали и выпаривали. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 0/100 до 50/50). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 3 в виде желтого твердого вещества (0,151 г, 79%).Trimethylboroxine (0.256 mL, 1.83 mmol) was added to an agitated solution of 5-bromo-6fluoropyridine-2-amine (0.291 g, 1.52 mmol, CAS 944401-65-4), tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) (0.176 g, 0.152 mmol) and Cs 2 CO 3 (0.993 g, 3.047 mmol) in 1,4-dioxane (5.3 ml) under nitrogen sparging. The reaction mixture was agitated at 105° C. for 16 hours under nitrogen. Water and EtOAc were added. The phases were separated and the organic was dried over MgSO4, filtered and evaporated. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 0/100 to 50/50). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 3 as a yellow solid (0.151 g, 79%).
Получение промежуточного соединения 4Preparation of Intermediate 4
Deoxo-Fluor® (50% в толуоле, 1,67 мл, 3,807 ммоль) добавляли каплями к раствору 2-хлор-5-(2фторэтил)пиридина (0,400 г, 2,538 ммоль, CAS 117528-28-6) в сухом DCM (15 мл) при 0°С. Через 1 мин холодную баню убирали и реакционную смесь взбалтывали при комнатной температуре в течение 2 чDeoxo-Fluor® (50% in toluene, 1.67 mL, 3.807 mmol) was added dropwise to a solution of 2-chloro-5-(2fluoroethyl)pyridine (0.400 g, 2.538 mmol, CAS 117528-28-6) in dry DCM ( 15 ml) at 0°C. After 1 min, the cold bath was removed and the reaction mixture was agitated at room temperature for 2 h.
- 11 039208- 11 039208
Смесь разбавляли водн. насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью DCM. Органический слой промывали водой, высушивали (MgSO4), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в гептане отThe mixture was diluted with aq. sat. NaHCO 3 and extracted with DCM. The organic layer was washed with water, dried (MgSO 4 ), filtered and the solvents were evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane from
0/100 до 70/30). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 4 (0,193 г, 45%).0/100 to 70/30). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 4 (0.193 g, 45%).
Получение промежуточного соединения 5Preparation of Intermediate 5
NaOH (0,064 г, 1,599 ммоль) добавляли к смеси [(6-хлорпиридин-3-ил)окси]уксусной кислоты (0,300 г, 1,599 ммоль, CAS 234109-28-5) в смеси CH3CN (4 мл) и воды (4 мл) . Смесь нагревали при 85°С в течение 1 ч Растворитель концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 5 (335 мг, 95%) в виде белого твердого вещества, которое использовали как таковое на следующей стадии.NaOH (0.064 g, 1.599 mmol) was added to a mixture of [(6-chloropyridin-3-yl)oxy]acetic acid (0.300 g, 1.599 mmol, CAS 234109-28-5) in a mixture of CH3CN (4 mL) and water (4 ml) . The mixture was heated at 85° C. for 1 h. The solvent was concentrated in vacuo to give intermediate 5 (335 mg, 95%) as a white solid, which was used as such in the next step.
Получение промежуточного соединения 6Preparation of Intermediate 6
Selectfluor® (1,116 г, 3,15 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 5 (0,314 г, 1,5 ммоль) в смеси воды (7,5 мл) и CH3CN (7,5 мл), предварительно дегазированной.Selectfluor® (1.116 g, 3.15 mmol) was added to a solution of intermediate 5 (0.314 g, 1.5 mmol) in a mixture of water (7.5 ml) and CH 3 CN (7.5 ml), previously degassed.
Добавляли трис(2,2'-бипиридил)дихлоррутения(П) гексагидрат (0,056 г, 0,075 ммоль). Реакционную смесь облучали 500 Вт лампой для судостроительной верфи, излучающей свет в видимой части спектра, помещенной на расстоянии 30 см от реакционной смеси, в течение 1 ч. После выключения света в реакционную среду наливали воду и диэтиловый эфир. Две фазы разделяли и водную экстрагировали с помощью Et2O. Объединенные органические фазы высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт фильтровали через силикагель с Et2O в качестве элюента и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 6 в виде бежевого маслянистого твердого вещества (0,167 г, 54%).Tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate (0.056 g, 0.075 mmol) was added. The reaction mixture was irradiated with a 500 W shipyard lamp emitting light in the visible part of the spectrum, placed at a distance of 30 cm from the reaction mixture, for 1 hour. After turning off the light, water and diethyl ether were poured into the reaction medium. The two phases were separated and the aqueous was extracted with Et 2 O. The combined organic phases were dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated under reduced pressure. The crude product was filtered through silica gel with Et 2 O as eluent and concentrated in vacuo to give intermediate 6 as a beige oily solid (0.167 g, 54%).
Получение промежуточного соединения 7Preparation of Intermediate 7
OO=S=O I . nhOO=S=O I . nh
Cl^N^Cl^N^
Взбалтываемый раствор 5-амино-2-хлорпиридина (1,00 г, 7,778 ммоль) в THF (27 мл) охлаждали до 0°С, затем к раствору добавляли 2-нитробензолсульфонилхлорид (1,72 г, 7,778 ммоль) и пиридин (0,942 мл, 11,668 ммоль). Обеспечивали нагревание полученной в результате смеси до к.т. и взбалтывали в течение 3 ч. 2-Нитробензолсульфонилхлорид (0,52 г, 2,334 ммоль) и пиридин (0,314 мл, 3,889 ммоль) добавляли при 0°С и смесь взбалтывали при к.т. в течение ночи. Затем к смеси добавляли воду и водн. слой экстрагировали EtOAc. Экстракт промывали насыщенным водн. NaHCO3 и солевым раствором. Орг. слой высушивали над MgSO4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель, EtOAc в гептане, от 0/100 до 10/90). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 7 (2,22 г, 91%).An agitated solution of 5-amino-2-chloropyridine (1.00 g, 7.778 mmol) in THF (27 ml) was cooled to 0°C, then 2-nitrobenzenesulfonyl chloride (1.72 g, 7.778 mmol) and pyridine (0.942 ml, 11.668 mmol). The resulting mixture was allowed to heat up to rt. and agitated for 3 h. 2-Nitrobenzenesulfonyl chloride (0.52 g, 2.334 mmol) and pyridine (0.314 ml, 3.889 mmol) were added at 0°C and the mixture was agitated at rt. during the night. Water and aq. were then added to the mixture. layer was extracted with EtOAc. The extract was washed with saturated aq. NaHCO 3 and saline. Org. the layer was dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. The residue was purified by flash column chromatography (silica gel, EtOAc in heptane, 0/100 to 10/90). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 7 (2.22 g, 91%).
Получение промежуточного соединения 8Preparation of Intermediate 8
Промежуточное соединение 7 (1,1 г, 3,506 ммоль) и 2-фторэтил 4-метилбензолсульфонат (0,918 г, 4,208 ммоль, CAS 383-50-6) растворяли в DMF (10,6 мл) . В атмосфере азота добавляли Cs2CO3 (1,942 г, 5,961 ммоль). Смесь нагревали до 85°С в течение ночи. После охлаждения до температуры окружающей среды темно-коричневую суспензию разбавляли водой и экстрагировали с EtOAc. Орг. слой промывалиIntermediate 7 (1.1 g, 3.506 mmol) and 2-fluoroethyl 4-methylbenzenesulfonate (0.918 g, 4.208 mmol, CAS 383-50-6) were dissolved in DMF (10.6 ml). Cs 2 CO 3 (1.942 g, 5.961 mmol) was added under nitrogen atmosphere. The mixture was heated to 85°C during the night. After cooling to ambient temperature, the dark brown suspension was diluted with water and extracted with EtOAc. Org. layer washed
- 12 039208 рассолом, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния, EtOAc в гептане, от 0/100 до 20/80). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 8 (0,687 г, 54%).- 12 039208 brine, dried over MgSO4, filtered and concentrated. The product was purified by flash column chromatography (silica, EtOAc in heptane, 0/100 to 20/80). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 8 (0.687 g, 54%).
Получение промежуточного соединения 9Preparation of Intermediate 9
Промежуточное соединение 7 (0,700 г, 2,231 ммоль) и 3-фторпропил-4-метилбензолсульфонат (0,674 г, 2,901 ммоль, CAS 312-68-5) растворяли в DMF (6,7 мл). Добавляли Cs2CO3 (1,45 г, 4,463 ммоль) и смесь нагревали до 85°С в течение ночи в атмосфере азота. Добавляли 3-фторпропил 4-метилбензолсульфонат (0,363 г, 1,562 ммоль) и Cs2CO3 (0,727 г, 2,231 ммоль) и смесь нагревали при 85°С в течение ночи. После охлаждения до температуры окружающей среды темно-коричневую суспензию разбавляли водой и экстрагировали с EtOAc. Органический слой промывали рассолом, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния, EtOAc в гептане, от 0/100 до 15/85). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 9 (0,395 г, 42%).Intermediate 7 (0.700 g, 2.231 mmol) and 3-fluoropropyl-4-methylbenzenesulfonate (0.674 g, 2.901 mmol, CAS 312-68-5) were dissolved in DMF (6.7 mL). Cs 2 CO 3 (1.45 g, 4.463 mmol) was added and the mixture was heated to 85° C. overnight under nitrogen. 3-Fluoropropyl 4-methylbenzenesulfonate (0.363 g, 1.562 mmol) and Cs 2 CO 3 (0.727 g, 2.231 mmol) were added and the mixture was heated at 85° C. overnight. After cooling to ambient temperature, the dark brown suspension was diluted with water and extracted with EtOAc. The organic layer was washed with brine, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated. The product was purified by flash column chromatography (silica, EtOAc in heptane, 0/100 to 15/85). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 9 (0.395 g, 42%).
Получение промежуточного соединения 10Preparation of Intermediate 10
Ко взбалтываемому раствору промежуточного соединения 8 (0,687 г, 1,91 ммоль) в 11,6 мл DMF добавляли LiOH-H2O (0,491 г, 11,46 ммоль) и 2-меркаптоэтанол (0,164 мл, 2,33 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь взбалтывали при к.т. в течение 2 ч. Добавляли воду и смесь экстрагировали с помощью EtOAc. Экстракт промывали водой и высушивали над MgSO4. Концентрирование при пониженном давлении давало маслянистые остатки. Продукт очищали флэш-хроматографией (силикагель, EtOAc в гептане, от 0/100 до 30/70). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 10 в виде желтого масла (0,276 г, 83%).To an agitated solution of intermediate 8 (0.687 g, 1.91 mmol) in 11.6 ml DMF was added LiOH-H 2 O (0.491 g, 11.46 mmol) and 2-mercaptoethanol (0.164 ml, 2.33 mmol) at 0°C. The reaction mixture was shaken at rt. over 2 hours. Water was added and the mixture was extracted with EtOAc. The extract was washed with water and dried over MgSO 4 . Concentration under reduced pressure gave oily residues. The product was purified by flash chromatography (silica gel, EtOAc in heptane, 0/100 to 30/70). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give intermediate 10 as a yellow oil (0.276 g, 83%).
Получение промежуточного соединения 11Preparation of Intermediate 11
Промежуточное соединение 10 (0,200 г, 1,145 ммоль) добавляли ко взбалтываемому раствору NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 0,069 г, 1,718 ммоль) в DMF (9,2 мл) при 0°С в атмосфере азота. После взбалтывания в течение 30 мин при данной температуре CH3I (0,134 мл, 1,833 ммоль) добавляли и взбалтывание продолжали в течение ночи при к.т. NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 0,032 г, 0,802 ммоль) добавляли при 0°С и смесь взбалтывали 30 мин. Добавляли CH3I (0,032 мл, 0,573 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 2 ч Смесь разбавляли водой и экстрагировали с EtOAc. Орг. слой высушивали (MgSO4), фильтровали и выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc в гептане от 0/100 до 15/85). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 11 (0,137 г, 63%).Intermediate 10 (0.200 g, 1.145 mmol) was added to an agitated solution of NaH (60% dispersion in mineral oil, 0.069 g, 1.718 mmol) in DMF (9.2 ml) at 0° C. under nitrogen. After shaking for 30 minutes at this temperature, CH 3 I (0.134 ml, 1.833 mmol) was added and shaking continued overnight at rt. NaH (60% dispersion in mineral oil, 0.032 g, 0.802 mmol) was added at 0° C. and the mixture was agitated for 30 minutes. CH 3 I (0.032 ml, 0.573 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. for 2 hours The mixture was diluted with water and extracted with EtOAc. Org. the layer was dried (MgSO 4 ), filtered and evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (EtOAc in heptane 0/100 to 15/85). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 11 (0.137 g, 63%).
Получение промежуточного соединения 12Preparation of Intermediate 12
NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 0,178 г, 4,46 ммоль) добавляли ко взбалтываемому раствору трет-бутил(6-хлорпиридин-3-ил)карбамата (1,36 г, 75% чистота, 4,46 ммоль, CAS 171178-45-3) в сухом DMF (7 мл) при 0°С под N2. Смесь взбалтывали при 0°С в течение 15 мин. Затем добавляли 1бром-3-фторпропан (0,491 мл, 5,353 ммоль) при 0°С, обеспечивали нагревание смеси до к.т. и взбалтывали в течение ночи. Добавляли больше 1-бром-3-фторпропана (0,327 мл, 3,568 ммоль) и NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 0,178 г, 4,46 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 4 ч. ДобавлялиNaH (60% dispersion in mineral oil, 0.178 g, 4.46 mmol) was added to an agitated solution of tert-butyl(6-chloropyridin-3-yl)carbamate (1.36 g, 75% pure, 4.46 mmol, CAS 171178-45-3) in dry DMF (7 ml) at 0°C under N 2 . The mixture was shaken at 0°C for 15 min. Then 1-bromo-3-fluoropropane (0.491 mL, 5.353 mmol) was added at 0° C., allowing the mixture to warm to rt. and shaken overnight. More 1-bromo-3-fluoropropane (0.327 ml, 3.568 mmol) and NaH (60% dispersion in mineral oil, 0.178 g, 4.46 mmol) were added and the mixture was agitated at rt. within 4 hours.
- 13 039208 дополнительный 1-бром-3-фторпропан (0,818 мл, 8,921 ммоль) и NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 0,178 г, 4,46 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение ночи. Реакционную смесь помещали в DCM и промывали насыщенным раствором NH4Cl. Органический слой отделяли, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 40 до 100%). Требуемые фракции извлекали и растворители выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 12 в виде бесцветного масла (1,71 г, 75% чистота, количественный выход).- 13 039208 additional 1-bromo-3-fluoropropane (0.818 ml, 8.921 mmol) and NaH (60% dispersion in mineral oil, 0.178 g, 4.46 mmol) and the mixture was shaken at rt. during the night. The reaction mixture was taken up in DCM and washed with saturated NH 4 Cl solution. The organic layer was separated, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo. The residue was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 40 to 100%). The desired fractions were recovered and the solvents were evaporated in vacuo to give intermediate 12 as a colorless oil (1.71 g, 75% pure, quantitative yield).
Получение промежуточного соединения 13Preparation of Intermediate 13
НH
СГ'ЬГSG'LG
Способ 1. TFA (4 мл, 53,3 ммоль) добавляли к смеси промежуточного соединения 12 (1,71 г, 5,33 ммоль, 75% чистота) в 20 мл DCM при 0°С, а затем смесь взбалтывали при к.т. в течение 150 мин. Затем смесь разбавляли DCM и промывали водн. насыщ. раствором NaHCO3. Орг. слой отделяли, высушивали (MgSO4), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 13 (1,91 г, 53% чистота, количественный), которое использовали как таковое.Method 1 TFA (4 ml, 53.3 mmol) was added to a mixture of intermediate 12 (1.71 g, 5.33 mmol, 75% pure) in 20 ml DCM at 0°C, and then the mixture was shaken at rt. t. within 150 min. The mixture was then diluted with DCM and washed with aq. sat. NaHCO 3 solution. Org. the layer was separated, dried (MgSO4), filtered and concentrated in vacuo to give intermediate 13 (1.91 g, 53% pure, quantitative) which was used as such.
Способ 2. Ко взбалтываемому раствору промежуточного соединения 7 (0,395 г, 0,93 ммоль) в DMF (5,6 мл) добавляли LiOH-H2O (0,239 г, 5,58 ммоль) и 2-меркаптоэтанол (0,798 мл, 1,134 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь взбалтывали при к.т. в течение 2 ч, после чего ее экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные орг. слои промывали водой, высушивали над MgSO4 и фильтровали. Концентрирование при пониженном давлении давало маслянистый остаток, который очищали флэш-хроматографией (силикагель, EtOAc в гептане, от 0/100 до 30/70). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 13 в виде желтого масла (0,168 г, 96%).Method 2 To an agitated solution of intermediate 7 (0.395 g, 0.93 mmol) in DMF (5.6 ml) was added LiOH-H 2 O (0.239 g, 5.58 mmol) and 2-mercaptoethanol (0.798 ml, 1.134 mmol) at 0°C. The reaction mixture was shaken at rt. for 2 h, after which it was extracted with EtOAc. United org. the layers were washed with water, dried over MgSO 4 and filtered. Concentration under reduced pressure gave an oily residue which was purified by flash chromatography (silica gel, EtOAc in heptane, 0/100 to 30/70). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give intermediate 13 as a yellow oil (0.168 g, 96%).
Получение промежуточного соединения 14Preparation of Intermediate 14
Способ 1. Формальдегид (37% в воде, 2,185 мл, 29,162 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 13 (полученного способом 1, 1,91 г, 9,721 ммоль, 53% чистота) в смеси уксусной кислоты (0,835 мл) и МеОН (20 мл). Затем порциями добавляли NaBH3CN (1,83 г, 29,162 ммоль). Смесь взбалтывали при к.т. в течение ночи (15 ч). Добавляли насыщ. раствор NaHCO3 и смесь экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слои высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 0/100 до 80/20). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 14 (0,687 г, 63%) в виде бесцветного масла.Method 1 Formaldehyde (37% in water, 2.185 ml, 29.162 mmol) was added to a solution of intermediate 13 (prepared by method 1, 1.91 g, 9.721 mmol, 53% pure) in a mixture of acetic acid (0.835 ml) and MeOH ( 20 ml). NaBH 3 CN (1.83 g, 29.162 mmol) was then added in portions. The mixture was shaken at rt. during the night (3 pm). Saturation was added. NaHCO 3 solution and the mixture was extracted with EtOAc. Org. the layers were dried over MgSO 4 , filtered and concentrated. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 0/100 to 80/20). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 14 (0.687 g, 63%) as a colorless oil.
Способ 2. Промежуточное соединение 13 (полученное способом 2, 0,172 г, 0,912 ммоль) добавляли ко взбалтываемому раствору NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 0,055 г, 1,368 ммоль) в DMF (7,3 мл) при 0°С в атмосфере азота. После взбалтывания в течение 30 мин при данной температуре добавляли CH3I (0,107 мл, 1,459 ммоль) и взбалтывали в течение ночи при к.т. Смесь разбавляли водой и экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой фильтровали, высушивали и выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc в гептане от 0/100 до 10/90). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 14 (0,143 г, 77%).Method 2 Intermediate 13 (prepared by Method 2, 0.172 g, 0.912 mmol) was added to an agitated solution of NaH (60% dispersion in mineral oil, 0.055 g, 1.368 mmol) in DMF (7.3 ml) at 0° C. under atmospheric nitrogen. After shaking for 30 minutes at this temperature, CH3I (0.107 ml, 1.459 mmol) was added and shaken overnight at rt. The mixture was diluted with water and extracted with EtOAc. The organic layer was filtered, dried and evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (EtOAc in heptane 0/100 to 10/90). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 14 (0.143 g, 77%).
Получение промежуточного соединения 15Preparation of Intermediate 15
2-Хлор-5-гидроксипиридин (0,300 г, 2,316 ммоль) и 2-фторэтил-4-метилбензолсульфонат (0,505 г, 2,316 ммоль, CAS 383-50-6) растворяли в DMF (7 мл). В атмосфере азота добавляли Cs2CO3 (1,132 г, 3,474 ммоль). Смесь нагревали до 85°С в течение 5 ч После охлаждения до температуры окружающей среды темно-коричневую суспензию разбавляли водой и экстрагировали с EtOAc. Орг. слои промывали с помощью солевого раствора, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния, EtOAc в гептане, от 0/100 до 35/65). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 15 (0,374 г, 92%).2-Chloro-5-hydroxypyridine (0.300 g, 2.316 mmol) and 2-fluoroethyl-4-methylbenzenesulfonate (0.505 g, 2.316 mmol, CAS 383-50-6) were dissolved in DMF (7 ml). Cs 2 CO 3 (1.132 g, 3.474 mmol) was added under nitrogen atmosphere. The mixture was heated to 85° C. for 5 h. After cooling to ambient temperature, the dark brown suspension was diluted with water and extracted with EtOAc. Org. the layers were washed with brine, dried over MgSO4, filtered and concentrated. The product was purified by flash column chromatography (silica, EtOAc in heptane, 0/100 to 35/65). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 15 (0.374 g, 92%).
Получение промежуточного соединения 16Preparation of Intermediate 16
2-Хлор-5-гидроксипиридин (0,300 г, 2,316 ммоль) и 3-фторпропил-4-метилбензолсульфонат (0,5382-Chloro-5-hydroxypyridine (0.300 g, 2.316 mmol) and 3-fluoropropyl-4-methylbenzenesulfonate (0.538
- 14 039208 г, 2,316 ммоль, CAS 312-68-5) растворяли в DMF (7 мл). В атмосфере азота добавляли Cs2CO3 (1,132 г, 3,474 ммоль). Смесь нагревали до 85°С в течение 5 ч. После охлаждения до температуры окружающей среды темно-коричневую суспензию разбавляли водой и экстрагировали с EtOAc. Органический слой промывали рассолом, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния, EtOAc в гептане, от 0/100 до 30/70). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 16 (0,408 г, 93%).- 14039208 g, 2.316 mmol, CAS 312-68-5) was dissolved in DMF (7 ml). Cs 2 CO 3 (1.132 g, 3.474 mmol) was added under nitrogen atmosphere. The mixture was heated to 85°C for 5 hours After cooling to ambient temperature, the dark brown suspension was diluted with water and extracted with EtOAc. The organic layer was washed with brine, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated. The product was purified by flash column chromatography (silica, EtOAc in heptane, 0/100 to 30/70). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 16 (0.408 g, 93%).
Получение промежуточного соединения 17Preparation of Intermediate 17
K3PO4 (1,70 г, 7,99 ммоль), Pd2(dba)3 (0,152 г, 0,166 ммоль) и Xantphos (0,161 мг, 0,277 ммоль) добавляли к раствору 2,5-дибромпиридина (0,738 г, 3,052 ммоль, CAS 624-28-2) в сухом THF (20 мл) при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли 6-аминоизохинолин (0,400 г, 2,774 ммоль, CAS 23687-26-5) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч. После охлаждения до к.т. смесь промывали с помощью водн. насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 0/100 до 75/25). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 17 (0,680 г, 80% чистота, выход 65%).K 3 PO 4 (1.70 g, 7.99 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.152 g, 0.166 mmol) and Xantphos (0.161 mg, 0.277 mmol) were added to a solution of 2,5-dibromopyridine (0.738 g, 3.052 mmol, CAS 624-28-2) in dry THF (20 ml) with nitrogen bubbling through the mixture. After 10 minutes, 6-aminoisoquinoline (0.400 g, 2.774 mmol, CAS 23687-26-5) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 hours. After cooling to rt. the mixture was washed with aq. sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. The organic layer was dried over MgSO4, filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 0/100 to 75/25). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give intermediate 17 (0.680 g, 80% purity, 65% yield).
Получение промежуточного соединения 18Preparation of Intermediate 18
смесь изомера Е (больший) и Z (меньший)mixture of isomer E (larger) and Z (smaller)
Промежуточное соединение 17 (0,680 г, 1,812 ммоль) в 1,4-диоксане (10,2 мл) дегазировали в течение 10 мин. Добавляли 2-[2-этоксивинил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (0,538 г, 2,719 ммоль, CAS 1201905-61-4, полученный согласно процедуре, описанной в WO 2012010538, смесь 2:1 Е и Z), Pd(OAc)2 (0,020 г, 0,0906 ммоль), X-Phos (0,095 г, 0,199 ммоль) и Cs2CO3 (0,886 г, 2,719 ммоль), а затем дегазированную воду (1,1 мл). Смесь дегазировали еще 10 мин и взбалтывали при 80°С в течение 6 ч. Затем смесь охлаждали до температуры окружающей среды и разбавляли EtOAc. Орг. фазу промывали водой и солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 0/100 до 100/0). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 18 (0,510 г, 91%, смесь Е и Z).Intermediate 17 (0.680 g, 1.812 mmol) in 1,4-dioxane (10.2 mL) was degassed for 10 min. 2-[2-ethoxyvinyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (0.538 g, 2.719 mmol, CAS 1201905-61-4, prepared according to the procedure described in WO 2012010538, mixture 2:1 E and Z), Pd(OAc) 2 (0.020 g, 0.0906 mmol), X-Phos (0.095 g, 0.199 mmol) and Cs 2 CO 3 (0.886 g, 2.719 mmol), followed by degassed water (1.1 ml). The mixture was degassed for another 10 minutes and agitated at 80° C. for 6 hours. The mixture was then cooled to ambient temperature and diluted with EtOAc. Org. the phase was washed with water and brine, dried over MgSO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 0/100 to 100/0). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give intermediate 18 (0.510 g, 91%, mixture of E and Z).
Получение промежуточного соединения 19Preparation of Intermediate 19
К смеси промежуточного соединения 18 (0,510 г, 1,75 ммоль) в THF (5,3 мл) добавляли HCl (2M в воде, 3,939 мл, 7,877 ммоль). Смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. Насыщ. NaHCO3 добавляли до рН 7. Смесь экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слой отделяли, высушивали (MgSO4), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 19. Продукт применяли как таковой на следующей стадии (0,378 г, 82%).To a mixture of intermediate 18 (0.510 g, 1.75 mmol) in THF (5.3 ml) was added HCl (2M in water, 3.939 ml, 7.877 mmol). The mixture was stirred at 60° C. overnight. Sat. NaHCO 3 was added to pH 7. The mixture was extracted with EtOAc. Org. the layer was separated, dried (MgSO 4 ), filtered and the solvents were evaporated in vacuo to give intermediate 19. The product was used as such in the next step (0.378 g, 82%).
Получение промежуточного соединения 20Preparation of Intermediate 20
NaBH4 (0,054 г, 1,436 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 19 в МеОН (4,5 мл) при 0°С. Смесь взбалтывали при к.т. в течение 30 мин. Добавляли воду и смесь экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слой отделяли, высушивали (MgSO4), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; МеОН в DCM от 0/100 до 10/90). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 20 (0,135 г, 35%).NaBH 4 (0.054 g, 1.436 mmol) was added to a solution of intermediate 19 in MeOH (4.5 ml) at 0°C. The mixture was shaken at rt. within 30 min. Water was added and the mixture was extracted with EtOAc. Org. the layer was separated, dried (MgSO 4 ), filtered and the solvents were evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; MeOH in DCM 0/100 to 10/90). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give Intermediate 20 (0.135 g, 35%).
В. Получение соединений формулы [19F] (I).B. Preparation of compounds of formula [ 19 F] (I).
Получение соединения 1Get connection 1
- 15 039208- 15 039208
Способ 1. K3PO4 (0,872 г, 4,11 ммоль), Pd2(dba)3 (0,078 г, 0,0856 ммоль) и Xantphos (0,083 г, 0,143 ммоль) добавляли к раствору 6-бромизохинолина (0,327 г, 1,57 ммоль) в сухом DMF (15 мл) при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли промежуточное соединение 1 (0,180 г, 1,427 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч После охлаждения до к.т. смесь промывали с помощью насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (оксид кремния; DCM/MeOH от 100/0 до 95/5). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт дополнительно очищали с помощью обращенной фазы от 70% Н2О (25 мМ NH4HCO3) - 30% MeCN-MeOH до 27% Н2О (25 мМ NH4HCO3) - 73% MeCN-MeOH. Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт растирали с DIPE с получением соединения 1 в виде белого твердого вещества (0,150 г, 41%).Method 1 K 3 PO 4 (0.872 g, 4.11 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.078 g, 0.0856 mmol) and Xantphos (0.083 g, 0.143 mmol) were added to a solution of 6-bromoisoquinoline (0.327 g , 1.57 mmol) in dry DMF (15 ml) with nitrogen bubbling through the mixture. After 10 min, intermediate 1 (0.180 g, 1.427 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 h. After cooling to rt. the mixture was washed with sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. Org. the layer was dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; DCM/MeOH 100/0 to 95/5). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was further purified by reverse phase from 70% H 2 O (25 mM NH4HCO3)-30% MeCN-MeOH to 27% H 2 O (25 mM NH4HCO3)-73% MeCN-MeOH. The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was triturated with DIPE to give Compound 1 as a white solid (0.150 g, 41%).
Способ 2. KF (10,2 г, 175,7 ммоль) добавляли к промежуточному соединению 2 (полученному способом 2, 9,85 г, 35,14 ммоль) в DMSO (236 мл). Полученную в результате смесь взбалтывали в течение 16 ч при 160°С, после чего LCMS демонстрировала полное превращение. Добавляли воду и DCM, двухфазную смесь встряхивали, а затем фильтровали через dicalite®. Орг. слой отделяли и водн. слой экстрагировали с помощью DCM. Объединенные орг. слои высушивали (MgSO4), фильтровали и выпаривали досуха. Красно-коричневый остаток очищали колоночной флэш-хроматографией с 120 г силикагеля с использованием градиента (гептан/EtOAc от 1:0 до 0:1). Фракции продукта выпаривали досуха с получением коричневого твердого вещества. Очистку проводили посредством препаративной HPLC (неподвижная фаза: RP XBridge Prep C18 OBD-10 мкм, 50x150 мм, подвижная фаза: раствор 0,25% NH4HCO3 в воде, МеОН) с получением соединения 1 в виде белых кристаллов (1,38 г, 15,5%) после выпаривания элюента, суспендирования в воде, фильтрования, промывания гептаном и высушивания в вакууме. 1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ ppm 2,17 (s, 3 Н) 6,75 (d, J=11,9 Гц, 1 H) 7,62 (d, J=5,7 Гц, 1 H) 7,66 (dd, J=8,9, 2,1 Гц, 1 H) 7,97 (d, J=8,8 Гц, 1 H) 8,20 (d, J=11,2 Гц, 1 H) 8,33 (d, J=5,7 Гц, 1 H) 8,42 (d, J=1,8 Гц, 1 H) 9,06 (s, 1 Н) 9,61 (s, 1 Н).Method 2 KF (10.2 g, 175.7 mmol) was added to intermediate 2 (prepared by method 2, 9.85 g, 35.14 mmol) in DMSO (236 ml). The resulting mixture was agitated for 16 hours at 160°C after which LCMS showed complete conversion. Water and DCM were added, the biphasic mixture was shaken and then filtered through dicalite®. Org. the layer was separated and aq. the layer was extracted with DCM. United org. the layers were dried (MgSO 4 ), filtered and evaporated to dryness. The red-brown residue was purified by 120 g silica gel flash column chromatography using a gradient (heptane/EtOAc 1:0 to 0:1). Product fractions were evaporated to dryness to give a brown solid. Purification was performed by preparative HPLC (stationary phase: RP XBridge Prep C18 OBD-10 µm, 50x150 mm, mobile phase: 0.25% NH4HCO3 solution in water, MeOH) to give compound 1 as white crystals (1.38 g, 15 .5%) after evaporating the eluent, suspending in water, filtering, washing with heptane and drying in vacuo. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.17 (s, 3 H) 6.75 (d, J=11.9 Hz, 1 H) 7.62 (d, J=5.7 Hz , 1 H) 7.66 (dd, J=8.9, 2.1 Hz, 1 H) 7.97 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=11, 2 Hz, 1 H) 8.33 (d, J=5.7 Hz, 1 H) 8.42 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 9.61 (s, 1 H).
Получение соединения 2Get connection 2
K3PO4 (0,462 г, 2,175 ммоль), Pd2(dba)3 (0,041 г, 0,0453 ммоль) и Xantphos (0,044 г, 0,0755 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 3 (0,100 г, 0,793 ммоль) в сухом THF при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли 6-бромизохинолин (0,157 г, 0,7 55 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч После охлаждения до к.т. смесь промывали с помощью водн. насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния; DCM/MeOH от 100/0 до 95/5). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали препаративной HPLC ((0,1% НСООН)/25 мМ NH4HCO3); от 70/30 до 27/73). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением соединения 2 (0,0238 г, 12%). 1Н-ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ ppm 2,24 (s, 3 Н) 6,72-6,86 (m, 2 Н) 7,40-7,60 (m, 3 Н) 7,89 (d, J=8,7 Гц, 1 Н) 7,93 (br s, 1 Н) 8,44 (d, J=5,8 Гц, 1 H) 9,10 (br s, 1 H).K 3 PO 4 (0.462 g, 2.175 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.041 g, 0.0453 mmol) and Xantphos (0.044 g, 0.0755 mmol) were added to a solution of intermediate 3 (0.100 g, 0.793 mmol ) in dry THF while bubbling nitrogen through the mixture. After 10 minutes, 6-bromoisoquinoline (0.157 g, 0.755 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 h. After cooling to rt. the mixture was washed with aq. sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; DCM/MeOH 100/0 to 95/5). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The residue was purified by preparative HPLC ((0.1% HCOOH)/25 mM NH4HCO3); from 70/30 to 27/73). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo to give compound 2 (0.0238 g, 12%). 1H-NMR (300 MHz, chloroform-d) δ ppm 2.24 (s, 3 H) 6.72-6.86 (m, 2 H) 7.40-7.60 (m, 3 H) 7, 89 (d, J=8.7 Hz, 1 H) 7.93 (br s, 1 H) 8.44 (d, J=5.8 Hz, 1 H) 9.10 (br s, 1 H) .
Получение соединения 3Get Compound 3
K3PO4 (0,300 г, 1,415 ммоль), Pd2(dba)3 (0,027 г, 0,0295 ммоль) и Xantphos (0,028 г, 0,0491 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 4 (0,080 г, 0,491 ммоль) в сухом THF (5 мл) при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,074 г, 0,516 ммоль, CAS 23687-26-5) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 90°С в течение 16 ч После охлаждения до к.т. смесь промывали с помощью насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; МеОН в DCM от 0/100 до 3/97). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Далее продукт очи- 16 039208 щали препаративной HPLC ((0,1% HCOOH)/ACN: МеОН 1:1); от 95/5 до 63/37). Требуемые фракции собирали, концентрировали в вакууме с получением соединения 3 (0,051 г, 38%). 1Н-ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ ppm 2,98 (dt, J=24,7, 6,2 Гц, 2 Н) 4,64 (dt, J=47,0, 6,3 Гц, 2 Н) 6,82 (br s, 1 Н) 6,98 (d, J=8,4 Гц,K 3 PO 4 (0.300 g, 1.415 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.027 g, 0.0295 mmol) and Xantphos (0.028 g, 0.0491 mmol) were added to a solution of intermediate 4 (0.080 g, 0.491 mmol ) in dry THF (5 ml) while bubbling nitrogen through the mixture. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.074 g, 0.516 mmol, CAS 23687-26-5) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 90° C. for 16 h. After cooling to rt. the mixture was washed with sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. Org. the layer was dried over MgSO4, filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; MeOH in DCM 0/100 to 3/97). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was further purified by preparative HPLC ((0.1% HCOOH)/ACN:MeOH 1:1); from 95/5 to 63/37). The desired fractions were collected, concentrated in vacuo to give compound 3 (0.051 g, 38%). 1 H-NMR (300 MHz, chloroform-d) δ ppm 2.98 (dt, J=24.7, 6.2 Hz, 2 H) 4.64 (dt, J=47.0, 6.3 Hz , 2 N) 6.82 (br s, 1 N) 6.98 (d, J=8.4 Hz,
Н) 7,43-7,56 (т, 3 Н) 7,89 (d, J=8,8 Гц, 1 Н) 7,98 (s, 1 H) 8,22 (s, 1 H) 8,43 (d, J=5, 8 Гц, 1 Н) 9, 10 (s, 1 H).H) 7.43-7.56 (t, 3 H) 7.89 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.98 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 8 .43 (d, J=5.8 Hz, 1 H) 9.10 (s, 1 H).
Соединение 3 также могло быть получено, в качестве альтернативы, из промежуточного соединения 20, например, путем образования соответствующего метансульфоната или 4-толуолсульфоната с последующим замещением источником фторида.Compound 3 could also be obtained, alternatively, from intermediate 20, for example, by formation of the corresponding methanesulfonate or 4-toluenesulfonate followed by displacement with a source of fluoride.
Получение соединения 4Get Compound 4
K3PO4 (0,481 г, 2,264 ммоль), Pd2(dba)3 (0,043 г, 0,0472 ммоль) и Xantphos (0,045 г, 0,0786 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 6 (0,127 г, 0,786 ммоль) в THF (6 мл) при барботировании азота. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,125 г, 0,865 ммоль, CAS 23687-26-5) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 90°С в течение 16 ч. После охлаждения до к.т. смесь промывали с помощью насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 5/95 до 100/0). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт очищали препаративной HPLC (от 59% Н2О (25 мМ NH4HCO3) - 41% MeCN-MeOH до 17% Н2О (25 мМ NH4HCO3) - 83% MeCN-MeOH). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт растирали с нпентаном с получением соединения 4 в виде бежевого твердого вещества (0,075 г, 34%). 1Н-ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ ppm 5,69 (d, J=54,6 Гц, 2 Н) 6,80 (br s, 1 Н) 7,00 (d, J=8,9 Гц, 1 Н) 7,39-7,47 (т, 1 Н) 7,54 (d, J=5,8 Гц, 1 Н) 7,89 (d, J=8,8 Гц, 1 Н) 7,97 (s, 1 H) 8,22 (d, J=2,1 Гц, 1 Н) 8,43 (d, J=5, 8 Гц, 1 Н) 9,09 (s, 1 H).K 3 PO 4 (0.481 g, 2.264 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.043 g, 0.0472 mmol) and Xantphos (0.045 g, 0.0786 mmol) were added to a solution of intermediate 6 (0.127 g, 0.786 mmol ) in THF (6 ml) with nitrogen sparging. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.125 g, 0.865 mmol, CAS 23687-26-5) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 90° C. for 16 hours. After cooling to rt. the mixture was washed with sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. The organic layer was dried over MgSO4, filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 5/95 to 100/0). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was purified by preparative HPLC (59% H 2 O (25 mM NH4HCO3)-41% MeCN-MeOH to 17% H 2 O (25 mM NH4HCO3)-83% MeCN-MeOH). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was triturated with npentane to give compound 4 as a beige solid (0.075 g, 34%). 1 H-NMR (300 MHz, chloroform-d) δ ppm 5.69 (d, J=54.6 Hz, 2 H) 6.80 (br s, 1 H) 7.00 (d, J=8, 9 Hz, 1 N) 7.39-7.47 (t, 1 N) 7.54 (d, J=5.8 Hz, 1 N) 7.89 (d, J=8.8 Hz, 1 N ) 7.97 (s, 1 H) 8.22 (d, J=2.1 Hz, 1 H) 8.43 (d, J=5.8 Hz, 1 H) 9.09 (s, 1 H ).
Получение соединения 5Get Compound 5
K3PO4 (0,294 г, 1,386 ммоль), Pd2(dba)3 (0,026 г, 0,0289 ммоль) и Xantphos (0,028 г, 0,0481 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 10 (0,084 г, 0,481 ммоль) в THF (4 мл) при барботировании азота. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,069 г, 0,481 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч Добавляли Pd2(dba)3 (0,026 г, 0,0289 ммоль) и Xantphos (0,028 г, 0,0481 ммоль) при барботировании азота и смесь дополнительно нагревали при 100°С в течение ночи. Pd2(dba)3 (0,026 г, 0,0289 ммоль) и Xantphos (0,028 г, 0,0481 ммоль) добавляли при барботировании азота и смесь дополнительно нагревали при 100°С в течение ночи. Смесь промывали с помощью водн. насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Органический слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в DCM от 0/100 до 50/50). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт дополнительно очищали препаративной HPLC (от 75% [25 мМ NH4HCO3] - 25% [ACN: МеОН 1:1] до 38% [25 мМ NH4HCO3] 62% [ACN: MeOH 1:1]). Требуемые фракции объединяли и растворитель выпаривали. Продукт растирали с Et2O и фильтровали с получением соединения 5 (0,042 г, 31%). 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ ppm 3,34-3,48 (m, 2 Н) 4,58 (dt, J=47,6, 4,8 Гц, 2 H) 5,63 (br t, J=5, 9 Гц, 1 H) 6,86 (d, J=8,8 Гц, 1 H) 7,11 (dd, J=8,8, 2,7 Гц, 1 H) 7,47-7,57 (m, 2 H) 7,78 (d, J=2,5 Гц, 1 H) 7,87 (d, J=8,9 Гц, 1 H) 8,21-8,31 (m, 2 H) 8, 96 (s, 1 H) 9, 12 (s, 1 H).K 3 PO 4 (0.294 g, 1.386 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.026 g, 0.0289 mmol) and Xantphos (0.028 g, 0.0481 mmol) were added to a solution of intermediate 10 (0.084 g, 0.481 mmol ) in THF (4 ml) with nitrogen sparging. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.069 g, 0.481 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 h. Pd 2 (dba) 3 (0.026 g, 0.0289 mmol) and Xantphos (0.028 g, 0.0481 mmol) were added with nitrogen bubbling and the mixture was further heated at 100° C. during the night. Pd 2 (dba) 3 (0.026 g, 0.0289 mmol) and Xantphos (0.028 g, 0.0481 mmol) were added with nitrogen bubbling and the mixture was further heated at 100° C. overnight. The mixture was washed with aq. sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in DCM 0/100 to 50/50). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was further purified by preparative HPLC (from 75% [25 mM NH4HCO3]-25% [ACN: MeOH 1:1] to 38% [25 mM NH4HCO3] 62% [ACN: MeOH 1:1]). The desired fractions were combined and the solvent was evaporated. The product was triturated with Et 2 O and filtered to give compound 5 (0.042 g, 31%). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 3.34-3.48 (m, 2 H) 4.58 (dt, J=47.6, 4.8 Hz, 2 H) 5, 63 (br t, J=5.9 Hz, 1 H) 6.86 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.11 (dd, J=8.8, 2.7 Hz, 1 H ) 7.47-7.57 (m, 2 H) 7.78 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 7.87 (d, J=8.9 Hz, 1 H) 8.21- 8.31(m, 2H) 8.96(s, 1H) 9.12(s, 1H).
Получение соединения 6Getting Compound 6
K3PO4 (0,444 г, 2,092 ммоль), Pd2(dba)3 (0,040 г, 0,0436 ммоль) и Xantphos (0,042 г, 0,0726 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 11 (0,137 г, 0,726 ммоль) в THF (6 мл) при барботировании азота. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,105 г, 0,726 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч Еще добавляли Pd2(dba)3 (0,026 г, 0,0289 ммоль) и Xantphos (0,028 г, 0,0481 ммоль) при барботировании азота через смесь, после чего ее дополнительно нагревали при 100°С в течение ночи. Смесь промывали с помощью водн. насыщ. NaHCO3 K3PO4 (0.444 g, 2.092 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.040 g, 0.0436 mmol) and Xantphos (0.042 g, 0.0726 mmol) were added to a solution of intermediate 11 (0.137 g, 0.726 mmol) in THF (6 ml) under nitrogen sparging. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.105 g, 0.726 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 h. Pd 2 (dba) 3 (0.026 g, 0.0289 mmol) and Xantphos (0.028 g, 0.0481 mmol) were further added while nitrogen was bubbled through the mixture, after which it was further heated at 100°C overnight. The mixture was washed with aq. sat. NaHCO3
- 17 039208 и экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в DCM от 0/100 до 65/35). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт дополнительно очищали препаративной HPLC (от 70% [25 мМ NH4HCO3] - 30% [ACN: MeOH 1:1] до 27% [25 мМ NH4HCO3] - 73% [ACN: MeOH 1:1]). Требуемые фракции объединяли и растворитель выпаривали. Продукт растирали с Et2O и фильтровали с получением соединения 6 (0,092 г, 43%). 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ ppm 2,93 (s, 3 Н) 3,62 (dt, J=26,7, 4,6 Гц, 2 H) 4,60 (dt, J=47,7, 4,7 Гц, 2 H) 6,93 (d, J=9,1 Гц, 1 H) 7,28 (dd, J=9,0, 2,7 Гц, 1 H) 7,46-7,60 (m, 2 H) 7,82-7,94 (m, 2 H) 8,27 (d, J=5, 8 Гц, 1 H) 8,34 (s, 1 H) 8, 97 (s, 1 H) 9,21 (s, 1 H).- 17 039208 and extracted with EtOAc. The combined organic layers were dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in DCM 0/100 to 65/35). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was further purified by preparative HPLC (from 70% [25 mM NH 4 HCO 3 ]-30% [ACN: MeOH 1:1] to 27% [25 mM NH4HCO3]-73% [ACN: MeOH 1:1]). The desired fractions were combined and the solvent was evaporated. The product was triturated with Et2O and filtered to give compound 6 (0.092 g, 43%). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 2.93 (s, 3 H) 3.62 (dt, J=26.7, 4.6 Hz, 2 H) 4.60 (dt, J=47.7, 4.7Hz, 2H) 6.93 (d, J=9.1Hz, 1H) 7.28 (dd, J=9.0, 2.7Hz, 1H) 7.46-7.60 (m, 2 H) 7.82-7.94 (m, 2 H) 8.27 (d, J=5.8 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H ) 8.97 (s, 1 H) 9.21 (s, 1 H).
Получение соединения 7Obtaining Compound 7
K3PO4 (0,544 г, 2,565 ммоль), Pd2(dba)3 (0,049 г, 0,0534 ммоль) и Xantphos (0,052 г, 0,0891 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 13 (0,168 г, 0,891 ммоль) в THF (6 мл) при барботировании азота. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,128 г, 0,891 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч. Добавляли больше Pd2(dba)3 (0,049 г, 0,0534 ммоль) и Xantphos (0,052 г, 0,0891 ммоль) под потоком азота и смесь снова нагревали при 100°С в течение ночи. Добавляли Pd2(dba)3 (0,049 г, 0,0534 ммоль) и Xantphos (0,052 г, 0,0891 ммоль) под потоком азота и смесь снова нагревали при 100°С в течение 6 ч Смесь промывали с помощью насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слои высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэшхроматографии (диоксид кремния; EtOAc в DCM от 0/100 до 45/55). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт очищали препаративной HPLC (от 75% [25 мМ NH4HCO3] - 25% [ACN: МеОН 1:1] до 0% [25 мМ NH4HCO3] - 100% [ACN: МеОН 1:1]). Требуемые фракции объединяли и растворитель выпаривали. Остаток растворяли в DCM, добавляли HCl (5М в 2-пропаноле) и полученную в результате смесь концентрировали в вакууме. Остаток растирали с Et2O и фильтровали с получением соединения 7 в виде оранжевого твердого вещества (0,066 г, выход 22%). 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ ppm 1,83-2,05 (m, 2 Н) 3,17 (br t, J=6,8 Гц, 2 H) 4,58 (dt, J=47,4, 5,8 Гц, 2 H) 5,83 (br s, 1 H) 7,00 (d, J=8,8 Гц, 1 H) 7,12 (dd, J=8,7, 2,7 Гц, 1 H) 7,77 (dd, J=9,2, 1,2 Гц, 1 H) 7,81 (d, J=2,5 Гц, 1 H) 7,99 (d, J=6,9 Гц, 1 H) 8,20 (d, J=9,1 Гц, 1 H) 8,28 (d, J=6, 6 Гц, 1 H) 8,42 (s, 1 Н) 9,30 (s, 1 Н) 10,08 (s, 1 Н).K 3 PO 4 (0.544 g, 2.565 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.049 g, 0.0534 mmol) and Xantphos (0.052 g, 0.0891 mmol) were added to a solution of intermediate 13 (0.168 g, 0.891 mmol ) in THF (6 ml) with nitrogen sparging. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.128 g, 0.891 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 hours. More Pd 2 (dba) 3 (0.049 g, 0.0534 mmol) and Xantphos (0.052 g, 0.0891 mmol) were added under nitrogen flow and the mixture was heated again at 100° C during the night. Pd2(dba)3 (0.049 g, 0.0534 mmol) and Xantphos (0.052 g, 0.0891 mmol) were added under a stream of nitrogen and the mixture was heated again at 100° C. for 6 h. The mixture was washed with sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. Org. the layers were dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in DCM 0/100 to 45/55). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was purified by preparative HPLC (from 75% [25 mM NH4HCO3] - 25% [ACN: MeOH 1:1] to 0% [25 mM NH4HCO3] - 100% [ACN: MeOH 1:1]). The desired fractions were combined and the solvent was evaporated. The residue was dissolved in DCM, HCl (5M in 2-propanol) was added and the resulting mixture was concentrated in vacuo. The residue was triturated with Et 2 O and filtered to give compound 7 as an orange solid (0.066 g, 22% yield). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 1.83-2.05 (m, 2 H) 3.17 (br t, J=6.8 Hz, 2 H) 4.58 (dt , J=47.4, 5.8 Hz, 2 H) 5.83 (br s, 1 H) 7.00 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.12 (dd, J=8 .7, 2.7Hz, 1H) 7.77 (dd, J=9.2, 1.2Hz, 1H) 7.81 (d, J=2.5Hz, 1H) 7.99 (d, J=6.9Hz, 1H) 8.20 (d, J=9.1Hz, 1H) 8.28 (d, J=6.6Hz, 1H) 8.42 (s , 1 H) 9.30 (s, 1 H) 10.08 (s, 1 H).
Получение соединения 8Getting connection 8
K3PO4 (0,431 г, 2,032 ммоль), Pd2(dba)3 (0,039 г, 0,0423 ммоль) и Xantphos (0,041 г, 0,0706 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 14 (0,143 г, 0,706 ммоль) в THF (5,9 мл) при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,102 г, 0,706 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч Добавляли еще Pd2(dba)3 (0,039 г, 0,0423 ммоль) и Xantphos (0,041 г, 0,0706 ммоль) при барботировании азота через смесь, после чего ее нагревали при 100°С в течение ночи. Дополнительный Pd2(dba)3 (0,039 г, 0,0423 ммоль) и Xantphos (0,041 г, 0,0706 ммоль) добавляли при барботировании азота и смесь нагревали при 100°С в течение 6 ч. Смесь промывали с помощью насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Орг. слой высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (диоксид кремния; EtOAc в DCM от 0/100 до 20/80). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт дополнительно очищали препаративной HPLC (от 75% [25 мМ NH4HCO3] - 25% [ACN: МеОН 1:1] до 0% [25 мМ NH4HCO3] - 100% [ACN: МеОН 1:1]). Требуемые фракции объединяли и растворитель выпаривали. Неочищенный продукт растворяли в DCM, добавляли HCl (5н. в 2-пропаноле) смесь концентрировали в вакууме. Остаток растирали с Et2O и фильтровали с получением соединения 8 в виде оранжевого твердого вещества (0,058 г, 23%). 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ ppm. 1,78-2,02 (m, 2 Н) 2,92 (s, 3 Н) 3,45 (br t, J=7,1 Гц, 2 H) 4,52 (dt, J=47,4, 5,7 Гц, 2 H) 7,09 (d, J=8,9 Гц, 1 H) 7,29 (dd, J=9,0, 3,0 Гц, 1 Н) 7,81 (dd, J=8,8, 1,2 Гц, 1 H) 7,91 (d, J=2,6 Гц, 1 H) 7,98 (d, J=6,6 Гц, 1 H) 8,21 (d, J=9,1 Гц, 1 H) 8,29 (d, J=6,7 Гц, 1 H) 8,51 (s, 1 Н) 9,32 (s, 1 Н) 10,20 (s, 1 Н).K 3 PO 4 (0.431 g, 2.032 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.039 g, 0.0423 mmol) and Xantphos (0.041 g, 0.0706 mmol) were added to a solution of intermediate 14 (0.143 g, 0.706 mmol ) in THF (5.9 ml) while bubbling nitrogen through the mixture. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.102 g, 0.706 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100°C for 16 h. More Pd2(dba)3 (0.039 g, 0.0423 mmol) and Xantphos (0.041 g, 0.0706 mmol) were added while nitrogen was bubbled through the mixture, after which it was heated at 100 °C during the night. Additional Pd2(dba)3 (0.039 g, 0.0423 mmol) and Xantphos (0.041 g, 0.0706 mmol) were added under nitrogen sparging and the mixture was heated at 100°C for 6 h. The mixture was washed with sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. Org. the layer was dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in DCM 0/100 to 20/80). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was further purified by preparative HPLC (from 75% [25 mM NH4HCO3] - 25% [ACN: MeOH 1:1] to 0% [25 mM NH4HCO3] - 100% [ACN: MeOH 1:1]). The desired fractions were combined and the solvent was evaporated. The crude product was dissolved in DCM, HCl (5N in 2-propanol) was added and the mixture was concentrated in vacuo. The residue was triturated with Et 2 O and filtered to give compound 8 as an orange solid (0.058 g, 23%). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm. 1.78-2.02 (m, 2 H) 2.92 (s, 3 H) 3.45 (br t, J=7.1 Hz, 2 H) 4.52 (dt, J=47.4 , 5.7 Hz, 2 H) 7.09 (d, J=8.9 Hz, 1 H) 7.29 (dd, J=9.0, 3.0 Hz, 1 H) 7.81 (dd , J=8.8, 1.2 Hz, 1 H) 7.91 (d, J=2.6 Hz, 1 H) 7.98 (d, J=6.6 Hz, 1 H) 8.21 (d, J=9.1 Hz, 1 H) 8.29 (d, J=6.7 Hz, 1 H) 8.51 (s, 1 H) 9.32 (s, 1 H) 10.20 (s, 1 H).
Получение соединения 9Getting Compound 9
- 18 039208- 18 039208
K3PO4 (0,449 г, 2,117 ммоль), Pd2(dba)3 (0,040 г, 0,0441 ммоль) и Xantphos (0,043 г, 0,0735 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 15 (0,142 г, 0,809 ммоль) в THF (4 мл) при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,106 г, 0,735 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч После охлаждения до к.т. смесь промывали с помощью водн. насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; EtOAc в гептане от 0/100 до 40/60). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Продукт растирали с диизопропиловым эфиром и фильтровали с получением соединения 9 в виде бежевого твердого вещества (0,116 г, 55%). 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ ppm 4,28 (br dt, J=30,2, 3,3 Гц, 2 H) 4,75 (br dt, J=47,9, 3,3 Гц, 2 H) 6,99 (d, J=8,9 Гц, 1 H) 7,43 (dd, J=8,9, 2,7 Гц, 1 H) 7,52-7,68 (m, 2 H) 7,93 (d, J=8,8 Гц, 1 H) 8,07 (d, J=2,5 Гц, 1 H) 8,30 (br d, J=5,6 Гц, 1 H) 8,42 (s, 1 H) 9,02 (s, 1 H) 9,44 (s, 1 H).K3PO4 (0.449 g, 2.117 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.040 g, 0.0441 mmol) and Xantphos (0.043 g, 0.0735 mmol) were added to a solution of intermediate 15 (0.142 g, 0.809 mmol) in THF (4 ml) while bubbling nitrogen through the mixture. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.106 g, 0.735 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 h. After cooling to rt. the mixture was washed with aq. sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. The combined organic layers were dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica gel; EtOAc in heptane 0/100 to 40/60). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The product was triturated with diisopropyl ether and filtered to give compound 9 as a beige solid (0.116 g, 55%). 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 4.28 (br dt, J=30.2, 3.3 Hz, 2 H) 4.75 (br dt, J=47.9, 3, 3 Hz, 2 H) 6.99 (d, J=8.9 Hz, 1 H) 7.43 (dd, J=8.9, 2.7 Hz, 1 H) 7.52-7.68 ( m, 2 H) 7.93 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 8.30 (br d, J=5.6 Hz , 1 H) 8.42 (s, 1 H) 9.02 (s, 1 H) 9.44 (s, 1 H).
Получение соединения 10Get connection 10
K3PO4 (0,449 г, 2,117 ммоль), Pd2(dba)3 (0,040 г, 0,0441 ммоль) и Xantphos (0,043 г, 0,0735 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 16 (0,153 г, 0,809 ммоль) в THF (4 мл) при барботировании азота через смесь. Через 10 мин добавляли изохинолин-6-амин (0,106 г, 0,735 ммоль) и смесь взбалтывали при к.т. в течение 10 мин. Затем смесь нагревали при 100°С в течение 16 ч Смесь промывали с помощью водн. насыщ. NaHCO3 и экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные орг. слои высушивали над MgSO4, фильтровали и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (диоксид кремния; EtOAc в гептане от 0/100 до 35/65). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в DCM, добавляли HCl (5н. в 2-пропаноле) и смесь концентрировали в вакууме. Остаток растирали с DIPE и фильтровали с получением соединения 10 в виде желтого твердого вещества (0,147 г, 47%). 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6) δ ppm 2,00-2,23 (m, 2 Н) 4,16 (t, J=6,2 Гц, 2 H) 4,63 (dt, J=47,3, 5,8 Гц, 2 H) 7,18 (d, J=8,9 Гц, 1 H) 7,51 (dd, J=8,9, 3,0 Гц, 1 H) 7,91 (dd, J=9,2, 1,4 Гц, 1 H) 8,07 (d, J=6,7 Гц, 1 H) 8,13 (d, J=2,7 Гц, 1 H) 8,28 (d, J=9,1 Гц, 1 H) 8,34 (d, J=6, 6 Гц, 1 H) 8,63 (s, 1 Н) 9,41 (s, 1 Н) 10,44 (s, 1 Н).K 3 PO 4 (0.449 g, 2.117 mmol), Pd 2 (dba) 3 (0.040 g, 0.0441 mmol) and Xantphos (0.043 g, 0.0735 mmol) were added to a solution of intermediate 16 (0.153 g, 0.809 mmol ) in THF (4 ml) while bubbling nitrogen through the mixture. After 10 minutes, isoquinoline-6-amine (0.106 g, 0.735 mmol) was added and the mixture was shaken at rt. within 10 min. The mixture was then heated at 100° C. for 16 h. The mixture was washed with aq. sat. NaHCO 3 and extracted with EtOAc. United org. the layers were dried over MgSO 4 , filtered and the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was purified by flash column chromatography (silica; EtOAc in heptane 0/100 to 35/65). The desired fractions were collected and concentrated in vacuo. The residue was dissolved in DCM, HCl (5N in 2-propanol) was added and the mixture was concentrated in vacuo. The residue was triturated with DIPE and filtered to give compound 10 as a yellow solid (0.147 g, 47%). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 2.00-2.23 (m, 2 H) 4.16 (t, J=6.2 Hz, 2 H) 4.63 (dt, J=47.3, 5.8Hz, 2H) 7.18 (d, J=8.9Hz, 1H) 7.51 (dd, J=8.9, 3.0Hz, 1H) 7.91 (dd, J=9.2, 1.4 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=6.7 Hz, 1 H) 8.13 (d, J=2.7 Hz, 1 H) 8.28 (d, J=9.1 Hz, 1 H) 8.34 (d, J=6.6 Hz, 1 H) 8.63 (s, 1 H) 9.41 (s, 1 H) 10.44 (s, 1 H).
С. Радиохимический синтез.C. Radiochemical synthesis.
Материалы и способы.Materials and methods.
Общая информация.General information.
Нерадиоактивный эталонный материал для Т808 синтезировали с помощью Janssen Research & Development (подразделение Janssen Pharmaceutica NV, Бирс, Бельгия) согласно сообщениям в литературе (Declercq L., Celen S., Lecina J. et al. Molecular Imaging 2016, 15, 1-151). Все химические вещества и реагенты приобретали у коммерческих источников и применяли без дополнительной очистки. HPLC-анализ проводили на системе LaChrom Elite HPLC (Hitachi, Дармштадт, Германия), соединенной с детектором УФ-излучения, установленным на 254 нм. Для анализа меченых радиоактивным изотопом соединений, элюат HPLC после пропускания через УФ-детектор проводили через сцинтилляционный детектор с NaI (Tl) размером 3 дюйма, присоединенный к одноканальному анализатору (GABI box; Raytest, Штраубенхардт, Германия). Данные получали и анализировали с применением систем сбора данных GINA Star (Raytest).A non-radioactive reference material for T808 was synthesized by Janssen Research & Development (a division of Janssen Pharmaceutica NV, Beers, Belgium) according to reports in the literature (Declercq L., Celen S., Lecina J. et al. Molecular Imaging 2016, 15, 1-151 ). All chemicals and reagents were purchased from commercial sources and used without further purification. HPLC analysis was performed on a LaChrom Elite HPLC system (Hitachi, Darmstadt, Germany) connected to a UV detector set at 254 nm. For the analysis of radiolabelled compounds, the HPLC eluate after passing through a UV detector was passed through a 3 inch NaI (Tl) scintillation detector attached to a single channel analyzer (GABI box; Raytest, Straubenhardt, Germany). Data were acquired and analyzed using GINA Star data acquisition systems (Raytest).
Тритирование соед. № 1Comm. tritiation No. 1
Н(Т)H(T)
Соед. № 1 [3Н] соед. № 1.Comm. No. 1 [ 3 H] conn. No. 1.
Соед. № 1 (1,74 мг, 6,87 мкмоль) и (1,2,5,6-п)-1,5-циклооктадиен(пиридин) (трициклогексилфосФин)иридия(1) гексафторфосфат, также называемый катализатором Крэбтри (7,72 мг, 9,59 мкмоль) растворяли в CH2Cl2 (0,6 мл). Ярко-оранжевый раствор дегазировали три раза на коллекторе для тритирования RC Tritec, а затем взбалтывали в атмосфере тритиевого газа (8,9 Ки) в течение 3,5 ч при комнатной температуре. Максимальное давление, достигаемое при реакции, составляло 882 мбар. После реакцииComm. No. 1 (1.74 mg, 6.87 µmol) and (1,2,5,6-p)-1,5-cyclooctadiene (pyridine) (tricyclohexylphosphine) iridium (1) hexafluorophosphate, also called Crabtree's catalyst (7, 72 mg, 9.59 μmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 (0.6 ml). The bright orange solution was degassed three times on an RC Tritec tritiation manifold and then agitated under tritium gas (8.9 Ci) for 3.5 hours at room temperature. The maximum pressure reached during the reaction was 882 mbar. After the reaction
- 19 039208 растворитель удаляли под вакуумом. Нестабильный тритий замещали путем добавления метанола (0,8 мл), взбалтывания раствора и повторного удаления растворителя под вакуумом. Данный способ повторяли три раза с получением сухого твердого неочищенного продукта.- 19 039208 the solvent was removed under vacuum. Unstable tritium was displaced by adding methanol (0.8 ml), shaking the solution and removing the solvent again under vacuum. This method was repeated three times to obtain a dry solid crude product.
Неочищенный продукт очищали с помощью способа HPLC: колонка Macherey+Nagel Nucleodur Gravity C18, 5 мкм, 8x150 мм; подвижная фаза А: вода с 0,1% TFA, В: ацетонитрил с 0,1% TFA; изократическая при 27% В; скорость потока 3,1 мл/мин, 230 и 254 нм, 20°С. После HPLC доводили рН фракций собранного продукта до нейтрального значения водным раствором NaHCO3 (10%). Объем смеси уменьшали на роторном испарителе. Затем продукт экстрагировали с помощью картриджа Phenomenex StrataX (3 мл, 100 мг), которые элюировали этанолом (5 мл). Полученный продукт дополнительно очищали с помощью HPLC в основных условиях: Macherey+Nagel Nucleodur Sphinx RP, 5 мкм, 8x150 мм; подвижная фаза А: 10 мМ NH4OAc с 0,05% NH4OH, В: ацетонитрил; изократическая при 46,5% В; скорость потока 3,1 мл/мин, 230 и 254 нм, 20°С. Объем фракций собранного продукта уменьшали на роторном испарителе. Затем продукт экстрагировали с помощью картриджа Phenomenex StrataX (3 мл, 100 мг), которые элюировали этанолом (5 мл).The crude product was purified by HPLC method: Macherey+Nagel Nucleodur Gravity C18 column, 5 µm, 8x150 mm; mobile phase A: water with 0.1% TFA, B: acetonitrile with 0.1% TFA; isocratic at 27% B; flow rate 3.1 ml/min, 230 and 254 nm, 20°C. After HPLC, the pH of the collected product fractions was adjusted to neutral with an aqueous solution of NaHCO 3 (10%). The volume of the mixture was reduced on a rotary evaporator. The product was then extracted with a Phenomenex StrataX cartridge (3 ml, 100 mg) which was eluted with ethanol (5 ml). The resulting product was further purified by HPLC under basic conditions: Macherey+Nagel Nucleodur Sphinx RP, 5 µm, 8x150 mm; mobile phase A: 10 mM NH 4 OAc with 0.05% NH 4 OH, B: acetonitrile; isocratic at 46.5% B; flow rate 3.1 ml/min, 230 and 254 nm, 20°C. The volume of fractions of the collected product was reduced on a rotary evaporator. The product was then extracted with a Phenomenex StrataX cartridge (3 ml, 100 mg) which was eluted with ethanol (5 ml).
Радиохимическую чистоту [3Н] соед. № 1 определяли как >99% с помощью следующего способа HPLC: колонка: Macherey+Nagel Nucleodur Sphinx RP (5 мкм), 4,6x150 мм, температура колонки: 30°С, подвижная фаза А: 10 мМ NH4OAc с 0,05% об./об. NH4OH в воде, подвижная фаза В: ацетонитрил, скорость потока: 1,0 мл/мин, объем введения: 5 мкл, длина волны выявления: УФ при 254 нм, градиент элюирования: градиент от 5%В до 95%В за 0-20 мин; изократическая при 95% В за 20-25 мин; градиент от 95% В до 5% В за 25-25,5 мин. Потоковым детектором радиоактивности служил Berthold LB 513 с коктейлем Zinsser Quickszint Flow 302 при скорости потока 3,0 мл/мин.Radiochemical purity [ 3 H] Comm. No. 1 was defined as >99% using the following HPLC method: column: Macherey+Nagel Nucleodur Sphinx RP (5 μm), 4.6x150 mm, column temperature: 30°C, mobile phase A: 10 mM NH 4 OAc with 0, 05% v/v NH 4 OH in water, mobile phase B: acetonitrile, flow rate: 1.0 ml/min, injection volume: 5 µl, detection wavelength: UV at 254 nm, elution gradient: gradient from 5%B to 95%B per 0-20 min; isocratic at 95% B for 20-25 minutes; gradient from 95% B to 5% B in 25-25.5 minutes. The radioactivity flow detector was a Berthold LB 513 with a Zinsser Quickszint Flow 302 cocktail at a flow rate of 3.0 ml/min.
Специфическую активность определяли до 57,7 мКи/ммоль с помощью масс-спектрометрии. Условия LCMS: колонка Agilent Zorbax SB C18 (1,8 мкм) 2,1x50 мм; подвижная фаза А: вода, 0,1% муравьиная кислота, В: MeCN 0,1% муравьиная кислота; 0 мин. 5% В; 0,2 мин. 5% В; 5 мин. 80% В; скорость потока 0,6 мл/мин; введение 1,0 мкл (1,06 мкКи, 39,2 кБк), УФ-выявление 225 нм; температура 60°С.The specific activity was determined to 57.7 mCi/mmol using mass spectrometry. LCMS conditions: Agilent Zorbax SB C18 column (1.8 µm) 2.1x50 mm; mobile phase A: water, 0.1% formic acid, B: MeCN 0.1% formic acid; 0 min. 5% B; 0.2 min. 5% B; 5 minutes. 80% B; flow rate 0.6 ml/min; injection 1.0 μl (1.06 μCi, 39.2 kBq), UV detection 225 nm; temperature 60°C.
Радиофторирование соед. № 1 (n=6)Radiofluorination Comm. No. 1 (n=6)
[18F]KF.K222[ 18 F]KF.K222
ΗΗ
DMSO, 160 °C (микроволновое излучение, 50 Вт), 10 мин.DMSO, 160 °C (microwave, 50 W), 10 min.
Промеж, соед. 2 [18П]соед. № 1Intermediate, conn. 2 [ 18 P]comp. No. 1
Получали фторид-18 ([18F]F-) с помощью ядерной реакции 18O(p,n)18F на циклотроне Cyclone 18/9 (Ion Beam Applications, Лувэн-ла-Нев, Бельгия) путем облучения 2 мл 97% обогащенного 18О-Н2О (Rotem HYOX18, Rotem Industries, Беэр-Шева, Израиль) протонами 18-МэВ. После облучения [18F]F- захватывали в анионообменном картридже SepPak Light Accell plus QMA (форма CO32-, Waters, Милфорд, Массачусетс, США) и элюировали с помощью смеси Kryptofix 2.2.2 (K-222, 27,86 мг) и K2CO3 (2,46 мг), растворенной в CH3CN/H2O (0,75 мл; 95:5 об./об.). После выпаривания растворителя с помощью потока гелия при 80°С и 35 Вт (микроволновый резонатор) добавляли безводный CH3CN (1 мл) и дополнительно высушивали [18F]F- при тех же условиях. Раствор 0,50 мг нитросодержащего предшественника в 0,25 мл DMSO добавляли к сухому остатку [18F] F-/K2CO3/K-222 и смесь нагревали при 160°С и 50 Вт в течение 10 мин в микроволновом резонаторе. Неочищенную смесь для введения радиоактивной метки разбавляли с помощью 0,6 мл препаративного буфера (0,01М Na2HPO4, pH 7,4, и EtOH (60:40 об./об.)) и очищали с применением HPLC с обращенной фазой (RP-HPLC) на колонке XBridge C18 (5 мкм, 4,6 мм x 150 мм; Waters, Милфорд, США) с элюированием смесью Na2HPO4, pH 7,4, и EtOH (60:40 об./об.) при расходе 0,8 мл/мин, и УФ-детекции при 254 нм. [18F]соед. № 1 элюировали 27 мин. Очищенный раствор с радиоактивным маркером разбавляли физиологическим раствором с получением концентрации этанола, составляющей <10%, подходящей для внутривенной инъекции. Раствор последовательно пропускали через фильтр 0,22 мкм (Millex-GV, Millipore, Биллерика, Массачусетс, США) с получением стерильного продукта. Контроль качества проводили с применением RP-HPLC на колонке XBridge (Ci8, 3,5 мкм, 3,0 mmxIOO мм; Waters, Милфорд, США) с элюированием смесью 0,01М Na2HPO4, pH 7,4, и CH3N (68:32 об./об.) при расходе 0,8 мл/мин. УФ-детекцию проводили при 254 нм. [18F]соед. № 1 элюировали 8 мин.Fluoride-18 ([ 18 F]F - ) was obtained using the nuclear reaction 18 O(p,n) 18 F on the Cyclone 18/9 cyclotron (Ion Beam Applications, Louvain-la-Neuve, Belgium) by irradiating 2 ml of 97% enriched in 18 О-Н2О (Rotem HYOX18, Rotem Industries, Beer Sheva, Israel) with 18-MeV protons. After irradiation, [ 18 F]F - was captured in a SepPak Light Accell plus QMA anion exchange cartridge (CO3 2- form, Waters, Milford, MA, USA) and eluted with Kryptofix 2.2.2 (K-222, 27.86 mg) and K2CO3 (2.46 mg) dissolved in CH3CN/H2O (0.75 ml; 95:5 v/v). After evaporating the solvent with a flow of helium at 80°C and 35 W (microwave resonator), anhydrous CH3CN (1 ml) was added and further dried with [ 18 F]F - under the same conditions. A solution of 0.50 mg of the nitro-containing precursor in 0.25 ml of DMSO was added to the dry residue of [ 18 F]F-/K2CO3/K-222 and the mixture was heated at 160° C. and 50 W for 10 min in a microwave resonator. The crude radiolabelling mix was diluted with 0.6 ml prep buffer (0.01 M Na2HPO 4 , pH 7.4, and EtOH (60:40 v/v)) and purified using reverse phase HPLC (RP -HPLC) on an XBridge C 18 column (5 μm, 4.6 mm x 150 mm; Waters, Milford, USA) eluting with Na 2 HPO 4 , pH 7.4, and EtOH (60:40 v/v). ) at a flow rate of 0.8 ml/min, and UV detection at 254 nm. [ 18 F]comp. No. 1 was eluted for 27 min. The purified radioactive marker solution was diluted with saline to give an ethanol concentration of <10% suitable for intravenous injection. The solution was successively passed through a 0.22 μm filter (Millex-GV, Millipore, Billerica, MA, USA) to obtain a sterile product. Quality control was performed using RP-HPLC on an XBridge column (Ci8, 3.5 μm, 3.0 mmxIOO mm; Waters, Milford, USA) eluting with 0.01M Na 2 HPO 4 , pH 7.4, and CH3N ( 68:32 v/v) at a flow rate of 0.8 ml/min. UV detection was performed at 254 nm. [ 18 F]comp. No. 1 was eluted for 8 min.
Получали [18F]соед. № 1 со средним, скорректированным относительно затухания радиохимическим выходом, составлявшим соответственно 12% (относительно радиоактивности [18F]F- на препаративной хроматограмме, n=6). Эту радиохимическую чистоту исследовали с применением HPLC на аналитической колонке C18, и она составляла более 99%. [18F]соед. № 1 получали на протяжении общего времени синтеза, составлявшего 60 мин, и собирали со средней конкретной радиоактивностью 85 ГБк/мкмоль в конце проведения синтеза (EOS, n=6).Received [ 18 F]Comp. No. 1 with an average attenuation-corrected radiochemical yield of 12%, respectively (relative to [ 18 F]F radioactivity in the preparative chromatogram, n=6). This radiochemical purity was examined using HPLC on a C 18 analytical column and was greater than 99%. [ 18 F]comp. No. 1 was obtained over a total synthesis time of 60 minutes and collected with an average specific radioactivity of 85 GBq/μmol at the end of the synthesis (EOS, n=6).
D. Аналитическая часть.D. Analytical part.
Точки плавления.melting points.
- 20 039208- 20 039208
Значения представляют собой либо максимальные значения, либо диапазоны значений температуры плавления, и их получали с экспериментальными погрешностями, которые обычно связаны с этим аналитическим способом.The values are either maximum values or melting temperature ranges, and were obtained with the experimental uncertainties that are commonly associated with this analytical method.
Для нескольких соединений точки плавления определяли с помощью прибора DSC823e (MettlerToledo). Точки плавления измеряли при градиенте температуры, составлявшем 10°С/мин. Максимальная температура составляла 300°С.For several compounds, melting points were determined using a DSC823e instrument (MettlerToledo). Melting points were measured at a temperature gradient of 10° C./min. The maximum temperature was 300°C.
Для нескольких соединений значения точки плавления определяли в открытых капиллярных трубках на Mettler Toledo МР50. Точки плавления измеряли при градиенте температуры, составлявшем 10°С/мин. Максимальная температура составляла 300°С. Данные о точках плавления считывали с цифрового дисплея и сверяли с данными системы видеозаписи.For several compounds, melting point values were determined in open capillary tubes on a Mettler Toledo MP50. Melting points were measured at a temperature gradient of 10° C./min. The maximum temperature was 300°C. Melting point data were read from a digital display and compared with data from a video recording system.
Способы LC/MS.LC/MS methods.
Измерения в ходе высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) осуществляли с применением насоса для LC, детектора на диодной матрице (DAD) или УФ-детектора и колонки, как описано в соответствующих способах. При необходимости включали дополнительные детекторы (см. приведенную ниже таблицу способов).High performance liquid chromatography (HPLC) measurements were performed using an LC pump, diode array detector (DAD) or UV detector and column as described in the respective methods. If necessary, additional detectors were included (see table of methods below).
Поток из колонки направляли в масс-спектрометр (MS), который был оснащен источником ионизации при атмосферном давлении. В компетенции специалиста в данной области техники находится установка настраиваемых параметров (например, диапазона сканирования, времени выдержки и т.п.) с целью получения ионов, обеспечивающих определение номинальной моноизотопной молекулярной массы (MW) соединения. Сбор данных осуществляли с помощью соответствующего программного обеспечения.The flow from the column was sent to a mass spectrometer (MS), which was equipped with an atmospheric pressure ionization source. It is within the skill of the art to set tunable parameters (eg, scan range, dwell time, etc.) to produce ions that provide a determination of the nominal monoisotopic molecular weight (MW) of the compound. Data collection was carried out using the appropriate software.
Соединения описывали по их значениям экспериментального времени удерживания (Rt) и ионам. Если в таблице данных не указано иное, то указанный молекулярный ион соответствует [М+Н]+ (протонированная молекула) и/или [М-Н]- (депротонированная молекула). В случае если соединение не было непосредственно способно к ионизации, указывают тип аддукта (т.е. [M+NH4]+, [М+НСОО]- и т.д.). Для молекул со сложными изотопными распределениями (Br, Cl) сообщаемое значение представляет собой значение, которое получали для наименьшей массы изотопа. Все результаты получали с экспериментальными погрешностями, которые обычно связаны с применяемым способом.Compounds were described by their experimental retention times (Rt) and ions. Unless otherwise indicated in the data sheet, the indicated molecular ion corresponds to [M+H]+ (protonated molecule) and/or [M-H] - (deprotonated molecule). In case the compound was not directly ionizable, the type of adduct is indicated (i.e. [M+NH4]+, [M+HCOO] - etc.). For molecules with complex isotopic distributions (Br, Cl), the reported value is the value that was obtained for the smallest isotope mass. All results were obtained with experimental errors, which are usually associated with the method used.
Далее в данном документе SQD означает одиночный квадрупольный детектор, MSD означает масс-селективный детектор, к.т. означает комнатную температуру, ВЕН означает мостиковый гибрид этилсилоксана/диоксида кремния, DAD означает детектор на диодной матрице, HSS означает диоксид кремния повышенной прочности.Throughout this document, SQD stands for Single Quadrupole Detector, MSD stands for Mass Selective Detector, k.t. stands for room temperature, BH stands for ethylsiloxane/silica bridged hybrid, DAD stands for diode array detector, HSS stands for high strength silica.
Таблица 1а. Коды способов LCMS (поток выражен в мл/мин;Table 1a. LCMS method codes (flow expressed in ml/min;
температура колонки (Т) в °С; время анализа в минутах)column temperature (T) in °С; analysis time in minutes)
- 21 039208- 21 039208
Таблица 1b. Данные анализа LCMS (Rt означает время удерживания (в минутах), [М+Н]+ означает массу протонированного соединения, способ относится к способу, применяемому для анализа (LC)MS)Table 1b. LCMS analysis data (Rt means retention time (in minutes), [M+H]+ means mass of protonated compound, method refers to the method used for (LC)MS analysis)
* от 30 до 300°С при 10°С/мин 50 мл N2.* 30 to 300°C at 10°C/min 50 ml N2.
Определения CHN и определения воды.CHN definitions and water definitions.
Для нескольких соединений количество углерода, водорода и азота (CHN) в (% вес./вес.) определяли с помощью Dynamic Flash Combustion на анализаторе ЕА 1108 CHN от Fisons instruments.For several compounds, the amount of carbon, hydrogen and nitrogen (CHN) in (% wt./wt.) was determined using Dynamic Flash Combustion on an EA 1108 CHN analyzer from Fisons instruments.
- 22 039208- 22 039208
Для нескольких соединений воду (% вес./вес.) определяли с помощью измерителя влажности СА-02 (Mitsubishi), кулонометрический принцип, применяемый к титрованию Карла-Фишера.For several compounds, water (% wt./wt.) was determined using a CA-02 moisture meter (Mitsubishi), the coulometric principle applied to the Karl-Fischer titration.
Таблица 1с. Определения CHN и водыTable 1c. Definitions of CHN and water
Е. Биологическая часть.E. Biological part.
Материалы и способы.Materials and methods.
Общая информация.General information.
Количественное определение радиоактивности в образцах для исследований биораспределения и радиоактивных метаболитов проводили с применением автоматизированного γ-счетчика, оснащенного кристаллом NaI(Tl) размером 3 дюйма с каналом, соединенным с многоканальным анализатором, помещенного в устройство для смены образцов (Wallac 2480 Wizard 3q, Wallac, Турку, Финляндия). Значения корректировали в отношении фонового излучения, физического затухания и мертвого времени счетчика. Грызунов содержали в вентилируемых по отдельности клетках в помещении с регулируемой температурой (~22°С) , контролируемой влажностью при цикле свет-темнота 12 ч - 12 ч, с доступом к пище и воде без ограничений. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с Бельгийским сводом правил по уходу и использованию животных после одобрения университетского комитета по этике в отношении животных.Quantification of radioactivity in samples for biodistribution studies and radioactive metabolites was performed using an automated γ-counter equipped with a 3-inch NaI(Tl) crystal with a channel connected to a multichannel analyzer placed in a sample changer (Wallac 2480 Wizard 3q, Wallac, Turku, Finland). The values were corrected for background radiation, physical attenuation and counter dead time. The rodents were housed in individually ventilated cages in a temperature controlled (~22°C) room, humidity controlled on a 12-12 hour light-dark cycle, with ad libitum access to food and water. All animal experiments were performed in accordance with the Belgian Code of Practice for the Care and Use of Animals, after approval by the University Animal Ethics Committee.
Выделение агрегированных тау-белков и амилоидных бляшек из головного мозга человека с AD.Isolation of aggregated tau proteins and amyloid plaques from the brain of a human with AD.
Обогащенные фракции агрегированных тау-белков получали в соответствии с немного модифицированной версией протокола, описанного Greenberg и Davies (Greenberg S.G., Davies P. A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct T proteins by polyacrylamide gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990; 87: 5827-5831) с использованием ткани головного мозга человека с AD (затылочная кора с высокой загрузкой фибрилл тау-белков). Вкратце, замороженные образцы головного мозга человека с AD (~10 г) гомогенизировали с 10-кратным объемом холодного буфера для гомогенизации (10 мМ Трис, 800 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 10% сахарозы, рН 7,4, содержащего фосфатазу PhosSTOP и ингибитор протеаз complete, не содержащий EDTA (Roche, Вилворде, Бельгия)) на льду. После центрифугирования при 27000 х g в течение 20 мин при 4°С извлекали надосадочную жидкость и добавляли 1% (вес./об.) Nлауроилсаркозина и 1% (об./об.) 2-меркаптоэтанола. Надосадочную жидкость с N-лауроилсаркозином/2меркаптоэтанолом инкубировали в течение 2 ч при 37°С при встряхивании на орбитальном шейкере. Впоследствии путем ультрацентрифугирования при 108000 х g в течение 1,5 ч при комнатной температуре осадок обогащали агрегированными тау-белками. Надосадочную жидкость удаляли и осадок осторожно промывали дважды небольшим количеством TBS (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,4). Наконец, осадок агрегированных тау-белков извлекали в TBS и повторно суспендировали с обеспечением однородности образца. Небольшие аликвоты хранили при -80°С.Enriched fractions of aggregated tau proteins were obtained according to a slightly modified version of the protocol described by Greenberg and Davies (Greenberg S.G., Davies P. A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct T proteins by polyacrylamide gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci 1990; 87: 5827-5831) using human brain tissue with AD (occipital cortex highly loaded with tau fibrils). Briefly, frozen human AD brain samples (~10 g) were homogenized with 10x cold homogenization buffer (10 mM Tris, 800 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% sucrose, pH 7.4, containing PhosSTOP phosphatase and complete protease inhibitor, EDTA-free (Roche, Vilvoorde, Belgium)) on ice. After centrifugation at 27,000 xg for 20 min at 4°C, the supernatant was removed and 1% (w/v) N-lauroylsarcosine and 1% (v/v) 2-mercaptoethanol were added. The N-lauroylsarcosine/2-mercaptoethanol supernatant was incubated for 2 hours at 37°C with shaking on an orbital shaker. Subsequently, by ultracentrifugation at 108,000 x g for 1.5 h at room temperature, the precipitate was enriched with aggregated tau proteins. The supernatant was removed and the pellet was gently washed twice with a small amount of TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4). Finally, the precipitate of aggregated tau proteins was recovered in TBS and resuspended to ensure sample homogeneity. Small aliquots were stored at -80°C.
Обогащенные препараты агрегированных бета-амилоидов получали из замороженных образцов головного мозга человека с AD (10 г затылочная кора с высокой загрузкой фибрилл тау-белков), которые гомогенизировали с 7-кратным объемом холодного буфера для гомогенизации (250 мМ сахарозы, 20 мМ Трис-основания, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, а также фосфатаза PhosSTOP и ингибитор протеаз complete без EDTA) на льду. После центрифугирования при 27000 х g в течение 20 мин клеточный дебрис удаляли при 4°С. Надосадочную жидкость, содержащую амилоидные бляшки, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.Enriched preparations of aggregated amyloid-beta were prepared from frozen human AD brain samples (10 g occipital cortex with a high loading of tau fibrils) that were homogenized with 7x cold homogenization buffer (250 mM sucrose, 20 mM Tris base). , 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, and PhosSTOP phosphatase and complete protease inhibitor without EDTA) on ice. After centrifugation at 27,000 x g for 20 min, cell debris was removed at 4°C. The supernatant containing amyloid plaques was aliquoted and stored at -80°C.
Анализы in vitro конкурентного связывания радиоактивного лиганда.In vitro assays for competitive binding of radioactive ligand.
В анализах конкурентного связывания радиоактивного лиганда измеряли связывание меченого радиоактивным изотопом эталонного лиганда в присутствии диапазона концентраций тестовых соединений в зависимости от дозы.Radioligand competitive binding assays measured the binding of a radiolabelled reference ligand in the presence of a range of dose-dependent test compound concentrations.
Вкратце, препараты агрегированных тау-белков разбавляли до 100 мкг белка/мл в PBS-буфере с помощью 5% этанола. В 96-луночном формате добавляли 3Н-Т808 (специфическая активность; 32,97 Ки/ммоль) до конечной концентрации 10 нМ к увеличивающимся количествам тестового соединения в присутствии 20 мкг белка препарата агрегированных тау-белков. Неспецифическое связывание определяли как число единиц, остающихся в присутствии 50 мкМ тиофлавина Т (обычное связывающее вещество для бета-листа). После 2 ч инкубирования при комнатной температуре несвязавшийся лиганд удаляли с помощью фильтрования связывающих смесей через стеклянные фильтры GF/B с применением прибора для сбора Filtermate 96 (Perkin Elmer, Завентем, Бельгия). Фильтры промывали три раза PBSбуфером, содержащим 20% этанола. После высушивания фильтрационного планшета, в течение ночи добавляли жидкость Microscint О (Perkin Elmer) и измеряли количество меченого радиоактивным изотопом лиганда, связавшегося с фибриллами посредством жидкостно-сцинтилляционной детекции в приборе Topcount (Packard Instrument Company, Коннектикут, США).Briefly, aggregated tau protein preparations were diluted to 100 μg protein/ml in PBS buffer with 5% ethanol. In a 96-well format, 3H-T808 (specific activity; 32.97 Ci/mmol) was added to a final concentration of 10 nM to increasing amounts of test compound in the presence of 20 μg of tau aggregate preparation protein. Non-specific binding was defined as the number of units remaining in the presence of 50 μM thioflavin T (a common beta-sheet binder). After 2 h incubation at room temperature, unbound ligand was removed by filtering the binding mixtures through GF/B glass filters using a Filtermate 96 collection device (Perkin Elmer, Zaventem, Belgium). The filters were washed three times with PBS buffer containing 20% ethanol. After drying the filtration plate, Microscint O liquid (Perkin Elmer) was added overnight and the amount of radiolabeled ligand bound to the fibrils was measured by liquid scintillation detection in a Topcount instrument (Packard Instrument Company, Connecticut, USA).
- 23 039208- 23 039208
Значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) определяли из кривых замещения, полученных по меньшей мере в двух независимых экспериментах с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния).Half maximum inhibitory concentration (IC50) values were determined from displacement curves obtained from at least two independent experiments using GraphPad Prism software (GraphPad Software, San Diego, CA).
Для определения связывания соединения с агрегированным бета-амилоидом осуществляли сходный анализ, но с некоторыми небольшими модификациями. Вкратце, амилоидные препараты разбавляли до 150 мкг белка/мл в 50 мМ Трис с помощью 0,1% BSA и 5% этанола. Добавляли 3H-AV-45 (флорбетапир специфическая активность; 45,95 Ки/ммоль) до конечной концентрации 10 нМ к увеличивающимся количествам тестового соединения в присутствии 30 мкг белка препарата амилоидных бляшек. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 500 мкМ тиофлавина Т. После 150 мин инкубирования при комнатной температуре связывающие смеси фильтровали через стеклянные фильтры GF/B. Фильтры промывали три раза PBS-буфером, содержащим 20% этанола. Последующие стадии были идентичны стадиям, описанным для препаратов агрегированных тау-белков.A similar assay was performed to determine compound binding to aggregated amyloid beta, but with some minor modifications. Briefly, amyloid preparations were diluted to 150 μg protein/ml in 50 mM Tris with 0.1% BSA and 5% ethanol. 3H-AV-45 (florbetapyr specific activity; 45.95 Ci/mmol) was added to a final concentration of 10 nM to increasing amounts of test compound in the presence of 30 μg amyloid plaque preparation protein. Non-specific binding was determined in the presence of 500 μM thioflavin T. After 150 min incubation at room temperature, the binding mixtures were filtered through GF/B glass filters. The filters were washed three times with PBS buffer containing 20% ethanol. The subsequent steps were identical to those described for aggregated tau protein preparations.
[19F]соед. № 1 демонстрировало эффективное связывание (pIC50 8,24, соответствующая Ki 2,4 нМ) с экстрагированным тау-белком человека с использованием [3Н]-Т808 и слабое связывание с агрегатами экстрагированного амилоида-бета человека (pIC50 5,18, соответствующая Kj 3,2 мкМ) с использованием [3H]-AV-45 в данном анализе замещения радиоактивной метки.[ 19 F]comp. No. 1 showed strong binding (pIC50 8.24 corresponding to Ki 2.4 nM) to extracted human tau protein using [ 3 H]-T808 and weak binding to extracted human amyloid-beta aggregates (pIC50 5.18 corresponding to Kj 3.2 μM) using [ 3 H]-AV-45 in this radiolabel displacement assay.
Иммуногистохимия (IHC): М&М головного мозга человека.Immunohistochemistry (IHC): M&M of the human brain.
Блоки головного мозга человека с AD (стадия по Брааку V-VI) подвергали быстрой заморозке, делали срезы на криостате (толщиной 20 мкм) и хранили при -80°С до применения в иммуногистохимическом исследовании. Срезы высушивали, фиксировали в формалине и инкубировали в пероксиде водорода (DAKO, S2023) в течение 5 мин и в блокирующем реагенте (PBS1x+0,05% Triton X-100) в течение 1 ч. Антитело к амилоиду или тау-белку [(4G8, Covance, SIG-38220), разбавление 1/500 в разбавителе для антител с фоновыми восстанавливающими компонентами (DAKO, S3022) или (АТ8 (Bierna et al., EMBO J. 1992, 11 (4):1593-7), собственного изготовления, исходная концентрация 1 мг/мл), 0,2 мкг/мл в разбавителе для антител с фоновыми восстанавливающими компонентами (DAKO, S3022)] наносили на срезы в течение 1 ч. Ткань стриатума иммунологически метили антителами к МАО-В и МАО-А (1:100, Thermo Fisher) для подтверждения экспрессии МАО.Human brain blocks with AD (Braak stage V-VI) were flash frozen, cut on a cryostat (20 μm thick) and stored at -80° C. until used in immunohistochemistry. Sections were dried, fixed in formalin, and incubated in hydrogen peroxide (DAKO, S2023) for 5 min and in blocking reagent (PBS1x + 0.05% Triton X-100) for 1 h. Anti-amyloid or tau antibody [( 4G8, Covance, SIG-38220), 1/500 dilution in antibody diluent with background reducing components (DAKO, S3022) or (AT8 (Bierna et al., EMBO J. 1992, 11(4):1593-7), home-made, initial concentration 1 mg/ml), 0.2 μg/ml in diluent for antibodies with background reducing components (DAKO, S3022)] were applied to sections for 1 h. Striatal tissue was immunologically labeled with antibodies to MAO-B and MAO -A (1:100, Thermo Fisher) to confirm MAO expression.
После сильного промывания срезы инкубировали с вторичным антителом к антителу мыши, конъюгированным с HRP (Envision, DAKO, R4000), с последующим нанесением хромогенного мечения DAB (DAKO, K3468). После контрастного окрашивания гематоксилином срезы обезвоживали и заливали органической заливочной средой (Vectamount, Vector labs, H-5000). На фиг. 1с показана патология, связанная с бета-амилоидами, в головном мозге с AD, определенная с помощью 4G8 IHC, и на фиг. 1b показана патология, связанная с тау-белками, в головном мозге с AD, определенная с помощью АТ8 IHC.After a strong wash, sections were incubated with an HRP-conjugated anti-mouse secondary antibody (Envision, DAKO, R4000) followed by DAB chromogenic labeling (DAKO, K3468). After counterstaining with hematoxylin, sections were dehydrated and embedded with organic embedding medium (Vectamount, Vector labs, H-5000). In FIG. 1c shows beta-amyloid pathology in AD brain as determined by 4G8 IHC, and FIG. 1b shows tau-associated pathology in AD brain as determined by AT8 IHC.
Авторадиографические исследования.Autoradiographic studies.
а) Высушенные на воздухе замороженные срезы толщиной 10-мкм зрительной зоны коры пациентки с AD (68-летняя женщина с заболеванием стадии по Брааку V-VI) инкубировали в течение 60 мин с [18F]соед. № 1 (7,4 кБк/500 мкл на срез), а затем промывали смесями PBS и этанола, как описано в другом месте (Xia C.F., Arteaga J., Chen G. et al. Alzheimer's Dement. 2013, 1-11). Для оценки специфичности связывания срезы инкубировали с маркером в присутствии 1 мкМ аутентичного Т808 или соед. № 1. После высушивания срезы подвергали воздействию фосфорного экрана с длительным послесвечением (экран высокого разрешения, Perkin Elmer). Экраны считывали на системе Cyclone Plus (Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс, США) и анализировали с использованием программного обеспечения Optiquant. Результаты выражали в виде цифровых световых единиц на квадратный мм (DLU/мм2). Смежные срезы с AD иммуноокрашивали с помощью антител к тау-белку (АТ8) и Ав (4G8) для установления отношения со связыванием [18F]соед. № 1.a) Air-dried, 10-µm-thick frozen sections of the optic cortex of a patient with AD (68-year-old woman with Braak stage V-VI disease) were incubated for 60 min with [ 18 F]comp. #1 (7.4 kBq/500 µl per section) and then washed with mixtures of PBS and ethanol as described elsewhere (Xia CF, Arteaga J., Chen G. et al. Alzheimer's Dement. 2013, 1-11) . To assess binding specificity, sections were incubated with a marker in the presence of 1 μM of authentic T808 or comp. No. 1. After drying, the sections were exposed to a phosphor screen with a long afterglow (high resolution screen, Perkin Elmer). Screens were read on a Cyclone Plus system (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) and analyzed using Optiquant software. The results were expressed as digital light units per square mm (DLU/mm 2 ). Adjacent sections with AD were immunostained with antibodies to tau protein (AT8) and Av (4G8) to establish a relationship with the binding of [ 18 F]comp. No. 1.
Цифровая авторадиография с [18F]соед. № 1 на человеческих срезах больного AD продемонстрировала высокое и селективное связывание с кортикальными участками, богатыми на тау-белки (фиг. 1, А). Иммуногистохимию с антителами к тау-белкам и к Ae выполняли на смежных срезах, идентифицировали многочисленные отложения в виде NFT и нейритических бляшек, что подтверждает совместную локализацию связывания маркера с NFT (фиг. 1, соответственно В и С). Для оценки специфичности связывания маркера с этими NFT проводили исследования блокирования с аутентичным эталонным соед. № 1 и структурно неродственным эталонным соединением Т808 (фиг. 2). Самоблокирование холодным соед. № 1 приводило к 99% ингибированию, что продемонстрировало, что связывание [18F]соед. № 1 является специфическим. Связывание [18F]соед. № 1 уменьшалось на 99% в присутствии 1 мкМ Т808, указывая на тау-специфическое связывание, поскольку сообщалось о высокой аффинности Т808 (KD=22 нМ) в отношении агрегированного тау и высокой селективности в отношении тау по сравнению с агрегатами Ae (27-кратная) (Zhang W., Arteaga J., Cashion D.K. et al. J Alzheimers Dis. 2012, 31(3), 601-612).Digital autoradiography with [ 18 F]Comp. No. 1 on human sections of AD patient showed high and selective binding to cortical regions rich in tau proteins (Fig. 1A). Immunohistochemistry with anti-tau and anti-Ae antibodies was performed on adjacent sections and identified numerous deposits in the form of NFTs and neuritic plaques, confirming co-localization of marker binding to NFTs (FIG. 1, B and C, respectively). To evaluate the specificity of marker binding to these NFTs, blocking studies were performed with an authentic reference compound. No. 1 and structurally unrelated reference compound T808 (Fig. 2). Self-locking cold connection No. 1 resulted in 99% inhibition, which demonstrated that the binding of [ 18 F]Comp. No. 1 is specific. Binding of [ 18 F]comm. No. 1 decreased by 99% in the presence of 1 μM T808, indicating tau-specific binding, since high affinity of T808 (K D = 22 nM) for aggregated tau and high selectivity for tau compared to Ae aggregates (27- multiple) (Zhang W., Arteaga J., Cashion DK et al. J Alzheimers Dis. 2012, 31(3), 601-612).
b) [3Н]-соед. № 1 связывалось с замороженными срезами мозга больного AD с патологией, связанной с тау-белками и патологией, связанной с Ав, но не связывалось с тканью больного AD без патологии, связанной с тау-белками, содержащей только бляшки Ав (фиг. 3D, Е). Маркер тестировали при 10 нМ и при этом более высокие концентрации в данном исследовании не рассматривали. Важно отметить,b) [ 3 H]-Comp. #1 bound to frozen brain sections of AD patient with tau-associated pathology and AV-associated pathology, but did not bind to tissue from AD patient without tau-related pathology containing only AV plaques (Fig. 3D, E ). The marker was tested at 10 nM and higher concentrations were not considered in this study. It is important to note,
- 24 039208 что [3Н]-соед. № 1 также не демонстрировало связывания с богатой на МАО человеческой тканью (стриатумом) (фиг. 3А). Эти данные подтверждают, что соединение по изобретению является селективным по отношению к патологии, связанной с тау-белками, но не к патологии, связанной с Ae и МАО.- 24 039208 that [ 3 H]-comp. No. 1 also showed no binding to MAO-rich human tissue (the striatum) (Fig. 3A). These data confirm that the compound of the invention is selective for tau-associated pathology but not for Ae and MAO-associated pathology.
Для сравнения использовали маркер тау [3Н]-ТНК-5351 и маркер Ав [3H]-AV-45, поскольку известно, что THK-5351 также связывается с МАО. Эти эксперименты показывают, что 10 нМ [3Н]-ТНК-5351 связывалось с богатой на МАО человеческой тканью, и это связывание могло самоблокироваться с помощью 10 мкМ ТНК-5351 (холодного), а также 10 мкМ соед. № 1 (холодного) (фиг. 3F-H). Это указывает на то, что соед. № 1 при более высоких концентрациях может связывать МАО.The tau marker [ 3 H]-THK-5351 and the AB marker [ 3 H]-AV-45 were used for comparison, since THK-5351 is also known to bind to MAO. These experiments show that 10 nM [ 3 H]-TNK-5351 bound to MAO-rich human tissue and this binding could be self-blocked by 10 μM TNK-5351 (cold) as well as 10 μM Comm. No. 1 (cold) (Fig. 3F-H). This indicates that the conn. No. 1 at higher concentrations can bind MAO.
[3Н]-ТНК5351 также связывалось с тканью больного AD, содержащей только бляшки Ae (негативной по тау), что подтверждает таким образом низкую селективность THK-5351 (фиг. 3I, J).[ 3 H]-THK5351 also bound to AD patient tissue containing only Ae plaques (tau-negative), thus confirming the low selectivity of THK-5351 (Fig. 3I, J).
[3H]-AV-45 (селективное по отношению к бляшкам Ав) связывалось, как предполагалось, с человеческими тканями как с патологией, связанной с тау-белками, и патологией, связанной с Ав (Ав+/тау+, ткань № 28391), так и с патологией, связанной только с Ав (Ав+/тау-, ткань № 92/050) (фиг. 3L-M). В качестве контроля для ткани человека, больного AD (ткань № 28391: фиг. 4, ткань № 92/050: фиг. 5) и ткани стриатума (фиг. 6), используемых в данном исследовании, выполняли иммуногистохимию. Ткани человека, больного AD (№ 28391; № 92/050), иммунологически метили с помощью 4G8 (антитело к амилоиду) и АТ8 (антитело к тау-белку) и при этом четко продемонстрировано, что срезы из № 28391 являются Ав+/тау+, тогда как срезы из № 92/050 являются Ав+/тау- (фиг. 4 и 5). Дополнительно, экспрессию МАО-В и МАО-А в человеческой ткани стриатума (№ S96/037) подтверждали с использованием иммуногистохимии (фиг. 6). Эти данные подтверждают выводы из in vitro связывания, наблюдаемого на фиг. 3.[ 3 H]-AV-45 (selective for AV plaques) has been suggested to be associated with human tissues as both a tau-associated pathology and an AV-related pathology (Ab+/tau+, tissue no. 28391 ), and pathology associated with AB only (Ab+/tau-, tissue no. 92/050) (Fig. 3L-M). As a control tissue from a human AD patient (tissue no. 28391: Fig. 4, tissue No. 92/050: Fig. 5) and striatal tissue (Fig. 6) used in this study, performed immunohistochemistry. Tissues from a human patient with AD (#28391; #92/050) were immunologically labeled with 4G8 (anti-amyloid) and AT8 (anti-tau) and clearly demonstrated that sections from #28391 are AB+/tau +, while sections from No. 92/050 are Av+/tau- (FIGS. 4 and 5). Additionally, the expression of MAO-B and MAO-A in human striatal tissue (No. S96/037) was confirmed using immunohistochemistry (FIG. 6). These data confirm the findings from the in vitro binding observed in FIG. 3.
с) Связывание [18F] соед. № 1 с тканью человека, больного AD, оценивали в присутствии подтвержденных связующих МАО. Как можно видеть на фиг. 7, 0,2 мКи/мл [18F] соед. № 1 продемонстрировало сильное связывание со срезами человека, больного AD с патологией, связанной с тау-белками (фиг. 7А). Этот паттерн связывания сохранялся при инкубировании образца с 10 мкМ клоргилина, сильного необратимого связующего МАО, с умеренной селективностью в отношении А-подтипа (фиг. 7В), или 10 мкМ селегилина (= депренила), сильного необратимого связующего МАО-В (фиг. 7С). Связывание [18F] соед. № 1 могло быть полностью блокировано 10 мкМ аутентичного соед. № 1 (фиг. 7D). Смежные срезы с AD иммуноокрашивали с помощью антител к тау-белкам (АТ8) и антител к Ав (4G8) для установления отношения со связыванием [18F]соед. № 1 (фиг. 8).c) Binding of [ 18 F] Comm. No. 1 with tissue from a human patient with AD was evaluated in the presence of confirmed MAO binders. As can be seen in FIG. 7, 0.2 mCi/ml [ 18 F] comp. No. 1 showed strong binding to sections of a human AD patient with tau-related pathology (FIG. 7A). This binding pattern was maintained when the sample was incubated with 10 μM clorgyline, a strong MAO-B irreversible binder, with moderate A-subtype selectivity (Fig. 7B), or 10 μM selegiline (= deprenyl), a strong MAO-B irreversible binder (Fig. 7C). ). Linking [ 18 F] Comm. No. 1 could be completely blocked by 10 μM authentic Comm. No. 1 (Fig. 7D). Adjacent sections with AD were immunostained with antibodies to tau proteins (AT8) and antibodies to AB (4G8) to establish a relationship with the binding of [ 18 F]comp. No. 1 (Fig. 8).
Исследования визуализации с помощью MicroPET Крысы линии Wistar.Imaging studies using MicroPET Wistar rats.
Динамическое дРЕТ сканирование в течение 120 мин с [18F]соед. № 1 или [18F]T807 выполняли на μΡΕΤ сканере Focus 220 (Concorde Microsystems, Ноксвилл, Теннесси, США) одновременно на трех самках крыс Wistar. В ходе всей процедуры крыс держали под газовой анестезией (2,5% изофлуран в О2 при скорости потока 1 л/мин). Изображения, получаемые с помощью сканирования, собирали в режиме списка и сбор данных подвергали редискретизации Фурье в 24 временных интервалах (4x15 с, 4x60 с, 5x180 с, 8x300 с, 3x600 с). Данные, которые реконструировали посредством 3D-реконструкции с применением максимальной апостериорной вероятности (3D-MAP), вручную выравнивали с помощью матрицы 18FFDG головного мозга крысы в координатах Paxinos с применением аффинной трансформации с обеспечением анализа предварительно определенных исследуемых объемных областей (VOI) (Casteels С. et al. J. Nucl. Med. 2006, 47, 1858-1866). Кривые время-активность (ТАС) целого головного мозга получали с применением VOI с помощью программного обеспечения PMOD (v 3.2, PMOD Technologies, Цюрих, Швейцария). Концентрацию радиоактивности в головном мозге выражали в виде стандартизированной величины поглощения (SUV, рассчитанной как (радиоактивность в Бк в мозге/мл)/(общая инъецированная доза (Бк)/вес тела в г)) в зависимости от времени после инъекции маркера. Сканирования начинали сразу же после IV инъекции приблизительно 50 МБк радиоактивного маркера (n=3/маркер). Для предварительной обработки и исследований замещения холодное эталонное соединение соед. № 1 или Т807 растворяли в смеси 5% DMSO, 5% Tween 80 и 40% (2-гидроксипропил)-бета-циклодекстрина, фильтровали через 0,22 мкм мембранный фильтр (Millex-GV, Millipore) перед инъекцией. Предварительную обработку (n=1) выполняли путем подкожной (SC) инъекции 10 мг/кг соед. № 1 или Т807 за 60 мин. до инъекции радиоактивного маркера. Замещение (n=1) проводили с помощью IV инъекции 1 мг/кг соед. № 1 или Т807 через 30 мин после инъекции радиоактивного маркера. Изображения μРЕТ сравнивали с исходным сканированием (n=1), полученным у не подвергнутой обработке крысы.Dynamic DRET scanning for 120 min with [ 18 F]Comp. No. 1 or [ 18 F]T807 was performed on a Focus 220 μΡΕΤ scanner (Concorde Microsystems, Knoxville, TN, USA) simultaneously on three female Wistar rats. Throughout the procedure, rats were kept under gas anesthesia (2.5% isoflurane in O 2 at a flow rate of 1 l/min). Scanned images were collected in list mode and the data collection was subjected to Fourier resampling at 24 time intervals (4x15 s, 4x60 s, 5x180 s, 8x300 s, 3x600 s). Data that were reconstructed by 3D reconstruction using maximum posterior probability (3D-MAP) were manually aligned with the rat brain 18 FFDG matrix in Paxinos coordinates using affine transformation to provide analysis of predefined volume regions of interest (VOI) (Casteels C et al., J. Nucl. Med. 2006, 47, 1858-1866). Whole brain time activity (TAC) curves were generated using VOI using PMOD software (v 3.2, PMOD Technologies, Zurich, Switzerland). The concentration of radioactivity in the brain was expressed as a standardized uptake value (SUV calculated as (radioactivity in Bq in brain/ml)/(total injected dose (Bq)/body weight in g)) as a function of time after marker injection. Scans were started immediately after IV injection of approximately 50 MBq of radioactive marker (n=3/marker). For pretreatment and substitution studies cold reference compound comp. No. 1 or T807 was dissolved in a mixture of 5% DMSO, 5% Tween 80 and 40% (2-hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin, filtered through a 0.22 μm membrane filter (Millex-GV, Millipore) before injection. Pre-treatment (n=1) was performed by subcutaneous (SC) injection of 10 mg/kg Comm. No. 1 or T807 in 60 min. before injection of a radioactive marker. Substitution (n=1) was performed using an IV injection of 1 mg/kg Comm. No. 1 or T807 30 minutes after the injection of the radioactive marker. The μRET images were compared with the original scan (n=1) obtained from an untreated rat.
Результаты 120 мин исходного исследования и исследования предварительной обработки и слежения за меткой [18F]соед. № 1 и сравнительного соединения [18F]T807 показаны на фиг. 9-11 (кривые время-активность, ТАС и %SUVмакс.). С помощью ТАС исходных сканирований [18F]соед. № 1 (фиг. 9) продемонстрировали высокое первоначальное поглощение головным мозгом с высокой интенсивностью величины SUV в головном мозге ~2,0 по сравнению с ~1,8 для [18F]T807 (фиг. 10). Поглощение костной тканью наблюдали в более поздние моменты времени для обоих соединений.Results of a 120 min baseline study and a pretreatment and tracking study of [ 18 F]comp. No. 1 and comparative compound [ 18 F]T807 are shown in FIG. 9-11 (curves time-activity, TAC and %SUV max .). Using the TAS of the original scans [ 18 F]Comp. No. 1 (FIG. 9) showed high initial brain uptake with a high intensity brain SUV value of ~2.0 compared to ~1.8 for [ 18 F]T807 (FIG. 10). Bone uptake was observed at later time points for both compounds.
[18F]соед. № 1 характеризовалось более высокой скоростью выведения (величина SUV 0,2 через 60 мин p.i.) по сравнению с [18F]T807 (величина SUV 0,4 через 60 мин p.i.), как показано на кривых %SUVмакс. (фиг. 11). Для [18F]соед. № 1 не наблюдали эффектов самопроизвольного блокирования или[ 18 F]comp. No. 1 had a higher clearance rate (0.2 SUV value at 60 min pi) compared to [ 18 F]T807 (0.4 SUV value at 60 min pi) as shown in the %SUV max curves. (Fig. 11). For [ 18 F]comp. No. 1 did not observe the effects of spontaneous blocking or
- 25 039208 самопроизвольного слежения за меткой, что отмечает отсутствие специфического связывания, не связанного с тау-белками, в головном мозге (фиг. 9). Регистрировали более низкое поглощение мозгом в ходе исходного сканирования [18F]T807 по сравнению с исследованием с предварительной обработкой, вероятно, вызванное насыщением метаболических ферментов и/или белков плазмы (фиг. 10). Сходный эффект наблюдали через 40 мин p.i. в исследовании слежения за меткой.- 25 039208 spontaneous tracking label, which indicates the absence of specific binding, not associated with tau proteins, in the brain (Fig. 9). Lower brain uptake was recorded during the initial [ 18 F]T807 scan compared to the pretreatment study, probably due to saturation of metabolic enzymes and/or plasma proteins (FIG. 10). A similar effect was observed after 40 min pi in the tag tracking study.
Исследования визуализации с помощью MicroPET макак-резус.Imaging studies using MicroPET in rhesus monkeys.
Динамическое сканирование μРЕТ с использованием [18F]соед. № 1 или [18F]T807 длительностью 120 мин проводили с помощью сканера μРЕТ Focus 220 у макака-резуса (6-летний самец Масаса mulatta, 7,6 кг), подвергнутого седативному воздействию кетамина (Ketalar®) и ксилазина (Rompun®) посредством внутримышечной (IM) инъекции. В ходе сканирования обезьяна несколько раз получала дополнительную дозу кетамина/ксилазина посредством IV инъекции. В ходе всего эксперимента отслеживали насыщенность крови О2, частоту дыхательных движений и частоту сердечных сокращений.Dynamic scanning μRET using [ 18 F]Comp. No. 1 or [ 18 F]T807 for 120 min was performed with a μPET Focus 220 scanner in a rhesus monkey (6-year-old male Macaca mulatta, 7.6 kg) sedated with ketamine (Ketalar®) and xylazine (Rompun®) via intramuscular (IM) injection. During the course of the scan, the monkey received an additional dose of ketamine/xylazine several times by IV injection. O 2 blood saturation, respiratory rate, and heart rate were monitored throughout the experiment.
Голову животного помещали по центру в поле обзора μРЕТ-скαнера. Изображения, получаемые с помощью сканирования, собирали в режиме списка и подвергали редискретизации Фурье в 24 временных интервалах (4x15 с, 4x60 с, 5x180 с, 8x300 с, 3x600 с). Данные реконструировали посредством итерационной 3D-реконструкции (3D-MAP) с применением максимальной апостериорной вероятности. ТАС для головного мозга в целом строили с использованием VOI с помощью программного обеспечения PMOD. Концентрация радиоактивных веществ в головном мозге выражена в виде SUV в зависимости от времени после инъекции маркера. Сканирования начинали немедленно после IV инъекции 185 МБк [18F]соед. № 1 или [18F]T807 в подкожную вену правой ноги. Для исследования с предварительной обработкой холодное эталонное соединение соед. № 1 растворяли в смеси 10% DMSO и 40% (2гидроксипропил)-бета-циклодекстрина, фильтровали через 0,22 мкм мембранный фильтр (Millex-GV, Millipore) перед инъекцией. Предварительную обработку (n=1) выполняли путем IV совместной инъекции 1 мг/кг холодного соед. № 1 и раствора радиоактивного маркера. Изображения μРЕТ сравнивали с исходным сканированием (n=1), полученным у не подвергнутой обработке обезьяны.The head of the animal was placed in the center in the field of view of the μPET scanner. Scanned images were collected in list mode and Fourier resampled at 24 time intervals (4x15 s, 4x60 s, 5x180 s, 8x300 s, 3x600 s). The data were reconstructed by iterative 3D reconstruction (3D-MAP) using the maximum posterior probability. TAS for the whole brain was built using VOI using the PMOD software. The concentration of radioactive substances in the brain is expressed as SUV depending on the time after the injection of the marker. Scans were started immediately after IV injection of 185 MBq [ 18 F]comp. No. 1 or [ 18 F]T807 into the saphenous vein of the right leg. For research with pre-treatment cold reference connection Comm. No. 1 was dissolved in a mixture of 10% DMSO and 40% (2hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin, filtered through a 0.22 μm membrane filter (Millex-GV, Millipore) before injection. Pre-treatment (n=1) was performed by IV co-injection of 1 mg/kg cold comp. No. 1 and a solution of a radioactive marker. The μRET images were compared with the original scan (n=1) obtained from an untreated monkey.
Результаты 120 мин исходного сканирования [18F]соед. № 1 и [18F]T807 показаны на фиг. 12-14 (ТАС и %SUVмакс.). С помощью ТАС исходного сканирования [18F]соед. № 1 в головном мозге продемонстрировали высокое первоначальное поглощение головным мозгом (величина SUV ~5,4 во всем мозге) с быстрым выведением (фиг. 12). С помощью ТАС исходного сканирования [18F]T807 в головном мозге продемонстрировали более медленное первоначальное поглощение головным мозгом (величина SUV ~1,3) и выведение (фиг. 13). Однородное распределение [18F]соед. № 1 регистрировали во всех наблюдаемых участках мозга без усиленного поглощения в мозолистом теле. ТАС на стороне черепа продемонстрировали отсутствие поглощения костной тканью свободного 18F-фторида, наблюдаемого через 120 мин после p.i. инъекции, поскольку сигнал SUV в зависимости от времени не повышался.Results of the 120 min initial scan of [ 18 F]comp. No. 1 and [ 18 F]T807 are shown in FIG. 12-14 (TAC and %SUV max .). With the help of the original TAC scan [ 18 F]comp. No. 1 in the brain showed high initial brain uptake (SUV value ~5.4 in whole brain) with fast clearance (FIG. 12). With the TAC baseline scan, [ 18 F]T807 in the brain showed slower initial brain uptake (SUV ~1.3) and clearance (FIG. 13). Homogeneous distribution of [ 18 F]Comp. No. 1 was recorded in all observed areas of the brain without increased uptake in the corpus callosum. TAS on the side of the skull showed no bone uptake of free 18 F-fluoride observed 120 min after pi injection, as the SUV signal did not increase with time.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17152062 | 2017-01-18 | ||
PCT/EP2017/067898 WO2018015307A1 (en) | 2016-07-18 | 2017-07-14 | Tau pet imaging ligands |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201990319A1 EA201990319A1 (en) | 2019-06-28 |
EA039208B1 true EA039208B1 (en) | 2021-12-17 |
Family
ID=57850950
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201990319A EA039208B1 (en) | 2017-01-18 | 2017-07-14 | Tau pet imaging ligands |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA039208B1 (en) |
-
2017
- 2017-07-14 EA EA201990319A patent/EA039208B1/en unknown
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
E. D. HOSTETLER, A. M. WALJI, Z. ZENG, P. MILLER, I. BENNACEF, C. SALINAS, B. CONNOLLY, L. GANTERT, H. HALEY, M. HOLAHAN, M. PURCE: "Preclinical Characterization of 18F-MK-6240, a Promising PET Tracer for In Vivo Quantification of Human Neurofibrillary Tangles", THE JOURNAL OF NUCLEAR MEDICINE, SOCIETY OF NUCLEAR MEDICINE, US, vol. 57, no. 10, 1 October 2016 (2016-10-01), US , pages 1599 - 1606, XP055374993, ISSN: 0161-5505, DOI: 10.2967/jnumed.115.171678 * |
KJELL NåGREN ; CHRISTER HALLDIN ; JUHA O. RINNE: "Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer’s disease", EUROPEAN JOURNAL OF NUCLEAR MEDICINE AND MOLECULAR IMAGING, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 37, no. 8, 22 December 2009 (2009-12-22), Berlin, DE , pages 1575 - 1593, XP019841927, ISSN: 1619-7089 * |
WILEY C A ET AL: "Carbon 11-labeled Pittsburgh compound B and carbon 11-labeled (R)-PK11195 positron emission tomographic imaging in Alzheimer disease", ARCHIVES OF NEUROLOGY, AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, CHICAGO, IL, US, vol. 66, no. 1, 1 January 2009 (2009-01-01), US , pages 60 - 67, XP002770459, ISSN: 0003-9942, DOI: 10.1001/archneurol.2008.511 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA201990319A1 (en) | 2019-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2014333996B2 (en) | Diazacarbazole derivatives as tau-pet-ligands | |
CN112533928A (en) | Novel compounds for use in diagnostics | |
EP3226915B1 (en) | Radiolabelled mglur2 pet ligands | |
WO2018024643A1 (en) | 9h-pyrrolo-dipyridine derivatives | |
EP3374358B1 (en) | Azetidine derivatives for tau imaging | |
JP6946412B2 (en) | Tau PET Imaging Ligand | |
EA039208B1 (en) | Tau pet imaging ligands | |
AU2017300585B2 (en) | Tau PET imaging ligands | |
AU2017216212B2 (en) | Tau PET imaging ligands | |
WO2024100218A1 (en) | Method of purifying a compound | |
WO2024163546A1 (en) | Novel compounds for tau imaging | |
NZ714831B2 (en) | Diazacarbazole derivatives as tau-pet-ligands |