EA032773B1 - Растения solanum lycopersicum, имеющие нетрансгенные изменения в гене acs2 - Google Patents

Растения solanum lycopersicum, имеющие нетрансгенные изменения в гене acs2 Download PDF

Info

Publication number
EA032773B1
EA032773B1 EA201590981A EA201590981A EA032773B1 EA 032773 B1 EA032773 B1 EA 032773B1 EA 201590981 A EA201590981 A EA 201590981A EA 201590981 A EA201590981 A EA 201590981A EA 032773 B1 EA032773 B1 EA 032773B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
acs2
protein
mutant
wild
plant
Prior art date
Application number
EA201590981A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590981A1 (ru
Inventor
Хендрик Виллем Вризен
Original Assignee
Нунхемс Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нунхемс Б.В. filed Critical Нунхемс Б.В.
Publication of EA201590981A1 publication Critical patent/EA201590981A1/ru
Publication of EA032773B1 publication Critical patent/EA032773B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/825—Solanum lycopersicum [tomato]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y404/00—Carbon-sulfur lyases (4.4)
    • C12Y404/01—Carbon-sulfur lyases (4.4.1)
    • C12Y404/01014—1-Aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (4.4.1.14)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum, содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной функцией по сравнению с белком Acs2 дикого типа.

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений и селекции растений. Изобретение относится к растениям Solanum lycopersicum, содержащим аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной активностью по сравнению с белком Acs2 дикого типа. Изобретение относится к растениям, плоды которых демонстрируют более низкую продукцию этилена, и/или более медленное созревание плода, и/или больший срок годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа. Кроме того, изобретение относится к плоду томата, семенам, пыльце, частям растений и потомству растений Solanum lycopersicum по изобретению. Кроме того, изобретение относится к пище и пищевым продуктам, содержащим или состоящим из плодов растений по изобретению.
Изобретение дополнительно относится к эндогенному гену acs2 и белку acs2, кодируемому указанным геном, содержащим по меньшей мере одну антропогенную нетрансгенную мутацию.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам получения растений томата, содержащих в своем геноме один или несколько мутантных аллелей acs2.
Предпосылки изобретения
Селекция Solanum lycopersicum направлена на получение коммерческих сортов, оптимально адаптированных к условиям выращивания и хранения. Задачей, с которой сталкиваются селекционеры, является нахождение улучшенного баланса между твердостью плода после сбора урожая и желаниями потребителей, касающимися вкуса, текстуры и цвета. Эти желания потребителей относятся строго к созреванию плода. Созревание плода является комплексным процессом развития, ответственным за трансформацию органа, содержащего семена, в ткань, привлекательную для распространителей семян и сельскохозяйственных потребителей. Изменения, связанные с созреванием плода, в частности размягчение после сбора урожая, ограничивают срок годности свежих томатов.
Для роста и развития плодов томата можно различать ряд последовательных фаз: развитие цветка, опыление, затем происходит раннее развитие плода, отличающееся высокой частотой деления клеток, и плод быстро увеличивается в размере, в основном, за счет роста клеток. В конце третьей фазы плод достигает стадии зеленовато-бурой окраски плода. В течение четвертой фазы происходит созревание плода, отличающееся изменением цвета и вкуса, а также твердости и текстуры плода.
Усиление характерной красной окраски плода томата вызвано накоплением ликопина и каротина. В целом, выделяют различные фазы окрашивания: зеленовато-бурую, бурую, розовую и красную. На стадии бурой окраски плода начинается типичная красная пигментация. Стадия полной спелости или стадия полностью спелого собранного плода является стадией, на которой плод достигает своей зрелой окраски на большей части плода.
В дополнение к изменениям окраски, в течение созревания плода ферментативная активность приводит к деградации средней ламеллярной области стенок клеток, что приводит к разрыхлению клеток, проявляющемуся в виде размягчения и утраты текстуры плода. Размягчение плода часто измеряют как внешнее сопротивление сжатию, которое можно количественно определять, например, с помощью пенетрометра.
Модификация отдельных генов, о которых известно, что они участвуют в созревании, пока не привела к получению плода с нормальным созреванием, но минимальным размягчением тканей.
Созревание и увядание климактерических плодов, таких как томаты, стимулирует этилен. Этилен является аутокаталитическим для своего собственного биосинтеза благодаря повышению синтазы (ACS) 1-аминоциклопропан-1-кабоновой кислоты (АСС) и оксидазы АСС (АСО). ACS также обозначают как 1аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтаза; Le-ACS или S-аденозил-Б-метионин метилтиоаденозинлиаза. Таким образом, повышение количества ACS и АСО приводит к повышенному преобразованию Lметионина в этилен. В томатах идентифицировали по меньшей мере восемь генов ACS (LEACS1A, LEACS 1B и LEACS2-7) (Alexander et. al., Journal of Experimental Botany, vol. 53, No 377, pp. 2039-2055, 2002), и каждая ACS имеет разный профиль экспрессии.
Синтаза АСС (ACS) является ферментом, катализирующим синтез 1-аминоциклопропан-1карбоновой кислоты (АСС) из S-аденозилметионина. Затем АСС преобразуется в этилен, что катализируется АСО. Биосинтез этилена описывают, например, Stearns и Glick (Biotechnology Advances 2003, vol 21 pp 193-210), что включено в настоящее описание в качестве ссылки.
ACS принадлежит к α-семейству пиридоксаль-5'-фосфат (PLP)-зависимых ферментов и имеет умеренный уровень сходства с другими членами этого семейства, такими как аспартатаминотрансфераза (AATase) и тирозинаминотрансфераза (TATase). Структура ACS из различных источников описана Capitani et al. При выравнивании последовательностей восьми белков ACS (Maluss domestica, Phaseolus aureus, Solanum tuberosum, Pelargonium hortorum, Nicotiana tabacum, Cucumis melo, Lycopersicon esculentum и Brassica oleracea) они описывают консервативные области, указанные на фиг. 1 в этой публикации Capitani. (Capitani et al., Journal of Molecular Biology, 1999, vol. 294, pp. 745-756).
Предложены две системы, функционирующие в климактерических растениях, регулирующие продукцию этилена. Первая является функциональной в течение нормального вегетативного роста (система 1); она является аутоингибиторной и отвечает за продукцию базальных уровней этилена, определяемых
- 1 032773 во всех тканях, включая таковые у неклимактерических растений. Система 1 продолжает функционировать в течение развития плода до достижения способности к созреванию плода. Затем достигается переходный период, когда активируются LEACS1A и LEACS4, что приводит к повышенному уровню этилена. Этот повышенный уровень этилена индуцирует экспрессию LEACS2, запускающей систему 2, активную в течение созревания климактерического плода. В системе 2 продукция этилена является аутокаталитической. Эту многокомпонентность регуляции этилена исследуют с использованием антисмыслового ингибирования LEACS2 в трансгенных растениях (Barry et al., Plant Physiology vol. 123, pp. 979-986, 2000).
В WO 2005/016504 описывают stay green растения, т.е. фенотип растений, у которых увядание листьев замедлено по сравнению со стандартом. В нем описывают растения с нарушениями в генах ACS2, ACS6, ASC7, что ингибирует экспрессию или активность указанных ACS.
Yokotani et al. описывают трансгенные томаты со всеми известными генами LeEIL (этиленнечувствительными генами), супрессированными для исследования механизмов регуляции биосинтеза этилена (Yokotani et al, Journal of Experimental Botany, vol. 60, pp. 3433-3442, 2009).
Известны мутанты по ACS2, например из Vijee Mohan et al. Они описывают (Vijee Mohan et al. Sol 2010, page 67 http://www.sol2010.org/sol2010/files/file/SOL2010_Abstracts.pdf) EcoTILLING у томата, где разнообразие нуклеотидных последовательностей используют как меру наследственной изменчивости, присутствующей у вида, в частности, однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) используют для представления наиболее распространенных вариаций в геноме. EcoTILLING используют как способ с высокой производительностью и низкой стоимостью для быстрого обнаружения полиморфизмов в природных популяциях с помощью гетеродуплексного анализа с использованием мисматч-специфичной эндонуклеазы. Коллекцию образцов томата получали из различных источников, таких как NBPGR (India), IIVR (India) и TGRC (California, USA) и анализировали по частоте природных SNP, среди прочего, в ACS2. Для различных генов определяли ряд SNP, но с различной частотой. Морфологические черты на различных стадиях развития и хемотипические наблюдения свидетельствовали о широком разнообразии среди образцов. Предполагают, что корреляции между этими вариантами и локализацией SNP применимы в поиске перспективных аллелей для разработки сельскохозяйственных культур.
Исследования на плодах трансгенных томатов (мутантов по ACS2), в которых подавляли продукцию этилена (Oeller et al, 1991 Science, vol. 254, pp. 437-439); (Picton et al. 1993 The Plant Journal vol. 3 pp. 469-481), показали замедленное созревание плода и критическую роль этилена в созревании плода.
В WO 92/04456 описывают контроль характеристик развития растений, на которые влияет этилен, у томата и цукини, среди прочего, с помощью рекомбинантной продукции ACS и использования антисенстехнологии или мутантных генов ACS.
Несмотря на изложенное выше, к настоящему времени не обнаружены применимые аллели для улучшения созревания плодов томата.
Таким образом, существует потребность в культивируемых растениях томата с модифицированной продукцией этилена, имеющих замедленное созревание и/или больший срок годности плодов томата по сравнению с растениями томата дикого типа.
Сущность изобретения
Таким образом, целью изобретения является получение и идентификация культивируемых растений вида Solanum lycopersicum, имеющих плоды с замедленным созреванием и/или большим сроком хранения плодов.
Таким образом, изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum, содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2, где указанный мутантный белок acs2 содержит одну или несколько заменен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y в SEQ ID NO: 1 или в белке Acs2 дикого типа, имеющем по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1, т.е. в варианте SEQ ID NO: 1 (описываемом ниже).
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к растению по изобретению, где указанная мутация приводит к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной функцией по сравнению с белком Acs2 дикого типа, где указанный белок Acs2 дикого типа является белком, имеющим по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1, и где указанный мутантный белок acs2 имеет достаточную функцию, чтобы приводить к созреванию плодов томата до стадии полной спелости, когда мутантный аллель присутствует в гетерозиготной или гомозиготной форме.
Общие определения
Термин последовательность нуклеиновой кислоты (или молекула нуклеиновой кислоты) относится к молекуле ДНК или РНК в одноцепочечной или двуцепочечной форме, в частности, ДНК, кодирующей белок или фрагмент белка по изобретению. Термин выделенная последовательность нуклеиновой кислоты относится к последовательности нуклеиновой кислоты, уже не содержащейся в природной среде, из которой ее выделяли, например, последовательности нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке-хозяине или в растительном ядерном или пластидном геноме.
- 2 032773
Термины белок или полипептид используют взаимозаменяемо, и они относятся к молекулам, состоящим из цепи аминокислот, без упоминания конкретного механизма действия, размера, 3-мерной структуры или происхождения. Таким образом фрагмент или часть белка Acs2 все равно можно обозначать как белок. Термин выделенный белок используют для обозначения белка, уже не содержащегося в природной среде, например, in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине.
Термин ген означает последовательность ДНК, содержащую область (транскрибируемую область), транскрибируемую в молекулу РНК (например, молекулу мРНК, hpRNA или РНКи) в клетке, функционально связанную с подходящими регуляторными областями (например, промотором). Таким образом, ген может содержать несколько функционально связанных последовательностей, таких как промотор, 5'-лидерная последовательность, содержащая, например, последовательности, участвующие в инициации трансляции, кодирующая (белок) область (кДНК или геномная ДНК) и 3'-нетранслируемую последовательность, содержащую, например, участки терминации транскрипции. Ген может являться эндогенным геном (в видах, из которых он происходит) или химерным геном (например, трансгеном или цис-геном).
Термин экспрессия гена относится к процессу, где область ДНК, функционально связанная с соответствующими регуляторными областями, в частности, промотором, транскрибируется в РНК, являющуюся биологически активной, т. е. способной транслироваться в биологически активный белок или пептид (или активный пептидный фрагмент) или самой являющейся активной (например, в посттрансляционном сайленсинге гена или РНКи). Кодирующая последовательность может находиться в смысловой ориентации и кодировать желаемый биологически активный белок или пептид, или активный пептидный фрагмент.
Активный белок или функциональный белок является белком, имеющим белковую активность, измеряемую in vitro, например, с помощью анализа активности in vitro, и/или in vivo, например, по фенотипу, придаваемому белком. Белок дикого типа является полностью функциональным белком, имеющим по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1 (также обозначаемым как вариант SEQ ID NO: 1). Аналогично, аллель Acs2 дикого типа является аллелем, кодирующим указанный белок дикого типа или вариант. В настоящем описании мутантный белок является белком, содержащим одну или несколько мутаций в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, при этом мутация приводит к образованию белка (мутантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок) со сниженной функцией или потерей функции, например, измеряемой in vivo, например, по фенотипу, придаваемому мутантным аллелем.
Термин белок acs2 со сниженной функцией или белок acs2 со сниженной активностью относится к мутантному белку acs2, имеющему сниженную каталитическую активность при синтезе АСС из Sаденозилметионина, приводящую к сниженному синтезу этилена по сравнению с белком Acs2 дикого типа. Указанная сниженная каталитическая активность белка acs2 влияет на характеристики созревания плодов, содержащих такой белок acs2 со сниженной функцией, когда аллель, кодирующий мутантный белок присутствует в растении томата в гомозиготной или гетерозиготной форме, т.е. замедленное созревание и/или больший срок годности плодов. Такой белок acs2 со сниженной функцией можно получать с помощью транскрипции и трансляции частично нокаутного мутантного аллеля acs2, являющегося, например, аллелем Acs2 дикого типа, содержащим одну или несколько мутаций в своей последовательности нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов такой частично нокаутный мутантный аллель acs2 является аллелем Acs2 дикого типа, содержащим одну или несколько мутаций, предпочтительно приводящим к продукции белка acs2, где по меньшей мере одну консервативную и/или функциональную аминокислоту заменяют другой аминокислотой таким образом, что значимо снижают, но не полностью устраняют биологическую активность. Однако другие мутации, такие как одна или несколько нонсенс-, миссенс-мутаций, мутаций в участке сплайсинга или мутаций со сдвигом рамки считывания, в аллеле Acs2 томата также могут приводить к сниженной функции белка acs2, и такие белки со сниженной функцией могут содержать одну или несколько аминокислот, замещенных, инсертированных или делетированных относительно белка ACS2 дикого типа. Такой частично нокаутный мутантный аллель acs2 также может кодировать доминантный негативный белок acs2, способный неблагоприятно влиять на биологическую активность других белков Acs2 в одной клетке. Такой доминантный негативный белок acs2 может являться белком Acs2, все еще способным взаимодействовать с теми же элементами, что и белок Acs2 дикого типа, но блокирующим какой-либо аспект его функции. Примерами доминантных негативных белков Acs2 являются белки acs2, в которых отсутствуют или присутствуют модификации в конкретных аминокислотных остатках, критичных для активации и/или димеризации, но все равно содержащих свой домен связывания, таким образом, что не только их биологическая активность снижается или устраняется, но дополнительно снижается общая активность acs2 в клетке в результате конкуренции за участки связывания с белками дикого типа и/или частично нокаутными белками acs2, присутствующими в клетке. Мутантные аллели могут являться природными мутантными аллелями, являющимися мутантными аллелями, обнаруживаемыми в природе (например, образующимися спонтанно без использования мутагенов человеком), или индуцированными мутантными аллелями, индуцируемыми вмеша
- 3 032773 тельством человека, например, посредством мутагенеза.
Термин белок Acs2 с потерей функции относится к мутантному белку Acs2, по существу, не имеющему каталитической активности при синтезе АСС из S-аденозилметионина по сравнению с белком Acs2 дикого типа, что приводит к сниженному синтезу этилена по сравнению с белком Acs2 дикого типа. Указанное отсутствие каталитической активности при синтезе влияет на характеристики созревания плодов, содержащих такой белок acs2 с потерей функции, если аллель, кодирующий мутантный белок, присутствует в гомозиготной или гетерозиготной форме в растении томата. Плоды растений томата, гомозиготных по такому белку acs2 с потерей функции, все равно могут продуцировать этилен, что катализируется другими белками (например, другими белками Acs, такими как AcslA или Acs4). В результате, плоды растений томата, гомозиготных по такому белку acs2 с потерей функции, все еще могут созревать, но созревание может являться замедленным, и/или срок годности может являться большим.
Мутация в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, является изменением одного или нескольких нуклеотидов по сравнению последовательностью дикого типа, например, заменой, делецией или инсерцией одного или нескольких нуклеотидов. Точечная мутация является заменой одного нуклеотида или инсерцией или делецией одного нуклеотида.
Нонсенс-мутация является (точечной) мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в результате которой кодон заменяется стоп-кодоном. Это приводит к преждевременному стоп-кодону, присутствующему в мРНК, и к образованию укороченного белка. Укороченный белок может иметь сниженную функцию или потерю функции.
Миссенс- или несинонимичная мутация является (точечной) мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в результате которой кодон заменяется таким образом, что он кодирует другую аминокислоту. Получаемый белок может иметь сниженную функцию или потерю функции.
Мутация в участке сплайсинга является мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в результате которой изменяется сплайсинг РНК из пре-мРНК, что приводит к образованию мРНК, имеющей иную нуклеотидную последовательность, и белка, имеющего иную аминокислотную последовательность, чем дикий тип. Получаемый белок может иметь сниженную функцию или потерю функции.
Мутация со сдвигом рамки считывания является мутацией в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в результате которой изменяется рамка считывания мРНК, что приводит к другой аминокислотной последовательности. Получаемый белок может иметь сниженную функцию или потерю функции.
Мутация в регуляторной последовательности, например, в промоторе гена, является изменением одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с последовательностью дикого типа, например, посредством замены, делеции или инсерции одного или нескольких нуклеотидов, что приводит, например, к снижению или отсутствию транскрипта мРНК получаемого гена.
Сайленсинг относится к понижающей регуляции или полному ингибированию экспрессии генамишени или семейства генов.
Целевой ген в подходах сайленсинга генов является геном или семейством генов (или одним или несколькими конкретными аллелями гена), эндогенная экспрессия которых регулируется понижающе или полностью ингибируется (подвергается сайленсингу), если экспрессируется химерный подвергнутый сайленсингу ген (или химерный ген РНКи), и, например, продуцируется осуществляющий сайленсинг транскрипт РНК (например, дцРНК или малые шпилечные РНК, способные осуществлять сайленсинг эндогенной экспрессии целевого гена). В подходах мутагенеза целевой ген является эндогенным геном, подвергаемым мутагенезу, что приводит к изменению (снижению или потере) экспрессии гена или изменению (снижению или потере) функции кодируемого белка.
Как применяют в настоящем описании, термин функционально связанный относится к связи полинуклеотидных элементов, находящихся в функциональной взаимосвязи. Нуклеиновая кислота является функционально связанной, когда ее помещают в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор, или, точнее, регулирующая транскрипцию последовательность, является функционально связанной с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Термин функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК, как правило, являются смежными, а при необходимости соединения двух областей, кодирующих белок, являются смежными и находящимися в рамке считывания таким образом, что продуцируется химерный белок. Химерный белок или гибридный белок является белком, состоящим из различных белковых доменов (или мотивов), не обнаруживаемых в таком виде в природе, но соединенным для образования функционального белка, демонстрирующего функциональность соединенных доменов. Химерный белок также может являться слитым белком из двух или более белков, встречающихся в природе.
Термин пища означает любое вещество, потребляемое для обеспечения нутритивной поддержки организма. Как правило, она имеет растительное или животное происхождение и содержит необходимые питательные вещества, такие как углеводы, жиры, белки, витамины или минералы. Вещество потребля
- 4 032773 ется организмом и поглощается клетками организма с целью продукции энергии, поддержания жизни или стимуляции роста. Термин пища включает вещество, потребляемое для обеспечения нутритивной поддержки организма человека и животного.
Термин срок годности или срок годности после сбора урожая обозначает (среднюю) длительность времени, которое дают плоду до того, как признать его неподходящим для продажи или потребления (испорченным или на стадии порчи). Срок годности является периодом времени, в течение которого можно хранить продукты, в течение которого определяемое качество конкретной доли продуктов остается приемлемым в ожидаемых условиях распределения, хранения и нахождения на витрине. На срок годности влияет несколько факторов: воздействие света и температуры, транспорт газов (включая влажность), механические воздействия и контаминация, например, микроорганизмами. Качество продуктов часто математически моделируют по параметру твердости/мягкости плода. Срок годности можно определять как (среднее) время, которое необходимо плодам линии растений, чтобы начать становится испорченными и неподходящими для продажи или потребления, например, начиная с того момента, когда первый плод растений входит в стадию бурой окраски плода, или с момента переходной стадии или с того момента, когда первый плод становится полностью красным, или со времени сбора урожая. В одном из вариантов осуществления мутанты по изобретению имеют срок годности, значимо больший, чем срок годности растений дикого типа, например, количество дней с того момента, как первый плод входит в стадию бурой окраски плода (или переходную стадию, стадию розовой окраски, стадию полной спелости или с момента сбора урожая), до того, как первый плод начинает становиться испорченным и неподходящим для продажи или потребления, является значимо большим, например, по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней больше, чем у плодов контрольных растений (таких как растения с Acs2/Acs2 дикого типа), когда растения выращивают в тех же условиях, и плоды обрабатывают тем же способом и хранят в тех же условиях. Таким образом, для определения необходимого количества дней от конкретной стадии (например, от стадии бурой окраски плода или более поздней стадии) до стадии порчи день, когда первый плод контрольного растения дикого типа (выращиваемого в тех же условиях, что и мутантные растения, и находящегося на той же стадии развития) входит в конкретную стадию (например, стадию бурой окраски плода или более позднюю стадию), например, можно принимать за начальную точку (день 1), начиная с которой плоды периодически обследуют (через конкретные интервалы времени, например, через 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней), до дня, когда первый плод проходит стадию полного созревания и становится испорченным (что определяют визуально и/или посредством оценки мягкости плода).
В настоящей заявке слова улучшенный, повышенный, больший и пролонгированный, как применяют в комбинации с выражением срок годности, являются взаимозаменяемыми, и все из них означают, что плоды растения томата по изобретению, в среднем, имеют больший срок годности, чем контрольные плоды (плоды Acs2/Acs2), такие как Pusa Sheetal, Тара или TPAADASU.
Замедленное созревание означает, что плодам растения томата или линии растений (например, мутанта) по изобретению, в среднем, необходимо значимо больше дней для достижения стадии полной спелости от стадии зеленовато-бурой окраски, бурой окраски, переходной стадии и/или стадии розовой окраски созревания плода томата по сравнению с контрольными плодами дикого типа растений, гомозиготных по аллелю Acs2 дикого типа (Acs2/Acs2). Замедленное созревание можно измерять на растении и/или после сбора урожая как дни, необходимые для конкретной процентной доли плодов (например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и/или 100% плодов) для достижения стадии полной спелости. Растение указывают как имеющее фенотип замедленного созревания, если достижение стадии полной спелости занимает по меньшей мере на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 дней больше для 10, 20, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90 и/или 100% плодов, чем занимает достижение той же процентной доли красных плодов у контрольных плодов дикого типа. Следует понимать, что в настоящее описание включают каждую комбинацию указанного выше количества дней (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) для достижения стадии полной спелости с каждой % плодов (т.е. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и/или 100%) для замедленного созревания, измеряемого на растениях и после сбора урожая. Например, если достижение стадии полной спелости занимает по меньшей мере на 2 дня больше для 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и/или 100% плодов, чем развитие той же процентной доли красных плодов у контрольных плодов дикого типа. Другим примером того, как можно измерять замедленное созревание у растений и/или после сбора урожая, является то, что оно занимает по меньшей мере на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 дней больше для 100% плодов для достижения стадии полной спелости, чем развитие той же процентной доли красных плодов у контрольных плодов дикого типа. День, когда первый плод контрольного растения дикого типа (выращиваемого в тех же условиях, что и мутантные растения, и находящегося на той же стадии развития) входит в конкретную стадию (например, стадию бурой окраски плода), например, можно принимать за начальную точку (день 1), начиная с которой периодически подсчитывают (через конкретные интервалы времени (например, через 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней)) количество плодов, находящихся на стадии бурой окраски плода, и количество плодов, находящихся на стадии полной спелости, для линии мутантных растений и контрольных растений (см. примеры).
В настоящей заявке слово увядание означает биологическое старение, т.е. изменение в биологии
- 5 032773 организма, происходящее с его старением после созревания.
Как применяют в настоящем описании, термин сниженная продукция этилена относится к статистически значимо сниженному количеству этилена, продуцируемого плодами томата по изобретению (по сравнению с плодами Acs2/Acs2 дикого типа) при созревании плода, например, на стадии розовой окраски, и/или на стадии светло-красной окраски и/или на стадии полной спелости, как описано в примерах, и как определяют с помощью измерений этилена в реальном времени. В одном из вариантов осуществления уровни этилена значимо снижены на всем протяжении созревания плода со стадии розовой окраски до стадии полной спелости.
Следует понимать, что сравнение различных линий растений включает выращивание ряда растений линии (например, по меньшей мере 5 растений, предпочтительно по меньшей мере 10 растений на линию) в тех же условиях, что растения одной или нескольких контрольных линий растений (предпочтительно растений дикого типа), и определение статистически значимых различий между линиями растений, выращиваемых в тех же условиях окружающей среды.
Задержка стадии бурой окраски плода относится к мутантам по изобретению, которым необходимо значимо больше дней, чем контролям дикого типа, для вхождения первых плодов и/или всех плодов в стадию бурой окраски плода, например, по меньшей мере на 1 день больше, предпочтительно по меньшей мере на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней больше, чем контролю дикого типа при выращивании в тех же условиях.
Стадии созревания плода томата можно разделять следующим образом: (1) стадия зеленоватобурой окраски плода: поверхность является полностью зеленой; оттенки зеленого могут варьироваться от светлых до темных. (2) Стадия бурой окраски плода: существует определенный разрыв в цвете от зеленого до желтовато-коричневого, розового или красного не более чем на 10% поверхности; (3) переходная стадия: от 10 до 30% поверхности не является зеленой; в совокупности, наблюдают определенное изменение от зеленой до желтовато-коричневой, розовой, красной окраски или их комбинации. (4) Стадия розовой окраски: от 30 до 60% поверхности не является зеленой; в совокупности, наблюдают розовую или красную окраску. (5) Стадия светло-красной окраски: от 60 до 90% поверхности не является зеленой; в совокупности наблюдают розово-красную или красную окраску. (6) Стадия полной спелости: более 90% поверхности не является зеленой; в совокупности, наблюдают красную окраску.
Идентичность последовательности и сходство последовательности можно определять с помощью выравнивания двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритмов глобального или локального выравнивания. Затем последовательности можно обозначать как по существу, идентичные или по существу, схожие, если их оптимально выравнивают, например, с помощью программ GAP или BESTFIT или программы Emboss Needle (с использованием параметров по умолчанию, см. ниже), они обладают, по меньшей мере, конкретной минимальной процентной долей идентичности последовательности (как определено ниже). В этих программах используют алгоритмы глобального выравнивания Needleman и Wunsch для выравнивания двух последовательностей по всей их длине, максимизируя количество совпадений и минимизируя количество пропусков. Как правило, используют параметры по умолчанию со штрафом за пропуск = 10 и штрафом за удлинение пропуска = 0,5 (для нуклеотидного и белкового выравнивания). В случае нуклеотидов используемой матрицей замен по умолчанию является DNAFULL, и в случае белков матрицей замен по умолчанию является Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Выравнивание последовательностей и подсчет процентной доли идентичности последовательностей, например, можно осуществлять с использованием компьютерных программ, таких как EMBOSS (http://www. ebi.ас.uk/Tools/psa/emboss needle/).
Альтернативно, сходство или идентичности последовательностей можно определять с помощью поиска в базах данных, таких как FASTA, BLAST и т.д., но совпадения необходимо находить и выравнивать попарно для сравнения идентичности последовательности. Два белка, или два белковых домена, или две последовательности нуклеиновой кислоты имею значительную идентичность последовательности, если процентная доля идентичности последовательностей составляет по меньшей мере 85, 90, 95, 98, 99% или более (например, по меньшей мере 99,1, 99,2 99,3 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 или более (как определяют с помощью Emboss needle с использованием параметров по умолчанию, т.е. штрафа за пропуск = 10, штрафа за удлинение пропуска = 0,5, с использованием матрицы замен DNAFULL в случае нуклеиновых кислот и Blosum62 - в случае белков).
В настоящем описании и формуле изобретения глагол содержать и его спряжения используют в неограничивающем смысле с тем значением, что включены пункты после слова, но не исключены пункты, указанные конкретно. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности того, что присутствуют несколько элементов, если контекст четко не указывает на один и только один из элементов. Таким образом, единственное число, как правило, означает по меньшей мере один. Кроме того, следует понимать, что при ссылке на последовательности в настоящем описании, как правило, ссылаются на конкретные физические молекулы с конкретной последовательностью субъединиц (например, аминокислот).
Как применяют в настоящем описании, термин растение включает целое растение или любые его части или производные, такие как органы растений (например, собранные или несобранные плоды, цве
- 6 032773 ты, листья и т.д.), растительные клетки, растительные протопласты, культуры растительных клеток или тканей, из которых можно восстанавливать целые растения, регенерируемые или нерегенерируемые растительные клетки, растительный каллюс, группы растительных клеток и растительные клетки, являющиеся интактными в растениях, или части растений, такие как эмбрионы, пыльца, семязачатки, завязи, плоды (например, собранные ткани или органы, такие как собранные томаты, или их части), цветы, листья, семена, клубнеплоды, клонально выращиваемые растения, корни, стебли, семядоли, гипокотили, корневые кончики и т.п. Также включена любая стадия развития, такая как саженец, незрелая и зрелая и т.д.
Термин линия растений или селекционная линия относится к растению и его потомству. Как применяют в настоящем описании, термин инбредная линия относится к линии растений, повторно самоопыляемой.
Сорт растений является группой растений внутри одного ботанического таксона наименьшей известной ступени, которую (независимо от того, выполнено ли признание прав селекционера растений или нет) можно определять с учетом экспрессии характеристик, являющейся результатом конкретного генотипа или комбинации генотипов, можно отделять от любой другой группы растений по экспрессии по меньшей мере одной из этих характеристик и можно рассматривать как единое целое, т.к. он может размножаться без какого-либо изменения. Таким образом, термин сорт растений нельзя использовать для обозначения группы растений даже одного типа, если они отличаются наличием 1 локуса или генов (или серией фенотипических характеристик, обусловленных этим одним локусом или геном), но они могут значительно отличаться друг от друга иным образом с точки зрения других локусов или генов.
Термин F1, F2, и т.д. относится к последовательным родственным поколениям после скрещивания между двумя родительскими растениями или растительными линиями. Растения, выращиваемые из семян, получаемые посредством скрещивания двух растений или линий, называют поколением F1. Самоопыление растений F1 приводит к поколению F2 и т.д. F1 гибридное растение (или семена F1) является поколением, получаемым при скрещивании двух инбредных родительских линий. Популяцией Ml является множество подвергнутых мутагенезу семян/растений конкретной линии или культивара. Термин М2, M3, М4, и т.д. относится к последовательным поколениям, получаемым после самоопыления первого подвергнутого мутагенезу семени/растения (M1).
Термин аллели означает любую одну или несколько альтернативных форм гена в конкретном локусе, все из которых относятся к одному признаку или характеристике в конкретном локусе. В диплоидной клетке организма аллели указанного гена локализуются в конкретном участке или локусе (во множественном числе - локусах) на хромосоме. Один аллель присутствует на каждой хромосоме из пары гомологичных хромосом. Особь диплоидного растения может содержать большое количество различных аллелей в конкретном локусе. Они могут являться идентичными аллелями гена (у гомозиготы) или двумя различными аллелями (у гетерозиготы).
Термин локус (во множественном числе - локусы) означает конкретное место, или места или участок на хромосоме, где обнаруживают, например, ген или генетический маркер. Таким образом, локус ACS2 является местом в геноме, где обнаруживают ген ACS2.
В настоящем описании термин аллель дикого типа (WT или Wt) относится к варианту гена, кодирующему полностью функциональный белок (белок дикого типа). Такая последовательность, кодирующая полностью функциональный белок Acs2, например, является последовательностью кДНК (мРНК) Acs2 дикого типа, приведенной в SEQ ID NO: 9 на основе мРНК 1-аминоциклопропан-1карбоксилатсинтазы томата в GenBank NM001247249.1, полных cds http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_0012247249.1http://www.ncbi.nlm.n.gov/nuccore/AY326958.l, или геномной последовательностью Acs2 дикого типа, приведенной в SEQ ID NO: 17. Белковая последовательность, кодируемая этой мРНК Acs2 дикого типа, приведена в SEQ ID NO: 1. Она состоит из 485 аминокислот. Другие аллели, кодирующие полностью функциональный белок Acs2 (т. е. аллели, обеспечивающие созревание и продукцию этилена до той же степени, что и белок SEQ ID NO 1), могут существовать в других растениях Solanum lycopersicum и могут иметь значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1, т.е. по меньшей мере приблизительно 85, 90, 95, 98, 99, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1. Такие полностью функциональные белки Acs2 дикого типа в настоящем описании обозначают как варианты SEQ ID NO: 1. Аналогично, нуклеотидные последовательности, кодирующие такие полностью функциональные белки Acs2, обозначают как варианты SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 17.
Следующие мутантные аллели acs2 являются примерами идентифицированных мутаций acs2 по настоящему изобретению, придающих сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности. Следует отметить, что нуклеотидные последовательности, приведенные в настоящем описании (SEQ ID NO: 9-16), являются кДНК, т.е. кодирующими последовательностями ДНК, кодирующими белки SEQ ID NO: 1-8. Очевидно, что при ссылке на эти нуклеотидные последовательности кДНК, следует понимать, что кДНК является кодирующей областью соответствующей геномной последовательности acs2 Solanum lycopersicum, однако, дополнительно содержащей интроны, и, таким образом, нуклеотиды имеют другую нумерацию. Таким образом, при ссылке на растение томата,
- 7 032773 содержащее последовательность acs2, например, по любой из SEQ ID NO: 9-16, таким образом, следует понимать, что растение томата содержит геномную последовательность acs2, содержащую кодирующую ДНК (кДНК), с которой транскрибируется мРНК SEQ ID NO: 8-14 (и которая, в свою очередь, транслируется в белок). мРНК имеет ту же нуклеотидную последовательность, что и кДНК, за исключением того, что тимин (Т) в мРНК является урацилом (U). Кроме того, при ссылке на растение томата, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую белок по изобретению (т.е. мутантный белок SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8), она включает различные нуклеотидные последовательности в связи с вырожденностью генетического кода. В одном из вариантов осуществления растение содержит геномную последовательность Acs2, приведенную в SEQ ID NO: 17, или геномную последовательность Acs2, по существу, идентичную ей (например, имеющую по меньшей мере приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 17), но с одной или несколькими мутациями в указанной последовательности, в частности, в экзонах указанной геномной последовательности (экзон 1 занимает нуклеотиды 1-171; экзон 2 занимает нуклеотиды 270-399, экзон 3 занимает нуклеотиды 485-644, и экзон 4 занимает нуклеотиды 1526 до 2523; принимая А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1), вызывающих снижение функции или потерю функции кодируемого мутантного белка acs2.
Один из примеров мутантного аллеля acs2 (мутант 783), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене аланина (Ala или А) треонином (Thr или Т) в положении аминокислоты 103 (А103Т) в кодируемом белке. Белковая последовательность мутанта 783 приведена в SEQ ID NO: 2. Замена аминокислоты является результатом мутации G в А в положении нуклеотида 307 в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК мутанта 783 приведена в SEQ ID NO: 10.
Другой пример мутантного аллеля acs2 (мутант 2145), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене глицина (Gly или G) аргинином (Arg или R) в положении аминокислоты 112 (G112R) в кодируемом белке.
Белковая последовательность мутанта 2145 приведена в SEQ ID NO: 3. Замена аминокислоты является результатом замены G на А в положении нуклеотида 334, как показано в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК мутанта 2145 приведена в SEQ ID NO: 11.
Другой пример мутантного аллеля acs2 (мутант 2714), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене пролина (Pro или Р) лейцином (Leu или L) в положении аминокислоты 118 (P118L) в кодируемом белке (SEQ ID NO: 4). Белковая последовательность мутанта 2714 приведена в SEQ ID NO: 4. Замена аминокислоты является результатом мутации С в Т в положении нуклеотида 353 (С353Т) в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК 2714 приведена в SEQ ID NO: 12.
Другой пример мутантного аллеля acs2 (мутант 3793), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене аланина (Ala или А) валином (Val или V) в положении аминокислоты 101 (A101V) в кодируемом белке (SEQ ID NO: 5). Замена аминокислоты является результатом мутации С в Т в положении нуклеотида 302 (С302Т) в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК приведена в SEQ ID NO: 13.
Другой пример мутантного аллеля acs2 (мутант 4946), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене аланина (Ala или А) треонином (Thr или Т) в положении аминокислоты 101 (А101Т) в кодируемом белке (SEQ ID NO: 6). Замена аминокислоты является результатом замены G на А в положении нуклеотида 301 (G301A) в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК приведена в SEQ ID NO:
14.
Другой пример мутантного аллеля acs2 (мутант 7871), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене цистеина (Cys или С) тирозином (Tyr или Y) в положении аминокислоты 265 (C265Y) в кодируемом белке (SEQ ID NO: 7). Замена аминокислоты является результатом мутации G в А в положении нуклеотида 794 (G794A) в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК приведена в SEQ ID NO:
15.
Другой пример мутантного аллеля acs2 (мутант 8185), придающего сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или увеличенный срок годности, идентифицированного по настоящему изобретению, содержит мутацию, приводящую к замене валина (Val или V) глутаминовой кислотой (Glu или Е) в положении аминокислоты 147 (V147E) в кодируемом белке (SEQ ID NO: 8). Замена аминокис
- 8 032773 лоты является результатом замены Т на А в положении нуклеотида 440 (Т440А) в SEQ ID NO: 9, если принимать А в инициаторном кодоне ATG за положение нуклеотида 1. Мутантная кДНК приведена в SEQ ID NO: 16.
В настоящем описании термин мутантный аллель относится к аллелю, содержащему одну или несколько мутаций в кодирующей последовательности (мРНК, кДНК или геномной последовательности) по сравнению с аллелем дикого типа. Такие мутации (например, инсерция, инверсия, делеция и/или замена одного или нескольких нуклеотидов) может приводить к образованию кодируемого белка, имеющего сниженную функциональность in vitro и/или in vivo (сниженную функцию) или не имеющего функциональности in vitro и/или in vivo (потерю функции), например, по причине того, что белок, например, является укороченным или имеет аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот подвергнуты делеции, инсерции или замене. Такие изменения могут приводить к образованию белка, имеющего другую трехмерную конформацию, направленного в другой субклеточный компартмент, имеющего модифицированный каталитический домен, имеющего модифицированную активность связывания с нуклеиновыми кислотами или белками и т.д.
В настоящем описании термины растение дикого типа и плоды дикого типа или нормальное созревание растений/плодов относятся к растению томата, содержащему две копии аллеля Acs2 дикого типа (WT или Wt) (Acs2/Acs2), кодирующего полностью функциональный белок Acs2 (например, в отличие от мутантных растений, содержащих мутантный аллель acs2). Такие растения, например, являются подходящими контролями в фенотипических анализах. Предпочтительно, растения дикого типа и/или мутантные растения являются культивируемыми растениями томата. Например, культивар Moneymaker является растением дикого типа, как и культивар Ailsa Craig, культивар Тара и многие другие.
Растения томата или культивируемые растения томата являются растениями Solanum lycopersicum, т.е. сортами, селекционными линиями или культиварами вида Solanum lycopersicum, культивируемыми людьми и имеющими хорошие агрономические характеристики; предпочтительно, такие растения не являются дикими растениями, т.е. растениями, как правило, имеющими худшую урожайность и худшие агрономические характеристики, чем культивируемые растения, и, например, растущие в природе в диких популяциях. Дикие растения включают, например, экотипы, линии PI (интродуцируемых растений), местные сорта или дикие образцы или дикие родственные формы вида. Т. н. наследственные сорта или культивары, т.е. перекрестно опыляющиеся сорта или культивары, которые, как правило, выращивали в течение более ранних периодов истории человечества и часто адаптировали в конкретных географических областях, в одном из аспектов изобретения включены в настоящее описание в качестве культивируемых растений томата.
Дикие родственные формы томата включают S. arcanum, S. chmielewskii, S. neorickii ( = L. parviflorum), S. cheesmaniae, S. galapagense, S. pimpinellifolium, S. chilense, S. comeliomulleri, S. habrochaites ( = L. hirsutum), S. huaylasense, S. sisymbriifolium, S. peruvianum, S. hirsutum или S. pennellii.
В настоящем описании термин среднее относится к арифметическому среднему.
Краткое описание списка последовательностей
В SEQ ID NO: 1 приведена полностью функциональная белковая последовательность ACS2 Solanum lycopersicum дикого типа, полученная из мРНК с учетом референсной последовательности NCBI: NMJ301247249.1; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247249.
В SEQ ID NO: 2 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 783 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 3 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 2145 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 4 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 2714 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 5 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 3793 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 6 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 4946 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 7 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 7871 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 8 приведена белковая последовательность acs2 мутанта 8185 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 9 приведена кДНК Acs2 Solanum lycopersicum дикого типа с учетом референсной последовательности NCBI: NM 001247249.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore./NM_001247249) для мРНК АСС-синтазы 2 (ACS2), относящейся к созреванию, Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 10 приведена кДНК acs2 мутанта 783 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 11 приведена кДНК acs2 мутанта 2145 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 12 приведена кДНК acs2 мутанта 2714 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 13 приведена кДНК acs2 мутанта 3793 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 14 приведена кДНК acs2 мутанта 4946 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 15 приведена кДНК acs2 мутанта 7871 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 16 приведена кДНК acs2 мутанта 8185 Solanum lycopersicum.
В SEQ ID NO: 17 приведена геномная ДНК Acs2 Solanum lycopersicum дикого типа, полученная из сети solgenomics (http://solgenomics.net область последовательности sl2.40ch01:78217541-78213542). Положение экзонов, как представлено в настоящем описании, получали из этой последовательности.
В SEQ ID NO: 18 приведены аминокислоты с 58 по 154 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 783 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 2.
- 9 032773
В SEQ ID NO: 19 приведены аминокислоты с 58 по 154 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 2145 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 3.
В SEQ ID NO: 20 приведены аминокислоты с 58 по 154 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 2714 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 4.
В SEQ ID NO: 21 приведены аминокислоты с 58 по 154 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 3793 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 5.
В SEQ ID NO: 22 приведены аминокислоты с 58 по 154 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 4946 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 6.
В SEQ ID NO: 23 приведены аминокислоты с 184 по 297 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 7871 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 7.
В SEQ ID NO: 24 приведены аминокислоты с 58 по 154 включительно белковой последовательности acs2 мутанта 8185 Solanum lycopersicum, приведенной в SEQ ID NO: 8.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Высвобождение этилена, измеряемое в нл/(ч-г), которые также можно записывать как нл-ч-1 -г-1, из плодов томата различных мутантов по acs2 на стадии розовой окраски и стадии полной спелости. Тара является растением типа (Acs2/Acs2).
Фиг. 2: На этом графике представлена процентная доля плодов на стадии полной спелости, определяемая в различные дни после начала входа контрольных плодов дикого типа в стадию бурой окраски плода [в день 1 первый плод дикого типа находился на стадии бурой окраски плода]. Плоды мутантных растений (указанные по номеру мутанта) являлись гомозиготными по конкретной мутации acs2 (acs2/acs2).
Фиг. 3: Выравнивание SEQ ID NO: 1-8. Мутации показаны жирным шрифтом и подчеркнуты.
Фиг. 4: Средняя твердость, необходимая для снижения диаметра плода в 1 мм на см плода (10%) мутанта 8185 (8185 Но) и дикого типа (wt; т.е. Тара) в Ньютонах [Н]. Те же плоды повторно измеряли в день 0 (стадия полной спелости, день сбора урожая) и дни 7, 14 и 21 после сбора урожая.
Фиг. 5: Выравнивание аминокислотной последовательности Acs4 дикого типа с шестью мутантами по acs4: мутантом 2477, мутантом 4043, мутантом 4222, мутантом 4303, мутантом 4691 и мутантом 5251. Также изображены малые и большие домены Acs4 (выделены светло-серым), как и мутации (выделены жирным шрифтом и подчеркнуты).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum, содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции и/или сниженной функцией по сравнению с белком Acs2 дикого типа.
В одном из аспектов изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum и/или его частям (например, плодам), содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной функцией по сравнению с белком Acs2 дикого типа, где указанная мутация или мутации приводят к сниженной продукции этилена, и/или замедленному созреванию плода, и/или большему сроку годности по сравнению с растениями Solanum lycopersicum, гомозиготными по полностью функциональному аллелю Acs2 дикого типа (Acs2/Acs2) (кодирующему функциональный белок Acs2 по SEQ ID NO: 1 или функциональный вариант).
Растение S. lycopersicum, кодирующее белок по SEQ ID NO: 1, например, описывают в Kamiyoshihara Y, et al. in Plant J. 2010, vol 64(1), pp 140-50; цикл LeACS2, синтазы 1-аминоциклопропан-1карбоновой кислоты, индуцируемой повреждением, у томата, регулируется фосфорилированием/дефосфорилированием.
В одном из аспектов изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum и/или его частям (например, плоду или семени), содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2, где указанный мутантный белок acs2 содержит одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y, в белке Acs2 дикого типа по SEQ ID NO: 1 или в его функциональном варианте. Указанный функциональный вариант является белком Acs2 дикого типа, имеющим по меньшей мере 85% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1; и, необязательно, где указанная мутация приводит к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной функцией по сравнению с белком Acs2 дикого типа.
В другом аспекте изобретение относится к растению по изобретению, где указанный мутантный белок acs2 содержит аминокислоты с 58 по 154 включительно и/или аминокислоты с 184 по 2 97 включительно или SEQ ID NO: 1, и где указанный мутантный белок acs2 содержит одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y в SEQ ID NO: 1.
В еще одном аспекте изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum и/или его частям (например, плоду или семени), содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, где указанный мутантный белок acs2, кодируемый указанным аллелем, содержит
- 10 032773 одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y, в SEQ I NO: 1 или варианте SEQ ID NO: 1 дикого типа, имеющем по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1.
В дополнительном аспекте изобретение относится к мутантному белку acs2, содержащему одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y в SEQ ID NO: 1 или варианте SEQ ID NO: 1 дикого типа, имеющем по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1. Предпочтительно указанный мутантный белок acs2 является белком acs2 Solanum lycopersicum.
В другом аспекте изобретение относится к растению по изобретению, где указанная мутация или мутации приводят к сниженной продукции этилена, и/или замедленному созреванию плода, и/или большему сроку годности по сравнению с растениями Solanum lycopersicum, гомозиготными по полностью функциональному аллелю Acs2 дикого типа (Acs2/Acs2) (кодирующему функциональный белок Acs2 с SEQ ID NO: 1 или функциональный вариант SEQ ID NO: 1). В другом аспекте мутация или мутации в растении по изобретению приводят к сниженной продукции этилена по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа, кодирующему белок SEQ ID NO: 1 или вариант SEQ ID NO: 1 дикого типа, имеющий по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте мутация или мутации в растении по изобретению приводят к замедленному созреванию плода и/или большему сроку годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа.
В еще одном аспекте изобретение относится к культивируемому растению вида Solanum lycopersicum и/или его частям (например, плодам), содержащему аллель acs2, содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs2, где указанный мутантный белок acs2 содержит одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E, C265Y в SEQ ID NO: 1 или вариантах SEQ ID NO: 1, и где указанные мутации приводят к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной функцией по сравнению с белком Acs2 дикого типа (или вариантом дикого типа), в результате чего плоды растения созревают до стадии полной спелости (предпочтительно, медленнее растений, гомозиготных по аллелю дикого типа, кодирующему полностью функциональный белок Acs2 (или вариант дикого типа)).
В одном из аспектов растение является гомозиготным по аллелю, кодирующему мутантный белок acs2.
В другом варианте осуществления такой мутантный аллель acs2 получают из и/или в культивируемом томате (например, селекционной линии, сорте или наследственном сорте) или дикой родственной форме томата. Такую антропогенную мутацию, например, можно индуцировать с использованием направленного мутагенеза, как описано в ЕР 1963505. Затем мутантные аллели acs2, полученные в диких родственных формах томата, легко переносят в культивируемый томат посредством селекции.
В еще одном аспекте изобретение относится к растению по изобретению, имеющему сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или больший срок годности, чем растения дикого типа (Acs2/Acs2), по причине того, что указанные растения содержат эндогенный аллель acs2, кодирующий белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией, имеющий значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.
В конкретном аспекте изобретение относится к культивируемым растениям томата, содержащим аллель acs2, обнаруживаемый и получаемый из (или полученный из) семян, депонируемых под регистрационным номером NCIMB 42032, NCIMB 42033, NCIMB 42035, NCIMB 42036, NCIMB 42040, NCIMB 42042 или NCIMB 42043, в одной или двух копиях, т.е. в гомозиготной или гетерозиготной форме. В гетерозиготной форме другой аллель может являться аллелем Acs2 дикого типа или другим мутантным аллелем acs2, например, из любого из других мутантов, представленных в настоящем описании, или любым другим мутантным аллелем acs2, кодирующим белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией, как представлено в настоящем описании. Таким образом, в гетерозиготной форме другой аллель может являться аллелем acs2 со сниженной функцией или потерей функции.
В другом аспекте изобретение относится к эндогенному аллелю acs2 или к кодируемому им белку acs2 с потерей функции или белку acs2 со сниженной функцией, содержащему аминокислотную последовательность, имеющую значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 21, или SEQ ID NO: 22, или SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.
В другом аспекте изобретение относится к эндогенному аллелю acs2 или к кодируемому им белку acs2 с потерей функции или белку acs2 со сниженной функцией, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID nO: 4, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 8, обнаруживаемому и получаемому из (или полученному из) семян, депонируемых под регистрационным номером NCIMB 42032, NCIMB 42033, NCIMB 42035, NCIMB 42036, NCIMB 42040, NCIMB 42042, или NCIMB 42043, соответственно.
- 11 032773
В еще одном аспекте изобретение относится к растению томата или части растения по изобретению, содержащему эндогенный аллель acs2, кодирующий белок acs2, имеющий 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.
В другом аспекте изобретение относится к растению томата или части растения, содержащему эндогенный аллель acs2,кодирующий белок acs2, где указанный белок содержит часть, имеющую значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 21, или SEQ ID NO: 22, или SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24; предпочтительно, где указанный белок содержит часть, имеющую 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 21, или SEQ ID NO: 22, или SEQ ID NO: 23, или SEQ ID NO: 24.
Изобретение дополнительно относится к семенам, растениям и частям растений томата, содержащим эндогенный ген acs2, кодирующий кДНК (мРНК), имеющую значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 9 и содержащую по меньшей мере одну нетрансгенную мутацию в указанном эндогенном гене acs2, где мутация приводит к замене аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из Ala101, Ala103, Gly112, Pro118, и Val147 и Cys265, в белке Acs2 дикого типа, например, где мутация выбрана из группы, состоящей из Ala101Thr, Ala101Val, Ala103Thr, Gly112Arg, Pro118Leu, Val147Glu и Cys265Tyr.
В другом аспекте изобретение относится к семенам, растениям и частям растений томата по изобретению, где указанная по меньшей мере одна нетрансгенная мутация приводит к продукции мутантного белка acs2 с потерей функции или сниженной активностью по сравнению с белком Acs2 дикого типа. Предпочтительно указанная мутация приводит к сниженной продукции этилена, и/или более медленному созреванию плода, и/или большему сроку годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготному по функциональному аллелю Acs2 дикого типа, кодирующему белок по SEQ ID NO: 1 или его функциональный вариант. Мутация, представленная где-либо в настоящем описании, может являться антропогенной или природной мутацией. Предпочтительно, растение является культивируемым растением томата. В другом варианте осуществления указанная мутация выбрана из группы, состоящей из G307A, G334A, С353Т, С302Т, G301A, G794A и Т440А в SEQ ID NO: 9.
В другом аспекте изобретение относится к семенам, растениям и частям растений томата, содержащим эндогенный мутантный ген acs2, где указанная нетрансгенная мутация приводит к замене аминокислоты в белке acs2, кодируемом и продуцирующемся посредством транскрипции и трансляции гена acs2, где указанная замена аминокислоты выбрана из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y в SEQ ID NO: 1 или функциональном варианте SEQ ID NO: 1, имеющем по меньшей мере 85% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1.
В еще одном аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 2. В другом аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 4. В еще одном аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 5. В другом аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6. В дополнительном аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 7. В еще одном аспекте изобретение относится к белку acs2, имеющему значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 8. Изобретение также относится к семенам, растениям и частям растений томата, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую эти белки.
В другом аспекте изобретение относится к плоду, семенам, пыльце, частям растений и/или потомству растения томата по изобретению. Предпочтительно, изобретение относится к плоду или семенам растения по изобретению. Более предпочтительно, изобретение относится к плоду томата, имеющему замедленное созревание и/или увеличенный срок годности после сбора урожая, вызываемые нетрансгенной мутацией по меньшей мере в одном аллеле acs2, как представлено где-либо в настоящем описании.
В другом аспекте изобретение относится к плоду, семенам, пыльце, частям растений и/или потомству растения томата по изобретению, содержащим белок acs2, содержащий одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112, P118L, V147E и C265Y в белке Acs2 дикого типа, имеющем по меньшей мере 85% идентичности аминокислотной последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретение относится к плоду или семенам такого растения по изобретению. В другом варианте осуществления изобретение относится к плоду томата, имеющему замедленное созревание и/или увеличенный срок годности после сбора урожая, вызываемые нетрансгенной мутацией по меньшей мере в одном аллеле acs2, как представлено где-либо в настоящем описании.
В одном из аспектов растения томата по изобретению имеют задержку стадии бурой окраски плода, что означает, что мутантам по изобретению необходимо значимо больше дней, например, на 1, 2, 3, 4, 5,
- 12 032773
6, 7, 8, 9, или 10 или более дней больше, чем контролям Acs2/Acs2 дикого типа, таким как ТАРА, TPAADASU или Pusa Sheetal, для входа первых плодов и/или всех плодов в стадию бурой окраски плода.
В другом аспекте плодам растений томата по изобретению необходимо больше дней для прохождения от стадии бурой окраски плода до стадии полной спелости, например плодам растений по изобретению необходимо на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 или более дней больше, чем контролям дикого типа Acs2/Acs2 для прохождения от стадии бурой окраски плода до стадии полной спелости.
В другом аспекте изобретение относится к плоду растения по изобретению, имеющему срок годности, составляющий по меньшей мере на 2 дня больше, чем срок годности плода томата, гомозиготного по аллелю Acs2 дикого типа. В другом аспекте изобретение относится к плоду растения по изобретению, имеющему сниженную продукцию этилена, являющуюся сниженной по меньшей мере на 10%, или сниженной по меньшей мере на 15%, или сниженной по меньшей мере на 20% по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа. В другом аспекте изобретение относится к плоду растения по изобретению, имеющему сниженную продукцию этилена, являющуюся сниженной по меньшей мере на 10%, или сниженной по меньшей мере на 15%, или сниженной по меньшей мере на 20% по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа, при измерении на стадии розовой окраски или стадии полной спелости.
В конкретном аспекте растения томата по изобретению имеют срок годности, значимо больший, чем срок годности растений дикого типа, например, количество дней от нахождения первого плода в стадии бурой окраски плода (или переходной стадии, стадии розовой окраски, стадии полной спелости или от сбора урожая) до того, как первый плод начинает становиться испорченным и неподходящим для продажи или потребления, является значимо большим, например, по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10 или более дней больше, чем плоды контрольных растений (таких как растения Acs2/Acs2 дикого типа), если растения выращивают в тех же условиях и плоды обрабатывают так же и хранят в тех же условиях.
Замедленное созревание и/или увеличенный срок годности могут иметь преимущество в том, что доступно больше дней для транспортировки собранных плодов, например, розничным продавцам и в супермаркеты, и/или что потребитель может дольше хранить плоды. Томаты можно собирать на стадии зеленовато-бурой окраски плода, или на стадии бурой окраски плода или позже. При сборе до стадии бурой окраски плода необходимо воздействие этилена, в то время как при сборе приблизительно на стадии бурой окраски плода или позже не требуется воздействие этилена, т.к. плоды сами продуцируют этилен. Как показано на фиг. 2, мутанты с замедленным созреванием по изобретению продуцируют меньше этилена на стадии розовой окраски и стадии полной спелости, чем плоды дикого типа, но достаточно этилена для созревания до стадии полной спелости. Один из аспектов изобретения относится к растениям томата, содержащим мутантный аллель acs2, кодирующий белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией, где плоды указанных растений продуцируют значимо меньше этилена, чем растения дикого типа (Acs2/Acs2). Термин значимо меньше этилена относится к плоду, продуцирующему 75% или менее, 70% или менее, 65% или менее, 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, или 15% или менее этилена, продуцируемого гомозиготными плодами Acs2/Acs2 на стадии розовой окраски или стадии полной спелости. Таким образом, этилен, продуцируемый на стадии розовой окраски, в одном из аспектов составляет менее приблизительно 3,5 нл/(ч-г), например, приблизительно 3 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 2,5 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 2,0 нл/(ч-г) или менее, приблизительно 1,5 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 1,0 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 0,5 нл/(ч-г) или менее. В одном из аспектов этилен, продуцирующийся на стадии полной спелости, составляет менее приблизительно 6 нл/(ч-г), например, приблизительно 5,5 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 5,0 нл/(ч-г) или менее, или 4,5 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 3,5 нл/(ч-г) менее, или приблизительно 3 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 2,5 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 2,0 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 1,5 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 1,0 нл/(ч-г) или менее, или приблизительно 0,5 нл/(ч-г) или менее.
В другом аспекте изобретение относится к плоду растения томата по изобретению, имеющему больший период созревания и/или увеличенный срок годности после сбора урожая, вызываемые нетрансгенной мутацией по меньшей мере в одном аллеле acs2, где больший период созревания и/или больший срок годности после сбора урожая составляет по меньшей мере 110% периода созревания и/или срока годности после сбора урожая плода томата, гомозиготного по аллелю Acs2 дикого типа. Предпочтительно период созревания и/или срок годности после сбора урожая составляет по меньшей мере 115%, более предпочтительно по меньшей мере 120%, даже более предпочтительно по меньшей мере 125% периода созревания и/или срока годности после сбора урожая плода томата, гомозиготного по аллелю Acs2 дикого типа. В другом аспекте период созревания и/или срок годности после сбора урожая составляет по меньшей мере 135%, более предпочтительно по меньшей мере 150%, даже более предпочтительно по меньшей мере 165% периода созревания и/или срока годности после сбора урожая плода томата, гомозиготного по аллелю Acs2 дикого типа. В еще одном аспекте период созревания и/или срок годности после
- 13 032773 сбора урожая составляет по меньшей мере 180%, более предпочтительно по меньшей мере 200% даже более предпочтительно по меньшей мере 250% периода созревания и/или срока годности после сбора урожая плода томата, гомозиготного по аллелю Acs2 дикого типа.
В еще одном аспекте изобретение относится к растению томата, содержащему аллель acs2, кодирующий мутантный белок acs2, где указанный аллель является полученным или получаемым из растения по изобретению, образец семян которого депонируют под регистрационными номерами NCIMB 42032, NCIMB 42033, NCIMB 42035, NCIMB 42036, NCIMB 42040, NCIMB 42042, или NCIMB 42043.
Другой аспект изобретения относится к растениям томата, имеющим то же или схожее замедленное созревание и/или увеличенный срок годности, что и растения томата по изобретению, образцы семян которых депонировались Nunhems B.V. и приняты для депонирования 21 августа 2012 в NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA, UK) согласно Будапештскому договору по экспертному решению (ЕРС 2000, правило 32(1)). Семенам присваивали следующие номера депозитов: NCIMB 42032 (мутант 783), NCIMB 42033 (мутант 2145), NCIMB 42035 (мутант 2714), NCIMB 42036 мутант (3793), NCIMB 42040 (мутант 4946), NCIMB 42042 (мутант 7871) или NCIMB 42043 (мутант 8185).
В дополнительном аспекте изобретение относится к культуре клеток или культуре ткани растения томата по изобретению. Культура клеток или культура ткани содержит регенерируемые клетки. Такие клетки можно получать из листьев, пыльцы, эмбрионов, семядоли, гипокотиля, меристемных клеток, корней, кончиков корней, пыльников, цветов, семян и стеблей.
Кроме того, изобретение относится к семенам, из которых можно выращивать растения по изобретению, а также упаковкам или контейнерам, содержащие такие семена. Кроме того, вегетативное размножение растений по изобретению является аспектом, включенным в настоящее описание. Аналогично, включены собранные плоды и части плодов для потребления в свежем виде или для обработки или в обработанной форме. Плоды можно сортировать, измерять и/или упаковывать. Плоды можно разрезать или дополнительно обрабатывать.
В другом аспекте изобретение относится к одной или нескольким клеткам растения по изобретению.
Изобретение также относится к пище и/или пищевым продуктам, содержащим или состоящим из плода или части плода растения томата по изобретению. Как применяют в настоящем описании, пища относится к питательным веществам, потребляемым человеком или животными. Примерами являются сэндвичи, салаты, соусы, кетчуп и т.п.
Способ получения растения томата по изобретению, включающий этапы:
a) получение растительного материала из растения томата;
b) обработка указанного растительного материала мутагеном для получения подвергнутого мутагенезу растительного материала;
c) анализ указанного подвергнутого мутагенезу растительного материала для идентификации растения, имеющего по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном аллеле acs2, имеющем значительную идентичность последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1 или его функциональному варианту.
Способ может дополнительно включать анализ периода созревания и/или срока годности плодов томата выбранного растения или потомства растения и селекцию растения, плод которого имеет замедленное созревание и/или увеличенный срок годности.
В одном из аспектов мутацию выбирают из мутации, приводящей к замене аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E, C265Y в SEQ ID NO: 1 или ее части. В дополнительном аспекте мутацию выбирают из мутации, вызывающей замену в кДНК, выбранную из группы, состоящей из G307A, G334A, С353Т, С302Т, G301A, G794A, и Т440А в SEQ ID NO: 9. В этом способе растительный материал на этапе а), предпочтительно, выбирают из группы, состоящей из семян, пыльцы, растительных клеток или растительной ткани линии или культивара растений томата. Семена растений являются более предпочтительными. В другом аспекте мутагеном, используемым в этом способе, является этилметансульфонат. На этапе b) и этапе с) подвергнутый мутагенезу растительный материал предпочтительно является популяцией мутантов, такой как популяция томата для TILLING.
Таким образом, один из аспектов относится к способу получения растения томата, имеющего замедленное созревание плода и/или больший срок годности плодов, включающий этапы:
a) получение популяции томата для TILLING,
b) скрининг указанной популяции для TILLING на мутанты по гену acs2 и
c) селекция из мутантных растений по п. b) тех растений (или потомства тех растений), плоды которых имеют сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или больший срок годности, чем плоды дикого типа (Acs2/Acs2).
Предпочтительно мутантные растения (M1) подвергают самоопылению один или несколько раз для получения, например, популяции M1 или предпочтительно популяций M3 или М4 для фенотипирования. В популяциях М2 мутантный аллель присутствует в соотношении 1 (гомозиготы по мутантному аллелю):
- 14 032773 (гетерозиготы по мутантному аллелю): 1 (гомозиготы по аллелю дикого типа).
В еще одном дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения гибридного растения Solanum lycopersicum, включающему:
(a) получение первого растения Solanum lycopersicum по настоящему изобретению или из семян, из которых можно выращивать растение по изобретению; и (b) скрещивание указанного первого растения Solanum lycopersicum со вторым растением Solanum lycopersicum для получения гибридных семян, где указанное гибридное растение Solanum lycopersicum содержит аллель acs2, имеющий одну или несколько мутаций, где указанные мутации приводят к продукции мутантного белка acs2, содержащего одну или несколько замен аминокислот, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y в SEQ ID NO: 1 или варианте SEQ ID NO: 1.
Растения и части растений (например, плоды, клетки и т.д.) по изобретению могут являться гомозиготными или гетерозиготными по мутантному аллелю acs2.
Предпочтительно растения по изобретению, содержащие один или несколько мутантных аллелей acs2 и продуцирующие мутантный белок acs2, являющийся белком acs2 с потерей функции или сниженной активностью по сравнению с белком Acs2 дикого типа, не приносят меньше плодов, чем растения дикого типа. Таким образом, количество плодов на растение, предпочтительно, не снижается.
Другие предполагаемые гены/белки ACS2 можно идентифицировать in silico, например, определяя последовательности нуклеиновой кислоты или белка в существующих базах данных нуклеиновых кислот или белков (например, GENBANK, SWISSPROT, TrEMBL) и используя стандартное программное обеспечение для анализа последовательностей, такое как инструменты поиска сходства последовательностей (BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLAST, FASTA и т.д.).
Один из вариантов осуществления относится к белку acs2 с потерей функции или мутантному белку acs2 со сниженной функцией (включая варианты или ортологи, такие как белки acs2 диких родственных форм томата) и растениям и частям растений, содержащим в своем геноме один или несколько аллелей acs2, кодирующих белок acs2 с потерей функции или мутанты со сниженной функцией, при этом сниженная функция приводит к сниженной продукции этилена, и/или более медленному созреванию плода, и/или большему сроку годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа.
Любой тип мутации может приводить к снижению функции кодируемого белка Acs2, например, инсерция, делеция и/или замена одного или нескольких нуклеотидов в геномной ДНК, содержащей кДНК (SEQ ID NO: 9 или ее варианты). Предпочтительный вариант осуществления относится к последовательности нуклеиновой кислоты acs2, кодирующей белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией по причине одной или нескольких мутаций, вызывающий сниженную продукцию этилена и/или придающий более медленное созревание плода и/или больший срок годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа.
In vivo белок acs2 с потерей функции или сниженную функцию таких белков можно тестировать, как представлено в настоящем описании, определяя эффект этого мутантного аллеля в отношении продукции этилена, и/или периода созревания, и/или срока годности. Растения, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую такой мутантный белок acs2 с потерей функции или белки со сниженной функцией, и имеющие сниженную продукцию этилена, и/или более медленное созревание плода, и/или больший срок годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа, можно получать, например, с использованием мутагенеза и идентифицировать с помощью TILLING или с использованием EcoTILLING, как известно в этой области. Кроме того, для тестирования in vivo функциональности мутантного аллеля acs2, кодирующего мутантный белок acs2, можно использовать трансгенные способы. Мутантный аллель можно функционально связывать с растительным промотором и встраивать химерный ген в растение томата с помощью трансформации. Регенерированные растения (или потомство, например, полученное с помощью самоопыления) можно тестировать на продукцию этилена, и/или период созревания плода, и/или срок годности. Например, для тестирования функциональности трансгенного аллеля acs2 можно трансформировать растение томата, содержащее нефункциональный аллель acs2.
TILLING (введение индуцированных повреждений в геном) является общим способом обратной генетики, в котором используют общепринятые способы химического мутагенеза для получения библиотек подвергнутых мутагенезу особей, которых позднее подвергают высокопроизводительному скринингу для поиска мутаций. В TILLING комбинируют химический мутагенез со скринингом мутаций в суммарных продуктах ПЦР, что приводит к выделению миссенс- и нонсенс-мутантных аллелей целевых генов. Таким образом, в TILLING используют общепринятый химический мутагенез (например, мутагенез с использованием EMS или MNU) или другие способы мутагенеза (например, использование излучения, такого как УФ) с последующим высокопроизводительным скринингом на мутации в конкретных целевых генах, таких как Acs2 по изобретению. Нуклеазы S1, такие как CEL1 или ENDO1, используют для расщепления гетеродуплексов целевой мутантной ДНК и ДНК дикого типа и определяют продукты расщепления с использованием, например, электрофореза, такого как система для анализа гелей LI-COR,
- 15 032773 см., например, Henikoff et al. Plant Physiology 2004, 135: 630-636. TILLING используют на многих видах растений, таких как томат (см. http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling), рис (Till et al. 2007, BMC Plant Biol 7: 19), арабидопсис (Till et al. 2006, Methods Mol Biol 323: 127-35), Brassica, маис (Till et al. 2004, BMC Plant Biol 4: 12) и т.д. Кроме того, широко используют EcoTILLING, в котором определяют мутанты в природных популяциях, см. Till et al. 2006 (Nat Protoc 1: 2465-77) и Comai et al. 2004 (Plant J 37: 778-86).
В одном из вариантов осуществления изобретения последовательности нуклеиновой кислоты (кДНК или геномные), кодирующие такие мутантные белки acs2, содержат одну или несколько нонсенси/или миссенс-мутаций, например транзиции (замену пурина другим пурином (А θ G) или пиримидина другим пиримидином (С θ Т)) или трансверзии (замену пурина пиримидином или наоборот (С/Т θ A/G). В одном из вариантов осуществления нонсенс- и/или миссенс-мутаций находятся в нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из экзонов Acs2, или, по существу, схожем домене варианта белка Acs2, т.е. в домене, имеющем по меньшей мере 80, 90, 95, 98, 99% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1 или ее варианту.
Один из вариантов осуществления относится к нуклеотидной последовательности acs2, содержащей одну или несколько нонсенс- и/или миссенс-мутаций в одной из экзон-кодирующих последовательностей, а также растению, содержащему такой мутантный аллель, приводящий к сниженной продукции этилена, и/или замедленному созреванию плода, и/или большему сроку годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа.
Конкретный вариант осуществления изобретения относится к растениям томата и частям растений (плодам, семенам и т.д.), содержащим мутантный аллель acs2 с потерей функции или сниженной функцией.
Кроме того, изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты (геномной ДНК, кДНК, РНК), кодирующим белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией, такой как, например, acs2, приведенный в SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; или их вариантам, как определено выше (включая любые химерные или гибридные белки, или мутантные белки, или укороченные белки). В связи с вырожденностью генетического кода различные последовательности нуклеиновой кислоты могут кодировать одинаковую аминокислотную последовательность. Последовательности нуклеиновой кислоты, к которым относится изобретение, включают природные, искусственные или синтетические последовательности нуклеиновой кислоты.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Acs2, представлена в SEQ ID NO: 9 (кДНК дикого типа), референсная последовательность NCBI: NM_001247249.1 http://www.ncbi.nlm.nib.gov/nuccore/NM_001247249.
Следует понимать, что когда последовательности приведены как последовательности ДНК, хотя и со ссылкой на РНК, конкретная последовательность оснований в молекуле РНК является идентичной с тем отличием, что тимин (Т) заменяют урацилом (U).
В настоящем описании при ссылке на нуклеотидные последовательности (например, ДНК или РНК) используют курсив, например, аллель acs2, в то время как при ссылке на белки курсив не используют, например, белок acs2. Мутанты обозначены строчными буквами (например, аллель acs2 или белок acs2), в то время как формы дикого типа/функциональные формы начинаются с прописной буквы (аллель Acs2 или белок Acs2).
Кроме того, изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты (геномной ДНК, кДНК, РНК), кодирующим мутантные белки acs2, т.е. белки acs2 с потерей функции или белки acs2 со сниженной функцией, как описано выше, и растениям и частям растений, содержащим такие мутантные последовательности. Например, последовательностям нуклеиновой кислоты acs2, содержащим одну или несколько нонсенс- и/или миссенс-мутаций в кодирующей последовательности Acs2 дикого типа, делающих кодируемый белок белком с потерей функции или сниженной функцией in vivo. Кроме того, изобретение относится к последовательностям с другими мутациями, таким как мутанты по участку сплайсинга, т. е. с мутациями в геномной последовательности acs2, приводящими к аномальному сплайсингу пре-мРНК, и/или мутациями со сдвигом рамки считывания, и/или инсерциями (например, инсерциями транспозона) и/или делециями одной или нескольких нуклеиновых кислот.
Очевидно, что для идентификации, синтеза или выделения вариантов или фрагментов последовательностей нуклеиновой кислоты acs2 можно использовать множество способов, таких как гибридизация нуклеиновых кислот, технология ПЦР, анализ и синтез нуклеиновых кислот in silico и т.п. Варианты SEQ ID NO: 9 могут кодировать функциональные белки Acs2 дикого типа или белок acs2 с потерей функции, или мутантные аллели со сниженной функцией любого из них, например, как получают с помощью мутагенеза и/или идентифицируют способами, такими как TILLING или EcoTILLING, или другими способами.
Растение по изобретению можно использовать в общепринятой схеме селекции растений для получения большего количества растений с теми же характеристиками или для встраивания мутантного аллеля acs2 в другие линии или сорта растений того же или родственного вида растений.
- 16 032773
Кроме того, трансгенные растения можно получать с использованием мутантных нуклеотидных последовательностей acs2 по изобретению с использованием известных в этой области способов трансформации и регенерации растений. Можно подвергать селекции элитный объект, являющийся трансформированным объектом, имеющим химерный ген (содержащий промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующий белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией), встроенный в конкретный участок в геноме, что приводит к хорошей экспрессии желаемого фенотипа.
Растения по изобретению, как описано выше, являются гомозиготами по мутантному аллелю acs2 или гетерозиготами. Для получения растений, содержащих мутантный аллель в гомозиготной форме, можно использовать самоопыление. Мутантные аллели acs2 по изобретению можно переносить в любое другое растение томата с помощью общепринятых способов селекции, таких как скрещивание, самоопыление, обратное скрещивание и т.д. Таким образом, можно получать любой тип томата, имеющий замедленное созревание и/или больший срок годности, в результате наличия по меньшей мере одного мутантного аллеля acs2 по изобретению. Можно получать и/или идентифицировать любой S. lycopersicum, имеющий по меньшей мере один мутантный аллель acs2 в своем геноме и продуцирующий белок acs2, являющийся белком acs2 с потерей функции или сниженной активностью по сравнению с белком Acs2 дикого типа. Таким образом, растение томата может являться любым культивируемым томатом, любым коммерческим сортом, любой селекционной линией или др., он может являться детерминатным или индетерминантным, перекрестноопыляющимся или гибридом, дающим плоды любого цвета, формы и размера. Мутантный аллель, полученный и/или идентифицированный в конкретном растении томата или в родственной форме томата, совместимой для полового размножения, легко можно переносить в любое другое растение томата с помощью селекции (скрещивая с растением, содержащим мутантный аллель, а затем подвергая селекции потомство, содержащее мутантный аллель).
Наличие или отсутствие мутантного аллеля acs2 по изобретению в любом растении томата или части растения и/или наследование аллеля потомством растения можно определять фенотипически и/или с использованием молекулярных способов (например, определяя наличие или отсутствие нуклеотидной последовательности acs2 или белка acs2 с использованием прямых или непрямых способов).
В одном из вариантов осуществления мутантный аллель получают или идентифицируют в культивируемом растении, но его также можно получать и/или идентифицировать в диком растении или некультивируемом растении, а затем переносить в культивируемое растение с использованием, например, скрещивания и селекции (необязательно, с использованием межвидового скрещивания, например, с эмбрионом, взятым для передачи мутантного аллеля). Таким образом, мутантный аллель acs2 можно получать (в случае антропогенной мутации с использованием способов мутагенеза для проведения мутагенеза в целевом гене acs2 или его варианте) и/или идентифицировать (в случае спонтанного или природного аллельного варианта) в Solanum lycopersicum или другом виде Solanum, включая, например, дикие родственные формы томата, такие как S. cheesmanii, S. chilense, S. habrochaites (L. hirsutum), S. chmielewskii, S. lycopersicum x S. peruvianum, S. glandulosum, S. hirsutum, S. minutum, S. parviflorum, S. pennellii, S. peruvianum, S. peruvianum var. humifusum и S. pimpinellifolium, а затем переносить в культивируемое растение Solanum, например, Solanum lycopersicum, с помощью общепринятых способов селекции. В настоящем описании термин общепринятые способы селекции включает скрещивание, самоопыление, селекцию, получение двойных гаплоидов, взятие эмбрионов, слияние протопластов, перенос через промежуточный вид и т.д., как известно селекционеру, т.е. иные способы, чем генетическая модификация, с помощью которых можно переносить аллели.
В другом варианте осуществления растение, содержащее мутантный аллель acs2, (например, томат) скрещивают с другим растением того же вида или близкородственного вида для получения гибридного растения (гибридных семян), содержащего мутантный аллель acs2. Такое гибридное растение также является вариантом осуществления изобретения.
Один из вариантов осуществления относится к семенам гибрида томата F1 (т.е. семенам, из которых можно выращивать гибридные растения томата F1), содержащим по меньшей мере один аллель acs2 по изобретению. Гибридные семена F1 являются семенами, собранными после скрещивания двух инбредных родительских растений томата. Такой гибрид F1 может содержать один или два мутантных аллеля acs2 по изобретению. Такой гибрид F1, содержащий два мутантных аллеля acs2 по изобретению, может содержать две копии одного аллеля acs2 или два разных аллеля acs2 по изобретению. Таким образом, в одном из вариантов осуществления растение по изобретению используют в качестве родительского растения для получения гибрида F1, плод которого имеет сниженную продукцию этилена, и/или замедленное созревание, и/или больший срок годности, чем растения Acs2/Acs2 дикого типа.
Кроме того, изобретение относится к способу переноса мутантного аллеля acs2 в другое растение, включающему получение растения, содержащего мутантный аллель acs2 в своем геноме, посредством чего растение, содержащее мутантный аллель, дает плоды, демонстрирующие сниженную продукцию этилена, и/или более медленное созревание плода, и/или больший срок годности по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю Acs2 дикого типа (как описано выше), скрещивание указанного растения с другим растением и получение семян указанного продукта скрещивания. Необязательно,
- 17 032773 можно дополнительно подвергать самоопылению и/или скрещивать растения, полученные из этих семян, и подвергать селекции потомство, содержащее мутантный аллель и дающее плоды с замедленным созреванием, и/или большим сроком хранения, и/или сниженной продукцией этилена по причине наличия мутантного аллеля по сравнению с растениями, содержащими аллель Acs2 дикого типа.
Как указано, следует понимать, что для получения мутантных растений по изобретению можно в равной степени использовать другие способы мутагенеза и/или селекции. Например, для получения популяций мутантов можно облучать или химически обрабатывать семена. Для скрининга популяций подвергнутых мутагенезу растений на мутантные аллели также можно использовать прямое секвенирование гена acs2. Например, скрининг KeyPoint является способом на основе секвенирования, который можно использовать для идентификации растений, содержащих мутантные аллели acs2 (Rigola et al. PloS One, March 2009, vol. 4(3): e4761).
Таким образом, изобретение относится к нетрансгенным мутантным растениям томата, продуцирующим более низкие уровни белка Acs2 дикого типа в плодах, или у которых полностью отсутствует белок Acs2 дикого типа в плодах, и продуцирующим белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией в плодах по причине одной или нескольких мутаций в одном или нескольких эндогенных аллелях acs2. Эти мутанты можно получать способами мутагенеза, такими как TILLING или его варианты, или их можно идентифицировать с помощью EcoTILLING или любым другим способом. Аллели acs2, кодирующие белок acs2 с потерей функции или белок acs2 со сниженной функцией, можно выделять и секвенировать или можно переносить в другие растения общепринятыми способами селекции.
Изобретение относится к любой части растения или его потомства, включая собранный плод, собранные ткани или органы, семена, пыльцу, цветы, завязи и т.д., содержащие мутантный аллель acs2 по изобретению в геноме. Кроме того, изобретение относится к культурам растительных клеток или культурам растительных тканей, содержащим в своем геноме мутантный аллель acs2. Предпочтительно культуры растительных клеток или культуры растительных тканей можно регенерировать в целые растения, содержащие мутантный аллель acs2 в геноме. Кроме того настоящее изобретение включает двойные гаплоидные растения (и семена, из которых можно выращивать двойные гаплоидные растения), полученные с помощью удвоения хромосом гаплоидных клеток, содержащих мутантный аллель acs2, и гибридные растения (и семена, из которых можно выращивать гибридные растения), содержащие мутантный аллель acs2 в своем геноме, при этом двойные гаплоидные растения и гибридные растения дают плоды по изобретению с замедленным созреванием и/или большим сроком годности.
Изобретение дополнительно относится к эндогенному белку acs2, имеющему по меньшей мере одну антропогенную нетрансгенную мутацию, выбранную из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y в SEQ ID NO: 1, или эндогенному аллелю acs2, кодирующему такой белок.
В другом аспекте изобретение относится к культивируемому растению или части растения (например, семенам) вида Solanum lycopersicum по изобретению, содержащему, в дополнение к одной или нескольким мутациям в аллеле acs2, как представлено в настоящем описании, аллель acs4, имеющий одну или несколько мутаций, приводящих к продукции мутантного белка acs4 с потерей функции или сниженной функцией по сравнению с белком Acs4 Solanum lycopersicum дикого типа, имеющего белковую последовательность, представленную на фиг. 5 и/или полученную из мРНК на основе регистрационного номера Genbank AAA34131.1 (кодируемой кДНК с регистрационным номером Genbank M63490.1).
Термины белок acs4 со сниженной функцией или белок acs4 со сниженной активностью относятся к мутантному белку acs4, имеющему сниженную каталитическую активность при синтезе АСС из S-аденозилметионина, приводящую к сниженному синтезу этилена, по сравнению с белком Acs4 дикого типа. Указанная сниженная каталитическая активность белка acs4 влияет на характеристики созревания плодов, содержащих такой белок acs4 со сниженной функцией, если аллель, кодирующий мутантный белок, присутствует в растении томата в гомозиготной или гетерозиготной форме, т. е. замедленное созревание и/или больший срок годности плодов. Такой белок acs4 со сниженной функцией можно получать с помощью транскрипции и трансляции частично нокаутного мутантного аллеля acs4, являющегося, например, аллелем Acs4 дикого типа, содержащим одну или несколько мутаций в своей последовательности нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов такой частично нокаутный мутантный аллель acs4 является аллелем Acs4 дикого типа, содержащим одну или несколько мутаций, предпочтительно, приводящих к продукции белка acs4, где по меньшей мере одну консервативную и/или функциональную аминокислоту заменяют другой аминокислотой таким образом, что значимо снижают биологическую активность, но не устраняют ее полностью. Однако, другие мутации, такие как одна или несколько нонсенс-, миссенс-мутаций, мутаций в участке сплайсинга или мутаций со сдвигом рамки считывания, в аллеле Acs4 томата также могут приводить к белку acs4 со сниженной функцией, и такие белки со сниженной функцией могут содержать одну или несколько замененных, инсертированных или делетированных аминокислот относительно белка ACS4 дикого типа. Такой частично нокаутный мутантный аллель acs4 также может кодировать доминантный негативный белок acs4, способный неблагоприятно влиять на биологическую активность других белков Acs4 в той же клетке. Такой доминантный негативный белок acs4 может являться белком acs4, все еще способным взаимодействовать с теми же элементами, что и белок
- 18 032773
Acs4 дикого типа, но блокирующим какой-либо аспект его функции. Примерами доминантных негативных белков acs4 являются белки acs4, в которых отсутствуют конкретные аминокислотные остатки, критичные для активации, или которые содержат модификации в них, но все равно содержат свой связывающий домен, таким образом, что не только снижается или устраняется их биологическая активность, но и они дополнительно снижают общую активность acs4 в клетке, конкурируя за участки связывания с белками acs4 дикого типа и/или частично нокаутными белками acs4, присутствующими в клетке. Мутантные аллели могут являться природными мутантными аллелями, являющимися мутантными аллелями, обнаруживаемыми в природе (например, образующимися спонтанно без использования мутагенов человеком) или индуцированными мутантными аллелями, индуцируемыми вмешательством человека, например, посредством мутагенеза.
Термин белок acs4 с потерей функции относится к мутантному белку acs4, по существу, не имеющему каталитической активности при синтезе АСС из S-аденозилметионина по сравнению с белком Acs4 дикого типа, что приводит к сниженному синтезу этилена по сравнению с белком Acs4 дикого типа. Указанное отсутствие каталитической активности при синтезе влияет на характеристики созревания плодов, содержащих такой белок acs4 с потерей функции, если аллель, кодирующий мутантный белок, присутствует в растении томата в гомозиготной или гетерозиготной форме. Плоды растений томата, гомозиготных по такому белку acs4 с потерей функции все равно могут продуцировать этилен, что катализируется другими белками (например, другими белками Acs, подобными Acs1A). В результате, плоды растений томата, гомозиготных по такому белку acs4 с потерей функции все равно могут созревать, но созревание может являться замедленным, и/или срок годности может являться большим.
В одном из аспектов указанный мутантный аллель acs4 является аллелем, обнаруживаемым и полученным и/или получаемым из семян мутанта 2477, и/или мутанта 4043, и/или мутанта 4222, и/или мутанта 4303, и/или мутанта 4691, и/или мутанта 5251. Эти мутанты по acs4 подробно описывают в заявке ЕР № 12186606.5. Предпочтительно указанные мутации в указанных аллелях acs2 и/или acs4 приводят к сниженной продукции этилена, и/или более медленному созреванию плода, и/или большему сроку годности плодов томата по сравнению с Solanum lycopersicum, гомозиготным по функциональному аллелю Acs2 и Acs4 дикого типа (например, Pusa Sheetal, Тара или TPAADASU) или их вариантам. Такие растения можно получать известными в этой области способами селекции посредством скрещивания растения, имеющего желаемую мутацию acs2, с растением, имеющим желаемую мутацию acs4. Такие растения или части растений могут являться гомозиготами или гетерозиготами по мутации acs2, или по мутации acs4 или по мутации и acs2, и acs4. Таким образом, растение генетически может представлять собой acs2/Acs2 acs4/Acs4, или acs2/acs2 acs4/Acs4, или acs2/Acs2 acs4/acs4, или acs2/acs2 acs4/acs4.
Предпочтительно мутантные растения имеют хорошие другие агрономические характеристики, т.е. они не имеют сниженное количество плодов и/или сниженное качество плодов по сравнению с растениями дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления растение является растением томата, и плод является плодом томата, таким как обработанный томат, томат, продаваемый свежим, любой формы, или размера или цвета. Таким образом, изобретение также относится к собранным продуктам растений или частям растений, содержащим один или два мутантных аллеля acs2. Они включают переработанные продукты, такие как томатная паста, кетчуп, томатный сок, нарезанные плоды томата, консервированные плоды, высушенные плоды, очищенные плоды и т. д. Продукты можно идентифицировать по содержанию мутантного аллеля в их геномной ДНК.
Депозиты семян
Типичный образец семян семи (7) мутантов томата, полученных с помощью TILLING (мутантов по acs2), по примеру 1 депонировался Nunhems B.V. и принят для депонирования 21 августа 2012 года в NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA, UK) согласно Будапештскому договору по экспертному решению (ЕРС 2000, правило 32(1)). Семенам присваивали следующие номера депозитов: NCIMB 42032 (мутант 783), NCIMB 42033 (мутант 2145), NCIMB 42035 (мутант 2714), NCIMB 42036 мутант (3793), NCIMB 42040 (мутант 4946), NCIMB 42042 (мутант 7871) или NCIMB 42043 (мутант 8185).
Типичный образец семян пяти мутантов томата, полученных с помощью TILLING (мутантов по acs4), по примеру 1 депонировался Nunhems B.V. и принят для депонирования 21 августа 2012 года в NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9YA, UK) согласно Будапештскому договору по экспертному решению (ЕРС 2000, правило 32(1)). Семенам присваивали следующие номера депозитов: NCIMB 42034 (мутант 2477), NCIMB 42037 (мутант 4043), NCIMB 42038 (мутант 4222), NCIMB 42039 (мутант 4691), NCIMB 42041 (мутант 5251). Эти мутанты по acs4 описывают в европейской патентной заявке № 12186606.5.
Заявитель требует, чтобы образцы биологического материала и любой материал, полученный из них, извлекал только уполномоченный Эксперт согласно Правилу 32(1) ЕРС, или соответствующему законодательству стран, или договорам, содержащим аналогичные правила и регламентирование, до упоминания о выдаче патента или в течение 20 лет с даты подачи, если заявка отклонена, абандонирована, отозвана или признана отозванной.
Доступ к депозиту будет доступен в течение периода рассмотрения настоящей заявки лицам, опре
- 19 032773 деленным Директором Патентного бюро США уполномоченными для этого по запросу. В соответствии с 37 C.F.R. § 1.808(b) все ограничения, налагаемые на депозитора относительно доступности депонируемого материала для общественности, будут безвозвратно сняты после выдачи патента. Депозит будут хранить в течение 30 лет, или 5 лет после самого последнего запроса, или в течение законного срока действия патента, в зависимости от того, что является большим, и будут заменять, если он становится нежизнеспособным в течение указанного периода. Заявитель не отказывается от каких-либо прав, предоставленных в соответствии с этим патентом на основании настоящей заявки или в соответствии с Plant Variety Protection Act (7 USC 2321 et seq.).
Примеры Общие способы
Продукты ПЦР-амплификации напрямую секвенировали в обслуживающей компании (BaseClear, The Netherlands, http://www.baseclear.com/) с использованием тех же праймеров, которые использовали для амплификации. Полученные последовательности выравнивали с использованием компьютерной программы (CLC Bio Main Work Bench, Denmark, www.clcbio.com) для идентификации замен нуклеотидов.
Материалы
Водой, используемой для анализов и мутагенеза, является водопроводная вода, профильтрованная в системе Milli-Q water Integral system, Milli-Q type Reference A+, дополненной Q-gard T2 Cartridge и Quantum TEX Cartridge. Сопротивление воды составляет > 18 МОм.
Этилметансульфонат (EMS) (чистый) получали в Sigma, продукт № М0880.
Измерение времени или периодов созревания томата и/или срока годности
Время или периоды созревания томата и/или срока годности можно измерять различными известными в этой области способами, такими как, например, осуществление периодической визуальной оценки плодов и/или измерение твердости или размягчения плода, измерение содержания ликопина в плодах томата, продукции этилена плодами, цвета плодов, или любым альтернативным способом или комбинацией способов. Твердость плода можно измерять, например, оценивая сопротивление деформации в единицах, например, 0,1 мм, как измеряют с использованием пенетрометра, оснащенным подходящим зондом (например, зондом 3 мм) (Mutschler et al., 1992, Hortscience 27 pp. 352-355) (Martinez et al 1995 Acta Horticulturae 412 pp 463-469). В этой области существуют альтернативные способы, такие как использование текстурометра (Bui et al. 2010; International Journal of Food Properties, vol. 13, Issue 4 pp. 830 846).
Цвет плода можно классифицировать с использованием стандартов США для оттенков свежего томата (U.S. Dept of Agriculture, 1973, US standards for grades of fresh tomatoes, U.S. Dept Agr. Agr. Mktg. Serv., Washington D.C.), измеряя цвет колориметром (Mutschler et al., 1992, Hortscience 27 pp. 352-355) или сравнивая цвет с использованием таблицы цветов, такой как Royal Horticultural Society (RHS) Color Chart (www.rhs.org.uk).
Содержание ликопина можно определять способом снижения объемов органических растворителей по Fish et al. Количественного анализа на ликопин, в котором используют снижение объемов органических растворителей. Fish et al. J. Food Compos. Anal. 2002. 15, 309-317. Этот способ можно использовать для определения содержания ликопина, напрямую измеряемого на интактном плоде томата с одновременной оценкой основных физико-химических характеристик: цвета, твердости, растворимых веществ, кислотности и рН (Clement et al, J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 9813-9818).
Высвобождение этилена можно измерять, помещая плод в закрытое пространство, например в стеклянный корпус емкостью 0,5 л. Можно экстрагировать один мл атмосферы стеклянного корпуса через один час и оценивать количество продуцируемого газа этилена с использованием газового хроматографа (например, Hewlett-Packard 5890), оснащенного подходящим детектором, например, пламенноионизационным детектором, и подходящей колонкой (например, 3 м колонкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 3,5 мм, содержащей активированный оксид алюминия 80/100 меш). Продукцию этилена можно выражать как количество в нл этилена, выделяющегося на грамм плода за час (нл г-1 ч-1) (Martinez et al. 1995 Acta Horticulturae 412 pp. 463-469).
Альтернативно, продукцию этилена можно измерять, как описано ниже, с использованием измерений в реальном времени с использованием лазерного детектора этилена (ETD-300, Sensor Sense B.V., Nijmegen, the Netherlands) в комбинации с газоулавливающей системой (Cristescu et al., 2008 Laser-based systems for trace gas detection in life sciences. Appl Phys H 2008; 92 pp. 343-9).
Пример 1. Мутагенез
Высоко гомозиготную инбредную линию, используемую в коммерческой технологии селекции томатов, использовали для мутагенеза по следующему протоколу. После пропитывания семян на фильтровальной бумаге Whatman® в течение 24 ч -20,000 семян, разделенных на 8 партий по 2500, соответственно, вымачивали в конических колбах в 100 мл воды высшей степени очистки и этилметансульфонате (EMS) в концентрации 1%. Колбы осторожно встряхивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Наконец, EMS вымывали проточной водой. После обработки EMS семена напрямую высаживали в теплице. Из 60% проросших семян 10600 саженцев пересаживали в поле. Из этих 10600 саженцев 1790 являлись стерильными или погибали до образования плодов. Для каждого оставшегося мутантного расте
- 20 032773 ния M1 собирали один плод и выделяли его семена. Полученная популяция, названная популяцией М2, состояла из 8810 партий семян, каждая из которых представляла собой семейство М2. Из них 585 семейств исключали из популяции по причине низкого количества семян.
ДНК выделяли всего из 10 семян, полученных из каждой партии семян М2. 10 семян на мутантную линию объединяли в глубокой пробирке Micronic®; http://www.micronic.com, из 96-луночного глубоко планшета, в каждую пробирку добавляли 2 шарика из нержавеющей стали. Пробирки и семена замораживали в жидком азоте в течение 1 мин и семена сразу измельчали в тонкодисперсный порошок на шейкере Deepwell (Vaskon 96 grinder, Belgium; http://www.vaskon.com) в течение 2 мин при 16,8 Гц (80% максимальной скорости). В планшет добавляли 300 мкл лизирующего буфера Р Agowa® из набора AGOWA® Plant DNA Isolation Kit, http://www.agowa.de и порошок суспендировали в растворе, встряхивая в течение 1 мин при 16,8 Гц на шейкере Deepwell. Планшеты центрифугировали в течение 10 ми при 4000 об./мин. 75 мкл супернатанта отбирали пипеткой в планшет 96 Kingfisher с использованием платформы Janus MDT® (Perkin Elmer, USA; http://www.perkinelmer.com) (96 наконечников). Следующие этапы осуществляли с использованием автоматизированной станции дозирования жидкостей Perkin Elmer Janus® и 96 Kingfisher® (Thermo labsystems, Finland; http://www.thermo.com).
Супернатант, содержащий ДНК, разводили буферным раствором (150 мкл) и магнитными частицами (20 мкл). После связывания ДНК с частицами осуществляли два последовательных этапа промывки (Промывочный буфер 1: промывочный буфер Agowa 1 1/3, этанол 1/3, изопропанол 1/3; Промывочный буфер 2: 70% этанол, 30% промывочный буфер Agowa 2) и, в конечном итоге, элюировали в элюирующем буфере (100 мкл MQ, 0,025 мкл Tween).
Измельчая десять семян S. lycopersicum, получали достаточно ДНК для насыщения магнитных частиц, таким образом, получали высоко гомогенную ДНК и сравнимые концентрации ДНК для всех образцов. Сравнивая с референсной лямбда-ДНК, оценивали концентрацию 30 нг/мкл для каждого образца. Дважды разведенную ДНК 4 раза объединяли. 2 мкл объединенной ДНК использовали в мультиплексной ПЦР для анализа для определения мутаций.
Праймеры, используемые для амплификации фрагментов гена для HRM, конструировали с использованием компьютерной программы (Primer3, http://primer3.sourceforge.net/). Длину продукта амплификации ограничивали 200-400 парами оснований. Качество праймеров определяли с помощью тестовой реакции ПЦР, при которой должны получать один продукт.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации фрагментов гена. 10 нг геномной ДНК смешивали с 4 мкл реакционного буфера (5-кратного реакционного буфера), 2 мкл 10-кратного красителя LC (красителя LCGreen+, Idaho Technology Inc., LIT, USA), 5 пмоль каждого прямого и обратного праймеров, 4 нмоль dNTP (Life Technologies, NY, USA) и 1 единицей ДНК-полимеразы (ДНК-Полимеразы Hot Start II) в общем объеме 10 мкл. Условия реакции представляли собой: 30 с при 98°С, затем 40 циклов по 10 с при 98°С, 15 с при 60°С, 25 с при 72°С и, в конце концов, 60 с при 72°С.
Доказано, что анализ кривых плавления высокого разрешения (HRM) является чувствительным и высокопроизводительным способом в генетике человека и растений. HRM является неферментативным способом скрининга. В течение ПЦР-амплификации молекулы красителя (красителя LCGreen+, Idaho Technology Inc., UT, USA) встраиваются между каждой отжегшейся парой оснований двухцепочечной молекулы ДНК. При включении в молекулу краситель испускает флуоресценцию при 510 нм после возбуждения при 470 нм. С помощью камеры в детекторе флуоресценции (LightScanner, Idaho Technology Inc., UT, USA) регистрируют интенсивность флуоресценции при прогрессирующем нагреве образца ДНК. При температуре, зависящей от стабильности спиралей ДНК, специфической для последовательности, двухцепочечный продукт ПЦР начинает плавиться, высвобождая краситель. Высвобождение красителя приводит к снижению флуоресценции, регистрируемой с помощью детектора флуоресценции в виде кривой плавления. Совокупности, содержащие мутацию, образуют гетеродуплексы в смеси фрагментов после ПЦР. Их идентифицируют как дифференциальные кривые температуры плавления при сравнении с гомодуплексами.
Наличие конкретной мутаций в отдельных растениях подтверждали, повторяя анализ HRM на ДНК из отдельных партий семян М2 из соответствующей идентифицированной совокупности ДНК. Когда наличие мутации с учетом профиля HRM подтверждали в одном из четырех отдельных образцов ДНК семейства М2, ПЦР-фрагменты секвенировали для идентификации мутации в гене.
При определении мутации эффект такой мутации прогнозировали с использованием компьютерной программы CODDLe (Choosing codons to Optimize Discovery of Deleterious Lesions, http://www.proweb.org/coddle), с помощью которой идентифицировали области выбранного пользователем гена и его кодирующей последовательности, где предполагаемые точечные мутации наиболее вероятно приведут к неблагоприятным воздействиям на функцию гена.
Семена из семейств М2, содержащие мутации с прогнозируемым эффектом в отношении активности белка, высевали для фенотипического анализа растений.
Гомозиготных мутантов выбирали или получали после самоопыления и последующей селекции. Определяли эффект мутации в отношении соответствующего белка и фенотипа растения.
- 21 032773
Проращивали семена, содержащие различные идентифицированные мутации, и выращивали растения в горшках с почвой в теплице со свето-темновым циклом 16/8 и температурой 18°С ночью и 22-25°С днем. Для каждого генотипа выращивали 5 растений. Для анализа использовали второе, третье и четвертое соцветие. Соцветия обрезали, оставляя шесть цветков на соцветие, которым позволяли завязывать плод посредством самоопыления. Регистрировали даты завязывания плодов первого и шестого цветков, как и дату наступления стадии бурой окраски и стадии полной спелости первого и шестого плода. На стадии бурой окраски шестого плода гроздь собирали и хранили в открытой коробке в теплице. Состояние плодов регистрировали в течение всего периода созревания.
На более поздних стадиях определяли состояние плодов на основе визуальной оценки и регистрировали дату, когда самый поздний плод становился испорченным, и дальнейшую порчу плодов (о которой свидетельствовало дальнейшее размягчение плода, оцениваемое с помощью сдавливания плодов, и визуальная оценка дегидратации/потери воды, разрыв кожуры и рост грибков).
Идентифицировали следующих мутантов: мутанта 783, мутанта 2145, мутанта 2714, мутанта 3793, мутанта 4946, мутанта 7871 и мутанта 8185, и депонировали семена в NCIMB под указанными выше регистрационными номерами.
Мутации в нуклеотидной последовательности сравнивали с кДНК Acs2 дикого типа, приведенной в SEQ ID NO 9, и их эффект в отношении белковой последовательности каждого мутанта описан выше.
Растения, содержащие мутации в целевой последовательности, такие как указанные выше мутантные растения или полученные из них растения (например, с помощью самоопыления или скрещивания), и содержащие мутантный аллель acs2, демонстрировали нормальный вегетативный рост всех частей растений при сравнении с растениями дикого типа, за исключением созревания плодов томата. Растения, содержащие мутации в целевой последовательности подвергали фенотипическому скринингу на созревание плода, продукцию этилена и срок годности.
Пример 2. Характеристики созревания мутантов по acs2
Проращивали семена, содержащие различные мутации, и растения выращивали в горшках с почвой в теплице со свето-темновым циклом 16/8 и температурой 18°С ночью и 22-25°С днем. Для каждого генотипа выращивали 5 растений. Для анализа использовали второе, третье и четвертое соцветие. Соцветия обрезали, оставляя шесть цветков на соцветие, которым позволяли завязывать плод посредством самоопыления. Регистрировали даты завязывания плодов первого и шестого цветков, как и дату наступления стадии бурой окраски и стадии полной спелости первого и шестого плода. На стадии полной спелости 4-го плода гроздь собирали и хранили в открытой коробке в теплице.
Состояние плодов регистрировали в течение всего периода созревания, делая фотографии каждой грозди. После сбора урожая делали фотографии одной коробки, содержащей все грозди с одним генотипом.
На более поздних стадиях определяли состояние плодов на основе визуальной оценки плодов и регистрировали дату, когда самый поздний плод становился испорченным, и дальнейшую порчу плодов (о которой свидетельствовало дальнейшее размягчение плода, оцениваемое с помощью сдавливания плодов, и визуальная оценка дегидратации/потери воды, разрыв кожуры и рост грибков).
Характеристики созревания плодов представлены на фиг. 2. День, когда первый плод растения дикого типа входил в стадию бурой окраски плода, принимали за день 1. Дни после него нумеровали как последующие дни. Мутанты демонстрировали задержку созревания, т.е. плодам мутантов требовалось больше дней, чтобы стать красными и/или стать испорченными. В частности, мутанты 3793 и 2714 демонстрировали значимую задержку в несколько дней. Мутанту 3793 требовалось больше времени, чтобы пройти от нахождения первого плода в стадии бурой окраски плода до 100% плодов в стадии полной спелости.
Отличительным для плодов растений по изобретению является то, что стадия бурой окраски плода начинается позже (например, мутанты 783, 2145, 2714, 3793). Характеристики после сбора урожая представлены ниже. День, когда первый плод растения дикого типа входил в стадию бурой окраски плода, принимали за день 1. Дни после него нумеровали как последующие дни. ________
Первый плод на стадии бурой окраски Все плоды на стадии бурой окраски Первый плод на стадии полной спелости Все плоды на стадии полной спелости Первый плод на стадии порчи
wt 1 25 4 29 42
783 Но 8 18 14 22 49
2145 Но 4 22 8 22 >51
2714 Но 4 25 23 29 >51
3793 Но 4 35 8 39 >51
Как можно видеть, плоды мутантов позже входили в стадию бурой окраски плода. Одновременно плоды мутантов позже входили в стадию полной спелости, и дата, когда первые плоды мутантной линии входили в стадию порчи, наступала значимо позже, чем у дикого типа.
- 22 032773
Пример 3. Высвобождение этилена
Этилен, выделяемый плодами томата, измеряли в реальном времени с использованием лазерного детектора этилена (ETD-300, Sensor Sense B.V., Nijmegen, the Netherlands) в комбинации с галоулавливающей системой (Cristescu et al., Laser-based systems for trace gas detection in life sciences. Appl Phys В 2008; 92 pp 343-9). Использовали шесть стеклянных кювет (объемом 100 мл) на эксперимент, одну - в качестве референса без растительного материала. Собирали воздух из лаборатории и пропускали его через катализатор на основе платины (Sensor Sense B.V., Nijmegen, the Netherlands) для удаления следов этилена или других углеводородов. Между образцом и детектором помещали поглотители газов с KOH и CaCl2 для снижения концентрации СО2 (до менее чем 1 м.д.) и снижения влажности в потоке газа, соответственно.
При сравнении этилена, выделяемого плодами мутантов 2145, 2714, 3793, 4946, 7871 и 8185 с диким типом (Тара) на стадии розовой окраски и стадии полной спелости (как показано на фиг. 1) определяли, что продукция этилена всеми мутантами снижена по сравнению с диким типом (Тара) по меньшей мере на одной из этих стадий. Тара является высоко гомозиготной инбредной родительской линией, используемой в коммерческой технологии селекции томатов (TPAADASU в Gady et al, 2012 Molecular Selection 29 pp 801-812), и гомозиготной по аллелю Acs2 дикого типа (Acs2/Acs2). Мутанты 2145, 3793 и 4946 продуцировали меньше этилена по сравнению с Тара на обеих стадиях, в то время как мутанты 2714 и 8185 - только на стадии розовой окраски, а 7871 - только на стадии полной спелости.
На стадии розовой окраски мутант 2145 продуцировал приблизительно на 14% меньше этилена, чем дикий тип, мутант 2714 продуцировал приблизительно на 5% меньше этилена, чем дикий тип, мутанты 3793, и 8185 продуцировал приблизительно на 39-47% меньше этилена, чем дикий тип. Мутант 4946 продуцировал приблизительно на 80% меньше этилена на стадии розовой окраски по сравнению с диким типом: < приблизительно 1,0 нл/(ч-г) по сравнению с приблизительно 4,8 нл/(ч-г) для дикого типа. В то же время, на стадии полной спелости мутанты 2714 и 8185 продуцировали приблизительно на 14 и 12%, соответственно, больше этилена, чем дикий тип. Мутант 3793 на стадии полной спелости приблизительно продуцировал на 8% меньше этилена, чем дикий тип, мутанты 7871, 2145 и 4946 продуцировали приблизительно на 29, 33, 40%, соответственно, меньше этилена, чем дикий тип. Где нл/(ч-г) означает нанолитры в час на грамм плода.
Пример 4. Твердость плода томата/тест на сжатие
Высевали семена мутантной линии 8185 и с февраля по сентябрь 6 растений выращивали в горшках емкостью 5 л в стандартных тепличных условиях. Выбирали и помечали три кисти томатов на растение. Из каждой кисти плодов выбирали 3-ий и 4-ый томат для анализа развития плода и размягчения в течение процесса созревания. Для анализа использовали всего шесть томатов на растение. Обозначали дату наступления стадии бурой окраски, стадии желтой/розовой окраски и стадии полной спелости для каждого томата. Стадии определяли согласно United States Standards for Grade of Fresh Tomatoes (USDA; 1997, US department of Agriculture, Agricultural Marketing, Service, Washington, DC. Стадию созревания томатов определяли по цвету томатов (таблица цветов RHS). Зеленовато-бурый, 144В; Бурый, N144D; Оранжевый, N163C/D; Красный, 44А/В; Перезрелый (испорченный) N34A и 46А).
Помечали томаты, вошедшие в стадию полной спелости (день 0), и собирали их с растения для анализа или оставляли на растении для анализа в последующую временную точку. В последнем случае плоды, оставшиеся на растении, собирали для анализа в день 3, 7, 10, 14 или 18 после наступления стадии полной спелости. Таким образом, для каждой временной точки собирали 6 плодов. Собранные томаты после измерений хранили при 22°С. Твердость плода измеряли с помощью текстурометра (Компрессор/нагрузочная рама Instron, http://www.instron.us, ID системы: 3342L2018; модель датчика усилия 2519104), контролируемого с помощью компьютера с запущенной программой Bluehill 3 (Instron).
Твердость томатов измеряли способом, разработанным Sirisomboon и Tanaka (Panmanas Sirisomboon, Munehiro Tanaka, Takayuki Kojima 2012 Evaluation of tomato textural mechanical properties. J Food Engineering 111, 618-624), адаптированным по предпочтениям заявителей. Плод сдавливали между двумя стальными пластинами (верхняя из которых является плоской частью динамометрического датчика), движущимися со скоростью 1 мм в секунду, создающими нарастающую силу до достижения 4 Ньютон. Эту силу эмпирически определяли как достаточно высокую для получения количественно измеримого сжатия плода без повреждения ткани плода, что также делает возможным повторные измерения. Сразу после этого давление ослабляли до 0,1 Н. Затем давление снова повышали до измерения 4 Н. Среднюю деформацию (Dav) при повышении силы с 0,1 Н до 4 Н вычисляли по двум измерениям (Dav/3,9 (мм/Н)). Т.к. плоды отличаются по размеру, деформацию вычисляли относительно диаметра плода (Drel = Dav/диаметр плода (мм/(И-см)). Твердость плода выражали как силу, необходимую для снижения диаметра на 1 мм на см плода (10%) (Твердость = 1/Drel (N)).
День 0 равен дню, в который плоды собирали и измеряли в первый раз. Таким образом, одни и те же плоды измеряли 4 раза для получения точек данных через 7, 7, 14 и 21 день. При измерении твердости плода определяли, что мутант 8185 имеет большую твердость плода, особенно приблизительно через 7, 14 и или 21 день, при этом плодам мутанта 8185 требуется приблизительно на 1 Н больше для снижения
- 23 032773 диаметра плода на 1 мм на см плода (10%).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Nunhems B.V.
<120> Растения Solanum lycopersicum, имеющие нетрансгенные изменения гене ACS2 <130> BCS 12-8014 <160>24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211>485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>1
Met 1 Gly Phe Glu Ile 5 Ala Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
- 24 032773
Trp Arg Thr Gly Val 165 Gln Leu Ile Pro Ile 170 His Cys Glu Ser Ser 175 Asn
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
- 25 032773
Asn Met Asp Asp 420 Gly Thr Val Asp Ile 425 Ala Leu Ala Arg Ile 430 Arg Arg
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485 <210> 2 <211> 485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400> 2
Met 1 Gly Phe Glu Ile 5 Ala Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Ala Ile Thr Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
- 26 032773
Phe 145 Leu Val Pro Ser Pro 150 Tyr Tyr Pro Ala Phe 155 Asn Arg Asp Leu Arg 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
- 27 032773
Ser Ser Phe Glu Cys 405 Gln Glu Pro Gly Trp 410 Phe Arg Val Cys Phe 415 Ala
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485 <210>3 <211>485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>3
Met 1 Gly Phe Glu Ile 5 Ala Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Arg
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
- 28 032773
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile 135 Phe Cys Leu Ala Asp 140 Pro Gly Asp Ala
130
Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
- 29 032773
370
375
380
Leu 385 Trp Arg Val Ile Ile Asn 390 Asp Val Lys Leu 395 Asn Val Ser Pro Gly 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485 <210>4 <211>485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>4
Met 1 Gly Phe Glu Ile 5 Ala Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
- 30 032773
100
105
110
Arg Val Arg 115 Phe Asp Leu Glu Arg Val 120 Val Met Ala Gly 125 Gly Ala Thr
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
- 31 032773
Val Gly Ile 355 Lys Cys Leu Lys Asn 360 Asn Ala Gly Leu Phe 365 Cys Trp Met
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485 <210>5 <211>485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>5
Met 1 Gly Phe Glu Ile 5 Ala Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
- 32 032773
Lys Ser Phe Lys Ala 85 Ile Ala Asn Phe Gln 90 Asp Tyr His Gly Leu 95 Pro
Glu Phe Arg Lys Val Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
- 33 032773
Met Arg Leu Gly 340 Lys Arg His Lys His 345 Phe Thr Asn Gly Leu 350 Glu Val
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485 <210> 6 <211> 485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400> 6
Met 1 Gly Phe Glu Ile Ala 5 Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
- 34 032773
Asp 65 Trp Ile Lys Arg Asn 70 Pro Lys Gly Ser Ile 75 Cys Ser Glu Gly Ile 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Thr Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
- 35 032773
Met Leu Ser Asp Glu 325 Lys Phe Val Asp Asn 330 Phe Leu Arg Glu Ser 335 Ala
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485 <210>7 <211>485 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>7
Met 1 Gly Phe Glu Ile Ala 5 Lys Thr Asn Ser 10 Ile Leu Ser Lys Leu 15 Ala
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
- 36 032773
Ile Gln 50 Met Gly Leu Ala Glu 55 Asn Gln Leu Cys Leu 60 Asp Leu Ile Glu
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Tyr Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
- 37 032773
290
295
300
Ser 305 Ser Phe Gly Leu Val 310 Ser Thr Gln Thr Gln 315 Tyr Phe Leu Ala Ala 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val Arg
485
<210> 8
<211> 485
<212> Белок
<213> Lycopersicon esculentum
<400> 8
Met Gly Phe Glu Ile Ala Lys Thr Asn Ser Ile Leu Ser Lys Leu Ala
1 5 10 15
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr
Phe Asp Gly Trp Lys
- 38 032773
Ala Tyr Asp 35 Ser Asp Pro Phe His 40 Pro Leu Lys Asn Pro 45 Asn Gly Val
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu
50 55 60
Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile
65 70 75 80
Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro
85 90 95
Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val Val Met Ala Gly Gly Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Phe Leu Glu Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Asn Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Gln Leu Ile Pro Ile His Cys Glu Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu
210 215 220
Ser Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile
245 250 255
Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile
260 265 270
- 39 032773
Val Tyr Ser 275 Leu Ser Lys Asp Met 280 Gly Leu Pro Gly Phe 285 Arg Val Gly
Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met
290 295 300
Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala
305 310 315 320
Met Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala
325 330 335
Met Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val
340 345 350
Val Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met
355 360 365
Asp Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser
370 375 380
Leu Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg
420 425 430
Phe Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Gln
435 440 445
Lys Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg
450 455 460
Met Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro
465 470 475 480
Ser Pro Leu Val
Arg
485
<210> 9
<211> 1459
<212> Белок
<213> Lycopersicon esculentum
<400> 9 atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag
- 40 032773
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gcgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 10 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 10
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
- 41 032773
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gcgattacga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 11 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 11
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gcgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaagaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
- 42 032773
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 12 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 12
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gcgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tctagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
- 43 032773
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 13 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 13
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gtgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
- 44 032773
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 14 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 14
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
acgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
- 45 032773
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 15 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 15
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gcgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttagt accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actacaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
- 46 032773
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt 1380
ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc 1440
tcaccattag ttcgttaag 1459
<210> 16 <211> 1459 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <400> 16
atgggatttg agattgcaaa gaccaactca atcttatcaa aattggctac taatgaagag 60
catggcgaaa actcgccata ttttgatggg tggaaagcat acgatagtga tcctttccac 120
cctctaaaaa accccaacgg agttatccaa atgggtcttg ctgaaaatca gctttgttta 180
gacttgatag aagattggat taagagaaac ccaaaaggtt caatttgttc tgaaggaatc 240
aaatcattca aggccattgc caactttcaa gattatcatg gcttgcctga attcagaaaa 300
gcgattgcga aatttatgga gaaaacaaga ggaggaagag ttagatttga tccagaaaga 360
gttgttatgg ctggtggtgc cactggggct aatgagacaa ttatattttg tttggctgat 420
cctggcgatg catttttaga accttcacca tactacccag catttaacag agatttaaga 480
tggagaactg gagtacaact tattccaatt cactgtgaga gctccaataa tttcaaaatt 540
acttcaaaag cagtaaaaga agcatatgaa aatgcacaaa aatcaaacat caaagtaaaa 600
ggtttgattt tgaccaatcc atcaaatcca ttgggcacca ctttggacaa agacacactg 660
aaaagtgtct tgagtttcac caaccaacac aacatccacc ttgtttgtga cgaaatctac 720
gcagccactg tctttgacac gcctcaattc gtcagtatag ctgaaatcct cgatgaacag 780
gaaatgactt actgcaacaa agatttagtt cacatcgtct acagtctttc aaaagacatg 840
gggttaccag gatttagagt cggaatcata tattctttta acgacgatgt cgttaattgt 900
gctagaaaaa tgtcgagttt cggtttagta tctacacaaa cgcaatattt tttagcggca 960
atgctatcgg acgaaaaatt cgtcgataat tttctaagag aaagcgcgat gaggttaggt 1020
aaaaggcaca aacattttac taatggactt gaagtagtgg gaattaaatg cttgaaaaat 1080
aatgcggggc ttttttgttg gatggatttg cgtccacttt taagggaatc gactttcgat 1140
agcgaaatgt cgttatggag agttattata aacgatgtta agcttaacgt ctcgcctgga 1200
tcttcgtttg aatgtcaaga gccagggtgg ttccgagttt gttttgcaaa tatggatgat 1260
ggaacggttg atattgcgct cgcgaggatt cggaggttcg taggtgttga gaaaagtgga 1320
- 47 032773 gataaatcga gttcgatgga acagaagcaa caatggaaga agaataattt gagacttagt
1380 ttttcgaaaa gaatgtatga tgaaagtgtt ttgtcaccac tttcgtcacc tattcctccc
1440 tcaccattag ttcgttaag
1459 <210> 17 <211> 2523 <212> ДНК <213> Lycopersicon esculentum <220>
<221> Экзон <222> (1)..(171) <223> Экзон 1 <220>
<221> Экзон <222> (270)..(399) <223> Экзон 2 <220>
<221> Экзон <222> (485)..(644) <223> Экзон 3 <220>
<221> Экзон <222> (1526)..(2523) <223> Экзон 4
<400> 17 atc Ile tta Leu tca Ser aaa Lys ttg gct Leu Ala 15 48
atg Met 1 gga Gly ttt Phe gag Glu att Ile 5 gca Ala aag Lys acc Thr aac Asn tca Ser 10
act aat gaa gag cat ggc gaa aac tcg cca tat ttt gat ggg tgg aaa 96
Thr Asn Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys
20 25 30
gca tac gat agt gat cct ttc cac cct cta aaa aac ccc aac gga gtt 144
Ala Tyr Asp Ser Asp Pro Phe His Pro Leu Lys Asn Pro Asn Gly Val
35 40 45
atc caa atg ggt ctt gct gaa aat cag gtaattaatt atcctttatt 191
Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln
50 55
251 tatatatttt gcagtttgac caaacagact attataattt ttttctgaaa cctcgatggt
gttaaatttc ttttgtag ctt Leu tgt Cys tta Leu 60 gac Asp ttg Leu ata gaa gat tgg Trp att Ile aag Lys 302
Ile Glu Asp 65
aga aac cca aaa ggt tca att tgt tct gaa gga atc aaa tca ttc aag 350
Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys
70 75 80
gcc att gcc aac ttt caa gat tat cat ggc ttg cct gaa ttc aga aaa g 399
Ala Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Lys
- 48 032773
100 tacatatcgt actatagtca gttaaattat attgatagta taaaaattcg ttaatatatt
459 taactaacga gtttatttaa tcagg cg att gcg aaa ttt atg gag aaa aca510
Ala Ile Ala Lys Phe Met Glu Lys Thr
105
aga Arg 110 gga Gly gga Gly aga Arg gtt Val aga Arg 115 ttt Phe gat Asp cca Pro gaa Glu aga Arg 120 gtt Val gtt Val atg Met gct Ala ggt Gly 125 558
ggt gcc act gga gct aat gag aca att ata ttt tgt ttg gct gat cct 606
Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys Leu Ala Asp Pro
130 135 140
ggc gat gca ttt tta gta cct tca cca tac tac cca gc gtaagtatat 654
Gly Asp Ala Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala
145 150
ttaattatat atgtgtaaaa aaaattaaaa tcatcaaatc atttttttta tttgtattac714 caaataaatt gtctaatttt caagattgta acacattcat caaagtacct aataatataa774 acgattcagt atattaacga tgtatataat ttaattcctt tggcggattt gtctttttat834 gttgggccat cagaagaaca ttctggtgta ttaattaatt aattaattaa taatagatgt894 gttgtcattc ttttttaaga cagcgagagt ttaattagtc ttaattactg gattatcacg954 caagctcttt cttgaatttt attattctta tattaaacac atgatagcat aatatctttc1014 ttttgtggaa tccagcttgt tcgtgaagct ttgtattcac acttataaaa caacaaaaaa1074 taaaatctgg tggtaattga ttaaagagag aaatataaaa aaataatagt caaatagact1134 aataaggaaa gaaataaaaa atacacaaaa tactaaaaaa aaagaattaa ggtatagtgg1194 tctattattg agaacttttt tgaagaattg aaccccactt taatttcttg cttgacccgt1254 gaccattgct tatcgaggta aaataaaatt tcaaacattg actatgactt gttagagagt1314 aattaccaca agtcaaaatt ttgttactct gtctcgttat ttcattagga tcgataagat1374 aacatctaac atatatatct tttttattag tacttgttta tttttagtaa aagcacgtta1434 tacattttac aatagtcaat tgttgcatat attagtatat atattttgct aagtcctaac1494 taacaatatt tttggcaatt gactaatgca g a ttt aac aga gat tta aga tgg1547
Phe Asn Arg Asp Leu Arg Trp
155160
aga Arg act Thr gga Gly gta Val 165 caa Gln ctt Leu att Ile cca Pro att Ile 170 cac His tgt Cys gag Glu agc Ser tcc Ser 175 aat Asn aat Asn 1595
ttc aaa att act tca aaa gca gta aaa gaa gca tat gaa aat gca caa 1643
Phe Lys Ile Thr Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Tyr Glu Asn Ala Gln
180 185 190
aaa tca aac atc aaa gta aaa ggt ttg att ttg acc aat cca tca aat 1691
Lys Ser Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser Asn
195 200 205
- 49 032773
cca Pro 210 ttg Leu ggc Gly acc Thr act Thr ttg Leu 215 gac Asp aaa Lys gac Asp aca Thr ctg Leu 220 aaa Lys agt Ser gtc Val ttg Leu agt Ser 225 1739
ttc acc aac caa cac aac atc cac ctt gtt tgt gac gaa atc tac gca 1787
Phe Thr Asn Gln His Asn Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr Ala
230 235 240
gcc act gtc ttt gac acg cct caa ttc gtc agt ata gct gaa atc ctc 1835
Ala Thr Val Phe Asp Thr Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile Leu
245 250 255
gat gaa cag gaa atg act tac tgc aac aaa gat tta gtt cac atc gtc 1883
Asp Glu Gln Glu Met Thr Tyr Cys Asn Lys Asp Leu Val His Ile Val
260 265 270
tac agt ctt tca aaa gac atg ggg tta cca gga ttt aga gtc gga atc 1931
Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly Ile
275 280 285
ata tat tct ttt aac gac gat gtc gtt aat tgt gct aga aaa atg tcg 1979
Ile Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Val Val Asn Cys Ala Arg Lys Met Ser
290 295 300 305
agt ttc ggt tta gta tct aca caa acg caa tat ttt tta gcg gca atg 2027
Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Phe Leu Ala Ala Met
310 315 320
cta tcg gac gaa aaa ttc gtc gat aat ttt cta aga gaa agc gcg atg 2075
Leu Ser Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Phe Leu Arg Glu Ser Ala Met
325 330 335
agg tta ggt aaa agg cac aaa cat ttt act aat gga ctt gaa gta gtg 2123
Arg Leu Gly Lys Arg His Lys His Phe Thr Asn Gly Leu Glu Val Val
340 345 350
gga att aaa tgc ttg aaa aat aat gcg ggg ctt ttt tgt tgg atg gat 2171
Gly Ile Lys Cys Leu Lys Asn Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met Asp
355 360 365
ttg cgt cca ctt tta agg gaa tcg act ttc gat agc gaa atg tcg tta 2219
Leu Arg Pro Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Ser Glu Met Ser Leu
370 375 380 385
tgg aga gtt att ata aac gat gtt aag ctt aac gtc tcg cct gga tct 2267
Trp Arg Val Ile Ile Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly Ser
390 395 400
tcg ttt gaa tgt caa gag cca ggg tgg ttc cga gtt tgt ttt gca aat 2315
Ser Phe Glu Cys Gln Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala Asn
405 410 415
atg gat gat gga acg gtt gat att gcg ctc gcg agg att cgg agg ttc 2363
Met Asp Asp Gly Thr Val Asp Ile Ala Leu Ala Arg Ile Arg Arg Phe
420 425 430
gta ggt gtt gag aaa agt gga gat aaa tcg agt tcg atg gaa aag aag 2411
Val Gly Val Glu Lys Ser Gly Asp Lys Ser Ser Ser Met Glu Lys Lys
435 440 445
caa caa tgg aag aag aat aat ttg aga ctt agt ttt tcg aaa aga atg 2459
Gln Gln Trp Lys Lys Asn Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Lys Arg Met
- 50 032773
2507
450 455 460 465
tat gat gaa agt gtt ttg tca cca ctt tcg tca cct att cct ccc tca
Tyr Asp Glu Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Pro Ile Pro Pro Ser
470 475 480
cca tta gtt cgt taa g
Pro Leu Val Arg
485
2523 <210> 18 <211>97 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>18
Leu 1 Cys Leu Asp Leu 5 Ile Glu Asp Trp Ile 10 Lys Arg Asn Pro Lys 15 Gly
Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe
20 25 30
Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Lys Ala Ile Thr Lys Phe
35 40 45
Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val
50 55 60
Val Met Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys
65 70 75 80
Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro
85 90 95
Ala <210>19 <211>97 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400>19
Leu 1 Cys Leu Asp Leu 5 Ile Glu Asp Trp Ile 10 Lys Arg Asn Pro Lys 15 Gly
Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe
20 25 30
Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe
35 40 45
- 51 032773
Met Glu Lys 50 Thr Arg Gly Arg 55 Arg Val Arg Phe Asp 60 Pro Glu Arg Val
Val Met Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys
65 70 75 80
Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro
85 90 95
Ala <210> 20 <211> 97 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400> 20
Leu 1 Cys Leu Asp Leu 5 Ile Glu Asp Trp Ile 10 Lys Arg Asn Pro Lys 15 Gly
Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe
20 25 30
Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe
35 40 45
Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly Arg Val Arg Phe Asp Leu Glu Arg Val
50 55 60
Val Met Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys
65 70 75 80
Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro
85 90 95
Ala
<210> 21
<211> 97
<212> Белок
<213> Lycopersicon esculentum
<400> 21
Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly
1 5 10 15
- 52 032773
Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe
20 25 30
Gln Asp Tyr His 35 Gly Leu Pro Glu 40 Phe Arg Lys Val Ile 45 Ala Lys Phe
Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val
50 55 60
Val 65 Met Ala Gly Gly Ala 70 Thr Gly Ala Asn Glu 75 Thr Ile Ile Phe Cys 80
Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro
85 90 95
Ala <210> 22 <211> 97 <212> Белок <213> Lycopersicon esculentum <400> 22
Leu 1 Cys Leu Asp Leu 5 Ile Glu Asp Trp Ile 10 Lys Arg Asn Pro Lys 15 Gly
Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe
20 25 30
Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Lys Thr Ile Ala Lys Phe
35 40 45
Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val
50 55 60
Val Met Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys
65 70 75 80
Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Val Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro
85 90 95
Ala
<210> 23
<211> 115
<212> Белок
<213> Lycopersicon esculentum
- 53 032773 <220>
<221> misc_feature <222> (115)..(115) <223> Xaa - может являться любой встречающейся в природе аминокислотой <400> 23
Ala Val 1 Lys Glu Ala 5 Tyr Glu Asn Ala Gln 10 Lys Ser Asn Ile Lys 15 Val
Lys Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Ser Asn Pro Leu Gly Thr Thr Leu
20 25 30
Asp Lys Asp Thr Leu Lys Ser Val Leu Ser Phe Thr Asn Gln His Asn
35 40 45
Ile His Leu Val Cys Asp Glu Ile Tyr Ala Ala Thr Val Phe Asp Thr
50 55 60
Pro Gln Phe Val Ser Ile Ala Glu Ile Leu Asp Glu Gln Glu Met Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Asn Lys Asp Leu Val His Ile Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp
85 90 95
Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly Ile Ile Tyr Ser Phe Asn Asp
100 105 110
Asp Val Xaa
115
<210> 24
<211> 97
<212> Белок
<213> Lycopersicon esculentum
<400> 24
Leu Cys Leu Asp Leu Ile Glu Asp Trp Ile Lys Arg Asn Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Ile Cys Ser Glu Gly Ile Lys Ser Phe Lys Ala Ile Ala Asn Phe
20 25 30
Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg Lys Ala Ile Ala Lys Phe
35 40 45
Met Glu Lys Thr Arg Gly Gly Arg Val Arg Phe Asp Pro Glu Arg Val
50 55 60
Val Met Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Asn Glu Thr Ile Ile Phe Cys
- 54 032773
65 70 75 80
Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Glu Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro
85 90 95
Ala
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Культивируемое растение вида Solanum lycopersicum, содержащее аллель синтазы 1-
аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (acs2), содержащий одну или несколько мутаций, которые приводят к образованию мутантного белка Acs2, содержащего одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y по отношению к белку Acs2 дикого типа, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и

Claims (14)

  1. 65 70 75 80 Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Glu Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro 85 90 95 Ala ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Культивируемое растение вида Solanum lycopersicum, содержащее аллель синтазы 1-
    аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (acs2), содержащий одну или несколько мутаций, которые приводят к образованию мутантного белка Acs2, содержащего одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y по отношению к белку Acs2 дикого типа, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и где указанный мутантный белок Acs2 обладает утраченной функцией или сниженной функцией по сравнению с указанным белком Acs2 дикого типа и его образование приводит к сниженной продукции этилена и/или замедленному созреванию плодов и/или увеличенному сроку годности плодов по сравнению с растением Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю ACS2 дикого типа, кодирующему указанный белок Acs2 дикого типа.
  2. 2. Культивируемое растение по п.1, где образование мутантного белка Acs2 приводит к тому, что 10% плодов указанного растения достигают стадии полной спелости по меньшей мере на 2 дня позже чем плоды растения Solanum lycopersicum, гомозиготного по аллелю ACS2 дикого типа, кодирующего указанный белок Acs2 дикого типа.
  3. 3. Культивируемое растение по п.2, где образование мутантного белка Acs2 приводит к образованию плодов, которым необходимо по меньшей мере на два дня больше времени для достижения стадии порчи по сравнению с плодами растения Solanum lycopersicum, гомозиготного по аллелю ACS2 дикого типа, кодирующего указанный белок Acs2 дикого типа.
  4. 4. Культивируемое растение по п.2 или 3, где образование мутантного белка Acs2 приводит к образованию плодов, в которых продукция этилена снижена по меньшей мере на 10% по сравнению с плодами растения Solanum lycopersicum, гомозиготного по аллелю ACS2 дикого типа, кодирующего указанный белок Acs2 дикого типа.
  5. 5. Культивируемое растение по любому из предшествующих пунктов, которое является гибридным растением F1.
  6. 6. Культивируемое растение по любому из предшествующих пунктов, где мутантный аллель acs2 находится в гомозиготной форме.
  7. 7. Культивируемое растение по любому из предшествующих пунктов, которое дополнительно содержит аллель синтазы 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (acs4), содержащий одну или несколько мутаций, приводящих к образованию мутантного белка Acs4 с утраченной функцией или сниженной функцией по сравнению с белком Acs4 дикого типа, где белок Acs4 дикого типа имеет последовательность белка, представленную на фиг. 5.
  8. 8. Культивируемое растение по п.7, где указанный мутантный аллель acs4 получен из семян растений NCIMB 42034 (мутант 2477), и/или NCIMB 42037 (мутант 4043), и/или NCIMB 42038 (мутант 4222), и/или NCIMB 42039 (мутант 4691), и/или NCIMB 42041 (мутант 5251).
  9. 9. Плод, семена или пыльца растения по любому из пп.1-8, содержащие мутантный белок Acs2, содержащий одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из А101Т, A101V, А103Т, G112R, P118L, V147E и C265Y по отношению к белку Acs2 дикого типа, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
  10. 10. Плод по п.9, имеющий сниженную продукцию этилена и/или замедленное созревание и/или увеличенный срок годности по сравнению с плодами растения Solanum lycopersicum, гомозиготного по аллелю ACS2 дикого типа.
  11. 11. Плод по п.10, срок годности которого по меньшей мере на 2 дня больше, чем срок годности плода растения, гомозиготного по аллелю ACS2 дикого типа.
  12. 12. Плод по п.10, в котором продукция этилена снижена по меньшей мере на 10% по сравнению с плодом растения Solanum lycopersicum, гомозиготным по аллелю ACS2 дикого типа.
  13. 13. Культивируемое растение по п.4 или плод по п.12, где сниженная продукция этилена определена на стадии розовой окраски и/или стадии полной спелости плода.
  14. 14. Пищевой продукт, содержащий или представляющий собой плод по любому из пп.9-12 или части указанного плода.
EA201590981A 2012-11-21 2013-11-20 Растения solanum lycopersicum, имеющие нетрансгенные изменения в гене acs2 EA032773B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12193592 2012-11-21
PCT/EP2013/074309 WO2014079896A1 (en) 2012-11-21 2013-11-20 Solanum lycopersicum plants having non-transgenic alterations in the acs2 gene

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590981A1 EA201590981A1 (ru) 2015-09-30
EA032773B1 true EA032773B1 (ru) 2019-07-31

Family

ID=47191635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590981A EA032773B1 (ru) 2012-11-21 2013-11-20 Растения solanum lycopersicum, имеющие нетрансгенные изменения в гене acs2

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9832943B2 (ru)
EP (1) EP2931026A1 (ru)
CN (1) CN104936438A (ru)
AU (1) AU2013349743B2 (ru)
CA (1) CA2891720C (ru)
EA (1) EA032773B1 (ru)
MX (1) MX357721B (ru)
WO (1) WO2014079896A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201708662D0 (en) * 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
US20210323950A1 (en) 2018-06-04 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Herbicidally active bicyclic benzoylpyrazoles
CN114107268B (zh) * 2021-11-09 2023-11-14 南开大学 高等植物acs双酶活关键位点突变制备得到的单酶活突变体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723766A (en) * 1990-09-10 1998-03-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Agriculture Control of fruit ripening through genetic control of ACC synthase synthesis
WO2005048692A2 (en) * 2003-11-17 2005-06-02 Arcadia Biosciences, Inc. Tomatoes having reduced deoxyhypusine synthase activity caused by non-transgenic alterations in a deoxyhypusine synthase gene

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9100993A (es) 1990-09-10 1992-05-04 Us Agriculture Secuencia de adn aislado y enzima acido 1-aminociclopropan-1-carboxilico sintasa,recombinante
CN1871346B (zh) 2003-06-23 2013-05-29 先锋高级育种国际公司 将单基因控制的保绿潜力工程化进植物中
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723766A (en) * 1990-09-10 1998-03-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Agriculture Control of fruit ripening through genetic control of ACC synthase synthesis
WO2005048692A2 (en) * 2003-11-17 2005-06-02 Arcadia Biosciences, Inc. Tomatoes having reduced deoxyhypusine synthase activity caused by non-transgenic alterations in a deoxyhypusine synthase gene

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. S. BARRY: "The Regulation of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid Synthase Gene Expression during the Transition from System-1 to System-2 Ethylene Synthesis in Tomato", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, vol. 123, no. 3, 1 July 2000 (2000-07-01), pages 979 - 986, XP055055635, ISSN: 00320889, DOI: 10.1104/pp.123.3.979 *
H. S. CHAE, FRANCOIS FAURE, JOSEPH KIEBER: "The eto1, eto2, and eto3 Mutations and Cytokinin Treatment Increase Ethylene Biosynthesis in Arabidopsis by Increasing the Stability of ACS Protein", THE PLANT CELL ONLINE, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, vol. 15, no. 2, 1 February 2003 (2003-02-01), pages 545 - 559, XP055055661, ISSN: 10404651, DOI: 10.1105/tpc.006882 *
M. TATSUKI: "Phosphorylation of Tomato 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic Acid Synthase, LE-ACS2, at the C-terminal Region", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 276, no. 30, 20 July 2001 (2001-07-20), pages 28051 - 28057, XP055055657, ISSN: 00219258, DOI: 10.1074/jbc.M101543200 *
Y. OKABE, E. ASAMIZU, T. SAITO, C. MATSUKURA, T. ARIIZUMI, C. BRES, C. ROTHAN, T. MIZOGUCHI, H. EZURA: "Tomato TILLING Technology: Development of a Reverse Genetics Tool for the Efficient Isolation of Mutants from Micro-Tom Mutant Libraries", PLANT AND CELL PHYSIOLOGY, JAPANESE SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS., vol. 52, no. 11, 1 November 2011 (2011-11-01), pages 1994 - 2005, XP055055641, ISSN: 00320781, DOI: 10.1093/pcp/pcr134 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2891720A1 (en) 2014-05-30
US20150282446A1 (en) 2015-10-08
MX2015006230A (es) 2015-08-14
MX357721B (es) 2018-07-20
CA2891720C (en) 2022-05-03
US9832943B2 (en) 2017-12-05
AU2013349743A1 (en) 2015-05-21
AU2013349743B2 (en) 2019-11-14
CN104936438A (zh) 2015-09-23
EA201590981A1 (ru) 2015-09-30
WO2014079896A1 (en) 2014-05-30
EP2931026A1 (en) 2015-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2019507595A (ja) 低減された損傷誘発性表面変色を示す植物
AU2014211518B2 (en) Solanum lycopersicum plants having pink fruits
US20170359979A1 (en) Solanum lycopersicum plants having pink glossy fruits
AU2013349743B2 (en) Solanum lycopersicum plants having non-transgenic alterations in the acs2 gene
US20220053731A1 (en) Solanaceous plant capable of stenospermocarpic fruit formation
US20220307045A1 (en) Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics
CA2886130C (en) Solanum lycopersicum plants having non-transgenic alterations in the acs4 gene
US20150135352A1 (en) Solanum lycopersicum plants having non-transgenic alterations in the rin gene
WO2016202927A1 (en) Tomato plants having a non-transgenic alteration in the dhs gene

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM BY KZ KG TJ TM