EA010574B1 - Peptide normalizing netabolism in bone and cartilaginous tissues, pharmaceutical composition based thereon and method for use thereof - Google Patents
Peptide normalizing netabolism in bone and cartilaginous tissues, pharmaceutical composition based thereon and method for use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- EA010574B1 EA010574B1 EA200700176A EA200700176A EA010574B1 EA 010574 B1 EA010574 B1 EA 010574B1 EA 200700176 A EA200700176 A EA 200700176A EA 200700176 A EA200700176 A EA 200700176A EA 010574 B1 EA010574 B1 EA 010574B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- bone
- pharmaceutical composition
- glutamyl
- metabolism
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к лекарственным средствам для профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата, в частности дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, и может быть использовано как средство, нормализующее метаболизм в костной и хрящевой тканях.
Известно, что дегенеративно-дистрофические заболевания опорно-двигательного аппарата, а также остеопороз костной ткани являются наиболее часто встречаемой патологией.
Для лечения этих заболеваний применяется широкий спектр препаратов, в зависимости от клинических проявлений заболеваний, возраста больного и способа применения.
Так, для лечения остеопороза применяются различные препараты кальция, витамины группы Ό и гормональные препараты (для женщин).
Медикаментозная терапия дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника включает применение различных лекарственных средств симптоматического и патогенетического действия: анальгетики и противовоспалительные средства (анальгин, новокаиновые блокады, реопирин, индометацин, бруфен); антигистаминные средства (димедрол, пипольфен); препараты, улучшающие периферическое кровообращение (пахикарпин, платифиллин); биостимуляторы (румалон, алоэ, стекловидное тело, АТФ); ферментные препараты (лидаза, ронидаза); анаболические стероиды (нерабол, ретаболил).
Кроме того, известны препараты, влияющие на обмен веществ в хрящевой ткани: глюкозамин, хондроитин сульфат натрия (Большая Российская энциклопедия лекарственных средств. М.: Ремедиум, 2002, т. 1, с. 230-232).
При этом большинство из перечисленных групп препаратов несовместимы с другими лекарственными средствами, вызывают негативные побочные эффекты, что сужает спектр показаний и ограничивает их применение.
Учитывая распространенность заболеваний опорно-двигательного аппарата в разных возрастных группах, а также их социальную значимость, разработка новых лекарственных средств, влияющих на метаболизм в костной, хрящевой и соединительной тканях актуальна в настоящее время.
Из уровня техники известен пептид аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-61и-Л8р-ОН (регистрационный номер ΚΝ-85806-95-7; 1Шр://51п\тсЬ.Пх-каг15ги11с.бс).
При экспериментальном изучении пептида аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН была выявлена его ранее неизвестная биологическая активность, проявляющаяся в нормализации метаболизма в костной и хрящевой тканях.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения средства пептидной природы, обладающего биологической активностью, проявляющейся в нормализации метаболизма в костной и хрящевой тканях и фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, а также способа ее применения.
Технический результат изобретения заключается в проявлении пептидом аланил-глутамиласпарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН биологической активности, проявляющейся в нормализации метаболизма в костной и хрящевой тканях, а также содержащей в качестве активного начала этот пептид фармацевтической композиции, использование которой способствует увеличению количества и усилению функции кальцитонинпродуцирующих клеток щитовидной железы, улучшает трофику клеток костной и хрящевой тканей и, таким образом, нормализует метаболизм в костной и хрящевой тканях.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.
Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.
Настоящее изобретение относится к пептиду аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН последовательности 1 |8ЕС ΙΌ N0:1], обладающему биологической активностью, проявляющейся в нормализации метаболизма в костной и хрящевой тканях.
Предлагается также применение пептида аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН последовательности 1 |8ЕС ΙΌ NО:1] для приготовления лекарственного средства, нормализующего метаболизм в костной и хрящевой тканях.
Другой аспект настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, нормализующей метаболизм в костной и хрящевой тканях, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН последовательности 1 |8Е0 ΙΌ NО:1] и фармацевтически приемлемый носитель.
При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.
Следующий аспект настоящего изобретения касается способа профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата путем нормализации метаболизма в костной и хрящевой тканях, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного на
- 1 010574 чала пептид аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-А1а-61и-А8р-0Н последовательности 1 |5>ЕО Ш N0:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.
При этом введение осуществляют внутримышечно.
Пептид аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-А1а-61и-А8р-ОН получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.
Изучение биологической активности проводили в эксперименте на эпифизэктомированных крысах, на эксплантатах хрящевой ткани и у больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями суставов.
Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид Н-А1а-01ц-А8р-0Н, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, нормализующего метаболизм в костной и хрящевой тканях.
Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида Н-А1а-01и-А8р-0Н, как активное начало, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.
Понятие эффективное количество подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.
Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.
Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности или для сохранения стерильности.
Сущность изобретения поясняется таблицами и фигурой.
В табл. 1 представлено влияние пептида Н-А1а-01и-А8р-0Н на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.
В табл. 2 представлено влияние пептида Н-А1а-01и-А8р-0Н на количественные характеристики исследуемых параметров в щитовидной железе по данным компьютерного анализа микроскопических изображений.
Таблица 1
- 2 010574
Таблица 2
*Р<0,05 по сравнению с показателем у интактных животных;
**Р<0,05 по сравнению с показателем у животных контрольной группы.
На фигуре показано влияние пептида Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН на развитие эксплантатов хрящевой ткани.
Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида аланил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН (пример 1), примерами испытания токсичности и биологической активности пептида (примеры 2-4), а также примером результатов клинического применения пептида, подтверждающим его фармакологические свойства и возможность достижения профилактического и/или лечебного эффекта (пример 5).
Пример 1. Синтез пептида Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН.
1. Название соединения: аланил-глутамил-аспарагиновая кислота.
2. Структурная формула: Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН
3. Брутто-формула без противоиона: С12Н19ИзО8.
4. Молекулярный вес без противоиона: 333,29.
5. Противоион: ацетат.
6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.
7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:
ВОС-С1и(ОВг1)-ОН
НО8и
ОСС
ВОС-С1и(ОВг1)-О8и
Η-Α5ρ(ΟΒζ1)-ΟΗ
V
В0С-О1и(0Вг1)-А8Р(0В21>ОН
1) ТРА
2) г-А1а-О8и
Ζ-Α13-01ιι(0Βζ1)-Α8ρ(0Βζ1)-0Η ϋ/Ρί
Н-А1а-С1и-Азр-ОН
ВОС - трет-бутилоксикарбонильная группа,
Ζ - бензилоксикарбонильная группа,
О8и - Ν-оксисукцинимидный эфир,
- 3 010574
ОСС - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид,
ΟΒζΙ - бензиловый эфир,
ΤΡΑ - трифторуксусная кислота.
Характеристики готового препарата:
содержание основного вещества: 98,75 % (по ВЭЖХ, 220 нм),
ТСХ - индивидуален,
К.(=0,75 (ацетонитрил-вода 1:3), содержание влаги: 6%, рН 0,01% раствора: 4,17, удельное оптическое вращение: [α]Ό22: -20° (с=1, Н2О), Ро1ата1 А, Саг1 Ζοίδδ 1еиа.
Пример синтеза.
1) ΒΟί.'-Ο1ιι(ΟΒζ1)-Ο5>ιι. Ν-оксисукцинимидный эфир №трет-бутилоксикарбонил-(у- бензил)глутаминовой кислоты (I).
№трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовую кислоту ΒΟί.'-Ο1ιι(ΟΒζ1)-ΟΗ (33,7 г, 0,1 моль) растворяли в 50 мл Ν,Ν'-диметилформамида, охлаждали до температуры -10°С, добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл Ν,Ν'-диметилформамида и Ν-гидроксисукцинимида (13,0 г, 0,11 моль), в 20 мл Ν,Ν'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую Ν,Ν'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.
2) ΒΟ^61π(ΟΒζ1)-Αδρ(ΟΒζ1)-ΟΗ, №трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-ф- бензил)аспартат (II).
(в-Бензил)аспарагиновую кислоту Η-Ακρ(ΟΒζ1)-ΟΗ (28,0 г, 0,12 моль) и 36 мл (0,12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл Ν,Ν'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли порциями раствор активированного эфира В0С-61и(0Βζ1)-0δи (I), полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0,5н. серной кислотой до рН 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4x50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0,5н. Η23Ο4 3x50 мл, водой 2x50 мл, 5% раствором NаΗСΟз 2x50 мл, водой 2x50 мл, насыщенным раствором №1С1 2x50 мл. Органический слой сушили над №28Ο4, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Получено 50 г продукта (92%).
К.(=0,34 (бензол-ацетон 2:1).
3) ΤΡΑ Η-Ο1ιι(ΟΒζ1)-Αφ(ΟΒζ1)-ΟΗ (III), трифторацетат (у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартата.
№трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартат (I) 5,68 г (»0,01 моль) растворяли в 20 мл смеси дихлорметан-трифторуксусная кислота (3:1). Через 2 ч растворитель упаривали в вакууме при температуре 40°С, упаривание повторяли с новой порцией дихлорметана (2x10 мл), остаток сушили в вакууме над ΝηΟΗ. Получили масло 5,80 г (»100%).
В(=0,63 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).
4) Ζ-Α1;·ι-Ο1ιι(ΟΒζ1)-Α5ρ(ΟΒζ1)-ΟΗ (IV), №бензилоксикарбонилаланил-(у-бензил)глутамил-ф- бензил)аспартат.
Трифторацетат (у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартата (II) 5,65 г (0,01 моль) растворяли в 10 мл диметилформамида, добавляли триэтиламин 2,80 мл (0,02 моль) и Ν-оксисукцинимидный эфир Ν-карбобензоксиаланина 4,14 г (0,013 моль). Смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре.
Продукт высаживали 0,5н. раствором серной кислоты (150 мл), экстрагировали в этилацетат (3x30 мл), промывали 0,5н. раствором серной кислоты (2x20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1x20 мл), водой, 0,5н. раствором серной кислоты (2x20 мл), водой и сушили над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтровали, упаривали в вакууме при температуре 40°С, остаток закристаллизовывали в системе этилацетат/гексан. Продукт отфильтровывали и сушили в вакууме над Р2О5.
Выход 4,10 г (66%). Тпл.=154°С.
К.£ =0,48 (бензол-ацетон, 1:1), К.(=0,72 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).
5) Η-ΑΠ-Ο^-Αδρ-ΟΗ, аланил-глутамил-аспартат.
Защищенный трипептид (IV) 1,1 г растворяли в смеси метиловый спирт-вода (4:1) и гидрировали над катализатором Рб/С (5%) в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над ΚΟΗ и Ρ2Ο5. Кристаллизация из системы вода-метанол.
Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали.
Получено 105 мг чистого препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.
6) Анализ готового препарата.
Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Рйеиотеиех С 18 ΕυΝΑ 4,6x150 мм. Α: 0,1% ΤΡΑ, В: МеСИ; дгаб. Β 0-100% через 10 мин. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества 98,75%.
ТСХ: индивидуален, К.£ =0,75 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ ЗотЫИ, силикагель
- 4 010574
СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).
Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С).
рН 0,01% раствора: 4,17 (потенциометрически).
Удельное оптическое вращение: [а]с 22: -20° (с=1, Н2О), Ро1ата1 А, Саг1 Ζοίδδ 1еиа.
Пример 2. Изучение токсичности пептида Н-А1а-С1и-Акр-ОН.
Общетоксическое действие пептида Н-А1а-С1и-Акр-ОН исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах массой 19-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1, 2, 3, 4 и 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор №С1.
Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 64 белых беспородных крысахсамцах массой 180-220 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,1 и 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор ИаС1. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата, у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 90 морских свинках-самцах массой 270-300 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно пептид в течение 6 месяцев в дозах 1 мкг/кг, 0,1 и 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор №1С1 в том же объеме.
У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.
Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании влияния пептида на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок достоверного изменения показателей через 3 и 6 месяцев после введения пептида не выявлено (табл. 1).
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.
Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую пептид Н-А1а-С1и-Акр-ОН в качестве активного начала, для проведения клинических испытаний.
Пример 3. Влияние пептида Н-А1а-С1и-Акр-ОН на структурно-функциональную организацию кальцитонин-продуцирующих клеток щитовидной железы эпифизэктомированных крыс.
Работа выполнена на 23 крысах самцах линии Вистар с массой тела 130-140 г. У животных был удален эпифиз. Операция эпифизэктомии проводилась под эфирным наркозом по разработанной методике.
Животным подопытной группы через три недели после операции (на 21 сутки) в течение последующих 10 дней подкожно вводили пептид Н-А1а-С1и-Акр-ОН в дозе 0,5 мкг на крысу в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №1С1. Эпифизэктомированным крысам контрольной группы и здоровым животным по аналогичной схеме вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.
Умерщвление животных и выделение щитовидной железы проводили утром с 10 до 12 ч при естественном освещении под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Часть эпифизэктомированных крыс подопытной и контрольной групп забивали через 3 суток после окончания инъекций (на 33 сутки после операции и начала опыта), а часть животных - через 12 суток (на 42 сутки после эпифизэктомии).
Кусочки щитовидной железы фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для светомикроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. Для анализа кальци
- 5 010574 тонин-иммунопозитивных клеток (С-клеток) в щитовидной железе использовали показатель объемной доли (рСа), количественной (ЫСа/1мм2) и оптической плотности (ОрЭСа).
Установлено, что у животных контрольной группы через 1 месяц после эпифизэктомии щитовидная железа в основном сохраняет структурные особенности. Вместе с тем количество коллоида в фолликулах уменьшается, а митотическая активность в фолликулярном эпителии усиливается. Количество С-клеток по сравнению с интактными животными возрастает на 24% и составляет 3012±172 на 1 мм2. Количественная плотность С-клеток через 1,5 месяца после эпифизэктомии возрастает более чем на 50% по отношению к интактным животным, достигая 3668±158 клеток на 1 мм2 (табл. 2). Через 1 месяц после эпифизэктомии содержание С-клеток в щитовидной железе животных подопытной группы, получавших пептид Н-А1а-С1и-А§р-ОН, также имеет особенности, которые сводятся к достоверному сокращению их числа по отношению к контролю на 35%. Содержание С-клеток в щитовидной железе через 1,5 месяца после эпифизэктомии (12 дней после окончания введения пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН) полностью нормализуется и практически не отличается от контроля, составляя 2346±162 на 1 мм2. Количественная плотность С-клеток на данном этапе значительно отличается от результатов, полученных в контрольной группе, где этот показатель составлял 3668±158 на 1 мм2, т.е. более чем на 50% превышает контрольные значения (табл. 2).
Результаты исследований функциональной морфологии щитовидной железы эпифизэктомированных крыс подопытной группы в условиях действия пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН демонстрируют его стимулирующее влияние на тканевой и клеточный метаболизм. Введение пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН оказывает компенсаторный эффект на структурно-функциональную организацию клеток щитовидной железы эпифизэктомированных животных. Его действие проявляется через 3 суток после окончания введения пептида полным нивелированием эффекта эпифизэктомии и сохраняется через 12 суток, т. е. до окончания эксперимента.
Увеличение количества и усиление функции С-клеток щитовидной железы под действием пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН свидетельствует о важной компенсаторной роли пептида в регуляции обмена кальция и повышении его резорбции костной тканью, что имеет большое значение в профилактике и лечении остеопороза различной этиологии.
Пример 4. Влияние пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН на развитие эксплантатов хрящевой ткани.
Эксперименты проведены на 28 фрагментах хрящевой ткани проксимальной головки бедренной кости крыс линии Вистар с массой тела 160-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты хрящевой ткани помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид Н-А1а-С1и-А§р-ОН до конечных концентраций 1, 10, 100, 200 и 400 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента хрящевой ткани. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.
На фигуре показано влияние пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН на развитие эксплантатов хрящевой ткани.
Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 26%, по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов хрящевой ткани на более длительных сроках культивирования (7 дней) были выявлено аналогичное стимулирующее действие пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН в той же концентрации.
Таким образом, в отношении хрящевой ткани пептид Н-А1а-С1и-А§р-ОН оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.
Пример 5. Эффективность применения пептида Н-А1а-С1и-А§р-ОН у больных с остеоартрозом коленных суставов.
Исследование проведено на 29 больных в возрасте 52-72 лет с остеоартрозом коленных суставов. Больные предъявляли жалобы на боли и ограничение сгибания и разгибания в суставах при ходьбе. У лиц старшей возрастной группы характерными признаками были деформация суставов, атрофия бедренных мышц и ослабление связочного аппарата суставов. Продолжительность течения заболевания составляла от 5 до 20 лет, отмечалась прогрессирующая динамика развития патологического процесса. Все больные ранее длительное время получали анальгетики и противовоспалительные средства, применение которых вызывало кратковременный терапевтический эффект, требующий увеличения дозы препаратов на курс лечения и продолжительного их приема.
Больные были рандомизированно разделены на 2 группы.
Больных основной группы разделили на 3 подгруппы по возрасту и степени выраженности деформации суставов. Больным основной группы в возрасте старше 65 лет с наиболее выраженной деформаци
- 6 010574 ей суставов и ограничением движений вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 5,0 мг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №101 в течение 20 дней. Больным основной группы в возрасте 60-65 лет с деформацией суставов средней степени вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 10,0 мкг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора №С1 в течение 20 дней. Больным основной группы в возрасте от 52 до 60 лет с начальной стадией развития заболевания, выражавшейся в болезненности суставов и некотором ограничении движений в суставах в период обострения заболевания, вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид Н-Л1а-О1и-Л8р-ОН, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 1,0 мкг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора ΝαΟΊ в течение 20 дней.
Контрольная группа включала 12 пациентов, получавших инъекции стерильного физиологического раствора по аналогичной схеме.
Эффективность применения фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН, у больных оценивали по динамике клинических показателей и данных рентгенологического исследования.
Необходимо отметить, что рентгенологические симптомы дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов являются не только объективными диагностическими критериями стадии развития патологического процесса, но и имеют большую прогностическую значимость при проводимой лекарственной терапии.
Установлено, что применение пептида Н-Л1а-О1и-Л8р-ОН у больных с остеоартрозом коленных суставов всех подгрупп способствовало снижению болевого синдрома и увеличению подвижности суставов в 54,5-62,7% случаев в зависимости от тяжести заболевания. При этом наиболее полно болевая симптоматика исчезала на рентгенологически определяемых начальных стадиях заболевания: сужение суставной щели между надколенником и бедром, латеральные остеофиты надколенника и мыщелка бедра. Существенной динамики рентгенологических симптомов в этот период не наблюдалось.
У больных в развернутой стадии артроза также наблюдалась аналогичная динамика субъективных показателей, но менее выраженная, поскольку на этой стадии заболевания требуется длительное комплексное лечение. Так как эта стадия заболевания была диагностирована у лиц более старшей возрастной группы, то положительная динамика субъективных показателей характеризовалась как очень благоприятная.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что лечебная эффективность фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН, основана на нормализации метаболизма и замедлении инволюционных изменений в костной и хрящевой тканях коленных суставов за счет улучшения трофики их клеток.
Таким образом, фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала эффективное количество пептида Н-Л1а-С1и-Л8р-ОН, целесообразно применять с лечебной или профилактической целью, в том числе в сочетании с любыми средствами симптоматической и патогенетической терапии, используемыми для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, используя различные дозировки фармацевтической композиции от 5 мг до 1 мкг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора ЫаС1 в зависимости от возраста пациента и степени выраженности патологического процесса в суставах и позвоночнике.
The invention relates to medicines for the prevention and treatment of diseases of the musculoskeletal system, in particular degenerative-dystrophic diseases of the joints and spine, and can be used as a means of normalizing metabolism in bone and cartilage tissues.
It is known that degenerative-dystrophic diseases of the musculoskeletal system, as well as osteoporosis of the bone tissue are the most common pathology.
A wide range of drugs is used to treat these diseases, depending on the clinical manifestations of the disease, the age of the patient and the method of application.
Thus, for the treatment of osteoporosis, various calcium preparations, vitamins of group Ό and hormonal preparations (for women) are used.
Drug therapy of degenerative-dystrophic diseases of the joints and spine includes the use of various drugs of symptomatic and pathogenetic action: analgesics and anti-inflammatory drugs (analgin, novocainic blockade, reopyrin, indomethacin, brufen); antihistamines (diphenhydramine, pipolfen); drugs that improve peripheral circulation (pahikarpin, platifillin); biostimulants (rumalon, aloe, vitreous body, ATP); enzyme preparations (lidaza, ronidaza); anabolic steroids (nerabol, retabolil).
In addition, drugs that affect the metabolism in cartilage tissue are known: glucosamine, chondroitin sodium sulfate (The Great Russian Encyclopedia of Medicines. M .: Remedium, 2002, vol. 1, p. 230-232).
However, most of the listed groups of drugs are incompatible with other drugs, cause negative side effects, which narrows the range of indications and limits their use.
Given the prevalence of diseases of the musculoskeletal system in different age groups, as well as their social significance, the development of new drugs that affect the metabolism in bone, cartilage and connective tissues is currently relevant.
The prior art discloses an alanyl-glutamyl-aspartic acid peptide of the general formula: H-L1a-61i-L8r-OH (registration number ΚΝ-85806-95-7; 1Shr: // 51p \ tsb.Ph-kag15gi11.bs).
In an experimental study of the peptide alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-L1a-C1i-L8r-OH, its previously unknown biological activity was revealed, which is manifested in the normalization of metabolism in bone and cartilage tissues.
The present invention posed and solved the problem of obtaining funds peptide nature, with biological activity, manifested in the normalization of metabolism in bone and cartilage tissues and pharmaceutical compositions containing this peptide as an active principle, as well as its method of application.
The technical result of the invention consists in the manifestation of the peptide alanyl-glutamyl aspartic acid of the general formula: H-L1a-S1i-L8r-OH of biological activity, manifested in the normalization of metabolism in bone and cartilage tissues, as well as containing as active principle this peptide pharmaceutical composition helps to increase the number and enhance the function of calcitonin-producing cells of the thyroid gland, improves trophism of bone and cartilage cells and thus normalizes metabolites zm in bone and cartilage tissues.
The possibility of an objective manifestation of the technical result when using the invention is confirmed by reliable data given in the examples, containing experimental information obtained in the process of conducting research according to the methods adopted in this field.
To solve the problem and achieve the technical result proposed a group of inventions, united by a common inventive concept.
The present invention relates to the peptide alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-L1a-C1i-L8p-OH sequence 1 | 8EC ΙΌ N0: 1], which has biological activity, manifested in the normalization of metabolism in bone and cartilage tissues.
It is also proposed the use of the peptide alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-L1a-C1i-L8p-OH sequence 1 | 8EC ΙΌ NO: 1] for the preparation of a drug that normalizes metabolism in bone and cartilage tissues.
Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition, normalizing metabolism in bone and cartilage tissues, containing, as active principle, an effective amount of peptide alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-L1a-C1i-L8p-OH sequence 1 | 8E0 ΙΌ NO: 1 ] and a pharmaceutically acceptable carrier.
While the pharmaceutical composition is in a form suitable for parenteral administration.
A further aspect of the present invention concerns a method for the prevention and treatment of diseases of the musculoskeletal system by normalizing metabolism in bone and cartilage tissues, which consists in administering to a patient a pharmaceutical composition containing as active
- 1 010574 peaks alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-A1a-61i-A8p-0H sequences 1 | 5> EO W N0: 1] in a dose of 0.01-100 mg / kg body weight at least one once a day for the period necessary to achieve a therapeutic effect.
The introduction is carried out intramuscularly.
The peptide alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-Ala-61i-A8p-OH is obtained by the classical method of peptide synthesis in solution.
The study of biological activity was carried out in an experiment on epiphysectomized rats, on cartilage tissue explants and in patients with degenerative-dystrophic diseases of the joints.
The concept of "pharmaceutical composition" refers to various dosage forms containing the peptide H-Ala-01ts-A8p-0H, which may find therapeutic use in medicine as a means of normalizing metabolism in bone and cartilage tissues.
To obtain the pharmaceutical compositions of the invention, an effective amount of peptide H-Ala-01i-A8p-0H, as an active principle, is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier according to the compounding methods used in pharmaceuticals.
The concept of an effective amount implies the use of such an amount of active principle that, in accordance with its quantitative indicators of activity and toxicity, and also on the basis of the knowledge of a specialist, must be effective in a given dosage form.
The carrier may have various forms that depend on the dosage form of the preparation desired for administration to the body.
For parenteral administration, the carrier will usually include saline or sterile water, although other ingredients may be included to promote stability or to maintain sterility.
The invention is illustrated by tables and figure.
In tab. 1 shows the effect of peptide H-A1A-01i-A8p-0H on the morphological and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs in the study of toxicity.
In tab. 2 shows the effect of the peptide H-A1A-01i-A8p-0H on the quantitative characteristics of the parameters studied in the thyroid gland according to the computer analysis of microscopic images.
Table 1
- 2 010574
table 2
* P <0.05 compared with intact animals;
** P <0.05 compared with the control animals.
The figure shows the effect of the peptide H-L1a-C1i-L8p-OH on the development of cartilage explants.
The invention is illustrated by an example of the synthesis of the peptide alanyl-glutamyl-aspartic acid of the general formula: H-L1a-C1i-L8r-OH (example 1), examples of testing the toxicity and biological activity of the peptide (examples 2-4), as well as an example of the results of the clinical use of the peptide, confirming its pharmacological properties and the possibility of achieving a prophylactic and / or therapeutic effect (example 5).
Example 1. Synthesis of peptide H-L1a-Cli-L8p-OH.
1. Connection name: alanyl-glutamyl-aspartic acid.
2. Structural formula: H-L1a-C1i-L8r-OH
3. Gross formula without counterion: C 12 H 1 9IzO 8 .
4. Molecular weight without counterion: 333.29.
5. Counterion: acetate.
6. Appearance: odorless white amorphous powder.
7. Method of synthesis: the peptide obtained by the classical method of synthesis in solution according to the scheme:
BOC-С1и (ОВг1) -ОН
BUT
OSS
BOC-С1и (ОВг1) -О8и
Η-Α5ρ (ΟΒζ1) -ΟΗ
V
BOC-O1i (0Bg1) -A8 P (0B 2 1> OH
1) TPA
2) Mr.Ala-O8i
Ζ-Α13-01ιι (0Βζ1) -Α8ρ (0Βζ1) -0Η ϋ / Ρί
N-A1A-S1i-Azr-ON
BOC - tert-butyloxycarbonyl group
Ζ - benzyloxycarbonyl group,
O8i - Ν-oxysuccinimide ester,
- 3 010574
OSS - Ν, Ν'-dicyclohexylcarbodiimide,
ΟΒζΙ - benzyl ether,
ΤΡΑ - trifluoroacetic acid.
Characteristics of the finished product:
content of the main substance: 98.75% (by HPLC, 220 nm),
TLC - is individual,
K. (= 0.75 (acetonitrile-water 1: 3), moisture content: 6%, pH of 0.01% solution: 4.17, specific optical rotation: [α] Ό 22 : -20 ° (c = 1 , H 2 O), Ro1ata1 A, Cag1 Ζοίδδ 1ia.
An example of synthesis.
1) .'- Ο1ιι (ΟΒζ1) -Ο5> ιι. N-oxysuccinimide ester of tert-butyloxycarbonyl- (y-benzyl) glutamic acid (I).
Terti-butyloxycarbonyl- (y-benzyl) glutamic acid ΒΟί .'- Ο1ιι (ΟΒζ1) -ΟΗ (33.7 g, 0.1 mol) was dissolved in 50 ml of, Ν'-dimethylformamide, cooled to -10 ° C, added with stirring cooled (4-6 ° C) solutions of Ν, Ν'-dicyclohexylcarbodiimide (23.0 g, 0.11 mol) in 30 ml of, Ν'-dimethylformamide and Ν-hydroxysuccinimide (13.0 g, 0.11 mol), in 20 ml of, Ν'-dimethylformamide. The reaction mixture was stirred for 12 hours while cooling with ice and then for 1 day at room temperature. The precipitated Ν, Ν'-dicyclohexyl urea was filtered off and the resulting solution of activated ester was used without isolation in the next step.
2) ΒΟ ^ 61π (ΟΒζ1) -Αδρ (ΟΒζ1) -ΟΗ, no. Tert-butyloxycarbonyl- (y-benzyl) glutamyl-f-benzyl) aspartate (II).
(v-Benzyl) aspartic acid Η-Ακρ (ΟΒζ1) -ΟΗ (28.0 g, 0.12 mol) and 36 ml (0.12 mol) of triethylamine were suspended in 50 ml of, Ν'-dimethylformamide and stirred for 1 h. Then a solution of activated B0C-61i (0-1) -0δi (I) obtained in the previous step was added in portions. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days. Then acidified with 0.5N. sulfuric acid to pH 2-3 and extracted with ethyl acetate 4x50 ml. The hoods were combined and sequentially washed with 0.5N. Η 2 3Ο 4 3x50 ml, water 2x50 ml, 5% NaΗSΟz solution 2x50 ml, water 2x50 ml, saturated solution №1С1 2x50 ml. The organic layer was dried over No. 2 8Ο4, the solvent was evaporated in vacuo, the residue was crystallized under hexane. Received 50 g of the product (92%).
K. (= 0.34 (benzene-acetone 2: 1).
3) ΤΡΑ Η-Ο1ιι (1) -Αφ (ΟΒζ1) -ΟΗ (III), trifluoroacetate (y-benzyl) glutamyl- (v-benzyl) aspartate.
Tertiary butyloxycarbonyl- (y-benzyl) glutamyl- (δ-benzyl) aspartate (I) 5.68 g (≈0.01 mol) was dissolved in 20 ml of a mixture of dichloromethane-trifluoroacetic acid (3: 1). After 2 h, the solvent was evaporated in vacuum at 40 ° C, evaporation was repeated with a new portion of dichloromethane (2x10 ml), the residue was dried in vacuum over ΝηΟΗ. Got oil 5.80 g ("100%).
B (= 0.63 (n-butanol-pyridine-acetic acid-water, 15: 10: 3: 12).
4)-Α1; · ι-Ο1ιι (ΟΒζ1) -Α5ρ (ΟΒζ1) -ΟΗ (IV), No. of benzyloxycarbonylanyl- (y-benzyl) glutamyl-f-benzyl) aspartate.
Trifluoroacetate (y-benzyl) glutamyl- (b-benzyl) aspartate (II) 5.65 g (0.01 mol) was dissolved in 10 ml of dimethylformamide, triethylamine 2.80 ml (0.02 mol) and Ν-hydroxysuccinimide ester were added Карб-carbobenzoxy alanine 4.14 g (0.013 mol). The mixture was stirred for 24 hours at room temperature.
The product was planted 0,5n. solution of sulfuric acid (150 ml), was extracted into ethyl acetate (3x30 ml), washed with 0.5N. solution of sulfuric acid (2x20 ml), water, 5% sodium bicarbonate solution (1x20 ml), water, 0.5n. solution of sulfuric acid (2x20 ml), water and dried over anhydrous sodium sulfate. Ethyl acetate was filtered, evaporated in vacuum at 40 ° C, the residue was crystallized in an ethyl acetate / hexane system. The product was filtered and dried in vacuo over P 2 O 5 .
Yield 4.10 g (66%). Mp = 154 ° C.
K. £ = 0.48 (benzene-acetone, 1: 1), K. (= 0.72 (n-butanol-pyridine-acetic acid-water, 15: 10: 3: 12).
5) Η-ΑΠ-Ο ^ -Αδρ-ΟΗ, alanyl-glutamyl-aspartate.
Protected Tripeptide (IV) 1.1 g was dissolved in methyl alcohol – water (4: 1) and hydrogenated over the Rb / C catalyst (5%) for 4 h. The catalyst was filtered, the solvent was evaporated in vacuo, the residue was dried in a vacuum ΚΟΗ and Ρ 2 Ο 5 . Crystallization from water-methanol system.
Finally, the residue was dissolved in 20 ml of deionized water and lyophilized.
Received 105 mg of pure product in the form of an odorless amorphous white powder.
6) Analysis of the finished product.
The content of the main substance was determined by the HPLC method on a C 18 ех υ ΝΑ 4.6 x 150 mm column. Α: 0.1% ΤΡΑ, B: MeSI; dgab Β 0-100% after 10 min. Flow rate 1 ml / min. Detection at 220 nm, scanning 190-600 nm, sample 20 μl. Content of the main substance is 98.75%.
TLC: individual, K. £ = 0.75 (acetonitrile-water 1: 3, plates PTSH-P-V-UV ZOTYI, silica gel
- 4 010574
STH-1VE 8-12 microns, the manifestation of chlorine / benzidine).
Moisture content: 6% (gravimetrically by weight loss when drying 20 mg at 100 ° C).
pH 0.01% solution: 4.17 (potentiometrically).
Specific optical rotation: [а] с 22 : -20 ° (с = 1, Н 2 О), Ро1ата1 А, Саг1 Ζοίδ 1.
Example 2. The study of the toxicity of the peptide H-A1A-CII-Acre-OH.
The general toxic effect of peptide H-A1A-C1i-Acre-OH was investigated in accordance with the requirements of the “Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances” (2000): acute toxicity after a single injection of the drug, as well as subacute and chronic toxicity with a long-term administration of peptide .
The study of acute toxicity was carried out on 66 white outbred mice-males weighing 19-22 g. The animals were randomly divided into 6 equal groups. The drug was administered to animals once intramuscularly in doses of 1, 2, 3, 4 and 5 mg / kg in 0.25 ml of sterile 0.9% Iacl solution. Animals of the control group in the same volume were injected with 0.9% solution No. С1.
Studies on subacute toxicity were carried out on 64 white outbred male rats weighing 180-220 g. Daily, once a day, animals of the experimental groups were injected intramuscularly for 90 days at doses of 1 μg / kg, 0.1 and 1 mg / kg in 0.5 ml of sterile 0.9% Iac1 solution. Control animals were injected in the same volume with sterile 0.9% Iacl solution. Before the introduction of the drug, on days 30, 60, and 90 after the start of drug administration, the animals studied the morphological composition and properties of peripheral blood. At the end of the experiment, biochemical and coagulological blood parameters were investigated.
Studies on chronic toxicity were performed for 6 months, based on the duration of the recommended clinical use of the drug, on 90 guinea pigs weighing 270-300 g. Animals of the experimental groups received a single intramuscular peptide daily for 6 months at doses of 1 μg / kg, 0.1 and 1 mg / kg in 0.5 ml of sterile 0.9% IaC1 solution. In the control group, animals were injected in a similar way with a sterile 0.9% solution №1С1 in the same volume.
In animals in the peripheral blood, the number of erythrocytes, hemoglobin, reticulocytes, platelets, leukocytes, leukocyte formula, erythrocyte sedimentation rate (ESR), erythrocyte resistance were determined using standard methods. Along with this, the content of total protein in serum was determined by the method of Lowry, potassium and sodium by plasma spectrophotometry. After the experiment was completed, a pathological study of the brain and spinal cord, spinal ganglia, thyroid gland, parathyroid glands, adrenal glands, testicles, pituitary, heart, lungs, aorta, liver, kidney, bladder, pancreas, stomach, small intestine, colon was performed. intestine, thymus, spleen, lymph nodes, bone marrow.
In the study of acute toxicity, it was established that a single injection of the tested peptide to animals at a dose exceeding the therapeutic one recommended for clinical use more than 5000 times does not cause toxic reactions, which indicates a large therapeutic breadth of the drug.
The study of the subacute and chronic toxicity of the peptide indicates the absence of side effects with prolonged use of the drug in doses exceeding therapeutic 100-1000 times. When studying the effect of the peptide on the morphological composition and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs, no significant changes in the indices after 3 and 6 months after administration of the peptide were detected (Table 1).
When assessing the general condition of animals, morphological and biochemical parameters of peripheral blood, the morphological state of the internal organs, the state of the cardiovascular and respiratory systems, liver and kidney functions, no pathological changes were found in the body.
The absence of a general toxic effect makes it possible to recommend a pharmaceutical composition containing the peptide H-Ala-Ci-Acre-OH as an active principle for conducting clinical trials.
Example 3. The effect of peptide H-A1A-CII-ACP-OH on the structural and functional organization of calcitonin-producing thyroid gland cells of epiphisectomized rats.
The work was performed on 23 rats of Wistar male rats weighing 130-140 g. The epiphysis was removed from the animals. The operation of epiphysectomy was performed under ether anesthesia according to the developed technique.
Three weeks after surgery (on day 21), peptide H-A1a-C1i-Acre-OH was administered subcutaneously to animals of the experimental group at a dose of 0.5 μg per rat in 0.5 ml of a sterile 0.9% physiological solution №1С1. An epiphysectomized rats of the control group and healthy animals were injected using a similar scheme with sterile saline in the same volume.
The killing of animals and the secretion of the thyroid gland were carried out in the morning from 10 to 12 hours with natural light under Nembutal anesthesia (50 mg / kg). Part of the epiphysectomized rats of the experimental and control groups were scored 3 days after the end of the injections (33 days after the operation and the beginning of the experiment), and some of the animals 12 days later (42 days after the epiphysectomy).
Pieces of the thyroid gland were fixed for 24 hours with Buen’s acidic liquid for light microscopy studies and according to Karnovsky for electron microscopy. For calcium analysis
- 5 010574 tonin-immunopositive cells (C-cells) in the thyroid gland used an indicator of the volume fraction (p Ca ), quantitative (L Ca / 1 mm 2 ) and optical density (OER Ca ).
It was established that in animals of the control group, 1 month after epiphysectomy, the thyroid gland basically retains its structural features. At the same time, the number of colloids in the follicles decreases, and the mitotic activity in the follicular epithelium increases. The number of C-cells in comparison with intact animals increases by 24% and is 3012 ± 172 per 1 mm 2 . The quantitative density of C-cells after 1.5 months after epiphysectomy increases by more than 50% relative to intact animals, reaching 3,668 ± 158 cells per 1 mm 2 (Table 2). After 1 month after epiphysectomy, the content of C-cells in the thyroid gland of animals of the experimental group that received the peptide H-Ala-Clu-Agp-OH, also has features that boil down to a significant reduction in their number relative to the control by 35%. The content of C-cells in the thyroid gland 1.5 months after epiphysectomy (12 days after the end of the administration of the peptide H-A1a-C1i-Agr-OH) completely normalizes and practically does not differ from the control, being 2346 ± 162 per 1 mm 2 . The quantitative density of C-cells at this stage differs significantly from the results obtained in the control group, where this indicator was 3,668 ± 158 per 1 mm 2 , i.e. more than 50% higher than control values (Table 2).
The results of studies of the functional morphology of the thyroid gland in epiphysectomized rats of the experimental group under the conditions of action of the peptide H-Ala-Clu-Agp-OH demonstrate its stimulating effect on tissue and cell metabolism. The introduction of the peptide H-A1A-C1I-A2r-OH has a compensatory effect on the structural and functional organization of the thyroid cells of epiphisectomized animals. Its effect is manifested 3 days after the end of the introduction of the peptide by complete leveling of the effect of epiphysectomy and lasts 12 days, that is, until the end of the experiment.
The increase in the number and enhancement of the function of C-cells of the thyroid gland under the action of peptide H-A1A-C1I-A2r-OH indicates an important compensatory role of the peptide in regulating calcium metabolism and increasing its bone resorption, which is of great importance in the prevention and treatment of osteoporosis different etiology.
Example 4. The effect of peptide H-A1A-CII-AGP-ON on the development of explants of cartilage tissue.
The experiments were carried out on 28 cartilage fragments of the proximal femoral head femur of Wistar rats weighing 160-200 g. Nutrient medium for cultivation of explants consisted of 35% Eagle solution, 25% fetal calf serum, 35% Hanks solution, 5% chicken embryonic extract , glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml), penicillin (100 units / ml), glutamine (2 mM) were added to the medium. Fragments of cartilage tissue were placed in this medium and cultured in Petri dishes in an incubator at a temperature of 36.7 ° C for 2 days. Peptide H-Ala-Cli-Agr-OH to final concentrations of 1, 10, 100, 200 and 400 ng / ml was added to the experimental medium. The criterion of biological activity was the area index (PI) - the ratio of the area of the total explant, together with the growth zone to the outgoing area of the cartilage fragment. The values of PI were expressed in percent, the reference value of PI was taken as 100%.
The figure shows the effect of the peptide H-A1a-C1i-Agr-OH on the development of cartilage explants.
It was established that after 1 day of cultivation, the explants spread on the collagen substrate and the proliferating and migrating cells began to evict on the periphery of the explant. On the 3rd day of cultivation, when the concentration of peptide H-A1a-C1i-Agr-OH 100 ng / ml, there was a significant increase in the explant IP by 26%, compared with the control values of PI. In the study of cartilage tissue explants at longer cultivation periods (7 days), a similar stimulating effect of the peptide H-A1a-C1i-And Arg-OH at the same concentration was found.
Thus, in relation to the cartilage tissue, the peptide H-A1a-C1i-Agr-OH had a tissue-specific effect, manifested in the stimulation of the growth of explants.
Example 5. The effectiveness of the use of peptide H-A1A-CII-A2P-HE in patients with osteoarthritis of the knee joints.
The study was conducted on 29 patients aged 52-72 years with osteoarthritis of the knee joints. Patients complained of pain and limitation of flexion and extension in the joints when walking. In older people, deformities of the joints, atrophy of the femoral muscles and weakening of the ligaments of the joints were characteristic signs. The duration of the disease ranged from 5 to 20 years, there was a progressive dynamics of the development of the pathological process. All patients had for a long time received analgesics and anti-inflammatory drugs, the use of which caused a short-term therapeutic effect, requiring an increase in the dose of drugs for the course of treatment and their prolonged use.
Patients were randomly divided into 2 groups.
Patients of the main group were divided into 3 subgroups according to age and degree of joint deformity. Patients of the main group over the age of 65 years with the most severe deformity
- 6 010574 her joints and movement restriction was injected pharmaceutical composition containing the peptide H-L1a-S1i-L8r-OH daily daily intramuscularly at a dose of 5.0 mg in 1 ml of sterile physiological 0.9% solution No. 101 for 20 days. Pharmaceutical composition containing peptide H-L1a-C1i-L8p-OH daily once intramuscularly at a dose of 10.0 μg in 1 ml of sterile physiological 0.9% solution was administered to patients of the main group aged 60-65 years with deformation of joints of moderate degree. C1 for 20 days. Patients of the main group aged 52 to 60 years old with the initial stage of disease development, expressed in joint pain and some limitation of movement in the joints during the exacerbation of the disease, were injected with a pharmaceutical composition containing the peptide H-L1a-O1i-L8p-OH daily intramuscularly once at a dose of 1.0 µg in 1 ml of sterile physiological 0.9% ΝαΟΊ solution for 20 days.
The control group included 12 patients who received injections of sterile saline in a similar way.
The effectiveness of the use of a pharmaceutical composition containing the peptide H-L1a-C1i-L8p-OH in patients was assessed by the dynamics of clinical parameters and X-ray data.
It should be noted that the radiological symptoms of degenerative-dystrophic diseases of the joints are not only objective diagnostic criteria for the stage of development of the pathological process, but also have great prognostic significance in the course of drug therapy.
The use of peptide H-L1a-O1i-L8p-OH in patients with osteoarthritis of the knee joints of all subgroups was found to reduce pain and increase joint mobility in 54.5% to 62.7% of cases, depending on the severity of the disease. At the same time, the most painful symptoms disappeared at radiographically determined initial stages of the disease: narrowing of the joint space between the patella and the thigh, lateral osteophytes of the patella and the condyle of the thigh. Significant dynamics of radiological symptoms during this period were not observed.
Patients in the advanced stage of arthrosis also showed a similar dynamics of subjective indicators, but less pronounced, since at this stage of the disease long-term complex treatment is required. Since this stage of the disease was diagnosed in individuals of the older age group, the positive dynamics of subjective indicators were characterized as very favorable.
The results of the study suggest that the therapeutic efficacy of a pharmaceutical composition containing the peptide H-L1a-C1i-L8p-OH is based on the normalization of metabolism and slowing down involutional changes in the bone and cartilage tissues of the knee joints by improving the trophism of their cells.
Thus, a pharmaceutical composition containing, as active principle, an effective amount of the peptide H-L1a-C1i-L8p-OH, is advisable to be used for therapeutic or prophylactic purposes, including in combination with any means of symptomatic and pathogenetic therapy used to treat degenerative dystrophic diseases of the joints and spinal column using various dosages of the pharmaceutical composition from 5 mg to 1 μg in 1 ml of sterile physiological 0.9% NaCl solution depending on the age of the patient and Degree of severity of the pathological process in the joints and spine.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006118497/15A RU2299741C1 (en) | 2006-05-30 | 2006-05-30 | Peptide normalizing metabolism in osseous and cartilage tissue, pharmaceutical composition based on thereof and method for its using |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700176A1 EA200700176A1 (en) | 2007-12-28 |
| EA010574B1 true EA010574B1 (en) | 2008-10-30 |
Family
ID=38310627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700176A EA010574B1 (en) | 2006-05-30 | 2007-01-29 | Peptide normalizing netabolism in bone and cartilaginous tissues, pharmaceutical composition based thereon and method for use thereof |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA010574B1 (en) |
| RU (1) | RU2299741C1 (en) |
| WO (1) | WO2007139433A1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496511C1 (en) * | 2012-04-20 | 2013-10-27 | Замертон Холдингс Лимитед | Pharmaceutical composition, agent (versions) and method of preventing and treating arthritis, osteoarthrosis and vertebral osteochondrosis (versions) |
| EA201201417A1 (en) * | 2012-11-15 | 2013-09-30 | Замертон Холдингс Лимитед | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF THE PROSTATE HYPERPLASIA, ITS APPLICATION FOR THE TREATMENT OF THE PROSTATE HYPERPLASIA AND THE METHOD OF TREATING THE PROSTATE HYPERPLASIA |
| RU2521973C1 (en) * | 2013-08-23 | 2014-07-10 | Замертон Холдингс Лимитед | Method for preventing and treating arthropathies and methods for using same |
| EA025549B1 (en) | 2014-09-09 | 2017-01-30 | Замертон Холдингс Лимитед | Composition and agents for prevention and treatment of diseases of the joints and the spine, and methods of their application |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2271825C2 (en) * | 1999-07-21 | 2006-03-20 | Омерос Корпорейшн | Solutions and methods for inhibiting pain, cartilage inflammation and destruction |
-
2006
- 2006-05-30 RU RU2006118497/15A patent/RU2299741C1/en active
-
2007
- 2007-01-29 EA EA200700176A patent/EA010574B1/en not_active IP Right Cessation
- 2007-02-05 WO PCT/RU2007/000054 patent/WO2007139433A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2271825C2 (en) * | 1999-07-21 | 2006-03-20 | Омерос Корпорейшн | Solutions and methods for inhibiting pain, cartilage inflammation and destruction |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Maehashi Kenji et al. "Isolation of peptides from an enzymic hydrolyzate of food proteines and characterization of their taste properties. Bioscience, Biotechnology, and Biotechemistry, 1999, 63 (3), 555-559, (referat) [on-layn]. Naydeno iz STN on the web RN 85806-95-7, [CA: 131:43862] * |
| Mckeown, L.P. et al. "Glycoprotein Ib peptides inhibit thrombin and SFLLRN-induced platelet aggregation. "Journal of Laboratory and Clinical Medicine", 1996, 128(5), 492-495, (referat), [on-layn]. Naydeno iz STN on the web RN 85806-95-7, [CA: 126:17100] * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007139433A1 (en) | 2007-12-06 |
| EA200700176A1 (en) | 2007-12-28 |
| WO2007139433A8 (en) | 2009-07-16 |
| RU2299741C1 (en) | 2007-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2139085C1 (en) | Agent stimulating reparative processes and method of its use | |
| US20100016223A1 (en) | Treatment of cartilage disorders with fgf-18 | |
| JP2003526622A (en) | Tetrapeptide having anti-aging effect, pharmacological substance based on the same, and use thereof | |
| JP4708511B2 (en) | Bile-derived immunomodulatory composition | |
| RU2299741C1 (en) | Peptide normalizing metabolism in osseous and cartilage tissue, pharmaceutical composition based on thereof and method for its using | |
| EA010158B1 (en) | Peptide enhancing resistance of capillaries, pharmaceutical composition based thereon and method for use thereof | |
| Radjabovich | The Effect of Antiseptic Stimulant on the Body | |
| CN110721308B (en) | A pharmaceutical compound preparation for treating osteoarthritis and its preparation method | |
| CN102441023B (en) | Injection composition for treating orthopedic diseases | |
| EA010575B1 (en) | Peptide exhibiting immunoprotective action, pharmaceutical composition based thereon amd method for use thereof | |
| RU2569754C2 (en) | Prophylactic medication, and/or therapeutic medication, and/or aggravation-suppressing medication in case of arthritis deformans in humans | |
| JP6897971B2 (en) | Methods and compositions for treating arthritis | |
| CN110694051B (en) | Application of nerve guidance factor Sema in preparation of injection for treating osteoarthritis | |
| Copp | Calcitonin and calcium metabolism. | |
| CN111000986A (en) | Application of irisin in preparing medicine for preventing and treating osteoarthritis | |
| CN110711244A (en) | Application of nerve-targeting factor Sema in preparation of liniment for treating osteoarthritis | |
| EP1353939B1 (en) | Tetrapeptide regulating prostate functions and its compositions and uses | |
| CA2425445C (en) | Tetrapeptide stimulating functional activity of hepatocytes, pharmacological substance on its basis and the method of its application | |
| CN114621323B (en) | Polypeptide compound with skin repairing effect and preparation method and application thereof | |
| RU2303454C1 (en) | Preparation for normalizing female reproductive function and method for its obtaining | |
| RU2297239C1 (en) | Peptide stimulating regeneration of liver tissue, pharmaceutical composition based on thereof and method for its using | |
| US5948442A (en) | Stimulating ENTEROGENIN compositions and methods for their isolation and use | |
| RU2302872C9 (en) | Agent normalizing cartilage tissue function and method for its preparing | |
| CN114129565A (en) | Application of histone methyltransferase EZH2 inhibitor in product for promoting bone metabolism into high conversion to repair bone defect | |
| RU2269355C1 (en) | Method for treating rheumatoid arthritis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KG TM |
|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment |