DK157171B - Anvendelse af propionibakterier til fremstilling af cellevaegpraeparater eller helcellepraeparater - Google Patents

Description

DK 157171 B

Den foreliggende opfindelse angâr anvendelse af Propionïbacterium granulosum stamme KP 45, DSM 1773, Propionibacterium avidum stamme KP 40, DSM 1772 og/eller 5 Propionibacterium acnés stamme ATCC 6919 til fremstilling af cellevægpræparater eller helcellepræparater til anvendelse ved tumorbehandling samt ved strâlings- eller kemo-terapi af tumorer.

Præparater af anaerobe coryneformer, f.eks. Corynebacte-10 rium parvum, CN 6134, der er beskrevet som antitumormid-ler, er kendte. Det har imidlertid vist sig, at disse præparater ved systemisk eller lokal terapi f0rer til u0nskede bivirkninger og komplikationer, og det anbefales derfor i litteraturen at undgà doser pâ mere end 7,5 mg/m2 15 legemsoverflade. Disse mængder svarer omtrentlig til en mængde pâ 20 mg pr. patient.

Det har vist sig, at præparater pâ basis af dræbte hele celler eller cellevægge fra ovennævnte propionibakterie-stammer er særdeles virksomme ved kemoterapi eller 20 strâlingsterapi af tumorer. Især er disse præparater egnede til underst0ttende terapi. Virkningen er særdeles stor ved lokal applikation.

Ved fors0g har det sâledes vist sig, at Propionibacterium acnés stamme ATCC 6919, Propionibacterium granulosum 25 stamme KP 45, DSM 1773, og Propionibacterium avidum stamme KP 40, DSM 1772, ved intraperitoneal injektion til mus i en dosis pâ 1,5 mg pr. mus bevirker en signifikant forlængelse af overlevelsestiden hos letalt (850 R) bestrâlede mus, idet Propionibacterium granulosumstammen 30 er mest virksom. Det er blevet konstateret, at de omhand-lede præparater er egnede til stimulering af CFU-S-proli-fereringen, dvs. til stimulering af en vandring af blod-dannende (hæmatopoetiske) kolonidannede enheder fra knog-lemarven til indtræden i cellecyklus og til vandring til 35 det perifere blod. I klinisk praksis betyder dette, at de omhandlede præparater er værdifulde til st0tteterapi 2

DK 157171 B

eller supplerende terapi ved strâlingsterapi af tumorer, da de forh0j er patienter nés evne til at kunne tâle bestrâling væsentligt.

5 Desuden bar det ved fors0g vist sig, at de omhandlede præparater ved intratumoral applikation er virksomme mod murin sarcoma 180 hos mus og f0rer til en régression pâ mere end 70% af sarcoma 180-tumorer.

Det har endvidere vist sig, at de omhandlede præparater 10 ved systemisk indgift til patienter med primære eller sekundære lungetumorer som st0ttebehandling til kemotera-pi hjælper til at undgâ hovedkomplikationen ved kemoterapi af tumorer, nemlig infektionsfaren. Det har sâledes vist sig, at de omhandlede præparater kan anvendes som udmær-15 kede antibakterielt virksomme st0ttebehandlingsmidler eller supplerende behandlingsmidler ved kemoterapi af kræft. ?

Helcellepræparaterne og cellevægpræparaterne fremstillet ud fra ovennævnte specifikke tre bakteriestammer stimule-20 rer de uspefikke immunreaktioner over makrofagsystemet og ikke de antistof- og/eller T-celle-betingede immunreaktioner. Helcellepræparaterne eller cellevægpræparaterne fremstillet ud fra ovennævnte tre specifikke bakteriestammer skal sâledes ikke anvendes til specifik immunterapi rettet 25 mod bestemte tumorantigener og heller ikke til opnâelse af adjuvansvirkning.

De ovenfor omtalte fors0gsresultater, der illustreres nærmere i det f01gende ved hjælp af nogle in vivo-fors0g, mà i enhver henseende betragtes som overraskende.

30 Den omhandlede anvendelse til fremstilling af cellevæg-præparater har vist sig at være særligt anvendelig, da faren for u0nskede bivirkninger er særligt lav ved denne type præparater. Cellevægpræparater er hidtil ikke blevet unders0gt klinisk.

3

DK 157171 B

Det foretrækkes at fremstille injicerbare suspensioner i phosphatpufret kogsaltopl0sning. Til dette formâl er en koncentration pà fra 0,5 til 50 mg aktivt materiale pr. ml 5 opl0sning særligt hensigtsmæssig. Fortrinsvis anvendes en koncentration pâ fra 2 til 12 mg/ml opl0sning, især pè 5 til 7,5 mg/ml opl0sning.

Særligt velegnede er intraven0se infusionsopl0sninger, som indeholder 15-30 mg præparat pr. 100 ml opl0sning. En 10 sâdan dosismængde har vist sig at være særligt fordelag-tig til indgift ved behandling af primære og sekundære lungeneoplasmer, idet en f0rste injektion b0r indgives mindst 10 dage inden den kemoterapeutiske behandling.

Som phosphatpuffer anvender man hensigtsmæssigt en 15 Na2HP04/KH2P04-phophatpuffer, der hensigtsmæssigt har en pH-værdi pâ ca. 7,2.

Forskellige propionibakteriestammer er f.eks. beskrevet i FEMS Microbiology Letters, bind 2, nr. 1, juli 1977, side 5-9.

20 Stammerne Propionibacterium granulosum KP 45 og Propio-nibacterium avidum KP 40 er særligt foretrukne. De er deponeret hos DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH, Griese-bachstrasse 8, D-3400 G'ôttingen, Forbundsrepublikken Tysk-25 land. Propionibacterium granulosum KP 45 har DSM-depone-ringsnummer 1773, og Propionibacterium avidum KP 40 har deponeringsnummer DSM 1772. Deponeringen fandt sted den 11. marts 1980. De to stammer kan rekvireres hos DSM i overensstemmelse med frigivelseserklæringen i DSM og hos 30 den tyske patentmyndighed.

Propionibacterium granulosum, Propionibacterium acnés og Propionibacterium avidum kan i 0vrigt isoleres og dyrkes fra udstrygningspræparater af acneeffluorescencer (Acné vulgaris, Acné papulopustulosa og Acné conclobata). Med 4

DK 157171 B

hensyn til taxonomien henvises til der Hautartz 30, 242-267 (1979).

Propionibakteriestammer findes ogsâ beskrevet i Applied 5 Microbiology, februar 1973, side 222-229, American Society for Microbiology, bind 25, nr. 2.

5

DK 157171 B

-H

N

Ά S + + as__ d fci + + J _!*___

!SI I

1 rd (D , ii 33 (dl —p---- “ pi fd w! .¾ gj _JE__ — 1 h ht pi · i d! -H . £ W - Μ## ei n ~--- pi o . d

Φ -Hl S AS

fi fil o e -h I i fi (DI -h fl ω 0) PI P--— ' •H ül A! .

î-j tdl n3 J, fl) fll 0) H fi P ‘Hl fi nJ -ri I + X si CO ü_____.

Φ oi ci)-- JQ -rU X ,

-H Qi tn .L

fi 0Γ -H g O fil S S H 1 +

•H ffl fl) S P

a i s v —-

o &t O I

fi 01 -H -H

ft I PQ P . ,

H fi H I I

P Ol S B

«j 'il ™ ^ I--——- tn cul 10) 5 M! || + + fi 0)1 a ^ 0) gl--—-

tn gi L

rl toi S

fi PI 'S m oral o ra + + PI cd o M fi —iû-fi------- 2 Ü i a) i 0) fi pi o p i o p ε te di -π o PE -h o _ 3 W-hi ûjtdggp aidgd

>i P σρ 3 m ω σΛ 3 -H

nj| y fip‘HH,0 J4 y 'H ^ gl -=--- '

Pi . h

Hl I A I

©S i δ i i S ή S 3 p fi g

SI 'ah «j 8*i 10¾ B

li g·# Sllfis® a as .a 3 a fil οι φ Λ

•Hi g ω O

Oj g "ü1 ^ 01 P ij eu fti fij ω fi S S _ fiui . ......—-----

DK 15717 1 B

6 , / / co -a) '—i

d r- P

o cm a) i d i xi <d P · m U d a) Ph vo ffi -h o y cm r» rH <! O) m σ> Ό > ο - h a) ω H rH -H d · d w v£> .d d = (1, (DH i> U d tji ^ co eu a)

• (d · CM P -ri N

- U dH i ω n d c; pu o cm +i <d a)

tnod-^dpuN

• m O'HdcMdcoto P h d g d eu "d o 0) I ‘ÜKD ^

β-S- « -P H O d ·Η O

** . O · en d P d

•H · [d d iH M d) rH

Clt · · CQ O -P <D -P 4P

fi : EJ U Κ-ΗΝ'ΗΛί^

5 . a s di HNidH

ω · -OO (d d Λ l

>, · tn P -P (D -P M

h, d co u d p d -h

51 >—> O 0) -H (d (D O M

5 « b -h g · m m -h d . ..

6 ή · ό · en m çl, tn _X;____ U d Ό t" Μ Ή Ο Ή • +) (Dffi (D Q d d H OlgH Q: CM > m I H , en O en i_I_ r- n .λ I CPi T) 5 tC -ri H . <ü 3 if) d ·Ρ o g g o i i o ·· d &*d çO pjcn (1) r- s<ol>co p cm p r- ^ pj 43 m m i_+_ P cm

CM -~ A4 I Ό H

• _ - CM C · ' ·' ΰ I g|S d CM d-

3 Λ S § S I I OCM

w ΰ Ή ο ' ω I

5 H H--en ·· <ü ΙΛ •d -p fi 2 ω d $ 8 8 |& + i ^SdcM*' Ο Λ XI & d .

H ---. +j · H Ê . · p --- - · cnxjodd

ω I S3 O M -H -H

W J. § H M (U P Λ

35 dû > O

s p O-HH+J-

-d fi CO 0 . -h S d u CO

&-P O S I I tn CM d P

P S g ο · · X3 q

Οι xj d H Pi Ο Ή -P

--J_-—r—:—:-r-r . O ft d -P’ " · - I fi , I fi - fi O P C 01 O eu .2 506 .2¾ i |m<d o -h pi âdggi a, g g -g g *cncn Λ a · +) ffn p S Μ Ο,ΡΡ-Η 8 td O O O C0 >1 U HdHHO nn 3 -H > -P · Ό W P (D &>

1¾ CM d M o>H CM d P d ço trîdCQ · ft Ή O

—-:-j- fi d (D P UH

fi I g -¾ en d · mm ω o

H I 3 d & O CD ü E O CM-H

d) · - - - tr> d -H d ^ S > d to rQ

'fi & JL L ,H B fi 5 5 fi £ -P P -P - en O

5 R E P °fi ‘H g. | ω ^ fi CD d+)g P d h p

Tj ωδΒΓ-Ρ 3 d&lco'cop 3 P dd <D-ddü 6 ’ë-RSdd'S p y p o d m 3 οχ)-h ηΡτΗ-η ex p 3 a p s p a afix p ü h > d p <p >ιΛ s -- -—-—--id (D (U P p o

S d g -P :OOPCO

rn jgcMPUKPUg s m O · ci) d · eu -h (ü g *3· ^ Il ο ϋιΛ p tflËti ^ è__ê-Ê--^ h m 7

DK 157171 B

Fremstillingen af de omhandlede præparater belyses nær-mere i de efterf01gende eksempler.

Eksempel 1.

Almen fremgangsmâde til udvinding af cellevæggene.

5 Der foretages væskedyrkninger af den pâgældende propioni-bakterie i 1 liter Erlenmeyerkolber ved 37°C under an-aerobe betingelser (gas-pak-fremgangsmâden, BBL).

Til denne massedyrkning podes mediet (A-bouillon+ eller Triptic soy broth, Difco) med en tyk opslæmning af propio-10 nibakterier. Hovedopslæmningen fremstilles ved udrivning af en 3 dage gainxnel A-agarkultur af propionibakterier i 10 ml bouillon. Efter en dyrkningstid pâ 72 timer ved 37°C isoleres cellerne fra væsken ved centrifugering ved 10.000 G (20 minutter) ien Sorval R2-k0lecentrifuge. Sedi-15 mentet vaskes tre gange med destilleret vand og blandes derefter med det dobbelte rumfang glasperler (diameter 0,17-0,18 mm), hvorefter der foretages formaling i en JL 11 cellem011e i 1 til 1 1/2 time. Efter at det ved en mi- kroskopisk kontrol (gram-præparat) er konstateret, at der 20 ikke længere findes hele celler, fjernes glasperlerne ved' hjælp af en G-l-glasfilterdigel under anvendelse af phos-++ phatpuffer (pH-værdi = 7,2) fra homogenisatet.

Den mælkeagtige suspension (indeholder cellevægge og cyto-plasma) centrifugeres i 20 minutter ved 40.000 G, og sedi-25 mentet optages i en phosphatpuffer (pH-værdi = 7,2). De autolytiske enzymer inaktiveres ved kogning i 10 minutter pâ et vandbad.

Disse endnu proteinholdige cellevægge renses yderligere ved inkubering ved 37°C i 24 timer med trypsin (Merck, 0,5 mg/ml suspension) og 1 ml toluen pr. 100 ml opslæmning 30 (til forhindring af bakterievækst).

De ved tryptisk nedbrydning rensede cellevægge fracentri- 8

DK 157171 B

fugeres derefter ved 40.000 G (30 minutter), vaskes tre gange med destilleret vand og fryset0rres.

+) A-bouillon:

Bacto casitone 12 g 5 Bacto Yeast extract 12 g KH2P°4 4 g

MgS04.7H20 1 g

Glucose 4 g

Destilleret vand ad -1000 ml, pH-værdi 7,2 10 Til A-agar + 28 g Bacto agar.

++) Phosphatpuffer: 1/15 M Na2HP04.2H20 og 1/15 M KH2P04 opl0ses hver for sig i 1000 ml destilleret vand, hvorefter 612 g af den se-15 kundære natriumphosphatopl0sning blandes med 388 g af den primære kaliumphosphatopl0sning, og pH-værdien indstilles pâ 7,2..

+++) Cellem011e: Vibrogen-cellem011e vi 3, Edmund Bühler, 7400 Tübingen.

20 Eksempel 2.

Fremstilling af suspenstoner af Propionibacterium acnés (stamme ATCC 6919), Propionibacterium avidum (stamme 0575, KP 40) og Propionibacterium granulosum (stamme KP 45).

Under anvendelse af den almene fremgangsmâde beskrevet i 25 eksempel 1 suspenderes lyofiliserede propionibakterier af den nævnte type i phosphatpufferholdig kogsaltopl0s-ning af den ovenfor anf0rte type i en koncentration pâ 5,0 eller 7,5 mg/ml. De fremstillede suspensioner er især egne-de til intraperitoneal injektion.

9

DK 157171 B

Eksempel 3.

Under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne fremgangs-mâde fremstilles intraperitonealt injicerbare suspensio-ner af Propionibacterium granulosum, stamme KP 45, 95-K, 5 Propionibacterium acnés, stamme ATCC 6919, og Propionibacterium avidum, stamme 0575, KP 40, ud fra lyofiliseret materiale med en koncentration pâ 5 eller 7,5 mg/ml.

Eksempel 4.

Fremstilling af injicerbare suspensioner til st0ttebehand-10 ling ved kemoterapi.

Propionibacterium granulosum, stamme KP 45, oparbejdes under anvendelse af den almene fremgangsmâde beskrevet i eksempel 1. Der fremstilles en suspension af 30 mg celle-materiale i 100 ml infusionsopl0sning til en intraven0s 15 indgift.

De omhandlede præparater kan indeholde gængse tilsætnings-stoffer. Præparaterne kan foreligge i ampulform eller i stérile flasker med gennemstikningslukke. Ogsâ konfektio-nering med adskilt opbevarelse af bestanddelene til tilbe-20 redning i anvendelses0jeblikket kan anvendes.

In vivo-unders0gelser.

1. Hæmopoese hos mus behandlet med propionibakterier efter létal bestrâling.

Tre propionibakteriestammer (Propionibacterium acnés, Pro-25 pionibacterium granulosum og Propionibacterium avidum) in-jiceres intraperitonealt i en dosis pâ 1,5 mg pr. mus til letalt bestrâlede mus (850 R). Det viser sig, at Propionibacterium granulosum giver den st0rste forlængelse af over-levelsestiden hos de behandlede mus.

30 Der anvendes voksne, 8 uger garnie han-Swiss-mus. Dyrene fodres med et standardfoder, og vand er tilgængeligt ad li- 10

DK 157171 B

bitum. Vandet og foderet er steriliseret. Vandet inde-holder oxytetracyclin (1 g pr. 1000 ml).

Bestrâling.

Musene bestrâles med henholdsvis 650 og 850 R i et rote-5 rende methacrylatbur (10 mus pr. bur) i en afstand pâ 50 cm fra THX 250 Medicor-enheden, der drives ved 200 kV og er forsynet med et 0,5 mm Cu-filter. Bestrâlingsmængden er ca. 75 R pr. minut og bestemmes ved hjælp af et CT-1 termoluminescens-R-dosimeter.

10 Til fors0get anvendes Propionibacterium acnés, stamme ATCC 6919, Propionibacterium avidum, stamme 0575, KP 40, og Propionibacterium granulosum, stamme KP 45, i form af dræb-te helceller og i form af cellevægge.

De lyofiliserede propionibakterier suspenderes i en phos-15 phatpufferholdig kogsaltopl0sning i en koncentration pâ 7,5 mg/ml, og der foretages intraperitoneal injektion af 0,2 ml af suspensionen (1,5 mg pr. mus).

Unders0gelse af exogene miltkolonier.

3, 2 eller 1 dag f0r knoglemarvstransplanteringen injice-20 res donormus med 1,5 mg Propionibacterium granulosum. Knoglemarvscelüesuspensionen er fremstillet ved, at man skyller begge lârbensknogler med sterilt Parker-medium.

5

Cellerne tælles i et hæmocytometer. 5 x 10 formenngsdyg-tige celler i 0,2 ml Parker-medium injiceres til musen i 25 halevenen, som 4 timer inden knoglemarvstransplantationen er blevet bestrâlet med 850 R. Kontrolmusene injiceres med 5 0,2 ml_medium eller 5 x 10 knoglemarvsceller fra normale mus, d.v.s. som ikke er behandlet med Propionibacterium granulosum. En anden gruppe donormus indgives Propioni-30 bacterium granulosum som beskrevet ovenfor, hvorefter dyre-ne anæstetiseres med ether, og der udtages blod fra det retrobulbære plexus. Blodcellerne tælles i hæmocytometeret, . 5 og lige store mængder blod med 5 x 10 nucleerede celler 11

DK 157171 B

injiceres i halevenen hos mus, som er bestrâlet med 850 R. Kontrolmusene indgives samme rumfang blod, som er udtaget fra normale mus, som ikke er behandlet med Propionibacterium granulosum. Aile musene aflives 9 dage efter transplantatio-5 nen af blod eller knoglemarv og vejes, milten udtages, der foretages atter vejning, og antallet af kolonier pr. milt bestemmes efter fiksering i en blanding af chloroform og éthanol (1:3).

Unders0gelse af endogene miltkolonier.

10 3,2 eller 1 eller 0 dage f0r bestrâlingen med 650 R injice res mus intraperitonealt med Propionibacterium granulosum. Kontrolmusene indgives samme rumfang PBS (phosphatpufret kogsaltopl0sning). 9 dage efter bestrâlingen aflives dyrene, milten udtages, vejes, og kolonierne optælles som i det oven-15 for beskrevne fors0g til bestemmelse af de exogene miltkolonier.

Overlevelsestest.

Mus opdeles i 7 grupper med 15 mus pr. gruppe, og de bestrâ-les med r0ntgenstrâler (850 R). Fire timer efter bestrâlin-20 gen gives dyrene en injektion af propionibakterieeellevægge eller hele celler. Kontrolmusene indgives samme rumfang PBS. Antallet af overlevende dyr i hver gruppe optælles den 10. dag efter bestrâlingen.

Til den statistiske analyse anvendes Student t-testen.

25 Pâ tegningen er virkningen af de unders0gte propionibakte-rier pâ overlevelsesevnen hos de letalt bestrâlede mus an-givet grafisk. Aile tre propionibakteriestammer giver i sam-menligning med kontroldyrene en signifikant forlængelse af overlevelsestiden. Propionibacterium granulosum er i form 30 af helcellepræparatet og i form af cellevægspræparatet mere virksom end Propionibacterium acnés og Propionibacterium avidum.

12

DK 157171 B

Virkning a£ Propionibacterium granulosum pâ endogene milt-kolonier (stamme KP 45).

Tabel I

Antal endogene miltkolonier hos mus behandlet med Propioni-5 bacterium granulosum (stamme KP 45) (Gennemsnitsværdi - standardafvigelse)

Relativ milt- Antal endogene vægt miltkolonier

Kontrol/650 R/ 1,82 ±0,45 1,24 ± 0,67 + x 10 Propionibacterium granulosum - 1,66 - 0,24 LO,6 - 4-,45 3 dage inden bestrâling ·|· «l*

Propionibacterium granulosum - 1,73 - 0,21 8,17 - 3,49 2 dage inden bestrâling 4*

Propionibacterium granulosum - 2,32-0,38 L4,l -4,70 15 4 timer efter bestrâling X - p<0,01

Den relative miltvægt hos de bestrâlede mus vokser kun, nâr Propionibacterium granulosum er indgivet 1 dage f0:r eller 4 timer efter bestrâling med 650 R. Dog er der en signifi-20 kant stigning i antallet af exogene miltkolonier ved samt- lige behandlinger.

Virkning af Propionibacterium granulosum pâ dannelsen af exogene . miltkolonier (stamme KP 45).

-1---- 13

DK 157171 B

vo B P X X X

1 Ο ,Μ Φ CM ^ I"· N n -H i—1 i—ï ^ k ». » - û (U h n H oo ^ <*) ο · τι a) cm h ^ ^ •h ρ φ o çxi a ρ m +i +i +i +i +i o Φ > ^ _ ρ ω φ p cm ο ο ο ο (¾ I Η (ί ·> k * - * iDCÊr-i^n m

TÇj fxj φ φ H Ο Ο H O

ω U £ H CM rH *H iH

e------

P

<D

rH Φ ^ M M

CJîqC'j-tfr'' X X

g Φ Φ m H oo Μ1 m (d ·Η - > - “ _J7 ,£ O G O cm H ^ ^

0) X O

Λ φ H +1+1+1 +l + Ο ω η χ cm 0 CO Γ" g 0 4JH - J· ω G ·Η Η Ο Ο Η Ο ftJHCg CM Η Η Η μ α)----- +1 !Τ> •Η > > Ρ +1 (d (d g Ip 0) Μ _ η (d σ> η σ> μ· ι> tn Ό Η η 'ί* Μ< Μ Η Ο G ·>*«» - *· Η G (d -Ρ Ο Ο Ο ο ο ν; +> > t7> Η tn -Η ϋ +1 +1 +1 +1 +ι Φ +1 +> > , „ Λ η φ +1 ιύ +> σι η r-t ιη σι φ η Η σι m m f" co B G ·Η φ ·Η * · Ο Tfl W g ο Η Η Η Η η μ_______ m «

d > fl' I I

ΐί —. ω ι ΐφ ι ι ’ϋ ι Ό ι mm -p G G Ο fl fi Ο ι fl Ο

·Η fd Η Ή (0 H fi ίο H

Φ G .GG flfl Ήίί

HfrW — Φ Φ G Φ Φ ifl ^ ® fl

jj bd g g φιΛ Φ tn-Q «J &>Λ G

Φ G td P (dp (dp

Lj m d -ri φ p tJ! Ό -P t7> Tfl -P θ' m g G Ό W φ Φ Φ ^ +jg α) φ G en > g cm > g i-)>§ iwSo g g φρ φ p φ g

(D-p'-' I S H -H gH-H S '“j ’P

m p φ Ο Λ P Ο Λ P OÆP

<jw φ h m Φ m Φ ω Φ

3 .X (d P +> P+> P -P

h S PS * φ ü «· Φ ü «· Φ Ο rj 3 φ p m (d m td ω (d om Pu o G G Λ 3ΑΛ SS-0.

ho c s φ ε φ -p ε φ -h Ο H Ή fl fl GG fl fl d d ε (d (dOO (dOO (doo

d O p P ·Η ·Η P -H -H P ·Η -H

Φ Φ -H mm+iwcu mena. ^ m ^ dp m G o fl ο G o

φ tîi G O > >Ή p >ΉΡ i> ‘Π 5h H

h in — p p m (¾ pwPî pwft O

o S w 2 GG GG g £ ~ «B g h g g g ts gflfl s g ta o φη φ οφφρφ φρφ ΦΗ2ί 'i, p p p H H -P S H -P S H-Pg ΗΦ FH+&>tP t7> σ'

φ -P Λ O Ofl4Jg Ofl4Jg o C -U S I

.p u O C G Φ Φ Φ βφφφ fl®0 3

β d WW WdHm wtflHm wcnm X

l< rQ L---------

m O un O

H H M

14

DK 157171 B

Der konstateres ingen forskelle pâ den relative miltvægt hos mus, soin har fâet transplanter et normal knoglemarv, og mus, som har fâet transplanteret knoglemarv fra donordyr, som er behandlet 2, 3 eller 1 dag inden transplantationen 5 med Propionibacterium granulosum. Denne behandling f0rer til en signifikant formindskelse af antallet af exogene miltkolonier hos de med 850 R bestrâlede dyr i sammenlig-ning med dyr, som er indgivet knoglemarv fra ubehandlede donordyr. Disse unders0gelsesresultater viser en formind-10 skelse af antallet af CFü-S i knoglemarven fra mus behandlet med Propionibacterium granulosum. Pâ den anden side bevirker en injektion af blod fra mus, som er blevet behandlet med Propionibacterium granulosum, til letalt bestrâlede fors0gsdyr en signifikant for0gelse af værdierne for 15 de relative miltvægte og antallet af miltkolonier sammen-lignet med injektionen af blod fra ubehandlede donordyr, hvilket fremgâr af nedenstâende tabel III.

15

DK 157171 B

_ I_______ tTi Γ"

o X

co d; P X

Ο Μ o X! x 00

Γζ) H H 00 H CN

φ H)H cn ro en · * !

g · Ό a) *· * *· O

P 0 ü O O O

•P Λ P W

a) a) > +i +i +f +i H CO (D 5-1 _

fd I H fd Γ" 'Ψ H

pj D O g H co O Ln td m d o * ^ ^

,cj CJ d H H H CN H

a)-----;

Λ 0) X

4-) d 54 X X X

Φ o O cn · ·ν< co oo > tjï-ri - - * :

a) o d - · CN H CN H

H X 0 44 (ü H -H +l +1 +1

O

54 H 44 CO

(ü (d 4J oo H CM 'Ü* .

-P r—I * w · *· ** g P! -h en σ\ o t> O riî g___„_H__ c/i---- ... · · t> » » "â) +) en en tr»

0 H 5B

^ tri -P X X x ed h h n co H oo p > -H CN 00 00 ^ H K-tmg *· * _*

H fd O O H H

H tJ H > o 54 -H +1 +1 +t +1

HH (d P

<t) 43 Ό fd H cn en en 44 pj H co 'ü* cm (d H td o - *· ·* B <d P & H cn m en tn ----:-- ; d ····“ o — +1 Ό i •H LD (ü en ^ -H > 4-1 cd >d a) 154 CM 54 Φ 54

en X! ftj en (D

ü > 0 ·ϋ ed 0) en 4-> 0 54 g 4J >1 q . „ i 4-) B H D M-î ! fd P! O en „ Λ i μ 4) ni ocdoo ο o eu en g d fd O oo co -.cn en

p — û) (D 54 h ^ oc H CO

M4 pj i-4 4-> 42 co σι Ο σ>

p) d I I I I I

54 en ü i oh -g i (D ο "" ο h β ’-lg

HH OH 0 430 43 O

p; d De d O» H tP H , O d id 54 ed 54 fil <d 54 fli |

Htd >dOfd >doo τι ο o : 054. cn 'd ?4 54g P g 4401 d n pi o tr cn d m d h d m d j H HOg o cn O en , h g g d g gddo gddo

Hd o ο o p d o o o h o o o h g h h en h o H en h g d en H g d 54 d fd enHS4 end end θα) o g *‘drdo * d p fd » d -P fd PÎ4J H P en M4 d P £0 M4 O P ΜΉ Ο μ : mo tn O d en ed ü d tnn ir d cn h tn tn fd d d g d 43 fd g d «d ^ g d -d ^ £

043 44 fd043 (d d g fd d g OO

X h cn <d <d p 43 -p rdptdd id P fd d * - eu d d P P -P d P 4-1 43 H P 4-) 43 H s o o

o (d 44 Ή 4) O fp OP *44 OP VV

H H P dOH d 43 O d 43 O Êi & id a b ό ό o > & ό o p ti o p .

ho o cdoog od+f ü ou-pü i1

Sp h HdHPd Hdoo h d o fd v (¾ _ ml m H 43 fa en I MH >43 1 m h > 43 1 X x

id O en O

• I Λ1 16

DK 157171 B

Mest virksom ved stimuleringen af miltkolonidannelsen er blod, som er taget fra donormus, der 2 eller 3 dage inden blodtransplantationen er blevet injiceret med Propioni-bacterium granulosum. Leucocytosen ved transplanteret blod 5 forages dog efter behandling med Propionibacterium granu-losum 3, 2 eller 1 dag inden blodudtagelsen.

I de ovenstâende fors0g har Propionibacterium granulosum st0rst virkning pâ letalt bestrâlede rotter. Den d0delige virkning af den letale dosis af r0ntgenstrâler er resulta-10 tet af inhiberingen af den proliférative evne hos de hæmo-poetiske stammeceller og beskadigelsen af epitelcellerne i de indre organer med efterf01gende udvikling af generel-le infektioner som f01ge af saprofytiske bakterier. Imid-lertid viser ovenstâende fors0g, at de med propionibakte-15 rier behandlede mus ikke udviser symptomer pâ diarré og/ eller bl0dninger fra ford0jelsesvejen. Propionibakteriernes beskyttelsesvirkning kan derfor tilskrives en for0get hel-bredelse af de hæmopoetiske stammeceller i knoglemarven efter bestrâlingen.

20 2. Virkning af Propionibacterium granulosum, Propionibac terium acnés og Propionibacterium avidum ved eksperimen-tel murin sarcoma 180-tumor hos mus.

Aile de tre ovennævnte propionibakterier indgives intrape-ritonealt eller intratumoralt i flere doser pâ 1 mg pr.

25 mus, og de er virksomme ved retarderingen af væksten og stimuleringen af regressionen af sarcoma 180 hos CFW-mus.

Desuden bevirker indgivelsen af propionibakterierne en forlængelse af overlevelsesevnen hos mus med sarcoma 180.

Anvendte propionibakterier.

25 Til fors0gene anvendes Propionibacterium granulosum, staminé KP 45 (isoleret fra sârinfektion i Hygiejneinstituttet ved Koln's universitet), Propionibacterium acnés, stamme 6919 (ATCC), Propionibacterium avidum, stamme 0575 (C.S.

Cummins, Anaerobe Labs., Virginia Polytechnic Inst, and 30 State üniversity, Blackburg), KP 40. De nævnte propioni- 17

DK 157171 B

bakterier lyofiliseres og suspenderes i en phosphatpufret kogsaltopl0sning i en koncentration pâ 5 mg/ml. 0,2 ml af suspensionen indgives intraperitonealt eller intratumoralt til mus med tumorer.

5 Tumor-bærende mus.

Ved dette tumorsystem anvendes voksne CFW-hanmus. Tumorer-ne induceres som beskrevet i Radio Sci. 12 (1978), side 185-189. Til dette formai dissekeres sarcoma 180-tumorer fra donormus, tumorvævet hakkes i stykker, trypsiniseres 10 (0,25% trypsin, 15 minutter ved 37°C) og filtreres. Antal-

O

let af celler optælles og indstilles pâ 10 formeringsdygtige celler pr. ml kogs'altopl0sning. 0,1 ml af suspensionen injiceres subkutant intraskapulært. Denne fremgangsmâde f0rer til udvikling af tumorer, som kam f01es efter ca.

15 4-5 dage. En hurtig vækst af tumorerne foregâr mellem den 4. og 14. dag efter transplantationen, idet den letale virkning indtræder mellem den 20. og 28. dag.

Der anvendes i ait 2-25- CFW-hanmus ved unders0gelserne.

Ved overlevelsesfors0gene opdeles 105 mus i 7 grupper 20 med 15 mus pr. gruppe, og dyrene i fors0gsgrupperne (I-VI) injiceres med propionibakterier 0, 4, 8, 12 og 16 dage efter implân'tàtionen af tumorcellerne. Der injiceres Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum eller Propionibacterium acnés intraperitonealt 25 (3 grupper) eller intratumoralt (3 grupper) i en dosis pâ 1 mg/mus. Kontrolmusene indgives intraperitoneale eller intratumorale injektioner af PBS. Antallet af overlevende dyr optællès den 16. eller 20. dag efter implantationen af tumorcellerne og derpâ hveranden dag frem til den 44. dag 30 efter implantationen. De 0vrige 120 dyr opdeles i 8 grupper, og musene i fors0gsgrupperne I-VI injiceres med propionibakterier som tidligere, hvorimod musene i kontrolgrupperne VII og VIII injiceres med PBS. Den 20. dag efter implantationen af tumorcellerne aflives samtlige mus, og tumorerne udskæ-35 res og vejes. Der foretages bestemmelse af det aritmetiske gennemsnit og standardafvigelserne for hver gruppe, og samt- 18

DK 157171 B

lige tumorer fra eksperimentelgrupperne, som ligger mere end to standardafvigelser under kontrolgennemsnitsværdi-erne, betegnes som régressive. Resultaterne analyseres statistisk under anvendelse af Student t-testen (tumor-5 masse) eller Chi-kvadratanalyse med Yates korrektion (régression af tumorerne og musenes overlevelse).

De opnâede fors0gsresultater er anf0rt i den efterf01gen-de tabel IV.

19

DK 157171 B

n H cm cm en 01-------- 3 g \ m m cm O en en ^ tyi "5t* g --------- d O in m H< 1·" r- eo

CD H

P d------:-- Φ 5-1 -HO) „ ^1 H00 eo in M* t"'· I 00 O) h en -P 0)___:------ ^ o

flj M

Oio r- oo en σι r- co H g cm d 3________ O -P------

η, ιμ σ\ oo ce h σ> O

O ctf co HH

P --—------- (¾ -G · · ·

(D

)¾ β CM CT) oo O CM H CM

φ O CM H H H H

g · 'H________

P -P

tji CD fd _ d h -p ο o <m -i η

HH β CM H H H H H H

H (D d________ 'd D h dp di dOgooOcM m* en en ^ en

,d g H CM H H H H H H

φ d________

Λ -P P

> Q) H p H -P co cm cm ld H1 in en m

Φ (ti H CM ... „ —H H H H H H

H Ό <U-------- (D d d o d o) eu d d &> r* m en m* en en in

EHOlOdCM H H H H H H

d H P ._________ f s jg .μ cm o en lo en en en en

[x,cj CM' H " H H H H H H

U cd_________

H

(D O) rçjg OcMinminenenin

CJ H CM H H H H H H H

QJ--------

P P

fB (D

vomm en en en en en

IM-ι HHHHHHHH

0 0) 00________

1 ? ' L 1 I | ! I

O ° p ed u > P y > u gi <U rd ed en d d P CM _ g _ ûdci ci d h gqg g isi i m - t! -d p ^ t! ^ p i 'd 'd φοο ΦΦΦΦωφωΒωα)

H -Pft-Pd-PdH+5-PH-PH

ber OO OQ UH uçd oed dpd-Pd-PdPdPdP

t û ry n û il y d0 ü .Sg -si ·§| ·§β 1¾ ·§«

ê -S g ta a S aa a .5 aaJ

tn O en

r—I rH

20

DK 157171 B

Virkningen af propionibakterierne pâ væksten og regressio-nen af sarcoma 180 hos CFW-mus er anf0rt i den efterf0lgen-de tabel V.

21

DK 157171 B

•P (-

0) I

i—1 · 03 -H

<3 p 03 m co O

q o) u q " - J·

C(J i—l Iji O dP Ο <*> O

,q H q 03 ·ρ Γ' <x> yo (DO) O fÜ 03 Λ ü -H-----

P P

-μο Μ l <D

CD g <D a) Ό > q -ro P a) P m m in m.

03 P q - P 03 H H H H

H -H HOP \ \ \ \ nq-l (d Ό Ο Ο Η Ο θ' td h -P a) S h 1-1 p «•fin?

03 q P (=Ü tnP

03 O------ s q g ο o q φ h cm y° 00

ra-H-Po) cm H 'a* H

+J CO 0) co cm CM CM

- (d P q w -p -P B'-' +1 +· +1 +' q 0 P P tD „ g (d HO^· H 00 CM rj H g co en 'ü* co O) fi q co ld oo [" O g B cm 0 .ri------

03 I

P P 03 -H _ _ (8 φ 0) oo O oo λ -p q p q - * “ 1 m 0 Ü3 O o\o O oo O oo o d) -p 0) -P LH "'S* 00 00 -P Pi 03 H CD M----- i—! 0) rtj -ro I Φ g &1 q 03 T3 oo -HP03P m m ΙΠ in

U P 0) H H H H

• p CM rl· H'01P"o\ \ \ \ >(diP (ti cd Ό O O oo co m

(fl Φ P Φ E

h - q q p p

03 en oo O fi tnP

Λ O -P----- fd râ *· ·Ρ

Eh ·Μ< P 03 H cm iP cm

q CD 03 CM rH co H

O) ·. Oj en, .co co co ^ PO (d cd ^ O l-π P g tn +1 +1 +1 +1 ej o* jj μ — 3 JS qo h oo cm vo

jJ ^3 H g co "5P CO CM

Λ 3 CD 00 O H

0) (fl Eh cm HH

Π3 q J_I_I------ 03 g P \ 03 tn •ti g 03

P H

φ ^ 03

P P

03 q p § É § +j 03 q q q (H 4J -P "P ·Ρ

iti ,14 P P P

rd 03 03 03

Cn Λ -P -P -P

o 3 O ü o 0 nj g td q 03 ο rQ 3 Λ Λ

(fl -p -P 03 *P -P

oia h q o q _ q qo oohoeo g p p h q -p q -p en p a -p as ftO p<© o q o q o -p o q

g q o PP P > PO

qo) î5 Ph tn 1¾ cd cd EH g ---J-

in O

22

DK 157171 B

Ved intraperitoneal indgift i en enkelt dosi-s pâ 1 mg/mus opnâs ved aile tre afpr0vede propionibakteriestammer en signifikant for0gelse af milten den 4. dag efter in.jektio-nen med yderligere for0gelse af miltmassen pâ dagene 6-14.

5 Denne for0gelse af milten genspejler stimuleringen af det retikuloendotheliske System og 10ber parallelt med antitu-morvirkningen af disse immunostimulatorer.

Propionibacterium granulosum f0rer til en régression pâ mere end 70% hos de unders0gte sarcoma 180-tumorer, nâr 10 der er taie om intratumoral indgift.

3. In vivo cytostatisk virkning i murine tumorceller af Propionibacterium granulosum.

Ved et andet fors0g unders0ges den cytostatiske virkning af Propionibacterium granulosum, stamme KP 45, pâ sarcoma 15 L-l hos BALB/c-mus (lunge). Ogsâ her optræder en signifikant virkning sammenlignet med virkningen hos ubehandlede dyr.

4. Antibakteriel virkning ved st0ttebehandling i forbindel-se med kemoterapi af primære eller sekundære lungetumo- 20 rer.

30 patienter med primære eller sekundære metastatiske lunge-tumorer udvælges til denne unders0gelse. 10 af patienterne gives intraven0se infusioner af 30 mg Propionibacterium granulosum i 100 ml intraven0s infusionsopl0sning. De andre 25 20 patienter tjener som kontrolgruppe.

Samtlige patienter behandles kemoterapeutisk til synkrono-sering af proliferingen af neoplastiske celler. Hvert for-s0g varer 3 dage: 1. dag: vinchristin 1,5 mg intraven0st kl. 8 og kl. 20, 2. dag: methotrexat 25 mg intramuskulært 30 kl. 20, 3. dag: methotrexat 25 mg intramuskulært kl. 8, ef-terfulgt af intraven0s indgift af methotrexat i en mængde pâ 25 mg kl. 14 og infusion af 30 mg/kg cyclophosphamid pâ samme tidspunkt.

DK 157171 B

; 23 -! / ' /

Denne kemoterapeutiske behandling gentages tre gange hver 21. dag.

Den samlede kemoterapi bestâr af de tre ovenfor anf0rte pe-rioder, der begynder den 1., 22. og 43. dag af iagttagelses-5 perioden.

Den 3., 10v 31. og 52. iagttagelsesdag indgives Propioni-bacterium granulosum i en dosis pâ 30 mg/100 ml intraven0st i form af en infùsionsopl0sning i l0bet af 15 minutter (den sidste dag af den f0rste kemoterapeutiske période og derpâ 10 1 uge efter afslutningen af denne période).

Hos de patienter, som kun har fâet kemoterapeutisk behandling, indtræder 5 tilfælde af bakterieinfektioner (3 raed Pneumoniae, 1 med Sepsis og 1 tilfælde af Angina tonsillaris) i l0bet af en 60 dages iagttagelsesperiode, medens de 10 15 patienter med kemoterapi og intraven0s infusion af Propioni-bacterium granulosum ikke viser symptomer pâ bakterieinfektioner. Denne forskel mâ betegnes som statistisk signifi-kant. · " "

Patienternes tolerans overfor intraven0se infusioner af 20 Propionibacterium granulosum, stamme KP 45, er god. Under infusionen af 30 mg Propionibacterium granulosum indtræder ganske vist kuldefornemmelser og efterf0lgende feber op til 39°C (2-12 timer efter infusionen), men den næste dag kun-ne disse bivirkninger ikke længere konstateres. Gentagne 25 infusioner af Propionibacterium granulosum f0rer ikke til udvikling af en forsinket hypertensitivitet under iagttagel-sesperioden pâ 60 dage. Der kan deraf drages den slutning, at den intraven0se infusion af fra 30 til 240 mg Propionibacterium granulosum, stamme KP 45, kan foretages uden risi-30 ko for alvorlige bivirkninger eller komplikationer hos patienter.

24

DK 157171 B

5. Generel anvisning til lokal indgift (mave- og tarmkræft) 10 mg lyofiliseret produkt suspenderes i 1 ml 1%'s xylocain i kogsaltopl0sning og injiceres intratumoralt gennem huden (diameter 1 mm), hvorved der anvendes en 80 cm lang stiv 5 polyethylenslange med fast anbragt intramuskulær nâl (18 gauge) uden epiphyse. Slangen indf0res gennem en bioptisk kanal i et endoskop (gastrofiberoskop eller colonoskop), hvorved den neoplastiske tumor, som kontrolleres visuelt, punkteres, og nâlen indf0res i tumorvævet i en længde pâ 10 0,5 til 1 cm. Produktet injiceres gennem slangen, og man skyller med 1-2 ml 1%'s xylocain i kogsaltopl0sning.

De intratumorale injektioner, som hver er pâ 10 mg pro-dukt, foretages eksempelvis i 10bet af de f0rste 3 dage og derefter den 10. og 17. dag i iagttagelsesperioden.

Claims (8)

1. Anvendelse af Propionibacterium granulosum stamme KP 45, DSM 1773, Propionibacterium avidum stamme KP 40, DSM 1772 og/eller Propionibacterium acnés stamme ATCC 6919 til 5 fremstilling af cellevægpræparater eller helcellepræparater til anvendelse ved tumorbehandling samt ved strâlings-eller kemoterapi af tumorer.

2. Anvendelse if0lge krav 1 til fremstilling af injicer-bare suspensioner i phosphatpufret natriumchloridopl0sning.

3. Anvendelse if01ge krav 1-2 til fremstilling af suspen sioner af hele celler eller cellevægge i phosphatpufret natrium-chloridopl0sning med en koncentration pâ 0,5-50 mg aktivt mate-riale pr. ml opl0sning.

4. Anvendelse if0lge krav 1 til fremstilling af intra-15 peritonealtj'intraveh0st eller intratumoralt applicerbare suspensioner af hele celler eller cellevægge i phosphatpufret natriumchloridopl0sning i terapien af tumorer.

5. Anvendelse if0lge krav 4, kendetegnet ved, at koncentrationen af cellematerialet er 0,5-50 mg/ml opl0s- 2. ning.

6. Anvendelse if0lge krav 1-4 til fremstilling af anti-baterielt virksomme cellevægpræparater eller helcellepræparater som st0ttebehandling ved strâlings- eller kemoterapi af tumorer.

7. Anvendelse if0lge et af kravene 1-6, kendeteg net ved, at man anvender Na^PO^/K^PO^-phosphatpuffer med pH-værdi 7,2.

8. Anvendelse if0lge et af kravene 1-7, kendeteg net ved, at man fremstiller en injicerbar suspension af d0de DK 157171 B hele celler eller cellevægge i en mængde pâ 0,5-50 mg/ml op-l0sning af cellemateriale i en natriumchloridopl0sning med Na2HP04/KH2P0'4-puffer med pH-værdi 7,2.