DK141275B - Svangerskabsforebyggende middel og fremgangsmåde til fremstilling af samme. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆ66ELSESSKRIFT 141 275 DANMARK isn int.οι.3 λ βi κ 39/oo «(21) Antegning nr. 324^/7$ (22) Indtavtrtt den ig. Jul. 197^ (23) Lebed« 19. Jul. 1976 (44) Antegningen fremiegt og fremlaggBlwKkrlftBt offentliggjort den 1 8. f øb * 1 9^0 DIREKTORATET FOR _ _ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (») Prioritet begaret fra den (71) MERCK & CO. INC., Rahway, New Jersey, US.

(72) Opfinder: Ralph Buchanan Lloyd Gw at kin, 22 Fairview Terrace, Maplewood, New Jersey, US.

(74) Fuldmagtig under (egene behandling;

Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Bout ard.___ (54) Svangerskabsforebyggende middel og fremgangsmåde til fremstilling af samme.

Den foreliggende opfindelse angår et svangerskabsforebyggende' middel. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det omhandlede middel.

Muligheden af at udnytte immunologiske procedurer til frugtbar-hedskontrol både for mænd og kvinder har været underkastet nærmere undersøgelse, men har hidtil ikke kunnet gennemføres. Sådanne tidligere forsøg er strandet, fordi man ikke har kunnet isolere et antigent materiale i ren form, hvilket er den nødvendige betingelse for at producere vævsspecifikke antistoffer.

En anden mangel ved sådanne tidligere forsøg består deri, at antisera, som er specifikke over for visse genitale væv, er arts- 2 141275 specifikke, det vil sige, at sådanne antisera ikke viser tegn på immun reaktion med det analoge væv fra dyr af andre arterj sådanne resultater viser yderligere artsspecificiteten af tidligere fremstillede antigene præparater. Kravene til enhver immunologisk metode til frugtharhedskontrol må omfatte vævsspecificitet og kryds-reaktion (modsat artsspecificitet), fordi den immunologiske procedure ikke kan betragtes som sikker, med mindre der er vævsspecificitet, og uden kryds-reaktion ville enhver sådan immunologisk procedure være yderst begrænset, fordi det antigene udgangsmateriale måtte opnås fra de arter, som skulle gøres ufrugtbare, hvilket er en umulighed for svangerskabskontrol for kvinder.

Muligheden af immunologisk kontrol med frugtbarheden under anvendelse af antigent zona pellucida fra pattedyr har været foreslået. Denne struktur, zona pellucida, og de hertil knyttede fænomener, herunder "zona-reaktion", er blevet studeret i den reproduktive biologi i forbindelse med visse sperma-æg-reaktio-ner: tilnærmelse, tilknytning og gennemtrængning. Tilnærmelse af sperma til æg forekommer at være en tilfældig proces uden talmæssig begrænsning. Tilknytning (af sperma til zona pellucida) skyldes formentlig bestemte sperma-receptorer, som findes på overfladen af zona og efter al sandsynlighed er begrænset — numme-risk ved et tilgængeligt areal. Gennemtrængning er dog normalt begrænset til et enkelt sædlegeme. Ved gennemtrængning bliver receptor-sæderne deaktiveret (zona-reaktion), og hvis receptor-sæderne eller de perifere sæder hertil er antigene, vil muligheden af at skabe antistoffer, der maskerer eller ændrer zona pellucida og således udelukker tilknytning og gennemtrængning, være en tiltrækkende, ikke-hormonal metode til frugtbarheds-kontrol. Sådanne forsøg er dog hidtil ikke lykkedes som følge af de ovennævnte to vanskeligheder, nemlig: artsspecificitet og mangel af vævsspecificitet. Det må antages, selv om opfindelsen ikke er bundet af denne teori, at sådanne tidligere forsøg mislykkedes, fordi det antigene stof, som skulle anvendes til det angivne formål, ikke blev fremstillet i funktionel form ved hidtil kendte processer, som typisk bestod i saltekstraktioner af macereret ovarievæv. Antisera, der er fremstillet af sådanne saltekstrakter, har ganske vist i nogen grad været ovarie-specifikke, fordi uønskede antistoffer adsorberes af andet væv end , 141275 ovarievæv, såsom tarm- og lungevæv, således at ekstrakterne renses i et vist omfang, men de har dog i alle tilfælde vist sig artsspecifikke. Det er endvidere af de i det efterfølgende angivne grunde yderst tvivlsomt, om sådanne hidtil kendte antisera er i stand til at indgå i en immun-reaktion med de kritiske antigene sæder af zona pellucida.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den uventede opdagelse, at et vævsspecifikt, ikke-artsafhængigt (kryds-reagerende) svangerskabsforebyggende middel kan fremstilles ud fra zona pellucida fra pattedyr ved en proces, der består i opvarmningen enten af zona pellucida per se, intakte æg eller ovarievæg omfattende æg i et passende medium, såsom vand, således at det proteinøse zona pellucida gøres opløseligt eller solubiliseres.

Sådanne vandige opløsninger indeholdende solubiliseret zona pellucida kan inddampes til tørhed til en form for zona-protein, der atter let opløses i vandige opløsninger. I den foreliggende beskrivelse benyttes udtrykket "solubiliseret zona pellucida" til at omfatte zona pellucida-protein fra pattedyr - tørt eller i opløsning - som er gjort vandopløseligt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Antistoffer fremstillet af sådant solubiliseret zona pellucida er ikke artsspecifikke og reagerer specifikt med zona pellucida på pattedyr eller mennesker, som behandles til opnåelse af svangerskabsforebyggelse.

Den foreliggende opfindelse har således til formål at tilvejebringe et middel til immunologisk frugtbarhedskontrol for hundyr eller kvinder, som opnår en reversibel tilstand af ufrugtbarhed, uden at gribe ind i den normale menstruationscyklus. Opfindelsen har yderligere til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et sådant middel.

Det svangerskabsforebyggende middel er ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det indeholder solubiliseret zona pellucida eller dets antistof, hvilket zona pellucida stammer fra et pattedyr af en art, som adskiller sig fra den, der skal behandles for frugtbarhedskontrol. Det solubiliserede zona pellucida stammer således fra fremmede kilder.

141275 4

Denne muliglied består, fordi æg i modsætning til sperma forekommer tidligt, i fetal udvikling, og derfor er hundyret tolerant over for dets eget zona pellucida, det ikke-eellulære proteinøse overtræk, der omgiver ovum hos pattedyr. Som ovenfor beskrevet skal der benyttes solubiliseret zona pellucida, der er taget fra en dyreart, som adskiller sig fra den, der skal behandles for frugtbarhedskontrol. Til immunisering af kvinder kan man for eksempel i praksis som kilde for zona pellucida anvende praktisk taget enhver lavere pattedyrart, såsom laboratorie-hamster eller laboratorie-mus, men af praktiske grunde foretrækkes slagtedyr, såsom køer, får og svin, fordi disse er let tilgængelige. Det omhandlede middel i form af et antiserumpræparat består ifølge opfindelsen af et injicerbart pharmaceutisk præparat, der indeholder antistoffet mod solubiliseret zona pellucida. Disse antisera-præparater ifølge opfindelsen er velegnede som passive midler til immunologisk kontrol af frugtbarheden, fordi podning med sådanne antistoffer kun medfører kortvarig ufrugtbarhed og yderligere synes at forhindre uterus-implantation af befrugtede æg. Dette kan om ønsket være kombineret med et egnet tilsætningsmiddel, såsom aluminiumhydroxid, mineralolie-vand-emulsioner eller emulgeringsmidler, såsom calciumalginat. Det særlige tilsætningsmiddel er ikke kritisk.

Det omhandlede middel kan fremstilles i enhedsdosisform eller i koncentreret form til efterfølgende fortynding. I stedet kan midlet fremstilles i tør form (lyofiliseret) ud fra den solubiliserede form at opnå et til lagring egnet produkt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af midlet indeholdende solubiliseret zona pellucida er ejendommeligt ved, at zona pellucida solubiliseres i et vandigt medium ved opvarmning af zona pellucida til 65-100°C, hvorefter det efter eventuel isolering og rensning oparbejdes til et pharmaceutisk middel på i og for sig kendt måde.

Dosisformen for midlet kan fremstilles ud fra den koncentrerede opløsning ved fortynding med sterilt vand eller med pufret vandigt tilsætningsmiddel (fortrinsvis pH = 7,0 - 7,2), således at enhedsdosen til injektion omfatter solubiliseret zona pellucida i en mængde på 1,0 - 10,0 ^ug/kg legemsvægt.

Fremstillingen af antisera og metoder til indgivelse er beskrevet i det efterfølgende. Hvad angår sammensætningen består 5 141275 antisera af det identificerede antistof i cellefri sera eller fraktioner deraf (Cohn-fraktioner eller lyofiliseret form).

Velkendte analytiske metoder til at karakterisere kvaliteten og mængden af det svangerskabsforebyggende middel og antistof mod solubiliseret zona pellucida omfatter for eksempel: (1) Gelimmunodiffusion [Ouchterlony, 26 Acta, Pathol., Microbiol. ,. Scand., 507 (1949)], (2) "Sandwich-teknik" [Coombs, Immunological Methods, udg. af

Ackroyd, Blackwell, Oxford (1964)] dvs. en teknik, som viser tilstedeværelsen af antisera ved reaktion med et andet antistof (fluorescin-konjugeret antistof) rettet mod det første antiserum, og (3) Inhibition af In Vitro Fertillisation (Gwatkin, et al., 30, J. Reprod. Fert. 389 (1972)].

Det omhandlede svangerskabsforebyggende middel anvendes i de af lægen foreskrevne dosisstørrelser og perioder. Ved vaccination med det omhandlede middel opnås en reversibel ufrugtbarhed på typisk mellem 15 og 30 uger. Ved immunisering af kvinder kan således benyttes injektioner med opløsninger af midlet indeholdende 70 - 700 pg solubiliseret zone pellucida, som gives en gang eller gentages efter et tidsrum på 7 - 14 dage. Immunitetstilstanden og dermed ufrugtbarheden kan bestemmes ved udtagning af en lille blodprøve og titrering af serum-delen deraf ved gel-lmmunodiffusion over for solubiliseret zone pellucida. Agglutination ved en titer større end 1:16 indicerer et tilstrækkeligt højt antistof-niveau til at sikre ufrugtbarhed. Tilbagevending af frugtbarhed indiceres ved et skarpt fald af antistof-titeren, der er en følge af dekom-ponering af antistoffet.

Behandling kan også ske ved hjælp af de ovenfor beskrevne antisera, idet kvinder kan behandles ved injektion af en globulin-rig fraktion af serum fra et immuniseret dyr, såsom en hest, et får eller et svin. Sådanne fraktioner fremstilles ved udfyldning med kold alkohol (Cobn-metoden), og enhedsdosen til injekticn kan typisk bestå af 10 - 20 mg/kg legemsvægt. En injektion givet indtil 14 dage efter coitus med mulighed for konception er som regel tilstræk- . 141275 6 kelig til at forhindre svangerskab, selv om gentagne injektioner indgivet daglig indtil den 14. dag giver forøget sikkerhed for effektivitet. I stedet kan midlet benyttes til kortvarig kontrol af frugtbarheden. Injektioner på 10 - 20 mg/kg legemsvægt af den ovenfor beskrevne fraktion medfører en ufrugtbarhedstilstand, som varer mindst 5 dage, og tilbagevenden af frugtbarheden kan bestemmes som ovenfor beskrevet.

Som ovenfor angivet er det ikke kritisk at anvende zona pellucida fra en bestemt art af pattedyr, men af praktiske grunde foretrækkes det at skaffe zona pellucida til fremstilling af midlet til mennesker ud fra følgende husdyr: laboratoriedyr, såsom mus, hamstere, rotter og kaniner, og slagtedyr, såsom køer, kalve, får og svin. .

Solubilisering af zona pellucida opnås ved opvarmning af de hele hinder til en temperatur mellem 65 og 100°C i vandigt medium, som indeholder phosphatpufret saltopløsning (PBS, med sammensætning i g/l: CaCl2 0,1; KC1 0,2; KH2P04 0,2; MgCl2*6H20 0,1;

NaCl 8,0; Na2HP04*2H20 1,15) eller tilsvarende saltopløsninger, der giver -en pH-værdi på 7,0 - 7,4. Opløseliggørelsen af det proteniøse zona pellucida kan i praksis udføres direkte på væv fra ovarier, som er mekanisk findelt forud for opvarmningen.

Fortrinsvis fås ovarievæv fra umodne dyr, fordi antallet af zona-bærende oocyter formindskes hurtigt med alderen. I stedet, især ved fremstilling i lille målestok, kan hinden skilles mekanisk fra ægget. Dette kan for eksempel ske ved at trække hele ægget gennem en åbning med en diameter på 1/2 - 5/4 af æggets normale diameter. Ved en sådan proces trækkes hinden fra ægget, når dette føres gennem åbningen.

Zona pellucida, der er solubiliseret på denne måde, kan yderligere isoleres eller renses for urenheder ved følgende generelle procedure: Centrifugering, dialyse af den dannede klare opløsning gennem cellofan i et vandigt bad, efterfølgende søjlekromatografi. Aktive fraktioner fra en sådan søjle identificeres ved standardprocedurer af den ovenfor angivne art, såsom immunodiffusion og in vitro frugtbarhedsprøve.

7 141275

Renheden af det dannede soluhiliserede zona pellucida kan bestemmes ved enhver af følgende velkendte procedurer: (1) Ultracentrifugering (2) Electrophorese på sammensatte geler af agarose-acrylamid [7 Biochemistry 668 (1968)] (3) Hindring af Hamster Eertilisation In Yitro og (4) Immunodiffusion over for antiserum specifikt for zona protein.

Det omhandlede middel i form af et antiserumpræparat kan fremstilles ved injektion i ethvert dyr af det solubiliserede zona pellucida fra en bestemt donor-art, hvorefter serum-antistoffet opsam les. Især er følgende procedurer egnede: Et passende dyr, såsom en hest, et får eller en ged, modtager en intramusculær injektion af solubiliseret zona pellucida i opløsning (5-10 μg solu-biliseret zona pellucida) i 0,5 - 1,0 ml komplet Freund’s adjuvans.

Med 10 dages intervaller gives tilsvarende injektioner i inkom-plet Freund's adjuvans. Dyrene årelades efter hver injektion, og titer af antistof måles ved immunodiffusion over for renset solubiliseret zona pellucida.

Opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle eksempler. I eksemplerne benyttes udtrykket SZP som forkortelse for solubiliseret zona pellucida.

EKSEMPEL 1

Præparation og egenskaber af^solublliseret hamster zona pellucida og analytiske procedurer

Hamster-zona isoleres fra intakte æg ved aftrækning. Ved denne metode trækkes de enkelte æg gennem et snævert hul (en pipette med en lysning på 60 μ), således at hinden brister og skiller fra det hele æg (vitellus). To tusinde stykker zona pellucida, der er fremstillet på denne måde, indføres i 100 mikroliter vandig phosphatpuffersaltopløsning [PBS; 99 J. Exp. Med. 167 (1954)] og opvarmes til 65°C i 35 minutter, hvorefter zona opløses fuld- 8 141275 stændigt til opnåelse af en klar opløsning. Ted ultracentri-fugal analyse påvises, at opløsningen indeholder en enkelt molekylær art med en molekylvægt på 8,9 x 10^. Den molekylære art er et protein, der består af 17 aminosyrer. (Tabel I).

TABEL· I

Aminosyre-sammensætning af hamster zona protein .Aminosyrer $ Total aminosyrer TIR 9,31 PHE 10,40 LIS 6,78 HIS 4,88 ARG 2,11 ASP 4,27 GIIJ 7,77 THR . 6,71 PRO 5,89 ADA 5,25 GET 6,54 VAL· 7,25 , CIS 0,92 MET 0,52 HE 0,24 ΗΒΗ 14,38 I overensstemmelse med aminosyre-sammensætningen har hamster zona proteinet (hamster-SZP) vist sig at være neutralt eller svagt basisk. Ved gel-elektrophorese af det således dannede hamster-SZP-protein (10 i» polyacrylamid, pH = 7,0, 2 milliampere pr.

5 mm diameter rør) opnåedes ingen bevægelse af proteinet efter 18 timer, idet prøven forblev som et enkelt bånd ved toppen af gelkolonnen. Båndet farves kraftigt med proteinfarve (ægte grøn); båndet farves ikke med alcian-blåt, hvilket viser, at SZP-protein indeholder lidt eller intet carbonhydrat. Ved behandling af hamster-SZP-urinstof og mercaptoethanol dissocierer det i tre enheder med lavere molekylvægt på henholdsvis 100.000, 9 141275 80.000 og 55.000, som det fremgår ved vandring i den ovenfor beskrevne elektrophorese-gel; dissociationen udføres ved opvarmning til 50°C i 45 minutter af en blanding af 10 ul hamster-SZP, en dråbe glycerol og 10 |il af en opløsning, som indeholder 100 mg natriumdodecylsulfat, 2,4 g urinstof, 100 ul 1,2$ vandig mercap-toethanol og 10 ml destilleret vand, hvorefter blandingen påføres en 10$ gel til elektrophorese over for reference-standards.

En analytisk procedure til bestemmelse af aktiviteten af ham-ster-SZP består i en indvirkning med aktive hamster-spermatozoer.

Ved aktive spermatozoer forstås sådanne, som er i stand til at gennemtrænge zona pellucida til befrugtning af et æg. Aktivering af sperma in vitro opnås rutinemæssigt ved behandling af sperma fra epididymis i 6 timer i et kulturmedium indeholdende cumulus-celler fra æggelederen af super-ovulerede dyr 20 timer efter injektion af 50 I.E. HCG [Gwatkin, et' al., 50 J. Reprod. Pert. 589 (1972)].

Når sådanne aktiverede spermatozoer dyrkes med hamster-SZP, kan den grad, til hvilken spermatozoerne er ude af stand til at gennemtrænge cumulus-frie æg, angives som et mål for aktiviteten af SZP. Por eksempel bliver aktiviteten af det ovenfor beskrevne hamster-SZP bestemt ved tilsætning af 10 ul af opløsningen indeholdende de aktiverede hamster-spermatozoer, 5 x 10^ sædlegemer pr. ml. Efter dyrkning i 50 minutter tilsættes 20 hamsteræg, der er fri for cumulus oophorus, og spermagennemtrængningen bedømmes efter et tidsrum på 90 minutter. Aktiverede spermatozoer, som er forbehandlet med hamster-SZP, selv om de er bevægelige, er helt ude af stand til at gennemtrænge æggene. Når muse- SZP, der er opnået for laboratoriemus ved samme procedure, anvendes i stedet for hamster- SZP, opnås positive, dvs. samme resultater ved den ovenfor beskrevne prøve på hamstersæd og æg. Dette er et bevis for, at SZP ikke er artsspecifik. En anden direkte indikation af kryds-reaktion (mangel på artsspecifikation) tilvejebringes ved immunisation over for befrugtning (beskrevet i det efterfølgende), hvorved det er vist, at vaccination af bestemte dyrearter,lige fra laboratorie-mus til forskellige primater, med hamster-SZP gør sådanne dyrearter ufrugtbare, hvilket iagttages ved naturlig parring samt observeres ved immunofluorescens af æg, der tages fra laparotomiserede arter, som er blevet vaccineret 10 14t275 (primater).

Yed en anden analytisk prøve omfattende immunofluorescens af æg, der er behandlet med antisera over for solubiliseret zona pellu-cida, er det påvist, at det omhandlede middel ikke er artspecifikt. Således vil for eksempel antiserum, dannet i mus over for det ovenfor beskrevne hamster-SZP reagere med æg fra hamstre, mus, køer, rhesus-aber og egernaber. Den nævnte reaktion er tydelig, når æggene behandles med fluorescent anti-museglobulin. Koncentrationen af antiserum, som kræves til at producere fluorescens, varierer dog med arterne.

Yaccination af hun-hamstere med det ovenfor beskrevne hamster-SZP producerede som ventet ingen påviselig immun-reaktion og altså ingen antistoffer, men når hun-mus indgives injektioner (middel bestående af 4 jig hamster-SZP i 0,5 ml Freund's komplet adjuvans ved første injektion og Freund’s ukomplet adjuvans ved efterfølgende injektioner) intramusculært og atter med 10 dages mellemrum i alt 4 injektioner serum, vises, at der er opnået antistoffer over for zona pellucida. Når disse mus parre-des, viste dyrene sig at være ufrugtbare.

For at demonstrere mangelen på artsspecificitet ved immun-reak-tionen opsamledes antiserum fra de vaccinerede mus, vaccineret med hamster-SZP, ved følgende procedure: En glas-mikropipette indføres i orbital sinus, og blodet bringes til at flyde ind i pipetten. Dette blod overføres til et glasrør og bringes til at koagulere, hvorefter det centrifugeres ved 1000 g i 5 minutter.

Serum dekanteres og opbevares ved 5°C. Når sådanne sera indeholdende anti-SZP prøves for indvirkning med artsforskellige æg fra pattedyr (hamstere, mus, køer, egernaber og rhesus-aber), iagttages uanset dyrearten en klar fluorescens ved zona pellucida på æg, der er behandlet på denne måde, når de udsættes for fluorescerende anti-muse-globulin. Antistof-antigen-reaktionen er dog specifik for zona pellucida-strukturen, idet andet væv end zona pellucida, såsom hamster cornea, hamster-æg uden zona, ham-ster-cumulus-celler og hamster-sperma, ikke giver nogen immun reaktion, dvs. der iagttages ingen fluorescens. Disse resultater illustrerer effektiviteten af midlet. En yderligere analytisk procedure til bestemmelse af renheden af solubiliseret zona pellucida 11 U1275 fra pattedyr består i at udføre immunodiffusion og immunoelektro-phorese-bedømmelser, hvorved reaktionen mellem SZP og et antistof produceret deraf iagttages. Hvad angår det ovenfor beskrevne hamster-SZP og antiserum er det iagttaget, at der dannes et énkelt precipitin-bånd, hvilket viser, at det solubiliserede zona pellucida" består af et enkelt antigen.

EKSEMPEL· 2 .. I

Isolation af SZP fra ovarier og vaccine-præparater

Hele ovarier (100) fra kalve (alder mellem 5 og 7 måneder) opsamles på is fra slagterier. Hvert ovarie omfatter cirka 180.000 follicler, hvorfra tilnærmelsesvis 2,0 mg zona-protein kan udvin des. Ovarierne findeles med skære eller hakkemaskiner, og for hvert gram våd vægt tilsættes 5,5 ml Dulbecco's phosphatpufret saltopløsning (PBS) [99 J. Exp. Med. 167 (1964)]. Blandingen homogeniseres i 1 minut i en Sorval Omnimixer, afkølet med Ib. Homogenisatet hældes over i 25 ml pyrex-centrifugerør, idet hvert rør indføres i kogende vand i 15 minutter. Rørene centrifugeres derefter ved 12.000 g i 8 minutter. Den klare ovenstående væske hældes fra, og bundfaldet bortkastes. Supernatanten i cellulose-dialyserør dialyseres over for 100 x rumfang vandigt medium åf 0,01 M ammoniumbicarbonat i 18 timer ved 5°C. Eet dialyserede materiale lyofiliseres. Den lyofiliserede ekstrakt opløses i en minimal mængde PBS til indføring i en kromatografisk kolonne, som er fyldt med Biorad’s "Biogel A-5M", hvorved opnås en separation af SZP fra lavere molekylære arter med en molekylvægt under 5 x 10 . Aktive fraktioner, elueret med PBS (fraktioner omfattende okse-SZP), identificeres ved immunodiffusion og in vitro frugtbarhedsprøve. De aktive fraktioner overføres derefter i en ........ · kromatografisk kolonne, som er fyldt med "Biogel A50M", der ad- " g 7 skilles over et molekylvægtområde fra 10 til 5 x 10 . De aktive fraktioner identificeres igen ved immunodiffusion og in vitro frugtbarhedsprøve. De således identificerede aktive fraktioner giver et enkelt bånd over for anti-SZP serum (mus), som overlapper det bånd, som er fundet med hamster-SZP, hvilket angiver immunologisk identitet. De aktive fraktioner blokerer befrugtning af hamsteræg in vitro. De dannede fraktioner omfattende okse-SZP i opløsning lyofiliseres for senere anvendelse.