EA011421B1 - Method for preparing the tumor vaccine - Google Patents
Method for preparing the tumor vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- EA011421B1 EA011421B1 EA200801751A EA200801751A EA011421B1 EA 011421 B1 EA011421 B1 EA 011421B1 EA 200801751 A EA200801751 A EA 200801751A EA 200801751 A EA200801751 A EA 200801751A EA 011421 B1 EA011421 B1 EA 011421B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- antigens
- antigen
- living cells
- presenting cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 199
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 199
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 197
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 30
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000005749 Anthriscus sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710106089 Protein cutoff Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/49—Breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, фармацевтике и медицине и может быть использовано для производства лекарств и осуществления медицинских технологий, в частности иммунотерапии онкологических заболеваний.The invention relates to biotechnology, pharmaceuticals and medicine and can be used for the production of drugs and the implementation of medical technology, in particular immunotherapy of cancer.
Наряду с такими методами лечения опухолевых заболеваний, как оперативное лечение, химио- или лучевая терапии, в лечении онкологических больных также используют и иммунотерапию. Одним из наиболее перспективных вариантов иммунотерапии является противоопухолевая вакцинация, которая заключается в индукции у онкологического больного иммунного ответа против антигенов вакцины, которые в той или иной степени идентичны антигенам опухоли. Таким образом, вызванный вакциной иммунный ответ перекрестно повреждает опухолевые клетки (ОК), что и определяет лечебный или профилактический эффекты противоопухолевой вакцинации. Более подробно о противоопухолевых вакцинах можно прочитать в книге Сапсег 1ттипе Тбегару: Ситтеп! апб Ейиге 81га1сц1С8” (ебк. 81иЫе С. апб \Уа1беп Р., 1обп ХУбеу & 8опк, 1пс, 2002).Along with such methods of treatment of tumor diseases as surgical treatment, chemotherapy or radiation therapy, immunotherapy is also used in the treatment of cancer patients. One of the most promising options for immunotherapy is antitumor vaccination, which consists in inducing an immune response in a cancer patient against the vaccine antigens, which are to some extent identical to the tumor antigens. Thus, the vaccine-induced immune response cross-damages tumor cells (OC), which determines the therapeutic or prophylactic effects of antitumor vaccination. You can read more about cancer vaccines in Sapseg I ttype Tbegaru: Cittep! App Eiige 81ga1sc1S8 ”(ebk. 81iNye S. apb \ R.1bep R., 1obp HUBu & Gopk, 1ps, 2002).
Основными факторами, определяющими эффективность вакцин, являются, во-первых, специфичность входящих в нее антигенов в отношении клеток опухоли пациента и, во-вторых, возможность вызвать к этим антигенам сильный и устойчивый иммунный ответ.The main factors determining the effectiveness of vaccines are, firstly, the specificity of its constituent antigens in relation to the tumor cells of the patient and, secondly, the ability to induce a strong and sustained immune response to these antigens.
Известны способы получения противоопухолевых вакцин, включающих антигены различной природы, имеющие свои преимущества и недостатки.Known methods for producing anticancer vaccines, including antigens of different nature, have their own advantages and disadvantages.
Так, например, в качестве антигенов при получении используют синтезированные пептиды, в частности др100(д209)-2М, МАВТ-127-35, МАСЕ-3.А1, ΝΥ-Ε8Ο-1, К-Вак/12 и т.д. (см. ВокепЬетд 8.А. е! а1. 1ттипо1одю апб Фегареибс еуа1иабоп οί а купФебс рерббе уассше ίοτ 1Не 1геа1теп1 οί рабейк \νίΐ1ι те!ак1абс те1апота. №11иге Меб 1998, ν.4, р.321-327; Сотт1ет Ι.Ν. е! а1. Епбапсетеп! οί се11и1аг 1ттипйу т те1апота рабеп!к интши/еб \νί11ι а рерббе Ггот МАКТ-1/Ме1ап А. Сапсег ί δα. Ат 1997, ν.3, р.37-44; Матсбапб М. е! а1. Титог гедгеккюпк оЬкетуеб т рабеп!к νίΐΐι те!ак!абс те1апота 1геа1еб νίΐΐι ап апбдешс рерббе епсобеб Ьу депе МАСЕ-3 апб ргекейеб Ьу НБА-А1. 1п! 1 Сапсег 1999, ν.80, р.219-230; 1адет Е. е! а1. ’Тпбисбоп оГ рптагу ΝΥ-ΕδΟ-1 1ттипйу: СЭ8+ Т 1утрбосу!е апб апбЬобу гекропкек ш рерббеуассбдНеб рабейк \νί11ι ΝΥ-Ε80-1+ сапсегк. Ргос №б Асаб δα. И8А 2000, ν.97, р.12198-12203; О)ебкеп М.К. е! а1. 1йгабегта1 гак рерббе уассбиЮоп νίΐΐι дгапи1осу!е-тасгорбаде со1опу-кбти1абпд Гас!ог ак абщνап!: сбшса1 апб 1ттипо1од1са1 гекропкек ш рабейк νί(Η рапсгеабс абепосатсшота. 1п! 1 Сапсег 2001, ν. 92, р. 441-450).For example, synthesized peptides are used as antigens in preparation, in particular dr100 (d209) -2M, MABT-1 27-35 , MACE-3.A1, ΝΥ-Ε8Ο-1, K-Vac / 12, etc. . (see Voképétd 8.A. e! a1. I typed on apFagarees on a webpage and coupehebs rerbbe uasshe Ipod iNe igea1te1 οί work rake \ νίΐ1ι te! .Ν. E! A1. Epbapsetep! Οί series 11 tiipyu t tepopota rabote! To intsh / eb \ νί11ι and rerbbe Ggot MAKT-1 / Me1ap A. Sapseg ί δα. At 1997, ν.3, p.37-44; M. e! A1. Titog gedgekkupk okeket t t worker to νίΐΐι te! Acy! Abs tepopo 1gea1eb νίΐΐι ap updes rebsb ebrobyb de depe MACE-3 apb rgeeieby no NBA-A1. 1 ap ten apes Mace-3 apb rgeeieby no NBA-A 1 i! 219-230; 1 h. E. e! A1. 'Tpbisbop oG rptagu ΝΥ-ΕδΟ-1 1 type: SE8 + T 1utrbosu! E apbobu gek opkek w rerbbeuassbdNeb rabeyk \ νί11ι ΝΥ-Ε80-1 + sapsegk Proc №b Asab δα I8A 2000, ν.97, r.12198-12203;.. O) ebkep MK e! a1. 1gabegta1 haq rerbbe WassbyOuppen Dgapi1osu! E-Tasgorbade So1opu-Kbti1abpd Gas! Octak Absorb !: Sahrahsterexpantheyou can help you find the most beautiful things you can find here (Refreshment Foundation), you will find some of the best things to know like
В других способах получения противоопухолевых вакцин в качестве антигенов используют белки, например, белки теплового шока или простат-специфический антиген (см., например, Маицб М.Н. е! а1. 'ТттипоШетару оГ сапсег иктд беа! кбоск рго!ешк. Бгоп! Вюка. 2002, ν.7, б.43-52; Ме1бепЬаиег Ν. е! а1. Сепетабоп оГ ЕГГес!ог Се11к АГ!ег Уасстабоп \УИ11 а Р8А-Вакеб Уассше. Ргок!а!е 2000, ν.43, р. 88-100). К основным преимуществам вакцин, полученных указанными способами с применением синтетических пептидов и определенных белков, можно отнести их низкую аллергенность, безопасность и относительную легкость в стандартизации производства.In other ways of obtaining anticancer vaccines, proteins, for example, heat shock proteins or a prostate specific antigen, are used as antigens (see, for example, Mitzb M.N. e! A1. 'TtypoShetaru oG sapseg ictd bea bosc proc. Esc. Bgop ! Vyuka. 2002, ν.7, b.43-52; Me1biebieg E. e! A1. Sepetabop oG EGGes! Og Se11k AG! Er Wasstabop \ UI11 a P8A-Wakeb Wasshe. Rgk! A! E 2000, ν.43 , p. 88-100). The main advantages of vaccines obtained by these methods with the use of synthetic peptides and certain proteins include their low allergenicity, safety, and relative ease in standardizing production.
Основной недостаток известных способов получения вакцин - это невозможность получения вакцин, вызывающих иммунный ответ с высокой противоопухолевой эффективностью. Данное обстоятельство связано с тем, что ОК отличаются генетической нестабильностью и в организме больного постоянно мутируют, что приводит к появлению новых, имеющих измененный антигенный состав ОК. Таким образом, определенный антиген, к которому пептидный или белковый антиген вакцины вызывает иммунный ответ, может быть изменен или отсутствовать у всех или части ОК больного. Более того, для большинства видов опухолей не известны отдельные специфичные для них антигены, которые можно было бы использовать для противоопухолевой вакцинации.The main disadvantage of known methods for producing vaccines is the impossibility of obtaining vaccines that elicit an immune response with high antitumor efficacy. This circumstance is due to the fact that OK differ in genetic instability and constantly mutate in the patient's body, which leads to the emergence of new ones that have a modified antigenic composition of OK. Thus, a specific antigen, to which a vaccine peptide or protein antigen induces an immune response, may be altered or absent in all or part of the patient’s OC. Moreover, for most types of tumors, specific antigens specific to them that could be used for antitumor vaccination are not known.
Известны также способы получения противоопухолевых вакцин, включающих специфические опухолевые антигены - так называемых цельноклеточных вакцин. В них в качестве антигенов применяют целые опухолевые клетки. Существует множество примеров применения целых ОК в качестве антигенов противоопухолевых вакцин, в частности, вакцин против колоректального рака, меланомы и карциномы почки (см. Атшкбопд А.С., Еа!оп Ό., Е\тб1д 1.С., Се11и1аг 1ттипо1бегару Гог Сапсег, Вп!. Меб. Т, 2001, ν.3323, р.1289-1293). Из патента США υδ 6039941 (МПК Ο2Ν15/09, А61К31/00, опубл. 21.03.2000) также известен способ получения цельноклеточной противоопухолевой вакцины, где в качестве антигенов используют целые ОК с введенными генно-инженерным способом генами, кодирующими поверхностные белки с иммуностимулирующей активностью.There are also known methods for producing anticancer vaccines, including specific tumor antigens - the so-called whole-cell vaccines. They use whole tumor cells as antigens. There are many examples of the use of whole OCs as antigens of anticancer vaccines, in particular, vaccines against colorectal cancer, melanoma and carcinoma of the kidney (see Atchkbopd A.S., Ea! Sapseg, BN !. Meb. T, 2001, ν.3323, p. 1289-1293). From the US patent υδ 6039941 (IPC Ν2Ν15 / 09, A61K31 / 00, publ. 21.03.2000) there is also known a method for producing a whole-cell antitumor vaccine, where whole OCs with genes for surface proteins with immunostimulating activity are introduced as antigens .
В других способах получения противоопухолевых вакцин, включающих специфические для опухоли антигены, в качестве антигенов используют неопухолевые клетки. Например, известно использование в качестве антигенов клеток эндотелия сосудов, вакцинация которыми вызывает иммунный ответ, направленный на повреждение сосудов солидных опухолей. Из литературных данных известен способ применения в качестве антигенов ксеногенных эндотелиальных клеток (ЭК), т.е. клеток, выделенных из эндотелия сосудов организма другого биологического вида, нежели вакцинируемый организм (см., например, \¥е1 Υ., 1ттипо!бегару оГ !итогк \ν61ι хеподепею епбо1беНа1 се11к ак а уассбто. №1Шге Мебюше, 2000, ν.6, р. 1160-1166). Недостатком подобных вакцин является то, что ксеногенные антигены хоть и более иммуногенны, но менее специфичны для сосудов опухоли вакцинируемого организма, что в итогеIn other methods for producing tumor vaccines, including tumor-specific antigens, non-tumor cells are used as antigens. For example, it is known to use vascular endothelial cells as antigens, the vaccination of which induces an immune response aimed at damaging the vessels of solid tumors. From the literature, there is a known method of using xenogenic endothelial cells (EC) as antigens, i.e. cells isolated from the vascular endothelium of an organism of a different species than the organism to be vaccinated (see, for example, \ ¥ Е1 Υ., 1 type! googar oG!) \ ν61ι hepodepey epbo1beNa1 sec11k ak a uasbto. №1Гге Mebjuše, 2000, ν.6 , R. 1160-1166). The disadvantage of such vaccines is that, although xenogenic antigens are more immunogenic, they are less specific for tumor vessels of the vaccinated organism, which ultimately
- 1 011421 приводит к снижению эффективности вакцины.- 1 011421 leads to a decrease in the effectiveness of the vaccine.
Из другого источника известно применение в цельноклеточной вакцине в качестве антигенов аллогенных ЭК, т.е. клеток другого организма, но того же биологического вида, что и вакцинируемый организм (см., например, 8еаррайсс1 Р.А., Νοίαη С.Р., 'Тибисбои о! аибЧишот 1ттиийу ίη т1се иктд а куидепе1с еибоШе11а1 се11 уассте, Аибсаисег Кек., 2003, ν.23, р.1165-1672; авторы научной работы также сравнивают эффективность вакцинации при использовании в качестве антигенов ЭК из различных источников). Недостатком аллогенных антигенов ЭК также является низкая их специфичность для сосудов опухоли вакцинируемого организма.From another source, it is known to use allogenic EC as antigens in the whole-cell vaccine, i.e. cells of another organism, but of the same biological species, as an organism to be vaccinated (see, for example, 8earyss1 RA, ίοίαη S.Р., 'Tibisbears! , 2003, ν.23, p.1165-1672; the authors of the scientific work also compare the effectiveness of vaccination when used as EC antigens from various sources). The disadvantage of allogenic EC antigens is also their low specificity for the tumor vessels of the organism being vaccinated.
Из статьи Окар Υ. и соавт. (Уассшабои \\йН аи1о1одоик еибоШебиш шЫЬйк аидюдеиебк аиб те1ак1ак1к о! со1ои саисег (НгоидН аШот-шцтЦу. Саисег 8ск, 2004, ν.95, р.85-90) известно применение в качестве антигенов аутологичных ЭК, т. е. клеток, полученных из вакцинируемого или генетически идентичного (сингенного) организма. Подобные вакцины дают наиболее специфичный иммунный ответ, по сравнению с использованием ксеногенных или аллогенных ЭК.From the article О. et al. (Uassshaboi \\ dh ai1o1odoik eiboShebish shYyk aidyudeiebk AIB te1ak1ak1k about! So1oi saiseg (NgoidN Ashot-shtstTsu. Saiseg 8sk 2004, ν.95, r.85-90) is known to use as antigens of autologous EC, ie. E. Cells derived from a vaccinated or genetically identical (syngeneic) organism. Such vaccines give the most specific immune response, compared with the use of xenogenic or allogeneic EK.
К очевидным преимуществам использования цельноклеточных противоопухолевых вакцин относят их поливалентность (т. е. содержание множества антигенов). Поливалентность вакцины позволяет вызывать иммунный ответ не к одному, а одновременно к множеству антигенов на поверхности ОК пациента, что существенно увеличивает вероятность уничтожения опухоли. Второе преимущество - это высокая специфичность антигенов, особенно в случае применения в качестве антигенов для вакцинации аутологичных ОК, т. е. ОК, выделенных из опухоли того же больного, которому проводят вакцинацию. К преимуществам использования целых ОК в качестве антигенов можно отнести возможность их использования в вакцинации больных с опухолями, для которых неизвестны отдельные опухолеспецифичные антигены и, соответственно, не созданы моновалентные вакцины.The obvious advantages of using whole-cell anticancer vaccines are their polyvalence (i.e., the content of many antigens). The multivalency of the vaccine allows one to induce an immune response not to one, but simultaneously to a multitude of antigens on the patient's OK surface, which significantly increases the probability of destroying the tumor. The second advantage is the high specificity of antigens, especially in the case of using autologous OCs as antigens for vaccination, i.e., OKs isolated from a tumor of the same patient that is being vaccinated. The advantages of using whole OK as antigens include the possibility of using them in vaccination of patients with tumors for which individual tumor-specific antigens are unknown and, accordingly, monovalent vaccines have not been created.
Основным недостатком всех цельноклеточных противоопухолевых вакцин является то, что вакцинация целыми клетками имеет низкую эффективность. Антигены при попадании в организм больного должны поглощаться антигенпрезентирующими клетками для дальнейшего их представления Тлимфоцитам. В случае использования в качестве антигенов целых клеток, поглощение их антигенпрезентирующими клетками затруднено.The main disadvantage of all whole cell cancer vaccines is that whole-cell vaccination has low efficacy. When ingested, antigens should be absorbed by antigen-presenting cells for their further presentation to Tlymphocytes. When whole cells are used as antigens, their uptake by antigen-presenting cells is difficult.
Второй существенный недостаток заключается в том, что целые клетки помимо целевых антигенов, которые представлены на их поверхности, содержат множество непригодных для вакцинации антигенов и балластных веществ, происходящих из внутриклеточного содержимого. Непригодность внутриклеточного содержимого для вакцинации объясняется тем, что внутриклеточные антигены скрыты внутри клеток и недоступны для иммунной системы организма. Таким образом, проблема поглощения ОК антигенпрезентирующими клетками и наличие в вакцине нецелевых антигенов и балластных веществ существенно ухудшают эффективность цельноклеточных вакцин.The second major drawback is that whole cells, in addition to the target antigens that are present on their surface, contain many unsuitable for vaccination antigens and ballast substances originating from the intracellular contents. The unsuitability of intracellular contents for vaccination is due to the fact that intracellular antigens are hidden inside the cells and inaccessible to the body’s immune system. Thus, the problem of the uptake of OA by antigen presenting cells and the presence of non-target antigens and ballast substances in the vaccine substantially worsen the effectiveness of whole-cell vaccines.
Частично проблемы цельноклеточных вакцин решаются применением в качестве антигенов не самих ОК, а их лизатов. Из международной заявки νθ 02053176 (МПК А61К39/00; Ο12Ν5/06; А61К39/00; Ο12Ν5/06 опубл. 11.07.2002) известен способ получения противоопухолевой вакцины, включающей антигены, которые представляют собой лизат ОК, содержащий дезагрегированные антигены. Они легко поглощаются антигенпрезентирующими клетками, что в итоге приводит к более выраженному иммунному ответу при вакцинации. Недостатком использования лизатов ОК является то, что основную массу лизата также составляют нецелевые антигены, вызывающие иммунный ответ на скрытое от иммунной системы внутриклеточное содержимое ОК больного. Более того, подобные вакцины содержат множество балластных веществ, в частности, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и т.д.Partially, the problems of whole-cell vaccines are solved by using not their OC themselves as antigens, but their lysates. From international application νθ 02053176 (IPC A61K39 / 00; Ο12Ν5 / 06; A61K39 / 00; Ο12Ν5 / 06 publ. 07.07.2002) there is a known method for producing an antitumor vaccine, including antigens, which are OK lysate, containing disaggregated antigens. They are easily absorbed by antigen presenting cells, which ultimately leads to a more pronounced immune response during vaccination. The disadvantage of using lysates OK is that the bulk of the lysate is also composed of non-target antigens, which cause an immune response to the intracellular contents of the patient's OK hidden from the immune system. Moreover, such vaccines contain many ballast substances, in particular, nucleic acids, carbohydrates, lipids, etc.
Из патента США И8 5993829 (МПК А61Р 35/00, С07К14/47, опубл. 30.11.1999) известен способ получения противоопухолевой вакцины, при котором антигены получают с поверхности клеток. ОК культивируют 1и νίΙΐΌ и получают антигены, теряемые ими в ростовую среду. Эти антигены, также описанные в патентах И8 6338853 (МПК А61Р 35/00, С07К14/47, опубл. 15.01.2002), ϋδ 5030621 (С07К14/47, С07К14/435, опубл. 09.07.1991), И8 5635188 (С07К14/47, С07К14/435, опубл. 03.06.1997), представляют собой белки, спонтанно теряемые ОК в составе мембранных везикул, т.н. экзосом, в бессывороточную ростовую среду.From US patent I8 5993829 (IPC A61P 35/00, C07K14 / 47, publ. 30.11.1999) a method is known for preparing an antitumor vaccine, in which antigens are obtained from the surface of cells. OK cultured 1i and νίΙΐΌ and get the antigens that they lose in the growth medium. These antigens, also described in patents I8 6338853 (IPC А61Р 35/00, С07К14 / 47, publ. 15.01.2002), δ 5030621 (С07К14 / 47, С07К14 / 435, publ. 09.07.1991), И8 5635188 (С07К14 / 47, C07K14 / 435, published on 03.06.1997), are proteins that are spontaneously lost by OK in membrane vesicles, the so-called exosomes in serum-free growth medium.
Необходимо отметить, что вакцина, полученная указанным способом, отличается установленным высоким содержанием нецелевых антигенов, в частности внутриклеточных белков (см., например, Рго1еот1с аиа1ук1к о! тектота-бепсеб ехокотек Ьу 1уо-б1теикюиа1 ро1уасгу1ат1бе де1 е1есборЬогек1к аиб такк крес1готе1ту. РгсИеоииск 2004, ν.4, р.4019-4031; РгсИеоиис аиа1ук1к о! ехокотек кесге1еб Ьу Нитаи теко(НеНота се11к. Атебсаи 1оигиа1 о! Ра11ю1оду 2004, ν.164, р.1807-1815; Ехокотек: сотрокйюи, Ьюдеиебк аиб киисбои, №1Р1ге КеОезук 1ттиио1оду, 2002, ν.2, р.569-579). Второй недостаток - это необходимость очистки антигенов перед их употреблением от липидов, являющихся составной частью экзосом.It should be noted that the vaccine obtained by this method is distinguished by an established high content of non-target antigens, in particular intracellular proteins (others, for example, with, for example, pros, bypass, and by-for-one, with 1yo-1Hytecysiuro1uyu1e1etecstoytheres, with the help of ex. .4 r.4019-4031; RgsIeoiis aia1uk1k of ehokotek kesge1eb Ly Nitai TECO (NeNota se11k Atebsai 1oigia1 of Ra11yu1odu 2004, ν.164, r.1807-1815; Ehokotek:!.! sotrokyyui, yudeiebk AIB kiisboi, №1R1ge KeOezuk Vol. 1, 2002, ν.2, p. 569-579.) The second drawback is that it is necessary awn purification of antigens before their use of lipids, which are part of exosomes.
Общим недостатком антигенов, специфичных для опухолевых клеток или клеток сосудов опухоли, является их слабая иммуногенность. Это объясняется тем, что, в отличие от противомикробной, противовирусной или неспецифической противоопухолевой вакцинации, в которых используют чужеродные и, соответственно, иммуногенные для вакцинируемого организма антигены, в данном случае используют антигены идентичные антигенам клеток вакцинируемого организма. Как правило, нормально функцио- 2 011421 нирующая иммунная система организма толерантна к собственным антигенам, в результате чего вызываемый иммунный ответ бывает слабым, кратковременным, либо вообще отсутствует. Таким образом, эффективность применения подобных опухолеспецифичных антигенов зависит от способности вызвать к ним надлежащий иммунный ответ.A common drawback of antigens specific for tumor cells or tumor vascular cells is their poor immunogenicity. This is explained by the fact that, in contrast to antimicrobial, antiviral or nonspecific antitumor vaccination, in which foreign and, accordingly, immunogenic antigens are used for the organism to be vaccinated, in this case antigens are used identical to the antigens of the cells of the organism being vaccinated. As a rule, the normal functioning of the body's immune system is tolerant to its own antigens, with the result that the evoked immune response is weak, short-lived, or absent. Thus, the effectiveness of the use of such tumor-specific antigens depends on the ability to induce an appropriate immune response to them.
Известны различные способы повышения иммунного ответа на антигены, например, химическая модификация антигенов или смешивание их с адъювантами (маслами, минеральными солями, экстрактами бактерий, цитокинами и т.д.).There are various ways to increase the immune response to antigens, for example, chemical modification of antigens or mixing them with adjuvants (oils, mineral salts, extracts of bacteria, cytokines, etc.).
Одним из наиболее эффективных способов добиться усиления иммунного ответа на антигены является использование антигенпрезентирующих клеток, т. е. тех клеток, с которыми обычно взаимодействуют введенные в организм антигены.One of the most effective ways to enhance the immune response to antigens is to use antigen-presenting cells, i.e., those cells with which the antigens introduced into the body usually interact.
В способах получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, как правило, в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки (ДК), которые способны поглощать антигены, деградировать их до маленьких фрагментов и представлять их на своей поверхности, ассоциированными с главным комплексом гистосовместимости. Клетки иммунной системы для проявления гуморального и клеточного иммунитета распознают главный комплекс гистосовместимости и ассоциированные с ним антигены. Обычно, зрелые ДК получают ίη νίίτο из СЭ34+ костно-мозговых предшественников или популяции моноцитов периферической крови. После получения ДК нагружают специфичными для опухоли антигенами. Пациенту вводят уже не сами антигены, а нагруженные ими ДК, т.е. применяют так называемую противоопухолевую дендритно-клеточную вакцину.In methods for producing an anti-tumor vaccine based on antigen-presenting cells loaded with antigens, as a rule, dendritic cells (DC) are used as antigen-presenting cells that are able to absorb antigens, degrade them to small fragments and present them on their surface associated with the main histocompatibility complex. Cells of the immune system for the manifestation of humoral and cellular immunity recognize the main histocompatibility complex and its associated antigens. Usually, mature DCs receive ίη νίίτο from CE34 + bone marrow progenitors or a population of peripheral blood monocytes. After receiving DK load tumor-specific antigens. It is not the antigens themselves that are injected into the patient, but the DCs loaded by them, i.e. apply the so-called anti-tumor dendritic cell vaccine.
Известны способы получения противоопухолевой вакцины на основе нагруженных антигенами антигенпрезентирующих клеток, при которых ДК нагружают синтезированными пептидами, опухолевыми клетками или их лизатами, живыми опухолевыми клетками (образованием гибридов ДК и опухолевых клеток) и т.д. Примеры применения ДК, нагруженных различными антигенами, описаны (см., например, 81готс 8.Е. οί а1., 'Ъ1га1еДек ίοτ Апйдеп Ьоабшд οί Оепбпйс Се11к ίο Епйапсе 1йе ΛηΙίΙιιιηοΓ 1ттипе Кекропке, Сапсег Кек., 2002, ν.62, р.1884-1889; Μοιίαπηί К. еί а1., Λυίοίο^οπκ Оепбпйс Се11к Оепсеб Ггот СЭ34+ Рюдет^^ апб Гют Μοηοсуίек Аге Νοί Рипс1юпа11у Ес.|ш\'а1еп1. Сапсег Кек., 1997, ν.57, р.55345541; Τοιφικ Ь., Нитап Μοηοсуίе-^еπνеб Масгорйадек апб Оепбпйс Се11к, Iттиηο1οду, 1997, ν.91, р.635-642; Сйаих Р. еί а1., 1бепййса1юп οί МАОЕ-3 Ер1крек РгекегНеб Ьу НЬА-ЭК Μο^Οϋ^δ ίο ΟΌ4+ Т ^утрйοсуίек, 1. Ехр. Меб. 1989, ν.189, р.767-777; №к11е Е., Уасста1юп οί Мекитота РаОегИк \νί11ι Рерббе - οτ Типюг Йука1е-ри1кеб Оепбпйс Се11к, №-Ииге Меб., 1998, ν.4, р.328-332; КгоЮга Υ., ^трата^е Апа1ук1к οί №сгойс апб Арοрίοί^с Типюг Се11к Ак а δοιιη^ οί Апйдеп(к) т Оепбпйс Се11-Ьакеб 1ттишха1юп, Сапсег Кек., 2001, ν.61, р.8105-8109; Кик С. еί а1., Тйе Оупатюк οί 1йе Т-Се11 Аηί^ίитο^ Кекрοηке, Сапсег Кек., 2001, ν.61, р.8794-8802; 8сйпигг, М., '^торЮ^с Рапстеайс Тинто г Се11к Аге 8ирегюг ίο Се11 Ьу^ек, Сапсег Кек., 2002, ν.62, р.2347-2352).Known methods for producing an anticancer vaccine based on antigen-presenting cells loaded with antigens, in which DCs are loaded with synthesized peptides, tumor cells or their lysates, live tumor cells (formation of DC hybrids and tumor cells), etc. Examples of the use of DK loaded with various antigens are described (see, for example, 81g.E. .1884-1889; Μοιίαπηί K. eί a1., Λυίοίο ^ οπк Oepbpis Se11k Oepseb Ggot SE34 + Rüdet ^^ ap. ; Τοιφικ Ь., Nitap οοηοсу ^- ^ eπνeb Masgorjadek aprofors april april, aka Oebbies Se11k, Itti ηο1еу, 1997, ν.91, p.635-642; Syaih R. its ί a1. ^ δ ίο ΟΌ4 + Т ^ utrysuk, 1. Exp. Meb. 1989, ν.189, p.767 -777; No. 11e E., WasstaIjup οί Mekitot RaOegIk \ νί11ι Rerbbe - οτ Tipyug Yukalei-ri1keb Oepbpis Se11k, No. -Ieb Meb., 1998, ν.4, p.328-332; Ap1uk1k οί №sgoys apb аrórίοί ^ with Tipyug Se11k Ak and δοιιη ^ οί Apydep (k) t Oybbiys Se11-yabeb 1tishkhi1yup, Sapsseg Kek., 2001, ν.61, р.8105-8109, 17.8, 8105-8109, 17.8 Oupatiuk οί 1sté T-Сe11 Аηί ^ ί itі ^ ^ Kekróηke, Sapseg Kek., 2001, ν.61, p.8794-8802; 8sipigg, M., '^ torus ^ with Rapteys Tinto r Seoul Age 8regueg Séréllis, Sapseg Keck., 2002, ν.62, p. 2347-2352).
Недостатки применения ДК, нагруженных отдельными антигенами, целыми опухолевыми клетками или их лизатами, идентичны недостаткам, описанным выше для моновалентных и поливалентных вакцин, не содержащих ДК, а именно - низкая специфичность и наличие нецелевых антигенов. Недостатком гибридов ДК и опухолевых клеток вдобавок является возможность образования гибридных клонов со злокачественными свойствами.The disadvantages of using DCs loaded with individual antigens, whole tumor cells or their lysates are identical to the disadvantages described above for monovalent and multivalent vaccines that do not contain DCs, namely, low specificity and the presence of non-target antigens. The lack of hybrids DC and tumor cells in addition is the possibility of the formation of hybrid clones with malignant properties.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, раскрытый в международной заявке ^02004012685 (8йеб апйдеп уассте \\Й11 бепбпЦс се11 аб_)иуапР', МПК А61К39/00, опубл. 12.02.2004 г.). В известном способе нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами, теряемыми ОК в процессе инкубации ш νίίτο в бессывороточную инкубационную среду (способ получения самих антигенов также описан в патентах США И8 5993829, МПК А61Р35/00, С07К14/47, опубл. 30.11.1999; ϋδ 6338853, МПК А61Р 35/00, С07К14/47, опубл. 15.01.2002; ϋδ 5030621, С07К14/47, С07К14/435, опубл. 09.07.1991; υδ 5635188, С07К14/47, С07К14/435, опубл. 3.06.1997).The closest analogue of the claimed invention is a method for producing an anti-tumor vaccine based on antigen-presenting cells loaded with antigens, disclosed in the international application ^ 02004012685 (8yeb apydep wasste \\ Y11 bepbpsc ce 11 ab) iuapr ', IPC A61K39 / 00, publ. February 12, 2004). In the known method, antigen-presenting cells are loaded with antigens that are lost by the OC during the incubation of ν το into the serum-free incubation medium (the method of obtaining the antigens themselves is also described in US Patents I8 5993829, IPC A61P35 / 00, C07K14 / 47, publ. 30.11.1999; ϋδ 6333333, C07K14 / 47, publ. , IPC А61Р 35/00, С07К14 / 47, published on January 15, 2002; ϋδ 5030621, С07К14 / 47, С07К14 / 435, published on 07/07/1991; υδ 5635188, С07К14 / 47, С07К14 / 435, published on 3.06.1997 ).
Однако нагрузка ДК антигенами, спонтанно теряемыми опухолевыми клетками, имеет ряд установленных недостатков. Протеомный анализ (анализ белкового состава) выявил, что только незначительная часть теряемых клетками антигенов относится к поверхностным белкам, основная же часть относится к внутриклеточному содержимому (см., например, Р^οίеοт^с апа1ук1к οί те1аηοта-бе^^νеб еxοкοтек Ьу ι\\Ό-б^теηк^οηа1 рο1уас^у1ат^бе де1 е1есί^οрйο^ек^к апб такк кресί^οтеί^у, Р^οίеοт^ск 2004, ν.4, р.40194031; Р^οίеοт^с Апа1ук1к οί Еxοкοтек δес^еίеб Ьу Нитап Μекοίйе1^οта Се11к, Атепсап кита οί Раίйο1οβν 2004, ν.164, р.1807-1815; Еxοкοтек: сοтрοк^ί^οη, Ьюдепеак апб №11иге Ие\зе\\'к Iттиηο1ο^ν, 2002, ν.2, р.569-579). Таким образом, культивируемые т νίίτο клетки в основном теряют непригодные для вакцинации антигены.However, the load DK antigens, spontaneously lost tumor cells, has a number of established shortcomings. The proteomic analysis (analysis of the protein composition) revealed that only an insignificant part of the antigens lost by the cells belongs to the surface proteins, while the main part belongs to the intracellular contents (see, for example, P ^ oyote ^ from the apiuk1k to the Tiaratotobe ^^^^ etecotec IU \\ Ό-^ ^ teηk ^ οηа1 рο1уас ^ у1ат ^ безе1 еТесί ^ ^ οро ^ ек ^ to the staff of ^ ί ^ ёт ^ ^ р, Р ^ ооеётккк 2004, ν.4, р.40194031 Ap1uk1k οί Ekokokotek dіes ^ ebeeb lu Nitap οf οf οf οf οf οf ıt Ce11k, Atepsap whale οί Rajо1οβν 2004, ν.164, p.1807-1815; ν, 2002, ν.2, p. 569-579). Thus, cultured cells νίίτο mostly lose unsuitable for vaccination antigens.
Теряемые клетками антигены представляют собой смесь белков, представление которых на поверхности антигенпрезентирующих клеток, в частности зрелых ДК, затруднено. Белковые антигены должны поглощаться ДК, деградироваться до пептидов и только потом представляться на поверхности ДК. Зрелые же ДК неспособны к поглощению антигенов. К недостаткам ближайшего аналога также можно отнести то, что клетки спонтанно теряют свои антигены в виде мембранных везикул - экзосом, содержащих,Lost cell antigens are a mixture of proteins, the representation of which on the surface of antigen-presenting cells, in particular mature DCs, is difficult. Protein antigens should be absorbed by DC, degraded to peptides and only then presented on the surface of DC. Mature DCs are incapable of absorbing antigens. The disadvantages of the closest analogue also include the fact that cells spontaneously lose their antigens in the form of membrane vesicles - exosomes containing,
- 3 011421 помимо белков, множество липидов. Поэтому выделение из них антигенов требует дополнительной стадии очистки - делипидизации. Также требуется очистка антигенов от компонентов инкубационной среды, в которую ОК теряют свои антигены и которая содержит около 40 компонентов (витамины, аминокислоты, соли, углеводы и т.д.), а также от стороннего белкового загрязнения, источником которого могут служить ростовые среды клеток, потенциально содержащие токсины, прионы и пирогенные белковые примеси.- 3 011421 in addition to proteins, many lipids. Therefore, the isolation of antigens from them requires an additional purification step - delipidization. It also requires the purification of antigens from the components of the incubation medium in which OCs lose their antigens and which contains about 40 components (vitamins, amino acids, salts, carbohydrates, etc.), as well as from third-party protein contamination, the source of which can serve as cell growth media , potentially containing toxins, prions and pyrogenic protein impurities.
Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в создании вакцины, способной повысить цитотоксическую активность (ЦТА) клеток иммунной системы в отношении клеток-мишеней за счет облегчения восприятия ими заданной совокупности антигенов.The technical result achieved with the use of the invention is to create a vaccine that can increase the cytotoxic activity (CTA) of the immune system cells against target cells by facilitating their perception of a given set of antigens.
Данный технический результат обеспечивается при использовании способа получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, согласно настоящему изобретению, нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток с обеспечением представления на поверхности антигенпрезентирующих клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней.This technical result is provided by using a method for producing an anti-tumor vaccine based on antigen-presenting cells loaded with antigens according to the present invention, the load of antigen-presenting cells is performed by antigens obtained by cleaving the protease from the surface of living cells with providing a set of antigens identical to the whole of cell surface antigens on the surface of antigen-presenting cells targets
В предпочтительном варианте реализации изобретения используют аутологичные живые клетки, так как обеспечивают получение совокупности как специфичных внутривидовых, так и индивидуальных для вакцинируемого организма антигенов.In a preferred embodiment of the invention, autologous living cells are used, since they provide a combination of both specific intraspecific and individual antigens for the organism to be vaccinated.
В других вариантах реализации изобретения используют аллогенные живые клетки в случае необходимости получения совокупности общих для биологического вида внутривидовых антигенов.In other embodiments of the invention, allogeneic living cells are used, if necessary, to obtain a set of intraspecific antigens common to a biological species.
Также могут быть использованы ксеногенные живые клетки в случае необходимости получения совокупности общих для различных видов организмов межвидовых антигенов.Xenogenic living cells can also be used if it is necessary to obtain a set of interspecific antigens common to different types of organisms.
В других вариантах реализации изобретения используют аллогенные и аутологичные живые клетки в комбинации.In other embodiments of the invention, allogeneic and autologous living cells are used in combination.
Кроме этого могут быть использованы ксеногенные и аллогенные живые клетки в комбинации.In addition, xenogenic and allogeneic living cells can be used in combination.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы ксеногенные и аутологичные живые клетки в комбинации.In other embodiments of the invention, xenogenic and autologous living cells may be used in combination.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы ксеногенные, аллогенные и аутологичные живые клетки в комбинации.In other embodiments of the invention, xenogenic, allogeneic and autologous living cells may be used in combination.
Комбинации различных типов живых клеток применяют для увеличения совокупности специфичных антигенов.Combinations of different types of living cells are used to increase the aggregate of specific antigens.
В предпочтительном варианте реализации изобретения используют свежевыделенные живые клетки. Свежевыделенные клетки наиболее близки по антигенному составу к клеткам организма больного. Получение живых клеток без повреждения поверхностных антигенов, например при их получении из биологических жидкостей или неэнзиматическом способе получения из тканей (при энзиматическом способе получения клеток из тканей происходит повреждение поверхностных антигенов клеток) позволяет применять свежевыделенные клетки для получения антигенов согласно данному изобретению.In a preferred embodiment of the invention, freshly isolated live cells are used. Freshly isolated cells are closest in antigenic composition to the cells of the patient. Obtaining living cells without damaging surface antigens, for example, when they are obtained from biological fluids or a non-enzymatic method of obtaining from tissues (with an enzymatic method of obtaining cells from tissues, the surface antigens of cells are damaged) allows the use of freshly isolated cells to produce antigens according to this invention.
В случае отсутствия достаточного количества свежевыделенных клеток для получения необходимого для нагрузки количества антигенов в других вариантах реализации изобретения могут быть использованы живые клетки, представляющие собой по меньшей мере одну первичную культуру. Также могут быть использованы живые клетки по меньшей мере одной клеточной линии. Антигены, расположенные на поверхности упомянутых клеток, также пригодны для нагрузки антигенпрезентирующих клеток.In the absence of a sufficient number of freshly isolated cells to obtain the required number of antigens for the load in other embodiments of the invention, living cells can be used, which are at least one primary culture. Can also be used living cells of at least one cell line. Antigens located on the surface of these cells are also suitable for loading antigen-presenting cells.
В целях создания вакцины для цитотоксического повреждения опухолевых клеток используют живые клетки, являющиеся опухолевыми клетками.In order to create a vaccine for cytotoxic damage to tumor cells, live cells, which are tumor cells, are used.
В целях создания вакцины для цитотоксического повреждения клеток сосудов опухоли используют живые клетки, являющиеся эндотелиальными клетками.In order to create a vaccine for cytotoxic damage to tumor vascular cells, live cells, which are endothelial cells, are used.
В других вариантах реализации изобретения для получения совокупности антигенов могут быть использованы живые клетки, представляющие собой генетически модифицированные клетки. Генетическая модификация, повышающая иммуногенность поверхностных антигенов клеток, способствует получению антигенов согласно данному изобретению с более выраженными иммуногенными свойствами.In other embodiments of the invention, living cells, which are genetically modified cells, can be used to produce a combination of antigens. Genetic modification that increases the immunogenicity of cell surface antigens contributes to the production of antigens according to this invention with more pronounced immunogenic properties.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин. В среднем на каждые 10 аминокислот последовательности белка встречается одно место, расщепляемое трипсином. Исходя из того, что средняя масса аминокислоты составляет 110 Да и того, что неполный протеолиз белков протеазой дает пептиды как с отсутствием, так и с наличием одного или двух недорасщепленных мест, при применении трипсина получаемые антигены предположительно будет соответствовать требуемым молекулярным весам. Однако специфичность аминокислотных последовательностей пептидов и наличие углеводных модификаций влияет на средний размер получаемых антигенов, в связи с чем при подборе конкретных условий получения антигенов необходимо экспериментально контролировать размер получаемых антигенов.In a preferred embodiment of the invention, trypsin is used as a protease. On average, for every 10 amino acids in the protein sequence, there is one site that is cleaved by trypsin. Based on the fact that the average amino acid mass is 110 Da and the fact that incomplete proteolysis of proteins by the protease gives peptides both with the absence and with the presence of one or two underdeveloped sites, when using trypsin, the resulting antigens will presumably correspond to the required molecular weights. However, the specificity of the amino acid sequences of peptides and the presence of carbohydrate modifications affect the average size of the antigens obtained, therefore, when selecting specific conditions for obtaining antigens, it is necessary to experimentally control the size of the antigens obtained.
Наиболее простым и быстрым способом контроля размера получаемых антигенов является массспектрометрический анализ.The simplest and fastest way to control the size of the antigens obtained is mass spectrometric analysis.
К антигенпрезентирующим клеткам могут добавлять иммуномодуляторы и цитокины. Любые подImmunomodulators and cytokines can be added to antigen presenting cells. Any under
- 4 011421 ходящие комбинации цитокинов, иммуномодуляторов и неспецифических антигенов могут применяться для дифференцировки мононуклеарных лейкоцитов в незрелые ДК, а также для созревания незрелых ДК.- 4 011421 walking combinations of cytokines, immunomodulators and nonspecific antigens can be used to differentiate mononuclear leukocytes into immature DK, as well as for the maturation of immature DK.
Для создания условий, в которых антигенпрезентирующие клетки способны представлять антигены клеткам иммунной системы, могут добавлять фармацевтический носитель, который может включать одно или несколько веществ. Носитель может способствовать сохранности антигенпрезентирующих клеток при хранении, транспортировке и их введении в организм, питать клетки, обеспечивать газообмен, стабилизировать клеточные мембраны, обеспечивать локальные или системные иммунологические реакции, усиливающие действие антигенпрезентирующих клеток.To create conditions in which antigen-presenting cells are capable of presenting antigens to cells of the immune system, a pharmaceutical carrier can be added, which may include one or more substances. The carrier can contribute to the preservation of antigen-presenting cells during storage, transportation and their introduction into the body, nourish the cells, ensure gas exchange, stabilize cell membranes, provide local or systemic immunological reactions that enhance the action of antigen-presenting cells.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы антигенпрезентирующие клетки, полученные искусственным путем, так как искусственные антигенпрезентирующие клетки обладают надлежащими антигенпрезентирующими свойствами и могут быть нагружены антигенами.In other embodiments of the invention, antigen-presenting cells obtained by artificial means can be used, since artificial antigen-presenting cells have proper antigen-presenting properties and can be loaded with antigens.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки.In a preferred embodiment of the invention, dendritic cells are used as antigen-presenting cells.
Могут быть использованы дендритные клетки, полученные из периферической крови.Dendritic cells derived from peripheral blood can be used.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы дендритные клетки, полученные из костного мозга, так как костно-мозговые ДК являются полноценными антигенпрезентирующими клетками и могут быть нагружены антигенами ίη νίίτο.In other embodiments of the invention, dendritic cells obtained from bone marrow can be used, since bone marrow DCs are full-fledged antigen-presenting cells and can be loaded with генη νίτο antigens.
В предпочтительном варианте реализации изобретения используют аутологичные дендритные клетки.In a preferred embodiment of the invention, autologous dendritic cells are used.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы аллогенные дендритные клетки, так как они способны осуществлять антигенпрезентирующую функцию в отношении аллогенных для них клеток иммунной системы.In other embodiments of the invention, allogeneic dendritic cells can be used, since they are able to perform an antigen presenting function in relation to allogenic cells of the immune system.
В других вариантах реализации изобретения могут использовать смесь аутологичных и аллогенных дендритных клеток. Применение смеси клеток предпочтительно при недостаточном для вакцинации количестве аутологичных дендритных клеток и возможно ввиду способности аллогенных ДК осуществлять антигенпрезентирующую функцию в отношении аллогенных для них клеток иммунной системы.In other embodiments of the invention, a mixture of autologous and allogeneic dendritic cells may be used. The use of a mixture of cells is preferable when the amount of autologous dendritic cells is insufficient for vaccination, and possibly due to the ability of allogenic DCs to perform an antigen-presenting function in relation to allogenic cells of the immune system.
В предпочтительном варианте используют зрелые антигенпрезентирующие клетки.In a preferred embodiment, mature antigen presenting cells are used.
Зрелые антигенпрезентирующие клетки могут быть получены непосредственно из тканей организма, либо получены ίη νίίτο из незрелых антигенпрезентирующих клеток.Mature antigen presenting cells can be obtained directly from body tissues, or организмаη νίίτο can be obtained from immature antigen presenting cells.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы также незрелые антигенпрезентирующие клетки.In other embodiments of the invention, immature antigen-presenting cells can also be used.
Незрелые антигенпрезентирующие клетки, в частности ДК, нагружают антигенами путем их инкубации в среде, содержащей антигены. В процессе инкубации незрелые ДК поглощают антигены, деградируют их и представляют на своей поверхности.Immature antigen presenting cells, in particular DC, are loaded with antigens by incubating them in a medium containing antigens. In the process of incubation, immature DCs absorb antigens, degrade them and present them on their surface.
Зрелые антигенпрезентирующие клетки, в частности ДК, могут нагружать антигенами в процессе инкубации с ними путем непосредственного связывания антигенов (без предварительного их поглощения ДК) с главным комплексом гистосовместимости, расположенным на поверхности ДК. В другом варианте зрелые антигенпрезентирующие клетки получают из уже нагруженных антигенами незрелых антигенпрезентирующих клеток.Mature antigen presenting cells, in particular DK, can be loaded with antigens during incubation with them by direct binding of antigens (without their prior absorption of DK) with the main histocompatibility complex located on the surface of DK. In another embodiment, mature antigen presenting cells are obtained from immature antigen presenting cells already loaded with antigens.
В случае получения антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, не способных поглощать антигены, например зрелых ДК, тип протеазы, ее концентрация, а также время воздействия на клетки подбирают с учетом того, что получаемые антигены должны быть с молекулярным весом от ~800 до ~3500 Да. Данное обстоятельство связано с тем, что именно такие пептиды способны связываться непосредственно с главным комплексом гистосовместимости, расположенным на поверхности антигенпрезентирующих клеток.In the case of obtaining antigens for the load of antigen-presenting cells that are not capable of absorbing antigens, for example, mature DCs, the type of protease, its concentration, as well as the time of exposure to the cells are selected taking into account the fact that the resulting antigens should be with a molecular weight from ~ 800 to ~ 3500 Yes . This circumstance is connected with the fact that such peptides are able to bind directly to the main histocompatibility complex located on the surface of antigen-presenting cells.
Для получения антигенов нужного молекулярного веса (размера) отщепленные от поверхности клеток антигены могут дополнительно, отдельно от клеток, инкубировать с протеазой для расщепления антигенов до необходимого молекулярного веса. Достижения антигенами нужного молекулярного веса можно контролировать масс-спектрометрическим анализом.To obtain antigens of the desired molecular weight (size), the antigens split from the cell surface can additionally, separately from the cells, be incubated with a protease to cleave the antigens to the required molecular weight. Achievements of antigens of the desired molecular weight can be monitored by mass spectrometric analysis.
В случае получения антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, способных их поглощать, например незрелых ДК, в предпочтительном варианте молекулярный вес антигенов должен быть не менее 600 Да. Антигены, представляющие собой пептиды меньшего молекулярного веса слабо- или неспецифичны, в связи с чем непригодны для вакцинации. Строгих ограничений на максимальный молекулярный вес антигенов нет, так как антигены после поглощения их антигенпрезентирующими клетками будут деградированы внутриклеточными протеазами до нужного размера.In the case of obtaining antigens for the load of antigen-presenting cells capable of absorbing them, such as immature DCs, in a preferred embodiment, the molecular weight of the antigens should be at least 600 Da. Antigens that are peptides of lower molecular weight are weak or nonspecific, and therefore unsuitable for vaccination. There are no strict restrictions on the maximum molecular weight of antigens, since the antigens, after being absorbed by their antigen-presenting cells, will be degraded by intracellular proteases to the desired size.
Время инкубации ДК с антигенами также может существенно варьировать. При нагрузке незрелых ДК время инкубации ДК с антигенами может составлять от 2 до 7 суток. При нагрузке зрелых ДК от 12 ч до 3 суток.The incubation time of DCs with antigens can also vary significantly. With a load of immature DCs, the incubation time of DCs with antigens can be from 2 to 7 days. With a load of mature DC from 12 hours to 3 days.
В предпочтительном варианте реализации изобретения нагрузку дендритных клеток проводят антигенами с молекулярным весом от 800 до 3500 Да.In a preferred embodiment of the invention, the load of dendritic cells is carried out with antigens with a molecular weight of from 800 to 3500 Da.
При этом нагрузку проводят в процессе инкубации, время которой выбирают из интервала от 12 ч до 3 суток.When this load is carried out in the process of incubation, the time of which is chosen from a range of 12 hours to 3 days.
- 5 011421- 5 011421
В случае использования незрелых антигенпрезентирующих клеток их нагрузку могут проводить антигенами с молекулярным весом не менее 600 Да в процессе инкубации, время которой выбирают из интервала от 2 до 7 суток.In the case of the use of immature antigen-presenting cells, their load can be carried out by antigens with a molecular weight of at least 600 Da during the incubation process, the time of which is chosen from 2 to 7 days.
В предпочтительном варианте реализации изобретения конечную концентрацию антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, добавляемых в инкубационную среду, выбирают из диапазона от 10 мкг/мл до 1 мг/мл. Если конечная концентрация антигенов будет менее 10 мкг/мл, совокупность антигенов не будет представлена на поверхности антигенпрезентирующих клеток в количестве, необходимом для проявления специфической цитотоксической активности (ЦТА) клеток иммунной системы. При добавлении антигенов с конечной концентрацией, превышающей 1 мг/мл, количество антигенов становится большим, чем предельное их количество, которое могут воспринять антигенпрезентирующие клетки для представления на своей поверхности.In a preferred embodiment of the invention, the final concentration of antigens for the load of antigen-presenting cells added to the incubation medium is selected from a range from 10 μg / ml to 1 mg / ml. If the final concentration of antigens is less than 10 µg / ml, the set of antigens will not be presented on the surface of antigen-presenting cells in an amount necessary for the manifestation of the specific cytotoxic activity (CTA) of the cells of the immune system. When antigens are added with a final concentration exceeding 1 mg / ml, the number of antigens becomes greater than their maximum amount, which antigen-presenting cells can perceive for presentation on their surface.
Повышение цитотоксической активности (ЦТА) клеток иммунной системы достигается также в случаях, когда для нагрузки ДК используют антигены, полученные однократным отщеплением протеазой с количества живых клеток вдвое-впятеро большего, чем количество нагружаемых дендритных клеток;An increase in the cytotoxic activity (CTA) of the immune system cells is also achieved in cases where antigens obtained by a single cleavage of protease from the number of living cells are twice or more than five times the number of loaded dendritic cells are used to load DK;
двухкратным-пятикратным отщеплением протеазой с количества живых клеток, равного количеству нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.two to five-fold cleavage by protease from a number of living cells equal to the number of loaded antigen-presenting cells.
При дальнейшем увеличении числа обработок протеазой количество живых клеток уменьшают в соответствии с указанной пропорцией. Число обработок протеазой может достигать 15-20 раз. Экспериментально было установлено, что указанные соотношения живых клеток и дендритных клеток во взаимосвязи с числом обработок протеазой являются оптимальными для представления на поверхности дендритных клеток заданной совокупности антигенов и облегчения восприятия их клетками иммунной системы.With a further increase in the number of protease treatments, the number of living cells is reduced in accordance with the indicated proportion. The number of protease treatments can reach 15-20 times. It was experimentally established that the indicated ratios of living cells and dendritic cells in conjunction with the number of protease treatments are optimal for presenting a given set of antigens on the surface of dendritic cells and facilitating their perception by the cells of the immune system.
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения нагрузку могут проводить антигенами, полученными однократным отщеплением протеазой с количества живых клеток вдвое-впятеро большего, чем количество нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.Thus, in one embodiment of the invention, the load can be carried out by antigens obtained by a single cleavage of the protease from the number of living cells twice to five times greater than the number of loaded antigen-presenting cells.
В другом варианте реализации изобретения нагрузку могут проводить антигенами, полученными двухкратным-пятикратным отщеплением протеазой с количества живых клеток, равного количеству нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.In another embodiment of the invention, the load can be carried out by antigens obtained by twofold to fivefold cleavage of a protease from a number of living cells equal to the number of loaded antigen-presenting cells.
Далее изобретение поясняется конкретными примерами реализации и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее:Further, the invention is illustrated with specific examples of implementation and the attached figures, which depict the following:
на фиг. 1 - результаты исследования цитотоксической активности лимфоцитов в отношении опухолевых клеток МСЕ-7;in fig. 1 - the results of the study of the cytotoxic activity of lymphocytes against tumor cells MCE-7;
на фиг. 2 - результаты исследования цитотоксической активности лимфоцитов в отношении ЭК;in fig. 2 - the results of a study of the cytotoxic activity of lymphocytes against EC;
на фиг. 3 - график роста опухоли гепатомы Н22, привитой мышам ВАЕВ/е, в экспериментальной и контрольной (·) группах. Показаны средние значения диаметра опухоли в группе +/- стандартное отклонение.in fig. 3 is a graph of tumor growth of hepatoma H22, vaccinated to mice with VAEV / e, in the experimental and control (·) groups. Shows the average diameter of the tumor in the group +/- standard deviation.
Пример № 1.Example number 1.
Ниже приведен пример реализации способа получения противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток, нагруженных антигенами. В данном примере нагрузку дендритных клеток проводят антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток с представлением на поверхности дендритных клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов опухолевых клеток-мишеней.Below is an example of the implementation of the method of obtaining an anticancer vaccine based on dendritic cells loaded with antigens. In this example, the dendritic cells are loaded with antigens obtained by trypsin cleavage from the surface of living tumor cells with a set of antigens on the surface of dendritic cells identical to the aggregate of surface antigens of the tumor target cells.
Для нагрузки дендритных клеток получают раствор антигенов, специфичных для опухолевых клеток-мишеней, используя культуру клеток человеческой аденокарциномы груди МСЕ-7.For loading dendritic cells, a solution of antigens specific for tumor target cells is obtained using an MCE-7 human adenocarcinoma cell culture.
1. Из флакона с культурой клеток МСЕ-7 удаляют ростовую среду и промывают монослой клеток стерильным физиологическим раствором. Промывку осуществляют не менее 3 раз до удаления остатков ростовой среды.1. The growth medium is removed from the MCE-7 cell culture bottle and washed with a monolayer of cells with sterile saline. Washing is carried out at least 3 times to remove residual growth medium.
Следующим и ключевым этапом является витальная для клеток обработка протеазой клеток МСЕ-7, где в качестве протеазы выбирают трипсин (активность ~3000 Ед/мг).The next key stage is the vital for cell treatment with protease of MCE-7 cells, where trypsin is chosen as a protease (activity ~ 3000 U / mg).
2. Добавляют к монослою клеток 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл раствора на 25 см2 поверхности культурального флакона.2. Add a 0.0001% trypsin solution to the cell monolayer using 1 ml of solution per 25 cm 2 of the surface of the culture flask.
3. Инкубируют флакон при 37°С. Между пятой и седьмой минутами инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены.3. Incubate the bottle at 37 ° C. Between the fifth and seventh minutes of incubation, trypsin solution containing surface antigens split off from the cells is removed from the vial.
4. К клеткам добавляют свежеприготовленную ростовую среду, содержащую сыворотку (обычно 10%), и продолжают их культивирование.4. To cells add freshly prepared growth medium containing serum (usually 10%), and continue their cultivation.
5. Для наработки массы антигенов, с интервалом в сутки от 2-х до 15-ти раз повторяют пп.2-4.5. For the accumulation of mass of antigens, with an interval of a day from 2 to 15 times, repeat paragraphs 2-4.
6. Чтобы убрать следы трипсина и других белков, раствор антигенов фильтруют через фильтр с отсечением по белку 10-15 кДа.6. To remove traces of trypsin and other proteins, the solution of antigens is filtered through a filter with cut-off protein 10-15 kDa.
7. Получают раствор антигенов, являющихся протеолитическими фрагментами поверхностных белков клеток, т. е. пептидами, которые, ввиду выраженной гликозилированности поверхностных белков7. Get a solution of antigens, which are proteolytic fragments of cell surface proteins, i.e. peptides, which, due to the pronounced glycosylation of surface proteins
- 6 011421 клеток, также могут характеризоваться той или иной степенью гликозилирования.- 6 011421 cells, can also be characterized by varying degrees of glycosylation.
Являясь пептидами, патентуемые антигены пригодны для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, в частности зрелых ДК, которые получают ίη νίίτο из очищенной фракции мононуклеарных лейкоцитов (моноцитов) периферической крови (Сапсег Кекеагсй, 2001, ν.61, р.6445-6450). Кровь донора собирают в пробирки с антикоагулянтом (гепарин или цитрат натрия), разбавляют равным объемом стерильного физиологического раствора и наслаивают на раствор фиколл-пак, имеющий плотность 1,077 г/мл (2 объема разведенной крови на один объем раствора фиколла). Центрифугируют 20 мин при 800д и комнатной температуре. Собирают пипеткой фракцию клеток на границе раздела раствора фиколла и плазмы крови, разводят клетки физиологическим раствором и центрифугируют 10 мин при 250 д. Осадок ресуспендируют в среде КРМ1-1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота и, в концентрации 50 млн кл/мл, по 10 мл вносят в чашки Петри. Чашки Петри инкубируют в условиях насыщающей влажности, 5% СО2 и 37°С в течение 1 ч. Неприкрепившиеся клетки (в основном лимфоциты) отбирают, центрифугируют, замораживают и хранят в жидком азоте. К монослою прикрепившихся клеток (в основном моноцитов) добавляют по 10 мл свежей среды и инкубируют в стандартных условиях. На следующий день и через три дня (на четвертый день) в инкубационную среду добавляют ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, 800 ед./мл) и ИЛ-4 (интерлейкин-4, 1000 ед./мл). Добавление данной композиции цитокинов необходимо для дифференцировки мононуклеарных лейкоцитов в незрелые ДК. На 6-й день к ДК, для созревания и нагрузки их антигенами, добавляют культуральную среду (КРМ1-1640, 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота), содержащую ФНО-α (фактор некроза опухолей-α, 10 нг/мл) и антигены, полученные отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток, как было описано выше (конечная концентрация антигенов 100 мкг/мл), и инкубируют 2 суток при 5% СО2 и 37°С. На 8-й день зрелые ДК собирают в отдельную емкость и используют в качестве противоопухолевой дендритоклеточной вакцины, а также проверяют их способность специфически стимулировать цитотоксические лимфоциты ίη νίίτο.Being peptides, the patented antigens are suitable for loading antigen-presenting cells, in particular mature DCs, which receive ίη νίίτο from the purified fraction of peripheral blood mononuclear leukocytes (monocytes) (Sapseg Kekeags, 2001, ν.61, p. 6445-6450). The donor's blood is collected in tubes with an anticoagulant (heparin or sodium citrate), diluted with an equal volume of sterile saline and layered on a ficoll-pack solution having a density of 1.077 g / ml (2 volumes of diluted blood per one volume of ficoll solution). Centrifuged for 20 min at 800d and room temperature. Pipette up the fraction of cells at the interface between the Ficoll solution and blood plasma, dilute the cells with saline and centrifuge for 10 minutes at 250 d. The sediment is resuspended in KRM1-1640 medium containing 10% inactivated bovine serum and, at a concentration of 50 million cells / ml , on 10 ml bring in Petri dishes. Petri dishes are incubated under conditions of saturating humidity, 5% CO 2 and 37 ° C for 1 hour. Non-adherent cells (mainly lymphocytes) are picked, centrifuged, frozen and stored in liquid nitrogen. 10 ml of fresh medium are added to the monolayer of adherent cells (mainly monocytes) and incubated under standard conditions. The next day and three days later (on the fourth day) GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, 800 units / ml) and IL-4 (interleukin-4, 1000 units / ml) are added to the incubation medium. The addition of this composition of cytokines is necessary for the differentiation of mononuclear leukocytes into immature DCs. On the 6th day, culture medium (KPM1-1640, 10% inactivated cattle serum) containing TNF-α (tumor necrosis factor-α, 10 ng / ml) and antigens are added to DK for maturation and loading with antigens. , obtained by cleaving with trypsin from the surface of living tumor cells, as described above (final concentration of antigens 100 μg / ml), and incubated for 2 days at 5% CO 2 and 37 ° C. On the 8th day, mature DCs are collected in a separate container and used as an antitumor dendritic cell vaccine, and also their ability to specifically stimulate cytotoxic ίη νίτο lymphocytes is tested.
Пример № 2.Example number 2.
В данном поясняющем, но не ограничивающем изобретение примере нагрузку дендритных клеток проводят антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых эндотелиальных клеток с последующим представлением на поверхности дендритных клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов эндотелиальных клеток-мишеней.In this illustrative, but not limiting example of the invention, the load of dendritic cells is carried out by antigens obtained by cleaving with trypsin from the surface of living endothelial cells with subsequent presentation on the surface of dendritic cells of a set of antigens identical to the set of surface antigens of endothelial target cells.
В качестве живых эндотелиальных клеток используют первичную культуру мышиных микро цирку ляторных дермальных ЭК (ЗАО БиоБогемия, Россия).The primary culture of mouse microcirculatory dermal EC (BioBogemia CJSC, Russia) is used as live endothelial cells.
1. Из чашки Петри с ЭК удаляют ростовую среду и промывают чашку 3-5 раз раствором Хенкса (из расчета 2 мл на 5 см2 поверхности чашки Петри) для удаления следов сыворотки, содержащейся в ростовой среде. После каждого добавления раствора Хенкса клетки выдерживают в нем 2 мин, после чего его удаляют.1. The growth medium is removed from the EC Petri dish and washed the dish 3-5 times with Hanks solution (at the rate of 2 ml per 5 cm 2 of the surface of the Petri dish) to remove traces of serum contained in the growth medium. After each addition of the Hanks solution, the cells are kept in it for 2 minutes, after which it is removed.
2. Добавляют к клеткам охлажденный (+4±2°С) 0,0001% раствор трипсина (активность ~3000 Ед/мг), приготовленный на растворе Хенкса из расчета 1 мл раствора на 5 см2 поверхности чашки Петри и через 10-15 с его удаляют.2. Add to cells the cooled (+ 4 ± 2 ° C) 0.0001% trypsin solution (activity ~ 3000 U / mg) prepared in Hanks solution at the rate of 1 ml of solution per 5 cm 2 of the surface of a Petri dish and after 10-15 from it is removed.
3. Сразу после удаления раствора трипсина чашку Петри накрывают крышкой и помещают в инкубатор на 10 мин при 37°С, 5% СО2. Следят, чтобы в инкубаторе была не менее чем 95%-ая влажность, чтобы избежать высыхания и гибели клеток.3. Immediately after removing the trypsin solution, the Petri dish is covered with a lid and placed in an incubator for 10 min at 37 ° C, 5% CO 2 . Ensure that the incubator contains at least 95% moisture to avoid drying and cell death.
4. Достают из инкубатора чашку Петри и струей физиологического раствора (из расчета 250 мкл на 5 см2 поверхности чашки Петри) смывают со дна чашки Петри клетки, с отщепленными с их поверхности фрагментами белков.4. Remove the Petri dish from the incubator and wash it with a stream of saline (250 μl per 5 cm 2 of the Petri dish) and remove the protein fragments from the bottom of the Petri dish.
5. Отбирают физиологический раствор с открепленными от дна флакона клетками, центрифугируют 5 мин при 200д.5. Selected saline solution with detached cells from the bottom of the vial, centrifuged for 5 min at 200d.
6. Осевшие при центрифугировании клетки ресуспендируют в свежеприготовленной ростовой среде и переносят в чашку Петри для дальнейшего культивирования и повторного использования для получения антигенов.6. Cells deposited during centrifugation are resuspended in a freshly prepared growth medium and transferred to a Petri dish for further cultivation and reuse to produce antigens.
7. Супернатант, полученный при центрифугировании, отбирают и фильтруют через фильтр с отсечением по белку 10-15 кДа, чтобы убрать следы трипсина и других белков.7. The supernatant obtained by centrifugation is selected and filtered through a 10-15 kDa protein cut-off filter to remove traces of trypsin and other proteins.
8. Полученный фильтрат, представляющий собой раствор поверхностных антигенов ЭК, используют для нагрузки зрелых ДК, полученных из крови здоровых мышей той же породы, аналогично тому, как это было описано в примере № 1.8. The obtained filtrate, which is a solution of EC surface antigens, is used to load mature DCs obtained from the blood of healthy mice of the same breed, in the same way as described in Example No. 1.
Далее проводят проверку функциональной активности ДК, нагруженных антигенами.Next, they check the functional activity of DCs loaded with antigens.
Функциональную активность ДК, нагруженных поверхностными антигенами опухолевых или ЭК, проверяют их способностью индуцировать ίη νίίτο цитотоксическую активность (ЦТА) лимфоцитов в отношении клеток-мишеней, а именно, опухолевых клеток МСЕ-7 и мышиных дермальных ЭК. Лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, как было описано выше, суспендировали в культуральной среде. Для стимуляции лимфоцитов ДК отмывали фосфатно-солевым буфером и помещали в 24-луночные планшеты вместе с лимфоцитами при соотношении 1:20 (ДК: лимфоциты), в 1 мл культуThe functional activity of DCs loaded with surface antigens of tumor or EC is checked by their ability to induce ίη νίίτο cytotoxic activity (CTA) of lymphocytes against target cells, namely, tumor cells of MCE-7 and mouse dermal EC. Lymphocytes isolated from human peripheral blood, as described above, were suspended in culture medium. To stimulate lymphocytes, DC was washed with phosphate-saline buffer and placed in 24-well plates with lymphocytes at a ratio of 1:20 (DC: lymphocytes), in 1 ml of culture
- 7 011421 ральной среды, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. На следующий день после начала стимуляции и далее 1 раз в 3 дня к культуре добавляли по 30 ед./мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2. Через 7 дней проводили вторичную стимуляцию культуры лимфоцитов с использованием ДК в том же количестве, как и при первой стимуляции. Через 5 дней после вторичной стимуляции проводили определение цитотоксической активности лимфоцитов в отношении опухолевых и эндотелиальных клеток. Для этого 1 млн опухолевых клеток или ЭК метили натрия хроматом с 51-ым хромом (3,7 МБк) в течение 1 ч при 37°С и отмывали 4 раза. В лунки 96-ти луночного планшета вносили суспензию стимулированных лимфоцитов в количестве 10-80 тыс. клеток на лунку, а затем добавляли меченые клетки-мишени (5 тыс. клеток на лунку). Через 18 ч отбирали из лунок по 100 мкл супернатанта и измеряли радиоактивность на гамма-счетчике. Результаты измерений использовали для определения специфического лизиса клеток-мишеней и рассчитывали ЦТА стимулированных лимфоцитов по формуле- 7 011421 ral media containing 10% inactivated fetal bovine serum. The next day after the start of stimulation and then 1 time in 3 days, 30 units / ml of human recombinant IL-2 were added to the culture. After 7 days, secondary stimulation of the lymphocyte culture was performed using DC in the same amount as in the first stimulation. 5 days after the secondary stimulation, the cytotoxic activity of lymphocytes was measured against tumor and endothelial cells. For this, 1 million tumor cells or EC were labeled with sodium chromate with 51 chromium (3.7 MBq) for 1 h at 37 ° C and washed 4 times. A suspension of stimulated lymphocytes in the amount of 10-80 thousand cells per well was added to the wells of a 96-well plate, and then labeled target cells were added (5 thousand cells per well). After 18 hours, 100 μl of the supernatant were taken from the wells and the radioactivity was measured on a gamma counter. The measurement results were used to determine the specific lysis of target cells and CTA of stimulated lymphocytes was calculated using the formula
ЦТА=(1-Р мишень+лнмфошпы/Рмишень) X 1 θθ ?CTA = (1-P target + lnmpholes / R-target) X 1 θθ?
в которой Рмишень - радиоактивность проб, где инкубировали клетки-мишени;in which P target is the radioactivity of the samples where the target cells were incubated;
Рмишень+лимфоциты - радиоактивность проб, где инкубировали клетки-мишени вместе со стимулированными лимфоцитами. Chez P m and n + m s if F o cytes - radioactivity of samples where the target cells were incubated with stimulated lymphocytes.
Для получения контрольных измерений также получали экзосомы клеток МСР-7. При этом использовали количество клеток МСР-7, эквивалентное количеству клеток в эксперименте. Экзосомы получали ультрацентрифугированием культуральной среды согласно способу, описанному в заявке ПО 2004012685 (8йеб апйдеп уассше \νί11ι бепбпйс се11 абщуап!, МПК А61К39/00, опубл. 12.02.2004 г.).To obtain control measurements, exosomes of MCP-7 cells were also obtained. At the same time, the number of MCP-7 cells equivalent to the number of cells in the experiment was used. Exosomes were obtained by ultracentrifuging the culture medium according to the method described in software application No. 2004012685 (8yeb apydep uassche \ νί11ι bepps se11 abschuap !, IPC A61K39 / 00, publ. 12.02.2004).
Результаты исследования цитотоксической активности стимулированных лимфоцитов в отношении опухолевых клеток приведены на фиг. 1.The results of a study of the cytotoxic activity of stimulated lymphocytes against tumor cells are shown in FIG. one.
В эксперименте лимфоциты стимулировали ДК-ми, нагруженными поверхностными антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток МСР-7 (и). В контроле использовали интактные (не нагруженные антигенами) ДК или ДК, нагруженные экзосомами клеток МСР-7 (·) или поверхностными антигенами ЭК (♦). Показаны средние значения +/- стандартное отклонение.In the experiment, the lymphocytes were stimulated with DK-mi loaded with surface antigens obtained by trypsin cleavage from the surface of living MCP-7 tumor cells ( i ). In the control, intact (not loaded with antigens) DCs or DCs loaded with exosomes of MCP-7 cells (·) or EC surface antigens (♦) were used. Average values +/- standard deviation are shown.
Как видно из фиг. 1, цитотоксические лимфоциты, полученные после совместного культивирования с дендритными клетками, нагруженными антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток МСР-7, обладали более высокой цитотоксической активностью против опухолевых клеток по сравнению с контрольными лимфоцитами, стимулированными интактными дендритными клетками или дендритными клетками, нагруженными иными антигенами, включая антигены, полученные согласно ближайшему прототипу изобретения.As can be seen from FIG. 1, cytotoxic lymphocytes obtained after co-cultivation with dendritic cells, loaded with antigens, obtained by cleaving with trypsin from the surface of living tumor cells MCP-7, had a higher cytotoxic activity against tumor cells compared to control lymphocytes stimulated by intact dendritic cells or dendritic cells loaded with other antigens, including antigens, obtained according to the closest prototype of the invention.
Результаты исследования цитотоксической активности стимулированных лимфоцитов в отношении ЭК приведены на фиг. 2.The results of a study of the cytotoxic activity of stimulated lymphocytes in relation to EC are shown in FIG. 2
В эксперименте лимфоциты стимулировали ДК-ми, нагруженными антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых эндотелиальных клеток . В контроле использовали интактные ДК или ДК, нагруженные лизатом ЭК (·) или поверхностными антигенами клеток МСР-7 (♦). Показаны средние значения +/- стандартное отклонение. Лизат ЭК получали путем трехкратного резкого замораживания клеток в жидком азоте и последующего размораживания при 37°С в водяной бане.In the experiment, lymphocytes were stimulated with DC-mi, loaded with antigens, obtained by cleaving with trypsin from the surface of living endothelial cells. In the control, intact DCs or DCs loaded with EC lysate (·) or surface antigens of MCP-7 cells (♦) were used. Average values +/- standard deviation are shown. EC lysate was obtained by triple sharp freezing of cells in liquid nitrogen and subsequent thawing at 37 ° C in a water bath.
Как видно из фиг. 2, цитотоксические лимфоциты после совместного культивирования с ДК, нагруженными поверхностными антигенами ЭК, обладали более высокой цитотоксической активностью в отношении ЭК (клеток-мишеней) по сравнению с контрольными лимфоцитами, стимулированными интактными дендритными клетками или дендритными клетками, нагруженными иными поверхностными антигенами или лизатом ЭК.As can be seen from FIG. 2, after co-cultivation with cytotoxic lymphocytes with DCs loaded with EC surface antigens, had higher cytotoxic activity against EC (target cells) compared with control lymphocytes stimulated by intact dendritic cells or dendritic cells loaded with other surface antigens or EC lysate.
При нагрузке антигенпрезентирующих клеток антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток, обеспечивается представление на поверхности антигенпрезентирующих клеток ассоциированной с главным комплексом гистосовместимости совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней. Т-лимфоциты распознают главный комплекс гистосовместимости и ассоциированные с ним антигены. В результате цитотоксическая активность (ЦТА) лимфоцитов проявляется не только в отношении указанных антигенов, но и в отношении клетокмишеней.When antigen presenting cells are loaded with antigens obtained by protease cleavage from the surface of living cells, antigen presenting cells associated with the main histocompatibility complex of an aggregate of antigens identical to the aggregate of target cell surface antigens are presented on the surface. T lymphocytes recognize the major histocompatibility complex and its associated antigens. As a result, cytotoxic activity (CTA) of lymphocytes is manifested not only in relation to these antigens, but also in relation to target cells.
Для подтверждения противоопухолевой активности вакцины, полученной патентуемым способом, был поставлен модельный эксперимент на млекопитающих, а именно 12-ти самцах мышей породы ВАЬВ/с примерно одного возраста и веса. Для получения вакцины использовали способ согласно второму примеру реализации изобретения. Антигены были получены с культуры мышиных микроциркуляторных дермальных ЭК (ЗАО БиоБогемия, Россия). За день до получения антигенов ЭК активировали добавлением кондиционированной ростовой среды клеток Н22 в ростовую среду ЭК в соотношении 1:3. ДК получали из крови здоровых мышей той же породы и нагружали антигенами согласно примеру № 2.To confirm the antitumor activity of the vaccine obtained by the patented method, a model experiment was carried out on mammals, namely, 12 male VABB / mice of approximately the same age and weight. To obtain the vaccine used the method according to the second example of the invention. Antigens were obtained from the culture of mouse microcirculatory dermal EC (ZAO BioBogemia, Russia). The day before antigens were produced, EC was activated by the addition of conditioned growth medium of H22 cells to EC growth medium in a 1: 3 ratio. DK was obtained from the blood of healthy mice of the same breed and loaded with antigens according to example No. 2.
0,1 мл раствора нагруженных антигенами ДК (примерно 100 тыс. ДК) вводили в хвостовую вену два раза с перерывом в 3 дня. Животным контрольной группы вводили раствор не нагруженных антиге0.1 ml of a solution of DG antigens loaded (approximately 100 thousand DK) were injected into the tail vein twice with a break of 3 days. Animals of the control group were injected with a solution not loaded antige
- 8 011421 нами ДК. Через 3 дня после последней иммунизации подопытным мышам была привита опухоль подкожным введением в подмышечную впадину 1 млн опухолевых клеток гепатомы Н22. Производили запись размеров опухоли и дня смерти мышей. Средняя продолжительность жизни животных, иммунизированных вакциной, полученной патентуемым способом, увеличилась на 52%.- 8 011421 us DK. Three days after the last immunization, a test mouse was inoculated with a subcutaneous injection of 1 million H22 hepatoma cells into the mouse gut. Recorded tumor size and day of death of mice. The average life expectancy of animals immunized with a vaccine obtained by the patented method has increased by 52%.
Результаты измерений размеров опухолей представлены на фиг. 3, из которой следует замедление роста опухолей у животных из экспериментальной группы, что указывает на выраженный противоопухолевый эффект вакцины, полученной патентуемым способом.The results of measurements of tumor sizes are presented in FIG. 3, which implies a slowdown in the growth of tumors in animals from the experimental group, which indicates a pronounced antitumor effect of the vaccine obtained by the patented method.
Таким образом, показана возможность применения патентуемого способа для получения противоопухолевой вакцины, содержащей антигенпрезентирующие клетки, а именно ДК, способной стимулировать цитотоксическую активность лимфоцитов, с целью селективного повреждения клеток-мишеней как ίη νίίτο, так и ίη νίνο.Thus, it has been shown that the patented method can be used to obtain an antitumor vaccine containing antigen-presenting cells, namely DC, capable of stimulating the cytotoxic activity of lymphocytes, with the aim of selectively damaging target cells both η νίίτο and η νίνο.
Применение протеазы для отщепления антигенов дает возможность получать антигены, являющиеся пептидами, с таким молекулярным весом, который обуславливает их способность быть представленными на поверхности антигенпрезентирующих клеток в форме, пригодной для полноценного восприятия клетками иммунной системы, о чем свидетельствует повышение ЦТА лимфоцитов.The use of protease for cleavage of antigens makes it possible to obtain antigens, which are peptides, with such molecular weight, which determines their ability to be presented on the surface of antigen-presenting cells in a form suitable for full-fledged perception by cells of the immune system, as evidenced by an increase in CTA of lymphocytes.
Нагрузка антигенпрезентирующих клеток антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток, позволяет получать путем однократного или многократного отщепления заданную совокупность антигенов, специфичных для клеток-мишеней, в количестве, оптимальном для представления указанной совокупности клеткам иммунной системы.The load of antigen-presenting cells with antigens obtained by protease cleavage from the surface of living cells allows one to obtain, by single or multiple cleavage, a given set of antigens specific for target cells in an amount optimal for presenting the specified set of cells to the immune system.
Кроме этого, применяемая мягкая (витальная для клеток) обработка клеток протеазой позволяет получать антигены с живых клеток, т.е. с клеток с сохраненной барьерной функцией цитоплазматической мембраны (стенки клетки). Данное обстоятельство позволяет воздействовать протеазой только на поверхность клеток и, соответственно, отщеплять только поверхностные антигены. Сохранность цитоплазматической мембраны также предотвращает выход из клетки внутриклеточного содержимого, способного загрязнить получаемые антигены нецелевыми внутриклеточными антигенами и другими балластными веществами (белками, липидами, нуклеиновыми кислотами и т.д.), что дает возможность представлять клеткам иммунной системы только антигены, являющиеся специфичными для клеток-мишеней, исключив присутствие на поверхности антигенпрезентирующих клеток других антигенов, не являющихся специфичными.In addition, the applied soft (vital for cells) treatment of cells with a protease makes it possible to obtain antigens from living cells, i.e. from cells with preserved barrier function of the cytoplasmic membrane (cell wall). This circumstance allows the protease to act only on the surface of cells and, accordingly, to remove only surface antigens. Preservation of the cytoplasmic membrane also prevents the release of intracellular contents from the cell, which can contaminate the antigens obtained with non-targeted intracellular antigens and other ballast substances (proteins, lipids, nucleic acids, etc.), which makes it possible for cells of the immune system to present only cell specific antigens targets, eliminating the presence on the surface of antigen-presenting cells of other antigens that are not specific.
Таким образом, при нагрузке антигенпрезентирующих клеток антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток (с сохраненной барьерной функцией цитоплазматической мембраны), с обеспечением представления на поверхности антигенпрезентирующих клеток ассоциированной с главным комплексом гистосовместимости совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней, облегчается последующее полноценное представление клеткам иммунной системы, в частности Т-лимфоцитам, исключительно антигенов, являющихся специфичными для клеток-мишеней, что обеспечивает повышение цитотоксической активности (ЦТА) лимфоцитов в отношении клеток-мишеней.Thus, when antigen presenting cells are loaded with antigens obtained by protease cleavage from the surface of living cells (with preserved barrier function of the cytoplasmic membrane), providing the representation of target cells on the surface of the antigen presenting cells associated with the main histocompatibility complex is identical to the surface antigens of the target cells full view of the cells of the immune system, in particular T-lymphocytes, exclusively ant genes that are specific for target cells, which enhances the cytotoxic activity (CTA) lymphocytes against target cells.
Claims (33)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200801751A EA200801751A1 (en) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | METHOD OF OBTAINING ANTI-TUMOR VACCINE |
| PCT/RU2009/000392 WO2010024719A1 (en) | 2008-08-26 | 2009-08-05 | Process for preparing an anti-tumour vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200801751A EA200801751A1 (en) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | METHOD OF OBTAINING ANTI-TUMOR VACCINE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA011421B1 true EA011421B1 (en) | 2009-02-27 |
| EA200801751A1 EA200801751A1 (en) | 2009-02-27 |
Family
ID=40849088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200801751A EA200801751A1 (en) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | METHOD OF OBTAINING ANTI-TUMOR VACCINE |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA200801751A1 (en) |
| WO (1) | WO2010024719A1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2063768C1 (en) * | 1991-08-14 | 1996-07-20 | Валентин Александрович Фигурнов | Method of preliminary tumor tissue treatment for cancerous tumor antigen preparing |
| WO2004012685A2 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
| US20080160049A1 (en) * | 2004-08-26 | 2008-07-03 | University Of Notre Dame Du Lac | Tissue Vaccines and Uses Thereof |
| US20080160050A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-07-03 | Kenichiro Hasumi | Dendritic cell tumor injection therapy and related vaccine |
| WO2008081035A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Cytovac A/S | Anti-tumor vaccine derived from normal chemically modified cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4431401A1 (en) * | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Live vaccine against tumor diseases |
| EA200700598A1 (en) * | 2007-03-07 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | ANTI-TUMOR VACCINE, METHOD FOR OBTAINING ANTI-TUMOR VACCINE AND METHOD FOR CARRYING OUT ANTITUMOR IMMUNOTHERAPY |
| EA200700940A1 (en) * | 2007-04-27 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | METHOD FOR OBTAINING ANTITUMENT VACCINE ON THE BASIS OF SURFACE ANTIGENES OF ENDOTHELIAL CELLS |
-
2008
- 2008-08-26 EA EA200801751A patent/EA200801751A1/en active IP Right Revival
-
2009
- 2009-08-05 WO PCT/RU2009/000392 patent/WO2010024719A1/en active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2063768C1 (en) * | 1991-08-14 | 1996-07-20 | Валентин Александрович Фигурнов | Method of preliminary tumor tissue treatment for cancerous tumor antigen preparing |
| WO2004012685A2 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
| US20080160049A1 (en) * | 2004-08-26 | 2008-07-03 | University Of Notre Dame Du Lac | Tissue Vaccines and Uses Thereof |
| US20080160050A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-07-03 | Kenichiro Hasumi | Dendritic cell tumor injection therapy and related vaccine |
| WO2008081035A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Cytovac A/S | Anti-tumor vaccine derived from normal chemically modified cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010024719A1 (en) | 2010-03-04 |
| EA200801751A1 (en) | 2009-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220016164A1 (en) | Pharmaceutical composition for use in the treatment of pancreatic cancer | |
| JP6134763B2 (en) | Dendritic cells that have been produced using GM-CSF and interferon α and that have taken up cancer cells that have been heat-treated and killed | |
| Hegmans et al. | Immunotherapy of murine malignant mesothelioma using tumor lysate–pulsed dendritic cells | |
| AU2001282123B8 (en) | Method for producing ready to use, antigen loaded or unloaded, cryoconserved mature dendritic cells | |
| ES2535835T3 (en) | Compositions for the preparation of mature dendritic cells | |
| US9694059B2 (en) | Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
| US11278605B2 (en) | Method for preparing an immunogenic lysate, the lysate obtained, dendritic cells loaded with such lysate and a pharmaceutical composition comprising the lysate or the dendritic cells | |
| US20020155108A1 (en) | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells | |
| Yin et al. | A novel therapeutic vaccine of GM-CSF/TNFα surface-modified RM-1 cells against the orthotopic prostatic cancer | |
| US20210353674A1 (en) | Pharmaceutical composition for use in the treatment of pancreatic cancer | |
| Sabado et al. | Dendritic cell vaccines | |
| RU2749610C2 (en) | Methods related to activated dendritic cells compositions and to immunotherapeutic treatment of individuals with advanced cancer | |
| Velek | Immunogenicity of dendritic cell-based HPV16 E6/E7 peptide vaccines: CTL activation and protective effects | |
| KR20180022949A (en) | Optimally activated dendritic cells that induce an enhanced or increased anti-tumor immune response | |
| Swartz et al. | Generation of tumor targeted dendritic cell vaccines with improved immunogenic and migratory phenotype | |
| EA011421B1 (en) | Method for preparing the tumor vaccine | |
| NL2024515B1 (en) | Pharmaceutical composition for use in the treatment of pancreatic cancer | |
| CN111518216B (en) | Polypeptide, composition containing polypeptide and application of composition in tumor immunity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM MD TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ TJ |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY KG RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |