EA037290B1 - NANOELECTRODE FOR DETECTING Cu(II) IONS AND METHOD OF PRODUCING AND USING A NANOELECTRODE - Google Patents
NANOELECTRODE FOR DETECTING Cu(II) IONS AND METHOD OF PRODUCING AND USING A NANOELECTRODE Download PDFInfo
- Publication number
- EA037290B1 EA037290B1 EA201891540A EA201891540A EA037290B1 EA 037290 B1 EA037290 B1 EA 037290B1 EA 201891540 A EA201891540 A EA 201891540A EA 201891540 A EA201891540 A EA 201891540A EA 037290 B1 EA037290 B1 EA 037290B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nanoelectrode
- ions
- electrode
- potential
- voltammogram
- Prior art date
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/333—Ion-selective electrodes or membranes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/49—Systems involving the determination of the current at a single specific value, or small range of values, of applied voltage for producing selective measurement of one or more particular ionic species
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/333—Ion-selective electrodes or membranes
- G01N27/3335—Ion-selective electrodes or membranes the membrane containing at least one organic component
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Настоящее изобретение в целом относится к устройствам и способам определения ионов металлов. В частности, изобретение относится к наноэлектроду для определения ионов Cu (II), способу его получения и применения для определения ионов меди в образце, а также к системе, содержащей наноэлектрод.The present invention generally relates to devices and methods for determining metal ions. In particular, the invention relates to a nanoelectrode for the determination of Cu (II) ions, a method for its preparation and use for the determination of copper ions in a sample, as well as a system containing a nanoelectrode.
Уровень техникиState of the art
Медь является важным для жизни элементом, однако изменения в ее клеточном гомеостазе могут привести к серьезным нейродегенеративным заболеваниям, включая болезни Менкеса и Вильсона, наследственный амиотрофический боковой склероз, болезнь Альцгеймера и прионные заболевания. Кроме того, высказано предположение о том, что изменение концентрации меди в клетках также имеет отношение к развитию рака. Поэтому важно разработать устройства и способы для точного контроля концентрации меди в клетках.Copper is an essential element for life, but changes in its cellular homeostasis can lead to serious neurodegenerative diseases, including Menkes and Wilson's diseases, hereditary amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, and prion diseases. In addition, it has been suggested that changes in the concentration of copper in cells are also related to the development of cancer. Therefore, it is important to develop devices and methods to accurately control the concentration of copper in cells.
Электрохимические способы могут быть более подходящими по сравнению с другими способами определения ионов меди благодаря повышенной надежности, чувствительности, быстрому отклику и возможности объединения с другими компонентами устройства. В документе US 3821100 раскрыт один из первых электрохимических способов определения ионов меди с использованием ионоселективного сенсора для определения меди. В документе CN 103941185 раскрыта система для определения концентрации паров меди на основе сенсора с микрометрической шкалой. В документе CN 103940882 раскрыт сенсор для определения следовых количеств ионов меди в образце воды и способ его получения. В документе CN 103913502 раскрыт способ быстрого определения меди на основе квадратно-волновой вольтамперометрии и трехэлектродного сенсора. В документе CN 102507698 раскрыт новый сенсор для одновременного определения ионов меди и ионов свинца.Electrochemical methods may be more suitable than other methods for the determination of copper ions due to increased reliability, sensitivity, fast response, and the ability to combine with other components of the device. US Pat. No. 3,821,100 discloses one of the first electrochemical methods for the determination of copper ions using an ion-selective copper sensor. CN 103941185 discloses a system for determining the concentration of copper vapor based on a micrometer scale sensor. Document CN 103940882 discloses a sensor for detecting trace amounts of copper ions in a water sample and a method for its preparation. CN 103913502 discloses a method for the rapid determination of copper based on square wave voltammetry and a three-electrode sensor. CN 102507698 discloses a new sensor for the simultaneous determination of copper ions and lead ions.
Однако существующие устройства для определения ионов меди имеют макро- или микроразмер и не подходят для локального и внутриклеточного определения. Размеры указанных устройств, как правило, слишком велики для измерения в обычных клетках млекопитающих (5-10 мкм), и способы нередко ограничены измерениями в ооцитах и эмбрионах, размер которых по меньшей мере в десять раз больше.However, existing devices for the determination of copper ions are macro- or micro-sized and are not suitable for local and intracellular determination. These devices are generally too large to be measured in normal mammalian cells (5-10 μm), and the methods are often limited to measurements in oocytes and embryos that are at least ten times larger.
Миниатюризация существующих устройств для определения ионов Cu (II) представляет собой сложную техническую задачу. Трудно создать недорогой наноразмерный электрод для определения Cu (II), обладающий высокой чувствительностью к ионам Cu (II), в частности, из-за того, что измерение сигналов низкой интенсивности представляет собой серьезную проблему. Кроме того, поверхность контакта между клеткой и электродом должна быть изолирована от окружающей среды.The miniaturization of existing devices for the determination of Cu (II) ions is a complex technical problem. It is difficult to create an inexpensive nanoscale electrode for the determination of Cu (II) with high sensitivity to Cu (II) ions, in particular, because the measurement of low intensity signals is a serious problem. In addition, the contact surface between the cage and the electrode must be isolated from the environment.
Соответственно, существует постоянная потребность в недорогих аналитических инструментах для измерения концентрации ионов меди с наноразмерным разрешением, например, внутри одной клетки. В частности, существует постоянная потребность в обеспечении высокоселективных и высокочувствительных электродов для определения ионов Cu (II), которые имеют наноразмерное пространственное разрешение. Настоящее изобретение решает указанные и другие задачи, как подробнее описано ниже.Accordingly, there is an ongoing need for inexpensive analytical instruments to measure the concentration of copper ions with nanoscale resolution, for example, within a single cell. In particular, there is an ongoing need to provide highly selective and highly sensitive electrodes for the determination of Cu (II) ions that have nanoscale spatial resolution. The present invention solves these and other problems, as described in more detail below.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Некоторые варианты реализации, раскрытые в данном описании, относятся к наноэлектроду для определения ионов Cu (II), содержащему:Some embodiments disclosed herein relate to a nanoelectrode for the determination of Cu (II) ions, comprising:
нанопипетку, имеющую кончик, имеющий отверстие;a nanopipette having a tip having an opening;
углеродную пробку, которая занимает по меньшей мере часть внутреннего пространства кончика и имеет первую поверхность, которая обращена к отверстию;a carbon plug that occupies at least a portion of the inner space of the tip and has a first surface that faces the opening;
металлическое покрытие, покрывающее по меньшей мере часть первой поверхности;a metal coating covering at least a portion of the first surface;
по меньшей мере одно хелатирующее ионы Cu (II) соединение, связанное с металлическим покрытием.at least one Cu (II) ion chelating compound associated with the metal coating.
В некоторых вариантах реализации металл в металлическом покрытии выбран из золота, серебра, платины и их сплавов. В некоторых вариантах реализации хелатирующее ионы Cu (II) соединение содержит в своей структуре тиольную группу. В некоторых вариантах реализации хелатирующее ионы Cu (II) соединение выбирают из природных пептидов; неканонических пептидов; азот-, кислород-, серосодержащих гетероциклических соединений; азот-, кислород-, серосодержащих краун-эфиров. В некоторых вариантах реализации диаметр отверстия составляет от 1 до 1000 нм, от 5 до 100 нм, от 10 до 70 нм или от 20 до 50 нм. В некоторых вариантах реализации наружный диаметр края кончика составляет от 10 до 10000 нм, от 100 до 800 нм или от 200 до 500 нм. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере часть первой поверхности является вогнутой и образует полость.In some embodiments, the metal in the plated metal is selected from gold, silver, platinum, and their alloys. In some embodiments, the Cu (II) ion chelating compound contains a thiol group in its structure. In some embodiments, the Cu (II) ion chelating compound is selected from naturally occurring peptides; non-canonical peptides; nitrogen-, oxygen-, sulfur-containing heterocyclic compounds; nitrogen-, oxygen-, sulfur-containing crown ethers. In some embodiments, the hole diameter is 1 to 1000 nm, 5 to 100 nm, 10 to 70 nm, or 20 to 50 nm. In some embodiments, the outer diameter of the tip edge is 10 to 10,000 nm, 100 to 800 nm, or 200 to 500 nm. In some embodiments, at least a portion of the first surface is concave and forms a cavity.
В некоторых вариантах реализации наноэлектрод дополнительно содержит внутренний электрод, расположенный в контакте со второй поверхностью углеродной пробки, при этом вторая поверхность обращена внутрь нанопипетки.In some embodiments, the nanoelectrode further comprises an inner electrode positioned in contact with the second surface of the carbon plug, the second surface facing the interior of the nanopipette.
Некоторые варианты реализации, раскрытые в настоящем описании, относятся к способу получения наноэлектрода для определения ионов Cu (II), включающему стадии:Some embodiments disclosed herein relate to a method for preparing a nanoelectrode for the determination of Cu (II) ions, comprising the steps of:
(а) обеспечение нанопипетки, имеющей кончик, имеющий отверстие;(a) providing a nanopipette having a tip having an opening;
(б) по меньшей мере частичное заполнение внутреннего пространства кончика углеродом для формирования углеродной пробки, первая поверхность которой обращена к отверстию;(b) at least partially filling the inner space of the tip with carbon to form a carbon plug, the first surface of which faces the opening;
(в) по меньшей мере частичное покрытие первой поверхности металлом с получением металличе(c) at least partially coating the first surface with a metal to form a metal
- 1 037290 ского покрытия;- 1 037290 cover;
(г) приведение в контакт металлического покрытия по меньшей мере с одним хелатирующим медь соединением для связывания хелатирующего медь соединения с металлическим покрытием.(d) contacting the metal coating with at least one copper chelating compound to bond the copper chelating compound to the metal coating.
В некоторых вариантах реализации способ после стадии (б) и до стадии (в) дополнительно включает стадию:In some embodiments, the method after step (b) and before step (c) further comprises the step of:
(д) формирование полости на первой поверхности.(e) forming a cavity on the first surface.
В некоторых вариантах реализации полость формируют путем электрохимической обработки, в частности, электрохимическим травлением. В некоторых вариантах реализации на первую поверхность наносят металл способом электрохимического осаждения. В некоторых вариантах реализации металл выбирают из группы, включающей золото, серебро, платину и их сплавы. В некоторых вариантах реализации хелатирующее ионы Cu (II) соединение содержит в своей структуре тиольную группу. В некоторых вариантах реализации хелатирующее ионы Cu (II) соединение выбрано из природных пептидов; неканонических пептидов; азот-, кислород-, серосодержащих гетероциклических соединений; азот-, кислород-, серосодержащих краун-эфиров. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает стадию (е) установка электрода в контакте со второй поверхностью углеродной пробки, при этом вторая поверхность обращена внутрь нанопипетки.In some embodiments, the cavity is formed by electrochemical machining, such as electrochemical etching. In some embodiments, metal is deposited on the first surface by electrochemical deposition. In some embodiments, the metal is selected from the group consisting of gold, silver, platinum, and their alloys. In some embodiments, the Cu (II) ion chelating compound contains a thiol group in its structure. In some embodiments, the Cu (II) ion chelating compound is selected from naturally occurring peptides; non-canonical peptides; nitrogen-, oxygen-, sulfur-containing heterocyclic compounds; nitrogen-, oxygen-, sulfur-containing crown ethers. In some embodiments, the method further comprises the step of (e) placing the electrode in contact with a second surface of the carbon plug, with the second surface facing the interior of the nanopipette.
Некоторые варианты реализации, раскрытые в настоящем описании, относятся к системе для определения ионов Cu (II) в образце, при этом система содержит наноэлектрод, раскрытый в настоящем описании в качестве рабочего электрода. В некоторых вариантах реализации система дополнительно содержит противоэлектрод, электрод сравнения, источник напряжения на указанные рабочий электрод и противоэлектрод и измеритель тока для измерения тока между указанными рабочим электродом и противоэлектродом. В некоторых вариантах реализации противоэлектрод представляет собой электрод из платиновой проволоки, а электрод сравнения представляет собой Ag/AgCl электрод. В некоторых вариантах реализации наноэлектрод, противоэлектрод, электрод сравнения, источник напряжения и измеритель тока соединены электрически.Some embodiments disclosed herein relate to a system for determining Cu (II) ions in a sample, the system comprising a nanoelectrode disclosed herein as a working electrode. In some embodiments, the system further comprises a counter electrode, a reference electrode, a voltage source across said working electrode and counter electrode, and a current meter for measuring current between said working electrode and counter electrode. In some embodiments, the counter electrode is a platinum wire electrode and the reference electrode is an Ag / AgCl electrode. In some embodiments, the nanoelectrode, counter electrode, reference electrode, voltage source, and current meter are electrically connected.
Некоторые варианты реализации, раскрытые в настоящем описании, относятся к способу определения ионов Cu (II) в образце, включающему стадии:Some embodiments disclosed herein relate to a method for determining Cu (II) ions in a sample, comprising the steps of:
(а) приведение в контакт образца с набором электродов, содержащим наноэлектрод, раскрытый в настоящем описании в качестве рабочего электрода;(a) contacting the sample with a set of electrodes containing the nanoelectrode disclosed herein as a working electrode;
(б) определение отклика рабочего электрода на вольтамперограмме путем изменения потенциала, прикладываемого к наноэлектроду;(b) determining the response of the working electrode on the voltammogram by changing the potential applied to the nanoelectrode;
(в) измерение высоты пика вольтамперограммы, соответствующей восстановлению ионов Cu (II) до ионов Cu (I) на рабочем электроде для определения концентрации ионов Cu (II).(c) measuring the height of the voltammogram peak corresponding to the reduction of Cu (II) ions to Cu (I) ions on the working electrode to determine the concentration of Cu (II) ions.
В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает стадии:In some embodiments, the method further comprises the steps of:
получение калибровочных кривых для высоты пиков вольтамперограммы для известных концентраций ионов Cu (II);obtaining calibration curves for the height of the voltammogram peaks for known concentrations of Cu (II) ions;
сравнение измеренной высоты пиков вольтамперограммы образца с калибровочной кривой для определения концентрации ионов Cu (II) в образце.comparison of the measured peak heights of the voltammogram of the sample with the calibration curve for determining the concentration of Cu (II) ions in the sample.
В некоторых вариантах реализации набор электродов дополнительно содержит противоэлектрод, электрод сравнения, источник напряжения на указанные рабочий электрод и противоэлектрод и измеритель тока для измерения тока между указанными рабочим электродом и противоэлектродом. В некоторых вариантах реализации противоэлектрод представляет собой электрод из платиновой проволоки, а электрод сравнения представляет собой Ag/AgCl электрод. В некоторых вариантах реализации вольтамперограмма выбрана из группы, состоящей из циклической вольтамперограммы, квадратно-волновой вольтамперограммы и квадратно-волновой адсорбционной инверсионной вольтамперограммы. В некоторых вариантах реализации при переходе Cu (II) в Cu (I) наблюдаются характеристические пики при потенциалах восстановления в диапазоне от +200,0 мВ до +700 мВ, в частности, от +400,0 мВ до +600 мВ. В некоторых вариантах реализации прикладываемый потенциал изменяют в диапазоне, который включает потенциал, при котором происходит переход Cu (II) в Cu (I), в частности, в диапазоне от -500 мВ до 800 мВ. В некоторых вариантах реализации изменение потенциала, прикладываемого к наноэлектроду, включает приложение отрицательного потенциала накопления. В некоторых вариантах реализации потенциал накопления составляет от -500 мВ до +0,0 мВ, в частности, от -500 мВ до -100,0 мВ. В некоторых вариантах реализации отрицательный потенциал накопления прикладывают в течение по меньшей мере 10 мс, по меньшей мере 30 мс или по меньшей мере 50 мс. В некоторых вариантах реализации изменение потенциала, прикладываемого к наноэлектроду, включает приложение положительного потенциала при скорости сканирования от 8 В/с до 2-103 В/с. В некоторых вариантах реализации чувствительность определения концентрации ионов Cu (II) возрастает со скоростью сканирования и/или значением (более отрицательным) потенциала накопления и/или продолжительностью приложения потенциала накопления.In some embodiments, the set of electrodes further comprises a counter electrode, a reference electrode, a voltage source across said working electrode and counter electrode, and a current meter for measuring current between said working electrode and counter electrode. In some embodiments, the counter electrode is a platinum wire electrode and the reference electrode is an Ag / AgCl electrode. In some embodiments, the voltammogram is selected from the group consisting of a cyclic voltammogram, a square wave voltammogram, and a square wave adsorption stripping voltammogram. In some embodiments, the transition of Cu (II) to Cu (I) exhibits characteristic peaks at reduction potentials ranging from +200.0 mV to +700 mV, in particular from +400.0 mV to +600 mV. In some embodiments, the applied potential is varied over a range that includes the potential at which the transition of Cu (II) to Cu (I) occurs, in particular in the range of -500 mV to 800 mV. In some embodiments, changing the potential applied to the nanoelectrode includes applying a negative storage potential. In some embodiments, the storage potential is from -500 mV to +0.0 mV, in particular from -500 mV to -100.0 mV. In some embodiments, the negative storage potential is applied for at least 10 ms, at least 30 ms, or at least 50 ms. In some embodiments, changing the potential applied to the nanoelectrode includes applying a positive potential at a scan rate of 8 V / s to 2-10 3 V / s. In some embodiments, the sensitivity of determining the concentration of Cu (II) ions increases with the scan rate and / or the value (more negative) of the storage potential and / or the duration of the application of the storage potential.
Предложенный наноэлектрод можно применять для локального определения ионов меди в жидкостях, внутри или вблизи микрообъектов различной природы и размеров, например, клеток, бактериальных клеток, тканей и животных, липосом, микрокапель и так далее. Электрод можно применять для проThe proposed nanoelectrode can be used for the local determination of copper ions in liquids, inside or near micro-objects of various nature and sizes, for example, cells, bacterial cells, tissues and animals, liposomes, micro-droplets, and so on. The electrode can be used for
- 2 037290 кариотов и эукариотов. Подходящие микрообъекты являются достаточно мягкими, так что нанокапилляр способен в них проникнуть. Предложенный наноэлектрод обладает высокой чувствительностью и селективностью к ионам меди.- 2,037,290 karyotes and eukaryotes. Suitable micro-objects are soft enough that the nanocapillary is able to penetrate them. The proposed nanoelectrode has a high sensitivity and selectivity to copper ions.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
На фиг. 1 представлена вольт-амперная характеристика углеродного наноэлектрода, полученного путем пиролитического осаждения углерода внутри вытянутой нанопипетки. Характеристику регистрировали в растворе 1 мМ ферроцена в метаноле (FeMeOH).FIG. 1 shows the current-voltage characteristic of a carbon nanoelectrode obtained by pyrolytic carbon deposition inside an elongated nanopipette. The characteristic was recorded in a solution of 1 mM ferrocene in methanol (FeMeOH).
На фиг. 2 представлена вольт-амперная характеристика, полученная в процессе травления углеродного наноэлектрода в растворе 0,1 М NaOH, 10 мМ KCl в течение 40 циклов по 10 с каждый для формирования полости на поверхности наноэлектрода. Кривая для каждого последующего цикла находится выше кривой для предыдущего цикла.FIG. 2 shows the current-voltage characteristic obtained in the process of etching a carbon nanoelectrode in a solution of 0.1 M NaOH, 10 mM KCl for 40 cycles of 10 s each to form a cavity on the surface of the nanoelectrode. The curve for each subsequent cycle is above the curve for the previous cycle.
На фиг. 3 представлена вольт-амперная характеристика углеродного наноэлектрода после вытравливания полости. Характеристику регистрировали в растворе 1 мМ FeMeOH.FIG. 3 shows the current-voltage characteristic of a carbon nanoelectrode after etching the cavity. The characteristic was recorded in a 1 mM FeMeOH solution.
На фиг. 4 представлена вольт-амперная характеристика, полученная в процессе осаждения золота на углеродном наноэлектроде в растворе 10 MM HAuCl-H2O. Кривая для каждого последующего цикла находится ниже кривой для предыдущего цикла.FIG. 4 shows the current-voltage characteristic obtained during the deposition of gold on a carbon nanoelectrode in a solution of 10 MM HAuCl-H 2 O. The curve for each subsequent cycle is below the curve for the previous cycle.
На фиг. 5 представлена вольт-амперная характеристика наноэлектрода после осаждения на его поверхности слоя золота. Характеристику регистрировали в растворе 1 мМ FeMeOH.FIG. 5 shows the current-voltage characteristic of the nanoelectrode after the deposition of a layer of gold on its surface. The characteristic was recorded in a 1 mM FeMeOH solution.
На фиг. 6 представлена вольт-амперная характеристика наноэлектрода после осаждения на его поверхности слоя золота и до осаждения хелатирующего медь соединения. Характеристику регистрировали при различных концентрациях ионов меди в растворе PBS (забуференный фосфатом солевой раствор, рН которого составляет 7,4, полученный из 7,2 мМ Na2HPO4, 2,8 мМ KH2PO4 и 150 мМ NaCl). Круги - PBS, квадраты - 3 · 10-7 М медь, треугольники -10-6 М медь.FIG. 6 shows the current-voltage characteristic of the nanoelectrode after the deposition of a layer of gold on its surface and before the deposition of a copper-chelating compound. Characterization was recorded at various concentrations of copper ions in PBS solution (phosphate buffered saline, pH 7.4, prepared from 7.2 mM Na 2 HPO 4 , 2.8 mM KH 2 PO 4 and 150 mM NaCl). Circles - PBS, squares - 3 · 10 -7 M copper, triangles -10 -6 M copper.
На фиг. 7 представлена вольт-амперная характеристика варианта предложенного медного наноэлектрода, полученная при различных концентрациях ионов меди в растворе PBS (забуференный фосфатом солевой раствор, рН которого составляет 7,4, полученный из 7,2 мМ Na2HPO4, 2,8 мМ KH2PO4 и 150 мМ NaCl). Круги - PBS, квадраты - 3·10-7 М медь, треугольники -10-6 М медь.FIG. 7 shows the current-voltage characteristic of a variant of the proposed copper nanoelectrode, obtained at various concentrations of copper ions in a solution of PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4, obtained from 7.2 mM Na 2 HPO 4 , 2.8 mM KH2PO4 and 150 mM NaCl). Circles - PBS, squares - 3 · 10 -7 M copper, triangles -10 -6 M copper.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Предложенный медный наноэлектрод содержит нанопипетку с кончиком. Термин нанопипетка означает трубку или капилляр с узким кончиком на одном конце. Кончик имеет отверстие с внутренним диаметром в наноразмерном диапазоне, например, от 1 до 1000 нм, от 5 до 100 нм, от 10 до 70 нм или от 20 до 50 нм. Наружный диаметр кончика регулируют таким образом, чтобы он не превышал размер микроскопического объекта и составлял, например, от 10 до 10000 нм, от 100 до 800 нм или от 200 до 500 нм. Внутренний и наружный диаметры кончика зависят от планируемого применения и регулируются известным способом в зависимости от параметров процесса изготовления. Другой конец нанопипетки имеет размер, позволяющий вводить провод внутрь наноэлектрода. Оборудование и способы изготовления нанопипеток известны, см., например, Actis, P. et al.//Biosensors and Bioelectronics 26, pp. 333-337. В некоторых вариантах реализации нанопипетки могут быть изготовлены путем лазерного вытягивания капиллярных трубок.The proposed copper nanoelectrode contains a nano-pipette with a tip. The term nanopipette means a tube or capillary with a narrow tip at one end. The tip has an opening with an inner diameter in the nanoscale range, for example, 1 to 1000 nm, 5 to 100 nm, 10 to 70 nm, or 20 to 50 nm. The outer diameter of the tip is adjusted so that it does not exceed the size of the microscopic object and is, for example, from 10 to 10,000 nm, from 100 to 800 nm, or from 200 to 500 nm. The inner and outer diameters of the tip depend on the intended application and are regulated in a known manner depending on the parameters of the manufacturing process. The other end of the nanopipette is sized to allow the wire to be inserted into the nanoelectrode. Equipment and methods for making nanopipettes are known, see, for example, Actis, P. et al. // Biosensors and Bioelectronics 26, pp. 333-337. In some embodiments, nanopipettes can be made by laser pulling capillary tubes.
Длина кончика нанопипетки может быть различной в зависимости от применения. Длина в диапазоне от 5 до 100 мкм целесообразна для применения с микрообъектами, такими как клетки млекопитающих. Нанопипетка может быть изготовлена из любого подходящего непроводящего материала, имеющего высокую температуру плавления, например, кварца, стекла, боросиликата.The length of the tip of the nanopipette can vary depending on the application. Lengths in the range of 5 to 100 µm are suitable for use with micro-objects such as mammalian cells. The nanopipette can be made of any suitable non-conductive material with a high melting point, for example, quartz, glass, borosilicate.
Нанопипетка может иметь два или более параллельных канала. Каналы могут быть расположены радиально или концентрически. Указанные нанопипетки могут быть изготовлены из многоканальных капиллярных трубок, которые являются коммерчески доступными. Многоканальные нанопипетки позволяют использовать различные хелатирующие медь соединения в разных каналах или комбинировать наноэлектрод для определения меди с другими аналитическими микроустройствами.A nanopipette can have two or more parallel channels. The channels can be arranged radially or concentrically. These nanopipettes can be made from multichannel capillary tubes that are commercially available. Multichannel nanopipettes allow you to use different copper chelating compounds in different channels or combine the nanoelectrode for copper determination with other analytical microdevices.
Нанопипетка имеет углеродную пробку, занимающую по меньшей мере часть внутреннего пространства кончика. Термин углеродная пробка в настоящем описании означает кусок углеродсодержащего материала, который полностью заполняет или блокирует внутреннее пространство кончика в поперечном направлении и по меньшей мере частично занимает внутреннее пространство кончика в продольном направлении (направление, параллельное оси нанопипетки).The nanopipette has a carbon plug that occupies at least a portion of the interior space of the tip. The term “carbon plug” as used herein means a piece of carbonaceous material that completely fills or blocks the interior of the tip in the transverse direction and at least partially occupies the interior of the tip in the longitudinal direction (direction parallel to the axis of the nanopipette).
Часть поверхности углеродной пробки находится в контакте со стенками нанопипетки. Другая часть поверхности обращена к отверстию. На данную часть поверхности ссылаются как на первую поверхность углеродной пробки. Еще одна часть поверхности обращена внутрь нанопипетки, то есть к более широкой части нанопипетки, противоположной кончику. На данную часть поверхности ссылаются как на вторую поверхность углеродной пробки.Part of the surface of the carbon plug is in contact with the walls of the nanopipette. The other part of the surface faces the hole. This portion of the surface is referred to as the first surface of the carbon plug. Another part of the surface is facing inside the nanopipette, that is, towards the wider part of the nanopipette, opposite the tip. This portion of the surface is referred to as the second surface of the carbon plug.
Способы и устройства для заполнения нанопипетки углеродом известны в данной области техники. Примером является способ пиролитического разложения углеводородов, описанный в Takahashi Y. et al. Angewandte Chemie 50, pp. 9638 - 9642.Methods and apparatus for filling a nanopipette with carbon are known in the art. An example is the method for pyrolytic decomposition of hydrocarbons described in Takahashi Y. et al. Angewandte Chemie 50, pp. 9638 - 9642.
- 3 037290- 3 037290
В некоторых вариантах реализации внешняя поверхность углеродной пробки является плоской и находится на одном уровне с краем кончика.In some embodiments, the outer surface of the carbon plug is flat and flush with the tip edge.
В других вариантах реализации по меньшей мере часть наружной поверхности углеродной пробки является вогнутой, то есть имеет углубление. Указанная конфигурация также упоминается как нанополость. Нанополость обеспечивает лучшую адгезию слоя металла к углеродной пробке.In other embodiments, at least a portion of the outer surface of the carbon plug is concave, that is, it has a depression. This configuration is also referred to as nanocavity. The nano-cavity provides better adhesion of the metal layer to the carbon plug.
Способы и устройства для создания полостей в углеродных телах известны в данной области техники. Примером является способ электрохимического травления, описанный в Clausmeyer J. et al.//Electrochemistry Communications 40, pp. 28-30.Methods and devices for creating cavities in carbon bodies are known in the art. An example is the electrochemical etching method described in Clausmeyer J. et al. // Electrochemistry Communications 40, pp. 28-30.
По меньшей мере на часть первой поверхности углеродной пробки нанесено металлическое покрытие. Металл способен образовывать связь с хелатирующим медь соединением, в частности, ковалентную связь. Примерами таких металлов являются золото, серебро и платина. Термин металлическое покрытие также включает сплавы металлов. Осаждение металла на поверхности углерода может быть выполнено, например, электрохимическим способом из подходящих солей или кислот. Осаждение металла в полости обеспечивает более сильное связывание хелатирующего медь соединения с наноэлектродом.At least a portion of the first surface of the carbon plug is coated with a metal coating. The metal is capable of forming a bond with a copper chelating compound, in particular a covalent bond. Examples of such metals are gold, silver and platinum. The term metal coating also includes metal alloys. The deposition of the metal on the carbon surface can be carried out, for example, electrochemically from suitable salts or acids. The deposition of the metal in the cavity provides stronger bonding of the copper chelating compound to the nanoelectrode.
Наноэлектрод содержит по меньшей мере одно хелатирующее медь соединение, связанное с металлическим покрытием. Молекулы хелатирующего медь соединения действуют как специфические коллекторы ионов меди и повышают чувствительность и селективность наноэлектрода к ионам меди.The nanoelectrode contains at least one copper chelating compound associated with a metal coating. The molecules of the copper chelating compound act as specific collectors of copper ions and increase the sensitivity and selectivity of the nanoelectrode to copper ions.
Хелатирующее медь соединение обратимо и селективно связывает ионы Cu2+, тем самым увеличивая локальную концентрацию ионов поблизости от наноэлектрода. При приложении положительного потенциала на наноэлектрод ионы Cu2+ восстанавливаются до ионов Cu+ и высвобождаются от наноэлектрода.The copper chelating compound reversibly and selectively binds Cu 2+ ions , thereby increasing the local concentration of ions in the vicinity of the nanoelectrode. When a positive potential is applied to the nanoelectrode, Cu 2+ ions are reduced to Cu + ions and are released from the nanoelectrode.
Другой характеристикой подходящего хелатирующего медь соединения является его способность связываться с металлическим покрытием.Another characteristic of a suitable copper chelating compound is its ability to bond to the metal coating.
В некоторых вариантах реализации указанная способность обеспечивается присутствием тиольной группы в структуре хелатирующего медь соединения. Тиольная группа способна образовывать прочную ковалентную связь с металлическим покрытием. Связывание дополнительно усиливается, когда металл покрытия представляет собой золото, поскольку связь сера-золото обладает особенно высокой энергией связи (44 ккал/моль).In some embodiments, this ability is provided by the presence of a thiol group in the structure of the copper chelating compound. The thiol group is capable of forming a strong covalent bond with the metal coating. Binding is further enhanced when the plating metal is gold because the sulfur-gold bond has a particularly high binding energy (44 kcal / mol).
В одном их конкретных вариантов реализации структура хелатирующего медь соединения включает пептиды, способные координировать ионы меди. Указанные пептиды могут быть выделены из природных источников или синтезированы химически.In one specific embodiment, the structure of the copper chelating compound includes peptides capable of coordinating copper ions. These peptides can be isolated from natural sources or chemically synthesized.
В конкретном варианте реализации пептиды, способные координировать ионы меди, содержат в своей структуре фрагменты пептида гистидина.In a specific embodiment, peptides capable of coordinating copper ions contain fragments of a histidine peptide in their structure.
Конкретным примером такого пептида является пептид глицил-Ь-гистидил-Ь-лизин (GHK), структура которого указана нижеA specific example of such a peptide is the peptide glycyl-L-histidyl-L-lysine (GHK), the structure of which is shown below.
Поскольку пептид содержит три аминокислоты, его называют трипептидом. Трипептид GHK имеет сильное сродство к меди (II) и впервые был выделен из плазмы человека.Since the peptide contains three amino acids, it is called a tripeptide. The GHK tripeptide has a strong affinity for copper (II) and was first isolated from human plasma.
Синтез пептидов, предназначенных для применения в наноэлектроде, может быть выполнен классическим способом синтеза пептидов, в частности, путем жидкофазного синтеза или твердофазного синтеза пептидов.The synthesis of peptides intended for use in a nanoelectrode can be performed by the classical peptide synthesis method, in particular, by liquid-phase synthesis or solid-phase peptide synthesis.
В другом варианте реализации пептид, способный координировать ионы меди, модифицируют путем введения линкерного пептида для усиления связывания соединения с поверхностью металлического покрытия.In another embodiment, a peptide capable of coordinating copper ions is modified by introducing a linker peptide to enhance the binding of the compound to the surface of the metal coating.
В конкретном варианте реализации линкерный пептид содержит по меньшей мере одну серосодержащую группу.In a specific embodiment, the linker peptide contains at least one sulfur-containing group.
Примером линкерного пептида, содержащего серосодержащую группу, является липоевая кислота. Введение липоевой кислоты в пептид, способный координировать ионы меди, обеспечивает сильное связывание с поверхностью металла и при этом не влияет на координационные свойства пептида.An example of a linker peptide containing a sulfur-containing group is lipoic acid. The introduction of lipoic acid into a peptide capable of coordinating copper ions provides strong binding to the metal surface and does not affect the coordination properties of the peptide.
Неограничивающий список хелатирующих медь агентов, которые могут быть использованы в наноэлектроде в соответствии с настоящим изобретением, включают природные пептиды, неканонические пептиды, азот-, кислород-, серосодержащие гетероциклические соединения, азот-, кислород-, серосодержащие краун-эфиры.A non-limiting list of copper chelating agents that can be used in a nanoelectrode in accordance with the present invention include natural peptides, non-canonical peptides, nitrogen-, oxygen-, sulfur-containing heterocyclic compounds, nitrogen-, oxygen-, sulfur-containing crown ethers.
- 4 037290- 4 037290
Наноэлектрод можно использовать в качестве рабочего электрода в системе для определения ионов Cu (II) в образце. Система может содержать противоэлектрод, электрод сравнения, источник напряжения на указанные рабочий электрод и противоэлектрод и измеритель тока для измерения тока между указанными рабочим электродом и противоэлектродом, при этом наноэлектрод, противоэлектрод, электрод сравнения, источник напряжения и измеритель тока электрически соединены друг с другом. Применение предложенного наноэлектрода, однако, не ограничено описанной выше конкретной системой. Возможны другие конфигурации электродов и измерительных и управляющих устройств, как хорошо известно специалистам в данной области техники.The nanoelectrode can be used as a working electrode in a system for determining Cu (II) ions in a sample. The system may include a counter electrode, a reference electrode, a voltage source on said working electrode and counter electrode, and a current meter for measuring current between said working electrode and counter electrode, wherein the nanoelectrode, counter electrode, reference electrode, voltage source and current meter are electrically connected to each other. The application of the proposed nanoelectrode, however, is not limited to the specific system described above. Other configurations of electrodes and measuring and control devices are possible, as is well known to those skilled in the art.
Для проведения измерений металлическая проволока или другой проводник могут быть подключены ко второй поверхности углеродной пробки наноэлектрода. Проволока используется для приложения электрического потенциала на наноэлектрод во время измерения и для электрического подключения наноэлектрода к другим компонентам измерительной установки.For measurements, a metal wire or other conductor can be connected to the second surface of the carbon plug of the nanoelectrode. The wire is used to apply an electric potential to the nanoelectrode during measurement and to electrically connect the nanoelectrode to other components of the measurement setup.
Предложенный наноэлектрод можно применять для локального определения ионов меди в жидкостях, внутри или вблизи микрообъектов различной природы и размеров, например, клеток, бактериальных клеток, тканей и животных, липосом, микрокапель и так далее. Электрод можно применять для прокариотов и эукариотов. Подходящие микрообъекты являются достаточно мягкими, так что нанокапилляр способен проникнуть в них с целью определения ионов меди. Предложенный наноэлектрод обладает высокой чувствительностью и селективностью по отношению к ионам Cu (II).The proposed nanoelectrode can be used for the local determination of copper ions in liquids, inside or near micro-objects of various nature and sizes, for example, cells, bacterial cells, tissues and animals, liposomes, micro-droplets, and so on. The electrode can be used for prokaryotes and eukaryotes. Suitable micro-objects are soft enough that the nanocapillary is able to penetrate them in order to detect copper ions. The proposed nanoelectrode has a high sensitivity and selectivity towards Cu (II) ions.
Навигация наноэлектрода в микрообъекте или вблизи него может осуществляться механически вручную под управлением соответствующих оптических систем. Также можно осуществлять навигацию наноэлектрода в микрообъекте с помощью автоматизированных инструментов. Например, для определения положения объекта можно использовать сканирующий ион-проводящий микроскоп, а затем можно использовать систему позиционирования для трехмерного позиционирования контролируемой навигации наноэлектрода в микрообъектах или вблизи них.Navigation of a nanoelectrode in a micro-object or near it can be carried out mechanically manually under the control of appropriate optical systems. It is also possible to navigate a nanoelectrode in a micro-object using automated tools. For example, a scanning ion-conducting microscope can be used to determine the position of an object, and then a positioning system can be used to 3D position the controlled navigation of the nanoelectrode in or near micro-objects.
Предложенный наноэлектрод можно использовать в электроаналитическом способе определения ионов Cu (II) в образце, основанном на вольтамперометрическом анализе. Для всех вольтамперометрических способов общим является то, что они включают приложение потенциала (Е) на рабочий электрод и контроль результирующего тока (I), протекающего через электрохимическую ячейку. Во многих случаях изменяют прикладываемый потенциал или контролируют ток в течение периода времени (t) как функцию приложенного потенциала (Е). Таким образом, все вольтамперометрические способы могут быть описаны как некоторая функция Е, I и t. Электрохимическая ячейка, в которой проводится вольтамперометрический анализ, состоит из рабочего (индикаторного) электрода, электрода сравнения и, как правило, противоэлектрода (вспомогательного электрода). Восстановление или окисление вещества на поверхности рабочего электрода при соответствующем потенциале приводит к массовому переносу нового материала на поверхность электрода и генерированию тока (I).The proposed nanoelectrode can be used in an electroanalytical method for determining Cu (II) ions in a sample based on voltammetric analysis. All voltammetric methods have in common that they involve applying a potential (E) to the working electrode and monitoring the resulting current (I) flowing through the electrochemical cell. In many cases, the applied potential is changed or the current is monitored over a period of time (t) as a function of the applied potential (E). Thus, all voltammetric methods can be described as some function of E, I and t. The electrochemical cell in which the voltammetric analysis is carried out consists of a working (indicator) electrode, a reference electrode and, as a rule, a counter electrode (auxiliary electrode). The reduction or oxidation of a substance on the surface of the working electrode at an appropriate potential leads to a massive transfer of new material to the surface of the electrode and the generation of current (I).
Согласно способу определения ионов Cu (II) в соответствии с настоящим изобретением для выполнения вольтамперометрических измерений используют циклическую вольтамперометрию, при этом потенциал от начального потенциала (Е1) до конечного потенциала (Е2) изменяется во времени на протяжении полного цикла. Циклическая вольтамперометрия основана на изменении приложенного на рабочий электрод потенциала как в прямом, так и в обратном направлениях (при некоторой частоте сканирования) при осуществлении контроля тока.According to the method for determining Cu (II) ions in accordance with the present invention, cyclic voltammetry is used to perform voltammetric measurements, and the potential from the initial potential (E1) to the final potential (E2) varies with time throughout the entire cycle. Cyclic voltammetry is based on a change in the potential applied to the working electrode in both forward and reverse directions (at a certain scanning frequency) while monitoring the current.
Как правило, результирующая вольтамперограмма отображает один или несколько пиков, каждый из которых соответствует конкретному электрохимическому превращению, происходящему на рабочем электроде. В способе в соответствии с настоящим изобретением электрохимическое превращение представляет собой переход Cu (II) в Cu (I), для которого характерны пики при восстановительных потенциалах в диапазоне от +200,0 мВ до +700 мВ, в частности, от +400,0 мВ до +600 мВ. Высота пика прямо пропорциональна концентрации электроактивных частиц, ионов Cu (II). Поэтому в результате получения соответствующей калибровочной кривой можно измерить концентрацию Cu (II) в образце.Typically, the resulting voltammogram displays one or more peaks, each of which corresponds to a specific electrochemical transformation that occurs at the working electrode. In the method according to the present invention, the electrochemical transformation is the transition of Cu (II) to Cu (I), which is characterized by peaks at reduction potentials in the range from +200.0 mV to +700 mV, in particular from +400.0 mV to +600 mV. The peak height is directly proportional to the concentration of electroactive particles, Cu (II) ions. Therefore, by obtaining an appropriate calibration curve, the concentration of Cu (II) in the sample can be measured.
Для электрохимических измерений можно использовать стандартные электронные схемы и устройства, которые включают управляемый усилитель и чувствительный индикатор напряжения и тока. Схемы могут содержать любое чувствительное устройство для определения изменений тока порядка 1-10 пА на основе базового тока 10-1000 пА. Такие электронные схемы и устройства имеют быстрое время отклика, относительно независимы от температуры или позволяют компенсировать изменения температуры. Устройство имеет вход в цепь, в которую прикладывается известное напряжение. Известны чувствительные схемы определения, в том числе усилители с фиксированным напряжением и трансимпедансные усилители. Выходной ток зависит от изменений входного напряжения, и могут быть определены небольшие изменения тока.For electrochemical measurements, standard electronic circuits and devices can be used, which include a controlled amplifier and a sensitive voltage and current indicator. The circuits can contain any sensing device for detecting current changes in the order of 1-10 pA, based on a base current of 10-1000 pA. Such electronic circuits and devices have fast response times, are relatively temperature independent, or compensate for temperature changes. The device has an input to a circuit to which a known voltage is applied. Sensitive detection circuits are known, including fixed voltage amplifiers and transimpedance amplifiers. The output current depends on changes in the input voltage, and small changes in current can be detected.
Предложенный способ определения ионов Cu (II) включает стадию приведения в контакт образца с набором электродов, содержащим предложенный наноэлектрод в качестве рабочего электрода. Противоэлектрод и электрод сравнения могут быть расположены вне образца, однако находятся в электрическом контакте с рабочим электродом, например, через раствор электролита. Затем записывают вольтамперограмму путем изменения потенциала, прикладываемого к наноэлектроду. Измеряют высоту пика, соотThe proposed method for determining Cu (II) ions includes the step of bringing the sample into contact with a set of electrodes containing the proposed nanoelectrode as a working electrode. The counter electrode and the reference electrode can be located outside the sample, but are in electrical contact with the working electrode, for example, through an electrolyte solution. Then a voltammogram is recorded by changing the potential applied to the nanoelectrode. Measure the height of the peak, corresponding
- 5 037290 ветствующего переходу Cu (II) в Cu (I), и сравнивают с калибровочной кривой для определения концентрации ионов Cu (II) в образце.- 5 037290 corresponding to the transition of Cu (II) to Cu (I), and compared with the calibration curve to determine the concentration of Cu (II) ions in the sample.
В некоторых вариантах реализации во время записи вольтамперограммы на рабочий электрод прикладывают возрастающий положительный потенциал. Потенциал изменяют в диапазоне, включающем потенциал, при котором происходит переход Cu (II) в Cu (I).In some embodiments, an increasing positive potential is applied to the working electrode during the recording of the voltammogram. The potential is changed in the range including the potential at which the transition of Cu (II) to Cu (I) occurs.
В некоторых вариантах реализации положительный потенциал прикладывают при скорости сканирования в диапазоне от 8 В/с до 2-103 В/с. Такое быстрое приложение положительного потенциала обеспечивает одновременное восстановление всех ионов меди, собранных на электроде, и, в результате, сильный ток, который увеличивает чувствительность измерения.In some embodiments, the positive potential is applied at a scan rate ranging from 8 V / s to 2-10 3 V / s. This rapid application of a positive potential ensures the simultaneous recovery of all copper ions collected on the electrode, and, as a result, a strong current, which increases the sensitivity of the measurement.
При медленном скачке напряжения ток, обусловленный переходом ионов меди, распределяется во времени, что может привести к плохому отклику электрохимического сигнала.With a slow voltage jump, the current due to the transition of copper ions is distributed over time, which can lead to a poor response of the electrochemical signal.
В некоторых вариантах реализации отрицательный потенциал накопления прикладывают на рабочий электрод до приложения положительного потенциала. Отрицательный потенциал накопления увеличивает сбор ионов меди на электроде посредством миграции, тем самым дополнительно увеличивая их локальную концентрацию. Применение положительного потенциала после применения потенциала накопления обеспечивает еще более сильные токи и лучшую чувствительность.In some embodiments, a negative storage potential is applied to the working electrode prior to the application of a positive potential. The negative storage potential increases the collection of copper ions at the electrode through migration, thereby further increasing their local concentration. Applying a positive potential after applying an accumulation potential provides even higher currents and better sensitivity.
В некоторых вариантах реализации потенциал накопления составляет от -500 мВ до +0,0 мВ, в частности, от -500 мВ до -100,0 мВ.In some embodiments, the storage potential is from -500 mV to +0.0 mV, in particular from -500 mV to -100.0 mV.
В некоторых вариантах реализации отрицательный потенциал накопления прикладывают в течение по меньшей мере 10 мс, по меньшей мере 30 мс или по меньшей мере 50 мс.In some embodiments, the negative storage potential is applied for at least 10 ms, at least 30 ms, or at least 50 ms.
Скорость, при которой прикладывают потенциал накопления, не имеет особого значения. Скорость можно установить на некотором значении и поддерживать в течение определенного периода времени.The rate at which the accumulation potential is applied is not critical. The speed can be set at a certain value and maintained for a certain period of time.
Чувствительность определения концентрации ионов Cu (II) возрастает с увеличением значения скорости сканирования и/или значения (более отрицательного) потенциала накопления и/или продолжительности приложения потенциала накопления.The sensitivity of determining the concentration of Cu (II) ions increases with an increase in the scan rate and / or the value of the (more negative) storage potential and / or the duration of the application of the storage potential.
В некоторых вариантах реализации потенциал во время записи вольтамперограммы изменяют в диапазоне от -500 мВ до 800 мВ.In some embodiments, the potential during the recording of the voltammogram is varied in the range from -500 mV to 800 mV.
ПримерExample
Несколько нанопипеток получили с использованием лазерного пуллера Р-2000 (Sutter Instrument) из кварцевых капилляров с наружным диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 0,90 мм (Q120-90-7,5, Intracel). Для изготовления использовали следующие параметры: Heat 790, Filament 3, Velocity 45, Delay 130 и Pull 90.Several nanopipettes were prepared using a P-2000 laser puller (Sutter Instrument) from quartz capillaries with an outer diameter of 1.2 mm and an inner diameter of 0.90 mm (Q120-90-7.5, Intracel). The following parameters were used for manufacturing: Heat 790, Filament 3, Velocity 45, Delay 130 and Pull 90.
Каждую нанопипетку заполняли газообразным бутаном через трубку Tygon. Кварцевую трубку, соединенную с аргоновым резервуаром для обеспечения постоянного потока аргона, разрезали, чтобы покрыть кончик нанопипетки. Затем кончик нанопипетки нагревали с помощью бутановой горелки, чтобы вызвать пиролитическое разложение газообразного бутана с образованием в результате углеродной пробки внутри кончика нанопипетки.Each nanopipette was filled with butane gas through a Tygon tube. A quartz tube connected to an argon reservoir to provide a constant flow of argon was cut to cover the tip of the nanopipette. The tip of the nanopipette was then heated with a butane torch to cause pyrolytic decomposition of the butane gas resulting in a carbon plug inside the tip of the nanopipette.
После осаждения углерода внутреннюю поверхность углеродной пробки приводили в контакт с проволокой Ag/AgCl, формируя таким образом рабочий электрод. Рабочий электрод и другой электрод Ag/AgCl, действующий в качестве вспомогательного электрода/электрода сравнения, погружали в 2 мл 1 мМ раствора FeMeOH в PBS (забуференный фосфатом солевой раствор, рН которого составляет 7,4, полученный из 7,2 мМ Na2HPO4, 2,8 мМ KH2PO4 и 150 мМ NaCl). Оба электрода подключали к усилителю Axopatch 700B с цифровым преобразователем DigiData 1322A (Molecular Devices) и ПК с программным обеспечением pClamp 10 (Molecular Devices).After carbon deposition, the inner surface of the carbon plug was brought into contact with an Ag / AgCl wire, thus forming a working electrode. A working electrode and another Ag / AgCl electrode, acting as an auxiliary / reference electrode, were immersed in 2 ml of 1 mM FeMeOH solution in PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4, prepared from 7.2 mM Na 2 HPO 4 , 2.8 mM KH 2 PO 4 and 150 mM NaCl). Both electrodes were connected to an Axopatch 700B amplifier with a DigiData 1322A digital converter (Molecular Devices) and a PC with pClamp 10 software (Molecular Devices).
Потенциал рабочего электрода линейно изменяли циклически. Продолжительность одного цикла составляла 10 с. На фиг. 1 представлена полученная вольт-амперная характеристика рабочего электрода. Величина плато при положительном потенциале указывает на установившийся ток, при этом кажущийся радиус углеродной пробки составляет примерно 20 нм (подробности методики расчета см. в Actis P. et al.//ACS Nano 8, pp. 875-884).The potential of the working electrode was linearly changed cyclically. The duration of one cycle was 10 s. FIG. 1 shows the obtained volt-ampere characteristic of the working electrode. The plateau value at positive potential indicates steady-state current, with the apparent radius of the carbon plug being about 20 nm (see Actis P. et al. // ACS Nano 8, pp. 875-884 for details of the calculation method).
После осаждения углерода вытравливали полость в углеродной пробке путем погружения электрода в раствор 0,1 М NaOH, 10 мМ KCl и применения 40 циклов положительного напряжения до 2,1 мВ в течение 10 с каждый. На фиг. 2 представлена вольт-амперная характеристика в процессе травления углеродной пробки. На фиг. 3 представлена вольт-амперная характеристика наноэлектрода с полостью. После травления ток уменьшался в положительной части потенциала и увеличивался в отрицательной части потенциала, свидетельствуя об изменении формы наноэлектрода с диска на трубку.After carbon deposition, the cavity in the carbon plug was etched by immersing the electrode in a solution of 0.1 M NaOH, 10 mM KCl and applying 40 cycles of positive voltage up to 2.1 mV for 10 seconds each. FIG. 2 shows the current-voltage characteristic in the process of etching a carbon plug. FIG. 3 shows the current-voltage characteristic of a nanoelectrode with a cavity. After etching, the current decreased in the positive part of the potential and increased in the negative part of the potential, indicating a change in the shape of the nanoelectrode from disk to tube.
На следующей стадии пленку из золота электрохимически осаждали на поверхности углеродного наноэлектрода путем погружения наноэлектрода в 10 мМ раствор HAuCl4·Н2О и приложения напряжения. На фиг. 4 представлена вольт-амперная характеристика процесса осаждения. Первоначальное осаждение золота происходило в полости, на что указывает медленное изменение тока, поскольку область взаимодействия поверхности золота с раствором остается неизменной. Затем началось увеличение лавинного тока, которое свидетельствует о том, что полость полностью заполнена и золото осаждается внеAt the next stage, a gold film was electrochemically deposited on the surface of a carbon nanoelectrode by immersing the nanoelectrode in a 10 mM HAuCl 4 · H 2 O solution and applying a voltage. FIG. 4 shows the current-voltage characteristic of the deposition process. The initial deposition of gold occurred in the cavity, which is indicated by a slow change in the current, since the region of interaction of the gold surface with the solution remains unchanged. Then an increase in the avalanche current began, which indicates that the cavity is completely filled and gold is deposited outside
- 6 037290 полости. На этой стадии электрохимическое осаждение остановили, чтобы предотвратить образование электрода микроразмера.- 6 037290 cavities. At this stage, electrochemical deposition was stopped to prevent the formation of a micro-sized electrode.
На фиг. 5 представлена вольт-амперная характеристика наноэлектрода после осаждения золота. Как видно, ток при положительных потенциалах значительно увеличился, что свидетельствует о существенном увеличении размера электрода из-за осаждения твердого золота в протравленной полости. Данный вывод подтверждается также увеличением тока кислорода при отрицательных потенциалах.FIG. 5 shows the current-voltage characteristic of the nanoelectrode after gold deposition. As can be seen, the current at positive potentials increased significantly, which indicates a significant increase in the size of the electrode due to the deposition of solid gold in the etched cavity. This conclusion is also confirmed by an increase in the oxygen current at negative potentials.
На фиг. 6 представлена вольт-амперная характеристика наноэлектрода после осаждения золота, зарегистрированная при различных концентрациях ионов меди в PBS. Режим приложения напряжения был таким же, как на фиг. 7, как описано ниже.FIG. 6 shows the current-voltage characteristic of the nanoelectrode after gold deposition, recorded at various concentrations of copper ions in PBS. The voltage application mode was the same as in FIG. 7 as described below.
На следующей стадии хелатирующее медь соединение иммобилизовали на поверхности золота, поместив наноэлектрод, полученный на предыдущей стадии, в раствор 10-3 М пептида глицил-Lгистидил-Ь-лизин в этаноле на одну ночь. Структурная формула пептида глицил-Ь-гистидил-Ьлизин представлена ниже.In the next step, the copper chelating compound was immobilized on the gold surface by placing the nanoelectrode obtained in the previous step in a solution of 10 -3 M glycyl-L-histidyl-L-lysine peptide in ethanol overnight. The structural formula of the peptide glycyl-L-histidyl-Lysine is presented below.
HN^NHN ^ N
ОABOUT
На фиг. 7 представлены вольтамперограммы полученного наноэлектрода для определения меди, записанные при различных концентрациях ионов Cu2+. Каждый цикл на фиг. 7, а также на фиг. 6 состоял из нескольких стадий. На первой стадии медленно уменьшающийся отрицательный потенциал прикладывали к наноэлектроду до тех пор, пока потенциал не достигал -500 мВ относительно электрода сравнения. На данной стадии хелатирующий агент меди собирал ионы Cu2+. На второй стадии потенциал быстро увеличивали до 800 мВ. На второй стадии увеличение потенциала от 0 до 800 мВ, которое произошло за 4 мс (скорость сканирования 200 В/с), привело к восстановлению ионов Cu2+ до ионов Cu+. Указанный переход соответствует максимуму на вольтамперограммах при примерно 500 мВ. На третьей стадии потенциал быстро уменьшали с 800 мВ до 0. Продолжительность полного цикла составляла 60 мс.FIG. 7 shows voltammograms of the obtained nanoelectrode for the determination of copper, recorded at various concentrations of Cu 2+ ions . Each cycle in FIG. 7 and also in FIG. 6 consisted of several stages. In the first stage, a slowly decreasing negative potential was applied to the nanoelectrode until the potential reached -500 mV relative to the reference electrode. At this stage, the copper chelating agent collected the Cu 2+ ions . In the second stage, the potential was rapidly increased to 800 mV. At the second stage, an increase in the potential from 0 to 800 mV, which occurred in 4 ms (scanning rate of 200 V / s), led to the reduction of Cu 2+ ions to Cu + ions. This transition corresponds to a maximum in voltammograms at about 500 mV. In the third stage, the potential was rapidly reduced from 800 mV to 0. The full cycle time was 60 ms.
Сравнение фиг. 7 с фиг. 6 (наноэлектрод без хелатирующего агента меди) показывает, что нанесение хелатирующего медь соединения на поверхность металла значительно повышает чувствительность наноэлектрода по отношению к ионам Cu2+ при низких концентрациях.Comparison of FIG. 7 with FIG. 6 (nanoelectrode without copper chelating agent) shows that the deposition of a copper chelating compound on the metal surface significantly increases the sensitivity of the nanoelectrode to Cu 2+ ions at low concentrations.
Кроме того, на фиг. 7 показано, что ток, связанный с восстановлением ионов меди, может быть точно измерен в присутствии других ионов в растворе, что демонстрирует селективность наноэлектрода в отношении меди.In addition, in FIG. 7 shows that the current associated with the reduction of copper ions can be accurately measured in the presence of other ions in solution, demonstrating the selectivity of the nanoelectrode for copper.
Полученный наноэлектрод для определения меди использовали для измерения концентрации ионов меди внутри клеток MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека). Для позиционирования наноэлектрода использовали микроманипулятор. Концентрация ионов меди была определена до и после воздействия на клетки биядерных комплексов Си, описанных в J. Med. Chem. 57, pp. 6252-6258. Начальная концентрация ионов меди внутри клеток составляла 6±2 мкМ. После инкубации клеток биядерными комплексами Си 9 мкМ концентрация внутри клеток увеличилась до 220±30 мкМ.The obtained nanoelectrode for the determination of copper was used to measure the concentration of copper ions inside MCF-7 cells (human breast adenocarcinoma). A micromanipulator was used to position the nanoelectrode. The concentration of copper ions was determined before and after exposure of cells to binuclear Cu complexes described in J. Med. Chem. 57, pp. 6252-6258. The initial concentration of copper ions inside the cells was 6 ± 2 μM. After incubation of the cells with 9 μM Cu binuclear complexes, the concentration inside the cells increased to 220 ± 30 μM.
Claims (32)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2015/000958 WO2017116267A1 (en) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | A nanoelectrode for detecting cu(ii) ions and a method of producing and using thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201891540A1 EA201891540A1 (en) | 2019-01-31 |
| EA037290B1 true EA037290B1 (en) | 2021-03-04 |
Family
ID=59225939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201891540A EA037290B1 (en) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | NANOELECTRODE FOR DETECTING Cu(II) IONS AND METHOD OF PRODUCING AND USING A NANOELECTRODE |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA037290B1 (en) |
| WO (1) | WO2017116267A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113791129A (en) * | 2021-08-23 | 2021-12-14 | 广州大学 | Copper ion electrochemiluminescence detection electrode, detector, preparation method and application thereof |
| CN114636739B (en) * | 2022-03-07 | 2024-04-16 | 西北工业大学 | Method for detecting copper ions in ultra-trace mode of solid-state multi-nanopore based on tripeptide modification |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200444B1 (en) * | 1996-03-29 | 2001-03-13 | Institut Fuer Chemo Und Biosensorik Muenster E.V. | Cation-selective sensor |
| US20090288962A1 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Battelle Memorial Institute | Electrochemical Sensor and Methods for Making and Using Same |
| RU2399040C1 (en) * | 2009-07-09 | 2010-09-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Дагестанский государственный университет | Copper-selective electrode membrane |
| US20110027913A1 (en) * | 2007-02-06 | 2011-02-03 | Bau Haim H | Multiplexed nanoscale electrochemical sensors for multi-analyte detection |
| WO2012104429A1 (en) * | 2011-02-04 | 2012-08-09 | Ecole Polytechnique | Nanosensor for capturing charged molecules by using in situ stripping voltammetry |
-
2015
- 2015-12-30 EA EA201891540A patent/EA037290B1/en unknown
- 2015-12-30 WO PCT/RU2015/000958 patent/WO2017116267A1/en active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200444B1 (en) * | 1996-03-29 | 2001-03-13 | Institut Fuer Chemo Und Biosensorik Muenster E.V. | Cation-selective sensor |
| US20110027913A1 (en) * | 2007-02-06 | 2011-02-03 | Bau Haim H | Multiplexed nanoscale electrochemical sensors for multi-analyte detection |
| US20090288962A1 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Battelle Memorial Institute | Electrochemical Sensor and Methods for Making and Using Same |
| RU2399040C1 (en) * | 2009-07-09 | 2010-09-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Дагестанский государственный университет | Copper-selective electrode membrane |
| WO2012104429A1 (en) * | 2011-02-04 | 2012-08-09 | Ecole Polytechnique | Nanosensor for capturing charged molecules by using in situ stripping voltammetry |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017116267A1 (en) | 2017-07-06 |
| EA201891540A1 (en) | 2019-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3093274B2 (en) | Gas concentration measurement method and micromachining detection device for implementing the method | |
| Goyal et al. | Electrochemical sensor for the determination of dopamine in presence of high concentration of ascorbic acid using a fullerene‐C60 coated gold electrode | |
| Gao et al. | Wireless nanopore electrodes for analysis of single entities | |
| Sun et al. | Simultaneous determination of epinephrine and ascorbic acid at the electrochemical sensor of triazole SAM modified gold electrode | |
| Saturno et al. | Electroanalytical detection of Pb, Cd and traces of Cr at micro/nano-structured bismuth film electrodes | |
| Lahcen et al. | Laser-scribed graphene sensor based on gold nanostructures and molecularly imprinted polymers: Application for Her-2 cancer biomarker detection | |
| JPH06105262B2 (en) | Method and apparatus for electrochemical measurement and simultaneous measurement of tunnel current | |
| US20090270266A1 (en) | Method for Electrocatalytic Protein Detection | |
| Chen et al. | Electrochemical immunosensor for serum parathyroid hormone using voltammetric techniques and a portable simulator | |
| Madasamy et al. | A miniaturized electrochemical assay for homocysteine using screen-printed electrodes with cytochrome c anchored gold nanoparticles | |
| Li et al. | Ultrasensitive and facile electrochemical detection of hydrogen sulfide in rat brain microdialysate based on competitive binding reaction | |
| EA037290B1 (en) | NANOELECTRODE FOR DETECTING Cu(II) IONS AND METHOD OF PRODUCING AND USING A NANOELECTRODE | |
| Chang et al. | Recent Advances in Nanosensors Built with Pre-Pulled Glass Nanopipettes and Their Applications in Chemical and Biological Sensing | |
| Josypčuk et al. | Screen-printed amalgam electrodes | |
| Samanman et al. | Novel template-assisted fabrication of porous gold nanowire arrays using a conductive-layer-free anodic alumina oxide membrane | |
| Tang et al. | Single mercury nanoelectrode: Single nucleus growth on Au nanoelectrode and its sensing application | |
| Kumbhat et al. | Functionalized surface for electrochemical sensing of electrochemically inactive alkali metal ion | |
| US20180011054A1 (en) | Metal ion detection method, test substance detection method | |
| Zhao et al. | A simple and convenient electrochemiluminescence immunoassay by using gold nanoparticles as both label and co-reactant | |
| CN107870188B (en) | Detection kit, preparation method thereof, analysis system containing detection kit, and applications of detection kit and analysis system | |
| Willander et al. | ZnO nanorods as an intracellular sensor for pH measurements | |
| Qi et al. | Electroless deposition of gold nanoparticles on carbon nanopipette electrode for electrochemical detection of catecholamines released from PC12 cells | |
| Zhai et al. | Real-time calcium uptake monitoring of a single renal cancer cell based on an all-solid-state potentiometric microsensor | |
| Zhai et al. | Development of carcinoembryonic antigen rapid detection system based on platinum microelectrode | |
| US20230041136A1 (en) | Sensing of molecules by electrochemical detection of nanoparticles |