EA020456B1 - Фармацевтическая композиция, содержащая связывающееся с vla-4 антитело, для подкожной или внутримышечной доставки - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает фармацевтическую композицию на водной основе, составленную для подкожной или внутримышечной доставки. Указанная композиция содержит связывающееся с VLA-4 антитело в концентрации от примерно 120 до примерно 190 мг/мл, натрий-фосфатный буфер в количестве примерно 1-100 мМ, хлорид натрия в количестве примерно 50-200 мМ и полисорбат-80 в количестве примерно 0,01-0,12%. рН указанной композиции может составлять 6±1. Также описаны способ получения указанной фармацевтической композиции на водной основе и способ лечения пациента с воспалительными заболеваниями, где указанный способ включает подкожное или внутримышечное введение указанной композиции.

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент США № 60/944076, поданной 14 июня 2007 г, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Уровень техники

Рассеянный склероз (РС) является одним из наиболее часто встречающихся заболеваний центральной нервной системы. На сегодняшний день около 2500000 людей по всему миру поражены РС.

Сущность изобретения

В основу изобретения положена, в частности, разработка композиций, содержащих высокие концентрации УЪА-4-связывающего антитела. Некоторые варианты реализации подходят для введения пациенту, такому как человек, например, в организм пациента-человека, подкожным (ПК) или внутримышечным (ВМ) путем. Композиции также подходят для внутривенного (ВВ) введения, например, в форме растворов в приемлемом инфузионном матриксе (таком как нормальный солевой раствор). УЪА-4связывающим антителом может быть натализумаб, к примеру, и концентрация антител колеблется в пределах от 120 до приблизительно 190 мг/мл. Композиции оказывают терапевтическое воздействие на воспалительные, иммунные или аутоиммунные заболевания. К примеру, композиция может оказать терапевтическое воздействие на воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), такое как рассеянный склероз (РС).

Согласно одному аспекту изобретение описывает фармацевтическую композицию на водной основе, например, стабильную фармацевтическую композицию на водной основе, содержащую УЪА-4связывающее антитело в концентрации от приблизительно 120 до приблизительно 190 мг/мл (например, в концентрации приблизительно 135 мг/мл, приблизительно 140 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 160 или приблизительно 165 мг/мл) и фосфатный буфер с рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5. В некоторых вариантах реализации концентрация УЬА-4 антитела колеблется от приблизительно 130 до приблизительно 180 мг/мл, или от приблизительно 140 до приблизительно 160 мг/мл. В одном варианте реализации концентрация УЬА-4 антитела превышает 150 мг/мл, например, колеблется от 150 до 190 мг/мл. В еще одном варианте реализации концентрация УЬА-4 антитела равна приблизительно 150 мг/мл.

В одном варианте реализации УЬА-4-связывающее антитело является гуманизированым моноклональным антителом, таким как натализумаб. В другом варианте реализации УЬА-4-связывающее антитело является разновидностью натализумаба. К примеру, в некоторых вариантах реализации вариабельный домен легкой цепи антитела содержит в своей композиции аминокислотную последовательность, отличающуюся от вариабельного домена легкой цепи натализумаб на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков, и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит в своей композиции аминокислотную последовательность, отличающуюся от вариабельного домена тяжелой цепи натализумаба на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации отдельные или все различия являются консервативными изменениями.

В еще одном варианте реализации один или оба вариабельных домена легкой цепи УЬА-4связывающего антитела содержат аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:7, описанную в патенте США № 5840299, включенном в настоящую заявку посредством ссылки, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:11, описанную в патенте США № 5840299. В других вариантах реализации УЬА-4 антитело является разновидностью одного из таких антител. К примеру, в некоторых вариантах реализации вариабельный домен легкой цепи антитела содержит в своей композиции аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности в §Е0 ГО N0:7, описанной в патенте США № 5840299, на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков, и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит в своей композиции аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности в 8Е0 ГО N0:7, описанной в патенте США № 5840299, на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков.

В еще одном варианте реализации УЬА-4-связывающее антитело содержит в своей композиции одну или обе аминокислотные последовательности легкой цепи из 8Е0 ГО N0:1 в табл. 1-1 и последовательность тяжелой цепи из 8Е0 ГО N0:2 в табл. 1-2. В других вариантах реализации УЬА-4связывающее антитело является разновидностью одного из таких антител. К примеру, в некоторых вариантах реализации легкая цепь антитела содержит в своей композиции аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности из 8Е0 ГО N0:1 на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков, и/или тяжелая цепь содержит в своей композиции аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности из 8Е0 ГО N0:2 на один или более аминокислотных остатков, но не более, чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков.

Различие в аминокислотной последовательности, в контексте настоящей заявки, означает различие в идентичности аминокислот (например, замена отличающейся аминокислоты на аминокислоту последовательности 8Е0 ГО N0:7 или 11, указанных выше), или делецию или вставку. Различие может

- 1 020456 быть, например, в области рамки считывания, в СЭР (гипервариабельном участке), в шарнирной или в константной области. Различие может быть внутри или на конце белковой последовательности. В некоторых вариантах реализации отдельные или все различия являются консервативными изменениями относительно указанной последовательности.

В некоторых вариантах реализации рН композиции равен приблизительно 6,0±0,5 (например, приблизительно 5,0±0,5, приблизительно 6,0±0,5, приблизительно 7,0±0,5), и композиция фосфатного буфера приблизительно 5 и приблизительно 30 мМ (например, приблизительно 10 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ). В другом варианте реализации, композиция дополнительно включает соль, такую, как хлорид натрия, в концентрации от приблизительно 100 до приблизительно 200 мМ (например, приблизительно 120, 140, 160, 180 мМ). В еще одном варианте реализации, композиция включает Ь-аргинина гидрохлорид, или глицерол. В другом варианте реализации, композиция включает аминокислоту, такую, как глицин, в концентрации от приблизительно 200 мМ до приблизительно 300 мМ (например, приблизительно 220, 240, 260, 280 мМ). В еще одном варианте реализации композиция включает фармацевтически приемлемый эксципиент, такой как сурфактант, например, полисорбат-80, в количестве от приблизительно 0,001 до приблизительно 2,0%, от приблизительно 0,004 до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,008 до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,08% (в/о) (например, приблизительно 0,01%, приблизительно 0,02%, приблизительно 0,03%, приблизительно 0,04%, приблизительно 0,05%, приблизительно 0,06%, приблизительно 0,07%, приблизительно 1%, приблизительно 1,5%).

В некоторых вариантах реализации композиция включает глицерол и практически не содержит Ьаргинина гидрохлорид, или хлорид натрия. В других вариантах реализации композиция включает Ьаргинина гидрохлорид и практически не содержит глицерол, или хлорид натрия (за исключением таковых из фосфатного буфера и Ь-аргинина гидрохлорида). В других вариантах реализации композиция включает хлорид натрия и практически не содержит глицерол, или Ь-аргинина гидрохлорид.

В некоторых вариантах реализации композиция, содержащая антитело, включает гистидиновый буфер, например, вместо фосфатного буфера, и рН гистидинового буфера равен от приблизительно 5 до приблизительно 7 (например, рН приблизительно 5,5±0,5, 6±0,5 или 6,5±0,5). Молярность композиции с гистидиновым буфером равна от приблизительно 10 до приблизительно 30 мМ (например, приблизительно 15 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ). Композиция с гистидиновым буфером также включает от приблизительно 200 до приблизительно 300 мМ глицерола (например, приблизительно 240 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 260 мМ, приблизительно 270 мМ, приблизительно 280 мМ глицерола) и от приблизительно 0,001 до приблизительно 2,0% (в/о) (например, приблизительно 0,02%, приблизительно 0,03%, приблизительно 0,04%, приблизительно 0,05%, приблизительно 0,06%, приблизительно 0,07%, приблизительно 1%, приблизительно 1,5%) полисорбата-80. Гистидиновая композиция также может содержать от приблизительно 5 мМ до приблизительно 15 мМ Ь-метионина (например, приблизительно 10 мМ Ь-метионина).

В одном варианте реализации указанная в настоящей заявке композиция содержит от 140 до 160 мг/мл натализумаба, от 5 до 15 мМ натрий-фосфатного буфера, от 130 до 150 мМ хлорида натрия и от 0,01 до 0,1% (в/о) полисорбата-80 при рН 6±0,5. В другом варианте реализации композиция содержит от 140 до 160 мг/мл натализумаба, от 5 до 15 мМ натрий-фосфатного буфера, от 250 до 300 мМ глицерола и от 0,01 до 0,1% (в/о) полисорбата-80 при рН 6±0,5. В еще одном варианте реализации композиция содержит от 140 до 160 мг/мл натализумаба, от 5 до 15 мМ натрий-фосфатного буфера, от 150 до 170 мМ Ьаргинина гидрохлорида и от 0,01 до 0,1% (в/о) полисорбата-80 при рН 6±0,5.

В одном из вариантов реализации указанная в настоящей заявке композиция является жидкостью.

В другом варианте реализации композиция является стабильной по меньшей мере в течение 12 мес. (например, по меньшей мере в течение 24, 30, 36 мес.) при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С (например, приблизительно 5°С). В другом варианте реализации композиция является стабильной по меньшей мере в течение двух, трех, четырех, пяти, шести или семи дней (например, по меньшей мере в течение нед. или двенадцати, или четырнадцати дней) при температуре окружающей среды приблизительно 20-30°С, например, около 25°С.

В еще одном варианте реализации композиция подходит для ПК или ВМ введения. В еще одном варианте реализации композиция подходит для ВВ введения.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ приготовления композиции на водной основе, такой как стабильная композиция на водной основе, содержащей от приблизительно 120 до приблизительно 190 мг/мл УЬЛ-4-связывающего антитела и полисорбат в фосфатном буфере. Способ включает экспрессию антитела в клеточной культуре, проведение по меньшей мере одной хроматографической стадии очистки антитела, проведение по меньшей мере двух стадий ультрафильтрации/диафильтрации антитела в фосфатном буфере, проведение по меньшей мере одной стадии ультрафильтрации антитела в фосфатном буфере, изменение концентрации антитела, например, снижение до значений от приблизительно 120 до приблизительно 190 мг/мл, путем добавления полисорбата и/или фосфатного буфера. В одном варианте реализации УЬЛ-4-связывающим антителом является натализу- 2 020456 маб, а в другом варианте полисорбатом является полисорбат-80. Концентрация антитела может быть, например, от 135 до 165 мг/мл, например, 150 мг/мл. В некоторых вариантах реализации фосфатный буфер включает другие вспомогательные вещества, такие как глицерол, Ь-аргинина гидрохлорид, или хлорид натрия. рН окончательной композиции равен от приблизительно 5 до приблизительно 7, например, от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает устройство для введения, разработанное специально, или подходящее для ПК или ВМ введения, упакованное или содержащее стандартную дозу композиции, описываемой в настоящей заявке, например, композиции, содержащей в концентрированной форме натализумаб, подходящей для ПК или ВМ введения. В одном из вариантов реализации стандартная доза содержит от приблизительно 100 до приблизительно 400 мг (например, от приблизительно 120 до приблизительно 350 мг; приблизительно 150 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг). В одном варианте реализации стандартная доза варьирует от выше 100 до приблизительно 400 мг. В другом варианте реализации объем стандартной дозы находится в промежутке от приблизительно 1,4 до приблизительно 3,0 мг/кг УЪЛ-4-связывающего антитела на кг массы тела человека. В другом варианте реализации стандартная доза составляет от приблизительно 0,25 до приблизительно 1,5 мл (например, приблизительно 0,5 мл, приблизительно 0,75 мл, приблизительно 1,0 мл).

В одном варианте реализации стандартная доза составляет приблизительно 300 мг натализумаба, а в другом варианте реализации стандартная доза разделена на части, к примеру, на половины, где каждая половина содержит приблизительно 150 мг УЪЛ-4-связывающего антитела. В еще одном варианте реализации пациенту вводят натализумаб согласно режиму. В одном варианте реализации пациенту вводят приблизительно 300 мг натализумаба 1 раз в мес., например, путем последовательного введения двух доз натализумаба по 150 г. В альтернативном варианте реализации пациенту вводят приблизительно 300 мг натализумаба в мес., с промежутком около 2 нед. между введением первой и второй доз натализумаба по 150 г.

Изобретение обеспечивает способы предоставления пациенту высококонцентрированной жидкой лекарственной формой УЪЛ-связывающего антитела, например, натализумаба.

В одном из вариантов реализации изобретение предусматривает постепенное повышение концентрации указанного антитела. Учитывая постепенное повышение концентрации антитела, оно предусматривает наблюдение за переносимостью пациентом, его реакциями и т.д. по мере роста концентрации. Например, введение можно начать с введения пациенту натализумаба в одной или более начальных или сходных концентрациях и следующим за этим введением конечных, более высоких доз натализумаба. Примеры композиций для первичного введения в типичном случае содержат антитело в концентрации менее 80, 70, 50, 30, 20 или 10% от конечной, более высокой концентрации. Типичными начальными концентрациями могут быть, например, 20, 30 или 40 мг/мл. Типичными конечными концентрациями являются, например, концентрации от приблизительно 120 до приблизительно 190 мг/мл (например, приблизительно 135 мг/мл, приблизительно 140 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 160 или приблизительно 165 мг/мл). В некоторых вариантах реализации пациенту производят одно или ряд введений в одной или нескольких начальных концентрациях. К примеру, в одном варианте реализации пациенту производят несколько введений с увеличиваемыми концентрациями. В некоторых вариантах реализации пациенту производят два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь введений до достижения конечной концентрации. К примеру, пациент получает одно или несколько введений в первой начальной концентрации и одно или более введений во второй, более высокой концентрации. В некоторых вариантах реализации пациента осматривают после одного или более введений на предмет симптомов, включая неблагоприятные симптомы. В некоторых вариантах реализации пациенту вводят композицию с повышенной концентрацией натализумаба только после подтверждения того факта, что предыдущее введение не вызвало никаких побочных действий на организм пациента.

В одном варианте реализации способ предусматривает постепенное увеличение установленной дозы антитела (дозировка в настоящем описании относится к количеству антитела, установленному в одном или каждом из определенных небольших количеств, например, двух введений). Он предусматривает постепенное увеличение дозировки и может предусматривать наблюдение за переносимостью пациентом, неблагоприятными реакциями и т.д. по мере увеличения дозировки. Например, введение можно начать с введения пациенту натализумаба в одной или более начальных или сходных дозировках и следующим за этим введением конечных, более высоких дозировок натализумаб. Типичные начальные дозировки могут составлять, например, 80, 70, 50, 30, 20 или 10% и менее от конечных более высоких дозировок. Типичные конечные дозировки варьируют в зависимости от частоты введений по достижении стабильного режима введения. К примеру, некоторые варианты реализации включают конечные дозировки в промежутке от 75 до 500 мг (например, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 мг) (эти дозировки могут быть типичными для введения приблизительно раз в мес.). Другие варианты реализации включают конечные дозировки в промежутке от 50 до 250 мг (например, 75, 100, 150, 200 мг) (эти дозировки типичны для введения каждые 2 нед.). Существуют варианты реализации, включающие конечные дозировки в промежутке от 25 до 150 мг (например, 50, 75, 100, 125 мг) (эти дозировки типичны для еженедельного введения). В некоторых вариантах реализации пациент получает одно или несколько введений в

- 3 020456 одной или нескольких начальных дозировках. Например, в одном из вариантов реализации пациент получает увеличиваемые дозировки в ходе ряда введений. В некоторых вариантах реализации пациент получает два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь введений в одной или более начальных дозировок до достижения конечной дозировки. К примеру, пациент получает одно или несколько введений в первой начальной дозировке и одно или более введений во второй, более высокой дозировке. В некоторых вариантах реализации пациента осматривают после одного или более введений на предмет симптомов, включая неблагоприятные симптомы. В некоторых вариантах реализации пациенту вводят повышенную дозировку натализумаба только после подтверждения того факта, что предыдущее введение не вызвало никаких побочных действий на организм пациента.

Настоящее изобретение также включает наборы, например, стартовые комплекты, для осуществления постепенного повышения концентрации или дозировки. В одном варианте реализации пациенту, или медицинскому работнику, предоставляют набор или стартовый комплект с лекарственной формой натализумаба, включая упаковки с увеличиваемыми концентрациями или дозировками натализумаба. Пациента или медицинского работника инструктируют относительно самостоятельного введения или вводят первую, например, низкую, или самую низкую дозировку или концентрацию натализумаба, и выжидания в течение указанного периода времени. Если пациент не испытывает, или испытывает в минимальной степени неблагоприятные симптомы, пациента или медицинского работника инструктируют в отношении второго самостоятельного введения лекарственной формы, например, более высокой, следующей по степени повышения концентрации или дозировки. Пациента или медицинского работника инструктируют относительно продолжения пошагового увеличения дозировки или концентрации до достижения желаемой дозировки или концентрации. Пациента или медицинского работника можно проинструктировать относительно дальнейшего самостоятельного введения или ведения конечной лекарственной формы в регулярные интервалы в течение установленного периода времени.

В одном варианте реализации пациенту предоставляют лекарственную форму с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела, предварительно упакованной в подходящее средство введения, такое как шприц.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ, например, способ инструктирования пациента, нуждающегося в лечении УЪЛ-4-связывающим антителом, относительно того, как следует вводить лекарственную форму, описанную в настоящей заявке. Способ включает (ί) обеспечение пациента по меньшей мере одной стандартной дозой лекарственной формы с высокой концентрацией УЪЛ-4связывающего антитела, описанной в настоящей заявке; и (ίί) инструктирование пациента относительно самостоятельного введения по меньшей мере одной стандартной дозы внутримышечно или подкожно. Другой способ, например, способ лечения, включает (ί) обеспечение пациента по меньшей мере двумя стандартными дозами лекарственной формы с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела, описанной в настоящей заявке; и (ίί) инструктирование пациента относительно самостоятельного введения стандартных доз внутримышечно или подкожно, например, по одной дозе за раз.

В одном из вариантов реализации заболевание пациента носит воспалительный характер, например, рассеянный склероз. В других вариантах реализации у пациента, например, астма (например, аллергическая астма), заболевание артритного характера (например, ревматоидный артрит, псориатический артрит), диабеты (например, диабеты I типа), фиброзное заболевание (например, легочный фиброз, миелофиброз, цирроз печени, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, суставной гломерулонефрит, диабетическая нефропатия, почечный нитерстициальный фиброз), или кишечное воспалительное заболевание (например, болезнь Крона, язвенный колит).

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает стандартную дозу лекарственной формы с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела, описанной в настоящей заявке, где объем стандартной дозы равен от приблизительно 0,25 до приблизительно 1,5 мл (например, приблизительно 0,5 мл, приблизительно 0,75 мл или приблизительно 1,0 мл). В одном варианте реализации стандартная доза равна от приблизительно 100 до приблизительно 450 мг (например, приблизительно 150 мг, приблизительно 160 мг, приблизительно 180 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг или приблизительно 350 мг).

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает стандартную дозу лекарственной формы с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела на водной основе, где человеку вводят от приблизительно 1,4 до приблизительно 3,0 мг УЪЛ-4-связывающего антитела или его фрагмента на кг веса тела человека.

Согласно другому аспекту, изобретение описывает способ лечения пациента путем введения пациенту композиции, содержащей УЪЛ-4-связывающее антитело в лекарственной форме, подходящей для ПК или ВМ введения. В одном варианте реализации заболевание пациента носит воспалительный характер, например, рассеянный склероз, астма, ревматоидный артрит, диабет или болезнь Крона. В другом варианте реализации композицию вводят согласно режиму. В еще одном варианте реализации способ далее включает выбор пациента, подходящего для лечения композицией. У пациента, подходящего для лечения, к примеру, обнаружили признаки или симптомы, свидетельствующие о проявлении болезни, к

- 4 020456 примеру, признак или симптом, характерный для РС. В еще одном варианте реализации способ далее включает введение пациенту второго терапевтического агента, такого как тромболитический агент, нейропротекторный агент, противовоспалительный агент, стероид, цитокин или фактор роста.

Согласно другому аспекту изобретение описывает способ оценки пациента путем определения, отвечает ли пациент предварительно установленному критерию, и, если пациент отвечает предварительно установленному критерию, одобрение, предоставление, выписывание рецепта, или введение композиции с УЬА-4-связывающим антителом, описанной в настоящей заявке, пациенту. В одном из вариантов реализации предварительно установленным критерием является неспособность организма пациента дать адекватный ответ на предшествующий альтернативный способ терапевтического лечения или режим, например, лечение РС. В еще одном варианте реализации предварительно установленным критерием является отсутствие любых признаков или симптомов прогрессивной мультифокальной лейкоэнцефалопатии (ПМЛ) или отсутствие любых проявлений ПМЛ. В другом варианте реализации критерий такой же, как описано в υδδΝ 60/836530, поданном 9 августа 2006, включенном в текст настоящей заявки посредством ссылки, описывающем способы и системы распространения лекарственных средств.

Согласно другому аспекту изобретение описывает способ инструктирования получателя (реципиента) относительно введения высококонцентрированной формы натализумаба. Способ включает инструктирование получателя (например, конечного потребителя, пациента, врача, оптового фармацевтического учреждения, дистрибьютора или фармацевтического отдела при больнице, частной лечебной клиники или НМО) относительно того, что лекарство вводят пациенту подкожно или внутримышечно.

Согласно другому аспекту предложен способ распространения описанной в настоящей заявке композиции. Композиция содержит концентрированную лекарственную форму натализумаба и подходит для подкожного или внутримышечного, или внутривенного введения. Способ включает предоставление пациенту (например, конечному потребителю, пациенту, врачу, оптовому фармацевтическому учреждению, дистрибьютору или фармацевтическому отделу при больнице, частной лечебной клинике или НМО) упаковки, содержащей достаточное количество стандартных доз для лечения пациента в течение по меньшей мере 6, 12, 24 или 36 мес.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ оценки качества упаковки или большого количества упаковок (например, определения, не просрочены ли они) композиции, описанной в настоящей заявке, содержащей высокую концентрацию УЬА-4-связывающего антитела. Способ определяет, не просрочена ли упаковка. Срок годности лекарственного средства равен по меньшей мере 6, 12, 24, 36 или 48 мес., например, более 24 или 36 мес. с предварительно установленного момента, такого как производство, опробирование, или упаковка. В некоторых вариантах реализации решение или меры принимают в результате исследования, например, антитело из упаковки используют или забраковывают, классифицируют, отбирают, удерживают, отправляют, перемещают в другое место, запускают в торговый оборот, продают или предлагают для продажи, изымают из торгового оборота или не предлагают более для продажи, в зависимости от того, просрочен ли продукт.

Согласно другому аспекту изобретения предложена упаковка, содержащая по меньшей мере две стандартные дозы композиции на водной основе, содержащей высокую концентрацию УЬА-4связывающего антитела. В одном варианте реализации все стандартные дозы содержат одинаковое количество антитела, согласно другим вариантам реализации предложены стандартные дозы двух или более концентраций, или с двумя или более различными композициями (например, с разной способностью к высвобождению или с разной интенсивностью). В одном варианте реализации по меньшей мере одна доза содержит от приблизительно 100 до приблизительно 450 мг УЬА-4-связывающего антитела, например, приблизительно 100 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг или приблизительно 400 мг УЬА-4-связывающего антитела.

Согласно другому аспекту изобретение включает способ инструктирования получателя относительно введения композиции на водной основе, содержащей УЬА-4-связывающее антитело. Способ включает инструктирование получателя (например, конечного потребителя, пациента, врача, оптового фармацевтического учреждения, дистрибьютора или фармацевтического отдела при больнице, частной лечебной клиники или НМО) относительно того, что антитело должно быть введено пациенту до истечения срока годности. Срок годности равен по меньшей мере 6, 12, 18, 24, 36 или 48 мес., например, более 18, 24 или 36 мес. с предварительно установленного момента, такого как производство, опробирование или упаковка. В одном из вариантов реализации пациент также получает запас антитела, например, запас стандартных доз.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает применение способа или системы, описанных в документе РСТ/υδ 2007/075577 (публикация за номером ΑΘ/2008/021954). к композиции, описанной в настоящей заявке. Варианты реализации включают способ распространения композиции, описанной в настоящей заявке, мониторинг или отслеживание снабжения аптечных учреждений, центров по введению, или пациента композицией, описанной в настоящей заявке, наблюдение одного или более пациентов, выбор пациентов или сбор или передача данных о применении композиции, описанной в настоящей заявке. Документ РСТ/υδ 2007/075577 (публикация за номером ΑΘ/2008/021954) включен в настоящую заявку посредством ссылки.

- 5 020456

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ выбора пациента для лечения композицией, описанной в настоящей заявке, от заболеваний, описанных в настоящей заявке, например, от рассеянного склероза. Способ включает выбор или предоставление пациенту, проходящего лечение посредством внутривенного введения УЪЛ-4-связывающего антитела, например, натализумаба и предоставление или введение описанной в настоящей заявке лекарственной формы пациенту, таким образом, проводя лечение пациента.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ анализа продукта или процесса, например, процесса производства. Способ включает лекарственную композицию на водной основе, содержащую высокую концентрацию УЪЛ-4-связывающего антитела, например, полученную способом, описанным в настоящей заявке, и оценку композиции путем определения параметра раствора, такого как цвет (например, обесцвечивание до бледно-желтого, или обесцвечивание до желтого), прозрачность (например, прозрачность до слабо опалесцирующего или прозрачность до опалесцирующего), или вязкость (например, в промежутке между приблизительно 5 и 30 сР (например, 10, 20 сР), измеренная при температуре окружающей среды, равной 20-30°С, например, 25°С). Оценка может включать определение одного или более параметров раствора. Возможно определение того, отвечает ли параметр раствора заданному критерию, например, исследуя процесс, определяют, представлен ли заданный критерий, или он представлен в заданной степени.

В одном варианте реализации оценка процесса включает измерение стабильности композиции с анти-УЬЛ-антителом. Стабильность композиции, содержащей антитело, можно измерить, например, через образование агрегатов, которое оценивают, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), измерения цвета, прозрачности, вязкости, так, как описано выше. Композицию признают стабильной и, таким образом, приемлемой для дальнейшей обработки или распространения, если изменение анализируемого параметра меньше чем приблизительно 10, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,05 или 0,005%, или менее в течение установленного периода времени и, возможно, при заданной температуре. В одном варианте реализации высококонцентрированная жидкая композиция с анти-УЪЛ-4-антителом стабильна в течение одного, двух, трех, четырех или пяти дней или более при комнатной температуре (например, при приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25°С).

В одном варианте реализации способ дополнительно включает сравнение полученного значения с контрольным значением, чтобы, таким образом, исследовать процесс производства.

В одном варианте реализации способ дополнительно включает поддержание производственного процесса, по меньшей мере, частично, основываясь на результатах анализа. В одном из вариантов реализации способ дополнительно включает изменение производственного процесса, основываясь на результатах анализа.

В одном варианте реализации способ включает оценку процесса, например, производственного процесса, водной формы высококонцентрированного УЪЛ-4-связывающего антитела, созданной благодаря выбранному процессу, что включает принятие решения относительно процесса, основанного на способе исследования, описанного в настоящей заявке. В одном варианте реализации способ дополнительно включает поддержание или изменение производственного процесса, основанного, по меньшей мере, частично, на способе исследования, описанном в настоящей заявке. Таким образом, в другом варианте реализации группа, проводящая оценку, не практикует способ исследования, описанный в настоящей заявке, но лишь полагается на результаты, полученные способом анализа, описанным в настоящей заявке.

В другом варианте реализации способ включает сравнение двух или более препаратов в способе наблюдения или контроля варьирования между образцами, или сравнения препарата с контрольным образцом.

В еще одном варианте реализации способ далее может включать принятие решения, например, классифицировать, отобрать, принять или отклонить, выпустить или удержать, переработать в лекарственный продукт, отправить, перенести в другое место, составить рецептуру, маркировать, упаковать, запустить в торговый оборот, продавать или предлагать для продажи, основываясь, по меньшей мере, частично, на выборе.

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ хранения, распространения или применения композиции с УЬЛ-4-связывающим антителом, например, композиции с натализумабом, описанной в настоящей заявке. Способ включает хранение композиции в начальный период времени при первом, низком значении температуры, например, ниже 1°С, например, от приблизительно температуры замерзания до значений ниже 15, 10 или 4°С;

хранение композиции во второй период времени при втором, более высоком значении температуры, например, в промежутке между 18 и 25°С, где продолжительность упомянутого выше второго периода времени более 24, 48, 72 или 96 ч и где второй период заканчивается при введении пациенту или выбраковке композиции.

- 6 020456

Согласно другому аспекту изобретение обеспечивает способ хранения, распространения или применения композиции с УЪЛ-4-связывающим антителом, например, композиции, содержащей натализумаб, описанной в настоящей заявке. Способ включает хранение композиции в первый период времени при первом, низком значении температуры, например, ниже 18 °С, например, от приблизительно температуры замерзания до значений, приблизительно равных или ниже 15, 10 или 4°С;

предоставление композиции пациенту, например, конечному потребителю, например, пациенту или медицинскому работнику;

возможно, инструктирование конечного потребителя относительно того, что композицию можно хранить при втором, более высоком значении температуры, например, без охлаждения или при комнатной температуре, например, в промежутке между 18 и 25°С и после получения реципиентом хранение композиции в течение временного периода до 24, 48, 72 или 96 ч при втором значении температуры.

Согласно другому аспекту изобретение описывает способ инструктирования субъекта, например, фармацевта, дистрибьютора или конечного потребителя, например, пациента или медицинского работника, относительно хранения, распространения или применения композиции с УЪЛ-4-связывающим антителом, например, композиции, содержащей натализумаб, описанной в настоящей заявке. Способ включает инструктирование субъекта относительно того, что композиция должна храниться при первом, низком значении температуры, например, при 18°С, например, от приблизительно температуры замерзания до значений, приблизительно равных или ниже 15, 10 или 4°С, в течение первого периода, где указанный выше первый период длится до предоставления композиции конечному потребителю или до того, как до введения пациенту остается 24, 48, 72 или 96 ч; и инструктирование субъекта относительно того, что композицию можно хранить при втором, более высоком значении температуры, например, без охлаждения или при комнатной температуре, например, в промежутке между 18 и 25°С в течение второго периода, где длительность упомянутого выше второго периода не превышает 24, 48, 7 2 или 96 ч, таким образом, инструктирование субъекта.

Согласно другому аспекту, изобретение обеспечивает способ хранения, распространения или применения композиции с УЪЛ-4-связывающим антителом, например, композиции, содержащей натализумаб, описанного в настоящей заявке. Способ включает хранение композиции при первом, низком значении температуры, например, ниже 18°С, например, от приблизительно температуры замерзания до значений, приблизительно равных или ниже 15, 10 или 4°С; и хранение композиции при втором, более высоком значении температуры, например, без охлаждения или при комнатной температуре, например, в промежутке между 18 и 25°С в течение более чем 24, 48, 72 или 96 ч.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ оценки, такой как способ оценки качества водной композиции с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела при контроле качества или в спецификационном анализе высвобождения. Способ включает оценку композиции, содержащей антитело по параметру раствора, такому как цвет (например, обесцвечивание до бледно-желтого или обесцвечивание до желтого), прозрачность (например, прозрачность до слабо опалесцирующего или прозрачность до опалесцирующего), или вязкость (например, в промежутке между приблизительно 5 и 30 сР, измеренная при температуре окружающей среды, равной 20-30°С, например, 25°С). Оценка может включать определение одного или более указанных выше параметров. Способ также может включать определение, отвечает ли параметр раствора заданному критерию, например, представлен ли заданный критерий, или он представлен в заданной степени. Если наблюдаемый параметр раствора находится в рамках заданных значений или отвечает заданному критерию стандарта, препарат отбирают, к примеру, для упаковки, применения, продажи, запуска в торговый оборот, выбраковки и т.д.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ соответствия нормативным требованиям, например, постмаркетинговым требованиям агентства по регулированию, например, ΡΌΆ. Способ включает оценку композиции, содержащей антитело по параметру раствора, такому как цвет (например, обесцвечивание до бледно-желтого или обесцвечивание до желтого), прозрачность (например, прозрачность до слабо опалесцирующего или прозрачность до опалесцирующего), или вязкость (например, в промежутке между приблизительно 5 и 30 сР, измеренная при температуре окружающей среды, равной 2030°С, например, 25°С). Постмаркетинговые требования могут включать измерение одного или более из перечисленных выше параметров. Способ также может включать определение того, отвечает ли параметр раствора заданному критерию, или находится ли параметр в рамках заданных значений; возможно, документальную фиксацию значения или результата анализа, или связь с агентством, например, передача значения или результата агентству по регулированию.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ получения образца композиции на вод- 7 020456 ной основе с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела, обладающего заданным свойством, например, отвечающей заданной спецификации, например, требованиям к маркировке, или нормативным требованиям, например, свойством, описанным в настоящей заявке. Способ включает приготовление препарата антитела; анализ препарата антитела в соответствии со способом, описанным в настоящей заявке; определение, отвечает ли тестовый препарат антитела предварительно установленному критерию, например, предварительно установленному соотношению с контрольным значением, например, одним или более контрольным значением, описанным в настоящей заявке, и выбор тестового препарата антитела для создания образца продукта.

Согласно другому аспекту изобретения предложены рассеянные образцы композиции на водной основе с высокой концентрацией УЬЛ-связывающего антитела, в которых один или более параметров раствора (например, значение параметра раствора, определенное способом, описанным в настоящей заявке) варьируется менее чем в заданных рамках разброса значений от предварительно выбранного желательного контрольного значения критерия, например, разброс значений критерия, описанный в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации один или более параметров одного или более образца препарата антитела являются определенными, и образец или образцы выбирают в соответствии с этим. Некоторые варианты реализации включают сравнение результатов определения с предварительно установленным значением критерия, например, со стандартным образцом. Другие варианты реализации включают корректировку дозы образца для введения, основываясь на результатах определения значения параметра.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ, обеспечивающий одно или более из перечисленного ниже: предоставление отчета субъекту-получателю отчета, оценка образца композиции на водной основе с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела на предмет соответствия стандартному образцу, например, в соответствии с требованиями ΡΌΆ, поиск данных другой группы о том, что препарат УЪЛ-4-связывающего антитела отвечает каким-либо предварительно установленным требованиям, или предоставление другой группе информации о препарате УЬЛ-4-связывающего антитела. Примеры субъектов-получателей или других групп включают правительство, например, Федеральное Правительство США, например, правительственное агентство, например, ΡΌΑ. Способ включает один или более (или все) приведенные ниже шаги для создания и/или тестирования водной лекарственной формы высококонцентрированного УЬА-4-связывающего антитела в первой стране, например, в США; отправление, по меньшей мере, аликвоты образца за пределы первой страны, например, отправление за пределы США, в другую страну; подготовка или получение отчета, содержащего данные о структуре препарата УЬА-4-связывающего антитела, например, данные, касающиеся описанной в настоящей заявке цепи, например, данные, полученные одним или более способами, описанными в настоящей заявке; и предоставление препарата УЬА-4-связывающего антитела описанного выше отчета субъекту-получателю отчета.

В одном варианте реализации субъект-получатель отчета может определять, соответствуют ли данные предварительно установленным требованиям или стандартным образцам, и, возможно, субъектполучатель отчета передает ответ по композиции с УЬА-4-связывающим антителом, например, производителю, распространителю, или продавцу. В одном варианте реализации, исходя из подтверждающей справки от субъекта-получателя отчета, препарат УЬА-4-связывающего антитела отбирают, упаковывают или запускают в торговый оборот.

Согласно другому аспекту предложен способ оценки композиции на водной основе, содержащей УЬА-4-связывающее антитело. Способ включает получение данных с учетом присутствия или уровня УЬА-4-связывающего антитела, например, данных, полученных при применении одного или нескольких способов, описанных в настоящей заявке; предоставление отчетных материалов, содержащих упомянутые выше данные, и, возможно, содержит определитель для образца УЬА-4-связывающего антитела; передачу на рассмотрение упомянутых выше отчетных материалов органу принятия решения, например, правительственному агентству, например, РОА; возможно, получение обратной связи от упомянутого выше органа принятия решения, возможно, решения выпускать или продавать образец УЬА-4связывающего антитела, основываясь на информации от органа принятия решений. В одном варианте реализации способ дополнительно включает выпуск образца.

Примеры композиций включают следующие:

1) натализумаб в количестве 125-175 мг/мл или 140-160 мг/мл, например, 150 мг/мл; натрий-фосфатный буфер в количестве 1-100 мМ, 5-20 мМ или 5-50 мМ, например, 10 мМ; хлорид натрия в количестве 50-200 мМ, 100-180 мМ или 120-160 мМ, например, 14 0 мМ; полисорбат-80 в количестве 0,01-0,12%, 0,02-0,08% или 0,02-0,06%, например, 0,04% (в/о), и рН 6,0±1,0, например, 6,0±0,5;

2) натализумаб в количестве 125-175 мг/мл или 140-160 мг/мл, например, 150 мг/мл;

мМ натрий-фосфатного буфера;

140 мМ хлорида натрия;

0,04% (в/о) полисорбата-80 и

- 8 020456 рН 6,0±0,5;

3) 150 мг/мл натализумаба;

натрий-фосфатный буфер в количестве 1-100 мМ, 5-20 мМ или 5-50, например, 10 мМ;

140 мМ хлорида натрия;

0,04% (в/о) полисорбата-80 и рН 6,0±0,5;

4) 150 мг/мл натализумаба;

мМ натрий-фосфатного буфера;

хлорид натрия в количестве 50-200 мМ, 100-180 мМ или 120-160 мМ, например, 140 мМ;

0,04% (в/о) полисорбата-80 и рН 6,0±0,5;

5) 150 мг/мл натализумаба;

мМ натрий-фосфатного буфера;

140 мМ хлорида натрия;

полисорбат-80 в количестве 0,01-0,12%, 0,02-0,08% или 0,02-0,06%, например, 0,04% (в/о) и рН 6,0±0,5;

6) 150 мг/мл натализумаба;

мМ натрий-фосфатного буфера;

140 мМ хлорида натрия;

0,04% (в/о) полисорбата-80 и рН 6,0±1,0, например, рН 6,0±0,5; и

7) 150 мг/мл натализумаба;

мМ натрий-фосфатного буфера;

0 мМ хлорида натрия;

0,04% (в/о) полисобрата 80 и рН 6,0±0,5.

В некоторых вариантах реализации любые из приведенных выше композиций 1-7 могут фактически не содержать аминокислот, например, аргинина или глицина, или глицерола.

Способы и композиции, описанные в настоящей заявке, можно применять в случаях, когда присутствие, распространение или количество одной или более структур может обладать биологической активностью или нарушать ее. Способы также пригодны в прогнозировании биологической активности структур для оценки или уточнения биологической эквивалентности.

Термин композиция с высокой концентрацией УЪА-4-связывающего антитела в настоящей заявке относится к стабильной композиции на водной основе, содержащей от приблизительно 120 до приблизительно 190 мг/мл (например, приблизительно 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 мг/мл) УЪА-4связывающего антитела, такого как натализумаб.

Подходит для ПК или ВМ введения означает, что введение композиции пациенту, например, человеку, будет иметь терапевтический эффект, такой как облегчение одного или более симптомов пациента.

Термин лечение относится к проведению терапии в количестве, виде и/или форме, эффективной для облегчения состояния, симптома или параметра, связанного с заболеванием, или для предотвращения прогрессирования заболевания как в статистически значимой степени, так и в степени, выявляемой специалистом в данной области. Эффективное количество, вид или форма могут варьироваться в зависимости от пациента и могут быть ориентированы на конкретного пациента.

Стабильная композиция, содержащая УЪА-4-связывающее антитело, обнаруживает минимальные, или не обнаруживает признаков агрегации, распада, дезаминирования, окисления или изменения биологической активности в течение длительного периода времени, например, 12, 24, 36 мес. или дольше. К примеру, в одном варианте реализации менее 10% композиции агрегирует, распадается или окисляется. Агрегацию, выпадение в осадок и/или денатурацию можно оценить при помощи известных методов, таких как визуальная оценка цвета и/или прозрачности, или анализ рассеивания УФ, или гельхроматография. Способность белка сохранять биологическую активность можно оценить путем измерения и определения количества химически модифицированных форм антитела. Изменения размера (например, отрезание фрагментов), которое можно оценить при помощи гель-хроматографии δΌδ-РАСЕ и/или времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (МАЬИ1/ТОР М8), или методом пептидного картирования обработанного эндопротеиназой антитела, к примеру. Другие типы химических модификаций включают изменение заряда (например, в результате дезаминирования), которое можно измерить при помощи ионообменной хроматографии, например. Антитело сохраняет биологическую активность в фармацевтической композиции, если биологическая активность антитела в заданный момент времени сохраняется в пределах 10% от биологической активности, наблюдавшейся в момент приготовления фармацевтической композиции, которую определяли в

- 9 020456 анализе связывания антигена, например.

УЪА-4-связывающее антитело относится к антителу, прикрепляющемуся к УЪА-4 интегрину, например, к субъединице α4 УЪА-4 интегрина и, по меньшей мере, частично ингибирующему его УЪА-4 активность, особенно связывающую активность УЪА-4 интегрина или сигнальную активность, например, способность преобразовывать сигнал, опосредованный УЪА-4. К примеру, УЪА-4-вязывающее антитело может ингибировать присоединение УЪА-4 к его лиганду, например, к белку клеточной поверхности УСАМ-1 или к компонентам внеклеточного матрикса, таким как фибронектин или остеопонтин. УЪА-4-связывающее антитело может присоединяться как к субъединице α4, так и к субъединице β1, или к ним обеим. В одном варианте реализации антитело прикрепляется к В1 α4. УЪА-4-связывающее антитело может связываться с УЪА-4 с К_б менее чем приблизительно 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 или 10^-10 М. УЪА-4 также известен как α4/β1 и СО29/СЭ49Ь.

Термин антитело в тексте настоящей заявки относится к белку, содержащему в своей композиции по меньшей мере один иммуноглобулиновый вариабельный домен, например, аминокислотную последовательность, представляющую собой иммуноглобулиновый вариабельный домен или последовательность иммуноглобулинового вариабельного домена. К примеру, антитело может содержать вариабельный домен тяжелой (Н) цепи (в настоящей заявке используется сокращение УН) и вариабельный домен легкой (Ъ) цепи (в настоящей заявке используется сокращение УЪ). В другом примере антитело содержит два вариабельных домена тяжелой (Н) цепи и два вариабельных домена легкой (Ъ) цепи. Значение термина антитело охватывает антиген-связывающие фрагменты антител (например, одноцепочечные антитела, РаЬ фрагменты, Р(аЬ')₂ фрагменты, Рб фрагменты, Ρν фрагменты, бЛЬ фрагменты), также, как и целые антитела, например, интактные иммуноглобулины типов 1дА, 1дС. 1дЕ, Ι§Ό, 1дМ (а также их подтипы). Легкие цепи иммуноглобулина могут быть типов каппа или лямбда. В одном варианте реализации антитело гликозилировано. Антитело может быть эффективно в антиген-зависимой клеточной цитотоксичности и/или комплемент-опосредованной цитотоксичности, или может не обладать одной или обеими этими активностями.

УН и УЪ фрагменты дополнительно можно подразделить на гипервариабельные области, называемые комплементарно определяемыми областями (СИК), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (РК). Длина РК8 и ΟΩΡδ была точно определена (см. КаЬа1, Е.А., е1 а1. (1991) Зсцисиссх оГ РгоЮиъ оГ 1тМипо1од1са1 1йеге81, ΡίΓιΗ Ебйюп, И.8. ОсраПтсШ оГ НеаНЬ апб Нитап §еМсе8, ΝΙΗ РиЬйсайоп Ыо. 91-3242; и СЬоШа, С. е1 а1. (1987) I. Мо1. Вю1. 196:901917). Определения КаЬа1 используются в тексте настоящей заявки. Каждый из УН и УЪ обычно состоит из трех ΡΌΡδ и четырех РК8, расположенных от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: РК1, СИК1, РК2, СИК2, РК3, СИК3, РК4.

Иммуноглобулиновый домен относится к домену вариабельного или константного домена молекулы иммуноглобулина. Иммуноглобулиновые домены обычно содержат два складчатых β-слоя, сформированных приблизительно семью β-цепями, и консервативную дисульфидную связь (см., например, А.Р. ХУППапъ апб Α.Ν. Вагс1ау 1988 Апп. Ве\' 1тМипо1. 6:381-405).

В настоящей заявке последовательность иммуноглобулинового вариабельного домена относится к аминокислотной последовательности, которая может формировать структуру иммуноглобулинового вариабельного домена. К примеру, последовательность может содержать всю или часть аминокислотной последовательности природного вариабельного домена. Например, в последовательности может отсутствовать одна, две или более Ν- или С-терминальные аминокислоты, внутренние аминокислоты, она может включать одну или более вставок или дополнительные терминальные аминокислоты, или другие изменения. В одном варианте реализации полипептид, содержащий последовательность иммуноглобулинового вариабельного домена, может связываться с другой последовательностью иммуноглобулинового вариабельного домена с образованием структуры, прикрепляющейся к мишени (или антиген-связывающего сайта), например, структуры, взаимодействующей с УЪА-4.

УН или УЪ цепь дополнительно может включать целиком или часть константной области тяжелой, или легкой цепи, чтобы, таким образом, сформировать тяжелую или легкую иммуноглобулиновую цепь, соответственно. В одном варианте реализации антитело представляет собой тетрамер, составленный двумя тяжелыми иммуноглобулиновыми цепями и двумя легкими иммуноглобулиновыми цепями. Тяжелые и легкие иммуноглобулиновые цепи могут быть связаны дисульфидными связями. Константная область тяжелой цепи обычно содержит три константных домена, СН1, СН2 и СН3. Константная область легкой цепи обычно содержит СЬ домен. Вариабельная область тяжелых и легких цепей содержит домен связывания, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител обычно служат медиаторами прикрепления антитела к тканям или факторам хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1с|) классического пути комплемента.

Один или более фрагментов антитела могут быть фрагментами антитела человека, по существу фрагментами антитела человека, или гуманизированными фрагментами антитела. Например, один или более вариабельных фрагментов могут быть фрагментами антитела человека, фрагментами антитела человека по существу. Например, один или более из СИК8, например, НС СИК1, НС СИК2, НС СИК3, ЬС

- 10 020456

СЭР1. ЬС СЭК2 и ЬС СЭК3 могут быть фрагментами антитела человека (НС, тяжелая цепь; ЬС, легкая цепь). Любая из легких цепей СЭК.8 может быть СОК человека. НС С.НР3 может быть НС СЭК3 человека. Одна или более каркасных областей могут быть каркасной областью человека, например РК1, РК2, РК3 и РК4 НС или ЬС. В одном варианте реализации все каркасные области являются каркасными областями человека, например, полученными из гематопоэтической клетки, например, гематопоэтической клетки, продуцирующей иммуноглобулины, или негематопоэтической клетки. В одном варианте реализации последовательности человека являются терминальными последовательностями, например, кодируемыми терминальной нуклеиновой кислотой. Одна или более константных областей могут быть константной областью человека, константной областью человека по существу или гуманизированной константной областью. В другом варианте реализации по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95 или 98% каркасных областей (например, РК1, РК2 и РК3, в совокупности, или РК1, РК2, РК3 и РК4, в совокупности) или антитело целиком могут быть каркасными областями или антителом человека, каркасными областями или антителом человека по существу, или гуманизированными каркасными областями, или антителом. Например, РК1, РК2 и РК3 в совокупности могут по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 или 99% соответствовать последовательности человека, кодируемой терминальным сегментом человека.

Вариабельная область иммуноглобулина человека по существу представляет собой вариабельную область иммуноглобулина, модифицированную таким образом, что форма, прошедшая модификацию, стимулирует более слабый иммунный ответ в организме человека, чем немодифицированная форма, например, в ходе модификации включают достаточное количество положений аминокислот каркасной области, чтобы вариабельная область иммуноглобулина не стимулировала иммунный ответ в нормально функционирующем организме человека. Описания гуманизированных иммуноглобулинов включают, например, патентах США № 6407213 и 5693762. В некоторых случаях гуманизированные иммуноглобулины могут содержать аминокислоту, не встречающуюся в организме человека в одном или более положении каркасной области.

Антитело целиком или его часть могут кодироваться геном иммуноглобулина или его сегментом. Примеры генов иммуноглобулина включают гены каппа, лямбда, альфа (1дА1 и 1дА2), гамма (1§О1, 1дО2, 1дО3, 1§О4), дельта, эпсилон и мю константной области, а также мириады генов вариабельной области иммуноглобулина. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина (около 25 кДа или 214 аминокислот) кодируются геном вариабельной области на МН2-конце (около 110 аминокислот) и геном каппа или лямбда константной области на СООН-конце. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина (около 50 кДа или 446 аминокислот) также кодируются геном вариабельной области (около 116 аминокислот) и одним из упомянутых выше генов константной области, например, гамма (кодирующим около 330 аминокислот).

Термин антиген-связывающая область полноразмерного антитела относится к одному или более фрагменту полноразмерного антитела, сохраняющему способность специфически связывать интересующую мишень, например, УЪА-4. Примеры связывающих областей, подпадающих под определение антиген-связывающая область полноразмерного антитела, включают (ί) РаЬ фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из УЬ, УН, СЬ и СН1 доменов; (ίί) Р(аЬ')₂ фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два РаЬ фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) РД фрагмент, состоящий из УН и СН1 доменов; (ίν) Ρν фрагмент, состоящий из УЪ и УН одной руки антитела, (ν) ДАЬ фрагмент (АатД с1 а1., (1989) №йиге 341:544-546), состоящий из УН домена; и (νΐ) и обособленная комплементарно определяемая область (СОК), сохраняющая функциональность. Более того, хотя два домена Ρν фрагмента, УЬ и УН, кодируются отдельными генами, их можно объединить при использовании методов рекомбинации с помощью синтетического линкера, позволяющего объединить их в одну белковую цепь, в которой УЬ и УН области парно соединены с образованием моновалентной молекулы, известной как одна Ρν (δεΡν) т(см., например, ВйД е1 а1. (1988) 8с1еисе 242:423-426; и Ни51ои е1 а1. (1988) Ргос. ЫаД. АсаД. 8с1. И8А 85:5879-5883).

В настоящей заявке приблизительно означает от 0,1 до 5% от упоминаемого значения (например, в пределах 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,1% выше или ниже данного значения).

Варианты реализации изобретения обеспечивают определенное количество преимуществ. В некоторых случаях тяжело добиться высокой концентрации белка, например, антитела, в лекарственной форме для применения в фармацевтических композициях. В настоящей заявке представлены способы приготовления таких композиций. Фармацевтические композиции, содержащие высокие концентрации белка, например, анти-УЪА-4 антитела, могут быть пригодны для применения в течение более короткого периода времени. Высококонцентрированную композицию, например, с анти-УЪА-4 антителом, также можно вводить более простыми способами (например, подкожно).

Подробности одного или более вариантов реализации изложены в прилагающихся чертежах и их описании, следующем ниже. Другие черты, объекты и преимущества изобретения будут понятны из описания и чертежей, а также из формулы изобретения.

- 11 020456

Описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует уровни растворимых агрегатов до и после перемешивания натализумаба в концентрации 150 мг/мл в разных композициях. НСЫ=20 мМ гистидина, 240 мМ глицина, 0,04% (в/о) полисорбата-80, рН 6. НОЬ=20 мМ гистидина, 240 мМ глицерола, 0,04% (в/о) полисорбата-80, рН 6. РСЫ=20 мМ фосфата, 240 мМ глицина, 0,02% (в/о) полисорбата-80, рН 6. Р8Т=20 мМ фосфата, 140 мМ ЫаС1, 0,02% (в/о) полисорбата-80, рН 6.

Фиг. 2 демонстрирует поглощение УФ раствором при 340 нм до и после перемешивания натализумаба в концентрации 150 мг/мл в композициях, описанных в пояснении к фиг. 1

Фиг. 3 демонстрирует отношение между агрегацией и разными уровнями полисорбата-80 для натализумаба (150 мг/мл) в композиции НОЬ (НОЬ=20 мМ гистидина, 240 мМ глицерола, рН 6; значение полисорбата-80 в эксперименте).

Фиг. 4 демонстрирует процент агрегации в зависимости от времени для натализумаба (150 мг/мл), хранившегося при 40°С в различных композициях, описанных в пояснении к фиг. 1.

Фиг. 5 демонстрирует процент агрегации в зависимости от времени для натализумаба (150 мг/мл), хранившегося во флаконах при 2-8°С в различных композициях, описанных в пояснении к фиг. 1.

Фиг. 6 демонстрирует процент окисления метионина в зависимости от времени для натализумаба (150 мг/мл), хранившегося при 2-8°С или при 40°С в различных композициях, описанных в пояснении к фиг. 1.

Фиг. 7 демонстрирует процент окисления метионина как функцию вспомогательного веществаакцептора свободных радикалов для натализумаба (150 мг/мл) в течение 6 мес.

Фиг. 8 демонстрирует уровни фрагментации для натализумаба в различных концентрациях и различных композициях в зависимости от времени (8 нед.).

Подробное описание изобретения

Стабильные композиции с высокой концентрацией УЬЛ-4-связывающего антитела пригодны для подкожного (ПК), внутримышечного (ВМ) или внутривенного (ВВ) введения. Композиции, описанные в изобретении, содержат от приблизительно 120 до приблизительно 190 мг/мл УЬЛ-4-связывающего антитела, такого как натализумаб.

Фармацевтические композиции

Описанные в настоящей заявке композиции представлены в виде фармацевтических композиций. УЬЛ-4-связывающее антитело (например, натализумаб) может находиться, например, в форме буферного раствора, в концентрации приблизительно от 120 до 190 мг/мл (например, от приблизительно 120 до приблизительно 180 мг/мл, от приблизительно 140 до приблизительно 160 мг/мл, от приблизительно 135 до приблизительно 165 мг/мл; например, приблизительно 120, 130, 135, 140, 150, 160, 165, 170, 180, 190 мг/мл). В одном варианте реализации УЬЛ-4-связывающее антитело (например, натализумаб) находится в буферном растворе в концентрации выше 150 мг/мл и ниже чем приблизительно 190 мг/мл. В другом варианте реализации композицию готовят в более высокой концентрации (например, от 170 до 190 мг/мл) и затем разводят до желаемой концентрации (например, от 135 до 165 мг/мл), например, композицию можно приготовить с концентрацией антитела, например, 175, 180 или 185 мг/мл, и затем развести до концентрации, являющейся желательной для введения, например, 140, 145, 150, 155 или 160 мг/мл. Композицию можно хранить при 2-8°С (например, 4-7°С).

В одном варианте реализации УЬЛ-4-связывающее антитело можно смешать с эксципиентами, такими как 160 мМ Ь-аргинина гидрохлорид (±10%), фосфатный буфер (например, фосфат гептогидрат двухосновного натрия и фосфат одноосновного натрия) и полисорбат-80, где общее содержание натрия не превышает 60 мМ. В другом варианте реализации УЬЛ-4-связывающее антитело можно смешать с 275 мМ глицерола (±10%), фосфатным буфером (например, фосфат гептогидрат двухосновного натрия и фосфат одноосновного натрия или другие фосфаты) и полисорбатом-80, хлорид натрия, по существу, отсутствует. В другом варианте реализации УЬЛ-4-связывающее антитело можно смешать с 140 мМ хлорида натрия (±10%), фосфатным буфером и полисорбатом-80. Примеры композиций, содержащих фосфатные буферы, приведены ниже, например, в примерах 8-12.

В одном варианте реализации УЬЛ-4-связывающее антитело можно смешать со вспомогательными веществами, такими как 240 мМ глицерола (±10%), гистидиновый буфер, полисорбат-80 и, возможно, Ьметионин. Примеры композиций, содержащих гистидиновые буферы, приведены ниже, например, в примерах 13 и 14.

Фосфатные буферы известны в данной области и включают, например, водные растворы фосфата натрия двухосновного (безводного), гептагидрата фосфата натрия двухосновного, дигидрата фосфата натрия двухосновного, безводного фосфата натрия одноосновного, моногидрата фосфата натрия одноосновного, дигидрата фосфата натрия одноосновного, безводного фосфата натрия трехосновного или додекагидрата фосфата натрия трехосновного, доведенные до нужного рН. Фосфатные буферы также включают, например, фосфат калия одноосновного, безводный фосфат калия двухосновного или фосфат калия трехосновного, доведенные до нужного рН.

Гистидиновые буферы известны в данной области и включают, например, водные растворы Ό- 12 020456 гистидина, Ό-гистидина монохлорид моногидрата, ΌΌ-гистидина, ΌΌ-гистидина монохлорид моногидрата, Ь-гистидина или Ь-гистидина монохлорид моногидрата, доведенные до нужного рН соляной кислотой или гидроксидом натрия, или другой кислотой или основанием, известными в данной области.

Обычно фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. Выражение фармацевтически приемлемый носитель, используемое в настоящем тексте, включает любой и все растворители, среды для разведения, оболочки, противобактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, задерживающие всасывание, и им подобные физиологически совместимые агенты.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, сохраняющей желаемую биологическую активность антитела, и не придает нежелательного токсического действия (см., например, Вегде, δ.Μ., с1 а1. (1977) 1. РЬатт. δοί. 66:1-19). Примеры таких солей включают добавочные кислотные соли и добавочные основные соли. Добавочные кислотные соли включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, иодисто-водородная и им подобных, а также полученные из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические монои дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алкановые кислоты, гидрокси-алкановые кислоты, ароматические кислоты, ароматические и алифатические сульфоновые кислоты, свободные аминокислоты и им подобные. Основные добавочные соли включают соли, полученные из щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и им подобные, а также из нетоксичных органических аминов, таких как Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и им подобные.

Обычно физиологически совместимые агенты, такие как свободные аминокислоты, хлористоводородные соли, натриевые соли или калиевые соли свободных аминокислот, используют в качестве вспомогательных веществ в фармацевтических композициях для повышения стабильности антитела. Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать в качестве добавок глицерол, маннитол, сорбитол и другие полиолы, а также сахара (например, сахароза) для повышения стабильности.

Композиции, описанные в настоящей заявке, могут содержать вспомогательные вещества, такие как поверхностно-активные вещества, например, полисорбат-80, глицерин моностеарат, полиоксил стеарат, лауромакрогол или сорбитан олеат. В другом варианте реализации композиции, описанные в настоящей заявке, содержат от приблизительно 0,01 (в/о) до приблизительно 0,1% (в/о) полисорбата-80, например, приблизительно 0,2 или 0,04% полисорбата-80.

Фармацевтические композиции содержат высокие концентрации УЬА-4-связывающего антитела в форме жидкого раствора (например, растворы для впрыскивания и вливания). Такие композиции можно вводить в парентеральной форме (например, подкожной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекцией). Фразы парентеральное введение или вводят парентерально, используемые в настоящей заявке, означают форму введения, отличную от энтерального и местного введения, обычно - инъекцией, и включают подкожное или внутримышечное введение, а также внутривенной, внутрисуставной, внутриглазничной, внутрисердечной, внутрикожной, внутрибрюшинной, чрестрахеальной, покутикулярной, подкапсулярной, подарахноидальной, внутриспинальной, эпидуральной, интрастенальной инъекцией или вливанием. В одном варианте реализации композиции, описанные в настоящем изобретении, вводят подкожно.

Фармацевтические композиции стерильны и стабильны в условиях производства и хранения. Фармацевтические композиции также можно протестировать, чтобы удостовериться, что они отвечают нормативным и промышленным стандартам введения.

Фармацевтическую композицию, содержащую высокую концентрацию УЬА-4-связывающего антитела, можно оформить в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации антитела. Стерильные растворы для введения можно приготовить путем помещения агента, описанного в настоящей заявке, в требуемое количество соответствующего растворителя с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, в зависимости от требуемого эффекта, за которым следует стерилизация фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем помещения агента, описанного в настоящей заявке, в стерильную среду, содержащую основную среду дисперсии, и добавления других требуемых ингредиентов из перечисленных выше. Правильную текучесть раствора можно измерить, например, используя такую оболочку, как лецитин, путем оценки требуемого размера частиц в случае дисперсии, с использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированного всасывания вводимых композиций можно достичь путем включения в композицию агента, задерживающего абсорбцию, например, солей - моностеаратов и желатина.

В некоторых вариантах реализации охарактеризованы параметры, описывающие композиции, например, параметры, отражаемые на этикетке продукта. Такие параметры включают, например, цвет (обычно обесцвечивание до бледно-желтого или обесцвечивание до желтого), прозрачность (обычно прозрачность до легкой опалесценции или прозрачность до опалесценции) и вязкость (обычно в промежутке от 5 до 30 сР, измеренная при температуре окружающей среды от 20 до 30°С). Такие параметры можно измерить при помощи методов, известных в данной области. К примеру, прозрачность можно

- 13 020456 измерить при использовании коммерчески доступных стандартов опалесценции (доступных в, например, НиШегЬаЬ ΛδδοοίαΙοδ. 1пс. (РезЮп, УА)).

В некоторых вариантах реализации исследуют стабильность композиции, содержащей антитело. Примеры способов включают, например, исследование агрегации, исследование окисления, фрагментации, исследование сиалирования, исследование изоэлектрических точек, исследование половинных антител, исследование тяжелых и легких цепей и анализ вторичной структуры (например, круговым дихроизмом), термальной денатурации (например, циркулярным дихроизмом или дифференциальной сканирующей калориметрией), триптофанового окружения (например, методом флуоресценции), укладки 1§О (например, методом кругового дихроизма в дальней УФ-области) и окружения ароматических остатков (например, спектрофотометрией УФ-У15).

Способы создания композиций, содержащих антитело

Лекарственные формы, содержащие композиции, содержащие УЪА-4-связывающее антитело, можно производить способом, описанным в опубликованной заявке США № 2005/0053598, изменив его таким образом, чтобы приспособить к высоким концентрациям антитела (например, концентрациям, равным от приблизительно 75 до приблизительно 190 мг/мл, от 100 до приблизительно 180 мг/мл, от приблизительно 120 до приблизительно 170 мг/мл, от 135 до приблизительно 165 мг/мл). Процесс можно модифицировать, как известно специалисту в данной области, но, в общем, методика следующая. Из функционирующего банка клеток получают ампулу, содержащую клетки, продуцирующие интересующее антитело или белок. Готовят инокулят. Культивируют или ферментируют клеточный инокулят, с дополнительной подпиткой, если это необходимо. Собирают/очищают клетки центрифугированием и/или фильтрацией. Это можно сделать, к примеру, концентрированием в 10 раз, при использовании, например, спирального фильтра. После промежуточной фильтрации, например, через 0,2-мкм фильтр проводят, например, аффинную хроматографию, например, с белком А 8ерЬаго5е Раз! ΡΙοΥ® и обратную элюцию. Затем на композицию, содержащую антитело, воздействуют низким рН, таким как 3,6-3,7. Затем смесь подвергают вирусной фильтрации, после которой проводят стадию концентрации/диафильтрации. Далее композицию очищают при помощи, например, анионно-обменной хроматографии, например, с помощью ПЕАР 8ерНаго5е Раз! Р1оА Эту стадию можно проводить многократно. С этого момента композицию далее концентрируют и затем очищают, например, при помощи гельфильтрационной хроматографии, такой как система 8ерЬасгу1 8300НК®. При желании композицию, содержащую антитело, можно концентрировать далее. Конечную композицию получают добавлением буфера и полисорбата и еще одной стадией концентрирования в процессе ультрафильтрации. Итоговую композицию можно протестировать на контроль качества и выпустить с гарантией качества (ОА). Композицию, содержащую антитело, можно получить в соответствии с любым из способов, приведенных ниже в табл. 1. Например, композицию, содержащую УЪА-4-связывающее антитело, такое как натализумаб, можно произвести следующим способом. Крупный образец клеточной культуры объемом от 5000 до 20000 л (например, 5000; 10000; 15000; 20000 л) инокулируют, культивируют, подпитывают, собирают и осветляют методами, известными в данной области. Осветленный материал очищают, например, методом хроматографии, вирусной инактивации и вирусной фильтрации.

Результатом ультрафильтрации/диафильтрации (ИР/ЭР) разъясненного материала является интермедиат фосфатного процесса. Интермедиат фосфатного процесса можно хранить при 2-8°С, например, для дальнейшей переработки, такой как методы дальнейшей концентрации белка. Для получения конечной композиции к интермедиату фосфатного процесса добавляют полисорбат и буфер (как описано в настоящей заявке) для достижения конечной желаемой концентрации антитела. В одном из альтернативных вариантов конечную композицию создают путем обратного разбавления интермедиата фосфатного процесса до конечной желаемой концентрации, например, до низкой концентрации в 20 мг/мл. Полисорбат обычно добавляют в ходе конечной стадии разбавления.

В одном варианте реализации композицию, содержащую УЬА-4-связывающее антитело, приготовляют в гистидиновой форме, как описано выше, за исключением того, что над интермедиатом фосфатного процесса проводят, по меньшей мере, вторую стадию ИР/ЭР и по крайней мере одну дополнительную стадию УФ, в форме гистидинового буфера, как описано в настоящей заявке, до конечной желаемой концентрации, такой как от приблизительно 75 до 190 мг/мл, например, от приблизительно 75 до приблизительно 190 мг/мл, например, 75, 100, 125, 135, 150, 165, 180, 190 мг/мл. В одном альтернативном варианте композицию, содержащую антитело в гистидиновом буфере, доводят до конечной концентрации, являющейся выше желаемой концентрации. Затем получают конечную композицию путем обратного разбавления до желаемой концентрации в форме гистидинового буфера. Полисорбат обычно добавляют в ходе конечной стадии разбавления.

В другом варианте реализации композицию, содержащую антитело, получают в фосфатной форме, как описано выше, за исключением того, что над интермедиатом фосфатного процесса проводят, по меньшей мере, вторую стадию ИР/ЭР и по крайней мере одну дополнительную стадию УФ в форме фосфатного буфера, как описано в настоящей заявке, до конечной желаемой концентрации, такой как от приблизительно 75 и 190 мг/мл, например, от приблизительно 75 до приблизительно 190 мг/мл, напри- 14 020456 мер, 75, 100, 125, 135, 150, 165, 180, 190 мг/мл. В одном альтернативном варианте композицию, содержащую антитело в фосфатном буфере, доводят до конечной концентрации, являющейся выше желаемой концентрации. Затем получают конечную композицию путем обратного разбавления до желаемой концентрации в форме фосфатного буфера. Полисорбат обычно добавляют в ходе конечной стадии разбавления.

Таблица 1. Способы создания лекарственных форм антител

Процесс приготовления для ВВ введения	Высокойонцентрированный клинический процесс (гистидиновая форма)	Высококонцентри- рованный клинический процесс (фосфатная Форма)	Высококонцентрированный промышленный фосфатный процесс
15,000 л клеточной культуры	15,000 л клеточной культуры	15,000 л клеточной культуры	15,000 л клеточной культуры
4	4	4
Сбор и разъяснение	Сбор и разъяснение	Сбор и разъяснение	Сбор и разъяснение
4	4	4
Очистка (хроматография, вирусная инактивация и вирусная фильтрация)	Очистка (хроматография, вирусная инактивация и вирусная фильтрация)	Очистка (хроматография, вирусная инактивация и вирусная фильтрация)	Очистка (хроматография, вирусная инактивация и вирусная фильтрация) )
4	г	4	4
иг/пг с получением интермедиата фосфатного процесса	иг/ϋΕ № ί с получением интермедиата фосфатного процесса. Если нужно, хранение при 2-8°С.	иг/ог № ί с получением интермедиата фосфатного процесса. Если нужно, хранение при 2-8°С.	Промышленный процесс ΠΡ/ϋΕ для фосфатной формы в концентрации 150 мг/мл
Ν/Α	иг/вг № 2 и иг/вг № 3 в Форме гистидинового буфера в концентрации 150 мг/мл	иг/ϋΕ № 2 и иг/ог № з в форме фосфатного буфера в концентрации 150 мг/мл	Ν/Α

Конечное	Конечное	Конечное	Конечное
оформление	оформление	Оформление	Оформление
(добавление	(добавление	(добавление	(добавление
полисорбата)	полисорбата) и	полисорбата} и	полисорбата) и
и расфасовка	расфасовка	расфасовка	расфасовка
лекарствен-	лекарственного	лекарственного	лекарственного
ного вещества	вещества	вещества	вещества

Процессы ИР/ΌΡ в табл. 1 (например, ИР/ΌΡ № 1 и ИР/ΌΡ № 2) обычно представляют собой процессы с тангенциальным потоком, использующие, например, кассеты гладких или спиральных фильтров ультрафильтрации (с размером пор, например, 10 или 30 кО) для концентрации и диафильтрации антитела. Такие процессы подходят для концентрирования продукта до значений от 0 до 100 г/л, например, 30, 50, 80 г/л. Процессы ультрафильтрации в табл. 1 (например, УФ № 3) обычно используют открытые кассеты гладких фильтров, которые подходят для концентрирования продукта до значений, например, от 0 до 300 г/л или выше, например, до 150, 200, 210, 220, 230 или 240 г/л.

В промышленном процессе ИР/ΌΡ обычно используют первую операцию ИР/ΌΡ для диафильтрации продукта в буфер и концентрирования продукта до значений от приблизительно 5 до 40 г/л (например, до приблизительно 10 г/л, до приблизительно 20 г/л, до приблизительно 30 г/л). Второе проведение ИР обычно осуществляют для концентрирования продукта до значений от приблизительно 135 до приблизительно 185 г/л (например, приблизительно 140, 150, 165 г/л).

Любую из описанных в настоящей заявке композиций, содержащих УкА-4-связывающее антитело, можно упаковать в асептические ампулы, как описано, например, в опубликованной заявке США № 2005/0053598, включенной в настоящую заявку посредством ссылки. К примеру, композиции можно упаковать в 3,0-, 5,0- или 20-мл ампулы. Расфасованное лекарственное средство хранят в замороженном виде при приблизительно 2-8°С.

В одном варианте реализации конечную композицию упаковывают в жидкой форме в 3,0-мл ампулы, с минимальным извлекаемым объемом в 1,0 мл. К примеру, наполненная ампула может содержать от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,5 мл (например, приблизительно 1,1 мл, приблизительно 1,2 мл, приблизительно 1,3 мл, приблизительно 1,4 мл) композиции, содержащей антитело. В еще одном варианте реализации упомянутую композицию, содержащую антитело, упаковывают в предварительно заполненный шприц, в объеме, например, 1 мл, который пациент вводит при применении, и с 1 мл раствора в

- 15 020456 организм пациента доставляется желаемое количество антитела, например, от 135 до 165 мг натализумаба, например, 150 мг натализумаба.

Натализумаб и другие УЪА-4-связывающие антитела

Антитела, пригодные для применения в лекарственной композиции с высокой концентрацией УЪА4-связывающего антитела, описанные в настоящей заявке, включают натализумаб, α-интегринсвязывающее антитело. Натализумаб (название υδΑΝ) присвоен код антитела номер ΑΝ100226, а также его называют ΤΥδΑΒΚΙ™. Аминокислотная последовательность легкой цепи и тяжелой цепи натализумаба до любой ίη νίνο модификации (например, отрезание аминокислот) показаны в табл. 1-1 и 1-2.

Таблица 1-1. Последовательность легкой цепи натализумаба (δΕΟ ГО N0:1)

	10	20	30	40	50
1	ϋΐ0ΜΤζ?3Ρ5ε	ЬЗАЗУбОКУТ	1ТСКТ30Б1Ы	ΚΥΜΑΗΥ00ΤΡ	скаркьыну
51	ТЗАЬ<ЭР61Р5	КГЗСЗБЗСЕЦ	ΥΤΓΤΙ33Σ0Ρ	ΕΟΙΑΤΎΥΟΡβ	ΎϋΝΙ,ΗΤΓΕΟΕ
101	ΤΚνΕΙΚΚΤνΑ	АРЗУПЕРРЗ	ЦЕОЕКЗСТАЗ	УУСЬШМЕУР	ΚΕΑΚνΟΗΚνϋ
151	ΝΑυ255Ν50Ε	8νΤΕ<2β5Κβ5	ТУЗЬЗЗТЬТЬ	ЗКАЭУЕКНКУ	УАСЕУТНСЕЬ
201	$5ΡνΤΚ5ΓΝΚ	СЕС

Таблица 1-2. Последовательность тяжелой цели натализумаба (δΕΟ ГО N0:2)

	10	20	30	40	50
1	срУой/озЁАЁ!	УККРСАЗУКУ	зсказегшк	ϋΤΥΙΗΗνΚβΑ	РЕОКЕЕИМГР
51	Ι0ΡΆΝ6ΥΤΚΥ	ϋΡΚΓΟΕΚνΤΙ	ΤΑΟΤ3Α5ΤΑΥ	МЕЬЗЗЬРЗЕЭ	ТАУУУСАКЕС
101	ΥΥΟΝΥΕνΥΑΜ	ОУИСОСТЬУТ	УЗЗАЗТКГРЗ	УЕРЬАРСЗЕЗ	ТЗЕЗТААЬСС
151	ЬУКОУГРЕРУ	ТУЗММЗСАЬТ	ЗСУНТРРАУЪ	□ЗЗСЬУЗЬЗЗ	УУТУРЗЗЗЬС
201	τκτγτςΝνϋΗ	ΚΡ3ΝΤΚνϋΚΚ	УЕЗКУСРРСР	зсРАРЕгьее	РЗУГЪЕРРКР
251	КРТЬШЗКТР	Εντονννϋνε	ОЕРРЕУОРЫИ	УУБСУЕУНИА	КТКРНЕЕОГК

301	ЗТУКУУЗУЬТ	УЪНСОИЪЫСК	ЕУКСКУЗИКГ	1Ρ33ΙΕΚΤΙ5	КАКГОРКЕРО
351	УУТЬРР5<2ЕЕ	МТК№УЗЬТС	ΕνΚΓΕΥΡ3ΩΙ	АУЕИЕЗЫбОР	ЕЫМУКТТРРУ
401	ЬРЗОЕЗРРЬУ	ЗКЬТУЭКЗКН	ОЕСЫУГЗСЗУ	МНЕАЬНЫНУТ	ОКЗЬЗЬЗЬЗК2

'Глутамин, циклизированный в пироглутамовую кислоту ²Лизин удаляют посттрансляционно

Натализумаб ингибирует миграцию лейкоцитов из крови в центральную нервную систему. Натализумаб связывается с УЪА-4 (также называемой α4(β1) на поверхности активированных Т-клеток и других одноядерных лейкоцитов. Это может нарушать адгезию Т-клеток к эндотелиальным клеткам, предотвращая таким образом миграцию одноядерных лейкоцитов в эндотелии и в паренхиму. Как результат, уровень воспалительных цитокинов также может снизиться.

Натализумаб может снижать количество мозговых повреждений и клинических рецидивов у пациентов с возвратно-ремиттирующим рассеянным склерозом и возвратным, вторично прогрессирующим рассеянным склерозом.

Натализумаб и родственные ему УЪА-4-связывающие антитела описаны, например, в патенте США № 5840299. Моноклональные антитела 21,6 и НР1/2 являются примерами моноклональных антител мыши, связывающих УЪА-4. Натализумаб является гуманизированным моноклональным антителом мыши 21,6 (см., например, патент США № 5840299). Гуманизированное НР1/2 также было описано (см., например, патент США № 6602503). Некоторые дополнительные УЪА-4-связывающие антитела, такие как НР2/1, НР2/4, Ь25 и Р4С2, описаны, например, в патенте США № 6602503; δαηοΙιοζ-Μαύτίά е! а1., 1986 Еиг. ί. 1тМипо1., 16: 1343-1349; Нет1ег е! а1., 1987 ί. Βίοι. СЬет. 2: 11478-11485; ΙδδβΕυΐζ апб АукгсΙολνίαζ, 1991, ί. 1тМипо1., 147: 109 (ТА-2 так); РиМо е! а1., 1991 ί. Βίο1. СЬет., 266:10241-10245; и патенте США № 5888507).

Некоторые УЪА-4-связывающие антитела распознают эпитопы субъединицы α4, вовлеченные в связывание с ее лигандом, например, УСАМ-1 или фибронектином. Многие антитела этого типа ингибируют связывание УЪА-4 с соответствующими лигандами (например, УСАМ-1 и фибронектином).

Некоторые пригодные УЪ-4-связывающие антитела могут взаимодействовать с УЪА-4 на поверхности клеток, например, лимфоцитов, но не вызывать агрегацию клеток. Вместе с тем замечено, что другие УЪА-4-связывающие антитела вызывают такую агрегацию. НР1/2 не вызывает агрегацию клеток. НР1/2 моноклональное антитело (δаηсЬеζ-Маά^^ά е! а1., 1986) обладает чрезвычайно высокой активностью, блокирует взаимодействие УЪА-4 как с УСАМ1, так и с фибронектином и обладает специфичностью к эпитопу В на поверхности УЪА-4. Это антитело и другие специфичные к эпитопу В антитела (такие как антитела, связывающие В1 или В2; ΡιιΕύο е! а1., 1991, зирга) представляют один класс УЪА-4-связывающих антител, которые можно использовать в композициях и способах, описанных в настоящей заявке.

- 16 020456

Типичное УЪЛ-4-связывающее антитело содержит один или более СЭРх, например, все три НС СЭРз и/или все три ЬС СЭР5 специфического антитела, описанного в настоящей заявке, или СЭКз, являющиеся, в совокупности, по меньшей мере на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичными такому антителу, например, натализумаба. В одном варианте реализации гипервариабельные петли Н1 и Н2 имеют такую же каноническую структуру, как у антитела, описанного в настоящей заявке. В одном варианте реализации гипервариабельные петли Ь1 и Ь2 имеют такую же каноническую структуру, как у антитела, описанного в настоящей заявке.

В одном варианте реализации аминокислотная последовательность вариабельного домена НС и/или ЬС по меньшей мере на 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности вариабельного домена НС и/или ЬС антитела, описанного в настоящей заявке, например, натализумаба. Аминокислотная последовательность вариабельного домена НС и/или ЬС может отличаться на по меньшей мере одну аминокислоту, но не более чем на десять, восемь, шесть, пять, четыре, три или две аминокислоты от соответствующей последовательности антитела, описанного в настоящей заявке, например, натализумаба. К примеру, различия могут преимущественно или полностью локализоваться в каркасных областях.

Аминокислотные последовательности вариабельных доменов НС и ЬС могут кодироваться последовательностью нуклеиновых кислот, гибридизованной в строгих условиях с последовательностью нуклеиновых кислот, описанной в настоящей заявке, или последовательностью, кодирующей последовательность вариабельного домена, или аминокислотную последовательность, описанную в настоящей заявке. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность одной или более каркасных областей (например, РК1, РК2, РК3 и/или РК4) вариабельного домена НС и/или ЬС по крайней мере на 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична соответствующим каркасным областям вариабельного домена НС и ЬС антитела, описанного в настоящей заявке. В одном варианте реализации одна или более каркасных областей тяжелой или легкой цепи (например, НС РК1, РК2 и РК3) по крайней мере на 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 100% идентична последовательностям соответствующих каркасных областей термального антитела человека.

Расчет гомологии или идентичности последовательностей между двумя последовательностями (термины использованы в настоящей заявке взаимозаменяемо) осуществляют следующим путем. Последовательности выравнивают для оптимизации сравнения (например, в одну или обе первую и вторую аминокислотную последовательности или последовательности нуклеиновых кислот встраивают ОЛР для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности в целях сравнения можно пропустить). Оптимальное выравнивание определяют как наивысший показатель при использовании программы ОАР с программным обеспечением ОСО с матрицей замен В1о88ига 62 со штрафом за пропуск последовательности 12, расширенным штрафом за пропуск последовательности 4 и штрафом за пропуск последовательности каркасной области 5. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее ему положение во второй последовательности, молекулы считают идентичными по этому положению (при использовании в настоящей заявке аминокислотная или нуклеотидная идентичность эквивалентна аминокислотной или нуклеотидной гомологии). Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений, которые последовательности делят между собой.

Термин гибридизация в строгих условиях, используемый в настоящей заявке, описывает условия гибридизации и отмывки. Указания по проведению реакций гибридизации можно найти в Сиггеп! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, кНп УПеу & Зопз, Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6, внесенном в настоящую заявку посредством ссылки. В этой ссылке описаны водные и безводные средства, которые также можно применять. Гибридизация в строгих условиях заключается в гибридизации в 6Х §§С при приблизительно 45°С, за которой следует одна или более отмывок в 0.2Х §§С, 0,1% δΌδ при 65°С или в сходных в основных чертах, условиях.

Введение

Композиции с высокой концентрацией УЪЛ-4-связывающего антитела, описанные в настоящей заявке, можно вводить пациенту, например, пациенту-человеку, множеством способов, включая подкожное, внутримышечное и внутривенное введение. Обычно введение осуществляют путем подкожной или внутримышечной инъекции.

Композицию можно вводить в фиксированной дозе или в дозе мг/кг. Обычно введение осуществляют в фиксированной дозе. К примеру, композицию вводят в фиксированной дозе от 75 до 500 мг (например, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 мг) каждые 4 нед. (например, ежемесячно) или от 50 до 250 мг (например, 75, 100, 150, 200 мг) каждые 2 нед., или от 25 до 150 мг (например, 50, 75, 100, 125 мг) раз в нед. Композицию также можно вводить в виде болюса в дозе от 1 до 8 мг/кг, например, приблизительно 6,0, 4,0, 3,0, 2,0, 1,0 мг/кг. Пределы модифицированной дозы включают дозу, меньшую чем 500, 400, 300, 250, 200, 150 или 100 мг/пациент, обычно для введения каждую четвертую нед. или раз в мес. УЪЛ4-связывающее антитело можно вводить, например, каждые три-пять нед., например, каждую четвертую

- 17 020456 нед. или раз в мес.

Режимы дозировки можно корректировать для обеспечения желаемого ответа, например, терапевтического ответа. Дозу также можно выбрать для снижения предотвращения продуцирования антител против УЪЛ-4-связывающего антитела, для достижения более чем 40, 50, 70, 75 или 80% содержания субъединицы α4 или для предотвращения возрастания уровня циркуляции белых кровяных телец.

В некоторых вариантах реализации изобретения активный агент можно приготовить с переносчиком, который будет защищать антитело от быстрого высвобождения, таким как композиция с контролируемым высвобождением, включая импланты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангедриды, полигликолиевую кислоту, коллаген, полиорто-простые эфиры и полимолочную кислоту. Многие способы приготовления таких композиций запатентованы или общеизвестны (см., например, 8и51атеб апб Соп1то11еб Рс1са5с Эгид ОсОтсгу §у81ет8, ТВ. ВоЬйъои ей., Магсе1 Эскксг. 1пс., №ν Уотк, 1978).

Режимы дозировки можно корректировать для обеспечения желаемого ответа, например, терапевтического ответа.

Терапевтический ответ является улучшением состояния, симптома или параметра, сопутствующего заболеванию, как до статистически значимой степени, так и до степени, определимой для специалиста в данной области.

Стандартная лекарственная форма или фиксированная доза, при использовании в настоящей заявке, относится к физически отдельным единицам, подходящим для однократного введения пациентам, нуждающимся в лечении; каждая единица содержит предварительно установленное количество активного антитела, рассчитанное на произведение желаемого терапевтического эффекта в комбинации с требуемым фармацевтическим переносчиком и, возможно, в комбинации с другим агентом.

Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество УЪЛ4-связывающего антитела, например, натализумаба, описанного в настоящей заявке. Такие эффективные количества можно определить, базируясь на эффекте вводимого агента, или на совместном эффекте агента и вторичного агента, если применяют более одного агента. Терапевтически эффективное количество агента также может варьироваться в соответствии с факторами, такими как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, и способность антитела вызывать желаемый ответ в организме индивидуума, например, уменьшение интенсивности по меньшей мере одного параметра заболевания, например, параметра рассеянного склероза, или уменьшение интенсивности по меньшей мере одного симптома заболевания, например, рассеянного склероза. Терапевтически эффективным количеством также является такое, в котором любые токсические или вредные эффекты превосходят терапевтически благоприятные эффекты.

Устройства и наборы

Композиции, содержащие высокую концентрацию УЪЛ-4-связывающего антитела (например, натализумаба), можно вводить при помощи медицинского устройства. Устройство может быть разработано специально или иметь такие свойства, как портативность, хранение при комнатной температуре и легкость в применении для возможности применения в экстренных ситуациях, например, необученным субъектом или персоналом экстренной службы в полевых условиях, перемещения в медицинские учреждения и другое медицинское снаряжение. Устройство может содержать, например, одно или более мест для хранения фармацевтических препаратов, содержащих УЪЛ-4-связывающее антитело (например, натализумаб), и может быть приспособлено для доставки одной или более стандартных доз агента.

Например, фармацевтическую композицию можно вводить с помощью устройства для чрескожной доставки, таким как шприц, включая гиподермальный и многоячеистый шприц. В одном варианте реализации устройство является предварительно наполненным шприцом с прилагаемой или встроенной иглой. В других вариантах реализации устройство является предварительно наполненным шприцом без прилагаемой иглы. Иглу можно упаковать вместе с предварительно наполненным шприцом. В одном варианте реализации устройство является устройством для самостоятельной инъекции, например, шприцем для самостоятельной инъекции. В другом варианте реализации устройство является перьевым инжектором. В еще одном варианте реализации шприц является шприцем с несъемной иглой, шприцем с колпачком Люэра или шприцем с поршнем Люэра. Другие подходящие устройства включают стенты, катетеры, микроиглы и имплантируемые устройства с контролируемым высвобождением. Композицию можно вводить внутривенно при помощи стандартного ВВ оборудования, включая, например, ВВ трубки со встроенными фильтрами или без. В некоторых вариантах реализации устройство является шприцем, применяемым для ПК или ВМ введения.

Фармацевтические композиции можно вводить при помощи медицинских устройств. Например, фармацевтические композиции можно вводить при помощи безыгольного гиподермального устройства для инъекций, такого как устройства, описанные в патентах США № 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры широко известных имплантов и модулей включают патент США № 4487603, который описывает имплантируемую микроинфузионную помпу для подачи

- 18 020456 препарата в контролируемом объеме; патент США № 4486194, который описывает терапевтическое устройство для введения препарата через кожу; патент США № 4447233, который описывает медицинскую инфузионную помпу для доставки препарата в определенном объеме; патент США № 4447224, который описывает имплантируемый инфузионный аппарат с переменным током для непрерывной доставки препарата; патент США № 4439196, который описывает осмотическую систему для доставки препарата, имеющую многоячеистые отделения; и патент США № 4475196, описывающий осмотическую систему для доставки препарата. Терапевтическая композиция также может находиться в форме биодеградируемого или небиодеградируемой композиции с замедленным высвобождением для подкожного или внутривенного введения (см., например, патент США № 3773919 и 4767628 и РСТ заявку \УО 94/15587). Непрерывного введения можно добиться, применяя имплантируемую или наружную помпу. Введение также можно осуществлять с перерывами, например, одной инъекцией в день, или непрерывно в низкой дозе, например, композиции с замедленным высвобождением. Устройство для доставки можно модифицировать так, чтобы оно оптимально подходило для введения УЬА-4-связывающего антитела. Например, шприц можно силиконизировать до степени, оптимальной для хранения и доставки анти-УЬА-4связывающего антитела. Конечно, также известны многие другие подобные импланты, системы доставки и модули.

Изобретение также описывает устройство для введения первого и второго агента. Устройство может содержать, например, одно или более мест для хранения фармацевтических препаратов и может быть приспособлено для доставки стандартных доз первого и второго агента. Первый и второй агенты можно хранить в одном или в разных отделениях. Например, устройство может перемешивать агенты перед введением. Также возможно применение различных устройств для введения первого и второго агентов.

УЬА-4-связывающее антитело (например, натализумаб) можно предоставить в наборе. В одном варианте реализации набор включает (а) контейнер, в который заключена композиция, содержащая высокую концентрацию УЬА-4-связывающего антитела, необязательно, (Ь) контейнер, в который заключена композиция, содержащая второй агент, и, необязательно, (с) информационный материал. Информационный материал может быть описательного, инструктивного, рекламного или другого характера, относящегося к способам, описанным в настоящей заявке, и/или использованию агентов в терапевтических целях. В одном варианте реализации набор также включает второй агент. Например, набор включает первый контейнер, в который заключена композиция, содержащая высокую концентрацию УЬА-4-связывающего антитела, и второй контейнер, в который заключен второй агент. В одном варианте реализации набор включает один или более одноразовых шприцов, предварительно наполненных высококонцентрированной жидкой композицией, содержащей антитело, описанной в настоящей заявке.

Информационный материал наборов не ограничен по своей форме. В одном варианте реализации информационный материал может содержать информацию о производстве антитела, концентрации, сроке годности, информацию о партии или о месте производства и так далее. В одном варианте реализации информационный материал относится к способам введения УЬА-4-связывающего антитела (например, натализумаб), например, в подходящей дозе, лекарственной форме, или способу введения (например, доза, лекарственная форма, или способ введения, описанные в настоящей заявке) для лечения пациента, страдающего воспалительным заболеванием (например, РС), или с повышенным риском возникновения приступа, вызванного воспалительным заболеванием. Информацию можно предоставить в различных форматах, включая напечатанный текст, материал для воспроизведения на компьютере, видеозапись или аудиозапись, или в виде информации, предоставляющей ссылку или адрес содержательного материала.

В дополнение к агенту, композиция в наборе может содержать другие ингредиенты, такие как растворитель или буфер, стабилизатор или консервант. Агент можно предоставить в любой форме, например, в жидкой, сухой или лиофилизированной форме, и в преимущественно чистой и/или стерильной форме. Если агенты предоставляют в жидком растворе, жидкий раствор является, например, водным раствором. Если агенты предоставляют в сухой форме, восстановление обычно осуществляют путем добавления подходящего растворителя. Растворитель, например, стерильную воду или буфер, можно предоставить в наборе.

Набор может включать один или более контейнеров для композиции или композиций, содержащих агенты. В некоторых вариантах реализации набор содержит отдельные контейнеры, разделители или отделения для композиции и информационного материала. Например, композицию можно заключить во флакон, ампулу или шприц, а информационный материал может быть заключен в пластиковый конверт или пакет. В других вариантах реализации различные элементы набора заключены в один неразделенный контейнер. Например, композиция заключена во флакон, ампулу или шприц с прикрепленным к ним информационным материалом в виде этикетки. В некоторых вариантах реализации набор включает некоторое количество (например, упаковку) индивидуальных контейнеров, каждый из которых содержит одну или более стандартных лекарственных форм (например, лекарственных форм, описанных в настоящей заявке) агентов. Контейнеры могут заключать в себе комбинацию стандартных дозировок, например, содержащих как УЪА-4-связывающее антитело (например, натализумаб), так и второй агент, например, в желаемом соотношении. Например, набор может включать некоторое количество шприцев, ампул, паке- 19 020456 тов из фольги, блистеров или медицинских устройств, например, каждый из которых содержит одну комбинированную стандартную дозу. Контейнеры в наборах могут быть герметичными, водонепроницаемыми (например, непроницаемыми для изменений влажности и испарения) и/или светонепроницаемыми.

Набор может включать устройство, подходящее для введения композиции, например, шприц или другое подходящее медицинское устройство. Устройство можно предоставить предварительно наполненным одним или более агентами, или пустым, но пригодным для заполнения.

Рассеянный склероз

Композиции, содержащие высокую концентрацию УЪА-4-связывающего антитела, подходящие для ПК или ВМ введения, пригодны для лечения воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Рассеянный склероз является заболеванием центральной нервной системы, характеризующимся воспалением и утратой миелиновых оболочек.

Пациентов, страдающих РС, можно идентифицировать согласно критериям постановки диагноза клинически установленного РС, определенных рабочей группой по диагностике РС (Рокег е! а1., Апп. №иго1. 13:227, 1983). Вкратце, индивидуум с клинически установленным РС, перенес два приступа и имеются клинические данные о двух повреждениях, или клинические данные об одном повреждении и параклинические данные о другом, отдельном повреждении. Установленный РС также можно диагностировать по данным о двух приступах и зоне олигоклональных 1дО в цереброспинальной жидкости. Также в диагностике РС можно использовать критерий МсЭопаИ (МсЭопаИ е! а1., 2001, КесошМепйей ШадпокОс сгйепа £ог шиШр1е кс1егок1к: дшйеПпек £гош 1йе 1п1егпаОопа1 Рапе1 оп 1йе Эхадпоак о£ Ми1йр1е 8с1егок1к, Апп №иго1 50:121-127). Критерий МсЭопаИ включает использование данных МРТ о поражении ЦНС с течением времени в диагностике РС, в отсутствие множественных клинических приступов. Эффективность лечения рассеянного склероза можно оценить несколькими различными путями. Для оценки эффективности лечения можно использовать следующие параметры. Два примера критериев включают: ΕΌδδ (расширенная шкала инвалидизации) и обнаружение обострений при МРТ (магнитнорезонансной томографии). ΕΌδδ представляет собой способ оценки клинического поражения из-за РС (КиП/ке. №иго1оду 33:1444, 1983). Определено восемь функциональных систем для типа и тяжести неврологического поражения. Вкратце, перед лечением пациентов оценивают на предмет поражения следующих систем: пирамидальной, мозжечка, ствола мозга, кишечника и мочевого пузыря, зрительной, спинного мозга и других. Через определенные интервалы проводят повторы. Шкала градуирована от 0 (норма) до 10 (смерть из-за РС) . Снижение на одну полную ступень свидетельствует об эффективности лечения (КиП/ке, Апп. №иго1. 36:573-79, 1994).

Обострения определены как появление нового симптома, свойственного РС и сопровождающегося соответствующей новой неврологической аномалией (ΙΡΝΒ М§ §!ийу Огоир, кирга). В дополнение, обострение должно длиться по меньшей мере 24 ч, и за ним должен следовать период стабильности или улучшения в течение по меньшей мере 30 дней. Вкратце, пациентов подвергают стандартному неврологическому осмотру клиницистами. Обострения бывают легкими, умеренными или тяжелыми, в соответствии с изменениями в Неврологической Шкале Оценок (§1ре е! а1., №иго1оду 34:1368, 1984). Определены ежегодный уровень обострений и доля пациентов без обострений.

Терапию можно признать эффективной, если есть статистически значимое различие в уровне или доле пациентов без обострений или пациентов без рецидивов между группой, подвергавшейся лечению, и группой, принимавшей плацебо, по любому из этих измерений. В дополнение также можно измерить время до первого обострения и длительность обострения и его тяжесть. Мерой эффективности терапии в этом отношении является статистически значимое различие во времени до первого обострения или в длительности и тяжести в группе, подвергавшейся лечению, в сравнении с контрольной группой. Период без обострений или без рецидивов длительностью более одного года, 18 мес., или 20 мес. является примечательным результатом.

Эффективность введения первого агента и, возможно, второго агента также можно измерить, базируясь на одном или более из следующих критериев: плотность МВР реактивных Т-клеток, определенная методом предельных разведений, пролиферативный ответ МВР реактивных Т-клеточных линий и клонов, цитокиновые профили Т-клеточных линий и клонов к МВР, установленные у пациентов. Об эффективности свидетельствует снижение плотности реактивных клеток, уменьшение включения тимидина в измененный пептид в сравнении с нативным, снижение содержания ΤΝΡ и ΙΡΝ-α.

Клинические измерения включают уровень рецидивов за одно- и двухгодичные интервалы, и изменения в ΕΌδδ, включая время продвижения с начального уровня в 1,0 единицу по ΕΌδδ, сохраняющегося в течение 6 мес. На кривой Каплана-Майера задержка в стабильном продвижении или невозможность продвижения демонстрирует эффективность. Другие критерии включают изменение в области и объеме Т2-изображений на МРТ и количество и объем повреждений, определенных по изображениям, усиленным гадолинием.

МРТ можно применять для измерения активных повреждений, используя гадолиний-ДТПАусиленное изображение (МсЭоиа1й е! а1. Апп. №иго1. 36:14, 1994), или местонахождение и обширность повреждений, используя метод Т₂-взвешенных изображений. Вкратце, устанавливают начальные уровни

- 20 020456

МРТ. Для каждого последующего исследования используют одну и ту же плоскость изображения и одно и то же положение пациента. Последовательности расположения и изображений можно выбрать так, чтобы максимизировать обнаружения повреждения и способствовать отслеживанию повреждения. В последующих исследованиях можно использовать те же последовательности расположения и изображений. Наличие, местоположение и обширность повреждений РС могут определить радиологи. Области повреждений можно обводить и суммировать снимок за снимком для составления общей области повреждения. Можно провести три анализа: данные о новых поражениях, степень появления активных поражений, процентное изменение области поражения (Ра1у с1 а1., №иго1оду 43:665, 1993). Улучшения благодаря терапии можно установить по статистически значимому улучшению у единичного пациента в сравнении с начальным уровнем группы, подвергавшейся лечению, относительно группы, принимавшей плацебо.

Примеры симптомов, сопряженных с рассеянным склерозом, лечение которых возможно осуществлять согласно способам, описанным в настоящей заявке, включают: неврит зрительного нерва, диплопию, нистагм, зрительную дизметрию, межъядерную офтальмоплегию, фосфен зрительного и слухового анализаторов, афферентный папиллярный дефект, парез, монопарез, парапарез, гемипарез, квадрапарез, плегию, параплегию, гемиплегию, тетраплегию, квадраплегию, спастичность, дизартрия, мышечная атрофия, спазмы, колики, гипотония, клонус, миоклонус, миокимия, синдром беспокойных ног, отвислая стопа, дисфункциональные рефлексы, парестезия, анестезия, невралгия, невралгическая и нейрогенная боль, синдром ГЬегтШе, проприоцептивную дисфункцию, невралгию тройничного нерва, атаксию, интенционный тремор, дизметрию, вестибулярную атаксию, вертиго, артикулярную атаксию, дистонию, дисдиадохокинезию, частое мочеиспускание, спастичность мочевого пузыря, вялый мочевой пузырь, дисфункцию детрузора сфинктера, эректильную дисфункцию, аноргазмию, фригидность, констипацию (запор), императивные позывы к дефекации, недержание кала, депрессивный синдром, когнитивную дисфункцию, деменцию, перепады настроения, эмоциональную лабильность, эйфорию, биполярный синдром, тревожность, афазию, дисфазию, утомляемость, симптом Утгоффа, гастроэзофагеальный рефлюкс и нарушения сна.

Каждый случай РС представляет одну из нескольких схем развития и вытекающий из этого характер течения. Чаще всего РС сначала выражается как серия приступов, за которыми следуют полные или частичные ремиссии по мере того, как симптомы загадочным образом облегчаются только для того, чтобы вернуться позже, после периода стабильности. Это называют возвратно-ремиттирующим (ВР) РС. Первично-прогрессирующий (ПП) характеризуется постепенным клиническим ухудшением без явных ремиссий, хотя симптомы могут давать временные плато, или легкое облегчение симптомов. Вторичнопрогрессирующий (ВП) РС начинается как возвратно-ремиттирующий по характеру течения, перетекающий позже в первично-прогрессирующий. Реже у пациентов встречается прогрессивно-возвратный (ПВ) характер течения, в котором заболевание протекает по прогрессирующему пути, прерываемому острыми приступами. ПП, ВП и ПВ иногда проявляются вместе, и это называют хроническим прогрессирующим РС.

Небольшое число пациентов страдает злокачественным РС, определенным как быстрое и необратимое ухудшение, приводящее к значительной потере трудоспособности, или даже смерти вскоре после начала болезни. Это ухудшение можно остановить или замедлить введением комбинированной терапии, описанной в настоящей заявке.

В качестве дополнения, или до экспериментов на человеке, для оценки эффективности применения двух агентов можно использовать животную модель. Примером животной модели для рассеянного склероза является экспериментальный аутоиммунный энцефалит (ЭАЭ) на мышиной модели, например, как описано в (Тиойу е1 а1. (1. 1тМипо1. (1988) 141: 1126-1130), 8оЪе1 е1 а1. (1. 1тМипо1. (1984) 132: 23932401), и Тгаидой (Се11 1тМипо1. (1989) 119: 114-129). Мышам можно вводить первый и второй агенты, описанные в настоящей заявке, до индукции ЭАЭ. После чего мышей оценивают по критериям признаков для определения эффективности использования двух агентов на модели.

Другие заболевания

Композиции и способы, описанные в настоящей заявке, также можно применять для лечения других воспалительных, иммунных или аутоиммунных заболеваний, например, воспаления центральной нервной системы (например, в дополнение к рассеянному склерозу, менингит, оптиконевромиелит, нейросаркоидоз, васкулит ЦНС, энцефалит или поперечный миелит), отторжения трансплантата органа или ткани, или реакция трансплантат против хозяина, острого повреждения ЦНС, например, инсульта или повреждения спинного мозга, хронической почечной недостаточности; аллергии, например, аллергической астмы, диабета 1 типа; воспалительных заболеваний кишечника, например, болезни Крона, язвенного колита; миастении гравис; фибромиалгии; артритных заболеваний, например, ревматоидного артрита, псориатического артрита; воспалительных/иммунных кожных заболеваний, например, псориаза, витилиго, дерматита, красного плоского лишая (лишая Вильсона); системной красной волчанки; синдрома Шегрена; гематологических раковых образований, например, множественной миеломы, лейкемия, лимфомы; плотных раковых образований, например, саркомы или карциномы, например, легкого, груди, простаты, мозга; и фиброзных заболеваний, например, фиброза легких, миелофиброза, цирроза печени, мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, суставного гломерулонефрита, диабетической

- 21 020456 нефропатии и почечного интерстициального фиброза.

Например, композицию, содержащую высокую концентрацию УЪА-4-связывающего антитела (например, натализумаба), можно вводить подкожно или внутримышечно для лечения указанных выше и других воспалительных, иммунных или аутоиммунных заболеваний.

Образование антител

Антитела, связывающие УЪА-4, могут образовываться в результате иммунизации, например, при использовании животных, или методами ίη νίίτο, такими как фаговый дисплей. УЪА-4 целиком, или его часть, можно использовать как иммуноген. Например, внеклеточную область субъединицы α4 можно использовать как иммуноген. В одном варианте реализации организм иммунизированного животного содержит клетки, продуцирующие иммуноглобулин, с естественными локусами иммуноглобулинов, локусами иммуноглобулинов человека, или частично локусами иммуноглобулинов человека. В одном варианте реализации организм животного (не человека) содержит по меньшей мере часть гена иммуноглобулина. Например, возможно создать линии мышей, у которых будет отсутствовать продукция антител мыши, большими фрагментами локуса 1д человека. Применяя технологию гибридом, можно продуцировать и отбирать антиген-специфические моноклональные антитела, полученные из генов, обладающих желаемой специфичностью (см., например, ХепоМоике™, Огееп с1 а1. №Цигс Оепейск 7:13-21 (1994), и.З. 2003-0070185, и.З. РаС Νο. 5789650, и νθ 96/34096.

Антитела не-человека к УЪА-4 также можно получить, например, от грызуна. Антитела не-человека можно гуманизировать, как описано в патенте США № 6602503, ЕР 239400, патенте США № 5693761 и 6407213.

ЕР 239400 (νίώοτ е1 а1.) описывает изменение антител путем замещения (заданной вариабельной областью) участков, определяющих комплементарность (СЭКк) одного вида СЭКк другого. Антитела с замещенными СЭКк могут менее эффективно вызывать иммунный ответ в организме человека в сравнении с настоящими химерными антителами, так как антитела с замещенными СЭКк содержат значительно меньше нечеловеческих компонентов (Шесйтапп е1 а1., 1988, №1иге 332, 323-327; Уегйоеуеп е1 а1., 1988, Заепсе 239, 1534-1536). Обычно СЭКк антитела крысы встраивают в соответствующие области антитела человека с использованием метода рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения последовательностей, кодирующих желаемое замещенное антитело. Можно добавить сегменты константной области гена человека желаемого изотипа (обычно гамма I для СН и каппа для СЪ), и гены гуманизированных тяжелых и легких цепей можно экспрессировать совместно в клетках млекопитающего с получением растворимого гуманизированного антитела.

У Оиееп е1 а1., 1989 и в документе νθ 90/07861 описан процесс, включающий выбор У каркасных областей человека при помощи компьютерного анализа для оптимальной гомологии белковой последовательности У каркасной области исходного антитела крысы и моделирование четвертичной структуры У области крысы для визуализации аминокислотных остатков каркасной области, подходящих для взаимодействия с СЭКк крысы. Эти аминокислотные остатки крысы затем совмещают с гомологичной каркасной областью человека (см. также патент США № 5693762; 5693761; 5585089 и 5530101). У Тетрек1 е1 а1., 1991, Вю1есйпо1оду 9, 266-271, использовались, стандартно, У каркасные области, полученные из ΝΕ\νΜ и КЕ1 тяжелой и легкой цепей, соответственно, для СЭК-переноса без введения радикалов в аминокислотные остатки мыши. Преимущество использования подхода Тетрек1 е1 а1. для создания гуманизированных антител, основанных на ΝΕνΜ и КЕ1, заключается в том, что благодаря рентгеноструктурной кристаллографии известны три пространственные структуры вариабельных областей ΝΕνΜ и КЕ1, и, исходя из этого, можно модулировать специфические взаимодействия между СЭКк и У каркасной областью.

Антитела не-человека можно изменять для введения замен, вносящих последовательности иммуноглобулина человека, например, консенсусные аминокислотные остатки человека в определенных положениях, например, в одном или более (например, по меньшей мере в пяти, десяти, двенадцати или во всех) из следующих положений: (в константной области вариабельного домена легкой цепи) 4Ъ, 35Ъ, 36Ъ, 38Ъ, 43Ъ, 44Ъ, 58Ъ, 46Ъ, 62Ъ, 63Ъ, 64Ъ, 65Ъ, 66Ъ, 67Ъ, 68Ъ, 69Ъ, 70Ъ, 71Ъ, 73Ъ, 85Ъ, 87Ъ, 98Ъ и/или (в константной области вариабельного домена тяжелой цепи) 2Н, 4Н, 24Н, 36Н, 37Н, 39Н, 43Н, 45Н, 49Н, 58Н, 60Н, 67Н, 68Н, 69Н, 70Н, 73Н, 74Н, 75Н, 78Н, 91Н, 92Н, 93Н и/или 103Н (в соответствии со способом нумерации КаЬа1) (см., например, патент США № 6407213).

Целые моноклональные антитела человека, связывающие УЪА-4, можно получить, например, используя праймированные ш νίΙΐΌ спленоциты, как описано у Воегпег е1 а1., 1991, 1. 1тМипо1., 147, 86-95. Их можно получить при помощи репертуарного клонирования, как описано у Регккоп е1 а1., 1991, Ргос. ΝηΙ. Асай. ЗсС иЗА, 88: 2432-2436 или у Ниапд апй З1о11аг, 1991, 1. 1тМипо1. Мейюйк 141, 227-236; а также и.З. РаС №. 5798230. Также для выделения высокоаффинных антител можно обратиться к обширным библиотекам неиммунизированных фаговых дисплеев человека (см., например, Уаидйап е1 а1., 1996; НоодепЬоот е1 а1. (1998) 1тМипо1есйпо1оду 4:1-20; и НоодепЬоот е1 а1. (2000) 1тМипо1 Тойау 2:371-8; и.З. 2003-0232333).

- 22 020456

Получение антител

Антитела можно получать в прокариотических и эукариотических клетках. В одном варианте реализации антитела (например, 5сРу5) получают в клетке дрожжей, таких как РюЫа (см., например, Ро\усг5 е1 а1. (2001) I 1тМипо1 Ме11юй5. 251:123-35), Нап5еи1а или 8ассИаготусе5.

В одном варианте реализации антитела, в особенности, полноразмерные антитела, например, 1дО, получают в клетках млекопитающего. Примеры клеток-хозяев млекопитающего для рекомбинантной экспрессии включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки йИГг-СНО, описанные в Иг1аиЬ апй СИа5т (1980) Ргос. ЫаЙ. Асай. δα. И8А 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером ЭНРР, например, как описано в КаиГтап апй 8Иагр (1982) Мо1. Бю1. 159:601-621), лимфоцитарные клеточные линии, например, клетки миеломы N80 и клетки δΡ2, клетки СО8, К562 и клетки трансгенного животного, например, трансгенного млекопитающего. Например, клетка является эпителиальной клеткой млекопитающего.

В дополнение к последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей иммуноглобулиновый домен, рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести добавочные последовательности нуклеиновых кислот, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетке-хозяине (например, ориджины репликации), и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые введен ген (см., например, патент США № 4399216, 4634665 и 5179017). Примеры селектируемых маркерных генов включают ген дигидрофолат редуктазы (ДГФР) (используемый в клетках-хозяевах йИт для метотрексат селекции/амплификации) и ген пео (для селекции 0418).

В примере системы для рекомбинантной экспрессии антитела (например, полноразмерного антитела, или его антиген-связывающая часть), рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий и тяжелую, и легкую цепь антитела, вводят в клетки йИГг СНО путем кальциевой фосфат-опосредованной трансфекции. В пределах рекомбинантного экспрессионного вектора каждый ген тяжелой и легкой цепей антигена функционально связан с регуляторным элементом энхансер/промотор (например, полученным из 8У40, СМУ, аденовируса и ему подобных, таких как регуляторный элемент энхансер/АйМЬР промотер СМУ, или регуляторный элемент энхансер/АйМЬР промотер 8У40) для достижения высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессионный вектор также несет ген ΌΗΡΚ, который допускает селекцию клеток СНО, трансфицированных вектором при помощи метотрексатной селекции/амплификации. Прошедшие селекцию трансформированные клетки-хозяева культивируют для экспрессии тяжелых и легких цепей антитела, и интактное антитело выделяют из культуральной среды. Для создания рекомбинантного экспрессионного вектора трансфицирования клеток-хозяев, селекции трансформантов, для культивирования клеток-хозяев и для выделения антитела из культуральной среды применяют стандартные методы молекулярной биологии. Например, некоторые антитела можно выделить методом аффинной хроматографии с белком А или белком О. Например, очищенные УЬА-4связывающие антитела, например, натализумаб, можно сконцентрировать до приблизительно 100 мг/мл или до приблизительно 200 мг/мл, применяя стандартные методы концентрирования.

Антитела также могут включать модификации, например, модификации, которые изменяют функцию Рс, например, для снижения исключения взаимодействия с Рс-рецептором или с С1ц. или и с тем и с другим. Например, константную область 1§О человека можно подвергнуть мутации в одном или более остатках, например, один или оба остатка 234 и 237, например, в соответствии с нумерацией в патенте США № 5648260. Другие примеры модификаций включают описанные в патенте США № 5648260.

Для некоторых антител, которые содержат Рс домен, можно разработать систему получения антитела для синтеза антител, в которых Рс домен гликозилирован. Например, Рс домен молекул 1дО гликозилируют по аспарагину 297 в СН2 домене. Этот аспарагин является сайтом модификации олигосахаридами биантеннарного типа. Это гликозилирование принимает участие в эффекторных функциях, опосредованных Рс γ-рецепторами и С1д компонентом системы комплемента (ВигЮп апй \УооГ (1992) Айу. 1ттипо1. 51:184; йеГГег15 е1 а1. (1998) 1ттипо1. Кеу. 163:59-76). Рс домен можно получить в системе экспрессии, основанной на клетках млекопитающих, которая гликозилирует остаток, соответствующий аспарагину 297.

Антитела также можно получать в трансгенном животном. Например, патент США № 5849992 описывает способ экспрессии антитела в железе млекопитающего или трансгенного млекопитающего. Создают трансген, содержащий специфичный в отношении молока промотор и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие интересующее антитело, например, антитело, описанное в настоящей заявке, и сигнальную последовательность. Молоко, вырабатываемое самками таких трансгенных млекопитающих, содержит секретированное в нем интересующее антитело, например, антитело, описанное в настоящей заявке. Антитело можно очистить от молока, или для некоторых областей применения использовать непосредственно.

Антитела можно модифицировать, например, при помощи молекул, улучшающих их стабильность и/или время циркуляции, например, в крови, сыворотке, лимфе, бронхоальвеолярной жидкости или других тканях, например, в по меньшей мере полтора, два, пять, десять или пятьдесят раз.

Например, УЬА-4-связывающее антитело можно соединить с полимером, например, с преимущественно неантигенным полимером, таким как полиалкиленоксид или полиэтиленоксид. Подходящие поли- 23 020456 меры значительно различаются по весу. Можно применять полимеры со среднечисленным молекулярным весом от приблизительно 200 до приблизительно 35000 Да (или от приблизительно 1000 до приблизительно 15000 и от приблизительно 2000 до приблизительно 12500).

Например, УЪЛ-4-связывающее антитело можно конъюгировать с водорастворимым полимером, например, с гидрофильным поливиниловым полимером, например, поливинилспиртом или поливинилпирролидоном. Не ограничивающий настоящее изобретение список таких полимеров включает: гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры блок-сополимеры, предполагающие, что растворимость в воде блок-сополимеров измеряют. Дополнительные пригодные полимеры включают полиоксиалкилены, такие как полиоксиэтилен, полиоксипропилен, и блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена (плюроники); полиметакрилаты; карбомеры; разветвленные или неразветвленные полисахариды, содержащие сахаридные мономеры Ό-маннозы, Ό- и Ь-галактозы, фукозы, фруктозы, Ό-ксилозы, Ьарабинозы, Ό-глюкуроновой кислоты, сиаловой кислоты, Ό-галактуроновой кислоты, Ό-маннуроновой кислоты (например, полиманнуроновой кислоты или альгиновой кислоты), Ό-глюкозамина, Όгалактозамина, Ό-глюкозы и нейраминовой кислоты, включая гомополисахариды и гетерополисахариды, такие как лактоза, амилопектин, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, амилоза, сульфат декстрана, декстран, декстрины, гликоген или полисахаридная субъединица мукополисахаридов кислот, например, гиалуроновой кислоты; полимеры сахароспиртов, такие как полисорбитол и полиманнитол; гепарин или гепарон.

Примеры вторых агентов

В некоторых случаях композиции, описанные в настоящей заявке, содержащие высокую концентрацию УЪЛ-4-связывающего антитела, подходящие для ПК или ВВ введения, содержат второй агент, или их вводят в сочетании с композицией, содержащей второй агент.

В одном варианте осуществления УЪЛ-4-связывающее антитело и второй агент предоставляют в единой композиции, и пациенту вводят единую композицию. Далее возможно, например, за по меньшей мере 24 ч до или после введения единой композиции отдельно ввести одну дозу высококонцентрированной композиции, содержащей антитело, и затем одну дозу композиции, содержащей второй агент. В другом варианте осуществления антитело и второй агент предоставляют в различных композициях, и стадия введения включает последовательное введение антитела и второго агента. Последовательные введения можно осуществить в один и тот же день (например, с перерывом в 1 ч или по меньшей мере в 3, 6 или 12 ч), или в разные дни.

Обычно и антитело, и второй агент вводят как некоторое количество доз, разделенных во времени. И антитело, и второй агент обычно вводят согласно режиму. Режим для одного из них или для обоих может иметь регулярную периодичность. Режим для введения антитела может иметь различную с режимом для второго агента периодичность, например, один можно вводить чаще, чем другой. В одном варианте осуществления одно из антител и второй агент вводят раз в нед., а в другом - 1 раз в мес. В другом варианте осуществления одно из антител и второй агент вводят непрерывно, например, в течение периода времени более 30 мин, но менее 1, 2, 4 или 12 ч, а в другом - вводят как болюс. Антитело и второй агент можно выводить любым подходящим способом, например, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

В некоторых вариантах реализации и антитело, и второй агент вводят в одинаковой дозе, и каждый из них прописывают в форме монотерапии. В других вариантах реализации антитело вводят в дозе, равной или меньшей, чем количество, требуемое для эффективности, при введении одного антитела. Аналогично этому второй агент можно вводить в дозе, равной или меньшей, чем количество, требуемое для эффективности, при введении одного второго агента.

Не ограничивающие собой изобретение примеры вторых агентов для лечения рассеянного склероза в комбинации с УЬА-4-связывающим антителом включают интерфероны, например, интерферон человека бета-1а (например, ΑνΟΝΕΧ® или КеЬГ®) и интерферон бета-1Ь (ΒΕΤΑ8ΕΚΟΝ™; интерферон человека бета, замещенный в положении17; Вег1ех/СЫгоп);

глатирамера ацетат (также называемый Сополимер 1, Сор-1; ί'ΌΡΑΧΟΝΕ™; Теуа Рйагтасеийса1 1пДикйтек, 1пс.);

Кйихап® (ритиксимаб) или другое анти-СВ20 антитело, например, конкурирующее с перекрывающимся с ритиксимаб эпитопом, или связывающее;

митоксантрон (ΝΟνΑΝΤΚΟΝΕ®, ЬеДег1е);

химиотерапевтические агенты, например, клабрибин (ΌΕυδΤΑΤΙΝ®), азатиоприн (ΙΜϋΚΑΝ®), циклофосфамид (ί'ΎΤΟΧΑΝ®), циклоспорин-А, метотрексат, 4-аминопиридин и тизанидин;

кортикостероид, например, метилпреднизолон (ΜΕΌΚΟΝΕ®, РП/ег), преднизолон; иммуноглобулин, например, КДихап® (ритиксимаб); ί’ΤΕΑ4 Ι§; алемтузумаб (МаЬСАМРАТО®) или даклизумаб (антитело, связывающее СЭ25); статины;

антагонисты ФНО.

Глатирамер ацетат представляет собой белок, сформированный неупорядоченной цепью аминокис- 24 020456 лот - глутаминовой кислотой, лизином, аланином и тирозином (отсюда - глатирамер). Его можно синтезировать в растворе этих аминокислот с приблизительным соотношением: 5 частей аланина к 3 частям лизина, 1,5 глутаминовой аминокислоты 1 частью тирозина, используя ангидриды Νкарбоксиаминокислот.

Добавочные вторые агенты включают антитела или антагонисты других цитокинов человека или факторов роста, например, ΤΝΡ, ЬТ, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-12 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-18, ЕМАР-11, СМСδΡ, РСР и ΡΌΟΡ. Также другие примеры вторых агентов включают молекулы клеточной поверхности, такие как СЭ2, СЭ3, СЭ4, СЭ8, СП25, СП28, СП30, СП40, СП45, СП69, СП80, СП86, СЭ9 или их лиганды. Например, даклизумаб (йасП/иЬшаЬ) является анти-СЭ25 антителом, которое может улучшать состояние при рассеянном склерозе.

Также другие примеры антител включают антитела, обеспечивающие активность агента, описанного в настоящей заявке, например, антитело, контактирующее с рецептором интерферона, например, с бета-рецептором интерферона. Обычно в вариантах осуществления, в которых второй агент содержит антитело, оно связывается с белком-мишенью, не являющимся УЪА-4 или а4 интегрином, или, по меньшей мере, не с тем эпитопом УЪА-4, который распознает первый агент.

Также другие примеры вторых агентов включают: РК506, рапамицин, мофетила микофенолат, лефлуномид, нестероидные противовоспалительные препараты (ΝδΛΙΌδ), например, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические агенты, ингибиторы системы комплемента, адренэргические агенты, агенты, препятствующие сигналингу с участием провоспалительных цитокинов, как описано в настоящей заявке, ингибиторы Ш-Ιβ превращающего фермента (например, Ух740), анти-Р7§, ΡδΟΡ, ингибиторы ТАСЕ, ингибиторы Т-клеточного сигналинга, такие как ингибиторы киназы, ингибиторы металлпротеиназы, сульфазалин, азатлоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные, как описано в настоящей заявке, противовоспалительные цитокины (например, 1Ь-4, 1Ъ-10, 1Ъ-13 и ТСР).

В некоторых вариантах реализации второй агент можно применять для лечения одного или более симптомов или поражающих факторов РС. Такие агенты включают, например, амантадин, баклофен, папаверин, меклизин, гидроксизин, сульфометоксазон, ципрофлоксацин, докузат, пемолин, дантролен, десмопрессин, дексаметазон, толтеродин, фенитоин, оксибутинин, бисакодил, велафаксин, амитриптилин, метенамин, клоназепам, изоцианид, варденафил, нитрофурантоин, гидрофильный муциллоид псиллиума, альпростадил, габапентин, нортриптилин, пароксетин, пропантелин бромид, модафинил, флуоксетин, фенозапиридин, метилпреднизолон, карбамазепин, имипрамин, диазепам, силденафил, бупропион и сертралин. Многие вторые агенты, являющиеся небольшими молекулами, имеют молекулярный вес от 150 до 5000 Да.

Примеры антагонистов ФНО включают химерные, гуманизированные антитела человека, или антитела, созданные ίη νίίΓΟ (или их антиген-связывающие фрагменты) к ФНО (например, ТОТа человека), такие как Ό2Ε7, (антитело ТЫРа человека, патент США № 6258562; ВАδР), СЭР-571/СПР-870/ВА¥-103356 (гуманизированное анти-ТОТа антитело; СеШесЬ/РЬаттааа), сА2 (химерное анти-ТОТа антитело; КЕМ1САПЕ™, СеШосот); фрагменты анти-ТОТ¹ антитела (например, СРЭ870); растворимые фрагменты рецепторов ТОТ¹, например, р55 или р75 рецепторы ТОТ¹ человека, или их производные, например, 75 кДТОТ'КЧдС (75 кЭ ТОТ¹ белок слияния-рецептор-1дС, ΕΝΒΚΕΡ™; 1ттипех; см., например, АгИтЮ & КкеитаШт (1994) Уо1. 37, δ295; 1. 1жс81. Мей. (1996) Уо1. 44, 235А), р55 каТ№К-1§С (55 кО ТОТ¹ белок слияния-рецептор-1дС (ЕЕНЕРСЕРТ™)); антагонисты ферментов, например, ингибиторы ТОТа превращающего фермента (ТАСЕ) (например, производное альфа-сульфонилгидроксамовой кислоты, АО 01/55112, и ингибитор Ν-гидрокси-форамида ТАСЕ СА 3333, -005, или -022); и ТОТ'-Ър/к-ТОТ'К (растворимый ТЯТ-связывающий белок; см., например, АтйтШк & КЬеитаШт (1996) Уо1. 39, Νο. 9 (8ирр1етеп1), δ284; Атег. 1. РЬу8ю1. - НеаЧ апй СйсиЫогу РЬу8ю1оду (1995) Уо1. 268, рр. 37-42).

В дополнение ко второму агенту, возможно доставлять в организм пациента другие агенты. Однако, в некоторых вариантах реализации пациенту в форме фармацевтической композиции не вводят никакого белка или биологически активного вещества, кроме УРА-4-связывающего антитела и второго агента. УРА-4-связывающее антитело и второй агент могут быть единственными агентами, которые вводят с инъекцией. В вариантах реализации, в которых УРА-4-связывающее антитело и второй агент являются рекомбинантными белками, УРА-4-связывающее антитело и второй агент могут быть единственными рекомбинантными агентами, которые вводят пациенту, или, по меньшей мере, единственными рекомбинантными агентами, модулирующими иммунный или воспалительный ответ. В других вариантах реализации УРА-4-связывающее антитело является единственным рекомбинантным агентом или единственным биологически активным веществом, которое вводят пациенту.

Все ссылки и публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки. Приведенные ниже примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом.

- 25 020456

Примеры

Пример 1.

Краткое описание разработки композиции для внутривенного введения: хранение и структурная стабильность

Для определения стабильности свойств лекарственной формы натализумаба, содержащей 20 мг/мл натализумаба в 10 мМ фосфата, 140 мМ хлорида натрия, 0,02% полисорбата-80, рН 6, при хранении проводили эксперименты. Степени изменений стабильности в процессе хранения лекарственной формы подсчитывали для разных совокупностей данных по условиям хранения (2-8°С в течение 24 мес.; 25°С в течение 12 мес.; 40°С в течение 3 мес.). Для исследования степени изменения стабильности относительно начального момента времени использовали следующие параметры: процент агрегации, процент окисления аминокислотного остатка метионина 255, процент присутствующего половинного антитела, процент Н+Ь, процент фрагментации, процент сиалирования и процент изоформ с низкой изоэлектрической точкой (р1). Результаты экспериментов по исследованию стабильности свойств лекарственной формы при хранении приведены в табл. 2. Эти результаты также обеспечивают базу для исследования стабильности композиций, содержащих высокие концентрации антител.

Таблица 2. Композиция 20 мг/мл: стабильность при хранении

Характерно-	Влияние параметра	Изменение	Степень изменения в
тика	композиции на	В	процессе хранения
	деградант	процессе
		хранения	2-8¾1	2 5°С‘	4 0”С!
% Агрегации	-рН 6 оптимум	Повышение	М/С	-0,1% в год	-0, 3% в месяц
% Мес255	Оптимизирован	Повышение	Ν/С	Ν/С	~0, 4-

окисления	уменьшением уровней пероксида				1% в месяц
% Половинных антител	-рН 5-6 оптимум, зависит от вспомогательного вещества	Повышение	Ν/С	Ν/С	-1% в месяц
% Н + Ь	-рН 5-6,5 оптимум	Повышение	Ν/С	Ν/С	-1,5% месяц
Фрагментации	~рН 5-6,5 оптимум	Снижение	Ν/С	Ν/С	-1% в месяц
Сиалирования	рН 5-6 оптимум (предсказанный)	Снижение	Ν/С	Ν/С	Ν/ϋ
% Изоформ с низкой р!	-рН 5 оптимум	Повышение	-1¾ в год	-1,8%/ месяц	-14% в месяц

'Степени, подсчитанные при использовании данных в реальном времени в течение 24 мес. ²Степени, подсчитанные при использовании данных в реальном времени в течение 12 мес. ³Степени, подсчитанные при использовании данных в реальном времени в течение 3 мес. МС - без изменений, N/0 - не определено.

Для исследования структурной стабильности лекарственной формы натализумаба использовали различные биофизические методы, включая мониторинг вторичной структуры белка посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), мониторинг окружения триптофановых остатков посредством триптофановой флюоресценции при помощи флюоресцентного спектрофотометра, мониторинг третичной структуры 1§С укладки при помощи кругового дихроизма в дальней области УФ и мониторинг окружения ароматических остатков через УФ и видимую спектрофотометрию.

Структурную стабильность 20 мг/мл композиции оптимизировали, частично, при помощи мониторинга Т_т (средняя точка температурной кривой плавления) в ходе экспериментов по термальному плавлению в дифференциальном сканирующем калориметре (М1сгоса1, АтЬегз!, МА). Избыточную энтальпию, требуемую для плавления белка против буферного контроля, измеряли, и данные анализировали на компьютере. Триптофановую флюоресценцию, как известно, чувствительную к структурной стабильности, измеряли при помощи УФ-спектрофотометрии при возрастающих значениях температур для оптимизации параметров композиции. Еще раз УФ-спектрофотометрию применяли в дальнем УФ для оценки укладки 1§С. Зарегистрировали шесть пиков, второе производное УФ-У15 спектра при 230-320 нм рассчитывали для контроля за окружением ароматических остатков как мерой структурной стабильности различных композиций.

Результаты исследований структуры для исследования стабильности натализумаба в концентрации 20 мг/мл приведены в табл. 3. Дополнительные исследования показали, что натализумаб проходит стадию гетерогенной нуклеации при накачивании поршневыми насосами. После множественных циклов замерзания/оттаивания не наблюдали никаких изменений качества антитела, и антитело было стабильно после перемешивания в ампулах длительностью в 2-3 дня (данные приведены в примере 2). Натализумаб

- 26 020456 подвергается агрегации, окислению и дезаминированию под воздействием интенсивного света, а также чувствительно к катализируемому металлом окислению при хранении в контакте с нержавеющей сталью в течение длительного периода времени.

Таблица 3. 20 мг/мл композиция: структурная стабильность

Характеристика Молекулы	Метод	Оптимальные условия для композиции
Вторичная структура	Дек	Оптимальный рН между 7 и 8 (базируясь на Тщ при 68°С)
Триптофановое окружение	Флюоресценция	рН-7 (базируясь на самой высокой начальной Температуре при рН 4-9)
Укладка 1дС	КД в дальнем УФ	Мониторинг 215-218 нм, максимум Έ при рН 7 при отсутствии соли
Окружение ароматических остатков	2ое производное υν-νί3 ликов	Зарегистрировали 6 ликов, максимальное при рН между 5 и 7

Пример 2.

Эксперименты по повышенной стабильности композиций 150 мг/мл

Для определения композиции, подходящей для более высоких концентраций натализумаба, который был бы пригоден для подкожного и внутримышечного введения, в особенности, проводили эксперименты по повышенной стабильности с 150 мг/мл натализумаба в различных композициях. Тестируемые композиции подвергали перемешиванию в стеклянных пробирках υδΡ/ЕР I типа, в течение нескольких дней при температуре окружающей среды (приблизительно 25°С). Композиции, используемые в исследовании агрегации, были следующими. НСЫ=20 мМ гистидина, 240 мМ глицина, рН 6. НОЬ=20 мМ гистидина, 240 мМ глицерола, рН 6. РСЫ=20 мМ фосфата, 240 мМ глицина, рН 6. Р§Т=20 мМ фосфата, 140 мМ ЫаС1, рН 6. В композициях НОЬ и НСЫ присутствовал дополнительно 0,04% (в/о) полисорбат-80 (в/о). В композициях РСЫ и Р8Т присутствовал дополнительно 0,02% (в/о) полисорбат-80, за исключением эксперимента, когда его тестировали в качестве переменной на стабильность (эксперимент 3 ниже). Гель-хроматографию (8ЕС) применяли для измерения процента агрегации до и после перемешивания.

Уровни растворимых агрегатов до и после агрегации представлены на фиг. 1. Процентное содержание растворимых агрегатов измеряли при помощи §ЕС, и наименьшее изменение процентного содержания растворимых агрегатов наблюдали в композиции НОЬ (20 мМ гистидин, 240 мМ глицерол, 0,04% (в/о) полисорбат-80, рН 6).

Тесты на повышенную стабильность, проводимые описанным выше способом, также исследовали на поглощение УФ для обнаружения агрегатов. Для исследования на присутствие агрегатов до и после перемешивания использовали УФ-спектрофотометр, измеряя поглощение при 340 нм для растворов натализумаба в концентрации 150 мг/мл в НСЫ, НОЬ, РСЫ и Р8Т буферах, как описано выше, на УФ/У18 спектрофотометре с длиной линий 1 см.

Результаты изучения агрегации натализумаба (150 мг/мл) в экспериментах по поглощению для различных композиций до и после перемешивания можно увидеть фиг. 2. Композиции с гистидином (НОЬ и НСЫ) были более стабильны при этих условиях, что очевидно из более низкого поглощения при 340 нм, свидетельствующего о более низкой агрегации. Нерастворимые осадки наблюдали в фосфатных композициях после хранения в течение 1 мес. при 40°С, но не наблюдали в гистидиновых композициях.

Табл. 4 содержит характеристики стабильности композиций 20 и 150 мг/мл. Результаты свидетельствуют о примерно одинаковой стабильности композиций 20 и 150 мг/мл.

Таблица 4. Характеристики стабильности в концентрации 20 и 150 мг/мл

Характеристика	Средний уровень изменений, 5° С, за год
20 мг/мл	150 мг/мл
Агрегация, измеренная ЗЕС	<0, 5%	<0, 5%
Кислотные изоформы	~1%	-1*
Окисление	<0, 5%	<0, 5%
Чистота (%Н+Ь)	<-0,5%	<-0,5%
Активность	Без изменений	Без изменений

Пример 3.

Полисорбат-80 оказывает солюбелизирующее действие на натализумаб

Изучали солюбелизирующее действие уровней полисорбата-80 на натализумаб в концентрации 20 и 150 мг/мл. Полисорбат-80 добавляли в различных концентрациях (в/о) к 20 и 150 мг/мл натализумаба в буфере НОЬ. Тестирование повышенной стабильности осуществляли путем перемешивания веществ, как описано выше, в течение 8 нед. при 40°С. Процент агрегации измеряли при помощи §ЕС, как описано в

- 27 020456 приведенном выше примере.

Влияние уровней полисорбата-80 на стабильность натализумаба в ходе перемешивания приведено на фиг. 3, на которой показаны данные для натализумаба в концентрации 135-165 мг/мл. Минимальный уровень стабильности полисорбата-80 в ходе экспериментов с перемешиванием равен приблизительно 0,03% (в/о) для 150 мг/мл натализумаба и 0,02% (в/о) для 20 мг/мл натализумаба. Таким образом, предпочтительная концентрация полисорбата-80 варьируется в соответствии с концентрацией антитела.

Пример 4.

Длительное хранение натализумаба при разной температуре

Стабильность 150 мг/мл натализумаба в разных композициях и при температуре 2-8°С, и при 40°С анализировали путем измерения процента агрегации, при помощи гель-хромотографии, как описано в примере 2 выше. Натализумаб (150 мг/мл) находился в буферах НСЫ, НОЬ, РСЫ или ΡδΤ, как описано в примере 2 выше. Данные для натализумаба, хранимого при 40°С, собирали в течение 5 мес.; для натализумаба, хранимого при 2-8°С, собирали в течение 24 мес.

Результаты по эффектам стабильности различных композиций натализумаба (150 мг/мл) при хранении при 40°С приведены на фиг. 4; результаты для хранения при 2-8°С приведены на фиг. 5. В концентрации 150 мг/мл натализумаб в ΡδΤ композиции (20 мМ фосфат, 140 мМ ЫаС1, 0,02% (в/о) полисорбат80, рН 6) меньше всего агрегировал при 40°С. В процессе хранения антитела при 2-8°С в течение 24 мес. не наблюдали значительных различий в агрегации. Эти данные показывают, что высококонцентрированное антитело натализумаб в ΡδΤ лекарственной композиции чрезвычайно стабильно.

Пример 5.

Окисление метионина в натализумабе снижалось в фосфатных композициях

Склонность метиониновых остатков к окислению в различных композициях натализумаба (150 мг/мл) и защитные эффекты свободного метионина (10 мМ) изучали при помощи УФ-ВЭЖХ исследования епбоЬукС пептидных карт. Натализумаб (150 мг/мл) хранили при 2-8°С и при 40°С в течение и более 24 мес. в композициях с гистидинов и фосфатом (НОЬ, НСЫ, ΡδΤ, и РСЫ, как описано в примере 2). Результаты, выраженные через процент окисленных остатков метионина, приведены на фиг. 6. Для фосфатных композиций окисление метиониновых остатков в натализумабе в концентрации 150 мг/мл было значительно снижено и происходило в меньшей степени как при 2-8°С, так и при 40°С, в сравнении с гистидиновыми композициями.

Анти-окислительные эффекты избыточного свободного метианина (Ь-те!) в гистидиновых композициях, таких как НОЬ, наблюдали в сравнении с композициями, содержащими натализумаб (150 мг/мл) без метионина, хранимых при 40°С в течение периода в 6 мес. (фиг. 7). Количественный анализ процента окисления метиониновых остатков проводили указанным выше способом. Таким образом, помещение натализумаба в концентрации 150 мг/мл в композициях фосфатных буферов имело больший защитный эффект против окисления метиониновых остатков и снижало количество вспомогательных веществ, требуемых для стабильности в концентрации 150 мг/мл.

Пример 6.

Степень фрагментации в гистидиновых буферах выше, чем в фосфатных буферах

Степень фрагментации натализумаба (20, 50, 75 и 150 мг/мл) в различных композициях (НОЬ: 20 мМ гистидина, 240 мМ глицерола, 0,04% (в/о) полисорбата-80, рН 6 и ΡδΤ: 20 мМ фосфата, 140 мМ ЫаС1, 0,02% (в/о) полисорбата-80, рН 6) сравнивали в течение 8 нед. Количественный анализ фрагментации проводили путем измерения процентного содержания половинных антител нередуцирующим Ое1СЫр капиллярным электрофорезом.

Результаты исследований фрагментации, в которых измеряли процентное содержание половинных антител в зависимости от времени для натализумаба в четырех различных концентрациях (20, 50, 75 и 150 мг/мл) и в двух разных композициях (НОЬ: 20 мМ гистидина, 240 мМ глицерола, 0,04% (в/о) полисорбата-80, рН 6; и ΡδΤ: 20 мМ фосфата, 140 мМ ЫаС1, 0,02% (в/о) полисорбат-80, рН 6), приведены на фиг. 8. Степень расщепления в шарнирных областях ниже в фосфатных композициях, чем в гистидиновых композициях. Окружение гистидиновой композиции обладало большим восстановительным потенциалом, чем окружение фосфатной композиции (базируясь на окислительно-восстановительном потенциале).

Пример 7.

Примеры композиций, содержащих натализумаб, подходящих для подкожного или внутримышечного введения

В свете приведенных выше экспериментов фосфатные композиции определили как оптимальные для высококонцентрированных композиций, содержащих натализумаб, подходящих для ПК или ВМ введения. Композиции также можно разводить и применять для ВВ введения. Эксперименты, приведенные выше, свидетельствуют, что натализумаб менее чувствителен к окислению при хранении в фосфатных композициях, таких как ΡδΤ и ΡСN, чем при хранении в гистидиновых композициях, НОЬ и НСЫ. Поэтому свободного метионина не требуется в фосфатных композициях для предотвращения окисления натализумаба (см. пример 5). Также наблюдали, что степень фрагментации натализумаба в композиции с

- 28 020456 фосфатом Р8Т была ниже, чем в композиции с гистидином НОЬ (см. пример 6). Стабильность при длительном хранении была выше в фосфатных композициях Р8Т и РСЫ, чем в гистидиновых композициях НОЬ и НСЫ.

В некоторых вариантах реализации содержание каждого из компонентов композиций, представленных ниже, может варьироваться до 10%.

Пример 8.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ натрий-фосфатного буфера

140 мМ хлорида натрия

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 9.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ натрий-фосфатного буфера

275 мМ глицерола

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 10.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ натрий-фосфатного буфера

160 мМ Ь-аргинина гидрохлорида

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 11.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ натрий-фосфатного буфера

9% (в/о) сахарозы

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 12.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ натрий-фосфатного буфера

9% (в/о) сорбитола

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 13.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ Ь-гистидина

240 мМ глицерола мМ Ь-метионина

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 14.

Пример композиции

150 мг/мл натализумаба мМ Ь-гистидина

240 мМ глицерола

0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до рН 6,0±0,5 Пример 15.

Данные о стабильности

Лекарственную композицию, представленную выше в качестве примера 8, хранили в шприце со встроенной иглой, и данные о стабильности снимали в разные моменты времени. Эти данные суммированы в табл., приведенных ниже, и из них следует, что композиция при хранении в шприце при 5°С стабильна в течение периода по меньшей мере от 18 до 24 мес.

- 29 020456

Композиция

150 мг/мл натализумаба 10 мМ натрий-фосфатного буфера 140 мМ хлорида натрия 0,04% (в/о) полисорбата-80 рН, доведенный до 6,0±0,5

Агрегаты

Бремя, месяцы	% агрегатов в процессе хранения при 5°С
0	0, 7
1	0,7
2	0,7
3	0,7
6	0,8
8	0, 9
12	1,0
18	1,1

Активность

Время,	Относительная
месяцы	активность при 25°С
0	100
8	• 101
12	97

Изоформы с низкой р1

Время,	% изоформ с низкой р! в
месяцы	процессе хранения при 5°С
0	15,2
1	15, 4
2	15, 1
3	15, 6
6	13,5
8	13,3

Г 15,0

Чистота (% тяжелых+легких цепей)

Время, месяцы	% Н + Ь в процессе хранения при 5°С
0	100
1	100
2	100
3	100
8	98, 8
12	100

Было описано несколько вариантов реализации изобретения. Тем не менее следует понимать, что возможно создание различных модификаций без выхода за пределы и объем изобретения. Соответственно, другие варианты реализации находятся в пределах следующей ниже формулы.

- 30 020456

Список последовательностей <110> ΒΙΟΰΕΝ ГОЕС МА IN0.

< 1 2 0 > КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛО <130> В204 7-7051140 <140>

<141>

<150> 60/944,076 <151> 2007-06-14 <160 2 <170> РаЬепЫп Уег. 3.3 <210 1 <210 213 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности конструкция <400 1

Азр Не С1п Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег ьеи Зег 1 5 10

Синтетическая

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Ьуз ТЬг Зег С1п Азр

МеЬ А1а Тгр Туг С1п С1п ТЬг Рго С1у Ьу5 А1а Рго

Наз Туг ТЬг Зег А1а Ьеи С1п Рго СЬу 11е Рго Зег 50 55 60

А1а Зег Уа1 О1у 15

Не Азп Ьуз Туг 30

Агд Ьеи Ьеи 11е 45

Агд РЬе Зег С1у

Зег С1у Зег 01у Агд Азр Туг ТЬг РЬе ТЬг 11е Зег

С1и Азр Не А1а ТЬг Туг Туг Суэ Ьеи С1п Туг Азр 35 90

РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд ТЬг

100

105

Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи

115

120

А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Ргс

Зег Ьеи С1п Рго 80

А5Л Ьеи Тгр ТЬг 95

Уа1 А1а А1а Рго

110

Ьуз Зег С1у ТЬг

125

Агд О1и А1а Ьуз

130

135

140

Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег С1у

145

150

155

Зег Уа1 ТЬг С1и 01п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг 165 170

ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг 01и Ьуз Нгз

180

185

Азп Зес С1п С1и 160

Зег Ьеи Зег Зег 175

Ьуз Уа1 Туг А1а 190

- 31 020456

Суз С1и Уа1 ТЬг Н13 С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Пуз Зег РЬе 195 200 205

Азп Агд С1у С1и Суз 210 <2Ю> 2 <211> 450 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая конструция <400 2

С1п Уа1 С1п Пей Уа1 С1л Зег С1у

5

Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а

Туг 11е Нхз Тгр νβΐ Агд С1п А1а 25 40

С1у Агд Не Азр Рго А1а Азп С1у 50 55

С1п С1у Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг А1а 65 70

МеЬ С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег 85

А1а Агд С1и С1у Туг Туг С1у Азп

100

Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг

115 120

Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго 130 135

ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 145 150

ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 51у А1а 165

Рго А1а Уа1 Ьеи С1п 5ег Зег С1у 180

ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у 195 200

Азр Низ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз 210 215

Туг С1у Рго Рго Суз Рго Зег Суз 225 230

Рго Зег νδΐ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго 245

А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а 10 15

Зег С1у РЬе Азп Не Ьуз Азр ТЬг 25 30

Рго С1у С1п Агд Ьеи С1и Тгр МеЬ

Туг ТЬг Ьуз Туг Азр Рго Ьуз РЬе

Азр ТЬг Зег А1а Зег ТЬг А1а Туг 75 80

С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 90 95

Туг С1у Уа1 Туг А1а МеЬ Азр Туг

105 НО

Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у 125

Суз 5ег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег 140

Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 155 160

Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Нхз ТЬг РЬе ПО П5

Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 185 190

ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1

205

Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз

220

Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи С1у С1у 235 240

Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС Не 250 255

- 32 020456

Зег

Агд

ТЬг

Рго 260

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1 265

Уа1

УаЬ

Азр

Уа1

Зег 270

С1п

С1и

АЗр

Рго

С1и

Уа1

С1п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

ΗΪ5

275

280

265

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

290

295

300

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

ΗΪ5

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

305

310

315

320

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

С1у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Не

С1и

325

330

335

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1 п

Уа1

Туг

340

345

350

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

С1п

С1и

31и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

355

360

365

ТЬг

Суз

ьеи

νοί

Ьуз

С1 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

370

375

380

С1и

Зег

АЗП

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

385

390

395

400

ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

405

410

415

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1 п

С1и

С1 у

А5П

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа 1

МеЬ

Н1з

420

425

430

□ 1и

А1а

Ьеи

Паз

Азп

Η Ϊ5

Туи

ГЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

435

440

445

С1у

Ьуз

450

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (12)

1. Фармацевтическая композиция на водной основе, составленная для подкожной или внутримышечной доставки, где композиция содержит связывающееся с УЬА-4 антитело в концентрации от примерно 120 до примерно 190 мг/мл, натрий-фосфатный буфер в количестве примерно 1-100 мМ, хлорид натрия в количестве примерно 50-200 мМ и полисорбат-80 в количестве примерно 0,01-0,12%.

2. Композиция по п.1, где связывающееся с УЬА-4 антитело представляет собой натализумаб или его вариант, где указанный вариант включает (ί) вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от вариабельной области легкой цепи натализумаб на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков, и/или (ίί) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от вариабельной области тяжелой цепи натализумаба на один или более аминокислотных остатков, но не более чем на два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных остатков.

3. Композиция по любому из пп.1 или 2, где композиция имеет рН от примерно 5,5 до примерно 6,5.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где композиция содержит 10 мМ натрий-фосфатного буфера.

5. Композиция по любому из пп.1-3, где композиция содержит 140 мМ хлорида натрия.

6. Композиция по любому из пп.1-3, где полисорбат-80 содержится в количестве от примерно 0,02 до примерно 0,04% (мас./об.).

7. Фармацевтическая композиция на водной основе, составленная для подкожной или внутримышечной доставки, где композиция содержит связывающееся с УЬА-4 антитело в концентрации от примерно 120 до примерно 190 мг/мл, буфер на основе фосфата натрия в концентрации примерно от 1 до 100 мМ, хлорид натрия в концентрации примерно от 50 до 200 мМ и полисорбат в количестве примерно от 0,001 до 2,0% (мас./об.), при этом рН указанной композиции составляет 6±1.

8. Композиция по любому из пп.1-7, где композиция является стабильной в течение по меньшей мере 18 мес. при температуре от примерно 2 до примерно 8°С.

9. Способ получения фармацевтической композиции на водной основе в соответствии с любым из пп.1-8, где указанный способ включает:

(ί) экспрессию указанного антитела в клеточной культуре;

(ίί) пропускание указанного антитела через по меньшей мере одну стадию хроматографической очистки;

(ίίί) пропускание указанного антитела через по меньшей мере две стадии ультрафильтрации/диафильтрации в фосфатном буфере;

(ίν) доведение концентрации указанного антитела до 120-190 мг/мл путем добавления полисорбата и фосфатного буфера.

- 33 020456

10. Способ лечения пациента с воспалительными заболеваниями, где способ включает подкожное или внутримышечное введение композиции согласно любому из пп.1-8.

11. Способ по п. 10, где воспалительным заболеванием является рассеянный склероз.

12. Способ по п.10, где воспалительным заболеванием является кишечное воспалительное заболевание.