EA018472B1 - Erythropoietin-containing particles for treatment and prophylaxis of neurologic and hematologic diseases and disorders - Google Patents
Erythropoietin-containing particles for treatment and prophylaxis of neurologic and hematologic diseases and disorders Download PDFInfo
- Publication number
- EA018472B1 EA018472B1 EA201001589A EA201001589A EA018472B1 EA 018472 B1 EA018472 B1 EA 018472B1 EA 201001589 A EA201001589 A EA 201001589A EA 201001589 A EA201001589 A EA 201001589A EA 018472 B1 EA018472 B1 EA 018472B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- particles according
- rats
- erythropoietin
- treatment
- disorders
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к новой иммобилизованной форме эритропоэтина, а именно его наносомальной/микросомальной форме, которая может быть использована для создания принципиально новых лекарственных средств, предпочтительно для лечения и профилактики неврологических и гематологических заболеваний.The invention relates to pharmacology and medicine, specifically to the new immobilized form of erythropoietin, namely, its nanosomal / microsomal form, which can be used to create innovative drugs, preferably for the treatment and prevention of neurological and hematological diseases.
Уровень техникиThe level of technology
Человеческий эритропоэтин (ЭПО) представляет собой состоящий из 165 аминокислот гликопротеин, который продуцируется почкой и является гуморальным плазменным фактором, стимулирующим образование эритроцитов (Сато! Р. и ИеДапбте С., С.К. Асаб. 8с1. 143: 432 (1906); Етз1еу А.Е, В1ооб 8: 349 (1953); Ке188шапп К.К., В1ооб 5: 372 (1950); 1асоЬ8ОИ Ь.О., Со1бтеа88ег Е., Ете1б к. и Ρί/ак Ь.Е., №1Шге 179: 6331-6334 (1957)).Human erythropoietin (EPO) is a 165-amino acid glycoprotein that is produced by the kidney and is a humoral plasma factor that stimulates the formation of red blood cells (Sato! R. and IeDapbte S., S.K. Asab. 8c1. 143: 432 (1906); Etzleeu, A.E., Blind 8: 349 (1953); Ke188shapp KK, Blind 5: 372 (1950); 1cass8OI L.O., Co1bteasheg E., Ettab1b., And Ρί / ak L.E., No. 1SG 179: 6331-6334 (1957)).
Человеческий ЭПО стимулирует деление и дифференцировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге и проявляет свою биологическую активность посредством связывания с рецепторами на эритоидных предшественниках (ΚΐηηΙζ В.8. (1991), В1ооб 77: 419).Human EPO stimulates the division and differentiation of committed erythroid progenitors in the bone marrow and exerts its biological activity by binding to receptors on erythroid progenitors (ΚΐηηΙζ B.8. (1991), B1oo 77: 419).
Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин представляет собой присутствующий в плазме в низких концентрациях кислый гликопротеин, стимулирующий восполнение эритроцитов, которые погибают в процессе старения.The naturally occurring human erythropoietin is an acidic glycoprotein present in plasma at low concentrations that stimulates the replacement of red blood cells that die in the process of aging.
Поскольку человеческий эритропоэтин играет ключевую роль в образовании эритроцитов, этот гормон прежде всего может применяться при лечении заболеваний крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов.Since human erythropoietin plays a key role in the formation of red blood cells, this hormone can be used primarily in the treatment of blood diseases, which are characterized by low production or production of abnormal red blood cells.
В клинических условиях ЭПО применяют, например, для лечения анемии у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (ЕзсйЬасй Ек., Едп ЕС., Иотепшд М.К. и др., ΝΕ1Μ 316: 73-78 (1987); ЕзсйЬасй Ек., АЬбиШаб1 М.Н., Вготепе ЕК. и др., Апп. 1п1егп. Меб. 111: 992 (1988); Едпе ЕС., ЕзсйЬасй Ек., Мсбште Т., Абашзоп Ек., К1бпеу 1п!1. 33: 262 (1988); Ыш У.8., Иедотеш К.Ь., 2ауа1а И. и др., Апп. 1п!егп. Меб. 110: 108-114 (1989)), страдающих СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии (Иаппа К.Р., Кибшск 8.А., АЬе1з Κ.Ι в М.В. Сагшск (ред.). Егу1йторо1еДп ш Сйшса1 Арр11сабоп Ап 1п1егпабопа1 Ретзресбуе, №те Уотк, ΝΥ: Магсе1 Иеккет; 1990: с. 301-324).In clinical settings, EPO is used, for example, for the treatment of anemia in patients with chronic renal failure (CRF) (Ezsybas Ek., Epp EU., Iotepshd MK, et al., ΝΕ1Μ 316: 73-78 (1987); Ezsyby Ek ., ABNShab1 M.N., Vgotepe EC, etc., App. 1n1, Meb. 111: 992 (1988); Edpe EC., Ezsiaby Ek., Msbshte T., Abashzop Ek., K1bpeu 1n! 1. 33 : 262 (1988); UW U.8., Iedotesh K., L., A.I., et al., App. 1n! Erb. Meb. 110: 108-114 (1989), suffering from AIDS and cancer patients undergoing Chemotherapy (Iappa KR, Kibshsk 8.A., Abelts Κ.Ι in M.V. Sagshsk (ed.). Eugortotropyx Synsa1 Arr11sabop An Apneurus Retzresbue, № those Watk, ΝΥ: Magse1 Iekket; 1990: p. 301-324).
Перспективно, но практически не изучено и не внедрено применение ЭПО в неврологии при геморрагических, гипоксических, травматических, аутоиммунных и токсических повреждениях нервной системы, субарахноидальном кровотечении (разрыв церебральной аневризмы), травме головного мозга, травме спинного мозга, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянном склерозе, депрессии, неврозах, нейрокогнитивном дефиците, нарушениях памяти, синдроме дефицита внимания, вегетососудистой дистонии, биполярных нарушениях, коматозных состояниях, ВИЧ-ассоциированной нейропатии, нейропатии, ассоциированной с химиотерапией, атаксии Фридриха, неврологических нарушениях при сепсисе, множественной травме, оксидативном стрессе, асфиксии, геморрагических и гипоксических повреждений мозга при недоношенности, при хирургическом лечении врожденных пороков (неонатальной хирургии), при хирургических вмешательствах с экстракорпоральным (искусственным) кровообращением, ВИЧ-ассоциированной нейропатии.Promising, but it has hardly been studied and implemented the use of EPO in neurology haemorrhagic, hypoxic, traumatic, autoimmune and toxic damages of the nervous system, subarachnoid hemorrhage (rupture of cerebral aneurysms), brain injury, spinal cord injury, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, diffuse sclerosis, depression, neurosis, neurocognitive deficit, memory disorders, attention deficit disorder, vascular dystonia, bipolar disorders, comatose states, HIV-ac sociated neuropathy, chemotherapy-associated neuropathy, Frederick's ataxia, neurological disorders in sepsis, multiple trauma, oxidative stress, asphyxia, hemorrhagic and hypoxic brain damage in prematurity, in the surgical treatment of congenital malformations (neonatal surgery), in surgical interventions, in case of prematurity, in the surgical treatment of congenital malformations (neonatal surgery), in surgical intervention a) blood circulation, HIV-associated neuropathy.
Эритропоэтин может также быть использован для лечения и/или профилактики нарушений зрения, ретинопатии при недоношенности, для повышения периферической иннервации, для антиноцицептивного эффекта при ВИЧ-ассоциированной нейропатии, для лечения стресса, аллопеции, эректильной дисфункции, хронической усталости, для повышения обучаемости, физической выносливости.Erythropoietin can also be used to treat and / or prevent visual impairment, retinopathy in case of prematurity, to increase peripheral innervation, to antinociceptive effect on HIV-associated neuropathy, to treat stress, alopecia, erectile dysfunction, chronic fatigue, to increase learning, physical endurance .
Однако биологическая доступность поступающих в продажу терапевтических средств на основе протеинов, таких как ЭПО, ограничена их коротким временем полужизни в плазме и чувствительностью к разложению протеазами. Эти недостатки препятствуют проявлению их максимальной потенциальной активности в клинических условиях, что заставляет искать способы изменения свойств нативного эритропоэтина, например путем его химического связывания с природными или синтетическими полимерами (см., например, патент Мерк 2370276, патент и заявку Хоффманн ля Рош на модифицированный эритропоэтин КИ 2232163, КИ 2008116309 - химически модифицированная форма эритропоэтина для лечения гематологических и неврологических нарушений соответственно).However, the bioavailability of commercially available protein-based therapeutics, such as EPO, is limited by their short plasma half-life and sensitivity to degradation by proteases. These shortcomings prevent the manifestation of their maximum potential activity in clinical conditions, which makes it necessary to look for ways to change the properties of native erythropoietin, for example, by chemically linking it with natural or synthetic polymers (see, for example, Merck patent 2370276, Hoffmann’s certificate of Roche for modified erythropoietin CI 2232163, CI 2008116309 - a chemically modified form of erythropoietin for the treatment of hematological and neurological disorders, respectively).
Принципиальным отличием технических решений Хоффман ля Рош является то, что химическая модификация эритропоэтина может приводить к снижению эффективности его доставки, в частности в преодолении гематоэнцефалического барьера. Кроме того, такая модификация может сказаться на активности самой лекарственной субстанции, в результате чего такая форма может оказаться неэффективной в отношении ряда патологий или нарушений.The principal difference in technical solutions of Hoffman la Roche is that chemical modification of erythropoietin can lead to a decrease in the efficiency of its delivery, in particular in overcoming the blood-brain barrier. In addition, such a modification may affect the activity of the drug substance itself, as a result of which this form may be ineffective against a number of pathologies or disorders.
Недостаточная изученность механизмов действия химически модифицированного эритропоэтина для той или иной гематологической или неврологической патологии, настоятельная потребность в создании более эффективных лекарственных форм эритропоэтина, делает поиск и разработку принципиально других его иммобилизованных форм актуальной задачей. Достаточно привести данные ВОЗ относительно потребности рынка только в препаратах, влияющих на центральную нервную систему, которая составляет 35 миллиардов долларов США в год.Insufficient study of the mechanisms of action of chemically modified erythropoietin for a particular hematological or neurological pathology, the urgent need to create more effective dosage forms of erythropoietin makes the search and development of fundamentally other of its immobilized forms an urgent task. It is enough to cite WHO data on the market demand only for drugs that affect the central nervous system, which is $ 35 billion per year.
Таким образом, изобретательской задачей было создание новой иммобилизованной формы эритроThus, the inventive task was to create a new immobilized form of erythro
- 1 018472 поэтина с использованием принципиально нового подхода - физической модификации эритропоэтина для повышения эффективности биологического действия по сравнениию с нативным эритропоэтином.- 1 018472 poetin using a fundamentally new approach - the physical modification of erythropoietin to increase the effectiveness of biological action compared with native erythropoietin.
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Неожиданно заявителем было обнаружено, что эритропоэтин (ЭПО), рекомбинантный человеческий или модифицированный эритропоэтин альфа, или его аналог, инкапсулированный в наночастицы и/или микрочастицы из фармацевтически пригодных, биодеградируемых (со)полимер(ов) и/или полимерных матриц, и/или сорбированный и/или адсорбированный на их поверхности, и/или инкапсулированный в липосомы, при снижении общей дозы препарата по сравнению с его нативной формой на общепринятых биологических моделях проявил больший терапевтический эффект. Заявителем обнаружен ранее не описанный эффект преодоления гематоэнцефалического барьера наночастицами с физической иммобилизацией эритропоэтина и избирательного повышения концентрации ЭПО в центральной нервной системе. Использование эффекта физической модификации ЭПО также позволяет избирательно повышать концентрацию ЭПО в других органах и тканях за счет подбора размера и состава наночастиц.Unexpectedly, the applicant has found that erythropoietin (EPO), recombinant human or modified erythropoietin alpha, or its analog encapsulated in nanoparticles and / or microparticles from pharmaceutically acceptable, biodegradable (co) polymer (s) and / or polymer matrices, and / or sorbed and / or adsorbed on their surface, and / or encapsulated in liposomes, while reducing the total dose of the drug compared to its native form in conventional biological models showed a greater therapeutic effect. The applicant discovered a previously undescribed effect of overcoming the blood-brain barrier by nanoparticles with the physical immobilization of erythropoietin and a selective increase in the concentration of EPO in the central nervous system. Using the effect of physical modification of EPO also allows you to selectively increase the concentration of EPO in other organs and tissues due to the selection of the size and composition of nanoparticles.
Это позволяет рассчитывать, что лекарственные препараты на основе предлагаемой формы эритропоэтина окажутся более эффективными для ряда патологий или нарушений неврологического или гематологического профиля, что позволит, в свою очередь, повысить эффективность лечения, снизить его стоимость, увеличить интервалы между приемами лекарственного средства и др.This allows us to expect that drugs based on the proposed form of erythropoietin will be more effective for a number of pathologies or disorders of the neurological or hematological profile, which will, in turn, increase the effectiveness of treatment, reduce its cost, increase the intervals between taking the drug, etc.
Таким образом, предлагаются частицы с размером 1-1000 нм с содержанием эритропоэтина 20-80 мас.%, представляющие собой фармацевтически пригодные, биосовместимые и биодеградируемые (со)полимерные матрицы и липосомы, в которые физически инкапсулирован или на их поверхности сорбирован рекомбинантный человеческий или модифицированный эритропоэтин альфа или его аналог, для лечения и профилактики неврологических и гематологических заболеваний и нарушений.Thus, the proposed particle size of 1-1000 nm with an erythropoietin content of 20-80 wt.%, Representing pharmaceutically suitable, biocompatible and biodegradable (co) polymer matrices and liposomes, which are physically encapsulated or on their surface sorbed recombinant human or modified Erythropoietin alpha or its analogue, for the treatment and prevention of neurological and hematological diseases and disorders.
Частицы находятся в растворе, взвеси, лиофилизате, дисперсии, суспензии или эмульсии.The particles are in solution, suspension, lyophilisate, dispersion, suspension or emulsion.
Предпочтительно в частицах полимером является полибутилцианакрилат (ПБЦА) или полиэтиленгликоль (ПЭГ).Preferably, the polymer in the particles is polybutyl cyanoacrylate (PBCA) or polyethylene glycol (PEG).
Предпочтительно в частицах сополимером является сополимер из молочной и гликолевой кислоты (ПЛГА).Preferably in the particles, the copolymer is a copolymer of lactic and glycolic acid (PLGA).
Полимерной матрицей может быть также альбумин, твердые липиды или аминокислотный дендример.The polymer matrix can also be albumin, solid lipids, or an amino acid dendrimer.
Предлагаемые частицы могут быть получены в процессе эмульсионной полимеризации и/или при осаждении полимера.The proposed particles can be obtained in the process of emulsion polymerization and / or during the deposition of the polymer.
Частицы при этом могут содержать поверхностные стабилизаторы на основе ионогенных и неионогенных ПАВ.In this case, particles may contain surface stabilizers based on ionic and non-ionic surfactants.
Другим объектом изобретения является лиофилизованный нанопорошок, содержащий указанные выше частицы.Another object of the invention is a lyophilized nanopowder containing the above particles.
Одним из вариантов является также водная нанодисперсия, содержащая указанные выше частицы.One option is also water nanodispersion containing the above particles.
Предлагаемые частицы могут быть использованы в качестве активной субстанции для создания лекарственных средств, в том числе для создания пролонгированных лекарственных средств. Загрузка эритропоэтина по отношению к полимеру (процент сорбции в наночастицы) может составлять от 5 до 98, предпочтительно от 20 до 80 мас.%.The proposed particles can be used as an active substance for the creation of medicines, including the creation of prolonged medicines. Download erythropoietin in relation to the polymer (the percentage of sorption into nanoparticles) can be from 5 to 98, preferably from 20 to 80 wt.%.
Предлагается также лекарственный препарат, включающий указанные частицы в эффективном количестве и вспомогательные вещества.A drug is also proposed, which includes the indicated particles in an effective amount and auxiliary substances.
Лекарственный препарат может содержать в качестве вспомогательных веществ стабилизаторы поверхности, криопротекторы, полимерные стабилизаторы, носители и консерванты и представлять собой жидкие и твердые дисперсии, суспензии, растворы, аэрозоли, капсулы, мази, кремы, гели, лиофилизированные составы, таблетки.The drug may contain surface stabilizers, cryoprotectants, polymer stabilizers, carriers and preservatives as excipients and be liquid and solid dispersions, suspensions, solutions, aerosols, capsules, ointments, creams, gels, lyophilized formulations, tablets.
Лекарственный препарат может быть предназначен для внутривенного, подкожного, интраназального, ингаляционного, интратекального, внутрижелудочного введения.The drug may be intended for intravenous, subcutaneous, intranasal, inhalation, intrathecal, intragastric administration.
Указанный препарат может быть использован для лечения и/или профилактики гематологических заболеваний и нарушений в дозе 20-1000 Ед/кг, при этом гематологическое заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей анемию при хронической почечной недостаточности, гемодиализе, ВИЧ-инфекции на фоне лечения зидовудином, цитостатической химиотерапии, анемию у недоношенных новорожденных.This drug can be used to treat and / or prevent hematological diseases and disorders at a dose of 20-1000 U / kg, while the hematological disease or disorder is selected from the group including anemia in chronic renal failure, hemodialysis, HIV infection during treatment with zidovudine , cytostatic chemotherapy, anemia in preterm infants.
Указанный препарат может быть использован для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний в дозе 50-1500 МЕ/кг, при этом неврологическое заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей геморрагические, гипоксические, травматические, аутоиммунные и токсические повреждения нервной системы, субарахноидальное кровотечение (разрыв церебральной аневризмы), травму головного мозга, травму спинного мозга, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, депрессию, неврозы, нейрокогнитивный дефицит, нарушения памяти, синдром дефицита внимания, вегетососудистую дистонию, биполярные нарушения, коматозные состояния, ВИЧассоциированную нейропатию, нейропатию, ассоциированную с химиотерапией, атаксию Фридриха, неврологические нарушения при сепсисе, множественной травме, оксидативном стрессе, асфиксии, геThe specified drug can be used for the treatment and / or prevention of neurological diseases at a dose of 50-1500 IU / kg, while the neurological disease or disorder is selected from the group including hemorrhagic, hypoxic, traumatic, autoimmune and toxic damage to the nervous system, subarachnoid hemorrhage (rupture) cerebral aneurysm), brain injury, spinal cord injury, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, depression, neurosis, neurocognitive deficit, memory disorders and, attention deficit disorder, vascular dystonia, bipolar disorders, coma, HIV-associated neuropathy, neuropathy associated with chemotherapy, Frederick's ataxia, neurological disorders in sepsis, multiple trauma, oxidative stress, asphyxia,
- 2 018472 моррагических и гипоксических повреждений мозга при недоношенности, при хирургическом лечении врожденных пороков (неонатальной хирургии), при хирургических вмешательствах с экстракорпоральным (искусственным) кровообращением, ВИЧ-ассоциированной нейропатии.- 2 018472 of morragic and hypoxic brain damage in case of prematurity, in the surgical treatment of congenital malformations (neonatal surgery), in surgical interventions with extracorporeal (artificial) circulation, HIV-associated neuropathy.
Препарат может быть использован для лечения и/или профилактики нарушений зрения, ретинопатии при недоношенности, для повышения периферической иннервации, для антиноцицептивного эффекта при ВИЧ-ассоциированной нейропатии, для лечения стресса, аллопеции, эректильной дисфункции, хронической усталости, для повышения обучаемости, физической выносливости, где лекарственный препарат содержит эритропоэтин в дозе 5-1500 МЕ/кг.The drug can be used to treat and / or prevent visual impairment, retinopathy in case of prematurity, to increase peripheral innervation, for antinociceptive effect on HIV-associated neuropathy, to treat stress, alopecia, erectile dysfunction, chronic fatigue, to increase learning, physical endurance, where the drug contains erythropoietin in a dose of 5-1500 IU / kg.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Ниже приведен ряд конкретных примеров реализации изобретения, которые являются только его более подробной иллюстрацией и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.Below are a number of specific examples of the implementation of the invention, which are only a more detailed illustration and should not be construed as limiting its scope.
Получение наноформ эритропоэтина.Getting nanoform of erythropoietin.
Пример 1.Example 1
Получение наночастиц с эритропоэтином на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот и твердых липидов.Preparation of nanoparticles with erythropoietin based on copolymers of lactic and glycolic acids and solid lipids.
Приготовление органической фазы. РЬСЛ (100 мг), лецитин (0-50 мг) и масло (0-50 мг) растворяли в ацетоне (5 мл).Preparation of the organic phase. PSCL (100 mg), lecithin (0-50 mg) and oil (0-50 mg) were dissolved in acetone (5 ml).
Приготовление водной фазы. Полоксамер 188 (100 мг) растворяли в очищенной воде (10 мл).Preparation of the aqueous phase. Poloxamer 188 (100 mg) was dissolved in purified water (10 ml).
Органическую фазу по каплям при постоянном перемешивании добавляли к водной фазе. Ацетон удаляли при небольшом нагревании, суспензию фильтровали через бумажный фильтр белая лента (размер пор 3 мкм), объем суспензии доводили до исходного (10 мл), добавляя воду. К 5 мл суспензии добавляли 5 мл раствора ЭПО 0.9% и 200 мг полисорбата-80.The organic phase was added dropwise with constant stirring to the aqueous phase. Acetone was removed with slight heating, the suspension was filtered through a white filter paper filter (pore size 3 μm), the volume of the suspension was brought to the original (10 ml) by adding water. To 5 ml of the suspension was added 5 ml of EPO 0.9% solution and 200 mg of polysorbate-80.
Степень включения ЭПО составляла 80%, средний размер частиц от 100 до 200 нм.The degree of inclusion of EPO was 80%, the average particle size of from 100 to 200 nm.
Пример 2.Example 2
Получение полибутилцианоакрилатных наночастиц с эритропоэтином, покрытых полисорбатом-80.Obtaining polybutylcyanoacrylate nanoparticles with erythropoietin coated with polysorbate-80.
100 мг янтарной кислоты, 100 мг полоксамера 188 растворяли в 10 мл воды очищенной. К этому раствору по каплям добавляли 100 мкл бутилцианоакрилата. Синтез вели 1.5 ч при легком нагревании, суспензию фильтровали от частично осадившегося полимера с помощью бумажного фильтра белая лента (размер пор 3 мкм), объем суспензии доводили до исходного (10 мл), добавляя воду очищенную. В полученной суспензии наночастиц растворяли 600 мг маннита, после чего к 5 мл суспензии добавляли 5 мл раствора ЭПО 0.9% и 200 мг полисорбата-80. Степень включения ЭПО составляла 80%, размер частиц от 100 до 200 нм.100 mg of succinic acid, 100 mg of poloxamer 188 was dissolved in 10 ml of purified water. To this solution, 100 μl of butyl cyanoacrylate was added dropwise. The synthesis was carried out for 1.5 h with gentle heating, the suspension was filtered from partially precipitated polymer using a white paper filter paper (pore size 3 μm), the volume of the suspension was brought to the original (10 ml) by adding purified water. In the resulting nanoparticle suspension, 600 mg of mannitol were dissolved, after which 5 ml of EPO 0.9% solution and 200 mg of polysorbate-80 were added to 5 ml of the suspension. The degree of inclusion of EPO was 80%, the particle size from 100 to 200 nm.
Пример 3.Example 3
Осуществляли операции, так как это описано в примере 1, однако раствор эритропоэтина вводили на стадии полимеризации.The operations were carried out as described in example 1, however, the solution of erythropoietin was introduced at the stage of polymerization.
Пример 4.Example 4
Осуществляли операции, так как это описано в примере 2, однако к суспензии не добавляли полисорбат-80.Carried out the operation, as described in example 2, however, to the suspension was not added Polysorbate-80.
Примеры 5-7.Examples 5-7.
Из композиций по примеру 1-3 лиофилизацией удаляли растворитель и получали порошки наноформ эритропоэтина.The solvent was removed from the compositions of Example 1-3 by lyophilization and powders of erythropoietin nanoform were obtained.
Примеры 8-10.Examples 8-10.
Наносомальную форму эритропоэтина по примерам 4-6 разводили пригодным для медицинского использования растворителем, получали восстановленные суспензии.The nanosomal form of erythropoietin in Examples 4-6 was diluted with a solvent suitable for medical use, and reconstituted suspensions were obtained.
Биологический пример.Biological example.
Эффективность неврологического защитного действия предлагаемых форм эритропоэтина (по примерам 2 и 4) показана на общепринятых биологических моделях.The effectiveness of the neurological protective action of the proposed forms of erythropoietin (in examples 2 and 4) is shown in conventional biological models.
Изучение проводилось на модели локального кровоизлияния в головном мозге - модели геморрагического инсульта (ГИ), вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой (ИПГ) (А.Н. Макаренко и соавт., 2002; Т.А. Воронина и соавт., 2005). Для оценки нарушения поведения и состояния животных после геморрагического инсульта были использованы сертифицированные методики, рекомендуемые Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Москва, 2005, МЗ РФ.The study was conducted on a model of local hemorrhage in the brain - a model of hemorrhagic stroke (GI) caused by intracerebral post-traumatic hematoma (IPG) (AN Makarenko et al., 2002; TA Voronina et al. 2005). To assess the behavioral and behavioral disorders of animals after a hemorrhagic stroke, certified techniques recommended by the Experimental (Preclinical) Guidelines for the Study of New Pharmacological Substances were used, Moscow, 2005, Ministry of Health of the Russian Federation.
Согласно этим методикам регистрация поведения и состояния животных проводилась через 1, 7 и 14 дней после операции по следующим показателям:According to these methods, the registration of the behavior and condition of the animals was carried out 1, 7 and 14 days after the operation according to the following parameters:
1) оценка неврологического статуса с использованием шкалы Мс Сго\х;1) assessment of neurological status using the MS Co / x scale;
2) изучение координации движений и мышечного тонуса животных в тестах вращающегося стержня (установка фирмы Идо Вакйе);2) study of the coordination of movements and muscle tone of animals in the tests of a rotating rod (installation of the company Ido Vakye);
3) влияние веществ на выживаемость крыс;3) the effect of substances on the survival rate of rats;
4) исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности крыс в установке открытое поле (фирма изготовитель НПК Открытая наука, Россия);4) a study of the orienting-exploratory behavior and motor activity of rats in an open field installation (manufacturer NPK Open Science, Russia);
5) оценка уровня тревожности на модели приподнятого крестообразного лабиринта (фирма изгото5) an assessment of the level of anxiety on a model of an elevated plus maze (firm izgoto
- 3 018472 витель НПК Открытая наука, Россия);- 3 018472 (NPK Open Science, Russia);
6) влияние веществ на выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) в установке фирмы ЬаГауейе 1п51гитеп1 Со (США);6) the effect of substances on the production of the passive avoidance conditioned reflex (passive avoidance reaction) in the installation of LaGaueye 1n51gate1 Co (USA);
7) влияние веществ на динамику веса крыс с геморрагическим инсультом.7) the effect of substances on the weight dynamics of rats with hemorrhagic stroke.
В исследовании были использованы крысы самцы линии Вистар весом 200-220 г, в начале эксперимента, содержащиеся в специальной экспериментальной комнате при свободном доступе к пище и воде и обычном световом режиме.The study used rats male Wistar line weighing 200-220 g, at the beginning of the experiment, contained in a special experimental room with free access to food and water and the usual light mode.
Моделирование геморрагического инсульта (ГИ) и интрацеребральной посттравматической гематомы (ИПГ) проводилось в области внутренней капсулы правого полушария.Modeling of hemorrhagic stroke (GI) and intracerebral post-traumatic hematoma (IPG) was carried out in the area of the inner capsule of the right hemisphere.
Крысам, наркотизированным хлоралгидратом (200 мг/кг, в/б), при помощи специального устройства (мандрен-нож) в стереотаксисе осуществляли деструкцию мозговой ткани в области сар8и1е йИсгпа. (координаты Н=4 мм, Ь=3.0 мм, А=1,5 мм от брегмы по атласу С. Рахшок) с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка оперируемого животного (0,02-0,03 мл). Морфологические исследования показали, что таким способом достигается локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина - 3 мм) без существенных повреждений расположенных выше образований мозга. Ложнооперированным животным проводили скальпирование и трепанацию черепа. Первое внутрибрюшинное введение тестируемых веществ осуществляли через 4-4,5 ч после операции и пробуждения животного от наркоза. Повторное ежедневное применение веществ проводили на второй и третий дни после операции. Ложнооперированным животным и контрольным крысам с геморрагическим инсультом вводили по той же схеме физиологический раствор. Динамику развития ИНГ исследовали в течение 14 дней с регистрацией гибели крыс, показателей поведения и состояния животных в 1-е, 7-е и 14-е сутки после операции, используя комплекс традиционных для экспериментальной нейропсихофармакологии методов (Т.А. Воронина, 1991; Т.Л. Гарибова и соавт., 2003). Неврологический статус крыс определялся с использованием шкалы 81гоке-1пбех МсСготе. Оценка неврологического статуса осуществлялась по балльной системе. При наличии у животных нескольких симптомов неврологического дефицита тяжесть состояния определялась как сумма соответствующих баллов. Отмечалось количество крыс с легкой (от 0,5 до 2,5 81гоке-шбех) и с тяжелой (от 3 до 10 81гоке-шбех) неврологической симптоматикой, а также положительной или отрицательной динамикой развития неврологического дефицита в группе. Для определения нарушений координации движений у крыс использовали тест вращающегося стержня; ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность исследовали в открытом поле, уровень тревожности - в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ), обучение и память изучали в условиях методики условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ).Rats anesthetized with chloral hydrate (200 mg / kg, i.p.), with the help of a special device (mandrel-knife) in stereotaxis, carried out the destruction of brain tissue in the region of the brain. (coordinates H = 4 mm, L = 3.0 mm, A = 1.5 mm from Bregma according to Atlas C. Rakhshok), followed (after 2-3 minutes) by injecting blood into the injury site taken from under the tongue of the operated animal (0 , 02-0.03 ml). Morphological studies have shown that in this way a local autohemorrhagic bilateral stroke is achieved in the area of the inner capsule (diameter - 2 mm, depth - 3 mm) without significant damage located above the formations of the brain. Scalping and trepanning of the skull were carried out by false-operated animals. The first intraperitoneal administration of the test substances was carried out 4-4.5 hours after the operation and the awakening of the animal from anesthesia. Repeated daily use of substances was carried out on the second and third days after surgery. Salon-operated animals and control rats with hemorrhagic stroke were given saline in the same way. The dynamics of development of ING was investigated for 14 days with the registration of the death of rats, indicators of the behavior and condition of animals on the 1st, 7th and 14th day after the operation, using a set of methods traditional for experimental neuropsychopharmacology (TA Voronina, 1991; TL Garibova et al., 2003). The neurological status of the rats was determined using the scale of 81göke-1beh McSgote. Evaluation of the neurological status was carried out on a point system. When animals had several symptoms of neurological deficiency, the severity of the condition was defined as the sum of the corresponding points. The number of rats with mild (from 0.5 to 2.5 81gok-shbeh) and with severe (from 3 to 10 81gok-shbeh) neurological symptoms, as well as positive or negative dynamics of the development of neurological deficit in the group was noted. To determine the impaired coordination of movements in rats, a rotating rod test was used; orienting-exploratory behavior and motor activity were studied in the open field, anxiety level - under the conditions of the elevated plus-maze technique (PCL), learning and memory were studied under the conditions of the passive avoidance conditioned reflex technique (passive avoidance response technique).
Животные были разделены на следующие группы.Animals were divided into the following groups.
Контроль (интактные животные) - 8 крыс.Control (intact animals) - 8 rats.
Контроль (ложнооперированные крысы) (используемое ниже сокращение ЛО) - 12 крыс. Животные с геморрагическим инсультом (используемое ниже сокращение ГИ) - 12 крыс. Инсульт + свободный эритропоэтин (используемое ниже сокращение Э10) - 12 крыс.The control (sham-operated rats) (the abbreviation LO used below) - 12 rats. Animals with hemorrhagic stroke (used below the abbreviation GI) - 12 rats. Stroke + free erythropoietin (abbreviation E10 used below) - 12 rats.
Инсульт + эритропоэтин по примеру 4, сорбированный на полимерных (поли(бутил)цианоакрилатных) наночастицах, непокрытых поверхностно-активным веществом (сурфактантом - полисорбатом 80) (ЭПО-ПБЦА НЧ) (используемое ниже сокращение Э6) - 12 крыс.Stroke + erythropoietin according to example 4, sorbed on polymeric (poly (butyl) cyanoacrylate) nanoparticles, uncoated with a surfactant (surfactant - polysorbate 80) (EPO-PBCA LF) (used below abbreviation E6) - 12 rats.
Инсульт + эритропоэтин по примеру 2, сорбированный на полимерных (поли(бутил)цианоакрилатных) наночастицах без покрытия поверхностно-активным веществом (сурфактантом - полисорбатом 80) (ЭПО-ПБЦА НЧ-ПС 80) (используемое ниже сокращение Э7) - 12 крыс.Stroke + erythropoietin according to example 2, sorbed on polymeric (poly (butyl) cyanoacrylate) nanoparticles without coating with a surfactant (surfactant - polysorbate 80) (EPO-PBCA LF-PS 80) (the abbreviation E7 used below) - 12 rats.
Статистическую обработку результатов проводили по программе Вю81айШс8 III с использованием параметрических и непараметрических методов Стьюдента, Вилкоксона, Манна-Уитни, хи-квадрат, Крускала-Уолиса АЫОУА.Statistical processing of the results was carried out according to the Vu81aiSch8 III program using parametric and nonparametric methods of Student, Wilcoxon, Mann-Whitney, Chi-square, Kruskal-Walis AYOUA.
Результаты исследования.The results of the study.
1. Изучение неврологического статуса крыс с ИПГ.1. The study of the neurological status of rats with IPG.
Методика.The technique.
Неврологический статус крыс определяется с использованием шкалы 81гоке-шбех МсСготе. Оценка неврологического дефицита осуществлялась по балльной системе. При наличии у животных нескольких симптомов неврологического дефицита тяжесть состояния определялась как сумма соответствующих баллов. Отмечалось количество крыс с легкой (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор - от 0,5 до 2,5 баллов по шкале 81гоке-шбех) и тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (манежные движения, парезы конечностей, паралич нижних конечностей, боковое положение - от 3 до 10 баллов).The neurological status of the rats is determined using the scale of the henchunner of the MsSgote. Evaluation of neurological deficit was carried out on a point system. When animals had several symptoms of neurological deficiency, the severity of the condition was defined as the sum of the corresponding points. It was noted the number of rats with mild (lethargy, weakness of the limbs, one-sided half-sore, tremor - from 0.5 to 2.5 points on a scale 81g-shbeh) and severe manifestations of neurological disorders (manege movements, paresis of the extremities, paralysis of the lower extremities, lateral position - from 3 to 10 points).
Результаты.Results.
Установлено, что в группе ложнооперированных крыс количество животных с легкими неврологическими нарушениями (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор) составляло от 12,5 до 25% в течение всего времени наблюдения. Эти изменения у крыс с ГИ наблюдались у 40-50% животных.It was established that in the group of sham-operated rats the number of animals with light neurological disorders (lethargy, weakness of the limbs, one-sided half-legs, tremor) ranged from 12.5 to 25% during the entire observation time. These changes in rats with HI were observed in 40-50% of animals.
- 4 018472- 4 018472
При регистрации тяжелых неврологических нарушений установлено, что у ложнооперированных животных этих проявлений не наблюдалось. В группе крыс с ГИ парезы, манежные движения, параличи развивались у 20-40% крыс. Данные суммированы в табл. 1.When registering severe neurological disorders, it was established that these manifestations were not observed in sham-operated animals. In the group of rats with GI paresis, manege movements, paralysis developed in 20-40% of rats. The data are summarized in table. one.
Таблица 1Table 1
Влияние веществ на неврологический статус крыс с ИНГ модели ГИThe effect of substances on the neurological status of rats with an ING model GI
Как следует из табл. 1, Э10 и Э6 не оказывали существенного влияния на неврологические нарушения у крыс с ГИ. Э7 оказывал значительное протекторное действие, уменьшая количество крыс с неврологическими нарушениями в 2 раза.As follows from the table. 1, E10 and E6 did not have a significant effect on neurological disorders in rats with GI. E7 had a significant protective effect, reducing the number of rats with neurological disorders by 2 times.
2. Изучение координации движений крыс с ИПГ.2. The study of the coordination of movements of rats with IPG.
Методика.The technique.
Изучение координации движений крыс проводили с использованием теста вращающегося стержня. Животных помещали на стержень диаметром 3 см, вращающийся со скоростью 3 об/мин, и регистрировали количество падений крысы в течение 2 мин наблюдения.The study of the coordination of movements of rats was performed using a rotating rod test. Animals were placed on a rod with a diameter of 3 cm, rotating at a speed of 3 rpm, and the number of rats falling was recorded during 2 minutes of observation.
Результаты.Results.
Установлено, что у крыс с ГИ по сравнению с ложнооперированными животными наблюдается значительное ухудшение координации движений. Это характеризуется статистически достоверным увеличением количества падений крыс с вращающегося стержня при регистрации в течение 2 мин (данные суммированы в табл. 2).It was established that in rats with HI, compared with sham-operated animals, there was a significant deterioration in the coordination of movements. This is characterized by a statistically significant increase in the number of rats falling from a rotating rod during registration for 2 minutes (the data are summarized in Table 2).
Таблица 2table 2
Влияние веществ на координацию крыс с ИНГ модели ГИ в тесте вращающегося стержняThe influence of substances on the coordination of rats with ING model GI in the test of the rotating rod
# - достоверность отличий от ЛО при Р<0,05 (критерий Стьюдента);# - reliability of differences from LO at P <0.05 (Student's criterion);
ЛО - ложнооперированные животные;LO - sham operated animals;
ГИ - крысы с геморрагическим инсультом.GI - rats with hemorrhagic stroke.
Как следует из табл. 2, на фоне повторного введения Э7 у крыс отмечалось статистически достоверное (7-е сутки) уменьшение количества падений, особенно на 14-й день наблюдения (табл. 2). Э10 и Э6 оказывали слабый позитивный эффект, лишь незначительно уменьшая количество падений с вращающегося стержня крыс с ГИ.As follows from the table. 2, against the background of repeated administration of E7 in rats, a statistically significant (7th day) decrease in the number of falls was observed, especially on the 14th day of observation (Table 2). E10 and E6 had a weak positive effect, only slightly reducing the number of falls from a rotating rod of rats with GI.
3. Динамика выживания крыс с ИПГ.3. Dynamics of survival of rats with IPG.
Гибель животных регистрировали на протяжении всего времени наблюдения в течение 14 дней. Данные суммированы в табл. 3The death of animals was recorded during the entire observation time for 14 days. The data are summarized in table. 3
- 5 018472- 5 018472
Таблица 3Table 3
Влияние веществ на выживание крыс с ГИThe effect of substances on the survival of rats with GI
& - достоверность отличий от ЛО при Р<0,05 (χ 2);& - reliability of differences from LO at Р <0.05 (χ 2);
* - достоверность отличий от группы крыс с ГИ при Р<0,05 (χ 2);* - reliability of differences from the group of rats with GI at P <0.05 (χ 2);
ЛО - ложнооперированные животные;LO - sham operated animals;
ГИ - крысы с геморрагическим инсультом.GI - rats with hemorrhagic stroke.
Установлено, что к 14-му дню наблюдения все ложнооперированные крысы выжили (табл. 3), а в группе крыс с ГИ выжило только 42% животных (табл. 3). На фоне повторного 3-дневного введения Э6 к концу эксперимента выжило 58% крыс, что на 16% больше, чем в контрольной группе с ГИ (табл. 3). Это свидетельствует о протекторном действии соединения. При введении Э7 к 14-м суткам выжило 75% крыс. ЭПО практически не влиял на выживаемость крыс с ГИ.It was established that by the 14th day of observation, all the sham-operated rats survived (Table 3), and in the group of rats with GI only 42% of the animals survived (Table 3). Against the background of repeated 3-day administration of E6, 58% of the rats survived by the end of the experiment, which is 16% more than in the control group with GI (Table 3). This indicates the protective effect of the compound. With the introduction of E7 to the 14th day, 75% of the rats survived. EPO had almost no effect on the survival of rats with GI.
Таким образом, наиболее эффективным веществом, предупреждающим гибель крыс, был образец под шифром Э7. По степени выраженности эффекта соединения располагались в следующем порядке Э7>Э6>Э10.Thus, the most effective substance preventing the death of rats was a sample under the code E7. According to the severity of the effect, the compounds were arranged in the following order: E7> E6> E10.
4. Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности животных с ИПГ в условиях методики открытого поля.4. The study of orienting-exploratory behavior and motor activity of animals with IPG in the conditions of the open field technique.
Методика.The technique.
Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности животных проводили в условиях методики открытого поля (НПК Открытая наука, Россия). Установка открытое поле для крыс представляет собой камеру диаметром 97 см и высотой стенок 42 см. Пол камеры разделен на три ряда секторов одинаковой площади с 13 отверстиями диаметром 2 см. В процессе 3минутного пребывания крысы в открытом поле регистрировали число вставаний на задние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из сектора в сектор (горизонтальная двигательная активность), число заглядываний в отверстия, количество умываний (груминг), количество болюсов. Для оценки уровня двигательной активности использовали показатель суммы горизонтальной и вертикальной активности животных.The study of the orientation and exploratory behavior and motor activity of animals was carried out under the conditions of the open field technique (NPK Open Science, Russia). The open field setting for rats is a chamber with a diameter of 97 cm and a wall height of 42 cm. The floor of the chamber is divided into three rows of sectors of the same area with 13 holes with a diameter of 2 cm. activity), the number of transitions from sector to sector (horizontal motor activity), the number of peeking into the holes, the number of washes (grooming), the number of boluses. To assess the level of motor activity, we used the indicator of the sum of horizontal and vertical activity of animals.
Результаты.Results.
Изучение ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности крыс сведено в табл. 4.The study of orienting-exploratory behavior and motor activity of rats is summarized in Table. four.
Таблица 4 Влияние веществ на поведение крыс с ИНГ модели ГИ в условиях методики открытого поляTable 4 The influence of substances on the behavior of rats with ING model GI in the conditions of the open field technique
- 6 018472- 6 018472
# - достоверность отличий от ЛО при Р<0,05 (критерий Стьюдента);# - reliability of differences from LO at P <0.05 (Student's criterion);
* - достоверность отличий от группы крыс с ГИ при Р<0,05 (критерий Стьюдента); ЛО - ложнооперированные животные;* - reliability of differences from the group of rats with GI at P <0.05 (Student's criterion); LO - sham operated animals;
ГИ - крысы с геморрагическим инсультом.GI - rats with hemorrhagic stroke.
Как следует из таблицы, у крыс с ГИ в сравнении с ложнооперированными животными в первый день после операции наблюдается статистически достоверное снижение всех показателей поведения в открытом поле: горизонтальной и вертикальной активности, числа обследований отверстий и, особенно, снижение суммарных показателей двигательной активности.As follows from the table, in rats with GI compared with sham-operated animals on the first day after surgery, there was a statistically significant decrease in all indicators of behavior in the open field: horizontal and vertical activity, the number of hole surveys and, especially, a decrease in total indicators of motor activity.
При этом Э7 корректировал поведение крыс с ГИ в открытом поле в 1-е и 7-е сутки после операции до уровня поведения ложнонооперированных животных. Э10 и Э6 практически не оказывали влияния на влияния на поведение крыс с ГИ в открытом поле на протяжении всего времени наблюдения.At the same time, E7 corrected the behavior of rats with GI in an open field on the 1st and 7th days after the operation to the level of the behavior of falsely operated animals. E10 and E6 had practically no influence on the behavior of rats with GI in an open field during the entire observation time.
5. Изучение уровня тревожности крыс ГИ.5. The study of the level of anxiety rats GI.
Методика.The technique.
Для изучения уровня тревожности крыс с ГИ был использован приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (НПК Открытая наука, Россия) с методикой оценки поведения животных согласно ΡοΙΙοχν и соавт. (1985). Лабиринт представляет собой перекрещенные полоски размером 50x10 см; два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 40 см. Лабиринт приподнят от пола на 50 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 10x10 см. Крыс помещали на центральную площадку хвостом к открытому рукаву. Регистрировалось время, проведенное животными в открытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 мин. В качестве критерия анксиолитического действия использовали показатель времени, проведенного в открытых рукавах установки. Число пересечений центральной платформы (общее число заходов в темный и светлый рукава лабиринта) использовали для оценки влияния соединений на двигательную активность крыс. Кроме того, регистрировалось латентное время начала движения животного после посадки на центральную площадку и суммарный показатель времени пребывания крысы на ней.To study the level of anxiety of rats with GI, an elevated plus-maze (PKL) (NPK Open Science, Russia) was used with a method for assessing the behavior of animals according to ΡοΙΙοχν et al. (1985). Labyrinth is a crossed strip of 50x10 cm; two opposite compartments have vertical walls 40 cm high. The labyrinth is 50 cm high from the floor. At the intersection of the planes there is a central platform 10x10 cm. Rats were placed on the central platform with a tail to the open sleeve. The time spent by animals in open sleeves, the number of entries in open and closed sleeves was recorded. The total observation time for each animal was 5 minutes. As a criterion for anxiolytic action, we used the indicator of time spent in open arms of the installation. The number of intersections of the central platform (the total number of entries into the dark and light sleeves of the labyrinth) was used to assess the effect of the compounds on the motor activity of rats. In addition, the latent time of the beginning of the movement of the animal after landing on the central site and the total index of the time the rat stayed on it was recorded.
Результаты.Results.
Исследование уровня тревожности крыс в условиях методики ПКЛ показало, что в отличие от ложнооперированных животных у крыс с ГИ в 1-е и 14-е сутки после операции отмечалось значительное уменьшение основного показателя поведения - времени, которое животное провело на незащищенных открытых рукавах лабиринта (табл. 5).The study of the level of anxiety of rats in the conditions of the PCL method showed that, unlike the sham-operated animals, rats with GI on the 1st and 14th days after the operation showed a significant decrease in the main indicator of behavior - the time that the animal spent on unprotected open arms of the maze (Table . five).
- 7 018472- 7 018472
Таблица 5Table 5
Влияние веществ на поведение крыс с ИНГ модели ГИ в условиях методики приподнятого крестообразного лабиринтаThe influence of substances on the behavior of rats with ING model GI in the conditions of the technique of elevated plus maze
# - достоверность отличий от ЛО при Р=0,05 (критерий Стьюдента);# - reliability of differences from LO at P = 0.05 (Student's criterion);
* - достоверность отличий от группы крыс с ГИ при Р=0,057 (критерий Стьюдента);* - reliability of differences from the group of rats with GI at P = 0.057 (Student's criterion);
ЛО - ложнооперированные животные;LO - sham operated animals;
ГИ - крысы с геморрагическим инсультом.GI - rats with hemorrhagic stroke.
Как следует из таблицы, у крыс с ГИ отмечалась тенденция уменьшения заходов в открытые рукава. Подобное поведение животных свидетельствует о повышенной тревожности у крыс с ГИ. В 1-е сутки наблюдения все образцы, особенно Э7, обладали способностью корректировать нарушенное у крыс с ГИ поведение в НКЛ, увеличивая время, проведенное животными в открытых незащищенных рукавах лабиринта.As follows from the table, in rats with GI, there was a tendency to decrease entry into open arms. Such behavior of animals indicates increased anxiety in rats with GI. On the first day of observation, all samples, especially E7, had the ability to correct disturbed behavior in NKL in GI rats, increasing the time spent by animals in open unprotected labyrinth arms.
Таким образом, Э7 почти полностью корректировал, а Э10 и Э6 умеренно снижали повышенную тревожность крыс с ГИ в условиях методики НКЛ.Thus, E7 almost completely corrected, and E10 and E6 moderately reduced the increased anxiety of rats with GI under the conditions of the NCL technique.
6. Влияние веществ на обучение и память крыс с ГИ.6. The effect of substances on the learning and memory of rats with GI.
Методика.The technique.
Базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия) является методика условного рефлекса пассивного избегания (УРНИ) (Воронина Т.А., 1989). Основными преимуществами этой методики являются быстрота выработки рефлекса (обучение с одной пробы) и возможность дифференцированно воздействовать на различные фазы памяти. В настоящем исследовании выработку условного рефлекса пассивного избегания проводили в установке фирмы ЬаГауейе 1п51гишеп1 Со (США).The basic model for assessing the effect of substances on the formation and reproduction of a memorial trail in the norm and in terms of its violation (amnesia) is the technique of the passive avoidance conditioned reflex (URNI) (Voronina TA, 1989). The main advantages of this technique are the speed of development of the reflex (learning from one sample) and the ability to differentially affect different phases of memory. In the present study, the development of a conditioned reflex of passive avoidance was carried out in an apparatus of La Gaouia 1H51G1S Co. (USA).
С этой целью животных помещали на освещенную, находящуюся на высоте 60 см платформу. В силу свойственного грызунам норкового рефлекса животное переходило в соединенную с платформой темную камеру, где получало обучающее электроболевое раздражение через электродный пол силой 0,30,6 мА. О степени обучения животного УРНИ судили по латентному времени первого захода крысы в темную камеру и длительности ее нахождения на освещенной платформе при повторном помещении туда животного через 6 ч после обучения (Абег е! а1., 1998). Проверка сохранения УРНИ (воспроизведение рефлекса) состояла в повторном помещении животного на висячую платформу не только через 6 ч после обучения, но и на 7-е и 14-е сутки после операции и регистрировали латентное время первого захода в темный отсек камеры, где ранее с использованием болевого раздражения проводилось обучение, и времени, проведенного крысой на освещенной висячей платформе за 3 мин.To this end, the animals were placed on an illuminated platform located at a height of 60 cm. Due to the mink reflex characteristic of rodents, the animal passed into a dark chamber connected to the platform, where it received a training electro-pain stimulation through an electrode floor of 0.30.6 mA. The degree of training of the animal URNI was judged by the latent time of the first entry of the rat into the dark chamber and the duration of its stay on the illuminated platform when the animal was placed there again 6 hours after the training (Abege et al., 1998). The test of saving the URNI (reproduction of the reflex) consisted in re-placing the animal on a hanging platform not only 6 hours after training, but also on the 7th and 14th day after the operation and recorded the latent time of the first entry into the dark compartment of the camera, where using pain stimulation was trained, and the time spent by the rat on the illuminated hanging platform for 3 min.
Результаты.Results.
Обучение животных УРНИ проводили через сутки после операции, а воспроизведение - через 6 ч, 7 и 14 суток после обучения. Изучение влияния веществ на обучение УРНИ показало, что животные во всех пяти группах обучились условному рефлексу, так как при его воспроизведении через 6 ч после обуAnimal training URNI was carried out a day after surgery, and reproduction - 6 hours, 7 and 14 days after training. Studying the effect of substances on learning URNI showed that animals in all five groups learned the conditioned reflex, because when it was played 6 hours after training
- 8 018472 чения 100% животных помнили об ударе током в темной камере и не заходили туда в течение всего времени наблюдения (данные сведены в табл. 6).- 8 018472 100% of the animals remembered the electric shock in the dark chamber and did not go there during the whole observation time (the data are summarized in Table 6).
Таблица 6Table 6
Влияние веществ на обучение УРПИ крыс с ИНГ модели ГИThe effect of substances on the training of the CRA for rats with an ING model GI
# - достоверность отличий от ЛО при Р<0,05 (критерий Манна-Уитни);# - reliability of differences from LO with P <0.05 (Mann-Whitney test);
& - при Р<0,05 (χ 2);& - at Р <0.05 (χ 2);
* - достоверность отличий от группы крыс с ГИ при Р<0,05 (χ 2);* - reliability of differences from the group of rats with GI at P <0.05 (χ 2);
ЛО - ложнооперированные животные;LO - sham operated animals;
ГИ - крысы с геморрагическим инсультом.GI - rats with hemorrhagic stroke.
Э6 и Э7 предупреждали развитие амнезии УРПИ у крыс с ГИ, увеличивая количество животных, осуществляющих рефлекс до 70 и 100% соответственно. Э10 не обладал защитным эффектом.E6 and E7 prevented the development of amnesia in passive avoidance reaction in rats with GI, increasing the number of animals performing a reflex to 70 and 100%, respectively. E10 did not have a protective effect.
Заключение.Conclusion
Как было показано выше, Э7 оказывал защитный эффект при регистрации неврологических дефицитов у крыс после геморрагического инсульта, уменьшая количество животных с легкими и, особенно, с тяжелыми неврологическими нарушениями, такими как манежные движения, парезы и параличи задних конечностей, улучшал координацию движений в тесте вращающегося стержня, сокращал количество погибших от инсульта животных и уменьшал потерю веса у оставшихся в живых крыс. Э7 оптимизировал ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой в открытом поле, а в условиях приподнятого крестообразного лабиринта ослаблял повышенную тревожность, наблюдаемую у крыс после инсульта. Э7 обладал способностью предупреждать амнезию условного рефлекса пассивного избегания, развивающуюся у животных после инсульта. Следует отметить, что эти эффекты вещества регистрировались в течение 2-недельного времени наблюдения.As was shown above, E7 had a protective effect when registering neurological deficits in rats after a hemorrhagic stroke, reducing the number of animals with lungs and, especially, with severe neurological disorders, such as manege movements, paresis and paralysis of the hind limbs, improved coordination of movements in the rotating test rod, reduced the number of animals killed by stroke and reduced weight loss in surviving rats. E7 optimized orienting-exploratory behavior and motor activity of rats with intracerebral post-traumatic hematoma in the open field, and in conditions of an elevated plus-maze weakened the increased anxiety observed in rats after a stroke. E7 had the ability to prevent the amnesia of the conditioned reflex of passive avoidance that develops in animals after a stroke. It should be noted that these effects of the substance were recorded during a 2-week observation period.
Сходным, но менее выраженным действием на основные нарушения, вызванные геморрагическим инсультом, обладал Э6. Особенно ярко эффективность этого соединения проявлялась по устранению нарушений памяти в тесте воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания у крыс с геморрагическим инсультом.E6 had a similar, but less pronounced effect on the main disorders caused by hemorrhagic stroke. Particularly vividly, the effectiveness of this compound was manifested in the elimination of memory disorders in the test of reproducing the conditioned reflex of passive avoidance in rats with hemorrhagic stroke.
Эффективность нативного ЭПО (Э10), как нейропротектора, была незначительна и выражалась только в виде уменьшения количества погибших после инсульта животных.The effectiveness of native EPO (E10), as a neuroprotector, was insignificant and was expressed only in the form of a decrease in the number of animals killed after a stroke.
Таким образом, препараты по примерам 2 (Э7) и 4 (Э6) показывают выраженный нейропротективный эффект на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой, тогда как нативный ЭПО практически не влияет на комплекс нарушений поведения, памяти и неврологических дефицитов, развивающихся у крыс после геморрагического инсульта.Thus, the preparations according to examples 2 (E7) and 4 (E6) show a pronounced neuroprotective effect on the model of hemorrhagic stroke caused by intracerebral post-traumatic hematoma, while native EPO has almost no effect on the complex of behavioral disorders, memory and neurological deficiencies developing in rats after hemorrhagic stroke.
- 9 018472- 9 018472
Claims (23)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201001589A EA018472B1 (en) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | Erythropoietin-containing particles for treatment and prophylaxis of neurologic and hematologic diseases and disorders |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201001589A EA018472B1 (en) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | Erythropoietin-containing particles for treatment and prophylaxis of neurologic and hematologic diseases and disorders |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201001589A1 EA201001589A1 (en) | 2012-02-28 |
| EA018472B1 true EA018472B1 (en) | 2013-08-30 |
Family
ID=45908217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201001589A EA018472B1 (en) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | Erythropoietin-containing particles for treatment and prophylaxis of neurologic and hematologic diseases and disorders |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA018472B1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2218914C2 (en) * | 1998-02-23 | 2003-12-20 | Цилаг Аг Интернэшнл | Erythropoietin liposomal dispersion |
| RU2237471C2 (en) * | 1998-01-29 | 2004-10-10 | Поли-Мед Инк. | Absorbing microparticles |
| US20040224016A1 (en) * | 1992-06-11 | 2004-11-11 | Zale Stephen E. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| RU2271196C2 (en) * | 1999-06-04 | 2006-03-10 | Элзэ Копэрейшн | Implantable composition (variants) and method for production thereof |
| US20080160078A1 (en) * | 2005-01-04 | 2008-07-03 | Mei-Chin Chen | Nanoparticles for drug delivery |
| CN101507712A (en) * | 2009-03-20 | 2009-08-19 | 河北师范大学 | Sustained-release micro-spheres preparation containing recombined erythropoietin and preparation method and use thereof |
-
2010
- 2010-09-15 EA EA201001589A patent/EA018472B1/en active IP Right Revival
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040224016A1 (en) * | 1992-06-11 | 2004-11-11 | Zale Stephen E. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| RU2237471C2 (en) * | 1998-01-29 | 2004-10-10 | Поли-Мед Инк. | Absorbing microparticles |
| RU2218914C2 (en) * | 1998-02-23 | 2003-12-20 | Цилаг Аг Интернэшнл | Erythropoietin liposomal dispersion |
| RU2271196C2 (en) * | 1999-06-04 | 2006-03-10 | Элзэ Копэрейшн | Implantable composition (variants) and method for production thereof |
| US20080160078A1 (en) * | 2005-01-04 | 2008-07-03 | Mei-Chin Chen | Nanoparticles for drug delivery |
| CN101507712A (en) * | 2009-03-20 | 2009-08-19 | 河北师范大学 | Sustained-release micro-spheres preparation containing recombined erythropoietin and preparation method and use thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Бакшеев В.И. и др. Эритропоэтин в клинической практике: прошлое, настоящее и будущее (обзор литературы). Клиническая медицина 2007 [найдено 2011-03-04] [он-лайн]. Найдено из Интернет: * |
| Не N. et al. Therapy for cerebral ischemic injury with erythropoietin-containing nanoparticles. J. Nanosci Nanotechnol. 2010 Aug: 10(8): 5320-32, с. 5320-5323, реферат * |
| РЛС. Энциклопедия лекарств, 2004. ООО "РЛС-2004", с. 1030-1031 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201001589A1 (en) | 2012-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jain et al. | Neuroprotection in traumatic brain injury | |
| CN103596562B (en) | Based on the neurological disorder therapy of baclofen and acamprosate | |
| EP3615057B1 (en) | Dosing regimen for treatment of cognitive impairments with blood plasma products | |
| Li et al. | Lithium treatment mitigates white matter injury after intracerebral hemorrhage through brain-derived neurotrophic factor signaling in mice | |
| Wu et al. | Epigenetic manipulation of brain-derived neurotrophic factor improves memory deficiency induced by neonatal anesthesia in rats | |
| CN110151745A (en) | Use the treatment of the autoimmune disorder of rxr agonist | |
| BRPI0708349A2 (en) | pharmaceutical composition and use of peptides | |
| TWI643624B (en) | Use of nano metal in promoting neurite outgrowth and treatment and/or prevention of neurological disorders | |
| CN103028110B (en) | The novelty teabag of antisecretory factor | |
| Herb et al. | Mutism after cerebellar medulloblastoma surgery | |
| Makurina et al. | Aging changes' inhibition of hemostasis and blood rheological features on the background of antioxidant lipisomal preparation" Lipovitam-Beta" application | |
| Xu et al. | Inhibition of adult hippocampal neurogenesis plays a role in sevoflurane-induced cognitive impairment in aged mice through brain-derived neurotrophic factor/tyrosine receptor kinase B and neurotrophin-3/tropomyosin receptor kinase C pathways | |
| RU2545734C1 (en) | Drug preparation for parkinson disease | |
| RU2275924C2 (en) | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof | |
| CN109200292B (en) | Nano complex with effect of treating Alzheimer disease and preparation method and application thereof | |
| AU2009236427A1 (en) | Biological markers and response to treatment for pain, inflammation, neuronal or vascular injury and methods of use | |
| WO2015060746A1 (en) | Combination for treating and/or preventing manifestations of psychiatric, cognitive, behavioral and neurological disorders in the case of organic diseases of the central nervous system having various origins | |
| EA018472B1 (en) | Erythropoietin-containing particles for treatment and prophylaxis of neurologic and hematologic diseases and disorders | |
| Zhang et al. | Resveratrol ameliorates trigeminal Neuralgia-Induced Cognitive deficits by regulating neural ultrastructural remodelling and the CREB/BDNF pathway in rats | |
| US20240100076A1 (en) | Methods and compositions for treating neurodegenerative diseases | |
| ES2902992T3 (en) | Benzodiazepine derivative with activity on the vascular and central nervous systems | |
| Zhao et al. | A novel neuroinflammation-responsive hydrogel based on mimicking naked mole rat brain microenvironment retards neurovascular dysfunction and cognitive decline in Alzheimer’s disease | |
| Critchley et al. | Spinal cord disease: basic science, diagnosis and management | |
| JP7277458B2 (en) | Methods and compositions for treating neurological disorders | |
| US11207354B2 (en) | Schwann cell differentiation promoting agent and a peripheral nerve regeneration promoting agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY KZ RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): AZ BY KZ RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): AM KG MD TJ TM |
|
| TC4A | Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent | ||
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment |