DK157885B

DK157885B - PROCEDURE FOR EXTRACTION OF GRAIN BETA AMYLASE

Info

Publication number: DK157885B
Application number: DK18482A
Authority: DK
Inventors: Antti Lehmussaari; Aino Mansikkamaeki
Original assignee: Cultor Ab
Priority date: 1982-01-18
Filing date: 1982-01-18
Publication date: 1990-02-26
Also published as: DK18482A; DK157885C

Description

DK 157885 BDK 157885 B

1 Nærværende opfindelse vedrører en fremgangsmåde til fremstilling af en råekstrakt af ^-amylase. ved ekstraktion af kom.,"specielt bygkorn med vand eller en vandig opløsning.The present invention relates to a process for preparing a crude extract of β-amylase. by extraction of cer., "especially barley with water or an aqueous solution.

5 |S-amylase er et stivelsehydrolyserende enzym, som udvikles i kærner under vækstperioden, og som indeholdes i kærnerne. Det bedst kendte og mest studerede er /3 -amylase fra byg, og det skyldes dettes afgørende betydning i bryggeriindustrien. (D.E.Briggs "Barley", 10 Chapman & Hall, London, 1978; Cook "Barley and Malt", Academic Press, London, 1962; J.R.A. Pollock "Brewing Science", Academic Press, London, 19-79).5 | S-amylase is a starch hydrolyzing enzyme that develops in nuclei during the growth period and is contained in the nuclei. The best known and most studied is β-amylase from barley, and this is due to its crucial importance in the brewing industry. (D.E. Briggs "Barley", 10 Chapman & Hall, London, 1978; Cook "Barley and Malt", Academic Press, London, 1962; J.R.A. Pollock "Brewing Science", Academic Press, London, 19-79).

Kommercielt tilgængeligt findes to typer /3-amylase, 15 hvoraf den ene er baseret på udvinding fra korn, den anden udvundet af bakterier. En forskel mellem dem er f.eks. sammensætningen af hydrolyseproduktet. En hydrolyse, som er katalyseret af bakteriebaseret £-a-mylase frembringer 15 til 30# maltotriose og 50 til 20 60# maltose, medens kornbaserede 3-amylaser hovedsa geligt frembringer maltose. Derfor er en stivelse, som er hydrolyseret af kornbaseret ,3-amylase det sødest smagende produkt, som samtidigt er et bedre næringsstof for gær.Commercially available are two types of 3-amylase, one of which is based on grain extraction, the other derived from bacteria. A difference between them is e.g. the composition of the hydrolysis product. A hydrolysis catalyzed by bacterial β-α-mylase produces 15 to 30 # maltotriose and 50 to 20 60 # maltose, while grain-based 3-amylases produce substantially equal maltose. Therefore, a starch hydrolyzed by grain-based, 3-amylase is the sweetest-tasting product, which is at the same time a better nutrient for yeast.

2525

De vigtigste anvendelser af 3-amylase findes indenfor bryggeri- og stivelseindustrierne. Såfremt man ikke råder over en malt med tilstrækkelig enzymatisk aktivitet til mæskning kan fejlen rettes ved tilsætning 3Q af f.eks. ,S-amylase. Det er nødvendigt med enzymtilsætning, når umaltet korn anvendes til mæskning. Gennemførelse af hydrolysen af stivelsen med en kornbaseret β-amylase vil resultere i søde, maltoserige produkter, som kan anvendes f.eks. som råmateriale ved 35 ølfremstilling eller i konfektureproduktionen. I kon-The major applications of 3-amylase are found in the brewing and starch industries. If one does not have a malt with sufficient enzymatic activity for mixing, the error can be corrected by adding 3Q of e.g. , S-amylase. Enzyme addition is required when unmalted grain is used for mushrooming. Carrying out the hydrolysis of the starch with a grain-based β-amylase will result in sweet maltose-rich products which can be used e.g. as a raw material in beer making or in confectionery production. In con-

DK 157885BDK 157885B

2 1 fektureindustrien er det muligt at erstatte noget af sakkarosen med sådan malt oserig sirup,, fordi denne sirup i sig selv er virkelig meget sød.2 1 the frying industry, it is possible to replace some of the sucrose with such malt-oily syrup, because this syrup itself is really very sweet.

5 Ovenfor anførte litteratur, dennes.referencer og publikationen tysk' fremlæggelsesskrift nr. 1792 362 beskriver flere fremgangsmåder til udvinding af -amylase af korn og kornkomponenter. Et almindeligt træk i alle disse fremgangsmåder er det, at kærnerne indledningsvis males eller 10 knuses, eller at udgangsmaterialet omfatter en eller flere mekanisk udskilte komponenter af kærnerne f. eks. klid. Pra disse udgangsmaterialer ekstraheres p-amylase med vand, en bufferopløsning etc., hvorved den indvundne råekstrakt indeholder β-amylase sammen 13 med en mængde andre opløselige korningredienser, som nødvendiggør en meget vanskelig rensning og opkoncentrering af enzym.5 The above literature, its references and the publication German Publication No. 1792 362 describe several methods for the extraction of amylase from grains and grain components. A common feature of all these methods is that the cores are initially ground or crushed, or that the starting material comprises one or more mechanically separated components of the cores, eg bran. From these starting materials, β-amylase is extracted with water, a buffer solution etc., whereby the crude extract recovered contains β-amylase together with 13 with a number of other soluble granular ingredients which necessitate a very difficult purification and concentration of enzyme.

Eftersom en kærnes skallag er semi-permeable, og ef-20 tersom ---amylase forekommer relativt nær ved skallen i en kærnes subaleurone lag, blev undersøgelser påbegyndt for at finde ud af, om det var muligt at ekstrahere »3-amylase fra hele kærner ud fra den antagelse, at kærnernes egne membraner kunne fungere som 25 en slags filter, og at det ville være muligt allerede på "råekstraktstadiet" at fremstille en i væsentlig grad forbedret renhed sammenlignet med de produkter, der opnås ved ekstraktion af mel eller grutning.Since a core's shell layer is semi-permeable, and since --- amylase occurs relatively close to the shell of a core's subaleuronic layer, studies were started to find out whether it was possible to extract »3-amylase from the whole cores on the assumption that the cores' own membranes could act as a kind of filter and that it would be possible already at the "crude extract" stage to produce a substantially improved purity compared with the products obtained by extracting flour or grating .

Det blev overraskende kdnstateret, at 60 til 80# af 30 den totale 3-amylasemængde kan ekstraheres fra korn ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at ekstraktionen sker fra hele eller delvist afskallede kærner, idet vægten af de fjernede skaldele ' er 0 til 20# af kærnevægten, ekstraktionstemperatu-35 ren mellem 20 og 55°C, og ekstraktionstiden mere end 3Surprisingly, it was found that 60 to 80 # of the total 3-amylase amount can be extracted from grains by the process of the invention, which is characterized in that the extraction is from whole or partially peeled cores, the weight of the removed shell parts being 0 to 20 # of the core weight, the extraction temperature between 20 and 55 ° C, and the extraction time more than 3

DK 157885 BDK 157885 B

1 5 timer.1 5 hours.

Mængden, renheden og ekstraktionstiden, for den ps-amyla-se, som skal ekstraheres af korn kan styres ved varia-5 tion af temperaturen, som påvirker permeabiliteten og diffusionshastigheden i kærnemembranerne.The amount, purity, and extraction time of the ps-amyla to be extracted from grain can be controlled by variation in temperature which affects the permeability and diffusion rate of the core membranes.

Et andet styremiddel er delvis fjernelse af de yderste 10 skaldele på kærnerne ved at anvende f.eks. den teknik, som kendes fra afskalning af riskorn, således at man opnår den ønskede permeabilitet i kornmembranerne. Et foretrukkent resultat opnås ved fjernelse af ca 10$ af kærnernes, foretrukkent bygkærnernes, totalvægt i form 15 af skaldele på en sådan måde, at frøhviden forbliver intakt.Another control means is partial removal of the outermost 10 shell parts on the cores using e.g. the technique known from peeling rice grains so as to achieve the desired permeability in the grain membranes. A preferred result is obtained by removing about 10 $ of the total weight of the kernels, preferably barley kernels, in the form 15 of shell parts in such a way that the seed white remains intact.

I nærværende fremgangsmåde tjener de ydre lag i kærnens frøhvide som en slags ultrafilter, som helt for-20 hindrer udstrømning af uopløselige urenheder til udludningsvandet, og som også i væsentlig grad begrænser mængden af udstrømmende opløselige komponenter.In the present method, the outer layers of the seed white of the core serve as a kind of ultrafilter which completely prevents the flow of insoluble impurities into the leaching water and which also substantially limits the amount of flowing soluble components.

Den indvundne p-amylaseindeholdende ekstrakt kan umiddelbart koncentreres f.eks. ved ultrafiltrering.The recovered β-amylase-containing extract can be concentrated immediately e.g. by ultrafiltration.

2525

Det foretrækkes i forbindelse med ekstraktionen at anvende en reducerende agent (f.eks. S02) til at frigøre s-amylase fra andre proteiner, og det bemærkes at denne fremgangsmåde er kendt i litteraturen.It is preferred, in connection with the extraction, to use a reducing agent (e.g., SO 2) to release s-amylase from other proteins, and it is noted that this process is known in the literature.

3030

Opfindelsen illustreres nedenfor mere detaljeret ved hjælp af følgende eksempler.The invention is illustrated below in more detail by the following examples.

3535

• DK 157885B• DK 157885B

n 1 Eksempel 1.n 1 Example 1.

100 g ikke afskallet byg blev udludet i 300 ml 0,5$ natriumpyrosulfit ved 30°C. Den udludede .^amylases ak-5 tivitet blev bestemt som funktion af tiden (tabellerne). Aktivitetsanalyserne blev udført efter en modificeret Bendelow metode (Bendelow, W.M'. 1963, Journal of Institute of Brewing* nr. 69, p. 467 - 472). Den anvendte enhed var en relativ enhed U (den specifikke ak-10 tivitet for malet byg blev betegnet som 100 U/g protein) . Alle analyser blev udført på filtrerede prøver.100 g of unshelled barley was poured into 300 ml of 0.5 $ sodium pyrosulfite at 30 ° C. The activity of the lamina amylase was determined as a function of time (Tables). The activity analyzes were performed according to a modified Bendelow method (Bendelow, W.M '. 1963, Journal of the Institute of Brewing * No. 69, pp. 467 - 472). The unit used was a relative unit U (the specific activity of milled barley was designated as 100 U / g protein). All analyzes were performed on filtered samples.

En 100$ aktivitet var betegnelsen for den mængde ,3-a-mylase, som under tilsvarende vilkår opløses fra formalet byg indenfor 18 timer.A $ 100 activity was the term for the amount of 3-α-mylase which, under similar conditions, dissolves from ground barley within 18 hours.

1515

Formalet byg: udludningstid (timer) 2 4 6 7 12 16 18Ground barley: leaching time (hours) 2 4 6 7 12 16 18

Aktivitetsprocent 27 49 71 89 96 99 100 20 Specifik aktivitet (U/g protein) 100Percentage of activity 27 49 71 89 96 99 100 20 Specific activity (U / g protein) 100

Aktivitet (U/g tørstof i udludningsvand) 30 25Activity (U / g solids in leachate) 25 25

Uafskallet byg: udludningstid (timer) 10 20 30 40 50 60 70Paddy barley: leaching time (hours) 10 20 30 40 50 60 70

Aktivitetsprocent 8 20 39 51 69 . 76 78 30 Specifik aktivitet (U/g protein) 152Activity rate 8 20 39 51 69. 76 78 30 Specific activity (U / g protein) 152

Aktivitet (U/g tørstof i udludningsvand) 52 35Activity (U / g solids in leachate) 52 35

DK 157885 BDK 157885 B

5 1 Eksempel 2.Example 1.

En prøve blev udført på samme måde som i eksempel 1 undtagen derved, at kærnerne blev afskallet således, at 5 10$ af kærnevægten blev fjernet som skalfraktion.A test was performed in the same manner as in Example 1 except that the cores were peeled so that 5 $ 10 of the core weight was removed as a shell fraction.

udludningstid (timer) 2 5 10 15 20 25 26 10 Aktivitetsprocent 7 20 48 65 73 79 80leaching time (hours) 2 5 10 15 20 25 26 10 Activity percentage 7 20 48 65 73 79 80

Specifik aktivitet (U/g protein) 156Specific activity (U / g protein) 156

Aktivitet (U/g.tørstof i udludningsvand) 60 15 — “Activity (U / g solids in leachate) 60 15 - “

Eksempel 3.Example 3

Kærnerne blev afskallet således, at 20$ af deres total-20 vægt blev fjernet som skalfraktion. løvrigt blev prøven gennemført på samme måde som i eksempel 1.The cores were peeled so that $ 20 of their total-20 weight was removed as shell fraction. The test was carried out in the same way as in Example 1.

udludningstid (timer) 2 5 10 15 18 20 21 25leaching time (hours) 2 5 10 15 18 20 21 25

Aktivitetsprocent 12 31 57 72 75 76 77Percentage of activity 12 31 57 72 75 76 77

Specifik aktivitet (U/g protein) . 135Specific activity (U / g protein). 135

Aktivitet (U/g tørstof i 30 udludning s vand). 44Activity (U / g dry matter in 30 leaching water). 44

Eksempel 4.Example 4

35 Por at undersøge temperaturindvirkningen på opløsnings-35 To investigate the effect of temperature on the solution

DK 157885 BDK 157885 B

6 1 hastigheden, for ^-amylase og dens indflydelse på opløsningens renhed, blev en prøve svarende til den i eksempel 1 udførte gennemført ved temperaturer på henholdsvis 25°C, 40°C og 50°c. Det materiale, som blev anvendt 5 i disse analyser, var byg afskallet i en udstrækning på 10¾.6 l of the rate, for β-amylase and its influence on the purity of the solution, a test similar to that performed in Example 1 was carried out at temperatures of 25 ° C, 40 ° C and 50 ° C, respectively. The material used 5 in these analyzes was barley peeled to an extent of 10¾.

udludningstid (timer) 2 5 10 20 22 23 24 26 10leaching time (hours) 2 5 10 20 22 23 24 26 10

Aktivitetsprocent 25°C 4 14 35 70 76 79 82 83 4o°C 7 19 4l 69 75 78 78 74 50°C 11 22 47 70 75 74 70 15 Nedenstående tabel illustrerer opløsningshastigheden, aktivitetsprocenten, den specifikke aktivitet og aktiviteten pr g tørstof.Activity rate 25 ° C 4 14 35 70 76 79 82 83 4o ° C 7 19 4l 69 75 78 78 74 50 ° C 11 22 47 70 75 74 70 15 The following table illustrates the dissolution rate, activity rate, specific activity and activity per gram of solid.

afskalnings- formalet 20 grad 10¾ bygpeeling ground 20 degree 10¾ barley

Udludningstemperatur(°C) 50 40 25 25Leaching temperature (° C) 50 40 25 25

Udludningstid (timer) 22 23 26 19Elimination time (hours) 22 23 26 19

Aktivitetsprocent 75 78 83 100 25 Specifik aktivitet (U/g protein) 183 178 156 98Percentage of activity 75 78 83 100 25 Specific activity (U / g protein) 183 178 156 98

Aktivitet (U/g tørstofindhold i udludningsvand) 74 78 65 29 30Activity (U / g solids content in leaching water) 74 78 65 29 30

Det kan således konkluderes af eksemplerne 1 - 4 at - renheden af j^-amylase, som ekstrahere s af hele kærner er betydeligt forbedret ved sammenlig-35 ning med den renhed, som opnås ved ekstraktionThus, it can be concluded from Examples 1-4 that - the purity of β-amylase extracted by whole grains is significantly improved by comparison with the purity obtained by extraction.

DK 157885BDK 157885B

7 1 fra mel, skønt ekstraktionstiden er længere (ek sempel 1), - ved afskalning af kærnerne og/eller ved at hæve 5 temperaturen kan ekstraktionstiden afkortes og ekstraktionen af (^-amylase foregår stadig med forbedret renhed i sammenligning med renheden for f?-amylase ekstraheret fra mel (eksemplerne 2, 3 og 4), og 10 - under de gunstigst mulige vilkår er det muligt fra hele kærner at ekstrahere 75 - 83¾ af den mængde j3-amylase, som kan ekstraheres fra mel. I dette tilfælde er renheden af f^-arnylasen i det 15 mindste 156/98 - 183/98 eller 1,59 - 1,87 gange større med hensyn til protein og 65/29 - 78/29 eller 2,24 - 2,69 gange større med hensyn til totaltørstoffet (eksempel 4).7 1 from flour, although the extraction time is longer (eg 1), - by peeling the cores and / or raising the temperature 5, the extraction time can be shortened and the extraction of (? -Amylase still takes place with improved purity compared to the purity of f? -amylase extracted from flour (Examples 2, 3 and 4), and 10 - under the most favorable conditions, it is possible from whole cores to extract 75 - 83¾ of the amount of β-amylase which can be extracted from flour. the purity of the f-arenylase at least 156/98 - 183/98 or 1.59 - 1.87 times greater in protein and 65/29 - 78/29 or 2.24 - 2.69 times greater by consideration of the total solids (Example 4).

20 Yderligere rensning af y8-amylase kan udføres ved anvendelse af kendt teknik som spraytørring, ultrafiltrering, udfældning etc. Da råekstraktens renhed ifølge nærværende opfindelses fremgangsmåde kan forbedres væsentligt kan de her nævnte procedurer lettes tilsva- 25 rende.Further purification of γ8 amylase can be carried out using known techniques such as spray drying, ultrafiltration, precipitation etc. Since the purity of the crude extract according to the method of the present invention can be substantially improved, the procedures mentioned herein can be similarly facilitated.

Claims

Process for the preparation of a crude extract of amylase by extraction of grains, in particular barley with water or an aqueous solution, characterized in that the extraction takes place from whole or partially peeled kernels where the weight of the removed shell parts is 0 - 20 $ of a core's weight, the extraction temperature being 20-55 ° C and the extraction time being more than 5 hours.