EA016172B1 - Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms - Google Patents

Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms Download PDF

Info

Publication number
EA016172B1
EA016172B1 EA200901272A EA200901272A EA016172B1 EA 016172 B1 EA016172 B1 EA 016172B1 EA 200901272 A EA200901272 A EA 200901272A EA 200901272 A EA200901272 A EA 200901272A EA 016172 B1 EA016172 B1 EA 016172B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fgfr1
cells
growth factor
receptor
fibroblast growth
Prior art date
Application number
EA200901272A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA200901272A1 (en
Inventor
Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс"
Priority to EA200901272A priority Critical patent/EA016172B1/en
Publication of EA200901272A1 publication Critical patent/EA200901272A1/en
Publication of EA016172B1 publication Critical patent/EA016172B1/en

Links

Abstract

The invention pertains to the field of medicine and relates to a method for suppressing the growth of tumors, which comprises blocking the pathway of "human fibroblast growth factor / human fibroblast growth factor receptor 1 (domains II and IIIc)", and to a method for diagnosing malignant neoplasms. This pathological pathway leads to an excessive proliferation of tumor cells and to the formation of new vessels accompanied by the growth of primary tumors and metastases. This pathway also represents an independent mechanism of tumor resistance to preparations acting on other pathological pathways. Blocking the pathway of "fibroblast growth factor / fibroblast growth factor receptor 1" using various substances that neutralize the receptor by bonding only with domains II and IIIc thereof results in the interruption or slow-down of tumor growth. This receptor can also be used as a target for the targeted delivery of diagnostic agents as it is present in large amounts in the cells of numerous tumors. The invention is advantageous in that it makes it possible to develop new agents for diagnosing and treating diseases related to excessive proliferation and neovascularization.

Description

Изобретение относится к медицине и включает способ подавления роста опухоли, основанный на блокировании пути человеческий фактор роста фибробластов/человеческий рецептор 1 типа фактора роста фибробластов (домены II и 111с), а также способ диагностики злокачественных новообразований. Указанный патологический путь приводит к избыточной пролиферацией опухолевых клеток и образованию новых сосудов, что сопровождается ростом первичной опухоли и метастазов. Кроме того, описанный путь является независимым механизмом устойчивости опухоли к препаратам, воздействующим на другие патологические пути. Блокирование пути фактор роста фибробластов/рецептор 1 типа фактора роста фибробластов различными субстанциями, нейтрализующими рецептор через связывание только с его доменами II и 111с, приводит к остановке или замедлению роста опухоли. Кроме того, данный рецептор может использоваться как мишень для целенаправленной доставки диагностических препаратов, т.к. находится в большом количестве на клетках многих опухолей. Преимущество изобретения заключается в разработке новых препаратов для диагностики и лечения заболеваний, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией.The invention relates to medicine, and includes a method for suppressing tumor growth based on the blocking of the pathway of human fibroblast growth factor / human receptor type 1 fibroblast growth factor (domains II and 111c), as well as a method for diagnosing malignant neoplasms. The indicated pathological pathway leads to excessive proliferation of tumor cells and the formation of new vessels, which is accompanied by the growth of the primary tumor and metastases. In addition, the described pathway is an independent mechanism of tumor resistance to drugs acting on other pathological pathways. Blocking the pathway of fibroblast growth factor / receptor type 1 fibroblast growth factor by various substances that neutralize the receptor through binding only to its domains II and 111c, leads to a halt or slowdown of tumor growth. In addition, this receptor can be used as a target for targeted delivery of diagnostic drugs, because is found in large numbers on the cells of many tumors. An advantage of the invention is the development of new drugs for the diagnosis and treatment of diseases associated with excessive proliferation and neovascularization.

Полное описание изобретенияFull Description of the Invention

Известно, что в основе развития злокачественных новообразований лежит избыточная пролиферация клеток, а также образование кровеносных сосудов в опухоли, через которые происходит ее питание (ангиогенез).It is known that the development of malignant neoplasms is based on excessive cell proliferation, as well as the formation of blood vessels in the tumor through which it is fed (angiogenesis).

Образование новых кровеносных сосудов происходит из уже существующего эндотелия и является важным компонентом многих заболеваний и нарушений, в том числе таких, как рост и метастазирование опухолей, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, иммунное отторжение трансплантированной роговицы и других тканей, а также хронические воспаления.The formation of new blood vessels originates from the existing endothelium and is an important component of many diseases and disorders, including such as tumor growth and metastasis, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia, neovascular glaucoma, hemangiomas, immune transplant rejection cornea and other tissues, as well as chronic inflammation.

В случае роста опухолей ангиогенез имеет особенно важное значение при переходе от гиперплазии к неоплазии, а также для обеспечения питания растущей солидной опухоли (I. Бо1кшап е! а1. №1Шге; 339, 58 (1989). Ангиогенез также позволяет опухолям находиться в контакте с кровеносной системой хозяина, в результате чего могут быть определены направления метастазирования для клеток опухоли. Данные, подтверждающие роль ангиогенеза в метастазировании клеток опухоли, были получены, в частности, в результате исследований, показавших зависимость между количеством и плотностью микрососудов в инвазивном рака молочной железы и фактическим наличием дистантных метастазов (Ν. ^е1бпет е! а1. Хе\\ Епд. I. Меб., 324: 1 (1991).In the case of tumor growth, angiogenesis is especially important in the transition from hyperplasia to neoplasia, as well as for providing nutrition to a growing solid tumor (I. Bo1kshap e! A1. No. 1Shge; 339, 58 (1989). Angiogenesis also allows tumors to be in contact with host circulatory system, which can be used to determine the direction of metastasis for tumor cells Data confirming the role of angiogenesis in the metastasis of tumor cells were obtained, in particular, from studies showing the relationship between the number of the presence and density of microvessels in invasive breast cancer and the actual presence of distant metastases (Ν. ^ e1bpet e! a1. Xe \\ Ep. I. Meb., 324: 1 (1991).

По многочисленным имеющимся данным пролиферация клеток опухоли, равно как и эндотелиальных клеток может быть вызывана различными полипептидами, которые естественным образом встречаются в природе. Одним из них является семейство факторов роста фибробластов (ФРФ). Впервые ФРФ был обнаружен в экстрактах гипофиза в 1973 году (Н. Агшейп. ΡΝΑ8 70, 9 (1973).According to numerous available data, the proliferation of tumor cells, as well as endothelial cells, can be caused by various polypeptides that naturally occur in nature. One of them is the family of fibroblast growth factors (FGF). FGF was first discovered in pituitary extracts in 1973 (N. Agsheyp. ΡΝΑ8 70, 9 (1973).

ФРФ относятся к семейству гепарин-связывающих полипептидов, модулирующих функции различных клеток. ФРФ оказывает сильное влияние на пролиферацию и дифференцировку опухолевых и эндотелиальных клеток. В настоящее время выделяют 23 члена семейства ФРФ (ФРФ 1-23). Каждый член семейства имеет свои функциональные особенности. Наиболее хорошо изучены ФРФ 1 и 2 типов (кислый и основной). Для того чтобы оказать воздействие на клетки, ФРФ должен связаться с рецептором на ее поверхности. Существуют 4 типа рецепторов ФРФ (ФРФР 1-4). С ФРФР1 связываются не только ФРФ 1 и 2, но и большинство других членов этого семейства, поэтому роль этого рецептора в проведении сигнала в клетку считается наиболее значимой. ФРФР1 состоит из надмембранной, внутримембранной и внутриклеточной частей. Надмембранная часть рецептора состоит из 3 доменов (Д ^Ш), подобных иммуноглобулину. ФРФ, как правило, взаимодействуют с Д II и III; гепаран-сульфат, участвующий в формировании комплекса ФРФ/ФРФР1, взаимодействует с Д3. Альтернативный мРНК сплайсинг способствует образованию на поверхности клетки нескольких вариантов ФРФР1 (И 1ойпкоп, Ь. ^1Шашк. I Αάν. Сапсег Век., 60, 1 (1993); МсКеейап е! а1. I Ргод №.1с1ею Ас1б Век. Мо1. Βίο1., 59, 135 (1998). Внутриклеточная часть рецептора представлена тирозинкиназой, при аутофосфорилировании которой происходит дальнейшее проведение сигнала в ядро и деление клетки.FGF belong to the family of heparin-binding polypeptides that modulate the functions of various cells. RFF has a strong effect on the proliferation and differentiation of tumor and endothelial cells. Currently, 23 members of the FRF family are distinguished (FRF 1-23). Each member of the family has its own functional features. The most studied are RFF of types 1 and 2 (acidic and basic). In order to affect cells, FGF must bind to a receptor on its surface. There are 4 types of FGF receptors (FGFR 1-4). Not only FRF 1 and 2, but also the majority of other members of this family bind to FGFR1; therefore, the role of this receptor in conducting signal to the cell is considered the most significant. FGFR1 consists of the supmembrane, intram Membrane and intracellular parts. The supmembrane part of the receptor consists of 3 domains (D ^ W), similar to immunoglobulin. FGF, as a rule, interact with D II and III; heparan sulfate, which participates in the formation of the RFF / RFFR1 complex, interacts with D3. Alternative mRNA splicing promotes the formation on the cell surface of several variants of FGFR1 (And 1oypcop, b. ^ 1 Shash. I Αάν. Sapseg Vek., 60, 1 (1993); Mskeyeyap e! A1. I Year No. 1s1eyu As1b Vek. Mo1. Βίο1 ., 59, 135 (1998). The intracellular part of the receptor is represented by tyrosine kinase, during autophosphorylation of which further signal transmission to the nucleus and cell division occurs.

Исследования Бюро по изучению рака почкиResearch Bureau for Kidney Cancer

Изучая в рандомизированном исследовании эффекты низкомолекулярного гепарина (НМГ) у пациентов с метастатическим почечноклеточным раком (ПКР), нами было доказано, что гепарин влияет на выживаемость пациентов и частоту ответов на иммунотерапию. Мы предположили, что НМГ может связывать ФРФ, взаимодействовать с его рецептором (ФРФР1), другими гепаран/гепарин-связываюшими факторами (И.В. Тимофеев и соав. Российский онкологический журнал, №5 (2008); I. ТкппаГеуеи е! а1. I. С1ш. Опсо1оду 25, 188 (2007). В другом исследовании мы показали, что у пациентов с метастатическим ПКР в 40% случаев встречаются нарушения в системе гемостаза, что также может быть вызвано повышенным образованием ФРФ и экспрессией ФРФР1 (I. Тк1шаГеуеи е! а1. I. Ехрепшеп1а1 & С11шса1 Сапсег Векеатсй, 28, 30 (2009). В дальнейших собственных исследованиях КСВВ-Ь01 и КСВВ-Ь02 мы изучали значение комплекса ФРФ/ФРФР1 в развитии ПКР.In a randomized study of the effects of low molecular weight heparin (LMWH) in patients with metastatic renal cell carcinoma (RCC), we have shown that heparin affects patient survival and the frequency of responses to immunotherapy. We suggested that LMWH can bind FGF, interact with its receptor (FGFR1), and other heparan / heparin-binding factors (IV Timofeev et al. Russian Oncological Journal, No. 5 (2008); I. TkppaGueuii e! A1. I. Cl. Oppsodu 25, 188 (2007). In another study, we showed that in patients with metastatic RCC in 40% of cases there are disorders in the hemostatic system, which can also be caused by increased formation of RFF and expression of RFFR1 (I. Tk1sha Geuei e ! a1. I. Extrept1a1 & C11shsa1 Sapseg Vekeatsy, 28, 30 (2009). In further own research niyah KSVV-01 and KSVV-02, we studied the importance of FGF / FGFR1 complex in RCC development.

КСВВ-Ь01: Изучение экспрессии ФРФР у пациентов с ПКР. Иммуногистохимический анализ проVSWR-L01: Study of expression of FGFR in patients with RCC. Immunohistochemical analysis of

- 1 016172 водили на срезах с парафиновых блоков опухолей 140 больных ПКР. Результаты сравнивали с экспрессией ФРФР у 40 здоровых доноров, которым ранее была произведена биопсия почки по разным причинам без последующего обнаружения заболеваний органа. Нами выявлена экспрессия ФРФР1 в 98% случаев на клетках первичной опухоли почки и в 82,5% случаев на клетках метастазов ПКР. Во всех случаях интенсивность окрашивания при иммуногистохимическом анализе была высокой (3+), что свидельствует о сильной экспрессии рецептора. В 68% - получено ядерное окрашивание. Экспрессия ФРФР1 на клетках здоровой ткани почки выявлена в 1 случае (2,5%) за счет окрашивания сосудов. Таким образом, данное исследование подтвердило предположение о появлении и высокой экспрессии ФРФР1 как на клетках первичной опухоли, так и в метастазах ПКР (I. Тк1таГеуеи е! а1. Е8МО-ЕССО 09 (2009): табл. 1. В исследовании КСКВ-Ь02 мы определяли концентрацию ФРФ 1 и 2, как основных факторов, обладающих митогенной активностью при связывании с ФРФР1, в плазме крови 38 больных метастатическим ПКР до начала таргетной терапии, при прогрессировании болезни на таргетной терапии, а также в плазме крови 38 здоровых добровольцев (методом ЕЫ8Л). Нами установлено, что в крови здоровых людей уровни обоих ФРФ были достоверно ниже по сравнению с больными метастатическим ПКР (табл. 2). Наибольшие различия были продемонстрированы для ФРФ 2 (р<0,001). При прогрессировании заболевания на таргетной терапии (сунитиниб, сорафениб) происходило достоверное повышение ФРФ 2 - более чем на 50% (р<0,001) и ФРФ 1 -более чем на 30% (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем ФРФ. При эффективности таргетной терапии изменение уровня обоих ФРФ достоверно не наблюдалось (р=0,3). Медиана концентрации ФРФ 2 в плазме пациентов при прогрессировании болезни и без -достоверно отличалась (р<0,001, фиг. 1).- 1 016172 drove on sections from the paraffin blocks of tumors of 140 patients with RCC. The results were compared with expression of FGFR in 40 healthy donors who had previously undergone a kidney biopsy for various reasons without subsequent detection of organ diseases. We revealed the expression of FGFR1 in 98% of cases on the cells of the primary kidney tumor and in 82.5% of cases on the cells of RCC metastases. In all cases, the staining intensity during immunohistochemical analysis was high (3+), which indicates a strong expression of the receptor. In 68%, nuclear staining was obtained. Expression of FGFR1 on healthy kidney tissue cells was detected in 1 case (2.5%) due to vascular staining. Thus, this study confirmed the hypothesis of the appearance and high expression of FGFR1 both on the cells of the primary tumor and in RCC metastases (I. Tk1taGeuei e! A1. E8MO-ECCO 09 (2009): Table 1. In the study of KSKV-L02 we the concentration of RGF 1 and 2 was determined as the main factors with mitogenic activity in binding to RGF1 in the blood plasma of 38 patients with metastatic RCC before the start of targeted therapy, with the progression of the disease on targeted therapy, as well as in the blood plasma of 38 healthy volunteers (EYL method) We found that o in the blood of healthy people, the levels of both RFF were significantly lower compared with patients with metastatic RCC (Table 2). The greatest differences were demonstrated for RFF 2 (p <0.001). With the progression of the disease on targeted therapy (sunitinib, sorafenib) there was a significant increase RFF 2 - more than 50% (p <0.001) and RFF 1 - more than 30% (p <0.05) compared with the initial level of RFF. With the effectiveness of targeted therapy, a change in the level of both RFF was not significantly observed (p = 0.3). The median concentration of RFF 2 in the plasma of patients with disease progression and non-significantly different (p <0.001, Fig. 1).

Кроме того, в этом исследовании анализировался уровень мишени для сунитиниба/сорафениба фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС). Статистических различий в концентрации ФРЭС в плазме пациентов с ПКР при прогрессировании болезни на терапии и исходным уровнем (р=0,2), а также корреляции с обоими ФРФ (р>0,1) не выявлено.In addition, this study analyzed target levels for sunitinib / sorafenib vascular endothelial growth factor (VEGF). Statistical differences in the concentration of VEGF in the plasma of patients with RCC during disease progression on therapy and baseline (p = 0.2), as well as correlation with both FGF (p> 0.1) were not found.

Таким образом, результаты исследований КСКВ-Ь01 и КСКВ-Ь02 свидетельствуют о том, что патологический путь ФРФ/ФРФР1 является не только независимым в развитии ПКР, но может определять устойчивость к существующей таргетной терапии опухолей. Другие авторы также показали значение ФРФ/ФРФР1 при развитии таких опухолей, как немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак желудка и пищевода, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, опухоли головы и шеи, меланома (С. Вейтепк е! а1. 1 С11шса1 сапсег текеатсй 14, 19 (2008); М. ΚοζίεζαΤ е! а1. 1 Опсодепе, 23,20 (2004); К. Еге1ег 1 Ога1 Опсо1оду 43, 1 (2007); Е. 81нп е! а1. 1 Сапсег Век С11п Опсо1. 126, 9 (2000); К. 8идштае! а1. 1 Опсо1оду теройк 17, 3 (2007); Е. ЭеуПагб е! а1. 1 ВМС Сапсег 6, 272 (2006); С. ЬеГеуге е! а1. 1 1пуек!1да!1уе Орй!йа1то1оду апб У1киа1 8с1епсе 50 (2009). Основываясь на вышеизложенном, мы предположили, что блокирование пути ФРФ/ФРФР1 может привести к нарушению пролиферации опухолевых клеток и ингибированию ангиогенеза. Антагонисты ФРФР1, в том числе человеческие моноклональные антитела, могут быть использованы для подавления роста опухоли и ее метастазов. Кроме того, создание конъюгатов моноклонального антитела (его фрагментов) к ФРФР1 и контрастных веществ, может использоваться в диагностике злокачественных и других образований, клетки которых экспрессируют ФРФР1 в большом количестве. Целью изобретения являлся способ подавления роста опухоли, заключающийся в блокировании (нейтрализации) доменов II и 111с ФРФР1, а также способ диагностики опухолей, клетки которых экспрессируют ФРФР1.Thus, the results of studies of KSKV-L01 and KSKV-L02 indicate that the pathological pathway of FGF / FGFR1 is not only independent in the development of RCC, but can determine resistance to the existing targeted therapy of tumors. Other authors have also shown the importance of RGF / RGFR1 in the development of tumors such as non-small cell lung cancer, breast cancer, cancer of the stomach and esophagus, prostate cancer, bladder cancer, head and neck tumors, melanoma (S. Veitepk e! A1. 1 С11шса1 сапсегroneteektsy 14, 19 (2008); M. ίοζίεζαΤ е! А1. 1 Osodepepe, 23.20 (2004); K. Ege1eg 1 Oga1 Oppo1odu 43, 1 (2007); E. 81нп е! А1. 1 Сапсег Век C11n Opso1. 126, 9 (2000); K. 8idstae! A1. 1 Oppo1 code teroyk 17, 3 (2007); E. EeuPagb e! A1. 1 Naval Forces Sapseg 6, 272 (2006); C. LeGeuge e! A1. 1 1 batch! 1 yes! 1ye Ory! Ya1to1odu apb U1kia1 8s1epse 50 (2009). Based on the above In the foregoing, we suggested that blocking the FGF / FGFR1 pathway can lead to impaired tumor cell proliferation and inhibition of angiogenesis. FGFR1 antagonists, including human monoclonal antibodies, can be used to inhibit tumor growth and its metastases. In addition, the creation of monoclonal antibody conjugates (its fragments) to FGFR1 and contrast agents can be used in the diagnosis of malignant and other formations, the cells of which express FGFR1 in large numbers. The aim of the invention was a method of suppressing tumor growth, which consists in blocking (neutralizing) domains II and 111c of FGFR1, as well as a method for diagnosing tumors whose cells express FGFR1.

Для проверки гипотезы и достижения целей были проведены исследования КСВВ-Ь03. КСВВ-Ь04 и КСВВ-Ь05.To test the hypothesis and achieve the objectives, studies of the SWR-L03 were conducted. KSVV-b04 and KSVV-b05.

Во всех указанных исследованиях для блокирования ФРФР1 (под ФРФ/Ч далее понимается рецептор, соответствующий регистрационным номерам в международных, базах Ишрго! - Р11362 и Епйга 2260, а именно его домены II и 111с (аминокислотная последовательность которых представлена на фиг.In all these studies, to block FGFR1 (FGF / H further refers to the receptor corresponding to registration numbers in international databases of Ishrgo! - P11362 and Epig 2260, namely its domains II and 111c (the amino acid sequence of which is shown in Fig.

2) в качестве веществ-антагонистов использовались синтезированные нами высокоспецифичные нейтрализующие моноклональные антитела: 1) против доменов ФРФР1 II и Шс (Ю-1); 2) против ФРФР1 и гепаран-сульфата (Ю-2).2) highly specific neutralizing monoclonal antibodies synthesized by us were used as antagonist substances: 1) against the domains of FGFR1 II and Schc (S-1); 2) against FRFR1 and heparan sulfate (Yu-2).

Термин моноклональное антитело используется здесь и далее для обозначения антитела, полученного из популяции достаточно однородных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны в своей специфичности и сродству, за исключением возможных, естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Необходимо обратить внимание на то, что в результате подобных, естественно встречающихся, мутаций состав моноклональных антител в данном изобретении, которое в большинстве своем содержит антитела, способные специфически связывать ФРФР1 или же комплекс ФРФР1/гепаран-сульфат или комплексы ФРФ/ФРФР1 или препятствовать связыванию ФРФ с ФРФР1. Таким образом, термин моноклональное указывает на характер антитела, происходящего из достаточно однородной популяции антител, но здесь не имеется в виду, что антитела должны производиться каким-либо определенным путем. Например, моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, могут быть получены гибридомным методом (С. КбЫет, С. М11к!еш. 1 Ыа!иге 256, 495 (1975) или с применением методов, использующих рекомбинантную ДНК (8. СаЫ11у е! а1. и.8. Ра!еп! N 4816567). При получении моноклональных антител гибридомным методомThe term monoclonal antibody is used hereinafter to refer to an antibody obtained from a population of sufficiently homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies that make up the population are identical in their specificity and affinity, with the exception of possible naturally occurring mutations that may be present in small amounts. It is necessary to pay attention to the fact that, as a result of naturally occurring mutations, the composition of monoclonal antibodies in this invention, which for the most part contains antibodies capable of specifically binding FGFR1 or the FGFR1 / heparan-sulfate complex or FGF / FGFR1 complexes or interfere with the binding of FGF with FRFR1. Thus, the term monoclonal indicates the nature of the antibody, originating from a fairly homogeneous population of antibodies, but this does not mean that antibodies must be produced in any particular way. For example, the monoclonal antibodies described in this invention can be obtained by the hybridoma method (S. Kbyt, S. M11k! Yes. Iga! 256, 495 (1975) or using methods using recombinant DNA (8. CaY11y! A1. and 8. Ra! en! N 4816567). Upon receipt of monoclonal antibodies by hybridoma method

- 2 016172 мышь или другое подходящее животное-хозяин иммунизируется антигеном посредством подкожной, внутриперитонеальной или внутримышечной инъекции с целью выявить лимфоциты, которые производят или же способны производить антитела, специфически связывающиеся с белком(ами), использованным(и) для иммунизации. В качестве альтернативы, лимфоциты могут быть иммунизированы ίη νίΐτο. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с использованием соответствующего агента, например такого, как полиэтиленгликоль, чтобы создать гибридомную клетку (1. Собшд. Мопос1опа1 ΛηΙίόοάίοδ: Ртшс1р1е8 апб РтасЛсс, рр. 59-103 (Асабстк Ргс55. 1986).- A mouse or other suitable host animal is immunized with an antigen by subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection to detect lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that specifically bind to the protein (s) used (s) for immunization. Alternatively, lymphocytes can be immunized with ίη νίΐτο. The lymphocytes are then fused with myeloma cells using an appropriate agent, such as polyethylene glycol, to create a hybridoma cell (1. Own. Mopos1op1 ΛηΙίόοάίοδ: Ptcc1p1e8 apb RtacLss, pp. 59-103 (Asabstc Pcg55. 1986).

В данном изобретении таким антигеном является ФРФР1 (домены II и 111с) или же комплекс ФРФР1/гепаран-сульфат. Антиген может представлять собой фрагмент или часть ФРФР1, обладающие одним или несколькими аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании ФРФ.In the present invention, such antigen is FGFR1 (domains II and 111c) or the FGFR1 / heparan-sulfate complex. The antigen may be a fragment or part of FGFR1 having one or more amino acid residues that are involved in the binding of FGF.

Приготовленные таким образом гибридомные клетки высеваются и выращиваются в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно должна содержать одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. Например, в случае, если в родительских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ или ГФРТ), культуральная среда для гибридом обычно будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), каковые вещества препятствуют росту клеток, не обладающих ГГФРТ.Thus prepared hybridoma cells are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably should contain one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused, parental myeloma cells. For example, if the parent myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (GGFRT or GGFR), the hybrid culture medium will usually contain hypoxanthine, aminopterin and thymidine (NAT medium), which substances inhibit the growth of cells that do not have GGFRT.

Предпочтительно выбирать такие клетки миеломы, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антител в отобранных клетках, производящих антитела, и являются чувствительными к средам, таким, например, как среда НАТ. Среди таких клеток предпочтительными клеточными линиями являются: мышиные линии миеломы, такие как линии, происходящие от мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, которые можно получить из Центра распределения клеток Института им. Солка в Сан-Диего (Калифорния, США); клетки 8Р-2, которые можно получить из Американской коллекции типовых культур в Роквилле (Мэриленд, США); и клетки Р3Х63Ад8И.1, описанные Йелтоном и др. (I Сигг. Тор. МютоЬю1. 1ттипо1. 81, 1 (1978). Кроме того, были описаны клеточные линии человеческой миеломы и человеческо-мышиной гетеромиеломы, способные производить человеческие моноклональные антитела (И. КохЬог с! а1. I 1ттипо1. 133, 3001 (1984); В. Вгобсиг, Р. Ткапд Мопос1опа1 АпбЬобу Ртобисбоп Тсс11пк|ис8 апб Аррйсайопк, рр. 51-63 (Магсс1 Исккст 1пс., Исте Уотк, 1987).It is preferable to select those myeloma cells that fuse efficiently, maintain a stable high level of antibody expression in selected antibody producing cells, and are sensitive to media, such as, for example, HAT medium. Among these cells, preferred cell lines are: murine myeloma lines, such as lines derived from murine tumors MORS-21 and MPC-11, which can be obtained from the Center for cell distribution of the Institute. Salk in San Diego (California, USA); 8P-2 cells, which can be obtained from the American Type Culture Collection in Rockville (Maryland, USA); and P3X63AD8I.1 cells described by Yelton et al. (I Sigg. Tor. Mutobu1. 1tipo1. 81, 1 (1978). In addition, cell lines of human myeloma and human-mouse heteromyeloma capable of producing human monoclonal antibodies (I Kokhog with! A1. I 1tipo1. 133, 3001 (1984); V. Vgobsig, R. Tkapd Mopos1op1 Apbobu Rtobisbop Tss11pk | Is8 apb Arrsayopk, pp. 51-63 (Magss1 Iskst 1ps., Issue Watk, 1987.

Культурная среда, в которой выращиваются клетки гибридомы, подвергается анализу для производства моноклональных антител, направленных против соответствующего антигена. Предпочтительно, чтобы специфичность связывания моноклональных антител, производимых клетками гибридомы, была высокой. Данное изобретение включает те моноклональные антитела (ΙΟ-1/ΙΟ-2), которые показали высокую специфичность (не менее 5х109) связывания с указанными антегенами, определенную по стандартной методике ВЮСОКЕ. Другими словами, антитела связывают по меньшей мере один из этих антигенов при анализе связывания и способны ингибировать биологическую активность ФРФР1. Высокая специфичность и сильное блокирование пути обеспечиваются благодаря одновременному связыванию с доменами II и 111с данного рецептора.The culture medium in which the hybridoma cells are grown is analyzed for the production of monoclonal antibodies directed against the corresponding antigen. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is high. This invention includes those monoclonal antibodies (ΙΟ-1 / ΙΟ-2) that have shown high specificity (not less than 5x10 9 ) of binding to these antigens, as determined by the standard method of VUSOKE. In other words, antibodies bind at least one of these antigens in a binding assay and are able to inhibit the biological activity of FGFR1. High specificity and strong blocking of the pathway are provided due to the simultaneous binding to domains II and 111c of this receptor.

После определения клеток гибридомы, которые производят антагонистические антитела желаемой специфичности, сродства и активности, клоны могут быть субклонированы методом ограниченных разбавлений и выращены стандартными методами (I. Собищ. Мопос1опа1 АпбЬобюк: Рг1пс1р1ск апб Ртасбсс, рр. 59-103 (Асабспйс Ртскк, 1986). К подходящим культуральным средам относятся, например, среда Игла, модифицированная Дулбекко (СИМД), или среда КРМЫ640. Кроме того, клетки гибридомы могут выращиваться ш νί\Ό в животных как асцитные опухоли.After identification of hybridoma cells that produce antagonistic antibodies of the desired specificity, affinity and activity, the clones can be subcloned by the method of limited dilutions and grown by standard methods (I. Sobisch. Mopos1op1 Apbobyuk: Prg1ps1p1sk apb Rtasbss, pp. 59-103 (Asabspys 1986). Suitable culture media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (SIMD), or KMMA 640. In addition, hybridoma cells can be grown in νί \ Ό in animals as ascites tumors.

Моноклональные антитела, продуцированные субклонами, отделяются от культуральной среды, асцитной жидкости или плазмы путем использования обычных методов иммуноглобулинной очистки, таких как, например, белок А-Сефароза, гидроксилапатитная хроматография, электрофорез в гелях, диализ или аффинная хроматография.Monoclonal antibodies produced by subclones are separated from the culture medium, ascites fluid or plasma by conventional immunoglobulin purification methods, such as, for example, A-Sepharose protein, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, может быть с легкостью выделена и секвенирована обычными методами (например, с использованием олигонуклеотидных проб, способных связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепу мышиных антител). В качестве источника ДНК использовались клетки гибридомы. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфецируются в клетки хозяина, такие как обезьяньи клетки линии СО8, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в иной ситуации не продуцируют иммуноглобулинный белок, для того чтобы достигнуть синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина. ДНК может быть модифицирована по выбору для того, чтобы изменить характер иммуноглобулина, продуцируемого экспрессией этой ДНК. Так, например, гуманизированные формы мышиных антител могут быть получены путем замещения комплементарной определяющей области (СИР.) вариабельного домена мышиного антитела на соответствующую область человеческого антитела. В некоторых вариантах отдельные аминокислоты из базовой области (ЕК) мышиного антитела также замещаются на соответствующие аминокислотные остатки человеческого антитела (Р. СаЛст с! а1. Ргос. Иа!. Асаб. 8ск 89, 4285 (1992); Р. СаЛст с! а1. I Вю!ссйпо1о§у 10, 163 (1992). Химерные формы мышиных антител могут быть получены также путем замещения гомологичных мышиных последовательностей ДНК на последовательность, кодирующую отдельные области челоDNA encoding the monoclonal antibodies described in this invention can be easily isolated and sequenced by conventional methods (for example, using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies). Hybridoma cells were used as a DNA source. After isolation, DNA can be placed in expression vectors, which are then transfected into host cells, such as monkey cells of the CO8 line, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells, which otherwise do not produce immunoglobulin protein in order to achieve monoclonal synthesis antibodies in recombinant host cells. DNA may be optionally modified in order to alter the nature of the immunoglobulin produced by expression of that DNA. For example, humanized forms of murine antibodies can be obtained by substituting the complementary determining region (CIR.) Of the variable domain of a murine antibody with the corresponding region of a human antibody. In some embodiments, individual amino acids from the base region (EC) of the mouse antibody are also replaced by the corresponding amino acid residues of the human antibody (R. CaLst c! A1. Prgos. Ia !. Asab. 8sk 89, 4285 (1992); R. CaLst c! A1 . I Vyuyu ssypoo 10, 163 (1992). Chimeric forms of murine antibodies can also be obtained by replacing homologous murine DNA sequences with a sequence encoding individual regions of the human

- 3 016172 веческих постоянных цепей иммуноглобулина (тяжелой и легкой) (8. СаЫ11у с1 а1. и.8. Ра1еп1 N 4816567; 8. Могпкоп е1 а1. Ргос. Ναι. Асаб. 8с1. 81, 6851 (1984). Антитела, использующиеся для проверки задач данного изобретения, включают мышиные антитела (1§С). Однако могут быть получены другие формы антител гуманизированные, а также полностью человеческие, что лишь отражает процент человеческого белка и не влияет на специфичность связывания с антигеном, т. е. доказательства способа настоящего изобретения.- 3 016172 strong immunoglobulin constant chains (heavy and light) (8. CaL11u c1 a1. And 8. Ra1ep1 N 4816567; 8. Mogpcop e1 a1. Proc. Ναι. Asab. 8c1. 81, 6851 (1984). Antibodies, used to verify the objectives of this invention include murine antibodies (1 C) However, other forms of antibodies humanized as well as fully human can be obtained, which only reflects the percentage of human protein and does not affect the specificity of binding to the antigen, i.e., evidence the method of the present invention.

Кроме того, для блокирования ФРФР1 и его доменов могут быть легко получены все виды, классы антител (например, 1дА, 1дЭ, 1дЕ, 1дО и 1дМ) и подклассы иммуноглобулинов, а также и фрагменты антител (например, ЕаЬ, Е(аЬ')2 и Εν), пока они обладают способностью связывать ФРФР1 и пока они проявляют антагонизм по отношению к биологической активности пути ФРФ/ФРФР1, которая проверена в данном изобретении.In addition, to block FGFR1 and its domains, all types, classes of antibodies (e.g., 1dA, 1de, 1de, 1do and 1dM) and subclasses of immunoglobulins, as well as antibody fragments (e.g., EaB, E (ab '), can be easily obtained. 2 and Εν), as long as they have the ability to bind FGFR1 and while they exhibit antagonism with respect to the biological activity of the FGF / FGFR1 pathway, which is tested in this invention.

В случае предпочитаемого варианта данного изобретения моноклональные антитела будут проявлять сродство к иммунизирующему антигену в размере по меньшей мере 109 литров/моль (Р. Мипкоп, Ό. ВобЬагб. 1 Апа1. ВюсНет. 107, 220 (1980). Кроме того, моноклональные антитела обычно будут ингибировать митогенную или ангиогенную активность ФРФР1 по крайней мере на 90%, как определяется, например, анализом выживания или пролиферации клеток ίη νίίτο, подобно описанному в наших исследованиях КСКВ-Б03 (пример 1) и КСРВ-Б04 (пример 2).In the case of a preferred embodiment of the present invention, monoclonal antibodies will exhibit an affinity for the immunizing antigen of at least 10 9 liters / mol (P. Mipcop, Wobbag. 1 Apa1. Wusnet No. 107, 220 (1980). In addition, monoclonal antibodies they will usually inhibit mitogenic or angiogenic activity of FGFR1 by at least 90%, as determined, for example, by the analysis of cell survival or proliferation клетокη νίίτο, similar to that described in our studies KSKV-B03 (example 1) and KSVV-B04 (example 2).

Для терапевтических и диагностических применений желательно, чтобы моноклональные антитела реагировали не со всеми компонентами и молекулярными формами ФРФР1. Например, желательно получить моноклональное антитело, которое способно специфически связываться только с доменами ФРФР1 II и 111с, а не с доменом I или другими доменами и изоформами рецептора. Для этого иммунизация производилась экстрацеллюлярной частью ФРФР1, включающей домены II и 111с. Необходимые молекулярные формы антитела легко определяются путем сравнения анализов ЕЫ8А или путем сравнения иммуноприпитации различных полипептидов ФРФР1. Это дает возможность иммунизации различными изоформами ФРФР1.For therapeutic and diagnostic applications, it is desirable that monoclonal antibodies do not react with all components and molecular forms of FGFR1. For example, it is desirable to obtain a monoclonal antibody that is capable of specifically binding only to FGFR1 II and 111c domains, and not to domain I or other receptor domains and isoforms. For this, immunization was carried out with the extracellular part of FGFR1, including domains II and 111c. The necessary molecular forms of an antibody are readily determined by comparing E8A assays or by comparing the immunoprotection of various RFFR1 polypeptides. This makes it possible to immunize with various isoforms of RFFR1.

ФРФР1 может быть заблокирован и другими известными способами, в частности, ингибиторами, созданными путем химического синтеза. Терапевтическое использование способа блокирования пути ФРФ/ФРФР1 Для использования способа, описанного в настоящем изобретении, в терапевтической практике любые антагонисты ФРФ/ФРФР1 вводятся млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой форме, включая введение внутривенно, а также следующими путями: внутримышечной, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, внуртисиновиальным, внутриоболочечным, оральным, локальным или ингаляционным.FGFR1 can be blocked by other known methods, in particular, inhibitors created by chemical synthesis. Therapeutic use of the method of blocking the FGF / FGFR1 pathway In order to use the method described in the present invention, in therapeutic practice, any FGF / FGFR1 antagonists are administered to a mammal, preferably a human, in a pharmaceutically acceptable form, including intravenous administration, as well as the following routes: intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal , subcutaneous, intraarticular, inturtisinovial, intracranial, oral, local or inhaled.

Антагонисты также могут вводиться внутриопухолевым, околоопухолевым, внутриочаговым и околоочаговым путями для обеспечения локального действия наряду с системным терапевтическим действием. Подобные формы введения включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своей природе не обладают ни токсическим, ни терапевтическим действием. Примерами таких носителей являются ионообменные вещества, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы (такие, как белок плазмы человека), буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных овощных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества с целлюлозной основой и полиэтиленгликоль. Носители для локальной или основанной на геле форм антагонистов включают полисахариды, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или метилцеллюлозы, поливинилпирролидон, полиакрилаты, полимеры полиоксиэтиленполиоксипропиленового блока, полиэтиленгликоль и спирты. Для введения во всех случаях используются обычные лекарственные формы, получаемые со складов. К таким формам относятся, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные препараты, аэрозоли, подъязычные таблетки и препараты с постоянным высвобождением вещества. Антагонист в таких препаратах будет обычно содержаться в концентрации примерно от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл.Antagonists can also be administered by intratumoral, peritumoral, intrafocal and focal pathways to provide local action along with a systemic therapeutic effect. Such administration forms include pharmaceutically acceptable carriers that are inherently neither toxic nor therapeutic. Examples of such carriers are ion exchange agents, alum, aluminum stearate, lecithin, plasma proteins (such as human plasma protein), buffering agents such as phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids, water, salts or electrolytes such as protamine sulfate, sodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride, zinc salts, colloidal silicon oxide, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose-based substances and polyethylene glycol. Carriers for local or gel-based antagonist forms include polysaccharides, such as sodium carboxymethyl cellulose or methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, polyoxyethylene polyoxypropylene block polymers, polyethylene glycol and alcohols. For administration in all cases, conventional dosage forms obtained from warehouses are used. Such forms include, for example, microcapsules, nanocapsules, liposomes, patches, inhalation preparations, aerosols, sublingual tablets, and sustained release preparations. The antagonist in such preparations will usually be contained in a concentration of from about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.

Подходящие примеры препаратов с постоянным высвобождением вещества включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антагонист; подобные матрицы имеют определенную форму, например это могут быть пленки или микрокапсулы. К примерам матриц с постоянным высвобождением относятся полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат)], описанные Лангером и др. (I. Вюшеб. Ма1ег. Век. 15, 167 (1981) и Лангером (Сйеш. Тесй. 12 (1982), или поли(винилалкоголь), полилактиды (Патент США N 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гаммаэтил-Ь-глутамата, описанные Сидман и др. (Вюро1ушегк 22, 547 (1983), недеградируемый этиленвинилацетат (Лангер и др. см. выше), деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как Ьиргоп ЭероГ™ (инъецируемые микросферы, состоящие из полимеров молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-Э-(-)- 3-гидроксибутировой кислоты. В то время, как такие полимеры, как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, способны к постоянному высвобождению молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные полипептидные антагонисты остаются в организме на долSuitable examples of sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing an antagonist; such matrices have a certain shape, for example, it can be films or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels [for example, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate)] described by Langer et al. (I. Vyubsch. Ma1eg. Vek. 15, 167 (1981) and Langer (Sjes. These. 12 (1982), or poly (vinyl alcohol), polylactide (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and gamma-ethyl L-glutamate, described by Sidman et al. (Wuroshegk 22, 547 (1983), non-degradable ethylene vinyl acetate (Langer and see above), degradable copolymers of lactic and glycolic acids, such as Birop EeroG ™ (injectable microspheres consisting of polymer in lactic and glycolic acids and leuprolide acetate), and poly-E - (-) - 3-hydroxybutyric acid, while polymers such as ethylene vinyl acetate and a copolymer of lactic and glycolic acids are capable of continuously releasing molecules for more than 100 days, certain hydrogels release proteins in shorter periods of time, when the encapsulated polypeptide antagonists remain in the body for a fraction of

- 4 016172 гое время, они могут денатурировать или агрегироваться в результате воздействия влаги при температуре 37°С, что ведет к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. С целью стабилизации могут быть разработаны разумные стратегии, в зависимости от действующего механизма. Например, если обнаружен механизм агрегации, выражающийся в формировании межмолекулярной 8-8-связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации с целью удаления кислых растворов, контролирования влажности, использования соответствующих добавок и разработки специфических полимерных матричных составов.- 4 016172, they can denature or aggregate as a result of exposure to moisture at a temperature of 37 ° C, which leads to a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. In order to stabilize, reasonable strategies may be developed, depending on the mechanism in place. For example, if an aggregation mechanism is found, which manifests itself in the formation of an 8-8-intermolecular bond via thiodisulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilization to remove acidic solutions, control humidity, use appropriate additives and develop specific polymer matrix compositions.

Антагонистические составы с постоянным высвобождением анти-ФРФР1 агента включают также антагонистические антитела, заключенные в липосомах. Липосомы, содержащие антагонисты, могут быть получены известными в данной области методами, например, описанными Эпстейном и др. (Ргос. N31. Асаб. 8с1. 82, 3688 (1985); Хуанг и др. (Ргосс. N31. Асаб. 8с1. 77, 4030 (1980); Патент США N 4485045 и Патент США N 4544545. Липосомы, как правило, имеют небольшую величину (величиной около 200800 ангстрем) и принадлежат к однослойному типу, в котором содержание липидов выше, чем 30 мол.% холестерина; выбранное соотношение может изменяться для подбора оптимальных условий терапии. Липосомы с продолжительным сроком циркуляции покрываются Патентом США N 5013556.Antagonistic sustained release formulations of an anti-FGFR1 agent also include antagonistic antibodies contained in liposomes. Liposomes containing antagonists can be obtained by methods known in the art, for example, described by Epstein et al. (Propos. N31. Asab. 8c1. 82, 3688 (1985); Huang et al. (Proc. N31. Asab. 8c1. 77, 4030 (1980); US Pat. No. 4,485,045 and US Pat. No. 4,544,545. Liposomes are generally small (about 20,000 Angstroms) and belong to the single-layer type in which the lipid content is higher than 30 mol.% Cholesterol; the selected ratio may vary to select the optimal treatment conditions. Long-circulating liposomes are covered by Pat Entente United States N 5013556.

Еще одним путем использования данного изобретения является инкорпорирование антагониста пути ФРФ/ФРФР1 внутрь изделий, имеющих определенную форму. Такие изделия могут быть использованы для модулирования роста клеток эндотелия и ангиогенеза. Кроме того, такие изделия могут быть использованы для модулирования инвазии опухолей и метастазов.Another way of using this invention is the incorporation of the antagonist of the pathway RFF / RFF1 into products having a specific shape. Such products can be used to modulate endothelial cell growth and angiogenesis. In addition, such products can be used to modulate the invasion of tumors and metastases.

Возможна конъюгация антагониста пути ФРФ/ФРФР1 и другого лечебного средства. При профилактике или лечении заболевания необходимая доза антагониста будет зависеть от типа заболевания, от его степени серьезности и протекания, от того, вводятся ли антитела с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, от истории болезни пациента и его реакции на антагонист и от указаний лечащего врача. Антагонист может вводиться пациенту различными способами, единовременно или в качестве серии назначений.Conjugation of an antagonist of the pathway of RFF / RFFR1 and another therapeutic agent is possible. When preventing or treating a disease, the required dose of an antagonist will depend on the type of disease, on its severity and course, on whether antibodies are administered for prophylactic or therapeutic purposes, on previous therapy, on the patient’s medical history and his response to the antagonist, and on the instructions of the patient a doctor. The antagonist can be administered to the patient in various ways, at a time, or as a series of appointments.

Антагонисты ФРФ/ФРФР1 могут быть использованы для лечения различных неопластических и ненеопластических заболеваний и нарушений. Неоплазмы и близкие состояния, которые поддаются такому лечению, включают почечноклеточный рак, рак легких, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, рак печени, рак яичников, рак шейки матки, рак эндометрия, гиперплазию эндометрия, эндометриоз, фибросаркомы, хориосаркомы, опухоли головы и шеи, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, рак кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, рак поджелудочной железы, ретинобластомы, астроцитому, глиобластому, шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркому, рак мочевого пузыря и другие уротелиальные опухоли, опухоль Вильмса, рак предстательной железы, аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами.FGF / FGFR1 antagonists can be used to treat various neoplastic and non-neoplastic diseases and disorders. Neoplasms and related conditions that can be treated with this include renal cell carcinoma, lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial hyperplasia, endometriosis, fibrosarcoma, choriosarcoma, head tumors and neck, hepatoblastoma, Kaposi’s sarcoma, melanoma, skin cancer, hemangioma, cavernous hemangioma, hemangioblastoma, pancreatic cancer, retinoblastoma, astrocytoma, glioblastoma, schwan, oligodendroglioma, medulloblastoma, neuroblastoma, rhabdomy Osarcoma, osteogenic sarcoma, leiomyosarcoma, bladder cancer and other urothelial tumors, Wilms tumor, prostate cancer, abnormal vascular proliferation associated with phacomatoses.

Возможно применение способа при неонкологических заболеваниях, которые поддаются лечению, включая такие как ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетические и другие ретинопатии, фиброплазии, неоваскулярную глаукому, тироидные гиперплазии (в том числе болезнь Граве), трансплантацию роговицы и других тканей, хронические воспаления, воспаление легких, нефротический синдром, асцит, преэклампсию, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот. В зависимости от типа заболевания и от степени его серьезности первоначальная доза для введения пациенту будет составлять от 1 мкг/кг до 15 мг/кг и может вводиться путем одного или многих отдельных введений или путем постоянного вливания. Обычная дневная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг и более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней и более, в зависимости от условий, лечение повторяется, пока не достигается желаемое подавление симптомов болезни. Однако могут использоваться и другие режимы дозировки. Успех лечения легко определяется обычными методами и анализами, например методами рентгено- визуализации опухолей.It is possible to use the method for non-cancer diseases that can be treated, including such as rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic and other retinopathies, fibroplasias, neovascular glaucoma, thyroid hyperplasias (including Grave’s disease), transplantation of the cornea and other tissues, chronic inflammation, pneumonia, nephrotic syndrome, ascites, preeclampsia, pericardial effusion (for example, associated with pericarditis) and pleural effusion. Depending on the type of disease and its severity, the initial dose for administration to the patient will be from 1 μg / kg to 15 mg / kg and may be administered by one or many separate administrations or by continuous infusion. A typical daily dose may vary from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the above factors. For repeated administration for several days or more, depending on the conditions, the treatment is repeated until the desired suppression of the symptoms of the disease is achieved. However, other dosage regimens may also be used. The success of treatment is easily determined by conventional methods and analyzes, for example, X-ray imaging of tumors.

В соответствии с другим применением изобретения эффективность антагониста пути ФРФ/ФРФР1 в предотвращении или лечении болезней может быть улучшена путем введения антагониста серийно или же в комбинации с другим веществом, эффективным для данной цели, таким как фактор некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины; антитела и ингибиторы, способный нейтрализовать или ингибировать ангиогенную активность фактора роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и его рецепторов и/или фактора роста гепатоцитов и/или эпидермального фактора роста и его рецепторов и/или фактора роста плаценты и/или тТОК и/или других внутриклеточныз киназ или одно или более обычных терапевтических веществ, таких как, например, алкилирующие соединения, антагонисты фолиевой кислоты, антиметаболиты метаболизма нуклеиновых кислот, антибиотики, аналоги пиримидинов, 5флюороурацил, пуриновые нуклеозиды, амины, аминокислоты, триазольные нуклеозиды или кортикостероиды. Подобные вещества могут присутствовать во вводимом составе или могут вводиться отдельно. Кроме того, антагонист пути ФРФ/ФРФР1 может вводиться серийно или же в комбинации с радиологическим лечением, которое может включать как иррадиацию, так и введение радиоактивных веществ.According to another application of the invention, the effectiveness of the antagonist of the FGF / FGFR1 pathway in the prevention or treatment of diseases can be improved by administering the antagonist serially or in combination with another substance effective for this purpose, such as tumor necrosis factor, interferons, interleukins; antibodies and inhibitors capable of neutralizing or inhibiting the angiogenic activity of the growth factor of endothelial cells of blood vessels and its receptors and / or the growth factor of hepatocytes and / or epidermal growth factor and its receptors and / or placental growth factor and / or TTOC and / or other intracellular kinases or one or more conventional therapeutic substances, such as, for example, alkylating compounds, folic acid antagonists, nucleic acid metabolism antimetabolites, antibiotics, pyrimidine analogs, 5fluorour acyl, purine nucleosides, amines, amino acids, triazole nucleosides or corticosteroids. Such substances may be present in the composition to be administered or may be administered separately. In addition, an antagonist of the RFF / RFFR1 pathway may be administered serially or in combination with radiological treatment, which may include both radiation and the administration of radioactive substances.

- 5 016172- 5 016172

В соответствии с одним из применений изобретения при комбинированной терапии подвергается атаке васкуляризация опухоли. Один или более антагонист ФРФ/ФРФР1 вводятся пациенту с опухолью в терапевтически эффективных дозах, определенных, например, при наблюдении некроза опухоли или ее метастазных фокусов, если они имеются. Такая терапия продолжается до тех пор, пока перестает наблюдаться дальнейшее улучшение или клиническое обследование показывает, что опухоль или ее метастазы исчезли. При прогрессировании болезни вводится одно или несколько описанных выше веществ(о) или гипертермия и лучевая терапия. Поскольку эффективность дополнительных веществ будет варьировать, желательно сравнить их влияние на опухоль путем стандартного матричного скрининга. Производится повторное введение антагониста ФРФ/ФРФР1 и дополнительного агента, пока не будет достигнут желаемый клинический эффект. В альтернативном случае антагонист(ы) ФРФ/ФРФР1 вводятся совместно и, при желании, вместе с дополнительными веществами. Использование в диагностикеIn accordance with one application of the invention, in combination therapy, a tumor vascularization is attacked. One or more antagonists of FGF / FGFR1 are administered to a patient with a tumor in therapeutically effective doses, determined, for example, by observing tumor necrosis or its metastatic foci, if any. Such therapy continues until further improvement ceases to be observed or clinical examination indicates that the tumor or its metastases have disappeared. With the progression of the disease, one or more of the substances described above (o) or hyperthermia and radiation therapy are administered. Since the effectiveness of additional substances will vary, it is advisable to compare their effect on the tumor by standard matrix screening. The repeated administration of the antagonist of FGF / FGFR1 and an additional agent is performed until the desired clinical effect is achieved. Alternatively, the antagonist (s) of FGF / FGFR1 are administered together and, if desired, together with additional substances. Diagnostic Use

В диагностике могут быть использованы антитела к ФРФР1 и также к его доменам II и 111с. Антитела обычно должны быть помечены остатком, который легко обнаружить. Это может быть любой остаток, который, прямо или косвенно, может продуцировать обнаруживаемый сигнал. Например, это могут быть радиоизотопы, такие как 3Н, 14С, 32Р, 358, 1251; флюоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как изотиоцианат флюоресцеина, родамин или люциферин; метки, помеченные радиоизотопами, 125 32 14 3 такими как, например, I, Р, С или Н, или ферменты, такие как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или пероксидаза хрена.In diagnosis, antibodies to FGFR1 and also to its domains II and 111c can be used. Antibodies should usually be labeled with a residue that is easy to detect. This can be any residue that, directly or indirectly, can produce a detectable signal. For example, it can be radioisotopes, such as 3 N, 14 C, 32 P, 35 8, 125 1; a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin; labels labeled with radioisotopes 125 32 14 3 such as, for example, I, P, C or H, or enzymes such as alkaline phosphatase, betagalactosidase or horseradish peroxidase.

Здесь может применяться любой известный в данной области метод для конъюгирования отдельных антител к обнаруживаемым остаткам, включая описанные методы Хантером и др. (I Ыа1иге 144, 945 (1962); Дэвидом и др. (I ВюсйетМгу 13, 1014 (1974); Пейном и др. (I 1ттипо1. Ме1й. 40, 219 (1981) и Нигреном (I. НШосйет. апб С’уЮсйет. 30, 407 (1982). Антитела данного изобретения или ФРФР1 могут быть использованы в диагностике опухолей человека и млекопитающих. При этом антитело или ФРФР1, помеченные обнаруживаемым остатком, вводится пациенту, предпочтительно в кровеносную систему, и анализируется присутствие и местонахождение меченого антитела или рецептора в организме пациента. Такая визуализация может использоваться, например, при определении стадии заболевания и при лечении неоплазм. Антитело или ФРФР1 метятся любым остатком, обнаружимым в организме млекопитающих, известными в этой области методами, например ядерным магнитным резонансом, радиологическим методом и т.д. Ниже в качестве примеров представлены некоторые доказательства способа подавления роста опухоли, заключающегося в блокировании (нейтрализации) ФРФР1, а также способа диагностики опухолей, клетки которых экспрессируют ФРФР1. Нижеследующие примеры предлагаются только в качестве иллюстрации и не должны восприниматься как в чем-либо ограничивающие настоящее изобретение.Any method known in the art can be used to conjugate individual antibodies to detectable residues, including those described by Hunter et al. (I Baighe 144, 945 (1962); David et al. (I Vusyet MGU 13, 1014 (1974); Payne and other (I 1ttypo1. Me1y. 40, 219 (1981) and Nygren (I. NShoset. apb S'yusyet. 30, 407 (1982). Antibodies of the present invention or FGFR1 can be used in the diagnosis of human and mammalian tumors. an antibody or FGFR1 labeled with a detectable residue is administered to a patient, preferably into the circulatory system, and analysis The presence and location of the labeled antibody or receptor in the patient’s body can be detected, for example, in determining the stage of the disease and in the treatment of neoplasms. The antibody or FGFR1 is labeled with any residue found in mammals by methods known in the art, such as nuclear magnetic resonance , radiological method, etc. Below, as examples, some evidence is presented of a method for suppressing tumor growth, which consists in blocking (neutralizing) FGFR1, as well as a method for diagnosing tumors whose cells express FGFR1. The following examples are offered by way of illustration only and should not be construed as limiting the present invention in anything.

Пример 1 (Результаты исследования КСКВ-Ь03): анализ выживания или пролиферации клеток ίη νί1го, нарушение функции ФРФР1 при добавлении моноклинального антитела, блокирующего ФРФР1 домены II и 111с.Example 1 (Results of the study KSKV-b03): analysis of the survival or proliferation of cells ηην1go, impaired function of FGFR1 when adding a monoclinal antibody that blocks FGFR1 domains II and 111c.

Для выбора модели клеточной линии были изучены различные линии клеток на предмет гиперэкспрессии ФРФР1:To select a model of the cell line, various cell lines were studied for overexpression of FGFR1:

1) человеческого почечноклеточного рака Сак1-1;1) human renal cell carcinoma Sac1-1;

2) человеческого рака молочной железы МСР7;2) human breast cancer MCP7;

3) человеческого рака предстательной железы Ии145;3) human prostate cancer AI145;

4) человеческого немелкоклеточного рака легкого А549.4) human non-small cell lung cancer A549.

Гиперэкспрессия ФРФР1 на клетках определялась в стандартном анализе Вестерн-блоттинг. Общий уровень экспрессии ФРФР1 на клетках составил 40%. Самый высокий уровень экспрессия ФРФР1 был выявлен на клетках линии человеческого почечноклеточного рака Сак1-1, самый низкий - на клетках человеческого рака предстательной железы Ии145 (различия в 10 раз): фиг. 3.Overexpression of FGFR1 on cells was determined in a standard Western blot analysis. The total level of expression of FGFR1 on cells was 40%. The highest level of expression of FGFR1 was detected on cells of the Sak1-1 human renal cell carcinoma line, the lowest - on the cells of human prostate cancer Ii145 (10-fold differences): FIG. 3.

Основываясь на полученных данных, линия человеческого почечноклеточного рака Сакг-1 была отобрана для дальнейших исследований.Based on the findings, the Sacg-1 human renal cell carcinoma line was selected for further studies.

Клетки были высеяны с плотностью 104 клеток/мл в 6-луночных пластинках. В каждую лунку были добавлены нейтрализующие моноклональные антитела Ю-1 и Ю-2 в равном объеме и различных концентрациях. Также в качестве контроля к части культуры было добавлено постороннее моноклонального антитела без нейтрализующей способности (приобретенное в АЬсат). После инкубации в каждую лунку был добавлен ФРФ 2 по 10 нг/мл. В качестве дополнительного контроля часть клеток выращивалась в отсутствие как атител, так и ФРФ 2. После роста культуры в течение 3 недель клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Не^1ей Раскагб 8саи)е1 (США).Cells were seeded with a density of 10 4 cells / ml in 6-well plates. The neutralizing monoclonal antibodies U-1 and U-2 in equal volume and different concentrations were added to each well. Also, as a control, an extraneous monoclonal antibody without neutralizing ability (acquired from ABcat) was added to part of the culture. After incubation, 10 ng / ml of RFF 2 was added to each well. As an additional control, part of the cells was grown in the absence of both antibodies and FGF 2. After culture growth for 3 weeks, the cells in each well were counted using a computer program using the He ^ 1ey Raskagb 8cai) e1 analyzer (USA).

Как показано на фиг. 4 и 5, оба моноклональных антитела (Ю-1 и Ю-2) полностью ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Достоверных различий в активности Ю-1 и Ю-2 выявлено не было. Моноклональное антитело к ФРФР1 без нейтрализующей способности (АЬсат) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФР1 (чем выше доза, тем выше митогенная активность). Общий вывод по данному примеру: при одновременном блокировании доменов II и Шс ФРФР1 достигается сильноеAs shown in FIG. 4 and 5, both monoclonal antibodies (S-1 and S-2) completely inhibited the ability of the added RFF 2 to support the growth and survival of renal cell cancer cells (more than 90%). There were no significant differences in the activity of Yu-1 and Yu-2. A monoclonal antibody to FGFR1 without a neutralizing ability (ABcat) did not cause changes in cell survival. In the experiment, it was found that the suppression of mitogenic activity depends on the dose of the agent that blocks the pathway of RFF / RFF1 (the higher the dose, the higher the mitogenic activity). The general conclusion of this example: while blocking domains II and Cc FRFR1, a strong

- 6 016172 ингибирование роста опухолевых клеток.- 6 016172 inhibition of tumor cell growth.

Также в данном примере мы показываем, что блокирование рецептора фактора роста фибробластов приводит к нарушению аутофосфорилирования рецептора, что отражает его функциональное значение.Also in this example, we show that blocking the receptor of the fibroblast growth factor leads to a violation of the receptor's autophosphorylation, which reflects its functional significance.

Для этого к описанным клеткам было добавлено антитело ΙΟ-1 и через 1,5 ч - ФРФ 2, 10 нг/мл. Культивирование происходило в течение 5 мин при температуре 37°С. Затем клетки были промыты и лизированы в специальном буффере для лизиса (50 ммоль НЕРЕ8 (рН 7,4), 150 ммоль ЫаС1, 10% глицерол, 1% Тритон X-100, 1,5 ммоль МдС12, ингибиторы протеазы и 2 ммоль натрия ванадат). Инкубация лизата проводилась на льду в течении 30 мин, а затем он был центрифугирован (13000 оборотов/мин, в течение 10 мин при температуре 4°С). Концентрация белка в лизате была измерена в анализе Кумасси Плюс (Р1егсе). После этого проводились иммунопреципитация/Вестерн-блоттинг. Эти методы выполнялись по стандартному протоколу (8ап!а Сги/ Вю1ес11по1оду. США) с использованием 1 мг моноклонального антитела для связывания ФРФР1 (контрольное антитело; 8ап1а Сги/ Вю!есйпо1оду), и антифосфотирозин (4010) антител. Полученные пробы использовали для электрофореза с последующим выявлением копреципитированных белков в Вестерн-блоттинге. Часть клеток без добавления ФРФ 2 и антител использовалась для контроля.For this, antibody ΙΟ-1 was added to the described cells, and after 1.5 h - RFF 2, 10 ng / ml. Cultivation took place for 5 min at a temperature of 37 ° C. Then the cells were washed and lysed in a special buffer for lysis (50 mM NERE8 (pH 7.4), 150 mmol YaS1, 10% glycerol, 1% X-100 Triton, 1.5 mmol MdS1 2, protease inhibitors, 2 mM Na vanadate). The lysate was incubated on ice for 30 minutes, and then it was centrifuged (13000 rpm, for 10 minutes at 4 ° C). Protein concentration in the lysate was measured in a Coomassie Plus (P1egse) assay. Following this, immunoprecipitation / Western blotting was performed. These methods were carried out according to the standard protocol (8AP! A SgI / Vu1es11po1od. USA) using 1 mg of a monoclonal antibody to bind FGFR1 (control antibody; 8ap1a Sgi / Vu1is1pod1) and antiphosphothyrosine (4010) antibodies. The obtained samples were used for electrophoresis, followed by identification of co-precipitated proteins in Western blotting. Some cells without the addition of RFF 2 and antibodies were used for control.

Результаты представлены на фиг. 6. Показано, что моноклональное антитело ΙΟ-1 вызывает нарушение процессов фосфорилирования ФРФР1, тогда как контрольное антитело анти-ФРФР1 (8ап1а Сги/ Вю!есйпо1оду, США) не препятствовало нарушению фосфорилирования рецептора. Концентрации блокирующего агента (в данном случае ΙΟ-1) влияют на фосфорилирование ФРФР1: чем выше концентрация, тем больше эффект. Таким образом, пример 1 (исследование КСКВ-Ь03) показывает, что клетки человеческого почечноклеточного рака в присутствии ФРФ 2 пролифирируют, а при блокировании рецептора-мишени ФРФР1 (только доменов II и 111с) и нарушении его функции, перестают размножаться и теряют митогенную активность. Более того, в примере 1 продемонстрировано, что клетки в отсутствии ФРФ 2 также не пролиферируют и это свидетельствует о его митогенном значении (если ФРФ 2 связать, клетки также не будут пролиферировать).The results are presented in FIG. 6. It was shown that the monoclonal antibody ΙΟ-1 causes a disruption in the phosphorylation of FGFR1, while the control antibody anti-FGFR1 (8ap1a CGI / Vu! Espo1odo, USA) did not interfere with phosphorylation of the receptor. The concentrations of the blocking agent (in this case, ΙΟ-1) affect the phosphorylation of RFFR1: the higher the concentration, the greater the effect. Thus, Example 1 (KSKB-L03 study) shows that cells of human renal cell carcinoma in the presence of FGF 2 proliferate, and when the target receptor FFGF1 is blocked (only domains II and 111c) and its function is impaired, it ceases to multiply and lose mitogenic activity. Moreover, in example 1, it was demonstrated that cells in the absence of RFF 2 also do not proliferate and this indicates its mitogenic value (if the RFF 2 is bound, the cells will also not proliferate).

Пример 2 (Результаты исследования КСКВ-Ь04): анализ выживания или пролиферации эндотелиальных клеток ίη У1!го, нарушение функции ФРФР1 на эндотелиоцитах при добавлении моноклонального антитела, блокирующего ФРФР1.Example 2 (Results of the study KSKV-b04): analysis of the survival or proliferation of endothelial cells ίη У1! Go, violation of the function of FGFR1 on endotheliocytes with the addition of a monoclonal antibody that blocks FGFR1.

Для анализа выживания эндотелиальных клеток в среде ФРФ и при блокировании ФРФР1 был проведен подобный эксперимент, что и при блокировании фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, описанный в патенте США N 20090022716 (Роск\\'е11; Райгста е! а1. И8 Ра!еп1 20090022716).A similar experiment was carried out to analyze the survival of endothelial cells in the RFF medium and when blocking RFFR1, as for blocking the vascular endothelial cell growth factor described in US patent N 20090022716 (Rosk \\ 'e11; Raigsta e! A1. I8 Ra! Ep1 20090022716 )

В качестве модели эндотелиоцитов использовались бычьи клетки капиллярного эндотелия коры надпочечников (КЭКН) (Ν. Ееггага е! а1. Ргос. №11. Асаб. 8ск 84: 5773 (1987). В начале мы выявили высокую экспрессию ФРФР1 на КЭКН в стандартном анализе. Вестерн-блоттинг (фиг. 7).As a model of endotheliocytes, bovine cells of the capillary endothelium of the adrenal cortex (ECCN) were used (Ν. Eeggaga e! A1. Proc. No. 11. Asab. 8sk 84: 5773 (1987). In the beginning, we revealed high expression of FGFR1 on ECCN in a standard analysis. Western blotting (Fig. 7).

Затем КЭКН были высеяны с плотностью 5х104 клеток/мл в 12-луночных пластинках. В каждую лунку было добавлено 10 нг/мл ФРФ 2 в присутствии или в отсутствие различных концентраций моноклональных антител к ФРФР1, а также постороннего моноклонального антитела без нейтрализующей активности к ФРФР1 (АЬсат). После роста культуры в течение 5 дней клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Не\\'1е11 Раскагб 8сап1е! (США). В качестве дополнительного контроля КЭКН выращивались в отсутствие ФРФ 2.Then EECs were seeded with a density of 5x10 4 cells / ml in 12-well plates. 10 ng / ml FGF 2 was added to each well in the presence or absence of different concentrations of monoclonal antibodies to FGFR1, as well as an extraneous monoclonal antibody without neutralizing activity for FGFR1 (ABcat). After culture growth for 5 days, the cells in each well were counted using a computer program on the He \\ '1e11 Raskagb 8sap1e analyzer! (USA). As an additional control, ECECs were grown in the absence of FRF 2.

Как показано на фиг. 8, оба моноклональных антитела к ФРФР1 ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание бычьих КЭКН. Моноклональное антитело без нейтрализующей активности (АЬсат) не оказывало никакого действия на клетки.As shown in FIG. 8, both monoclonal anti-FGFR1 antibodies inhibited the ability of the added FGF 2 to support the growth and survival of bovine ECCNs. A monoclonal antibody without neutralizing activity (ABcat) had no effect on cells.

Таким образом, пример 2 демонстрирует, что при блокировании пути ФРФ/ФРФР1 эндотелиальные клетки перестают размножаться и теряют митогенную активность, что может приводить к нарушению ангиогенеза в опухоли.Thus, Example 2 demonstrates that when the FGF / FGFR1 pathway is blocked, endothelial cells cease to multiply and lose mitogenic activity, which can lead to impaired angiogenesis in the tumor.

Пример 3 (Результаты исследования КСКВ-Ь05): Ингибирование роста опухоли ш у1уо при блокировании пути ФРФ/ФРФР1.Example 3 (Results of the study KSKV-b05): Inhibition of tumor growth w1010 when blocking the pathway RFF / RFFR1.

Самкам мышей (Ве1де/пибе) возрастом 5-6 недель (приобретенным в Наг1ап 8ргадие ИаМеу, 1пс. (Индианаполис, США) были подкожно введены 2х106 опухолевых клеток линии человеческого почечноклеточного рака Сак1-1 в 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (ФРФБ). После того, как установился рост опухоли, мыши были разделены на 3 группы.Female mice (Be1de / Pibe) 5-6 weeks old (purchased from Nag1ap 8gradie IaMeu, 1ps. (Indianapolis, USA) were injected subcutaneously with 2x10 6 tumor cells of the human kidney cell line Sac1-1 in 100 μl of saline with phosphate buffer (PFBF ). After tumor growth was established, the mice were divided into 3 groups.

Первой (лечебной) группе мышей вводили интраперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело ΙΟ-1 к ФРФР1 в дозе 100 мкг/кг. Второй (лечебной) группе мышей вводили интраперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело ΙΟ-2 к ФРФР1/гепаран-сульфату в дозе 100 мкг/кг. Третьей (контрольной) группе мышей вводился физиологический раствор. Каждая группа включала 15 мышей.The first (treatment) group of mice was administered intraperitoneally 2 times a week with a monoclonal antibody ΙΟ-1 to FGFR1 at a dose of 100 μg / kg. The second (treatment) group of mice was administered intraperitoneally 2 times a week with a monoclonal antibody ΙΟ-2 to FGFR1 / heparan sulfate at a dose of 100 μg / kg. A third (control) group of mice was injected with saline. Each group included 15 mice.

Величина опухоли измерялась каждые 5 дней, и по завершении исследования опухоли были вырезаны и взвешены.Tumor size was measured every 5 days, and at the end of the study, the tumors were excised and weighed.

Влияние моноклональных антител/физиологического раствора на рост (объем) опухолей показан на фиг. 9. На рисунке видно, что у тех мышей, которым были введены моноклональные антитела, блокирующие ФРФР1, объем опухоли был значительно меньше, чем у мышей из контрольной группы.The effect of monoclonal antibodies / saline on tumor growth (volume) is shown in FIG. 9. The figure shows that in those mice that were injected with monoclonal antibodies blocking FGFR1, the tumor volume was significantly less than in mice from the control group.

- 7 016172- 7 016172

Вес (медиана) опухоли мышей контрольной группы был достоверно выше по сравнению с мышами лечебных групп (р<0,001). Количество метастазов в легкие также было достоверно выше у мышей контрольной группы (р<0,01). У тех мышей, которые получали нейтрализующие моноклональные антитела, начиная с первой недели после инокуляции клетками Сак1-1, скорость роста опухолей была значительно более медленной, чем у мышей, которым вводили физиологический раствор.The weight (median) of the tumor in the mice of the control group was significantly higher compared to the mice of the treatment groups (p <0.001). The number of lung metastases was also significantly higher in mice of the control group (p <0.01). In those mice that received neutralizing monoclonal antibodies, starting from the first week after inoculation with Sac1-1 cells, the tumor growth rate was significantly slower than in mice that were injected with saline.

На основании этих данных был сделал вывод об эффективности способа подавления роста опухоли ίη νίνο путем блокирования пути ФРФ/ФРФР1 (через блокирование доменов II и 111с ФРФР1).Based on these data, it was concluded that the method of suppressing the growth of the tumor ίη νίνο by blocking the pathway of FGF / FGFR1 (through blocking domains II and 111c of FGFR1) was concluded.

Claims (2)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способ подавления роста опухоли, отличающийся тем, что нейтрализуют домены II и Шс рецептора типа 1 фактора роста фибробластов специфическим к данным доменам антителом.1. A method of suppressing tumor growth, characterized in that they neutralize the domains II and Cc of the receptor type 1 fibroblast growth factor specific for these domains antibody. 2. Способ диагностики злокачественных новообразований, основанный на обнаружении в биологическом образце повышенной экспрессии рецептора типа 1 фактора роста фибробластов с помощью специфического антитела к доменам II и Шс рецептора типа 1 фактора роста фибробластов, при этом антитело прямо или косвенно продуцирует обнаруживаемый сигнал.2. A method for the diagnosis of malignant neoplasms, based on the detection of increased expression of fibroblast growth factor type 1 receptor in a biological sample using a specific antibody to fibroblast growth factor type II receptor domains II and Cc, the antibody directly or indirectly producing a detectable signal. Таблицы и ФигурыTables and Shapes Таблица 1. Экспрессия ФРФР1 на клетках рака почки людей (первичная опухоль, метастазы). Сравнение с экспрессией ФРФР1 на клетках паренхимы почки здоровых людей и экспрессией ФРФР2 на клетках рака почки людей (первичная опухоль, метастазы)Table 1. Expression of FGFR1 on human kidney cancer cells (primary tumor, metastases). Comparison with the expression of FGFR1 on healthy kidney kidney parenchyma cells and the expression of FGFR2 on human kidney cancer cells (primary tumor, metastases) N N ФРФР1, % FRFR1,% ФРФР1: ядро,% FGFR1: core,% ФРФР2, % FRFR2,% ФРФР2: ядро, % FGFR2: core,% ПКР: первичная опухоль RCC: primary tumor 100 one hundred 98 98 68 68 4 4 - - ПКР: метастазы RCC: metastases 40 40 82,5 82.5 5 5 - - Здоровые люди: паренхима почки Healthy People: Kidney Parenchyma 40 40 2,5 2,5 - - - - - -
Таблица 2. Концентрация ФРФ 1 и 2 у пациентов с метатстатическим ПКР до начала лекарственного лечения и у здоровых добровольцевTable 2. Concentration of RFF 1 and 2 in patients with metastatic RCC before drug treatment and in healthy volunteers Здоровые люди Healthy people Пациенты с метастатическим ПКР Patients with metastatic RCC Р R ФРФ1, медиана, пг/мл RFF1, median, pg / ml 1,7 1.7 4,8 4.8 0,03 0,03 ФРФ2, медиана, пг/мл FRF2, median, pg / ml 0,2 0.2 6,9 6.9 <0,001 <0.001
Различия в концентрации ФРФ2 у пациентов с метастатическим ПКР с прогрессированием болезни и с клиническим эффектом при лечении таргетными препаратамиDifferences in the concentration of RFF2 in patients with metastatic RCC with disease progression and with clinical effect in the treatment with targeted drugs
EA200901272A 2009-05-26 2009-05-26 Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms EA016172B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200901272A EA016172B1 (en) 2009-05-26 2009-05-26 Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200901272A EA016172B1 (en) 2009-05-26 2009-05-26 Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200901272A1 EA200901272A1 (en) 2010-12-30
EA016172B1 true EA016172B1 (en) 2012-02-28

Family

ID=43531302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901272A EA016172B1 (en) 2009-05-26 2009-05-26 Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA016172B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2692248C2 (en) * 2014-02-14 2019-06-24 Макродженикс, Инк. Improved methods of treating vascularised malignant tumors

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005066211A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
WO2009056886A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Astrazeneca Ab Pyrimidine derivatives and their use as modulators of fgfr activity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005066211A2 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
WO2009056886A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Astrazeneca Ab Pyrimidine derivatives and their use as modulators of fgfr activity

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Leivonen M. et al. Prognostic value of syndecan-1 expression in breast cancer. Oncology [online], 2004; 67(1):11-8, [retrived on 2010-01-18]. Retrived from the Internet: <URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez, referat *
Oliani S.M. et al. Immunocytochemical localization of heparin in secretory granules of rat peritoneal mast cells using a monoclonal anti-heparin antibody (ST-1). J Histochem Cytochem [online], february 1997, 45(2):231-5, [retrived on 2010-01-18]. Retrived from the Internet: <URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez, referat *
Sabine Werner et al. Differential splicing in the extracellular region of fibroblast growth factor receptor 1 generates receptor variants with different ligand-binding specificities. Molecular and cellular biology. January 1992, vol. 12, no. 1, p. 82, 84 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2692248C2 (en) * 2014-02-14 2019-06-24 Макродженикс, Инк. Improved methods of treating vascularised malignant tumors

Also Published As

Publication number Publication date
EA200901272A1 (en) 2010-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100335584B1 (en) Antagonists Against Vascular Endothelial Growth Factor
Mercurio et al. Targeting CXCR4 by a selective peptide antagonist modulates tumor microenvironment and microglia reactivity in a human glioblastoma model
JPH11502853A (en) Vascular endothelial growth factor antagonist
JP2011006488A (en) Method for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis
RU2440142C1 (en) Antibody, stopping or retarding tumour growth (versions), method of suppressing tumour growth, method of diagnosing malignant lesions
NZ550110A (en) Compositions and methods comprising an EGFL7 antagonist for modulating vascular development
UA115789C2 (en) Antibody formulations and uses thereof
US9549971B2 (en) Methods for inhibiting angiogenesis using EGFL8 antagonists
US20090208486A1 (en) Pharmaceutical composition comprising cxcr3 inhibitor
Yin et al. Anemoside A3 activates TLR4-dependent M1-phenotype macrophage polarization to represses breast tumor growth and angiogenesis
EP2450055B1 (en) Method for suppressing renal tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor
Cai et al. Nogo‐B promotes tumor angiogenesis and provides a potential therapeutic target in hepatocellular carcinoma
US20110293634A1 (en) Antibodies binding to adrenomedullin receptors and uses thereof as drugs
CN103403030A (en) Methods for treating and diagnosing disease
JPWO2021100794A1 (en) Antibodies-containing preparation
EA016172B1 (en) Method for suppressing tumor growth by blocking fibroblast growth factor receptor, and method for diagnosing malignant neoplasms
US9724385B2 (en) STIP1 polypeptides and uses thereof
Isumi et al. DS-7080a, a selective anti-ROBO4 antibody, shows anti-angiogenic efficacy with distinctly different profiles from anti-VEGF agents
KR101836756B1 (en) Vaccine targeting il-17a
KR100315613B1 (en) Vascular Endothelial Cell Growth Factor Antagonists
US20150377888A1 (en) Methods for Predicting and Preventing Metastasis in Triple Negative Breast Cancers
JP2022122736A (en) Use of anti-PROK1 antibody
Fontenot et al. A Novel Monoclonal Antibody to Secreted Frizzled-Related Protein
AU2016202059A1 (en) Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): RU