DK147286B - Fremgangsmaade til fremstilling af cellulaseenzymer af cl- og cx-typen samt aryl-beta-glucosidaser ved dyrkning af thielavia terrestris - Google Patents

Description

i 147286

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af cellulaseenzymer af og Cx-typen samt aryl-p-glucosi-daser ved dyrkning af Thielavia ter restris.

Det er kendt af fremstille cellulaseenzympræparater ved dyrk-05 ning af svampen Thielavia ter restri s i et næringsmedium indeholdende kilder for cellulose, nitrogen, salte og evt. yderligere stoffer, jfr. USA-patentskrift nr. 4.081.328. Det fremstillede enzympræparat rapporteres at have C1- og C -cellulaseenzymaktivitet. Det er end-videre tidligere rapporteret, at enzymproduktionen af andre cellu-10 laseproducerende organismer end Thielavia terrestris inhiberes af glycerol.

Følgende artikler behandler glycerol eller glucoses undertrykkelse af cellulaseproduktionen ved anvendelse af andre organismer end Thielavia terrestris; 15 Mandels, 1975, Growth and Cellulase Production by Trichoderma, pp. 81-109. I Bailey et al, Symposium on the Enzymatic Hydro-lysis of Cellulose, The Finnish National Fund for Research and Development (SITRA), Helsinki, Finland.

20 Nisizawa et al, 1972, Catabolite Repression of Cellulase Fermenta tion in Trichoderma Viride, J. Biol. Chem. 71, 999-1007.

Montenecourt et al, 1977, Preparation of Mutants of Trichodermia reisei with Enhanced Cellulase Production, Appl. and Env. Mi-25 crobiol., 34, No. 6, 777-782. Denne undersøgelse viste, at 5% glycerol undertrykkede cellulaseproduktion og også i vidt omfang reducerede mængden af syntetiseret ekstracelltilært protein i forhold til, hvad der udskiltes, når cellulose var den eneste carbon kilde.

30 I modsætning til angivelserne ifølge de tidligere undersøgelser som ovenfor nævnt, har det nu overraskende vist sig, at der, når glycerol sættes til et cellulose-holdigt næringsmedium, som anvendes til fremstilling af cellulaser ved dyrkning af Thielavia terrestris, op-35 2 147286 nås en forøgelse af fremstillingen af disse enzymer, idet fremstillingen af enzymer med C^- og C - aktivitet ikke påvirkes af glyceroltilsætningen, men fremstillingen af enzymer med aryl-p-glucosidaseaktivitet forøges indtil ca. fem fold. Endvidere har det vist sig ved gelfiltre-05 ringsadskillelsesteknikker, at sammensætningen af β-glucosidaserne i nærværelse af glycerol ændres i forhold til den, der findes i standardmediet i sig selv. Andelen af de mere varmestabile af β-glucosi-daseenzymerne forøgedes således i forhold til de mindre varmestabile, et vigtigt praktisk resultat, da varmestabilitet er en yderst ønskvær- 10 dig egenskab med henblik på forøgelse af udbyttet af glucose fremstillet ud fra cellulosematerialer ved arbejde ved højere temperaturer.

Desuden gør cellulasernes varmestabilitet det muligt ved opvarmning af systemet at fortsætte den enzymatiske aktivitet, der skyldes ceHu-laserne, og samtidig udvirke destruktion af forholdsvis varmefølsomme 1 ζ uønskede enzymer, som kan være til stede. Eksempler på uønskede enzymer, der kan elimineres på denne måde, mens de værdifulde cellulaser bevares, er sådanne enzymer, som forårsager uønskede virkninger, såsom proteinhydrolyse, forskellige deamineringer, hydrolyse af lipider og lignende.

20

Hvad angår mængden af glycerol, som til forøgelse af udbyttet af aryl^-glucosidaser kan sættes til mediet med positiv og gunstig virkning, har det vist sig, at så lidt som ca. 0,5 vægt% er effektivt, mens mængder op til ca. 5 vægt% kan anvendes med fordel. Dette fænomen er således en klart uventet opdagelse, da det som nævnt 25 er velkendt fra den kendte teknik, at fremstillingen af cellulolytiske enzymer fra f.eks. Trichoderma dissimilationsundertrykkes med glucose og glycerol.

Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed en fremgangsmåde til fremstilling af cellulaseenzymer af C-- og C - 30 x typen samt aryl-p-glucosidaser ved dyrkning af Thieiavia terrestris i et næringsmedium indeholdende kilder for cellulose, nitrogen, salte og evt. yderligere stoffer og udvinding og evt. adskillelse af de dannede enzymer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der til mediet sættes fra ca. 0,5 til ca. 5% glycerol.

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen udvindes de dannede enzymer og adskilles ved 1) filtrering af mediekulturen, 2) udfæld- 35 3 Ή7286 ning med ammoniumsulfat-mættet opløsning, 3) opløsning og derefter afsaltning ved gelfiltrering, 4) fornyet gelfiltrering med eluering med natriumchlorid, og 5) yderligere gelfiltrering af eluaterne med opsamling af adskilte fraktioner af aryl^-glucosidase og Cog 05 C^-enzymaktivitet.

For at vise denne uventede virkning, som glycerol har på fremstillingen af cellulolytiske enzymer med Thielavia terrestris, blev der gennemført nogle undersøgelser under anvendelse af medier af forskelfig sammensætning som vist: 10 A) Mediesammen sætning: ("Avicel 105" er cellulosepulver, og "CSL" er majsstøbevæske)

Nr. Grund- "Avicel Pepton "CSL" Glu- Cello- Gly-15 medium* 105" _ _ cose biose cerol 1 100 ml 1 g 2 g 2 g 2 100 ml 1 g 0,5 g 0,5 g 3 100 ml 1 g 0,1 g 0,1 g 4 100 ml 1 g 0,5 g 0,5 g 5 g 5 100 ml 1 g 0,5 g 0,5 g 5 g 6 100 ml 1 g 0,5 g 0,5 g 5 g * Grundmedium: KHgPO^ 6,8 g/1, (NH4)2S04 1,3 g/l, MgC04 25 7H2° ®'5 S/*' CaCl2 0/2 S/·/ sporstofopløsning 2 ml/l.

B) Dyrkning: En farkultur fremstilledes ved overføring af en lille mængde mycelium fra et skråsubstrat til en 250-ml kolbe indeholdende 100 ml medium nr. 2. Kolben anbragtes ved 48°C i 48 timer på rotationsrysteapparat. Hovedkulturen påbegyndtes ved overføring af 2 ml af mediet fra forkulturen til en 250-ml kolbe indeholdende 100 ml af mediet. Dyrkningen gennemførtes på et rotationsrysteapparat ved 48°C.

C) Resultat:

Som vist i figurerne, jfr. nedenfor, undertrykkedes fremstillingen 35 af cellulolytiske enzymer med Thielavia terrestris af glucose ligesom ved Trichoderma. Glycerol havde imidlertid ikke nogen virkning på fremstillingen af enzymer med C^- (filterpapiraktivitet) og C^-aktivi- 4 147286 tet. Thielavia terrestris fremstillede ca. fem gange si meget aryl-β-glucosidase i mediet indeholdende 5% glycerol som i standardmediet (nr. 2) (sammenlign med USA-patentskrift nr. 4.081.328). Det viste sig også ved gelfiltrering, at der er forskel i sammensætningen af 05 de fra standard mediet og det glycerolholdige medium opnåede β-glucosidaser.

Den optimale temperatur for cellulaseaktivitet bestemtes til at være ca. 60°C. Disse aktiviteter kan måles ved hjælp af følgende analysemetoder. De med Thielavia terrestris fremstillede termostabile 10 cellulaser frembringer 10-12 enheder filterpapiraktivitet, 25-30 enheder aryl^-glucosidase og 80-90 enheder CMC-ase i 1 ml centrifugat af dyrkningsvæsken.

Enzymanalyse 15 1. Filterpapiraktivitet

Som substrat benyttes en 100-mg strimmel af "Whatman nr. 1" filterpapir (1 x 12 cm). Analyseblandingen i et prøverør (16 x 150 mm) udgøres af 1 ml 0,5M acetatpuffer, pH 5,0, en strimmel filterpapir foldet ligesom en bælg, og 1 ml fortyndet enzymopløsning.

20 Blandingen holdes i en time i vandbad (60°C). Efter inkubering sættes 2 ml dinitrosalicylsyrereagens til analyseblandingen, og fremstillede reducerende sukkere bestemmes ved DNS-metoden og beregnes som glucoseækvivalent. Én enhed filterpapiraktivitet defineres som den mængde enzym, der frembringer 1 mg glucoseækvivalent reduce-25 rende sukkere under de ovenfor beskrevne betingelser.

2. CMC-ase

Analyseblandingen udgøres af 1 ml 1% carboxymethylcellulose (SIGMA, produkt nr. C-8758) indeholdende 0,5M acetatpuffer, pH 30 5,0, og 1 ml fortyndet enzymopløsning. Blandingen holdes ved 60°C

i 30 minutter. Efter inkubering sættes 2 ml dinitrosalicylsyrereagens til blandingen, og fremstillede reducerende sukkere måles ved DNS-metoden og beregnes som glucoseækvivalent. Én enhed CMC-ase defineres som den mængde enzym, der fremstiller 1 mg glucoseækvivalent 35 reducerende sukkere under de ovenfor beskrevne betingelser.

3. Aryl-Q-glucosidase

Der anvendes o-nitrophenyl^-D-glucopyranosid som substrat.

147286 5

Analyseblandingen indeholder 0,5 ml 10 mm o-nitrophenyl-p-D-glucopyranosid, 0,5 ml 0,5M acetatpuffer, pH 5,0, og 1 ml fortyndet enzymopløsning. Efter inkubering ved 60°C i 30 minutter sættes 2 ml 0,2M natriumcarbonat til blandingen. Frigjort o-nitrophenol måles 05 ved absorbansen ved 410 nm. Én enhed aryl-p-glucosidase defineres som den mængde enzym, der fremstiller 1 μ mol o-nitrophenol under de ovenfor beskrevne betingelser.

Ved at benytte disse analysemetoder til at følge fraktioneringsfremgangsmåderne er enzymer med C^, Cx-aktiviteter og aryl-p-glu- 10 cosidaser blevet skilt fra hinanden efter følgende skema:

Rensningsfremgangsmåde

Kulturfiltrat

Udfældning med (NH .)2SO.

^ ved 90% mætning

Præc pitat opløst i vand og afsaltet ved gelfiltrering over "Bio-Gel P-2"*)

Afsaltet opløsning 20 fyldt på en søjle af "DEAE-Bio-Gel A"*) ved pH 5,0 i--

Ikke-adsorberede materialer Adsorberede materialer fyldt på "CM-Bio-Gel A"*)

2g ved pH 5,0 elueret med NaCI

Eluat | j gel-filtrering over "Bio-Gel

Adsorberede ikke-adsorberede P-150"*) materialer materialer 30 gel-filtrering over -— elueret med "Bio-Gel P-150"*) To fraktioner β-glucosidase

NaCI To medførte og Οχ

Eluat En fraktion medførte (3 fraktioner) og Cx „ gel-filtrering over 35 »Bio-Gel P-150"*)_

To fraktioner p-giucosidase

Tre fraktioner medførte C. og C

I_ X

polyacrylamidgeler fremstillet af BIO-RAD Laboratories, Richmond, Californien, USA.

6 147286

Ved anvendelse af det skitserede fraktioneringsskema adskiltes aryl-p-glucosidaserne i to homogene fraktioner med "BIO-Gel P-150" (gennemsnitlig partikelstørrelse ~ 150 mesh i vid tilstand) ved eluering med 0,1M natriumacetatpuffer, pH 5,0. Strømningshastigheden var 05 27 ml/time, og der opsamledes fraktioner p§ 7 ml.

Som fig. 1 giver udtryk for, var adskillelsen af disse enzymer i højeste grad vellykket, idet to homogene aryl-p-glucosidaser blev isoleret fra hinanden. Fig. 1 illustrerer indvirkningen af pH på de to aryl-^-glucosidasers aktivitet.

10 De data, der svarer til den uventede iagttagelse, at glycerol i modstrid med tidligere rapporter over andre cellulaseproducerende organismer var i stand til med Thielavia terrestris at forøge udbyttet af β-glucosidaseenzym omkring fem fold i stedet for at inhibere dets fremstilling, mens udbyttet af C^/C^-f remstil lingen var uændret, 15 vises i fig. 2, 3, 4 og 5.

Sammensætningen af aryl-6-glucosidaserne ændredes også i nærværelse af glycerol i forhold til, hvad der findes med standardmediet (fig. 4). De mere varmestabile af β-glucosidaseenzymerne (fig. 5) forøgedes i forhold til de mindre varmestabile, et vigtigt praktisk 20 resultat, da varmestabilitet er en vigtig egenskab med henblik pi forøgelse af udbyttet af glucose fra cellulosematerialer.

Undersøgelse af, hvilken indvirkning glycerol koncentrationen i mediet har pi udbyttet af aryl^-glucosidaser, viste, at så lidt som 0,5% glycerol havde en positiv virkning.

25 Fig. 2 illustrerer ændringer i pH og aktivitet med dyrknings tiden under anvendelse af forskellige medier. Under anvendelse af de ovenfor beskrevne medier 1-6 vises virkningerne på aktivitet og pH-ændringer som funktion af dyrkningstiden. Disse data viser, at glucose undertrykkede produktionen af cellulaseenzymer, men at glyce-30 rol ikke havde nogen væsentlig virkning på -aktiviteten, selvom det forøgede udbyttet af aryl^-glucosidase.

Fig. 3 viser indvirkningen af de forskellige medier på aryl-β-glucosidase- og Cx-aktivitet.

Fig. 4 viser resultaterne af gelfiltreringsadskillelsen af aryl-35 β-glucosidaser fra standardmedium og fra glycerolholdigt medium og viser, hvordan udbyttet af de to forskellige β-glucosidaser påvirkes ved tilsætning af glycerol til standardmediet. Fraktionen omkring nr. 80 forøges ved glyceroltilsætningen, og denne er den mest varmestabile af de to rensede β-glucosidaser.