EA038893B1 - Method for the determination of eukaryotic cell viability using the laser interference microscopy method - Google Patents
Method for the determination of eukaryotic cell viability using the laser interference microscopy method Download PDFInfo
- Publication number
- EA038893B1 EA038893B1 EA202000269A EA202000269A EA038893B1 EA 038893 B1 EA038893 B1 EA 038893B1 EA 202000269 A EA202000269 A EA 202000269A EA 202000269 A EA202000269 A EA 202000269A EA 038893 B1 EA038893 B1 EA 038893B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- cell
- optical thickness
- viability
- fluctuations
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
- G01N33/48735—Investigating suspensions of cells, e.g. measuring microbe concentration
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области клеточной биологии и цитологии, в частности касается оценки жизнеспособности клеток эукариот с помощью метода лазерной интерференционной микроскопии.The invention relates to the field of cell biology and cytology, in particular for assessing the viability of eukaryotic cells using the method of laser interference microscopy.
Жизнеспособность клетки - это физиологическое состояние, при котором в клетках происходят важные прижизненные процессы, обеспечивающие выполнение ими специфических функций и реализацию клеточного деления [Stoddart M.J. (ed.). Mammalian cell viability: methods and protocols // New York (NY): Humana Press. - 2011. - 240 p.].Cell viability is a physiological state in which important vital processes take place in cells that ensure the performance of specific functions and the implementation of cell division [Stoddart M.J. (ed.). Mammalian cell viability: methods and protocols // New York (NY): Humana Press. - 2011. - 240 p.].
В настоящее время известно множество методов регистрации жизнеспособности иммортализованных или выделенных из тканей клеток эукариот в условиях воздействия различных факторов, например условий культивирования и криоконсервации, при исследовании процессов апоптоза или клеточной смерти под действием цитотоксичных агентов и так далее. Большинство существующих методов определения клеточной жизнеспособности основаны на оценке морфологической целостности клеток, их пролиферативной или метаболической активности.Currently, there are many methods for registering the viability of immortalized or isolated from tissues of eukaryotic cells under the influence of various factors, for example, conditions of cultivation and cryopreservation, in the study of apoptosis or cell death under the influence of cytotoxic agents, and so on. Most of the existing methods for determining cell viability are based on assessing the morphological integrity of cells, their proliferative or metabolic activity.
Оценка жизнеспособности возможна при использовании следующих методов детекции и визуализации клеток: светлопольная микроскопия [Strober W. Trypan blue exclusion test of cell viability // Current protocols In immunology. - 2015. - Vol. 111. - №. 1. - P. A3.B.1-A3.B.3], флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия [Atale N., Gupta S., Yadav U. C.S., Rani V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques // Journal of microscopy. - 2014. - Vol. 255. №. 1. - P. 7-19; Clemons P.A., Tolliday N.J., Wagner B.K. Cell-based assays for high-throughput screening // Humana Press. - 2014. - 218 p.; Johnson S., Nguyen V., Coder D. Assessment of cell viability // Current protocols in cytometry. - 2013. - Vol. 64. - №. 1. - P. 9.2.1-9.2.26], a также спектрофотометрия [Riss Т. L., Moravec R.A., Niles A.L., Duellman S., Benink H.A., Worzella T.J., Minor L. Cell viability assays // Assay Guidance Manual [Internet]: Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 2016; Van Meerloo J., Kaspers G.J.L., Cloos J. Cell sensitivity assays: the MTT assay // Cancer cell culture. 2011. - P. 237-245].Viability assessment is possible using the following methods of cell detection and visualization: bright-field microscopy [Strober W. Trypan blue exclusion test of cell viability // Current protocols In immunology. - 2015. - Vol. 111. - No. 1. - P. A3.B.1-A3.B.3], fluorescence microscopy and flow cytometry [Atale N., Gupta S., Yadav UCS, Rani V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques // Journal of microscopy. - 2014. - Vol. 255. no. 1. - P. 7-19; Clemons P.A., Tolliday N.J., Wagner B.K. Cell-based assays for high-throughput screening // Humana Press. - 2014 .-- 218 p.; Johnson S., Nguyen V., Coder D. Assessment of cell viability // Current protocols in cytometry. - 2013. - Vol. 64. - No. 1. - P. 9.2.1-9.2.26], as well as spectrophotometry [Riss T. L., Moravec RA, Niles AL, Duellman S., Benink HA, Worzella TJ, Minor L. Cell viability assays // Assay Guidance Manual [Internet]: Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 2016; Van Meerloo J., Kaspers G. J. L., Cloos J. Cell sensitivity assays: the MTT assay // Cancer cell culture. 2011. - P. 237-245].
На сегодняшний день эталонным способом оценки жизнеспособности клеток является спектрофотометрический (колориметрический) метод, направленный на изучение пролиферативной или метаболической активности клеток с использованием тетразолиевых красителей (например, 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид). Следует отметить, что окрашивание тетразолиевыми красителями осуществляется в течение продолжительного времени (более 3 ч), а также зависит от условий проведения эксперимента, которые могут влиять на метаболическую активность клеток. В свою очередь, процесс окрашивания при определении жизнеспособности клеток методами светлопольной микроскопии (например, трипановый синий), флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии (пропидий йодид, 7-аминоактиномицин D, этидиум бромид, 4'-6-диамидино-2-фенил-индол и другие) занимает от 2 до 30 мин. Однако при этом регистрируется морфологическая целостность клеток, что не всегда отражает истинный показатель жизнеспособности; а в ряде случаев при увеличении продолжительности инкубации с красителем (например, трипановым синим) возможна неспецифическая окраска живых клеток [Прилепский А.Ю., Дроздов А.С., Богатырев В.А., Староверов С.А. Методы работы с клеточными культурами и определение токсичности наноматериалов // СПб: Университет ИТМО. - 2019. - 43 с]. Кроме того, при окрашивании клеточных компонентов различными красителями могут происходить необратимые изменения структур клеток, которые негативно воздействуют на их жизнеспособность [Ihmels H., Otto D. Intercalation of organic dye molecules into double-stranded DNA-general principles and recent developments // Supermolecular dye chemistry. - 2005. - P. 161-204].To date, the standard method for assessing cell viability is the spectrophotometric (colorimetric) method aimed at studying the proliferative or metabolic activity of cells using tetrazolium dyes (for example, 3- (4,5-dimethylthiazol2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide ). It should be noted that staining with tetrazolium dyes is carried out for a long time (more than 3 hours), and also depends on the conditions of the experiment, which can affect the metabolic activity of cells. In turn, the staining process in determining cell viability using bright field microscopy (for example, trypan blue), fluorescence microscopy and flow cytofluorimetry (propidium iodide, 7-aminoactinomycin D, ethidium bromide, 4'-6-diamidino-2-phenyl-indole and others) takes 2 to 30 minutes. However, in this case, the morphological integrity of the cells is recorded, which does not always reflect the true indicator of viability; and in some cases, with an increase in the duration of incubation with a dye (for example, trypan blue), non-specific staining of living cells is possible [Prilepsky A.Yu., Drozdov A.S., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A. Methods for working with cell cultures and determining the toxicity of nanomaterials // St. Petersburg: ITMO University. - 2019. - 43 s]. In addition, when staining cellular components with various dyes, irreversible changes in cell structures can occur, which negatively affect their viability [Ihmels H., Otto D. Intercalation of organic dye molecules into double-stranded DNA-general principles and recent developments // Supermolecular dye chemistry. - 2005. - P. 161-204].
Таким образом, существенным недостатком перечисленных методов является инвазивность, которая оказывает негативное влияние на жизнеспособность объекта исследования.Thus, a significant drawback of the listed methods is invasiveness, which has a negative impact on the viability of the research object.
Существует потребность в разработке неинвазивных методов оценки жизнеспособности клеток в режиме реального времени, которые позволяют, минуя этапы трудоемкой и длительной пробоподготовки, исключить возникновение артефактов (например, неспецифическое окрашивание препарата), и, как следствие, избежать или уменьшить погрешности измерений в процессе анализа клеточной жизнеспособности.There is a need to develop non-invasive methods for assessing cell viability in real time, which allow, bypassing the stages of laborious and time-consuming sample preparation, to exclude the occurrence of artifacts (for example, nonspecific staining of the drug), and, as a consequence, to avoid or reduce measurement errors during the analysis of cell viability. ...
Неинвазивный метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) позволяет получить изображение клетки со сверхвысоким пространственным разрешением и провести детальный анализ оптических свойств объекта. ЛИМ является уникальным физическим методом исследования динамики и морфологии клеточных структур нативных неокрашенных биологических препаратов в режиме реального времени и позволяет получить достоверные данные о жизнеспособности клеток, исключив процедуру окрашивания. Среди перспективных технологий ЛИМ выделяют неинвазивные методы исследования морфологии и динамики клеток [Игнатьев, П.С. Лазерная интерференционная микроскопия морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени: дис. канд. физ.-мат. наук: 01.04.21 / Игнатьев Павел Сергеевич - Москва, - 2011. - 158 с.], такие как когерентная фазовая микроскопия [Tychinskii V.P. Coherentphase microscopy of intracellular processes // Physics-Uspekhi. - 2001. - Vol. 44. - №. 6. - P. 617-629], динамическая фазовая микроскопия [Tychinskii V.P. Dynamic phase microscopy: is a 'dialogue' with the cell possible? // Physics-Uspekhi. - 2007. - Vol. 50. - №. 5. - P. 513-528], оптическая когерентная томография [Vishnyakov G.N., Levin G.G., Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference microsThe non-invasive method of laser interference microscopy (LIM) allows one to obtain an image of a cell with an ultra-high spatial resolution and to carry out a detailed analysis of the optical properties of an object. LIM is a unique physical method for studying the dynamics and morphology of cell structures of native unstained biological preparations in real time and allows obtaining reliable data on cell viability, eliminating the staining procedure. Among the promising LIM technologies, non-invasive methods for studying the morphology and dynamics of cells are distinguished [Ignatiev, PS. Laser interference microscopy of morphology and dynamics of biological objects in real time: dis. Cand. phys.-mat. Sciences: 01.04.21 / Ignatiev Pavel Sergeevich - Moscow, - 2011. - 158 p.], such as coherent phase microscopy [Tychinskii V.P. Coherentphase microscopy of intracellular processes // Physics-Uspekhi. - 2001. - Vol. 44. - No. 6. - P. 617-629], dynamic phase microscopy [Tychinskii V.P. Dynamic phase microscopy: is a 'dialogue' with the cell possible? // Physics-Uspekhi. - 2007. - Vol. 50. - No. 5. - P. 513-528], optical coherence tomography [Vishnyakov G.N., Levin G.G., Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference micros
- 1 038893 copy of living cells // Microscopy and Analysis. - 2004. - P. 15-18] и модуляционная интерференционная лазерная микроскопия [Andreev V.A., Indukaev K.V. The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy // Journal of Russian Laser Research. - 2003. - Vol. 24. - №. 3. - P. 220-236; Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Осипов П.А., Сергеев И.К. Лазерная интерференционная микроскопия для нанобиотехнологий // Медицинская техника. -2013. - Т. 1. - С. 27-30].- 1 038893 copy of living cells // Microscopy and Analysis. - 2004. - P. 15-18] and modulation interference laser microscopy [Andreev V.A., Indukaev K.V. The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy // Journal of Russian Laser Research. - 2003. - Vol. 24. - No. 3. - P. 220-236; Ignatiev P.S., Indukaev K.V., Osipov P.A., Sergeev I.K. Laser interference microscopy for nanobiotechnology // Medical technology. -2013. - T. 1. - S. 27-30].
В настоящее время метод ЛИМ получил распространение в исследованиях, направленных на изучение морфофункциональных и динамических состояний биологических объектов, таких как клетки крови эритроциты [Majeed H., Sridharan S., Mir M., Ma L., Min E., Jung W., Popescu G. Quantitative phase imaging for medical diagnosis // Journal of biophotonics. - 2017. - Vol. 10. - №. 2. - P. 177-205; Popescu G., Ikeda Т., Best C., Badizadegan K., Dasari R.R., Feld M.S. Erythrocyte structure and dynamics quantified by Hilbert phase microscopy // Journal of biomedical optics. 2005. - Vol. 10. - №. 6. - doi:10.1117/1.2149847; Popescu G., Ikeda Т., Goda K., Best-Popescu C.A., Laposata M., Manley S., Feld M.S. Optical measurement of cell membrane tension // Physical review letters. - 2006. - Vol. 97. - №. 21: 218101; Popescu G., Park Y., Dasari R.R., Badizadegan K., Feld M.S. Coherence properties of red blood cell membrane motions // Physical Review E. - 2007. Vol. - 76. - №. 3: 031902], культуры нейронов [Wang R., Wang Z., Leigh J., Sobh N., Millet L., Gillette M.U., Popescu G. One-dimensional deterministic transport in neurons measured by dispersion-relation phase spectroscopy // Journal of Physics: Condensed Matter. - 2011. - Vol. 23. - №. 37. - P. 1-9; Wang Z., Millet L., Mir M., Ding H., Unarunotai S., Rogers J., Popescu G. Spatial light interference microscopy (SLIM) // Optics express. 2011. - Vol. 19. - №. 2. - P. 1016-1026], клеточные линии эпителиального происхождения [Lue N., Choi W., Popescu G., Ikeda Т., Dasari R.R., Badizadegan K., Feld M.S. Quantitative phase imaging of live cells using fast Fourier phase microscopy // Applied Optics. - 2007. - Vol. 46. - №. - 10. -P. 1836-1842; Nikitiuk A.S., Voronina A.O., Beloglazova Y.A., Ozernykh O.S., Grishko V.V., Naimark O.B. Study of cancer and normal cells dynamics based on laser interference microscopy // AIP Conference Proceedings: AIP Publishing LLC. - 2020. - Vol. 2216. - №. 1: 060005; Popescu G., Park Y., Lue N., Best-Popescu C., Deflores L., Dasari R.R., Badizadegan K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics // American Journal of Physiology-Cell Physiology. - 2008. Vol. 295. - №. 2. - P. 538-544], изолированные митохондрии [Tychinsky V., Kretushev A., Vyshenskaja T. Mitochondria optical parameters are dependent on their energy state:an ewelectrooptical effect? // European Biophysics Journal. - 2004. - Vol. 33. - №. 8. - P. 700-705] и хлоропласты [Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Vyshenskaya T.V., Tikhonov A.N. A dynamic phase microscopic study of optical characteristics of individual chloroplasts // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. - 2004. - Vol. 1665. -№. 1-2. - P. 57-64]. Недавно предложен метод, позволяющий на основании данных о динамических характеристиках опухолевых и нормальных клеток человека дифференцировать патологически измененные клетки с помощью метода ЛИМ без добавления специфических красителей [Nebogatikov V., Nikitiuk A., Konysheva A., Ignatyev P., Grishko V., Naimark О. Study of morphological changes in breast cancer cells MCF-7 under the action of pro-apoptotic agents with laser modulation interference microscope MIM-340 // AIP Conference Proceedings: AIP Publishing LLC. - 2017. - Vol. 1882. - №. 1: 020053; Nikitiuk A.S., Voronina A.O., Beloglazova Y.A., Ozernykh O.S., Grishko V.V., Naimark O.B. Study of cancer and normal cells dynamics based on laser interference microscopy // AIP Conference Proceedings: AIP Publishing LLC. - 2020. - Vol. 2216. - №. 1: 060005].Currently, the LIM method has become widespread in studies aimed at studying the morphofunctional and dynamic states of biological objects, such as red blood cells [Majeed H., Sridharan S., Mir M., Ma L., Min E., Jung W., Popescu G. Quantitative phase imaging for medical diagnosis // Journal of biophotonics. - 2017. - Vol. 10. - No. 2. - P. 177-205; Popescu G., Ikeda T., Best C., Badizadegan K., Dasari R.R., Feld M.S. Erythrocyte structure and dynamics quantified by Hilbert phase microscopy // Journal of biomedical optics. 2005. - Vol. 10. - No. 6. - doi: 10.1117 / 1.2149847; Popescu G., Ikeda T., Goda K., Best-Popescu C.A., Laposata M., Manley S., Feld M.S. Optical measurement of cell membrane tension // Physical review letters. - 2006. - Vol. 97. - No. 21: 218101; Popescu G., Park Y., Dasari R.R., Badizadegan K., Feld M.S. Coherence properties of red blood cell membrane motions // Physical Review E. - 2007. Vol. - 76. - No. 3: 031902], neuronal culture [Wang R., Wang Z., Leigh J., Sobh N., Millet L., Gillette MU, Popescu G. One-dimensional deterministic transport in neurons measured by dispersion-relation phase spectroscopy // Journal of Physics: Condensed Matter. - 2011. - Vol. 23. - No. 37. - P. 1-9; Wang Z., Millet L., Mir M., Ding H., Unarunotai S., Rogers J., Popescu G. Spatial light interference microscopy (SLIM) // Optics express. 2011. - Vol. 19. - No. 2. - P. 1016-1026], cell lines of epithelial origin [Lue N., Choi W., Popescu G., Ikeda T., Dasari R.R., Badizadegan K., Feld M.S. Quantitative phase imaging of live cells using fast Fourier phase microscopy // Applied Optics. - 2007. - Vol. 46. - No. - 10. -P. 1836-1842; Nikitiuk A.S., Voronina A.O., Beloglazova Y.A., Ozernykh O.S., Grishko V.V., Naimark O.B. Study of cancer and normal cells dynamics based on laser interference microscopy // AIP Conference Proceedings: AIP Publishing LLC. - 2020. - Vol. 2216. - No. 1: 060005; Popescu G., Park Y., Lue N., Best-Popescu C., Deflores L., Dasari R.R., Badizadegan K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics // American Journal of Physiology-Cell Physiology. - 2008. Vol. 295. - No. 2. - P. 538-544], isolated mitochondria [Tychinsky V., Kretushev A., Vyshenskaja T. Mitochondria optical parameters are dependent on their energy state: an ewelectrooptical effect? // European Biophysics Journal. - 2004. - Vol. 33. - No. 8. - P. 700-705] and chloroplasts [Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Vyshenskaya T.V., Tikhonov A.N. A dynamic phase microscopic study of optical characteristics of individual chloroplasts // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Biomembranes. - 2004. - Vol. 1665. -No. 1-2. - P. 57-64]. Recently, a method has been proposed that allows, based on data on the dynamic characteristics of tumor and normal human cells, to differentiate pathologically altered cells using the LIM method without adding specific dyes [Nebogatikov V., Nikitiuk A., Konysheva A., Ignatyev P., Grishko V., Naimark O. Study of morphological changes in breast cancer cells MCF-7 under the action of pro-apoptotic agents with laser modulation interference microscope MIM-340 // AIP Conference Proceedings: AIP Publishing LLC. - 2017. - Vol. 1882. - No. 1: 020053; Nikitiuk A.S., Voronina A.O., Beloglazova Y.A., Ozernykh O.S., Grishko V.V., Naimark O.B. Study of cancer and normal cells dynamics based on laser interference microscopy // AIP Conference Proceedings: AIP Publishing LLC. - 2020. - Vol. 2216. - No. 1: 060005].
Данные о возможности исследования жизнеспособности клеток с использованием метода ЛИМ в источниках информации не обнаружены.Data on the possibility of studying cell viability using the LIM method were not found in the information sources.
Задача настоящего изобретения - разработка неинвазивного способа оценки жизнеспособности эукариотических клеток, исключающего этап длительной пробоподготовки, в том числе обработку клеток красителем.The objective of the present invention is the development of a non-invasive method for assessing the viability of eukaryotic cells, excluding the stage of long sample preparation, including the treatment of cells with a dye.
Технический результат - сокращение продолжительности процесса оценки жизнеспособности и повышение уровня достоверности результатов в условиях режима реального времени.The technical result is a reduction in the duration of the viability assessment process and an increase in the level of reliability of the results in real-time conditions.
Для решения поставленной задачи разработан способ определения жизнеспособности клеток эукариот методом лазерной интерференционной микроскопии, когда жизнеспособность исследуемых клеток определяют неинвазивным методом в режиме реального времени, исключая этап окрашивания специфическими красителями, с последующей оценкой наклона спектра мощности Фурье флуктуаций оптической толщины клеток и сопоставлением с обоснованными критериями.To solve this problem, a method has been developed for determining the viability of eukaryotic cells by the method of laser interference microscopy, when the viability of the studied cells is determined by a non-invasive method in real time, excluding the stage of staining with specific dyes, with subsequent assessment of the slope of the Fourier power spectrum of fluctuations in the optical thickness of cells and comparison with justified criteria.
На фиг. 1-16 представлены типовые результаты измерений флуктуаций оптической толщины клеток MCF-7. На фиг. 17-18 представлено сравнение наклона спектра мощности Фурье флуктуаций оптической толщины живых и мертвых раковых клеток MCF-7.FIG. 1-16 show typical results of measurements of fluctuations in the optical thickness of MCF-7 cells. FIG. 17-18 show a comparison of the slope of the Fourier power spectrum of fluctuations in the optical thickness of living and dead MCF-7 cancer cells.
Методика исследования жизнеспособности клеток по предлагаемому способуThe technique for studying the viability of cells according to the proposed method
Для осуществления способа используют эукариотические клетки, полученные из различных органов или тканей, например клетки линии MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) или другие клетки. Клетки MCF-7 культивируют в питательной среде DMEM с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и смеси 1% пенициллина/стрептомицина (1000 ЕД/мл; 10 мг/мл) (ПанЭко, Россия) в СО2-инкубаторе (Thermo Fisher Scientific, США) во влажной атмосфере 5,0±0,5% CO2 при +37,0±1,0°C. Исследование других клеток осуществляют в соответствии с условиями их культивироTo implement the method, eukaryotic cells obtained from various organs or tissues are used, for example, MCF-7 cells (breast adenocarcinoma) or other cells. MCF-7 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum and a mixture of 1% penicillin / streptomycin (1000 U / ml, 10 mg / ml) (PanEco, Russia) in a CO 2 incubator (Thermo Fisher Scientific, USA) in a humid atmosphere of 5.0 ± 0.5% CO2 at + 37.0 ± 1.0 ° C. The study of other cells is carried out in accordance with the conditions of their cultivation.
- 2 038893 вания. Работы с клетками проводят в асептических условиях с использованием стерильных реактивов и расходных материалов.- 2 038893. Cells are handled under aseptic conditions using sterile reagents and consumables.
Непосредственно перед определением жизнеспособности клеток с помощью метода ЛИМ готовят препараты клеток для микроскопии несколькими способами: путем нанесения суспензии (свободных) клеток на диэлектрическое предметное стекло с зеркальным напылением в область, ограниченную тонким слоем густой силиконовой смазки (спейсер), или при перемещении на предметное стекло с зеркальным напылением носителя (подложки) с закрепленными (иммобилизованными) клетками. При этом исследуемые клетки должны находиться в буферной зоне (полная питательная среда, фосфатно-солевой буфер или другое) и сохранять свою жизнеспособность.Immediately before the determination of cell viability using the LIM method, cell preparations for microscopy are prepared in several ways: by applying a suspension of (free) cells on a dielectric glass slide with mirror sputtering in the area bounded by a thin layer of thick silicone grease (spacer), or by transferring onto a glass slide Mirror-coated carrier (substrate) with fixed (immobilized) cells. In this case, the cells under study must be in the buffer zone (complete nutrient medium, phosphate-buffered saline, or other) and maintain their viability.
Жизнеспособность исследуемой клетки определяется по результатам анализа флуктуаций ее оптической толщины. Флуктуации оптической толщины клетки регистрируются при помощи лазерного интерференционного микроскопа МИМ-340 (Швабе, Россия). Допустимо использование других приборов, реализующих основные принципы метода ЛИМ. При этом аналогичный прибор должен иметь возможность проводить измерение оптической толщины клетки и получать фазовое изображение клетки, а также регистрировать флуктуации оптической толщины клетки в виде трек-диаграммы.The viability of the cell under study is determined by the results of the analysis of fluctuations in its optical thickness. Fluctuations in the optical thickness of a cell are recorded using a laser interference microscope MIM-340 (Shvabe, Russia). It is permissible to use other devices that implement the basic principles of the LIM method. In this case, a similar device should be able to measure the optical thickness of the cell and obtain a phase image of the cell, as well as register fluctuations in the optical thickness of the cell in the form of a track diagram.
Измерения флуктуаций оптической толщины клеток выполняют с помощью ЛИМ согласно следующему алгоритму:Measurements of fluctuations in the optical thickness of cells are performed using LIM according to the following algorithm:
1) съемка фазового изображения исследуемой клетки (кадр № 1);1) shooting a phase image of the investigated cell (frame No. 1);
2) повторная съемка фазового изображения клетки (кадр № 2) через 60 с;2) repeated shooting of the phase image of the cell (frame No. 2) after 60 s;
3) получение разностного кадра путем вычитания кадра № 1 из кадра №2;3) obtaining a difference frame by subtracting frame # 1 from frame # 2;
4) определение положения скан-линии, вдоль которой в дальнейшем осуществляется регистрация флуктуаций оптической толщины клетки;4) determination of the position of the scan line, along which further registration of fluctuations of the optical thickness of the cell is carried out;
5) измерение флуктуаций оптической толщины клетки вдоль установленной скан-линии в течение 247 с (8192 скан-линии), которые сохраняются в виде трек-диаграммы.5) measurement of fluctuations of the optical thickness of the cell along the set scan line for 247 s (8192 scan lines), which are stored in the form of a track diagram.
Принцип определения жизнеспособности клетки по результатам измерений флуктуаций оптической толщины заключается в следующем. По разностному кадру, полученному на основе фазовых изображений клетки, измеренных с 60-секундной задержкой, определяется профиль клетки, в котором произошли наиболее сильные изменения оптической толщины клетки. Далее в виде трек-диаграммы фиксируются изменения данного профиля во времени с частотой записи не менее 33 Гц и временем записи не менее 247 с. Для каждого временного сигнала выполняется низкочастотная фильтрация с помощью одномерного непрерывного вейвлет-преобразования. Из отфильтрованной трек-диаграммы выделяется одномерный сигнал, имеющий максимальное значение дисперсии. Выполняется оценка наклона спектра мощности данного сигнала, рассчитанного на основе одномерного Фурье-преобразования, согласно следующим соотношениям:The principle of determining cell viability from the results of measurements of fluctuations in optical thickness is as follows. The difference frame, obtained on the basis of phase images of the cell, measured with a 60-second delay, is used to determine the cell profile in which the strongest changes in the optical thickness of the cell have occurred. Further, in the form of a track diagram, the changes of this profile in time are recorded with a recording frequency of at least 33 Hz and a recording time of at least 247 s. For each time signal, low-pass filtering is performed using a one-dimensional continuous wavelet transform. A one-dimensional signal with the maximum variance value is extracted from the filtered track diagram. The slope of the power spectrum of this signal is estimated, calculated on the basis of a one-dimensional Fourier transform, according to the following relations:
S(k) = \f^, где Δφ(t) - флуктуации оптической толщины клетки, f(k) - образ Фурье функции Δφ(ί), k - частота, S(k) - спектр мощности, β - наклон спектра мощности.S (k) = \ f ^, where Δφ (t) is the fluctuations of the optical thickness of the cell, f (k) is the Fourier image of the function Δφ (ί), k is the frequency, S (k) is the power spectrum, β is the slope of the power spectrum ...
Наклоны спектров мощности Фурье флуктуаций оптической толщины, соответствующие живым или мертвым клеткам, определяют для представительных выборок клеток методами статистической обработки данных измерений.The slopes of the Fourier power spectra of optical thickness fluctuations corresponding to living or dead cells are determined for representative samples of cells by methods of statistical processing of measurement data.
Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами 1-5.The essence of the proposed solution and the possibility of its implementation is confirmed by examples 1-5.
Пример 1. Получение и исследование суспензии свободных жизнеспособных клеток.Example 1. Obtaining and study of a suspension of free viable cells.
Клетки MCF-7 выращивали в течение 48 ч в соответствии с условиями культивирования по вышеописанной методике и получали клеточную суспензию жизнеспособных клеток. Клетки открепляли с поверхности культурального флакона при помощи смеси растворов (1:4) 0,25% Трипсина (МР Biomedicals, США)/Версена (0,2% ЭДТА в фосфатном буфере; ПанЭко, Россия). Полученную суспензию жизнеспособных клеток (концентрация 5x104 клеток/мл) осаждали путем центрифугирования на микроцентрифуге Z 216 MK (Hermle, Германия) при следующих условиях: 150 g, 5 мин, +37,0±1,0°C. Из полученной суспензии клеток удалили супернатант и осадок ресуспендировали в 300 мкл 0,01 М фосфатносолевого буфера (PBS, ПанЭко, Россия).MCF-7 cells were grown for 48 hours in accordance with the culture conditions as described above, and a cell suspension of viable cells was obtained. The cells were detached from the surface of the culture flask using a mixture of solutions (1: 4) 0.25% Trypsin (MP Biomedicals, USA) / Versene (0.2% EDTA in phosphate buffer; PanEko, Russia). The resulting suspension of viable cells (concentration 5x104 cells / ml) was precipitated by centrifugation in a Z 216 MK microcentrifuge (Hermle, Germany) under the following conditions: 150 g, 5 min, + 37.0 ± 1.0 ° C. The supernatant was removed from the resulting cell suspension and the pellet was resuspended in 300 μl of 0.01 M phosphate-buffered saline (PBS, PanEko, Russia).
Препараты свободных жизнеспособных клеток, полученных в виде клеточных суспензий, подготавливали непосредственно перед исследованием с помощью метода ЛИМ следующим образом. По периметру диэлектрического предметного стекла с зеркальным напылением наносили тонкий слой силикоPreparations of free viable cells obtained in the form of cell suspensions were prepared immediately before the study using the LIM method as follows. A thin layer of silica was applied along the perimeter of a dielectric glass slide with mirror sputtering.
- 3 038893 новой смазки (спейсер). На ограниченную спейсером поверхность наносили 30 мкл исследуемой клеточной суспензии и накрывали стерильным покровным стеклом размером 24x50 мм, плотно прижимая к предметному стеклу таким образом, чтобы клетки находились между предметным и покровным стеклом и при этом не подвергались механическому воздействию, оставаясь жизнеспособными.- 3 038893 new grease (spacer). On a surface limited by a spacer, 30 μL of the test cell suspension was applied and covered with a sterile 24x50 mm cover slip, pressing tightly against the slide so that the cells were between the slide and the cover slip and were not subjected to mechanical stress, while remaining viable.
Для оценки жизнеспособности клеток MCF-7 проводили измерения флуктуаций оптической толщины клеток с помощью лазерного интерференционного микроскопа МИМ-340 (Швабе, Россия) по вышеописанной методике. В работе использовали полупроводниковый лазер с длиной волны 655 нм в качестве источника когерентного излучения и объектив с увеличением x10.To assess the viability of MCF-7 cells, fluctuations in the optical thickness of cells were measured using a laser interference microscope MIM-340 (Shvabe, Russia) according to the above method. We used a semiconductor laser with a wavelength of 655 nm as a source of coherent radiation and a lens with a magnification of x10.
Типовые результаты исследования жизнеспособных свободных клеток представлены на фиг. 1-4.Typical results from a viable free cell assay are shown in FIG. 1-4.
Пример 2. Получение и исследование суспензии свободных нежизнеспособных клеток.Example 2. Obtaining and study of a suspension of free non-viable cells.
Суспензию клеток готовили как в примере 1. Для получения нежизнеспособных клеток полученную суспензию подвергали ультразвуковому воздействию (частота 37 кГц) при +45,0±1,0°C в течение 60 мин на Elmasonic S13OH (Elma, Германия).The cell suspension was prepared as in example 1. To obtain non-viable cells, the resulting suspension was subjected to ultrasound (frequency 37 kHz) at + 45.0 ± 1.0 ° C for 60 min on an Elmasonic S13OH (Elma, Germany).
Препараты нежизнеспособных клеток, полученных в виде клеточных суспензий, подготавливали как в примере 1.Preparations of non-viable cells obtained in the form of cell suspensions were prepared as in example 1.
Измерения флуктуаций оптической толщины клеток MCF-7 проводили аналогично примеру 1.Measurements of fluctuations in the optical thickness of MCF-7 cells were carried out analogously to example 1.
Типовые результаты исследования суспензий нежизнеспособных клеток представлены на фиг. 5-8.Typical test results for suspensions of non-viable cells are shown in FIG. 5-8.
Пример 3. Получение и исследование жизнеспособных клеток, закрепленных на носителе.Example 3. Obtaining and research of viable cells attached to a carrier.
Клеточную культуру MCF-7 концентрацией 2x104 клеток/мл рассевали в чашки Петри диаметром 60 мм (Ningbo Greetmed Medical Instruments, Китай), на дно которых в качестве носителя помещали покровное стекло размером 24x50 мм2. Клетки выращивали в соответствии с условиями культивирования исследуемой клеточной линии в течение 48 ч для получения жизнеспособных клеток, закрепленных на носителе.The MCF-7 cell culture at a concentration of 2x104 cells / ml was plated into 60 mm Petri dishes (Ningbo Greetmed Medical Instruments, China), on the bottom of which a 24x50 mm 2 cover slip was placed as a carrier. The cells were grown in accordance with the culture conditions of the studied cell line for 48 h to obtain viable cells attached to the carrier.
Препараты жизнеспособных закрепленных на носителе клеток подготавливали непосредственно перед исследованием методом ЛИМ следующим образом. По периметру предметного стекла наносили тонкий слой силиконовой смазки, выступающей в качестве спейсера. Далее из чашки Петри пинцетом извлекали покровное стекло, удерживая его за самый край, и помещали на спейсер таким образом, чтобы клетки располагались между покровным и предметным стеклом в буферной зоне. Избыточное количество среды смывали с поверхности плотно прижатого покровного стекла смоченной в воде марлей с последующим удалением излишка воды сухой марлей.Viable cell preparations were prepared immediately prior to LIM studies as follows. A thin layer of silicone grease was applied around the perimeter of the slide to act as a spacer. Then, the cover glass was removed from the Petri dish with tweezers, holding it by the very edge, and placed on the spacer so that the cells were located between the cover glass and the slide in the buffer zone. The excess amount of the medium was washed off from the surface of the tightly pressed cover glass with gauze soaked in water, followed by the removal of excess water with dry gauze.
Измерения флуктуаций оптической толщины клеток MCF-7 проводили аналогично примеру 1.Measurements of fluctuations in the optical thickness of MCF-7 cells were carried out analogously to example 1.
Типовые результаты исследования жизнеспособных клеток, закрепленных на носителе, представлены на фиг. 9-12.Typical results from a study of viable cells attached to a support are shown in FIG. 9-12.
Пример 4. Получение и исследование нежизнеспособных клеток, закрепленных на носителе.Example 4. Obtaining and research of non-viable cells attached to the carrier.
Клетки выращивали и затем подготавливали препараты закрепленных на носителе клеток как в примере 3. Для получения закрепленных на носителе нежизнеспособных клеток дополнительно проводили этап фиксации, погружая носитель с закрепленными клетками в фиксирующий 4% раствор параформальдегида в течение 20 мин при +4°C и затем трижды отмывая препарат 0,01 М раствором PBS (ПанЭко, Россия).The cells were grown and then preparations of cells fixed on the carrier were prepared as in example 3. To obtain non-viable cells fixed on the carrier, an additional fixation step was performed by immersing the carrier with fixed cells in a fixing 4% paraformaldehyde solution for 20 min at + 4 ° C and then three times washing the preparation with 0.01 M PBS solution (PanEko, Russia).
Измерения флуктуаций оптической толщины клеток MCF-7 проводили аналогично примеру 1.Measurements of fluctuations in the optical thickness of MCF-7 cells were carried out analogously to example 1.
Типовые результаты исследования нежизнеспособных клеток, закрепленных на носителе, представлены на фиг. 13-16.Typical results from a study of non-viable cells attached to a support are shown in FIG. 13-16.
Пример 5. Сравнительный анализ данных измерения флуктуаций оптической толщины клеток и расчет порогового значения, определяющего жизнеспособность исследуемых клеток.Example 5. Comparative analysis of the measurement data of fluctuations in the optical thickness of cells and the calculation of the threshold value that determines the viability of the cells under study.
В результате статистической обработки данных, полученных в соответствии с примерами 1-4 для 162 жизнеспособных клеток MCF-7 (86 закрепленных на носителе клеток и 76 свободных клеток) и 147 нежизнеспособных клеток MCF-7 (86 закрепленных на носителе клеток и 61 свободных клеток), устанавливали пороговое значение, определяющее жизнеспособность клеток линии MCF-7.As a result of statistical processing of the data obtained in accordance with examples 1-4 for 162 viable MCF-7 cells (86 cells fixed to the carrier and 76 free cells) and 147 non-viable MCF-7 cells (86 cells fixed to the carrier and 61 free cells) , set a threshold value that determines the viability of MCF-7 cells.
Для этого на первом этапе проводили сравнительный анализ 4 выборок наклона спектра мощности Фурье отфильтрованного сигнала, имеющего наибольшую дисперсию флуктуаций оптической толщины, жизнеспособных и нежизнеспособных клеток, закрепленных на носителе или полученных в виде суспензии. Согласно критерию Уилкоксона-Манна-Уитни определяли, что зона пересекающихся значений между этими образцами достаточно мала и соответствовала значению параметра р, равному 0,0002 (р<0,001) или 2,5726x10’29 (р<0,001) для свободных или закрепленных клеток, соответственно. Чтобы определить критическое значение наклона спектра мощности вс флуктуаций оптической толщины, относительно которых можно судить о жизнеспособности клетки по данным ЛИМ, оценивали значения выборок, соответствующие 25-й и 75-й квантили. На основании данных оценок сделан вывод о том, что для закрепленных на носителе клеток MCF-7 значение вс соответствовало ® 1, для свободных клеток данное значение составило 0,75.For this, at the first stage, a comparative analysis of 4 samples of the Fourier power spectrum slope of the filtered signal with the greatest variance of optical thickness fluctuations, viable and non-viable cells, fixed on a carrier or obtained in the form of a suspension, was carried out. According to the Wilcoxon-Mann-Whitney criterion, it was determined that the zone of intersecting values between these samples is small enough and corresponded to the value of the parameter p equal to 0.0002 (p <0.001) or 2.5726x10'29 (p <0.001) for free or fixed cells. respectively. To determine the critical value of the slope of the power spectrum in the optical thickness fluctuation regarding which can judge the viability of cells according LIM evaluated sample values corresponding to the 25th and 75th quantile. Conclusion is made on the basis of these estimates that for fixed on MCF-7 medium in a value 1 corresponds ®, available for this value was 0.75 cells cells.
На втором этапе исследования проводили сравнительный анализ выборок наклона спектра мощности Фурье отфильтрованных сигналов, имеющих наибольшую дисперсию флуктуаций оптической толAt the second stage of the study, we performed a comparative analysis of samples of the Fourier power spectrum slope of filtered signals with the greatest variance of optical thickness fluctuations.
- 4 038893 щины закрепленных и свободных жизнеспособных клеток, а также закрепленных и свободных нежизнеспособных клеток. С помощью теста Уилкоксона-Манна-Уитни установлена значимая разница между первыми двумя выборками (р<0,001) и значимая разница между последними (р<0,01).- 4 038893 shields of fixed and free viable cells, as well as fixed and free non-viable cells. Using the Wilcoxon-Mann-Whitney test, a significant difference was established between the first two samples (p <0.001) and a significant difference between the latter (p <0.01).
Сравнительный анализ наклона спектра мощности Фурье флуктуаций оптической толщины живых и мертвых раковых клеток MCF-7 с помощью теста Уилкоксона-Манна-Уитни представлен на фиг. 1718.Comparative analysis of the Fourier power spectrum slope of optical thickness fluctuations of living and dead MCF-7 cancer cells using the Wilcoxon-Mann-Whitney test is shown in FIG. 1718.
Таким образом, если наклон спектра мощности Фурье флуктуаций оптической толщины клеток линии MCF-7 больше, чем пороговое значение ec, то данную клетку считали живой, в противном случае мертвой.Thus, if the slope of the Fourier power spectrum of fluctuations in the optical thickness of MCF-7 cells is greater than the threshold value ec, then this cell was considered alive, otherwise dead.
Использование предлагаемого способа позволяет сократить продолжительность процесса анализа жизнеспособности клеток эукариот и повысить уровень достоверности результатов в режиме реального времени, исключая этапы длительной пробоподготовки и процедуры окрашивания специфическими красителями.The use of the proposed method allows to reduce the duration of the analysis of the viability of eukaryotic cells and to increase the level of reliability of the results in real time, excluding the stages of lengthy sample preparation and the procedure for staining with specific dyes.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA202000269A EA038893B1 (en) | 2020-09-02 | 2020-09-02 | Method for the determination of eukaryotic cell viability using the laser interference microscopy method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA202000269A EA038893B1 (en) | 2020-09-02 | 2020-09-02 | Method for the determination of eukaryotic cell viability using the laser interference microscopy method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA202000269A1 EA202000269A1 (en) | 2021-11-02 |
| EA038893B1 true EA038893B1 (en) | 2021-11-03 |
Family
ID=78750216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA202000269A EA038893B1 (en) | 2020-09-02 | 2020-09-02 | Method for the determination of eukaryotic cell viability using the laser interference microscopy method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA038893B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013093507A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | University Of Leeds | Assay of functional cell viability |
| RU2543340C2 (en) * | 2013-04-04 | 2015-02-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный технический университет радиотехники, электроники и автоматики" | Method for assessing functional state of human lymphocyte |
-
2020
- 2020-09-02 EA EA202000269A patent/EA038893B1/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013093507A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | University Of Leeds | Assay of functional cell viability |
| RU2543340C2 (en) * | 2013-04-04 | 2015-02-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный технический университет радиотехники, электроники и автоматики" | Method for assessing functional state of human lymphocyte |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BRAZHE A.R., et al. Phase-modulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J. of Biomedical Optics, 13(3), 034004 (2008). https://doi.org/10.1117/1.2937213 * |
| NEBOGATIKOV V. et al. Study of morphological changes in breast cancer cells MCF-7 under the action of pro-apoptotic agents with laser modulation interference microscope MIM-340 AIP Conference Proceedings 1882, 020053 (2017); Published Online: 28 September 2017; https://doi.org/10.1063/1.5001632 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA202000269A1 (en) | 2021-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hu et al. | Quantitative phase imaging (QPI) in neuroscience | |
| Chan et al. | Label-free separation of human embryonic stem cells and their cardiac derivatives using Raman spectroscopy | |
| Chen et al. | Photonic crystal enhanced microscopy for imaging of live cell adhesion | |
| Downes et al. | Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation | |
| US8184298B2 (en) | Spatial light interference microscopy and fourier transform light scattering for cell and tissue characterization | |
| Kim et al. | Holotomography: refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging | |
| Poon et al. | Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: from current state-of-the-art to future clinical translation | |
| Sun et al. | Real-time subcellular imaging based on graphene biosensors | |
| Scalfi-Happ et al. | Investigation of lipid bodies in a colon carcinoma cell line by confocal Raman microscopy | |
| Kim et al. | Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging | |
| Hu et al. | Quantitative phase imaging: principles and applications | |
| Pham et al. | Altered mitochondrial structure and motion dynamics in living cells with energy metabolism defects revealed by real time microscope imaging | |
| Aksoy et al. | Infrared spectroscopy and imaging in stem cells and aging research | |
| Seo et al. | Cellular imaging using phase holographic microscopy: for the study of pathophysiology of red blood cells and human umbilical vein endothelial cells | |
| Hu et al. | Synthetic aperture interference light (SAIL) microscopy for high-throughput label-free imaging | |
| EA038893B1 (en) | Method for the determination of eukaryotic cell viability using the laser interference microscopy method | |
| JP6419717B2 (en) | Cell identification method | |
| Butt et al. | Quantitative phase imaging for characterization of single cell growth dynamics | |
| Creath | Dynamic quantitative phase images of pond life, insect wings, and in vitro cell cultures | |
| Belashov et al. | Dry mass and average phase shift dynamics in HeLa cells subjected to low-dose photodynamic treatment | |
| O'Dwyer et al. | Automated raman cytology for the classification of triple negative breast cancer cell lines | |
| Goswami et al. | Quantitative phase imaging techniques for measuring scattering properties of cells and tissues: a review—part I | |
| Bouvet et al. | Multimode fiber-coupled VIPA spectrometer for high-throughput Brillouin imaging of biological samples | |
| Bonnier et al. | Collagen matrices as an improved model for in vitro study of live cells using Raman microspectroscopy | |
| Baczewska et al. | Quantitative phase imaging supported by raman micro-spectroscopy for identifying and quantifying changes in myeloid cells treated with proteasome inhibitor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment |