EA007654B1

EA007654B1 - Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases

Info

Publication number: EA007654B1
Application number: EA200500065A
Authority: EA
Inventors: Кристофер Ф. Тумбс
Original assignee: Эмджен Инк.
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2003-06-23
Publication date: 2006-12-29
Also published as: EA200500065A1; RS20050031A

Abstract

A method is provided for the localized intravascular administration of a fibrinolytic metalloproteinase to a human subject in amounts that are both safe and effective to lyse an occluding fibrin-containing blood clot, while also avoiding the neutralizing effects of alpha2-macroglobulin in the circulating blood. A method is also provided for the treatment of a blood clot in, around or attached to an indwelling vascular access device. A method for restoring patency and function of an indwelling vascular access device is also provided.

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Данное изобретение относится к терапевтическому введению фибринолитических металлопротеиназ, и, более конкретно, к способу введения таких средств ίη νίνο путем локализованной доставки к сосудистым тромбам для осуществления лизиса сгустка. Данное изобретение также относится к растворению сгустков крови в стационарном катетере, шунте или другом устройстве сосудистого доступа с целью восстановления функции данного устройства сосудистого доступа.This invention relates to the therapeutic administration of fibrinolytic metalloproteinases, and more specifically, to a method of administering such средствη νίνο means by localized delivery to vascular thrombi to effect clot lysis. This invention also relates to the dissolution of blood clots in a stationary catheter, shunt or other vascular access device in order to restore the function of this vascular access device.

Уровень техникиState of the art

Случаи закупорки сосудов, вызванные сгустками крови, такими как тромбы и эмболы, представляют собой серьезные заболевания, которые без своевременного лечения могут грозить потерей конечности или жизни. Для лечения и удаления сгустков крови в сосудах разработаны устройства и способы. Для иллюстрации см. патент США № 4447236 (Οιιίηη). выданный 8 мая 1984 г.; патент США № 4692139 (8й1е5), выданный 8 сентября 1987 г.; патент США № 4755167 (Т1и511с с1 а1.), выданный 5 июля 1988 г.; патент США № 5167628 (Воу1е8), выданный 1 декабря 1992 г.; патент США № 5222941 (Όοη М1сйае1), выданный 29 июня 1993 г.; патент США № 5250034 (Аррйпд е1 а1.), выданный 5 октября 1993 г; патент США № 5370653 (Сгадд), выданный 6 декабря 1994 г.; патент США № 5380273 (ЭиЬги1 е1 а1.), выданный 10 января 1995 г.; патент США № 5498236 (ИнЬгЫ е1 а1.), выданный 12 марта 1996 г.; патент США № 5626564 (Ζΐιηη е1 а1.), выданный 6 мая 1997 г.; патент США № 5709676 (АЙ), выданный 20 января 1998 г.; патент США № 5865178 (Уоек), выданный 2 февраля 1999 г., и \УО 90/07352 (опубликованную 12 июля 1990 г.). Такие способы и устройства включают в себя инфузионные катетеры для доставки тромболитических и фибринолитических средств к кровяному сгустку и его растворения. Инфузионные катетеры обычно используют совместно с ферментативно активными средствами, которые способны вызывать деградацию фибрина в сгустке и, таким образом, эффективно растворять сгусток. Такие ферменты обычно обозначают как «тромболитические» или «фибринолитические» средства.Vascular blockages caused by blood clots, such as blood clots and emboli, are serious illnesses that can lead to loss of limb or life without timely treatment. Devices and methods have been developed for the treatment and removal of blood clots in blood vessels. See U.S. Patent No. 4,447,236 (Οιιίηη) for illustration. issued May 8, 1984; US patent No. 4692139 (8y1e5), issued September 8, 1987; US patent No. 4755167 (T1i511s s1 a1.), issued July 5, 1988; US patent No. 5167628 (ВУ1е8), issued December 1, 1992; US patent No. 5222941 (29οη M1syaye1), issued June 29, 1993; US patent No. 5250034 (Arripp e1 a1.), issued October 5, 1993; US patent No. 5370653 (Sgadd), issued December 6, 1994; U.S. Patent No. 5,380,273 (EuBi1 e1 a1.), issued January 10, 1995; U.S. Patent No. 5,498,236 (Ingl e1 a1.), issued March 12, 1996; US patent No. 5626564 (Ζΐιηη e1 a1.), issued May 6, 1997; US patent No. 5709676 (AI), issued January 20, 1998; U.S. Patent No. 5865178 (Wauke), issued February 2, 1999, and UO 90/07352 (published July 12, 1990). Such methods and devices include infusion catheters for the delivery of thrombolytic and fibrinolytic agents to a blood clot and its dissolution. Infusion catheters are usually used in conjunction with enzymatically active agents that are capable of causing fibrin degradation in the clot and thus effectively dissolve the clot. Such enzymes are commonly referred to as “thrombolytic” or “fibrinolytic” agents.

Фибролаза представляет собой известную фибринолитическую цинковую металлопротеиназу, которая впервые была выделена из яда южной медноголовой змеи (АдкЩгойоп οοηίοτίπχ οοηΐοήηχ). См. Оиап е1 а1., ЛгеНпе οί ВюсйетЩгу аий Вюрйуыск, Vο1ите 289, ЫитЬег 2, рр. 197-207 (1991); Βηηάο1ρ1ι е1 а1., Рго1еш 8с1спсс, СатЬййде ишуегайу Ргекк (1992), рр. 590-600; заявка на выдачу европейского патента № 0323722 (Vа1еηζие1а е1 а1.), опубликованная 12 июля 1989 г.; и патент США № 4610879 (МагИаМ е1 а1.), выданный 9 сентября 1986 г. Фибролаза, как было показано, является фибринолитиком, и было отмечено, что данная металлопротеиназа характеризуется протеолитической активностью в отношении Λα-цепи фибриногена, со сниженным протеолитическим расщеплением Βα-цепи и отсутствием активности в отношении γ-цепи фибриногена; ЛНтей е1 а1., Ηаетο8ΐа8^8, Vο1ите 20, рр. 147-154 (1990). Поскольку фибрин является главным компонентом кровяных сгустков, фибринолитические свойства фибролазы подчеркивают ее потенциал в качестве средства растворения тромба для тромболитического применения ίη νίνο; см. Магккщй е1 а1., Οκ^Εύοη, Vο1ите 9, ЫитЬег 5, рр. 2448-2456 (1994) и ЛНтей е1 а1. выше.Fibrolase is a well-known fibrinolytic zinc metalloproteinase, which was first isolated from the venom of a southern copper-headed snake (Adnchoscopyon οοηίοτίπχ οοηΐοήηχ). See Oiap e1 a1., LgeNpe οί Vyusyet Shchiy ay Vyryuysk, Vο1ite 289, Exit 2, pp. 197-207 (1991); Βηηάο1ρ1ι e1 a1., Rgo1esh 8s1spss, Satyde ishueguayu Rgekk (1992), pp. 590-600; application for the grant of European patent No. 0323722 (Vа1еηζе1а е1 а1.), published July 12, 1989; and U.S. Patent No. 4,610,879 (MagIaM e1 a1.), issued September 9, 1986. Fibrolase has been shown to be a fibrinolytic, and it was noted that this metalloproteinase is characterized by proteolytic activity against the Λα-chain of fibrinogen, with reduced proteolytic cleavage of Βα- chain and lack of activity against the γ-chain of fibrinogen; LNtei e1 a1., It has 8ΐa8 ^ 8, Vο1ite 20, pp. 147-154 (1990). Since fibrin is the main component of blood clots, the fibrinolytic properties of fibrolase emphasize its potential as a means of dissolving a blood clot for thrombolytic use ίη νίνο; see Mag. e1 a1., Οκ ^ Εύοη, Vο1ite 9, Exit 5, pp. 2448-2456 (1994) and LNtei e1 a1. higher.

Новый действующий тромболитик (ΝΑΤ) представляет сбой модифицированную форму фибролазы, которая отличается от фибролазы тем, что ΝΑΤ содержит 201 аминокислоту с Ν-концевой последовательностью 8РРрВ, в то время как Ν-концевая последовательность нативной фибролазы начинается с ЕОРРРОР и составляет 203 аминокислоты в длину. Ν-концевую модификацию конструировали так, чтобы предотвратить химические реакции аминокислотных остатков, способных образовывать вариабельное количество циклизованного глутамина (пироглутаминовая кислота), что потенциально приводит к вариациям от серии к серии по качеству и единообразию продукта. Таким образом, ΝΑΤ может рассматриваться как более стабильная молекула.The new active thrombolytic (ΝΑΤ) represents a malfunction of the modified form of fibrolase, which differs from fibrolase in that ΝΑΤ contains 201 amino acids with the 8-terminal sequence of 8PPpB, while the Ν-terminal sequence of native fibrolase begins with EORPPOR and is 203 amino acids in length. The Ν-terminal modification was designed to prevent chemical reactions of amino acid residues capable of forming a variable amount of cyclized glutamine (pyroglutamic acid), which potentially leads to variations from series to series in terms of product quality and uniformity. Thus, ΝΑΤ can be considered as a more stable molecule.

Несмотря на данные структурные различия, ΝΑΤ и фибролаза сходны в отношении их ферментативной (фибринолитической) активности. Данное сходство в биологической активности согласуется с данными, указывающими на то, что активный участок фибролазы затрагивает аминокислоты 139-159, как описано Маттд ίη Τοχκοη, УЫите 33, рр. 1189-1200 (1995), и его предсказанное расположение в трехмерном пространстве отдалено от Ν-конца. Активный участок фибролазы и молекул ΝΑΤ содержит атом цинка, который образует комплекс с тремя остатками гистидина.Despite these structural differences, ΝΑΤ and fibrolase are similar in terms of their enzymatic (fibrinolytic) activity. This similarity in biological activity is consistent with data indicating that the active site of fibrolase affects amino acids 139-159, as described by Mattd ίη Τοχκοη, PU 33, pp. 1189-1200 (1995), and its predicted location in three-dimensional space is distant from the Ν-end. The active site of fibrolase and molecules ΝΑΤ contains a zinc atom, which forms a complex with three histidine residues.

В опубликованной литературе по происходящей из яда фибролазе продемонстрирована ее протеолитическая активность в отношении фибриногена в сайте Ьу8⁴¹³-Теи⁴¹⁴ и в отношении окисленной β-цепи инсулина в сайте Α1а¹⁴-^еи¹⁵; Ве1хю5 ηηά МагНаМ, Τίποιι+οδίδ Векеагсй, Vο1ите 74, рр. 355-367 (1994); Рге1хег е1 а1., Р1агтасеийса1 Векеагсй, Vο1ите 8, рр. 1103-1112 (1991), ηηά Рге1хег е1 а1., Рйагтасеийса1 Векеагсй, Vο1ите 9, рр. 870-877 (1992). Также было продемонстрировано, что ΝΑΤ характеризуется протеолитической активностью в отношении данных субстратов в тех же сайтах расщепления.The published literature on venom-derived fibrolase demonstrates its proteolytic activity against fibrinogen at the Li8 ^413- Tei ⁴¹⁴ site and with respect to the oxidized insulin β-chain at the S1a ¹⁴ - ^ ei ¹⁵ site; Be1uh5 ηηά MagNaM, Τίποιι + οδίδ Vekeages, Vο1ite 74, pp. 355-367 (1994); Rge1heg e1 a1., P1agtaseiyisa1 Vekeagsy, Vο1ite 8, pp. 1103-1112 (1991), ηηά Rge1heg e1 a1., Ryagtaseijsa1 Vekeagsy, Vο1ite 9, pp. 870-877 (1992). It was also demonstrated that ΝΑΤ is characterized by proteolytic activity against these substrates at the same cleavage sites.

В отличие от фибринолитических металлопротеиназ, таких, как фибролаза и ΝΑΤ, средства лизиса сгустка, такие как стрептокиназа, урокиназа и активатор плазминогена тканевого типа ^Αχ представляют собой активаторы плазминогена, которые способствуют тромболизу путем активации эндогенной системы фибринолиза. Более конкретно, активаторы плазминогена катализируют преобразование плазUnlike fibrinolytic metalloproteinases, such as fibrolase and ΝΑΤ, clot lysis agents such as streptokinase, urokinase, and tissue type plasminogen activator ^ Αχ are plasminogen activators that promote thrombolysis by activating the endogenous fibrinolysis system. More specifically, plasminogen activators catalyze plasma conversion

- 1 007654 миногена в плазмин, сериновую протеазу. Плазмин способен расщеплять фибриноген и фибрин в аргинил-лизиловых связях, и именно путем активации плазмина активаторы плазминогена в конечном счете воздействуют на деградацию фибрина и лизис сгустка. Коммерчески доступными в настоящее время тромболитическими средствами являются такие активаторы плазминогена, как урокиназа, стрептокиназа или ίΡΆ.- 1 007654 minogen in plasmin, a serine protease. Plasmin is capable of cleaving fibrinogen and fibrin in arginyl-lysyl bonds, and it is by activating plasmin that plasminogen activators ultimately affect fibrin degradation and clot lysis. Plasminogen activators such as urokinase, streptokinase or ίΡΆ are currently commercially available thrombolytic agents.

В отличие от такого класса тромболитических лекарственных средств, как активаторы плазминогена, фибринолитические металлопротеиназы, такие как фибролаза и ΝΑΤ, не относятся к эндогенной системе фибринолиза (преобразование плазминогена в плазмин). Следовательно, данный класс средств лизиса сгустка может отличаться от активаторов плазминогена по их уникальному типу действия, и они определяются как «прямые» фибринолитические средства.Unlike a class of thrombolytic drugs such as plasminogen activators, fibrinolytic metalloproteinases, such as fibrolase and ΝΑΤ, do not belong to the endogenous system of fibrinolysis (conversion of plasminogen to plasmin). Therefore, this class of clot lysis agents may differ from plasminogen activators in their unique type of action, and they are defined as “direct” fibrinolytic agents.

Альфа-2-макроглобулин представляет собой преобладающий ингибитор протеиназ, присутствующий в сыворотке млекопитающих, и является одним из крупнейших белков сыворотки (имеет молекулярную массу 725 кДа). Специфичность а₂-макроглобулина в отношении протеиназ широка и охватывает классы сериновых, цистеиновых протеиназ, протеиназ аспарагиновой кислоты и металлопротеиназ. Молекула а₂-макроглобулина представляет собой тетрамер с идентичными субъединицами, которые связаны дисульфидными мостиками попарно с нековалентными связями между половинами молекулы. Так, в восстановительных условиях нативный а₂-макроглобулин может диссоциировать на свои четыре мономерных субъединицы.Alpha-2-macroglobulin is the predominant proteinase inhibitor present in mammalian serum and is one of the largest serum proteins (has a molecular weight of 725 kDa). The specificity of a ₂ -macroglobulin with respect to proteinases is wide and covers the classes of serine, cysteine proteinases, aspartic acid proteinases and metalloproteinases. The a ₂ -macroglobulin molecule is a tetramer with identical subunits that are connected in disulfide bridges in pairs with non-covalent bonds between the halves of the molecule. So, under reducing conditions, native a ₂ -macroglobulin can dissociate into its four monomeric subunits.

Каждая субъединица а₂-макроглобулина имеет область, очень чувствительную к протеолитическому расщеплению (область «наживки»). Протеолиз области наживки индуцирует конформационное изменение в а₂-макроглобулине, что приводит к захвату протеиназы внутри молекулярной структуры α₂макроглобулина. Данный процесс описан в литературе как взаимодействие «венерина мухоловка». Как только протеиназа захватывается, она получает стерическое затруднение и поэтому не может достигать своего молекулярного субстрата.Each subunit of a ₂ -macroglobulin has a region that is very sensitive to proteolytic cleavage (the “bait” region). Proteolysis of the bait region induces a conformational change in a ₂ macroglobulin, which leads to the capture of proteinase within the molecular structure of α ₂ macroglobulin. This process is described in the literature as the interaction of “venus flytrap”. Once proteinase is captured, it receives steric hindrance and therefore cannot reach its molecular substrate.

Кроме того, между а₂-макроглобулином и многими протеиназами, которые она захватывает, образуется ковалентная связь. Как отмечалось, захват протеиназы приводит к конформационному изменению в молекуле а₂-макроглобулина. Предполагается, что после данного конформационного изменения тиоэфирная связь на внутренней части молекулы а₂-макроглобулина становится реакционноспособной и может образовывать ковалентную связь с нуклеофильными остатками (такими, как лизин) захваченной протеиназы. Таким образом, в общей циркуляции а₂-макроглобулин может эффективно нейтрализовывать разнообразные протеиназы.In addition, a covalent bond is formed between a ₂ -macroglobulin and many of the proteinases that it captures. As noted, proteinase uptake leads to a conformational change in the a ₂ -macroglobulin molecule. It is believed that after this conformational change, the thioether bond on the inside of the a ₂ -macroglobulin molecule becomes reactive and can form a covalent bond with nucleophilic residues (such as lysine) of the captured proteinase. Thus, in the general circulation, a ₂ -macroglobulin can effectively neutralize a variety of proteinases.

Более того, конформационное изменение в а₂-макроглобулине, вызванное захватом протеиназы, приводит к образованию его формы, распознаваемой ретикулоэндотелиальной системой. Клиренс захваченных а₂-макроглобулином протеиназ в общем описан со значениями времени полужизни в минутах и, как полагают, осуществляется посредством белка, родственного рецептору липопротеина низкой плотности (БОБ), экспрессируемого на макрофагах, гепатоцитах и фибробластах. Для большей информации по а₂-макроглобулину см. МеБюбк ίη Еи7уто1оду, ебйеб Ьу Α.Ε Ватгей, Асабешю Ргекк, 1пс., РЫ1абе1рЫа, (1981), рр. 737-754.Moreover, the conformational change in a ₂ -macroglobulin caused by the capture of a proteinase leads to the formation of its form recognized by the reticuloendothelial system. The clearance of a _2- captured macroglobulin proteinases is generally described with half-lives in minutes and is thought to be via protein related to low-density lipoprotein receptor (BOB) expressed on macrophages, hepatocytes and fibroblasts. For more information on a ₂ -macroglobulin, see Mebubk ίη Ei7ut1odu, ebjebuu Ε.Ε Vatgei, Asabeshu Rgekk, 1ps., P1labe1rYa, (1981), pp. 737-754.

Альфа-2-макроглобулин способен образовывать макромолекулярный комплекс с фибролазой, ΝΑΤ и другими протеиназами. В отличие от других протеиназ, которые образуют диссоциируемый комплекс с а₂-макроглобулином, фибролаза и ΝΑΤ являются двумя примерами фибринолитических протеиназ, которые образуют комплекс, который не диссоциирует с а₂-макроглобулина при физиологических условиях. Когда, например, очищенный человеческий а₂-макроглобулин и ΝΑΤ инкубируют вместе, образование комплекса начинается в течение секунд и почти заканчивается в пределах нескольких минут. Данный феномен показывает, что образование комплекса ίη νίίτο может происходить быстро и указывает на возможную быстроту образования комплекса между а₂-макроглобулином и ΝΑΤ или другими фибринолитическими металлопротеиназами ίη νινο.Alpha-2-macroglobulin is able to form a macromolecular complex with fibrolase, ΝΑΤ and other proteinases. Unlike other proteinases that form a dissociable complex with a ₂ -macroglobulin, fibrolase and ΝΑΤ are two examples of fibrinolytic proteinases that form a complex that does not dissociate with a ₂ -macroglobulin under physiological conditions. When, for example, purified human a ₂ -macroglobulin and ΝΑΤ are incubated together, complexation begins within seconds and almost ends within a few minutes. This phenomenon shows that the formation of the ίη νίίτο complex can occur quickly and indicates the possible rapid formation of the complex between a ₂ -macroglobulin and ΝΑΤ or other fibrinolytic metalloproteinases ίη νινο.

Хотя а₂-макроглобулин является одним из главных белков плазмы, в циркуляции, тем не менее, находится конечное количество а₂-макроглобулина, которое будет доступно для нейтрализации фибринолитической металлопротеиназы. Способность связывания а₂-макроглобулина, таким образом, является насыщаемой. Как только способность к связыванию а₂-макроглобулина превышается, концентрация несвязанной фибринолитической металлопротеиназы возрастает пропорционально тому как к образцу добавляется дополнительное количество фибринолитической металлопротеиназы.Although a ₂ -macroglobulin is one of the main plasma proteins, the final amount of a ₂ -macroglobulin is still in circulation, which will be available to neutralize fibrinolytic metalloproteinase. The binding ability of a ₂ -macroglobulin is thus saturable. As soon as the ability to bind a ₂ -macroglobulin is exceeded, the concentration of unbound fibrinolytic metalloproteinase increases in proportion to how additional fibrinolytic metalloproteinase is added to the sample.

Присутствие а₂-макроглобулина в общей циркуляции пациента представляет собой препятствие системному (например, внутривенному) введению фибролазы, ΝΑΤ и других фибринолитических металлопротеиназ, которые связываются а₂-макроглобулином в общей циркуляции крови. Если насыщаемый уровень природного а₂-макроглобулина не будет достигнут путем системно введенной дозы таких фибринолитических металлопротеиназ, последние будут эффективно нейтрализоваться и становиться неэффективными для терапевтических целей.The presence of a ₂ -macroglobulin in the general circulation of the patient is an obstacle to the systemic (e.g., intravenous) administration of fibrolase, ΝΑΤ and other fibrinolytic metalloproteinases that bind a ₂ -macroglobulin in the general blood circulation. If a saturable level of natural a ₂ -macroglobulin is not achieved by a systemically administered dose of such fibrinolytic metalloproteinases, the latter will be effectively neutralized and become ineffective for therapeutic purposes.

В одном из исследований ίη νινο, проведенных на кроликах, оценивали биологическую эффективIn one study of ίη νινο conducted on rabbits, the biological effectiveness of

- 2 007654 ность происходящей из яда фибролазы после системного внутривенного введения. Айтеб с1 а1., Наето513515. выше. Использованная доза фибролазы составляла 3,7 мг на килограмм, что по оценкам приводило к конечной концентрации в крови, примерно составляющей 60 мкг/мл у кролика массой 3,0 кг. Данное количество выбирали на основе исследований по оценке инактивации данного фермента в присутствии крови или плазмы, преимущественно вследствие действия а₂-макроглобулина (см. сс. 336 и 339).- 2 007654 the occurrence of fibrolase derived from venom after systemic intravenous administration. Ayteb s1 a1., Nato 513515. higher. The dose of fibrolase used was 3.7 mg per kilogram, which was estimated to result in a final blood concentration of approximately 60 μg / ml in a rabbit weighing 3.0 kg. This amount was selected based on studies evaluating the inactivation of this enzyme in the presence of blood or plasma, mainly due to the action of a ₂ -macroglobulin (see pp. 336 and 339).

В другом исследовании ίη νΐνο у собак оценивали биологический эффект рекомбинантной фибролазы на лизис сгустка. Магк1апб е1 а1., Спсйайоп, выше. Четыре миллиграмма данного материала на килограмм (массы тела животного) вводили струйно в течение 5 мин проксимально от предварительно индуцированного тромба в левой сонной артерии через катетерное устройство (см. с. 2450). Здесь опять было отмечено, что инактивация фибролазы происходит в общей циркуляции крови преимущественно вследствие присутствия а₂-макроглобулина (см. с. 2454, вторую колонку, последний параграф).Another study of ίη νΐνο in dogs evaluated the biological effect of recombinant fibrolase on clot lysis. Magk1apb e1 a1., Spsyayop, above. Four milligrams of this material per kilogram (animal body weight) was injected jet for 5 min proximal from a pre-induced thrombus in the left carotid artery through a catheter device (see p. 2450). Here it was again noted that inactivation of fibrolase occurs in the general blood circulation mainly due to the presence of a ₂ -macroglobulin (see p. 2454, second column, last paragraph).

Как показывают данные, два исследования, дезактивирующие эффекты а₂-макроглобулина, могут преодолеваться введением системных дозировок фибринолитической металлопротеиназы, которые превышают насыщаемый уровень природного а₂-макроглобулина (исследование на кроликах) или путем доставки фермента локально в участок сгустка (исследование на собаках) и избежания системного введения.As the data show, two studies that deactivate the effects of a ₂ -macroglobulin can be overcome by administering systemic dosages of fibrinolytic metalloproteinase that exceed the saturated level of natural a ₂ -macroglobulin (rabbit study) or by delivering the enzyme locally to the clot site (dog study) and avoid systemic administration.

С другой стороны, дозы фибринолитической металлопротеиназы в избытке насыщаемого уровня а₂-макроглобулина, при системной или местной доставке, могут превышать уровни, которые безопасны и хорошо переносятся подвергающимся лечению субъектом. Примечательно, что фибринолитические металлопротеиназы способны разрушать не только фибрин, но также могут приводить к деградации других структурных белков, и поэтому они потенциально токсичны ίη νΐνο, когда присутствуют в больших количествах, которые превышают насыщаемый уровень а₂-макроглобулина.On the other hand, doses of fibrinolytic metalloproteinase in excess of the saturated level of a ₂ -macroglobulin, in case of systemic or local delivery, may exceed levels that are safe and well tolerated by the treated subject. It is noteworthy that fibrinolytic metalloproteinases can destroy not only fibrin, but can also lead to the degradation of other structural proteins, and therefore they are potentially toxic ίη νΐνο when they are present in large quantities that exceed the saturated level of a ₂ -macroglobulin.

Образование кровяного сгустка или другой основанной на фибрине закупорки также вызывает беспокойство при использовании стационарного катетера или другого устройства сосудистого доступа. Имеется много состояний, которые требуют повторяющегося периодически или длительного применения устройства сосудистого доступа, такого как катетер, трансплантат для доступа, футляр, игла, артериовенозная фистула или шунт. Например, в различных процедурах, ассоциированных с гемодиализом, химиотерапией, переливанием или обменом крови, и в других процедурах, где используется повторная внутривенная или внутриартериальная доставка лекарственных средств (или забор жидкостей), можно использовать постоянный катетер или другое постоянно или наполовину постоянно имплантированное медицинское устройство. Кровяные сгустки могут образовываться внутри или вокруг устройства или могут прикрепляться к любому устройству, которое введено в сосудистое пространство, особенно когда данное устройство остается в сосудистом пространстве в течение длительных периодов времени или когда устройство имеет одно или несколько очень маленьких отверстий. Кроме того, другие основанные на фибрине закупоривающие объекты могут прикрепляться к любой части стационарного устройства сосудистого доступа, что может препятствовать или мешать его надлежащему функционированию.The formation of a blood clot or other fibrin-based blockage is also of concern when using a stationary catheter or other vascular access device. There are many conditions that require repeated or intermittent use of a vascular access device, such as a catheter, access graft, case, needle, arteriovenous fistula, or shunt. For example, in various procedures associated with hemodialysis, chemotherapy, blood transfusion or blood exchange, and in other procedures that use repeated intravenous or intra-arterial drug delivery (or fluid sampling), a permanent catheter or other permanently or half-permanently implanted medical device can be used . Blood clots can form inside or around the device or can attach to any device that is inserted into the vascular space, especially when the device remains in the vascular space for extended periods of time or when the device has one or more very small openings. In addition, other fibrin-based plugging objects may attach to any part of the stationary vascular access device, which may interfere with or interfere with its proper functioning.

Было бы полезно располагать быстрым и эффективным способом лечения, т.е. разрушения, растворения или лизиса сгустков или других закупорок, которые образовались внутри или вокруг стационарного устройства сосудистого доступа или прикреплены к нему. В отсутствие эффективного способа лечения сгустков, которые образовались внутри или вокруг устройства сосудистого доступа, может потребоваться замена стационарного устройства врачом, что приводит к дополнительным расходам и риску для пациента.It would be useful to have a quick and effective treatment, i.e. destruction, dissolution or lysis of clots or other blockages that have formed in or around the fixed vascular access device or attached to it. In the absence of an effective method for treating clots that have formed inside or around the vascular access device, it may be necessary to replace the stationary device with a doctor, which leads to additional costs and risks for the patient.

В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является предоставление безопасного и эффективного способа лечения кровяного сгустка или закупорки внутри или вокруг стационарного устройства доступа.Accordingly, an object of the present invention is to provide a safe and effective method for treating a blood clot or blockage in or around a stationary access device.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа восстановления раскрытого состояния полностью или частично закупоренного стационарного устройства сосудистого доступа.It is also an object of the present invention to provide a method for reconstructing an open condition of a fully or partially occluded stationary vascular access device.

Дальнейшей целью настоящего изобретения является предоставление способа восстановления функциональности стационарного устройства сосудистого доступа, где функциональность была изменена закупоркой, основанной на фибрине.A further object of the present invention is to provide a method for restoring the functionality of a stationary vascular access device, where the functionality has been altered by a fibrin-based blockage.

Также целью настоящего изобретения является предоставление безопасного и биологически эффективного пути применения местно введенных фибринолитических металлопротеиназ для лизиса кровяных сгустков ίη νΐνο.It is also an object of the present invention to provide a safe and biologically effective route to the use of locally administered fibrinolytic metalloproteinases for the lysis of blood clots ίη νΐνο.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу терапевтического лечения кровяного сгустка в стационарном устройстве сосудистого доступа путем введения через указанное устройство для сосудистого доступа некоторого количества фибринолитической металлопротеиназы в фармацевтически приемлемом растворе, где данное количество не превышало 1,7 мг фибринолитической металлопротеиназы на килограмм массы тела подлежащего лечению субъекта-человека. В некоторых осуществлениях устройство сосудистого доступа стационарно установлено в артерии или вене субъектачеловека. В некоторых осуществлениях устройство сосудистого доступа представляет собой катетер,In some implementations, the present invention relates to a method for the therapeutic treatment of a blood clot in a stationary vascular access device by introducing through this vascular access device a certain amount of fibrinolytic metalloproteinase in a pharmaceutically acceptable solution, where this amount does not exceed 1.7 mg of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of body weight of the subject treating a human subject. In some implementations, the vascular access device is stationary installed in the artery or vein of a human subject. In some implementations, the vascular access device is a catheter,

- 3 007654 шунт, трансплантат для доступа, иглу или футляр. В некоторых осуществлениях устройство сосудистого доступа используется для введения или удаления жидкостей из сосудистой области. В некоторых осуществлениях устройство сосудистого доступа согласно изобретению используется в сочетании с гемодиализом, переливанием, удалением или обменом крови, химиотерапией или любой другой процедурой, которая требует введения или удаления жидкостей из вены или артерии.- 3,007654 shunt, transplant for access, needle or case. In some implementations, the vascular access device is used to introduce or remove fluids from the vascular region. In some implementations, the vascular access device according to the invention is used in combination with hemodialysis, transfusion, removal or exchange of blood, chemotherapy or any other procedure that requires the introduction or removal of fluids from a vein or artery.

В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу лизиса кровяных сгустков в стационарном устройстве сосудистого доступа путем местного введения в указанный сгусток некоторого количества фибринолитической металлопротеиназы, которая образует комплекс с альфа-2макроглобулином, в количестве, достаточном для облегчения лизиса сгустка, без значительного превышения при этом уровня насыщения альфа-2-макроглобулина у указанного субъекта-человека, в фармацевтически приемлемом растворе.In some embodiments, the present invention relates to a method for lysing blood clots in a stationary vascular access device by topically injecting a certain amount of fibrinolytic metalloproteinase into said clot, which forms a complex with alpha-2 macroglobulin, in an amount sufficient to facilitate clot lysis, without significantly exceeding the level saturating alpha-2-macroglobulin in said human subject in a pharmaceutically acceptable solution.

В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу восстановления раскрытого состояния полностью или частично закупоренного стационарного устройства сосудистого доступа. В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу восстановления функции закупоренного стационарного устройства сосудистого доступа.In some implementations, the present invention relates to a method for restoring an open state of a fully or partially blocked stationary vascular access device. In some implementations, this invention relates to a method for restoring the function of a clogged stationary vascular access device.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг. 1А-1С. Фиг. 1А представляет собой фоновую ангиограмму сонной артерии взрослой свиньи перед индуцированным баллонным катетером повреждением и образованием закупоривающего тромба; фиг. 1В - ангиограмму, снятую на 4 сутки у того же животного, перед введением ΝΑΤ способом согласно изобретению; фиг. 1С - ангиограмму через 2 ч после введения 30 мг ΝΑΤ через катетер «ΡΚΌ» (см. фиг. 3 для иллюстрации данного устройства);FIG. 1A-1C. FIG. 1A is a background angiogram of an adult pig carotid artery before a balloon-catheter-induced injury and clogging; FIG. 1B is an angiogram taken on the 4th day in the same animal, before the introduction of ΝΑΤ the method according to the invention; FIG. 1C is an angiogram 2 hours after administration of 30 mg ΝΑΤ through the catheter “ΡΚΌ” (see Fig. 3 to illustrate this device);

на фиг. 2 проиллюстрирован тип катетерного устройства, сконструированного для локализованной доставки тромболитического средства в кровеносный сосуд;in FIG. 2 illustrates a type of catheter device designed for the localized delivery of a thrombolytic agent into a blood vessel;

фиг. 3 представляет собой вид на боковой разрез катетерного устройства альтернативного типа для локализованной доставки тромболитического средства в кровеносный сосуд;FIG. 3 is a side sectional view of an alternative type of catheter device for localized delivery of a thrombolytic agent into a blood vessel;

фиг. 4 представляет собой гистограмму оцененной максимальной дозы ΝΑΤ у пациентов с периферической закупоркой сосудов;FIG. 4 is a histogram of the estimated maximum dose ΝΑΤ in patients with peripheral vascular obstruction;

на фиг. 5 проиллюстрировано применение ΝΑΤ в модели закупорки катетера ίη νίίτο;in FIG. 5 illustrates the use of ΝΑΤ in a catheter obstruction model ίη νίίτο;

на фиг. 6 проиллюстрированы итоговые результаты 6 экспериментов, средние данные которых показывают, что ΝΑΤ разрешает закупорки ίη νίίτο максимум на 40% быстрее ЛЬЬокта5С5 Ореп СаЮ. коммерческого продукта урокиназы для очистки катетеров.in FIG. 6, the final results of 6 experiments are illustrated, the average data of which show that ает permits blockages ίη νίίτο maximum 40% faster than L0cta 5C5 Ore SaU. a commercial urokinase product for catheter cleaning.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу лечения кровяного сгустка ίη νίνο у субъекта-человека фибринолитической металлопротеиназой, охватывающему местное введении безопасного, биологически эффективного количества фибринолитической металлопротеиназы в кровяной сгусток, например, путем использования катетера или другого устройства сосудистого доступа. Обычно стационарные сгустки фибрина локализуются в кровеносном сосуде (артериальном или венозном, природном или синтетическом (например, трансплантат)) у субъекта-человека. В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу лечения кровяного сгустка, расположенного внутри или вокруг стационарного катетера, шунта, иглы или другого устройства сосудистого доступа, или прикрепленного к нему. В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу восстановления раскрытого состояния полностью или частично закупоренного стационарного устройства сосудистого доступа. В некоторых осуществлениях данное изобретение относится к способу восстановления функциональности стационарного устройства сосудистого доступа, где функциональность была изменена или в некоторой степени нарушена закупоркой, основанной на фибрине.In some implementations, the present invention relates to a method for treating a ίη νίνο blood clot in a human subject with a fibrinolytic metalloproteinase encompassing topical administration of a safe, biologically effective amount of fibrinolytic metalloproteinase into a blood clot, for example, by using a catheter or other vascular access device. Typically, stationary fibrin clots are localized in a blood vessel (arterial or venous, natural or synthetic (eg, graft)) in a human subject. In some implementations, this invention relates to a method for treating a blood clot located in or around a fixed catheter, shunt, needle or other vascular access device, or attached to it. In some implementations, the present invention relates to a method for restoring an open state of a fully or partially blocked stationary vascular access device. In some implementations, the present invention relates to a method for restoring the functionality of a stationary vascular access device, where the functionality has been altered or somewhat impaired by fibrin-based blockage.

Под «безопасным, биологически эффективным» количеством подразумевается количество, достаточное для деградации фибрина и облегчения лизиса сгустка (например, тромба), при том, что уровень фермента существенно не превышает уровень насыщения а₂-макроглобулина в системе циркуляции подлежащего лечению пациента (т.е. уровни, которые могут вызывать повреждение стенок кровеносных сосудов). Обычно данное количество заключено в интервале от 0,025 до 1,7 мг на килограмм массы тела для подлежащего лечению субъекта-человека, что определено в исследовании, проведенном с образцами крови от субъектов-людей, которые изучали ίη νίίτο на содержание и связывающую способность α₂макроглобулина. Из результатов данного исследования ίη νίίτο можно определить насыщаемый уровень а₂-макроглобулина ίη νίνο для всех практических целей, что обеспечивает, таким образом, выявление биологически эффективного количества с учетом не только минимального уровня фибринолитической металлопротеиназы, требуемой для биологической эффективности, но также максимального уровня для хорошо переносимого введения. Данное исследование описано в дальнейших подробностях ниже среди примеров.By “safe, biologically effective” amount is meant an amount sufficient to degrade fibrin and facilitate clot lysis (eg, a blood clot), while the enzyme level does not significantly exceed the saturation level of a ₂ -macroglobulin in the circulation system of the patient to be treated (i.e. levels that may cause damage to the walls of blood vessels). Typically, this amount is in the range from 0.025 to 1.7 mg per kilogram of body weight for the human subject to be treated, as determined in a study conducted with blood samples from human subjects who studied ίη νίίτο for the content and binding ability of α ₂ macroglobulin . From the results of this study ίη νίίτο, one can determine the saturable level of a ₂ -macroglobulin ίη νίνο for all practical purposes, which ensures, therefore, the identification of a biologically effective amount taking into account not only the minimum level of fibrinolytic metalloproteinase required for biological effectiveness, but also the maximum level for well tolerated administration. This study is described in further detail below by way of examples.

Термины «местно» или «местный», применяемые к пути доставки фибринолитической металлопротеиназы, указывают здесь на внутриартериальное или внутривенное введение или непосредственно в сам кровяной сгусток (т.е. внутрь тромба) или в непосредственной близости от сгустка (проксимально илиThe terms “topical” or “local”, as applied to the delivery route of fibrinolytic metalloproteinase, refer here to intra-arterial or intravenous administration either directly into the blood clot (i.e., inside the blood clot) or in the immediate vicinity of the clot (proximal or

- 4 007654 дистально относительно кровотока), и достаточно близко для того, чтобы большая часть фибринолитической металлопротеиназы была поглощена сгустком. Для лечения сгустков, находящихся внутри или вокруг устройства сосудистого доступа, или прикрепленных к нему, или для восстановления раскрытого состояния или функции устройства сосудистого доступа, доставка фибринолитической металлопротеиназы главным образом осуществляется через само устройство сосудистого доступа и поэтому, по существу, является местной. В некоторых осуществлениях вторичное устройство сосудистого доступа, такое как катетер, может использоваться для доставки фибринолитической металлопротеиназы в имплантированное медицинское устройство, такое как эндопротез сосуда.- 4 007654 distally relative to the blood flow), and close enough so that most of the fibrinolytic metalloproteinase is absorbed by the clot. For the treatment of clots located inside or around the vascular access device, or attached to it, or to restore the open state or function of the vascular access device, the delivery of fibrinolytic metalloproteinase is mainly carried out through the vascular access device itself and is therefore essentially local. In some implementations, a secondary vascular access device, such as a catheter, can be used to deliver fibrinolytic metalloproteinase to an implanted medical device, such as a vascular endoprosthesis.

Термин «катетерное средство доставки» или «устройство сосудистого доступа» используется здесь в общепринятом смысле, указывающем на трубчатое медицинское устройство для вставки в каналы, сосуды, ходы или полости тела для целей инъекции или отбора жидкостей или для поддержания хода открытым. В общем, такие средства обычно включают в себя удлиненный гибкий корпус катетера, содержащий один или несколько внутренних ходов (или «просветов»); проксимальную часть, обеспечивающую введение материала (т.е. средству лизиса сгустка) в корпус катетера и его протекание через просвет; дистальную часть, необязательно имеющую конический конец; и один или несколько выходных портов на конце дистальной части или вблизи нее для обеспечения выхода материала из катетера в ответ на прилагаемое давление.The term "catheter delivery device" or "vascular access device" is used here in the conventional sense, indicating a tubular medical device for insertion into channels, vessels, passages or cavities of the body for the purpose of injection or selection of fluids or to keep the course open. In general, such means typically include an elongated flexible catheter body containing one or more internal passages (or “gaps”); the proximal part, providing for the introduction of material (i.e., a clot lysis agent) into the catheter body and its passage through the lumen; a distal portion optionally having a conical end; and one or more outlet ports at or near the end of the distal portion to allow material to exit the catheter in response to applied pressure.

Используемые здесь термины «протеолитическая деградация», «растворение», «лизис» и «терапевтическое лечение» все используются здесь для ссылки на деградацию, дезинтеграцию, декомпозицию, распад или другое удаление кровяного сгустка или другой основанной на фибрине закупорки. Кровяной сгусток может частично или полностью закупоривать просвет сосуда или медицинского устройства. Сходным образом, «восстановление раскрытого состояния» относится к любому измеряемому усилению кровяного потока (например, по объему или скорости) через сосуд или просвет устройства или выходной порт из-за растворения там кровяного сгустка.As used herein, the terms “proteolytic degradation”, “dissolution”, “lysis” and “therapeutic treatment” are all used here to refer to degradation, disintegration, decomposition, decomposition or other removal of a blood clot or other fibrin-based blockage. A blood clot may partially or completely clog the lumen of a vessel or medical device. Similarly, “recovery of an open state” refers to any measurable increase in blood flow (for example, in volume or speed) through a vessel or lumen of an apparatus or outlet port due to dissolution of a blood clot there.

Используемый здесь термин «кровяной сгусток» или «закупорка» относится к любой массе, скоплению, затруднению или разрастанию на основе фибрина. Обычно кровяные сгустки являются результатом свертывания крови в артерии или вене и ослабляют, затрудняют, мешают или полностью или частично блокируют поток крови через эти сосуды. Кровяные сгустки также могут образовываться внутри или вокруг любого чужеродного объекта, введенного в сосудистое пространство. Кровяные сгустки могут быть стационарными, такими как тромб (кровяной сгусток, который образуется в сосуде и остается там) или могут перемещаться, как эмбол (кровяные сгустки, которые двигаются от участка, где они образовались, в другое место организма). Кровяные сгустки также могут широко варьировать по размеру, форме и композиции и могут включать в себя сферические массы, а также лоскуты или другие плоские структуры. Иногда кусок атеросклеротической бляшки, маленькие кусочки опухоли, жировые глобулы, воздух, амниотическая жидкость или другие материалы, находящиеся в крови, могут действовать тем же образом, что и кровяной сгусток. Если данные массы содержат фибрин или другие вещества, чувствительные к деградации под действием фибринолитической металлопротеиназы, то один из способов согласно изобретению может использоваться для их лечения.The term “blood clot” or “blockage” as used herein refers to any mass, accumulation, obstruction or proliferation based on fibrin. Typically, blood clots are the result of blood coagulation in an artery or vein and weaken, obstruct, interfere with, or completely or partially block the flow of blood through these vessels. Blood clots can also form in or around any foreign object introduced into the vascular space. Blood clots can be stationary, such as a blood clot (a blood clot that forms in the vessel and stays there) or can move like an embolus (blood clots that move from the site where they formed to another place in the body). Blood clots can also vary widely in size, shape, and composition, and can include spherical masses, as well as flaps or other flat structures. Sometimes a piece of atherosclerotic plaque, small pieces of a tumor, fat globules, air, amniotic fluid, or other materials in the blood can act in the same way as a blood clot. If these masses contain fibrin or other substances susceptible to degradation by fibrinolytic metalloproteinase, then one of the methods according to the invention can be used to treat them.

Другой способ согласно изобретению далее иллюстрируется ниже в отношении закупорки периферических артерий (РАО). РАО происходит из заболевания периферических сосудов вследствие атеросклероза. Симптомы развиваются медленно в течение многих лет по мере прогрессирования атеросклероза, с критическим уровнем ишемии, достигаемым примерно у 15-20% пациентов с заболеванием нижних конечностей. Медикаментозное лечение ограничено и преимущественно направлено на профилактику или снижение риска, с использованием медикаментов, таких как средства снижения уровня липидов или противотромбоцитарные средства, программ отмены курения и физических упражнений. 1аск8ои аиб С1адей, Сйе81, Уо1ите 114, рр. 6668-6828 (1998).Another method according to the invention is further illustrated below in relation to occlusion of peripheral arteries (RAW). RAO comes from peripheral vascular disease due to atherosclerosis. Symptoms develop slowly over the years as atherosclerosis progresses, with a critical level of ischemia achieved in about 15-20% of patients with lower limb disease. Medication is limited and primarily aimed at prevention or risk reduction, using medications such as lipid lowering or antiplatelet agents, smoking cessation programs, and exercise. 1ask8oy aib S1adey, Sye81, Uo1ite 114, pp. 6668-6828 (1998).

Клинические проявления заболевания периферических сосудов могут включать в себя острые приступы угрожающей конечности ишемии или более хронические признаки заболевания сосудов (например, перемежающаяся хромота). Кроме указанных выше превентивных мер, хроническую РАО обычно не лечат до начала умеренного ограничения образа жизни или угрожающей конечности ишемии. В зависимости от затронутого сегмента сосуда и степени закупорки, доступное медицинское вмешательство включает в себя подкожную транслюминальную ангиопластику, хирургическую реваскуляризацию и тромболиз. Исследования показали, что внутривенная инфузия средств лизиса сгустка, особенно на ранних стадиях закупорки, может предотвращать необходимость хирургического вмешательства. Как продемонстрировано в испытании Косйе81ет, где сравнивали тромболиз активатором плазминогена урокиназой, с хирургией при лечении острой РАО (Оште1 е! а1., 1оита1 о£ Уа8си1ат 8игдегу, 1994, Уо1ите 19, рр. 1021-1030), примерно 33% пациентов в части исследования с тромболизом успешно излечивались лишь в результате медикаментозного вмешательства, избегнув, таким образом, более инвазивной процедуры. Наоборот, 98% пациентов оперативной части исследования подвергались эндоваскулярной или хирургической процедуре.Clinical manifestations of peripheral vascular disease may include acute attacks of threatening limb ischemia or more chronic signs of vascular disease (eg, intermittent claudication). In addition to the preventative measures mentioned above, chronic RW is usually not treated until a moderate lifestyle restriction or threatening limb ischemia begins. Depending on the affected segment of the vessel and degree of blockage, the available medical intervention includes subcutaneous transluminal angioplasty, surgical revascularization, and thrombolysis. Studies have shown that intravenous infusion of clot lysis agents, especially in the early stages of blockage, can prevent the need for surgery. As demonstrated in the Cosie81et trial, where thrombolysis was compared with plasminogen activator urokinase, with surgery in the treatment of acute RAO (Oshte1 e! A1., 1oit1 o £ Wa8siat 8igdegu, 1994, Gooite 19, pp. 1021-1030), approximately 33% of patients in part studies with thrombolysis were successfully cured only as a result of medical intervention, thus avoiding a more invasive procedure. In contrast, 98% of patients in the operative part of the study underwent an endovascular or surgical procedure.

Другие медицинские нарушения, где участвуют закупоренные кровяные сгустки, можно эффективно лечить сходным образом настоящим способом, среди них в качестве неограничивающих примеровOther medical disorders involving clogged blood clots can be effectively treated in a similar way in this way, among them as non-limiting examples.

- 5 007654 острый инфаркт миокарда, ишемический инсульт, глубокий тромбоз вен и легочную эмболию. В некоторых осуществлениях способ согласно изобретению может также использоваться для растворения сгустков, которые происходят в постоянно имплантированных медицинских устройствах, таких как стационарные катетеры и трансплантаты доступа для гемодиализа. Другие типовые имплантированные медицинские устройства включают в себя шунты, части для доступа, иглы, футляры или другие устройства сосудистого доступа.- 5 007654 acute myocardial infarction, ischemic stroke, deep vein thrombosis and pulmonary embolism. In some implementations, the method according to the invention can also be used to dissolve clots that occur in permanently implanted medical devices, such as fixed catheters and hemodialysis access grafts. Other typical implanted medical devices include shunts, access parts, needles, cases, or other vascular access devices.

В некоторых осуществлениях данное изобретение может использоваться для терапевтической доставки любой фибринолитической металлопротеиназы, которая способна образовывать комплекс с α₂макроглобулином. Такие фибринолитические металлопротеиназы, если встречаются в природе, могут быть очищены из их природных источников, например, фибролаза из змеиного яда. Альтернативно, полипептидные средства - фибринолитические металлопротеиназы, последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности которых известны, могут продуцироваться путем использования общепринятых способов рекомбинантной экспрессии и очистки.In some embodiments, the present invention can be used for the therapeutic delivery of any fibrinolytic metalloproteinase that is capable of complexing with α ₂ macroglobulin. Such fibrinolytic metalloproteinases, if found in nature, can be purified from their natural sources, for example, snake venom fibrolase. Alternatively, polypeptide agents — fibrinolytic metalloproteinases, whose nucleic acid and amino acid sequences are known, can be produced using conventional recombinant expression and purification methods.

В общем, в рекомбинантных способах используется молекула ДНК, кодирующая интересующую фибринолитическую металлопротеиназу, которая встроена в подходящий вектор для экспрессии в подходящей клетке-хозяине. Вектор выбирают, чтобы он был функциональным в конкретной используемой клетке-хозяине, т.е. совместим с механизмом клетки-хозяина, так, что может происходить экспрессия ДНК.In general, recombinant methods use a DNA molecule encoding a fibrinolytic metalloproteinase of interest that is inserted into a suitable vector for expression in a suitable host cell. The vector is selected to be functional in the particular host cell used, i.e. compatible with the mechanism of the host cell, so that DNA expression can occur.

Векторы также могут содержать 5'-фланкирующую последовательность (также обозначаемую как «промотор») и другие элементы регуляции экспрессии, функционально связанные с подлежащей экспрессии ДНК, а также другие известные элементы, такие как элемент инициации репликации, элемент терминации транскрипции, полную последовательность интрона, содержащую донорный и акцепторный участки сплайсинга, последовательность сигнального пептида, элемент - участок связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для вставки кодирующей нуклеиновой кислоты и элемент - маркер селекции. Данный вектор может также необязательно содержать последовательность-«метку», т.е. олигонуклеотидную последовательность, локализованную на 5'- или З'-конце последовательности, кодирующей полипептид, которая кодирует поли-Ηίδ или другую малую иммуногенную последовательность. Данная метка будет экспрессироваться вместе с интересующим белком и может служить в качестве аффинной метки для очистки данного полипептида из клетки-хозяина. Если это требуется, метка может впоследствии удаляться из очищенного белка различными способами, например, с использованием селективной пептидазы.The vectors may also contain a 5'-flanking sequence (also referred to as a "promoter") and other expression control elements functionally associated with the DNA to be expressed, as well as other known elements, such as a replication initiation element, a transcription termination element, a complete intron sequence, containing donor and acceptor splicing sites, signal peptide sequence, element - ribosome binding site, polyadenylation sequence, polylinker region for encoding nucleic acid rates and the element is a selection marker. This vector may also optionally contain a label sequence, i.e. an oligonucleotide sequence located at the 5'- or 3'-end of a sequence encoding a polypeptide that encodes a poly-Ηίδ or other small immunogenic sequence. This label will be expressed along with the protein of interest and can serve as an affinity tag for purification of the polypeptide from the host cell. If desired, the label can subsequently be removed from the purified protein in various ways, for example, using selective peptidase.

В тех случаях, где требуется, чтобы полипептид секретировался из клетки-хозяина, может использоваться сигнальная последовательность для направления полипептида из клетки-хозяина, где он синтезировался. Обычно сигнальная последовательность расположена в кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты или непосредственно с 5'-конца кодирующей области. Были идентифицированы многие сигнальные последовательности, и могут использоваться любые, которые функциональны в выбранной клетке-хозяине.In cases where it is required that the polypeptide is secreted from the host cell, a signal sequence can be used to direct the polypeptide from the host cell where it was synthesized. Typically, the signal sequence is located in the coding region of the nucleic acid sequence or directly from the 5'-end of the coding region. Many signal sequences have been identified, and any that are functional in the selected host cell can be used.

После того, как вектор сконструирован и нуклеиновая кислота встроена в надлежащий участок вектора, завершенный вектор может быть встроен в подходящую клетку-хозяин для амплификации и/или экспрессии полипептидов. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими (как Е. со11) или эукариотическими (как дрожжевая клетка, клетка насекомого или клетка позвоночных).After the vector has been constructed and the nucleic acid is inserted into the proper region of the vector, the completed vector can be inserted into a suitable host cell for amplification and / or expression of the polypeptides. Host cells can be prokaryotic (like E. co11) or eukaryotic (like a yeast cell, insect cell or vertebrate cell).

Подходящие клетки или клеточные линии хозяина могут представлять собой клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки ЗТЗ. Выбор подходящих клеток хозяина-млекопитающего и способы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и продукции и очистки продукта известны в данной области. Другие подходящие клеточные линии млекопитающих представляют собой клеточные линии обезьян СО8-1 и СО8-7, и клеточную линию СУ-1. Дальнейшие типовые клетки хозяина-млекопитающего охватывают клеточные линии приматов и клеточные линии грызунов, включая трансформированные клеточные линии. Нормальные диплоидные клетки, клеточные линии, происходящие из культуры первичной ткани ίη νίίτο, а также первичные эксплантаты, также являются подходящими. Клетки-кандидаты могут иметь генотипический дефицит по гену селекции или могут содержать ген селекции доминантного действия. Другие подходящие клеточные линии млекопитающих охватывают в качестве неограничивающих примеров НеЬа, мышиные клетки Ь-929, линии ЗТЗ, происходящие от мышей 8^155. Ва1Ь-с или ΝΙΗ, клеточные линии хомячков ВНК или НаК.Suitable host cells or cell lines may be mammalian cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells or ZTZ cells. The selection of suitable mammalian host cells and methods for transforming, culturing, amplifying, screening and producing and purifying a product are known in the art. Other suitable mammalian cell lines are monkey cell lines CO8-1 and CO8-7, and cell line SU-1. Further typical mammalian host cells encompass primate cell lines and rodent cell lines, including transformed cell lines. Normal diploid cells, cell lines derived from культурыη νίίτο primary tissue culture, as well as primary explants, are also suitable. Candidate cells may have a genotypic deficit in the selection gene or may contain a selection gene for dominant action. Other suitable mammalian cell lines include, but are not limited to, HeLa, murine L-929 cells, and 3G lines derived from 8 ^ 155 mice. Ba1b-c or ΝΙΗ, cell lines of hamsters of BHK or NaK.

Также в качестве клеток-хозяев могут применяться бактериальные клетки, например, различные штаммы Е. со11, и различные штаммы дрожжевых клеток.Also, bacterial cells, for example, various strains of E. co11 and various strains of yeast cells, can be used as host cells.

Встраивание (также обозначаемое как «трансформация» или «трансфекция») вектора в выбранную клетку-хозяин может выполняться с использованием таких способов, как кальций-фосфатный, электропорация, микроинъекция, липофекция или способ ΌΕΑΕ-декстран. Выбранный способ частично является функцией используемого типа клетки-хозяина. Данные способы и другие подходящие способы хорошо известны специалистам в данной области.The incorporation (also referred to as “transformation” or “transfection”) of the vector into the selected host cell can be accomplished using methods such as calcium phosphate, electroporation, microinjection, lipofection, or the ΌΕΑΕ-dextran method. The selected method is partially a function of the type of host cell used. These methods and other suitable methods are well known to those skilled in the art.

Клетка-хозяин при культивировании в подходящих условиях может синтезировать интересующуюA host cell, when cultured under suitable conditions, can synthesize the

- 6 007654 фибринолитическую металлопротеиназу. Клетки-хозяева могут культивироваться с использованием стандартных сред, хорошо известных специалистам в данной области. Данные среды обычно содержат все питательные вещества, необходимые для роста и выживания клеток. Подходящими средами для культивирования клеток Е. сой являются, например, бульон Йипа (ЙВ) и/или бульон Теггтйс (ТВ). Подходящими средами для культивирования эукариотических клеток являются ΒΡΜΙ 1640, МЕМ, ΌΜΕΜ, причем все они могут дополняться сывороткой и/или факторами роста, как это требуется для культивирования конкретной клеточной линии.- 6 007654 fibrinolytic metalloproteinase. Host cells can be cultured using standard media well known to those skilled in the art. These media usually contain all the nutrients necessary for cell growth and survival. Suitable media for culturing E. soybean cells are, for example, Yip broth (JV) and / or Teghtis broth (TB). Suitable media for culturing eukaryotic cells are ΒΡΜΙ 1640, MEM, ΌΜΕΜ, all of which can be supplemented with serum and / or growth factors, as required for the cultivation of a particular cell line.

Обычно в качестве дополнения к среде добавляют антибиотик или другое вещество, которое может применяться для селективного роста трансформированных клеток. Конкретное используемое соединение определяется конкретным элементом-маркером селекции, присутствующем на плазмиде, которой трансформирована данная клетка-хозяин. Например, там, где маркер селекции обеспечивает устойчивость к канамицину, добавляемым к культуральной среде соединением будет канамицин.Typically, an antibiotic or other substance that can be used to selectively grow transformed cells is added to supplement the medium. The particular compound used is determined by the particular selection marker element present on the plasmid by which this host cell has been transformed. For example, where a selection marker provides resistance to kanamycin, the compound added to the culture medium will be kanamycin.

Количество белка, продуцируемого в клетке-хозяине, может оцениваться с использованием стандартных способов, известных в данной области, включая анализ путем вестерн-блота, δΌδ-электрофорез в полиакриламидном геле, неденатурирующий гель-электрофорез, разделение путем ВЭЖХ, иммунопреципитация и/или анализы активности, такие как анализы связывания ДНК путем оценки сдвигов в геле.The amount of protein produced in the host cell can be estimated using standard methods known in the art, including Western blot analysis, δΌδ polyacrylamide gel electrophoresis, non-denaturing gel electrophoresis, HPLC separation, immunoprecipitation and / or activity assays such as DNA binding assays by evaluating gel shifts.

Если белок секретируется из клетки-хозяина, отличной от грамотрицательной бактерии, большая часть его, вероятно, будет находиться в культуральной среде клеток. Если он не секретируется, он будет присутствовать в цитоплазме. В случае внутриклеточного белка клетки хозяина обычно вначале разрушают механически. В случае белка, характеризующегося периплазматической локализацией, для высвобождения периплазматического содержимого в буферный раствор могут применяться механическое разрушение или осмотическая обработка, и затем полипептид выделяют из данного раствора. Очистка из раствора может затем выполняться с использованием различных способов.If the protein is secreted from a host cell other than a gram-negative bacterium, most of it is likely to be in the cell culture medium. If it is not secreted, it will be present in the cytoplasm. In the case of intracellular protein, the host cells are usually first mechanically destroyed. In the case of a protein characterized by periplasmic localization, mechanical disruption or osmotic treatment can be used to release the periplasmic contents into the buffer solution, and then the polypeptide is isolated from this solution. Purification from solution may then be carried out using various methods.

Если белок синтезируется так, что он содержит метку, такую как гексагистидин или другой, малый пептид на своем С- или Ν-конце, он может быть, по существу, очищен в одностадийной процедуре путем пропускания раствора через аффинную колонку, где матрикс колонки характеризуется высоким сродством в отношении данной метки или непосредственно в отношении полипептида (т.е. моноклональное антитело). В случае, если полипептид не имеет метки, и антитело недоступно, для очистки могут применяться другие хорошо известные процедуры, например, ионообменная хроматография, хроматография на молекулярных ситах, хроматография на обращенной фазе, ВЭЖХ, нативный гель-электрофорез в сочетании с элюцией из геля, и препаративное изоэлектрофокусирование (прибор/способ «корите», НоеГег Заеиййс). В некоторых случаях для достижения повышенной чистоты могут комбинироваться два или большее число способов.If a protein is synthesized so that it contains a label, such as hexahistidine or another, small peptide at its C- or Ν-terminus, it can be essentially purified in a one-step procedure by passing the solution through an affinity column, where the column matrix is characterized by high affinity for a given label or directly for a polypeptide (i.e. a monoclonal antibody). If the polypeptide is unlabeled and the antibody is unavailable, other well-known procedures can be used for purification, for example, ion exchange chromatography, molecular sieve chromatography, reverse phase chromatography, HPLC, native gel electrophoresis in combination with gel elution, and preparative isoelectric focusing (device / method “reproach”, Noegeg Zaeijs). In some cases, two or more methods may be combined to achieve enhanced purity.

Полипептид - новый действующий тромболитик (ΝΑΤ), использованный здесь для иллюстрации воплощения данного изобретения, в основном относится к фибринолитически активной металлопротеиназе 8ЕО ΙΌ N0: 1. Полипептид ΝΑΤ кодируется молекулой кДНК с 8Е0 ΙΌ N0: 2, хотя любая молекула ДНК с вариантной последовательностью, кодирующей тот же самый полипептид, может использоваться для экспрессии и производства в соответствии с конкретными способами, дальнейшие ссылки на которые приведены ниже.The polypeptide is a new active thrombolytic (ΝΑΤ), used here to illustrate the embodiment of the present invention, mainly refers to the fibrinolytically active metalloproteinase 8EO ΙΌ N0: 1. The polypeptide ируется is encoded by a cDNA molecule with 8E0 ΙΌ N0: 2, although any DNA molecule with a variant sequence, encoding the same polypeptide, can be used for expression and production in accordance with specific methods, further links to which are given below.

Фибролаза описана в научной и патентной литературе; см. ссылки, приведенные выше. Обычно форма фибролазы, которая используется при воплощении данного изобретения, характеризуется последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3, которая кодируется молекулой кДНК 8Е0 ΙΌ N0: 4 или ее вариантами, кодирующими ту же аминокислотную последовательность.Fibrolase is described in the scientific and patent literature; see links above. Typically, the form of fibrolase that is used in the embodiment of this invention is characterized by the sequence 8E0 ΙΌ N0: 3, which is encoded by the cDNA molecule 8E0 ΙΌ N0: 4 or its variants encoding the same amino acid sequence.

Предпочтительно для рекомбинантной экспрессии NΑΤ используется дрожжевая система экспрессии. Особое внимание уделяется штаммам Р1сй1а, например, РюЫа раДогк, как обладающим максимальным преимуществом и предпочтительным для применения. Подробное описание такой системы может быть обнаружено в патенте США № 4855231 (81готаи е! а1.), патенте США № 4812405 (Йап е! а1.), патенте США № 4818700 (Сгедд е! а1.), патенте США № 4885242 (Сгедд), и патенте США № 4837148 (Сгедд), описания которых включены сюда в качестве ссылки. При экспрессии фибролазы в такой системе обычно используется молекула ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 5, кодирующая «препро»-последовательность (нуклеотиды 1-783), в дополнение к «зрелому» полипептиду (нуклеотиды 784-1392). При экспрессии NΑΤ в такой системе обычно используется молекула ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 6, кодирующая «препро»-последовательность (нуклеотиды 1-783), в дополнение к «зрелому» полипептиду (нуклеотиды 784-1386).Preferably, a yeast expression system is used for recombinant expression of NΑΤ. Particular attention is paid to the strains P1c1a1a, for example, PuPaa raDogk, as having the maximum advantage and preferred for use. A detailed description of such a system can be found in U.S. Pat. No. 4,855,231 (81, e! A1.), U.S. Pat. No. 4,812,405 (Yap e! A1.), U.S. Pat. No. 4,818,700 (Chedd e! A1.), U.S. Pat. No. 4,885,242 (Cg. ), and U.S. Patent No. 4,837,148 (Sgedd), the disclosures of which are incorporated herein by reference. When expressing fibrolase in such a system, the 8E0 ΙΌ N0: 5 DNA molecule, which encodes a “prepro” sequence (nucleotides 1–783), is used in addition to a “mature” polypeptide (nucleotides 784-1392). When NΑΤ is expressed in such a system, the 8E0 ΙΌ N0: 6 DNA molecule, which encodes a “prepro” sequence (nucleotides 1–783), is used in addition to a “mature” polypeptide (nucleotides 784–1386).

Фибринолитическую металлопротеиназу, использованную согласно изобретению, независимо от того, представляет ли она собой NΑΤ, фибролазу, или некоторую другую фибринолитическую металлопротеиназу, вводят в виде фармацевтически приемлемого раствора, отдельно или в присутствии дополнительных фармацевтически приемлемых ингредиентов. Если это требуется, такой раствор может включать в себя, в дополнение к фибринолитической металлопротеиназе и растворителю (т.е. дистиллированной воде или физиологическому раствору), стандартные ингредиенты, такие как стабилизаторы (для предотвращения агрегации белка или физической или химической деградации водных сред), наполнители (для обеспечения наполнения), разбавители, антибактериальные средства, антиоксиданты и так далее, в общепринятых количествах. Известные наполнители, которые могут быть включены в композицию,The fibrinolytic metalloproteinase used according to the invention, regardless of whether it is NΑΤ, fibrolase, or some other fibrinolytic metalloproteinase, is administered as a pharmaceutically acceptable solution, alone or in the presence of additional pharmaceutically acceptable ingredients. If required, such a solution may include, in addition to fibrinolytic metalloproteinase and a solvent (i.e., distilled water or physiological saline), standard ingredients such as stabilizers (to prevent protein aggregation or physical or chemical degradation of aqueous media), fillers (to ensure filling), diluents, antibacterial agents, antioxidants, and so on, in conventional amounts. Known fillers that may be included in the composition,

- 7 007654 охватывают многоатомные спирты (включая маннит, сорбит и глицерин); сахара (включая глюкозу и сахарозу); и аминокислоты (включая аланин, глицин и глутаминовую кислоту). См., например, Кешшдΐοη'δ Рйагтасеи11са1 8с1епсез, Маск РиЬШЫпд Сотрапу, Истон, Пенсильвания. См. также XVО 01/24817 А2 (которая включена сюда полностью в качестве ссылки), где описаны различные композиции фибринолитических средств, используемых согласно настоящему изобретению.- 7 007654 encompass polyhydric alcohols (including mannitol, sorbitol and glycerin); sugar (including glucose and sucrose); and amino acids (including alanine, glycine and glutamic acid). See, for example, Cheshdΐοη'δ Rhythasei11c1 8c1epsez, Musk Rhyshpd Sotrapu, Easton, PA. See also XVO 01/24817 A2 (which is incorporated herein by reference in its entirety) for various compositions of fibrinolytic agents used according to the present invention.

Требуется, чтобы фармацевтическая композиция была забуферена перед введением (биологически совместимым буферным средством, например, лимонной кислотой или солью лимонной кислоты) до рН, нейтральной или близкой ней (7,0) и обычно составляющей от 6,5 и до 8,0 (±0,5).The pharmaceutical composition is required to be buffered prior to administration (with a biocompatible buffering agent, for example, citric acid or a salt of citric acid) to a pH of neutral or close to it (7.0) and usually between 6.5 and 8.0 (± 0.5).

Если ион металла фибринолитической металлопротеиназы представляет собой цинк, как в фибролазе или ΝΑΤ, будет предпочтительно включить в качестве стабилизатора водорастворимую соль цинка (например, сульфат цинка или ацетат цинка). Для дальнейшего усиления долгосрочной стабильности и срока хранения композиции также является предпочтительным замораживать раствор или преобразовывать его в лиофилизованный (высушенный вымораживанием) продукт, который оттаивает или восстанавливается перед использованием, в зависимости от обстоятельств.If the metal ion of the fibrinolytic metalloproteinase is zinc, as in fibrolase or ΝΑΤ, it will be preferable to include a water-soluble zinc salt (for example, zinc sulfate or zinc acetate) as a stabilizer. To further enhance the long-term stability and shelf life of the composition, it is also preferable to freeze the solution or convert it into a lyophilized (freeze-dried) product that thaws or restores before use, as the case may be.

В порядке иллюстрации, замораживаемая жидкая медицинская композиция, которая может использоваться согласно способу данного изобретения, включает в себя фибролазу или ΝΑΤ, водорастворимую цинковую соль, буфер на основе лимонной кислоты, необязательно дополнительный стабилизатор, выбранный из группы, состоящей из водорастворимых солей кальция, и, необязательно, наполнитель (например, маннит). Для увеличения стабильности при замораживании-оттаивании может также добавляться поверхностно-активное вещество, такое как Т\гееп 80® (ΒΑ8Ε, битее, Иллинойс). Буфер Тт (81дта, 81. Боше, Миссури) или другой буфер с буферной емкостью выше рН 7,0 может добавляться для стабилизации рН на уровне рН 7,4 или выше. Большая часть данных ингредиентов присутствует в малых количествах, изменяющихся от 0,001 до 2,0 ммоль/л (мМ), или в количествах менее 10% (мас./об.). Буферное средство добавляют в количестве, достаточном для достижения требуемого значения рН, и данное количество может изменяться в зависимости от конкретного препарата.By way of illustration, a freezing liquid medical composition that can be used according to the method of the present invention includes fibrolase or ΝΑΤ, a water-soluble zinc salt, a citric acid buffer, optionally an additional stabilizer selected from the group consisting of water-soluble calcium salts, and, optionally a bulking agent (e.g. mannitol). To increase stability during freeze-thawing, a surfactant, such as T \ Gep 80® (ΒΑ8Ε, Bitter, Illinois) can also be added. Tm buffer (81dta, 81. Boche, Missouri) or another buffer with a buffer capacity above pH 7.0 can be added to stabilize the pH at pH 7.4 or higher. Most of these ingredients are present in small amounts, varying from 0.001 to 2.0 mmol / L (mM), or in amounts of less than 10% (w / v). The buffering agent is added in an amount sufficient to achieve the desired pH value, and this amount may vary depending on the particular preparation.

В порядке дальнейшей иллюстрации, лиофилизируемая или лиофилизированная фармацевтическая композиция, которая может использоваться согласно способу данного изобретения, включает в себя фибролазу или ΝΑΤ, цинковый стабилизатор (например, водорастворимую соль цинка, такую как указанные выше) и буфер на основе лимонной кислоты, с другими наполнителями (например, такими наполнителями как маннит, глицин и т.д.) или без них. Лиофилизованная композиция также может содержать сахар-дисахарид, такой как сахароза или трегалоза, в качестве средства защиты при лиофилизации. Для защиты фибринолитической металлопротеиназы (например, фибролазы или ΝΑΤ) от стрессов лиофилизации может добавляться поверхностно-активное вещество, такое как Тетееп 80®. рН в идеале поддерживается на уровне рН 8,0±0,5 с использованием подходящего буфера с рК_а в данном интервале (например, Тпз). Количество ингредиентов соответствует указанным выше.As a further illustration, a lyophilized or lyophilized pharmaceutical composition that can be used according to the method of the present invention includes fibrolase or ΝΑΤ, a zinc stabilizer (for example, a water-soluble zinc salt, such as those mentioned above) and citric acid buffer, with other excipients (for example, such excipients as mannitol, glycine, etc.) or without them. The lyophilized composition may also contain a sugar disaccharide, such as sucrose or trehalose, as a protective agent in lyophilization. To protect fibrinolytic metalloproteinase (e.g., fibrolase or ΝΑΤ) from lyophilization stresses, a surfactant such as Teteep 80® can be added. The pH is ideally maintained at a pH of 8.0 ± 0.5 using a suitable buffer with pK _a over a given range (e.g., Tp). The number of ingredients corresponds to the above.

Как отмечалось, в некоторых осуществлениях способ согласно изобретению использовали для местного введения биологически эффективных количеств фибринолитической металлопротеиназы в интервале дозировок от 0,025 до 1,7 мг/кг. Предпочтительно, данное количество будет заключено в интервале примерно от 0,1 до 0,5 мг/кг. Концентрация раствора составляется в соответствии с этим в разведениях, на которые влияют потребности введения.As noted, in some implementations, the method according to the invention was used for topical administration of biologically effective amounts of fibrinolytic metalloproteinase in a dosage range from 0.025 to 1.7 mg / kg. Preferably, this amount will be in the range of about 0.1 to 0.5 mg / kg. The concentration of the solution is made in accordance with this in dilutions that are affected by the needs of the introduction.

В отличие от лечения тромбоза природной артерии или вены, такого как РАО, лечение кровяного сгустка, находящегося в имплантированном или стационарном устройстве сосудистого доступа, связано с дополнительными затруднениями. Например, в случае закупорки центральной венозной линии «мертвый объем» катетера (т.е. внутренний диаметр катетера, умноженный на его длину) определяет максимальный объем, который может быть помещен внутрь катетера. Например, катетер с внутренним диаметром 1,0 мм и длиной 40,0 см обладает мертвым объемом, составляющим ~0,3 мл. Поскольку объем может быть столь ограниченным, важно определить надлежащую концентрацию раствора. Соответственно, повышенная концентрация раствора является эффективным средством для увеличения количества лекарственного средства, доступного для растворения целевого кровяного сгустка.In contrast to the treatment of natural artery or vein thrombosis, such as RAO, the treatment of a blood clot located in an implanted or stationary vascular access device is associated with additional difficulties. For example, in the event of a blockage of the central venous line, the “dead volume” of the catheter (i.e., the inner diameter of the catheter times its length) determines the maximum volume that can be placed inside the catheter. For example, a catheter with an inner diameter of 1.0 mm and a length of 40.0 cm has a dead volume of ~ 0.3 ml. Since the volume can be so limited, it is important to determine the proper concentration of the solution. Accordingly, an increased concentration of the solution is an effective means to increase the amount of drug available to dissolve the target blood clot.

В некоторых осуществлениях способ согласно изобретению касается применения фибринолитической металлопротеиназы для лечения закупорок, ассоциированных с устройством сосудистого доступа. Такие сгустки могут находиться внутри или вокруг устройства сосудистого доступа или могут быть прикреплены к нему. Обычно сгустки образуются в просвете или выходном порте устройства, такого как катетер, и могут препятствовать функционированию катетера. Сгустки также могут находиться снаружи устройства сосудистого доступа, в виде нашлепки, которая может закрывать выходной порт и, таким образом, предотвращать введение лекарственного средства или забор крови. Сгустки также могут прикрепляться к устройству сосудистого доступа, что препятствует надлежащему функционированию устройства. Данная помеха может быть результатом частичной закупорки или блокады, т. е. когда некоторая часть жидкости может проходить, или полной закупорки, при которой жидкость проходить не может.In some implementations, the method according to the invention relates to the use of fibrinolytic metalloproteinase for the treatment of blockages associated with a vascular access device. Such clots can be located inside or around the vascular access device or can be attached to it. Typically, clots form in the lumen or outlet port of a device, such as a catheter, and can interfere with the functioning of the catheter. The clots can also be located outside the vascular access device, in the form of a blotch, which can close the outlet port and, thus, prevent the introduction of the drug or blood sampling. Clots can also attach to the vascular access device, which interferes with the proper functioning of the device. This interference may be the result of a partial blockage or blockage, i.e. when a certain part of the liquid can pass, or a complete blockage in which the liquid cannot pass.

Для демонстрации одного из способов согласно изобретению использовали модель закупорки катетера ίη νίίτο для симуляции сгустка в устройстве типа стационарного катетера. В данной модели покрытые коллагеном пастеровские пипетки использовали для симуляции стационарной части катетера. КровьTo demonstrate one of the methods according to the invention, the ίη νίίτο catheter blockage model was used to simulate a clot in a device such as a stationary catheter. In this model, collagen-coated Pasteur pipettes were used to simulate the stationary part of the catheter. Blood

- 8 007654 человека забирали посредством палочки для взятия крови из пальца под действием капиллярных сил на длину 3,0 мм, и давали ей возможность свернуться. Кончик одной из пипеток вводили в пузырек, содержащий солевой раствор, а другой - в раствор 4 мг ΝΑΤ (100 мкл с концентрацией раствора 40 мг/мл). На фиг. 5 проиллюстрированы результаты данной модели закупорки катетера ίη νίΐτο, которые указывают на то, что сгусток в солевом растворе остается интактным, в то время как раствор 40 мг/мл активно растворяет сгусток.- 8 007654 people were taken by means of a stick for taking blood from a finger under the action of capillary forces to a length of 3.0 mm, and gave it the opportunity to curl. The tip of one of the pipettes was introduced into a vial containing saline solution, and the other into a 4 mg раствор solution (100 μl with a solution concentration of 40 mg / ml). In FIG. Figure 5 illustrates the results of this model of ίη νίΐτο catheter occlusion, which indicate that the clot in the saline solution remains intact, while the 40 mg / ml solution actively dissolves the clot.

В другом эксперименте отдельную группу пипеток (каждая из которых содержит на своем конце кровяной сгусток) вводили и инкубировали в пузырьке, содержащем следующее: 100 мкл солевого раствора, 100 мкл раствора урокиназы (5000 МЕ/мл) и 100 мкл раствора ΝΑΤ, где количество лекарственного средства изменялось от 0,5 до 4 мг при увеличении концентрации раствора от 5 до 40 мг/мл. На фиг. 6 проиллюстрированы итоговые результаты многочисленных экспериментов, где полученные в результате средние данные показывают, что ΝΑΤ разрешает закупорки ίη νίίτο максимум на 40% быстрее, чем АЬЬокшаке® Ореп Са1й®, коммерческий продукт урокиназы для очистки катетера (вторая колонка, 500 МЕ Великобритании). На фиг. 6 также демонстрируется зависимая от дозы природа ΝΑΤ, в понятиях скорости, с которой действует ΝΑΤ, протеолитически расщепляя кровяной сгусток.In another experiment, a separate group of pipettes (each containing a blood clot at its end) was introduced and incubated in a vial containing the following: 100 μl of saline solution, 100 μl of urokinase solution (5000 IU / ml) and 100 μl of solution ΝΑΤ, where the amount of drug funds ranged from 0.5 to 4 mg with an increase in the concentration of the solution from 5 to 40 mg / ml. In FIG. Figure 6 illustrates the final results of numerous experiments, where the resulting average data show that ает resolves occlusions ίη νίίτο maximum 40% faster than Albokshake® Orep Ca1y®, a commercial urokinase product for catheter cleaning (second column, 500 IU UK). In FIG. Figure 6 also demonstrates the dose-dependent nature of ΝΑΤ, in terms of the speed at which ΝΑΤ acts, proteolytically cleaving a blood clot.

Для лечения относительно малой закупорки стационарного катетера, такой как симулированная моделью закупорки катетера ίη νίΐτο, предпочтительный интервал для лечения может составлять примерно от 5 до 40 мг/мл фибролазы, ΝΑΤ или другой фибринолитической металлопротеиназы. Однако в зависимости от типа и размера устройства сосудистого доступа или другого медицинского устройства, и положения, размера и степени сгустка или закупорки, могут требоваться меньшие или большие дозы. Например, сгусток в относительно большом шунте для гемодиализа будет, вероятно, требовать более высокой концентрации фибринолитической металлопротеиназы, чем сгусток, блокирующий выходной порт катетера диаметром 10 мм. В соответствии с этим, концентрации для данного показания могут изменяться в пределах от 0,1 мг/мл или менее до значений свыше 80 мг/мл.For the treatment of relatively small clogging of a stationary catheter, such as the simulated закупη νίΐτο catheter clogging model, the preferred treatment interval may be from about 5 to 40 mg / ml fibrolase, ΝΑΤ, or other fibrinolytic metalloproteinase. However, depending on the type and size of the vascular access device or other medical device, and the position, size and degree of clot or blockage, smaller or larger doses may be required. For example, a clot in a relatively large hemodialysis shunt will likely require a higher concentration of fibrinolytic metalloproteinase than a clot blocking the outlet port of a catheter 10 mm in diameter. Accordingly, concentrations for a given indication can range from 0.1 mg / ml or less to values above 80 mg / ml.

Для кровяных сгустков, находящихся внутри, вокруг стационарного катетерного устройства или прикрепленных к нему, эффективная доза может доставляться любыми путями, включая пульсирующую инфузию, длительную инфузию, болюсное введение или комбинацию всех трех. За счет сложностей, вызванных затруднениями «мертвого объема», в общем, предпочтительным является болюсное введение.For blood clots located inside, around, or attached to a fixed catheter device, the effective dose can be delivered by any means, including pulsatile infusion, continuous infusion, bolus administration, or a combination of all three. Due to the difficulties caused by the difficulties of "dead volume", in general, a bolus injection is preferred.

В обычном случае способ согласно изобретению осуществляется в сочетании с управляемой катетером процедурой тромболиза. Такие процедуры охватывают применение предварительно стерилизованного устройства доставки лекарственного средства катетерного типа, боковые стенки которого могут быть сделаны из тонкого, полужесткого или гибкого биологически совместимого материала (например, полиолефина, фторполимера или другого инертного полимера). В общем, подходящие катетеры содержат по меньшей мере одну внутреннюю полость (или просвет), проходящую по всей длине устройства. Материал, из которого сконструирован катетер, является достаточно гибким для того, чтобы двигаться внутри сосудистого русла без причинения травмы стенкам кровеносных сосудов, но при этом достаточно жестким для того, чтобы дотянуться до участка обработки, притом, что внутренняя полость устройства остается полностью расширенной. Обычно такое катетерное устройство изменяется в интервале от 2 до 20 по французской шкале для диаметров катетеров (1/3 мм равняется 1 французской единице) и составляет в длину от 2 до 6 футов или более.In the usual case, the method according to the invention is carried out in combination with a catheter-driven thrombolysis procedure. Such procedures include the use of a pre-sterilized catheter-type drug delivery device, the side walls of which can be made of a thin, semi-rigid or flexible biocompatible material (e.g., polyolefin, fluoropolymer or other inert polymer). In general, suitable catheters comprise at least one internal cavity (or lumen) extending over the entire length of the device. The material from which the catheter is constructed is flexible enough to move inside the vascular bed without causing injury to the walls of the blood vessels, but stiff enough to reach the treatment area, despite the fact that the internal cavity of the device remains fully expanded. Typically, such a catheter device ranges from 2 to 20 on the French scale for catheter diameters (1/3 mm equals 1 French unit) and is 2 to 6 feet or more in length.

Типовые катетерные устройства для внутрисосудистой доставки тромболитических лекарственных средств согласно изобретению проиллюстрированы на фиг. 2 и 3, виды практического применения которых подробно описаны в приведенных ниже примерах. Однако может использоваться любое общепринятое устройство катетерной доставки или сосудистого доступа, которое подходит для данного способа, включая, в качестве неограничивающих примеров, указанные здесь конкретные устройства.Typical catheter devices for intravascular delivery of thrombolytic drugs according to the invention are illustrated in FIG. 2 and 3, the practical applications of which are described in detail in the examples below. However, any conventional catheter delivery or vascular access device that is suitable for the method may be used, including, but not limited to, the specific devices indicated herein.

Например, на фиг. 2 проиллюстрирован тип катетерного устройства, сконструированного для локализованной доставки тромболитического средства в кровеносный сосуд. Устройство, показанное в боковом поперечном разрезе, содержит «боковые отверстия» в конце доставки, через которые испускается продукт инфузии (тромболитическое средство) при приложенном давлении жидкости. Диаметры катетерных трубок на данной фигуре и последующей фигуре увеличены относительно общего размера для лучшего отображения деталей. См. также фиг. 3, на которой иллюстрируется боковой поперечный разрез альтернативного типа катетерного устройства для локализованной доставки тромболитического средства в кровеносный сосуд. Данное устройство содержит узкие щели, обозначаемые как «выходные отверстия для ответа на давление» (ΡΚΌ), которые прорезаны в стенке катетера с регулярными интервалами, так, что продукт инфузии выходит при достижении давления жидкости внутри катетера критической точки, что вызывает открывание щели. Данное устройство может использоваться в сочетании с автоматическим, управляемым поршнем, устройством пульсовой инфузии (не показано, но описано ниже), способным доставлять порции лекарственного средства для инфузии.For example, in FIG. 2 illustrates a type of catheter device designed for the localized delivery of a thrombolytic agent into a blood vessel. The device, shown in lateral cross-section, contains “side openings” at the end of delivery through which an infusion product (thrombolytic agent) is emitted at an applied fluid pressure. The diameters of the catheter tubes in this figure and the following figure are increased relative to the overall size for better display of details. See also FIG. 3, which illustrates a lateral cross section of an alternative type of catheter device for localized delivery of a thrombolytic agent into a blood vessel. This device contains narrow slots, referred to as “pressure response outlets” (ΡΚΌ), which are cut into the catheter wall at regular intervals so that the infusion product exits when the fluid pressure inside the catheter reaches a critical point, which causes the gap to open. This device can be used in combination with an automatic, piston-controlled, pulse infusion device (not shown, but described below) that can deliver portions of a drug for infusion.

Для кровяных сгустков, которые находятся в вене или артерии и не ассоциированы с введением устройства сосудистого доступа или другого медицинского устройства, эффективная доза фибринолитической металлопротеиназы может доставляться через катетер в локальный участок обработки путем пульсирующей инфузии, непрерывного введения, болюсной инфузии или сочетания всех трех способов.For blood clots that are located in a vein or artery and are not associated with the introduction of a vascular access device or other medical device, an effective dose of fibrinolytic metalloproteinase can be delivered via a catheter to a local treatment site by pulsed infusion, continuous injection, bolus infusion, or a combination of all three methods.

- 9 007654- 9 007654

Сила раствора (т.е. концентрация) фибринолитической металлопротеиназы в растворе для лечения также является значимым параметром для данных типов сгустков. Более конкретно, следует выбрать интервал между минимальным разведением фибринолитической металлопротеиназы для эффективности на нижней границе (что особенно важно для болюсного введения) и максимальной растворимостью фибринолитической металлопротеиназы на высшей границе. В общем, используют концентрации растворов, находящиеся в пределах примерно от 0,1 до 80 мг/мл. Затем выбирают объем болюса (или общий объем множественных болюсов в случае «пульсовой» доставки) для доставки эффективного количества фибринолитической металлопротеиназы в предписанных выше пределах.The strength of the solution (i.e. concentration) of fibrinolytic metalloproteinase in the treatment solution is also an important parameter for these types of clots. More specifically, the interval between the minimum dilution of fibrinolytic metalloproteinase for efficacy at the lower boundary (which is especially important for bolus administration) and the maximum solubility of fibrinolytic metalloproteinase at the highest boundary should be selected. In general, solution concentrations ranging from about 0.1 to 80 mg / ml are used. Then choose the volume of the bolus (or the total volume of multiple boluses in the case of "pulse" delivery) to deliver an effective amount of fibrinolytic metalloproteinase within the limits prescribed above.

Описание конкретных осуществленийDescription of specific implementations

Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые, как подразумевается, являются только иллюстративными и не ограничивают изобретение описанными осуществлениями. В данных примерах и по всему описанию данного изобретения «кг» означает килограммы массы тела тестируемого субъекта, «мг» означает миллиграммы, «мл» означает миллилитры и «мин» означает минуты. Иллюстрируемая фибринолитическая металлопротеиназа, а именно, новый действующий тромболитик (ΝΑΤ), получена рекомбинантным способом и создана согласно способам, указанным выше.The invention is further illustrated by the following examples, which are intended to be illustrative only and not to limit the invention to the described embodiments. In these examples and throughout the description of the invention, “kg” means kilograms of body weight of the test subject, “mg” means milligrams, “ml” means milliliters, and “min” means minutes. Illustrated fibrinolytic metalloproteinase, namely, a new active thrombolytic (ΝΑΤ), obtained by the recombinant method and created according to the methods described above.

Пример 1. Тромболиз при подостром тромбозе общей сонной артерии взрослых свиней.Example 1. Thrombolysis in subacute thrombosis of the common carotid artery of adult pigs.

ΝΑΤ исследовали в модели подострого тромбоза сонной артерии у взрослых свиней со средней массой тела 75 кг в контрактной лаборатории (Сйат1е8 Ктует ЬаБогакпек, ЗоиЛЬпйде, Массачусетс). Назначением данного исследования было определение фибринолитической активности ΝΑΤ в модели тромбоза, которая имеет отношение к закупорке периферических артерией у человека.ΝΑΤ investigated in a model of subacute carotid artery thrombosis in adult pigs with an average body weight of 75 kg in a contract laboratory (Syat1e8 Ktuet LaBogakpek, Zoylpyde, Massachusetts). The purpose of this study was to determine the fibrinolytic activity of ΝΑΤ in a model of thrombosis, which is related to occlusion of peripheral arteries in humans.

В данной модели на животных сонную артерию подвергали тромбозу по всей ее длине (примерно 20 см от ее начала у аорты до бифуркации сонной артерии) сочетанием баллонного повреждения, тромбина и застоя. Размер тромба приближается к размеру тромба, встречающегося у человека с закупоркой периферических артерий. После успешного тромбоза животным позволяли восстанавливаться в течение четырех суток. Четырехсуточный период выбирали для обеспечения интенсивного перекрестного связывания фибрина, ремоделирования тромба и инфильтрации клеток. Примечательно, что размер и возраст тромба в данной модели вполне обоснованы в плане величины или длительности симптомов ишемии, о которых сообщали в последнем опубликованном испытании ΤΟΡΑ8 тромболиза активаторами плазминогена при закупорке периферических артерий у человека. Для ссылки см. Оипе1 е1 а1., Νον Еид1аий 1оитиа1 о£ Мейкте, Уо1ите 338, рр. 1105-1111 (1998).In this animal model, the carotid artery was subjected to thrombosis along its entire length (approximately 20 cm from its beginning in the aorta to the carotid bifurcation) by a combination of balloon injury, thrombin and stagnation. The size of a blood clot is close to the size of a blood clot that occurs in humans with obstruction of peripheral arteries. After successful thrombosis, the animals were allowed to recover for four days. The four-day period was chosen to ensure intensive cross-linking of fibrin, remodeling of the thrombus, and cell infiltration. It is noteworthy that the size and age of the thrombus in this model are quite justified in terms of the magnitude or duration of the symptoms of ischemia, which were reported in the last published trial of ΤΟΡΑ8 thrombolysis by plasminogen activators in case of occlusion of peripheral arteries in humans. For reference, see Oepe1 e1 a1., Νον Eid1aii oitia1 o £ Make, Uoite 338, pp. 1105-1111 (1998).

В кратком изложении, общая сонная артерия может быть подвергнута тромбозу по всей ее длине путем баллонного повреждения, направляемого флуороскопией. Используемые баллоны характеризуются повышенным размером и не соответствуют диаметру сосуда. Баллоны заполняют газом при давлениях выше двенадцати атмосфер, что вызывает сдавливающее повреждение внутреннего слоя сосуда. В то время как баллон раздувается, его двигают назад и вперед для того, чтобы сорвать эндотелий сосудов.In summary, the common carotid artery can be thrombosed along its entire length by balloon injury guided by fluoroscopy. Used cylinders are characterized by increased size and do not correspond to the diameter of the vessel. Cylinders are filled with gas at pressures above twelve atmospheres, which causes compressive damage to the inner layer of the vessel. While the balloon inflates, it is moved back and forth in order to disrupt the vascular endothelium.

Процедура применения баллонов очень травматична и приводит к образованию высоко тромбогенной поверхности сосудов, и повторяется во всей длине общей сонной артерии. После тщательного повреждения всей артерии баллон отводят назад в проксимальное положение вблизи аорты и раздувают для прекращения тока через сосуд. После закупорки через дистальный порт баллонного катетера вводят 50 ед. бычьего тромбина для стимуляции свертывания. Баллон остается раздутым в течение периода 30 мин, что приводит к тромботической закупорке сосуда. Через 30 мин баллон сдувают и записывают ангиограмму для подтверждения того, что сосуд стал закупоренным. С данными процедурами закупорка сосуда осуществлялась более чем в 90% случаев.The procedure for using the balloons is very traumatic and leads to the formation of a highly thrombogenic surface of the vessels, and is repeated along the entire length of the common carotid artery. After thorough damage to the entire artery, the balloon is retracted to the proximal position near the aorta and inflated to stop the flow through the vessel. After blockage, 50 units are administered through the distal port of the balloon catheter. bovine thrombin to stimulate coagulation. The balloon remains inflated for a period of 30 minutes, resulting in thrombotic blockage of the vessel. After 30 minutes, the balloon is deflated and an angiogram recorded to confirm that the vessel has become clogged. With these procedures, vessel blockage was carried out in more than 90% of cases.

На фиг. 1А представлена фоновая ангиограмма сонной артерии взрослой свиньи перед индуцированным баллонным катетером повреждением и образованием закупоривающего тромба. Стрелки показывают положение и присутствие контрастирующей среды в левой общей сонной артерии, указывая на то, что ток крови в данной артерии не прекращен (т.е. кровеносный сосуд «раскрыт» или имеет ). Фиг. 1В представляет собой ангиограмму, полученную на 4 сутки у того же животного перед введением ΝΑΤ согласно способу данного изобретения. Стрелка указывает на положение левой общей сонной артерии, однако, контрастирующая среда не течет в артерии вследствие присутствия закупоривающего тромба. Фиг. 1С представляет собой ангиограмму через 2 ч после введения 30 мг ΝΑΤ через катетер «ΡΚΟ» (см. фиг. 3 для иллюстрации данного устройства). Стрелка указывает на наличие в сосуде контрастирующей среды, что демонстрирует восстановление раскрытия левой каротидной артерии. Минимальный остаточный тромб виден в просвете артерии.In FIG. 1A shows a background angiogram of an adult pig carotid artery before balloon-catheter-induced damage and clogging. The arrows indicate the position and presence of the contrast medium in the left common carotid artery, indicating that the blood flow in the artery has not stopped (ie, the blood vessel is “open” or has). FIG. 1B is an angiogram obtained on day 4 from the same animal before administration of ΝΑΤ according to the method of the present invention. The arrow indicates the position of the left common carotid artery, however, the contrast medium does not flow into the artery due to the presence of an obstructing thrombus. FIG. 1C is an angiogram 2 hours after administration of 30 mg ΝΑΤ through the catheter “ΡΚΟ” (see Fig. 3 for an illustration of this device). The arrow indicates the presence of a contrast medium in the vessel, which demonstrates the restoration of the opening of the left carotid artery. A minimal residual thrombus is visible in the lumen of the artery.

После того как тромбоз произошел, баллонный катетер, направляющий катетер и футляр для доступа удаляют, и животному дают возможность восстанавливаться в течение четырех суток. На четвертые сутки животных подвергали повторной анестезии, опять подтверждали наличие закупорки, и под контролем флуороскопии проводили катетер для доставки лекарственных средств с множественными отверстиями (см. фиг. 2 и 3), и располагали его так, что боковые отверстия локализовались внутри тромба. Тромболиз за счет ΝΑΤ наблюдали ангиографически с использованием фиксированных дозировок ΝΑΤ, которые изменялись от 10 до 30 мг (или примерно от 0,1 до 0,4 мг/кг на основе массы), как показано на фиг. 1А-1С.After thrombosis has occurred, the balloon catheter, guide catheter and access case are removed and the animal is allowed to recover for four days. On the fourth day, the animals were re-anesthetized, blockage was again confirmed, and under the control of fluoroscopy, a catheter for drug delivery with multiple openings was performed (see Figs. 2 and 3) and positioned so that the lateral openings were localized inside the thrombus. Thrombolysis due to ΝΑΤ was observed angiographically using fixed dosages ΝΑΤ that varied from 10 to 30 mg (or from about 0.1 to 0.4 mg / kg based on weight), as shown in FIG. 1A-1C.

- 10 007654- 10 007654

Как проиллюстрировано изображением на фиг. 1В, ΝΑΤ эффективен в восстановлении антеградного потока, что оценивали путем ангиографии. Для более количественной оценки поток через целевой сосуд подсчитывали количественно по 4-балльной шкале (в интервале от 0 до 3), где = нет потока, = поток по оценке составляет менее 30% от такового в противоположной (нетромбозированной) сонной артерии, = поток по оценке составляет 30-80% от такового в противоположной сонной артерии, = поток, который не отличается от такового в противоположной сонной артерии.As illustrated by the image in FIG. 1B, ΝΑΤ is effective in restoring antegrade flow, which was evaluated by angiography. For a more quantitative assessment, the flow through the target vessel was quantified on a 4-point scale (in the range from 0 to 3), where = no flow, = estimated flow is less than 30% of that in the opposite (non-thrombosed) carotid artery, = flow according the estimate is 30-80% of that in the opposite carotid artery, = flux that does not differ from that in the opposite carotid artery.

Изображению, показанному на фиг. 1В, начисляли степень потока, эквивалентную трем (3), что является часто встречающимся результатом в тромбозированных сосудах, обработанных фиксированной 30 мг дозировкой ΝΑΤ (примерно 0,4 мг/кг на свинью массой 75 кг). Табл. 1-3 в следующих ниже примерах иллюстрируют режим лечения и средние коэффициенты потока, полученные из серийных ангиограмм. Во всех исследованиях непрерывно осуществляли мониторинг дыхания, температуры тела, частоты сердечных сокращений и артериального давления крови, и данные характеристики оставались в физиологических пределах без изменений, наблюдаемых после введения ΝΑΤ.The image shown in FIG. 1B, a flow rate equivalent to three (3) was calculated, which is a frequent result in thrombosed vessels treated with a fixed 30 mg dosage of ΝΑΤ (approximately 0.4 mg / kg per 75 kg pig). Tab. 1-3 in the following examples illustrate the treatment regimen and average flow coefficients obtained from serial angiograms. All studies continuously monitored respiration, body temperature, heart rate, and blood pressure, and these characteristics remained physiologically unchanged after administration of введения.

Пример 2. Выбор катетеров РКО и импульсно-распылительной доставки.Example 2. The choice of catheters RKO and pulsed-spray delivery.

При клиническом обслуживании закупорки периферических артерий тромболитические средства доставляли через катетеры, которые расположены вблизи или тромба или погружены в него. Как показано на фиг. 2 и 3, имеется два типа обычно применяемых катетера.In clinical maintenance, occlusion of peripheral arteries, thrombolytic agents were delivered via catheters that are located near or immersed in the thrombus. As shown in FIG. 2 and 3, there are two types of commonly used catheters.

Одна из разновидностей, катетер с «боковыми отверстиями» (фиг. 2), имеет очень маленькие круглые боковые отверстия (2), прорезанные в катетере (4) вблизи закрытого дистального конца 6, и выходной порт 8 (для раствора фибринолитической металлопротеиназы) в уплотнительном кольце 10, прикрепленном к проксимальному концу 12. Катетер 4 сконструирован из гибкого, продолговатого, биосовместимого полимерного трубочного материала, полого и тонкостенного, с однородным диаметром от 2 до 20 французских единиц, и, предпочтительно, от 3 до 5 французских единиц. Катетер содержит два непроницаемых для излучения маркера 14 на внешней поверхности вблизи дистального конца 6, которые отграничивают часть катетера, содержащую боковые отверстия 2. На практике данный катетер вставляют в хирургическое отверстие в закупоренной артерии или вене, и под наблюдением путем флуороскопии по принятым стандартным процедурам осторожно продвигают по кровеносному сосуду, так что дистальный конец 6 располагается внутри или вблизи тромба. Маркеры 14, которые явственно выявляются на изображении флуороскопа, могут служить для управления расположения данной части катетера, так что продукт инфузии, исходящий из боковых отверстий 2, будет непосредственно контактировать с тромбом. Затем фармацевтический раствор фибринолитической металлопротеиназы впрыскивают при мягком давлении из подобного шприцу резервуара 16 во входной порт 8 и продвигают в направлении дистального конца 6 с его выходом через отверстия 2 в тромб, вызывая деградацию фибринозного материала.One of the varieties, a catheter with “lateral openings” (Fig. 2), has very small round lateral openings (2) cut in the catheter (4) near the closed distal end 6, and the outlet port 8 (for a solution of fibrinolytic metalloproteinase) in the sealing a ring 10 attached to the proximal end 12. The catheter 4 is constructed from a flexible, elongated, biocompatible polymer tubing material, hollow and thin-walled, with a uniform diameter from 2 to 20 French units, and preferably from 3 to 5 French units. The catheter contains two radiation-tight markers 14 on the outer surface near the distal end 6, which delimit the part of the catheter containing the lateral openings 2. In practice, this catheter is inserted into the surgical opening in a blocked artery or vein, and carefully monitored by fluoroscopy according to standard procedures advance through the blood vessel, so that the distal end 6 is located inside or near the blood clot. Markers 14, which are clearly visible in the fluoroscope image, can serve to control the location of this part of the catheter, so that the infusion product coming from the side openings 2 will directly contact the thrombus. Then, the pharmaceutical solution of fibrinolytic metalloproteinase is injected under gentle pressure from the syringe-like reservoir 16 into the inlet port 8 and is advanced towards the distal end 6 with its outlet through the openings 2 into the thrombus, causing degradation of the fibrinous material.

Когда инфузии фибринолитической металлопротеиназы проводили с использованием данного типа катетера, большая часть содержащего фибринолитическое средство раствора стремится выйти через проксимальные боковые отверстия (т.е. ближайшие к выходному порту 8 для лекарственного средства), что вносит отрицательный вклад в однородность доставки лекарственного средства в участок лечения. Также имеется возможность обратного тока крови внутрь катетера через боковые порты 2 при отрицательном давлении.When fibrinolytic metalloproteinase infusions were performed using this type of catheter, most of the solution containing the fibrinolytic drug tends to exit through the proximal lateral openings (i.e., closest to the drug output port 8), which negatively contributes to the uniformity of drug delivery to the treatment site . There is also the possibility of a reverse flow of blood into the catheter through the side ports 2 at negative pressure.

Другая разновидность катетера, также состоящая из полого тонкостенного биологически совместимого полимерного материала, показанного на фиг. 3, имеет исключительно тонкие щели 2, которые прорезаны лазером в гибком катетере 4 с регулярными интервалами вблизи закрытого дистального конца 6. Данные щели, которые обозначены как выходные отверстия для ответа на давление («РКО»), являются достаточно тесными для того, чтобы продукт инфузии не выходил до достижения давления жидкости внутри катетера критической точки и стимуляции одновременного расширения данных щелей и, таким образом, их временного открытия. Катетер также может содержать внешние непроницаемые для излучения маркеры 8 для помощи расположения данного устройства в участке тромба.Another type of catheter, also consisting of a hollow thin-walled biocompatible polymer material, shown in FIG. 3 has exceptionally thin slits 2 that are laser-cut in a flexible catheter 4 at regular intervals near the closed distal end 6. These slots, which are designated as pressure response outlets (“PSCs”), are close enough that the product the infusion did not exit until the fluid pressure inside the catheter reached a critical point and stimulated the simultaneous expansion of these slots and, thus, their temporary opening. The catheter may also contain external radiation-tight markers 8 to help locate the device in the area of the thrombus.

В идеале такие инфузионные катетеры «РКО» используют в сочетании с автоматическим, управляемым поршнем, устройством пульсовой инфузии (не показано), способным доставлять регулируемые порции лекарственного средства для инфузии малого объема во входной порт 10 в уплотнительном кольце 12, прикрепленном к проксимальному концу 14 катетера 4. Когда порция доставлена, давление внутри катетера моментально возрастает. В ответ выходные отверстия для ответа на давление (щели 2) моментально открываются и позволяют продукту инфузии (например, фармацевтическому раствору фибринолитической металлопротеиназы) выйти. Теоретическое преимущество импульсной доставки продукта инфузии и катетера типа РКО состоит в том, что продукт инфузии доставляется однородно через щели по всей длине катетера, в то время как продукт инфузии, доставляемый через катетер с «боковыми отверстиями» (фиг. 2), следует по пути наименьшего сопротивления и, как указывалось, вытекает из проксимальных боковых щелей в неоднородной манере.Ideally, such RKO infusion catheters are used in combination with an automatic, piston-driven, pulse infusion device (not shown) capable of delivering controlled doses of small volume infusion medicine to inlet port 10 in o-ring 12 attached to the proximal end of the catheter 14 4. When the portion is delivered, the pressure inside the catheter instantly increases. In response, the pressure response openings (slots 2) instantly open and allow the infusion product (e.g., a pharmaceutical solution of fibrinolytic metalloproteinase) to exit. The theoretical advantage of pulsed delivery of the infusion product and catheter of the PKO type is that the infusion product is delivered uniformly through slots along the length of the catheter, while the infusion product delivered through the catheter with “lateral openings” (Fig. 2) follows the path least resistance and, as indicated, follows from the proximal lateral cracks in an inhomogeneous manner.

Модель на свиньях четырехсуточного тромбоза сонной артерии использовали для оценки производительности двух указанных выше типов катетеров, с применением фиксированных дозировок 30 мгA four-day carotid artery thrombosis pig model was used to evaluate the performance of the two types of catheters mentioned above, using fixed dosages of 30 mg

- 11 007654- 11 007654

ΝΑΤ (примерно 0,4 мг/кг на свинью массой 75 кг). Результаты суммированы в табл. 1.ΝΑΤ (approximately 0.4 mg / kg per pig weighing 75 kg). The results are summarized in table. one.

Таблица 1 Сравнение ангиографических коэффициентов потока, полученных с ΝΑΤ при использовании катетера с боковыми отверстиями и инфузионного катетера РКОTable 1 Comparison of angiographic flow coefficients obtained with ΝΑΤ when using a catheter with side openings and an infusion catheter RKO

Ангиографический потока Angiographic flow коэффициент coefficient Лекарственное средство Medicine Доза Dose Кат. Cat. Время доставки (объем пульсов) Time of delivery (volume of pulses) 0 0 30 мин thirty min 1 ч 1 hour 2 ч 2 h 4 ч 4 h ΝΑΤ η = 5 ΝΑΤ η = 5 30 мг 30 mg СМ CM 60 мин (инфузия) 60 min (infusion) 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0 1,2 + 0,4 1,2 + 0.4 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0.5 1,8 ± 0,4 1.8 ± 0.4 2,0 ± 0,7 2.0 ± 0.7 ΝΑΤ η = 5 ΝΑΤ η = 5 30 мг 30 mg РЗ RZ 60 мин (пульсы по 0,1 мл) 60 min (pulses of 0.1 ml) 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0 1,5 ± 0,6 1,5 ± 0.6 1,5 ± 0, 6 1,5 ± 0, 6 2,3 ± 0,5 2,3 ± 0.5 2,5 ± 0,6 2,5 ± 0.6

СМ: клапанный инфузионный катетер «с боковыми отверстиями» Сгад§-Мс№тага™ (М1сго ТЬсгарсийез. 1пс., 8ап С1стси1с. Калифорния). Р8: «пульсово-распылительная» доставка. определяемая путем использования катетера с выходными отверстиями для ответа на давление (РКО) (ип1*Ризе Са111с1сг™. АпдюОупапнсз. 1пс.. ОиеепзЬигу. НьюЙорк). используемые в сочетании с автоматическим. пульсовым устройством инфузии (ΡϋΤ8Ε*8ΡΚΑΥ 1ЮЕСТОК Мобе! Р81-1. АпфоВупатюз. 1пс.. ОиеепзЬигу. Нью-Йорк).SM: valvular infusion catheter “with lateral openings” Sgad§-Msotag ™ (M1go Tggarsiyez. 1ps., 8ap S1stsi1s. California). P8: "pulse spray" delivery. determined by using a catheter with outlet openings for responding to pressure (RCO) (un1 * Rize Ca111c1cg ™. UpdateUpApps. 1ps .. Oieepzigu. New York). used in conjunction with an automatic. pulse infusion device (ΡϋΤ8Ε * 8ΡΚΑΥ 1 Ю СТО СТО М об об е!!!!!!!!! Ап Ап Ап Ап .. .. О О. New York).

Как показано в табл. 1. ангиографические коэффициенты потока в группе. обработанной пульсовораспылительным вариантом. характеризовались чуть более высокими начальными коэффициентами потока на 30-минутной ангиограмме. что сохранялось до 4-часовой временной точки. Хотя статистически значимых различий не было получено. результаты ангиограмм в общем следует расценивать как соответствующие указанным выше. Поэтому катетер типа РКО в сочетании с пульсово-распылительной доставкой является предпочтительным способом доставки фибринолитической металлопротеиназы в сочетании с данным изобретением.As shown in the table. 1. angiographic flow coefficients in the group. treated pulsation spray option. characterized by slightly higher initial flow coefficients on a 30-minute angiogram. which lasted up to a 4-hour time point. Although statistically significant differences were not obtained. results of angiograms in general should be regarded as corresponding to the above. Therefore, a PKO-type catheter in combination with pulse-spray delivery is the preferred method for delivering fibrinolytic metalloproteinase in combination with this invention.

Пример 3. Оценка времени доставки лекарственного средства.Example 3. Estimation of drug delivery time.

Острую закупорку периферических артерий обычно лечат активаторами плазминогена. такими как урокиназа. доставляемыми в виде инфузии. которая часто длится 24 ч. и иногда в течение 48 ч. Длительная инфузия предполагает поддержание низкого уровня образования плазмина в течение продолжительного периода времени для эффективного растворения закупоривающего тромба. Поскольку ΝΑΤ и фибролаза являются фибринолитическими металлопротеиназами. такие продолжительные инфузии могут оказаться ненужными. Для оценки того. влияет ли скорость доставки на лизис сгустка по ангиографии. фиксированную дозу 30 мг ΝΑΤ (примерно 0.4 мг/кг на свинью массой 75 кг) доставляли с использованием катетеров РКО и пульсово-распылительного устройства. С использованием пульсов объемом 0.1 мл 5 мг/мл раствор ΝΑΤ доставляли в течение 6 мин (10 пульсов в минуту) или в течение 60 мин (один пульс в минуту). Результаты показаны в табл. 2.Acute occlusion of peripheral arteries is usually treated with plasminogen activators. such as urokinase. delivered as an infusion. which often lasts 24 hours and sometimes for 48 hours. Prolonged infusion involves maintaining a low level of plasmin formation over an extended period of time to effectively dissolve the clogging clot. Since ΝΑΤ and fibrolase are fibrinolytic metalloproteinases. such prolonged infusions may be unnecessary. To assess that. whether the delivery rate affects clot lysis by angiography. a fixed dose of 30 mg ΝΑΤ (approximately 0.4 mg / kg per pig weighing 75 kg) was delivered using RKO catheters and a pulse-spraying device. Using 0.1 ml pulses of 5 mg / ml, solution ΝΑΤ was delivered within 6 min (10 pulses per minute) or within 60 min (one pulse per minute). The results are shown in table. 2.

- 12 007654- 12 007654

Таблица 2table 2

Сравнение времени доставки лекарственного средства для ΝΑΤ, доставляемого катетером РКО и пульсово-распылительного инъектораComparison of drug delivery time for ΝΑΤ delivered by an RKO catheter and a pulse-spray injector

Ангиографический коэффициент потока Angiographic coefficient flow Лекарственное средство Medicine Доза Dose Кат. Cat. Время доставки (объем пульсов) Time of delivery (volume of pulses) 0 0 30 мин thirty min 1 ч 1 hour 2 ч 2 h 4 ч 4 h ΝΑΤ η = 3 ΝΑΤ η = 3 30 мг 30 mg РЗ RZ 6 мин (0,1 мл) 6 min (0.1 ml) 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0 2,7 ± 0, 6 2.7 ± 0, 6 2,7 ± 0, 6 2.7 ± 0, 6 2,7 + 0, 6 2.7 + 0, 6 2,7 ± 0, 6 2.7 ± 0, 6 ΝΑΤ η = 3 ΝΑΤ η = 3 30 мг 30 mg РЗ RZ 60 мин (0,1 мл) 60 min (0.1 ml) 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0 1,0 ± 1,0 1,0 ± 1,0 1,3 ± 1,2 1.3 ± 1,2 1,7 ± 0, 6 1.7 ± 0, 6

Как видно из табл. 2, доставка 30 мг ΝΑΤ за 6 мин приводит к среднему коэффициенту потока, составляющему 2,7, у трех животных на 30-минутной ангиограмме, что сохранялось к 4-часовой временной отметке. Доставка 30 мг ΝΑΤ путем пульсовой инфузии в течение 60 мин, наоборот, дала менее впечатляющие результаты. Хотя эти данные не сравнивали статистически, данные результаты указывают на предпочтительность доставки ΝΑΤ при более скором импульсном режиме.As can be seen from the table. 2, a delivery of 30 mg ΝΑΤ in 6 min leads to an average flow coefficient of 2.7 in three animals on a 30-minute angiogram, which remained at the 4-hour time mark. Delivery of 30 mg ΝΑΤ by pulse infusion over 60 minutes, on the contrary, gave less impressive results. Although these data were not statistically compared, these results indicate the preference for delivery ΝΑΤ at a faster pulse mode.

Пример 4. Оптимизация объема пульсов.Example 4. Optimization of the volume of pulses.

Устройство пульсово-распылительной инфузии программировали для доставки объемов пульсов от 0,1 до 0,5 мл на пульс. Для определения того, оказывает ли объем пульса какое-либо влияние на ангиографические исходы при использовании в качестве модели свиней, объемы пульсов по 0,2 мл сравнивали с объемами 0,4 мл. ΝΑΤ доставляли фиксированной дозой 10 мг (эквивалентно 0,15 мг/кг на свинью массой 75 кг). Результаты показаны в табл. 3.A pulse spray infusion device was programmed to deliver pulse volumes from 0.1 to 0.5 ml per pulse. To determine whether the pulse volume had any effect on the angiographic outcomes when using pigs as a model, 0.2 ml pulse volumes were compared with 0.4 ml volumes. ΝΑΤ delivered a fixed dose of 10 mg (equivalent to 0.15 mg / kg per pig weighing 75 kg). The results are shown in table. 3.

Таблица 3Table 3

Сравнение результатов ангиографии, полученных с использованием ΝΑΤ, доставленного при объеме пульсов 0,2 или 0,4 млComparison of angiography results obtained using ΝΑΤ delivered at a pulse volume of 0.2 or 0.4 ml

Ангиографический потока Angiographic flow коэффициент coefficient Лекарственное средство Medicine Доза Dose Кат. Cat. Время доставки (объем пульсов) Time of delivery (volume of pulses) 0 0 30 мин thirty min 1 ч 1 hour 2 ч 2 h 4 ч 4 h ΝΑΤ п = 7 ΝΑΤ n = 7 10 мг 2,5 мг/мл 10 mg 2.5 mg / ml РЗ RZ 5 мин (0,2 мл/15 с) 5 minutes (0.2 ml / 15 s) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,6 1,0 ± 0.6 1,1 ± 0,7 1,1 ± 0.7 1,6 ± 1,0 1,6 ± 1,0 1,4 ± 1,1 1.4 ± 1,1 ΝΑΤ η = 6 ΝΑΤ η = 6 10 мг 2,5 мг/мл 10 mg 2.5 mg / ml РЗ RZ 5 мин (0,4 мл/30 с) 5 minutes (0.4 ml / 30 s) 0, 0 ± 0,0 0, 0 ± 0,0 1,2 ± 0,4 1,2 ± 0.4 1,0 + 0, 6 1,0 + 0, 6 0, 8 ± 0, 8 0, 8 ± 0, 8 1,0 ± 0,6 1,0 ± 0.6

Как показано в табл. 3, после 30 мин средний ангиографический коэффициент был немного выше в группе объема пульса 0,4 мл. Однако на четырехчасовой временной отметке среднее по группе было немного выше в группе объема пульса 0,2 мл. По существу, из данных исследований нельзя сделать какоголибо заключения в отношении того, является ли один из объемов пульса наилучшим.As shown in the table. 3, after 30 min, the average angiographic coefficient was slightly higher in the 0.4 ml pulse volume group. However, at the four-hour time mark, the group average was slightly higher in the group of pulse volume 0.2 ml. In fact, from these studies it is impossible to draw any conclusions as to whether one of the pulse volumes is the best.

Результаты в предшествующем тексте и таблицах указывают на то, что фактически все из данных режимов лечения ΝΑΤ эффективны при лечении закупорки периферических артерий способом доставки согласно изобретению и что данные результаты по меньшей мере сравнимы с таковыми для активаторов плазминогена, таких как урокиназа, лечение которыми является современным лечением выбора тромбоThe results in the preceding text and tables indicate that virtually all of these treatment regimens are effective in treating peripheral artery occlusion with the delivery method of the invention and that these results are at least comparable to those for plasminogen activators, such as urokinase, which are modern in treatment thrombotic treatment

- 13 007654 литическими средствами.- 13,007654 by lytic means.

Данные результаты демонстрируют, что катетер РКО с пульсово-распылительной доставкой, как оказывается, обеспечивает наилучшие ангиографические результаты. По массе тела животных в данном исследовании (70-100 кг) фиксированная дозировка 30 мг примерно эквивалентна 0,3-0,4 мг/кг на основе массы. Снижение фиксированной дозировки ΝΑΤ до 10 мг приводит к снижению групповых средних ангиографических коэффициентов через 4 ч, и у некоторых животных раскрытие сосуда не достигалось.These results demonstrate that a pulmonary-pulmonary delivery pulmonary delivery catheter appears to provide the best angiographic results. By animal body weight in this study (70-100 kg), a fixed dosage of 30 mg is approximately equivalent to 0.3-0.4 mg / kg based on weight. A decrease in the fixed dosage ΝΑΤ to 10 mg leads to a decrease in the group mean angiographic coefficients after 4 hours, and in some animals, vessel opening was not achieved.

Это указывает на то, что доза 10 мг ΝΑΤ, как оказалось, является пороговой дозой для биологической активности в данной модели. По массе тела животных в данном исследовании (70-100 кг) фиксированная дозировка 10 мг примерно эквивалентна 0,1-0,15 мг/кг на основе массы. Изменение объема пульса от 0,2 до 0,4 мл, как оказалось, существенно не влияет на ангиографические коэффициенты раскрытия.This indicates that a dose of 10 mg ΝΑΤ, as it turned out, is a threshold dose for biological activity in this model. By animal body weight in this study (70-100 kg), a fixed dosage of 10 mg is approximately equivalent to 0.1-0.15 mg / kg based on weight. Changing the pulse volume from 0.2 to 0.4 ml, as it turned out, does not significantly affect the angiographic opening coefficients.

Пример 5. Установление интервала безопасных, хорошо переносимых, биологически эффективных доз для человека.Example 5. The establishment of an interval of safe, well-tolerated, biologically effective doses for humans.

Не существует удовлетворительной литературы по концентрации или биохимической активности а₂-макроглобулина у пожилых пациентов с заболеванием периферических сосудов (РУО). Поскольку концентрации а₂-макроглобулина представляют собой ключевую детерминанту безопасности и, вероятно, относятся к переносимости фибринолитических металлопротеиназ ίη νίνο, у пациентов с РУО проводили перекрестное эпидемиологическое исследование для оценки концентрации а₂-макроглобулина в сыворотке и емкости связывания фибринолитической металлопротеиназы (с использованием ΝΑΤ в качестве тестируемого средства).There is no satisfactory literature on the concentration or biochemical activity of a ₂ -macroglobulin in elderly patients with peripheral vascular disease (CBR). Since concentrations of a ₂ -macroglobulin are a key safety determinant and probably relate to the tolerance of fibrinolytic metalloproteinases ίη νίνο, a cross-epidemiological study was conducted in patients with CBR to assess the concentration of a ₂ -macroglobulin in serum and the binding capacity of fibrinolytic metalloproteinase (using ΝΑΤ in as a test tool).

Двести шестьдесят пациентов рекрутировали в двух центрах (С1стс1апб Сйшс Роипбайоп, С1стс1апб. Огайо, и Косйейег Оепега1 Но§рйа1, Косйейег, Нью-Йорк). Собирали демографическую информацию и другие характеристики пациентов и сыворотку получали для измерения а₂-макроглобулина, емкости связывания ΝΑΤ (путем титрования образцов сыворотки отдельных пациентов с использованием ВЭЖХанализа, в котором детектируется несвязанный ΝΑΤ) и других параметров химии сыворотки. Первичный выходной параметр представлял собой определение взаимоотношений между концентрацией α₂макроглобулина в крови и количеством ΝΑΤ (в микрограммах на миллилитр сыворотки), которое может нейтрализоваться ίη νίΙΐΌ (емкость связывания ΝΑΤ).Two hundred and sixty patients were recruited in two centers (C1sts1apb Sysshs Roibbayop, C1sts1apb. Ohio, and Cosjeeg Oepega1 Nogrya1, Cosjeeg, New York). Demographic information and other patient characteristics were collected and serum was obtained to measure a ₂ -macroglobulin, binding capacity ΝΑΤ (by titration of serum samples of individual patients using HPLC analysis, in which unbound ΝΑΤ was detected) and other parameters of serum chemistry. The primary output parameter was the determination of the relationship between the concentration of α ₂ macroglobulin in the blood and the amount of ΝΑΤ (in micrograms per milliliter of serum), which can be neutralized by ίΙΐΌη νίΙΐΌ (binding capacity ΝΑΤ).

Сравнение характеристик пациентов в данном исследовании с таковыми двух наибольших опубликованных исследований тромболиза в РАО (т.е. исследований 8ΤΙΕΕ и ΤΟΡΑ8) выявило, что популяция пациентов в данном исследовании отображалась в предыдущих исследованиях тромболиза в РАО; для дальнейших подробностей предшествующих исследований см. Динар о£ 8игдегу, Уо1ише 220, рр. 251266 (1994) и Оипе1 е! а1., Νονν Епд1апб 1оигпа1 о£ Мебкше, Уо1ише 338, рр. 1105-1111 (1998) соответственно.Comparison of the characteristics of patients in this study with those of the two largest published studies of thrombolysis in RAO (i.e., studies 8ΤΙΕΕ and ΤΟΡΑ8) revealed that the patient population in this study was reflected in previous studies of thrombolysis in RAO; for further details of previous studies, see Dinar on 8 8igdegu, Woishche 220, pp. 251266 (1994) and Oipe1 e! a1., Νονν Епд1апб 1Оппа о о Mebkshe, Уо1шеше 338, рр. 1105-1111 (1998), respectively.

Оценочную максимальную дозу (ЕМЭ) для ΝΑΤ рассчитывали для каждого пациента с использованием емкости связывания ΝΑΤ и оценки объема плазмы каждого пациента. Результаты исследования предсказывают, что средний пациент мог получать дозировку 1,7 мг/кг (доставленную местно или системно) без превышения способности а₂-макроглобулина к связыванию и нейтрализации ΝΑΤ. Результаты данного исследования суммированы на фиг. 4.The estimated maximum dose (EME) for ΝΑΤ was calculated for each patient using the binding capacity ΝΑΤ and the estimated plasma volume of each patient. The results of the study predict that the average patient could receive a dosage of 1.7 mg / kg (delivered topically or systemically) without exceeding the ability of a ₂ -macroglobulin to bind and neutralize ΝΑΤ. The results of this study are summarized in FIG. 4.

На фиг. 4 оценочную максимальную дозу ΝΑΤ рассчитывали для каждого из 216 субъектов в данном исследовании. Результаты данного исследования отображены вверху в виде гистограммы, где при визуальной оценке может наблюдаться колоколообразное распределение. Предсказано, что средний пациент данного исследования способен переносить 1,7 мг/кг ΝΑΤ (пик колоколообразного распределения). Дозировки, вводимые в исследованиях на животных, показаны для ссылки (правая сторона) и, как можно видеть, превышают оценочную максимальную дозу ΝΑΤ для 99% популяции исследования.In FIG. A 4 estimated maximum dose ΝΑΤ was calculated for each of the 216 subjects in this study. The results of this study are displayed at the top in the form of a histogram, where a bell-shaped distribution can be observed with a visual assessment. The average patient of this study was predicted to tolerate 1.7 mg / kg ΝΑΤ (peak bell-shaped distribution). Dosages administered in animal studies are shown for reference (right side) and, as can be seen, exceed the estimated maximum dose ΝΑΤ for 99% of the study population.

Таким образом, предписанный для изобретения интервал от 0,025 до 1,7 мг/кг представляет собой рациональную оценку дозы, которую могут безопасно получать пациенты (на основе объема плазмы и способности связывать ΝΑΤ для а₂-макроглобулина) без появления свободного ΝΑΤ в циркуляции.Thus, the range of 0.025 to 1.7 mg / kg prescribed for the invention is a rational estimate of the dose that patients can safely receive (based on plasma volume and the ability to bind ΝΑΤ for a ₂ -macroglobulin) without the appearance of free ΝΑΤ in the circulation.

В заключение, результаты типовых фармакологических исследований, примеров 1-4, приведенных выше, указывают на биологическую эффективность фибринолитической металлопротеиназы в качестве средства лизиса сгустка в моделях тромбоза на животных, где тромб сравним по размеру и возрасту с тем, который часто возникает при закупорке периферических артерий у человека. Дозировки, выявленные в моделях на животных, получали без отношения или оценки потенциальных видов токсичности для животного. Эффективные дозировки для кроликов и собак (3,7 и 4,0 мг/кг соответственно), как описано Αΐιιικά е! а1. и Магк1апб е! а1. (см. выше), могут дать возможность для ветеринарного применения фибринолитических металлопротеиназ. Однако введение доз 3,7 и 4,0 мг/кг при рассмотрении в свете данных по человеку привело бы к передозировке у 99% исследованной популяции. Поэтому опубликованные исследования на животных не дают возможности для терапевтического применения фибринолитических металлопротеиназ у человека безопасным, а также биологически эффективным способом. С другой стороны, данные, представленные в примере 5, дают возможность для такого применения у человека.In conclusion, the results of the model pharmacological studies, examples 1-4 above, indicate the biological effectiveness of fibrinolytic metalloproteinase as a means of clot lysis in animal thrombosis models, where a blood clot is comparable in size and age to that which often occurs when peripheral arteries are blocked in humans. Dosages identified in animal models were obtained without regard to or assessment of potential types of toxicity to the animal. Effective dosages for rabbits and dogs (3.7 and 4.0 mg / kg, respectively) as described Αΐιιικά e! a1. and Magk1apb e! a1. (see above), may provide an opportunity for veterinary use of fibrinolytic metalloproteinases. However, the introduction of doses of 3.7 and 4.0 mg / kg when viewed in the light of human data would lead to an overdose in 99% of the studied population. Therefore, published animal studies do not provide the opportunity for the therapeutic use of fibrinolytic metalloproteinases in humans in a safe, as well as biologically effective way. On the other hand, the data presented in example 5, provide an opportunity for such use in humans.

Claims

1. A method of lysing a blood clot in or around a stationary vascular access device or a blood clot attached to it for use in humans, comprising administering through said vascular access device an amount of fibrinolytic metalloproteinase that does not exceed 1.7 mg of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of human body weight.

2. A method of proteolytic degradation of a blood clot in or around a stationary vascular access device or a blood clot attached to it for use in humans, comprising administering through this vascular access device a certain amount of fibrinolytic metalloproteinase, which forms a complex with alpha-2-macroglobulin, where a given amount sufficient to facilitate lysis of the clot, but it does not exceed a level significantly exceeding the level of saturation of alpha-2-macroglobulin at the specified person.

3. The method according to claim 1 or 2, comprising from 0.1 to 80 mg / ml fibrinolytic metalloproteinase.

4. The method according to claim 1 or 2, comprising from 0.1 to 50 mg / ml fibrinolytic metalloproteinase.

5. The method according to claim 1 or 2, wherein said vascular access device is a catheter.

6. The method according to claim 1 or 2, wherein said vascular access device is a shunt.

7. The method according to claim 1 or 2, wherein said vascular access device is an access graft.

8. The method according to claim 1 or 2, wherein said vascular access device is a needle.

9. The method according to claim 1 or 2, where the vascular access device is used to introduce a liquid composition into a human artery or vein.

10. The method according to claim 1 or 2, where the vascular access device is used to select blood from a human artery or vein.

11. The method according to claim 1 or 2, where the vascular access device is used in connection with the hemodialysis procedure.

12. The method according to claim 1 or 2, where the vascular access device is used in connection with a blood transfusion procedure.

13. The method according to claim 1 or 2, where the vascular access device is used in connection with chemotherapy.

14. The method according to claim 1 or 2, which is used to treat obstruction of peripheral arteries.

15. The method according to claim 1 or 2, where the vascular access device is used in connection with the selection of blood.

16. The method according to claim 1 or 2, where the specified blood clot is located on the inner surface of a stationary vascular access device.

17. The method according to claim 1 or 2, where the specified blood clot is located on the outer surface of a stationary device for vascular access.

18. The method according to claim 1 or 2, wherein said blood clot is attached to a stationary vascular access device.

19. The method according to claim 1 or 2, wherein said vascular access device is located in an artery.

20. The method according to claim 1 or 2, wherein said vascular access device is located in a vein.

21. The method according to claim 1 or 2, in which the specified device vascular access includes a catheter device with side holes.

22. The method according to claim 1 or 2, where the specified vascular access device includes a catheter delivery device with "outlet for response to pressure" (ΡΚΌ).

23. The method according to claim 1 or 2, in which the solution of fibrinolytic metalloproteinase is administered using a bolus.

24. The method according to claim 1 or 2, in which the fibrinolytic metalloproteinase includes a new active thrombolytic (ΝΑΤ).

25. The method according to claim 1 or 2, in which fibrinolytic metalloproteinase includes fibrolase.

26. A method of restoring the disclosure of a stationary vascular access device for use in a person having a fibrin-based blockage, comprising administering through the said vascular access device a certain amount of fibrinolytic metalloproteinase, which forms a complex with alpha-2-macroglobulin, where this amount is sufficient to facilitate clot lysis , but it does not exceed a level significantly exceeding the level of saturation of alpha2-macroglobulin in the specified person, where the specified amount of no more than 1.7 milligrams of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of body weight.

27. A method of restoring the functioning of a stationary vascular access device for use in a person having a fibrin-based blockage, comprising administering through the vascular access device a certain amount of fibrinolytic metalloproteinase, which forms a complex with alpha-2-macroglobulin, where this amount is sufficient for

- 15 007654 facilitating clot lysis, but it does not exceed a level significantly exceeding the saturation level of alpha-2-macroglobulin in the specified person, where the specified amount does not exceed 1.7 mg of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of human body weight.

28. The use of fibrinolytic metalloproteinase in an amount not exceeding 1.7 mg of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of human body weight, in a pharmaceutically acceptable solution, in the manufacture of a medicament for the therapeutic treatment of a blood clot in or around said stationary vascular access device or a blood clot attached thereto .

29. The use of fibrinolytic metalloproteinase, which forms a complex with alpha-2 macroglobulin, in an amount sufficient to facilitate clot lysis, but not exceeding a level significantly exceeding the saturation level of alpha-2-macroglobulin located inside, around the stationary vascular access device or attached to it a clot, in a pharmaceutically acceptable solution, in the manufacture of a medicament for proteolytic degradation of a blood clot in or around the stationary disorders of vascular access or a blood clot attached to it.

30. The use of claim 28 or 29, wherein the fibrinolytic proteinase is in a concentration of 0.1 to 80 mg / ml.

31. The use of claim 28 or 29, wherein the fibrinolytic proteinase is in a concentration of from 0.1 to 50 mg / ml.

32. The use of claim 28 or 29, wherein said vascular access device is a catheter.

33. The application of claim 28 or 29, wherein said vascular access device is a shunt.

34. The use of claim 28 or 29, wherein said vascular access device is an access graft.

35. The use of claim 28 or 29, wherein said vascular access device is a needle.

36. The application of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used to administer the fluid composition to a human artery or vein.

37. The application of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used to select blood from a human artery or vein.

38. The application of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used in connection with the hemodialysis procedure.

39. The application of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used in connection with a blood transfusion procedure.

40. The use of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used in connection with chemotherapy.

41. The application of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used in the treatment of occlusion of peripheral arteries.

42. The use of claim 28 or 29, wherein the vascular access device is used in connection with a blood sampling.

43. The application of claim 28 or 29, wherein said blood clot is located on the inner surface of a stationary vascular access device.

44. The application of claim 28 or 29, wherein said blood clot is located on the outer surface of the stationary vascular access device.

45. The application of claim 28 or 29, wherein said blood clot is attached to a stationary vascular access device.

46. The use of claim 28 or 29, wherein said vascular access device is located in an artery.

47. The application of claim 28 or 29, wherein said vascular access device is located in a vein.

48. The application of claim 28 or 29, wherein said vascular access device includes a “lateral opening” catheter device.

49. The application of claim 28 or 29, wherein said vascular access device includes a catheter delivery device with “pressure response exit ports”.

50. The use of claim 28 or 29, wherein said drug is prepared for bolus administration.

51. The use of claim 28 or 29, wherein the fibrinolytic metalloproteinase includes a new active thrombolytic (ΝΑΤ).

52. The use of claim 28 or 29, wherein the fibrinolytic metalloproteinase includes fibrolase.

53. The use of fibrinolytic methyloproteinase in an amount that forms a complex with alpha-2-macroglobulin, and in an amount sufficient to facilitate clot lysis, but not exceed

- 16 007654 at a level significantly exceeding the level of saturation of alpha-2-macroglobulin in a human subject, in a pharmaceutically acceptable solution, where the specified amount does not exceed 1.7 mg of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of body weight of a human subject, in the manufacture of a medicament to restore disclosure stationary device for vascular access, characterized by blockage on the basis of fibrin.

54. The use of fibrinolytic metalloproteinase in an amount that forms a complex with alpha-2-macroglobulin, and in an amount sufficient to facilitate clot lysis, but not exceeding a level significantly exceeding the level of saturation of alpha-2-macroglobulin, in a human subject, in a pharmaceutically acceptable solution where the indicated amount does not exceed 1.7 mg of fibrinolytic metalloproteinase per kilogram of body weight of a human subject, in the manufacture of a medicament to restore the functioning of the hospital Nogo vascular access device, characterized occlusion based on fibrin.

55. The method according to claims 1, 2, 26 and 27, where the concentration of the provided fibrinolytic metalloproteinase is from 5.0 to 40 mg / ml

56. The application of paragraphs 28, 29, 53 and 54, where the concentration of the provided fibrinolytic metalloproteinase is from 5.0 to 40 mg / ml

57. The dose of fibrinolytic metalloproteinase, which forms a complex with alpha-2 macroglobulin, where the specified dose ranges from 0.5 to 4.0 mg.

58. The dose of claim 57, wherein said dose is selected from the group consisting of 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, and 4.0 mg.

59. The dose of claim 57, wherein the fibrinolytic metalloproteinase is a new active thrombolytic (ΝΑΤ).

60. The dose of claim 57, wherein the fibrinolytic metalloproteinase is fibrolase.

61. A method of restoring the disclosure of a stationary vascular access device, comprising bringing said device into contact with a dose according to any one of claims 57-59.

62. The method of claim 61, wherein the fibrinolytic metalloproteinase covalently binds to alpha-2 macroglobulin.