DK172014B1

DK172014B1 - Process for enzymatically treating xantham gum with a view to improving the filterability of aqueous solutions thereof

Info

Publication number: DK172014B1
Application number: DK200887A
Authority: DK
Inventors: Daniel Ballerini; Yves Benoit; Frederic Monot
Original assignee: Inst Francais Du Petrole
Priority date: 1987-04-15
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1997-09-15
Also published as: DK200887A; DK200887D0

Description

DK 172014 B1DK 172014 B1

Formålet med den foreliggende opfindelse er at beskrive en forbedring af fremgangsmåden ifølge US patent nr. 4.431.734 i ansøgers navn.The object of the present invention is to describe an improvement in the method of US Patent No. 4,431.734 in the name of the applicant.

I dette patent beskrives en fremgangsmåde til enzymatisk be-5 handling af xanthangummi med henblik på forbedring af filtrerbar-heden og pumpebarheden af vandige opløsninger af xanthangummi ved deres indsprøjtning og cirkulering gennem olieførende lag med henblik på at forbedre indvindingen af råolie. Denne fremgangsmåde omfatter en passende behandling med to enzymatiske systemer, den •jo første af polysaccharasetypen ved surt eller nogenlunde neutralt pH og den anden af proteasetypen ved basisk, neutralt eller surt pH, og fremgangsmåden gør det muligt at forbedre xanthanopløsningers pumpebarhed og udflydningsevne gennem olieførende lag uden at vigtige egenskaber hos polysacchariderne går tabt, navnlig deres 15 fortykkende evne.This patent describes a process for enzymatic treatment of xanthan gum to improve the filterability and pumpability of aqueous solutions of xanthan gum by their injection and circulation through oil-bearing layers to improve the recovery of crude oil. This process comprises an appropriate treatment with two enzymatic systems, the first one of the polysaccharase type at acidic or somewhat neutral pH and the second of the protease type at basic, neutral or acidic pH, and the method allows to improve the pumpability and flowability of xanthan solutions through oil-bearing layers. without losing important properties of the polysaccharides, especially their thickening ability.

Ifølge dette patentskrift kan den enzymatiske behandling ved hjælp af et enzym af polysaccharasetypen og et enzym af proteasetypen udføres enten samtidigt ved en pH-værdi, som er forenelig med en tilstrækkelig aktivitet af de to enzymsystemer, eller ved på hinan-20 den følgende trin ved en pH-værdi, der er egnet til den enzymtype, der er valgt i hvert trin. Der opnås de bedste resultater, hvis man anvender to på hinanden følgende trin, idet det første trin udføres med polysaccharasen, og det andet trin derefter udføres med proteasen.According to this patent, the enzymatic treatment by means of a polysaccharase-type enzyme and a protease-type enzyme can be carried out either simultaneously at a pH compatible with a sufficient activity of the two enzyme systems, or at the following steps at a pH value suitable for the enzyme type selected in each step. The best results are obtained if two consecutive steps are used, the first step being performed with the polysaccharase, and the second step then performed with the protease.

De enzymekstrakter, der kaldes polysaccharaser, og som sædvan-25 ligvis opnås fra aerobiske kulturer af svampe, der hidrører fra klassen Basidiomycetes, eller de svampe, som hidrører fra f.eks. slægterne Aspergillus, Fusarium, Myrothecium, Penicillium, Polyporus, Rhizopus, Sclerotinia, Sporotrichum og Trichoderma, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge dette patentskrift. Disse enzymer, som 30 er i stand til at hydrolysere polysacchariderne, sælges sædvanligvis under navnet cellulaser og anvendes ved fremgangsmåden ifølge dette patentskrift ved sådanne pH-, temperatur- og saltkoncentrationsbetingelser, at egenskaberne af selve xanthangummien ikke påvirkes kendeligt.The enzyme extracts called polysaccharases, which are usually obtained from aerobic cultures of fungi derived from the class Basidiomycetes, or the fungi derived from e.g. the genera Aspergillus, Fusarium, Myrothecium, Penicillium, Polyporus, Rhizopus, Sclerotinia, Sporotrichum and Trichoderma may be used in the method of this patent. These enzymes, which are capable of hydrolyzing the polysaccharides, are usually sold under the name cellulases and are used in the process of this patent under such pH, temperature and salt concentration conditions that the properties of the xanthan gum itself are not appreciably affected.

35 Den anden kategori af enzymekstrakter, som kan anvendes til at komplementere forannævnte kategori ved fremgangsmåden ifølge dette patentskrift, omfatter klassen af bakterielle proteaser. Disse proteaser frembringes almindeligvis af mikroorganismer af Bacillus-slægten, såsom B.subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens og B.pumilis, eller også af Streptomyces-slægten, såsom S.fradiae, DK 172014 B1 2 S.griseus og S.rectis. Enzymkilden er dog ikke kritisk. Disse protea-ser har alt efter omstændighederne en optimal aktivitet ved en let sur, neutral eller basisk pH-værdi og kaldes derfor sure, neutrale henholdsvis alkaliske proteaser.The second category of enzyme extracts which can be used to complement the aforementioned category by the method of this patent comprises the class of bacterial proteases. These proteases are commonly produced by microorganisms of the Bacillus genus such as B.subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens and B.pumilis, or also of the Streptomyces genus such as S.fradiae, S.griseus and S. rectis. However, the enzyme source is not critical. These proteases, as the case may be, have optimum activity at a slightly acidic, neutral or basic pH and are therefore called acidic, neutral or alkaline proteases, respectively.

5 Den enzymatiske behandling ifølge denne fremgangsmåde finder fortrinsvis sted under en inkuberingsperiode, hvis totale varighed ligger mellem 0,5 og 60 timer og fortrinsvis mellem 4 og 48 timer, ved temperaturer, som går fra omgivelsestemperatur (ca. 25°C) indtil ca. 65°C og fortrinsvis fra 40 til 60°C. De korte behandlingstider vil 10 fortrinsvis være forbundet med hævede temperaturer og omvendt. De enzymatiske behandlinger udføres i et vandigt miljø med en koncentration af opløst salt af alkalimetaller og/eller jordalkalimetaller på -2 -1 mindst 10 ækvivalenter/liter, fortrinsvis mindst 10 ækvivalenter/ liter. Den ved denne fremgangsmåde opnåede relative synergistiske 15 virkning er dog større, desto større behandlingsvandets saltindhold er. Et specielt aspekt ved fremgangsmåden ifølge dette patentskrift ligger i den kendsgerning, at den synergistiske aktivitet af de to enzympræparationer ligeledes opnås i nærværelse af bivalente ioner, f.eks. Ca eller Mg , og navnlig aflejringsvand.The enzymatic treatment according to this method preferably takes place during an incubation period, the total duration of which is between 0.5 and 60 hours and preferably between 4 and 48 hours, at temperatures ranging from ambient temperature (about 25 ° C) to approx. 65 ° C and preferably 40 to 60 ° C. The short processing times will preferably be associated with elevated temperatures and vice versa. The enzymatic treatments are carried out in an aqueous environment with a concentration of dissolved salt of alkali metals and / or alkaline earth metals of -2 -1 at least 10 equivalents / liter, preferably at least 10 equivalents / liter. However, the relative synergistic effect obtained by this process is greater the greater the salt content of the treatment water. A particular aspect of the process of this patent lies in the fact that the synergistic activity of the two enzyme preparations is also achieved in the presence of bivalent ions, e.g. Ca or Mg, and in particular deposition water.

20 Et første formå! med den foreliggende opfindelse er at tilveje bringe en forbedret fremgangsmåde til klaring af vandige opløsninger af xanthangummi, ved hvilken fremgangsmåde dette gummis fortyk-kende evne bevares. Et andet formål med opfindelsen omfatter en forbedret klaring af fermenteringsråsaften såvel som vandige disper-25 sioner af xanthangummi, som kan fås i form af pulver. Et andet formål med opfindelsen er elimineringen af uopløselige cellulære rester hidrørende fra fermenteringsprocessen af disse xanthangummi-er. Et andet formål med opfindelsen er en forbedring af disse xan-thangummiopløsningers pumpebarhed til brug ved indvinding af olie 30 under anvendelse af hjælpestoffer. Endnu et andet formål med opfindelsen omfatter eliminering af mikrogeler og således forbedring af disse xanthangummiers flydeevne i en olieførende formation i en vis afstand fra indsprøjtningsbrønden. Endelig ligger et andet formål med opfindelsen i anvendelsen af faste sammensætninger, som gør det 35 muligt at forbedre xanthangummiopiøsningers klarhed, pumpebarhed og udflydningsevne.20 A first ability! The present invention provides an improved method for clarifying aqueous solutions of xanthan gum, which preserves the thickening ability of this gum. Another object of the invention comprises improved clarification of the fermentation raw juice as well as aqueous dispersions of xanthan gum which are obtainable in the form of powder. Another object of the invention is the elimination of insoluble cellular residues resulting from the fermentation process of these xanthan gums. Another object of the invention is to improve the pumpability of these xanthan gum solutions for use in recovering oil 30 using auxiliaries. Yet another object of the invention comprises elimination of microgels and thus enhancement of the flowability of these xanthan gums in an oil-bearing formation at some distance from the injection well. Finally, another object of the invention lies in the use of solid compositions which enable the clarity, pumpability and flowability of xanthan gum solutions to be improved.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at foreslå, at der anvendes andre præparationer eller enzymekstrakter til den første DK 172014 B1 3 kategori af enzymekstrakter, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge US patent nr. 4.431.734.The object of the present invention is to propose the use of other preparations or enzyme extracts for the first category of enzyme extracts used in the process of US Patent No. 4,431.734.

Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes der i stedet for en enzympræparation af polysaccharasetypen, stadig kaldet cellulase, 5 hvis enzymaktivitet hovedsagelig er en cellulolytisk aktivitet, et enzymekstrakt, hvis aktivitet hovedsagelig er en polygalacturonase-aktivitet. Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes således to enzymekstrakter af forskellige typer, et enzymekstrakt kaldet ekstrakt PG, som er defineret nedenfor, og et enzymekstrakt, kal- 10 det ekstrakt P, som er defineret nedenfor, under betingelser, som er forenelige med aktiviteten af disse enzymekstrakter.According to the present invention, instead of a polysaccharase type enzyme preparation, still called cellulase, whose enzyme activity is mainly a cellulolytic activity, an enzyme extract whose activity is mainly a polygalacturonase activity is used. Thus, according to the present invention, two enzyme extracts of different types, an enzyme extract called extract PG as defined below, and an enzyme extract called extract P defined below are used under conditions compatible with the activity of these enzyme extracts. .

De enzymekstrakter, som man anvender ved den foreliggende opfindelse, indeholder almindeligvis flere andre aktiviteter, og det er således vigtigt, at for ekstraktet PG er polygalacturonaseaktiviteten 15 hovedaktiviteten, og at de andre aktiviteter f.eks. cellulase, sur protease, xylanase osv. kun er sekundære aktiviteter. De anvendte PG-ekstrakter udviser almindeligvis kun lidt og fortrinsvis stort set ingen cellulaseaktivitet. Der anvendes fortrinsvis et enzymekstrakt, hvis polygalacturonaseaktivitet er af endotypen.The enzyme extracts used in the present invention generally contain several other activities and thus it is important that for the PG extract, the polygalacturonase activity is the main activity and that the other activities e.g. cellulase, acidic protease, xylanase, etc. are only secondary activities. The PG extracts used generally exhibit little and preferably virtually no cellulase activity. Preferably, an enzyme extract is used whose polygalacturonase activity is of the endotype.

20 Som hovedaktivitet forstår man den enzymaktivitet, som almin deligvis stort set er dominerende blandt de talrige aktiviteter, som et enzymekstrakt udviser. Udskillelsen af denne aktivitet favoriseres ved valget af dyrkningsbetingelserne og -miljøet samt mikroorganismekilden, som er producent i det tilfælde, hvor enzymekstraktet 25 er af mikrobiel oprindelse eller stammer fra svampe. Man kan også gå igang med en separation af enzymerne, hvilket fører til en berigelse og en oprensning, som er rettet mod opnåelsen af en given aktivitet.20 As the main activity is understood the enzyme activity, which is generally largely dominant among the numerous activities that an enzyme extract exhibits. The secretion of this activity is favored by the choice of the culture conditions and environment, as well as the source of the microorganism, which is produced in the case where the enzyme extract 25 is of microbial origin or is derived from fungi. A separation of the enzymes can also be initiated, leading to an enrichment and purification aimed at the achievement of a given activity.

Med de i US patent nr. 4.431.734 anvendte enzymer har den 30 polysaccharase, som opnås ved dyrkning af basidiomycet-slægtenWith the enzymes used in U.S. Patent No. 4,431,734, it has 30 polysaccharase obtained by growing the basidiomycet genus

Poria, som anbefales i dette patentskrift, en hovedaktivitet af cellu-lasetypen på omkring 50.000 carboxymethylcellulaseenheder (CMCase) pr. gram præparat, dvs. ca. 250 enheder pr. mg protein.Poria, as recommended in this patent, is a major cellulose type activity of about 50,000 carboxymethyl cellulase units (CMCase) per cell. gram of preparation, i.e. ca. 250 units per mg of protein.

CMCase-aktiviteten, som måler cellulaseaktiviteten i et enzym-35 ekstrakt, svarer til antal mikromol glucose, som frigøres ud fraThe CMCase activity, which measures the cellulase activity in an enzyme extract, corresponds to the number of micromoles of glucose released from

carboxymethylcellutose, når forsøget udføres i 30 minutter ved pHcarboxymethyl cellutose when the experiment is carried out for 30 minutes at pH

4,6 ved 37°C. For at kunne sammenligne enzymaktiviteter af præparationer i form af pulver eller i form af væsker foretrækkes det at anvende specifikke aktiviteter (pr. mg protein).4.6 at 37 ° C. In order to be able to compare enzyme activities of preparations in the form of powders or in the form of liquids, it is preferred to use specific activities (per mg protein).

DK 172014 B1 4DK 172014 B1 4

Et enzymekstrakts polygalacturonaseaktivitet svarer til antal mikromol frigjort sur galacturonsyre ud fra polygalacturonsyre, idet forsøget udføres i 30 minutter ved pH 4,0 og ved 40°C.The polygalacturonase activity of an enzyme extract corresponds to the number of micromoles of acidic galacturonic acid released from polygalacturonic acid, the experiment being carried out for 30 minutes at pH 4.0 and at 40 ° C.

Polygalactorunaseaktiviteten i polysaccharasen i ovennævnte 5 amerikanske patentskrift, som forhandles under navnet cellulase, og som er opnået ud fra baddiomycet-slægten Poria, har ca. 5 enheder pr. mg protein.The polygalactorunase activity of the polysaccharase of the aforementioned US patent, which is negotiated under the name cellulase and obtained from the baddiomycet genus Poria, has about. 5 units per mg of protein.

Enzymaktiviteterne af polygalacturonasetypen frembringes sædvanligvis af bakteriekulturer af slægten Erwinia, Pseudomonas, gær TO af slægten Kluyveromyces eller svampene af slægten Aspergillus,The polygalacturonase type enzyme activities are usually produced by bacterial cultures of the genus Erwinia, Pseudomonas, yeast TO of the genus Kluyveromyces or the fungi of the genus Aspergillus,

Rhizopus, Fusarium, Rhizoctonia, Penidliium, Sclerotinia og Verti-cillium.Rhizopus, Fusarium, Rhizoctonia, Penidliium, Sclerotinia and Verticillium.

Ud fra en mikroorganismekilde, f.eks. Aspergillus niger, er det muligt at opnå et enzymekstrakt, hvis hovedenzymaktivitet er dels af 15 cellulasetypen (polysaccharase), dels af polygalactorunasetypen.From a microorganism source, e.g. Aspergillus niger, it is possible to obtain an enzyme extract whose main enzyme activity is partly of the cellulase type (polysaccharase) and partly of the polygalactorunase type.

Valget af carbonkilde i dyrkningsmiljøets sammensætning er vigtigt for at rette mikroorganismen mod frembringelsen af hovedsagelig én bestemt enzymaktivitet. For således at opnå polygalacturonase som hovedaktivitet er det ofte nødvendigt at anvende et kulhydrat som 20 indeholder pektin (kommercielt pektin, kornklid, roepulp ...). Miljøet kan bl.a. indeholde mineralsaltkilder og en nitrogenkilde.The choice of carbon source in the composition of the culture environment is important for directing the microorganism to the production of essentially one particular enzyme activity. Thus, to obtain polygalacturonase as the main activity, it is often necessary to use a carbohydrate containing 20 pectin (commercial pectin, cereal bran, beet pulp ...). The environment can include contain mineral salt sources and a nitrogen source.

Efter dyrkning ved f.eks. 30°C i nogle dage befries miljøet for celler ved filtrering eller centrifugering, og det kan anvendes som enzymekstrakt med en hovedaktivitet af polygalacturonase. Det er 25 desuden muligt at berige ekstraktet med hensyn til proteiner ved f.eks. ultrafiltrering eller ved præcipitering af proteiner ved hjælp af opløsningsmidler (f.eks. acetone, ethanol) eller salte (f.eks. ammoniumsulfat).After cultivation at e.g. At 30 ° C for some days, the environment is liberated from cells by filtration or centrifugation, and it can be used as enzyme extract with a major activity of polygalacturonase. In addition, it is possible to enrich the extract for proteins by e.g. ultrafiltration or by precipitation of proteins by solvents (e.g., acetone, ethanol) or salts (e.g., ammonium sulfate).

Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes enzymekstrakter, 30 som kun indeholder lidt cellulaseaktivitet. Eksempler på industrielle præparationer er navnlig de enzymekstrakter, som kaldes pektinaser, og som opnås fra en kultur af en svamp af slægten Aspergillus og nærmere bestemt hidrørende fra Aspergillus niger.According to the present invention, enzyme extracts which contain little cellulase activity are used. Examples of industrial preparations are, in particular, the enzyme extracts called pectinases, which are obtained from a culture of a fungus of the genus Aspergillus and more specifically derived from Aspergillus niger.

Proteaseaktiviteten af enzymekstrakterne af typen PG, målt i 35 ANSON-enheder pr. gram enzymekstrakt som beskrevet nedenfor, ligger almindeligvis under 0,05 enheder og fortrinsvis under 0,01 og mest fortrinsvis under 0,005. Hvis man måler de specifikke enzymaktiviteter af ekstraktet i enheder pr. mg protein, og hvis man med "C" betegner cellulaseaktiviteten og med “PG1' polygalacturonaseaktivi- DK 172014 B1 5 teten i disse ekstrakter, anvendes ved den foreliggende opfindelse fortrinsvis enzymekstrakter, hvis C/PG-forhold ligger under 1 og fortrinsvis under 0,5 og mest fortrinsvis under 0,1.The protease activity of the PG-type enzyme extracts, measured in 35 ANSON units per grams of enzyme extract as described below are generally below 0.05 units and preferably below 0.01 and most preferably below 0.005. If one measures the specific enzyme activities of the extract in units per and "PG1" polygalacturonase activity in these extracts, the present invention preferably uses enzyme extracts whose C / PG ratio is below 1 and preferably below 0, 5 and most preferably below 0.1.

Ifølge den foreliggende opfindelse forbedres således filtrerbar-5 heden af vandige opløsninger af xanthangummi ved at udføre en behandling af disse opløsninger med et enzymekstrakt, hvis hovedaktivitet er en polygalacturonaseaktivitet (PG-ekstrakt), og med et enzymekstrakt, der som hovedaktivitet har en proteaseaktivitet (dette ekstrakt vil blive kaldt "ekstrakt P") under betingelser, som 10 er forenelige med aktiviteten i disse ekstrakter.Thus, according to the present invention, the filterability of aqueous solutions of xanthan gum is improved by performing a treatment of these solutions with an enzyme extract whose main activity is a polygalacturonase activity (PG extract) and with an enzyme extract having a main activity a protease activity ( this extract will be called "extract P") under conditions which are compatible with the activity of these extracts.

Proteaseaktiviteten kan bestemmes ved KUNITZ-metoden. I dette tilfælde svarer én proteaseenhed til den mængde enzymekstrakt, som frigiver en substansmængde, der ikke kan præcipiteres med TCA (trichloreddikesyre), og som har en optisk densitet ved 550 nm lig 15 med den optiske densitet, som 0,4 g tyrosin giver med FOL.IN-reagens. Temperaturen ved forsøget var 37°C og reaktionstiden 20 minutter. I tilfældet med alkaliske eller neutrale proteaser er substratet 1% kasein og i tilfældet med sure proteaser er substratet 1% bovinserumalbumin. pH-Værdierne til måling af alkaliske, neutrale og 20 sure proteaseaktiviteter er 10, 7 henholdsvis 3.The protease activity can be determined by the KUNITZ method. In this case, one protease unit corresponds to the amount of enzyme extract which releases a quantity of substance that cannot be precipitated with TCA (trichloroacetic acid) and which has an optical density at 550 nm equal to the optical density afforded by 0.4 g of tyrosine. FOL.IN reagent. The temperature of the experiment was 37 ° C and the reaction time 20 minutes. In the case of alkaline or neutral proteases, the substrate is 1% casein and in the case of acidic proteases the substrate is 1% bovine serum albumin. The pH values for measuring alkaline, neutral and 20 acidic protease activities are 10, 7 and 3, respectively.

Andre proteaseenheder anvendes som ANSON-enheden, hvilket er den enzymmængde, som under standardbetingelser (25°C; pH 7,5; 10 minutter) fordøjer hæmoglobin med en sådan begyndelseshastighed, at den pr. minut frigør en mængde af i TCA opløseligt pro-25 dukt, som giver den samme farvning med fenolreagens som 1 mi I liækvivalent tyrosin.Other protease units are used as the ANSON unit, which is the amount of enzyme that, under standard conditions (25 ° C; pH 7.5; 10 minutes), digests hemoglobin at such an initial rate that per minute releases an amount of TCA soluble product which gives the same staining with phenol reagent as 1 ml of 1 equivalent tyrosine.

Således er f.eks. ALCALASE 0,6 L (som forhandles af Novo Industri A/S) en flydende præparation, der er opnået ved fermentering med Bacillus licheniformis, og der som hovedaktivitet (protease) 30 indeholder 0,6 ANSON-enheder pr. gram og ingen anden væsentlig enzymaktivitet.Thus, e.g. ALCALASE 0.6 L (which is sold by Novo Industri A / S) a liquid preparation obtained by fermentation with Bacillus licheniformis and containing as main activity (protease) 30, 0.6 ANSON units per grams and no other significant enzyme activity.

Generelt indeholder enzymekstrakter hidrørende fra bakterieslægten Bacillus, der som hovedaktivitet har proteaseaktivitet, praktisk talt ikke polygalacturonaseaktivitet eller cellulase blandt deres 35 sekundære aktiviteter.In general, enzyme extracts derived from the bacterial genus Bacillus, which as a main activity have protease activity, contain practically no polygalacturonase activity or cellulase among their 35 secondary activities.

Sædvanligvis har de enzymekstrakter, der som hovedaktivitet har den proteaseaktivitet, som man anvender ved den foreliggende opfindelse, polygalacturonaseaktivitet henholdsvis cellulaseaktivitet DK 172014 B1 6 udtrykt i enheder pr. mg på under 5 og fortrinsvis under 1 og mest fortrinsvis under 0,5.Generally, the enzyme extracts having the main activity of the protease activity employed in the present invention have polygalacturonase activity and cellulase activity, respectively, expressed in units per day. mg less than 5 and preferably less than 1 and most preferably less than 0.5.

De enzymekstrakter, der som hovedaktivitet har proteaseaktivi-tet, har en aktivitet målt i ANSON-enheder pr. gram enzymekstrakt 5 på sædvanligvis mindst 0,1 enhed og fortrinsvis mellem 0,2 og 10 enheder.The enzyme extracts having the main activity of protease activity have an activity measured in ANSON units per grams of enzyme extract 5 of usually at least 0.1 unit and preferably between 0.2 and 10 units.

En af de andre fordele ved den foreliggende opfindelse er, at der i polysaccharidopløsningen kun inkorporeres små proteinmængder ved at vælge en enzympræparation, der er specielt aktiv, for at 10 eliminere de tilstoppende midler, som er tilstede i polymeropløsninger. Når man anvender en enzympræparation som den, der er beskrevet i US patent nr. 4.431.734, der som hovedaktivitet har cellulaseaktivitet, og som blandt de sekundære aktiviteter indeholder polygalacturonaseaktivitet, er det nødvendigt at tilsætte enzym-T5 mængder (alts! proteiner), der er forholdsvis betydelige. I tilfældet med f.eks. cellulase opnået fra Basidiomycetslægten Poria tilsættes ifølge eksempel 1 i dette patentskrift ca. 30 vægt% enzym i forhold til polysaccharid. Det har imidlertid vist sig, at proteinerne kan spille en rolle som tilstopningsmiddel i polysaccharidopløsninger, hvis 20 de er til stede i for betydelige mængder. Følgelig er det meget fore-trukkent at tilsætte færrest mulige proteiner i tilfældet med en behandling, der har til hensigt at forbedre polysaccharidopløsningers filtrerbarhed. Det er derfor, det er passende at anvende en enzympræparation, som er aktiv på tilslagsniveauet (fr: au niveau des 25 agrégats), hvilket gør det muligt at mindske den mængde af aktivt materiale (altså proteiner), som skal inkorporeres for at opnå en virkningsfuld behandling. Man har på overraskende måde fundet, at de enzymekstrakter, som kaldes PG-ekstrakter, gør det muligt at opnå en kraftig forbedring af xanthanopløsningers filtrerbarhed, 30 navnlig når man kombinerer behandlingen med et enzymekstrakt, som har ovennævnte aktivitet, med en behandling af et enzymekstrakt kaldet ekstrakt P fra klassen af bakterielle proteaser. Man kan således ved at anvende disse to behandlinger klare polysaccharidopløsninger med meget lidt hævede proteinmængder, tydeligt mindre 35 end de mængder, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge US patent nr. 4.431.734.One of the other advantages of the present invention is that in the polysaccharide solution only small amounts of protein are incorporated by selecting an enzyme preparation that is particularly active to eliminate the clogging agents present in polymer solutions. When using an enzyme preparation such as that described in U.S. Patent No. 4,431.734, which has as its main activity cellulase activity and which, among the secondary activities, contains polygalacturonase activity, it is necessary to add enzyme T5 amounts (i.e. proteins), there are relatively significant. In the case of e.g. cellulase obtained from the Basidiomycet genus Poria according to Example 1 of this patent is added approx. 30% by weight of enzyme relative to polysaccharide. However, it has been found that the proteins may play a role as a clogging agent in polysaccharide solutions if present in excessive amounts. Accordingly, it is very preferable to add the fewest possible proteins in the case of a treatment intended to improve the filterability of polysaccharide solutions. That is why it is appropriate to use an enzyme preparation that is active at the aggregate level (fr: au level des 25 agrégats), which allows to reduce the amount of active material (ie proteins) to be incorporated to obtain a effective treatment. Surprisingly, it has been found that the enzyme extracts called PG extracts make it possible to greatly improve the filterability of xanthan solutions, especially when combining the treatment with an enzyme extract having the above activity with a treatment of an enzyme extract. called extract P from the class of bacterial proteases. Thus, using these two treatments, clear polysaccharide solutions with very little elevated protein levels can be clearly less than those used in the method of U.S. Patent No. 4,431.734.

Enzymbehandlingen ifølge den foreliggende opfindelse kan dels udføres ved den samtidige tilstedeværelse af et PG-ekstrakt og et enzymekstrakt kaldet ekstrakt P ved en pH-værdi, som er forenelig med en aktivitet, der er tilstrækkelig af de to typer aktiviteter, dels DK 172014 B1 7 ved på hinanden følgende behandlinger først ved hjælp af et enzymekstrakt af én af de ovennævnte to typer ved en pH-værdi, der er egnet for den valgte type, derefter med et enzymekstrakt af den anden type ved en pH-værdi, der er passende for denne 5 anden type, f.eks. PG-ekstraktet ved surt pH efterfulgt af P-ekstraktet ved let sur, neutral eller basisk pH alt efter P-ekstrakt-typen, eller omvendt. Der opnås de bedste resultater, hvis man opererer med to på hinanden følgende trin, først med PG-ekstraktet og derefter med P-ekstraktet.The enzyme treatment of the present invention can be performed, in part, in the simultaneous presence of a PG extract and an enzyme extract called extract P at a pH which is compatible with an activity sufficient for the two types of activity, and partly DK 172014 B1 7 by successive treatments first by means of an enzyme extract of one of the above two types at a pH suitable for the selected type, then with an enzyme extract of the other type at a pH suitable for this other type, e.g. The PG extract at acidic pH followed by the P extract at slightly acidic, neutral or basic pH depending on the P extract type, or vice versa. The best results are obtained by operating two successive steps, first with the PG extract and then with the P extract.

10 Den enzymatiske behandling ifølge opfindelsen udføres i vandigt miljø ved en koncentration af opløselige salte af alkalimetaller og/ eller jordalkalimetaller på mindst 10 ækvivalenter/liter, fortrinsvisThe enzymatic treatment of the invention is carried out in aqueous environment at a concentration of soluble salts of alkali metals and / or alkaline earth metals of at least 10 equivalents / liter, preferably

.-I.-IN

mindst 10 ækvivalenter/liter. Den opnåede relative synergistiske virkning er forholdsvis ufølsom overfor saltindholdet. Skønt salt-15 koncentrationer på over ca. 1 ækvivalent/liter kan anvendes, foretrækkes det almindeligvis at anvende koncentrationer, som ligger _p mellem mindst 10 ækvivalenter/liter og højst ca. 1 ækvivalent/liter.at least 10 equivalents / liter. The relative synergistic effect obtained is relatively insensitive to the salt content. Although salt-15 concentrations in excess of approx. 1 equivalents / liter may be used, it is generally preferred to use concentrations ranging from at least 10 equivalents / liter to no more than approx. 1 equivalent / liter.

Et specielt aspekt ved den foreliggende opfindelse ligger i den kendsgerning, at den synergistiske aktivitet af de to enzymtyper lige-20 ledes opnås i nærværelse af bivalente ioner, f.eks. Ca eller Mg og navnlig i aflejringsvand.A particular aspect of the present invention lies in the fact that the synergistic activity of the two enzyme types is also achieved in the presence of bivalent ions, e.g. Ca or Mg and especially in depositional water.

Den samtidige eller pi hinanden følgende enzymatiske behandling ifølge den foreliggende opfindelse finder fortrinsvis sted under en inkuberingsperiode, hvis totale varighed ligger mellem 0,5 og 60 25 timer og fortrinsvis mellem 4 og 48 timer ved temperaturer, som går fra ca. 15°C til ca. 70°C, fortrinsvis på mellem 20 og 60°C. De korte behandlingstider er fortrinsvis forbundet med hævede temperaturer og omvendt. Hvis man har valgt at anvende den enzymatiske behandling ved temperaturer, der er højere, kan den optimale tid 30 være forholdsvis kort, f.eks. 2-24 timer ved 50°C, 1-12 timer ved 60°C. De foretrukne temperaturer ligger mellem 20 og 60°C og overstiger fortrinsvis ikke 70°C, idet enzymekstrakterne ved temperaturer over denne temperatur er følsomme overfor en væsentlig deaktivering.The simultaneous or consecutive enzymatic treatment of the present invention preferably takes place during an incubation period, the total duration of which is between 0.5 and 60 hours and preferably between 4 and 48 hours at temperatures ranging from approx. 15 ° C to approx. 70 ° C, preferably between 20 and 60 ° C. The short processing times are preferably associated with elevated temperatures and vice versa. If one has chosen to use the enzymatic treatment at higher temperatures, the optimal time 30 may be relatively short, e.g. 2-24 hours at 50 ° C, 1-12 hours at 60 ° C. The preferred temperatures are between 20 and 60 ° C and preferably do not exceed 70 ° C, as the enzyme extracts at temperatures above this temperature are sensitive to substantial deactivation.

35 Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anven des PG-ekstrakterne under de pH-betingelser (3<pH<7), temperatur-betingelser (15-70 C) og saltkoncentration (>10”£ ækvivalenter/liter), som er angivet ovenfor, ved hvilke betingelser egenskaberne af selve xanthangummien ikke påvirkes kendeligt.35 In the process of the present invention, the PG extracts are used under the pH conditions (3 <pH <7), temperature conditions (15-70 ° C) and salt concentration (> 10 µg equivalents / liter) set forth above. , under which conditions the properties of the xanthan gum itself are not appreciably affected.

Den anden kategori af enzymekstrakter, som anvendes ifølge op- DK 172014 B1 8 findel sen, omfatter ekstrakter af klassen af bakterielle proteaser.The second category of enzyme extracts used according to the invention comprises extracts of the class of bacterial proteases.

Disse P-ekstrakter frembringes sædvanligvis af mikroorganismer af slægten Bacillus, såsom B. subtilis, B.licheniformis, B.amylo-liquefaciens og B.pumilis, eller også Streptomyces-slægten, såsom 5 S.fradiae, S.griseus og S.rectis. Kilden til ekstraktet er dog ikke kritisk. Disse P-ekstrakter har alt efter omstændighederne en optimal aktivitet ved en pH-værdi, der er let sur, neutral eller basisk og kaldes da henholdsvis surt, neutralt eller alkalisk P-ekstrakt. I tilfældet med en samtidig behandling ved hjælp af et PG-ekstrakt og •JO et P-ekstrakt vælger man naturligvis enzymarter, hvis aktivitetsområde, hvad angår pH-værdien, overlapper.These β extracts are usually produced by microorganisms of the genus Bacillus, such as B. subtilis, B. licheniformis, B. amylo-liquefaciens and B. pumilis, or also the Streptomyces genus such as S. fradiae, S. griseus and S.rectis . However, the source of the extract is not critical. These P extracts, as the case may be, have an optimum activity at a pH that is slightly acidic, neutral or basic and is then called acidic, neutral or alkaline P extract, respectively. In the case of concomitant treatment using a PG extract and • JO a P extract, of course, enzyme species whose activity range, in terms of pH, overlaps, are selected.

Skønt den synergistiske behandling ifølge den foreliggende opfindelse især finder anvendelse på dispersioner af pulverformigt xanthan-gummi i saltvand forstår det sig, at den ligeledes kan finde 15 anvendelse på fermenteringssafte. Endvidere behøver xanthangummier isoleret ud fra således behandlede fermenteringssafte ikke nogen senere enzymatisk behandling, og filtrerbarheden af vandige opløsninger heraf er betragtelig forbedret. Fremgangsmåder til isolering af en pulverformig xanthangummi ud fra fermenteringssaften er for 20 øvrigt velkendte og omfatter f.eks. en præcipitation ved hjælp af en alkohol, der er blandbar med fermenteringssaften, eller ved en tørringsfremgangsmåde ved frysetørring eller ved fordampning af opløsningsmidlet.Although the synergistic treatment of the present invention is particularly applicable to dispersions of powdered xanthan gum in saline, it is understood that it can also be applied to fermentation juices. Furthermore, xanthan gums isolated from the fermentation juices so treated do not require any subsequent enzymatic treatment and the filterability of aqueous solutions thereof is greatly improved. Methods for isolating a powdery xanthan gum from the fermentation juice are otherwise well known and include e.g. a precipitation by an alcohol miscible with the fermentation juice, or by a drying process by freeze-drying, or by evaporation of the solvent.

Den synergistiske fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfin-25 delse, hvortil anvendes en samtidig eller på hinanden følgende behandling med et PG-ekstrakt og et P-ekstrakt, gør det for det første muligt at opnå en nedbrydning af cellulære rester og bakterielle faste stoffer i suspension i xanthangummi-opløsningerne ved at omdanne dem til vandopløselige forbindelser, således at man til sidst 30 opnår en klar opløsning. Desuden, og dette er meget overraskende, gør denne samvirkende behandling det muligt at eliminere de gennemskinnelige mikrogeler, der er ansvarlige for tilstopning af olieførende formationer i en vis afstand fra indsprøjtningsbrønden. Under hele denne operation med klaring og eliminering af mikrogelerne bevares 35 xanthangummiens fortykningsevne, og de således opnåede klare opløsninger kan derefter, efter simpel fortynding og uden senere filtreringsbehandling, indsprøjtes i de olieførende formationer. Disse opløsningers pumpebarhed og udflydningsevne gennem disse formationer er klart forbedrede i forhold til isolerede behandlinger med enzym- DK 172014 B1 9 ekstrakter, hvilket let kan påvises ved korresponderende under* søgelser gennem kalibrerede filtre.First, the synergistic process of the present invention, used for a simultaneous or consecutive treatment with a PG extract and a P extract, allows the degradation of cellular residues and bacterial solids in suspension to be achieved. in the xanthan gum solutions by converting them into water-soluble compounds, so that finally a clear solution is obtained. In addition, and this is very surprising, this cooperative treatment allows the translucent microgels responsible for clogging of oil-bearing formations at some distance from the injection well to be eliminated. Throughout this operation of clearing and eliminating the microgels, the thickening ability of the xanthan gum is retained, and the clear solutions thus obtained can then, after simple dilution and without subsequent filtration treatment, be injected into the oil-bearing formations. The pumpability and flowability of these solutions through these formations is clearly improved over isolated treatments with enzyme extracts, which can be easily detected by corresponding investigations through calibrated filters.

Med henblik på at udføre den samvirkende behandling samtidigt under anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfin-5 del se kan man gå frem på følgende måde ud fra dispersioner af pulverformige xanthangummier i et vandigt system, som har det ovenfor søgte saltindhold, eller opløsninger af selve den vandige fase af fermenteringsråsafte: Om nødvendigt indstilles pH-værdien i denne opløsning til en pH-værdi, der svarer til den optimale aktivitet for 10 de to enzymekstrakttyper, og disse to enzymekstrakter tilsættes. Temperaturen holdes ved fra 15-70°C i en variabel tid til opnåelse af den ovenfor beskrevne forbedring af filtrerbarheden. Opløsningens pH-værdi genindstilles om nødvendigt til brugsværdien og efter fortynding til den ønskede koncentration og viskositet er den således 15 behandlede opløsning klar til brug.In order to perform the cooperative treatment simultaneously using the method of the present invention, one can proceed as follows from dispersions of powdered xanthan gums in an aqueous system having the salt content sought above, or solutions of the the aqueous phase of fermentation raw juice: If necessary, adjust the pH of this solution to a pH corresponding to the optimal activity for the two enzyme extract types and these two enzyme extracts are added. The temperature is maintained at from 15-70 ° C for a variable time to achieve the filterability improvement described above. If necessary, the pH of the solution is reset to its value in use and, after dilution to the desired concentration and viscosity, the solution thus treated is ready for use.

I det tilfælde hvor man ønsker at udføre den enzymatiske behandling ifølge den foreliggende opfindelse i 2 trin, kan man gå frem på følgende måde: Om nødvendigt føres pH-værdien af xanthan-gummiopløsningen til en værdi på under 7 og over 3, fortrinsvis en 20 pH-værdi på mellem 3 og 6, ved hjælp af f.eks. saltsyre, eddikesyre eller svovlsyre. PG-ekstraktet tilsættes, og temperaturen holdes på fra 15 til 70°C i løbet af den ovenfor definerede nødvendige tid, hvorefter opløsningens pH-værdi ved hjælp af en base, f.eks. natriumhydroxid eller kaliumhydroxid føres til pH-værdier på over 6 og 25 under 12, fortrinsvis en pH-værdi på mellem 6,5 og 9. Efter tilsætning af P-ekstraktet holdes temperaturen påny mellem 15 og 70°C i løbet af den ovenfor definerede nødvendige tid. Efter at have genjusteret opløsningens pH-værdi til brugs-pH-værdien og efter at have fortyndet til den ønskede koncentration og viskositet er den 30 således behandlede opløsning klar til brug.In the case where one wishes to carry out the enzymatic treatment of the present invention in 2 steps, one can proceed as follows: If necessary, the pH of the xanthan gum solution is passed to a value below 7 and above 3, preferably a 20 pH value of between 3 and 6, using e.g. hydrochloric, acetic or sulfuric. The PG extract is added and the temperature is maintained from 15 to 70 ° C during the required time defined above, whereupon the pH of the solution by a base, e.g. sodium hydroxide or potassium hydroxide is passed to pH values above 6 and 25 below 12, preferably a pH of between 6.5 and 9. After addition of the P extract, the temperature is maintained again between 15 and 70 ° C during the above defined required time. After re-adjusting the pH of the solution to the utility pH and after diluting to the desired concentration and viscosity, the solution thus treated is ready for use.

En variant af den enzymatiske behandling i 2 trin omfatter at opløsningens pH-værdi først indstilles til en værdi, som fortrinsvis ligger mellem 6,5 og 9, og at den enzymatiske behandling udføres med P-ekstraktet, før pH-værdien genjusteres til let sure værdier, 35 fortrinsvis på mellem 3 og 6, og den enzymatiske behandling med PG-ekstraktet udføres.A variant of the 2-step enzymatic treatment comprises that the pH of the solution is first adjusted to a value preferably between 6.5 and 9 and that the enzymatic treatment is carried out with the P extract before the pH is readjusted to slightly acidic values, preferably between 3 and 6, and the enzymatic treatment with the PG extract is carried out.

Under den enzymatiske behandling ifølge den foreliggende opfindelse er mængden af xanthangummi f.eks. på mellem 0,01 og 4 vægt%, fortrinsvis på mellem 0,04 og 1,5 vægt%, i forhold til vandet, DK 172014 B1 10 og mængden af hvert enzymekstrakt er f.eks. på mellem 0,01 og 10 vægt% proteiner, fortrinsvis på mellem 0,025 og 5 vægt% proteiner i forhold til vægten af xanthan, idet disse mængdeforhold Ikke er begrænsende. Den minimale mængde enzymekstrakt, som skal anven-5 des, er naturligvis en funktion af mængden af aktiv faktor (altså poiygalactorunaseaktiviteten og proteaseaktiviteten) i de valgte enzympræparationer.During the enzymatic treatment of the present invention, the amount of xanthan gum, e.g. between 0.01 and 4% by weight, preferably between 0.04 and 1.5% by weight, relative to the water, and the amount of each enzyme extract is e.g. of between 0.01 and 10% by weight of proteins, preferably of between 0.025 and 5% by weight of proteins relative to the weight of xanthan, these proportions being non-limiting. The minimum amount of enzyme extract to be used is, of course, a function of the amount of active factor (ie, the polygalactorunase activity and protease activity) in the enzyme preparations of choice.

Ifølge et yderligere aspekt ved den foreliggende opfindelse kan de faste formulationer, som indeholder xanthangummien, og de to Ί0 enzymekstrakttyper tilsættes direkte til aflejringsvandet, hvilket hermed helt eliminerer al nødvendig separat tilsætning af enzym-ekstrakter til xanthangummiopløsningen, dette gælder ved den samtidige enzymatiske behandling. Disse faste sammensætninger er en speciel fordel, når den enzymatiske klaring f.eks. skal udføres på 15 selve stedet for indvinding ved hjælp af hjælpestoffer. Den enzymatiske reaktion vil således efterhånden føre til opløsning af poly-saccharid, og hvis opløsningsvandets temperatur og pH vælges hensigtsmæssigt vil den enzymatiske behandling ikke forlænge den sædvanlige varighed af fremstillingen af den indsprøjtede xanthan-20 gummiopløsning. Det er således muligt direkte at opnå en klar opløsning, som har den ønskede viskositet, og som kan anvendes direkte uden supplerende behandling og navnlig filtrering, og som har klart forbedrede pumpe- og filtrerbarhedsegenskaber til anvendelse i indvindingsoperationer med hjælpestoffer.According to a further aspect of the present invention, the solid formulations containing the xanthan gum and the two enzym0 enzyme extract types can be added directly to the deposition water, thereby completely eliminating all necessary separate addition of enzyme extracts to the xanthan gum solution, as is the case with the simultaneous enzymatic treatment. These solid compositions are a particular advantage when the enzymatic clearance e.g. must be carried out at the site of recovery itself by means of excipients. Thus, the enzymatic reaction will eventually lead to dissolution of polysaccharide, and if the temperature and pH of the solution water are appropriately selected, the enzymatic treatment will not prolong the usual duration of preparation of the injected xanthan gum solution. Thus, it is possible to directly obtain a clear solution which has the desired viscosity and which can be used directly without adjunctive processing and in particular filtration, and which has clearly improved pumping and filterability properties for use in recovery operations with excipients.

25 En sådan fast sammensætning kan f.eks. omfatte fra 10 til 100.000 og fortrinsvis fra 20 til 40.000 vægtdele xanthangummi pr. vægtdel protein i enzymekstraktblandingen.Such a solid composition can e.g. comprise from 10 to 100,000 and preferably from 20 to 40,000 parts by weight of xanthan gum. part by weight of protein in the enzyme extract mixture.

De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen; de har ikke på nogen måde til hensigt at blive betragtet som begrænsende.The following examples illustrate the invention; they have no intention whatsoever of being considered restrictive.

3030

Eksempel 1 (sammenlignende).Example 1 (comparative).

Dette eksempel beskriver en enzymatisk behandling, hvortil medvirker en polysaccharase, som frembringes af basidiomycetslægten Poria, der udviser en cellulaseaktivitet som hovedaktivitet (25.000 35 enheder CMCase/l, dvs. 250 enheder CMCase/mg protein) og en svag polygalacturonaseaktivitet (500 polygalacturonaseenheder/l), dvs. 5 enheder/mg protein) blandt de talrige sekundære aktiviteter.This example describes an enzymatic treatment involving a polysaccharase produced by the basidiomycet genus Poria, which exhibits a cellulase activity as its main activity (25,000 35 units of CMCase / l, i.e. 250 units of CMCase / mg protein) and a weak polygalacturonase activity (500 polygalacturonase units / ), i.e. 5 units / mg protein) among the numerous secondary activities.

Der anvendtes en opløsning af 10 g/l Rhodopol 23 polysaccha-ridpulver (Rhone-Poulenc Industries - Frankrig) fremstillet i vand DK 172014 B1 11 indeholdende 1 g/l NaCI og 0,4 g/i natriumazid som bakteriostatisk middel. Efter omrøring i nogle timer blev opløsningens pH-værdi indstillet til 4,5, og temperaturen blev ført til 50°C. Derefter tilsattes 500 mg/l af en enzympræparation af polysaccharase hidrørende 5 fra basidiomycetslægten Porta, hvilken præparation fik lov til at virke i 16 timer. Den tilførte enzymmængde svarede til inkorporering af 100 mg/l proteiner (1 vægt% proteiner i forhold til xanthan). pH-værdien blev derefter indstillet til 9,0 med 1 N natriumhydroxid, og der tilsattes 500 mg/i alkalase (forhandles af Novo Industri A/S) 10 hidrørende fra en kultur af Bacillus licheniformis med en protease-aktivitet pi 0,6 ANSON-enheder pr. gram. Dette enzymekstrakt indeholdt en alkalisk proteaseaktivitet som hovedaktivitet og praktisk ingen polygalacturonaseaktivitet, ej heller cellulaseaktivitet; disse «2 aktiviteter var under 10 enheder pr. mg protein. Behandlingen 15 blev standset efter 6 timers pivirkning ved 50°C med dette enzymekstrakt.A solution of 10 g / l Rhodopol 23 polysaccharide powder (Rhone-Poulenc Industries - France) prepared in water DK 172014 B1 11 containing 1 g / l NaCl and 0.4 g / l sodium azide as bacteriostatic agent was used. After stirring for a few hours, the pH of the solution was adjusted to 4.5 and the temperature was brought to 50 ° C. Then, 500 mg / L of an enzyme preparation of polysaccharase derived from the basidiomycet genus Porta was added, which preparation was allowed to operate for 16 hours. The amount of enzyme supplied corresponded to the incorporation of 100 mg / l proteins (1 wt% of proteins relative to xanthan). The pH was then adjusted to 9.0 with 1N sodium hydroxide and 500 mg / l of alkalase (marketed by Novo Industri A / S) 10 derived from a culture of Bacillus licheniformis with a protease activity of 0.6 ANSON was added. units per gram. This enzyme extract contained an alkaline protease activity as its main activity and virtually no polygalacturonase activity, nor cellulase activity; these «2 activities were below 10 units per. mg of protein. Treatment 15 was stopped after 6 hours of pivoting at 50 ° C with this enzyme extract.

Prøver udtaget før tilsætning af enzym, efter indvirkning med polysaccharase og efter indvirkning med alkalase blev underkastet en hurtig filtrerbarhedstest, som er beskrevet i hovedpatentet, for at 20 vurdere den enzymatiske behandlings virkningsfuldhed. Denne test bestod i at lade de efter fortynding til en xanthan koncentration pi 0,4 g/l ved hjælp af vand med 1 g/l NaCI og 0,4 g/l NaN^ og efter at pH-værdien var blevet indstillet til 7 passere gennem et 0,8 pm milliporefilter (O = 47 mm) under et konstant tryk pi 10 kPa. Det 25 opsamlede volumen af filtratet blev registreret efter filtreringstiden. Resultaterne er angivet i tabel 1 nedenfor.Samples taken before addition of enzyme, after interaction with polysaccharase and after interaction with alkalase were subjected to a rapid filterability test described in the main patent to assess the efficacy of the enzymatic treatment. This test consisted of allowing, after dilution, to a xanthan concentration of 0.4 g / l by water with 1 g / l NaCl and 0.4 g / l NaN 2 and after adjusting the pH to 7 pass through a 0.8 µm millipore filter (O = 47 mm) under a constant pressure of 10 kPa. The collected volume of the filtrate was recorded after the filtration time. The results are given in Table 1 below.

Tabel 1Table 1

Opsamlet filtratvolumen efter 30 Nr. Opløsning _20 minutter_ 1 Før behandling 30 ml 2 Efter 16 timers pivirkning 160 ml med polysaccharase 35 3 Efter 22 timers pivirkning 200 ml med polysaccharase 4 Efter 16 timer (polysaccharase) 670 ml s derefter 6 timer (Alcalase) DK 172014 B1 12Collected filtrate volume after 30 no. Solution _20 minutes_ 1 Before treatment 30 ml 2 After 16 hours pivoting 160 ml with polysaccharase 35 3 After 22 hours pivoting 200 ml with polysaccharase 4 After 16 hours (polysaccharase) 670 ml s then 6 hours (Alcalase) DK 172014 B1 12

Disse resultater viser virkningsfuldheden af den kombinerede be-handling med polysaccharase-Novo-Alcalase på xanthanopløsningers filtrerbarhed og den vigtige synergistiske virkning mellem de to enzympræparater. Den relative viskositet af opløsningerne er praktisk 5 talt ikke påvirket af behandlingen.These results demonstrate the efficacy of the combined treatment with polysaccharase-Novo-Alcalase on the filterability of xanthan solutions and the important synergistic effect between the two enzyme preparations. The relative viscosity of the solutions is practically unaffected by the treatment.

Eksempel 2 (sammenlignende)Example 2 (comparative)

Den behandling, som er beskrevet i dette eksempel, er gennemført under betingelser, der er helt identiske med betingelserne 10 ved behandling nr.3 i eksempel 1 med undtagelse af den tilføjede polysaccharasemængde, som er 125 mg/l i stedet for 500 mg/l i ovennævnte eksempel, dvs. 0,25 vægt% proteiner i forhold til xanthan-vægten. De tilførte aktiviteter af cellulase og polygalacturonase var henholdsvis 6250 CMCase-enheder/l og 125 polygalacturonaseenheder/l 15 medens den var 25000 CMCase-enheder/l og 500 polygalacturonaseenheder/l i eksempel 1.The treatment described in this example was carried out under conditions that are completely identical to the conditions 10 of treatment # 3 in Example 1 except for the added amount of polysaccharase which is 125 mg / l instead of 500 mg / l above example, ie 0.25 wt% of proteins relative to the xanthan weight. The added activities of cellulase and polygalacturonase were 6250 CMCase units / L and 125 polygalacturonase units / L, respectively, while being 25000 CMCase units / L and 500 polygalacturonase units / L in Example 1.

I dette tilfælde var virkningsfuldheden af den kombinerede behandling med polysaccharase-Novo Alcalase, mindre eftersom det samlede filtratvolumen efter den kombinerede virkning med poly-20 saccharase og Novo Alcalase var 300 ml ved 20 minutter (i stedet for 670 ml i eksempel 1).In this case, the efficacy of the combined treatment with polysaccharase-Novo Alcalase was less since the total filtrate volume after the combined action with polysaccharase and Novo Alcalase was 300 ml at 20 minutes (instead of 670 ml in Example 1).

Eksempel 3 (sammenlignende).Example 3 (comparative).

Dette eksempel er beregnet til at vise indvirkningen af et en-25 zym, der som ovenfor indeholder ceJlulaseaktivitet som hovedaktivitet, men hvis polygalacturonaseaktivitet er endnu svagere end i den, der blev anvendt i eksempel 1.This example is intended to show the effect of an enzyme which, as above, contains cellulase activity as its main activity, but whose polygalacturonase activity is even weaker than that used in Example 1.

Behandlingen blev udført under lignende betingelser som i forsøg nr. 4 i eksempel 1: samme begyndelsesopløsning, identisk indvirkning 30 med Novo Alcalase (hele tiden er 2 perioder blevet afprøvet: 2 timer og 6 timer), hurtig filtrerbarhedsprøve.The treatment was carried out under similar conditions as in Experiment # 4 of Example 1: same initial solution, identical effect 30 with Novo Alcalase (2 periods and 2 hours all the time, fast filterability test, all the time).

Det enzym, der blev anvendt i begyndelsen, var en enzympræparation (i form af et frysetørret ekstrakt) frembragt af Trichoderma reesei, og som udviste en kraftig cellulaseaktivitet (200 enheder/mg 35 protein) og en meget svag polygalacturonaseaktivitet (1 enhed/mg protein). Proteinindhotdet i dette frysetørrede ekstrakt var ca. 100%, og dette ekstrakt blev tilsat i en mængde på 100 mg/l protein til opløsningen med 10 g/l Rhodopol 23 (identisk med opløsningen i eksempel 1) ført til en pH-værdi på 4,5 og 50°C, hvilket udgør de DK 172014 B1 13 optimale betingelser for enzymvirkning. Før tilsætning af P-ekstraktet (Novo Alcalase) fik cellulasen lov til at virke i 16 timer.The enzyme used initially was an enzyme preparation (in the form of a lyophilized extract) produced by Trichoderma reesei, which showed a strong cellulase activity (200 units / mg protein) and a very weak polygalacturonase activity (1 unit / mg protein). ). The protein content of this freeze-dried extract was approx. 100% and this extract was added in an amount of 100 mg / l protein to the solution with 10 g / l Rhodopol 23 (identical to the solution in Example 1) to a pH of 4.5 and 50 ° C, which they represent optimal conditions for enzyme action. Before adding the P extract (Novo Alcalase), the cellulase was allowed to work for 16 hours.

Resultaterne fra de udførte hurtige afprøvninger for filtrer-barhed er vist i tabel 2.The results from the filterability fast tests performed are shown in Table 2.

5 Tabel 2Table 2

Opsamlet filtrat volumen efterThe collected filtrate volume after

Nr. Opløsning _20 minutter_ 1 Før behandling 30 ml 10 2 Efter 16 timer (cellulase) 120 ml 3 Efter 16 timer (cellulase) 310 ml + 2 timer (Alcalase) 15 4 Efter 16 timer (cellulase) 310 ml + 6 timer (Alcalase)No. Solution _20 minutes_ 1 Before treatment 30 ml 10 2 After 16 hours (cellulase) 120 ml 3 After 16 hours (cellulase) 310 ml + 2 hours (Alcalase) 15 4 After 16 hours (cellulase) 310 ml + 6 hours (Alcalase)

Disse opløsningers relative viskositet blev praktisk talt ikke modificeret af disse enzympræparaters påvirkning.The relative viscosity of these solutions was practically not modified by the effect of these enzyme preparations.

20 Den endelige filtrerbarhed ligger under den, der blev opnået i eksempel 1. Denne enzympræparation, hvis polygalacturonase- aktivitet var svag, var ikke velegnet til at eliminere de tilstopningsmidler, som var til stede i polysaccharidopløsningen. Dette eksempel viser navnlig, at cellulaseaktiviteten ikke er den hoved-25 aktivitet, som er ansvarlig for forbedringen af filtrerbarheden.The final filterability is below that obtained in Example 1. This enzyme preparation, whose polygalacturonase activity was weak, was not well suited to eliminate the clogging agents present in the polysaccharide solution. In particular, this example demonstrates that cellulase activity is not the major activity responsible for improving filterability.

Eksempel 4 I dette eksempel anvendtes en enzympræparation opnået fra en kultur af Aspergillus niger. Dette ekstrakt, kaldet ekstrakt PG, 30 har som hovedaktivitet polygalacturonaseaktivitet.Example 4 In this example, an enzyme preparation obtained from a culture of Aspergillus niger was used. This extract, called extract PG, 30 has as its main activity polygalacturonase activity.

Behandlingen udføres under lignende betingelser som betingelserne i ovenstående eksempler, nemlig: frembringelse af en opløsning af Rhodopol 23 ved 10 g/l i vand med 1 g/l NaCI og 0,4 g/l NaNg, indvirkning ved PG-ekstraktet opnået fra Aspergillus 35 niger ved pH 4,0, 40°C i 16 timer efterfulgt af påvirkning med Novo Alcalase fra Bacillus licheniformis ved pH 9,0 og 50°C i 2 timer eller 6 timer.The treatment is carried out under conditions similar to the conditions of the above examples, namely: generation of a solution of Rhodopol 23 at 10 g / l water with 1 g / l NaCl and 0.4 g / l NaNg, effect on the PG extract obtained from Aspergillus 35 niger at pH 4.0, 40 ° C for 16 hours followed by exposure with Novo Alcalase from Bacillus licheniformis at pH 9.0 and 50 ° C for 2 hours or 6 hours.

PG-ekstraktet blev tilsat på en sådan måde, at der tilførtes 100 mg proteiner/liter. Dette enzym indeholdt lidt CNICase, ca. 1 DK 172014 B1 14 enhed/mg protein, og ca. 60 polygaiacturonaseenheder pr. mg protein, hvilket udgør hovedaktiviteten, proteaseaktiviteten var mindre end 0,01 ANSON enheder pr. g enzym.The PG extract was added such that 100 mg of protein / liter was added. This enzyme contained a little CNICase, ca. 1 DK 172014 B1 14 unit / mg protein, and approx. 60 polygaiacturonase units per mg of protein, which is the main activity, protease activity was less than 0.01 ANSON units per g of enzyme.

De udtagne opløsninger blev fortyndet til 0,4 g/l polymer og blev 5 underkastet den hurtige prøve for filtrerbarhed. Resultaterne er vist i tabel 3, og de relative viskositeter ændrede sig praktisk talt ikke i løbet af behandlingen.The extracted solutions were diluted to 0.4 g / L polymer and subjected to the rapid filterability test. The results are shown in Table 3 and the relative viscosities did not change practically over the course of treatment.

Tabet 3 10 Opsamlet filtratvolumen efterThe loss 3 10 Collected filtrate volume after

Nr. Opløsning _20 minutter_ 1 Før behandling 30 ml 2 Efter 16 timer (PG-ekstrakt ) 210 ml 15 3 Efter 18 timer (PG-ekstrakt ) 220 ml 4 Efter 22 timer (PG-ekstrakt ) 230 ml 20 5 Efter 16 timer (PG-ekstrakt ) 750 ml + 2 timer (Alcalase) 6 Efter 16 timer (PG-ekstrakt ) 820 ml + 6 timer (Alcalase) 25No. Solution _20 minutes_ 1 Before treatment 30 ml 2 After 16 hours (PG extract) 210 ml 15 3 After 18 hours (PG extract) 220 ml 4 After 22 hours (PG extract) 230 ml 20 After 16 hours (PG extract) extract) 750 ml + 2 hours (Alcalase) 6 After 16 hours (PG extract) 820 ml + 6 hours (Alcalase) 25

Resultaterne viser, at det første enzym er fuldstændigt tilpasset til at eliminere tilstoppende midler i polysaccharidopløsningen, og at den synergistiske virkning sammen med Alcalase er bemærkelsesværdig. Følgelig er erstatningen af et enzym, som udviser cellulaseaktivitet 30 som hovedaktivitet og poiygalacturonaseaktivitet som sekundær aktivitet, med et enzym, som udviser liden cellulaseaktivitet og poiygalacturonaseaktivitet som hovedaktivitet helt tilrådelig eftersom forbedringen af disse xanthanopløsningers filtrerbarhed er større.The results show that the first enzyme is completely adapted to eliminate clogging agents in the polysaccharide solution and that the synergistic effect with Alcalase is remarkable. Accordingly, the replacement of an enzyme exhibiting cellulase activity as a major activity and polyglyacturonase activity as a secondary activity with an enzyme exhibiting little cellulase activity and a polyglyacturonase activity as a major activity is highly advisable as the enhancement of the filterability of these xanthan solutions is greater.

35 Eksempel 5 (sammenlignende).Example 5 (comparative).

Den i dette eksempel beskrevne behandling blev udført under betingelser, som er identiske med betingelserne i forsøg nr. 6 i eksempel 4. Den anvendte enzympræparation hidrørte ligeledes fra en kultur af Aspergillus niger, men den specifikke DK 172014 B1 15 polygalakturonaseaktivitet var 0,8 enheder pr. mg protein, og den specifikke CMCase-aktivitet var af størrelsesordenen 100 enheder pr. mg protein. Den til behandling af xanthan tilførte proteinmængde var 100 mg/liter opløsning. Den endelige filtrerbarhed af opløsningen var 5 200 ml efter 20 minutter. Skønt dette enzymekstrakt hidrørte fra kulturen af samme mikroorganisme som kulturen i eksempel 4, var dette enzymekstrakt således mindre virkningsfuldt til forbedring af disse polysaccharidopløsningers filtrerbarhed.The treatment described in this example was carried out under conditions identical to the conditions of Experiment No. 6 in Example 4. The enzyme preparation used was also derived from a culture of Aspergillus niger, but the specific polygalacturonase activity was 0.8 units. per. and the specific CMCase activity was of the order of 100 units per ml. mg of protein. The amount of protein applied to treat xanthan was 100 mg / liter of solution. The final filterability of the solution was 5,200 ml after 20 minutes. Thus, although this enzyme extract was derived from the culture of the same microorganism as the culture of Example 4, this enzyme extract was less effective in improving the filterability of these polysaccharide solutions.

10 Eksempel 6Example 6

Dette eksempel er beregnet til at vise virkningsfuldheden af en enzympræparation med en meget stærk polygalacturonaseaktivitet på grund af en delvis oprensning.This example is intended to demonstrate the efficacy of an enzyme preparation with a very strong polygalacturonase activity due to partial purification.

Behandlingsbetingelserne var analoge med betingelserne i eksem-15 pel 4 med undtagelse af det anvendte første enzymekstrakt. Dette var her et delvist oprenset PG-ekstrakt hidrørende fra en kultur af Aspergillus niger. Dets polygalacturonaseaktivitet var ca. 120 enheder pr. mg protein og dets CMCase-aktivitet var af størrelsesordenen 10 enheder/mg protein. Dette enzymekstrakt blev tilført i en 20 mængde p§ 5,6 mg protein pr. liter (i stedet for 100 mg/l i de foregående eksempler). I dette tilfælde var vægtforholdet mellem proteiner i PG-ekstraktet/xanthan kun 0,056 %. I forhold til i eksempel 1 var mængden af tilført CMCase ca. 450 gange svagere, medens mængden af polygalacturonase var af samme størrelsesorden (670 25 enheder/l i stedet for 500). Dette oprensede PG-ekstrakt fik lov til at virke ved pH 4 og 40°C i 16 timer før tilsætning af Novo Alcalase.The treatment conditions were analogous to the conditions of Example 4 except for the first enzyme extract used. This was a partially purified PG extract derived from a culture of Aspergillus niger. Its polygalacturonase activity was approx. 120 units per mg of protein and its CMCase activity was of the order of 10 units / mg of protein. This enzyme extract was added in a 20 amount of 5.6 mg protein per ml. liter (instead of 100 mg / l in the previous examples). In this case, the weight ratio of proteins in the PG extract / xanthan was only 0.056%. Compared to Example 1, the amount of CMCase added was approx. 450 times weaker, while the amount of polygalacturonase was of the same order (670 25 units / l instead of 500). This purified PG extract was allowed to work at pH 4 and 40 ° C for 16 hours before adding Novo Alcalase.

De udtagne prøver blev underkastet en hurtig filtrerbarhedstest. Resultaterne er angivet i tabel 4.The samples taken were subjected to a rapid filterability test. The results are given in Table 4.

30 35 DK 172014 B1 1630 35 DK 172014 B1 16

Tabel 4Table 4

Opsamlet filtratvolumen efterCollected filtrate volume after

Opløsning 20 minutter_ 5 Før behandling 30 miResolution 20 minutes_ 5 Before treatment 30 mi

Efter 16 timers indvirkning med oprenset PG-ekstrakt 130 ml 10 Efter 22 timers indvirkning med oprenset PG-ekstrakt 150 mlAfter 16 hours of action with purified PG extract 130 ml 10 After 22 hours of action with purified PG extract 150 ml

Efter 16 timer (oprenset PG-ekstrakt) + 6 timer (Alcalase) 640 ml 15After 16 hours (purified PG extract) + 6 hours (Alcalase) 640 ml 15

Man har bl.a. bekræftet, at den relative viskositet praktisk talt var konstant under hele den enzymatiske behandling.You have confirmed that the relative viscosity was practically constant throughout the enzymatic treatment.

Dette eksempel viser, at man ved at anvende et delvis oprenset PG-ekstrakt kan opnå en meget god forbedring af xanthanopløsningers 20 filtrerbarhed med en meget lille mængde enzym, altså protein. Den med det delvis oprensede PG-ekstrakt tilførte cellulasemængde er negligibel, hvilket viser, at den ceilulolytiske aktivitet ikke er uundværlig ved klaringen af polysaccharidopløsninger.This example shows that by using a partially purified PG extract one can achieve a very good improvement in the filterability of xanthan solutions 20 with a very small amount of enzyme, i.e. protein. The amount of cellulase added to the partially purified PG extract is negligible, showing that the cellulolytic activity is not indispensable in the clarification of polysaccharide solutions.

Dette eksempel viser også, at der eksisterer en meget kraftig 25 synergi mellem virkningen af PG-ekstraktet og virkningen af P- ekstraktet (alkalisk protease: Novo Alcalase), hviiket gør det muligt at opnå et resultat, der praktisk talt er ækvivalent med resultatet opnået i det sammenlignende eksempel 1 ovenfor ved at anvende en proteinmængde, der klart er meget mindre (ca. 18 gange mindre), 30 hvilket er specielt fordelagtigt, og gør det muligt at undgå enhver risiko for tilstopning på grund af en for stor mængde proteiner.This example also shows that there is a very strong synergy between the action of the PG extract and the action of the P extract (alkaline protease: Novo Alcalase), which makes it possible to obtain a result which is practically equivalent to the result obtained. In Comparative Example 1 above, using a quantity of protein that is clearly much smaller (about 18 times less), which is particularly advantageous and allows to avoid any risk of clogging due to an excessive amount of proteins.

De vandige opløsninger af xanthangummi, som er gjort klare ved den enzymatiske behandling ifølge den foreliggende opfindelse, kan anvendes direkte, eventuelt efter fortynding til den ønskede 35 koncentration, uden nogen yderligere behandling for så vidt an går udskylningsvæsker i olieførende formationer.The aqueous solutions of xanthan gum made clear by the enzymatic treatment of the present invention can be used directly, optionally after dilution to the desired concentration, without any further treatment as far as flushing fluids are in oil-bearing formations.

Claims

A method of treating a xanthan gum to improve the filterability of aqueous solutions thereof, comprising an enzymatic treatment of one. 5 aqueous solution of xanthan gum which exhibits a concentration of dissolved salts of alkali metals and / or terrestrial potassium metals of at least _p10 equivalents / liter, characterized in that the enzymatic treatment is performed by two enzyme extracts of different types, an enzyme extract called PG extract whose main activity is a polygalacturonase activity, and an enzyme extract, called P extract, whose main activity is a protease activity, under conditions compatible with the activity of these enzyme extracts.

Process according to claim 1, characterized in that the two enzyme extracts of different types are used simultaneously under conditions which allow these two extract types to be active simultaneously.

Process according to claim 1, characterized in that the enzymatic treatment is carried out in two successive steps, first with an enzyme extract of the first type, then with an enzyme extract of the second type, the conditions for each step being selected on such a step. way that the selected extract type is active during this step.

Method according to claim 3, characterized in that the first step comprises the treatment with the PG extract and the second step the treatment with the P extract.

Process according to claim 4, characterized in that the first step is carried out with a PG extract at a pH of between 3 and 7 and the second step is carried out with a P extract at a pH of between 6 and 12, the total duration of these two steps being between 0.5 and 60 hours and the temperature being between 15 and 70 ° C.

Process according to any one of claims 1-5, characterized in that the PG extract is an extract obtained from a culture of a fungus belonging to the Aspergillus genus and that

The 35 P extract is obtained from a culture of a Bacillus-type microorganism.

Process according to any one of claims 1-6, characterized in that the PG extract is an extract obtained from an Aspergillus niger culture. DK 172014 Bl

Method according to any one of claims 1-7, characterized in that the PG extract has such a main polygalacuronase activity and a secondary activity of the cellulase (C) type that the ratio of the C / PG activities is below 1. and a protease activity of less than 0.05 ANSON units per g of PG extract and that the P extract exhibits a protease head activity of at least 0.1 ANSON units per ml. g of P extract, as well as cellulase and polygalacturoase activities of less than 5 units per mg of protein.

Process according to any of claims 1-8, 10, characterized in that the extract amounts used are such that the amounts of each extract, extract PG and extract P, relative to protein each exhibit a weight percentage of between 0.01 and 10% by weight of xanthan gum.

Powdered xanthan gum or an aqueous solution, characterized in that it is obtained by the method according to any one of claims 1-9.

Use of xanthan gum prepared by the method of any one of claims 1-9 as an agent in the recovery of oil with adjuvants. 20 25 30 35