EA032507B1 - Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery - Google Patents
Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery Download PDFInfo
- Publication number
- EA032507B1 EA032507B1 EA201700521A EA201700521A EA032507B1 EA 032507 B1 EA032507 B1 EA 032507B1 EA 201700521 A EA201700521 A EA 201700521A EA 201700521 A EA201700521 A EA 201700521A EA 032507 B1 EA032507 B1 EA 032507B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- microspheres
- nanospheres
- histone
- suspension
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 136
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 230000009471 action Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 title claims description 9
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 128
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 38
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 30
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 23
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 4
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 claims description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 36
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 28
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 10
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 9
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 8
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 4
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- -1 1dC Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N h2o hydrate Chemical compound O.O JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M methacrylate group Chemical group C(C(=C)C)(=O)[O-] CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 238000012667 polymer degradation Methods 0.000 description 2
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purine-6-thione Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=S)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241001506137 Rapa Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920001586 anionic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010415 colloidal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethoxyethane Chemical compound CCO.CCOCC PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к наномедицине, которая использует биодеградируемые наносферы и микросферы для включения в их состав биологически активных белков для стабилизации их структуры. Данный способ предусматривает предварительное включение гистона животного происхождения в состав матрикса наносфер диаметром не более 1000 нм, которые получают на основе декстрана, и последующее включение наносфер с гистоном в резорбируемые микросферы, которые получают на основе сополимера полилактидгликолида. Высвобождение гистона из резорбируемых микросфер происходит в течение не менее 50 суток. Представленное изобретение обеспечивает сохранение нативной структуры белка за счет его включения в состав полимерных наносфер, повышает надежность и упрощает способ получения нативного белка в составе полимерных наносфер и резорбируемых микросфер, которые предназначены для пролонгации физиологического действия нативного белка, применяемого в терапевтических целях.The invention relates to medicine, in particular to nanomedicine, which uses biodegradable nanospheres and microspheres to include biologically active proteins in their composition to stabilize their structure. This method involves the preliminary inclusion of histone of animal origin in the matrix of nanospheres with a diameter of not more than 1000 nm, which are obtained on the basis of dextran, and the subsequent inclusion of nanospheres with histone in resorbable microspheres, which are obtained on the basis of a polylactide glycolide copolymer. The release of histone from resorbable microspheres occurs within at least 50 days. The presented invention ensures the preservation of the native structure of the protein due to its inclusion in the composition of polymer nanospheres, increases the reliability and simplifies the method of obtaining the native protein in the composition of polymer nanospheres and resorbable microspheres, which are designed to prolong the physiological effect of the native protein used for therapeutic purposes.
Изобретение относится к области медицины, в частности к наномедицине, которая использует нанотехнологии и наноструктурные системы в области нанодиагностики, нанотерапии и тканевой инженерии.The invention relates to medicine, in particular to nanomedicine, which uses nanotechnology and nanostructure systems in the field of nanodiagnostics, nanotherapy and tissue engineering.
Наночастицы определяют как плотные коллоидные частицы, размеры которых лежат в диапазоне от 10 до 1000 нм. Наночастицы, в основном, могут быть построены из макромолекул или ансамблей макромолекул, таких как синтетические преформированные полимеры (например, сополимер полилактидгликолид, полилактид-полиэтиленгликоль), или из природных макромолекул, таких как альгинат, хитозан, желатин, а также из полисахаридов (декстран). В наночастицах лекарственное средство или биологически активные высокомолекулярные соединения либо растворены, включены, инкапсулированы, либо адсорбированы, либо химически связаны с матриксом наночастиц [1]. В зависимости от способа изготовления наночастицы можно получить в виде наносфер или нанокапсул. Нанокапсулы - это система, в которой лекарственное средство заключено в полость капсулы, окруженной специфической полимерной мембраной. Наносферы - это матриксная система, в которой лекарственное средство физически и однородно диспергировано в матриксе полимера.Nanoparticles are defined as dense colloidal particles, the sizes of which lie in the range from 10 to 1000 nm. Nanoparticles can mainly be constructed from macromolecules or ensembles of macromolecules, such as synthetic preformed polymers (e.g. polylactide glycolide copolymer, polylactide-polyethylene glycol), or from natural macromolecules such as alginate, chitosan, gelatin, and also from polysaccharides ( . In nanoparticles, the drug or biologically active macromolecular compounds are either dissolved, incorporated, encapsulated, or adsorbed, or chemically bound to the matrix of nanoparticles [1]. Depending on the manufacturing method, the nanoparticles can be obtained in the form of nanospheres or nanocapsules. Nanocapsules is a system in which a drug is enclosed in a capsule cavity surrounded by a specific polymer membrane. Nanospheres are a matrix system in which a drug is physically and uniformly dispersed in a polymer matrix.
Биодеградируемые микро- и наночастицы используют для включения в их состав биологически активных макромолекул для повышения их стабильности, биодоступности и повышения терапевтического индекса при непрерывном и контролируемом высвобождении в течение длительного периода времени [2-4].Biodegradable micro- and nanoparticles are used to include biologically active macromolecules in their composition to increase their stability, bioavailability and increase the therapeutic index with continuous and controlled release over a long period of time [2-4].
Рассматривают три возможных механизма высвобождения лекарственных средств или биомакромолекул, включенных в микро- и наночастицы:Three possible mechanisms for the release of drugs or biomacromolecules included in micro- and nanoparticles are considered:
в результате диффузии через поры;as a result of diffusion through the pores;
в результате ферментативного расщепления или деградации полимера;as a result of enzymatic cleavage or degradation of the polymer;
при диссоциации лекарственного средства или биомакромолекул, связанных с полимером.upon dissociation of a drug or biomacromolecules bound to a polymer.
Высвобождение инкапсулированных макромолекул в результате деструкции полимера рассматривается как механизм контролируемого высвобождения макромолекул, который зависит от состава полимера (гомополимер или гетерополимер), молекулярной массы полимера и соотношения входящих в состав гетерополимера мономеров.The release of encapsulated macromolecules as a result of polymer degradation is considered as a mechanism for the controlled release of macromolecules, which depends on the composition of the polymer (homopolymer or heteropolymer), the molecular weight of the polymer, and the ratio of the monomers included in the heteropolymer.
Способность направленной доставки лекарственных средств к мишени определяют такие факторы как размеры наночастиц, их поверхностный заряд, гидрофильность и характер модификации их поверхности [5-7].The ability of targeted delivery of drugs to the target is determined by such factors as the size of the nanoparticles, their surface charge, hydrophilicity and the nature of the modification of their surface [5-7].
Исходя из этого, в каждом конкретном случае для нового класса белковых молекул, предназначенных для инкапсулирования в наночастицы, требуется индивидуальное проектирование технологического процесса их приготовления, т.е. процесса формулирования с учетом особенностей их физикохимических свойств, выбора мишени их действия и путей введения в организм.Based on this, in each case, for a new class of protein molecules intended for encapsulation in nanoparticles, individual design of the technological process of their preparation is required, i.e. the process of formulating, taking into account the peculiarities of their physicochemical properties, the choice of the target of their action and the routes of introduction into the body.
Процесс формулирования наносфер с преформированными полимерами включает удаление органического растворителя из системы формулирования [8]. В этом способе полимер растворяют в органическом растворителе. Лекарственное средство диспергируют в растворе преформированного полимера, затем смесь эмульгируют в водном растворе, чтобы получить эмульсию как масло (О, ой) в воде (^, \та1сг). то есть О/\У эмульсию, используя эмульгирующий агент. После образования эмульсии органический растворитель удаляют либо при повышенной температуре, либо в вакууме, либо при продолжительном перемешивании, что приводит к образованию наночастиц. Способ спонтанной эмульгации (способ диффузии органического растворителя) рассматривают как модифицированную версию способа удаления органического растворителя. В этом способе водорастворимый органический растворитель, наряду с водонерастворимым органическим растворителем, используют как органическую фазу. За счет спонтанной диффузии водорастворимого органического растворителя на границе раздела между двумя фазами возникает турбуленция, что приводит к образованию частиц малого размера. Этот технологический прием получения наносфер, также известен как способ нанопреципитации.The process of formulating nanospheres with preformed polymers involves the removal of an organic solvent from the formulation system [8]. In this method, the polymer is dissolved in an organic solvent. The drug is dispersed in a solution of the preformed polymer, then the mixture is emulsified in an aqueous solution to obtain an emulsion as an oil (O, oh) in water (^, \ ta / cg). that is, O / U emulsion using an emulsifying agent. After the formation of the emulsion, the organic solvent is removed either at elevated temperature, or in vacuum, or with prolonged stirring, which leads to the formation of nanoparticles. The method of spontaneous emulsification (organic solvent diffusion method) is considered as a modified version of the organic solvent removal method. In this method, a water-soluble organic solvent, along with a water-insoluble organic solvent, is used as the organic phase. Due to the spontaneous diffusion of a water-soluble organic solvent, turbulence occurs at the interface between the two phases, which leads to the formation of small particles. This technique for producing nanospheres is also known as a nanoprecipitation method.
Фактически формулирование наночастиц основано на использовании наноэмульсионных систем, которые можно рассматривать как матрицы для получения наночастиц.In fact, the formulation of nanoparticles is based on the use of nanoemulsion systems, which can be considered as matrices for producing nanoparticles.
Микросферы на основе резорбируемого сополимера полилактид-гликолида часто используют при создании систем доставки биологически активных макромолекул. Однако имеется ряд проблем, связанных с использованием этих систем. Во-первых, для приготовления нагруженных белком микросфер используют органические растворители, которые оказывают неблагоприятное воздействие на стабильность белковых молекул.Microspheres based on a resorbable polylactide-glycolide copolymer are often used to create delivery systems for biologically active macromolecules. However, there are a number of problems associated with the use of these systems. First, organic solvents are used to prepare protein-loaded microspheres, which adversely affect the stability of protein molecules.
Во-вторых, белки высвобождаются из микросфер либо через поры, либо при деградации полимерного матрикса микросфер. В-третьих, при деградации полимерного матрикса происходит генерация продуктов деградации, что, возможно, приводит к снижению значения рН в системе и химической деградации инкапсулированного белка. Наряду с этим создание микросфер для пролонгированного высвобождения белка в течение продолжительного периода времени (до нескольких месяцев) требует разработки способа эффективного инкапсулирования белка в микросферы.Secondly, proteins are released from the microspheres either through the pores or by degradation of the polymer matrix of the microspheres. Thirdly, during the degradation of the polymer matrix, degradation products are generated, which, possibly, leads to a decrease in the pH in the system and chemical degradation of the encapsulated protein. In addition, the creation of microspheres for prolonged release of protein over an extended period of time (up to several months) requires the development of a method for efficiently encapsulating protein in microspheres.
Оптимизация процессов получения микрочастиц на основе сополимера полилактид-гликолида, нагруженных белком для последующего пролонгированного их высвобождения, требует полного предо- 1 032507 хранения нативной структуры белка как в процессе его приготовления, так и его использования. Денатурация и агрегация молекул белка не только отменяет их терапевтическую активность, но и обуславливает побочные эффекты, такие как иммуногенность и токсичность.Optimization of the processes for the preparation of microparticles based on a polylactide-glycolide copolymer loaded with a protein for their subsequent prolonged release requires complete preservation of the native protein structure both during its preparation and its use. Denaturation and aggregation of protein molecules not only cancels their therapeutic activity, but also causes side effects, such as immunogenicity and toxicity.
Загрузка белкового лекарственного средства в наночастицы достигается двумя способами [9]. Первый способ основан на включении лекарственного средства в процессе получения наночастиц. Второй способ основан на адсорбции лекарственного средства на уже сформированных наночастицах в результате проведения процесса инкубации наночастиц в растворе лекарственного средства.The loading of a protein drug into nanoparticles is achieved in two ways [9]. The first method is based on the inclusion of the drug in the process of obtaining nanoparticles. The second method is based on the adsorption of the drug on the already formed nanoparticles as a result of the process of incubation of the nanoparticles in the drug solution.
Помимо способа включения и адсорбции лекарственного средства известны способы химического конъюгирования лекарственных средств на поверхности наночастиц [4].In addition to the method of incorporation and adsorption of a drug, methods are known for chemical conjugation of drugs on the surface of nanoparticles [4].
Во всех известных способах приготовления микрочастиц стартовой позицией является растворение сополимера полилактид-гликолида в органическом растворителе, обычно в хлористом метилене или этилацетате (органическая фаза).In all known microparticle preparation methods, the starting position is to dissolve the polylactide-glycolide copolymer in an organic solvent, usually in methylene chloride or ethyl acetate (organic phase).
Рассматривают два различных подхода в процессе инкапсулирования препарата белка, которые различаются в зависимости от физического состояния белка. Для инкапсулирования используют либо растворы белка (растворимая форма), либо используют сублимационно высушенный препарат белка, или переводят белок в нерастворимую форму и получают твердые частицы белка (твердая форма белка). Для получения твердых частиц, содержащих белковый препарат, используют стабилизаторы белка, такие как соли, сахара, детергенты, ионы металлов.Two different approaches are considered in the process of encapsulating a protein preparation, which differ depending on the physical state of the protein. Either protein solutions (soluble form) are used for encapsulation, or a freeze-dried protein preparation is used, or the protein is converted to an insoluble form and protein solid particles are obtained (solid protein form). To obtain solid particles containing a protein preparation, protein stabilizers are used, such as salts, sugars, detergents, metal ions.
Однако многие стабилизаторы белков ограничивают продолжительность и непрерывность высвобождения белка после его инкапсулирования в систему непрерывного высвобождения.However, many protein stabilizers limit the duration and continuity of the release of a protein after it is encapsulated in a continuous release system.
Современные стратегии формулирования белковых препаратов можно отнести к двум категориям: формулированию белков в твердые частицы перед их инкапсулированием с целью увеличения их резистентности к органическим растворителям;Modern strategies for formulating protein preparations can be classified in two categories: formulating proteins into solid particles before encapsulating them in order to increase their resistance to organic solvents;
наноинкапсулированию белков в полимерные материалы, которые растворимы в воде, что позволяет избежать контакта с органическими растворителями, которые используют для растворения биодеградируемых полимеров в системах непрерывного высвобождения [10].nano-encapsulation of proteins in polymeric materials that are soluble in water, which avoids contact with organic solvents that are used to dissolve biodegradable polymers in continuous release systems [10].
Известны способы преобразования белков в твердые частицы перед микроинкапсулированием в полимерные структуры для их последующего непрерывного высвобождения из системы [11]. Белковые частицы образуются при фазовом разделении совместного раствора белок - полиэтиленгликоль (РЕО) в процессе замораживания. Поскольку РЕО растворим в органических растворителях, очищенные частицы белка получают сублимацией совместного раствора белка и РЕО, с последующим удалением РЕО фазы. Принцип этого способа основан на фазовом разделении водной смеси РЕО-белок, индуцированном при использовании технологического приема конденсация замораживанием. Белковые частицы образуются при фазовом разделении совместного раствора белок-РЕО в процессе замораживания. В результате последующего процесса лиофилизации сферические микродомены белка, рассредоточенные в непрерывной твердой фазе РЕО, могут образовываться при конкретных условиях. После растворения РЕО в хлористом метилене получают суспензию микронизированных белковых частиц. Полученные белковые частицы добавляют к раствору сополимера полилактид-гликолида в органическом растворителе для формирования суспензии белок-в-растворе сополимера полилактид-гликолид и эмульгируют в водной непрерывной фазе, содержащей поливиниловый спирт в качестве эмульгатора, для образования сложных микросфер. Этот процесс известен как δ/0/^ν (твердые частицы-в масле-в воде) микроинкапсулирование.Known methods for converting proteins into solid particles before microencapsulation in polymer structures for their subsequent continuous release from the system [11]. Protein particles are formed during the phase separation of a joint protein - polyethylene glycol (PEO) solution during freezing. Since REO is soluble in organic solvents, purified protein particles are obtained by sublimation of a joint solution of protein and REO, followed by removal of the REO phase. The principle of this method is based on the phase separation of the aqueous REO-protein mixture induced by freezing condensation induced by using the technological technique. Protein particles are formed during the phase separation of a joint protein-REO solution during freezing. As a result of the subsequent lyophilization process, spherical microdomains of a protein dispersed in the continuous solid phase of REO can form under specific conditions. After the REO is dissolved in methylene chloride, a suspension of micronized protein particles is obtained. The resulting protein particles are added to a solution of a polylactide-glycolide copolymer in an organic solvent to form a suspension of a protein-in-solution of a polylactide-glycolide copolymer and emulsified in an aqueous continuous phase containing polyvinyl alcohol as an emulsifier to form complex microspheres. This process is known as δ / 0 / ^ ν (particulate matter-in-oil-in-water) microencapsulation.
Однако белковые частицы при инкапсулировании окружены гидрофобным полимером матрикса микросфер (например, сополимер полилактид-гликолид). Поэтому к недостаткам этого способа относят как присутствие органических растворителей, так и гидрофобного полимерного матрикса.However, the protein particles during encapsulation are surrounded by a hydrophobic polymer of the matrix of microspheres (for example, a polylactide-glycolide copolymer). Therefore, the disadvantages of this method include both the presence of organic solvents and a hydrophobic polymer matrix.
Известно, что декстрановые микросферы получают при использовании приема эмульгирования в системе вода-в-воде [12]. Этот прием основан на неспособности к смешиванию водорастворимых полимеров в водных растворах. Полимеры остаются в растворе, но расслаиваются на две водные фазы при превышении концентрации выше определенного значения. Когда водные растворы РЕО и декстрана смешивают, то получают двухфазную систему в зависимости от молекулярной массы и концентрации обоих полимеров. После приготовления эмульсии декстрановые частицы подвергают химической сшивке (предварительно в декстран вводят метакрилатные остатки). При этом микрочастицы приобретают свойства гидрогелей. Поперечно-сшитые декстрановые частицы отделяют при центрифугировании, при этом средний размер частиц лежит в диапазоне от 2,5 до 25 мкм. Высвобождение белка из таких микрочастиц осуществляют с помощью предварительно включенной в микросферы эндодекстраназы. При этом высвобождение белка из микросфер линейно связано с количеством включенной декстраназы.It is known that dextran microspheres are obtained using emulsification in a water-in-water system [12]. This technique is based on the inability to mix water-soluble polymers in aqueous solutions. The polymers remain in solution, but are stratified into two aqueous phases when the concentration exceeds a certain value. When aqueous solutions of PEO and dextran are mixed, a biphasic system is obtained depending on the molecular weight and concentration of both polymers. After the emulsion is prepared, the dextran particles are chemically crosslinked (methacrylate residues are introduced into the dextran first). In this case, microparticles acquire the properties of hydrogels. Crosslinked dextran particles are separated by centrifugation, with an average particle size ranging from 2.5 to 25 microns. Protein release from such microparticles is carried out using endodextranase previously incorporated into the microspheres. Moreover, the release of protein from the microspheres is linearly related to the amount of dextranase incorporated.
Таким образом, декстрановые микросферы, которые подвергаются ферментативной деградации, имеют некоторые недостатки. Во-первых, регулирование высвобождения белка определяется изменением количества сшивок с помощью метакрилата. Во-вторых, необходимо проводить введение целевого белка совместно с декстраназой.Thus, dextran microspheres, which undergo enzymatic degradation, have some disadvantages. First, the regulation of protein release is determined by the change in the number of crosslinks with methacrylate. Secondly, it is necessary to administer the target protein together with dextranase.
Известен способ для загрузки белков в полисахаридные частицы в отсутствие гидрофобногогидрофильного поверхностного натяжения. Этот способ основан на разделении двух водных фаз [13]. В этом способе для предотвращения слияния полисахарид-дисперсионных фаз и формирования блоки- 2 032507 рующей фазы в систему двойной водной фазы декстран-РЕС вводят третий компонент, в качестве которого используют альгинат натрия [14]. Анионный полисахарид альгинат натрия формирует диффузионный заряженный слой вокруг диспергированных декстрановых капель, это удерживает их от слияния друг с другом. В результате, двухфазная система становится стабильной в эмульсии жидкостьжидкость.A known method for loading proteins into polysaccharide particles in the absence of hydrophobic hydrophilic surface tension. This method is based on the separation of two aqueous phases [13]. In this method, to prevent the fusion of the polysaccharide-dispersion phases and the formation of a blocking phase, a third component is introduced into the system of the double aqueous phase of dextran-RES, using sodium alginate [14]. The anionic polysaccharide sodium alginate forms a diffusion charged layer around dispersed dextran droplets, this keeps them from merging with each other. As a result, a two-phase system becomes stable in a liquid-liquid emulsion.
Таким образом, белки, которые предпочтительно отделяются в декстран-дисперсионную фазу при разделении двух водных фаз (см. 11), в данном случае предварительно переводят в фазу плотных стекловидных (§1а88у, некристаллических или стекловидных) наночастиц, которые устойчивы к органическим растворителям в процессе проведения лиофилизации. Такие декстрановые наночастицы, имеющие диаметр 200-500 нм, включают в микросферы на основе сополимера полилактид-гликолида, используя З/О/А процесс микроинкапсулирования.Thus, proteins that are preferably separated into the dextran-dispersion phase upon separation of two aqueous phases (see 11), in this case, are preliminarily transferred to the phase of dense glassy (§1-88y, non-crystalline or glassy) nanoparticles that are resistant to organic solvents in the process lyophilization. Such dextran nanoparticles having a diameter of 200-500 nm are incorporated into microspheres based on a polylactide-glycolide copolymer using a 3 / O / A microencapsulation process.
Упаковка белков в декстрановые стекловидные наночастицы перед микроинкапсулированием предохраняет белки от деградации, снижения биологической активности и адсорбции на сополимере полилактид-гликолида как в процессе формулирования в микросферы, так и при непрерывном их высвобождении из полимерной системы в течение длительного периода времени.The packaging of proteins in dextran glassy nanoparticles before microencapsulation protects the proteins from degradation, decrease in biological activity and adsorption on the polylactide-glycolide copolymer both during their formation into microspheres and during their continuous release from the polymer system for a long period of time.
Однако эта система имеет некоторые недостатки. Например, необходимость использования относительно концентрированных водных растворов двух гидрофильных полимеров (полисахарида и РЕС раствора) и использование третьего водорастворимого полимера полиэлектролита, несущего отрицательный заряд как для формирования эмульсии вода-вода, так и для стабилизации дисперсионной полисахаридной фазы от слияния. Кроме того, некоторые белки могут интенсивно взаимодействовать с полиэлектролитами за счет ионных взаимодействий.However, this system has some disadvantages. For example, the need to use relatively concentrated aqueous solutions of two hydrophilic polymers (polysaccharide and PEC solution) and the use of a third water-soluble polyelectrolyte polymer that carries a negative charge both to form a water-water emulsion and to stabilize the dispersion polysaccharide phase from fusion. In addition, some proteins can interact intensively with polyelectrolytes due to ionic interactions.
Известен способ приготовления полисахаридных стекловидных микрочастиц, которые имеют диаметр менее 10 мкм, а также наночастиц, которые имеют диаметр 500 нм и содержат в своем составе подвергающиеся деградации агенты, такие как белки, пептиды, продуценты генной инженерии, вакцины, антитела, вирусы, липосомы. В основу способа положен принцип эмульгации в системе вода-вода при низкой температуре и индуцированного замораживанием фазового разделения [15, 16].A known method of preparing polysaccharide vitreous microparticles that have a diameter of less than 10 microns, as well as nanoparticles that have a diameter of 500 nm and contain degradable agents such as proteins, peptides, genetic engineering producers, vaccines, antibodies, viruses, liposomes. The method is based on the principle of emulsification in a water-water system at a low temperature and freeze-induced phase separation [15, 16].
Этот способ обеспечивает приготовление полисахаридных частиц, содержащих структурнонестабильные агенты, такие как белки без использования полиэлектролитов. Однако без образования диффузионного заряженного слоя вокруг дисперсионной фазы (см. 13-14) дисперсионные капли сливаются, и образование двух фаз блокируется сразу после прекращения механических воздействий (например, перемешивания). Чтобы избежать эффекта, приводящего к блокированию образования фаз, используют технологические приемы, которые стабилизируют водные капли в водной непрерывной фазе без использования полиэлектролитов. Используют два приема для стабилизации диспергированных водных капель от агрегации и слияния двух фаз, которые основаны на проведении процессов при низкой температуре: низкая температура при приготовлении водной эмульсии и замораживание, индуцирующее двухфазное водное разделение. К недостаткам этого способа относят способность белков, растворенных в растворе РЕС, образовывать частицы при замораживании - высушивании. Другими словами, фазовое разделение, индуцированное замораживанием, также может иметь место для растворов белок-РЕС (см.11). Следовательно, белки, которые формируют собственные частицы наряду с декстрановыми частицами, будут совместно осаждаться из РЕС раствора в продолжении замораживания.This method provides the preparation of polysaccharide particles containing structurally unstable agents, such as proteins without the use of polyelectrolytes. However, without the formation of a diffusion charged layer around the dispersion phase (see 13-14), the dispersion droplets merge, and the formation of two phases is blocked immediately after the cessation of mechanical influences (for example, mixing). To avoid the effect that leads to blocking the formation of phases, use technological methods that stabilize water droplets in an aqueous continuous phase without the use of polyelectrolytes. Two methods are used to stabilize dispersed water droplets from aggregation and the merging of two phases, which are based on carrying out processes at a low temperature: low temperature in the preparation of an aqueous emulsion and freezing, inducing biphasic water separation. The disadvantages of this method include the ability of proteins, dissolved in a solution of RES, to form particles during freezing - drying. In other words, freeze-induced phase separation can also occur for protein-RES solutions (see 11). Therefore, proteins that form their own particles along with dextran particles will co-precipitate from the PEC solution while continuing to freeze.
Известен способ приготовления полимерных микросфер, которые получают на основе кристаллизованного декстрана при эмульгировании водного раствора декстранов с молекулярной массой 500 кЭа и 10 кЭа в органической эмульсионной среде, в качестве которой используют растительное масло [17]. Такую эмульсию двух несмешивающихся жидкостей подвергают ультразвуковой обработке. Затем полученную суспензию вносят в ацетон для осуществления кристаллизации полисахарида в эмульсионной среде. Образованные микросферы отделяют от суспензии при центрифугировании. Окончательно осадок микросфер высушивают при комнатной температуре. Образцы микросфер из кристаллизованного декстрана по данным электронной микроскопии имеют диаметр не более 1000 нм. Известный способ предусматривает ковалентное связывание положительно заряженных белков, в качестве которых используют гистоны, с поверхностью декстрановых микросфер. Ковалентное связывание обусловлено реакцией между ё-аминогруппами лизиновых остатков в молекуле гистона и активными группами в цепях полисахаридов. Количество ковалентно связанного гистона с поверхностью микросфер составляет от 60 до 200 мкг белка на 1,0 г наносфер.A known method of preparing polymer microspheres, which are obtained on the basis of crystallized dextran by emulsification of an aqueous solution of dextrans with a molecular weight of 500 kEa and 10 kEa in an organic emulsion medium, which is used as a vegetable oil [17]. Such an emulsion of two immiscible liquids is subjected to ultrasonic treatment. Then, the resulting suspension is introduced into acetone to crystallize the polysaccharide in an emulsion medium. The formed microspheres are separated from the suspension by centrifugation. Finally, the precipitate of the microspheres is dried at room temperature. Samples of microspheres from crystallized dextran according to electron microscopy have a diameter of not more than 1000 nm. The known method involves the covalent binding of positively charged proteins, which use histones, with the surface of dextran microspheres. Covalent binding is due to the reaction between the ами-amino groups of the lysine residues in the histone molecule and the active groups in the polysaccharide chains. The amount of covalently bound histone with the surface of the microspheres is from 60 to 200 μg of protein per 1.0 g of nanospheres.
Недостатком известного способа является модификация поверхности декстрановых микросфер положительно заряженными гистонами, что препятствует созданию микрочастиц для продолжительной циркуляции после их введения ίη νίνο [17, 18].The disadvantage of this method is the modification of the surface of dextran microspheres by positively charged histones, which prevents the creation of microparticles for continuous circulation after their introduction ίη νίνο [17, 18].
Известно, что адсорбция определенных белков плазмы крови, таких как 1дС, альбумин, компоненты комплемента (общее название этих белков - опсонины), а также гистонов [19, 20], на поверхности микрочастиц и фагоцитоз микрочастиц являются взаимосвязанными процессами. Опсонины действуют как мостик между микрочастицами и фагоцитами. Когда микрочастицы вводят внутривенно, они легко узнаются иммунной системой организма и затем выводятся из циркуляции (иммунный клиренс).It is known that the adsorption of certain plasma proteins, such as 1dC, albumin, complement components (the common name of these proteins is opsonins), as well as histones [19, 20], on the surface of microparticles and phagocytosis of microparticles are interrelated processes. Opsonins act as a bridge between microparticles and phagocytes. When microparticles are administered intravenously, they are easily recognized by the body’s immune system and then removed from circulation (immune clearance).
Следовательно, исследование процесса опсонизации наноносителей, наряду с установлением ихTherefore, the study of the process of opsonization of nanocarriers, along with their establishment
- 3 032507 распределения в различных органах после введения ίη νίνο, как и последующее выведение (клиренс) из организма, одинаково важно для развития наномедицинских технологий.- 3 032507 distribution in various organs after the introduction of ίη νίνο, as well as subsequent excretion (clearance) from the body, is equally important for the development of nanomedical technologies.
Известен способ приготовления состава для контролируемого высвобождения рекомбинантного инсулина человека при пероральном применении, который является наиболее близким по технической сущности предполагаемому изобретению и выбран в качестве прототипа [21]. Известный состав включает микрочастицы, которые предварительно получают на основе кристаллизованного декстрана и рекомбинантный инсулин человека, который добавляют к водной суспензии микрочастиц, причем инсулин адсорбируется на поверхности микрочастиц, которые получают на основе водного раствора декстрана 55-65%-ной концентрации с молекулярной массой от 20 до 75 кПа, затем раствор выдерживают в течение 3 ч при температуре 60°С, и после кристаллизации декстрана в результате упаривания воды формируются микрочастицы, которые осаждают из раствора при центрифугировании и высушивают при комантной температуре, причем микрочастицы имеют диаметр более 500 нм и не более 5000 нм, затем приготавливают водную суспензию микрочастиц и в полученную суспензию вносят равный объем инсулина, который растворяют до 15-30%-ной концентрации в дистиллированной воде, затем суспензию повторно центрифугируют и получают плотные микрочастицы, содержащие в составе инсулин, причем инсулин адсорбируется на поверхности и/или в порах дестранового матрикса.A known method of preparing a composition for the controlled release of recombinant human insulin during oral administration, which is the closest in technical essence to the proposed invention and selected as a prototype [21]. The known composition includes microparticles, which are preliminarily prepared on the basis of crystallized dextran and recombinant human insulin, which is added to an aqueous suspension of microparticles, moreover, insulin is adsorbed on the surface of microparticles, which are obtained on the basis of an aqueous solution of dextran of 55-65% concentration with a molecular weight of 20 up to 75 kPa, then the solution is kept for 3 hours at a temperature of 60 ° C, and after crystallization of dextran, microparticles are formed as a result of evaporation of water, which precipitate from a thief by centrifugation and dried at a constant temperature, the microparticles having a diameter of more than 500 nm and not more than 5000 nm, then an aqueous suspension of microparticles is prepared and an equal volume of insulin is added to the resulting suspension, which is dissolved to a concentration of 15-30% in distilled water, the suspension is then centrifuged again and dense microparticles containing insulin are obtained, the insulin being adsorbed on the surface and / or in the pores of the dextran matrix.
Недостатком известного способа приготовления состава для контролируемого высвобождения инсулина, в котором инсулин адсорбирован на поверхности декстранового матрикса, является доступность белка к действию протеолитических ферментов, в частности, в процессе его высвобождении из состава при пероральном введении животным. Поэтому время действия инсулина ограничено одними сутками, как показано в эксперименте.A disadvantage of the known method of preparing a composition for the controlled release of insulin, in which insulin is adsorbed on the surface of a dextran matrix, is the availability of the protein to the action of proteolytic enzymes, in particular, during its release from the composition upon oral administration to animals. Therefore, the action time of insulin is limited to one day, as shown in the experiment.
Кроме того, микрочастицы, полученные на основе кристаллизованнго декстрана, представляют гетерогенную по размерам популяцию микрочастиц, диаметр которых лежит в пределах более 500 нм и не более 5000 нм.In addition, microparticles obtained on the basis of crystallized dextran represent a population of microparticles heterogeneous in size, the diameter of which lies within 500 nm and not more than 5000 nm.
Необходимо отметить, что в настоящее время микрочастицы с диаметром от 10 до 1000 нм определяют как плотные коллоидные наночастицы или наносферы [1]. Поэтому, можно предположить, что в данной гетерогенной по размеру популяции микрочастиц присутствуют как наночастицы или наносферы, так и микрочастицы или микросферы.It should be noted that microparticles with a diameter of 10 to 1000 nm are currently defined as dense colloidal nanoparticles or nanospheres [1]. Therefore, it can be assumed that in this population of a microparticle heterogeneous in size, there are both nanoparticles or nanospheres, and microparticles or microspheres.
Предлагаемое изобретение лишено указанных недостатков благодаря предварительному включению биологически активного белка, в качестве которого используют гистон животного происхождения, в структуру матрикса декстрановых наносфер в процессе их получения. Такие наносферы, содержащие гистон, предназначены для последующего их включения в резорбируемые микросферы на основе сополимера полилактид-гликолида для пролонгированного высвобождения нативного гистона.The present invention is devoid of these drawbacks due to the preliminary inclusion of a biologically active protein, which is used histone of animal origin, in the structure of the matrix of dextran nanospheres in the process of their preparation. Such histone-containing nanospheres are intended for their subsequent incorporation into resorbable microspheres based on a polylactide-glycolide copolymer for prolonged release of the native histone.
В научно-технической литературе профили высвобождения белков из различных микрочастиц классифицируют на четыре категории: А, В, С, Ό. Разделение основано на величине начального бурствысвобождения, длительности высвобождения белка и кинетике устойчивого состояния высвобождения после бурст-высвобождения соответственно в каждой категории [22]. Бурст-высвобождение рассматривается как исходное высвобождение в течение первых 24 ч. В категории А вслед за исходным бурствысвобождением (с выходом более 30%) следует незначительное добавочное высвобождение. В категории В вслед за низким исходным бурст-высвобождением (менее 30%) следует незначительное добавочное высвобождение. Если формулированный белок при его высвобождении имеет исходное бурствысвобождение менее 30%, но общее высвобождение белка составляет более 60%, тогда такой тип высвобождения относят к категории С. Категорию Ό рассматривают как идеальный профиль высвобождения белка с низким бурст-высвобождением, за которым следует устойчивое состояние высвобождения всего загруженного в систему белка.In the scientific and technical literature, protein release profiles from various microparticles are classified into four categories: A, B, C, Ό. The separation is based on the magnitude of the initial burst release, the duration of protein release, and the kinetics of the steady state of release after burst release, respectively, in each category [22]. Burst release is considered as the initial release during the first 24 hours. In category A, after the initial burst release (with a yield of more than 30%), a slight incremental release follows. In category B, a low initial burst release (less than 30%) is followed by a minor incremental release. If the formulated protein has an initial burst release of less than 30% during its release, but the total protein release is more than 60%, then this type of release is classified as category C. Category как is considered as an ideal low burst release protein release profile followed by a steady state release of all protein loaded into the system.
Неполное высвобождение биоактивного белка из микросфер, полученных на основе резорбируемого сополимера полилактид-гликолида, связывают с одним из следующих явлений: ковалентная или нековалентная агрегация, гидролиз или неспецифическая адсорбция на матриксе полимера. Нестабильность белка в процессе высвобождения может быть следствием локального снижения рН внутри микрочастиц за счет задержки кислотных продуктов деградации полимера.Incomplete release of a bioactive protein from microspheres based on a resorbable polylactide-glycolide copolymer is associated with one of the following phenomena: covalent or non-covalent aggregation, hydrolysis, or nonspecific adsorption on a polymer matrix. The instability of the protein during the release process may be due to a local decrease in pH inside the microparticles due to the delay of the acidic products of polymer degradation.
Для пояснения свойств белков, в частности гистонов, используемых в заявляемом изобретении, заявитель считает целесообразным дать их характеристику в приложении к данному описанию (см. Приложение).To clarify the properties of proteins, in particular the histones used in the claimed invention, the applicant considers it appropriate to give their characteristics in the appendix to this description (see Appendix).
Техническим результатом заявленного изобретения является сохранение нативной структуры белка, предварительно включенного в структуру матрикса наносфер диаметром не более 1000 нм, приготовленных на основе декстрана, повышение надежности и упрощение способа включения белка и удешевления способа получения наносфер, предназначенных для последующего включения в резорбируемые полимерные микросферы, которые получают на основе сополимера полилактид-гликолида, что обеспечивает пролонгированное высвобождение гистона в результате резорбции микросфер в течение не менее 50-ти суток и имеет ряд преимуществ, которые обусловлены, в основном тем, что:The technical result of the claimed invention is the preservation of the native structure of the protein, previously included in the structure of the matrix of nanospheres with a diameter of not more than 1000 nm, prepared on the basis of dextran, increasing the reliability and simplification of the method of incorporating protein and cheapening the method of producing nanospheres intended for subsequent inclusion in resorbable polymer microspheres, which obtained on the basis of a polylactide-glycolide copolymer, which ensures prolonged histone release as a result of resorption microspheres for at least 50 days and has several advantages, which are mainly due to the fact that:
1) физическое включение белка в наносферы менее сложный процесс, чем химическое присоединение к поверхности наносфер;1) the physical incorporation of protein into the nanospheres is a less complex process than the chemical attachment of nanospheres to the surface;
- 4 032507- 4 032 507
2) получение наносфер с включенными в их состав белками дешевле и может иметь промышленный масштаб по сравнению с химическим присоединением белка к поверхности наносфер;2) obtaining nanospheres with proteins included in their composition is cheaper and can have an industrial scale in comparison with the chemical attachment of a protein to the surface of nanospheres;
3) инкапсулирование наносфер с включенными в их состав белками в микросферы с пролонгированным высвобождением белков из их состава обеспечивает их эффективность и специфичность действия за счет предохранения белков от действия протеолитических ферментов и гидролитической деградации при взаимодействии с биологическими компонентами ίη νίνο;3) encapsulation of nanospheres with proteins included in their composition in microspheres with prolonged release of proteins from their composition ensures their effectiveness and specificity of action due to the protection of proteins from the action of proteolytic enzymes and hydrolytic degradation when interacting with biological components ίη νίνο;
устранения потенциально возможных токсических эффектов белков при прямом их введении в организм различными путями;elimination of potential toxic effects of proteins when directly introduced into the body in various ways;
повышения биологического периода полураспада белка в системе циркуляции и возможности снижения терапевтических доз белка;increasing the biological half-life of the protein in the circulation system and the possibility of reducing therapeutic doses of the protein;
повышение терапевтического индекса (соотношение между ЬП 50 и ΕΌ 50, где ЬП 50, полулетальная доза и ΕΌ, 50% эффективная доза), за счет непрерывного высвобождения белкового лекарственного средства в течение длительного периода времени;an increase in the therapeutic index (ratio between bp 50 and b 50, where b 50, semi-lethal dose and b, 50% effective dose), due to the continuous release of the protein drug over a long period of time;
преимущества использовании непрерывной доставки белковых препаратов в терапевтических целях, которые заключаются в поддержании его концентрации в сыворотке в пределах терапевтического окна (терапевтическое окно, временной период в пределах которого концентрация лекарственного средства ниже токсической величины и выше терапевтической величины).The advantages of using continuous delivery of protein drugs for therapeutic purposes, which are to maintain its concentration in serum within the therapeutic window (therapeutic window, the time period within which the concentration of the drug is below the toxic value and above the therapeutic value).
Технический результат достигается тем, что в известном способе приготовления и использования состава для перорального введения, содержащего рекомбинантный инсулин человека, который включает известные и общие с заявленным новым способом признаки, где состав содержит водную суспензию микрочастиц с диаметром более 500 нм и не более 5000 нм, которые получают на основе кристаллизованного декстрана и водный раствор инсулина, который вносят в предварительно полученную водную суспензию микрочастиц, где инсулин адсорбируется на поверхности декстранового матрикса, в предлагаемом способе используют белок животного происхождения, и в качестве белка используют сублимационно высушенный гистон, который растворяют до 1,0%-ной концентрации в дистиллированной воде, затем водный раствор гистона добавляют в равном объеме к водному раствору декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кПа, затем раствор, содержащий декстран и гистон, выдерживают в течение 30±5 мин при температуре 6±2°С, затем этот раствор добавляют в органическую жидкость, в качестве которой используют растительное масло, в количестве 3,5 объема от объема исходного раствора, и получают смесь двух несмешивающихся жидкостей, которую перемешивают и повторно выдерживают в течение 30±5мин при температуре 6±2°С и получают суспензию, затем суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течение 45±5 с при мощности излучения 100 Вт, затем полученную суспензию центрифугируют, а центрифугирование проводят в течение 5±1 мин при 2000 х-д, затем осадок высушивают при комнатной температуре и получают наносферы диаметром не более 1000 нм, содержащие гистон, после чего приготавливают первичную суспензию наносфер в предварительно приготовленном растворе полимера, в качестве которого используют резорбируемый сополимер полилактид-гликолид с молекулярной массой от 50 до 80 кПа при молярном соотношении мономеров, равном 75:25, который растворяют до 10%-ной концентрации в гидрофобном органическом растворителе, в качестве которого используют хлористый метилен, перемешивают в течение 60±5 мин при температуре 6±2°С, причем в раствор полимера добавляют наносферы с гистоном при весовом соотношении наносфер и полимера, равном 1:50, затем к раствору добавляют этиловый спирт в количестве 10 объемов по отношению к объему исходного раствора, затем смесь перемешивают и получают вторичную суспензию, которую подвергают диспергированию при перемешивании в течение 10 мин при комнатной температуре для равномерного распределения полимера в органическом растворителе и формирования микросфер, затем микросферы осаждают из суспензии при добавлении охлажденного этилового спирта, который добавляют в 100-кратном объеме по отношению к объему суспензии, затем осадок микросфер помещают на мелкопористый стеклянный фильтр и отфильтровывают, затем осадок собирают и высушивают при комнатной температуре в течение 8±2 ч и полученные резорбируемые микросферы, содержащие в своем составе наносферы с гистоном с содержанием белка на 1,0 мг сухого веса микросфер от 2,0 до 4,0 мкг вносят в модельную среду инкубации, в качестве которой используют фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,2 и подвергают инкубации при +21°С в течение 2-х месяцев, отслеживая при этом через каждые сутки в течение не менее 50-ти суток концентрацию белка в инкубационной среде, после чего полученные нативные белки в составе резорбируемых микросфер используют в качестве основы пролонгации физиологического действия белков.The technical result is achieved by the fact that in the known method for the preparation and use of an oral composition containing recombinant human insulin, which includes known and common features of the claimed new method, where the composition contains an aqueous suspension of microparticles with a diameter of more than 500 nm and not more than 5000 nm, which are obtained on the basis of crystallized dextran and an aqueous solution of insulin, which is introduced into a previously prepared aqueous suspension of microparticles, where insulin is adsorbed on the surface of dex trans matrix, the proposed method uses a protein of animal origin, and the protein used is freeze-dried histone, which is dissolved to a 1.0% concentration in distilled water, then an aqueous solution of histone is added in an equal volume to an aqueous solution of dextran 6% concentration with a molecular weight of 50 to 70 kPa, then the solution containing dextran and histone is kept for 30 ± 5 min at a temperature of 6 ± 2 ° C, then this solution is added to an organic liquid, which is used as oil, in an amount of 3.5 volumes of the volume of the initial solution, and a mixture of two immiscible liquids is obtained, which is stirred and re-aged for 30 ± 5 min at a temperature of 6 ± 2 ° C and a suspension is obtained, then the suspension is subjected to ultrasonic treatment for 45 ± 5 s at a radiation power of 100 W, then the resulting suspension is centrifuged, and centrifugation is carried out for 5 ± 1 min at 2000 x-d, then the precipitate is dried at room temperature to obtain nanospheres with a diameter of not more than 1000 nm containing histone, after which prepare a primary suspension of nanospheres in a pre-prepared polymer solution, which is used as a resorbable polylactide-glycolide copolymer with a molecular weight of from 50 to 80 kPa with a molar ratio of monomers equal to 75:25, which is dissolved to a 10% concentration in a hydrophobic organic solvent, which is used as methylene chloride, stirred for 60 ± 5 min at a temperature of 6 ± 2 ° C, and nanospheres with histone are added to the polymer solution at a weight ratio of nanospheres and poly RA equal to 1:50, then ethanol is added to the solution in an amount of 10 volumes relative to the volume of the initial solution, then the mixture is stirred and a secondary suspension is obtained, which is dispersed under stirring for 10 min at room temperature to uniformly distribute the polymer in the organic solvent and the formation of microspheres, then the microspheres are precipitated from the suspension by adding chilled ethanol, which is added in a 100-fold volume relative to the volume of the suspension, then the precipitate is the cross-spheres are placed on a fine-pore glass filter and filtered, then the precipitate is collected and dried at room temperature for 8 ± 2 hours and the resulting resorbable microspheres containing nanospheres with histone containing 1.0 mg protein dry weight of microspheres from 2.0 up to 4.0 μg is introduced into a model incubation medium, using phosphate-saline buffer solution, pH 7.2, and incubated at + 21 ° C for 2 months, while monitoring every day for at least 50 days concentration be Single in the incubation medium, after which the resulting native proteins consisting of resorbable microspheres are used as the basis of prolongation of the physiological actions of proteins.
Таким образом, предварительное включение белка в матрикс наносфер и последующее включение наносфер в состав резорбируемых микросфер обеспечивает сохранение нативной структуры белка за счет устойчивости белка к действию протеолитических ферментов, так же, как и к органическим растворителям, и кислотному окружению в составе микросфер при пролонгированном высвобождении белка.Thus, the preliminary inclusion of protein in the matrix of nanospheres and the subsequent inclusion of nanospheres in the composition of resorbable microspheres ensures the preservation of the native protein structure due to the resistance of the protein to the action of proteolytic enzymes, as well as to organic solvents and the acid environment in the composition of the microspheres during prolonged release of protein .
Заявленный способ был апробирован в лабораторных условиях на лабораторной базе СанктПетербургского государственного университета. Результаты проведенных исследований поясняютсяThe claimed method was tested in laboratory conditions at the laboratory base of St. Petersburg State University. Research Results Explained
- 5 032507 следующими примерами и чертежами.- 5,032,507 with the following examples and drawings.
На фиг. 1 представлены результаты электронной микроскопии наносфер, полученных на основе декстрана (х1000). Адсорбция на поверхности стекла. Показано, что наносферы имеют средний диаметр не более 1000 нм и формируют однородный слой на поверхности стекла. Слой наносфер на поверхности стекла устойчив к действию инкубационной среды при длительном хранении.In FIG. 1 presents the results of electron microscopy of nanospheres obtained on the basis of dextran (x1000). Adsorption on the surface of the glass. It was shown that nanospheres have an average diameter of not more than 1000 nm and form a uniform layer on the glass surface. The layer of nanospheres on the glass surface is resistant to the action of the incubation medium during long-term storage.
На фиг. 2 представлен график высвобождения гистона Н1 из резорбируемых микросфер, приготовленных на основе сополимера полилактид-гликолида, содержащих декстрановые наносферы с включенным в их состав гистоном Н1, в модельную среду инкубации в зависимости от времени от начала инкубации в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 50-ти суток. По оси абсцисс - время инкубации в часах.In FIG. Figure 2 shows a graph of the release of histone H1 from resorbable microspheres prepared on the basis of a polylactide-glycolide copolymer containing dextran nanospheres with histone H1 included in their composition in a model incubation medium depending on the time from the start of incubation in phosphate-buffered saline for 50- that day. The abscissa shows the incubation time in hours.
По оси ординат - количество высвобожденного белка в процентах от исходного количества белка в микросферах.The ordinate is the amount of protein released as a percentage of the initial amount of protein in the microspheres.
На представленном графике видно, что в течение первых 2-х суток количество высвобождаемого гистона Н1 составляет 20-22% от количества исходного белка. После 120 ч выход белка составлял 43%, после 240 ч - 79%, после 480 ч - 84% и после 720 ч - 92%. Полное высвобождение гистона Н1 наступает в течение 50-ти суток (1200 ч) и составляет 97% от начала инкубации.The graph shows that during the first 2 days the amount of histone H1 released is 20-22% of the amount of the original protein. After 120 hours, the protein yield was 43%, after 240 hours - 79%, after 480 hours - 84% and after 720 hours - 92%. Full release of histone H1 occurs within 50 days (1200 h) and is 97% of the start of incubation.
Пример 1.Example 1
В этой серии экспериментов осуществления предлагаемого изобретения способ получения биологически активного белка в составе полимерных наносфер предусматривает использование стабильной полимерной суспензии двух несмешивающихся жидкостей (водный раствор - органическая жидкость), в качестве которых используют водный раствор декстрана, содержащий белковый препарат (дисперсионная фаза) и органическую жидкость, в качестве которой используют растительное масло (непрерывная фаза).In this series of experiments implementing the invention, the method for producing a biologically active protein in the composition of polymer nanospheres involves the use of a stable polymer suspension of two immiscible liquids (aqueous solution - organic liquid), which are used as an aqueous solution of dextran containing a protein preparation (dispersion phase) and an organic liquid , which use vegetable oil (continuous phase).
В частном конкретном случае способ осуществляют следующим образом. В качестве модельного белка используют гистон Н1. Получение гистона Н1 осуществляют следующим образом. Предварительно получают препарат суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят известным способом [23]. Затем из водного раствора суммарного гистона отделяют гистон Н1 от других классов гистонов известным способом [24].In the particular case of the method is as follows. As a model protein, histone H1 is used. Obtaining histone H1 is as follows. Preliminarily, a preparation of total histone sulfate from calf thymus tissue is obtained in a known manner [23]. Then, histone H1 is separated from other histone classes from an aqueous solution of total histone in a known manner [24].
Приготавливают водный раствор декстрана и водный раствор белка, причем используют сублимационно высушенный гистон, который растворяют до 1,0%-ной концентрации в дистиллированной воде, затем водный раствор гистона добавляют в равном объеме к водному раствору декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кВа, затем раствор, содержащий декстран и гистон, выдерживают в течение 30±5 мин при температуре 6±2°С, затем этот раствор добавляют в органическую жидкость, в качестве которой используют растительное масло, в количестве 3,5 объема от объема исходного раствора, и получают смесь двух несмешивающихся жидкостей, которую перемешивают и повторно выдерживают в течение 30±5мин при температуре 6±2°С и получают суспензию, затем суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течение 45±5 с при мощности излучения 100 Вт, затем полученную суспензию центрифугируют, а центрифугирование проводят в течение 5±1 мин при 2000 х-д, затем осадок высушивают при комнатной температуре и получают наносферы диаметром не более 1000 нм, содержащие гистон Н1 в составе декстранового матрикса.An aqueous solution of dextran and an aqueous solution of protein are prepared, and freeze-dried histone is used, which is dissolved to a 1.0% concentration in distilled water, then an aqueous solution of histone is added in an equal volume to an aqueous solution of dextran of 6% concentration with a molecular weight of 50 to 70 kVA, then the solution containing dextran and histone is incubated for 30 ± 5 min at a temperature of 6 ± 2 ° C, then this solution is added to the organic liquid, which is used as vegetable oil, in an amount of 3.5 vol m of the volume of the initial solution, and a mixture of two immiscible liquids is obtained, which is mixed and re-aged for 30 ± 5 min at a temperature of 6 ± 2 ° C and a suspension is obtained, then the suspension is subjected to ultrasonic treatment for 45 ± 5 s at a radiation power of 100 W then the resulting suspension is centrifuged, and centrifugation is carried out for 5 ± 1 min at 2000 x-d, then the precipitate is dried at room temperature to obtain nanospheres with a diameter of not more than 1000 nm containing histone H1 in the composition of the dextran matrix.
Определение количества белка, включенного в наносферы, осуществляют с помощью аминокислотного анализа. Декстрановые наносферы, содержащие включенный в матрикс гистон Н1, высушивают до постоянного веса при 50°С. В качестве стандарта используют препарат гистона Н1. Образцы гидролизуют 6 н хлористо-водородной кислотой в герметичных пробирках в течение 24 ч при 110°С.The determination of the amount of protein included in the nanosphere is carried out using amino acid analysis. Dextran nanospheres containing histone H1 included in the matrix are dried to constant weight at 50 ° C. A histone H1 preparation is used as a standard. Samples are hydrolyzed with 6 N hydrochloric acid in sealed tubes for 24 hours at 110 ° C.
После высушивания образцов до постоянного веса проводят аминокислотный анализ и рассчитывают количество белка.After drying the samples to constant weight, an amino acid analysis is performed and the amount of protein is calculated.
Количество белка оценивают на основании данных по содержанию в гидролизатах устойчивых к дегидратации аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота.The amount of protein is estimated based on the content of hydrolysates of dehydration-resistant amino acids, such as aspartic acid, glycine, glutamic acid.
Образцы наносфер, которые получают на основе декстрана анализируют с использованием электронной микроскопии при их нанесении на поверхность стекла. Для этого стандартные образцы стекла обрабатывают смесью этанол-эфир (в равных объемах) в течение 1 ч и выдерживают при 500°С в течение 1 ч. Поверхность стекла покрывают водной суспензией наносфер и высушивают при комнатной температуре.Samples of nanospheres that are prepared based on dextran are analyzed using electron microscopy when applied to a glass surface. For this, standard glass samples are treated with ethanol-ether mixture (in equal volumes) for 1 h and kept at 500 ° C for 1 h. The glass surface is covered with an aqueous suspension of nanospheres and dried at room temperature.
Результаты сканирующей электронной микроскопии наносфер, которые получают на основе декстрана представлены на фиг. 1. Показано, что наносферы имеют диаметр не более 1000 нм.The results of scanning electron microscopy of nanospheres, which are obtained on the basis of dextran, are presented in FIG. 1. It is shown that nanospheres have a diameter of not more than 1000 nm.
Пример 2.Example 2
В этой серии экспериментов осуществления заявленного изобретения, использован способ включения наносфер, содержащих белки, в матрикс резорбируемых микросфер на основе сополимера полилактид-гликолида, где наносферы с белком представляют твердую форму белка.In this series of experiments implementing the claimed invention, a method was used to incorporate nanospheres containing proteins into a matrix of resorbable microspheres based on a polylactide-glycolide copolymer, where the nanospheres with the protein represent the solid form of the protein.
В частном конкретном случае способ осуществляют следующим образом. Наносферы с гистоном Н1 в их составе получают, как это описано в примере 1. Приготавливают первичную суспензию нано- 6 032507 сфер в предварительно приготовленном растворе полимера, в качестве которого используют резорбируемый сополимер полилактид-гликолид с молекулярной массой от 50 до 80 кЭа при молярном соотношении мономеров, равном 75:25, который растворяют до 10%-ной концентрации в гидрофобном органическом растворителе, в качестве которого используют хлористый метилен, перемешивают в течение 60±5 мин при температуре 6±2°С, причем в раствор полимера добавляют наносферы с гистоном при весовом соотношении наносфер и полимера, равном 1:50, затем к раствору добавляют этиловый спирт в количестве 10 объемов по отношению к объему исходного раствора, затем смесь перемешивают и получают вторичную суспензию, которую подвергают диспергированию при перемешивании в течение 10 мин при комнатной температуре для равномерного распределения полимера в органическом растворителе и формирования микросфер, затем микросферы осаждают из суспензии при добавлении охлажденного этилового спирта, который добавляют в 100-кратном объеме по отношению к объему суспензии, затем осадок микросфер помещают на мелкопористый стеклянный фильтр и отфильтровывают, затем осадок собирают и высушивают при комнатной температуре в течение 8±2 ч, и полученные резорбируемые микросферы, содержащие в своем составе наносферы с гистоном с содержанием белка на 1,0 мг сухого веса микросфер от 2,0 до 4,0 мкг, причем высвобождение гистона из микросфер в результате их резорбции происходит в течение не менее 50 суток, как описано ниже в примере 3.In the particular case of the method is as follows. Nanospheres with histone H1 in their composition are prepared as described in Example 1. An initial suspension of nano-spheres in a pre-prepared polymer solution is prepared, using a resorbable polylactide-glycolide copolymer with a molecular weight of 50 to 80 kEA in a molar ratio monomers equal to 75:25, which is dissolved to a 10% concentration in a hydrophobic organic solvent, which is used as methylene chloride, stirred for 60 ± 5 min at a temperature of 6 ± 2 ° C, moreover, in a solution of poly measure, nanospheres with histone are added at a weight ratio of nanospheres to polymer of 1:50, then ethanol is added to the solution in an amount of 10 volumes relative to the volume of the initial solution, then the mixture is stirred and a secondary suspension is obtained, which is dispersed under stirring for 10 min at room temperature for uniform distribution of the polymer in the organic solvent and the formation of microspheres, then the microspheres are precipitated from the suspension with the addition of chilled ethyl alcohol, which add in a 100-fold volume relative to the volume of the suspension, then the precipitate of microspheres is placed on a fine-porous glass filter and filtered off, then the precipitate is collected and dried at room temperature for 8 ± 2 hours, and the resulting resorbable microspheres containing nanospheres with histone with a protein content of 1.0 mg dry weight of microspheres from 2.0 to 4.0 μg, and the release of histone from microspheres as a result of their resorption occurs for at least 50 days, as described below in example 3.
Пример 3.Example 3
В этой серии экспериментов оценивают скорость высвобождения белка из резорбируемых микросфер по количеству белка в инкубационной среде в зависимости от времени инкубации.In this series of experiments, the rate of protein release from resorbable microspheres is estimated by the amount of protein in the incubation medium depending on the incubation time.
В модельных экспериментах проводят оценку скорости высвобождения белка из микросфер, приготовленных на основе резорбируемого сополимера полилактид-гликолида, содержащих в своем составе наносферы с гистоном Н1, в зависимости от времени инкубации ίη νίίτο.In model experiments, the rate of protein release from microspheres prepared on the basis of a resorbable polylactide-glycolide copolymer containing nanospheres with histone H1, depending on the incubation time ίη νίίτο, is estimated.
В первой серии экспериментов проводят оценку скорости высвобождения белка из наносфер, приготовленных на основе декстрана. Скорость высвобождения белка из наносфер оценивают по количеству белка в модельной среде при инкубации наносфер в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7,2 и температуре +21°С, при этом концентрацию белка определяют в инкубационной среде в течение первых 5 ч и вплоть до 120 ч.In the first series of experiments, the rate of release of protein from nanospheres prepared on the basis of dextran is evaluated. The rate of release of protein from nanospheres is estimated by the amount of protein in the model medium during incubation of nanospheres in phosphate-buffered saline, pH 7.2 and a temperature of + 21 ° C, while the protein concentration is determined in the incubation medium for the first 5 hours and up to 120 hours
В частном конкретном случае используют образцы наносфер с диаметром не более 1000 нм, содержащих в составе от 110 до 130 нг белка на 1,0 мкг сухого веса наносфер. Образец наносфер в количестве 0,98 г помещают в среду инкубации объемом 65 мл и инкубируют при +21°С при перемешивании.In a particular particular case, nanosphere samples with a diameter of not more than 1000 nm are used, containing from 110 to 130 ng of protein per 1.0 μg of dry weight of nanospheres. A 0.98 g sample of nanospheres is placed in a 65 ml incubation medium and incubated at + 21 ° C. with stirring.
Для анализа количества высвобождаемого гистона Н1 из модельной среды инкубации последовательно отбирают аликвоты среды в период первых 5 ч (через каждый час), в период от 10 до 24 ч (через каждые 5 ч) и вплоть до 120 ч от начала инкубации и проводят определение концентрации белка в аликвотах инкубационной среды.To analyze the amount of histone H1 released from the model incubation medium, aliquots of the medium are sequentially taken during the first 5 hours (every hour), from 10 to 24 hours (every 5 hours) and up to 120 hours from the start of incubation and concentration is determined protein in aliquots of the incubation medium.
Результаты экспериментов показывают, что основное количество гистона Н1 высвобождается в первые 10 ч инкубации и составляет 40%, затем через 24 ч высвобождение гистона Н1 из системы достигает 70%. Оставшиеся 30% белка высвобождается постепенно в течение последующих 4 суток, т.е. полное высвобождение достигается через 120 ч.The experimental results show that the main amount of histone H1 is released in the first 10 hours of incubation and is 40%, then after 24 hours the release of histone H1 from the system reaches 70%. The remaining 30% of the protein is released gradually over the next 4 days, i.e. complete release is achieved after 120 hours
На основании полученных данных можно сделать заключение, что биодеградация наносфер, приготовленных на основе декстрана, в основном, протекает в течение первых суток от начала инкубации.Based on the data obtained, it can be concluded that the biodegradation of nanospheres prepared on the basis of dextran mainly proceeds during the first days from the start of incubation.
Во второй серии экспериментов оценивают скорость резорбции микросфер, приготовленных на основе резорбируемого сополимера полилактид-гликолида с инкапсулированными в их матрикс наносферами, содержащих в своем составе гистон Н1.In the second series of experiments, the rate of resorption of microspheres prepared on the basis of a resorbable polylactide-glycolide copolymer with nanospheres encapsulated in their matrix containing histone H1 is estimated.
Скорость резорбции микросфер оценивают по высвобождению белка в модельную среду при инкубации микросфер в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7,2 и температуре +21°С и наблюдают в течение первых суток и вплоть до 50-ти суток инкубации.The rate of resorption of the microspheres is estimated by the release of protein into the model medium upon incubation of the microspheres in phosphate-buffered saline, pH 7.2 and a temperature of + 21 ° C and is observed during the first day and up to 50 days of incubation.
Образец микросфер помещают в среду инкубации, в качестве которой используют фосфатносолевой буферный раствор, рН 7,2, и проводят инкубацию при температуре +21°С при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере при скорости 30 об/мин. Затем определяют количество белка в среде инкубации в течение 50 суток от начала инкубации.A sample of microspheres is placed in an incubation medium, using phosphate-buffered saline, pH 7.2, and incubated at + 21 ° C with constant stirring on an orbital shaker at a speed of 30 rpm. Then determine the amount of protein in the incubation medium for 50 days from the start of incubation.
В частном конкретном случае используют образец микросфер, содержащий в своем составе от 2 до 4 мкг белка на 1,0 мг сухого веса микросфер. Образец микросфер в количестве 1,54 г помещают в среду инкубации объемом 180 мл и инкубируют при +21°С при перемешивании. Проводят определение концентрации белка в аликвотах среды, которые отбирают из среды инкубации (объемом 5,0-10,0 мл) в течение первых суток через 1, 5, 12 и 24 ч и в период от 2 до 50 суток (после 2, 5, 10, 30 и 50 суток) от начала инкубации. На основании данных по определению концентрации белка в отобранных образцах (в мкг/мл) рассчитывают общее количество высвобождаемого гистона Н1 в течение каждого конкретного срока от начала инкубации (в абсолютных величинах (мкг) и в процентном отношении) (таблица).In the particular case of using a sample of microspheres containing in its composition from 2 to 4 μg of protein per 1.0 mg of dry weight microspheres. A sample of microspheres in an amount of 1.54 g is placed in an incubation medium with a volume of 180 ml and incubated at + 21 ° C with stirring. Determine the concentration of protein in aliquots of the medium, which are selected from the incubation medium (volume 5.0-10.0 ml) during the first day after 1, 5, 12 and 24 hours and in the period from 2 to 50 days (after 2, 5 , 10, 30 and 50 days) from the start of incubation. Based on the data on determining the protein concentration in the selected samples (in μg / ml), the total amount of histone H1 released during each specific period from the start of incubation is calculated (in absolute values (μg) and in percentage terms) (table).
- 7 032507- 7 032 507
Количество гистона Н1, высвобождаемого из микросфер, приготовленных на основе сополимера полилактид-гликолида, содержащих инкапсулированные наносферы с включенным в их состав гистоном Н1, в модельную среду на различных сроках инкубацииThe amount of histone H1 released from microspheres prepared on the basis of a polylactide-glycolide copolymer containing encapsulated nanospheres with histone H1 included in their composition, in a model medium at different periods of incubation
В таблице приведены данные по количеству высвобожденного гистона Н1 из микросфер в течение первых часов, первых суток и до 50 суток от начала инкубации. Из приведенных данных видно, что количество белка в среде увеличивается со временем инкубации и характеризуется как непрерывный процесс выхода белка из системы.The table shows data on the amount of histone H1 released from the microspheres during the first hours, first days, and up to 50 days from the start of incubation. It can be seen from the above data that the amount of protein in the medium increases with the incubation time and is characterized as a continuous process of the release of protein from the system.
На графике (фиг. 2) представлен профиль высвобождения гистона Н1 из микросфер, содержащих наносферы с гистоном Н1 в модельную среду инкубации в зависимости от времени от начала инкубации в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 50 суток.The graph (Fig. 2) shows the release profile of histone H1 from microspheres containing nanospheres with histone H1 to a model incubation medium versus time from the start of incubation in phosphate-buffered saline for 50 days.
Высвобождение белка из микросфер на основе резорбируемого сополимера полилактид-гликолида обычно характеризуется начальной контролируемой диффузией фазой. Процесс выхода белка из системы в первые 24ч определяется высвобождением адсорбированного белка на поверхности микросфер. Начальное высвобождение положительно заряженного гистона Н1 из микросфер, полученных на основе резорбируемого сополимера полилактид-гликолида, может контролироваться электростатическим взаимодействием между ЫН2-группами гистона Н1 и свободными карбоксильными группами цепей гетерополимера. Этот факт подтверждается увеличением срока первичного высвобождения гистона Н1 из системы до 2-х суток. В течение первых 2-х суток количество высвобожденного гистона Н1 сохраняется на одном уровне и составляет 20 и 22% в первые 24 и 48 ч соответственно.Protein release from microspheres based on a resorbable polylactide-glycolide copolymer is usually characterized by an initial diffusion-controlled phase. The process of the release of protein from the system in the first 24 hours is determined by the release of adsorbed protein on the surface of the microspheres. The initial release of positively charged histone H1 from microspheres obtained on the basis of a resorbable polylactide-glycolide copolymer can be controlled by the electrostatic interaction between the OH 2 groups of histone H1 and the free carboxyl groups of the heteropolymer chains. This fact is confirmed by an increase in the period of primary release of histone H1 from the system up to 2 days. During the first 2 days, the amount of histone H1 released remains at the same level and amounts to 20 and 22% in the first 24 and 48 hours, respectively.
Последующее высвобождение гистона Н1 из микросфер можно характеризовать как непрерывный и равномерный выход белка из системы инкубации в результате резорбции микросфер в течение 50 суток. После 120 ч выход белка составлял 43%, после 240 ч 79%, после 480 ч 84% и после 720 ч 92%. Полное высвобождение гистона Н1 наступает в течение 50 суток (1200 ч) и составляет 97% от начала инкубации.The subsequent release of histone H1 from the microspheres can be characterized as a continuous and uniform release of protein from the incubation system as a result of resorption of the microspheres for 50 days. After 120 hours, the protein yield was 43%, after 240 hours 79%, after 480 hours 84% and after 720 hours 92%. Full release of histone H1 occurs within 50 days (1200 h) and is 97% of the start of incubation.
Представленное изобретение обеспечивает сохранение нативной структуры белка за счет его включения в состав полимерных наносфер и повышает надежность, и упрощает способ получения нативного белка в составе полимерных наносфер и резорбируемых микросфер, которые предназначены для пролонгации физиологического действия нативного белка, применяемого в терапевтических целях.The presented invention ensures the preservation of the native structure of the protein due to its inclusion in the composition of polymer nanospheres and increases reliability, and simplifies the method of producing the native protein in the composition of polymer nanospheres and resorbable microspheres, which are designed to prolong the physiological effect of the native protein used for therapeutic purposes.
Заявленное изобретение может быть использовано для доставки белковых лекарственных средств к клеткам-мишеням и тканям организма и имеет преимущества при использовании в различных областях наномедицины, например, при создании вакцин для иммунизации против ряда заболеваний; в биорегенеративной инженерии для стимулирования регенерации ткани; в области нанодиагностики, основанной на использовании молекулярных детекторов, биосенсоров и флуоресцентных наночастиц.The claimed invention can be used to deliver protein drugs to target cells and body tissues and has advantages when used in various fields of nanomedicine, for example, when creating vaccines for immunization against a number of diseases; in bioregenerative engineering to stimulate tissue regeneration; in the field of nanodiagnostics based on the use of molecular detectors, biosensors and fluorescent nanoparticles.
Можно рассматривать и другие многочисленные возможности применения микроинкапсулирования белковых лекарственных средств, например, для их локальной доставки в области, которые при определенных ситуациях могут быть малодоступны для тока крови в организме. Более того, белки с неблагоприятной фармакокинетикой, например с очень коротким периодом полураспада или неспособных достигать соответствующих мишеней, также требуют использования способов непрерывной доставки для их дальнейшего терапевтического использования.You can consider other numerous possibilities of using microencapsulation of protein drugs, for example, for their local delivery in areas that, in certain situations, may be inaccessible for blood flow in the body. Moreover, proteins with unfavorable pharmacokinetics, for example with a very short half-life or unable to reach the corresponding targets, also require the use of continuous delivery methods for their further therapeutic use.
- 8 032507- 8 032507
Список использованной литературыList of references
1. Иа§ауа1тпа В V Ν, Нетап! К.8.Уабау, Ауаг А, УазибНа Ь.8, 8зЫуакитаг Н. Щйегеп! ксНтдиез Гог ргерагакоп о£ ро1утепс папорагкскз. Аз1ап 1оита1 оГ РНагтасеи11са1 апб С1тка1 КезеагсН, 2012, Уо1 5, 8ирр1 3: 16-23.1. Jaagaua1pa In V V, Netap! K.8. Ouabau, Auag A, UAZIBNa L.8, Szuuakitag N. Schiegep! KsNtiez Gog rgeragakop o ро ro1uteps paporagksks. Az1ap 1oita1 oG Rnagtasei11ca1 apb C1tka1 KezeagsN, 2012, Yo1 5, 8irr1 3: 16-23.
2. 8о1апо Итапа УкЮгт, Уе§а Ваибгк 1озе КоЬегГо, όοηζάΐεζ Раг Κοάοΐίο. ТЬе Νε\ν Ρΐείά οί ΐϋε Иапотебкте. 1п1ета1юпа1 боита1 οί Αρρίΐεά δεΐεηεε апб ТесЬпо1оду. 2015, 5(1): 79-88.2. 8a1apo Itapa UkUgt, Uea Waibgk 1ose KoegGo, όοηζάΐεζ Rag Κοάοΐίο. Thye Νε \ ν Ρΐείά οί ΐϋε Iapotebkte. 1p1et1yup1 baita1 οί Αρρίΐεά δεΐεηεε apb Tesbod1odu. 2015, 5 (1): 79-88.
3. бе Мога18 МО, Магкпз УО, δΐείϊεηδ ϋ, Ргапке Р, ба Соз1а ДА. Вю1о§ка1 аррНсабопз оГ папоЬ1о1есНпо1о§у. 1 Иапозс1 Иапо1есЬпо1. 2014, 14(1): 1007-17.3. Be Moga18 MO, Magkpz UO, δΐείϊεηδ ϋ, Rgapke P, ba Soz1a YES. Wülgö1 arrHsabopz ogus daddy lucidus. 1 Apollo1 and Apollocera. 2014, 14 (1): 1007-17.
4. РгебепЬегд 8, \Уа111§геп Μ, Кезкху Μ, Ахекзоп А. ТЬе тескашзтз о£ бги§ геказе ΐη ро1у(1асбс-со-§1усоНс ас1б)-Ьазеб бгид беИуегу зузктз. Ιηΐ 1 РЬагт. 2011, 30;415(1-2):34-52.4. Rzhebebegd 8, \ ya111§gep К, Kezkhu Μ, Akhekzop A. Thy tekashztz about б bgi§ gekase ΐη po1u (1ссбс-со-§1усоНс ас1б) -Заэббе беIюегу зузктз. Ιηΐ 1 Pact. 2011, 30; 415 (1-2): 34-52.
5. Китай А, Уабау 8К, Уабау 8С. Вюбе§габаЫе ро1утепс папорагкскз Ьазеб бги§ άεΐΐνειγ зузктз. СоПокк 8иг£В: ВюткгГасез. 2010, 75(1):1-18.5. China A, Ouabau 8K, Ouabau 8C. Anyone of the paparangians азazeb bgi§ άεΐΐνειγ zuzktz. SoPokk 8ig £ V: WutkGasez. 2010, 75 (1): 1-18.
6. Р1за1 ϋδ, Коз1озк1 МР, Ва1и-1уег 8У. ЦеИуегу οί 1Ьегареи11с рго1етз. 1 РЬагт δει. 2010, 99(6):2557-75.6. R1za1 ϋδ, Koz1ozk1 MR, Ba1i-1ueg 8U. Tseyuegu οί 1 Ligarei11 with rgo1ets. 1 Pbmt δει. 2010, 99 (6): 2557-75.
7. НШапеаи Н, Соиугеиг Р.Иапосатегз' епку ίηΐο 1Ье εεΐΐ: гекуапсе ΐο бги§ беИуегу. Се11 Μοί Ιύίε 8εί. 2009, 66(17):2873-96.7. NShapeai N, Saugegeig R. Iaposategs' ίηΐο 1bе εεΐΐ: hekuapse гиο bgi§ beIyuegu. Be11 Μοί Ιύίε 8εί. 2009, 66 (17): 2873-96.
8. РгазатзЬа Рап1а, Ца Υεοη Κΐιη, Лп 8εοη Κννοη, А Кейт 8οη, Кап§ ХУоо Бее, Μοοη 8ик К1т. Ргокт Эгид-Ьоаскб Ро1утепс Иапорагбскз. ] Вютеб δει Еп§теег (6ΒΪ8Ε). 2014, 7(10): 825-832.8. Prostate Rapa, Tsa Υεοη Κΐιη, Ln 8εοη Κννοη, And Kate 8οη, Kap§ Hoooo Bey, Μοοη 8к К1т. Rgokt Aegid-Looaskb Ro1uteps Iaporagbsk. ] Vyuteb δει Ep§teeg (6ΒΪ8Ε). 2014, 7 (10): 825-832.
9. 8орр1таб1 Κδ, АттаЬЬаУ! ΤΜ, Ки1кагт ΑΚ, Кибгтзкг \УЕ.Вюбе§габаЬк ро1утепс папорагкскз аз бги§ άεϋνεΓγ άενΐεεδ. I Сопко1 Кеказе. 2001, 70(1-2): 1-20.9.8opr1tab1 Κδ, AttaBaU! ΤΜ, Ki1kagt ΑΚ, Kibgtzkg \ UE.Vyube§gaba bk ro1uteps paporakskzz bgi§ άεϋνεΓγ άενΐεεδ. I Sopko1 Kekase. 2001, 70 (1-2): 1-20.
10. Ей К, КИЬапоу АМ, Ьапдег К.Ргокт з1аЬ11ку ϊη сопкоПеб-геказе зузктз. Иа1 Вю1есЬпо1. 2000, 18(1):24-5.10. Her K, KIbapou AM, Lapdeg K. Rgokt z1ab11ku ϊη sopkoPeb-hekase zuzktz. Ia1 Vy1esbpo1. 2000, 18 (1): 24-5.
11. Могка Т, Нопкт У, УатаЬага Н, 8игик1 Т, УозЫпо Н. Гогтакоп апб ко1а!юп οί зрЬепса! ίϊηε ρΓοΐεΐη ткгорагбскз 1Ьгои§Ь 1уорЬШгакоп о£ ρτοίεΐηро1у(е1Ьукпе §1усо1) адиеоиз гтхШге. РЬагт Кез. 2000, 17(11):1367-73.11. Mogka T, Nopkt U, Uatalaga N, 8igik1 T, UoZypo N. Gogtakop apb koaa! ίϊηε ρΓοΐεΐη г ора г г 1 1 § § акоп г акоп акоп акоп акоп о о о акоп ρ ρ акоп акоп (((((((ад ге ге ге ге. Ragt Kez. 2000, 17 (11): 1367-73.
12. Ггапззеп О, 81епекез Кб, Нептпк АУЕ.СопкоПеб геказе о Г а тобе! ргокт Лот епгутаксаПу бе§габ1п§ бехкап ткгозрЬегез. б Сопко1 Кеказе. 1999, 59(2):21928.12. Ggapzzep O, 81pepez Kb, Neptpk AUE. SopkoPeb hekase about you! Rokokt Lot epgutaksa Pu baggab1n§ bekhkap tkgozryegez. b Sopko1 Kekase. 1999, 59 (2): 21928.
13. Тио бт, Ь1 СЬеп, Ниа гЬи.81аЫе ро1утег адиеоиз/адиеоиз етик1оп зузкт апб изез 1Ьегео£. 2004.1686805879 В2.13. Thiobt, L1, Ln, Nig, Ll. 2004.1686805879 B2.
14. Тио Лп, Ниа Ζΐηι, б1аЬао Ζΐηι. АдиезрЬегез, ίϋεϊτ ргерагакоп апб изез 1Ьегео£ 2006. υδ6998393.14. Tio Ln, Nia Ζΐηι, b1abao Ζΐηι. Adieger, ίϋίϋϊϊггераерагггггг ггакоп ап ап апббббезезез 1ЬЬЬЬео £ £ 2006 2006. υδ6998393.
15. Тио бт, Γεΐ АУи, Ψεϊεη Уиап. Ро1узассЬалбе ткгорагкскз соп!атт§ Ью1о§ка1 а§еп!з: 1Ьеге ргерагакоп апб аррИсабопз. 2007. ХУ02007025441 А1.15. Thio bt, Γεΐ Au, Ψεϊεη Viap. Rouzassassalbe torgoraggskz sop! Attg ю bülögka1 szep! Z: 1 ег е р ера г г ап ап ап б ар ар ар аб аб аб. 2007. XU02007025441 A1.
16. Γεΐ ДУ и, гЫЬиа ΖΗοη, Лп§ 8и, Е1апдтт§ Ψεί, Ψεΐεη Уиап, Тио Лп. ϋενείορηιεηΐ оГ бехкап папорайккз Гог з1аЬШгт§ беИсак ргоктз. Иапозсак Кез Бек. 2013,8(1): 197-204.16. Γεΐ У У Ь,, Ь иа иа η η η η η η η п § п § η η 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 Т Т Т. ϋενείορηιεηΐ оГ Behkap paporaiks Gog z1aShrt§ beIsak rgoktz. Iapozsak Kez Beck. 2013.8 (1): 197-204.
17. Горюхина О.А.,Мартюшин С.В.Динаев Т.П. Способ получения трехмерных матриц для тканоподобных структур из клеток животного происхождения. 2010. Патент на изобретение №2396342 С1.Российская Федерация.17. Goryukhina O.A., Martyushin S.V. Dinaev T.P. A method of obtaining three-dimensional matrices for tissue-like structures from cells of animal origin. 2010. Patent for invention No. 2396342 C1. Russian Federation.
18. Горюхина О. А., Мартюшин С. В., Блинова М. И., Полянская Г. Г., Черепанова О. А., Пинаев Г. П. Культивирование клеток на микросферах, покрытых гистонами. Цитология. 2010, 52,1:12-23.18. Goryukhina O. A., Martyushin S. V., Blinova M. I., Polyanskaya G. G., Cherepanova O. A., Pinaev G. P. Cell cultivation on microspheres coated with histones. Cytology. 2010, 52.1: 12-23.
19. Тишкина Т. Е., Горюхина О. А. Влияние ограниченного протеолиза гистонов на их фагоцитозстимулирующую активность. Вести.Ленингр.ун-та. 1983, 3:122-124.19. Tishkina T. E., Goryukhina O. A. Effect of limited proteolysis of histones on their phagocytosis-stimulating activity. News. Leningrad. 1983, 3: 122-124.
20. Тау1ог М. В., Вгоууп I. Ν. Ηΐδίοηε ргеорзошзакоп шегеазез 1Ье гезрпа1огу Ьигз! гезропзе οί рЬа§осу!ез ΐο Рпеитосузкз сагтй ГЕМ8 МкгоЬюЬ Бей. 1991, 69:79-82.20. Tau1og M.V., Vgouup I. Ν. Ηΐδίοηε ге зак з зак зак зак ш ш ш аз аз аз!!!!!!! Gezropze ίί Ь § §! у! ез ΐ Р Р Р Р ит ит ос аг аг ЕМ ЕМ ЕМ 8 М к ей ей ей. 1991, 69: 79-82.
21. 8аЬекку V. Ога1 тзиИп сотрозйкт апб теГЬобз οί такт£ апб изт§ 1Ьегео1.2010.11820100166855 А1 (Прототип).21. 8aekku V. Oga1 tiIp sotrozykt apb teGobz οί tact ап apb from § 1 Begeo1.2010.11820100166855 A1 (Prototype).
22. Уе М, К1гп 8, Ратк К. 1ззиез ΐη 1оп§-1егт ρΓοΐεΐη беИуегу изт§ Ыобе§габаЫе ткгорагбекз. б Сопко1 Кеказе. 2010,146(2):241-60.22. Ue M, K1gp 8, Ratk K. зηиезΐ 1η 1op§-1egt ρΓοΐε бη уΓуΓ из из изт§§§обоб т т т т т т т т т т т т ткг тккккггггггггггггггггггггг. b Sopko1 Kekase. 2010,146 (2): 241-60.
23. Горюхина О.А., Миглиниец М.П., Криева М.А. Способ получения суммарного гистона из животного сырья. 1981. Патент на изобретение №843915. Российская Федерация.23. Goryukhina O.A., Migliniyets M.P., Krieva M.A. The method of obtaining the total histone from animal raw materials. 1981. Patent for invention No. 843915. Russian Federation.
24. Горюхина О.А., Мюльберг А.А., Криева М.А.,, Тишкина Т.Е. Способ очистки препарата гистона Н4 из ткани тимуса телят. 1989. Патент на изобретение №1319352. Российская Федерация.24. Goryukhina O.A., Mulberg A.A., Krieva M.A., Tishkina T.E. A method of purifying a histone H4 preparation from calf thymus tissue. 1989. Patent for invention No. 1319352. Russian Federation.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147241A RU2647466C1 (en) | 2016-12-01 | 2016-12-01 | Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201700521A2 EA201700521A2 (en) | 2018-08-31 |
| EA201700521A3 EA201700521A3 (en) | 2018-11-30 |
| EA032507B1 true EA032507B1 (en) | 2019-06-28 |
Family
ID=61627661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201700521A EA032507B1 (en) | 2016-12-01 | 2017-11-23 | Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA032507B1 (en) |
| RU (1) | RU2647466C1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2722822C1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-06-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ)" | Method of producing polymer nanospheres for targeted delivery to target tissue |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7544656B2 (en) * | 2003-03-04 | 2009-06-09 | The Technology Development Company, Ltd. | Long acting injectable insulin composition and methods of making and using thereof |
| RU2396342C1 (en) * | 2008-12-25 | 2010-08-10 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет | Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells |
| RU2426590C2 (en) * | 2003-07-18 | 2011-08-20 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Method of production, use and composition of minor spherical particles produced in controlled phase separation |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2459834C1 (en) * | 2011-08-19 | 2012-08-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Пента-91" | Method of producing monodispersed carboxylated polymer microspheres |
| RU2600108C1 (en) * | 2015-09-29 | 2016-10-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский университет "Московский институт электронной техники" (МИЭТ) | Method of producing polymer microspheres containing quantum dots |
-
2016
- 2016-12-01 RU RU2016147241A patent/RU2647466C1/en active
-
2017
- 2017-11-23 EA EA201700521A patent/EA032507B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7544656B2 (en) * | 2003-03-04 | 2009-06-09 | The Technology Development Company, Ltd. | Long acting injectable insulin composition and methods of making and using thereof |
| RU2426590C2 (en) * | 2003-07-18 | 2011-08-20 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Method of production, use and composition of minor spherical particles produced in controlled phase separation |
| RU2396342C1 (en) * | 2008-12-25 | 2010-08-10 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет | Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHIRUI MAO et al. Effect of WOW process parameters on morphology and burst release of FITC-dextran loaded PLGA microspheres. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 334, pp. 137-148 * |
| TIANTIAN REN et al. Sustained-release polylactide-co-glycolide microspheres loaded with pre-formulated protein polysaccharide nanoparticles. Micro & Nano Letters, 2011, vol. 6, iss. 2, pp. 70-74 * |
| Горюхина О.А. и др. Культивирование клеток на микросферах, покрытых гистонами. Цитология, 2010, т. 52, № 1, с. 12-23 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2647466C1 (en) | 2018-03-15 |
| EA201700521A3 (en) | 2018-11-30 |
| EA201700521A2 (en) | 2018-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdelkader et al. | Review on micro-encapsulation with Chitosan for pharmaceuticals applications | |
| Hu et al. | A novel long-acting azathioprine polyhydroxyalkanoate nanoparticle enhances treatment efficacy for systemic lupus erythematosus with reduced side effects | |
| Mitra et al. | Chitosan microspheres in novel drug delivery systems | |
| US6726934B1 (en) | Micro-particulate and nano-particulate polymeric delivery system | |
| Rampino et al. | Chitosan nanoparticles: Preparation, size evolution and stability | |
| Panos et al. | New drug delivery systems based on chitosan | |
| Cui et al. | Preparation and characterization of melittin-loaded poly (DL-lactic acid) or poly (DL-lactic-co-glycolic acid) microspheres made by the double emulsion method | |
| US6692770B2 (en) | Starch microparticles | |
| Mahapatro et al. | Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in-vivo delivery of drugs and vaccines | |
| AU710347B2 (en) | Composition for sustained release of an agent | |
| KR100490002B1 (en) | Polyaminoacid-based particles for use as active principle vectors, and methods for preparing same | |
| CN108653741B (en) | Metal organic coordination polymer coated natural sericin microsphere and preparation method and application thereof | |
| JP2007308500A (en) | Prolonged release of gm-csf | |
| US20080241267A1 (en) | Hydrogel Microspheres with Improved Release Profile | |
| EP1021168A1 (en) | Micro-particulate and nano-particulate polymeric delivery system | |
| Swed et al. | Protein encapsulation into PLGA nanoparticles by a novel phase separation method using non-toxic solvents | |
| KR20030051687A (en) | Biodegradable microparticles for controlled release administration, with purified amylopectin-based starch of reduced molecular weight | |
| US6616949B2 (en) | Process for producing microparticles | |
| Lee et al. | Stabilization of protein encapsulated in poly (lactide-co-glycolide) microspheres by novel viscous S/W/O/W method | |
| US7105181B2 (en) | Microparticles | |
| WO2003062199A2 (en) | Pace-a microspheres for delivery of antigens | |
| US20030170313A1 (en) | Micro-particulate and nano-particulate polymeric delivery system | |
| Kharel et al. | Hollow microparticles as a superior delivery system over solid microparticles for the encapsulation of peptides | |
| Stevanović | Polymeric micro-and nanoparticles for controlled and targeted drug delivery | |
| EA032507B1 (en) | Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU |