DK160562B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af antistoffer specifikke for linseepithelceller og middel til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 160562B

«

Ansøgningen angår en analogi fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer specifikke for 1inseepithelceller.

Ekstrakapsular katarakt-udtagning er i den seneste tid 5 blevet en mere populær metode til fjernelse af grå stær, sandsynligvis på grund af dens lavere forekomst af postoperative komplikationer udtrykt ved cystoid macular ødem og mulig nethindeløsning. Fremkomsten af en forbedret ekstrakapsular udtagningsteknik, såsom phacoemulgering, og 10 behovet for en intakt baglinsekapsel til implantation af mange forskellige intraoculare linser har spillet en vigtig rolle for påvirkning af denne udviklingslinie. Den eneste mulige ulempe ved ekstrakapsular katarakt-udtagning er den høje forekomst af uklarhedsdannelse i baglinsekapslen, 15 hvilket kræver yderligere kirurgiske indgreb (posterior kapsulotomi eller génpolering af baglinsekapslen) for at opnå godt syn.

Patogenesen i uklarhedsdannelsen i baglinsekapslen efter 20 ekstrakapsular katarakt-udtagning er kendt: de resterende linseepithelceller formerer sig på baglinsekapslen og danner abortive linse-"fibre" og "blære"-celler (dvs. Elschnig's perler).

25 Som anført i Contact and Intraocular Lens Medical Journal, bind 5, nr. 4, oktober/december 1979, side 175-178, After-Cataract: Studies of Chemical and Radiation Inhibition, af Roy med flere, er kemiske midler og strålingsmidler blevet forsøgt for at prøve at finde en metode i forbindel-30 se med ekstrakapsular katarakt-kirurgi, som kunne nedsætte forekomsten af vækst efter katarakt. Som anført i denne publikation blev de anvendte kemikalier (vineristin og vin= biastin) prøvet for kemisk at hæmme subkapsulare epithel= celler, fordi de havde vist sig at have en direkte hæm-35 mende virkning på cellemitose (L.S. Goodman og A. Gillman:

The Pharmacological Basis of Therapeutics, Maximilan,

New York, 1965, side 1373-1376). Vineristin og vinblastin fandtes at hæmme hornhindesåret, således at det lægedes dårligt, og på grund af de udslettende virkninger for horn-

; DK 160562 B

2 hinden og iris var det forfatternes opfattelse, at disse lægemidler ikke skulle anvendes til yderligere dyreunder-søgeiser for at prøve at hæmme subkapsular epithelformering. Forfatterne angav endvidere at stråling givet den 2. dag efter operation syntes at være den mest effektive af alle doseringsprogrammer, men de angav at der er rogen fare for skade og konkluderede at det er vanskeligt at sige om der ville være problemer, hvis man anvendte stråling til mennesker.

Forfatterne påpegede endvidere at hvis der kunne findes et lægemiddelsystem eller kemisk system, som selektivt 15 kunne hæmme de subkapsulare epithelceller, kunne dette være en nyttig måde til at hjælp til at forhindre efter-katarakter.

Det er kendt, at man kan foretage inddrypning af de mitoti-20 ske inhibitorer methotrexat og retinonsyre eller blandinger deraf i øjets forkammer i minimale effektive doser efter afslutning af én 1inseepithelcellecyklus, hvilken inddrypning effektivt forhindrer uklarhedsdannelse i bagi insekapslen uden fare for øjet efter ekstrakapsular katarakt-udtagning.

25

Methotrexat er en cyklusafhængig antimetabolit, der hæmmer enzymet dihydrofolatreduktase, og derved griber ind i opretholdelsen af det intracellulære forråd af reducerede folater.

30

Retinonsyre, hvis nøjagtige mekanisme er ukendt, synes at hæmme enten celledeling eller DNA-syntese eller begge dele.

35

Den foreliggende opfindelse udgør en forbedring ved at producere og anvende monoklonale antistoffer, der er specifikke for resterende linseepithelceller, som kan anvendes til at Ødelægge disse celler selektivt uden skade for andre

DK 160562 B

3 dele af øjet på tidspunktet for den oprindelige katarakt-5 fjernelse.

Der kendes ingen teknik, der lærer produktion af monoklona-le antistoffer specifikke for 1 inseepithel cel ler, eller brugen af sådanne antistoffer til selektivt at ødelægge disse 10 resterende 1inseepithelceller uden at skade andre dele af Øjet.

Repræsentative eksempler på kendt teknik, der vedrører produktion af monoklonale antistoffer er følgende:

Monoclonal Antibodies, 1980, Plenum Press, New York, 15 redigeret af Roger H. Kennett, Thomas J. McKearn og Cathleen B. Bechtol; continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, bind 256, 7, august 1975, side 495-497 og følgende ameri-kanske patenter, der vedrører produktion af monoklonale antistoffer; nr. 4.271.145; 4.196.265; 4.172.124; 4.195.125; 4.262.090 og 4.294.927.

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistof- fer, som er specifikke for linseepithelceller, fremgangs- 2 5 måder til deres fremstilling herunder kontinuerlige cellelinier, hvorfra de høstes, og brugen af dem til at ødelægge de resterende linseepithelceller selektivt uden skade for andre dele af øjet på tidspunktet for den oprindelige katarakt-fjernelse eller senere til fjernelse

3 O

af en efter-katarakt. De monoklonale antistoffer indgives i' forkammeret i menneskets øje og får lov at reagere med linseepithelcellerne. Komplement indgives så i forkammeret for at bevirke selektiv lyse eller anden skade for linse-2g epithelcellerne uden at skade andre dele af øjet. Dette repræsenterer et gennemgribende fremskridt sammenlignet med brugen af mitotiske inhibitorer og andre metoder derved, at ødelæggelse er specifik kun for de resterende linseepithelceller som ellers formerer sig og vandrer til

DK 160562B

• *1- 4 dækning af overfladen af bagkapslen, som efterlades på 5 stedet i øjet, hvilket forårsager en "sekundær katarakt", som resulterer i tab af syn, der kræver en operation til.·

Det er derfor et fomål med opfindelsen at tilvejebringe monoklonale antistoffer, der er specifikke for linseepi-1Q thelceller,

Et andet fomål med opfindelsen er at tilvejebringe en kontinuerlig cellelinie til produktion af monoklonale antistoffer, der er specifikke for linseepithelceller.

15

Et yderligere fomål med opfindelsen er forhindring af uklarhedsdannelse i linsekapslen, som følge af at resterende linseepithelceller fomerer sig og '.’Vandrer til dækning af dens overflade efter ekstrakapsular katarakt-udtagning, 2q ved indgivelse af monoklonale antistoffer, der er specifikke for linseepithelceller,på tidspunktet for fjernelse af den oprindelige katarakt, og lade disse antistoffer reagere med disse resterende linseepithelceller og derefter indgive komplement, der lyser disse celler.

25

Et yderligere fomål med opfindelsen er fjernelsen af efter-katarakter forårsaget af linseepithelcellevækst og vandring, ved at indgive monoklonale antistoffer i øjets forkammer, lade disse antistoffer reagere med linse-gø epithelcellerne, og derefter indgive komplement, som lyser disse celler.

Andre fomål, ejendommeligheder og fordele ved opfindelsen fremgår af det følgende, 35

Opfindelsen angår fremgangsmåder til forhindring af formering af resterende linseepithelceller efter ekstrakap-sublar udtagning ved at indgive monoklonale antistoffer, der er specifikke for disse linseepithelceller, i for- 5

DK 160562B

kammeret i menneskeøjet og lade dem reagere med linseepi- thelcellerne, Normalt indgives ca. 100 pi af disse mono-5 klonale antistoffer, og normalt tager det ca. 30 minutter for disse monoklonale antistoffer at reagere med linse-epithelcellerne. Komplement indgives så i forkammeret i en effektiv mængde på ca. 100 pi, hvilket forårsager lyse eller anden skade på de resterende linseepithelceller, og derved forhindrer dem i at formere sig og vandre til dækning af overfladen af linsekapslen, som efterlades på stedet. Dette kan gøres på tidspunktet for ekstrakap-sular katarakt-udtagning, fortrinsvis umiddelbart efter katarakt-fjerneIse, eller det kan gøres senere for at fjerne en anden katarakt forårsaget af formering eller vækst af disse celler over overfladen af linsekapslen.

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved konden-2Q sering af 1 inseepithel anti stofproducerende celler med mye-lomaceller til dannelse af en kondenseret hybrid, dyrkning af hybriden og opsamling af antistofferne, der er specifikke for linseepithelceller fra den dyrkede hybrid.

25

Komplementet er et standardkomplement f.eks., og et typisk komplement og dets fremstilling, som er nyttig i den foreliggende opfindelse, er beskrevet i Monoclonal Antibodies, supra, side 391-392.

30

Det følgende er fremgangsmader til fremstilling af monoklonale antistoffer mod linseepithelceller.

Cellekultur.

35

Humane linseepithelceller fas enten fra menneskeøjne inden for 30 minutter efter døden, eller fra væv fjernet under katarakt-kirurgi. Cellerne dyrkes som et monolag i en vævskul turinkuba tor under anvendelse af velkendt teknik.

6

DK 160562B

Immunisering med linseepithelceller.

5

En mus (BALB/c eller en anden egnet stamme) injiceres intraperitonealt eller intravenøst med 5-10 millioner hele celler. To uger senere bliver en blodprøve fra hvert dyr undersøgt for specifikt antistof. Dyret med den højeste 10 titer får så igen injiceret intraperitonealt eller intravenøst 5 - 10 millioner· hele celler.

Kondensering af immune miltceller med myelomaceller♦ 15 Tre til fire dage efter at musen er immuniseret (intravenøst) dræbes musen ved omvridning af halsen. Musen tappes for blod og serumet fryses. Musen renses med 70% etha= nol og milten fjernes aseptisk. Ved anvendelse af et gummistempel i en steril 3 ml engangssprøjte hakkes milten 2o igennem en 50 mesh rustfri stålsigte med varm HBSS. Suspensionen pipetteres op og ned flere gange med en 3 ml sprøjte. En enkeltcellesuspension fremstilles ved at lede suspensionen gennem en 200 mesh rustfri stålsigte. Miltcellerne centrifugeres i 10 minutter ved 1.200 omdrejninger 25 pr. minut. De røde blodceller analyseres ved behandling med 0,83% NH^Cl i 5 minutter ved 40°C. Miltcellerne vaskes to gange i serumfrit medium. Cellerne tælles og deres levedygtighed bestemmes ved eksklusionsprøven med tryptan-blåt farvestof.

30

Miltcellesuspensionen fremstilles af ikke-immuniseret BALB/c-mus til fødelag på hybrider. Myelomacellerne over- 5 føres i expcnentiel vækstfase (5 x 10 celler/ml) til et 50 ml konisk polypropylencentrifugeglas. Myeloma og milt- 35 cellesuspensionen vaskes separat to gange i serumfrit medium. Cellerne tælles, forenes og vaskes én gang for 8 7 at få en blandet pille (10 miltceller og 10 myelomaceller) . Centrifugeglasset bankes forsigtigt for at disper-gere pillen i en klumpet suspension. 0,8 ml 50% PEG til- 7

DK 160562B

sættes i løbet af 1 minut (37°C). Suspensionen får lov 5 at henstå i 1 minut. 1 ml serumfrit medium tilsættes i løbet af endnu 1 minut. 20 ml serumfrit medium tilsættes i løbet af 5 minutter.

Cellerne centrifugeres og gensuspenderes i 60 - 100 ml 7 10 hybridoma-medium indeholdende HAT og 2-4 x 10 miltceller fra normal BALB/c-mus. Portioner på 0,1 ml fordeles i mikrotestplader med 96 fordybninger og inkuberes ved 37°C i 10% CC>2· Yderligere 0,1 ml HT-vækstmedium tilsættes den 7. dag, når der iagttages kraftig vækst. HY-j5 medium anvendes indtil der fremstilles subkulturer. Mediumudskiftning gentages hver 3- til 4 dag. Når der iagttages kolonier visuelt (mellem 12 og 20 dage) sorteres klonerne.

100 ml supernatanter fra kulturerne opsamles til primær sortering af antistofaktivitet.

20

Materialerne anvendt til kondensering af immune miltceller med myelomaceller er anført i følgende tabel 1.

TABEL 1.

25 A. Materialer: 1. 50% polyethylenglycol (PEG) 1540 (polysciences), 1 ml steril PEG 1540, 30 1 ml serumfrit medium (SF-DMEM), 2. Littlefields’ koncentration af thymidin (T) 1,6 x 10-^M, -4 -7 1,0 x 10 M-hyposanthin, 4 x 10 M-aminopterin, a. 100 X HT stamopløsning,

Opløs: 0,01361 g hypoxanthin, 35 0,0388 g thymidin i 100 ml dobbelt destil leret vand opvarmet til 70-80 C.

Filtersteriliser, fordel i portioner og opbevar frosset ved -70°C.

8

DK 160562B

b. 100 x aminopterin stamopløsning opløs: 0,018 g i dobbelt destilleret vand til sæt 0,1 N NaOH dråbevis, hvis aminopterin ikke opløses let. Indstil til pH 7,8. Filtersteriliser og opbevar frosset ved -70°C.

10 c. Hybridoma-medium

Dulbecco's MEM med høj glucose (4,5 g/1) L-glutamin tilsat til 4 mM 2% type 100 kaninserum (Kappa Scientific) 1 mM natriumpyruvat (Gibco) 100 Μ MEM ikke-essentielle aminosyrer (Gibco) 50 M 15 B-mercaptoethanol 10 mM HEPES stødpude 5 - ml HAT-medium.

Enzymbundet immunosorbantbestemmelse (ELISA) for celler.

20

Glutaraldehyd i 0,1 M NaHCO^ sættes til hver fordybning i en 96 - 2311 polystyrenmikrotiterplade 50 μΐ på 5% og henstilles ved stuetemperatur i mindst 30 minutter.

En vasket målcellesuspension i HEPES-stødpude Hank's 7 balancerede saltopløsning (HHBSS) med 10 celler/ml 2 5 fremstilles. Pladerne vaskes tre gange ved at fylde fordybningerne med destilleret vand og slå vandet ud. De vaskes én gang til med 0,15 M NaCl med 0,01 M Na2HP04 (PBS-0), og væsken slås ud. 50 yl/fordybning af celle-suspensionen tilsættes og pladerne centrifugeres ved 1500 omdrejninger pr. minut i 3 minutter uden bremse på. 200 μΐ/fordybning af 1% formaldehyd i HHBSS tilsættes og overlades ved stuetemperatur i 15 minutter. Pladerne centrifugeres og væsken kasseres. Pladerne vaskes så tre gange ved at hælde PBS-9 i fordybningerne og slå væsken ud.

50 yl/fordybning af 1% BSA i PBS-9 sættes til hver plade og får lov at blive i 10 minutter ved stuetemperatur.

50 yl hybridoma-mediumprøver tilsættes til duplikerede fordybninger, SDMEM + 2% RS tilsættes til række 1 i hver 9

DK 160562B

plade og inkuberes i 90 minutter ved stuetemperatur eller 5 natten over i køleskab. Pladerne vaskes ti gange med 0,05%

Triton X-100 i destilleret vand. 50 yl/fordybning af peberrod peroxidase-konjugeret IgG-fraktion af gedeantimus-immunoglobuliner fortyndet 1:30 fra den frosne stamop-løsning tilsættes i 0,5 M NaCl, 0,5% Triton X-100, 0,01 M jq Na2HP0^ og overlades ved stuetemperatur i 10 minutter. Fordybningerne vaskes ti gange med 0,05% Triton X-100.

100 yl/fordybning substrat: 0,1 M natriumcitrat indeholdende 1/100 rumfang 40 mM 2,2'-azino-di(3-ethylbenzthiazolin= sulfonsyre)diammoniumsalt (ABTS) og 1/100 30% hydrogenper= 15 oxid tilsættes. Substrat tilsættes til række 1 på en tom plade. Titertek-spektrofotometeret tilsluttes. Efter 30 minutter aflæses pladerne med OD414· Aflæsningerne for mediet alene (række 1) bruges til at danne et gennemsnit for hver plade. Middelværdierne og S.D. beregnes og prøver-20 ne betragtes kun som positive, hvis middelværdien + 2 S.D. Middelværdien af kontrollerne trækkes fra hver positiv prøve og den specifikke O.D. noteres.

Cytolyse af linseepithelceller.

25

Supernatanterne, som skal undersøges, deles i 1- til 5-yimængder i mikrofordybninger. Cellerne vaskes i 0,1% BSA og suspenderes til ca. 2*000 celler pr. yl. 1 yl celler, der skal undersøges, sættes til hver fordybning og inku-30 beres med antistofferne i 1/2 time ved stuetemperatur.

5 yl kaninserum, som giver optimal lyse, med kontrolantistof og ikke en lyse, når de tilsættes uden yderligere antistoffer, tilsættes og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Den procentmængde linseepithelceller, som dræbes, 35 konstateres med et mikroskop.

Histologisk kriterium og cytotoksicitet for antistofspeci-ficitet.

: . DK 160562B

10

Monolagskulturer af linseepithelceller behandles først med antistofferne og derefter med komplement (som beskrevet 5 i det foregående afsnit). Kulturerne iagttages så under mikroskop for at bestemme om alle linseepithelcellerne er blevet lyset. Ud fra de forudgående prøver bliver antistoffer fra de mest lovende kloner anvendt til at afprøve om disse antistoffer faktisk ødelægger kun linseepithel- 10 cellerne og ikke andet ocular væv-ved at anvende intakte humane øjne eller forkamre og iagttage resultaterne histologisk. Langtids cytotoksicitet og effektivitet af disse antistoffer undersøges, ved at injicere antistofferne og komplementer i forkamrene på aber in situ efter ekstra-kapsular linseudtagning. Langtidsforløbet i de behandlede øjne vil blive sammenlignet med det i ubehandlede øjne ved ophthalmologiske iagttagelser og histologiske undersøgelser.

20

Produktion af antistof i stor målestok.

Produktion i stor målestok af et enkelt monoklonalt anti-stof kan opnås ved at injicere ca. 10 -hybrid celler i passende H-2 forenelige mus. Ascitestumorer induceres på følgende måde: Til ascitesproduktion bliver mus injiceret intraperitonealt med 0,5 ml pristan (2,6,10,14-tetramethylpentadecan, Aldrich), og får lov at hvile i 1 til 2 måneder. 3 til 4 dage før overføring af inter-species hybridomaerne får hver mus injiceret 50 μΐ anti-lymfocytserum. På dagen for tumoroverførsel modtager hver mus en samlet legemsstråling (600 til 800 rad) efter- 7 fulgt 6 til 8 timer senere af syngenisk knoglemarv (10 6 7 celler/mus). Hybridomaceller (10 - 10 ) i Dulbecco's modificerede Eagle's medium injiceres så intraperitonealt.

3 5 Når tumorerne begynder at vise sig (10 til 30 dage efter injektion) tappes musene for blod og tilstedeværelsen og koncentrationerne af antistofferne i serumen undersøges kontinuerligt. De ønskede antistoffer opsamles, renses og

Claims (2)

1. 2. Middel til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, omfattende en kontinuerlig cellelinie, der producerer antistoffer specifikke for 1inseepithelceller. 25
2. 3. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den kontinuerlige cellelinie omfatter kultiveret hybrid af kondenserede linseepithel antistofproducerende celler kondenseret med myelomaceller. 30 35