EA016240B1 - Method for forecasting effectiveness of treating psoriasis patients by infliximab - Google Patents
Method for forecasting effectiveness of treating psoriasis patients by infliximab Download PDFInfo
- Publication number
- EA016240B1 EA016240B1 EA200901243A EA200901243A EA016240B1 EA 016240 B1 EA016240 B1 EA 016240B1 EA 200901243 A EA200901243 A EA 200901243A EA 200901243 A EA200901243 A EA 200901243A EA 016240 B1 EA016240 B1 EA 016240B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- treatment
- psoriasis
- infliximab
- gene
- blood serum
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и представляет собой способ определения прогноза эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом. Изобретение может быть использовано для индивидуализации терапии больных псориазом.The present invention relates to medicine, namely to dermatology, and is a method for determining the prognosis of the effectiveness of treatment of patients with psoriasis infliximab. The invention can be used to individualize the treatment of psoriasis patients.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Псориаз является одним из наиболее распространенных заболеваний кожи, он поражает около 1,52% населения. В последние годы в Российской Федерации значительно участились случаи развития тяжелых форм заболевания, приводящих к нарушению трудоспособности, развитию инвалидизации и значительному снижению качества жизни. Традиционные методы лечения тяжелых форм псориаза (фотохимиотерапия, применение иммуносупрессоров и другие) часто оказывают лишь кратковременный эффект в виде непродолжительных ремиссий, что определяет актуальность разработки принципиально новых методов терапии псориаза и прогнозирования их эффективности.Psoriasis is one of the most common skin diseases, it affects about 1.52% of the population. In recent years, cases of the development of severe forms of the disease, leading to disability, the development of disability and a significant decrease in the quality of life, have become much more frequent in the Russian Federation. Traditional methods of treating severe forms of psoriasis (photochemotherapy, the use of immunosuppressants and others) often have only a short-term effect in the form of short remissions, which determines the relevance of developing fundamentally new methods of treating psoriasis and predicting their effectiveness.
Одним из основных звеньев патогенеза псориаза является избыточная продукция медиаторов иммунного ответа - цитокинов, обладающих провоспалительной активностью. Ключевую роль в развитии воспалительной реакции играет фактор некроза опухоли α (ΤΝΡ-α), который индуцирует синтез других провоспалительных цитокинов, включая 1Ь-8, 1Ь-6, ΙΡΝ-γ, а также способствует индукции экспрессии молекул внутриклеточной адгезии, миграции активированных иммунокомпетентных клеток и увеличению продукции сосудистого фактора роста, что приводит к активации пролиферативных процессов в коже.One of the main links in the pathogenesis of psoriasis is the excess production of mediators of the immune response - cytokines with pro-inflammatory activity. The key role in the development of the inflammatory reaction is played by tumor necrosis factor α (ΤΝΡ-α), which induces the synthesis of other pro-inflammatory cytokines, including 1b-8, 1b-6, ΙΡΝ-γ, and also contributes to the induction of expression of intracellular adhesion molecules, migration of activated immunocompetent cells and an increase in the production of vascular growth factor, which leads to the activation of proliferative processes in the skin.
Учитывая важную роль ΤΝΡ-α в патогенезе псориаза, с использованием биотехнологических методов были разработаны принципиально новые лекарственные средства - биологические модификаторы иммунного ответа (БМИО), механизм действия которых основан на блокаде функциональной активности ΤΝΡ-α. Показаниями для назначения этих препаратов являются тяжелое течение заболевания и неэффективность других методов системной терапии псориаза.Considering the important role of ΤΝΡ-α in the pathogenesis of psoriasis, using biotechnological methods, fundamentally new drugs have been developed - biological modifiers of the immune response (BMIO), the mechanism of action of which is based on the blockade of the functional activity of α-α. Indications for the appointment of these drugs are the severe course of the disease and the ineffectiveness of other methods of systemic therapy of psoriasis.
В сравнении с традиционными методами лечения псориаза биологические модификаторы иммунного ответа обладают рядом преимуществ. Благодаря специфичности воздействия на продукцию ΤΝΡ-α биологические агенты оказывают выраженный терапевтический эффект у большинства больных тяжелыми формами псориаза и псориатическим артритом, вызывая регресс псориатических высыпаний, уменьшение болевого синдрома, нормализацию общего состояния и улучшение качества жизни. Оказывая выраженный противовоспалительный эффект, биологические модификаторы иммунного ответа предотвращают развитие инвалидизирующих форм псориаза и псориатического артрита. Длительное сохранение высоких концентраций препарата в сыворотке крови способствует наступлению продолжительных ремиссий заболевания, в течение которых больной псориазом чувствует себя здоровым человеком.In comparison with traditional methods of treating psoriasis, biological modifiers of the immune response have several advantages. Due to the specificity of the effect on продукцию-α production, biological agents have a pronounced therapeutic effect in most patients with severe forms of psoriasis and psoriatic arthritis, causing regression of psoriatic rashes, a decrease in pain, normalization of the general condition and an improvement in the quality of life. Providing a pronounced anti-inflammatory effect, biological modifiers of the immune response prevent the development of disabling forms of psoriasis and psoriatic arthritis. Long-term maintenance of high concentrations of the drug in blood serum contributes to the onset of prolonged remissions of the disease, during which the patient with psoriasis feels a healthy person.
Вместе с тем, далеко не все пациенты отвечают на введение этих препаратов в одинаковой степени. У большинства больных псориазом наблюдается выраженный терапевтический эффект от применения биологических модификаторов иммунного ответа, тогда как в 25-30% случаев отмечается резистентность к проводимой терапии.However, not all patients respond to the administration of these drugs to the same extent. Most patients with psoriasis have a pronounced therapeutic effect from the use of biological modifiers of the immune response, while in 25-30% of cases there is resistance to the therapy.
В настоящее время больным тяжелыми формами псориаза в рамках приоритетного национального проекта Здоровье по профилю Дерматология за счет средств федерального бюджета оказывается высокотехнологичная медицинская помощь с использованием дорогостоящих препаратов, в том числе биологических модификаторов иммунного ответа. Затраты на лечение одного больного псориазом биологическими агентами в Российской Федерации при этом составляют в среднем около 1 млн рублей в год.Currently, patients with severe psoriasis in the framework of the priority national project Health in the profile of Dermatology at the expense of the federal budget provide high-tech medical care using expensive drugs, including biological modifiers of the immune response. The costs of treating one patient with psoriasis with biological agents in the Russian Federation on average amount to about 1 million rubles per year.
С 2007 г. в соответствии с Приказом № 776 от 18 декабря 2007 г. один из биологических модификаторов иммунного ответа (инфликсимаб) включен в утвержденный Минздравсоцразвития стандарт медицинской помощи больным псориатическим артритом. С 2008 г. назначение инфликсимаба вошло в утвержденный Приказом № 780 Минздравсоцразвития от 18 декабря 2007 г. стандарт медицинской помощи больным псориазом. Кроме того, инфликсимаб входит в Перечень лекарственных средств, отпускаемых по рецептам врача (фельдшера) при оказании дополнительной бесплатной медицинской помощи отдельным категориям граждан, имеющим право на получение государственной социальной помощи, утвержденный Приказом № 665 Минздравсоцразвития от 18 сентября 2006 г.Since 2007, in accordance with Order No. 776 of December 18, 2007, one of the biological modifiers of the immune response (infliximab) is included in the standard of care for psoriatic arthritis patients approved by the Ministry of Health and Social Development. Since 2008, the appointment of infliximab has been included in the standard of care for psoriasis patients approved by Order No. 780 of the Ministry of Health and Social Development of December 18, 2007. In addition, infliximab is included in the List of medicines dispensed by prescription of a doctor (paramedic) when providing additional free medical care to certain categories of citizens entitled to receive state social assistance, approved by Order No. 665 of the Ministry of Health and Social Development of September 18, 2006.
Инфликсимаб (К.с1шеабс®) - представитель группы препаратов биологических модификаторов иммунного ответа, полученных с помощью биотехнологических методов и специфично блокирующих рецепторы провоспалительных цитокинов.Infliximab (K.c1cheabs®) is a representative of the group of drugs of biological modifiers of the immune response obtained using biotechnological methods and specifically blocking the pro-inflammatory cytokine receptors.
Инфликсимаб представляет собой химерный белок, сконструированный из фрагментов мышиного и человеческого 1дС1. Он обладает высокой аффинностью к человеческому ΤΝΡ-α, играющему значительную роль в развитии аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в том числе псориаза и псориатического артрита. Механизм его действия основан на связывании и образовании устойчивого соединения с обеими формами человеческого ΤΝΡ-α (растворимой и трансмембранной). Связывание инфликсимаба с ΤΝΡ-α предотвращает взаимодействие последнего с его натуральными рецепторами, блокирует инициацию каскада сигналов, ведущих к генной транскрипции и последующей биологической активности. Такой механизм действия препарата обуславливает его терапевтическую эффективность.Infliximab is a chimeric protein constructed from fragments of mouse and human 1dC1. It has a high affinity for human ΤΝΡ-α, which plays a significant role in the development of autoimmune and inflammatory diseases, including psoriasis and psoriatic arthritis. The mechanism of its action is based on the binding and formation of a stable compound with both forms of human ΤΝΡ-α (soluble and transmembrane). The binding of infliximab with ΤΝΡ-α prevents the interaction of the latter with its natural receptors, blocks the initiation of a cascade of signals leading to gene transcription and subsequent biological activity. This mechanism of action of the drug determines its therapeutic effectiveness.
- 1 016240- 1 016240
Специфичность инфликсимаба по отношению к ΤΝΓ-α подтверждена его неспособностью нейтрализовать цитотоксический эффект лимфотоксина-α (ЬТ-α или ΤΝΓ-β) - цитокина, который может связываться с теми же рецепторами, что и ΤΝΓ-α.The specificity of infliximab with respect to ΤΝΓ-α is confirmed by its inability to neutralize the cytotoxic effect of lymphotoxin-α (LТ-α or ΤΝΓ-β), a cytokine that can bind to the same receptors as ΤΝΓ-α.
Препарат вводится больным псориазом в дозировке 5 мг/кг массы тела внутривенно капельно медленно по схеме 0-2-6 недель и затем каждые 8 недель.The drug is administered to patients with psoriasis in a dosage of 5 mg / kg of body weight intravenously drip slowly according to the scheme 0-2-6 weeks and then every 8 weeks.
По данным компании 8с11сппд-Р1оид11 (США) в 2007 г. курс лечения инфликсимабом в РФ получали как минимум 300 пациентов. Из них около 200 больных получили препарат за счет средств федерального бюджета и стоимость их лечения составила не менее 200 млн руб. в год.According to 8s11spppd-P1oid11 (USA), in 2007 at least 300 patients received a course of treatment with infliximab in the Russian Federation. Of these, about 200 patients received the drug at the expense of the federal budget and the cost of their treatment was at least 200 million rubles. in year.
В связи с включением данного препарата в утвержденный протокол лечения псориаза доля затраченных на приобретение инфликсимаба средств федерального бюджета может резко возрасти. Отмена препарата даже у 10% больных по причине заведомой неэффективности позволит сэкономить не менее 20 млн руб. ежегодно.Due to the inclusion of this drug in the approved protocol for the treatment of psoriasis, the share of the federal budget spent on the acquisition of infliximab can increase sharply. Discontinuation of the drug even in 10% of patients due to deliberate inefficiency will save at least 20 million rubles. annually.
Учитывая высокую стоимость лечения больных псориазом биологическими модификаторами иммунного ответа, а также возможность развития нежелательных побочных реакций на лечение у больных, особую актуальность представляет персонализированный подход к назначению такой терапии, который должен быть основан на разработке методов, позволяющих до назначения лечения прогнозировать его терапевтическую эффективность. Анализ доступной литературы и предварительные патентные исследования показали, что в настоящее время такого подхода к назначению лечения больных псориазом биологическими модификаторами иммунного ответа не существует.Given the high cost of treating patients with psoriasis with biological modifiers of the immune response, as well as the possibility of developing unwanted adverse reactions to treatment in patients, the personalized approach to prescribing such therapy, which should be based on the development of methods that allow predicting its therapeutic effectiveness before prescribing treatment, is of particular relevance. An analysis of the available literature and preliminary patent studies have shown that at present there is no such approach to prescribing treatment of psoriasis patients with biological modifiers of the immune response.
При проведении патентного поиска был выявлен лишь один патент, касающийся способа прогнозирования терапевтической эффективности и индивидуального подхода к лечению воспалительных и аутоиммунных заболеваний.When conducting a patent search, only one patent was identified regarding a method for predicting therapeutic efficacy and an individual approach to the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.
Изобретение в соответствии с международной патентной публикацией \УО 2005/054850, принадлежащее Робей Вохсй СсхсПхсНаП бит Мсб|/ткс11с Гогасйиид (Германия), относится к способам диагностики для прогнозирования терапевтической эффективности и индивидуального подхода к лечению воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Этот метод азатиоприновой терапии (определяется уровень 6тиогуанозиннуклеотида в пробах) предназначен для диагностики воспалительных и аутоиммунных желудочно-кишечных болезней: болезни Крона и язвенного колита. Азатиоприн - иммунносупрессивный и противовоспалительный агент, который часто используют для лечения хронических воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, билиарный цирроз печени. Также раскрыты новые способы терапевтического мониторинга при лечении азатиоприном (имураном) либо оптимизации клинической ответной реакции пациента на азатиоприновую терапию по изменению уровня 6-тиогуанозиннуклеотида в пробах, полученных от пациента. Однако это изобретение основано на использовании соединений, принципиально отличных от биологических модификаторов иммунного ответа как структурно, так и по механизму действия, а кроме того, не относится к способам прогнозирования терапевтической эффективности при лечении псориаза.The invention, in accordance with the international patent publication UO 2005/054850, owned by Robey Wohsch SschsPhsNaP bit Msb | / tks11s Gogasyyid (Germany), relates to diagnostic methods for predicting therapeutic efficacy and an individual approach to the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. This method of azathioprine therapy (determined by the level of 6thioguanosine nucleotide in samples) is intended for the diagnosis of inflammatory and autoimmune gastrointestinal diseases: Crohn's disease and ulcerative colitis. Azathioprine is an immunosuppressive and anti-inflammatory agent that is often used to treat chronic inflammatory diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and biliary cirrhosis. Also disclosed are new methods of therapeutic monitoring in the treatment of azathioprine (imuran) or optimization of the patient's clinical response to azathioprine therapy by changing the level of 6-thioguanosine nucleotide in samples received from the patient. However, this invention is based on the use of compounds that are fundamentally different from biological modifiers of the immune response both structurally and by the mechanism of action, and, moreover, does not apply to methods for predicting therapeutic efficacy in the treatment of psoriasis.
Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом на уровне молекулярных мишеней его фармакологического воздействия с целью использования в качестве критерия отбора пациентов для целенаправленного проведения медикаментозной терапии инфликсимабом.The objective of the invention is to develop a method for predicting the effectiveness of treatment of patients with psoriasis with infliximab at the level of molecular targets of its pharmacological effects in order to use patients as a criterion for the selection of targeted therapy with infliximab.
Технический результат изобретения заключается в возможности прогнозирования эффективности терапии больных псориазом инфликсимабом на основании определения молекулярных маркеров в биоптате кожи и сыворотке крови больных до лечения, что позволяет экономить значительные материальные средства, затрачиваемые на лечение, а также избежать побочных эффектов терапии.The technical result of the invention consists in the possibility of predicting the effectiveness of treatment of patients with psoriasis infliximab based on the determination of molecular markers in the biopsy of the skin and blood serum of patients before treatment, which saves significant material resources spent on treatment, and also avoids the side effects of therapy.
Это достигается за счет того, что у больного производят забор биоптата кожи с очага поражения и забор крови из локтевой вены; осуществляют гомогенизацию биоптата кожи и производят выделение ДНК, амплификацию ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΓ-Κ-ΙΙ; детекцию и визуализацию продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΓ-Κ-ΙΙ (оценочный электрофорез); обработку амплификатов рестриктазой ΝΙαΙΙΙ; детекцию и визуализацию продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2) и анализ полученных результатов; стандартным способом получают сыворотку крови и в ней проводят определение содержания интерлейкина 16--10 с использованием технологии хМАР.This is achieved due to the fact that the patient biopsy of the skin from the lesion and blood sampling from the ulnar vein; homogenization of skin biopsy and DNA extraction, amplification of DNA fragment 6 of the exon of the gene ΤΝΓ-Κ-ΙΙ; detection and visualization of amplification products of DNA of exon fragment 6 of the ΤΝΓ-Κ-ΙΙ gene (evaluative electrophoresis); treatment of amplifications with restriction enzyme ΝΙαΙΙΙ; detection and visualization of restriction products (evaluation electrophoresis 2) and analysis of the results; in a standard way, blood serum is obtained and the content of interleukin 16-10 is determined in it using xMAP technology.
Результатом проведенного исследования является определение генотипа больного псориазом в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΓ-Κ-ΙΙ; при этом при выявлении гомозиготного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΓ-Κ-ΙΙ прогнозируют высокую эффективность лечения больного псориазом инфликсимабом, а при выявлении гомозиготного генотипа ОО позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΓ-ΚΙΙ прогнозируют низкую эффективность лечения.The result of the study is the determination of the genotype of a patient with psoriasis at position 676 of the sixth exon of the ΤΝΓ-Κ-г gene; while identifying the TT homozygous genotype at position 676 of the sixth exon of the ΤΝΓ-Κ-ена gene, the treatment of a patient with psoriasis infliximab is predicted to be highly effective, while identifying the homozygous OO genotype of position 676 of the sixth exon of the ΤΝΓ-ΚΙΙ gene predicts a low treatment efficiency.
Настоящее изобретение было создано в ходе выполнения научно-исследовательской работы Разработка молекулярных методов повышения эффективности лечения псориаза препаратами биологических модификаторов иммунного ответа (Государственный контракт 02.512.11.2199 от 12.05.2008 г.).The present invention was created in the course of research work. The development of molecular methods to increase the effectiveness of the treatment of psoriasis with drugs of biological modifiers of the immune response (State contract 02.512.11.2199 from 05/12/2008).
Объектом исследования являлись 22 больных тяжелыми и среднетяжелыми формами псориаза, поThe object of the study were 22 patients with severe and moderate forms of psoriasis, according to
- 2 016240 лучавшие лечение инфликсимабом. Для оценки эффективности терапии больных псориазом инфликсимабом и проведения статистической обработки данных был применен объективный критерий - изменение площади поражения кожи пациентов псориатическими высыпаниями под влиянием проведенной терапии - ΔΡΑ8Ι. В зависимости от результата лечения инфликсимабом больные были разделены на 2 группы: первую группу (14 человек) составили пациенты с хорошим эффектом от проведенного лечения, у которых величина ΔΡΆ8Ι была >75%. Вторую группу (8 человек) составили пациенты с недостаточным эффектом или отсутствием эффекта от терапии инфликсимабом, у которых величина ΔΡΆ8Ι составила менее 75%.- 2016240 treated with infliximab treatment. An objective criterion was applied to assess the effectiveness of therapy with psoriasis infliximab and to carry out statistical data processing - the change in the area of skin lesions of patients with psoriatic rashes under the influence of the therapy - ΔΡΑ8Ι. Depending on the result of treatment with infliximab, the patients were divided into 2 groups: the first group (14 people) consisted of patients with a good effect of the treatment, in which the ΔΡΆ8Ι value was> 75%. The second group (8 people) consisted of patients with insufficient or no effect from infliximab therapy, in which the ΔΡΆ8Ι value was less than 75%.
При проведении исследований до начала лечения у пациентов проводилось изучение молекулярной структуры гена ΤΝΡ-α, кодирующего молекулярную мишень инфликсимаба - цитокин ΤΝΡ-α;When conducting research before treatment, patients studied the molecular structure of the ΤΝΡ-α gene encoding the molecular target of infliximab - the cytokine ΤΝΡ-α;
молекулярной структуры генов, кодирующих рецепторы ΤΝΡ-α (первого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-Ι и шестого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ);the molecular structure of genes encoding ΤΝΡ-α receptors (the first exon of the ΤΝΡ-Κ.-г gene and the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-г gene);
содержания провоспалительных и воспалительных цитокинов в сыворотке крови больных псориазом.the content of pro-inflammatory and inflammatory cytokines in the blood serum of patients with psoriasis.
В результате проведенных исследований было установлено, что между группами больных существуют различия генотипа в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ. При этом частота встречаемости гомозиготного ТТ генотипа гена в 676 положении у больных с выраженным ответом на инфликсимаб была достоверно выше (р<0,05), чем у пациентов с недостаточно выраженным ответом на препарат или отсутствием ответа. Напротив, частота встречаемости гомозиготного ОС генотипа гена в 676 положении была достоверно выше (р<0,01) у больных с отсутствием ответа или ослабленным ответом на инфликсимаб в сравнении с больными с выраженным ответом на данный препарат. Полученные данные были подтверждены результатами корреляционного анализа: гомозиготный ТТ генотип гена в 676 положении ассоциировался с высокой интенсивностью ответа больного на лечение инфликсимабом, а гомозиготный ОС генотип гена в 676 положении - с ослабленным ответом на лечение инфликсимабом.As a result of the studies, it was found that between the groups of patients there are differences in the genotype at position 676 of the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-г gene. At the same time, the frequency of occurrence of a homozygous TT gene genotype at position 676 in patients with a pronounced response to infliximab was significantly higher (p <0.05) than in patients with an insufficiently expressed response to the drug or lack of response. In contrast, the frequency of occurrence of homozygous OS of the gene genotype at position 676 was significantly higher (p <0.01) in patients with no response or a weakened response to infliximab compared with patients with a pronounced response to this drug. The obtained data were confirmed by the results of correlation analysis: a homozygous TT gene genotype at position 676 was associated with a high intensity of the patient's response to treatment with infliximab, and a homozygous OS genotype at 676 position was associated with a weakened response to infliximab treatment.
Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что генотип в положении 676 в шестом экзоне гена ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ может быть ответственен за различный клинический ответ на инфликсимаб у пациентов с псориазом.Thus, the studies performed have established that the genotype at position 676 in the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-г gene may be responsible for the different clinical response to infliximab in patients with psoriasis.
В результате изучения уровня выбранных для исследования цитокинов в сыворотке крови больных псориазом (ΤΝΡ-α, ΙΕ-6, ΙΕ-8, ΙΠ-10) было установлено, что единственным значимым критерием, позволяющим прогнозировать эффективность терапии больных псориазом инфликсимабом (разница между группами больных статистически достоверна р<0,001), является определяемый до лечения в сыворотке крови уровень ΙΠ-10, высокие значения которого - >2,7 пг/мл (нижний предел высокого значения с учетом ошибки средней величины; средние значения по группе 2,9±0,3) - позволяют прогнозировать высокую эффективность лечения больных псориазом инфликсимабом, а низкие значения - <1,0 пг/мл (верхний предел низкого значения с учетом ошибки средней величины; средние значения по группе 0,7±0,3 пг/мл) - позволяют прогнозировать низкую эффективность лечения или отсутствие эффекта от лечения данным препаратом. При расчете корреляционных связей между уровнем интерлейкинов и результатами проведенной терапии, проведенном с использованием коэффициента Спирмена, было установлено, что концентрация ΙΠ-10 до лечения существенно и положительно коррелирует с изменением ΡΆ8Ι, т.е. чем выше у больного уровень ΙΠ-10 до лечения, тем больше шансов на хороший результат лечения. Данный результат был получен при использовании современной технологии хМАР, обладающей высокой аналитической чувствительностью.As a result of studying the level of psoriasis patients selected for the study of cytokines in the blood serum (ΤΝΡ-α, ΙΕ-6, ΙΕ-8, ΙΠ-10), it was found that the only significant criterion that allows predicting the effectiveness of therapy with psoriasis infliximab (the difference between groups of patients statistically significant p <0.001), the ΙΠ-10 level determined before treatment in blood serum is high, the values of which are> 2.7 pg / ml (the lower limit of the high value, taking into account the error of the average value; the average values in the group are 2.9 ± 0 , 3) - allow prog to indicate the high efficiency of treatment for patients with psoriasis infliximab, and low values <1.0 pg / ml (the upper limit of the low value taking into account the error of the average value; group averages 0.7 ± 0.3 pg / ml) - allow predicting low efficiency treatment or lack of effect of treatment with this drug. When calculating the correlation between the level of interleukins and the results of the therapy performed using the Spearman coefficient, it was found that the concentration of ΙΠ -10 before treatment significantly and positively correlates with a change in ΡΆ8Ι, i.e. the higher the patient’s level of ΙΠ-10 before treatment, the greater the chance of a good treatment result. This result was obtained using modern xMAP technology with high analytical sensitivity.
Проведенные исследования позволили установить, что начальный (до проведения лечения) уровень в сыворотке крови ΙΠ-10 ассоциируется с различным клиническим ответом на инфликсимаб у пациентов с псориазом.Studies have shown that the initial (before treatment) level in the blood serum руется-10 is associated with a different clinical response to infliximab in patients with psoriasis.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом путем определения молекулярного состава образца биопсии кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения, предусматривающему получение и исследование биоптата кожи и сыворотки крови больного псориазом и отличающемуся тем, что осуществляют определение полиморфизма в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ, а в сыворотке крови проводят определение содержания ΙΠ-10 и при выявлении гомозиготного генотипа ТТ в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ и высоком содержании ΙΠ-10 в сыворотке прогнозируют высокую эффективность лечения, а при выявлении гомозиготного генотипа ОС позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ и низком содержании ΙΠ-10 в сыворотке прогнозируют низкую эффективность лечения.Thus, the present invention relates to a method for predicting the effectiveness of treatment of patients with psoriasis with infliximab by determining the molecular composition of a biopsy sample of the skin and blood serum of a patient with psoriasis before treatment, comprising obtaining and examining a biopsy of the skin and blood serum of a patient with psoriasis and characterized in that the polymorphism is determined in position 676 of the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-г gene, and in the blood serum, the content of ΙΠ-10 is determined and if a homozygous gene is detected type TT at position 676 of the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-ена gene and a high content of ΙΠ-10 in serum predict high treatment efficiency, and if a homozygous OS genotype of position 676 of the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-ΙΙ gene and low content of ΙΠ-10 is detected in serum predict low treatment efficacy.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения высоким содержанием ΙΠ-10 в сыворотке крови является содержание >2,7 пг/мл, а низким содержанием ΙΠ-10 в сыворотке крови является содержание <1,0 пг/мл.According to preferred embodiments of the present invention, a high serum content of ΙΠ-10 is> 2.7 pg / ml and a low ΙΠ -10 content of blood serum is <1.0 pg / ml.
Приведенные ниже примеры клинического применения настоящего изобретения позволяют заключить, что разработанный способ прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом может быть применен для решения вопроса о целесообразности назначения терапии больнымThe following examples of clinical applications of the present invention allow us to conclude that the developed method for predicting the effectiveness of treatment for patients with psoriasis infliximab can be used to solve the question of the advisability of prescribing therapy to patients
- 3 016240 псориазом данным препаратом.- 3 016240 psoriasis with this drug.
Разработанный способ имеет важную медицинскую и социальную значимость. Учитывая высокую стоимость лечения биологическими модификаторами иммунного ответа и государственное финансирование курсового лечения больных тяжелыми формами псориаза, разработанный способ позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности назначения дорогостоящего курса лечения биологическими агентами конкретному пациенту и сэкономить значительные материальные средства госбюджета. Кроме того, способ позволяет предупредить развитие побочных эффектов при лечении больных псориазом биологическими модификаторами иммунного ответа.The developed method has important medical and social significance. Considering the high cost of treatment with biological modifiers of the immune response and state funding for the course treatment of patients with severe forms of psoriasis, the developed method allows you to make informed decisions about the appropriateness of prescribing an expensive course of treatment with biological agents to a particular patient and save significant material budget funds. In addition, the method allows to prevent the development of side effects in the treatment of patients with psoriasis with biological modifiers of the immune response.
Краткое описание чертежаBrief Description of the Drawing
На чертеже изображена электрофореграмма амплифицированных и рестрицированных фрагментов ДНК шестого экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ. 1 - после рестрикции генотип СС; 2 - после рестрикции генотип ТТ; 3 - маркер молекулярных масс 100 Ь.р. (100-1000); 4 - после амплификации до рестрикции.The drawing shows an electrophoregram of amplified and restricted DNA fragments of the sixth exon of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene. 1 - after restriction, the CC genotype; 2 - after restriction the TT genotype; 3 - molecular weight marker 100 bp (100-1000); 4 - after amplification to restriction.
Примеры предпочтительных вариантов осуществления изобретенияExamples of preferred embodiments of the invention
Пример 1. Лабораторно-диагностическая методика прогнозирования эффективности лечения больных псориазом инфликсимабом путем определения молекулярного состава образца биопсии кожи и сыворотки крови больного псориазом до начала лечения.Example 1. Laboratory diagnostic method for predicting the effectiveness of treatment of patients with psoriasis infliximab by determining the molecular composition of a biopsy sample of the skin and blood serum of a patient with psoriasis before treatment.
У больного псориазом до начала лечения производят забор биоптата кожи с очага поражения и забор крови из локтевой вены.A psoriasis patient prior to treatment begins to take a skin biopsy from the lesion and blood sampling from the ulnar vein.
Забор и подготовка биоптата кожи для исследования.Fence and preparation of a skin biopsy for research.
Взятие образца из участка пораженной кожи пациента проводится в условиях малой операционной (специальной процедурной комнаты) с использованием стерильных инструментов и расходных материалов и применением местной анестезии. Для получения материала используется медицинский скальпель. Непосредственно перед забором материала проводят обработку операционного поля 70% раствором этилового спирта, местное обезболивание проводят 2% раствором лидокаина или новокаина в количестве 5 мл. Местный анестетик вводят непосредственно под кожу. Иссекаемый участок, длина которого в три раза превышает ширину, очерчивают эллипсовидным разрезом, погружая скальпель на 0,3 см. Длинная ось эллипса располагается вдоль линий натяжения кожи. Разрез делают скорее вертикально, чем под углом. Отделение лоскута кожи проводят при оттягивании лоскута пинцетом и подрезании его скальпелем с нижней части. На дефект кожи накладывают 1-2 кетгутовых шва. На операционную рану накладывают асептическую повязку. Биоптат помещают в сухие пробирки с плотно закрывающимися крышками. Биоптат немедленно передают в лабораторию для исследования. При невозможности немедленного проведения исследования биоптат помещают в сосуд Дюара с жидким азотом. Повторное замораживание и размораживание образцов не допускается. Оттаивание образца перед исследованием производится в условиях комнатной температуры (при +18-25°С) до полного оттаивания.A sample is taken from the site of the affected skin of the patient in a small operating room (special treatment room) using sterile instruments and supplies and local anesthesia. To obtain the material, a medical scalpel is used. Immediately before sampling the material, the surgical field is treated with a 70% solution of ethyl alcohol, local anesthesia is performed with a 2% solution of lidocaine or novocaine in an amount of 5 ml. A local anesthetic is injected directly under the skin. The excised area, the length of which is three times the width, is outlined with an ellipsoidal section, immersing the scalpel by 0.3 cm. The long axis of the ellipse is located along the skin tension lines. The incision is done more vertically than at an angle. The skin flap is separated by pulling the flap with tweezers and cutting it with a scalpel from the bottom. 1-2 catgut sutures are applied to the skin defect. An aseptic dressing is applied to the surgical wound. The biopsy specimen is placed in dry test tubes with tight-fitting lids. The biopsy is immediately transferred to the laboratory for research. If it is impossible to immediately conduct the study, the biopsy sample is placed in a Dewar vessel with liquid nitrogen. Repeated freezing and thawing of samples is not allowed. Thawing of the sample before examination is carried out at room temperature (at + 18-25 ° C) until complete thawing.
Для проведения молекулярно-генетических исследований биоптат должен быть гомогенизирован. Измельчение биоптата кожи осуществляется механическим способом при высокоскоростном движении специальных металлических шариков с использованием автоматической станции для разрушения и гомогенизации биологических образцов Т188иеЬу8ег II.To conduct molecular genetic studies, the biopsy specimen must be homogenized. The skin biopsy is mechanically crushed during high-speed movement of special metal balls using an automatic station for the destruction and homogenization of biological samples of T188b2e8eg II.
Для этого каждый биоптат помещается в пластиковую одноразовую пробирку объемом 1,5 или 2 мл в зависимости от размера биоптата. В данную пробирку добавляется 200 мкл реагента Ττίζοί (лизирующего реагента) из коммерческого набора для выделения РНК и помещается один металлический шарик размером 0,3 мм (для 1,5 мл пробирок) или 0,5 мм (для 2 мл пробирок) с помощью пинцета или специальной пипетки-дозатора соответственно. Далее пробирка помещается в прибор на 2-5 мин при частоте движения шариков 30 ударов/с до полной гомогенизации биоптата. Наступление полной гомогенизации контролируется визуально, образец должен представлять собой однородную суспензию без крупных частиц. После завершения вышеописанной процедуры 200 мкл полученного гомогената переносятся в чистую пробирку объемом 1,5 мл.For this, each biopsy sample is placed in a plastic disposable tube with a volume of 1.5 or 2 ml, depending on the size of the biopsy sample. 200 μl of Ττίζοί reagent (lysing reagent) from a commercial RNA isolation kit is added to this tube and one metal ball 0.3 mm in size (for 1.5 ml tubes) or 0.5 mm (for 2 ml tubes) is placed with tweezers or a special pipette-dispenser, respectively. Next, the test tube is placed in the device for 2-5 minutes at a frequency of movement of balls of 30 beats / s until the biopsy specimen is completely homogenized. The onset of complete homogenization is visually controlled, the sample should be a homogeneous suspension without large particles. After completion of the above procedure, 200 μl of the resulting homogenate are transferred to a clean 1.5 ml tube.
В связи с тем, что металлические шарики предназначены для многократного использования, после окончания процедуры гомогенизации каждый шарик переносится в пластиковый контейнер с водным раствором моющего средства, затем промывается дистиллированной водой и автоклавируется.Due to the fact that metal balls are intended for repeated use, after the homogenization procedure is completed, each ball is transferred to a plastic container with an aqueous solution of detergent, then it is washed with distilled water and autoclaved.
Проведение исследования биоптата кожи.Conducting a skin biopsy study.
Исследование биоптата кожи включает ряд этапов: выделение ДНК;The study of skin biopsy includes a number of steps: DNA extraction;
амплификация ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ;amplification of DNA fragment 6 of the exon of the gene ΤΝΕ-Κ-ΙΙ;
детекция и визуализация продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ (оценочный электрофорез);detection and visualization of amplification products of DNA of exon fragment 6 of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene (estimated electrophoresis);
рестрикция продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ;restriction of amplification products of DNA of exon fragment 6 of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene;
детекция и визуализация продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2); анализ полученных результатов.detection and visualization of restriction products (evaluation electrophoresis 2); analysis of the results.
Выделение ДНК из биоптата.Isolation of DNA from a biopsy.
После завершения процедуры гомогенизации 400 мкл полученного гомогената переносятся в чистую пробирку объемом 1,5 мл. К полученному гомогенату добавляется 12 мкл протеиназы К (конечнаяUpon completion of the homogenization procedure, 400 μl of the resulting homogenate are transferred to a clean 1.5 ml tube. 12 μl of proteinase K (final
- 4 016240 концентрация 20 мг/мл) и инкубируется в течение 20 ч при 37°С.- 4 016240 concentration of 20 mg / ml) and incubated for 20 hours at 37 ° C.
Дальнейшее выделение ДНК осуществляется с использованием коммерческого набора реагентов ΟίαΙοιη™ ΌΝΑ Ргер 100. Выделение ДНК проводится в боксе биологической безопасности во избежание загрязнения помещения и последующей контаминации инкубационной смеси чужеродной ДНК при постановке ПЦР.Further DNA isolation is carried out using a commercial set of reagents ΟίαΙοιη ™ ΌΝΑ Rger 100. DNA isolation is carried out in a biological safety box to avoid contamination of the room and subsequent contamination of the incubation mixture of foreign DNA during PCR.
В состав набора реагентов ΟίαΙοιηΙΛ1 ΌΝΆ Ргер 100 входит лизирующий реагент (Ьу515 геадеп!) с гуанидинтиоцианатом, в присутствии которого ДНК активно сорбируется на сорбенте М1с1еоЗ (суспензия сорбента), затем отмывается от белков и солей спиртовым раствором.The reagent kit ΟίαΙοιη ΙΛ1 ΌΝΆ Rger 100 includes a lysing reagent (Li515 geadep!) With guanidine thiocyanate, in the presence of which DNA is actively sorbed on the sorbent M1c1eOZ (suspension of the sorbent), then it is washed from proteins and salts with an alcohol solution.
В пробирку объемом 1,5 мл к полученному лизату добавляется 400 мкл лизирующего реагента, содержимое пробирки перемешивается переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Далее пробирка со смесью термостатируется при 65°С в течение 1 ч. После термостатирования пробирка со смесью центрифугируется в течение 15 с при 5000 д (»12000 об/мин) в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворимый остаток. Прозрачный супернатант целиком переносится в чистую пробирку объемом 1,5 мл и к нему добавляется 20 мкл суспензии сорбента М1с1еоЗ. Перед использованием М1с1еоЗ интенсивно встряхивается на вортексе. Пробирка помещается на ротатор, перемешивается в течение 30-40 мин (10-20 об/мин), затем центрифугируется в течение 15 с при 5000 д. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. К осадку добавляется 200 мкл лизирующего реагента, смесь тщательно перемешивается на вортексе до полного гомогенного состояния. Если суспендирование затруднено из-за сильного слипания сорбента, которое может быть обусловлено высоким содержанием ДНК, то сорбент необходимо вначале осторожно суспендировать пипетированием, а затем перемешать на вортексе. Затем в пробирку добавляется 1 мл рабочего раствора солевого буфера для отмывки ДНК. Содержимое пробирки перемешивается переворачиванием пробирки 5-10 раз и центрифугируется в течение 15 с при 5000 д. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. К осадку добавляется 1 мл рабочего раствора солевого буфера, содержимое пробирки перемешивается на вортексе и центрифугируется в течение 15 с при 5000 д. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. Процедура отмывки ДНК повторяется еще один раз. Осадок подсушивается при температуре 65°С в течение 4-5 мин. ДНК элюируется из сорбента путем добавления 50-100 мкл Ех1гадепе Е (100 мкл добавляется, если выделение проводится из цельной крови или другой пробы, содержащей большое количество ДНК). Ех1гадепе Е отбирается из пробирки при постоянном перемешивании. Далее содержимое пробирки суспендируется на вортексе в течение 5-10 с до получения гомогенной суспензии, затем термостатируется при 65°С в течение 5-10 мин, еще раз суспендируется на вортексе и центрифугируется в течение 1 мин при 10000 д. Полученный раствор, содержащий ДНК, пригоден для дальнейшего использования. Однако через 2-3 дня рекомендуется центрифугировать данный раствор, содержащий сорбент, в течение 1 мин при 10000 д и перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку объемом 1,5 мл. ДНК хранится при температуре 4°С. При длительном хранении рекомендуется перенести пробирки с ДНК в температуру -20°С.400 μl of the lysing reagent is added to the 1.5 ml test tube to the resulting lysate, the contents of the test tube are mixed by inversion (5-10 times). Intensive shaking of the mixture is not recommended. Further, the tube with the mixture is thermostated at 65 ° C for 1 h. After the temperature control, the tube with the mixture is centrifuged for 15 s at 5000 d (»12000 rpm) if the mixture contains unsolubilized cell debris or other insoluble residue. The transparent supernatant is completely transferred to a clean tube with a volume of 1.5 ml and 20 μl of a suspension of the M1c1eOZ sorbent is added to it. Before use, M1c1eoZ is vigorously shaken on the vortex. The tube is placed on a rotator, mixed for 30-40 minutes (10-20 rpm), then centrifuged for 15 s at 5000 d. The supernatant is carefully removed without touching the pellet. 200 μl of lysing reagent is added to the precipitate, the mixture is thoroughly mixed on a vortex until completely homogeneous. If the suspension is difficult due to the strong adhesion of the sorbent, which may be due to the high DNA content, then the sorbent must first be carefully suspended by pipetting, and then mix on a vortex. Then, 1 ml of a working solution of saline buffer for washing DNA is added to the test tube. The contents of the tube are mixed by turning the tube 5-10 times and centrifuged for 15 s at 5000 d. The supernatant is carefully removed without touching the pellet. 1 ml of the working solution of saline buffer is added to the precipitate, the contents of the tube are mixed on a vortex and centrifuged for 15 s at 5000 d. The supernatant is carefully removed without touching the precipitate. The DNA washing procedure is repeated one more time. The precipitate is dried at a temperature of 65 ° C for 4-5 minutes. DNA is eluted from the sorbent by adding 50-100 μl of Ex1gadepe E (100 μl is added if the isolation is from whole blood or another sample containing a large amount of DNA). Exhadepe E is taken from the tube with constant stirring. Next, the contents of the tube are suspended on a vortex for 5-10 s until a homogeneous suspension is obtained, then thermostated at 65 ° C for 5-10 minutes, suspended again on a vortex and centrifuged for 1 min at 10,000 d. The resulting solution containing DNA Suitable for future use. However, after 2-3 days it is recommended to centrifuge this solution containing the sorbent for 1 min at 10,000 d and transfer the supernatant with DNA to a clean 1.5 ml tube. DNA is stored at 4 ° C. For long-term storage, it is recommended to transfer the DNA tubes to a temperature of -20 ° C.
Амплификация ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ.Amplification of DNA fragment 6 of the exon of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene.
Для выделения ДНК шестого экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ использованы следующие праймеры, характеристика которых представлена в табл. 1.To isolate the DNA of the sixth exon of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene, the following primers were used, the characteristics of which are presented in Table. one.
Таблица1 Праймеры для выделения ДНК и проведения амплификации шестого экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙTable 1 Primers for DNA isolation and amplification of the sixth exon of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene
Чтобы избежать контаминации, сбор амплификационной смеси проводится в стерильном ламинаре.To avoid contamination, the amplification mixture is collected in a sterile laminar.
Амплификация осуществляется с использованием коммерческого набора реагентов Набор реагентов для проведения ПЦР (фирма Синтол, Россия). Перед проведением реакции подготавливается нужное количество ПЦР пробирок объемом 0,2 мл. Пробирки маркируются соответствующим образом: положительный (К+), отрицательный (К-) контроли и исследуемые пробы (указывается номер пробы).Amplification is carried out using a commercial set of reagents. A set of reagents for PCR (Synthol, Russia). Before the reaction, the required number of PCR tubes of 0.2 ml is prepared. Test tubes are marked accordingly: positive (K +), negative (K-) controls and test samples (indicate the number of the sample).
Затем приготавливается амплификационная смесь, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (табл. 2).Then an amplification mixture is prepared, including the following volumes of components per tube (table. 2).
- 5 016240- 5 016240
Таблица 2table 2
Состав амплификационной смесиThe composition of the amplification mixture
После приготовления смесь компонентов перемешивается и центрифугируется на вортексе.After preparation, the mixture of components is mixed and centrifuged on a vortex.
Затем в каждую пробирку объемом 0,2 мл вносится по 20 мкл приготовленной амплификационной смеси и по 5 мкл исследуемого образца ДНК или отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используется 6Н2О. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл.Then, 20 μl of the prepared amplification mixture and 5 μl of the test DNA sample or negative control are added to each 0.2 ml tube. 6H 2 O is used as a negative control. The total volume of the reaction mixture is 25 μl.
ПЦР проводится в амплификаторе Эуаб. На первой стадии образцы подвергаются тепловой денатурации при 96°С в течение 10 мин. Затем следуют 35 циклов, состоящие из стадии денатурации ДНК: 96°С, 30 с, отжига праймеров: 60°С, 30 с и синтеза ДНК: 72°С, 60 с. На последней стадии образцы подвергаются обработке при 72°С в течение 10 мин.PCR is carried out in the Euab amplifier. In the first stage, the samples undergo thermal denaturation at 96 ° C for 10 min. This is followed by 35 cycles consisting of the stage of DNA denaturation: 96 ° C, 30 s, annealing of primers: 60 ° C, 30 s and DNA synthesis: 72 ° C, 60 s. In the last stage, the samples are processed at 72 ° C for 10 min.
Детекция и визуализация продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ (оценочный электрофорез).Detection and visualization of amplification products of DNA of exon fragment 6 of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene (estimated electrophoresis).
A) . Приговление 2%-ного агарозного геля. Приготовление геля проводится в соответствии с указаниями Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984. Для приготовления 75 мл 2%-ного агарозного геля к 1,5 г агарозы добавляется 7,5 мл 10-кратного трисборатного буфера (10хТВЕ) и 67,5 мл дистиллированной воды. Приготовленная смесь прогревается в СВЧ-печи 5-7 мин (до полного растворения агарозы), затем в нее добавляется 8-10 мкл бромистого этидия (10 мг/мл) и перемешивается. Расплавленная агароза охлаждается до температуры 50-60°С и заливается в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов на планшет устанавливается одна или две гребенки. В некоторых случаях при установлении гребенок используются зажимы типа бульдог (в зависимости от модели камеры для горизонтального электрофореза). Раствор агарозы застывает за 15-30 мин при комнатной температуре.A). Sagging of a 2% agarose gel. The preparation of the gel is carried out in accordance with the instructions of Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning. M., Mir, 1984. To prepare 75 ml of a 2% agarose gel, 7.5 ml of 10-fold trisborate buffer (10 × TBE) and 67.5 ml of distilled water are added to 1.5 g of agarose. The prepared mixture is heated in a microwave oven for 5-7 minutes (until the agarose is completely dissolved), then 8-10 μl of ethidium bromide (10 mg / ml) is added to it and mixed. The molten agarose is cooled to a temperature of 50-60 ° C and poured into a tablet for pouring the gel. To obtain pockets on an agarose gel for applying samples to a plate, one or two combs are installed. In some cases, when installing combs, bulldog type clamps are used (depending on the model of the camera for horizontal electrophoresis). The agarose solution solidifies in 15-30 minutes at room temperature.
Б). Разделение продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ методом горизонтального электрофореза.B) Separation of amplification products of DNA of exon fragment 6 of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene by horizontal electrophoresis.
В камеру для горизонтального электрофореза помещается 1хТВЕ буфер, приготовленный разбавлением 10хТВЕ буфера дистиллированной водой.A 1 x TBE buffer prepared by diluting 10 x TBE buffer with distilled water is placed in a horizontal electrophoresis chamber.
После застывания агарозы гребенка/гребенки осторожно вынимается/ются из геля. Планшет с агарозным гелем переносится в камеру для проведения электрофореза. 1хТВЕ буфер должен покрывать агарозный гель на 5-7 мм.After solidification, the agarose comb / comb is carefully removed / removed from the gel. An agarose gel tablet is transferred to the electrophoresis chamber. 1 x TBE buffer should cover the agarose gel 5-7 mm.
Для электрофоретического анализа продуктов амплификации выбранных генов отбирается одинаковый объем (5 мкл) инкубационной смеси из каждой пробы, полученной в результате амплификации, смешивается с 1-2 мкл раствора, предназначенного для нанесения проб в агарозный гель (содержит бромфеноловый синий), и наносится в карманы геля. Для установления точного размера амплифицируемого продукта в один из карманов агарозного геля вносится маркер молекулярной массы ДНК в растворе, предназначенном для нанесения на гель (100 Ьр) СспсРЫсг.For electrophoretic analysis of amplification products of selected genes, the same volume (5 μl) of the incubation mixture is taken from each sample obtained as a result of amplification, mixed with 1-2 μl of a solution intended for application of samples in an agarose gel (contains bromophenol blue), and put into pockets gel. To establish the exact size of the amplified product, a marker of the molecular weight of DNA in a solution intended for application to the gel (100 Lp) Csrcrycr is introduced into one of the pockets of the agarose gel.
Затем электрофоретическая камера подключается к источнику питания и задается напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/см. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации осуществляется в направлении от катода (-) к аноду (+).Then the electrophoretic camera is connected to a power source and the voltage corresponding to the electric field strength of 10-15 V / cm is set. Electrophoretic separation of amplification products is carried out in the direction from the cathode (-) to the anode (+).
Контроль над электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2 см или 6-8 см в зависимости от размера используемого агарозного геля.Control over electrophoretic separation is carried out visually by the movement of the dye strip. The dye strip should extend from the start of 1.5-2 cm or 6-8 cm, depending on the size of the agarose gel used.
B) . Визуализация результатов электрофореза продуктов амплификации выбранных генов.B) Visualization of the results of electrophoresis of amplification products of selected genes.
После электрофореза агарозный гель фотографируется в трансиллюминаторе в коротковолновом УФ-свете (длина волны 254-310 нм) с выводом данных на экран монитора компьютера.After electrophoresis, the agarose gel is photographed in a transilluminator in short-wave UV light (wavelength 254-310 nm) with data output to a computer monitor screen.
По полученным данным последовательно оцениваются четыре параметра:Based on the data obtained, four parameters are sequentially evaluated:
1) отсутствие светящихся полосок в дорожке, в которую был нанесен амплифицированный отрицательный контроль;1) the absence of luminous stripes in the track in which the amplified negative control was applied;
2) прошла ли реакция амплификации (наличие/отсутствие светящихся полосок в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам);2) whether the amplification reaction took place (the presence / absence of luminous strips in the paths of the agarose gel corresponding to the positive control and the analyzed samples);
3) насколько специфично прошла реакция амплификации (наличие одной/нескольких светящихся полосок в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам);3) how specific was the amplification reaction (the presence of one / several luminous strips in the paths of the agarose gel corresponding to the positive control and the analyzed samples);
- 6 016240- 6 016240
4) соответствует ли размер амплификационного продукта ожидаемому (если реакция амплификации прошла специфично и в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам, определяется одна светящаяся полоска, то сравнивается положение данной полоски на геле с положением маркера молекулярных весов ДНК).4) whether the size of the amplification product corresponds to the expected one (if the amplification reaction was specific and one luminous strip is determined in the paths of the agarose gel corresponding to the positive control and the analyzed samples, then the position of this strip on the gel is compared with the position of the molecular weight marker of DNA).
Рестрикция продуктов амплификации ДНК фрагмента 6 экзона гена ΤΝΕ-В-П.Restriction of amplification products of DNA of exon fragment 6 of the ΤΝΕ-В-П gene.
Для проведения рестрикции продуктов амплификации используется рестриктаза ΝΙαΙΙΙ (ΗίηΙΙΙ).For the restriction of amplification products, the restriction enzyme ΝΙαΝΙ (ΗίηΙΙΙ) is used.
Перед проведением реакции подготавливается нужное количество ПЦР пробирок объемом 0,2 мл и пробирки маркируются (указывается номер пробы).Before the reaction, the required number of PCR tubes of 0.2 ml volume is prepared and the tubes are labeled (the number of the sample is indicated).
Затем приготавливается рестрикционная смесь, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (табл. 3).Then a restriction mixture is prepared, which includes the following volumes of components per tube (table. 3).
Таблица 3Table 3
Состав рестрикционной смесиThe composition of the restriction mixture
После приготовления смесь компонентов аккуратно перемешивается и центрифугируется на вортексе.After preparation, the mixture of components is gently mixed and centrifuged on a vortex.
Затем в каждую пробирку объемом 0,2 мл вносится по 20 мкл приготовленной амплификационной смеси и по 10 мкл продукта амплификации ДНК или отрицательного контроля. Общий объем реакционной смеси составляет 30 мкл.Then, 20 μl of the prepared amplification mixture and 10 μl of the DNA amplification product or negative control are added to each 0.2 ml tube. The total volume of the reaction mixture is 30 μl.
Рестрикция проводится в амплификаторе Эуаб. На первой стадии образцы подвергаются обработке при 37°С в течение 5 мин для осуществления рестрикции, а затем обработке при 80°С в течение 5 мин для инактивации фермента.Restriction is carried out in the Euab amplifier. In the first stage, the samples are processed at 37 ° C for 5 min to effect restriction, and then processed at 80 ° C for 5 min to inactivate the enzyme.
Детекция и визуализация продуктов рестрикции (оценочный электрофорез 2).Detection and visualization of restriction products (evaluation electrophoresis 2).
Оценочный электрофорез № 2 проводится так, как оценочный форез № 1, за исключением того, что в данном случае для анализа отбирается одинаковый объем (15 мкл) из каждой пробы после рестрикции ДНК, смешивается с 2 мкл раствора, предназначенного для нанесения проб в агарозный гель (содержит бромфеноловый синий), и наносится в карманы геля.Evaluation electrophoresis No. 2 is carried out as evaluation phoresis No. 1, except that in this case the same volume (15 μl) is taken from each sample after DNA restriction, it is mixed with 2 μl of a solution intended for applying the samples to an agarose gel (contains bromphenol blue), and is applied to the pockets of the gel.
Анализ полученных результатов.Analysis of the results.
Если в дорожке агарозного геля видна светящаяся полоска и размер продукта соответствует 242 п.н., то генотип образца - ОС. Если в дорожке агарозного геля видны две светящиеся полоски и размер продуктов соответствует 134 и 113 п.н. соответственно, то генотип образца - ТТ. Если в дорожке агарозного геля видны три светящиеся полоски и размер продуктов соответствует 242, 134, 113 п.н. соответственно, то генотип образца - СТ. Примеры такого электрофоретического определения генотипа проиллюстрированы на фиг. 1.If a luminous strip is visible in the agarose gel path and the product size corresponds to 242 bp, then the sample genotype is OS. If two luminous strips are visible in the agarose gel path and the size of the products corresponds to 134 and 113 bp accordingly, the sample genotype is TT. If three luminous strips are visible in the agarose gel path and the size of the products corresponds to 242, 134, 113 bp accordingly, the genotype of the sample is CT. Examples of such an electrophoretic genotype determination are illustrated in FIG. one.
Определение содержания интерлейкина 16-10 с использованием технологии хМАР.Determination of the content of interleukin 16-10 using xMAP technology.
Для определения содержания 1Ь-10 используется набор Вю-Р1ех Нитап Су1окше 1-Р1ех А Рапе1 (Вю-Ваб), позволяющий выявить только ΙΠ-10, или любая более емкая панель, позволяющая проводить одновременное определение ряда цитокинов, в число которых входит ΙΠ-10, например, 8-Р1ех (позволяет одновременно определять содержание в образцах следующих цитокинов: ΙΕ-2, ΙΕ-4, ГЬ-б, ΙΕ-8, ΙΠ-10, ОМ-С8Е, ΙΕΝ-γ, ΤΝΕ-α).To determine the content of Lb-10, a set of Vyu-P1ekh Nitap Su1okshe 1-P1ekh Rape1 (Vyu-Vab) is used, which allows to detect only S-10, or any more capacious panel that allows simultaneous determination of a number of cytokines, including S 10, for example, 8-P1ex (allows you to simultaneously determine the content in the samples of the following cytokines: ΙΕ-2, ΙΕ-4, Gb-6, ΙΕ-8, ΙΠ-10, OM-C8E, ΙΕΝ-γ, ΤΝΕ-α).
Исследование проводится следующим образом.The study is carried out as follows.
Концентрацию цитокинов в образцах сыворотки крови определяют с помощью калибровочной кривой, для построения которой используют разведения стандартов (набор Вю-Р1ех Нитап Су1окше 8-Р1ех А Аккау (Вю-Ваб)). Разведения готовят согласно инструкции к набору и с использованием специального буфера - Нитап 8етит 8!апбай Эбиеп! (набор Нитап 8егит Эбиеп! кй (Вю-Ваб)).The concentration of cytokines in blood serum samples is determined using a calibration curve, to build which use dilutions of standards (set of Vu-P1ex Nitap Sulokshe 8-P1ekh Akkau (Vu-Wab)). Dilutions are prepared according to the instructions for the kit and using a special buffer - Nitap 8etit 8! Apbay Ebiep! (set Nitap 8egit Ebiep! ky (Vu-Wab)).
Увлажняют необходимое для исследования количество лунок специального микропланшета (набор Реадеп! кй (Вю-Ваб)) 100 мкл буфера для исследования Вю-Р1ех Аккау ЬиГГег (набор ВеадепГ кй (ВюВаб)), после чего вносят в каждую лунку по 50 мкл предварительно приготовленного рабочего раствора микросфер. Для приготовления рабочего раствора микросфер используют 25-кратный исходный раствор Апй-Нитап 8-Р1ех А СопщдаГеб Веабк (Вю-Р1ех Нитап СуГокше 8-Р1ех А Аккау (Вю-Ваб)) и буфер для разведения Вю-Р1ех Аккау ЬиГГег (набор ВеадепГ кй (Вю-Ваб)).Humidify the number of wells of a special microplate required for the study (Readep! Ky (Vu-Wab) kit) 100 μl of Vyu-R1ekh Akkau LiuGGeg research buffer (VeadepG ky (VyuVab) kit), and then add 50 μl of a pre-prepared working medium to each well solution of microspheres. To prepare the working solution of microspheres, we use a 25-fold stock solution Apy-Nitap 8-P1ex A SopschdaGeb Weabk (Vu-P1ekh Nitap SuGokshe 8-P1ekh A Akkau (Vyu-Vab)) and a buffer for diluting Vyu-P1ek Akkau LiuGGeg (WeadepG ky kit (Vu-Wab)).
После внесения микросфер осуществляют 2 промывки Вю-Р1ех \Уак11 ЬиГГег (по 100 мкл на лунку) с использованием предварительно откалиброванной вакуумной установки, состоящей из системы для вакуумной фильтрации Уасиит МапИЫб (Вю-Ваб) и отсасывателя медицинского ОМ-1.After introducing the microspheres, 2 washes of Vu-P1ex \ Wak11 LiGGeg (100 μl per well) were carried out using a pre-calibrated vacuum unit consisting of a Uasiit MapiIB (Vu-Wab) vacuum filtration system and an OM-1 medical aspirator.
Затем в соответствующие лунки микропланшета вносят по 50 мкл образца или разведения стандарта, проводят инкубацию на шейкере с непрозрачной крышкой при 1100 об/мин в течение 30 с, после чего при 300 об/мин в течение 30 мин.Then, 50 μl of the sample or dilution of the standard is added to the corresponding wells of the microplate, incubated on a shaker with an opaque cap at 1100 rpm for 30 s, and then at 300 rpm for 30 minutes.
После завершения инкубации удаляют буфер вакуумной фильтрацией и проводят 3 промывки ВюР1ех ^акй ЬиГГег (по 100 мкл на лунку).After completion of the incubation, the buffer is removed by vacuum filtration and 3 washes with VyuP1ex ^ ai LiGHeg (100 μl per well) are carried out.
- 7 016240- 7 016240
Вносят в лунки по 25 мкл рабочего раствора детектирующих антител, приготовленного из исходного раствора - Нитап 8-Р1ех А Ос1се1юп АийЬобу (Вю-Р1ех Нитап Су1октс 8-Р1ех А Аккау (Βίο-Раб)) с использованием специального буфера Ое1ее1юп АибЬобу ббиеШк (набор РеадеШ кб (Βίο-Раб)). Проводят инкубацию микропланшета на шейкере с непрозрачной крышкой при 1100 об/мин в течение 30 с, после чего при 300 об/мин в течение 30 мин.Pipette 25 μl of the working solution of detecting antibodies prepared from the initial solution — Nitap 8-P1ex A Os1ce1yup Aiyobu (Vyu-P1ekh Nitap Si1okts 8-P1ek A Akkau (Zn-Rab)) using a special buffer Oe1e1yup Aiboboe kit kb (Βίο-Rab)). The microplate is incubated on a shaker with an opaque cap at 1100 rpm for 30 s, after which at 300 rpm for 30 minutes.
После завершения инкубации удаляют буфер вакуумной фильтрацией и проводят 3 промывки ΒίοР1ех \Уак11 Ьийег (по 100 мкл на лунку).After completion of the incubation, the buffer is removed by vacuum filtration and 3 washings of Poox \ Naq11 Liieg (100 μl per well) are carried out.
В каждую из задействованных лунок вносят по 50 мкл рабочего раствора стрептавидина-РЕ, подготовленного из исходного 100-кратного раствора Мгер1а\збш-РЕ (набор РеадеШ к11 (Βίο-Раб)) с использованием буфера В1о-Р1ех Аккау Ьийег. Проводят инкубацию микропланшета на шейкере с непрозрачной крышкой при 1100 об/мин в течение 30 с, после чего при 300 об/мин в течение 10 мин.To each of the wells involved, 50 μl of streptavidin-PE working solution prepared from the initial 100-fold solution of Mher1a \ zbsh-PE (ReadeSh k11 kit (K-Rab)) using B1o-P1ek Akkau Liyeg buffer is added. The microplate is incubated on a shaker with an opaque cap at 1100 rpm for 30 s, and then at 300 rpm for 10 minutes.
После завершения инкубации удаляют буфер вакуумной фильтрацией и проводят 3 промывки ВюР1ех \Уак11 Ьийег (по 100 мкл на лунку).After completion of the incubation, the buffer is removed by vacuum filtration and 3 washes with VyuP1ex \ Vak11 Liiyeg (100 μl per well) are carried out.
Аккуратно ресуспендируют образовавшиеся в каждой лунке комплексы в 125 мкл Вю-Р1ех Аккау Ьийег и инкубируют на шейкере при 1100 об/мин в течение 30 с непосредственно перед считыванием на приборе.The complexes formed in each well are carefully resuspended in 125 μl Vu-P1ex Akkau Liieg and incubated on a shaker at 1100 rpm for 30 s immediately before reading on the instrument.
Проводят калибровку прибора с использованием специального набора калибраторов СаПЬгабои кй (Вю-Раб).The instrument is calibrated using a special set of Calaboy calibers (Vu-Rab).
В приложении Вю-Р1ех Мападег задают формат микропланшета, концентрации цитокинов в разведениях стандартов и другие параметры исследования, после чего проводят измерение на приборе. Результат получают автоматически, концентрация выражается в пг/мл.In the application Vyu-P1ekh Mapadeg specify the format of the microplate, the concentration of cytokines in dilutions of the standards and other research parameters, and then measure on the device. The result is obtained automatically, the concentration is expressed in pg / ml.
Результатом проведенного исследования является определение содержания 1Б-10 в сыворотке крови больного псориазом; причем при высоком содержании 1Б-10 в сыворотке (>2,7 пг/мл) прогнозируют высокую эффективность лечения больного псориазом инфликсимабом, а при низком содержании 1Б-10 в сыворотке (<1,0 пг/мл) прогнозируют низкую эффективность лечения.The result of the study is the determination of the content of 1B-10 in the blood serum of a patient with psoriasis; moreover, with a high content of 1B-10 in serum (> 2.7 pg / ml), the treatment of a patient with psoriasis infliximab is predicted to be highly effective, and with a low content of 1B-10 in serum (<1.0 pg / ml), a low treatment efficiency is predicted.
Примеры клинического применения настоящего изобретенияClinical Examples of the Present Invention
Пример 1. Я. А. И., 51 год, мари, родился и живет в г. Йошкар-Ола. Инвалид 2 группы по псориазу. Диагноз: псориатическая эритродермия, псориатический артрит. Сопутствующая патология - жировой гепатоз. Анамнестические данные: наследственность не отягощена. Заболевание псориазом началось в возрасте 28 лет. Длительность заболевания составляет 23 года. Псориатический артрит начался в возрасте 45 лет, длительность псориатического артрита составляет 5 лет. Ранее получал лечение метотрексатом с хорошим эффектом, длительно получал лечение циклоспорином с клиническим выздоровлением, неотигазоном - с улучшением, парентерально глюкокортикостероиды - с кратковременным улучшением, фототерапию не получал. В связи со значительной распространенностью и тяжелым течением кожного процесса, прогрессированием псориатического артрита проведено лечение инфликсимабом в дозе 500 мг по схеме (4 инфузии). В результате терапии инфликсимабом клинические проявления заболевания разрешились. Индекс РА81 до лечения составил 50,2, после лечения - 0. Динамика регресса патологического процесса, охарактеризованная по индексу РА81 (АРАМ), составила 100%, что соответствовало выраженному клиническому эффекту от лечения инфликсимабом.Example 1. Ya. A. I., 51, Marie, was born and lives in Yoshkar-Ola. Disabled person 2 groups for psoriasis. Diagnosis: psoriatic erythroderma, psoriatic arthritis. Concomitant pathology - fatty hepatosis. Anamnestic data: heredity is not burdened. Psoriasis started at the age of 28. The duration of the disease is 23 years. Psoriatic arthritis began at the age of 45 years, the duration of psoriatic arthritis is 5 years. Previously, I received treatment with methotrexate with a good effect, I received treatment with cyclosporine for a long time with clinical recovery, neotigasone - with improvement, parenteral glucocorticosteroids - with short-term improvement, I did not receive phototherapy. Due to the significant prevalence and severe course of the skin process, the progression of psoriatic arthritis, infliximab was treated at a dose of 500 mg according to the scheme (4 infusions). As a result of therapy with infliximab, the clinical manifestations of the disease resolved. The index of RA81 before treatment was 50.2, after treatment - 0. The dynamics of the regression of the pathological process, characterized by the index of RA81 (ARAM), was 100%, which corresponded to the pronounced clinical effect of treatment with infliximab.
При обследовании больного до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип ТТ в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΕ-Р-Й; содержание 1Ь-10 в сыворотке крови составило 3,2 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать выраженный клинический эффект от лечения инфликсимабом.When examining the patient before treatment according to the method described above, laboratory indicators were revealed (in the skin biopsy specimen the TT genotype was identified at position 676 of the sixth exon of the β-P-г gene; the content of 1Ь-10 in the blood serum was 3.2 pg / ml), which allowed before treatment, predict the pronounced clinical effect of treatment with infliximab.
Пример 2. М. Л. М., 47 лет, русская. Родилась и проживает в г. Москве. Диагноз: распространенный вульгарный псориаз, прогрессирующая стадия. Сопутствующие заболевания: сахарный диабет второго типа; тромбофлебит нижних конечностей; эрозия шейки матки; астено-депрессивный синдром; жировой гепатоз; желчекаменная болезнь, ремиссия. Анамнестические данные: наследственность отягощена псориазом страдает отец. Заболевание началось в возрасте 27 лет. Длительность заболевания составляет 20 лет. Ранее получала следующую терапию: метотрексат 15-35 мг в/м 1 раз в неделю № 4 с кратковременным улучшением, фототерапию 2 курса по 15 процедур - без эффекта, парентерально глюкортикостероиды: дипроспан 1,0 в/м 1 раз в 10 дней № 2 - без эффекта в 2008 г. В связи с распространенностью и тяжестью процесса, а также отсутствием эффекта от ранее проводимой терапии было проведено лечение инфликсимабом в дозе 400 мг по схеме, всего 4 инфузии. В результате проведенной терапии псориатические высыпания на коже туловища и верхних конечностей разрешились. На коже голеней остаются незначительно единичные бляшки розового цвета, без шелушения в стадии разрешения. Индекс РАМ до лечения составил 49, после лечения 4,0. Динамика регресса патологического процесса, охарактеризованная по индексу РАМ (АРАМ), составила 91,8%, что соответствовало выраженному клиническому эффекту от лечения инфликсимабом.Example 2. M. L. M., 47 years old, Russian. Born and lives in Moscow. Diagnosis: common vulgar psoriasis, progressive stage. Concomitant diseases: type 2 diabetes mellitus; thrombophlebitis of the lower extremities; cervical erosion; astheno-depressive syndrome; fatty hepatosis; cholelithiasis, remission. Anamnestic data: heredity is weighed down by psoriasis; the father suffers. The disease began at the age of 27 years. The duration of the disease is 20 years. Previously received the following therapy: methotrexate 15-35 mg i / m 1 time per week No. 4 with short-term improvement, phototherapy of 2 courses of 15 procedures - no effect, parenteral glucorticosteroids: diprospan 1.0 i / m 1 time in 10 days No. 2 - no effect in 2008. Due to the prevalence and severity of the process, as well as the lack of effect from previous therapy, infliximab was treated at a dose of 400 mg according to the scheme, only 4 infusions. As a result of the therapy, psoriatic rashes on the skin of the trunk and upper limbs resolved. Slightly isolated pink plaques remain on the skin of the lower legs, without peeling in the resolution stage. The PAM index before treatment was 49, after treatment 4.0. The dynamics of the regression of the pathological process, characterized by the RAM index (ARAM), amounted to 91.8%, which corresponded to the pronounced clinical effect of treatment with infliximab.
При обследовании больной до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип ТТ в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΕ-Р-П; содержание 1Ь-10 в сыворотке крови составило 3,0 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать выраWhen examining the patient before treatment using the method described above, laboratory indicators were revealed (in the skin biopsy sample the TT genotype was identified at position 676 of the sixth exon of the R-P gene; the content of L-10 in the blood serum was 3.0 pg / ml), which allowed to predict the treatment before treatment
- 8 016240 женный клинический эффект от лечения инфликсимабом.- 8 016240 the clinical effect of treatment with infliximab.
Пример 3. К. Л. В., 40 лет, русская, родилась и проживает в г. Саратове. Диагноз: распространенный вульгарный псориаз, псориатический артрит. Сопутствующей патологии нет. Анамнестические данные: псориаз зарегистрирован в возрасте 30 лет. Наследственность не отягощена. Длительность заболевания составляет 10 лет. Псориатический артрит диагностирован в возрасте 39 лет. Продолжительность псориатического артрита составляет 1 год. Ранее получала лечение метотрексатом без эффекта, циклоспорином без эффекта, лечение глюкокортикостероидами парентерально - с улучшением, фототерапию (ПУВА-терапия) - без эффекта. В связи с тяжелым течением заболевания и торпидностью к ранее проводимой терапии было назначено лечение инфликсимабом. Проведено 3 инфузии инфликсимабом в дозе 425 мг по схеме. Однако в процессе лечения отмечалась неудовлетворительная динамика (прогрессирование кожного процесса). 4-я инфузия не проводилась из-за развития гнойно-воспалительного осложнения. Индекс ΡΑ8Ι до лечения составил 10,1, перед 3-й инфузией - 11,2. Динамика патологического процесса, охарактеризованная по индексу ΡΑ8Ι (ΔΡΑ8Ι), составила -14%, что соответствовало отсутствию эффекта от проведенного лечения инфликсимабом.Example 3. K. L. V., 40 years old, Russian, was born and lives in the city of Saratov. Diagnosis: common vulgar psoriasis, psoriatic arthritis. There is no concomitant pathology. Anamnestic data: psoriasis is registered at the age of 30 years. Heredity is not burdened. The duration of the disease is 10 years. Psoriatic arthritis was diagnosed at the age of 39 years. The duration of psoriatic arthritis is 1 year. Previously, she received treatment with methotrexate without effect, cyclosporine without effect, parenteral glucocorticosteroid treatment with improvement, phototherapy (PUVA therapy) without effect. Due to the severe course of the disease and the torpidity to the previously conducted therapy, treatment with infliximab was prescribed. Conducted 3 infliximab infusions at a dose of 425 mg according to the scheme. However, in the course of treatment, unsatisfactory dynamics (progression of the skin process) were noted. The 4th infusion was not carried out due to the development of purulent-inflammatory complications. The ΡΑ8Ι index before treatment was 10.1, before the 3rd infusion - 11.2. The dynamics of the pathological process, characterized by the index ΡΑ8Ι (ΔΡΑ8Ι), was -14%, which corresponded to the lack of effect from the treatment with infliximab.
При обследовании больного до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип ОС в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΕ-Κ-ΙΙ; содержание 1Ь-10 в сыворотке крови составило 0,5 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать отсутствие клинического эффекта или недостаточный клинический эффект от лечения инфликсимабом.When examining the patient before treatment using the method described above, laboratory indicators were revealed (in the biopsy of the skin, the OS genotype was identified at position 676 of the sixth exon of the ΤΝΕ-Κ-ΙΙ gene; the content of 1-10 in the blood serum was 0.5 pg / ml), which allowed before treatment, predict the absence of a clinical effect or insufficient clinical effect of treatment with infliximab.
Если бы с учетом полученных лабораторных показателей данной пациентке лечение не было проведено, экономический эффект составил бы 600000 рублей (стоимость 3 инфузий инфликсимаба при проведении лечения больной весом 85 кг) и можно было бы избежать развитие гнойно-септического осложнения у пациентки.If, taking into account the obtained laboratory parameters, the patient would not have been treated, the economic effect would have been 600,000 rubles (the cost of 3 infliximab infusions when treating a patient weighing 85 kg) and the development of purulent-septic complications in the patient could be avoided.
Пример 4. Ж. А. В., 41 год, русский. Родился и проживает в г. Москве. Инвалид 3 группы по псориазу. Диагноз: распространенный вульгарный псориаз, прогрессирующая стадия. Псориатическитй полиартит. Длительность заболевания составляет 26 лет. Длительность псориатического артрита составляет 4 года. Сопутствующие заболевания: гипертоническая болезнь 2 стадии, 2 степени, риск 3; жировой гепатоз; ожирение 2 степени. Наследственность: псориазом страдают отец и деды по материнской и отцовской линии. Ранее получал курс ПУВА-терапии с улучшением, метотрексат внутримышечно 1 раз в неделю и кортикостероиды внутрисуставно с кратковременным эффектом. В связи с распространенностью и тяжестью течения заболевания было проведено лечение инфликсимабом в дозе 400 мг по схеме, всего 4 инфузии. В результате проведенной терапии псориатические высыпания на коже туловища и верхних конечностей значительно побледнели, однако полного разрешения элементов не отмечалось. Отечность и ограничение активных движений в пораженных суставов сохранялись. Индекс ΡΑ8Ι до лечения составил 23,2, после лечения 18,2. Динамика патологического процесса, охарактеризованная по индексу ΡΑ8Ι (ΔΡΑ8Ι), составила 65,2% и характеризовала недостаточный эффект от терапии инфликсимабом.Example 4. J. A. V., 41 years old, Russian. Born and lives in Moscow. Disabled person 3 groups for psoriasis. Diagnosis: common vulgar psoriasis, progressive stage. Psoriatic polyarthritis. The duration of the disease is 26 years. The duration of psoriatic arthritis is 4 years. Concomitant diseases: hypertension 2 stages, 2 degrees, risk 3; fatty hepatosis; obesity 2 degrees. Heredity: maternal and paternal fathers and grandfathers suffer from psoriasis. I previously received a course of PUVA therapy with improvement, methotrexate intramuscularly 1 time per week, and intra-articular corticosteroids with a short-term effect. Due to the prevalence and severity of the course of the disease, infliximab was treated at a dose of 400 mg according to the scheme, a total of 4 infusions. As a result of the therapy, psoriatic rashes on the skin of the trunk and upper limbs were significantly paled, however, full resolution of the elements was not noted. Swelling and restriction of active movements in the affected joints persisted. The ΡΑ8Ι index before treatment was 23.2, after treatment 18.2. The dynamics of the pathological process, characterized by the index ΡΑ8Ι (ΔΡΑ8Ι), amounted to 65.2% and characterized the insufficient effect of infliximab therapy.
При обследовании больного до лечения по описанной выше методике были выявлены лабораторные показатели (в биоптате кожи выявлен генотип СС в позиции 676 шестого экзона гена ΤΝΡ-Κ.-Π; содержание ЕС-10 в сыворотке крови составило 0,7 пг/мл), которые позволяли до лечения прогнозировать отсутствие клинического эффекта или недостаточный клинический эффект от лечения инфликсимабом.When examining the patient before treatment according to the method described above, laboratory parameters were detected (in the skin biopsy sample the CC genotype was identified at position 676 of the sixth exon of the ΤΝΡ-Κ.-г gene; the content of EC-10 in the blood serum was 0.7 pg / ml), which allowed before treatment to predict the absence of a clinical effect or insufficient clinical effect of treatment with infliximab.
Если бы с учетом полученных лабораторных показателей данному пациенту лечение не было проведено, экономический эффект составил бы 640000 рублей (стоимость 4 инфузий инфликсимаба при проведении лечения больному весом 80 кг).If, given the laboratory parameters obtained, this patient had not been treated, the economic effect would have been 640,000 rubles (the cost of 4 infliximab infusions during treatment for a patient weighing 80 kg).
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA200901243A EA016240B1 (en) | 2009-10-13 | 2009-10-13 | Method for forecasting effectiveness of treating psoriasis patients by infliximab |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA200901243A EA016240B1 (en) | 2009-10-13 | 2009-10-13 | Method for forecasting effectiveness of treating psoriasis patients by infliximab |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200901243A1 EA200901243A1 (en) | 2011-04-29 |
EA016240B1 true EA016240B1 (en) | 2012-03-30 |
Family
ID=44356308
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200901243A EA016240B1 (en) | 2009-10-13 | 2009-10-13 | Method for forecasting effectiveness of treating psoriasis patients by infliximab |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA016240B1 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2006112587A (en) * | 2003-09-15 | 2007-10-27 | Комбинаторкс, Инкорпорейтед (Us) | METHODS AND MEANS FOR TREATING IMMUNO INFLAMMATORY DISORDERS |
-
2009
- 2009-10-13 EA EA200901243A patent/EA016240B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2006112587A (en) * | 2003-09-15 | 2007-10-27 | Комбинаторкс, Инкорпорейтед (Us) | METHODS AND MEANS FOR TREATING IMMUNO INFLAMMATORY DISORDERS |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
GNILORYBOV A.M. i dr. "Biologicheskaya terapiya autoimmunnykh zabolevaniy: klinicheskaya effektivnost' i vozmozhnosti ee prognozirovaniya". Ukrains'ka Revmatologichna shkola, 1-3 bereznya 2007 [naydeno 26.03.2010]. Naydeno iz Internet: <URL:http://www.rheumocenter.org.ua/view/ukr/page/53/, str.1-2 * |
HOHLER T. et al., "A TNF-alpha promoter polymorphism is associated with juvenile onset psoriasis and psoriatic arthritis", J Invest Dermatol. 1997 Oct; 109(4):562-5, referat, [naydeno 31.03.2010]. Naydeno iz PubMed: PMID: 9326391 * |
KAGANOVA N.L. i dr. "Vozmozhnosti prognozirovaniya klinicheskogo otveta na lechenie bol'nykh psoriazom infliksimabom". Tezisy 2 foruma NADK, Rostov-na-Donu, 2008, referat [naydeno 16.03.2010]. Naydeno iz Internet: <URL:http://www.dermatology.ru//collections/tezisy-2-foruma-nadk-rostov-na-donu-2008> * |
MATUSHEVSKAYA Yu.I. "Otsenka effektivnosti terapii bol'nykh tyazhelymi formami psoriaza s primeneniem genno-inzhenernogo biologicheskogo preparata infliksimab na osnove klinicheskikh i immunologicheskikh pokazateley". Avtoreferat dissertatsii na soiskanie uchenoy stepeni kandidata meditsinskikh nauk, M., 2008, 18 s., str. 2, 4, 5, 14-17 * |
SCHMELING H. et al. "Tumor necrosis factor alpha promoter polymorphisms in pateints with juvenile idiopathic arthritis". Clin. Exp. Rheumatol. 2006 Jan-Feb; 24(l):103-8, referat [naydeno 31.03.2010]. Naydeno iz PubMed: PMID: 16539828 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA200901243A1 (en) | 2011-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Trumpff et al. | Stress and circulating cell-free mitochondrial DNA: A systematic review of human studies, physiological considerations, and technical recommendations | |
Portelli et al. | Genetic risk factors for the development of allergic disease identified by genome‐wide association | |
Awata et al. | A common polymorphism in the 5′-untranslated region of the VEGF gene is associated with diabetic retinopathy in type 2 diabetes | |
Jensen et al. | Macrophage subpopulations and the acute inflammatory response of elderly human skeletal muscle to physiological resistance exercise | |
Haddock et al. | Psoriasiform eruptions during Kawasaki disease (KD): a distinct phenotype | |
Ruffner et al. | Conserved IFN signature between adult and pediatric eosinophilic esophagitis | |
CN109486938A (en) | Detect method, primer and the application of SMN1 and SMN2 gene mutation | |
Katayanagi et al. | Alternative gene expression by TOLLIP variant is associated with lung function in chronic hypersensitivity pneumonitis | |
CN108715893B (en) | SNP markers related to radioactive brain injury caused by radiotherapy and application thereof | |
Mohammed et al. | Expression of lncRNAs NEAT1 and lnc-DC in serum from patients with behçet’s disease can Be used as predictors of disease | |
CN113862350B (en) | Diagnostic marker hsa_circ_0043898 in peripheral blood of spinal nodule and application thereof | |
RU2453851C1 (en) | Method for prediction of level of efficiency of reduction of manifestation severity of atopic dermatitis | |
Beigi et al. | Investigation of the association between rs4977574 A> G polymorphism in ANRIL gene and coronary artery disease in Iranian population | |
CN108796063A (en) | Application of Micro-15b in preparation of reagent for diagnosing diabetic retinopathy | |
CN108929903A (en) | Marker and kit for chronic periodontitis screening, diagnosis, therapeutic evaluation | |
EA016240B1 (en) | Method for forecasting effectiveness of treating psoriasis patients by infliximab | |
Mohammed et al. | Vitamin D receptor FokI gene polymorphism in rheumatoid arthritis patients | |
Piruzian et al. | Study of molecular mechanisms involved in the pathogenesis of immune-mediated inflammatory diseases, using psoriasis as a model | |
US20030068645A1 (en) | Methods and materials for evaluating cardiovascular conditions | |
RU2625503C2 (en) | Determination of the content of gc-rich sequence of the genom (gc-dna) in the composition of circulating extracellular dna of peripheral blood plasma as a method of determination of the level of cell death in pregnancy | |
CN111057761A (en) | Detection kit for CHD7 mutation of pathogenic gene of CHARGE syndrome | |
JP7514458B2 (en) | Method for predicting efficacy of therapeutic drugs for rheumatoid arthritis and biomarkers used therein | |
CN113398247B (en) | Application of substance for promoting CD44 level in preparation of product for treating/preventing vascular endothelial inflammation by promoting CD44 | |
CN110373459B (en) | Reagent and kit for detecting childhood asthma based on site rs2236647 of STIP1 gene and application | |
Abed et al. | Novel single nucleotide polymorphism (rs1600485907) of IL-41 gene associated with systemic lupus erythematous |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |