DK148362B - Fremgangsmaade til fremstilling af kolesterinesterase - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af kolesterinesterase Download PDFInfo
- Publication number
- DK148362B DK148362B DK319180AA DK319180A DK148362B DK 148362 B DK148362 B DK 148362B DK 319180A A DK319180A A DK 319180AA DK 319180 A DK319180 A DK 319180A DK 148362 B DK148362 B DK 148362B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- dsm
- streptomyces
- cholesterol
- culture
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 9
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 abstract description 6
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 abstract description 5
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 abstract description 5
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 abstract 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 4
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- HVYWMOMLDIMFJA-UHFFFAOYSA-N 3-cholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 2
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJECHNNFRHZQKU-UHFFFAOYSA-N Oelsaeurecholesterylester Natural products C12CCC3(C)C(C(C)CCCC(C)C)CCC3C2CC=C2C1(C)CCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)C2 RJECHNNFRHZQKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- RJECHNNFRHZQKU-RMUVNZEASA-N cholesteryl oleate Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CC[C@H]3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)C1 RJECHNNFRHZQKU-RMUVNZEASA-N 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235556 Cunninghamella elegans Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241001149951 Mucor mucedo Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 241000204087 Pseudonocardia autotrophica Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000520747 Streptomyces canescens Species 0.000 description 1
- 241000187130 Streptomyces chartreusis Species 0.000 description 1
- 241000936751 Streptomyces cyaneofuscatus Species 0.000 description 1
- 241000936713 Streptomyces griseomycini Species 0.000 description 1
- 241000936729 Streptomyces hachijoensis Species 0.000 description 1
- 241000946864 Streptomyces michiganensis Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 241000946794 Streptomyces roseolus Species 0.000 description 1
- 241000187179 Streptomyces tendae Species 0.000 description 1
- 241000946767 Streptomyces toxytricini Species 0.000 description 1
- 241000946738 Streptomyces variabilis Species 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 229930193551 sterin Natural products 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
i 148362
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af kolesterinesterase, hvor man dyrker en mikroorganisme, som er i stand til kolesterinesterase-dannelse, i et egnet næringsmedium i nærværelse af en induktor og udvinder enzymet af kulturvæsken og/eller cellerne.
Kolesterinesterase spiller en vigtig rolle i den kliniske og biokemiske analytik, efter at der er udviklet fremgangsmåder til enzymatisk bestemmelse af kolesterin. Da en stor del af kolesterinet foreligger i biologisk materiale i form af estere, muliggør den fælles anvendelse af kolesterinesterase og kolesterinoxiderende enzymer såsom kolesterinoxidase eller kolesterindehydrogenase en fuldenzymatisk bestemmelse, også af kolesterinestere. Dette er kendt fra DE-patentskrift nr. 2.264.847. Som særligt egnet inden for rammerne af kole-sterinester-bestemmelsen har vist sig enzymet fra mikroorganismer (DE-offentliggørelsesskrift nr. 25 06 712.3). En ulempe ved de hidtil fundne mikroorganismer med et indhold af kolesterinesterase, som gør oparbejdningen lønsom, består dog i de forholdsvis ringe udbytter af enzym-aktivitet, som derved fås.
Normalt sker ved de kendte fremgangsmåder dyrkningen i et næringsmedium, der indeholder en induktor. Ved "induktor" forstås her et stof, som stimulerer mikroorganismen til at danne det ønskede enzym, i det hele taget eller i større mængder end uden induktor? for normalt kræver mikroorganismer ingen kolesterinesterase, da der står tilstrækkeligt mange andre næringskilder til deres rådighed, og dannelsen af et ikke-nødvendigt enzym er uøkonomisk for cellen. Kendte induktorer har været kolesterinestere eller kemisk lignende forbindelser.
Det har nu overraskende vist sig, at ved anvendelse af en bestemt induktor, som i kemisk henseende står fjernt fra kolesterinestere, kan opnås mange gange højere aktiviteter, end det hidtil har været muligt. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er derfor ejendommelig ved, at man anvender leci- 2 148362 thin som induktor.
Fortrinsvis anvendes den ifølge opfindelsen anvendte induktor også som carbon-kilde, især som eneste carbon-kilde.
Det er dog også muligt at tilsætte særlige carbon-kilder, f.eks. majs-støbevand, peptoner, gærekstrakter samt, men mindre egnet, sukker eller polyalkoholer såsom glycerin.
Som særligt egnet blandt de forskellige lecithiner har vist sig soja-lecithin, men også andre lecithin-arter såsom ægge-lecithin eller hjerne-lecithin, gav meget gode resultater.
Den anvendte lecithin-mængde ligger i almindelighed mellem ca. 0,1 og 5 vægt%, beregnet på rumfanget af næringsmediet.
Ved anvendelse af lecithin som induktor og eneste carbon-kilde blev der opnået særligt gode resultater med en mængde på 0,5 - 2 vægt%.
Til opfindelsen egner sig i princippet alle mikroorganismer, som er i stand til at danne kolesterinesterase i en mængde, der gør oparbejdning lønsom. Sådanne mikroorganismer er kendt i stort antal. Egnede er for eksempel:
Candida rugosa ATCC 14830
Fhizopus spec. DSM 695
Aspergillus spec. DSM 698
Streptomyces aureoverticillium DSM 40080
Streptomyces cyaneofuscatus DSM 40148
Streptomyces griseomycini DSM 40159
Streptomyces longisporus-fl. DSM 40165
Streptomyces raalachiticus DSM 40167
Streptomyces roseolus DSM 40174
Streptomyces toxytricini DSM 40178
Streptomyces variabilis DSM 40179
Streptomyces spec. DSM 687 148362 3
Streptomyces autotrophicus DSM 40011
Streptomyces canescens DSM 40528
Streptomyces chartreusis DSM 40085
Streptomyces michiganensis DSM 40015
Streptomyces murinus DSM 40091
Streptomyces hachijoensis DSM 40114
Streptomyces caelestes DSM 40084
Streptomyces tendae DSM 40101
Nocardia rubra DSM 43008
Candida mycoderma DSM 688
Candida albicans DSM 689
Candida albicans DSM 690
Candida albicans DSM 691
Candida spec. DSM 692
Cunninghamella elegans DSM 693
Mucor mucedo DSM 694
Penicillium spec. DSM 696
Aspergillus spec. DSM 697
Pseudomonas fluorescens ATCC 31156
Pseudomonas fluorescens IAM 1051
Pseudomonas fluorescens ATCC 948
Pseudomonas fluorescens KY 4032
Pseudomonas fluorescens IFO 3081
Pseudomonas spec. IAM 18002 og 18001 Særligt foretrækkes Pseudomonas spec. 1280 og 1281.
Et særligt foretrukket næringsmedium, der især er egnet til Pseudomonas-arter, indeholder desuden sædvanlige tilsatte salte og mikronæringsstoffer og skal ved tilsætning af en egnet stødpude indstilles til en pH-værdi på ca.
5 - 9, fortrinsvis 6 og 8. Som stødpude foretrækkes phos-phat-stødpude. Derudover indeholder næringsmediet hensigts-mæsssigt endvidere ammonium-, chlor-, Fe-, Cu-, Zn-, Mg- og Ca-ioner, bortset fra phosphat-stødpudens alkali-ioner.
Phosphat foreligger hensigtsmæssigt i en koncentration på 0,4-2 vægt%, men der kan dog også anvendes større eller 4 148362 mindre koncentrationer.
Et særligt foretrukket næringsmedium til anvendelse ifølge opfindelsen har ca. følgende sammensætning, der er beregnet på én liter væske: 5.00- 10,00 g, fortrinsvis 6,00-8,00 g, Na2HPC>4,2H20, 1.00- 5,00 g, fortrinsvis 2,00-4,00 g, KH2P04, 0,20- 2,00 g, fortrinsvis 0,80-1,20 g, NH^Cl, 0,01- 0,10 g, fortrinsvis 0,30-0,70 g, NaCl, 0,01- 1,00 ml 1%-ig FeCl^-opløsning, 0,01- 1,00 ml 0,2%-ig CuCl2-opløsning, 0,01- 1,00 ml 1%-ig zinksulfat-opløsning, 0,10-10,00 ml 10%-ig CaClj-opløsning, 1.00- 20,00 ml, fortrinsvis 3,00-10,00 ml, 12%-ig MgSO^-opløsning, 0,10- 5,00, fortrinsvis 0,50-2,00, vægt%, sojalecithin.
Dyrkningen af de særligt foretrukne mikroorganismer i ovennævnte næringsmedier udføres under aérobe betingelser. Velegnet er både rystekultur og luftet neddykket kultur. Temperaturen kan ligge mellem ca. 15 og ca. 45°C, fortrinsvis mellem 25 og 35°C. Maksimale enzymudbytter får man i almindelighed allerede efter 1-2 dages varighed af kulturen.
Kolesterinesterasen kan optræde både i kulturmediet og i cellerne. Ved tilsætning af overfladeaktive midler, især ikke-ionogene midler, som fortrinsvis hører til typen polyoxy= ethylenestere og -ethere med alkyl- og aralkyl-rester, kan man ved mange mikroorganismer påvirke fordelingsmønsteret mellem kulturvæsken og cellerne, sædvanligvis i retning af en forøgelse af den ekstracellulære aktivitet på bekostning af den intracellulære aktivitet. Med ionogene overfladeaktive midler forløber ændringen af fordelingen dog lejlighedsvis i omvendt retning.
148362 5
Efter endt dyrkning isoleres kolesterinesterasen af cellemassen og/eller kulturfiltratet på sædvanlige måder og renses eventuelt. Til mange formål egner sig dog allerede et ikke-renset råprodukt, som i det væsentlige kun består af oplukket cellemasse. Til oplukningen egner sig de for fagmanden hertil velkendte metoder, som her ikke kræver nærmere belysning. Både af kulturfiltratet og af den oplukkede cellemasse kan enzymet efter fraskillelse af uopløselige bestanddele fældes ved fældning med sædvanlige fældningsmidler, for eksempel salte såsom ammo= niumsulfat eller organiske opløsningsmidler såsom acetone eller alkohol,og derpå renses yderligere under anvendelse af de sædvanlige fraktioneringsmetoder såsom kromatografi og udfældning.
De følgende eksempler belyser nærmere opfindelsen.
EKSEMPEL 1,
Pseudomonas spec. DSM 1280, som fra en dybkølet ampul er bragt på en skråkultur, for-kultiveres i hovedkulturmediet i 2 dage ved 30°C aerobt (rystekolbe) og podes så indtil 10% over i et medium, som pr. liter har følgende sammensætning : 7.00 g Na2HP04,2H20, 3.00 g KH2P04, 1.00 g NH4C1, 0,05 g NaCl, 0,10 ml FeCl3, 1%, 0,10 ml CuCl2, 0,2%, 0,10 ml ZnS04, 1%, 1.00 ml CaCl2, 10%, 5.00 ml MgS04, 12%, 1,50 % sojalecithin, pH 7,0.
148362 6
Kultiveringen sker ved 30°C aerobt i rystekolbe. Efter 1 -3 dage fås aktiviteter på ca. 15.000 U/l (overstand og biomasse; substrat: kolesteryloleat).
Ca. samme udbytter fås, når der under samme betingelser i stedet for Pseudomonas spec. DSIl 1280 anvendes Pseudomonas spec. DSM 1281.
Af en fremkommen kulturopløsning blev den uopløselige cellemasse fracentrifugeret og anvendt til kolesterinester-bestemmel-se. Bestemmelsen skete efter følgende reaktionsligninger: X) Kolesterinester + H,0 Holesterinesterase kolesterin + fedtsyre.
2) 4.1/7 n toXesterin-OD/katalase tnlM<.mnn ^ h2°2.
(Måling af kolestenon-dannelsen ved 240 nm).
Til målingen blev anvendt følgende opløsninger: 1) Phosphatstødpude 0,5 M, pH 7,5, 0,4% thesit, 2} Kolesterinoleat c = 4 i thesitdioxan (v/v = 1/1), 3) H2°2 ca* 0/6 M ml perhydrol/100 ml), 4) Katalase (0,01 mg protein/ml), 5) Kolesterinoxidase (mindst 50 U/ml), 6) Kulturopløsning (ved ca. 5.000 U/l fortyndet 1:5 med H20, 0,01 ml -* test) .
Til målingen blev 2,95 ml opløsning 1) blandet med 0,02 ml opløsning 3). Efter 5 minutter blev 0,01 ml opløsning 6) og 0,02 ml opløsning 5) tilsat, og efter 1 minut blev reaktionen startet ved tilsætning af 0,1 ml opløsning 2).
148362 7
Beregningen udføres som følger: —x— x x A E/min. = U/l kulturopløsning.
15,5 x 0,01 EKSEMPEL 2.
Candida rugosa ATCC 14830, som fra en dybkølet ampul er bragt på en skråkultur, podes over på et kulturmedium af nedenstående sammensætning og kultiveres i 48 timer ved 28 - 30°C aerobt (rystekolber 20/100). Derefter bliver med 10% podemateriale podet over på et medium, der har følgende sammensætning (angivelse pr. liter): 20 g sojamel (fra General Poods under handelsbetegnelsen GeFu 988 SUP), 20 g opløselig stivelse, 5 g K2HP04,3H20, 1 g MgS04,7H20, 1 g (NH4)2S04, 1,5% sojalecithin, pH 6,6-6,8.
Kultiveringen skete ved ca. 28°C aerobt. Efter 3-4 dage fås aktiviteter på 1.500 - 2.000 U/l (overstand; testsubstrat: Kolesterinoleat).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2933646 | 1979-08-20 | ||
| DE19792933646 DE2933646A1 (de) | 1979-08-20 | 1979-08-20 | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK319180A DK319180A (da) | 1981-02-21 |
| DK148362B true DK148362B (da) | 1985-06-17 |
| DK148362C DK148362C (da) | 1985-11-04 |
Family
ID=6078850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK319180A DK148362C (da) | 1979-08-20 | 1980-07-24 | Fremgangsmaade til fremstilling af kolesterinesterase |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4343903A (da) |
| EP (1) | EP0024345B1 (da) |
| JP (1) | JPS5642587A (da) |
| AT (1) | ATE4326T1 (da) |
| DD (1) | DD154021A5 (da) |
| DE (2) | DE2933646A1 (da) |
| DK (1) | DK148362C (da) |
| HU (1) | HU184814B (da) |
| IL (1) | IL60448A (da) |
| ZA (1) | ZA805073B (da) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3200274A1 (de) * | 1982-01-07 | 1983-07-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden |
| DE3340950A1 (de) * | 1983-11-11 | 1985-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| DE3447390A1 (de) * | 1984-12-24 | 1986-07-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| JPH0714342B2 (ja) * | 1990-08-10 | 1995-02-22 | 田辺製薬株式会社 | エステラーゼの製法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2315501C3 (de) * | 1973-03-28 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
| JPS50157588A (da) * | 1974-06-17 | 1975-12-19 | ||
| US4052263A (en) * | 1975-12-11 | 1977-10-04 | Eastman Kodak Company | Production of cholesterol esterase using Nocardia cholesterolicum |
| JPS55113074A (en) * | 1979-02-24 | 1980-09-01 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | Developing device for electrophotographic copier |
-
1979
- 1979-08-20 DE DE19792933646 patent/DE2933646A1/de not_active Withdrawn
-
1980
- 1980-06-30 IL IL60448A patent/IL60448A/xx unknown
- 1980-07-24 DK DK319180A patent/DK148362C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-08-06 US US06/175,808 patent/US4343903A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-08-13 AT AT80104796T patent/ATE4326T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-08-13 DE DE8080104796T patent/DE3064409D1/de not_active Expired
- 1980-08-13 EP EP80104796A patent/EP0024345B1/de not_active Expired
- 1980-08-18 DD DD80223375A patent/DD154021A5/de unknown
- 1980-08-19 JP JP11307580A patent/JPS5642587A/ja active Granted
- 1980-08-19 HU HU802067A patent/HU184814B/hu unknown
- 1980-08-19 ZA ZA00805073A patent/ZA805073B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK148362C (da) | 1985-11-04 |
| DE3064409D1 (en) | 1983-09-01 |
| HU184814B (en) | 1984-10-29 |
| US4343903A (en) | 1982-08-10 |
| DE2933646A1 (de) | 1981-03-26 |
| JPS5733946B2 (da) | 1982-07-20 |
| ZA805073B (en) | 1981-09-30 |
| ATE4326T1 (de) | 1983-08-15 |
| IL60448A0 (en) | 1980-09-16 |
| EP0024345B1 (de) | 1983-07-27 |
| JPS5642587A (en) | 1981-04-20 |
| EP0024345A1 (de) | 1981-03-04 |
| DK319180A (da) | 1981-02-21 |
| IL60448A (en) | 1983-05-15 |
| DD154021A5 (de) | 1982-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3634195A (en) | Production of lipase | |
| US4774179A (en) | Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound | |
| US4093517A (en) | Method for producing cholesterol oxidase in the presence of a nonionic surfactant | |
| US4283494A (en) | Microbial lipase, process for its preparation and microbiologically pure culture therefor | |
| US4985364A (en) | Preparation of cyclopropanecarboxylic acids | |
| US3558434A (en) | Stimulation of the growth of microorganisms | |
| US3713976A (en) | Cultivation of micro-organisms on hydrocarbons | |
| Liu et al. | Cultural conditions and some properties of the lipase of Humicola lanuginosa S-38 | |
| FR2487375A1 (fr) | Procede de production de l'enzyme cholesterase et d'hydrolyse des esters de cholesterol d'acides gras en utilisant l'enzyme elle-meme | |
| JPH0253029B2 (da) | ||
| US4492756A (en) | Microorganisms of the genus Hyphomicrobium and process for degrading compounds wich contain methyl groups in aqueous solutions | |
| DK148362B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af kolesterinesterase | |
| US3825473A (en) | Production of cephalosporin c | |
| GB2167421A (en) | Process for producing peroxidase | |
| Cooksey | The metabolism of organic acids by a marine pennate diatom | |
| US4072568A (en) | Method for the preparation of cholesterol oxidase | |
| US3767533A (en) | Process for producing uricase | |
| US4360596A (en) | Process for the preparation of cholesterol esterase | |
| US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
| US3713984A (en) | Cultivation of micro-organisms on hydrocarbons | |
| US3663373A (en) | Process for the preparation of iodinin | |
| CA1067844A (en) | Method and medium for producing cholesterol oxidase | |
| D'Amato et al. | A chemically defined medium for cephalosporin C production by Paecilomyces persicinus | |
| US3585110A (en) | Process for preparing 1-dehydro steroids | |
| US3661712A (en) | Process for producing zearalenone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |